JP2024527525A - 肝遺伝子のインビボ編集のための方法 - Google Patents

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Abstract

臨床試験におけるインビボ編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの治療薬の初めての全身投与が記載されている。本明細書に記載されるのは、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、肝遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子組成物を全身投与することによる、当該遺伝子のインビボ編集のための方法である。例えば、本明細書で開示されるのは、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子組成物を全身投与することによる、トランスサイレチン遺伝子のインビボ編集のための方法である。バイオセーフティ尺度及び臨床有効性尺度の評価、ならびに処置方法も、本明細書に記載される。【選択図】図１－１、図１－２

Description

本願は、２０２１年６月２２日に出願された米国仮出願第６３／２０２，７４４号、２０２１年６月２５日に出願された米国仮出願第６３／２０２，８１２号、２０２１年１１月３日に出願された米国仮出願第６３／２６３，４６６号、２０２１年１１月２２日に出願された米国仮出願第６３／２６４，４３５号、及び２０２２年２月２８日に出願された米国仮出願第６３／３１４，８７８号の利益を主張し、それらの内容を全体として参照により本明細書に援用するものである。
ミスフォールディングしたトランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質から構成されたアミロイド原線維が組織に蓄積することを特徴とするアミロイドーシスは、ＡＴＴＲと呼ばれる場合があり、進行性致死的疾患である（Ｍａｒｃｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１５、Ｇｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１５）。ＡＴＴＲは幅広い症状を呈する可能性があり、異なるクラスのＡＴＴＲを有する対象は、異なる特徴及び予後を有し得る。ＡＴＴＲのいくつかのクラスには、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）、及び野生型ＴＴＲアミロイドーシス（ｗｔ－ＴＴＲアミロイドーシス）が含まれる。ＦＡＰは一般的に感覚運動神経障害を呈し、ＦＡＣ及びｗｔ－ＴＴＲアミロイドーシスは一般的にうっ血性心不全を呈する。ＡＴＴＲアミロイドーシスは、後天性の場合があり（野生型ＡＴＴＲアミロイドーシス；ＡＴＴＲｗｔ）、心筋症及び心不全の原因として認識されている（Ｇｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１５）。ＴＴＲアミロイドーシスは、遺伝性の場合があり（変異型ＡＴＴＲ；ＡＴＴＲｖ；ｈＡＴＴＲ）、ＴＴＲ遺伝子における１００を超える病原性突然変異によって誘発され得る（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ ２０１３）。ＡＴＴＲｖアミロイドーシスは、世界中でおよそ５０，０００人に存在すると考えられており（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｍｅｄ， ２０１５、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ， ２０１８）、常染色体優性の遺伝パターンと、アミロイド多発神経障害または心筋症が支配的な臨床表現型とを有し、ほとんどの対象が２つの組み合わせ（ＡＴＴＲ－ＰＮ－ＣＭ）を示す（Ｄｏｈｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２０２１）。症状の発症後、ＡＴＴＲアミロイドーシスは進行性であり、アミロイド心筋症を有する対象では診断後２～６年以内（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ， ２０１９）、心筋症のないアミロイド多発神経障害を有する対象では症状発症後４～１７年以内の中央値で死に至る（Ｍｅｒｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌ Ｔｈｅｒ ２０２０）。
ＴＴＲは、ＴＴＲ遺伝子によって生産されるタンパク質であり、通常はレチノール及びチロキシンを全身に輸送するように機能する。ＴＴＲは主に肝臓で合成され、ごく一部は脈絡叢及び網膜で生産される。ＴＴＲは、通常、可溶性四量体タンパク質として血液中を循環する。四量体の安定性を妨害する可能性があるＴＴＲの病原性変異型は、ＴＴＲ遺伝子の突然変異アレルによってコードされ得る。突然変異型ＴＴＲは、ミスフォールディングしたＴＴＲをもたらし得、これはアミロイド（すなわち、ミスフォールディングしたＴＴＲタンパク質の凝集体）を生成し得る。場合によっては、ＴＴＲの病原性変異型は、アミロイドーシス、またはアミロイドの蓄積に起因する疾患につながる可能性がある。例えば、ミスフォールディングしたＴＴＲ単量体は、末梢神経、心臓、及び消化管などの組織内で重合してアミロイド原線維になり得る。アミロイド原線維は、ミスフォールディングしたＴＴＲに沈着した野生型ＴＴＲを含むこともある。
ＡＴＴＲアミロイドーシスに対する現行処置は、四量体型のＴＴＲの安定化を介して（ジフルニサル、タファミジス）（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＮＥＪＭ ２０１８、Ｂｅｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊａｍａ ２０１３）、またはＴＴＲ ｍＲＮＡの分解によるＴＴＲタンパク質合成の阻害を介して（イノテルセン、パチシラン）（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＮＥＪＭ ２０１８、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ＮＥＪＭ ２０１８）、進行中のアミロイド形成を低下させることに依存する。そのような処置は、症状緩和、機能向上、及び生存期間延長をもたらすが（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ＮＥＪＭ ２０１８、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ２０２１、Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１９）、ＴＴＲノックダウンを維持するための生涯にわたる投与の必要性によって制限される。より一般的に言えば、多くの障害に対する既存の遺伝子編集手法は、遺伝子発現において短期的な効果をもたらすが、遺伝子発現において所望の効果を維持するために慢性投与を必要とする。パチシランの場合、慢性処置は、グルココルチコイド及び抗ヒスタミン薬による前投薬に関連する（Ｕｒｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌ Ｔｈｅｒ ２０２０）。さらに、ＴＴＲ安定化剤を投与されている対象は、疾患の進行を経験する（Ｌｏｚｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１３）。イノテルセンは、糸球体腎炎及び血小板数減少を含む重篤な副作用に関連している（Ｇｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１９）。より高度のＴＴＲノックダウンは、ｈＡＴＴＲ多発神経障害を有する対象における神経障害エンドポイントのより大きな向上に関連している（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ＮＥＪＭ ２０１８）。持続的ノックダウンを含むＴＴＲ低下の増進は、ＡＴＴＲアミロイドーシスを有する対象の転帰向上につながり得る。したがって、慢性投与を必要とすることなく、ＴＴＲのノックダウンなどの遺伝子発現における長期的な効果をもたらすことができる遺伝子編集療法に対する満たされていないニーズが残っている。
本開示は、臨床試験におけるインビボ編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの治療薬の初めての全身投与を記載する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＣａｓヌクレアーゼを含むガイドＲＮＡを使用して、ＴＴＲ遺伝子の発現を実質的に低下させるかまたはノックダウンし、それによって、ＡＴＴＲに関連するＴＴＲタンパク質の生産を実質的に低下または消失させるための方法を提供する。ＴＴＲ遺伝子の改変による、ＡＴＴＲに関連するＴＴＲタンパク質の生産の実質的な低下または消失は、血清ＴＴＲレベルの長期的な低下または消失、例えば血清ＴＴＲの永続的な低下であり得る。追加の実施形態には、ヒト対象に対する、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ成分の、インビボで肝臓をターゲットとした送達において使用するための脂質ナノ粒子システム、ならびにそれを使用する方法が含まれる。
一態様において、本明細書で提供されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することであって、ＬＮＰ組成物が、有効量の、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、全身投与することを含み、それによってＡＴＴＲを処置し、組成物の投与が、血清ＴＴＲをベースライン血清と比べて低下させる、方法である。
一態様において、本明細書で提供されるのは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）に関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ、別称トランスサイレチンアミロイドーシス）を有するヒト対象におけるＴＴＲ遺伝子のインビボ編集のための方法であって、ヒト対象に、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を全身投与することと、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において遺伝子を編集することとを含み、組成物の投与が、対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、バイオセーフティ尺度のベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす、方法である。
一態様において、本明細書で提供されるのは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）に関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を有するヒト対象におけるＴＴＲ遺伝子のインビボ編集のための方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することであって、ＬＮＰ組成物が、有効量の、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、全身投与することと、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位においてＴＴＲ遺伝子を編集することとを含み、組成物の投与が、対象における臨床尺度のレベルにおいて、ベースラインレベルと比較して臨床的に有意な向上をもたらす、方法である。
一態様において、本明細書で提供されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することであって、ＬＮＰが、有効量の、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、全身投与することを含み、それによってＡＴＴＲを処置し、組成物の投与が、対象における臨床尺度のレベルにおいて、臨床尺度のベースラインレベルと比較して臨床的に有意な向上をもたらす、方法である。
一態様において、本明細書で提供されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することであって、ＬＮＰ組成物が、有効量の、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、全身投与することを含み、それによってＡＴＴＲを処置し、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡが、約２５～約１００ｍｇの合計用量で投与される、方法である。
一態様において、本明細書で提供されるのは、単一遺伝子障害を有するヒト対象の肝臓における遺伝子のインビボ編集のための方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することであって、ＬＮＰ組成物が、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）肝臓における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、全身投与することと、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において遺伝子を編集することとを含み、組成物の投与が、対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、バイオセーフティ尺度のベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす、方法である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害は、ＡＴＴＲである。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＴＴＲである。
一態様において、本明細書で提供されるのは、単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することであって、ＬＮＰ組成物が、有効量の、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）肝臓における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、全身投与することと、肝臓における遺伝子を編集し、それによって単一遺伝子障害を処置することとを含み、処置が安全かつ忍容性良好である、方法である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害は、ＡＴＴＲである。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＴＴＲである。
一態様において、本明細書で提供されるのは、単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法であって、ヒト対象にＬＮＰ組成物を全身投与することを含み、ＬＮＰ組成物が、有効量の、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）肝臓における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、方法である。この方法は、投与前の対象におけるバイオセーフティ尺度の第１のレベルを判定することと、投与後のある期間の対象におけるバイオセーフティ尺度の第２のレベルを判定することと、バイオセーフティ尺度の第１のレベルと第２のレベルとの間の変化を評価することとをさらに含む。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度の第１のレベルと第２のレベルとの間の変化は、許容可能な変化である。いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害は、ＡＴＴＲである。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＴＴＲである。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－２ｋを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００である。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物は、約５～７のＮ／Ｐ比を有する。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は、約４～６である。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、重量基準で約５：１から約１：５までの範囲をとる比率で存在する。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、重量基準で約３：１から約１：３までの範囲をとる比率で存在する。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、重量基準で約２：１から約１：２までの範囲をとる比率で存在する。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ｍＲＮＡは、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードする。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、コドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡに対する少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及び／またはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＡＴＴＲは、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＡＴＴＲは、野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＡＴＴＲは、多発神経障害を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＡＴＴＲは、心筋症を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＡＴＴＲは、心筋症を伴う野生型トランスサイレチンアミロイドーシスであり、例えば、対象は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の下でクラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩに分類される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、対象は、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及び／またはＡＴＴＲ－ＣＭを有する。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、バイオセーフティ尺度のベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、バイオセーフティ尺度は、プロトロンビンである。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、バイオセーフティ尺度は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）である。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、バイオセーフティ尺度は、フィブリノゲンである。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、バイオセーフティ尺度は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）である。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、バイオセーフティ尺度は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）である。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約０．３ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約０．７ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約１．０ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約５ｍｇ～約９ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約１５ｍｇ～約２７ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約７ｍｇ～約９ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約２５ｍｇ～約２７ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約２５ｍｇ～約１５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約２５ｍｇ～約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約５０ｍｇ～約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約３５ｍｇ～６５ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約４０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約６０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約７０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約８０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、臨床尺度は、血清ＴＴＲレベルである。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、臨床尺度は、血清プレアルブミンレベルである。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、ＴＴＲ遺伝子の発現を低下させるかまたはノックダウンする。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前のベースラインと比較して、ＴＴＲ遺伝子の発現を６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させるかまたはノックダウンする。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前のベースラインと比較して、ＴＴＲ遺伝子の発現を８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下させるかまたはノックダウンする。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも６０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも７０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも８０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも８４％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも９０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも９５％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも９６％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＴＴＲレベル（例えばベースライン）と比較して、対象におけるＴＴＲ血清レベルを６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、ＬＮＰ組成物の投与後７日目に、対象におけるＴＴＲ血清レベルを前述のいずれかの量だけ低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、ＬＮＰ組成物の投与後１４日目に、対象におけるＴＴＲ血清レベルを前述のいずれかの量だけ低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、ＬＮＰ組成物の投与後２８日目に、対象におけるＴＴＲ血清レベルを前述のいずれかの量だけ低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも６０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも７０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも８０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも８４％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも９０％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも９５％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを少なくとも９６％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、組成物の投与前の血清プレアルブミンレベル（例えばベースライン）と比較して、対象における血清プレアルブミンレベルを６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約５０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約４０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約３０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約２０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約１０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物はまた、第２の治療剤と共に投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、第２の治療剤は、四量体型のＴＴＲの安定化剤である。前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、第２の治療薬は、ジフルニサルまたはタファミジスである。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、ＬＮＰ組成物の投与後１４日目に、対象における血清プレアルブミンレベルを前述のいずれかの量だけ低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与は、ＬＮＰ組成物の投与後２８日目に、対象における血清プレアルブミンレベルを前述のいずれかの量だけ低下させる。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、本方法は、ＬＮＰ組成物の単回投与後、ＴＴＲ遺伝子などの遺伝子の発現を永続的に低下させることをさらに含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与後２８日目の血清ＴＴＲレベルまたは血清プレアルブミンレベルは、永続的である。
前述の態様及び実施形態のいずれかにおいて、ＬＮＰ組成物の投与後２８日目の血清ＴＴＲレベルまたは血清プレアルブミンレベルは永続的であり、例えば、２か月目、３か月目、４か月目、５か月目、６か月目、７か月目、８か月目、９か月目、１０か月目、１１か月目、及び／または１２か月目に永続的である。
一態様において、本明細書で開示されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、対象における血清ＴＴＲレベルをベースライン血清ＴＴＲレベルと比較して少なくとも９５％低下させる有効量の組成物を対象に投与することを含む、方法である。
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の写しは、要請及び必要手数料の支払いに応じて特許庁により提供される。
ＮＴＬＡ－２００１ ＬＮＰベースの遺伝子療法のための方法の概要。パネルＡは、ＬＮＰ粒子の組成及び注入療法を表し、パネルＢは、提唱される遺伝子療法送達機構を説明し、パネルＣは、ＴＴＲ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集を表す。 図１－１の続きである。 ｓｇＲＮＡ濃度の関数としてのＴＴＲ遺伝子のＮＴＬＡ－２００１編集についての初代ヒト肝細胞の細胞培養ベースの評価。示されている一次尺度は、コントロールと比較したパーセンテージとしてのＴＴＲ遺伝子編集、ＴＴＲ ｍＲＮＡレベル、及びＴＴＲタンパク質レベルである。 Ａは、非ヒト霊長動物におけるＣｙｎ－ＬＮＰを使用したＴＴＲ編集頻度及び遺伝子編集パターンのインビボ評価。Ｂは、非ヒト霊長動物におけるＣｙｎ－ＬＮＰを使用したＴＴＲ編集頻度及び遺伝子編集パターンのインビボ評価。 ＮＴＬＡ－２００１で処置したヒトにおける、時間の関数としての血清ＴＴＲタンパク質濃度の変化（コントロールと比較した）（データは２８日目まで示されている）。示されている尺度は、コホートＡ及びＢの両方からのものである。 ＮＴＬＡ－２００１で処置したヒトにおける、時間の関数としての血清ＴＴＲタンパク質濃度の変化（コントロールと比較した）（データは２８日目まで示されている）。示されている尺度は、コホートＡ及びＢの両方からのものである。 ＮＴＬＡ－２００１で処置したヒトにおける、時間の関数としての血清ＴＴＲタンパク質濃度の変化（コントロールと比較した）（データは２８日目まで示されている）。示されている尺度は、コホートＡ及びＢの両方からのものである。 Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ、及びＳＩＴＥ－Ｓｅｑによって特定された、ＮＴＬＡ－２００１のｓｇＲＮＡの潜在的なオフターゲット部位。 ＮＴＬＡ－２００１で処置した初代ヒト肝細胞の細胞培養物において評価した、オンターゲット及びオフターゲットの遺伝子編集頻度。 ＮＴＬＡ－２００１で処置した初代ヒト肝細胞の細胞培養物において評価した、オンターゲット及びオフターゲットの遺伝子編集頻度。 ＮＴＬＡ－２００１によって誘導された遺伝子突然変異の特性解析を行うために使用される方法を説明する概略図。 ハイスループットシークエンシングのために使用されるＰＣＲ法を説明する概略図。 ハイスループットシークエンシングのために使用されるＰＣＲ法を説明する概略図。 ＮＴＬＡ－２００１で処置した初代ヒト肝細胞からＴＴＲ座位の周囲で検出された構造変異型の評価。 肝臓におけるＴＴＲ遺伝子編集のパーセンテージとして測定された、マウスモデルにおけるＮＴＬＡ－２００１編集の用量依存的評価。 血清タンパク質レベルとして測定された、マウスモデルにおけるＮＴＬＡ－２００１編集の用量依存的評価。 マウスにおける部分肝切除後の血清ＴＴＲレベルにより測定したＴＴＲ遺伝子のＮＴＬＡ－２００１ベースの編集の永続性の評価。 Ｃｙｎ－ＬＮＰ処置した非ヒト霊長動物における時間の関数としての血清ＲＮＡ濃度。 Ｃｙｎ－ＬＮＰ処置した非ヒト霊長動物における遺伝子編集率によって測定したＴＴＲ編集の評価。 Ｃｙｎ－ＬＮＰ処置した非ヒト霊長動物における血清ＴＴＲレベルによって測定したＴＴＲ編集の評価。 Ｃｙｎ－ＬＮＰで処置した非ヒト霊長動物の肝臓におけるＴＴＲ血清タンパク質レベルと遺伝子編集率との相関。 プロトロンビン時間（ＰＴ）として測定した、ＮＴＬＡ－２００１処置対象における肝臓パラメータ及び凝固パラメータ。 活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）として測定した、ＮＴＬＡ－２００１処置対象における肝臓パラメータ及び凝固パラメータ。 フィブリノゲンとして測定した、ＮＴＬＡ－２００１処置対象における肝臓パラメータ及び凝固パラメータ。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）として測定した、ＮＴＬＡ－２００１処置対象における肝臓パラメータ及び凝固パラメータ。 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）として測定した、ＮＴＬＡ－２００１処置対象における肝臓パラメータ及び凝固パラメータ。 非ヒト霊長動物におけるＣｙｎ－ＬＮＰの成分の血漿濃度。 ＮＴＬＡ－２００１処置有害事象。 登録された臨床試験対象の特徴。 多発神経障害の用量漸増研究のための臨床試験対象データ。 多発神経障害の用量漸増研究のための臨床試験対象データ。 多発神経障害の用量漸増研究のための臨床試験対象データ。 多発神経障害の用量漸増研究のための臨床試験対象データ。 用量別のＴＴＲの低下。ＳＥ、標準誤差。（＊）２か月目にはＮ＝２。（†）２か月目にはＮ＝５。 プロトロンビン時間（ＰＴ）のデータ。ＳＥ＝標準誤差。 活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のデータ。ＳＥ＝標準誤差。 フィブリノゲンのデータ。ＳＥ＝標準誤差。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のデータ。ＳＥ＝標準誤差。 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のデータ。ＳＥ＝標準誤差。 ｄダイマーのデータ。ＳＥ＝標準誤差。 コホート３及び４を含むＮＴＬＡ－２００１処置有害事象。 登録された臨床試験対象の人口構成及びベースラインの特徴。 登録された臨床試験対象の人口構成及びベースラインの特徴。 ＮＴＬＡ－２００１の単一用量ＩＶ注入後のＬＰ０１の中間平均血漿濃度－時間プロファイル。ＮＴＬＡ－２００１は、ピークから急速に低下し、その後、二次ピーク及び対数線形相を呈する。入手可能なＬＰ０１のＰＫデータが投薬後４８時間まで表されている。 ＮＴＬＡ（ＡＵＣ ｍｇ＊ｈ／ｍＬ）に対する２８日目のＴＴＲの中間平均（ＳＥ）の観察（点）及びモデル予測（線）は、ＮＴＬＡ－２００１曝露が増加するにつれて２８日目の血清ＴＴＲが減少することを示している。投薬前ＴＴＲ濃度データがＡＵＣ＝０で示されている。データは、示された各用量レベルにおける観察された個々のＴＴＲ及びＡＵＣ値の分布の平均として示されている。 示されている体重四分位別の１．０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇの後のＮＴＬＡ－２００１ ＡＵＣ（ｍｇ＊ｈ／ｍＬ）の中間モデル予測分布。シミュレーションにより、ＮＴＬＡ－２００１ ８０ｍｇが１．０ｍｇ／ｋｇに相当する固定用量として特定された。 ＮＴＬＡ－２００１注入後に観察されたＡＳＴ及びＡＬＴのレベルにおける軽微な一時的変化。
ここで、本発明のある特定の実施形態について詳細に説明する。その例は添付の図面に示す。本発明を示された実施形態と併せて説明するが、これらの実施形態が、本発明をこれらの実施形態に限定するように意図されていないことは理解されよう。そうではなく、本発明は、添付の実施形態によって定義されるような本発明に含まれ得る全ての代替形態、修飾形態、及び均等物を網羅するように意図されている。
本件の教示内容を詳細に説明する前に、組成物またはプロセスステップは様々であり得るため、本開示が特定の組成物またはプロセスステップに限定されないことを理解されたい。本明細書及び添付の実施形態で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容による別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「（１つの）結合体」に言及された場合は複数の結合体を含み、「（１つの）細胞」に言及された場合は複数の細胞または細胞集団を含む、などとなる。本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法的変形は、非限定的であるように意図されており、リスト内の項目の列挙は、挙げられた項目に対し置き換えまたは追加され得る他の同様の項目を除外するものではない。
数値範囲は、その範囲を画定する数字を含む。測定値及び測定可能値は、有効数字及び測定に伴う誤差を考慮した概算値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定的であるようには意図されていない。以上の全般的説明及び発明を実施するための形態は、いずれも例示的かつ説明的なものに過ぎず、本教示を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書内で特に注記しない限り、本明細書内で、様々な構成要素を「含む」と記載している実施形態は、記載された構成要素から「なる」または「本質的になる」ことも企図されており、本明細書内で様々な構成要素から「なる」と記載されている実施形態は、記載された構成要素を「含む」またはそれから「本質的になる」ことも企図されている。また、本明細書内で、様々な構成要素から「本質的になる」と記載している実施形態は、記載された構成要素から「なる」またはそれを「含む」ことも企図されている（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、内容による別段の明確な指示がない限り、包括的な意味で、すなわち「及び／または」と同等の意味で使用される。「約」という用語は、リストの前に使用される場合は、リストの各メンバーを修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者による判定で特定の値に対し許容可能な誤差を意味し、この誤差は、部分的には、値がどのように測定または判定されるかに依存する。本発明のいくつかの実施形態において、「約」は、記載された値の±１０％、または場合により±５％を含む。
数または一連の数に先行する「少なくとも」という用語は、内容から明らかであるように、「少なくとも」という用語に隣接する数、及び論理的に含まれ得る全ての後続の数または整数を含むものと理解される。例えば、核酸分子内のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２０ヌクレオチド核酸分子のうちの少なくとも１８のヌクレオチド」とは、１８、１９、または２０のヌクレオチドが示された特性を有することを意味する。少なくとも、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連の数または範囲内の数の各々を修飾し得ると理解される。
本明細書で使用する場合、「以下」または「未満」は、文脈から論理的な、当該表現及び論理的な低いゼロまでの値または整数に隣接する値と理解される。例えば、「２ヌクレオチド塩基対以下」の二重鎖領域は、２、１、または０ヌクレオチド塩基対を有する。「以下」または「未満」が一連の数または範囲の前に存在する場合、その一連の数または範囲の各々が修飾されるものと理解される。
本明細書で使用する場合、範囲は、上限及び下限の両方を含む。
本明細書で使用する場合、ある値の最大量が１００％（例えば、１００％阻害または１００％封入）によって表される場合、その値は検出方法によって限定されるものと理解される。例えば、１００％阻害は、アッセイの検出レベル未満のレベルに対する阻害と理解され、１００％封入は、封入を意図された物質が小胞外で検出することができないものと理解される。
別段の記載がない限り、本明細書で使用される以下の用語及び表現は、以下の意味を有することが意図されている。
「ｍＲＮＡ」は、本明細書では、ポリペプチドに翻訳され得る（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質となり得る）オープンリーディングフレームを含むＲＮＡまたは修飾型ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを指すために使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ、例えば、２’－メトキシリボース残基を含む、リン酸－糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸リン酸－糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。一般的に、ｍＲＮＡは、相当量のチミジン残基を含有しない（例えば、０残基、または３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２個より少ないチミジン残基；または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、もしくは０．１％未満のチミジン含有量）。ｍＲＮＡは、そのウリジン位置の一部または全部に修飾ウリジンを含むことができる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書では、従来的なＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びこれらのアナログであるポリマーを含む、骨格に沿って共に結合している窒素含有複素環の塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む多量体化合物を指すために使用される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、化学的に合成されるか、またはインビトロ転写される。ポリヌクレオチドは、修飾ウリジンを含むインビトロ転写されたＲＮＡなどのｍＲＮＡであり得る。核酸「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ；ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む種々の結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または２’メトキシ置換もしくは２’ハライド置換などの置換を伴う同様の化合物であり得る。ＲＮＡは、ＤＮＡまたは１つ以上のデオキシヌクレオシドもしくはデオキシヌクレオシドアナログを含み得る。「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び「ガイド」は、本明細書では、Ｃａｓヌクレアーゼをゲノム位置にターゲティングする、ｃｒＲＮＡ（別称ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）などのＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡとの組み合わせ（別称ｔｒａｃｒＲＮＡ）を指すために互換的に使用される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼのための同族ガイドＲＮＡ構造は、当技術分野において公知である。ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ配列は、単一のＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として、または例えば別個のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）として関連していてもよい。ｔｒＲＮＡは、天然発生の配列でもよいし、天然発生の配列と比較して修飾または差異を有するｔｒＲＮＡ配列でもよい。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるような修飾型ＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」とは、ターゲット配列に対し相補的であり、Ｃａｓヌクレアーゼによる結合または修飾（例えば、切断）のためにガイドＲＮＡをターゲット配列に導くように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「ターゲティング配列」または「スペーサー配列」と称されることもある。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。これより短い配列または長い配列、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さの配列も、ガイドとして使用することができる。ガイド配列は、１８～２５または１８～２０のヌクレオチドの長さでもよい。いくつかの実施形態において、ガイド配列及びターゲット領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、ガイド配列及びターゲット領域は、少なくとも１つのミスマッチを含み得る。例えば、ガイド配列及びターゲット配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、このときターゲット配列の全長は、少なくとも１８、１９、２０、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態において、ガイド配列及びターゲット領域は、０個または１～４個のミスマッチを含んでもよく、このときガイド配列は、少なくとも１８、１９、２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列及びターゲット領域は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、このときガイド配列は、２０ヌクレオチドを含む。
