JP3379774B2 - 塩基配列決定方法 - Google Patents
塩基配列決定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の塩基配列決定方法
に関し、更に詳しくは蛍光標識したオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いる塩基配列決定方法及びキット
に関する。
に関し、更に詳しくは蛍光標識したオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いる塩基配列決定方法及びキット
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ塩基配列解析法として普及してい
るジデオキシチェーンターミネーター法（ジデオキシ
法）は、従来、ＤＮＡを放射性元素で標識し、ゲル電気
泳動により塩基長に応じて分離したパターンをオートラ
ジオグラフィーによって読み取ることにより行ってきた
が、近年周辺技術の発達により蛍光物質標識を利用した
自動シークエンサーが開発され、種々の改良が加えられ
て精度の高いデータが得られるようになってきた。この
方法では、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ド、又は反応停止用基質のジデオキシヌクレオチド三リ
ン酸に蛍光物質を結合し、ジデオキシ反応物をゲル電気
泳動で分離しながらＤＮＡ断片にレーザー光を照射し
て、発する蛍光を受光して１塩基ずつ解読していく。一
般に、より精度の高い結果が得られること、及び合成が
容易なことより、前者のプライマー標識法が主として用
いられている。
るジデオキシチェーンターミネーター法（ジデオキシ
法）は、従来、ＤＮＡを放射性元素で標識し、ゲル電気
泳動により塩基長に応じて分離したパターンをオートラ
ジオグラフィーによって読み取ることにより行ってきた
が、近年周辺技術の発達により蛍光物質標識を利用した
自動シークエンサーが開発され、種々の改良が加えられ
て精度の高いデータが得られるようになってきた。この
方法では、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ド、又は反応停止用基質のジデオキシヌクレオチド三リ
ン酸に蛍光物質を結合し、ジデオキシ反応物をゲル電気
泳動で分離しながらＤＮＡ断片にレーザー光を照射し
て、発する蛍光を受光して１塩基ずつ解読していく。一
般に、より精度の高い結果が得られること、及び合成が
容易なことより、前者のプライマー標識法が主として用
いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このプライマー標識法
においては、通常プライマー１分子につき蛍光物質１分
子を結合させて用いる。蛍光標識法を用いる場合、デー
タの精度は特にシグナル強度に依存する。特に、１回の
反応でより長くデータを解読するためにはシグナル強度
が強いほど有利である。この目的を達するために、プラ
イマー１分子当りに複数個の蛍光物質を導入することが
考えられる。しかし、それによってコンホメーションの
変化や立体障害などにより、プライマーと鋳型ＤＮＡと
の結合が不安定になったり、また蛍光物質相互の干渉作
用により蛍光強度が減少したりすることが予想され、任
意の位置に任意の数の蛍光物質を導入してもシグナル強
度が上がるとは限らない。つまり、蛍光物質の導入位置
及び数が重要なファクターになると推定される。しか
し、それらのファクターの最適値は知られていない。本
発明の目的は、シグナル強度の高い蛍光標識プライマー
を創製し、該プライマーを用いた高感度かつ高精度な核
酸の塩基配列決定方法及び該方法に使用するキットを提
供することにある。
においては、通常プライマー１分子につき蛍光物質１分
子を結合させて用いる。蛍光標識法を用いる場合、デー
タの精度は特にシグナル強度に依存する。特に、１回の
反応でより長くデータを解読するためにはシグナル強度
が強いほど有利である。この目的を達するために、プラ
イマー１分子当りに複数個の蛍光物質を導入することが
考えられる。しかし、それによってコンホメーションの
変化や立体障害などにより、プライマーと鋳型ＤＮＡと
の結合が不安定になったり、また蛍光物質相互の干渉作
用により蛍光強度が減少したりすることが予想され、任
意の位置に任意の数の蛍光物質を導入してもシグナル強
度が上がるとは限らない。つまり、蛍光物質の導入位置
及び数が重要なファクターになると推定される。しか
し、それらのファクターの最適値は知られていない。本
発明の目的は、シグナル強度の高い蛍光標識プライマー
を創製し、該プライマーを用いた高感度かつ高精度な核
酸の塩基配列決定方法及び該方法に使用するキットを提
供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はジデオキシ法による核酸の塩基配列
決定方法に関し、５′末端及び該５′末端から４〜１２
個の塩基を隔てた位置のヌクレオチド間にそれぞれ１分
子の蛍光物質を結合させたオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いることを特徴とする。また本発明の第２
の発明は、ジデオキシ法による核酸の塩基配列決定に使
用されるプライマーであって、上記したオリゴヌクレオ
チドプライマーに関する。そして、本発明の第３の発明
は核酸の塩基配列決定用キットに関し、上記第２の発明
のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とす
る。
発明の第１の発明はジデオキシ法による核酸の塩基配列
決定方法に関し、５′末端及び該５′末端から４〜１２
個の塩基を隔てた位置のヌクレオチド間にそれぞれ１分
子の蛍光物質を結合させたオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いることを特徴とする。また本発明の第２
の発明は、ジデオキシ法による核酸の塩基配列決定に使
用されるプライマーであって、上記したオリゴヌクレオ
チドプライマーに関する。そして、本発明の第３の発明
は核酸の塩基配列決定用キットに関し、上記第２の発明
のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とす
る。
【０００５】以下、詳細に本発明を説明する。本発明の
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの長さは、
ジデオキシ法に用いることができるものであればよく、
特に制限はないが、好ましくは１０〜３０塩基である。
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの長さは、
ジデオキシ法に用いることができるものであればよく、
特に制限はないが、好ましくは１０〜３０塩基である。
【０００６】また、本発明のプライマーとして用いるオ
リゴヌクレオチドの塩基配列としては、一般に広く用い
られているベクター由来の配列、独自にデザインされた
配列等ジデオキシ法に用いることができるものであれば
何でもよい。ベクター由来の配列の例としては、配列表
の配列番号１〜１０でそれぞれ表されるＭ１、Ｍ２、Ｍ
３、Ｍ４、ＲＶ、ＲＶＭ、ＲＶＮ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６
の各プライマーが挙げられる。
リゴヌクレオチドの塩基配列としては、一般に広く用い
られているベクター由来の配列、独自にデザインされた
配列等ジデオキシ法に用いることができるものであれば
何でもよい。ベクター由来の配列の例としては、配列表
の配列番号１〜１０でそれぞれ表されるＭ１、Ｍ２、Ｍ
３、Ｍ４、ＲＶ、ＲＶＭ、ＲＶＮ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６
の各プライマーが挙げられる。
【０００７】オリゴヌクレオチドの合成方法としては、
亜リン酸アミダイト法、リン酸トリエステル法、ハイド
ロジェンホスホネート法等が挙げられるが、亜リン酸ア
ミダイト法が一般的である。
亜リン酸アミダイト法、リン酸トリエステル法、ハイド
ロジェンホスホネート法等が挙げられるが、亜リン酸ア
ミダイト法が一般的である。
【０００８】オリゴヌクレオチドに蛍光物質を導入する
方法としては、リンカーアームが結合したオリゴヌクレ
オチドを合成し、これに標識試薬を作用させる方法が一
般的である。リンカーアーム導入用試薬は公知のものが
使用でき、一部は市販されている。これらのリンカーア
ーム導入用試薬を適宜選択することにより、オリゴヌク
レオチドの５′末端、ヌクレオチド間、３′末端、塩基
等にリンカーアームを導入し、蛍光物質を結合すること
ができる。例えば５′末端にリンカーアームを導入する
ための試薬としては下記式（化１）で表される化合物が
あり、ヌクレオチド間にリンカーアームを導入するため
の試薬としては下記式（化２）で表される化合物があ
る。
方法としては、リンカーアームが結合したオリゴヌクレ
オチドを合成し、これに標識試薬を作用させる方法が一
般的である。リンカーアーム導入用試薬は公知のものが
使用でき、一部は市販されている。これらのリンカーア
ーム導入用試薬を適宜選択することにより、オリゴヌク
レオチドの５′末端、ヌクレオチド間、３′末端、塩基
等にリンカーアームを導入し、蛍光物質を結合すること
ができる。例えば５′末端にリンカーアームを導入する
ための試薬としては下記式（化１）で表される化合物が
あり、ヌクレオチド間にリンカーアームを導入するため
の試薬としては下記式（化２）で表される化合物があ
る。
【０００９】
【化１】
【００１０】（ただしｎは自然数）
【００１１】
【化２】
【００１２】ＤＭＴr ： ジメトキシトリチル基
Ｆmoc ： フルオレニルメトキシカルボニル基
【００１３】本発明の標識に用いる蛍光物質としては蛍
光を発するものであれば何でもよく例えば、フルオレセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルロ
ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＮＢＤ−
フルオリド（ＮＢＤ−fluoride、シグマ社）、テキサス
レッド（Texas Red 、モレキュラープローブ社）等が挙
げられる。
光を発するものであれば何でもよく例えば、フルオレセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルロ
ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＮＢＤ−
フルオリド（ＮＢＤ−fluoride、シグマ社）、テキサス
レッド（Texas Red 、モレキュラープローブ社）等が挙
げられる。
【００１４】本発明者らは、５′末端及びヌクレオチド
間にリンカーアームを導入し、ＦＩＴＣで蛍光標識し、
図１及び図２に示すフルオレセインが複数個結合したオ
リゴヌクレオチドを各種作製した。すなわち、図１は配
列表の配列番号４で表されるＭ４プライマーの配列を基
に作製した８種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＰ
１〜ＦＰ８）を表す図であり、図２は配列表の配列番号
５で表されるＲＶプライマーの配列を基に作製した８種
類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＰＲ１〜ＦＰＲ
８）を表す図である。
間にリンカーアームを導入し、ＦＩＴＣで蛍光標識し、
図１及び図２に示すフルオレセインが複数個結合したオ
リゴヌクレオチドを各種作製した。すなわち、図１は配
列表の配列番号４で表されるＭ４プライマーの配列を基
に作製した８種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＰ
１〜ＦＰ８）を表す図であり、図２は配列表の配列番号
５で表されるＲＶプライマーの配列を基に作製した８種
類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＰＲ１〜ＦＰＲ
８）を表す図である。
【００１５】これらの蛍光標識オリゴヌクレオチドは、
蛍光強度、二重鎖を形成したときの安定性（Ｔｍ値）、
プライマーとして用いたときのＤＮＡポリメラーゼによ
る取り込み活性等により評価することができる。本発明
者らは図１に示される８種類の蛍光標識オリゴヌクレオ
チド（ＦＰ１〜ＦＰ８）について、これらの評価を行っ
た。その結果を表１に示す。
蛍光強度、二重鎖を形成したときの安定性（Ｔｍ値）、
プライマーとして用いたときのＤＮＡポリメラーゼによ
る取り込み活性等により評価することができる。本発明
者らは図１に示される８種類の蛍光標識オリゴヌクレオ
チド（ＦＰ１〜ＦＰ８）について、これらの評価を行っ
た。その結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
表 １
─────────────────────────────────
プライマー 蛍光強度 Ｔｍ（℃） 取り込み効率
(pmol/pmol)
─────────────────────────────────
ＦＰ１ １．００ ７４．４ ０．８９４
ＦＰ２ ０．９２ ７２．１ ０．７２８
ＦＰ３ １．６６ ７２．５ ０．６２５
ＦＰ４ １．４４ ７２．９ ０．８２９
ＦＰ５ １．７４ ７０．７ ０．６３０
ＦＰ６ １．０８ ６９．３ ０．６５９
ＦＰ７ １．５０ ６９．３ ０．５７７
ＦＰ８ １．４８ ６７．７ ０．４２３
──────────────────────────────────
【００１７】その結果、蛍光強度はフルオレセインを１
個導入したものより複数個導入したものの方が強いが、
フルオレセインを３個以上導入してもそれ以上強度は上
がらなかった。また、フルオレセインの導入位置により
強度に大きな違いが見られた。また、Ｔｍ値より、導入
したフルオレセインの数が多いほど、また同じ数の場合
は３′末端側に位置するほど二重鎖を形成したときの安
定性は悪かった。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる取り
込み活性はほぼＴｍ値に対応し、プライミング効率は二
重鎖の安定性に依存していた。以上より、蛍光物質の導
入位置と数が重要なファクターであり、５′末端に１個
とヌクレオチド間に１個導入したものが最適であると決
定した。
個導入したものより複数個導入したものの方が強いが、
フルオレセインを３個以上導入してもそれ以上強度は上
がらなかった。また、フルオレセインの導入位置により
強度に大きな違いが見られた。また、Ｔｍ値より、導入
したフルオレセインの数が多いほど、また同じ数の場合
は３′末端側に位置するほど二重鎖を形成したときの安
定性は悪かった。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる取り
込み活性はほぼＴｍ値に対応し、プライミング効率は二
重鎖の安定性に依存していた。以上より、蛍光物質の導
入位置と数が重要なファクターであり、５′末端に１個
とヌクレオチド間に１個導入したものが最適であると決
定した。
【００１８】更に、蛍光標識オリゴヌクレオチドをプラ
イマーとし、蛍光式シークエンサーを用いて実際にシー
クエンシングを行うことにより、蛍光標識オリゴヌクレ
オチドのプライマーとしての能力を詳しく調べることが
できる。シグナル強度と分離度を数値化するために、１
００塩基対ごとの１０分間（約１５ピークが存在する）
における輝度を平均し、その平均値からその間の最低輝
度を差引いた値を算出し、この値をもってシークエンシ
ングの結果の良否を評価することができる。すなわち、
シグナル強度が高くても各ピークの分離が悪いと最低ピ
ークが高くなり差引きの値が低くなるため、この値はシ
ークエンシングの結果の良否を数値化していると推定さ
れる。本発明者らは図１に示される８種類の蛍光標識オ
リゴヌクレオチド（ＦＰ１〜ＦＰ８）をプライマーとし
てシークエンシングを行い〔（図３）及び（図４）〕、
前述の値を算出した（図５）。すなわち、図３及び図４
は蛍光式シークエンサーによるシークエンシングの結果
を表す図であり、図３は２０５分以下の部分、図４は３
００分以上の部分について表した図である。また、図５
は相対蛍光強度を縦軸に、塩基数を横軸にとったグラフ
である。
イマーとし、蛍光式シークエンサーを用いて実際にシー
クエンシングを行うことにより、蛍光標識オリゴヌクレ
オチドのプライマーとしての能力を詳しく調べることが
できる。シグナル強度と分離度を数値化するために、１
００塩基対ごとの１０分間（約１５ピークが存在する）
における輝度を平均し、その平均値からその間の最低輝
度を差引いた値を算出し、この値をもってシークエンシ
ングの結果の良否を評価することができる。すなわち、
シグナル強度が高くても各ピークの分離が悪いと最低ピ
ークが高くなり差引きの値が低くなるため、この値はシ
ークエンシングの結果の良否を数値化していると推定さ
れる。本発明者らは図１に示される８種類の蛍光標識オ
リゴヌクレオチド（ＦＰ１〜ＦＰ８）をプライマーとし
てシークエンシングを行い〔（図３）及び（図４）〕、
前述の値を算出した（図５）。すなわち、図３及び図４
は蛍光式シークエンサーによるシークエンシングの結果
を表す図であり、図３は２０５分以下の部分、図４は３
００分以上の部分について表した図である。また、図５
は相対蛍光強度を縦軸に、塩基数を横軸にとったグラフ
である。
【００１９】その結果、フルオレセインを１個導入した
ＦＰ１、ＦＰ２に比べて、５′末端に１個とヌクレオチ
ド間に１個導入したＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５で良い結果
が得られ、特に、ＦＰ３、ＦＰ４では７００塩基長程度
まで高感度、高精度を有していた。しかし、フルオレセ
インの数は２個でもヌクレオチド間に２個導入したＦＰ
６では良い結果は得られなかった。また、フルオレセイ
ンの数を３個以上にしたＦＰ７、ＦＰ８では期待された
感度・精度は得られず、逆にバックグラウンドが高くな
り、結果は悪かった。これらの結果は表１に示した前述
の結果とよく対応しており、すなわち、蛍光標識プライ
マーとしては、５′末端に１個とヌクレオチド間に１個
の蛍光物質を導入したオリゴヌクレオチドが最適である
ことがわかった。
ＦＰ１、ＦＰ２に比べて、５′末端に１個とヌクレオチ
ド間に１個導入したＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５で良い結果
が得られ、特に、ＦＰ３、ＦＰ４では７００塩基長程度
まで高感度、高精度を有していた。しかし、フルオレセ
インの数は２個でもヌクレオチド間に２個導入したＦＰ
６では良い結果は得られなかった。また、フルオレセイ
ンの数を３個以上にしたＦＰ７、ＦＰ８では期待された
感度・精度は得られず、逆にバックグラウンドが高くな
り、結果は悪かった。これらの結果は表１に示した前述
の結果とよく対応しており、すなわち、蛍光標識プライ
マーとしては、５′末端に１個とヌクレオチド間に１個
の蛍光物質を導入したオリゴヌクレオチドが最適である
ことがわかった。
【００２０】また、本発明の方法に使用する蛍光標識プ
ライマーを含有するキットを作製することにより、塩基
配列決定を容易に行うことができる。なお、キットには
他の試薬類を含めてもよく、キットに含める試薬として
は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン
酸（ｄＮＴＰ）、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄ
ｄＮＴＰ）、反応用緩衝液等が挙げられる。キットに含
めるＤＮＡポリメラーゼとしては、クレノウフラグメン
ト、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、タック（Taq)ＤＮＡポリ
メラーゼ、ブカベスト(BcaBESTTM) ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社）等が挙げられる。なお、キットに含める試
薬の形状は溶液でもよいし凍結乾燥物でもよい。
ライマーを含有するキットを作製することにより、塩基
配列決定を容易に行うことができる。なお、キットには
他の試薬類を含めてもよく、キットに含める試薬として
は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン
酸（ｄＮＴＰ）、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄ
ｄＮＴＰ）、反応用緩衝液等が挙げられる。キットに含
めるＤＮＡポリメラーゼとしては、クレノウフラグメン
ト、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、タック（Taq)ＤＮＡポリ
メラーゼ、ブカベスト(BcaBESTTM) ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社）等が挙げられる。なお、キットに含める試
薬の形状は溶液でもよいし凍結乾燥物でもよい。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】実施例１
(1) 蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡシンセサイザー３
８０Ｂ型（アプライドバイオシステムズ社）を用い、亜
リン酸アミダイト法にて行った。５′末端にリンカーア
ームを導入する試薬としてアミノリンク２（アプライド
バイオシステムズ社）を、ヌクレオチド間にリンカーア
ームを導入する試薬としてアミノモディファイアーII
（クローンテック社）を用いた。脱保護した合成未精物
を減圧乾固させ、８０μｌの１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ／Ｎａ
2 ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．５）、１６０μｌの滅菌水、
１６０μｌのＦＩＴＣ溶液〔ＦＩＴＣ５mgを５００μｌ
の２０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド溶液に溶かしたもの〕
を加えてよく溶解させ、遮光しながら室温で一晩静置し
た。セファデクスＧ５０で未反応のＦＩＴＣを除去した
後、逆相ＨＰＬＣで目的物を分取し、図１に示すＦＰ１
〜ＦＰ８及び図２に示すＦＰＲ１〜ＦＰＲ８を作製し
た。
８０Ｂ型（アプライドバイオシステムズ社）を用い、亜
リン酸アミダイト法にて行った。５′末端にリンカーア
ームを導入する試薬としてアミノリンク２（アプライド
バイオシステムズ社）を、ヌクレオチド間にリンカーア
ームを導入する試薬としてアミノモディファイアーII
（クローンテック社）を用いた。脱保護した合成未精物
を減圧乾固させ、８０μｌの１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ／Ｎａ
2 ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．５）、１６０μｌの滅菌水、
１６０μｌのＦＩＴＣ溶液〔ＦＩＴＣ５mgを５００μｌ
の２０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド溶液に溶かしたもの〕
を加えてよく溶解させ、遮光しながら室温で一晩静置し
た。セファデクスＧ５０で未反応のＦＩＴＣを除去した
後、逆相ＨＰＬＣで目的物を分取し、図１に示すＦＰ１
〜ＦＰ８及び図２に示すＦＰＲ１〜ＦＰＲ８を作製し
た。
【００２３】(2) 導入した蛍光物質の数の確認
実施例１−(1) で合成した蛍光標識オリゴヌクレオチド
を２０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）、０．１mM Ｚ
ｎＣｌ2 の１００μｌに溶解し、０．６５ユニットのヌ
クレアーゼＰ１を加え、５０℃で２時間反応を行い、モ
ノヌクレオチドにまで分解した。次にそれらの蛍光強度
を励起波長４９４nmにてスペクトロフルオロホトメータ
ーＲＦ−５４０（島津製作所）を用いて測定し、結合し
ているフルオレセインの数を確認した。
を２０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）、０．１mM Ｚ
ｎＣｌ2 の１００μｌに溶解し、０．６５ユニットのヌ
クレアーゼＰ１を加え、５０℃で２時間反応を行い、モ
ノヌクレオチドにまで分解した。次にそれらの蛍光強度
を励起波長４９４nmにてスペクトロフルオロホトメータ
ーＲＦ−５４０（島津製作所）を用いて測定し、結合し
ているフルオレセインの数を確認した。
【００２４】実施例２
(1) 蛍光強度の測定
各蛍光標識オリゴヌクレオチド１．３pmolを２．７mlの
ＴＥ緩衝液〔１０mMトリス(Tris)−ＨＣｌ、１mM ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８．０〕に溶解し、実施例１−(2)と同様に
して蛍光強度を測定した。ＦＰ１の蛍光強度を１とした
ときの各蛍光標識オリゴヌクレオチドの相対強度を算出
した（表１）。
ＴＥ緩衝液〔１０mMトリス(Tris)−ＨＣｌ、１mM ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８．０〕に溶解し、実施例１−(2)と同様に
して蛍光強度を測定した。ＦＰ１の蛍光強度を１とした
ときの各蛍光標識オリゴヌクレオチドの相対強度を算出
した（表１）。
【００２５】(2) 二重鎖融解温度の測定
各蛍光標識オリゴヌクレオチドの配列に、相補的なオリ
ゴヌクレオチドを合成し、それぞれ０．２ＯＤユニット
ずつを混合しアニーリングを行った。Ｔｍアクセサリー
付分光光度計ＵＶ２１００スペクトロホトメーター（島
津製作所）を用いて、温度を上昇させながら２６０nmの
吸光度を記録した。このＵＶ吸収の温度依存曲線からＴ
ｍ値を求めることにより、各蛍光標識オリゴヌクレオチ
ドの二重鎖としての安定性を比較した（表１）。
ゴヌクレオチドを合成し、それぞれ０．２ＯＤユニット
ずつを混合しアニーリングを行った。Ｔｍアクセサリー
付分光光度計ＵＶ２１００スペクトロホトメーター（島
津製作所）を用いて、温度を上昇させながら２６０nmの
吸光度を記録した。このＵＶ吸収の温度依存曲線からＴ
ｍ値を求めることにより、各蛍光標識オリゴヌクレオチ
ドの二重鎖としての安定性を比較した（表１）。
【００２６】(3) ＤＮＡポリメラーゼによるｄＮＴＰの
取り込み 各蛍光標識オリゴヌクレオチド０．２pmolをそれぞれ
０．４pmolのM13mp19ssDNA（宝酒造社）とアニーリング
させ、５０μｌの２５mM ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ
９．３）、２mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＫＣｌ、１mM
ＤＴＴ、０．２mMｄＡＴＰ、０．２mM ｄＧＴＰ、０．
２mM ｄＴＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、０．０６μＭ
〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰを含む溶液中で０．３ユニットの
タックポリメラーゼを加えて７２℃で２０分反応させ
た。取り込まれた放射活性はＤＥ８１フィルター上でリ
ン酸不溶性画分として液体シンチレーションカウンター
で測定した。鋳型ＤＮＡ１pmol当りの合成されたＤＮＡ
量を算出した（表１）。
取り込み 各蛍光標識オリゴヌクレオチド０．２pmolをそれぞれ
０．４pmolのM13mp19ssDNA（宝酒造社）とアニーリング
させ、５０μｌの２５mM ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ
９．３）、２mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＫＣｌ、１mM
ＤＴＴ、０．２mMｄＡＴＰ、０．２mM ｄＧＴＰ、０．
２mM ｄＴＴＰ、０．１mM ｄＣＴＰ、０．０６μＭ
〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰを含む溶液中で０．３ユニットの
タックポリメラーゼを加えて７２℃で２０分反応させ
た。取り込まれた放射活性はＤＥ８１フィルター上でリ
ン酸不溶性画分として液体シンチレーションカウンター
で測定した。鋳型ＤＮＡ１pmol当りの合成されたＤＮＡ
量を算出した（表１）。
【００２７】(4) ＤＮＡシークエンシング
各蛍光標識オリゴヌクレオチド１pmolを用い、M13mp18s
sDNA（宝酒造社）１．４μｇを鋳型としてジデオキシ反
応を行った。反応にはアンプリタックシークエンシング
キット（日立蛍光式シーケンサ専用）（宝酒造社）を用
いた。反応生成物の解析には蛍光式ＤＮＡシーケンサＳ
Ｑ３０００（日立製作所）を用いた。１００塩基対ごと
の１０分間における輝度を平均し、その平均値よりその
間の最低輝度を差引いた値を算出した（図３、図４、図
５）。
sDNA（宝酒造社）１．４μｇを鋳型としてジデオキシ反
応を行った。反応にはアンプリタックシークエンシング
キット（日立蛍光式シーケンサ専用）（宝酒造社）を用
いた。反応生成物の解析には蛍光式ＤＮＡシーケンサＳ
Ｑ３０００（日立製作所）を用いた。１００塩基対ごと
の１０分間における輝度を平均し、その平均値よりその
間の最低輝度を差引いた値を算出した（図３、図４、図
５）。
【００２８】実施例３ キットの構築
蛍光標識プライマーＦＰ４に、ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混
合液（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種）、ブカベストＤＮＡポリ
メラーゼ、１０×反応用緩衝液〔２００mMトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．５）、１０mM ＭｇＣｌ2 〕、M13mp18ssD
NA、ストップソルーション（９５％ホルムアミド、２０
mM ＥＤＴＡ、０．０５％メチルバイオレット）を組合
せ、塩基配列決定用キット（６０回分）を構築した（表
２）。
合液（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４種）、ブカベストＤＮＡポリ
メラーゼ、１０×反応用緩衝液〔２００mMトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．５）、１０mM ＭｇＣｌ2 〕、M13mp18ssD
NA、ストップソルーション（９５％ホルムアミド、２０
mM ＥＤＴＡ、０．０５％メチルバイオレット）を組合
せ、塩基配列決定用キット（６０回分）を構築した（表
２）。
【００２９】
【表２】
表 ２
───────────────────────────────────
ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合液 ４種類 各 １２０μｌ
ブカベストＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ） ６０μｌ
プライマーＦＰ４溶液（１pmol／μｌ） ６０μｌ
１０×反応用緩衝液 １００μｌ
M13mp18ssDNA（０．２μｇ／μｌ） ２０μｌ
ストップソルーション ９００μｌ
───────────────────────────────────
【００３０】
【発明の効果】本発明により、シグナル強度の高い蛍光
標識プライマーを用いた高感度かつ高精度な核酸の塩基
配列決定方法及び該方法に使用するキットが提供され
た。
標識プライマーを用いた高感度かつ高精度な核酸の塩基
配列決定方法及び該方法に使用するキットが提供され
た。
配列番号：１
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGTTTTCCCA GTCACGACGT TGTA 24
配列番号：２
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GAGGGTTTTC CCAGTCACGA CGTT 24
配列番号：３
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGT 24
配列番号：４
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
配列番号：５
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTTCACACAG GAAACAGCTA TGAC 24
配列番号：６
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGG 24
配列番号：７
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TATGTTGTGT GGAATTGTGA GCGG 24
配列番号：８
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GCGCGCAATT AACCCTCACT AAAG 24
配列番号：９
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
AACGCGTAAT ACGACTCACT ATAG 24
配列番号：10
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CATACGATTT AGGTGACACT ATAG 24
【図１】蛍光標識オリゴヌクレオチドＦＰ１〜ＦＰ８を
表す図である。
表す図である。
【図２】蛍光標識オリゴヌクレオチドＦＰＲ１〜ＦＰＲ
８を表す図である。
８を表す図である。
【図３】蛍光式シークエンサーでシークエンシングを行
った結果の２０５分以下の部分を表す図である。
った結果の２０５分以下の部分を表す図である。
【図４】蛍光式シークエンサーでシークエンシングを行
った結果の３００分以上の部分を表す図である。
った結果の３００分以上の部分を表す図である。
【図５】相対蛍光強度と塩基数の関係を表す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 加藤 郁之進
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(56)参考文献 国際公開91／17169（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/90
Claims (3)
- 【請求項１】 ジデオキシ法による核酸の塩基配列決定
方法において、５′末端及び該５′末端から４〜１２個
の塩基を隔てた位置のヌクレオチド間にそれぞれ１分子
の蛍光物質を結合させたオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いることを特徴とする核酸の塩基配列決定方
法。 - 【請求項２】 ジデオキシ法による核酸の塩基配列決定
に使用されるプライマーであって、５′末端及び該５′
末端から４〜１２個の塩基を隔てた位置のヌクレオチド
間にそれぞれ１分子の蛍光物質を結合させたオリゴヌク
レオチドプライマー。 - 【請求項３】 請求項１記載の方法で核酸の塩基配列
決定を行うためのキットであって、請求項２記載のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とする核酸
の塩基配列決定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30324892A JP3379774B2 (ja) | 1992-10-16 | 1992-10-16 | 塩基配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30324892A JP3379774B2 (ja) | 1992-10-16 | 1992-10-16 | 塩基配列決定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06125798A JPH06125798A (ja) | 1994-05-10 |
| JP3379774B2 true JP3379774B2 (ja) | 2003-02-24 |
Family
ID=17918666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30324892A Expired - Fee Related JP3379774B2 (ja) | 1992-10-16 | 1992-10-16 | 塩基配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3379774B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI316964B (ja) * | 2000-10-30 | 2009-11-11 | Takara Bio Inc | |
| US20040054160A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-18 | Santona Pal | Nucleic-acid ink compositions for arraying onto a solid support |
-
1992
- 1992-10-16 JP JP30324892A patent/JP3379774B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06125798A (ja) | 1994-05-10 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |