JP3425622B2 - ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法 - Google Patents

ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、長鎖高度不飽和脂
肪酸生産能を有するラビリンチュラ（Labyrinthula）属
に属する微生物、該微生物の培養物及び該微生物を用い
た炭素数２０以上で不飽和結合２つ以上持つ長鎖高度不
飽和脂肪酸（不飽和結合を２つ以上持つ高度不飽和をPU
FA、鎖長が２０以上の前記高度不飽和脂肪酸をLCPUFAと
する）の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アラキドン酸（ＡＡ）、エイコサペンタ
エン酸（EPA ）やドコサヘキサエン酸（DHA ）などのLC
PUFAは生体内での種々の生理活性が注目され、近年、機
能性食品、医薬分野への利用が進められている。一方
で、これらのLCPUFAは一般の植物油脂には全く含まれて
おらず、DHA およびEPA がイワシやマグロなどの魚油に
含まれるのみである。LCPUFAのそれぞれの成分は特徴あ
る生理機能を有することから、種々の分野への利用を進
めるうえでは、その組成や含有量を調整することが重要
である。しかし、この技術としては魚油からDHA を濃縮
精製するための酵素を用いる方法などがあるだけで、そ
の組成や含有量を調整するための有効な変換手法が無
い。これらの現状においては、特徴のあるLCPUFA組成を
持ったLCPUFA含有油脂の多様な供給源を開発することが
求められている。 その重要な方法の一つに、微生物を
用いた生産方法がある。これまでにも、一般の植物油脂
には存在しないγ−リノレン酸、アラキドン酸などの生
産にモルティエレラ属のカビを培養して、その菌体中か
らそれらのPUFAを含む油脂を回収する方法もこれまでに
行われてきた。また、本発明で目的とするLCPUFAの一つ
であるDHA についてはスラウストキトリウムあるいはシ
ゾキトリウム属菌などの海洋性微生物を用いた生産方法
なども開発されてきた。
【０００３】このような、微生物によってLCPUFAを生産
させる場合には、前駆体となる脂肪酸あるいは油脂を炭
素源として培養する方法が考えられる。PUFAの前駆体で
ある油脂あるいは脂肪酸を用いることはエネルギー的に
有利であるため、初発原料にグルコースなどの糖類を用
いるより、高い生産効率が得られる可能性がある。ま
た、ダイズ油あるいはパーム油などの既存の植物油脂を
PUFA含有油脂に変換することにより、それらの油脂の付
加価値を大きく高めることができるとともに、脂肪酸組
成が変化することによる融点などの物理的特性の改変な
ども図れる可能性もある。
【０００４】油脂を炭素源として微生物を培養できるこ
とは古くから知られており、酵母やバクテリアなどの培
養例は多く存在するが、これらの培養の目的は主として
菌体そのもの、すなわち蛋白質の生産を目的とするもの
であった。モルティエレラ属のカビには、植物油脂に含
まれる成分であるα−リノレン酸をエイコサペンタエン
酸に変換する能力があることも知られている。
【０００５】しかし、これまでに油脂あるいは脂肪酸を
炭素源としてDHA などの炭素数２０以上で不飽和結合を
２つ以上持つLCPUFAに変換させる能力を有した微生物は
見いだされていない。DHA を生産する能力のあるスラウ
ストキトリウム属菌などの微生物を用いた生産方法にお
いても、グルコースなどの糖類を炭素源として用いなけ
ればならず、油脂あるいは脂肪酸を炭素源として用いた
場合には、菌体内に取り込まれるものの、不飽和化ある
いは鎖長の延長はほとんど行われない。その結果、菌体
収量は上がるものの、DHA などのLCPUFA生産量は極端に
減少してしまう欠点があった。
【０００６】また、本発明のラビリンチュラ属菌は、基