Ｃａｓタンパク質の核酸基質が二本鎖核酸であることから、Ｃａｓタンパク質のターゲット配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖及びマイナス鎖の両方（すなわち、所定の配列及び配列の逆相補配列）を含む。したがって、ガイド配列が「ターゲット配列に対し相補的」であると述べられている場合、ガイド配列はガイドＲＮＡをターゲット配列の逆相補配列と結合させるよう誘導し得ることを理解されたい。よって、いくつかの実施形態において、ガイド配列がターゲット配列の逆相補配列に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列中でＴがＵに置換されていることを除いて、ターゲット配列（例えば、ＰＡＭを含まないターゲット配列）におけるある特定のヌクレオチドと同一である。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡの結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはこのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、このときＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ガイドＲＮＡの配列に依存する。例示的なＣａｓヌクレアーゼ（及び「Ｃａｓタンパク質」）には、Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡの１つまたは２つの鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡクリーバーゼである。Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼを含む。本明細書で使用される場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼなどの、ＲＮＡガイド下ＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼには、クラス２ Ｃａｓクリーバーゼ及びクラス２ Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａ変異型）が含まれ、これらはさらに、ＲＮＡガイド下ＤＮＡクリーバーゼまたはニッカーゼ活性を有する。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ変異型）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａ変異型）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ変異型）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ変異型）のタンパク質ならびにこれらの修飾物が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １６３： １－１３ （２０１５））は、Ｃａｓ９に相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照により全体として援用される。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。「Ｃａｓ９」は、Ｓｐｙ Ｃａｓ９、本明細書に収載するＣａｓ９の変異型、及びそれらの均等物を包含する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １３（１１）： ７２２－３６ （２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６０：３８５－３９７ （２０１５）を参照されたい。本明細書で使用される場合、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の送達は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡの送達を含む。例えば、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含み得る。
本明細書では、「修飾ウリジン」は、ウリジンと同じ水素結合アクセプター及びウリジンとの１つ以上の構造差を有するチミジン以外のヌクレオシドを指すために使用される。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、置換ウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メトキシなどのアルコキシ）がプロトンに取って代わるウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、置換シュードウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メチルなどのアルキル）がプロトンに取って代わるシュードウリジン、例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、置換ウリジン、シュードウリジン、または置換シュードウリジンのいずれかである。
本明細書で使用される「ウリジン位置」とは、ポリヌクレオチドにおいてウリジンまたは修飾ウリジンが占める位置を指す。したがって、例えば、「ウリジン位置の１００％が修飾ウリジンである」ポリヌクレオチドは、それと同じ配列の従来的なＲＮＡ（全塩基が標準的なＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧ塩基である）ではウリジンであるはずの全て位置に修飾ウリジンを含む。別段の記載がない限り、本開示におけるまたは本開示に付随する配列表または配列一覧のポリヌクレオチド配列中のＵは、ウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。
本明細書で使用される場合、「処置」は、対象における疾患または障害のための治療薬のあらゆる投与または適用を指し、疾患の阻害、疾患の進行の緩徐化、その発生の抑止、疾患の進行の逆転（例えば、アミロイド原線維の蓄積の逆転）、疾患の１つ以上の症状の緩和、疾患の治癒、本明細書に記載される１つ以上の臨床尺度の向上、または疾患の１つ以上の症状の再発の防止を含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲの処置は、ＡＴＴＲの症状の軽減を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲの処置は、ＴＴＲ遺伝子の発現の実質的な低下またはノックダウン、例えば、少なくとも９５％の永続的な低下を含み得、それによって、ＡＴＴＲに関連するＴＴＲタンパク質の生産が実質的に低下または消失し得る。
本明細書で使用される場合、「アミロイド」は、通常可溶性のタンパク質またはペプチドの異常な凝集体を指す。アミロイドは不溶性であり、アミロイドは臓器及び組織においてタンパク質性沈着物を生じさせ得る。アミロイド中のタンパク質またはペプチドは、タンパク質の多くのコピーが付着して原線維を形成することができる形態にミスフォールディングし得る。いくつかの形態のアミロイドは人体において正常な機能を有し得るが、本明細書で使用される「アミロイド」は、タンパク質の異常または病的な凝集体を指す。アミロイドは、ＴＴＲなどの単一のタンパク質またはペプチドを含む場合もあれば、ＴＴＲ及び追加のタンパク質などの複数のタンパク質またはペプチドを含む場合もある。
本明細書で使用される場合、「アミロイド原線維」は、分解に対する抵抗性があるアミロイドの不溶性線維を指す。アミロイド原線維は、特定のタンパク質またはペプチドならびにこれが凝集した組織及び細胞型に基づいて症状を生じさせ得る。
本明細書で使用される場合、「アミロイドーシス」とは、アミロイドまたはアミロイド原線維の沈着により引き起こされる症状を特徴とする疾患を指す。アミロイドーシスは、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、神経系、及び消化路を含む多数の臓器に影響を及ぼし得る。
本明細書で使用される場合、「ＴＴＲ」は、ＴＴＲ遺伝子の遺伝子産物であるトランスサイレチンを指す。ＴＴＲは、当技術分野において、ＣＴＳ、ＣＴＳ１、ＨＥＬ１１１、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢ、プレアルブミン、ＴＢＰＡ、及びＡＴＴＮとしても知られている。例えば、ＨＧＮＣ：ＨＧＮＣ：１２４０５（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７２７６）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ＡＴＴＲ」、「ＴＴＲ関連アミロイドーシス」、「ＴＴＲアミロイドーシス」、「ＡＴＴＲアミロイドーシス」、「ＴＴＲに関連するアミロイドーシス」、または「トランスサイレチンアミロイドーシス」は、複数の組織（主に神経及び筋肉）においてアミロイド原線維として蓄積するミスフォールディングしたＴＴＲタンパク質に起因し、主な多発神経障害（ＰＮ）及び／または心筋症（ＣＭ）の疾病表現型につながる状態を指す。ＰＮの症状としては、末梢神経障害による四肢の無感覚、眩暈感、及び自律神経障害による胃腸の乱れが挙げられる。ＣＭの症状としては、息切れ、及びうっ血性心不全を含む心機能障害の他の症状が挙げられる。両方の表現型が、遺伝性（家族性）ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｖ）と関連している。ＡＴＴＲ－ＣＭは、ＴＴＲ遺伝子（ＡＴＴＲｖ－ＣＭ）における突然変異（複数可）及び／または野生型ＴＴＲ遺伝子（ＡＴＴＲ－ＣＭ）から生じ得る。野生型ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲ－ｗｔ）は、主にＣＭと関連している。ＡＴＴＲｖを有する対象は、神経及び心臓の両方の機能障害からなる混合型臨床表現型を呈することがある。
本明細書で使用される場合、「遺伝性ＡＴＴＲ」は、ＴＴＲ遺伝子の配列における突然変異に関連するＡＴＴＲを指す。ＡＴＴＲに関連するＴＴＲ遺伝子における既知の突然変異には、Ｔ６０Ａ、Ｖ３０Ｍ、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ１２２Ａ、またはＶ１２２（－）の置換を含むＴＴＲをもたらすものが含まれる。遺伝性ＡＴＴＲには、拘束型心筋症を特徴とする家族性アミロイド心筋症（「ＦＡＣ」）が含まれ、これは、心筋症を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス（「ＡＴＴＲｖ－ＣＭ」）としても知られている。うっ血性心不全は、ＦＡＣにおいてよく見られる。平均発症年齢はおよそ６０～７０歳であり、推定平均余命は診断後４～５年である。遺伝性ＡＴＴＲには、家族性アミロイド多発神経障害（「ＦＡＰ」）も含まれ、これは、主に感覚運動神経障害を特徴とする多発神経障害を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス（「ＡＴＴＲｖ－ＰＮ」）としても知られている。自律神経障害は、ＦＡＰにおいてよく見られる。神経障害が主な特徴であるが、ＦＡＰの症状は、悪液質、腎不全、及び心疾患を含む場合もある。ＦＡＰの平均発症年齢はおよそ３０～５０歳であり、推定平均余命は診断後５～１５である。本明細書で使用される場合、「遺伝性ＡＴＴＲ」は、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及び／またはＡＴＴＲｖ－ＣＭを指す。
本明細書で使用される場合、「野生型ＡＴＴＲ」及び「ＡＴＴＲｗｔ」は、Ｔ６０Ａ、Ｖ３０Ｍ、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ１２２Ａ、またはＶ１２２（－）などの病的なＴＴＲ突然変異に関連していないＡＴＴＲを指す。ＡＴＴＲｗｔは、老人性全身性アミロイドーシスとも呼ばれている。発症は典型的には６０歳以上の男性で起こり、最も一般的な症状は、うっ血性心不全及び心房細胞などの異常な心拍リズムである。追加の症状には、心機能障害の帰結、例えば息切れ、疲労、眩暈感、腫脹（特に脚）、悪心、狭心症、睡眠の乱れ、及び体重減少などが含まれる。本明細書で使用される場合、「野生型ＡＴＴＲ」は、ＴＴＲ突然変異に関連していない、多発神経障害及び／または心筋症の疾病表現型を指す。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、既にＡＴＴＲと診断されているか、または同時にＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、遺伝子検査（例えば、ＴＴＲ突然変異の記録）に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、感覚運動末梢神経障害の臨床診断に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、５以上かつ１３０以下の神経障害スコア（ＮＩＳ）に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、生検または妥当性確認済みの非侵襲的イメージングによるＴＴＲアミロイドの組織沈着の記録に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、３ｂ以下の多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアに基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、心筋症を伴う遺伝性ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｖ）アミロイドーシスまたは野生型心筋症（ＡＴＴＲｗｔ）と分類される、心筋症を伴うＡＴＴＲアミロイドーシスと診断される。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲ－ＣＭを有するヒト対象は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の下でクラスＩまたはクラスＩＩに分類される。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲ－ＣＭを有するヒト対象は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の下でクラスＩＩＩに分類される。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、症状（例えば、多発神経障害症状）の進行がある。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアにおける１ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）ステージにおける１ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、神経障害スコア（ＮＩＳ）における５ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ＮＩＳ－下肢（ＬＬ）における５ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、補正体格指数（ｍＢＭＩ）における２５ｋｇ／ｍ２×ｇ／Ｌ以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、６分間歩行試験における３０メートル以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、１０メートル歩行試験における０．１ｍ／ｓ以上の減少を有する。本明細書で使用される場合、「突然変異型ＴＴＲ」とは、ＴＴＲのアミノ酸配列において、ＴＴＲの野生型アミノ酸配列と比較して変化を有するＴＴＲの遺伝子産物（すなわち、ＴＴＲタンパク質）を指す。ヒト野生型ＴＴＲ配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７２７６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１ １８２７１で入手可能である。例えばヒトにおけるＡＴＴＲに関連するＴＴＲの突然変異型は、シグナル配列を含まない成熟タンパク質配列に基づくアミノ酸位置に従って表記される（例えば、Ｔ６０ＡはＴ８０Ａに相当し、これはｐ．Ｔ８０Ａとも表記される）、Ｔ６０Ａ、Ｖ３０Ｍ、Ｖ３０Ａ、Ｖ３０Ｇ、Ｖ３０Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｖ１２２Ａ、またはＶ１２２（－）を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」とは、遺伝子編集により、例えば、細胞、細胞集団、組織、または臓器において、特定の遺伝子産物（例えば、ＴＴＲ）の発現を減少させることを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、シークエンシング、例えば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって評価することができる。発現は、好適なコントロール、例えば対象のベースラインまたは処置前と比較して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはアッセイの検出レベル未満まで減少し得る。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は公知であり、目的の組織または細胞集団から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングを含む。タンパク質のノックダウンは、目的の組織、細胞集団、または液体からタンパク質の量を検出することによって測定することができる。フローサイトメトリー分析は、タンパク質発現のノックダウンを測定するための公知の方法である。分泌タンパク質の場合、ノックダウンは、組織培養培地もしくは血液、またはこれらに由来する血清もしくは血漿などの液体中で評価することができる。血清タンパク質レベルは、例えばＥＬＩＳＡによる定量アッセイによって測定することができ、ノックダウンを検出するために使用することができる。いくつかの実施形態において、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現のいくらかの損失、例えば、完全長タンパク質に転写もしくは翻訳される完全長野生型ｍＲＮＡ量の減少、または細胞の集団によって発現されるタンパク質量の減少を指すことがある。ｍＲＮＡ配列におけるどのような変化が野生型または完全長タンパク質の発現減少をもたらすかについては、十分に理解されている。いくつかの実施形態において、「ノックダウン」は、ＴＴＲなどの特定の遺伝子産物の発現のいくらかの損失を指す場合がある。
本明細書で使用される場合、血清ＴＴＲもしくは血清プレアルブミンのノックダウン（例えば、永続的なノックダウン）の文脈における「永続的な」、または遺伝子（例えばＴＴＲ遺伝子）の発現を「永続的に」低下させることは、遺伝子発現における持続的なノックダウンまたは持続的な低下などの持続的効果を指す。いくつかの実施形態において、血清ＴＴＲまたは血清プレアルブミンの永続的なノックダウンは、ＬＮＰ組成物の投与後１４日目または２８日目に測定され、例えば、少なくとも６か月間、９か月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、またはそれ以上にわたって維持される低下（ベースラインと比べたレベル）を指す。いくつかの実施形態において、維持されるレベルは様々であり得る。いくつかの実施形態において、低下は、処置される障害に対する所望の臨床有効性と相関する。ＡＴＴＲなどの所定の障害に対して所望の臨床有効性を達成するための低下のレベルは、当技術分野では公知である。例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の低下が、特定の障害に対する所望の臨床有効性と相関する。例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の低下が、ＡＴＴＲに対する所望の臨床有効性と相関する。
本明細書で使用される場合、「単一遺伝子障害」は、肝遺伝子産物の異常な発現または活性から生じる障害を指す。単一遺伝子障害は、肝臓内の遺伝子または肝遺伝子産物の異常な発現もしくは活性を引き起こす非コード領域に対する編集によって処置され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、タンパク質である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、肝臓内の遺伝子または肝遺伝子産物の異常な発現もしくは活性を引き起こす非コード領域に対する編集は、遺伝子産物のレベル（例えば、血清レベル）を低下させる。いくつかの実施形態において、遺伝子は、野生型と比べた遺伝子内の１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、野生型である。単一遺伝子障害は、単一の遺伝子編集による処置に適した遺伝子障害であり得る。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの投与後の、対象における血清ＴＴＲレベルをベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて少なくとも６０％低下させる、及び／または血清ＴＴＲを約５０μｇ／ｍＬ未満に低下させる、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの量を指す。例えば、ＬＮＰ組成物は、有効量の、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びＴＴＲをターゲティングするガイドＲＮＡなどのガイドＲＮＡ（合計ＲＮＡまたは全ＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、全ＲＮＡとして測定される「有効量」のＲＮＡを含み得る、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを送達する。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの有効量は、対象において血清ＴＴＲレベルをベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて少なくとも６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの有効量は、対象において血清プレアルブミンレベルをベースライン血清プレアルブミンレベルと比べて少なくとも６０％低下させる。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの有効量は、対象において血清プレアルブミンレベルをベースライン血清プレアルブミンレベルと比べて少なくとも６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの有効量は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの投与後、血清ＴＴＲを約５０μｇ／ｍＬ未満、約４０μｇ／ｍＬ未満、約３０μｇ／ｍＬ未満、約２０μｇ／ｍＬ未満、または約１０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。
本明細書で使用される場合、「バイオセーフティ尺度」は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物のヒト対象への投与に関連する安全性事象をモニターするために使用される臨床尺度を指す。バイオセーフティ尺度は、本明細書に記載されるような、有害事象（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥグレード３以上）、重篤な有害事象、特に注目すべき有害事象、及び／または処置下で発現した有害事象（ＣＴＣＡＥグレード３以上）を含む、安全性事象の判定を可能にし得る。安全性事象（例えば、有害事象）の重篤性を定義するためのガイドラインは、当技術分野では公知である（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）、バージョン５．０を含むＣＴＣＡＥ）。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与前に測定される。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定される。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与前及び投与後に測定され、それによって、ＬＮＰ組成物による処置前及び処置後のバイオセーフティ尺度のレベルの比較を行い、許容可能な変化などの変化を判定することが可能になる。本明細書で使用される場合、「許容可能な」変化とは、バイオセーフティ尺度レベルにおける変化であって、結果として生じる変化が、安全性事象（例えば、有害事象（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥグレード３以上）、重篤な有害事象、特に注目すべき有害事象、処置下で発現した有害事象（ＣＴＣＡＥグレード３以上）、及び／または臨床医による判定で治験薬の中止を別途必要とする事象に該当しない変化を指す。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与前に測定されたバイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定されたバイオセーフティ尺度の１つ以上のレベルに対する比較のためのベースラインとなり得る（例えば、投与後に特定の間隔で得られた測定値がベースラインレベルに対して比較され得る）。いくつかの実施形態において、ベースラインは、ＬＮＰ組成物の投与前に得られた、入手可能な最後の測定値である。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度は、値だけを使用して安全性事象を判定することができる場合には、ベースラインに対して比較されない。
本明細書で使用される場合、「安全かつ忍容性良好」とは、本明細書に記載される安全性事象がないこと、例えば、有害事象（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥグレード３以上）、重篤な有害事象、特に注目すべき有害事象、処置下で発現した有害事象（ＣＴＣＡＥグレード３以上）、及び／または臨床医による判定で治験薬の中止を別途必要とする事象がないことを指す。いくつかの実施形態において、「安全かつ忍容性良好」には、本明細書に記載される組成物、例えば、有効量のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲをターゲティングするガイドＲＮＡを含むＬＮＰ組成物の投与と無関係であるＮＣＩ－ＣＴＣＡＥグレード３以上を経験する患者、及び／または、例えば、前記事象について許容可能な期間の後に介入の有無を問わず解消する患者が含まれる。
いくつかの実施形態において、特に注目すべき有害事象は、例えば、注入関連反応（ＩＲＲ）（例えば、処置もしくは注入中止を必要とするもの、及び／またはグレード３以上）；サイトカイン放出症候群の発生；臨床的に意義のある異常出血によって定義される異常な凝固の所見または血栓もしくは出血の発生またはＣＴＣＡＥグレード２以上の異常な血液検査結果；ＣＴＣＡＥグレード２以上のＡＬＴ上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＡＳＴ上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上の総ビリルビン上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＧＬＤＨ上昇を根拠とする急性肝傷害；脾臓への影響に起因する事象（脾臓出血、脾臓梗塞、ときに血小板減少症、ときに貧血、または血球の顕微鏡検査で特定の異常所見を認めるリンパ球減少症）；副腎への影響に起因する事象；甲状腺機能低下の臨床的に意義のある症状；正常範囲を下回るチロキシン（Ｔ４レベル）低下；及びビタミンＡ欠乏症と一致する眼事象を含む。
いくつかの実施形態において、有害事象は、必ずしも処置との因果関係を有するとは限らない、治験薬を投与されたかまたは研究上の措置を受けた対象における、あらゆる不都合な医学的出来事である。いくつかの実施形態において、有害事象は、医薬（治験）品に関連するか否かにかかわらず、処置に時間的に関連する、意図されない兆候（異常な検査所見を含む）、症状、または疾患である。いくつかの実施形態において、有害事象は、臨床兆候または症状を誘導する。いくつかの実施形態において、有害事象は、積極的介入を必要とする。いくつかの実施形態において、有害事象は、処置の中断または中止を必要とする。いくつかの実施形態において、有害事象は、治験責任医師の意見において臨床的に有意な異常である。有害事象のグレーディング基準は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）を含むＣＴＣＡＥなど、当技術分野では公知である。
バイオセーフティ尺度には、例えば、凝固、血液学、臨床化学、尿検査、及び他の生物分析評価（例えば、サイトカイン、補体）に広く関連する公知の検査評価項目が含まれる。特定のバイオセーフティ尺度は、肝酵素レベル（例えば、処置投与後４週間超にわたるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）＞５×ＵＬＮの上昇、処置投与後のＡＬＴまたはＡＳＴ＞３×ＵＬＮ及び総ビリルビン＞２×ＵＬＮ（Ｈｙの法則））、処置投与後４週間超にわたる活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のレベル（例えば、ａＰＴＴの上昇）＞５×ＵＬＮ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）のレベル、トロンビン生成時間（ＴＧＴ）のレベル（例えば、ピーク高さ、ラグタイム、及び／または内因性トロンビン産生能）、フィブリノゲンのレベル、プロトロンビン国際標準化（ＩＮＲ）比、レベル、ｄダイマーのレベル、播種性血管内凝固と一致する検査パラメータ、血液学検査値の変化（例えば、処置投与後のＣＴＣＡＥグレード２を超える異常な血液検査結果）、化学検査値の変化、凝固の変化、尿検査における変化、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベル、Ｃ反応性タンパク質のレベル、補体（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｂｂ）のレベル、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１）のレベル、チロキシン（Ｔ４レベル）（例えば、処置投与後の正常範囲を下回るレベル低下または甲状腺機能低下の臨床的に意義のある症状／兆候）、急性肝傷害（例えば、処置投与後の、ＣＴＣＡＥグレード２を超えるＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビンもしくはＧＬＤＨの上昇、または肝傷害の臨床的に意義のある症状／兆候）、及び１２誘導心電図の変化を含むが、これらに限定されない。ＬＮＰ組成物の投与に関連するものを含め、追加のバイオセーフティ尺度が、当技術分野では公知である。同様に、バイオセーフティ尺度の許容可能なレベル及び／または変化は、当技術分野では公知であり、慣例的方法によって、例えば、臨床医または試験所によって評価され得る。
本明細書で使用される場合、「臨床有効性尺度」は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物で処置されるヒト対象における疾患の改善を評価するために使用される尺度を指す。いくつかの実施形態において、臨床有効性尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定される。いくつかの実施形態において、臨床有効性尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与前及び投与後に測定され、それによって、ＬＮＰ組成物による処置前及び処置後の臨床有効性尺度のレベルの比較が可能になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与前に測定された臨床尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定された臨床尺度の１つ以上のレベルに対する比較のためのベースラインまたはコントロールとなり得る。いくつかの実施形態において、ベースラインは、ＬＮＰ組成物の投与前に得られた、入手可能な最後の測定値である。
トランスサイレチンアミロイドによって特徴付けられる障害の場合、臨床有効性尺度は、血清ＴＴＲの減少（例えば、処置投与後にＥＬＩＳＡによる測定で血清ＴＴＲの６０％の減少）、血清ＴＴＲの減少（例えば、処置投与後に質量分析による測定で血清ＴＴＲの少なくとも６０％の減少）、血清プレアルブミンの減少、多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアの低下、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）ステージの低下、神経障害スコア（ＮＩＳ）の減少、補正神経障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）の減少、神経障害スコア（ＮＩＳ）－下肢（ＬＬ）の減少、補正体格指数（ｍＢＭＩ）における２５ｋｇ／ｍ２×ｇ／Ｌ以上の増加、６分間歩行試験（６－ＭＷＴ）における３０メートル以上の増加、及び１０メートル歩行試験（１０－ＭＷＴ）における０．１メートル／秒以上の増加を含むが、これらに限定されない。追加の臨床有効性尺度としては、血清ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）レベルの向上、Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ－Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙによって評価される生活の質の向上、ＥｕｒｏＱＯＬ（ＥＱ）－５Ｄ－５Ｌによって評価される生活の質の向上、心臓ＭＲＩの向上、脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルの向上、トロポニンＩレベルの向上、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の向上、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＫＣＣＱ）によるスコアの向上が挙げられる。ＴＴＲアミロイドーシスを含め、追加の臨床有効性尺度が、当技術分野では公知である。同様に、臨床有効性尺度における「臨床的に有意な向上」、すなわち、ＴＴＲアミロイドーシスを含む疾患の改善を示す臨床有効性尺度（複数可）のレベル及び／または変化は、当技術分野では公知であり、慣例的方法によって、例えば、臨床医または試験所によって評価され得る。例えば、血清ＴＴＲレベルは、ＴＴＲアミロイドーシスに関する臨床有効性尺度である。ＴＴＲアミロイドーシスの処置に関するこの臨床有効性尺度における「臨床的に有意な向上」には、ベースライン、例えば、本書に記載されるＬＮＰ組成物などでの処置前と比較した、処置後の血清ＴＴＲレベルの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の低下が含まれる。例えば、血清プレアルブミンレベルも、ＴＴＲアミロイドーシスに関する臨床有効性尺度である。ＴＴＲアミロイドーシスの処置に関するこの臨床有効性尺度における「臨床的に有意な向上」には、ベースライン、例えば、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物などでの処置前と比較した、処置後の血清プレアルブミンレベルの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の低下が含まれる。「ＴＴＲ」は「プレアルブミン」と同義であるが、「血清プレアルブミンレベル」は、「血清ＴＴＲレベル」を測定するためのアッセイと比較した場合、このタンパク質レベルを測定するための異なるアッセイを示す。両アッセイが同じタンパク質を測定する。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰ）という用語は、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の（すなわち、２つ以上の）脂質分子を含む粒子を指す。ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（これには、単層小胞及び多層小胞、例えば、「リポソーム」というラメラ相脂質二重層が含まれ、このラメラ相脂質二重層は、いくつかの実施形態では実質的に球状であり、さらに特定の実施形態では、例えばＲＮＡ分子のかなりの部分を含む、水性核を含むことができる）、エマルジョンの分散相、ミセル、または懸濁液の内相であり得る。例えば、内容が全体として参照により本明細書に援用される、ＷＯ２０１７１７３０５４Ａ１及びＷＯ２０１９０６７９９２Ａ１も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という表現は、概ね非毒性であり、生物学的に望ましくないものではなく、かつその他の点で薬学的使用のために許容不可能なものではない医薬組成物を調製する際に有用であることを意味する。
本明細書で使用される場合、全身投与は、静脈内注入によるものであり得る。「注入」とは、例えばおよそ２時間の注入時間を用いる１つ以上の薬剤の能動的投与を指す。いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）をコードするｍＲＮＡ及び本明細書に記載されるｇＲＮＡを含むＬＮＰが、ヒト対象に全身投与される。
本明細書で使用される場合、「注入予防法」とは、例えば、静脈内ステロイド（例えば、デキサメタゾン１０ｍｇ）、静脈内Ｈ１ブロッカー（例えば、ジフェンヒドラミン５０ｍｇ）または経口Ｈ１ブロッカー（例えば、セチリジン１０ｍｇ）、及び静脈内または経口のＨ２ブロッカー（例えば、ファモチジン２０ｍｇ）の投与を含む、処置（例えば、ＬＮＰの投与を含む）の前に対象に投与されるレジメンを指す。
Ｉ． 遺伝子をターゲティングする組成物
本明細書で開示されるのは、ヒト対象の肝臓における目的の遺伝子（例えば、ＴＴＲ）を編集するための方法、対象の肝細胞における遺伝子を修飾するための方法、または疾患を処置するための方法、及びかかる方法において使用するための組成物を含む関連する組成物である。概して、本明細書で開示されるのは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む、ＬＮＰ組成物である。かかる方法及び組成物で処置される対象は、例えば、ＡＴＴＲｗｔまたは遺伝性（もしくは家族性）形態のＡＴＴＲであり得るＡＴＴＲを有する対象のように、目的の配列の野生型または非野生型遺伝子を有し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡのインビボで肝臓をターゲットとした送達のための脂質ナノ粒子システムの全身投与を含む。
１． ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本開示の方法及び組成物で使用されるガイドＲＮＡは、目的の遺伝子（例えば、ＴＴＲ遺伝子）をターゲティングするガイド配列を含む。ＴＴＲ遺伝子をターゲティングする例示的なガイド配列が、例示的な一般的ｓｇＲＮＡ構造及びガイドＲＮＡの保存部分と共に、配列表に示されている。ガイド配列は、例えば、ガイド配列の３’末端に続く次の例示的なヌクレオチド配列：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号３３）を有する、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含み得る。ｓｇＲＮＡの場合、上記のガイド配列は、例えば、ガイド配列の３’末端に続く次の例示的なヌクレオチド配列（５’→３’方向）：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号３２）を有する、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、一般的なｓｇＲＮＡ構造内にガイド配列を含んでもよいし、ガイド配列及びｓｇＲＮＡ保存領域、例えば配列表に示される例示的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは修飾されている。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、以下の配列番号１９に示される修飾パターンを含み、ここで、Ｎは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体が、本明細書に記載されるガイド配列を構成し、修飾型ｓｇＲＮＡは、次の配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１９）を含み、ここで、「Ｎ」は、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり得る。例えば、本明細書には、Ｎが本明細書で開示されるガイド配列のいずれかに置き換えられている配列番号１９が包含される。修飾は、ガイドのヌクレオチドでＮを置換しても、配列番号１９に示したとおりのままであり得る。すなわち、ガイドのヌクレオチドが「Ｎ」に置き換わるが、最初の３つのヌクレオチドは２’ＯＭｅ修飾されており、第１及び第２のヌクレオチド、第２及び第３のヌクレオチド、ならびに第３及び第４のヌクレオチドの間にはホスホロチオエート結合がある。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、ＳｐｙＣａｓ９などのＣａｓ９ヌクレアーゼ）であり得るＣａｓヌクレアーゼをターゲットＤＮＡ配列に導くガイド配列を含む。ｇＲＮＡは、ガイド配列の１８、１９、または２０個の連続したヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ガイド配列の少なくとも１８、１９、または２０個の連続したヌクレオチドに対し約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ガイド配列に対し約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各組成物及び方法の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合していてもよく、別々のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上にあってもよい。ｓｇＲＮＡとの関連において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介し、共有結合することができる。
いくつかの実施形態において、配列表におけるｓｇＲＮＡ配列及び修飾された配列を含むガイド配列が包含される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号１５、１６、３４、３５、及び３８～５４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号１５、１６、３４、３５、及び３８～５４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号１５、１６、３４、３５、及び３８～５４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号１５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号１５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号１５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号１６、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号１６、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号１６、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号３４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号３４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号３４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号３５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号３５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号３５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号３８、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号３８、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号３８、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号３９、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号３９、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号３９、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４０、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４０、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４０、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４１、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４１、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４１、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４２、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４２、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４２、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４３、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４３、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４３、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４５、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４６、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４６、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４６、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４７、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４７、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４７、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４８、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４８、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４８、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号４９、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号４９、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号４９、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号５０、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号５０、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号５０、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号５１、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号５１、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号５１、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号５２、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号５２、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号５２、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号５３、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号５３、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号５３、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡは、配列番号５４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡは、配列番号５４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰ組成物は、配列番号５４、またはその１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド部分のいずれか１つ以上を含む、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む。
上記のＴＴＲガイドＲＮＡのいずれも、配列表の一般的なｓｇＲＮＡ構造、または、例えば、配列表に示されるガイドＲＮＡ保存領域構造を含み得る。
本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含むことができる。ｄｇＲＮＡは、例えばガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、例えばｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１及び第２のＲＮＡ分子は、共有結合していない場合があるが、ｃｒＲＮＡの一部とｔｒＲＮＡの一部との間の塩基対合を介してＲＮＡ二重鎖を形成することができる。
本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として単一のＲＮＡ分子を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡと共有結合しているガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ガイド配列の１８、１９、または２０個以上の連続したヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ガイド配列の２０個の連続したヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合している。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部とｔｒＲＮＡの一部との間の塩基対合を介してステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合している。
いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、天然発生のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに依存する。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、例えば、１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造など、ある特定の二次構造を含むことができる。
本明細書で提供されるガイドＲＮＡは、目的の遺伝子内のターゲット配列を認識する（例えば、それにハイブリダイズする）のに有用であり得る。例えば、目的の遺伝子のターゲット配列は、提供される、ガイドＲＮＡを含むＣａｓクリーバーゼによって認識及び切断され得る。したがって、ＣａｓクリーバーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをガイドＲＮＡによって目的の遺伝子のターゲット配列に導くことができ、ここで、ガイドＲＮＡのガイド配列がターゲット配列とハイブリダイズし、ＣａｓクリーバーゼなどのＣａｓヌクレアーゼがターゲット配列を切断する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、目的の遺伝子内のターゲット配列に基づいて決定される。
いずれかの特定の理論に拘束されるものではないが、遺伝子のある特定の領域における突然変異（例えば、ヌクレアーゼ媒介ＤＳＢまたは目的の遺伝子の編集の結果として生じるインデルに起因するフレームシフト突然変異）は、遺伝子の他の領域における突然変異ほど忍容できない場合があり、したがって、ＤＳＢの位置は、結果として生じ得るタンパク質ノックダウンの量またはタイプにおける重要な要素である。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子内のターゲット配列に相補的であるまたはそれに対する相補性を有するｇＲＮＡが、目的の遺伝子における特定の位置にＣａｓヌクレアーゼを導くために使用される。
２． ｇＲＮＡの修飾
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、化学的に修飾されている。１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、カノニカルなＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれに加えて使用される１つ以上の非天然発生及び／または天然発生の構成要素または構成の存在を表すために、「修飾型」ｇＲＮＡまたは「化学修飾型」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態において、修飾型ｇＲＮＡは、ノンカノニカルなヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んで合成され、ここでは「修飾型」と呼ばれる。
修飾型ガイドＲＮＡは、従来的なＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びこれらのアナログであるポリマーを含む、骨格に沿って共に結合している窒素含有複素環の塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含み得る。ガイドＲＮＡ「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む種々の結合から構成され得る。ガイドＲＮＡの糖部分は、リボース、デオキシリボース、または２’メトキシなどの置換を伴う同様の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、修飾ウリジン、例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、またはＮ１－メチルシュードウリジンなど）；イノシン；プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－プリンまたはアザ－プリン、デアザ－ピリミジンまたはアザ－ピリミジン、５位または６位に置換基を伴うピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２位、６位、または８位に置換基を伴うプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であり得る。ガイドＲＮＡの化学修飾に関する一般的な説明については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６， Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， １１ｔｈ ｅｄ．， １９９２）を参照されたい。ガイドＲＮＡは、従来的なＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基、及び結合のみを含むこともあれば、従来的な構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ結合を有する従来的な塩基、または従来的な塩基及び１つ以上の塩基アナログの両方を含有するポリマー）を含むこともある。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡではウラシルまたはそのアナログの存在により、またＤＮＡではチミンまたはそのアナログの存在により異なり得る。
未修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清にあるヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有することができる。
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合（ｌｉｎｋａｇｅ）または結合（ｂｏｎｄ）とは、ホスホジエステル結合、例えばヌクレオチド塩基間の結合において、硫黄が１つの非架橋リン酸酸素を置換している結合を指す。オリゴヌクレオチドを生成するためにホスホロチオエートを使用する場合、修飾されたオリゴヌクレオチドは、Ｓ－オリゴと呼ばれることもある。
ＰＳ修飾を表すために「＊」が使用され得る。本願において、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語は、次の（例えば、３’）ヌクレオチドにＰＳ結合で連結されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
本願において、「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、かつ次の（例えば、３’）ヌクレオチドにＰＳ結合で連結されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
以下の図は、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生成する、非架橋リン酸酸素へのＳ－の置換を示す：

Figure 2024527525000002
いくつかの実施形態において、５’末端の最初の３つ、４つ、または５つのヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端の最後の３つ、４つ、または５つのヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾される。いくつかの実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、逆位脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、あるいは安定性及び／または性能を高めることが当技術分野においてよく知られている他のヌクレオチド修飾である。
いくつかの実施形態において、５’末端の最初の４つのヌクレオチドと、３’末端の最後の４つのヌクレオチドとが、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で連結されている。
いくつかの実施形態において、５’末端の最初の３つのヌクレオチドと、３’末端の最後の３つのヌクレオチドとが、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、修飾型ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号１９に示す修飾パターンを含み、ここで、Ｎは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体が、ヌクレアーゼをターゲット配列に導くガイド配列を構成する。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＷＯ０２０１９０６７８７（その内容は全体として本明細書に援用される）の表２のいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＷＯ０２０１９０６７８７２（その内容は全体として本明細書に援用される）の表１のガイド配列のいずれか１つと、配列番号３２のヌクレオチドとを含むｓｇＲＮＡを含み、ここで、配列番号３２のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ガイド配列は、配列番号１９に示されるように修飾されていてもよい。
３． Ｃａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡ
本明細書で開示される、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のようなＣａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むＲＮＡはいずれも、組成物または方法において、本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれかと組み合わせることができる。本明細書に記述される実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、ｍＲＮＡであり得る。
翻訳を増加させるコドン及び／または高度に発現されるｔＲＮＡに対応するコドン；例示的なコドンセット
いくつかの実施形態において、核酸は、ヒトなどの哺乳動物における翻訳を増加させるコドンを有するＯＲＦを含む。さらなる実施形態では、核酸は、ヒトの肝臓などの臓器における翻訳を増加させるコドンを有するＯＲＦを含む。さらなる実施形態では、核酸は、ヒトの肝細胞などの細胞型における翻訳を増加させるコドンを有するＯＲＦを含む。肝細胞、肝臓、またはヒトなどにおける翻訳の増加は、ＯＲＦの野生型配列の翻訳の程度と比べて、あるいは、ＯＲＦの由来となった生物もしくはアミノ酸レベルで最も類似したＯＲＦを含有する生物、例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、または後述する他の原核生物からのＣａｓヌクレアーゼなどの原核生物由来Ｃａｓヌクレアーゼの場合には別の原核生物のコドン分布に合致するコドン分布を有するＯＲＦと比べて、判定することができる。あるいは、いくつかの実施形態において、哺乳動物、細胞型、哺乳動物の臓器、ヒト、ヒトの臓器などにおける、Ｃａｓ９配列の翻訳の増加は、あらゆる適用可能な点突然変異、異種ドメインなどを含む、他の全ての条件が同じである、配列番号３６の配列を有するＯＲＦの翻訳と比べて判定される。ヒト肝臓及びヒト肝細胞を含むヒトにおける発現を増加させるのに有用なコドンは、ヒト肝臓／肝細胞において高度に発現されるｔＲＮＡに対応するコドンであり得、これらについては、Ｄｉｔｔｍａｒ ＫＡ， ＰＬｏｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（１２）： ｅ２２１ （２００６）に記載されている。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ヒトなどの哺乳動物において高度に発現されるｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸について最も高度に発現されるｔＲＮＡ）に対応するコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ヒトの臓器などの哺乳動物の臓器において高度に発現されるｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸について最も高度に発現されるｔＲＮＡ）に対応するコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ヒトの肝臓などの哺乳動物の肝臓において高度に発現されるｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸について最も高度に発現されるｔＲＮＡ）に対応するコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、ヒトの肝細胞などの哺乳動物の肝細胞において高度に発現されるｔＲＮＡ（例えば、各アミノ酸について最も高度に発現されるｔＲＮＡ）に対応するコドンである。
あるいは、生物（例えば、ヒト）全般で高度に発現されるｔＲＮＡに対応するコドンを使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、表３に示すコドンセット（例えば、低Ｕ、低Ａ、または低Ａ／Ｕコドンセット）からのコドンである。低Ａ及び低Ａ／Ｕセットにおけるコドンは、示されているヌクレオチドを最小限に抑えるコドンを使用し、また、２つ以上の選択肢が利用可能である場合には、高度に発現されるｔＲＮＡに対応するコドンを使用する。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、表３に示す低Ｕコドンセットからのコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、表３に示す低Ａコドンセットからのコドンである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ内のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、表３に示す低Ａ／Ｕコドンセットからのコドンである。
Figure 2024527525000003
例示的な配列
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、配列番号１～１２及び３６のいずれかに対し少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含み、このＣａｓヌクレアーゼは、配列番号１３～１４のいずれかに対し少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、配列番号１～１２及び３６のいずれかから表３に示す配列に従ってコドン最適化されている配列、または配列番号１～１２及び３６のいずれかに対し少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書で使用される場合、第１の配列の第２の配列へのアラインメントにより、全体で第２の配列の位置のＸ％以上が第１の配列にマッチすることが示される場合、第１の配列は、第２の配列「に対し少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムには、当技術分野でよく知られているＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムがある。当業者には、所定の配列ペアをアラインするのにどのアルゴリズム及びパラメータ設定の選択が適切であるかが分かるであろう。概ね同様の長さであり、予想される同一性がアミノ酸について＞５０％、またはヌクレオチドについて＞７５％である配列に関しては、ＥＢＩによりｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのｗｅｂサーバーにて提供されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェイスのデフォルト設定を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが概して適切である。
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びＯＲＦの追加の特徴
本明細書に記載される追加の特徴はいずれも、上述の実施形態のいずれかで実現可能である限り、組み合わせることができる。
コードされたＣａｓヌクレアーゼ
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、クリーバーゼ活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性と称されることもある。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼである（これは、例えばＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣａｓヌクレアーゼであり得る）。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３タンパク質、ならびにそれらの修飾物が含まれる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのもの（例えば、次の段落の一覧を参照されたい）、ならびにそれらの修飾された（例えば、エンジニアリングされた、または突然変異型の）バージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照されたい。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、またはそのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはＣｍｒ２サブユニット、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型システムからものであり得る。様々なＣＲＩＳＰＲシステム及びＣａｓヌクレアーゼの説明については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：４６７－４７７ （２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １３： ７２２－３６ （２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６０：３８５－３９７ （２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓクリーバーゼ、例えばＣａｓ９クリーバーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓニッカーゼ、例えばＣａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えばクリーバーゼである。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的で例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
野生型Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＲｕｖＣドメインは非ターゲットＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡのターゲット鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つ以上のＲｕｖＣドメイン及び／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ターゲットＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導することができる。
いくつかの実施形態において、タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部で置き換えられているキメラＣａｓヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のような異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは修飾ヌクレアーゼであり得る。
他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものであり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
ポリＡ尾部
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部をさらに含む。場合によっては、ポリＡ尾部は、それがプラスミドによりコードされている場合、ポリＡ尾部内の１つ以上の位置において１つ以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリＡ尾部は、少なくとも８個の連続したアデニンヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態において、ポリＡ尾部は、１つ以上の非アデニンヌクレオチドも含む。本明細書で使用される場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、及びシトシンヌクレオチドは、例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のポリＡ尾部は、Ｃａｓヌクレアーゼまたは目的の配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続したアデニンヌクレオチドを含み得る。場合によっては、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、Ｃａｓヌクレアーゼまたは目的の配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続アデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドは、規則的または不規則な間隔でアデニンヌクレオチドを中断する。
いくつかの実施形態において、ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡのインビトロ転写に使用されるプラスミドにコードされており、転写産物の一部となる。プラスミドにコードされたポリＡ配列、すなわち、ポリＡ配列中の連続したアデニンヌクレオチドの数は、正確ではない可能性があり、例えば、プラスミド中の１００ポリＡ配列は、転写されたｍＲＮＡ中に最大１００のポリＡ配列をもたらし得る。いくつかの実施形態において、ポリＡ尾部は、プラスミドにコードされておらず、ＰＣＲテーリングまたは酵素テーリングによって、例えばＥ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して付加される。
ＵＴＲ；Ｋｏｚａｋ配列
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、ヒドロキシステロイド１７－ベータデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４またはＨＳＤ）からの少なくとも１つのＵＴＲ、例えば、ＨＳＤからの５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファグロビン（ＨＢＡ）ｍＲＮＡ、ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡ、またはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓベータグロビン（ＸＢＧ）ｍＲＮＡからの少なくとも１つのＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧなどのグロビンｍＲＮＡからの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧからの５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧからの３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＸＢＧ、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ－アクチン、アルファ－チューブリン、腫瘍タンパク質（ｐ５３）、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）からの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、同じ供給源、例えば、アクチン、アルブミン、またはＨＢＡ、ＨＢＢ、もしくはＸＢＧなどのグロビンなどの構成的に発現されたｍＲＮＡからの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、Ｋｏｚａｋ配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列は当技術分野において公知である。Ｋｏｚａｋ配列は、翻訳開始、及び核酸から翻訳されるポリペプチドの全体的収率に影響を与え得る。Ｋｏｚａｋ配列は、開始コドンとして機能し得るメチオニンコドンを含む。最小Ｋｏｚａｋ配列はＮＮＮＲＵＧＮであり、ここで、次のうちの少なくとも１つが真である：第１のＮはＡまたはＧである、及び第２のＮはＧである。ヌクレオチド配列との関連において、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）を意味する。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列はｇｃｃｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号３７）であり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチが最大１つ、２つ、３つ、もしくは４つである。
修飾ヌクレオチド
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、一部または全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５位において、例えば、ハロゲンまたはＣ１－Ｃ３アルコキシで修飾されているウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、１位において、例えば、Ｃ１－Ｃ３アルキルで修飾されているシュードウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンはシュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンはＮ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は修飾ウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の８５～９５％、または９０～１００は、修飾ウリジン、例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジン、シュードウリジン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の８５～９５％、または９０～１００％は、シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、核酸中のウリジン位置の８５～９５％、または９０～１００％は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。
５’キャップ
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、５’キャップ、例えばＣａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは一般に、核酸の５’から３’方向の鎖の１番目のヌクレオチド、すなわち、第１のキャップ近位ヌクレオチドの５’位に５’－三リン酸を介して連結されている７－メチルグアニンリボヌクレオチドである（これは、以下に記述するように、例えばＡＲＣＡに関して、さらに修飾されていてもよい）。Ｃａｐ０では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースがいずれも２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１では、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースがいずれも２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照されたい。
キャップは、共転写によりＲＮＡに含まれ得る。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ型番ＡＭ８０４５）は、開始時に転写産物にインビトロで組み込まれ得るグアニンリボヌクレオチドの５’位に連結された７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－三リン酸を含むキャップアナログである。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， （２００１） “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，” ＲＮＡ ７： １４８６－１４９５を参照されたい。ＡＲＣＡ構造を以下に示す。
Figure 2024527525000004
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ型番Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ型番Ｎ－７１３３）を使用することで、Ｃａｐ１構造を共転写により得ることができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化型も、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからそれぞれ型番Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３として入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）の構造は、本明細書では、上記の型番の最後の３桁を使用して言及されることもある（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ型番Ｎ－７１１３については「ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）１１３」）。
Figure 2024527525000005
あるいは、キャップを転写後にＲＮＡに付加することもできる。例えば、ワクシニアキャッピング酵素が市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ型番Ｍ２０８０Ｓ）、これは、そのＤ１サブユニットによりもたらされるＲＮＡトリホスファターゼ活性及びグアニリルトランスフェラーゼ活性、ならびにそのＤ１２サブユニットによりもたらされるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、これは、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０をもたらすようＲＮＡに７－メチルグアニンを付加することができる。例えば、Ｇｕｏ， Ｐ． ａｎｄ Ｍｏｓｓ， Ｂ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７， ４０２３－４０２７、Ｍａｏ， Ｘ． ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ， Ｓ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ２４４７２－２４４７９を参照されたい。キャップ及びキャッピング手法に関する追加の説明については、例えば、ＷＯ２０１７／０５３２９７及びＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． （２００９） Ｎｏ． ５３， １２９－１３０を参照されたい。
４． 核酸組成物の送達
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、目的の遺伝子（例えばＴＴＲ）内で二本鎖切断（ＤＳＢ）または遺伝子編集を誘導する方法が提供される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子においてＤＳＢを誘導するために、ガイド配列の１つ以上が投与される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）と共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えばリピドＡを含むＬＮＰにおいて投与される。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、リピドＡと、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含む、脂質成分を含む。
いくつかの実施形態において、化学修飾型ガイドＲＮＡなどのガイドＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を投与することを含む、目的の遺伝子（例えばＴＴＲ）内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法が提供される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子においてＤＳＢを誘導するために、ｓｇＲＮＡの１つ以上が投与される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をコードする、本明細書に記載されるＲＮＡと共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えば、リピドＡと、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含むＬＮＰにおいて投与される。
いくつかの実施形態において、化学修飾型ガイドＲＮＡなどのガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、目的の遺伝子（例えばＴＴＲ）を修飾する方法が提供される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子を修飾するために、ｓｇＲＮＡの１つ以上が投与される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をコードする、本明細書に記載されるＲＮＡと共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えば、リピドＡと、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含むＬＮＰにおいて投与される。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの１つ以上を含む組成物を投与することを含む、疾患（例えばＡＴＴＲ）を処置する方法が提供される。ガイドＲＮＡは、例えばＣａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードする、本明細書に記載されるＲＮＡと共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えば、リピドＡと、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含むＬＮＰにおいて投与される。
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡを投与することを含む、遺伝子産物（例えばＴＴＲ）を低下させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子産物の蓄積を低下させるまたは防止するために、ガイド配列の１つ以上を含むｇＲＮＡが投与される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸と共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えば、リピドＡと、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含むＬＮＰにおいて投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような１つ以上のガイドＲＮＡを投与することを含む、遺伝子産物の濃度を低下させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、この遺伝子産物の蓄積を低下させるまたは防止するために、ガイド配列の１つ以上を含むｇＲＮＡが投与される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸と共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えば、リピドＡ）と、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含むＬＮＰにおいて投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような１つ以上のガイドＲＮＡを含む、対象の遺伝子産物の蓄積を低下させるまたは防止する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡの１つ以上を含む組成物を投与することを含む、対象の遺伝子産物の蓄積を低下させるまたは防止する方法が提供される。いくつかの実施形態において、アミロイドまたはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積を低下させるまたは防止するために、１つ以上のガイド配列を含むｇＲＮＡが投与される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡと共に投与される。Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載されるＬＮＰ、例えば、リピドＡ）と、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧなどのＰＥＧ脂質）と、場合により中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）とを含むＬＮＰにおいて投与される。
いくつかの実施形態において、核酸から翻訳されたＣａｓヌクレアーゼと共にガイド配列を含むｇＲＮＡが、ＤＳＢを誘導し、修復中の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＴＴＲ遺伝子における突然変異をもたらす。いくつかの実施形態において、ＮＨＥＪは、ヌクレオチド（複数可）の欠失または挿入をもたらし、これによってＴＴＲ遺伝子におけるフレームシフトまたはナンセンス突然変異が誘導される。
５． 脂質組成物
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡと、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードする本明細書に記載される核酸とを含む、本明細書に記載される核酸組成物は、脂質ナノ粒子として製剤されるか、または脂質ナノ粒子によって投与される。例えば、「ＬＩＰＩＤ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」と題するＷＯ２０１７１７３０５４Ａ１、及び「ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」と題するＷＯ２０１９０６７９９２Ａ１を参照されたい。これらの文献の内容、特に文献中で開示されているＬＮＰ組成物は、全体として参照により本明細書に援用される。対象に治療用ＲＮＡを送達できることが当業者に知られている脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸と共に利用され得る。
ＬＮＰを含む組成物は、２つの活性物質、すなわちガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼをコードするＲＮＡを、イオン化可能脂質を含む脂質成分と共に含むことができる。脂質ナノ粒子とは、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の（すなわち、２つ以上の）脂質分子を含む粒子を意味する。
イオン化可能脂質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ成分を肝臓細胞に送達するための脂質組成物は、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートであるリピドＡを含むことができ、これは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートとも呼ばれる。リピドＡは、
Figure 2024527525000006

として表すことができる。
リピドＡは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、ｐｐ．８４～８６）に従って合成され得る。
追加の脂質
本開示の脂質組成物における使用に好適な「中性脂質」としては、例えば、種々の中性脂質、非荷電脂質または双性イオン脂質が挙げられる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。別の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。
「ヘルパー脂質」には、ステロイド、ステロール、及びアルキルレゾルシノールが含まれる。本開示における使用に好適なヘルパー脂質は、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、及びヘミコハク酸コレステロールを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールであり得る。
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば、血液中）で存在し得る時間の長さを変化させる脂質であり、ステルス脂質は、ＰＥＧ脂質であり得る。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低下させ、粒径をコントロールすることにより、製剤プロセスを補助し得る。本明細書で使用されるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態学的特性を調節し得る。本開示の脂質組成物における使用に好適なステルス脂質は、脂質部分とＰＥＧに基づくポリマー部分とを含むＰＥＧ脂質を含むが、これは典型的ではない。約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、「ＰＥＧ－２Ｋ」、別名「ＰＥＧ ２０００」を含む脂質を含め、当技術分野において公知のＰＥＧ脂質が企図される。ＰＥＧ－２Ｋは、本明細書では以下の式（Ｉ）によって表され、式中、ｎは４５であり、これは、数平均重合度が約４５のサブユニットを含むことを意味する。しかし、当技術分野で公知である他のＰＥＧ実施形態を使用してもよい。
Figure 2024527525000007
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（型番ＧＭ－０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）（型番ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＰＥ）、または１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）（型番８８０１２０Ｃ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ；ＧＳ－０２０、ＮＯＦ Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ）、及び１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択され得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、グリセロール基を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）基を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。
ＬＮＰ製剤
ＬＮＰ組成物は、脂質成分と、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡなどのクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ）及びｇＲＮＡを含むＲＮＡ成分とを含み得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ成分として、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｇＲＮＡとを含む。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ成分、リピドＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びステルス脂質を含み得る。ある特定のＬＮＰ組成物において、ヘルパー脂質はコレステロールである。ある特定の組成物において、中性脂質はＤＳＰＣである。追加の実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
ある特定の実施形態において、脂質組成物は、製剤中の成分脂質のそれぞれのモル比に従って表される。本開示の諸実施形態は、製剤中の成分脂質のそれぞれのモル比に従って表される脂質組成物を提供する。一実施形態では、リピドＡなどのイオン化可能脂質のモル％は、約４０モル％～６０モル％、場合により約５０モル％であり得る。一実施形態では、イオン化可能脂質のモル％は、約５５モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのイオン化可能脂質モル％は、ターゲットモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのイオン化可能脂質モル％は、ターゲットモル％の±４モル％、±３モル％、±２モル％、±１．５モル％、±１モル％、±０．５モル％、または±０．２５モル％となる。全てのモル％の数字は、ＬＮＰ組成物中の脂質成分の割合として与えられる。
一実施形態では、中性リン脂質などの中性脂質のモル％は、約５モル％～１５モル％、場合により約９モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチの中性脂質モル％は、ターゲット中性脂質モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。
一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約２０モル％～６０モル％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約２５モル％～５５モル％であり得、場合により、ヘルパー脂質のモル％は、約３０モル％～４０モル％であり得る。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、脂質成分を１００モル％にするように、イオン化可能脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質の濃度に基づいて調整される。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、脂質成分を少なくとも９９モル％にするように、イオン化可能脂質及びＰＥＧ脂質の濃度に基づいて調整される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのヘルパーモル％は、ターゲットモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は、約１モル％～１０モル％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は、約２モル％～４モル％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は、約２．５モル％～４モル％であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は、約３モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのＰＥＧ脂質モル％は、ターゲットＰＥＧ脂質モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。
ある特定の実施形態において、カーゴは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓ９）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と、ｇＲＮＡとを含む。一実施形態では、イオン化可能脂質はリピドＡである。様々な実施形態において、ＬＮＰ組成物は、イオン化可能脂質（例えばリピドＡ）、中性脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールである。ある特定の実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含み得る。追加の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。
本開示の諸実施形態は、イオン化可能脂質の正に荷電されたイオン化可能基（Ｎ）と、封入される核酸の負に荷電されたリン酸基（Ｐ）との間のモル比に従って表される脂質組成物も提供する。これは、Ｎ／Ｐの比によって数学的に表され得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、イオン化可能脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、核酸成分とを含み得、Ｎ／Ｐ比は約３～１０である。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約５～７であり得、場合により、Ｎ／Ｐ比は約６であり得る。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は６±１であり得る。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は６±０．５であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎ／Ｐ比は、ターゲットＮ／Ｐ比の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分は、例えば、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼをコードする、本明細書で開示される核酸などのＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるＣａｓ９ ｍＲＮＡ）、及び本明細書に記載されるｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分は、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及び本明細書に記載されるｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ成分は、本明細書に記載されるクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及び本明細書に記載されるｇＲＮＡを含む。前述の実施形態のいずれかにおいて、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるｓｇＲＮＡ、例えば本明細書に記載される化学修飾型ｓｇＲＮＡであり得る。
ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えばクラス２ Ｃａｓ ｍＲＮＡ）及び少なくとも１つの本明細書に記載されるｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ｇＲＮＡと、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとを、約１０：１～１：１０の比で含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡと、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとの比は、約１：１である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡと、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとの比は、約１：２である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡと、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとの比は、約１：３である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＲＮＡ水溶液を１００％エタノールなどの有機溶媒系の脂質溶液と混合することによって形成される。好適な溶液または溶媒は、水、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールを含むか、またはそれらを含有し得る。例えばＬＮＰのインビボ投与用の、薬学的に許容可能な緩衝液が使用され得る。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体混合、Ｔ字混合、または交差混合が使用される。ある特定の態様では、流量、合流部サイズ、合流部の幾何形状、合流部形状、管径、溶液、及び／またはＲＮＡ及び脂質の濃度は変動し得る。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物は、例えば、透析、タンジェンシャルフロー濾過、またはクロマトグラフィーにより濃縮または精製され得る。ＬＮＰは、リピドＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを含む４つの脂質から構成され得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４５ｍＭ ＮａＣｌ、及び５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ７．４の水性緩衝液中に懸濁させて製剤する。
本開示のＬＮＰの多分散指数（ｐｄｉ）及びサイズの特性解析を行うために動的光散乱法（「ＤＬＳ」）が使用され得る。ＤＬＳでは、サンプルを光源に晒すことから得られる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から決定されるＰＤＩは、ある集団における粒径（おおよその平均粒径）分布を表し、完全に均一な集団では、ＰＤＩはゼロである。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＬＮＰは、５０～１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、８５～９０ｎｍのサイズを有する。別段の記載がない限り、本明細書で言及されるサイズはいずれも、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒでの動的光散乱法により測定される、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子サンプルは、計数率がおよそ２００～４００ｋｃｔｓとなるようリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈される。データは、強度測度の加重平均として提示される。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、ＡＴＴＲを処置するための薬品を調製する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、ＡＴＴＲを有する対象においてアミロイドまたはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積及び凝集を低下させるまたは防止するための薬品を調製する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、血清ＴＴＲ濃度を低下させるための薬品を調製する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、血清プレアルブミン濃度を低下させるための薬品を調製する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、哺乳動物などの対象、例えばヒトなどの霊長動物において、ＡＴＴＲを処置する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、ＡＴＴＲを有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒトなどの霊長動物において、アミロイドまたはアミロイド原線維におけるＴＴＲの蓄積及び凝集を低下させるまたは防止する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、哺乳動物などの対象、例えばヒトなどの霊長動物において、血清ＴＴＲ濃度を低下させる際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｇＲＮＡ及び本明細書で開示されるＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に関連するＬＮＰは、哺乳動物などの対象、例えばヒトなどの霊長動物において、血清プレアルブミン濃度を低下させる際に使用するためのものである。
場合によっては、脂質成分は、４８～５３モル％のリピドＡ；約８～１０モル％のＤＳＰＣ；及び１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）を含み、残りの脂質成分はコレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は３～８±０．２である。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは脂質成分を含み、脂質成分は、約５０モル％のイオン化可能脂質、例えばリピドＡ；約９モル％の中性脂質、例えばＤＳＰＣ；約３モル％のステルス脂質、例えばＰＥＧ脂質、例えばＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、残りの脂質成分はヘルパー脂質、例えばコレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である。いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質はリピドＡである。いくつかの実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ脂質である。いくつかの実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは脂質成分を含み、脂質成分は、約５０モル％のリピドＡ；約９モル％のＤＳＰＣ；約３モル％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含み、残りの脂質成分はコレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である。
ＩＩ． 全身送達の方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）は、全身投与される。本明細書で使用される場合、全身投与とは、生物における広い体内分布、例えば、静脈内投与、腹腔内注射などを指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物の単回投与は、ターゲットタンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の単回投与は、細胞集団におけるターゲットタンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。他の実施形態では、ＬＮＰ組成物の２回以上の投与が、累積効果によって編集を最大化するために有益であり得る。例えば、ＬＮＰ組成物を２回または３回（「追加用量」）、例えば、第２の用量または第３の用量で投与することができる。第２の用量または第３の用量の用量は、例えば、血清ＴＴＲ及び／または血清プレアルブミンをベースラインレベル（例えば、第１のＬＮＰ投与前のレベル）と比較して約６０％、７０％、８０％、もしくは９０％、またはそれよりも大きく低下させるように、臨床医によって決定され得る。２回以上の投与（第２の用量または第３の用量）は、第１の用量がどのように投与されたか（重量ベースまたは固定用量）にかかわらず、重量ベース（例えば、０．７ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇ）または固定用量（例えば、約６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、または９０ｍｇ）として投与され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、約２時間～４時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、約２時間～３時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、約３時間～４時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、約４時間～５時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、約４時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、少なくとも２時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、少なくとも３時間の注入時間の注入によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、少なくとも４時間の注入時間の注入によって投与される。
ＩＩＩ． 用量
１． 重量ベースの用量
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ（全ＲＮＡまたは合計ＲＮＡ）を含む）は、重量ベースの用量を使用して投与される。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．３ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．７ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約１ｍｇ／ｋｇの合計用量である。ＬＮＰ組成物は、ＬＮＰ組成物が全ＲＮＡに基づいて投薬される場合、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量を投与するという意味で、有効量で投与され得る。
他の実施形態において、０．１ｍｇ／ｋｇ用量を受ける対象は、累積効果によって編集を最大化するために、ＬＮＰ組成物の２回以上の投与を受けてもよい。例えば、ＬＮＰ組成物は、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数、例えば２回投与されてもよく、例えば、第２の投与、第３の投与、第４の投与、または第５の投与が行われてもよい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＬＮＰ組成物を以前に投与されたヒト対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清ＴＴＲの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後にＥＬＩＳＡにより測定された血清ＴＴＲの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清ＴＴＲの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後に質量分析またはＥＬＩＳＡにより測定された血清ＴＴＲの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清プレアルブミンの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後に濁度アッセイなどにより測定された血清プレアルブミンの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清プレアルブミンの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後に血清プレアルブミンにおける減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。
２． 固定用量
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ（総用量または合計用量）を含む）は、固定用量を使用して投与される。固定用量は、ヒト対象において約２５～１５０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５ｍｇ～７５ｍｇ、場合により約２５ｍｇ～７５ｍｇ、約２５ｍｇ～６０ｍｇ、約２５ｍｇ～８０ｍｇ、または約２５ｍｇ～１１５ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５０ｍｇ～１５０ｍｇ、場合により約５０ｍｇ～１００ｍｇまたは約７５ｍｇ～１５０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５ｍｇ～９ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約１５ｍｇ～２７ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５０ｍｇ～９０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約３５ｍｇ～６５ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５ｍｇ～１８０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５０ｍｇ～７０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約６０ｍｇ～８０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約７０ｍｇ～９０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約８０ｍｇ～１００ｍｇの合計用量である。ＬＮＰ組成物は、ＬＮＰ組成物が全ＲＮＡに基づいて投薬される場合、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量を投与するという意味で、有効量で投与され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ（総用量または合計用量）を含む）は、固定用量を使用して投与される。固定用量は、ヒト対象において２５～１５０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５ｍｇ～７５ｍｇ、場合により２５ｍｇ～７５ｍｇ、２５ｍｇ～６０ｍｇ、２５ｍｇ～８０ｍｇ、または２５ｍｇ～１１５ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５０ｍｇ～１５０ｍｇ、場合により５０ｍｇ～１００ｍｇまたは７５ｍｇ～１５０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５ｍｇ～９ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、１５ｍｇ～２７ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５０ｍｇ～９０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、３５ｍｇ～６５ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５ｍｇ～１８０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５０ｍｇ～７０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、６０ｍｇ～８０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、７０ｍｇ～９０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、８０ｍｇ～１００ｍｇの合計用量である。
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約７ｍｇ～９ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約２５ｍｇ～２７ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約４４ｍｇ～６８ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５９ｍｇ～１１１ｍｇの合計用量である。
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、７ｍｇ～９ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、２５ｍｇ～２７ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、４４ｍｇ～６８ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、５９ｍｇ～１１１ｍｇの合計用量である。
いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約２５ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、または１５０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、５０ｍｇ、５１ｍｇ、５２ｍｇ、５３ｍｇ、５４ｍｇ、５５ｍｇ、５６ｍｇ、５７ｍｇ、５８ｍｇ、５９ｍｇ、６０ｍｇ、６１ｍｇ、６２ｍｇ、６３ｍｇ、６４ｍｇ、６５ｍｇ、６６ｍｇ、６７ｍｇ、６８ｍｇ、６９ｍｇ、７０ｍｇ、７１ｍｇ、７２ｍｇ、７３ｍｇ、７４ｍｇ、７５ｍｇ、７６ｍｇ、７７ｍｇ、７８ｍｇ、７９ｍｇ、８０ｍｇ、８１ｍｇ、８２ｍｇ、８３ｍｇ、８４ｍｇ、８５ｍｇ、８６ｍｇ、８７ｍｇ、８８ｍｇ、８９ｍｇ、９０ｍｇ、９１ｍｇ、９２ｍｇ、９３ｍｇ、９４ｍｇ、９５ｍｇ、９６ｍｇ、９７ｍｇ、９８ｍｇ、９９ｍｇ、１００ｍｇ、１０１ｍｇ、１０２ｍｇ、１０３ｍｇ、１０４ｍｇ、１０５ｍｇ、１０６ｍｇ、１０７ｍｇ、１０８ｍｇ、１０９ｍｇ、１１０ｍｇ、１１１ｍｇ、１１２ｍｇ、１１３ｍｇ、１１４ｍｇ、１１５ｍｇ、１１６ｍｇ、１１７ｍｇ、１１８ｍｇ、１１９ｍｇ、１２０ｍｇ、１２１ｍｇ、１２２ｍｇ、１２３ｍｇ、１２４ｍｇ、１２５ｍｇ、１２６ｍｇ、１２７ｍｇ、１２８ｍｇ、１２９ｍｇ、１３０ｍｇ、１３１ｍｇ、１３２ｍｇ、１３３ｍｇ、１３４ｍｇ、１３５ｍｇ、１３６ｍｇ、１３７ｍｇ、１３８ｍｇ、１３９、１４０ｍｇ、１４１ｍｇ、１４２ｍｇ、１４３ｍｇ、１４４ｍｇ、１４５ｍｇ、１４６ｍｇ、１４７ｍｇ、１４８ｍｇ、または１５０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約８０ｍｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、８０ｍｇの合計用量である。
他の実施形態において、約５ｍｇ～９ｍｇの用量を受ける対象は、累積効果によって編集を最大化するために、ＬＮＰ組成物の２回以上の投与を受けてもよい。例えば、ＬＮＰ組成物は、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数、例えば２回投与されてもよく、例えば、第２の投与、第３の投与、第４の投与、または第５の投与が行われてもよい。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＬＮＰ組成物を以前に投与されたヒト対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清ＴＴＲの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えばＬＮＰ組成物の投与後にＥＬＩＳＡにより測定された血清ＴＴＲの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清ＴＴＲの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後にＥＬＩＳＡまたは質量分析により測定された血清ＴＴＲの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清プレアルブミンの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後に濁度アッセイなどにより測定された血清プレアルブミンの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を以前に投与されており、かつ、例えば第１のＬＮＰ投与後２８日目に判定して、血清プレアルブミンの６０％超、７０％超、または８０％超の低下を達成していない（例えば、ＬＮＰ組成物の投与後に血清プレアルブミンの減少が６０％未満、７０％未満、または８０％未満である）ヒト対象に、ＬＮＰ組成物が投与される。
本発明のいくつかの実施形態において、「約」は、記載された値の±５％以内、例えば約８０ｍｇである値の場合には７６ｍｇ～８４ｍｇの範囲を意味する。本発明のいくつかの実施形態において、「約」は、記載された値の±１０％以内を意味する。
ＩＶ． 使用方法
１． インビボ編集の方法
単一遺伝子障害を有するヒト対象の肝臓における遺伝子のインビボ編集の方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子のインビボ編集の方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含む。いくつかの実施形態において、インビボ編集は、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において起こる。
ヒト対象の肝臓におけるＴＴＲ遺伝子のインビボ編集の方法も、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子のインビボ編集の方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子のインビボ編集は、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において起こる。
これらの実施形態において、対象へのＬＮＰ組成物の投与は、バイオセーフティ尺度における変化に関連し得る。いくつかの実施形態において、対象は、バイオセーフティ尺度における変化が許容可能な変化であるかどうかを判定するために評価される。いくつかの実施形態において、許容可能な変化は、臨床医及び／または試験所によって判定され得る。いくつかの実施形態において、許容可能な変化は、本明細書に記載されるような、有害事象（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥグレード３以下）、重篤な有害事象、特に注目すべき有害事象、及び／または処置下で発現した有害事象（ＣＴＣＡＥグレード３以下）を含む、安全性事象として適格でないものであり得る。バイオセーフティ尺度は、ＬＮＰ組成物の投与に関連するものを含め、当技術分野において公知である。バイオセーフティ尺度の許容可能なレベル及び／または変化は、当技術分野において公知であり、慣例的方法によって評価され得る。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベルは、本明細書に記載される対象組み入れ基準に含まれるもの及び／または対象除外基準に含まれないものである。
いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化は、ある期間の後に許容可能である変化、例えば、最初は許容可能なレベルを外れるが、例えば投与後２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、または２８日目までに許容可能なレベルに安定化する変化である。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化は、前記バイオセーフティ尺度の正常上限の１５０％以内及び／または前記バイオセーフティ尺度の正常下限の５０％以内、例えば、プロトロンビンＵＬＮの１５０％以内及び／またはフィブリノゲンのＬＬＮの５０％以内に入るレベルの変化である。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）－ＣＴＣＡＥガイドライン、バージョン５．０を含むＣＴＣＡＥガイドラインによるグレード３以上の有害事象に該当しないものである。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度レベル（例えば、本明細書に記載されるような、検査パラメータ、バイタルサイン、ＥＣＧデータ、身体検査などに関連する１つ以上のレベル）における変化は、その変化が、例えば、臨床兆候もしくは症状を誘導する；積極的介入を必要とする；ＬＮＰ組成物の中断もしくは中止を必要とする；及び／またはバイオセーフティ尺度における変化が臨床的に有意であると臨床医が判定した場合に、有害事象に該当する。
いくつかの実施形態において、有害事象は、必ずしも処置との因果関係を有するとは限らない、治験薬を投与されたかまたは研究上の措置を受けた対象における、あらゆる不都合な医学的出来事である。いくつかの実施形態において、有害事象は、医薬（治験）品に関連するか否かにかかわらず、処置に時間的に関連する、意図されない兆候（異常な検査所見を含む）、症状、または疾患である。いくつかの実施形態において、有害事象は、臨床兆候または症状を誘導する。いくつかの実施形態において、有害事象は、積極的介入を必要とする。いくつかの実施形態において、有害事象は、処置の中断または中止を必要とする。いくつかの実施形態において、有害事象は、治験責任医師の意見において臨床的に有意な異常である。有害事象のグレーディング基準は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）を含むＣＴＣＡＥなど、当技術分野では公知である。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、重篤な有害事象に該当しないものである。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、死に至る。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、生命を脅かす（例えば、臨床医により判定される差し迫った死亡リスクに対象を晒す）。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、持続的または重大な能力障害をもたらす。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、普通の生活機能を行う能力の欠如または実質的な妨害をもたらす。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、先天異常または出生時欠損をもたらす。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、患者の入院を必要とするか、または入院延長につながる。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、特に注目すべき有害事象に該当しないものである。いくつかの実施形態において、特に注目すべき有害事象は、例えば、注入関連反応（ＩＲＲ）（例えば、処置もしくは注入中止を必要とするもの、及び／またはグレード３以上）、血栓の発生、出血の発生、ＣＴＣＡＥグレード２以上の異常な血液検査結果、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＡＬＴ上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＡＳＴ上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上の総ビリルビン上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＧＬＤＨ上昇、サイトカイン放出症候群の発生、脾臓への影響に起因する事象（脾臓出血、脾臓梗塞、ときに血小板減少症、ときに貧血、または血球の顕微鏡検査で特定の異常所見を認めるリンパ球減少症）、副腎への影響に起因する事象、臨床的に意義のある症状または甲状腺機能低下、及びビタミンＡ欠乏症と一致する眼事象を含む。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、処置下で発現した有害事象の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）グレード３以上に該当しないものである。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、神経系障害（例えば、頭痛、末梢性感覚神経障害）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、胃腸障害（例えば、下痢、悪心）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、傷害、被毒、及び手技上の合併症（例えば、注入関連反応、皮膚擦過傷）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、耳及び迷路器官の障害（例えば、頭位性眩暈）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、眼障害（例えば眼内異物感）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、全身性障害または投与部位の状態（例えば、カテーテル部位腫脹）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、感染または外寄生（例えば、急性副鼻腔炎）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、チロキシンの減少である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、呼吸器、胸部、または縦隔の障害（例えば、鼻漏）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、皮膚及び皮下組織の障害（例えば、そう痒、発疹）である。
インビボ編集の方法は、例えば、凝固、血液学、臨床化学、尿検査、及び他の生物分析評価（例えば、サイトカイン、補体）に広く関連する公知の検査評価項目を測定することを含み得る。特定のバイオセーフティ尺度は、次の非限定的なバイオセーフティ尺度：肝酵素、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のレベル、プロトロンビン時間（ＰＴ）のレベル、トロンビン生成時間（ＴＧＴ）のレベル（例えば、ピーク高さ、ラグタイム、及び／または内因性トロンビン産生能）、フィブリノゲンのレベル、プロトロンビン国際標準化（ＩＮＲ）比、ｄダイマーのレベル、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、遊離チロキシン、遊離トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＨＢＶ、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ Ａｂ、播種性血管内凝固と一致する検査パラメータ、血液学検査値の変化、化学検査値の変化、凝固の変化、尿検査における変化、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベル、Ｃ反応性タンパク質のレベル、補体（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｂｂ）のレベル、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１）のレベル、チロキシン（Ｔ４レベル）（例えば、処置投与後の正常範囲を下回るレベル低下または甲状腺機能低下の臨床的に意義のある症状／兆候）、急性肝傷害（例えば、処置投与後の、ＣＴＣＡＥグレード２を超えるＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビンもしくはＧＬＤＨの上昇、または肝傷害の臨床的に意義のある症状／兆候）、及び１２誘導心電図の変化のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
例えば、血液学、凝固、臨床化学、及び尿検査に関連する他のバイオセーフティ尺度は、当技術分野において公知である。例えば、血液学に関連するバイオセーフティ尺度は、血小板数、ＲＢＣ数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、ＲＢＣ指数（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＲＤＷ）、網赤血球率（％）、ＷＢＣ数と分画（好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球）を含むが、これらに限定されない。例えば、凝固に関連するバイオセーフティ尺度は、ａＰＴＴ、ＰＴ、ＩＮＲ、フィブリノゲン、ｄダイマー、及びＴＧＴを含むが、これらに限定されない。例えば、臨床化学に関連するバイオセーフティ尺度は、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチニン、非絶食時グルコース、カリウム、ナトリウム、塩化物、二酸化炭素、カルシウム、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン及び直接ビリルビン、総タンパク質、クレアチンキナーゼ、ラクトースデヒドロゲナーゼ、総コレステロール、ならびにＬＤＬコレステロールを含むが、これらに限定されない。例えば、尿検査に関連するバイオセーフティ尺度は、比重、ｐＨ、グルコース、タンパク質、血液、ケトン、ビリルビン、ウロビリノゲン、亜硝酸塩、及び白血球エステラーゼを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定される。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与前及び投与後に測定され、それによって、ＬＮＰ組成物による処置前及び処置後のバイオセーフティ尺度のレベルの比較が可能になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与前に測定されたバイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定されたバイオセーフティ尺度の１つ以上のレベルに対する比較のためのベースラインとなり得る。いくつかの実施形態において、ベースラインは、ＬＮＰ組成物の投与前に得られた、入手可能な最後の測定値である。これらの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、肝酵素レベルにおける許容可能な変化（例えば、処置投与後４週間超にわたるＡＬＴまたはＡＳＴ＞５×ＵＬＮを超えない上昇、処置投与後のＡＬＴまたはＡＳＴ＞３×ＵＬＮ及び総ビリルビン＞２×ＵＬＮ（Ｈｙの法則）を超えない上昇）をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のレベル（例えば、処置投与後４週間超にわたるａＰＴＴ＞５×ＵＬＮの上昇）における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、プロトロンビン時間（ＰＴ）のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、トロンビン生成時間（ＴＧＴ）のレベル（例えば、ピーク高さ、ラグタイム、及び／または内因性トロンビン産生能）における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、フィブリノゲンのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、プロトロンビン国際標準化（ＩＮＲ）比における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、ｄダイマーのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、播種性血管内凝固と一致する検査パラメータにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、血液学検査値（例えば、処置投与後のＣＴＣＡＥグレード２を超える異常な血液検査結果）における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、化学検査値における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、臨床的に意義のある異常出血によって定義される異常な凝固の所見における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、尿検査における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、Ｃ反応性タンパク質のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、補体のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、サイトカインのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。
これらの実施形態において、組成物の投与は、ＣＴＣＡＥガイドラインによるグレード３以上の処置下で発現した有害事象に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、血栓の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、出血の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、播種性血管内凝固の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、サイトカイン放出症候群の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、脾臓への影響に起因する所見（脾臓出血、脾臓梗塞、ときに血小板減少症、ときに貧血、または血球の顕微鏡検査で特定の異常所見を認めるリンパ球減少症）に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、副腎への影響に起因する所見に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、ビタミンＡ欠乏症と一致する眼科的所見に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、チロキシンのレベル（Ｔ４レベル）における許容可能な変化をもたらす（例えば、処置投与後、レベルを正常範囲未満に低下させることもなければ、甲状腺機能低下の臨床的に意義のある症状／兆候に該当することもない）。これらの実施形態において、組成物の投与は、急性肝傷害（例えば、処置投与後の、ＣＴＣＡＥグレード２を超えるＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビンもしくはＧＬＤＨの上昇、または肝傷害の臨床的に意義のある症状／兆候）に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、臨床医によって判定される１２誘導心電図における許容可能な変化をもたらす。
いくつかの実施形態において、遺伝子のインビボ編集の方法は、ヒト対象に、有効量の、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を全身投与することを含み、投与は、抗Ｃａｓ抗体（例えば、抗Ｃａｓ９抗体）のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、リピドＡの薬物動態における許容可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋの薬物動態における許容可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの薬物動態における許容可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、ｓｇＲＮＡの薬物動態における許容可能な変化をもたらす。
２． 処置方法
遺伝子のインビボ編集によってヒト対象を処置する方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、肝遺伝子産物の異常な発現または活性から生じる単一遺伝子障害を処置する。単一遺伝子障害は、肝臓内の遺伝子または肝遺伝子産物の異常な発現もしくは活性を引き起こす非コード領域に対する編集（例えば、単一の編集）によって処置され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、タンパク質である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、肝臓内の遺伝子または肝遺伝子産物の異常な発現もしくは活性を引き起こす非コード領域に対する編集は、遺伝子産物のレベル（例えば、血清レベル）を低下させる。いくつかの実施形態において、本方法は、肝臓における（例えば、肝細胞における）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングし、編集する。いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害は、ＡＴＴＲである。
いくつかの実施形態において、遺伝子のインビボ編集の方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することと、バイオセーフティ尺度のレベルを判定することとを含む。いくつかの実施形態において、処置方法は、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において起こる遺伝子のインビボ編集を含む。
いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することと、投与前の対象におけるバイオセーフティ尺度の第１のレベルを判定することと、投与後のある期間の対象におけるバイオセーフティ尺度の第２のレベルを判定することと、バイオセーフティ尺度の第１のレベルと第２のレベルとの間の変化を評価することとを含む。
いくつかの実施形態において、処置方法は、対象の肝細胞における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを投与することを含む。
いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与して、肝臓内の遺伝子を編集することを含む。いくつかの実施形態において、単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与して、異常な肝遺伝子産物の生産をノックダウンすることを含む。いくつかの実施形態において、処置方法は、細胞集団における肝遺伝子産物の生産をノックダウンする。いくつかの実施形態において、処置方法は、肝臓における単一の編集後に、肝遺伝子産物の長期的なノックダウン（例えば、永続的なノックダウン）をもたらす。いくつかの実施形態において、処置方法は、例えば累積効果によって編集を最大化するために、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を２回以上、例えば、１、２、３、４、または５回投与することを含む。いくつかの実施形態において、処置方法は、有効な低下を達成する（例えば、ベースラインレベルと比べた肝遺伝子産物のレベルにおける少なくとも６０％の低下を達成する）ために、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を２回以上（例えば２回）投与することを含む。
処置方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、さらにバイオセーフティ尺度のレベルを判定することとを含む。これらの実施形態において、対象へのＬＮＰ組成物の投与は、バイオセーフティ尺度における変化に関連し得る。いくつかの実施形態において、対象は、バイオセーフティ尺度における変化が許容可能な変化であるかどうかを判定するために評価される。いくつかの実施形態において、許容可能な変化は、臨床医及び／または試験所によって判定され得る。いくつかの実施形態において、許容可能な変化は、本明細書に記載されるような、有害事象（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥグレード３以下）、重篤な有害事象、特に注目すべき有害事象、及び／または処置下で発現した有害事象（ＣＴＣＡＥグレード３以下）を含む、安全性事象として適格でないものであり得る。バイオセーフティ尺度は、ＬＮＰ組成物の投与に関連するものを含め、当技術分野において公知である。バイオセーフティ尺度の許容可能なレベル及び／または変化は、当技術分野において公知であり、慣例的方法によって評価され得る。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベルは、本明細書に記載される対象組み入れ基準に含まれるもの及び／または対象除外基準に含まれないものである。
いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化は、ある期間の後に許容可能である変化、例えば、最初は許容可能なレベルを外れるが、例えば投与後２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１４日目、または２８日目までに許容可能なレベルに安定化する変化である。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化は、前記バイオセーフティ尺度の正常上限の１５０％以内及び／または前記バイオセーフティ尺度の正常下限の５０％以内、例えば、プロトロンビンＵＬＮの１５０％以内及び／またはフィブリノゲンのＬＬＮの５０％以内に入るレベルの変化である。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）－ＣＴＣＡＥガイドライン、バージョン５．０を含むＣＴＣＡＥガイドラインによるグレード３以上の有害事象に該当しないものである。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度レベル（例えば、本明細書に記載されるような、検査パラメータ、バイタルサイン、ＥＣＧデータ、身体検査などに関連する１つ以上のレベル）における変化は、その変化が、例えば、臨床兆候もしくは症状を誘導する；積極的介入を必要とする；ＬＮＰ組成物の中断もしくは中止を必要とする；及び／またはバイオセーフティ尺度における変化が臨床的に有意であると臨床医が判定した場合に、有害事象に該当する。
いくつかの実施形態において、有害事象は、必ずしも処置との因果関係を有するとは限らない、治験薬を投与されたかまたは研究上の措置を受けた対象における、あらゆる不都合な医学的出来事である。いくつかの実施形態において、有害事象は、医薬（治験）品に関連するか否かにかかわらず、処置に時間的に関連する、意図されない兆候（異常な検査所見を含む）、症状、または疾患である。いくつかの実施形態において、有害事象は、臨床兆候または症状を誘導する。いくつかの実施形態において、有害事象は、積極的介入を必要とする。いくつかの実施形態において、有害事象は、処置の中断または中止を必要とする。いくつかの実施形態において、有害事象は、治験責任医師の意見において臨床的に有意な異常である。有害事象のグレーディング基準は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）を含むＣＴＣＡＥなど、当技術分野では公知である。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、重篤な有害事象に該当しないものである。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、死に至る。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、生命を脅かす（例えば、臨床医により判定される差し迫った死亡リスクに対象を晒す）。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、持続的または重大な能力障害をもたらす。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、普通の生活機能を行う能力の欠如または実質的な妨害をもたらす。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、先天異常または出生時欠損をもたらす。いくつかの実施形態において、重篤な有害事象は、患者の入院を必要とするか、または入院延長につながる。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、特に注目すべき有害事象に該当しないものである。いくつかの実施形態において、特に注目すべき有害事象は、例えば、注入関連反応（ＩＲＲ）（例えば、処置もしくは注入中止を必要とするもの、及び／またはグレード３以上）、血栓の発生、出血の発生、ＣＴＣＡＥグレード２以上の異常な血液検査結果、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＡＬＴ上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＡＳＴ上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上の総ビリルビン上昇、ＣＴＣＡＥグレード２以上のＧＬＤＨ上昇、サイトカイン放出症候群の発生、脾臓への影響に起因する事象（脾臓出血、脾臓梗塞、ときに血小板減少症、ときに貧血、または血球の顕微鏡検査で特定の異常所見を認めるリンパ球減少症）、副腎への影響に起因する事象、臨床的に意義のある症状または甲状腺機能低下、及びビタミンＡ欠乏症と一致する眼事象を含む。
いくつかの実施形態において、許容可能なバイオセーフティ尺度レベル（またはバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化）は、処置下で発現した有害事象の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）グレード３以上に該当しないものである。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、神経系障害（例えば、頭痛、末梢性感覚神経障害）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、胃腸障害（例えば、下痢、悪心）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、傷害、被毒、及び手技上の合併症（例えば、注入関連反応、皮膚擦過傷）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、耳及び迷路器官の障害（例えば、頭位性眩暈）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、眼障害（例えば眼内異物感）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、全身性障害または投与部位の状態（例えば、カテーテル部位腫脹）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、感染または外寄生（例えば、急性副鼻腔炎）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、チロキシンの減少である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、呼吸器、胸部、または縦隔の障害（例えば、鼻漏）である。いくつかの実施形態において、処置下で発現した有害事象は、皮膚及び皮下組織の障害（例えば、そう痒、発疹）である。
インビボ編集の方法は、例えば、凝固、血液学、臨床化学、尿検査、及び他の生物分析評価（例えば、サイトカイン、補体）に広く関連する公知の検査評価項目を測定することを含み得る。特定のバイオセーフティ尺度は、次の非限定的なバイオセーフティ尺度：肝酵素、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のレベル、プロトロンビン時間（ＰＴ）のレベル、トロンビン生成時間（ＴＧＴ）のレベル（例えば、ピーク高さ、ラグタイム、及び／または内因性トロンビン産生能）、フィブリノゲンのレベル、プロトロンビン国際標準化（ＩＮＲ）比、ｄダイマーのレベル、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、遊離チロキシン、遊離トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＨＢＶ、ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ Ａｂ、播種性血管内凝固と一致する検査パラメータ、血液学検査値の変化、化学検査値の変化、凝固の変化、尿検査における変化、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベル、Ｃ反応性タンパク質のレベル、補体（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｂｂ）のレベル、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＭＣＰ－１）のレベル、チロキシン（Ｔ４レベル）（例えば、処置投与後の正常範囲を下回るレベル低下または甲状腺機能低下の臨床的に意義のある症状／兆候）、急性肝傷害（例えば、処置投与後の、ＣＴＣＡＥグレード２を超えるＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビンもしくはＧＬＤＨの上昇、または肝傷害の臨床的に意義のある症状／兆候）、及び１２誘導心電図の変化のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
例えば、血液学、凝固、臨床化学、及び尿検査に関連する他のバイオセーフティ尺度は、当技術分野において公知である。例えば、血液学に関連するバイオセーフティ尺度は、血小板数、ＲＢＣ数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、ＲＢＣ指数（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＲＤＷ）、網赤血球率（％）、ＷＢＣ数と分画（好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球）を含むが、これらに限定されない。例えば、凝固に関連するバイオセーフティ尺度は、ａＰＴＴ、ＰＴ、ＩＮＲ、フィブリノゲン、ｄダイマー、及びＴＧＴを含むが、これらに限定されない。例えば、臨床化学に関連するバイオセーフティ尺度は、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチニン、非絶食時グルコース、カリウム、ナトリウム、塩化物、二酸化炭素、カルシウム、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン及び直接ビリルビン、総タンパク質、クレアチンキナーゼ、ラクトースデヒドロゲナーゼ、総コレステロール、ならびにＬＤＬコレステロールを含むが、これらに限定されない。例えば、尿検査に関連するバイオセーフティ尺度は、比重、ｐＨ、グルコース、タンパク質、血液、ケトン、ビリルビン、ウロビリノゲン、亜硝酸塩、及び白血球エステラーゼを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定される。いくつかの実施形態において、バイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与前及び投与後に測定され、それによって、ＬＮＰ組成物による処置前及び処置後のバイオセーフティ尺度のレベルの比較が可能になる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与前に測定されたバイオセーフティ尺度のレベルは、ＬＮＰ組成物の投与後に測定されたバイオセーフティ尺度の１つ以上のレベルに対する比較のためのベースラインとなり得る。いくつかの実施形態において、ベースラインは、ＬＮＰ組成物の投与前に得られた、入手可能な最後の測定値である。これらの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、肝酵素レベルにおける許容可能な変化（例えば、処置投与後４週間超にわたるＡＬＴまたはＡＳＴ＞５×ＵＬＮを超えない上昇、処置投与後のＡＬＴまたはＡＳＴ＞３×ＵＬＮ及び総ビリルビン＞２×ＵＬＮ（Ｈｙの法則）を超えない上昇）をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のレベル（例えば、処置投与後４週間超にわたるａＰＴＴ＞５×ＵＬＮの上昇）における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、プロトロンビン時間（ＰＴ）のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、トロンビン生成時間（ＴＧＴ）のレベル（例えば、ピーク高さ、ラグタイム、及び／または内因性トロンビン産生能）における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、フィブリノゲンのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、プロトロンビン国際標準化（ＩＮＲ）比における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、ｄダイマーのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、播種性血管内凝固と一致する検査パラメータにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、血液学検査値（例えば、処置投与後のＣＴＣＡＥグレード２を超える異常な血液検査結果）における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、化学検査値における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、臨床的に意義のある異常出血によって定義される異常な凝固の所見における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、尿検査における許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、Ｃ反応性タンパク質のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、補体のレベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、サイトカインのレベルにおける許容可能な変化をもたらす。
これらの実施形態において、組成物の投与は、ＣＴＣＡＥガイドラインによるグレード３以上の処置下で発現した有害事象に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、血栓の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、出血の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、播種性血管内凝固の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、サイトカイン放出症候群の発生に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、脾臓への影響に起因する所見（脾臓出血、脾臓梗塞、ときに血小板減少症、ときに貧血、または血球の顕微鏡検査で特定の異常所見を認めるリンパ球減少症）に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、副腎への影響に起因する所見に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、ビタミンＡ欠乏症と一致する眼科的所見に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、チロキシンのレベル（Ｔ４レベル）における許容可能な変化をもたらす（例えば、処置投与後、レベルを正常範囲未満に低下させることもなければ、甲状腺機能低下の臨床的に意義のある症状／兆候に該当することもない）。これらの実施形態において、組成物の投与は、急性肝傷害（例えば、処置投与後の、ＣＴＣＡＥグレード２を超えるＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビンもしくはＧＬＤＨの上昇、または肝傷害の臨床的に意義のある症状／兆候）に該当しないバイオセーフティ尺度レベルにおける許容可能な変化をもたらす。これらの実施形態において、組成物の投与は、臨床医によって判定される１２誘導心電図における許容可能な変化をもたらす。
ＴＴＲ遺伝子のインビボ編集によってヒト対象を処置する方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子のインビボ編集の方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することと、上述のようなバイオセーフティ尺度のレベルを判定することとを含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子のインビボ編集は、対象の肝細胞においてガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において起こる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるようなＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）に罹患したヒト対象を処置する方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、遺伝性ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｖ）に罹患したヒト対象を処置するためのものである。いくつかの実施形態において、本方法は、非遺伝性（野生型）ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｗｔ）に罹患したヒト対象を処置するためのものである。いくつかの実施形態において、本方法は、ＡＴＴＲｖ－ＰＮに罹患したヒト対象を処置するためのものである。いくつかの実施形態において、本方法は、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ、別称ＡＴＴＲｖ－ＣＭ）に罹患したヒト対象を処置するためのものである。いくつかの実施形態において、本方法は、野生型ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｗｔ－ＣＭ）に罹患したヒト対象を処置するためのものである。いくつかの実施形態において、本方法は、ＡＴＴＲ－ＣＭ、ＮＹＨＡクラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩに罹患したヒト対象を処置するためのものである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含み、それによってＡＴＴＲを処置し、組成物の投与が、対象における臨床尺度のレベルにおいて、臨床尺度のベースラインレベルと比較して臨床的に有意な向上をもたらす、方法である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含み、それによってＡＴＴＲを処置し、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡが、約２５～約１００ｍｇの合計用量で投与される、方法である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含み、それによってＡＴＴＲを処置し、組成物の投与が、血清ＴＴＲをベースライン血清と比べて低下させる、方法である。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲは、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲは、野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲは、多発神経障害を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲは、心筋症を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである。ＡＴＴＲが心筋症を伴う野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである実施形態において、対象は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の下でクラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩに分類される。いくつかの実施形態において、ＡＴＴＲは、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及び／またはＡＴＴＲ－ＣＭである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質を含む。ＬＮＰがＰＥＧ脂質を含む実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む。ＰＥＧ脂質がジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－２ｋを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、約５～７のＮ／Ｐ比を有する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、重量基準で約５：１から約１：５までの範囲をとる比率で存在する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードする。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、コドン最適化されている。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。ガイドＲＮＡが少なくとも１つの修飾を含む実施形態において、ガイドＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．３ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約０．７ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約１．０ｍｇ／ｋｇの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約２５ｍｇ～約１５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約２５ｍｇ～約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５０ｍｇ～約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約４０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約６０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約７０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約８０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの有効量は、約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、組成物の投与前のベースライン血清ＴＴＲと比較して、血清ＴＴＲを６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる。いくつかの実施形態において、血清ＴＴＲレベルは、組成物の投与後に約５０μｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、血清ＴＴＲレベルは、組成物の投与後に約４０μｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、血清ＴＴＲレベルは、組成物の投与後に約３０μｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、血清ＴＴＲレベルは、組成物の投与後に約２０μｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、血清ＴＴＲレベルは、組成物の投与後に約１０μｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、本方法は、ＬＮＰ組成物の第２の用量を投与することをさらに含み、第２の用量の投与は、第１の用量の投与前のベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて血清ＴＴＲレベルを少なくとも８０％低下させる。いくつかの実施形態において、本方法は、ＬＮＰ組成物の第２の用量を投与することをさらに含み、第２の用量の投与は、第２の用量の投与前かつ第１の用量の投与後のベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて血清ＴＴＲレベルを少なくとも８０％低下させる。いくつかの実施形態において、組成物は、第２の治療薬と共に投与される。いくつかの実施形態において、第２の治療薬は、ジフルニサルまたはタファミジスである。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に既にＡＴＴＲと診断されているか、または処置と同時にＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、遺伝子検査（例えば、ＴＴＲ突然変異の記録）に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、感覚運動末梢神経障害の臨床診断に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、５以上かつ１３０以下の神経障害スコア（ＮＩＳ）に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、生検または妥当性確認済みの非侵襲的イメージングによるＴＴＲアミロイドの組織沈着の記録に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、３ｂ以下の多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアに基づいてＡＴＴＲと診断される。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ症状の進行がある。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアにおける１ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）ステージにおける１ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、神経障害スコア（ＮＩＳ）における５ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ＮＩＳ－下肢（ＬＬ）における５ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、補正体格指数（ｍＢＭＩ）における２５ｋｇ／ｍ２×ｇ／Ｌ以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、６分間歩行試験における３０メートル以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、１０メートル歩行試験における０．１ｍ／ｓ以上の減少を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＴＴＲ低下療法を受けている間にＡＴＴＲの進行がある対象を処置する方法である。いくつかの実施形態において、処置方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含み、対象は、異なるＡＴＴＲ療法によって処置されたことがあるか、または現在処置されている。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、ｍＮＩＳ＋７スコアなどの臨床有効性尺度によって測定した場合、異なるＡＴＴＲ療法を受けている間にＡＴＴＲの進行がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物が投与される対象は、イノテルセンで処置されたことがあるか、または現在処置されており、かつＡＴＴＲの進行を呈する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物が投与される対象は、パチシランで処置されたことがあるか、または現在処置されており、かつＡＴＴＲの進行がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物が投与される対象は、ジフルニサルで処置されたことがあるか、または現在処置されており、かつＡＴＴＲの進行がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物が投与される対象は、タファミジスで処置されたことがあるか、または現在処置されており、かつＡＴＴＲの進行がある。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子のインビボ編集の方法は、ヒト対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、有効量の、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を全身投与することを含み、臨床尺度のレベルにおける臨床的に有意な向上をもたらす。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、さらに１つ以上の臨床有効性尺度を判定することとを含み、臨床有効性尺度は、血清ＴＴＲの減少（例えば、処置投与後にＥＬＩＳＡによる測定で血清ＴＴＲの６０％の減少）、血清ＴＴＲの減少（例えば、処置投与後に質量分析による測定で血清ＴＴＲの６０％の減少）、血清プレアルブミンの減少、多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアの低下、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）ステージの低下、神経障害スコア（ＮＩＳ）の減少、補正神経障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）の減少、神経障害スコア（ＮＩＳ）－下肢（ＬＬ）の減少、補正体格指数（ｍＢＭＩ）における２５ｋｇ／ｍ２×ｇ／Ｌ以上の増加、６分間歩行試験（６－ＭＷＴ）における３０メートル以上の増加、及び１０メートル歩行試験（１０－ＭＷＴ）における０．１メートル／秒以上の増加を含むが、これらに限定されない。追加の臨床有効性尺度としては、血清ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）レベルの向上、Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ－Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙによって評価される生活の質の向上、ＥｕｒｏＱＯＬ（ＥＱ）－５Ｄ－５Ｌによって評価される生活の質の向上、心臓ＭＲＩの向上（例えば、細胞外容積の減少）、脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルの向上、トロポニンＩレベルの向上、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の向上、及びＫａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＫＣＣＱ）によるスコアの向上が挙げられる。ＴＴＲアミロイドーシスに対する有効性を評価するための尺度を含め、追加の臨床有効性尺度が、当技術分野では公知である。同様に、ＴＴＲアミロイドーシスを含む疾患の改善を示す臨床有効性尺度のレベル及び／または変化は、当技術分野では公知であり、慣例的方法によって、例えば、臨床医または試験所によって評価され得る。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、ＬＮＰ組成物の投与後に臨床有効性尺度を測定することとを含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、ＬＮＰ組成物の投与前及び投与後に臨床有効性尺度を測定することとを含み、それによって、ＬＮＰ組成物による処置前及び処置後の臨床有効性尺度のレベルの比較が可能になる。
例えば、血清ＴＴＲレベルは、ＴＴＲアミロイドーシスに関する臨床有効性尺度である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、対象における血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルを低下させることとを含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）に、対象における血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルを、例えば処置前のベースラインと比較して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上低下させることとを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも６０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも７０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも８０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも８５％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも９０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも９５％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）に、対象における血清ＴＴＲレベルなどのＴＴＲレベルを、ベースラインと比較して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下させることとを含む。
ＴＴＲの血清レベルを測定する方法は、例えばＥＬＩＳＡなど、当技術分野では公知である。
例えば、血清プレアルブミンレベルは、ＴＴＲアミロイドーシスに関する臨床有効性尺度である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、対象における血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルを低下させることとを含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物を投与することと、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）に、対象における血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルを、例えば処置前のベースラインと比較して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上低下させることとを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも６０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも７０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも８０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも８５％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも９０％の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＴＲに関連するアミロイドーシスを処置する方法は、処置後（例えば、ＬＮＰ組成物の投与から１４日後または２８日後）の血清プレアルブミンレベルなどのＴＴＲレベルにおいて、ベースラインと比較して少なくとも９５％の低下をもたらす。プレアルブミンの血清レベルを測定する方法は、例えばＥＬＩＳＡなど、当技術分野では公知である。
他の実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、対象における血清ＴＴＲレベルを約５０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約４０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約３０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約２０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物の投与は、血清ＴＴＲレベルを約１０μｇ／ｍＬ未満に低下させる。
いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインレベルと比較した血清プレアルブミンの減少をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアをベースラインから少なくとも１ポイント減少させる。いくつかの実施形態において、処置は、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）ステージをベースラインから少なくとも１ポイント減少させる。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した神経障害スコア（ＮＩＳ）における少なくとも１ポイントの減少をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した補正神経障害スコア（ｍＮＩＳ＋７）における減少をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した神経障害スコア（ＮＩＳ）－下肢（ＬＬ）における減少をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した補正体格指数の増加（例えば、（ｍＢＭＩ）≧２５ｋｇ／ｍ２×ｇ／Ｌ）をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した６分間歩行試験（６－ＭＷＴ）における３０メートル以上の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した１０メートル歩行試験（１０－ＭＷＴ）における０．１メートル／秒以上の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した血清ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）レベルの向上をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した、Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ－Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙによって評価される生活の質の向上をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した、ＥｕｒｏＱＯＬ（ＥＱ）－５Ｄ－５Ｌによって評価される生活の質の向上をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した心臓ＭＲＩ（例えば、アミロイド原線維の心臓イメージング）の向上をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）レベルの向上をもたらし、いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較したトロポニンＩレベルの向上をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較したＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の向上をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、ベースラインと比較した、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＫＣＣＱ）によるスコアの向上をもたらす。
いくつかの実施形態において、処置は、ＦＡＰの進行を緩徐化または停止させる。いくつかの実施形態において、処置は、感覚運動神経障害または自律神経障害の症状における変化の向上、安定化、または緩徐化をもたらす。
いくつかの実施形態において、処置は、ＦＡＣの症状における変化の向上、安定化、または緩徐化をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、拘束型心筋症またはうっ血性心不全の症状の変化の向上、安定化、または緩徐化をもたらす。
いくつかの実施形態において、処置の有効性は、感覚運動または自律神経障害の症状における向上、または進行の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、身体の一領域の運動能力もしくは身体のいずれかの領域の知覚能力における増加、または当該能力の減少の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、嚥下能力、呼吸能力、腕、手、脚、もしくは足の使用能力、または歩行能力における向上、または当該能力の減少の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、神経痛の向上、または進行の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、神経痛は、疼痛、灼熱感、刺痛、または異常感を特徴とする。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、体位性低血圧、眩暈感、消化管運動障害、膀胱機能異常、もしくは性機能異常における向上、または増大の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、脱力感の向上、または進行の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、筋電図、神経伝導検査、または対象により報告された転帰を使用して測定される。
いくつかの実施形態において、処置の有効性は、うっ血性心不全またはＣＨＦの症状の向上、または進行の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、息切れ、呼吸困難、疲労、または足首、足、腹部、もしくは頸部静脈の腫脹の減少、または増大の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、体重増加、頻尿、または夜間の咳などの測度によって評価され得る体内の液体蓄積の向上、または進行の緩徐化によって測定される。いくつかの実施形態において、処置の有効性は、心臓バイオマーカー検査（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド［ＢＮＰ］またはＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド［ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ］など）、肺機能検査、胸部ｘ線、または心電図検査を使用して測定される。
いくつかの実施形態において、処置は、対象の生存期間の延長をもたらす。いくつかの実施形態において、処置は、疾患進行を緩徐化または停止させる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物による処置の有効性は、送達後２週目、４週目、２か月目、４か月目、６か月目、９か月目、１年目、２年目、３年目、４年目、５年目、または１０年目に見られる。
他の実施形態において、ＬＮＰ組成物はまた、第２の治療剤と共に投与される。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、四量体型のＴＴＲの安定化剤である。いくつかの実施形態において、第２の治療薬は、ジフルニサルまたはタファミジスである。
ａ． 対象組み入れ基準
いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及びＡＴＴＲ－ＣＭ）を有し、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）が投与される対象は、以下の対象組み入れ基準のうちの１つ以上について評価される。
ｉ． ＡＴＴＲｖ－ＰＮ対象組み入れ基準
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、既にＡＴＴＲと診断されているか、または同時にＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、遺伝子検査（例えば、ＴＴＲ突然変異の記録）に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、感覚運動末梢神経障害の臨床診断に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、５以上かつ１３０以下の神経障害スコア（ＮＩＳ）に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、生検または妥当性確認済みの非侵襲的イメージングによるＴＴＲアミロイドの組織沈着の記録に基づいてＡＴＴＲと診断される。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、３ｂ以下の多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアに基づいてＡＴＴＲと診断される。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置の前に、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ症状の進行がある。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアにおける１ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、家族性アミロイド多発神経障害（ＦＡＰ）ステージにおける１ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、神経障害スコア（ＮＩＳ）における５ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ＮＩＳ－下肢（ＬＬ）における５ポイント以上の増加を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、補正体格指数（ｍＢＭＩ）における２５ｋｇ／ｍ２×ｇ／Ｌ以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、６分間歩行試験における３０メートル以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、１０メートル歩行試験における０．１ｍ／ｓ以上の減少を有する。これら及び他の組み入れ基準の評価は、当技術分野では公知である。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、投与時に１８歳～８０歳である。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ＴＴＲ突然変異の記録（例えば、全ＴＴＲ遺伝子シークエンシング情報）に基づく、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）に起因する末梢神経障害（ＰＮ）の診断を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、感覚運動末梢神経障害の診断を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、５以上かつ１３０以下の神経障害スコア（ＮＩＳ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、生検または妥当性確認済みの非侵襲的イメージングによるＴＴＲアミロイドの組織沈着の記録を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、３ｂ以下の多発神経障害性能力障害（ＰＮＤ）スコアを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、約５０ｋｇ～９０ｋｇの体重を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、約５０ｋｇ～１２０ｋｇの体重を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に正常上限（ＵＬＮ）以下のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に正常上限（ＵＬＮ）以下のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に正常上限（ＵＬＮ）以下の総ビリルビンレベルを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に正常上限（ＵＬＮ）以下の国際標準化比（ＩＮＲ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に４５ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２を超える（例えば、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ方程式によって測定された）推定糸球体濾過率（ＧＦＲ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に１００，０００細胞／ｍｍ３以上の血小板数を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に２，０００ｐｇ／ｍＬ未満の脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に２００ｍｇ／ｄＬ未満の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に正常下限（ＬＬＮ）以上のビタミンＡを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に正常範囲以内の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時にＬＬＮ以上のビタミンＢ１２レベルを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、心エコー図を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は男性であり、投与後８４日間にわたり精子を寄付しないことに同意しなければならない。
ｉｉ． ＡＴＴＲ－ＣＭ対象組み入れ基準
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、心筋症を伴う遺伝性ＡＴＴＲ（ＡＴＴＲｖ）アミロイドーシスまたは野生型心筋症（ＡＴＴＲｗｔ）と分類される、心筋症を伴うトランスサイレチン（ＡＴＴＲ）アミロイドーシスの診断の記録を有する。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、少なくとも１つの心不全入院歴及び／または心不全の臨床的証拠を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）クラスＩ～ＩＩＩの心不全を有する。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング前に少なくとも２１日間にわたり一貫して維持された（または変化が５０％以下であった）用量で少なくとも週３回の経口利尿薬療法を受ける。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、本明細書に記載される組成物の投与前の４週間以内に心血管関連の入院がなく臨床的に安定している。
いくつかの実施形態において、ヒト対象の心不全症状は、治験責任医師による評価で最適に管理され、臨床的に安定している。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング期間中に６分間歩行試験（６－ＭＷＴ）で１５０メートル以上を完了することができる。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に少なくとも４５ｋｇの体重を有する。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニングの間、ある特定の検査基準を満たす。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、正常上限（ＵＬＮ）範囲以下のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及び総ビリルビンを有する（対象がギルバート症候群を有する場合を除く）。いくつかの実施形態において、ギルバート症候群の病歴を有するヒト対象については、対象は、スクリーニング時に２×ＵＬＮ以下の総ビリルビンを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ＣＫＤ－ＥＰＩによる測定で３０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２超の推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、１００，０００細胞／ｍｍ３以上の血小板数を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、正常範囲以内か、または治験責任医師によって臨床的に有意でないとみなされる、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、フィブリノゲン、及びｄダイマーレベルを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、６００ｐｇ／ｍＬ超のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ（または、患者が既知の心房細胞の診断を有する場合、１，０００ｐｇ／ｍＬ超のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、薬物療法の有無にかかわらず、スクリーニング時に２００ｍｇ／ｄＬ未満の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、正常下限（ＬＬＮ）以上のビタミンＡを有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、正常範囲以内の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）測定値を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に、上述の検査基準の全てを満たす。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニングの間、及び本明細書に記載される組成物による処置の２８日後まで、アルコール消費を１日当たり１アルコール飲料に制限する。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、例えばインフォームドコンセントに署名する時点で１８～９０歳（端点を含む）である男性及び／または女性の対象である。いくつかの実施形態において、女性対象は、閉経後である（例えば、スクリーニング前に別の医学的原因がない状態で１２か月にわたり月経がない。いくつかの実施形態において、ホルモン避妊法またはホルモン補充療法を使用していない女性において閉経後状態を確認するために、閉経後範囲内の高い卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レベルが使用され得る。いくつかの実施形態において、１２か月間の無月経がない場合、単一のＦＳＨ測定は不十分である）。いくつかの実施形態において、女性対象は、スクリーニングの少なくとも１か月前に不妊手術（例えば、子宮摘出術、両側卵管切除術、及び両側卵巣摘出術）をしたものである。いくつかの実施形態において、妊娠可能なまたは妊娠中のパートナー（複数可）がいる男性対象は、スクリーニング前及び治験薬投与後８４日間にわたってコンドームを使用することに同意する。いくつかの実施形態において、男性対象は、治験薬投与後８４日間にわたり精子を寄付しないことに同意する。国別のガイドラインに基づき精子の寄付が禁忌である場合には、この時間枠は８４日間を超えて延長され得る。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、医療施設における待機的手技の続行が許容可能と判定されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染または罹患のリスク（例えば、一連のワクチン接種が完了したこと、最近のＰＣＲ検査結果が陰性であったこと、またはそのような検査がもはや必要ないことの記録など）について評価される。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、投薬後少なくとも２８日間は別の介入的研究に参加しないことに同意する。
いくつかの実施形態において、スクリーニング期間中、ヒト対象は、適切なサイズのカフを用いて３つの血圧測定値の記録を行い、その各々が１４０／９０ｍｍＨｇ未満である。スクリーニング中に血圧が１４０／９０ｍｍＨｇ以上であれば、対象は、本明細書に記載される組成物の投与に進む前に、対象の３つの血圧測定値が１４０／９０ｍｍＨｇ未満になるまで、新しいまたは変更された血圧降下療法を受け、スクリーニングを続けることができる。
ｂ． 対象除外基準
いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及びＡＴＴＲ－ＣＭ）を有し、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）が投与される対象は、以下の対象除外基準のうちの１つ以上について評価される。
ｉ． ＡＴＴＲｖ－ＰＮ対象除外基準
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、非ＴＴＲタンパク質に起因するアミロイドーシス、例えば、アミロイド軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、軟髄膜トランスサイレチンアミロイドーシスを有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、いかなる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分に対しても過敏性を有しないか、または以前にＬＮＰを受け、何らかの処置関連検査異常もしくは有害事象（例えば、ＬＮＰ含有生成物を受けた後、ベースラインが正常であった場合はＡＬＴもしくはＡＳＴ＞３×ＵＬＮ、またはベースラインが正常を超えた場合は＞３×ベースライン、ＬＮＰ含有生成物を受けた後、ベースラインが正常であった場合はＩＮＲ、ａＰＴＴもしくはｄダイマー＞１．５×ＵＬＮ、またはベースラインが正常を超えた場合は＞１．５×ベースライン、ＣＴＣＡＥグレード３以上に分類されるＬＮＰ処置関連有害事象、処置または注入中止を必要とするＬＮＰ含有生成物に対する注入関連反応（ＩＲＲ））を経験している。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、感覚運動神経障害または自律神経障害（例えば、糖尿病性神経障害、自己免疫疾患関連神経障害）の他の既知の原因を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、１型真性糖尿病または２型真性糖尿病の５年以上にわたる診断を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング前の９０日以内またはスクリーニング中に、心不全または心不全症状の悪化に起因する、現在または過去のＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ症状を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、９０日以内に心血管系入院または侵襲的手技をしていない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、侵襲的心血管系手技（例えば、冠動脈ステント、ペースメーカーの留置など）をしていない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ビタミンＡ補充を受けない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、処置前の投薬レジメンを受けない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、投与１４日以内の抗血小板物質（例えば、アスピリン、クロピドグレル）または抗血栓療法（例えば、ワルファリン、ダビガトラン、アピキサバン）の使用歴を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、血栓形成傾向の既往、あるいは第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ及び／またはプロトロンビン２０２１０の遺伝子検査陽性結果を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、２年未満の予想生存期間を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ビタミンＡ欠乏症と一致する眼科的所見を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、硬変の既往を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ウイルス、寄生虫、または真菌の全身感染の既往または疑いを有せず、細菌感染のための抗生物質を受けてもいない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎の感染歴、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）もしくはＣ型肝炎ウイルス抗体（ＨＣＶ Ａｂ）の陽性検査結果を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、陽性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ステータスの履歴を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、肝臓、心臓もしくは他の固形臓器の移植もしくは骨髄移植の既往、または投与から１年以内の移植の予定を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング前の５年以内またはスクリーニング期間中に、皮膚の基底細胞癌、治癒的に切除された皮膚扁平上皮癌、治癒的に切除された子宮頸部上皮内癌、または適切な管理が観察のみである低悪性度前立腺腺癌を除いて、活動性悪性腫瘍の既往を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング前の３年以内にアルコールまたは薬物の乱用歴を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、妊娠可能なまたは授乳中の女性ではない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、投与７日以内に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ポリメラーゼ変化反応（ＰＣＲ）検査の陽性結果を有しない。
これら及び他の除外基準の評価は、当技術分野では公知である。
ｉｉ． ＡＴＴＲ－ＣＭ対象除外基準
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、非ＴＴＲタンパク質に起因するアミロイドーシス、例えば、アミロイド軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスを有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、既知の軟髄膜トランスサイレチンアミロイドーシスを有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、いかなる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分に対しても過敏性の既往を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、以前にＬＮＰを受けておらず、またいかなる処置関連検査異常または有害事象（ＡＥ）（例えば、ＬＮＰ含有生成物を受けた後、ベースラインが正常であった場合はＡＬＴもしくはＡＳＴ＞３×ＵＬＮ、またはベースラインが正常を超えた場合は＞３×ベースライン；ＬＮＰ含有生成物を受けた後、ベースラインが正常であった場合はＩＮＲ、ａＰＴＴもしくはｄダイマー＞１．５×ＵＬＮ、またはベースラインが正常を超えた場合は＞１．５×ベースライン；ＣＴＣＡＥグレード３以上と分類される何らかのＬＮＰ処置関連有害事象；処置または注入中止を必要とするＬＮＰ含有生成物に対する注入関連反応（ＩＲＲ）（いくつかの実施形態において、注入関連反応を軽減するための注入速度の緩徐化は除外対象とみなされない）；及び／または治験責任医師の意見において除外対象となるべきである何らかのＬＮＰ処置関連有害事象）も経験していない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、規定の時間枠内で、ＡＴＴＲに対する以下のＴＴＲ指向療法を使用しない：
パチシラン（低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）治療製剤ＬＮＰ）、例えば、過去の使用歴及び／または治験薬投与前９０日以内の最後の用量の投与。
イノテルセン（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））、例えば、過去の使用歴及び／または治験薬投与前１６０日以内の最後の用量の投与。
ブトリシラン（治験中のｓｉＲＮＡ治療用ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）、例えば、過去の使用歴。
タファミジス（ＴＴＲ安定化剤）、例えば、対象が治験薬投与前に少なくとも１４日間にわたり継続投与を受けている。
ジフルニサル（ＴＴＲ安定化剤）、例えば、治験薬投与前１４日以内の最後の用量の投与。
ドキシサイクリン及び／またはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＴＲ基質溶媒）、例えば、治験薬投与前１４日以内の最後の用量の投与。
実験的ＴＴＲ安定化剤（例えば、ＡＧ－１０）、例えば、治験薬投与前６か月以内の最後の用量の投与。
ＡＴＴＲｖ－ＣＭの処置のための任意の他の治験剤、例えば、治験薬投与前３０日以内または５半減期以内のいずれか長い方での最後の用量の投与。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、治験責任医師の意見において、虚血性心臓病（例えば、心筋酵素及びＥＣＧ変化の記録歴がある心筋梗塞の既往）、高血圧、または未解消の弁膜疾患によって引き起こされ、主としてトランスサイレチンアミロイド心筋症に起因するものではない、心不全を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、持続性心室頻拍もしくは心室細動の停止の既往、またはペースメーカーが適応となるが留置されない房室（ＡＶ）結節性もしくは洞房（ＳＡ）結節性の機能異常の既往を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、治験薬投与前２８日以内に、ペースメーカーまたは除細動器の留置、抗不整脈薬の開始または変更がない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ビタミンＡ補充を受けられないまたは受ける意思がないものではない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、必要な前投薬のＡＴＴＲ－ＣＭステータス管理に関連する有意義なリスクを示す臨床評価を有しない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、必要な処置前の投薬レジメンを受けられないまたは受ける意思がないものではない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、治験薬投与前１４日以内のワルファリンもしくはヘパリン／ヘパリン誘導体による抗血栓療法、または治験薬投薬後期間中にワルファリン抗血栓療法を必要とする見込みがない。いくつかの実施形態において、アピキサバン、ダビガトラン、エドキサバン、またはリバーロキサバンの使用は、用量がスクリーニング前の２８日間にわたって安定であり、スクリーニング中に安定であり、かつ治験薬投与後９０日間にわたって安定なままであると予想される場合に許可される。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、血栓形成傾向の既往、あるいは第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン２０２１０の遺伝子検査陽性歴、あるいはプロテインＳ欠乏症及び／またはプロテインＣ欠乏症のいずれかの検査陽性結果を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、治験責任医師の意見において、１年未満の予想生存期間を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、眼科検査のスクリーニングにおいてビタミンＡ欠乏症と一致する眼科的所見を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、硬変の既往を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニングの１４日以内に、ウイルス、寄生虫、または真菌の全身感染の既往または疑いを有せず、細菌感染のための抗生物質を受けてもいない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング時に、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎の感染歴、またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）もしくはＣ型肝炎ウイルス抗体（ＨＣＶ Ａｂ）の陽性検査結果を有しない。いくつかの実施形態において、硬変の証拠を有せず、Ｃ型肝炎の治癒を意図したレジメンを完了し、かつ活動性Ｃ型肝炎も上昇した肝毒性リスクも有しないと胃腸科医によって判断された対象は、除外されない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、陽性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ステータスの履歴を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、肝臓、心臓もしくは他の固形臓器の移植もしくは骨髄移植の既往、またはスクリーニングから１年以内の移植の予定を有しない。いくつかの実施形態において、角膜移植の既往歴または予定は、除外対象ではない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング前の３年以内またはスクリーニング期間中に、皮膚の基底細胞癌、治癒的に切除された皮膚扁平上皮癌、治癒的に切除された子宮頸部上皮内癌、または適切な管理が観察である低悪性度前立腺腺癌を除いて、活動性悪性腫瘍の既往を有しない。
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、スクリーニング前の３年以内にアルコールまたは薬物の乱用歴を有しない。いくつかの実施形態において、女性対象は、妊娠可能でも授乳中でもない。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、治験責任医師の意見において、対象の安全性に悪影響を与える、研究結果の評価に支障を来す、または研究への準拠を妨げる可能性がある、何らかの状態、検査異常、または他の理由を有しない。
３． 注入予防法
いくつかの実施形態において、対象に、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ、例えば、ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡとを含む）を投与することを含む、本明細書に記載される方法は、注入予防法をさらに含む。いくつかの実施形態において、注入予防法は、遺伝子編集組成物の投与前に対象に施与される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物を投与する前に対象に施与される注入予防法レジメンは、静脈内ステロイド、静脈内Ｈ１ブロッカーまたは経口Ｈ１ブロッカー、及び静脈内または経口のＨ２ブロッカーを投与することを含む。静脈内ステロイドは、デキサメタゾン、例えば１０ｍｇであり得る。静脈内Ｈ１ブロッカーは、ジフェンヒドラミン、例えば５０ｍｇであり得る。経口Ｈ１ブロッカーは、セチリジン、例えば１０ｍｇであり得る。静脈内または経口のＨ２ブロッカーは、ファモチジン、例えば２０ｍｇであり得る。
実施例１。ＴＴＲ遺伝子編集のためのＬＮＰ粒子ベースの組成物
ヌクレアーゼｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含有するキャッピング及びポリアデニル化されたｍＲＮＡを、慣例的方法を使用したインビトロ転写により生成した。簡潔に述べると、線状化プラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。Ｔ７プロモーター、転写用の配列、及びポリアデニル化領域を含有するプラスミドＤＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＸｂａＩで線状化した。ＸｂａＩは加熱により失活させた。線状化されたプラスミドを酵素及び緩衝塩から精製した。修飾されたｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド；各２～５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュード－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ；１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；ならびに１ｘ反応緩衝液を３７℃でインキュベートすることによって行った。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて最終濃度を０．０１Ｕ／μＬとし、反応物を３７℃でインキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。
ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して、ｍＲＮＡを精製した。あるいは、ｍＲＮＡを沈殿プロトコルにより精製し、その後、場合によってはＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅ消化の後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用してｍＲＮＡを精製した。ＨＰＬＣで精製したｍＲＮＡの場合、ＬｉＣｌ沈殿及び再構成の後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１１， Ｖｏｌ． ３９， Ｎｏ． ２１ ｅｌ４２を参照されたい）。プーリングのために選択された画分を合わせ、上記のように、酢酸ナトリウム／エタノール沈殿により脱塩した。さらに別の方法では、ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿法により精製し、続いてタンジェンシャルフロー濾過によってさらに精製した。２６０ｎｍでの吸光度を測定することによってＲＮＡ濃度を決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、Ｂｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって転写産物を分析した。
配列表に記載のオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを生成した。本段落で引用されている配列が以下でＲＮＡに関して言及される場合、ＴをＵで置き換えるべきであることが理解される（これは、上記のような修飾ヌクレオシドであり得る）。実施例において使用されるメッセンジャーＲＮＡには、５’キャップ及び３’ポリアデニル化配列（例えば最大１００ｎｔ）が含まれ、それらは表３で確認される。ガイドＲＮＡは、当技術分野において公知の方法によって化学的に合成される。
ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰ製剤の調製
概して、脂質ナノ粒子成分を様々なモル比で１００％エタノールに溶解させた。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を２５ｍＭクエン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解させ、ＲＮＡカーゴの濃度をおよそ０．４５ｍｇ／ｍＬとした。使用したＬＮＰは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）ともいい、本明細書ではリピドＡともいう、イオン化可能脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートと、コレステロールと、ＤＳＰＣと、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧとを、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で含むものであった。ＬＮＰは、脂質アミン対ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）モル比を約６とし、ｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比を１：２として製剤した。使用したＬＮＰは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを含む。
ＬＮＰは、脂質含有エタノールと、２倍容のＲＮＡ溶液及び１倍容の水との衝突噴流混合を利用するクロスフロー技術を使用して調製した。脂質含有エタノールを、混合十字部によって２倍容のＲＮＡ溶液と混合した。インラインＴ字部を介して第４流の水を十字部からの出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照のこと）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、水でさらに希釈した（およそ１：１ｖ／ｖ）。フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でのタンジェンシャルフロー濾過を使用して希釈後のＬＮＰを濃縮し、次いで、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を使用して５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）にバッファー交換した。得られた混合物を、その後、０．２μｍ滅菌フィルターの使用により濾過した。最終的なＬＮＰの特性解析を行って、封入効率、多分散指数、及び平均粒径を決定した。最終的なＬＮＰを以後の使用まで４℃または－８０℃で保管した。
次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）及び編集効率の分析
当技術分野において公知の方法に従って、例えばＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、型番ＱＥ０９０５０）またはＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、型番ＳＳ００００３５－Ｄ２）を使用して、ゲノムＤＮＡを細胞または組織から抽出した。ゲノム内のターゲット位置における編集効率を定量的に決定するため、シークエンシングを用いて、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を特定した。目的の遺伝子（例えば、ＴＴＲ）内のターゲット部位の周辺にＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅させた。プライマー配列設計は、当技術分野で標準となっているように行った。
製造元のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってさらなるＰＣＲを行って、シークエンシングのための化学物質を追加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器でアンプリコンのシークエンシングを行った。クオリティスコアが低いものを除去した後、リードを参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対してアラインした。リードを含む結果ファイルを参照ゲノムにマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的のターゲット領域と重なるリードを選択し、野生型のリード数に対し挿入または欠失（「インデル」）を含むリード数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型を含む配列リードの総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）のある配列リードの総数と定義される。
実施例２。ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡの選択
ＴＴＲ遺伝子配列ＡＡＡＧＧＣＵＧＣＵＧＡＵＧＡＣＡＣＣＵ（配列番号１５；ヒトゲノムビルドｈｇ３８染色体１８：３１５９２９８７～３１５９３００７）をターゲティングするｓｇＲＮＡを、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ手法及び経験的手法の両方の組み合わせを適用した包括的なオフターゲット特性解析ワークフローの後に、効率的なノックアウト及び特異性のために選択した。高い治療指数（オンターゲット編集とオフターゲット編集の比率）を選択するために、ゲノムワイド分析及びターゲットシークエンシングを行って、候補ｓｇＲＮＡオフターゲット部位を特定し、検証した。
相補的な計算及び試験所ベースの手法（Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ及びＳＩＴＥ－Ｓｅｑ）を使用して、オフターゲット編集の可能性のあるゲノム座位を発見した。その後、ＮＴＬＡ－２００１における潜在的なオフターゲット部位とシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ターゲティング配列との間のミスマッチを調べた。インターバルツリーアルゴリズムを使用して、タンパク質をコードするエクソンと重なる部位を検出した。タンパク質をコードするエクソンと少なくとも１つのヌクレオチドが重なるものについては、プロトスペーサー配列とのミスマッチが４つ以下であれば保持した。コーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）からのエクソンと重ならない潜在的なオフターゲット部位については、３つのミスマッチを許容した。これら両セットの部位を合わせて、ＮＴＬＡ－２００１の予測される潜在的なオフターゲット編集座位のキュレーションに含めた。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット発生アッセイＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを、既報のように、軽微な変更を加えて行った。公開されているプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリの調製を行い、１５０塩基対（ｂｐ）のペアエンドリードを用いて、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉＳｅｑ及びＨｉＳｅｑ ２，５００の両方でシークエンシングを行った。ＮＴＬＡ－２００１のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、Ｓｐｙ Ｃａｓ９緑色蛍光タンパク質（Ｓｐｙ Ｃａｓ９－ＧＦＰ）融合タンパク質を構成的に発現するようにエンジニアリングされたＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３－Ｃａｓ９）において行った。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット発見アッセイＳＩＴＥ－Ｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素活性に対するあらゆる基質制限をなくすために除タンパク及び精製されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に対して実行されるため、このアッセイは、潜在的なオフターゲット編集の発見感度が最も高い無細胞の生化学的方法のひとつである。２名のユニークな男性血液ドナーの末梢血単核細胞に由来するヒトｇＤＮＡに対してＳＩＴＥ－Ｓｅｑを実行した。インビトロでアセンブルされたＣａｓ９のリボ核タンパク質及びトランスサイレチン［ＴＴＲ］ターゲティングｓｇＲＮＡを含有するＮＴＬＡ－２００１によって各ｇＤＮＡサンプルを消化して、オンターゲット部位及びｓｇＲＮＡ配列に対する相同性を有する潜在的なオフターゲット部位におけるＤＮＡ切断を誘導した。ｇＤＮＡ消化の後、遊離ｇＤＮＡ断片の末端をアダプターとライゲートして、編集された断片の濃縮及びＮＧＳライブラリの構築を容易にした。実施例１に記載のようにＮＧＳライブラリのシークエンシングを行い、バイオインフォマティクス分析によってリードを分析して、遊離ＤＮＡ末端のゲノム座標を決定した。次に、リードの蓄積があるヒトゲノム内の位置を潜在的なオフターゲット部位としてアノテートした。
Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒによる計算的予測ならびに経験的発見アッセイＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ及びＳＩＴＥ－Ｓｅｑによって発見された全ての潜在的なオフターゲット編集座位について、ＮＴＬＡ－２００１ゲノム編集細胞における妥当性が確認されたオフターゲット編集に関するキュレーション及びアノテーションを行った。Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ及びＳＩＴＥ－ＳｅｑからのＮＴＬＡ－２００１に関する潜在的なオフターゲット編集の発見により、ＮＴＬＡ－２００１オンターゲット部位を含む合計６５８の部位が得られた。ＳＩＴＥ－Ｓｅｑでは４７６（７２．３％）の部位が発見され、そのうち４３１（６５．５％）は、この方法によってのみ発見された。Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒでは２２２（３３．７％）の部位が発見され、そのうち１７８（２７．１％）は、この方法によってのみ発見された。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑでは１２（１．８％）の部位が発見され、そのうち４（０．６％）は、この方法によってのみ発見された（図５）。
偽発見率は、各発見アッセイに合わせて一意的にコントロールした：（１）Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒは、ゲノム全体で最大３つのミスマッチ及びエクソンＤＮＡ内で最大４つのミスマッチを有する座位を特定するように調整した、（２）細胞ベースのアッセイであるＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、Ｃａｓ９を構成的に発現するようにエンジニアリングされたＨＥＫ２９３細胞株において最適化し、最大忍容用量の二本鎖ドナーオリゴヌクレオチドを使用した、（３）生化学ベースのアッセイであるＳＩＴＥ－Ｓｅｑは、１６ｎＭ、６４ｎＭ、及び２５６ｎＭのＣａｓ９ ＲＮＰ濃度でのオフターゲット発見について適格性評価を行い、より多くの潜在的なオフターゲット座位の負荷によって妥当性確認感度を低下させずに編集された細胞において妥当性が確認され得る潜在的なオフターゲット座位の全ての捕捉を確実にするために最適なものとして６４ｎＭでのＣａｓ９ ＲＮＰ消化を選択した。
誤分類率は次のとおりであった。
● ゲノム全体で最大３つのミスマッチ及びエクソンＤＮＡ内で最大４つのミスマッチを許容するＣａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ結果により、２２１の潜在的なオフターゲット座位が特定された。編集された細胞における妥当性確認データに基づくと：
○ 偽陽性率＝１－（３÷２２１）＝９８．６％
○ 偽陰性率＝１－（３÷７）＝５７．１％
● ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑでは、１１の潜在的なオフターゲット座位が特定された。編集された細胞におけるインデル検出の妥当性確認データに基づくと：
○ 偽陽性率＝１－（３÷１１）＝７２．７％
○ 偽陰性率＝１－（３÷７）＝５７．１％
● ＳＩＴＥ－Ｓｅｑでは、４７５の潜在的なオフターゲット座位が特定された。編集された細胞におけるインデル検出の妥当性確認データに基づくと：
○ 偽陽性率＝１－（７÷４７５）＝９８．５％
○ 偽陰性率＝１－（７÷７）＝０％
実施例３。初代ヒト肝細胞における潜在的なオフターゲット編集の妥当性確認
オフターゲットの可能性を評価するために使用した脂質ナノ粒子［ＬＮＰ］の最高濃度は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）において細胞毒性を誘導しないＮＴＬＡ－２００１の最高濃度に基づいて選択した。この濃度は、９０％有効濃度（ＥＣ９０；ＰＨＨにおいて９０％超のＴＴＲタンパク質のノックダウンを達成した濃度）の２７倍であった。
ＰＨＨにおける潜在的なオフターゲット編集の妥当性を確認するために、２つの相補的技術を使用した。１つ目は、ＲＮａｓｅ Ｈ２依存性ＰＣＲ増幅及びＮＧＳ（ｒｈＡＭＰＳｅｑ）と呼ばれるマルチプレックスＰＣＲ技術である。このアッセイは、ＮＧＳを用いたアンプリコンシークエンシングのために単一のＰＣＲ反応においてオンターゲット座位及び潜在的なオフターゲット座位を同時に濃縮することを可能にする。第２の技術は、実施例１に記載したような標準的なシングルプレックスアンプリコンシークエンシング（Ａｍｐ－Ｓｅｑ）であり、これを使用して、ｒｈＡＭＰＳｅｑに適用された組み入れ基準に適合しなかった座位の特性解析を行った。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｓｅｑ機器を使用して、１５０塩基ｂｐペアエンドシークエンシングリードに加えて２つの８ｂｐデュアルインデックスリードを含むｒｈＡＭＰＳｅｑライブラリのシークエンシングを行った。次に、サンプルに特異的なシークエンシングリードをスティッチし、ｂｏｗｔｉｅ２（ｖ２．２．６）を使用してヒトゲノム参照配列（ビルドＧＲＣｈ３８）にアラインし、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用した局所的リアラインメントを行った。潜在的なＣａｓ９切断部位の１０塩基対以内のヌクレオチドを、ヒトゲノム参照配列に対するインデルについて評価した。部位編集パーセンテージは、インデルを含むシークエンシングリードの総数をシークエンシングリードの総数で割ったものとして定義した。
超飽和濃度のＮＴＬＡ－２００１への曝露後、２つのＰＨＨドナーロットで妥当性が確認されたオフターゲットインデルが７つ検出された（表１）。オフターゲット編集がオンターゲット編集に正比例することからこの手法が選択され、したがって、妥当性が確認されたオフターゲット編集の検出がＮＴＬＡ－２００１による過飽和ゲノム編集によって最大化された。
Figure 2024527525000008
座位のうち５つはヒトゲノムの遺伝子間領域に位置し、２つはタンパク質コード遺伝子のイントロンに位置していた。妥当性が確認されたこれらのオフターゲット編集座位について、さらに、ＮＴＬＡ－２００１曝露の用量に応じた特性解析を行った（図６）。この手法により、治療上意義のあるＴＴＲタンパク質低下におけるオフターゲットインデル形成の検出及び頻度のより詳細な特性解析を行うことができた。
これらの特定のオフターゲットシークエンシングデータをＮＧＳで分析したところ、ＰＨＨにおいて平均９０％のＴＴＲタンパク質低下を達成したＥＣ９０よりも最大３倍高いＮＴＬＡ－２００１でＰＨＨを処置した場合、妥当性が確認されたオフターゲットインデルの検出数がゼロであることが判明した。
潜在的なオフターゲット座位の偽分類率を決定するためのトゥルースセットは存在しない。現在利用可能な全ゲノムシークエンシング技術は、ターゲティングされたアンプリコンシークエンシングによって検出されたオフターゲットインデルの感度と比較して不十分である。合計６５７の潜在的なオフターゲットを、０．２％の頻度までインデルの９０％超を検出するのに適格であると評価されたアンプリコンシークエンシング妥当性確認に供した。
● 妥当性確認に失敗した部位の合計＝９８．９３％
● 妥当性が確認されたオフターゲット座位＝１．０７％
実施例４。ＮＴＬＡ－２００１の効力のインビトロ評価
ヒト肝細胞の初代細胞培養物において、ＮＴＬＡ－２００１のインビトロ用量応答及び遺伝子編集効力を評価した。
初代ヒト肝細胞では、ＮＴＬＡ－２００１は非常に強力であり（ＥＣ５０；０．０５～０．１５ｎＭ；ＥＣ９０；０．１７～０．６７ｎＭ）、飽和レベルのＴＴＲ遺伝子編集を示し（≧９３．７％）、ＴＴＲ ｍＲＮＡの９１％以上の低下及びＴＴＲタンパク質の９５％以上の低下をもたらした（図２）。ＮＧＳデータは、ＮＴＬＡ－２００１がＴＴＲ遺伝子のノックアウトを誘導したことを示した。
図２は、ガイドＲＮＡの濃度上昇と、結果として生じるＴＴＲ遺伝子編集のパーセンテージとの間の関係、ならびに単一ロットの初代ヒト肝細胞におけるＴＴＲ ｍＲＮＡ及びタンパク質の低下を示す。主なインデルパターンは、フレームシフト突然変異を誘導する切断部位での一塩基の欠失または挿入であった（データは示さない）。
実施例５。ゲノム編集後のＤＮＡ構造変異型の特性解析
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集は、二本鎖ＤＮＡ切断修復の自然な結果としてＤＮＡの構造変化（ＳＶ）をもたらす可能性がある。潜在的なＤＮＡ ＳＶには、染色体間転座、逆位、重複、及び欠失が含まれる。ＮＴＬＡ－２００１によるゲノム編集後に起こり得る潜在的なＤＮＡ ＳＶの包括的な特性解析を実行するために、Ｉｎｔｅｌｌｉａは、（１）ＳＶ特性解析アッセイを用いるショートリードＮＧＳ、（２）ロングレンジＰＣＲを用いるロングリードＮＧＳという２つの相補的な手法を開発し、それらの適用の適格性評価を行った（図７）。これらの手法の結果から、公開されている高効率ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集の結果と一致した、ＤＮＡ ＳＶの調和性のある低い（＜１％）レベルが明らかになった。
ＳＶ特性解析アッセイのペアエンドＮＧＳデータの分析では、可能性のある２つの結果が得られる。１つは、ペアエンドシークエンシングリードの調和性のあるマッピングである。調和性のあるリードのマッピングは、バランスの取れた再編成を潜在的に示し得る。しかし、バランスの取れた再編成は、天然の染色体構造を保存する通常のオンターゲット編集から区別不能なものとなる。代替的な結果は、ペアエンドシークエンシングリードの不調和なマッピングである。不調和なマッピングは、染色体間転座、逆位、または重複など、ＤＮＡ修復後の構造変化の存在を潜在的に示し得る。
ＳＶ特性解析アッセイは、ＮＴＬＡ－２００１で処置した２つのドナーロットのＰＨＨに対して行った。高分子量ｇＤＮＡを単離し、上述のようにライブラリを調製した。１５０ｂｐペアエンドシークエンシングリード及び２つの８ｂｐデュアルインデックスリードを使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑ ＮＧＳ技術を使用して、ＮＧＳライブラリのシークエンシングを行った。インハウスで開発したコードを使用して、ＮＧＳリードをＤＮＡ ＳＶについて分析した。簡潔に述べると、各リードまたはリードペアを参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８）にアラインした。不調和なリード、または分割されたＮＧＳアラインメントは、５’末端及び３’末端が、野生型ゲノムから予想されるＤＮＡインサートの最大サイズ（シングルリードでは３００ｂｐ、リードペアでは１，０００ｂｐ）よりも大きいゲノム内の２つの異なる位置にアラインした、リードまたはリードペアとして定義した。ＮＧＳがゲノム内の２つ以上の座位にアラインした場合、関与する２つの断片を使用して、（１）染色体内転座、（２）染色体間、（３）逆位、及び（４）重複の基準でＳＶを分類した。アラインメントが２つ以上のクラスのシグネチャーと一致した場合、これを「複合体」と分類した。反復性ＤＮＡ ＳＶは、検出されたＤＮＡ ＳＶを表す２つ以上のユニークな分子識別子を有するものとして定義した。
ＮＴＬＡ－２００１でゲノム編集されたＰＨＨは、超飽和レベルのオンターゲット編集において低い（＜１％）ＤＮＡ ＳＶ修復結果を示した。ＮＴＬＡ－２００１でのゲノム編集後に検出されたＤＮＡ ＳＶの頻度は、高効率編集ｇＲＮＡについての既報の結果と調和している。特定された転座はいずれも既知のリスクに関連せず、検出された唯一の反復性転座は、姉妹染色体のオンターゲット部位間の無動原体及び二動原体の融合であった。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集後に潜在的な修復結果としてＤＮＡのキロベースペア（Ｋｂ）欠失が生じる可能性は、マウス胚性幹細胞、マウス造血前駆細胞、及びヒト分化細胞株で以前に報告されている。ＩｌｌｕｍｉｎａベースのＮＧＳを用いるターゲティングされたＰＣＲベースのアンプリコンシークエンシングは、１００ｂｐを超える欠失などの大きな構造変異型の特性解析及び数量化を行う能力が限られている。したがって、ＮＴＬＡ－２００１によるゲノム編集後にＤＮＡ修復の結果として大きな欠失が生じる可能性の特性解析を行うために、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＵＳＡ）のＩｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｍｔ Ｓｉｎａｉにおいて、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの技術を用いたロングレンジＰＣＲとそれに続くロングリードシークエンシングを実施し、９６６ｂｐ欠失の検出限界を決定することによって適格性評価を行った（図８）。
２つのドナーロットのＰＨＨをＮＴＬＡ－２００１で処置し、ｇＤＮＡをロングレンジＰＣＲのために単離し、Ｉｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｍｔ Ｓｉｎａｉ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＵＳＡ）においてＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩ機器を使用してシークエンシングを行った。ＰＨＨにおけるＮＴＬＡ－２００１によるゲノム編集後の標準的なショートリードＡｍｐ－Ｓｅｑを用いたオンターゲットインデル頻度の分析は、９２．５７±７．８５％（ロット１）及び９３．５０±０．１０％（ロット２）のオンターゲットインデル編集頻度を明らかにした。超飽和ゲノム編集用量においてインビトロでゲノム編集されたＰＨＨにおけるＮＴＬＡ－２００１についてのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ技術を用いたロングレンジＰＣＲとそれに続くロングリードシークエンシングの分析は、２名のＰＨＨドナーの１名において、４７１ｂｐ及び１，０６５ｂｐのサイズの２つの欠失の頻度が、それぞれリードの０．２６％及び０．４８％と低いことを明らかにした（図９）。ＮＴＬＡ－２００１のオンターゲット部位に最も近い遺伝子は約２８Ｋｂ離れており、したがって、この報告で特性解析されたＤＮＡ構造変異型は、コーディングＤＮＡ配列に意図しないゲノム改変を追加することなくＴＴＲ遺伝子の破壊をもたらしたＮＴＬＡ－２００１の生産的ゲノム編集の結果であると考えられる。
実施例６。トランスジェニックマウスにおける用量依存性かつ永続的な効果
トランスジェニックマウスの研究から、ＮＴＬＡ－２００１の用量依存的かつ永続的な効果が明らかになった。
第１の実験では、ｈｕＴＴＲトランスジェニックマウスを、０．１、０．３、もしくは１ｍｇ／ｋｇのＮＴＬＡ－２００１、１ｍｇ／ｋｇの非ターゲティングコントロール脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、またはｔｒｉｓスクロース食塩水緩衝液コントロール（各群ｎ＝５マウス）で処置した。肝臓ＴＴＲ遺伝子編集（パネルＡ）及び血清ヒトＴＴＲタンパク質（パネルＢ）を、投薬７日後にそれぞれ次世代シークエンシング及びヒトトランスサイレチン酵素結合免疫吸着アッセイによって測定した。各群で処置した５匹のマウスからの平均及び標準誤差の値を示している（図１０）。
ＴＴＲ遺伝子の編集は循環血清ＴＴＲタンパク質レベルを低下させ、このレベルは投薬後４週までに最下点に達し、１２か月時点の観察で依然として最大限に抑制されていた。
第２の実験では、肝臓の２／３の切除及びその後の全肝再生の後、遺伝子編集パーセンテージ及び対応するタンパク質レベルは変化しておらず、編集の恒久的性質が裏付けられた（図１１）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングするシングルガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）１ｍｇ／ｋｇ、またはｔｒｉｓスクロース食塩水（ＴＳＳ）コントロールにより、ＣＤ１マウスを処置した（各群ｎ＝５マウス）。７日目に、マウスに部分肝切除（ＰＨｘ）を行って、肝臓のおよそ７０％を除去した。血清ＴＴＲタンパク質濃度を、投薬後０日目、７日目（ＰＨｘ前）、及び１７日目（ＰＨｘ後４日目）に、ＴＴＲ酵素結合免疫吸着アッセイによって測定した。各群で処置した５匹のマウスからの平均及び標準誤差の値を示している。
ＬＮＰ製剤の投与の７日後、動物は血清ＴＴＲの９８％のノックダウンを示し、これはＰＨｘ後の肝臓の再生後に維持された。これらのＬＮＰ処置動物はまた、ＰＨｘの前後の両方で同一のＴＴＲ遺伝子編集パーセンテージ（７３％）を示し、このことは、遺伝子編集が肝臓再生プロセスを通して維持されることを示している。
実施例７。非ヒト霊長動物におけるＬＮＰ媒介性編集
用量群（１、２、３、及び６ｍｇ／ｋｇ）ごとに３匹のカニクイザルをＣｙｎ－ＬＮＰ注入の少なくとも１時間前にデキサメタゾンで前処置して、計画された臨床前処置を模倣した。２９日目に次世代シークエンシングを使用して、肝臓におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子編集を評価した。血清ＴＴＲタンパク質濃度を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析によってアッセイし、基底（０日目）値に対するパーセンテージとして報告した。ＴＴＲ遺伝子編集は１～６ｍｇ／ｋｇで用量応答性を示し（パネルＡ）、これは、ベースラインと比べた血清ＴＴＲタンパク質レベルの低下に対応した（パネルＢ）。各処置群について、平均及び標準偏差の値を示している。パネルＢの斜線枠内は、ＴＴＲタンパク質低下の治療上意義のある範囲を示す（図１３）。
カニクイザル研究は、ＬＮＰ成分の急速な初期分布及びクリアランスを示した（図１６及び図１２）。
図１４は、カニクイザルにおけるＣｙｎ－ＬＮＰ単一用量の薬物動態の統合された要約プロットである。
さらに、３ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇの単一用量のＣｙｎ－ＬＮＰは、全肝臓における７３％の遺伝子編集パーセンテージ（最大）及び１２か月にわたり持続した血清ＴＴＲのほぼ完全な低下（＞９４％）と関連していた（図３Ａ）。ＴＴＲ遺伝子の編集を肝組織のＮＧＳ分析によって確認した（図３Ｂ）。
図３Ａは、０日目に１．５、３．０、及び６．０ｍｇ／ｋｇ（全ＲＮＡ／体重）の用量でＣｙｎ－ＬＮＰの静脈内投与を与え、３６７日間追跡したカニクイザル（各コホートｎ＝３）における、ベースラインに対する割合としての血清トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質濃度の平均低下を示す。処置を受けていないコントロールコホートを比較のために提示している。それぞれの点に対する垂直線は、各群３匹についての標準偏差を示す。パネルＢは、カニクイザルに対するＣｙｎ－ＬＮＰ投与後の次世代シークエンシングデータの結果を示す。ガイドＲＮＡターゲット配列は、赤色の必要なＰＡＭ配列の隣に青色で示されている。［Ｇ／Ａ］は、研究に使用したカニクイザルの間で天然に発生するＳＮＰを表す。カニクイザルゲノムビルドｍｆ５染色体１８に対するインデルのヌクレオチド位置は次のとおりである：＋１：５０６８１５４９－５０６８１５５０。
主なインデルパターンは、フレームシフト突然変異を誘導する切断部位での一塩基の挿入であった。挿入部位における「Ｎ」は、全体として全インデルの１．０３％を構成した複数塩基挿入（ＡＡ、ＡＧＧなど）を指す。残りの画分は、様々な長さの欠失を含んでいた。ｓｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡを意味する。
Figure 2024527525000009
実施例８。臨床試験
全体的な処置設計を図１にまとめる。パネルＡは、ＮＴＬＡ－２００１の主要な成分を示す。ＮＴＬＡ－２００１の担体系は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。ＬＮＰ製剤については本明細書に記載されている。ＮＴＬＡ－２００１の活性成分は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヒト最適化メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子（およそ１．５ＭＤａの分子量を有するおよそ４４００ヌクレオチドの配列）、及びトランスサイレチン（ＴＴＲ）をコードするヒト遺伝子に特異的なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子（およそ３５ｋＤａの分子量）である。これらの成分は、薬物投与のためのＬＮＰのカーゴを形成する。ＮＴＬＡ－２００１の静脈内投与及び循環への進入後、ＬＮＰは、全身循環を通って肝臓内に直接輸送され、肝臓内に優先的に分布する。パネルＢは、肝臓内の肝類洞の毛細血管へのＮＴＬＡ－２００１ ＬＮＰの輸送を示す。他の臨床認可されたＬＮＰと同様に、ＮＴＬＡ－２００１は、循環中でアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）によってオプソニン化され、次いで、肝細胞の表面に発現した低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体による取り込みを受け、その後エンドサイトーシス及びエンドソーム形成が起こると見込まれる。ＬＮＰの分解及びエンドソーム膜の破壊の後、活性成分（ＴＴＲ特異的ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ）が細胞質内に放出される。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ分子は、天然のリボソームプロセスを通じて翻訳され、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ酵素を生産する。ＴＴＲ特異的ｓｇＲＮＡはＣａｓ９エンドヌクレアーゼと相互作用し、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）とＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の複合体を形成する。パネルＣは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体が核内移行のターゲットになって核に進入し、核内でＴＴＲの非相補的ＤＮＡ鎖上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することを示す。ｓｇＲＮＡの５’末端にあるターゲット特異的な２０ヌクレオチド配列は、ターゲット部位でＤＮＡ二重らせんに結合し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体がらせんを巻き戻してターゲット遺伝子にアクセスすることを可能にする。Ｃａｓ９は、一連の立体構造変化及びヌクレアーゼドメイン活性化（ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメイン）を起こし、ｓｇＲＮＡ相補配列により定義されるようにＴＴＲ配列を正確にターゲットとしたＤＮＡ切断をもたらす。内因性ＤＮＡ修復機構は切断の末端をライゲートし、場合によっては塩基の挿入または欠失（インデル）を導入する。インデルの生成は、完全長ｍＲＮＡの量を減少させるミスセンスまたはナンセンス突然変異の結果として、機能的なターゲット遺伝子のｍＲＮＡレベルの低下をもたらし、最終的にターゲットタンパク質のレベル低下をもたらし得る。ターゲットタンパク質（この場合はＴＴＲ）の生産抑止をもたらすインデルは、ノックアウト突然変異と呼ばれる。
Ａ． 多発神経障害の用量漸増研究
多発神経障害コホート１及び２
登録
１つの研究施設では、３名の対象がスクリーニングされ、そのうち２名が適格であり、リクルートされた。１名の対象は、体重がその時点で研究プロトコルにより許容される上限を上回っていた。他方の研究施設では、４名の患者がスクリーニングされ、そのうち４名が適格であり、リクルートされた。患者は４６～６４歳であり、４／６は男性であった。体重は７０～９０ｋｇであった。３名の患者がｐ．Ｔ８０Ａ突然変異を有し、２名がｐ．Ｓ９７Ｙ突然変異を有し、１名がｐ．Ｈ１１０Ｄ突然変異を有していた。３名の患者は以前に治療を受けておらず、３名は以前にジフルニサルを受けていた。６名の患者全員が多発神経障害性能力障害スコア１及びＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ機能分類Ｉを有していた。Ｎ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）は５０～５９６ｎｇ／Ｌの範囲であった。
臨床試験設計及び適格性
２部構成、国際共同、第１相、非盲検、多施設共同研究の第１部から、２つの初期コホート（コホート１及び２）を報告する。患者は、２０２０年１１月から２０２１年４月の間に、全ＲＮＡ／体重で０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇの単一用量のＮＴＬＡ－２００１の静脈内投与によって処置された。本明細書では、その後に処置されたこれらの患者からのデータも報告する。第１部の主な適格性基準には、年齢１８～８０歳、ｈＡＴＴＲアミロイドーシスによる多発神経障害の診断（心筋症の有無を問わない）、スクリーニング来診時の体重５０～９０ｋｇ、及びＡＴＴＲアミロイドーシスのための認可済み処置へのアクセスがないことが含まれた。非ＡＴＴＲアミロイドーシス、既知の軟髄膜ＡＴＴＲアミロイドーシス、またはＲＮＡサイレンシング療法の既往歴を有する患者は除外した。ＴＴＲ安定化剤の使用歴は、ウォッシュアウト期間（ジフルニサル：３日間）を設けて許容した（図１８）。
臨床試験安全性
カニクイザルにおける安全性研究により、無有害作用レベル（ｎｏ－ｏｂｓｅｒｖｅｄ－ａｄｖｅｒｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｌｅｖｅｌ：ＮＯＡＥＬ）は、ヒトにおける１ｍｇ／ｋｇの用量に相当する３ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の単回投与と決定された。総体表面積に基づくアロメトリックスケーリング及び安全係数１０の適用の後、本研究でのＮＴＬＡ－２００１の最大推奨開始用量は０．１ｍｇ／ｋｇであった。静脈内ＬＮＰ注入の潜在的な炎症促進作用を軽減するために、注入前に患者にグルココルチコイドならびにヒスタミン受容体１型及び２型遮断薬を与えた。
ＮＴＬＡ－２００１処置は、注入を中断することなく完了した。プロトコルにより規定された停止事象は観察されなかった。処置下で発現した有害事象は６名中３名の患者で報告され、その全ての重篤度が軽度（グレード１）であった。患者１名は特に注目すべき有害事象を経験した（グレード１注入関連反応；図１７参照）。重篤な有害事象は観察されなかった。
Ｄダイマーレベルは、当技術分野で公知の方法によって評価した。上昇したｄダイマーレベルは、６名中５名の患者において注入の４～２４時間後に観察された。上昇は、非ヒト霊長動物においてＮＯＡＥＬ用量で観察されたものよりも低かった。値は、６名の患者全員において７日目までにベースラインに戻った。凝固パラメータである活性化部分トロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時間を当技術分野で公知の方法によって評価したところ、結果は基準範囲の上限の１．２倍以内に留まった。フィブリノゲン及び血小板の計数は、当技術分野で公知の方法によって行われ、基準範囲の下限を上回る状態を保った。肝機能検査（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼ）は、当技術分野で公知の方法によって行われ、結果は正常範囲内に留まった（図１５）。
図１５Ａはプロトロンビン時間を示し、図１５Ｂは活性化部分トロンボプラスチン時間を示し、図１５Ｃはフィブリノゲンを示し、図１５Ｄはアラニンアミノトランスフェラーゼを示し、図１５Ｅはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを示す。青線は、経時的な個々の対象の結果を示す。単一の赤線は、経時的な平均結果を示す。水平の破線は、各パラメータについて、適宜ＵＬＮまたはＬＬＮのいずれかを示す。ベースラインは、治験薬の注入開始前に得られた入手可能な最後の測定値と定義される。中央試験所から２８日目までに得られた結果のみをプロットしている。
ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼを意味し、ａＰＴＴは活性化部分トロンボプラスチン時間を意味し、ＡＳＴはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを意味し、ＢＬはベースラインを意味し、ＰＴはプロトロンビン時間を意味し、ＬＬＮは正常下限を意味し、ＵＬＮは正常上限を意味する。処置下で発現した有害事象及び検査所見の評価のために患者をモニターした。ベースライン、ならびに１週目、２週目、及び４週目に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＴＴＲタンパク質レベルの分析のために血清サンプルを得た。患者は、ＮＴＬＡ－２００１注入から２４か月にわたり、安全性及び治療活性結果について評価されている。
薬物動態
中間薬物動態データは、静脈内（ＩＶ）注入後、ＮＴＬＡ－２００１イオン化可能脂質がピークレベルからの急速な低下を示し、その後に二次ピーク、そして対数線形相が続くことを示唆している。
臨床試験有効性
ＮＴＬＡ－２００１の薬力学的効果を判定するために、複数の血清ＴＴＲレベルを評価した。標準物質として健康な対象のヒト血漿ＴＴＲ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７４２）を使用した定量的アッセイとしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発し、妥当性を確認した。
簡潔に述べると、アッセイマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、４４６６１２）を、０．０５Ｍ炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．６中で１ｕｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗ヒトプレアルブミン抗体（Ｄａｋｏ、Ａ０００２）と共に一晩インキュベートした。プレートをＴＴＲ洗浄溶液（ＴＴＲＷＳ：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１×ダルベッコＰＢＳ）で４回洗浄し、１Ｘ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｇｅｎｉｘ、ＨＫ０８５－５ｋ）で１時間ブロッキングし、ＴＴＲＷＳで４回洗浄した。調製したプレートで、標準、コントロール、及び希釈した試験サンプルを約２時間インキュベートした。プレートをＴＴＲＷＳで４回洗浄し、次いで、１Ｘ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで１：２，５００に希釈したヒツジ抗ヒトプレアルブミン抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＡＨＰ１８３７）と共に１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＲＷＳで４回洗浄し、次いで、１Ｘ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで１：１０，０００に希釈した抗ヒツジアルカリホスファターゼ共役抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ５１８７）と共に１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＲＷＳで４回洗浄した。ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ｐ－ニトロフェニルホスフェートタブレット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ１８９１）を製造元の説明に従って使用して、プレートを現像した。現像試薬との３０分間のインキュベーション後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を使用して反応を停止させた。吸光度を分光光度法によって評価した。ヒト血漿ＴＴＲ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７４２）を使用してシグナル（ＯＤ）対濃度の標準曲線を生成して、ＱＣ及び未知のサンプルを数量化した。
ベースラインからの血清ＴＴＲタンパク質濃度の低下が１４日目までに観察され、２８日目まで進行した（図４Ａ）。２８日目には、ＮＴＬＡ－２００１は、コホート１（用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇ）では５２％、コホート２（０．３ｍｇ／ｋｇ；図４Ｂ）では８７％の平均ＴＴＲ低下と関連していた。効果は用量依存的であり、より高い用量のＮＴＬＡ－２００１を受けた患者ではＴＴＲ濃度がさらに大きく低下した。さらに、ＮＴＬＡ－２００１の効果は、各用量レベルで全員について再現可能であり、２８日目の低下は、コホート１では４７～５６％（４７％、５２％、及び５６％）、コホート２では８０～９６％（８０％、８４％、及び９６％）の範囲であった（図４Ｃ）。
パネルＡは、コホート１（０．１ｍｇ／ｋｇ）についてのベースラインからの総循環血清トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質における変化のパーセンテージを示す。ＴＴＲタンパク質は、バイオマーカー法妥当性確認の規制ガイドラインに従った、妥当性確認済みの酵素結合免疫吸着アッセイ法によって数量化した。血清サンプルは、各サンプルを二連で試験して１回測定した。優良試験所規範に従い、アッセイ実行を成功させるために再検査は行わなかった。コホート１（０．１ｍｇ／ｋｇ）の各患者について、投薬前ベースラインと比べた血清ＴＴＲタンパク質における低下のパーセンテージについての投薬後７日目、１４日目、及び２８日目におけるデータを示している（３つのサンプリング時点からの平均濃度）。パネルＢは、コホート２（０．３ｍ／ｋｇ）についてのベースラインからの総循環血清ＴＴＲタンパク質における変化のパーセンテージを示す。方法及び分析は、パネルＡに示したものと同一である。パネルＣは、コホート１及びコホート２の両方についての、２８日目の総循環血清ＴＴＲタンパク質におけるベースラインからの変化のパーセンテージの平均（各コホートＮ＝３）を示す。
上記のように、ベースラインからの血清ＴＴＲタンパク質濃度の低下が２８日目まで観察された。また、ベースラインからの血清ＴＴＲタンパク質濃度の低下は、ＮＴＬＡ－２００１による処置の後、９か月目まで（コホート１対象１及びコホート１対象３、図１９Ａ）、または１２か月目まで（コホート１対象２、図１９Ａ）観察された。２８日目の平均ＴＴＲ低下率は、コホート１（用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇ）で５２％、コホート２（用量レベル０．３ｍｇ／ｋｇ）で８７％であった。２か月目の平均ＴＴＲ低下率は、コホート１で５４％、コホート２で８１％であった。処置後９か月目には、コホート２の平均血清ＴＴＲ低下は８６％であった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。１２か月目の平均ＴＴＲ低下率は、コホート２では８９％に維持された（表４）。
多発神経障害コホート３及び４
登録
コホート３については６名の対象をリクルートし、コホート４については３名の対象をリクルートした。対象は年齢１９～７０歳であり、９名中５名の対象が男性であり、体重は５９～１１１ｋｇであった。３名の対象がｐ．Ｔ８０Ａ突然変異を有し、２名がｐ．Ｅ６２Ｄ突然変異を有し、１名がｐ．Ｓ７０Ｒ突然変異を有し、１名がｐ．Ｖ５０Ｍ突然変異を有し、１名がｐ．Ｅ９４Ｇ突然変異を有していた。７名の対象は多発神経障害性能力障害スコア１を有し、２名は多発神経障害性能力障害スコア２を有していた。７名の対象はＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ機能分類Ｉを有し、１名は分類ＩＩを有し、１名は心不全の診断を有しなかった。Ｎ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）は５０～５４４ｎｇ／Ｌの範囲であった（図２３Ａ及び２３Ｂ）。
臨床試験設計及び適格性
本明細書に含まれるのは、２部構成、国際共同、第１相、非盲検、多施設共同研究の第１部からのコホート３及び４の中間結果である。患者は、全ＲＮＡ／体重で１．０ｍｇ／ｋｇ（コホート３の患者６名）または０．７ｍｇ／ｋｇ（コホート４の患者３名）の単一用量のＮＴＬＡ－２００１の静脈内投与によって処置された。登録及び適格性基準は、本明細書に記載されるとおりである。
臨床試験安全性
カニクイザルにおける安全性研究により、無有害作用レベル（ｎｏ－ｏｂｓｅｒｖｅｄ－ａｄｖｅｒｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｌｅｖｅｌ：ＮＯＡＥＬ）は、ヒトにおける１ｍｇ／ｋｇの用量に相当する３ｍｇ／ｋｇ静脈内注入の単回投与と決定された。静脈内ＬＮＰ注入の潜在的な炎症促進作用を軽減するために、注入前に患者にグルココルチコイドならびにヒスタミン受容体１型及び２型遮断薬を与えた。
ＮＴＬＡ－２００１処置は、注入を中断することなく完了した。処置下で発現した有害事象が９名の対象全員で報告された。有害事象の大多数は重篤度が軽度であった（図２２）。全ての注入関連反応が臨床的続発症なく解消し、軽度とみなされた。潜在する胃不全麻痺を有する一患者で１．０ｍｇ／ｋｇ用量において、関連ある嘔吐のグレード３事象（ＳＡＥ）が１回報告された。臨床的に有意な検査所見は観察されず、一過性のグレード１の肝酵素上昇が観察された。プロトコルにより規定された停止事象は観察されなかった。
肝機能（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼ）、凝固パラメータ（活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、フィブリノゲン）、及びｄダイマー値を当技術分野で公知の方法によって評価した。結果は正常範囲内に留まった（図２１）。
図２１Ａはプロトロンビン時間を示し、図２１Ｂは活性化部分プロトロンビン時間を示し、図２１Ｃはフィブリノゲンを示し、図２１Ｄはアラニンアミノトランスフェラーゼを示し、図２１Ｅはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを示し、図２１Ｆはｄダイマー比を示す。データは、各コホートについての経時的な平均結果として示されている。ベースラインは、治験薬の注入開始前に得られた入手可能な最後の測定値と定義される。中央試験所から７日目までに得られた結果のみをプロットしている。
ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼを意味し、ａＰＴＴは活性化部分トロンボプラスチン時間を意味し、ＡＳＴはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを意味し、ＢＬはベースラインを意味し、ＰＴはプロトロンビン時間を意味する。処置下で発現した有害事象及び検査所見の評価のために患者をモニターした。ベースライン、ならびに１週目、２週目、及び４週目、ならびに２か月目に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＴＴＲタンパク質レベルの分析のために血清サンプルを得た。患者は、ＮＴＬＡ－２００１注入から２４か月にわたり、安全性及び治療活性結果について評価されている。
臨床試験有効性
ＮＴＬＡ－２００１の薬力学的効果を判定するために、複数の血清ＴＴＲレベルを評価した。標準物質として健康な対象のヒト血漿ＴＴＲ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７４２）を使用した定量的アッセイとしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発し、妥当性を確認した。
簡潔に述べると、アッセイマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、４４６６１２）を、０．０５Ｍ炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．６中で１ｕｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗ヒトプレアルブミン抗体（Ｄａｋｏ、Ａ０００２）と共に一晩インキュベートした。プレートをＴＴＲ洗浄溶液（ＴＴＲＷＳ：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１×ダルベッコＰＢＳ）で４回洗浄し、１Ｘ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｇｅｎｉｘ、ＨＫ０８５－５ｋ）で１時間ブロッキングし、ＴＴＲＷＳで４回洗浄した。調製したプレートで、標準、コントロール、及び希釈した試験サンプルを約２時間インキュベートした。プレートをＴＴＲＷＳで４回洗浄し、次いで、１Ｘ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで１：２，５００に希釈したヒツジ抗ヒトプレアルブミン抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＡＨＰ１８３７）と共に１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＲＷＳで４回洗浄し、次いで、１Ｘ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｃｋで１：１０，０００に希釈した抗ヒツジアルカリホスファターゼ共役抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ５１８７）と共に１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＲＷＳで４回洗浄した。ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ｐ－ニトロフェニルホスフェートタブレット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ１８９１）を製造元の説明に従って使用して、プレートを現像した。現像試薬との３０分間のインキュベーション後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を使用して反応を停止させた。吸光度を分光光度法によって評価した。ヒト血漿ＴＴＲ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７４２）を使用してシグナル（ＯＤ）対濃度の標準曲線を生成して、ＱＣ及び未知のサンプルを数量化した。
コホート３の対象６名中３名及びコホート４の対象３名中１名について報告する中間結果
ベースラインからの血清ＴＴＲタンパク質濃度の低下が１４日目までに観察され、２８日目まで進行した。７日目には、コホート４の対象１名（０．７ｍｇ／ｋｇ；図１９Ｃの対象３）について、血清ＴＴＲの７８％の低下が報告された。この対象の血清ＴＴＲは、１４日目までに９４％低下し、２８日目までに９７％低下した。７日目には、コホート３の対象３名が４３～８８％の範囲の低下を示した（対象１で４３％、対象２で８０％、対象３で８８％）。１４日目には、血清ＴＴＲのさらなる低下が観察された（対象１で８０％、対象２で８８％、対象３で９７％）。２８日目には、低下は８８～９８％の範囲であった（対象１で８８％、対象２で８８％、対象３で９８％；図１９）。
コホート３の対象６名中６名及びコホート４の対象３名中３名について報告する中間結果
血清ＴＴＲタンパク質濃度におけるベースラインからの低下が、７日目、１４日目、２８日目、５６日目（２か月目）、４か月目（一部の対象）、６か月目（一部の対象）、及び６か月目（一部の対象）に観察された。この中間結果の時点で入手可能な各対象の値の全てが図１９Ｂ～１９Ｄに示されている。２８日目の平均ＴＴＲ低下率は、コホート３（用量レベル１ｍｇ／ｋｇ）で９３％、コホート４（用量レベル０．７ｍｇ／ｋｇ）で８６％であった。２か月目の平均ＴＴＲ低下率は、コホート３で９３％、コホート４で８８％であった。図２０に示すように、低下は２か月目に維持されていた。パーセンテージにおける低下は、コホート３（１ｍｇ／ｋｇ）及びコホート４（０．７ｍｇ／ｋｇ）の各対象についての総循環血清トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質におけるベースラインからの変化を表す。図１９Ａ～１９Ｄに示した結果に対してさらに更新された血清ＴＴＲ低下の情報を以下の表４に示す。６か月目の平均ＴＴＲ低下率は、コホート３（用量レベル１ｍｇ／ｋｇ）の全対象で９３％、コホート４（用量レベル０．７ｍｇ／ｋｇ）の全対象で８７％であった。この更新時点では、コホート３の対象６名中３名に関する９か月目の平均ＴＴＲ低下率は９３％のままであった。ＡＴＴＲタンパク質は、バイオマーカー法妥当性確認の規制ガイドラインに従った、妥当性確認済みの酵素結合免疫吸着アッセイ法によって数量化した。血清サンプルは、各サンプルを二連で試験して１回測定した。優良試験所規範に従い、アッセイ実行を成功させるために再検査は行わなかった。
Figure 2024527525000010

Figure 2024527525000011

Figure 2024527525000012

Figure 2024527525000013
Ｂ． 多発神経障害の８０ｍｇ一定用量研究
この更新時点で、１名の対象を８０ｍｇ一定用量研究にリクルートした。この対象は３６歳の男性であった。臨床試験設計及び適格性は、対象を全ＲＮＡ（ガイドＲＮＡとメッセンジャーＲＮＡ）８０ｍｇの一定用量におけるＮＴＬＡ－２００１の単一用量で処置したことを除いては、多発神経障害研究について本明細書に記載されるとおりである。
ＮＴＬＡ－２００１の薬力学的効果を判定するために、血清ＴＴＲレベルを評価した。本明細書に記載されるように、標準物質として健康な対象のヒト血漿ＴＴＲ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７４２）を使用した定量的アッセイとしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発し、妥当性を確認した。血清ＴＴＲタンパク質濃度におけるベースラインからの低下が７日目までに観察された。７日目に、対象は、血清ＴＴＲの５８％の低下を報告した（絶対ＴＴＲ濃度１３９ｕｇ／ｍｌ）。
Ｃ． 心筋症の用量漸増研究
登録コホート１ａ及び２ａ
コホート１ａ及びコホート２ａのリクルートメントは現在進行中である。本明細書では、ＴＴＲ低下データが入手可能であるコホート１ａ及び２ａにおける対象のリクルートメント情報を提供する。コホート１ａ対象は３名がリクルートされ、これらの対象は７１～７５歳であり、３名の対象全員が男性であり、体重範囲は６３～８８ｋｇであった。コホート１ａについては、対象３名中２名が野生型ＴＴＲを有し、対象２名がＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類ＩＩを有し、対象１名がＮＹＨＡ機能分類Ｉを有していた。ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰベースラインレベルは２１０３ｐｍｏｌ／Ｌ～３６３７ｐｍｏｌ／Ｌの範囲であった。コホート２ａ対象は１名がリクルートされ、この患者は、体重７１ｋｇの７５歳男性であった。コホート２ａの対象は、野生型ＴＴＲ、及びＮＹＨＡ機能分類ＩＩＩを有していた。
臨床試験設計及び適格性
本明細書に含まれるのは、２部構成、国際共同、第１相、非盲検、多施設共同研究の第１部からのコホート１ａ及び２ａにおける現在進行中の研究の中間結果である。対象は、全ＲＮＡ／体重で０．７ｍｇ／ｋｇ（コホート１ａの対象３名）または０．７ｍｇ／ｋｇ（コホート２ａの対象１名）の単一用量のＮＴＬＡ－２００１の静脈内投与によって処置された。登録及び適格性基準は、本明細書に記載されるとおりである。
ＮＴＬＡ－２００１の薬力学的効果を判定するために、複数の血清ＴＴＲレベルを評価した。本明細書に記載されるように、標準物質として健康な対象のヒト血漿ＴＴＲ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７４２）を使用した定量的アッセイとしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発し、妥当性を確認した。血清ＴＴＲタンパク質濃度におけるベースラインからの低下が、以下の表５にまとめるように観察された。

Figure 2024527525000014
実施例９。追加の臨床アッセイ
生物分析法及び臨床薬理
ＮＴＬＡ－２００１の４成分、すなわちイオン化可能リピドＡ（別称ＬＰ０１）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ脂質、ガイドＲＮＡ、及びｍＲＮＡを数量化するために、血漿薬物動態法を開発し、妥当性を確認した。リピドＡ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋは、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法によって数量化する。アッセイシグナル［内部標準（ＩＳ、同位体標識された標準物質を使用）に対する標準物質の曲線下面積の比］対濃度応答の標準曲線を使用する。ＱＣ及び未知のサンプルシグナルを標準曲線から補間して血漿濃度を決定する。ガイドＲＮＡ及びｍＲＮＡの両方を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって数量化する。シグナルサイクル閾値（Ｃｔ）対濃度の標準曲線を使用する。ＱＣ及び未知のサンプルを標準曲線から補間して血漿濃度を数量化した。リピドＡ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋについて、排出の特性解析を行うために、尿ＰＫ法を開発し、妥当性を確認した。
ＮＴＬＡ－２００１に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）及び抗Ｃａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９ｍＲＮＡ導入遺伝子産物）抗体を評価するために、免疫原性法を開発し、妥当性を確認した。両方法でサンドイッチ形式のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＭＳＤ－ＥＣＬ）アッセイを使用し、ＮＴＬＡ－２００１ ＬＮＰまたはＣａｓ９タンパク質を捕捉抗原としてコーティングした。薬物またはＣａｓ９タンパク質に対する固定化された抗体を抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧ－スルホタグ検出抗体により検出した。サンプル分析は、抗体応答のスクリーニング、確認、及び力価測定のための規制ガイドラインに従ったカットポイントを使用した階層別分析として計画される。確認のためのアッセイは、カットポイントに基づく薬物またはＣａｓ９タンパク質の競合的阻害に基づく。確認された陽性サンプルをエンドポイント力価について試験する。
追加の薬力学的方法には、一次ＰＤとしてのＥＬＩＳＡによる血清ＴＴＲ、及び二次ＰＤとしてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ならびに患者管理及びＰＤのためのプレアルブミンインビトロ診断法（ＩＶＤ）が含まれた。標準物質として健康な対象のヒト血漿ＴＴＲを使用した定量的アッセイとしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発し、妥当性を確認した。ポリクローナル抗体は、捕捉抗体及び検出抗体の両方として使用される。シグナル（ＯＤ）対濃度の標準曲線を生成して、ＱＣ及び未知のサンプルを数量化する。Ｖ３０Ｍ突然変異型及び対応する野生型Ｖ３０Ｖ、ならびにＮＨＰデータをブリッジングするためのＮＨＰ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチド位置と同様の上流の第３のペプチドを含む、ＴＴＲを数量化するための３つのサロゲートペプチドを使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を開発し、妥当性を確認した。シグナル（各ペプチドについての標準物質／同位体標識ＩＳの比）対濃度応答を標準曲線として使用して、ＱＣ及び未知のサンプルを補間して、血清濃度を決定した。プレアルブミン法は、ＩＶＤ法としての比濁原理に基づいており、ＴＴＲに対するポリクローナル抗血清を添加することで免疫複合体が生成されると、ＴＴＲの存在により混濁が生じる。探索の目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡによるレチノイド結合タンパク質（ＲＢＰ）を含む追加のＰＤバイオマーカーアッセイを開発し、妥当性を確認した。Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ Ｓｉｍｏａプラットフォームに基づく適格性評価済みの方法を使用して、探索的ＰＤバイオマーカーとしての循環ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）を数量化した。このバイオマーカーはＡＴＴＲ－ＰＮ特異的である。
ＮＴＬＡ－２００１注入後のサイトカイン応答を評価するために、Ｌｕｍｉｎｅｘによるマルチプレックスサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮｇ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２３、ＴＮＦａ）及びＥＬＩＳＡによるＭＣＰ－１を開発し、妥当性を確認した。補体活性化を評価するために、ＥＬＩＳＡによる補体成分Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、及びＢｂ法を開発し、妥当性を確認した。
予備的な血漿ＰＫデータが、ＮＴＬＡ－２００１の４成分（イオン化可能リピドＡ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ脂質、ガイドＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）について利用可能である。０．１～１．０ｍｇ／ｋｇの用量におけるＮＴＬＡ－２００１の単回ＩＶ注入後、ＬＰ０１は、ピークレベルからの急速な低下を呈し、その後、二次ピーク、そしてこの用量範囲にわたって１９．７４（１６．５７）から２４．８１（２３．５５）（時間）の範囲の平均（％ＣＶ）終末相ｔ１／２によって特徴付けられる対数線形相が続いた。図２４。他の成分に関するデータは示されていない。
実施例１０。曝露応答（ＥＲ）分析
ＮＴＬＡ－２００１について、２８日目のＴＴＲ（％ベースライン）を使用して、式１に従ってＳ字形関係を仮定し、Ｒ４．０．５（Ｔｈｅ Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）による非線形最小二乗を使用することにより、中間ＥＲモデルを開発した。
Figure 2024527525000015

式中、γは、Ｈｉｌｌ係数であり、Ｅｍａｘは、Ｄ２８ ＴＴＲ（％ベースライン）における最大の低下であり、ＥＣ５０は、Ｄ２８ ＴＴＲ（％ベースライン）に対する半値効果に対応するＮＴＬＡ－２００１曝露であり、εは、平均０及び分散σ２で正規分布している。平均予測に対するブートストラップ（用量群によって層別化、ｎ＝１０００）の信頼区間（ＣＩ）を生成した。ブートストラップ推定値（ｎ＝１０００）及びεからシミュレーションによって予測区間（ＰＩ）を生成した。
モデルの当てはめは、ＮＴＬＡ－２００１についての飽和ＥＲ関係を示す図２５に示されている。
実施例１１。母集団薬物動態（ＰＯＰＰＫ）
ＮＴＬＡ－２００１分析物ＬＰ０１について、公開されているモデルに基づき、ＮＯＮＭＥＭソフトウェア（バージョン７．５．０、ＩＣＯＮ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＬＣ、Ｂｌｕｅ Ｖｅｌｌ，ＰＡ）を使用して、中間ＰＯＰＰＫモデルを開発した。この分析では、１５名のＡＴＴＲｖ－ＰＮ対象において２９０の観察があった。このモデルについてのパラメータ値及び当てはめの良さ（ｇｏｏｄｎｅｓｓ ｏｆ ｆｉｔ）のプロットを求めた（図示せず）。モデル化された直線関係と共に、体重と推定消失クリアランスとの間の関係を決定した。この関係は比例関係を満たさず、すなわち、体重の倍加は、クリアランスにおける２倍未満の変化につながる。
図２６は、１ｍｇ／ｋｇ（左パネル）及び８０ｍｇ（右パネル）のＮＴＬＡ－２００１の投与後の体重四分位別のシミュレートされたＡＵＣの分布を提供する。体重の中央値［５％、９５％］が８１［４８、１４６］ｋｇである１００００の仮想の対象において実施されたＰＯＰＰＫシミュレーションは、体重四分位間で１ｍｇ／ｋｇのＮＴＬＡ－２００１後のＬＰ０１ ＡＵＣが大きく重なるが、体重と共に曝露中央値が増加する僅かな傾向があることを示唆している。同様に、８０ｍｇのＮＴＬＡ－２００１の後にも、体重四分位間でシミュレートされたＬＰ０１ ＡＵＣが重なる。固定重量ベースの投与後のＮＴＬＡ－２００１ ＡＵＣ推定値の幾何平均ならびに個々の比（ＧＭＲ）の５パーセンタイル及び９５パーセンタイルの範囲は、０．９８［０．７４、１．２８］である。第４の体重四分位（［９０．３～１４６］ｋｇ）の、第１の体重四分位（［４８～７１．７］ｋｇ）に対する、シミュレートされた平均曝露の比は、１ｍｇ／ｋｇのＮＴＬＡ－２００１については１．２５であり、８０ｍｇのＮＴＬＡ－２００１については０．８１である。シミュレーションにより、ＮＴＬＡ－２００１ ８０ｍｇが１．０ｍｇ／ｋｇに相当する固定用量として特定された。
配列表
以下の配列表は、本明細書で開示される配列の一覧を提供する。ＤＮＡ配列（Ｔを含む）がＲＮＡに関して言及される場合、Ｔは、Ｕ（内容に応じて修飾されていても修飾されていなくてもよい）で置き換えられるべきであり、逆もまた同様であると理解される。
Figure 2024527525000016

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Claims (138)

  1. ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することを含み、
    前記組成物の前記投与が、ベースライン血清ＴＴＲと比べて血清ＴＴＲを低下させる、前記方法。
  2. 前記ＡＴＴＲが、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＡＴＴＲが、野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＡＴＴＲが、多発神経障害を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記ＡＴＴＲが、心筋症を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項１または２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ＡＴＴＲが、心筋症を伴う野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項１または３に記載の方法。
  7. 前記対象が、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の下でクラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩに分類される、請求項１、５、または６に記載の方法。
  8. 前記対象が、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及び／またはＡＴＴＲ－ＣＭを有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ＬＮＰが、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＬＮＰが、ＰＥＧ脂質を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ＰＥＧ脂質が、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－２ｋを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＬＮＰ組成物が、約５～７のＮ／Ｐ比を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓヌクレアーゼが、重量基準で約５：１から約１：５までの範囲をとる比率で存在する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ｍＲＮＡが、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ｍＲＮＡが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ｍＲＮＡが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードする、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡが、コドン最適化されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約０．３ｍｇ／ｋｇの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  22. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約０．７ｍｇ／ｋｇの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  23. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約１．０ｍｇ／ｋｇの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  24. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約２５ｍｇ～約１５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  25. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約２５ｍｇ～約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  26. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約５０ｍｇ～約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  27. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約６０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  28. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約７０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  29. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約８０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  30. ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡの前記有効量が、約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記組成物の投与が、前記組成物の投与前のベースライン血清ＴＴＲと比較して、血清ＴＴＲを６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約５０μｇ／ｍＬ未満である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約４０μｇ／ｍＬ未満である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約３０μｇ／ｍＬ未満である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約２０μｇ／ｍＬ未満である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約１０μｇ／ｍＬ未満である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記ＬＮＰ組成物の第２の用量を投与することをさらに含み、前記第２の用量の投与が、前記第１の用量の投与前の前記ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて血清ＴＴＲレベルを少なくとも８０％低下させる、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＬＮＰ組成物の第２の用量を投与することをさらに含み、前記第２の用量の投与が、前記第２の用量の投与前かつ前記第１の用量の投与後の前記ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて血清ＴＴＲレベルを少なくとも８０％低下させる、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記組成物が、第２の治療薬と共に投与される、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記第２の治療薬が、ジフルニサルまたはタファミジスである、請求項３９に記載の方法。
  41. トランスサイレチン（ＴＴＲ）に関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を有するヒト対象におけるＴＴＲ遺伝子のインビボ編集のための方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を全身投与することと、
    ｂ． 前記対象の肝細胞において前記ガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において前記ＴＴＲ遺伝子を編集することと
    を含み、前記組成物の前記投与が、前記対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、前記バイオセーフティ尺度のベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす、前記方法。
  42. ＡＴＴＲを有するヒト対象におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子のインビボ編集のための方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することと、
    ｂ． 前記対象の肝細胞において前記ガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位においてＴＴＲ遺伝子を編集することと
    を含み、前記組成物の前記投与が、前記対象における臨床尺度のレベルにおいて、ベースラインレベルと比較して臨床的に有意な向上をもたらす、前記方法。
  43. ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することを含み、
    前記組成物の前記投与が、前記対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、ベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす、前記方法。
  44. ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することを含み、
    前記組成物の前記投与が、前記対象における臨床尺度のレベルにおいて、前記臨床尺度のベースラインレベルと比較して臨床的に有意な向上をもたらす、前記方法。
  45. ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することを含み、
    Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約２５～約１００ｍｇの合計用量で投与される、前記方法。
  46. 単一遺伝子障害を有するヒト対象の肝臓における遺伝子のインビボ編集のための方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． 肝臓における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することと、
    ｂ． 前記対象の肝細胞において前記ガイドＲＮＡによってターゲティングされる部位において前記遺伝子を編集することと
    を含み、前記組成物の前記投与が、前記対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、前記バイオセーフティ尺度のベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす、前記方法。
  47. 単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． 肝臓における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することと、
    ｂ． 肝臓における前記遺伝子を編集し、それによって前記単一遺伝子障害を処置することとを含み、前記処置が安全かつ忍容性良好である、前記方法。
  48. 単一遺伝子障害を有するヒト対象を処置する方法であって、
    ａ． 前記ヒト対象に、有効量の、
    ｉ． ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び
    ｉｉ． 肝臓における遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡ
    を含むＬＮＰ組成物を全身投与することと、
    ｂ． 投与前の前記対象におけるバイオセーフティ尺度の第１のレベルを判定することと、
    ｃ． 投与後のある期間の前記対象における前記バイオセーフティ尺度の第２のレベルを判定することと、
    ｄ． 前記バイオセーフティ尺度の前記第１のレベルと前記第２のレベルとの間の変化を評価することとを含み、前記組成物の前記投与が、前記対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、ベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらし、それによってＡＴＴＲを処置する、前記方法。
  49. 前記全身投与の前に、ＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を有するヒト対象を選択することを含む、請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記全身投与の前に、単一遺伝子障害を有するヒト対象を選択することを含む、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ＬＮＰが、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートを含む、請求項４１～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ＬＮＰが、ＰＥＧ脂質を含む、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記ＰＥＧ脂質が、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－２ｋを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＬＮＰ組成物が、約５～７のＮ／Ｐ比を有する、請求項４１～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓヌクレアーゼが、重量基準で約５：１から約１：５までの範囲をとる比率で存在する、請求項４１～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ｍＲＮＡが、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、請求項４１～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ｍＲＮＡが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする、請求項４１～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ｍＲＮＡが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードする、請求項４１～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡが、コドン最適化されている、請求項４１～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項４１～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記ガイドＲＮＡに対する前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項４１～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記単一遺伝子障害が、ＡＴＴＲである、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
  65. 肝臓における前記遺伝子が、ＴＴＲである、請求項４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記ＡＴＴＲが、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項４１～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記ＡＴＴＲが、野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項４１～６５のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記ＡＴＴＲが、多発神経障害を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項４１～６６のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記ＡＴＴＲが、心筋症を伴う遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項４１～６６または６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記ＡＴＴＲが、心筋症を伴う野生型トランスサイレチンアミロイドーシスである、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記対象が、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）分類の下でクラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩに分類される、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記対象が、ＡＴＴＲｖ－ＰＮ及び／またはＡＴＴＲ－ＣＭを有する、請求項４１～６５のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記バイオセーフティ尺度が、プロトロンビンである、請求項４１～６７のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記組成物の投与が、前記対象におけるバイオセーフティ尺度のレベルにおいて、前記バイオセーフティ尺度のベースラインレベルと比較して許容可能である変化をもたらす、請求項４１、４３、または４６のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記バイオセーフティ尺度が、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）である、請求項４１、４３、４６、または４８のいずれかに記載の方法。
  76. 前記バイオセーフティ尺度が、フィブリノゲンである、請求項４１、４３、４６、または４８のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記バイオセーフティ尺度が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）である、請求項４１、４３、４６、または４８のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記バイオセーフティ尺度が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）である、請求項４１、４３、４６、または４８のいずれか１項に記載の方法。
  79. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  81. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約０．３ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される、請求項４１～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約０．７ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される、請求項４１～８０のいずれか１項に記載の方法。
  83. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約１．０ｍｇ／ｋｇの合計用量で投与される、請求項４１～８０のいずれか１項に記載の方法。
  84. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約５０ｍｇ～９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記ＬＮＰ組成物の第２の用量を投与することをさらに含み、前記第２の用量の投与が、ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて血清ＴＴＲレベルを少なくとも８０％低下させる、請求項８４に記載の方法。
  86. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約１５ｍｇ～１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  87. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約７０ｍｇ～約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記ＬＮＰ組成物の第２の用量を投与することをさらに含み、前記第２の用量の投与が、（ｉ）前記第１の用量の投与前または（２）前記第２の用量の投与前かつ前記第１の用量の投与後のベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて血清ＴＴＲレベルを少なくとも８０％低下させる、請求項８７に記載の方法。
  89. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約２５ｍｇ～約２７ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  90. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約２５ｍｇ～約１５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  91. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約２５ｍｇ～約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  92. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約５０ｍｇ～約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  93. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約３５ｍｇ～６５ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  94. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約４０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  95. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約５０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量で投与される、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  96. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約６０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  97. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約７０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  98. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約８０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  99. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  100. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、約１００ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  101. 前記全ＲＮＡが、前記合計ｍｇ用量の約±５％以内である、請求項８４～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記全ＲＮＡが、前記合計ｍｇ用量の約±１０％以内である、請求項８４～１００のいずれか１項に記載の方法。
  103. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、７５ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、７６ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  105. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、７７ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  106. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、７８ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  107. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、７９ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  108. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  109. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８１ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  110. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８２ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  111. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８３ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  112. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８４ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  113. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８５ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  114. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８６ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  115. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８７ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  116. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８８ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  117. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、８９ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  118. Ｃａｓヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡ及びＴＴＲ遺伝子をターゲティングする前記ガイドＲＮＡが、９０ｍｇの全ＲＮＡの合計用量である、請求項４１～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  119. 前記臨床尺度が、血清ＴＴＲレベルである、請求項４２または４４に記載の方法。
  120. 前記組成物の投与が、ＴＴＲ遺伝子の発現を低下させるかまたはノックダウンする、請求項４１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
  121. 前記組成物の投与が、前記組成物の投与前のベースラインと比較して、ＴＴＲ遺伝子の発現を６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させるかまたはノックダウンする、請求項４１～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記組成物の投与が、前記組成物の投与前の血清ＴＴＲレベルと比較して、前記対象におけるＴＴＲ血清レベルを少なくとも６０％低下させる、請求項４１～１２０のいずれかに記載の方法。
  123. 前記組成物の投与が、前記組成物の投与前の血清ＴＴＲレベルと比較して、前記対象におけるＴＴＲ血清レベルを６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低下させる、請求項４１～１２０のいずれかに記載の方法。
  124. 前記血清ＴＴＲレベルが、ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて少なくとも６０％低下する、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記血清ＴＴＲレベルが、ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて少なくとも８０％低下する、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記血清ＴＴＲレベルが、ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて少なくとも９０％低下する、請求項１２３に記載の方法。
  127. 前記血清ＴＴＲレベルが、ベースライン血清ＴＴＲレベルと比べて少なくとも９５％低下する、請求項１２３に記載の方法。
  128. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約５０μｇ／ｍＬ未満である、請求項４１～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約４０μｇ／ｍＬ未満である、請求項４１～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  130. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約３０μｇ／ｍＬ未満である、請求項４１～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  131. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約２０μｇ／ｍＬ未満である、請求項４１～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  132. 前記血清ＴＴＲレベルが、前記組成物の投与後に約１０μｇ／ｍＬ未満である、請求項４１～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記組成物が、第２の治療薬と共に投与される、請求項４１～１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 前記第２の治療薬が、ジフルニサルまたはタファミジスである、請求項１３３に記載の方法。
  135. ヒト対象におけるＴＴＲに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する方法であって、前記対象における血清ＴＴＲレベルをベースライン血清ＴＴＲレベルと比較して少なくとも９５％低下させる有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  136. 前記組成物の単回投与後、前記遺伝子の発現を永続的に低下させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  137. 前記遺伝子がＴＴＲ遺伝子である、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記組成物が、（ｉ）ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及び（ｉｉ）ＴＴＲ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを含む、請求項１３６または１３７に記載の方法。
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