JP3007120B2 - Monoclonal antibody against reverse transcriptase of human immunodeficiency virus, its production method and its antibody producing strain - Google Patents
Monoclonal antibody against reverse transcriptase of human immunodeficiency virus, its production method and its antibody producing strainInfo
- Publication number
- JP3007120B2 JP3007120B2 JP2187100A JP18710090A JP3007120B2 JP 3007120 B2 JP3007120 B2 JP 3007120B2 JP 2187100 A JP2187100 A JP 2187100A JP 18710090 A JP18710090 A JP 18710090A JP 3007120 B2 JP3007120 B2 JP 3007120B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hiv
- monoclonal antibody
- antibody
- culture
- hybridoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、AIDS(後天性免疫不全症候群)の原因と考
えられているヒト免疫不全ウイルス(以下、HIVと略
す。)の逆転写酵素(RTと略す。)に対するモノクロー
ナル抗体の製法に関するものである。The present invention relates to a reverse transcriptase of human immunodeficiency virus (hereinafter abbreviated as HIV), which is considered to be a cause of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). RT) (abbreviated as RT).
従来、種々の抗体がAIDSの診断またはHIVの基礎研究
のために利用されてきている。Conventionally, various antibodies have been used for diagnosis of AIDS or basic research of HIV.
これまでの研究から、HIVがヒトに感染するために
は、HIV遺伝子のpol領域の遺伝子産物(例えば、逆転写
酵素領域、プロテアーゼ領域、エンドヌクレアーゼ領域
などの各遺伝子産物など。)が必須であると考えられて
いる。From previous studies, in order for HIV to infect humans, gene products of the pol region of the HIV gene (eg, each gene product such as a reverse transcriptase region, a protease region, and an endonuclease region) are essential. It is believed that.
そして、これらの遺伝子産物のうちのRTに関しては、
RTの酵素活性を阻害するポリクローナル抗体の量が、AI
DSの病期が進行するにつれて減少又は消失することが示
されている〔Laurence,J.、Saunders,A.and Kulkosky,
J.:Science,256,1501〜1504(1987)、Sano,K.et al.:
J.Clin.Microbiol.25,2415〜2417(1987)〕。And, regarding RT of these gene products,
The amount of polyclonal antibody that inhibits the enzyme activity of RT
It has been shown to decrease or disappear as the stage of DS progresses (Laurence, J., Saunders, A. and Kulkosky,
J .: Science, 256 , 1501-1504 (1987), Sano, K. et al .:
J. Clin. Microbiol. 25 , 2415-2417 (1987)].
従って、従来知られていないRTに対して反応性を有
し、かつそのRT活性を阻害することができるモノクロー
ナル抗体を作製することは、AIDSの病態を把握する上で
非常に重要な意義を有するものである。Therefore, to produce a monoclonal antibody that has reactivity to a conventionally unknown RT and can inhibit the RT activity has a very important significance in grasping the pathology of AIDS. Things.
本発明の目的は、HIVのRTに対して反応性を有し、か
つそのRT活性を阻害することができるモノクローナル抗
体の製法を提供することである。An object of the present invention is to provide a method for producing a monoclonal antibody having reactivity to HIV RT and capable of inhibiting its RT activity.
本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研
究した結果、HIVのRTを発現できるワクシニアウイルス
をマウスに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球と
マウスミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリド
ーマ株を培養することによって、HIVのRTに対して反応
性を有し、かつそのRT活性を阻害することができるモノ
クローナル抗体を得ることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, immunized mice with a vaccinia virus capable of expressing HIV RT, and fused lymphocytes obtained from the mice with mouse myeloma cells. By culturing the hybridoma strain obtained in this manner, it has been found that a monoclonal antibody having reactivity to HIV RT and capable of inhibiting the RT activity can be obtained, and to complete the present invention. Reached.
即ち、本発明は、 (1)HIVのRTであるp66及びそのプロセッシングにより
形成されたp51のいずれとも反応性を有し、かつそのRT
阻害活性を有するモノクローナル抗体。That is, the present invention relates to (1) both reactive with p66, which is an RT of HIV, and p51 formed by processing thereof, and
A monoclonal antibody having inhibitory activity.
(2)HIVのRTを発現できるワクシニアウイルスをマウ
スに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球とマウス
ミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドーマ株
を培養することを特徴とする前記記載のモノクローナル
抗体の製法 (3)上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ株 に関するものである。(2) The method as described above, wherein a mouse is immunized with a vaccinia virus capable of expressing RT of HIV, and a hybridoma strain obtained by fusing lymphocytes obtained from the mouse with mouse myeloma cells is cultured. Method for producing monoclonal antibody (3) The present invention relates to a hybridoma strain producing the above monoclonal antibody.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明のモノクローナル抗体は、HIV(例えば、HIV−
1、HIV−2などを挙げることができるが、好ましくはH
IV−1がよい。)のRTに対して反応性を有し、かつその
RT活性を阻害することができるモノクローナル抗体であ
る。そして、そのようなモノクローナル抗体は、HIVのR
Tを発現できるワクシニアウイルスを免疫原としてマウ
スに免疫し、そのマウスから得られたリンパ球とマウス
ミエローマ細胞とを融合することによって得られたハイ
ブリドーマ株を培養することによって製造することがで
きる。The monoclonal antibody of the present invention comprises HIV (for example, HIV-
1, HIV-2, etc., but preferably H
IV-1 is preferred. ) Is reactive to RT and
It is a monoclonal antibody that can inhibit RT activity. And such a monoclonal antibody, HIV R
It can be produced by immunizing a mouse with a vaccinia virus capable of expressing T as an immunogen, and culturing a hybridoma strain obtained by fusing lymphocytes obtained from the mouse with mouse myeloma cells.
本発明におけるマウスの免疫原としては、HIVのRTを
発現できるワクシニアウイルスを免疫原として用いる場
合には、例えば、HIVのRTを発現する組換えワクシニア
ウイルスなどを挙げることができる。When a vaccinia virus capable of expressing HIV RT is used as an immunogen as the mouse immunogen in the present invention, for example, a recombinant vaccinia virus expressing HIV RT can be mentioned.
本発明のモノクローナル抗体は、HIVのRTである約65K
の蛋白質及びそのプロセシングによって形成される約51
Kの蛋白質のいずれに対しても反応性を有し、かつそのR
T活性を阻害することができるが、HIVのRTを発現しない
大腸菌の抽出液(大腸菌を超音波で破砕し、遠心して得
られた上清)とは反応性が認められないものである。The monoclonal antibody of the present invention has an HIV RT of about 65K.
Protein and about 51 formed by its processing
It is reactive with any of the K proteins and its R
An extract of Escherichia coli that can inhibit T activity but does not express HIV RT (supernatant obtained by crushing Escherichia coli with ultrasonic waves and centrifuging) has no reactivity.