本的には寒天等の培養基の表面でしか増殖せず、さらに
その継代培養には摂食物として細菌や酵母などの他の微
生物を共存させ二者培養をおこなうことが要求され、DH
A などのLCPUFA生産に用いることのできるような有効な
培養方法は従来見いだされていないため、LCPUFA生産性
の高い株の探索あるいはLCPUFA生産のための培養条件の
検討は全く行われてこなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来、油脂を炭素源と
して培養可能であり、かつ菌体中に取り込まれた油脂に
DHA などのLCPUFAを付与する能力を有した微生物および
その培養方法は存在してこなかった。そこで、この発明
はLCPUFAを含まない植物油脂等をDHA などのLCPUFAを含
有した油脂に変換させる能力を持った微生物、その培養
方法ならびにLCPUFAを含有した油脂を製造する方法を提
供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、DHA など
のLCPUFAを含有する微生物の一つとして、ラビリンチュ
ラ属海生菌について生態的な特徴などを調べるととも
に、その生態的な特徴を利用した分離・培養方法につい
て鋭意研究を重ねてきた。その結果、従来効率良く安定
的に増殖させることが困難であったラビリンチュラ属菌
について培養に用いる寒天平板培地にモラキセラ属海洋
細菌をあらかじめ塗布・培養した後にラビリンチュラ属
海生菌を接種することにより、海草やマングローブ落葉
などの各種分離源からラビリンチュラ属菌を効率良くか
つ選択的に分離しうる方法を見いだし、すでに特許第２
９７６０２７号を取得してきた。また、同時にDHA など
のLCPUFAを効率良く微生物生産する方法として油脂等を
炭素源として適用することについて検討し、各種の分離
源から得られたラビリンチュラ属菌をはじめとする各種
のDHA を生産できる海生菌について油脂等での培養を重
ね、DHA 等のLCPUFAを含有する油脂に変換する能力のあ
る微生物の探索およびその培養条件培養条件の検討を行
い、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は油脂あるいは脂肪酸を
炭素源として培養可能であり、かつ長鎖高度不飽和脂肪
酸生産能を有するラビリンチュラ（Labyrinthula）属に
属する微生物である。そして、その具体的微生物として
は、ラビリンチュラ・エスピー S3-2（Labyrinthula s
p S3-2 )が挙げられる。
【００１０】さらに、本発明は上記微生物を炭素源とし
て油脂あるいは脂肪酸を含む培地中で培養することによ
り得られるラビリンチュラ属に属する微生物の培養物。
である。さらに、本発明は上記微生物を炭素源として油
脂あるいは脂肪酸を含む培地中で培養し、培養物から長
鎖高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする長鎖高
度不飽和脂肪酸の製造方法である。
【００１１】さらに、本発明は油脂を炭素源としてラビ
リンチュラ属の微生物を培養することにより、前記油脂
を長鎖高度不飽和脂肪酸に変換することを特徴とする油
脂の改質方法である。上記長鎖高度不飽和脂肪酸として
は、DHA などの炭素数２０以上で不飽和結合２つ以上持
つものが挙げられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】１．発明に用いる微生物 以下の方法により採取されるラビリンチュラ属海生菌の
分離株であり、油脂あるいは脂肪酸を炭素源として増殖
し、それらをDHA をはじめとするLCPUFAに変換させる能
力を有する菌株であればいずれのものでも良い。上記油
脂としては大豆油、パーム油、オリーブ油、サフラワー
油等が、脂肪酸としてはミリスチン酸、ステアリン酸、
オレイン酸、リノール酸等の飽和あるいは不飽和脂肪酸
及びそれらのエチルエステル等のエステル類が挙げられ