そのような特徴を有するモノクローナル抗体は、HIV
のRTを発現できるワクシニアウイルスを免疫原として用
いて作製したハイブリドーマ株〔例えば、7C4株(微工
研条寄第3012号)など〕などを培養することによって産
生することができる。そして、そのようにして得られた
本発明のモノクローナル抗体のRT活性を阻害する程度
は、例えば、Jeffrey Laurenceらの方法〔Science:235,
1501〜1504(1987)〕、Anthony D.Hoffmanらの方法〔V
irology:147,326〜335(1985)〕に準じた測定では、50
%以上の阻害活性を示すものである。Monoclonal antibodies having such characteristics are known as HIV
Can be produced by culturing a hybridoma strain (for example, 7C4 strain (Microtechnical Research Laboratories No. 3012) or the like) prepared using a vaccinia virus capable of expressing RT as an immunogen. The degree of inhibiting the RT activity of the thus obtained monoclonal antibody of the present invention is determined, for example, by the method of Jeffrey Laurence et al. [Science: 235 ,
1501-1504 (1987)], the method of Anthony D. Hoffman et al. [V
irology: 147 , 326-335 (1985)].
% Or more.
このようなハイブリドーマの作製は、例えば、Milste
in & Khlerの方法〔Nature,256,495(1976)〕に準
じて行うことができる。そのようなハイブリドーマ株の
好ましい作製方法について、概略を以下順次説明する。Such hybridomas are produced, for example, by Milste
It can be performed according to the method of in & Khler [Nature, 256 , 495 (1976)]. An outline of a preferred method for producing such a hybridoma strain will be described below in order.
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の作製 (i)免疫動物リンパ球の調製 マウスへの免疫方法は、HIVのRT領域をコードする遺
伝子を挿入したワクシニアウイルス〔例えば、1〜5×
108PFU/ml含む緩衝液(例えば、MEMなどの培地成分を含
む溶液など)〕又は形質転換菌から分離されたHIVのRT
〔例えば、大腸菌に発現させて得られたレコンビナント
RTなどを10〜800μg/ml含む緩衝液(例えば、MEMなどの
培地成分を含む溶液など)〕を免疫原として、10〜500
μでマウスに1回または数週間隔で数回投与すること
で行うことができる。Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Hybridoma Strain (i) Preparation of Lymphocytes from Immunized Animals The method of immunizing mice was performed by vaccinia virus inserted with a gene encoding the RT region of HIV [for example, 1 to 5 ×
Buffer containing 10 8 PFU / ml (for example, a solution containing a medium component such as MEM)] or RT of HIV isolated from transformed bacteria
[For example, a recombinant obtained by expressing in Escherichia coli
A buffer solution containing 10 to 800 μg / ml of RT or the like (for example, a solution containing a medium component such as MEM)] as an immunogen,
It can be performed by administering once or several times to mice at μ intervals.
リンパ球は、その免疫マウスの充分な抗体価を確認
後、最終免疫から数日後の、血液、リンパ節、脾臓など
から得ることができるが、脾臓から得た方が好きまし
い。Lymphocytes can be obtained from blood, lymph nodes, spleen, etc. several days after the final immunization after confirming a sufficient antibody titer of the immunized mouse, but it is preferable to obtain them from the spleen.
(ii)ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、マウス由来のMPC−11、P3−X63−Ag8
・653(653)、P3−X63−Ag8−U1(P3U1)、P3−NS−1
(NS−1)、SP2/0−Ag14(SP2/0)など、およびラット
由来の210.RC Y3.Ag1.2.3(Y3)などのエミローマ細胞
を用いることができるが、653、P3U1、NS−1、SP2/0な
どの細胞外に抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用
いた方が好ましい。(Ii) Preparation of myeloma cells For cell fusion, mouse-derived MPC-11, P3-X63-Ag8
・ 653 (653), P3-X63-Ag8-U1 (P3U1), P3-NS-1
(NS-1), SP2 / 0-Ag14 (SP2 / 0) and the like, and rat-derived Emiroma cells such as 210.RC Y3.Ag1.2.3 (Y3) can be used, but 653, P3U1, NS- 1, It is preferable to use myeloma cells that do not produce and secrete antibodies outside the cell, such as SP2 / 0.
(iii)細胞融合 細胞融合は、前記のようにして免疫されたマウスのリ
ンパ球とミエローマ細胞との細胞数を(5〜20):1の割
合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例え
ば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分(IMDM、
MEM、DMEM、McCoy、RPMI1640などの培地成分)溶液、等
張緩衝液などを用いて良く混合し、遠心分離した後のペ
レット(細胞塊)に、HVJ(センダイウイルス)またはP
EG(ポリエチレングリコール)溶液を添加することによ
って行うことができるが、好ましくはPEG溶液を用いる
のがよく、さらに好ましくは平均分子量が1000〜8000で
30〜60重量%のPEG溶液を用いるのがよい。この時、細
胞融合を促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホ
キシド、ポリ−L−アルギニンなどを添加することもで
きる。(Iii) Cell fusion Cell fusion is a cell suspension that does not interfere with cell fusion by increasing the cell number between lymphocytes and myeloma cells of the mouse immunized as described above at a ratio of (5-20): 1. Solutions, for example, commonly used media components for lymphocyte culture (IMDM,
Mix well using MEM, DMEM, McCoy, RPMI1640, etc.) solution, isotonic buffer, etc., and centrifuge the pellet (cell mass) with HVJ (Sendai virus) or P
It can be carried out by adding an EG (polyethylene glycol) solution, preferably a PEG solution, more preferably an average molecular weight of 1,000 to 8,000.
It is preferred to use a 30-60% by weight PEG solution. At this time, colchicine, dimethyl sulfoxide, poly-L-arginine and the like can be added to promote cell fusion.
細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫され
た動物と異種の動物由来のものを使用することもできる
が、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
の抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された
動物とは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さら
に好ましくは同系のものを用いた方がよい。As the myeloma cells used for cell fusion, those derived from an animal different from the immunized animal can be used.However, in view of the amount of antibody production and the stability of the obtained monoclonal antibody-producing hybridoma strain, It is better to use the same type of myeloma cells as the animal, and more preferably to use the same type of myeloma cells.
(iv)ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞を
HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有した培地。この培地成分として
は一般に用いられるリンパ球培養用培地成分を用いるこ
とができる)で培養して行うことができる。(Iv) Selection of hybridoma Selection of hybridoma involves selection of cells after cell fusion.
The culture can be carried out by culturing in a HAT medium (a medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine, fetal bovine serum, and a commonly used medium component for lymphocyte culture).
ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル
(培養ウエル)に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個
数を入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物
質またはそれを産生する細胞(例えば、胸腺、脾臓、リ
ンパ節由来のリンパ球など)をフィーダー細胞として必
要に応じて使用することができるし、あるいはIL−6を
含むリンパ球培養用培地などを使用することもできる。Hybridomas are cultured by adding the number of cells suitable for searching for antibody-producing wells to each well (culture well) of a culture plate. At this time, a hybridoma growth-promoting substance or cells producing the same (eg, thymus, spleen) , Lymph node-derived lymphocytes, etc.) can be used as feeder cells, if necessary, or a lymphocyte culture medium containing IL-6 can be used.