る。
【００１３】２．ラビリンチュラ属菌の分離方法 ラビリンチュラ属菌は、熱帯から極域の広い海洋環境に
分布していることが知られており、その分離源として
は、海水や種々の海藻あるいはアマモなどの海草、マン
グローブ樹林などの沿岸に繁茂する植物の落葉、各種の
底生動物、海水中あるいは沿岸で採取された木片、泥
砂、種々の有機物などが用いられる。しかし、ラビリン
チュラ属菌の分布密度や、分離株の増殖活性を考えた場
合に、熱帯・亜熱帯海域から採取されるアマモの葉片や
オヒルギなどのマングローブ落葉などを分離源とするこ
とが望ましく、これらを分離源として下記に示した方法
（特許第2976027号参照）で採取することができる。
【００１４】i) 寒天培地の準備 ラビリンチュラ属菌の分離および培養に用いるは、以下
のように準備する。すなわち、０〜１０ｇのグルコース
と酵母エキス、ペプトンなどの適当な栄養源と５〜２０
ｇの寒天を１リットルの天然海水または人工海水で調製
した培地を蒸気滅菌した後に、通常の微生物培養実験に
用いるシャーレ（直径９cmのものが良く使われる）にそ
そぎ込み、冷却、固化させる。また、このときの天然海
水あるいは人工海水の濃度は、通常の海水濃度の２０〜
１００％で調製して使うが、５０％〜９０％の濃度がラ
ビリンチュラ属菌の培養には望ましい。
【００１５】ii) 寒天培地への細菌の塗布 ラビリンチュラ属菌を効率よく増殖させるために、前記
の要領で準備した寒天平板培地にあらかじめ細菌を塗布
・培養したものを用いる。このときに用いる細菌として
は、海洋性の細菌を用いることが望ましく、ラビリンチ
ュラ属菌の増殖に効率の良い海洋性細菌の代表的なもの
としては、モラキセラ属細菌（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６９５４）が挙げられる。寒天平板培地を調製する際
に用いた海水濃度が５０％以下であれば、海洋性でない
細菌を用いることもできる。塗布すべき細菌は、予めグ
ルコース（0.1％）、ペプトン（0.05％）、酵母エキス
（0.25％）を５０％濃度の人工海水で調製した培養液に
接種して、２〜７日間、２０〜３０℃の培養温度で振と
う培養したものを用いる。培養条件は、用いる細菌の培
養に適した培養条件で行う。このようにして調製した細
菌の培養液を、シャーレに調製した寒天平板培地に１０
０マイクロリットルずつ無菌的に接種して、コンラージ
棒などで培地表面に塗り広げたもの、あるいは１〜５日
間、２０〜３０℃の培養温度ないし室温で静置培養して
細菌を増殖させてたものを以下のラビリンチュラ属菌の
分離に用いる。
【００１６】海草やマングローブ落葉などの試料採取物
は、１cm×１cm程の断片にした後、滅菌水などでその表
面を数回洗浄し、表面に付着した水分中から持ち込まれ
る細菌あるいはかび胞子などを可能な限り取り除いた後
に、前述のモラキセラ属細菌を塗布・培養した寒天平板
培地の中央に貼り付ける。この寒天平板培地を室温ない
し２０〜３０℃の培養温度で、２〜７日間静置培養し、
ラビリンチュラ属菌の出現を観察する。ラビリンチュラ
属菌は、長さ１０μm程の紡錘形の細胞からなり、これ
が数珠つながりあるいは一塊になって滑り運動をしなが
ら寒天平板培地上に広がっていく。この運動性により網
目状あるいはかびの菌糸が広がるような様子を呈して試
料の周囲から放射状の広がりを見せ、多くの場合、２〜
５日で試料を貼り付けたシャーレ中央からシャーレの周
辺に到達する。このときラビリンチュラ属菌以外の様々
な細菌やかび・酵母なども試料周辺に出現するが、それ
らは塗布されたモラキセラ属細菌により、増殖が抑制さ
れる。また、ラビリンチュラ属菌は、モラキセラ属細菌
のコロニー中で活発に増殖を繰り返し、網目状に広が
る。シャーレの縁付近まで到達した網目状の細胞塊（約
５mm×５mm）を寒天培地ごと切り取り、再度、モラキセ
ラ属細菌を塗布・培養した寒天平板培地の中央に移植す
る。再び、この寒天平板培地を室温ないし２０〜３０℃
の培養温度で、２〜７日間静置培養する。この方法ある
いはこれを再度繰り返すことにより、ラビリンチュラ属
菌の分離が可能となる。ただし、この分離菌はモラキセ
ラ属細菌などとの二者培養物である。
【００１７】iii) 二者培養の特徴 この二者培養物は、クロラムフェニコールなどの抗生物
質を適量入れた寒天平板培地で容易に純粋化される。し
かし、ラビリンチュラ属菌は純粋化した状態での増殖性
は非常に弱く、馬血清を１％添加した寒天平板培地で多
少の増殖が見られる他は、純粋株として培養株を維持
し、継代培養するのは困難である。一方で、モラキセラ
属細菌などの海洋細菌を予め塗布した寒天平板培地を用
いることにより、極めて良好な増殖と菌の活性を維持す
ることができる。
【００１８】３．ラビリンチュラ属菌の特徴 ラビリンチュラ属菌は、以下の菌学的性質を有するもの
であり、その形態、動きから顕微鏡観察により容易に他
の微生物から区別される。ラビリンチュラ属菌の栄養細
胞は特徴的な紡錘形であり、原形質のネットワークを滑
走運動する。分類学上の二つ上位のラビリンチュラ目
は、ラビリンチュラ科とスラウストキトリウム科から成
り、ラビリンチュラ科はラビリンチュラ属１属から成
り、スラウストキトリウム科はスラウストキトリウム
属、シゾキトリウム属などの７属が報告されている（Ha
ndbook of Protoctista, David Porter 著, 1990）。ま
た、スラウストキトリウム科の菌類はその栄養細胞が球
形ないしは卵形で、特徴的な紡錘形であるラビリンチュ
ラ属とは容易に識別される。これらのラビリンチュラ目
の微生物は、以前は菌界に分類され、海洋環境に広く存
在し従属栄養で増殖するいわゆる海生菌として知られて
きた。その内、スラウストキトリウム科の微生物は卵菌
類に、一方ラビリンチュラ科の微生物は粘菌類に分類さ
れていた。しかし、これらのラビリンチュラ目の微生物
は一般的に２本の長さ、形態の異なる鞭毛を有する遊走
子を介する生活環を持っており、その遊走子の構造ある
いは遺伝子の系統解析などにより、近年は、黄色植物界
の不等毛門に組み入れられている。
【００１９】４．寄託株 本発明の代表的な分離株は、石垣島で採取されたオヒル
ギの落葉から前述の方法で分離されたラビリンチュラ・
エスピーS3-2（Labyrintula sp. S3-2株）であり、工業
技術院生命工学工業技術研究所に平成１２年３月１４日
付けで寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９０を得
ている。なお、他の分離株として、ラビリンチュラ・エ
スピー 714-2、P11-1 、P28-1、P37-1 、P38-2 、P47-1
が挙げられる。
【００２０】また、本発明の油脂の改質に用いる微生物
は、前記ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９０に限らず、上述した
ラビリンチュラ属菌と実質的に同一の菌学的性質を有す
る菌株であればいずれの菌株も使用することができる。
油脂あるいは脂肪酸を原料としてこのような微生物を培
養し、その培養物中にDHA などのLCPUFAを蓄積させた
後、その培養物から油脂を回収することにより、LCPUFA
含有油脂を得ることができる。
【００２１】５．ｏｉｌプレート培地 油脂あるいは脂肪酸を原料としたラビリンチュラ属菌の
培養には、当該ラビリンチュラ属菌を分離・培養に用い
た培地組成の培地を調製して蒸気滅菌した後に、オレイ
ン酸やリノール酸などの脂肪酸あるいは大豆油やパーム
油などの油脂を培地１リットルあたり１ｇ〜２０ｇ加
え、超音波破砕装置などを使って乳化・分散させてシャ
ーレにそそぎ込み、寒天平板培地とする。脂肪酸あるい
は油脂としては、ここに例示したものの他に、ステアリ
ン酸、ミリスチン酸あるいはα−リノレン酸などの飽和
あるいは不飽和脂肪酸およびそのエチルエステルなどの
エステル化物や、オリーブオイル、サフラワー油などの
天然植物油あるいはトリオレインなどの合成トリグリセ
リドを用いることができる。油脂等の培地中への分散を
助けるために、培地中にTween-80などの界面活性剤を予
め適量加えておくことも効果的である。また、培地に添
加する窒素源としては、前記の酵母エキスやペプトンの
代わりに、種々の微生物の培養で用いられるコーンスチ
ープリカー、尿素、グルタミン酸ナトリウムなどの有機
窒素源、あるいは酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒
素源を用い、無機塩としてリン酸カリウム等を適宜組み
合わせて使用できる。また、グルコースの代わりには、
フルクトース、サッカロースなどの糖類あるいはグリセ
ロールなどを用いることもできる。
【００２２】６．培養方法 このようにして調製した油脂あるいは脂肪酸含有寒天培
地に、予め細菌の培養に適当なグルコース、ペプトンな
どで調製した公知の液体培地、例えばグルコース（0.1
％）、ペプトン（0.05％）酵母エキス（0.025％）を５
０％濃度の人工海水で調製した培養液などで培養してお
いたモラキセラ属菌を塗布・培養しておくかあるいは、
ラビリンチュラ属菌を接種する際に塗布しても効果は同
等である。ラビリンチュラ属菌は、モラキセラ属細菌を
塗布した分離・培養培地にて充分増殖したものを用い、
網目状に広がったラビリンチュラ属菌の細胞塊（約５mm
×５mm）を切り取り、油脂含有プレートの中央に接種す
る。培養温度、15〜30 ℃にて、３〜１４日間、静置培
養する。ラビリンチュラ属菌は最初には、モラキセラ属
細菌のコロニーの中を接種源の周囲から網目状あるいは
かびの菌糸が広がるような様子を呈して放射状の広がり
を見せていくが、油脂含有プレートではさらに寒天の中
にも侵入し、活発な増殖をみせていく。その結果、白く
乳化していた油脂含有プレートは、ラビリンチュラ属菌
の増殖とともに透明感が増してくる。これは、寒天中に
乳化分散していた油脂がラビリンチュラ属菌の菌体中に
摂取されてくるためと考えられる。
【００２３】７．培養物 所定の期間培養を行った後の寒天培地は、油脂を資化す
ることにより増殖したラビリンチュラ属菌が詰まった状
態となる。培地中に分散されていた油脂は菌体中に取り
込まれた後、LCPUFAに変換、蓄積される。この培養物で
ある寒天平板培地に含まれる油脂含量およびLCPUFAの含
有量は、ラビリンチュラ属菌が増殖した寒天片を切り取
り、常法によりガスクロマトグラフで脂肪酸組成を分析
することにより求められる。
【００２４】８．油脂の回収 この培養物からLCPUFAを含有した油脂を回収するには、
この培養物を超音波やダイノミルなどによって破砕した
後、例えばヘキサンやクロロホルムなどでの有機溶媒抽
出を行う。
【００２５】寒天１ｇ（湿重量）あたりの油脂含有量は
１〜２５重量％であり、油脂に含まれるLCPUFAの含有量
は１〜２５％である。LCPUFAの組成は、炭素数２０のア
ラキドン酸（AA, 20:4）、エイコサペンタエン酸（EPA,
20:5）および炭素数２２のドコサテトラエン酸（DTA,
22:4）、ドコサペンタエン酸（DPA, 22:5）、ドコサヘ
キサエン酸（DHA, 22:6）などからなる。これらのLCPUF
Aは、原料として用いられた油脂中には全く含まれてお
らず、ラビリンチュラ属菌によって生産されたものであ
り、モラキセラ属菌のみを塗布、培養した場合にはこれ
らは全く生産されていない。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
でない。 〔実施例１〕ラビリンチュラ・エスピーS3-2を用いて、
各種脂肪酸および油脂を添加した寒天平板培地で培養し
た。寒天平板培地は、50%濃度人工海水１リットルに、
グルコース 2.0 g、ポリペプトン 1.0 g、酵母エキス0.
5 g、寒天15.0 gを溶解して蒸気滅菌し、オレイン酸、
リノール酸、α−リノレン酸などの脂肪酸あるいは大豆
油を４.5ｇ加えた後、9cmシャーレ中に10mlずつ分注し
て作製した。このようにして調製した寒天平板培地に、
モラキセラ属菌LB004株の培養液100マイクロリットルを
塗布し、３日間室温で培養を行い、モラキセラ属菌塗布
培地を調製した。モラキセラ属菌の培養液は、50%濃度
人工海水１リットルに、グルコース 2.0g、ポリペプト
ン 1.0 g、酵母エキス0.5 gを加えて作製した培地にて
４日間培養したものを用いた。このモラキセラ属菌塗布
培地に、ラビリンチュラ属菌分離株S3-2を培地の中心に
接種し、室温で１１日間培養した。培養後、寒天平板培
をおよそ2 cm x 2 cmの大きさで切り取ってねじ口試験
管中に移し、105℃、３時間乾燥後、常法に従って油脂
の直接抽出ならびに脂肪酸メチルエステルの調製を行
い、LCPUFAの濃度を求めた。すなわち、乾燥培養物を、
ねじ口試験管中で、10%塩酸メタノールおよびジクロロ
メタンを加え、60℃の温浴中で３時間加熱して培養物中
の油脂成分を脂肪酸メチルエステル化した後、当該成分
をn-ヘキサンにて抽出した。ガスクロマトグラフ分析に
より、この脂肪酸メチルエステルの全脂肪酸組成を求め
て、LCPUFA成分の含有量およびその組成を求めた。その
結果を表１に示した。なお、各LCPUFA成分については、
ガスクロマトグラフ−質量分析法により標準物質との比
較を行って確認した。
【００２７】実験に用いたいずれの脂肪酸あるいは油脂
においてもラビリンチュラ・エスピーS3-2は良好に増殖
し、寒天培地表面に増殖するだけでなく、寒天培地中へ
の広がりも観察された。寒天培地は、培養当初は培地中
に分散された脂肪酸あるいは油脂により白濁しているが
ラビリンチュラ属菌の増殖につれて透明感を増した。顕
微鏡観察によっても培地中での菌体の増殖が確認され、
ラビリンチュラ属菌は油脂を良好に資化していることが
示された。ガスクロマトグラフ分析の結果、用いた脂肪
酸または油脂に含まれていない、LCPUFAの生成が認めら
れ、その濃度は、18.3から19.2%に達した。LCPUFAの主
要な脂肪酸は、各種の脂肪酸を用いた場合ではDHAとDPA
であり両者で90%前後に達する高い濃度であった。大豆
油を用いた場合にも同様に、ドコサヘキサエン酸とドコ
サペンタエン酸が主要な成分であったが、アラキドン酸
の割合が増加していた。
【００２８】
【表１】
【００２９】〔実施例２〕実施例１における大豆油を用
いた培地条件で、モラキセラ属菌を塗布したのみの条件
（Ｍ）モラキセラ属菌を塗布しないでラビリンチュラ属
菌のみを接種した条件（Laby）、両者を用いた条件（Ｍ
+Laby）で比較対照として培養を行った。室温で１６日
間培養した後、実施例１に示した分析条件での分析を行
った。
【００３０】大豆油にはLCPUFAは含まれておらず、表２
に示すように、モラキセラ属菌のみを接種した場合にお
いてもLCPUFAは検出されない。ラビリンチュラ属菌のみ
を接種した条件では、DHA をはじめとするLCPUFAが生成
しているが、モラキセラ属菌を併せて用いることによ
り、大豆油中に含まれていたオレイン酸(18:1)あるいは
リノール酸(18:2)から、DHA をはじめとする炭素数20な
いし22のLCPUFAが良好に生産され、LCPUFAへの変換が促
進されていることが示された。
【００３１】
【表２】
【００３２】〔実施例3〕石垣島、小笠原父島、パラオ
諸島各地で採取したマングローブ落葉から分離した各種
のラビリンチュラ属菌分離株について、実施例１に示し
た培地組成において油脂として大豆油を用いた条件で１
１日間培養を行った。培養後、寒天平板培地（培養物）
を2 cmｘ2 cmの大きさで切り取り、培地表面の菌体とと
もに、培地中の油脂を含めてLCPUFAの分析を行った。そ
の結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
【００３４】ラビリンチュラ属菌のいずれの分離株にお
いても、大豆油において良好な増殖を示した。全脂肪酸
中におけるLCPUFAの濃度は、9.0 〜14.0％の値が得られ
ており、大豆油中に含まれていた炭素数16あるいは18の
脂肪酸から、DHA をはじめとする炭素数20ないし22のLC
PUFAが良好に生産されていることが示された。
【００３５】〔実施例４〕実施例１の培地条件にて、各
種の大豆油濃度の培地を調製し、S3-2株の培養を行っ
た。実験No.304から306の条件においては、大豆油の培
地中への分散を促進するために界面活性剤としてTween-
80を培地１リットルあたり1ml添加した。培養条件は、
室温で７日間とし、最も大豆油の濃度の高い実験No. 30
6条件では、１４日間の培養も行った。培地中に含まれ
ている大豆油の濃度の分析と、培養終了後のLCPUFA生成
量は、アラキジン酸（20:0）を内部標準としたガスクロ
マトグラフ分析における全脂肪酸メチルエステルの面積
から求めた。培地調製後における、大豆油の濃度は、湿
寒天培地1gあたり、1.1 mgから22.8 mgであった。培養
結果を表４に、LCPUFA組成を表５に示す。
【００３６】
【表４】
【００３７】
【表５】
【００３８】７日間の培養で、LCPUFA生成量は大豆油濃
度の増加にともなって増加したが、大豆油濃度が22.8 m
gの濃度では低下した。一方で、LCPUFA濃度は、大豆油
濃度が最も低い条件では21.6%の最も高い値が得られ
た。大豆油濃度が22.8 mgの濃度においては、培養日数
を１４日間とすることにより、LCPUFA生成量は７日間培
養の場合の約２倍である0.76mg/g-agarと、最も高い値
になり、LCPUFA濃度も大きく増加した。また、LCPUFA組
成も、DPAやDHA といった、より鎖長が長くて不飽和度
の高い脂肪酸への変換が進んでいることが示された。
【００３９】
【発明の効果】本発明は、従来有効な培養方法がなかっ
たラビリンチュラ属菌について効率の良い培養方法を提
供するものである。これによって、植物油脂や脂肪酸等
からドコサヘキサエン酸などの炭素数２０以上で不飽和
結合２つ以上有する長鎖高度不飽和脂肪酸を含んだ油脂
含有物あるいは該長鎖高度不飽和脂肪酸含有油脂を効率
よく生産することができる。本発明は、また、植物油脂
等を付加価値の高い長鎖高度不飽和脂肪酸を含有した油
脂へ変換する新規な油脂の改質方法として用いることが
できる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (56)参考文献 中原 東郎 他，Ｌａｂｙｒｉｎｔｈ ｕｌａ属海生菌の脂肪酸組成−▲餌▼と しての各種バクテリアの影響−，日本油 化学会平成11年度年会（38回油化学討論 会）講演要旨集，1999年10月20日，ｐ. 133 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/64 C12N 1/00 - 1/38 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ラビリンチュラ（Labyrinthula）属に属
    し、炭素数２０以上で不飽和結合を２つ以上有する長鎖
    高度不飽和脂肪酸を生産する能力を有する微生物を、炭
    素源として油脂あるいは脂肪酸を含む培地中で培養し、
    培養物から炭素数２０以上で不飽和結合を２つ以上有す
    る長鎖高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする、
    前記長鎖高度不飽和脂肪酸の製造方法。
  2. 【請求項２】ラビリンチュラ（Labyrinthula）属に属
    し、炭素数２０以上で不飽和結合を２つ以上有する長鎖
    高度不飽和脂肪酸を生産する能力を有する微生物が、ラ
    ビリンチュラ・エスピーS3-2（Labyrinthula sp S3-2）
    である請求項１に記載の製造方法。
  3. 【請求項３】油脂を炭素源として、ラビリンチュラ（La
    byrinthula）属に属し、炭素数２０以上で不飽和結合を
    ２つ以上有する長鎖高度不飽和脂肪酸を生産する能力を
    有する微生物を培養することにより、前記油脂を炭素数
    ２０以上で不飽和結合を２つ以上有する長鎖高度不飽和
    脂肪酸に変換することを特徴とする、油脂の改質方法。
  4. 【請求項４】ラビリンチュラ（Labyrinthula）属に属
    し、炭素数２０以上で不飽和結合を２つ以上有する長鎖
    高度不飽和脂肪酸を生産する能力を有する微生物が、ラ
    ビリンチュラ・エスピーS3-2（Labyrinthula sp s3-2）
    である請求項３に記載の油脂の改質方法。
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US09/749,035 US6461839B2 (en) 2000-03-30 2000-12-28 Method of producing a polyunsaturated fatty acid containing culture and polyunsaturated fatty acid containing oil using microorganisms
EP00250461A EP1138759B1 (en) 2000-03-30 2000-12-29 A method of producing a polyunsaturated fatty acid-containing culture and polyunsaturated fatty acid-containing oil using microorganisms belonging to the genus Labyrinthula
DE60031091T DE60031091T2 (de) 2000-03-30 2000-12-29 Verfahren zur Produktion einer mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltenden Kultur und eines mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltenden Öles unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Labyrinthula

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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3723822B2 (ja) * 2001-06-22 2005-12-07 特許キャピタル株式会社 高度不飽和脂肪酸の製造方法
CN1276073C (zh) 2001-10-16 2006-09-20 独立行政法人产业技术总合研究所 微生物及其类胡萝卜素化合物类产品
JP4647212B2 (ja) * 2001-12-12 2011-03-09 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション 脂肪種子および微生物供給源からの脂質の抽出および脱ろう
US20040203120A1 (en) * 2002-03-22 2004-10-14 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists
US20050019880A1 (en) * 2003-03-31 2005-01-27 Council Of Scientific And Industrial Research Method of enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists
NO347177B1 (no) * 2003-08-01 2023-06-19 Basf Plant Science Gmbh Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer
EP2447356B1 (en) 2005-06-07 2016-04-20 DSM Nutritional Products AG Eukaryotic microorganisms for producing lipids and antioxidants
EP2082053B1 (en) 2006-08-01 2016-04-13 DSM Nutritional Products AG Process for producing microbial oil comprising polyunsaturated fatty acids
JP5303918B2 (ja) * 2006-12-11 2013-10-02 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
ATE554177T1 (de) 2007-06-04 2012-05-15 Univ Hokkaido Nat Univ Corp Verfahren zur herstellung von dha-haltigem phospholipid durch mikrobielle fermentation
US8207363B2 (en) 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
US9924733B2 (en) 2010-01-19 2018-03-27 Dsm Ip Assets B.V. Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
BR112014001126B1 (pt) 2011-07-21 2022-05-10 Dsm Ip Assets B.V Composição contendo óleo microbiano refinado e forma de dosagem oral
AU2012345942A1 (en) * 2011-11-29 2014-06-12 Dignity Sciences Limited Compositions comprising 20-carbon fatty acids and methods of making and using same
EP2970926B1 (en) 2013-03-13 2018-01-31 DSM Nutritional Products AG Engineering microorganisms
AR104042A1 (es) 2015-03-26 2017-06-21 Mara Renewables Corp Producción de alta densidad de biomasa y aceite utilizando glicerol en bruto
MX2018000502A (es) 2015-07-13 2018-09-07 Mara Renewables Corp Mejora del metabolismo de microalga de xilosa.
US10851395B2 (en) 2016-06-10 2020-12-01 MARA Renewables Corporation Method of making lipids with improved cold flow properties
US11419350B2 (en) 2016-07-01 2022-08-23 Corbion Biotech, Inc. Feed ingredients comprising lysed microbial cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
DE69637953D1 (de) * 1995-04-17 2009-07-30 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Hoch ungesättigte fettsäurenproduzierende mikroorganismen und verfahren zur herstellung von hoch ungesättigten fettsäuren durch verwendung dieser mikroorganismen
JP2976027B1 (ja) * 1998-08-27 1999-11-10 工業技術院長 海生菌の分離方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中原 東郎 他，Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ属海生菌の脂肪酸組成−▲餌▼としての各種バクテリアの影響−，日本油化学会平成１１年度年会（３８回油化学討論会）講演要旨集，１９９９年１０月２０日，ｐ．１３３

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