HAT培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、HT培地(ヒポキサンチン、チミジン、ウシ胎
児血清を含有した培地、この培地成分としては一般に用
いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができ
る)で数日間培養し、さらに、一般的に用いられるウシ
胎児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。Hybridomas selected by growing in HAT medium are HT medium (medium containing hypoxanthine, thymidine, fetal calf serum, commonly used as a medium component) until the number of cells suitable for searching antibody production wells is reached. The culture medium can be used for several days, and further cultured in a generally used lymphocyte culture medium containing fetal bovine serum.
(v)抗体産生ハイブリドーマの選択 前記(iv)で得られたハイブリドーマが、目的とする
抗体を産生しているか否かの検定は、例えば、LEISA法
(酵素免疫測定法)、免疫ブロッティング法、プラーク
形成法、凝集反応法、RIA(ラジオアイソトープを用い
た方法)、間接蛍光抗体法(IFA)などで抗体産生ウェ
ルを検索し、さらに、その抗体がHIVのRT活性を阻害す
るか否を検討することによって行うことができるが、検
定数が非常に多い場合の抗体産生ウェルの検索では、先
ずELISA法で探索するのが好ましい。(V) Selection of antibody-producing hybridoma The assay for determining whether the hybridoma obtained in the above (iv) is producing the desired antibody is performed by, for example, LEISA (enzyme-linked immunosorbent assay), immunoblotting, plaque Search antibody-producing wells by the formation method, agglutination method, RIA (radioisotope-based method), indirect fluorescent antibody method (IFA), etc., and examine whether the antibody inhibits HIV RT activity However, in the case of searching for antibody-producing wells when the number of assays is very large, it is preferable to first search by ELISA.
このELISA法は、以下のようにして行う。 This ELISA method is performed as follows.
HIVのRT〔例えば、HIVから分離されたRT、RTを生産し
た形質転換菌から分離されたRT(例えば、前記記載の大
腸菌RTなど)、RTの一部分を合成したペプチドなど〕を
固定化した(HIVのRTと反応性を有する抗体が存在して
いる場合には、その固定化を要する量は本ELAISAで抗体
の存在を確認できる程度の量でよい。)ELISAプレート
の各ウェル(測定ウェル)に、ハイブリドーマ培養上清
を加えて一定時間静置する。The RT of HIV (eg, RT isolated from HIV, RT isolated from a transformant that produced RT (eg, Escherichia coli RT described above), a peptide partially synthesized from RT, etc.) was immobilized ( When an antibody having reactivity with HIV RT is present, the amount required for immobilization may be such an amount that the presence of the antibody can be confirmed by this ELISA.) Each well (measurement well) of the ELISA plate , A hybridoma culture supernatant is added thereto, and the mixture is allowed to stand for a certain time.
そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合した動
物由来の抗体と反応して結合することができる酵素標識
抗体(標識に要いる酵素は、例えば、ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
などを挙げることができる。標識される抗体は、測定ウ
ェルに結合したハイブリドーマ培養上清由来の抗体だけ
と反応して結合することができる限り特に限定されず、
例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得られ
た血清、またはマウス細胞などを用いて作製されたハイ
ブリドーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げるこ
とができる。)をこれらの測定ウェルに加えて一定時間
静置する。An enzyme-labeled antibody capable of reacting with and binding to an animal-derived antibody bound to each of the washed measurement wells (enzymes required for labeling include, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, etc.) The antibody to be labeled is not particularly limited as long as it can react and bind only to the antibody derived from the hybridoma culture supernatant bound to the measurement well.
Examples thereof include serum obtained from mice, rats, rabbits, goats and the like, and monoclonal antibodies produced by hybridoma strains prepared using mouse cells and the like. ) Is added to these measurement wells and allowed to stand for a certain period of time.
次に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対
応した基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして、
酵素活性が認められれば、その培養上清をとった培養ウ
ェル中にHIVのRTとの反応性を有する抗体を産生するハ
イブリドーマが存在していたことがわかる。Next, these measurement wells are washed, and a substrate solution corresponding to the enzyme used is added to measure the enzyme activity. And
When the enzyme activity is observed, it is understood that a hybridoma producing an antibody having reactivity with HIV RT was present in the culture well in which the culture supernatant was taken.
HIVのRTとの反応性を有し、かつHIVのRTの活性を阻害
する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、Jeffrey
Laurenceらの方法〔Science:235,1501〜1504(198
7)〕、Anthony D.Hoffmanらの方法〔Virology:147,326
〜335(1985)〕に準じて、DNAへの〔3H〕Deoxythymidi
ne triphoshateの取り込み量を測定し、その取り込みを
阻害する培養ウェルを探索するすることによって知るこ
とができる。The search for hybridomas that are reactive with HIV RT and produce antibodies that inhibit HIV RT activity is described in Jeffrey
Laurence et al. [Science: 235 , 1501-1504 (198
7)], Anthony D.Hoffman et al's method [Virology: 147, 326
~ 335 (1985)], and [ 3 H] Deoxythymidi to DNA
It can be known by measuring the amount of uptake of ne triphoshate and searching for culture wells that inhibit the uptake.
このようにして、細胞増殖が認められ、HIVのRTに対
して反応性を有し、かつHIVのRT活性を阻害する抗体を
産生しているハイブリドーマを得ることができる。In this way, a hybridoma that has cell proliferation, is reactive with HIV RT, and produces an antibody that inhibits HIV RT activity can be obtained.
HIVのRTとの反応性を有する抗体を産生するハイブリ
ドーマが存在していたウェルについては、ELISAの他
に、さらにウエスタンブロッティング法によってHIVのR
Tとの反応性を再確認することが好ましい。For wells in which hybridomas producing antibodies reactive with HIV RT were present, in addition to ELISA, the HIV R was further analyzed by Western blotting.
It is preferred to reconfirm the reactivity with T.
(iv)ハイブリドーマの株化(クローニング) 抗体産生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマ
は、限界希釈法、シングル・セル・マニプレーション法
(倒立顕微鏡下、1ウェルに1個のハイブリドーマを入
れる方法)、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方
法、FACS(Fluorecent Activated Cell Sorter)を用い
た方法などでクローニングすることができる。この時、
前記のいずれかのクローニング方法によって(v)で見
出した抗体産生ハイブリドーマを培養し、その増殖が認
められた培養ウェルの上清を用い(v)の抗体産生ハイ
ブリドーマの選択で行ったELISA法と同様の方法で、抗
体産生ウェルを検索する。(Iv) Straining (cloning) of hybridomas Hybridomas in culture wells in which antibody production was observed were determined by limiting dilution, single-cell manipulation (a method in which one hybridoma was placed in one well under an inverted microscope). ), A method of picking up colonies using soft agar, or a method using FACS (Fluorecent Activated Cell Sorter). At this time,
The antibody-producing hybridoma found in (v) is cultured by any one of the above-mentioned cloning methods, and the supernatant is used in the culture well in which the proliferation was observed. The same as the ELISA method performed in the selection of the antibody-producing hybridoma in (v). The antibody production well is searched by the method described above.
このようにして、HIVに対して特異性が高く、かつHIV
のRT活性を阻害する抗体価が高いモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ株を選択することができる。In this way, it is highly specific for HIV and
A hybridoma strain that produces a monoclonal antibody having a high antibody titer that inhibits the RT activity of can be selected.
モノクローナル抗体の製法 HIVに対して特異性が高く、かつHIVのRT活性を阻害す
る抗体価が高いモノクローナル抗体の生産は、前記(v
i)で得たハイブリドーマ株をフラスコ内で培養した
り、または動物の腹腔内で培養することによって行うこ
とができる。Production of Monoclonal Antibody The production of a monoclonal antibody having a high specificity for HIV and a high antibody titer that inhibits the RT activity of HIV is described in (v.
It can be carried out by culturing the hybridoma strain obtained in i) in a flask or culturing intraperitoneally of an animal.
前記(vi)で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、0〜20%
ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養用
培地(例えば、IMDM、MEM、DMEM、McCoy、RPMI1640など
の培地成分を含む培地)で細胞濃度が上限に達するまで
培養することによって行うことができる。この時、該モ
ノクローナル抗体は、遠心操作で得た培養上清中に含ま
れている。The production of the monoclonal antibody in the culture of the hybridoma strain obtained in (vi) in a flask is, for example, 0 to 20%
This can be done by culturing cells in a commonly used lymphocyte culture medium containing fetal bovine serum (eg, a medium containing medium components such as IMDM, MEM, DMEM, McCoy, and RPMI1640) until the cell concentration reaches the upper limit. it can. At this time, the monoclonal antibody is contained in the culture supernatant obtained by centrifugation.
一方、前記(vi)で得たハイブリドーマ株の動物腹腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合に
用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行う
こともできるが、同種の動物を用いて行った方が好まし
く、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方がよ
い。On the other hand, the production of the monoclonal antibody in the intraperitoneal culture of the hybridoma strain obtained in the above (vi) can be performed using an animal different from the animal from which the cells used for cell fusion are derived. The method is preferably performed using an animal of the same type, and more preferably performed using an animal of the same type.
このような方法によりHIVのRTに対して特異性が高
く、かつHIVのRT活性を阻害する抗体価が高い該モノク
ローナル抗体の生産は、マウス、ラット、ハムスターな
どの適当な動物の腹腔内にこの動物の免疫能を低下させ
る物質、例えば、プリスタンなどの鉱物油を投与し、数
週間後に5×105〜107個の前記(vi)で得たハイブリド
ーマ株細胞を投与し、その腹腔内にこの株細胞を数週間
で高密度に増殖させることによって行うことができる。
この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で得た腹水
上清中に含まれている。そして、その抗体濃度は、フラ
スコ内培養で得た時の培養上清の抗体濃度の10〜1000倍
である。By such a method, the production of the monoclonal antibody having a high specificity for HIV RT and a high antibody titer that inhibits HIV RT activity can be performed intraperitoneally in a suitable animal such as a mouse, rat, or hamster. A substance that reduces the immunity of the animal, for example, a mineral oil such as pristane, is administered, and several weeks later, 5 × 10 5 to 10 7 hybridoma cell lines obtained in the above (vi) are administered, and the peritoneal cavity is intraperitoneally administered. This can be done by growing this cell line in high density in a few weeks.
At this time, the monoclonal antibody is contained in the ascites supernatant obtained by centrifugation. The antibody concentration is 10 to 1000 times the antibody concentration of the culture supernatant obtained by culturing in the flask.
ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での
培養で得られた該モノクローナル抗体は、蛋白質の一般
的な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを行うことによって精製され、高純度のモノクロー
ナル抗体となる。The monoclonal antibody obtained by culturing the hybridoma strain in a flask or in the animal intraperitoneal cavity is subjected to salting out, dialysis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., which are applied to a general method for purifying proteins. To obtain a high-purity monoclonal antibody.
前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、HIV
のRTに対して高い特異的な反応性を有し(HIVのRTであ
る約65Kの蛋白質及びそのプロセシングによって形成さ
れる約51Kの蛋白質のいずれに対しても高い特異的な反
応性を有す)、かつHIVのRT活性を阻害するが、HIVのRT
を発現しない大腸菌の抽出液(大腸菌を超音波で破砕
し、遠心して得られた上清)とは反応しないものであ
る。The monoclonal antibody obtained as described above is used for HIV.
Highly specific reactivity to RT of HIV (High specific reactivity to both about 65K of HIV RT protein and about 51K of protein formed by its processing) ) And inhibits HIV RT activity, but HIV RT
Does not react with an E. coli extract (supernatant obtained by crushing E. coli with ultrasonic waves and centrifuging) that does not express the E. coli.
以下、本発明を参考例及び実施例によって具体的に説
明する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定
するものではない。Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference examples and examples. Note that these examples do not limit the scope of the present invention.
参考例1 〔HIVのRTを発現する形質転換ワクシニアウイルス(WRR
T)及び形質転換菌(E.C.RT)の作製〕 単層培養したウサギ腎臓細胞株(RK13)にWRRTを接種
し(m.o.i.:1PFU/cell以上)、2日間培養後に細胞を回
収し、これをMEM(1%牛胎児血清含有)に懸濁し、3
回凍結・融解した後に超音波破砕し、遠心分離(1500
G、10分間)することによって免疫原である上清を得
た。HIV−1ゲノムを含むプラスミドクローンpBH10〔Ra
ttnerら:AIDS Res.Hum.Retro.3,57−69(1987)〕と下
記の2本の合成DNA断片 を用い、Flexnerらの方法〔Virology 166,339〜349(19
88)〕によってHIV−1のRTドメインDNA断片1.68Kbを調
製した。Reference Example 1 [Transformed vaccinia virus expressing WRT of HIV (WRR
T) and Preparation of Transformed Bacteria (ECRT)] A rabbit kidney cell line (RK13) cultured in a monolayer was inoculated with WRRT (moi: 1 PFU / cell or more), cultured for 2 days, and the cells were collected. Suspended in 1% fetal calf serum)
After thawing and thawing multiple times, sonicate and centrifuge (1500
G, 10 minutes) to obtain an immunogen supernatant. Plasmid clone pBH10 containing the HIV-1 genome [Ra
TTNER et al .: AIDS Res. Hum. Retro. 3 , 57-69 (1987)] and the following two synthetic DNA fragments: Using the method of Flexner et al. [Virology 166 , 339-349 (19)
88)] to prepare 1.68 Kb of an HIV-1 RT domain DNA fragment.
この断片を、前記Flexnerらの方法によってワクシニ
アウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子中に導入した
組換えワクシニアウイルス(WRRT)を作製した。This fragment was introduced into the vaccinia virus thymidine kinase (TK) gene by the method of Flexner et al. To produce a recombinant vaccinia virus (WRRT).
また、前記HIV−1のRTドメインDNA断片を、大腸菌発
現プラスミドpKK223−3(ファルマシア社製)のEcoR I
部位に挿入したプラスミドpKKRTを作製し、このプラス
ミドを持った形質転換大腸菌をE.C.RTと命名した。The HIV-1 RT domain DNA fragment was ligated to the EcoRI I plasmid of Escherichia coli expression plasmid pKK223-3 (Pharmacia).
A plasmid pKKRT inserted into the site was prepared, and the transformed Escherichia coli having this plasmid was named ECRT.
参考例2 〔ELISA用抗原の調製〕 参考例1の形質転換大腸菌(E.C.RT)を250mlのLB倍
地(10g/ トリプトン、5g/ 酵母エキス、10g/
NaCl、100μg/ml アンピシリン)で6時間振とう培
養(37℃)した後、1mMになるようにIsopropil−β−D
−thio−Galactopyranoside(IPTG)を加え、さらに6
時間培養を続けた。この培養液を遠心して(7000G、10
分間)大腸菌を回収し、これをPBSで3回洗浄し、4mlの
PBSに懸濁し、3回凍結・融解した後に超音波破砕し、
遠心分離(1500G、10分間)することによってELISA用の
抗原溶液である上清を得た。ELISAでは、この上清を炭
酸緩衝液(1.6g/ Na2CO3、2.96g/ NaHCO3、0.16g
/ NaN3)で300倍に希釈して使用した。Reference Example 2 [Preparation of ELISA antigen] The transformed Escherichia coli (ECRT) of Reference Example 1 was mixed with 250 ml of LB medium (10 g / trypton, 5 g / yeast extract, 10 g /
After shaking culture (37 ° C.) with NaCl, 100 μg / ml ampicillin) for 6 hours, isopropil-β-D was adjusted to 1 mM.
-Thio-Galactopyranoside (IPTG) and 6 more
Culture was continued for hours. Centrifuge this culture (7000G, 10
Min), collect the E. coli, wash it three times with PBS, and add 4 ml
Suspended in PBS, frozen and thawed three times, then sonicated,
By centrifuging (1500 G, 10 minutes), a supernatant as an antigen solution for ELISA was obtained. In ELISA, the supernatant was used in a carbonate buffer (1.6 g / Na 2 CO 3 , 2.96 g / NaHCO 3 , 0.16 g
/ NaN 3 ) diluted 300 times before use.
実施例1 〔HIVのRTに対するモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株の作製〕 (a)マウスの免疫及び脾臓リンパ球の調製 参考例1のワクシニアウイルスWRRTを1.5×108PFU/ml
含むMEM溶液(2%牛胎児血清含有)を50μづつBALB/
cマウス(♀、7週齢)の両後肢足趾皮下に投与した。Example 1 [Preparation of a Hybridoma Strain Producing a Monoclonal Antibody Against HIV RT] (a) Immunization of Mice and Preparation of Spleen Lymphocytes The vaccinia virus WRRT of Reference Example 1 was prepared at 1.5 × 10 8 PFU / ml.
Containing 50% of MEM solution (containing 2% fetal calf serum)
c mice (♀, 7 weeks old) were administered subcutaneously to both hind toes.
この初回免疫から6週間後に前記と同様に調製したワ
クシニアウイルスWRRTの溶液を、同マウスの尾静脈に10
0μ投与した。Six weeks after this initial immunization, a solution of vaccinia virus WRRT prepared in the same manner as above was injected into the tail vein of the same mouse at 10 minutes.
0 μ was administered.
前記のようにして免疫されたマウスから摘出した(最
終免疫から3日目に摘出された)脾臓を、MEM溶液(リ
ンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶解したもの、10mM
HEPESを含む)を入れたシャーレ中で洗い、新たに用意
したMEM溶液の中に移して、注射筒と注射針とを用いてM
EMで灌流した。The spleen excised from the mouse immunized as described above (excluded on the third day after the final immunization) was dissolved in a MEM solution (a lymphocyte culture medium powder in distilled water, 10 mM
HEPES (including HEPES) in a Petri dish, transfer into a freshly prepared MEM solution, and add M
Perfused with EM.
このようにして得た浮遊リンパ球を、MEM溶液に懸濁
して、遠心分離し(350G、5分間)、MEM溶液に再懸濁
し、細胞融合に使用するマウス脾臓リンパ球とした。The floating lymphocytes thus obtained were suspended in a MEM solution, centrifuged (350 G, 5 minutes), resuspended in the MEM solution, and used as mouse spleen lymphocytes for cell fusion.
(b)細胞融合 3.75×107個の対数増殖期にある8−アザグアニン耐
性のマウスミエローマ細胞(SP2/0)と前記の(a)の
マウスの脾臓リンパ球1.5×108個とを50ml容プラスチッ
ク製コニカル遠心管に入れ、混合し、次いで、上清を遠
心分離した後に(350G、6分間)、同遠心管を軽くたた
いてペレットをほぐした。(B) Cell fusion A 50 ml volume of 3.75 × 10 7 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cells (SP2 / 0) in logarithmic growth phase and 1.5 × 10 8 mouse spleen lymphocytes of (a) above After placing in a plastic conical centrifuge tube, mixing, and then centrifuging the supernatant (350 G, 6 minutes), the pellet was gently tapped to loosen the pellet.
このペレットを激しく振とうしながら、この中に、50
%PEG4000溶液(37℃)を1分間かけて1ml入れ、さら
に、1分間激しく振とうした。While shaking the pellet vigorously,
1 ml of a% PEG 4000 solution (37 ° C.) was added over 1 minute, and the mixture was shaken vigorously for 1 minute.
同遠心管を穏やかに振とうしながらMEM溶液(37℃)
を数分間かけて徐々に加え、最終的には10mlとし、室温
で遠心分離(120G、6分間)して、上清を吸引除去し
た。MEM solution (37 ° C) while gently shaking the centrifuge tube
Was gradually added over several minutes, finally to 10 ml, centrifuged at room temperature (120 G, 6 minutes), and the supernatant was aspirated off.
同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし、70mlのHA
T培地(1×10-4Mヒポキサンチン,4×10-7Mアミノプテ
リン,1.6×10-5Mチミジン及び20%ウシ胎児血清を含有
するIMDM培地、37℃に保温)に懸濁して、96ウェルの培
養プレート19枚の各培養ウェルに100μづつ分注し
て、CO2インキュベーターを用いて培養した(5%CO2、
95%空気、37度、湿度100%)。Tap the centrifuge tube lightly to loosen the pellet, and add 70 ml of HA.
T medium (1 × 10 −4 M hypoxanthine, 4 × 10 −7 M aminopterin, IMDM medium containing 1.6 × 10 −5 M thymidine and 20% fetal calf serum, kept at 37 ° C.) 100 μl was dispensed into each culture well of 19 culture plates of 96 wells and cultured using a CO 2 incubator (5% CO 2 ,
95% air, 37 degrees, humidity 100%).
(c)ハイブリドーマの選択 前述(b)の培養開始から2〜4週間かけて、細胞増
殖が認められた培養プレートの各ウェルの培養上清中
に、HIVに対する抗体が含まれているか否かを、次に示
すELISA法で検討した。(C) Selection of hybridoma It was determined whether the antibody to HIV was contained in the culture supernatant of each well of the culture plate in which cell proliferation was observed over 2 to 4 weeks from the start of culture in (b) above. The following ELISA method was used.
まず、96ウェルELISAプレートの各分析ウェルに、参
考例2の溶液を50μづつ分注し、4℃で1晩静置し
た。First, 50 μl of the solution of Reference Example 2 was dispensed into each analysis well of a 96-well ELISA plate and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
次いで、ELISAプレートの各分析ウェルを洗浄液(0.0
5%のTween20を含むPBS)で2回洗浄した後、0.5%のBS
A溶液(PBSに溶解)を各分析ウェルに100μづつ分注
して室温で30分間静置し、これらの各分析ウェルを洗浄
液で2回洗浄し、前記培養プレートの各培養ウェルの培
養上清を、これらの各分析ウェルに50μづつ分注して
室温で2時間静置した(陰性対照には、融合前のマウス
脾臓リンパ球とマウスミエローマ細胞との混合物を同様
に培養して得た上清を用いた。一方、陽性対照には、本
発明での細胞融合に用いたマウスの血清を洗浄液で10培
に希釈したものを用いた。)。Then, each assay well of the ELISA plate was washed with a washing solution (0.0
After washing twice with PBS containing 5% Tween 20, 0.5% BS
A solution (dissolved in PBS) was dispensed at 100 μl into each analysis well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and each of these analysis wells was washed twice with a washing solution. Was dispensed into each of the analysis wells in an amount of 50 μl and allowed to stand at room temperature for 2 hours (a negative control was obtained by culturing a mixture of mouse spleen lymphocytes and mouse myeloma cells before fusion in the same manner. On the other hand, as a positive control, a serum obtained by diluting the serum of the mouse used for cell fusion in the present invention to 10 times with a washing solution was used.)
次に、ELISAプレートの各分析ウェルを洗浄液で4回
洗浄し、マウス免疫グロブリンに対するアルカリフォス
ファターゼ標識抗体溶液を、5μづつ、各分析ウェル
に分注し、室温で1時間静置した。そして、ELISAプレ
ートの各分析ウェルを洗浄液で4回洗浄後、p−ニトロ
フェニルリン酸ナトリウム・6H2O溶液(1mg/mlを100μ
づつ各分析ウェルに分注し、室温で30分反応後、マイ
クロプレート用の吸光度測定装置を用いて各ウェルの40
5nmにおける吸光度を測定した。Next, each analysis well of the ELISA plate was washed four times with a washing solution, and an alkaline phosphatase-labeled antibody solution against mouse immunoglobulin was dispensed at 5 μl into each analysis well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Then, after washing each analysis well of the ELISA plate four times with a washing solution, sodium p-nitrophenylphosphate · 6H 2 O solution (1 mg / ml was added to 100 μl)
Each well was allowed to react at room temperature for 30 minutes.
The absorbance at 5 nm was measured.
このような検討の結果、培養プレート中の658個の培
養ウェルの中の14個で、HIVのRTに対する抗体の産生が
認められた。As a result of these studies, production of antibodies to HIV RT was observed in 14 out of 658 culture wells in the culture plate.
これらの抗体を産生した14個の培養ウェルについて、
免疫ブロッティング法(W.B.)を行った。For the 14 culture wells that produced these antibodies,
Immunoblotting (WB) was performed.
その結果、HIVのRTの反応した抗体を含有する培養ウ
ェルは、14個の中の10個で認められた。即ち、この10個
の培養ウェルには、HIVのRTと反応する抗体を産生する
ハイブリドーマが存在することが確認された。As a result, 10 out of 14 culture wells containing antibodies reacted with HIV RT were observed. That is, it was confirmed that hybridomas producing antibodies that react with HIV RT were present in these 10 culture wells.
(d)ハイブリドーマの株化(クローニング) 20%ウシ胎児血清を含むIMDM培地を用いて、前述の
(c)工程の場合において示した抗体産生が確認された
10個の培養ウェルのうちの8個の培養ウェルについて限
界希釈法でハイブリドーマをクローニングした。(D) Hybridoma cell line formation (cloning) Using IMDM medium containing 20% fetal bovine serum, the antibody production shown in the case of the above-mentioned step (c) was confirmed.
Hybridomas were cloned by limiting dilution in eight of the ten culture wells.
ハイブリドーマ培養には、96ウェル培養プレートを用
い、(ハイブリドーマ1個)/フィーダー細胞(1×10
7/ml)を含むリンパ球培養用培地100μ)/ウェルで
培養した。For the hybridoma culture, a 96-well culture plate was used, and (1 hybridoma) / feeder cells (1 × 10 6
7 / ml) and 100 μl / well of lymphocyte culture medium.
前記の8個の培養ウェルの各々のクローニングにおい
て、10日目頃から単一コロニーとして観察される培養ウ
ェルの上清を採取して、参考例2の溶液を用いたELISA
法(前述の(c)工程と同様の方法)で抗体産生ウェル
のスクリーニングを行ない、各々のクローニングにおい
てハイブリドーマ株を少なくとも2株づつ得、これらを
再クローニングした。In the cloning of each of the eight culture wells, the supernatant of the culture well observed as a single colony from around day 10 was collected, and ELISA using the solution of Reference Example 2 was performed.
The antibody-producing wells were screened by the method (the method similar to the above-mentioned step (c)), and at least two hybridoma strains were obtained in each cloning, and these were recloned.
このようにして得られた14の再クローニング株の培養
上清を用いて、それらの抗体がHIVのRT活性を阻害する
か否かをJeffrey Laurenceらの方法〔Science:235,1501
〜1504(1987)〕、Anthony D.Hoffmanらの方法〔Virol
ogy:147,326〜335(1985)〕に準じて、次のようにして
検討した。Using the thus obtained culture supernatants of 14 recloned strains, it was determined whether or not those antibodies inhibit HIV RT activity by the method of Jeffrey Laurence et al. [Science: 235 , 1501].
1501504 (1987)], the method of Anthony D. Hoffman et al. [Virol
ogy: 147 , 326-335 (1985)].
RT溶液(WRRTを感染させたRK−13細胞を超音波破砕後
に遠心して得られたHIV−1のRTを含有する上清を、0.1
% Triton X−100を含むPBSで希釈したもの)10μ
と前記の被検モノクローナル抗体含有液(PBS)10μ
とを混合して、4℃、30分間反応させた後にRT緩衝液
〔100mMトリス(pH8.0)、10mM ジチオスレイトール、
10mM MgCl2、100mM KCl、0.05 Triton X−100、0.
6mM グルタチオン、1mM エチレングリコールビス四酢
酸、〕25μ加え、15nM 3H−dTTPを2μ、175μg/m
lのpolyA(dT)15を2μ加え、混合した後に37℃で1
時間反応させ、濾紙(DEAE−セルロース製)にこれを滴
下して浸みこませ、乾燥して4×SSCで洗浄し、エタノ
ールで洗浄し、乾燥させてこの濾紙の放射線量(CPM)
を液体シンチレーションカウンターで測定した。抗体を
含まない溶液を加えた場合の放射線量を100%のRT活性
(阻害活性0%)として、本発明の抗体のRT活性の阻害
の程度を測定した結果、阻害の程度が50%以上のものは
2クローンあり、そのうちの1クローン(7C4株)のも
のは90%以上であった。RT solution (supernatant containing RT-13 of HIV-1 obtained by sonication of RK-13 cells infected with WRRT,
% Triton X-100 diluted in PBS) 10μ
And the test monoclonal antibody-containing solution (PBS) 10μ
And allowed to react at 4 ° C. for 30 minutes, followed by RT buffer [100 mM Tris (pH 8.0), 10 mM dithiothreitol,
10 mM MgCl 2 , 100 mM KCl, 0.05 Triton X-100, 0.
6mM glutathione, 1mM ethylene glycol-bis-tetraacetic acid,] 25μ added, 2.mu. a 15nM 3 H-dTTP, 175μg / m
2 μl of polyA (dT) 15 , add and mix at 37 ° C.
Let it react for hours, drop it into filter paper (made of DEAE-cellulose), infiltrate it, dry, wash with 4 × SSC, wash with ethanol, dry and dry the filter paper for radiation dose (CPM)
Was measured with a liquid scintillation counter. Assuming that the radiation dose when a solution containing no antibody was added was taken as 100% RT activity (inhibition activity 0%), the degree of inhibition of the RT activity of the antibody of the present invention was measured. There were two clones, of which one clone (7C4 strain) accounted for 90% or more.
このようにして得られた株を7C4株(微工研条寄第301
2号)と称し、この株が産生したモノクローナル抗体を7
C4と称す。The strain obtained in this manner was changed to 7C4 strain (Microtechnical Lab.
No. 2), and the monoclonal antibody produced by this strain
Called C4.
この株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体の
クラス・サブクラス、L鎖の型を次の測定試験Iで決定
し、各種化合物に対する反応性を測定試験IIで検討し
た。The class, subclass, and type of L chain of the monoclonal antibody contained in the culture supernatant of this strain were determined in the following assay I, and the reactivity to various compounds was examined in assay II.
測定試験I 〔HIVのRTに対するモノクローナル抗体のクラス・サブ
クラスの決定〕 7C4株が産生した免疫グロブリンのクラス・サブクラ
スの決定は、マウス抗体の各クラス・サブクラスに特異
的なペルオキシダーゼ標識抗体溶液(IgG1、IgG2a、IgG
2b、IgG3、IgM、IgA、κ型L鎖またはλ型L鎖などに対
する西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗体)を
用いた前述の(c)工程と同様のELISA法、およびマウ
ス抗体の各クラス・サブクラスに特異的な抗体溶液(Ig
G1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、κ型L鎖またはλ
型L鎖などに対する抗体)を用いたオクタロニー法で行
った。Measurement Test I [Determination of Class and Subclass of Monoclonal Antibody Against HIV RT] The determination of the class and subclass of the immunoglobulin produced by the 7C4 strain was performed by using a peroxidase-labeled antibody solution (IgG 1 , IgG 2 a, IgG
2 b, IgG 3, IgM, IgA, κ type L-chain or λ L chain similar to the ELISA method as described above in step (c) using an antibody) labeled with horseradish peroxidase for such, and the murine antibody Antibody solution (Ig
G 1, IgG 2 a, IgG 2 b, IgG 3, IgM, IgA, κ type L chain or λ
(Antibody against a type L chain or the like).
その結果、7C4株が産生したモノクローナル抗体(7C
4)は、IgG1に属する抗体(L鎖はκ)であることがわ
かった。As a result, the monoclonal antibody (7C4
4) an antibody belonging to IgG 1 (L chain was found to be kappa).
測定試験II 〔HIVのRTに対するモノクローナル抗体の反応の検討〕 モノクローナル抗体(7C4)の反応特異性について、H
IVのRTである約65K蛋白質及びそのプロセシングによっ
て生じる約51K蛋白質、大腸菌RTの約65K及び51Kの蛋白
質との反応性をウエスタンブロッティング法によって検
討した。Measurement test II [Examination of reaction of monoclonal antibody to HIV RT] Regarding the reaction specificity of monoclonal antibody (7C4),
The reactivity of the IV RT with the approximately 65K protein, the approximately 51K protein produced by its processing, and the approximately 65K and 51K proteins of Escherichia coli RT were examined by Western blotting.
その結果、この、モノクローナル抗体はいずれの蛋白
質とも反応性を有していた。As a result, this monoclonal antibody was reactive with all proteins.
実施例3 〔フラスコ培養でのHIVのRTに対するモノクローナル抗
体の生産〕 15%ウシ胎児血清を含むIMDM培地で培養して得た7C4
株の培養細胞を10mlのIMDM液(ウシ胎児血清を含まな
い)に移しかえて、死滅直前まで培養した。Example 3 Production of Monoclonal Antibody Against HIV RT in Flask Culture 7C4 obtained by culturing in IMDM medium containing 15% fetal bovine serum
The cultured cells of the strain were transferred to 10 ml of IMDM solution (without fetal bovine serum) and cultured until just before death.
HIVのRTに対するモノクローナル抗体(7C4)は、培養
液を遠心分離(1500G、5分間)して得られた上清中に3
5μg/ml(ELISAにより測定)含有されていた。Monoclonal antibody against HIV RT (7C4) was found in the supernatant obtained by centrifuging the culture (1500G for 5 minutes).
5 μg / ml (measured by ELISA).
実施例4 〔マウス腹腔内でのHIVのRTに対するモノクローナル抗
体の生産〕 HIVのRTに対する大量のモノクローナル抗体を得るた
めに、マウス腹腔内で7C4株の細胞を培養した。Example 4 Production of Monoclonal Antibody Against HIV RT in Mice Intraperitoneally In order to obtain a large amount of monoclonal antibody against HIV RT, cells of the 7C4 strain were cultured in the mouse intraperitoneally.
BALB/cマウス(♀、6週齢、2週間前にプリスタンを
0.5ml腹腔内に投与しておく)の腹腔内に、PBSで浮遊さ
せた7C4株の細胞を1×106個投与した。BALB / c mice (♀, 6 weeks old, 2 weeks ago with pristane
1 × 10 6 cells of the 7C4 strain suspended in PBS were administered intraperitoneally (0.5 ml intraperitoneally administered).
このマウスの体重は、1週間目頃から顕著な増加を示
し、2週間目に腹水(10ml/匹)を採取した。この腹水
を遠心分離(1500G、5分間)して、腹水上清を得た。The weight of this mouse showed a remarkable increase from around the first week, and ascites (10 ml / animal) was collected at the second week. This ascites was centrifuged (1500G, 5 minutes) to obtain ascites supernatant.
HIVのRTに対するモノクローナル抗体(7C4)は、この
腹水上清中に8.0mg/ml(ELISAにより測定)含有されて
いた。A monoclonal antibody against HIV RT (7C4) was contained in the ascites supernatant at 8.0 mg / ml (determined by ELISA).
本発明のHIVのRTに対して反応性を有し、かつHIVのRT
活性を阻害することができるモノクローナル抗体は、HI
Vに関する基礎研究のための試薬、AIDSを簡単で迅速
に、かつ正確に診断するための臨床検査測定試薬、及び
治療薬などへの利用を期待できるものである。The HIV RT of the present invention has reactivity with HIV RT
Monoclonal antibodies that can inhibit the activity
It can be expected to be used as a reagent for basic research on V, a clinical test measurement reagent for simple, rapid, and accurate diagnosis of AIDS, and a therapeutic drug.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12R 1:91) (72)発明者 宇田 泰三 山口県宇部市大字小串1978番地の5 宇 部興産株式会社宇部研究所内 (72)発明者 小林 利章 山口県宇部市大字小串1978番地の5 宇 部興産株式会社宇部研究所内 (72)発明者 安田 斡司 神奈川県鎌倉市七里ケ浜4―25―1 (72)発明者 佐藤 隆則 神奈川県鎌倉市梶原2―26 日本ゼオン 梶原社宅2―305 (56)参考文献 EMBO J.Vol.7[1 ](1988)p.239−243 Science,Vol.235 (1987),p.1501−1504 Aids Res.Hum;Refr oviruses,Vol.5[1 ](1989)p.51−60 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 C12P 21/08 WPI(DIALOG) BIOSIS(DIALOG)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FIC12R 1:91) (72) Inventor Taizo Uda 1978 Ogushi, Obe City, Ube City, Yamaguchi Prefecture 5 Ube Industries, Ltd. Ube Research Laboratories (72 Inventor Toshiaki Kobayashi 5-1978 Kogushi, Ube City, Ube City, Yamaguchi Prefecture Inside Ube Research Institute, Ube Industries, Ltd. (72) Inventor Yasuda Yasuda 4-25-1, Shichirigahama, Kamakura City, Kanagawa Prefecture Takanori 2-26 Kajiwara, Kamakura-shi, Kanagawa Japan Zeon 2-305 Kajiwara Company Housing (56) References Vol. 7 [1] (1988) p. 239-243 Science, Vol. 235 (1987), p. 1501-1504 Aids Res. Hum; Refoviruses, Vol. 5 [1] (1989) p. 51-60 (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C12N 15/00 C12P 21/08 WPI (DIALOG) BIOSIS (DIALOG)
Claims (3)
素(RT)であるp66及びそのプロセッシングにより形成
されたp51のいずれとも反応性を有し、かつそのRT阻害
活性を有するモノクローナル抗体。1. A monoclonal antibody having reactivity with p66, which is a reverse transcriptase (RT) of human immunodeficiency virus (HIV), and p51 formed by processing thereof, and having an RT inhibitory activity.
でマウスを免疫し、該マウスから得られたリンパ球とマ
ウスミエローマ細胞とを融合し、得られたハイブリドー
マ株を培養することにより、モノクローナル抗体を得る
ことを特徴とする、請求項1記載のモノクローナル抗体
の製法。2. A monoclonal antibody is immunized by immunizing a mouse with a vaccinia virus capable of expressing HIV RT, fusing lymphocytes obtained from the mouse with mouse myeloma cells, and culturing the obtained hybridoma strain. The method for producing a monoclonal antibody according to claim 1, wherein the monoclonal antibody is obtained.
するハイブリドーマ株。3. A hybridoma strain producing the monoclonal antibody according to claim 1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2187100A JP3007120B2 (en) | 1990-07-17 | 1990-07-17 | Monoclonal antibody against reverse transcriptase of human immunodeficiency virus, its production method and its antibody producing strain |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2187100A JP3007120B2 (en) | 1990-07-17 | 1990-07-17 | Monoclonal antibody against reverse transcriptase of human immunodeficiency virus, its production method and its antibody producing strain |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0475597A JPH0475597A (en) | 1992-03-10 |
JP3007120B2 true JP3007120B2 (en) | 2000-02-07 |
Family
ID=16200107
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2187100A Expired - Fee Related JP3007120B2 (en) | 1990-07-17 | 1990-07-17 | Monoclonal antibody against reverse transcriptase of human immunodeficiency virus, its production method and its antibody producing strain |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3007120B2 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7315817B2 (en) | 2001-07-25 | 2008-01-01 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Sound encoder and sound decoder |
US7756699B2 (en) | 2001-09-03 | 2010-07-13 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Sound encoder and sound encoding method with multiplexing order determination |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002253239A (en) * | 2001-02-27 | 2002-09-10 | Jo Chiba | Gene encoding human immunodeficiency virus, reverse transcriptase inhibitory polypeptide and use thereof |
-
1990
- 1990-07-17 JP JP2187100A patent/JP3007120B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Aids Res.Hum;Refroviruses,Vol.5[1](1989)p.51−60 |
EMBO J.Vol.7[1](1988)p.239−243 |
Science,Vol.235(1987),p.1501−1504 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7315817B2 (en) | 2001-07-25 | 2008-01-01 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Sound encoder and sound decoder |
US7756699B2 (en) | 2001-09-03 | 2010-07-13 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Sound encoder and sound encoding method with multiplexing order determination |
US7756698B2 (en) | 2001-09-03 | 2010-07-13 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Sound decoder and sound decoding method with demultiplexing order determination |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0475597A (en) | 1992-03-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Parsons et al. | Monoclonal antibodies to Rous sarcoma virus pp60src react with enzymatically active cellular pp60src of avian and mammalian origin | |
US4487829A (en) | Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses | |
JP3058685B2 (en) | Feline T cell lymphotropic lentivirus polypeptide | |
JPH09294584A (en) | Monoclonal antibody against human tumor necrosis factor | |
US7871621B2 (en) | Anti-HBs monoclonal antibody | |
US5571679A (en) | Anti-EDA monoclonal antibody and a method for diagnosis of disease associated with the EDA region of fibronectin | |
WO1997016537A1 (en) | Stable chicken b-cell line and method of use thereof | |
EP0487610B1 (en) | Prohormone cleavage site blocking antibody | |
JP3007120B2 (en) | Monoclonal antibody against reverse transcriptase of human immunodeficiency virus, its production method and its antibody producing strain | |
JPH0764879B2 (en) | Monoclonal antibody against Factor-V IIIC | |
JPH0789998A (en) | Antimicrocystin monoclonal antibody and hybridoma producing the antibody | |
JPH0213376A (en) | Monoclonal antibody to pseudomonas aeruginose | |
JP4533995B2 (en) | Anti-ADAMTS13 monoclonal antibody | |
JPH06153979A (en) | Monoclonal antibody against fish iridovirus, hybridoma for producing the antibody and production method | |
JPH0672894B2 (en) | Method for measuring human lung surface-active substance and reagent kit used therefor | |
JP5840274B2 (en) | Monoclonal antibody that specifically reacts with strome lysin 1 | |
JPS61277699A (en) | Monoclonal antibody against pulmonary surface active substance and production thereof | |
JPH06253886A (en) | Monoclonal antibody against crk protein and hybridoma strain producing the antibody | |
JPS6244175A (en) | Hybridoma for producing monocronal antibody specific to mouse interleukin-2 | |
JPH0759588A (en) | Production of monoclonal antibody against proliferation factor receptor and anti-c-erbb-2 monoclonal antibody | |
JPH05304985A (en) | Monoclonal antibody against integrase of human immunodeficiency virus, and cell producing the same | |
WO1989002078A1 (en) | Method for diagnosing chronic articular rheumatism | |
JP4470146B2 (en) | Cartilage fibronectin detection method, cartilage tumor detection method using the method, anti-cartilage FN monoclonal antibody, and hybridoma producing the antibody | |
JPH0614041B2 (en) | Method for detecting lung surface-active substance and reagent kit used therefor | |
JP3395817B2 (en) | Hybridomas producing monoclonal antibodies against Mycoplasma gallisepticum, monoclonal antibodies, and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |