JP2024509743A - in vitroおよびin vivoトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドDNA/脂質粒子の調製方法 - Google Patents

in vitroおよびin vivoトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドDNA/脂質粒子の調製方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024509743A
JP2024509743A JP2023549081A JP2023549081A JP2024509743A JP 2024509743 A JP2024509743 A JP 2024509743A JP 2023549081 A JP2023549081 A JP 2023549081A JP 2023549081 A JP2023549081 A JP 2023549081A JP 2024509743 A JP2024509743 A JP 2024509743A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
nucleic acid
particle size
propane
lipid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023549081A
Other languages
English (en)
Inventor
マオ ハイクアン
チョウ イニン
フー イチョン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Johns Hopkins University
Original Assignee
Johns Hopkins University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johns Hopkins University filed Critical Johns Hopkins University
Publication of JP2024509743A publication Critical patent/JP2024509743A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192Processes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

in vitroおよびin vivo局所トランスフェクションにおける細胞の効率的なトランスフェクションに最適な粒径の核酸/脂質粒子を調製する方法が提供される。本方法は、核酸/脂質ナノ粒子集合の動態制御に基づいて、約50nm~1200nmの規定サイズの保存安定性がある粒子を調製する。50nm~1200nmのサイズ範囲に対する、核酸/脂質粒子媒介のトランスフェクションのサイズ依存特性も提供される。【選択図】図1

Description

脂質ナノ粒子(LNP)は、遺伝子治療のため核酸を送達するために広く使用されている。in vitroおよびin vivoトランスフェクション効率を増加させるため、脂質および核酸組成、窒素/リン酸塩(N/P)比、ならびにLNPの生分解性などの要因は、広く調査されている。しかしながら、ウイルスベクターを生産するための当該技術分野で現在既知の方法は、低い再現性、一貫性のない収量、ならびに最善ではないin vitroおよびin vivoトランスフェクション効率により制限されている。例えば、in vivoの全身送達用途のため、凍結乾燥形態の100nm未満の離散ナノ粒子の生成が成功している(Huら、2019)。これらの小さなナノ粒子は、しかしながら、ウイルスベクター生産細胞株(すなわち、HEK293TまたはHEK293F細胞)および他の細胞型におけるin vitroトランスフェクションにとっては準最適である。肝臓を標的とする治験におけるsiRNAおよびCOVID-19 mRNAワクチンならびにいくつかの脂質NPベースの製品を送達するために使用される3つのLNPベースの製剤(すなわち、肝臓がんを抑制するためのMTL-CEBPA、肝線維症のためのND-L02-s0201/BMS-986263)はすべて、40nm~200nmのサイズ範囲の粒子を有する。200nm~1200nmの範囲のLNPがin vitroおよびin vivoの両方のトランスフェクション効率にどのように影響するかについての報告はまだない。この情報の不足は、主に、この範囲内の調節可能なサイズの脂質ナノ粒子の調製を可能にする信頼できる方法または過程の不足に起因する。
いくつかの態様においては、本開示の保護対象は、210~1200nmの平均粒径および0.05~0.5の多分散性指数を有する複数の核酸/脂質粒子を調製する方法であって、
(a)20~200nmの第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液を調製または提供することと、
(b)第1の溶液の極性を約80の誘電率から約45~60に減少させ、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の粒径成長を誘発し、210nm~1200nmの範囲にある第2の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第2の溶液を形成することと、
(c)約65~80の誘電率の第2の溶液の極性を反転させ、第2の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の成長を所定の粒径で停止させ、210~1200nmの規定の粒径および0.1~0.3の多分散性指数を有する複数の核酸/脂質粒子を形成することと
を含む方法を提供する。
態様によっては、第1の粒径は、約40nm~約120nmの範囲を有する。特定の態様においては、第1の粒径は、約60nmである。
態様によっては、第2の粒径は、約210nm~約1,200nmの範囲を有する。特定の態様においては、第2の粒径は、約210、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、および1200nmからなる群から選択される。
態様によっては、第1の溶液は、Ca2+、Mg2+、Zn2+、およびFe3+からなる群から選択される1つまたは複数の多価陽イオンを更に含む。
態様によっては、第1の溶液の極性は、第1の溶液に水混和性有機溶剤を追加することにより低下する。特定の態様においては、本方法は、さまざまな濃度の水混和性有機溶剤を第1の溶液に追加し、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の粒径成長を制御することを含む。より特定の態様においては、水混和性有機溶剤は、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、アセトン、およびアセトニトリルからなる群から選択される。
態様によっては、第2の溶液の極性は、HOによる希釈により反転する。
態様によっては、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液は、継続的なフラッシュナノ複合体形成(FNC)技術により調製される。他の態様においては、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液は、手動のピペット混合およびボルテックス(vertexing)法により調製される。特定の態様においては、本方法は、約100μg/mLの入力核酸濃度を含む。
態様によっては、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、ガイドRNA、プラスミドDNA、ベクターDNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA、およびsiRNAからなる群から選択される。特定の態様においては、核酸は、プラスミドDNA(pDNA)または異なる種のプラスミドDNAの混合物を含む。更により特定の態様においては、核酸は、血漿DNAを含む。
いくつかの態様においては、核酸/脂質ナノ粒子は、正電荷脂質、中性脂質、負電荷脂質、ペグ化脂質、およびイオン化脂質からなる群から選択される1つまたは複数の脂質を含む。
態様によっては、核酸/脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。特定の態様においては、カチオン性脂質は、N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノ-プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、O-アルキルホスファチジルコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(12:0 EPD)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:0 EPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0 EPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(18:0 EPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(18:1 EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、および1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)、N-(4-カルボキシベンジル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オレオイルオキシ)プロパン-1-アミニウム(DOBAQ)、1,2-ジステアロイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(18:0 DAP)、1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(16:0 DAP)、1,2-ジミリストイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(14:0 DAP)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)(18:1 DAP)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(14:0 TAP)、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(16:0 TAP)、1,2-ステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(18:0 TAP)、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(18:1 TAP(DOTAP))、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、3β-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC-コレステロール・HCl)、DC-コレステロール、N4-コレステリル-スペルミン(GL67)、1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、2,3,-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミネカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパントリフルオロアセテート(DOSPA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジオレオイルカルバミル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DOCDAP)、1,2-ジリネオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DLINDAP)、ジラウリル(C12:0)トリメチルアンモニウムプロパン(DLTAP)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、DC-Choi、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(シス,シス-9,12-オクタデカジエノキシ)プロパン(CLinDMA)、2-[5’-(コレスト-5-エン-3[ベータ]-オキシ)-3’-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(シス,シス-9’,12’-オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、およびN,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、および1,2-N,N’-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン(DOcarbDAP)、ならびにそれらの組み合わせおよび薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
特定の態様においては、カチオン性脂質は、DOTAPである。
他の態様においては、本開示の保護対象は、本明細書に開示された方法により調製された核酸/脂質ナノ粒子を提供する。
他の態様においては、本開示の保護対象は、血漿DNAを含む脂質ナノ粒子であって、約210nm~約1,200nmの範囲を有する平均粒径を有するナノ粒子を提供する。
他の態様においては、本開示の保護対象は、以下の1つまたは複数を含む、本明細書に開示された方法により調製された複数の核酸/脂質ナノ粒子の使用を提供する:
(a)ウイルスベクター生産のためのin vitroトランスフェクション、
(b)治療用細胞および遺伝子編集のためのex vivoトランスフェクション、
(c)in vivoトランスフェクション、
(d)肝内注射、皮内注射、硝子体内注射、筋肉内注射、外耳道内注射、および腫瘍内注射などのin vivo局所投与、ならびに
(e)鼻腔内送達、経口送達、および舌下送達などの組織特異的送達。
態様によっては、ウイルスベクター生産のためのin vitroトランスフェクションは、1つまたは複数の細胞を複数の核酸/脂質ナノ粒子に接触させることを含む。態様によっては、本使用は、複数の核酸/脂質ナノ粒子を、1つまたは複数の細胞の単層培養液または1つまたは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む。
特定の態様においては、1つまたは複数の細胞は、ウイルスパッキングHEK293細胞を含む。より特定の態様においては、1つまたは複数の細胞は、HEK293S細胞、HEK293T細胞、HEK293F細胞、HEK293FT細胞、HEK293FTM細胞、HEK293SG細胞、HEK293SGGD細胞、HEK293H細胞、HEK293E細胞、HEK293MSR細胞、またはHEK293A細胞を含む。更により特定の態様においては、1つまたは複数の細胞は、HEK293T細胞を含む。なお更により特定の態様においては、1つまたは複数の細胞は、懸濁培養液に適したHEK293T細胞を含む。
いくつかの態様においては、本方法は、肝細胞、ケラチノサイト、成体幹細胞および前駆細胞、多能性幹細胞、T細胞、NK細胞、ならびに腫瘍細胞の1つまたは複数をトランスフェクトすることを含む。
本開示の保護対象により全体または一部において取り上げられている、本開示の保護対象のいくつかの態様が上述されたが、他の態様は、記載が進むにつれ、以下に最適に記載された添付の実施例および図面に関連して取り上げられたとき、明らかになるであろう。
特許または出願ファイルは、少なくとも1つのカラー付きの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願文書のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて米国特許商標庁より提供される。
このように、本開示の保護対象を一般的な用語で記載してきたが、次に、添付の図面を参照する。図面は必ずしも縮尺どおりに記載されていない。
図1A、1B、1C、1D、1E、および1Fは、成長動態の制御により、約60nm~約1200nmのサイズを有するpDNA/脂質粒子のサイズ制御を行う本開示の方法を例示する。図1Aは、提案された合成過程の模式図である。図1Bは、小さな脂質ナノ粒子のビルディングブロックとして使用される、設計された脂質ナノ粒子(LNP)の製剤の詳細および特徴付けを示す。図1Cは、異なる極性の溶剤(すなわち、エタノールの濃度)の下、誘発された予測可能なサイズ成長を示す。エラーバーは、3つの独立した実験に由来する平均値の標準誤差を示す。図1Dは、異なる濃度のエタノールにより誘発された異なるNP比のLNPの予測可能なサイズ成長を示す。図1Eは、粒径成長が、55%のエタノールの成長曲線に沿った異なる時点でのHOによる1対1の希釈により停止したことを示す。図1Fは、異なるサイズの一連の安定的な粒子の、DLSにより測定されたz平均直径分布を示す。エラーバーは、図1C、1D、および1Eの3つの独立した実験に由来する平均値の標準誤差を示す。 図2Aおよび2Bは、約60nm~約1200nmの制御されたサイズの安定的な粒子のin vitroトランスフェクション効率を示す。HEK293T細胞(図2A)またはHepG2細胞(図2B)に対するレポーターとしてのルシフェラーゼの導入遺伝子発現の効率を示す。(n=4)。 図3A、3B、および3Cは、肝内注射による制御されたサイズの安定的なpDNA/脂質粒子のin vivo局所トランスフェクション効率を示す。図3Aは、肝内注射の代表的なスキームである。図3Bは、マウス1匹あたり3μgのDNAのナノ粒子の肝内注射後48時間の、健康なBALB/cマウスの肝臓におけるin vivoトランスフェクション効率を示す。図3Cは、収集された肝臓組織から更に作成された単細胞懸濁液であり、そのルシフェラーゼ活性が測定された。
以下、本開示の保護対象について、本発明の全てではないが一部の実施形態が示されている添付の図面を参照して、より詳細に説明する。同一の数字は、全体を通して同一の要素を指す。本開示の保護対象は、多くの異なる形態で具体化されてよく、本明細書に記載の実施形態に限定して解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用される法的要件を満たすように提供される。実際、本明細書に記載の本開示の保護対象の多くの変更および他の実施形態は、前述の説明および関連図面に示された教示の利益を有する、本開示の保護対象が属する技術分野に精通している者であれば思い浮かぶであろう。そのため、本開示の保護対象は、開示された特定の実施形態に限定されず、変更および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されていることを理解されたい。
いくつかの実施形態においては、本開示の保護対象は、in vitroおよびin vivo局所トランスフェクションにおける細胞の効率的なトランスフェクションに最適な粒径の核酸/脂質粒子を調製する方法を提供する。本方法は、粒子凝集の制御および成長停止を含む、核酸/脂質ナノ粒子集合の動態制御に基づいて、約50nm~1200nmの規定サイズの保存安定性がある粒子を調製する。50nm~1200nmのサイズ範囲の、異なる細胞株における核酸/脂質粒子媒介のトランスフェクションのサイズ依存特性ももたらされる。
本開示の保護対象は、200nmより大きく、1.2μmまでのサイズ範囲に対する、サイズ依存のトランスフェクションの最初の体系的調査を示す。これまでに、このサイズ範囲内のDNA/脂質粒子は、in vivo適用への関心が限られていたため、十分に研究されてこなかった。DNA/脂質粒子のサイズ効果をよく理解するため、本開示の保護対象は、DNA/脂質粒子凝集およびサイズ成長動態の予測可能な性質を示す。本開示の方法は、210~1200nm内でサイズをより高度に制御されたDNA/脂質粒子を生産する拡張可能な方法を提供する。さらに、本方法は、汎用性が高く、さまざまな組成のDNA/脂質粒子を生産するように調整されうる。
本開示のDNA/脂質粒子は、優れたかつ再現性のあるトランスフェクション活性および保存安定性を生み出し、オフザシェルフ製品として使用されうる。このDNA/脂質粒子製剤は、ウイルス製造過程を含む細胞トランスフェクション過程を大幅に簡略化し、合理化することができる。加えて、本方法は、トランスフェクション剤としてのDNA/脂質粒子の品質管理が向上することにより、細胞およびウイルスベクターの生産品質および一貫性を改善する。本開示のDNA/脂質粒子は、さまざまなスケールのウイルスベクターの生産のためのプロセス工学において、広範囲の用途を見出すと予想される。他の潜在的な有用性としては、再生医療および免疫療法のための細胞のex vivoトランスフェクション、ならびにin vivo遺伝子治療が挙げられる。
本開示のサイズが規定されたナノ粒子は、ウイルス生産または細胞治療のための細胞のin vitroおよびex vivo局在的トランスフェクション、ならびに肝細胞、ケラチノサイト、成体幹細胞および前駆細胞、多能性幹細胞、T細胞、NK細胞、および腫瘍細胞のトランスフェクションを含む、in vivo局在的トランスフェクションに対する有用性を潜在的に見出しうる。
いくつかの実施形態においては、本開示の保護対象は、210~1200nmの平均粒径および0.05~0.5の多分散性指数を有する複数の核酸/脂質粒子を調製する方法であって、
(a)20~200nmの第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液を調製または提供することと、
(b)第1の溶液の極性を80の誘電率から約45~60に減少させ、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の粒径成長を誘発し、210nm~1200nmの範囲にある第2の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第2の溶液を形成することと、
(c)約65~80の誘電率の第2の溶液の極性を反転させ、第2の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の成長を所定の粒径で停止させ、210~1200nmの規定の粒径および0.1~0.3の多分散性指数を有する複数の核酸/脂質粒子を形成することと
を含む方法を提供する。
実施形態によっては、第1の粒径は、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、および120nmを含む、約40nm~約120nmの範囲を有する。より特定の実施形態においては、第1の粒径は、約60nmである。
実施形態によっては、第2の粒径は、約210nm~約1,200nmの範囲を有する。特定の実施形態においては、第2の粒径は、約210、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、および1200nmからなる群から選択される。
実施形態によっては、第1の溶液は、Ca2+、Mg2+、Zn2+、およびFe3+からなる群から選択される1つまたは複数の多価陽イオンを更に含む。
実施形態によっては、第1の溶液の極性は、第1の溶液に水混和性有機溶剤を追加することにより低下する。特定の実施形態においては、本方法は、さまざまな濃度の水混和性有機溶剤を第1の溶液に追加し、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の粒径成長を制御することを含む。より特定の実施形態においては、水混和性有機溶剤は、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、アセトン、およびアセトニトリルからなる群から選択される。
実施形態によっては、第2の溶液の極性は、HOによる希釈により反転する。
実施形態によっては、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液は、継続的なフラッシュナノ複合体形成(FNC)技術により調製される。他の実施形態においては、第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液は、手動のピペット混合およびボルテックス(vertexing)法により調製される。特定の実施形態においては、本方法は、約100μg/mLの入力核酸濃度を含む。
実施形態によっては、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、ガイドRNA、プラスミドDNA、ベクターDNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA、およびsiRNAからなる群から選択される。特定の実施形態においては、核酸は、プラスミドDNA(pDNA)または異なる種のプラスミドDNAの混合物を含む。更により特定の実施形態においては、核酸は、血漿DNAを含む。
実施形態によっては、本開示の核酸/脂質粒子は、異なる電荷特性の1つまたは複数の脂質により調製される。いくつかの実施形態においては、1つまたは複数の脂質は、正電荷脂質、中性脂質、負電荷脂質、ペグ化脂質、およびイオン化脂質から選択される。
実施形態によっては、核酸/脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。
カチオン性脂質は、DNAまたはRNAなどの、アニオン核酸との凝集複合体を形成する能力を有する。これらの凝集したリポソーム構造は、生理的pHで正の表面電荷を有する。正の電荷を持つ表面は、アニオン核酸と細胞膜との相互作用を仲介し、リポソームを細胞膜と区別することができないため、アニオン核酸の細胞への導入を可能にする。カチオン性脂質媒介のトランスフェクションの利点としては、高い効率性、広範囲の細胞型をトランスフェクトする能力、再現性、低毒性、および単純さが挙げられる。
好適なカチオン性脂質としては、多価カチオン性脂質、例えば、N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノ-プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、O-アルキルホスファチジルコリン、例えば、以下を含むエチルホスホコリン(EPC):1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(12:0 EPD)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:0 EPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0 EPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(18:0 EPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(18:1 EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、および1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)、pH感受性カチオン性脂質、例えば、N-(4-カルボキシベンジル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オレオイルオキシ)プロパン-1-アミニウム(DOBAQ)、1,2-ジステアロイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(18:0 DAP)、1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(16:0 DAP)、1,2-ジミリストイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(14:0 DAP)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)(18:1 DAP)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(14:0 TAP)、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(16:0 TAP)、1,2-ステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(18:0 TAP)、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(18:1 TAP(DOTAP))、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、3β-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC-コレステロール・HCl)、DC-コレステロール、N4-コレステリル-スペルミン(GL67)、1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、2,3,-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミネカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパントリフルオロアセテート(DOSPA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジオレオイルカルバミル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DOCDAP)、1,2-ジリネオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DLINDAP)、ジラウリル(C12:0)トリメチルアンモニウムプロパン(DLTAP)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、DC-Choi、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(シス,シス-9,12-オクタデカジエノキシ)プロパン(CLinDMA)、2-[5’-(コレスト-5-エン-3[ベータ]-オキシ)-3’-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(シス,シス-9’,12’-オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、およびN,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、および1,2-N,N’-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン(DOcarbDAP)、ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、カチオン性脂質は、DOTAPである。
本明細書において使用されるとき、用語「塩(salt)」または「塩(salts)」は、本発明の化合物の酸添加を指す。「塩」は、特に「薬学的に許容される塩」を含む。用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的効果およびカチオン性脂質の特性を保持し、典型的に、生物学的にまたはその他の点で望ましくないことはない塩を指す。多くの場合、カチオン性脂質は、アミノ基および/もしくはカルボキシル基またはそれらに類似した基の存在により、酸性塩および/または塩基塩を形成することができる。
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物/臭化水素酸塩、炭酸水素塩/炭酸塩、重硫酸塩/硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物/塩酸塩、クロルテオフィロン酸塩、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩/ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩/リン酸水素塩/リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル化物、およびトリフルオロ酢酸塩により形成されうる。
塩が得られる無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、等が挙げられる。塩が得られる有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸、等が挙げられる。
薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基により形成されうる。
塩が得られる無機塩基としては、例えば、アンモニウム塩および周期表の列I~XIIの金属が挙げられる。実施形態によっては、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅に由来する。特に好適な塩としては、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が挙げられる。塩が得られる有機塩基としては、例えば、一級、二級、および三級アミン、自然発生の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基イオン交換樹脂、等が挙げられる。特定の有機アミンとしては、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート(cholinate)、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リジン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。
追加的な好適な塩の一覧は、例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、第20版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.,(1985);ならびにStahlおよびWermuthによる「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use」(Wiley-VCH、Weinheim、ドイツ、2002)に見出すことができる。代表的な薬学的に許容される塩としては、塩化物、臭化物、トリフレート(トリフルオロメタンスルホン酸)、メチル硫酸塩、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩、等が挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態においては、本開示の保護対象は、本明細書に開示された方法により調製された核酸/脂質ナノ粒子を提供する。
他の実施形態においては、本開示の保護対象は、血漿DNAを含む脂質ナノ粒子であって、約210nm~約1,200nmの範囲を有する平均粒径を有するナノ粒子を提供する。
他の実施形態においては、本開示の保護対象は、以下の1つまたは複数を含む、本明細書に開示された方法により調製された複数の核酸/脂質ナノ粒子の使用を提供する:
(a)ウイルスベクター生産のためのin vitroトランスフェクション、
(b)治療用細胞および遺伝子編集のためのex vivoトランスフェクション、
(c)in vivoトランスフェクション、
(d)肝内注射、皮内注射、硝子体内注射、筋肉内注射、外耳道内注射、および腫瘍内注射などのin vivo局所投与、ならびに
(e)鼻腔内送達、経口送達、および舌下送達などの組織特異的送達。
実施形態によっては、ウイルスベクター生産のためのin vitroトランスフェクションは、1つまたは複数の細胞を複数の核酸/脂質ナノ粒子に接触させることを含む。実施形態によっては、本使用は、複数の核酸/脂質ナノ粒子を、1つまたは複数の細胞の単層培養液または1つまたは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む。
本明細書において検討されるナノ粒子によるトランスフェクションに適した細胞の実例としては、CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞、211A細胞、またはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態においては、1つまたは複数の細胞は、ウイルスパッケージングHEK293細胞を含む。より特定の実施形態においては、1つまたは複数の細胞は、HEK293S細胞、HEK293T細胞、HEK293F細胞、HEK293FT細胞、HEK293FTM細胞、HEK293SG細胞、HEK293SGGD細胞、HEK293H細胞、HEK293E細胞、HEK293MSR細胞、またはHEK293A細胞を含む。更により特定の実施形態においては、1つまたは複数の細胞は、HEK293T細胞を含む。なお更により特定の実施形態においては、1つまたは複数の細胞は、懸濁培養液に適したHEK293T細胞を含む。
いくつかの実施形態においては、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。本明細書において検討される、特定の実施形態での使用に適したレトロウイルスベクターの実例としては、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)、ならびにレンチウイルスに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な実施形態においては、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書において検討される、特定の実施形態での使用に適したレンチウイルスベクターの実例としては、HIV(ヒト免疫不全ウイルス;1型HIVおよび2型HIVを含む)、ビスナマエディウイルス(VMV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)に由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
より好適な実施形態においては、レンチウイルスベクターは、1型HIVまたは2型HIVに由来する。
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、左(5’)レンチウイルスLTRと、Psiパッケージ配列(Ψ+)と、セントラルポリプリントラクト/DNAフラップ(cPPT/FLAP)と、Rev応答配列(RRE)と、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、右(3’)レンチウイルスLTRとを含むレンチウイルスベクターをコードする。レンチウイルスベクターは、ポリアデニル化配列、インシュレーター、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)、B型肝炎ウイルス(HPRE)、等を含むがこれらに限定されるものではない転写後調節エレメントを任意に含んでよい。
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、異種プロモーターを含む修飾左(5’)レンチウイルスLTRと、Psiパッケージ配列(Ψ+)と、セントラルポリプリントラクト/DNAフラップ(cPPT/FLAP)と、Rev応答配列(RRE)と、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、修飾(3’)レンチウイルスLTRとを含むレンチウイルスベクターをコードする。
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、修飾5’LTRを含むレンチウイルスベクターをコードし、ここで、5’LTRのU3領域は、異種プロモーターに置き換えられ、ウイルス粒子の生産中にウイルスゲノムの転写を推進する。使用されうる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスサルウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、前初期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、および単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーターが挙げられる。
特定の実施形態においては、トランスファープラスミドは、ウイルスベクター複製を不完全にする修飾自己不活型(SIN)3’LTRを含むレンチウイルスベクターをコードする。SINベクターは、3’LTRのU3領域の1つまたは複数の修正を含み、1回目のウイルス複製より後のウイルス転写を防止する。これは、右(3’)LTR U3領域が、ウイルス複製中に左(5’)LTR U3領域のテンプレートとして使用されるため、ウイルス転写物がU3エンハンサー-プロモーターなしでは作成できないからである。特定の実施形態においては、3’LTRは、U3領域が削除され、Rおよび/またはU5領域が、例えば、異種または合成ポリ(A)配列、1つまたは複数のインシュレーターエレメント、および/または誘導性プロモーターにより置き換えられるように修飾される。
特定の実施形態においては、1つまたは複数のpDNAは、パッケージ可能なウイルスベクターゲノムと、gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx、およびnefからなる群から選択されるウイルス構造/アクセサリータンパク質の1つまたは複数とを含むトランスファープラスミドをコードする。好適な実施形態においては、ウイルス構造/アクセサリータンパク質は、gag、pol、env、tat、およびrevからなる群から選択される。より好適な実施形態においては、ウイルス構造/アクセサリータンパク質は、gag、pol、env、およびrev、またはgag、pol、およびenvからなる群から選択される。
ウイルスエンベロープタンパク質(env)は、最終的に細胞株から生成された組換えレトロウイルスに感染して形質転換されうる宿主細胞の範囲を判定する。1型HIV、2型HIV、SIV、FIV、およびEIVなどのレンチウイルスの場合、Envタンパク質は、gp41およびgp120を含む。
本発明において用いられうるEnv遺伝子の実例としては、MLVエンベロープ、10A1エンベロープ、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、Ebola、Sendai、FPV(家禽ペストウイルス)、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、RNAウイルス(例えば、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科(Calciviridae)、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、レトロウイルス科のRNAウイルスファミリー)のエンベロープ、およびDNAウイルス(ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科(Poxyiridae)、およびイリドウイルス科のファミリー)のエンベロープをコードする遺伝子が利用されてよい。代表的な例としては、FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10、およびEIAVが挙げられる。
他の実施形態においては、特定の実施形態での使用に適したEnvタンパク質としては、以下のウイルスのいずれか:A型インフルエンザ、例えば、H1N1、H1N2、H3N2、およびH5N1(鳥インフルエンザ)、B型インフルエンザ、C型インフルエンザウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群のいずれかのウイルス、腸管アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、デュベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス1&2、およびオーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベジクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ヘルペスウイルス、例えば、1型および2型単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス(HHV)、6型および8型ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridiae)、例えば、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候性出血熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含むフィロウイルス科(フィロウイルス)、キャサヌル森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスを含むフラビウイルス科、およびパラミクソウイルス科、例えば、ヘンドラウイルスおよびニパウイルス、大痘瘡および小痘瘡(天然痘)、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)、ウエストナイルウイルス、いずれかの脳炎(encephaliltis)ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な実施形態においては、Env遺伝子は、VSV-Gエンベロープ糖タンパク質をコードする。
いくつかの好適な実施形態においては、本明細書において検討されるpDNA/PEI複合体は、異種プロモーターを含む修飾左(5’)レンチウイルスLTRと、Psiパッケージ配列(Ψ+)と、cPPT/FLAPと、RREと、治療導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターと、修飾SIN(3’)レンチウイルスLTRとを含むレンチウイルスベクターをコードするトランスファープラスミド;レンチウイルスgag/polをコードするプラスミド、revをコードするプラスミド、およびEnv遺伝子をコードするプラスミド、好ましくはVSV-Gエンベロープ糖タンパク質を含む。
長年の特許法の慣例に従い、「a」、「an」、および「the」という用語は、特許請求の範囲を含めて、本願において使用されるとき、「1つまたは複数」を指す。従って、例えば、「対象(a subject)」への言及は、文脈が明らかに反対の場合(例えば、複数の対象(a plurality of subjects))等を除き、複数の対象を含む。
多くの実施形態において本開示の方法によって処置される「対象」は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載の方法は、「対象」という用語に含まれることが意図されている全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解されたい。従って、「対象」には、既存の病態もしくは疾患の治療、または病態もしくは疾患の発症を予防するための予防的治療など、医療目的のヒト対象、または医療目的、獣医学目的、もしくは開発目的の動物対象を含みうる。好適な動物対象としては、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿、等;ウシ(bovine)、例えば、ウシ(cattle)、雄ウシ(oxen)、等;ヒツジ(ovine)、例えば、ヒツジ(sheep)等;ヤギ(caprine)、例えば、ヤギ(goat)等;ブタ(porcine)、例えば、ブタ(pig)、雄ブタ(hog)、等;ウマ(equine)、例えば、ウマ(horse)、ロバ、シマウマ、等;野生のネコ(cat)および飼いネコ(cat)を含むネコ(feline);イヌ(dog)を含むイヌ(canine);ウサギ(rabbit)、ノウサギ(hare)、等を含むウサギ類(lagomorph);およびマウス、ラット、等を含むげっ歯類を含むがこれらに限定されるものではない哺乳類が挙げられる。動物は、遺伝子導入動物であってよい。いくつかの実施形態においては、対象は、胎児、新生児、乳児、若年、および成人対象を含むがこれらに限定されるものではないヒトである。さらに、「対象」には、病態もしくは疾患に罹患している、または罹患している疑いのある患者を含みうる。したがって、本明細書では、「対象」および「患者」という用語は互換的に使用される。「対象」という用語は、対象の生物、組織、細胞、または細胞の集合体も指す。
概して、活性薬剤または薬物送達デバイスの「有効な量」とは、所望の生物学的反応を誘発するのに必要な量を指す。当業者には理解されるように、薬剤またはデバイスの有効な量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、医薬組成物の構成、標的組織などの因子に応じて変化しうる。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含む(comprising)」という用語は、文脈上別段の意味を有する場合を除き、非排他的な意味で使用される。同様に、「含む(include)」という用語およびその文法的変形は、非限定的であることを意図しており、リスト内の項目の列記は、リスト化された項目に置換または追加されうる他の同様の項目を排除するものではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される量、サイズ、寸法、比率、形状、公式化、パラメーター、パーセンテージ、数量、特性、および他の数値を表す全ての数は、「約」という用語が値、量、または範囲とともに明示的に表示されなくても、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解される。従って、反対の指示がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、正確ではなく、正確である必要はないが、本開示の保護対象により得ようとする所望の特性に応じて、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、および当業者に公知の他の要因を反映して、近似値とするおよび/または所望により大きくまたは小さくすることができる。例えば、値について言及するとき、「約」という用語は、開示される方法を実施するため、または開示される組成を使用するために適切であるような、いくつかの実施形態においては±100%、いくつかの実施形態においては±50%、いくつかの実施形態においては±20%、いくつかの実施形態においては±10%、いくつかの実施形態においては±5%、いくつかの実施形態においては±1%、いくつかの実施形態においては±0.5%、およびいくつかの実施形態においては±0.1%の規定量からの変動を包含することを意味しうる。
さらに、1つまたは複数の数または数値範囲に関連して使用されるとき、用語「約」は、範囲内の全ての数を含む、そのような全ての数値を指すと理解されるべきであり、記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。端点による数値範囲の記載には、その範囲に組み込まれる全ての数、例えば、その分数を含む全整数(例えば、1~5という記載には、1、2、3、4、および5、ならびにその分数、例えば、1.5、2.25、3.75、4.1、等が含まれる)、およびその範囲内の任意の範囲が含まれる。
以下の実施例は、本開示の保護対象の代表的な実施形態を実施するための指針を当業者に提供するために含まれる。本開示および当該技術分野における一般的な技術水準に照らして、当業者であれば、以下の実施例は例示的なものであることのみを意図しており、本開示の保護対象の範囲から逸脱することなく、多数の変更、修正、および改変が採用されうることが理解できる。以下の総合的な説明および具体例は、例示を目的としたものであり、他の方法によって本開示の化合物を製造することを任意の方法で限定するものと解釈されるものではない。
(実施例1)
1.1 概要
本開示の保護対象は、ビルディングブロックである60nmのLNPを使用してサイズが制御され、安定的なpDNA/脂質粒子(200nm~1200nm)を生成する動力学的に制御されたアプローチを提供する。これらの粒子の平均サイズが、in vitroおよびin vivoの両方の高いトランスフェクション効率を達成する際の決定要素であることが特定されている。in vitroトランスフェクションの場合、60nmのLNPと比較して、1200nmのLNPのトランスフェクション効率は、HEK293T細胞およびHepG2肝臓がん細胞に対して、それぞれ、111倍および44倍高い。加えて、pDNA/脂質粒子のサイズが、肝内注射によるin vivo局所トランスフェクションの効率に対する主要な決定要因として特定された。本開示のサイズが制御されたLNPは、ウイルスベクターの生産および遺伝子治療の両方のプロセス工学において、広範囲の用途を見出すであろう。
1.2 代表的な結果
1.2.1 40~1000nmの範囲に制御されたサイズの安定的なpDNA/PEI粒子の生産
いくつかの実施形態においては、本開示の保護対象は、pDNA/脂質粒子系の動態成長の特徴に基づくボトムアップの集合ストラテジーを提供する(図1A)。第1に、均一で小さなLNPが調製された。これらのLNPは、疎水性効果により、安定的で、凝縮されていた。均一で小さなLNPは、続いて、より大きな粒子に対するビルディングブロックとして使用された。第2に、水混和性有機溶剤、例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノール、DMSO、DMF、THF、アセトン、アセトニトリル、等を追加して溶液の極性を調整することにより、pDNA/脂質粒子表面の動態安定性は、十分に除かれることになる。この時点で、粒子会合および凝集が可能になり、粒子はゆっくりと成長した。この過程は、例えば、HOによる希釈で溶液の極性を反転させることにより、所望の粒径に達したときに効果的に停止させることができる。
第1のステップ中、高流量の乱流混合を誘発する閉じ込め衝突ジェット(CIJ)ミキサーを使用したフラッシュナノ複合体形成(FNC)技術を使用して、均一で小さなpDNA/脂質ナノ粒子が合成された。フラッシュナノ複合体形成技術は、アニオン核酸溶液、例えば、pDNA溶液と、カチオン性脂質溶液との混合を加速させ、マイクロチェンバ内の乱流混合によりPEC集合動態を一致させるために使用されうる動力学的に制御された混合過程である。これにより、ナノ粒子サイズ、組成、およびpDNAペイロードの同調性により示されるような、pDNA/脂質ナノ粒子集合に対する動態条件の明示制御が成し遂げられる。Heら(2018)、および2020年11月5日に公開された、Compositionally Defined Plasmid DNA/Polycation Nanoparticles and Methods for Making the Sameと題する国際PCT特許出願公開第WO2020223323号(Maoら)を参照のこと。これらは、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
100μg/mLの入力pDNA濃度を有し、設計されたナノ粒子は、DLSにより測定された60nmの平均サイズを有した(図1B)。このアプローチは、ピペット混合およびボルテックス(vertexing)による小さなバッチスケールにおいて試験された。異なる量のエタノールによるチャレンジにより、ゆっくりとしたサイズ成長過程が引き起こされ、エタノールの最終濃度により、成長率が判定された(図1C)。エタノールの濃度を調整することにより、負の電荷を持つ核酸リン酸(P)基に対する正の電荷を持つポリマーアミン(N=窒素)基の比率(N/P比)が異なるLNPが、同様のサイズ成長動態プロファイルを有する(図1D)。室温で40~70%のエタノール(60~40程度の混合物の誘電率)により開始し、成長経路に沿った異なる時点で懸濁液を同量のHOと混合することにより成長を停止させることにより、高い一貫性を有して(図1F)、平均粒径を200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、800nm、および1200nmで(図1E)安定化させることに成功した。これらの特定の粒径は、原理の証明として意図的に選択された。任意の他の所望のサイズも、異なる時点で成長を停止させることにより容易に得られる。
このアプローチの包括的性質に基づいて、異なる所望のサイズで異なる組成を有するpDNA/脂質粒子が得られる。
1.2.2 制御されたサイズの安定的なpDNA/脂質粒子のin vitroトランスフェクション効率
安定的な粒子が、HEK293T細胞およびHepG2細胞の単層培養液に投与され、レポーターとしてのルシフェラーゼをコードするpDNAを使用して、トランスフェクション効率が試験された。投与溶液は希釈され、トランスフェクション実験のための1μg pDNA/mLの作業濃度が得られた。ルシフェラーゼ活性読み出し(図2A、図2B)により、60nmのLNPと比較して、1200nmのLNPのトランスフェクション効率は、HEK293T細胞およびHepG2肝臓がん細胞に対して、それぞれ111倍および44倍高いことが検証された。
1.2.3 肝内注射による制御されたサイズの安定的なpDNA/脂質粒子のin vivo局所トランスフェクション効率
異なるサイズ(100nm、600nm、および1000nm)の安定的な粒子が、肝臓に直接注入され、レポーターとしてのルシフェラーゼをコードするpDNA(マウスあたり3μg)を使用して、トランスフェクション効率が試験された(図3A)。図3Bに示すように、pDNA/脂質粒子のサイズは、肝内注射によるin vivo局所トランスフェクションの効率に対する主要な決定要因としても作用する。100nmまたは1000nmのLNPと比較して、600nmのサイズのpDNA/脂質粒子は、最も高いトランスフェクション効率を生み出した。600nmのLNPの際立って高い導入遺伝子レベルは、48時間後に収集された肝臓の単細胞懸濁液のルシフェラーゼ活性読み出しにより更に確認された(図3C)。
[参照]
本明細書に記載の全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、本開示の保護対象が属する技術分野に精通している者のレベルを示すものである。本明細書に記載の全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献(例えば、ウェブサイト、データベース、等)は、個々の出版物、特許出願、特許、および他の参照文献が具体的にかつ個々に参照により組み込まれる場合と同一の程度まで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。多数の特許出願、特許、および他の参照文献が本明細書で参照されているが、このような参照は、これらの文書のいずれかが当技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではないことが理解されよう。本明細書と組み込まれた参考文献との間に矛盾がある場合は、本明細書(組み込まれた参考文献に基づく場合がある、その修正を含む)が優先するものとする。本明細書では、特に断りのない限り、標準的な技術上認められた用語の意味を使用する。本明細書では、さまざまな用語の標準的な略語を使用する。
He,Z.;Hu,Y.;Nie,T.;Tang,H.;Zhu,J.;Chen, K.;Liu,L;Leong,K.W.;Chen,Y.;Mao,H.-Q.,Size controlled lipid nanoparticle production using turbulent mixing to enhance oral DNA delivery.Acta Biomaterialia 2018,81,195-207.
International PCT Patent Application Publication No.WO2020223323 for Compositionally Defined Plasmid DNA/Polycation Nanoparticles and Methods for Making the Same,to Mao et al.,published November 5,2020.
前述の保護対象は、理解を明瞭にする目的で、図示および例示によってある程度詳細に説明されたが、当業者には、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正を実施できることが理解されよう。

Claims (31)

  1. 210nm~1200nmの平均粒径および0.05~0.5の多分散性指数を有する複数の核酸/脂質粒子を調製する方法であって、
    (a)20~200nmの第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液を調製または提供することと、
    (b)前記第1の溶液の極性を約80の誘電率から約45~60に減少させ、前記第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の粒径成長を誘発し、210nm~1200nmの範囲にある第2の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第2の溶液を形成することと、
    (c)約65~80の誘電率の前記第2の溶液の極性を反転させ、前記第2の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の成長を所定の粒径で停止させ、210~1200nmの平均粒径および0.05~0.5の多分散性指数を有する複数の核酸/脂質粒子を形成することと
    を含む、方法。
  2. 前記第1の粒径は、約40nm~約120nmの範囲を有する、請求項1に記載の方法。
  3. 前記第1の粒径は、約60nmである、請求項2に記載の方法。
  4. 前記第2の粒径は、約210、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、および1200nmからなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第1の溶液は、Ca2+、Mg2+、Zn2+、およびFe3+からなる群から選択される1つまたは複数の多価陽イオンを更に含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記第1の溶液の極性は、前記第1の溶液に水混和性有機溶剤を追加することにより低下する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
  7. さまざまな濃度の前記水混和性有機溶剤を前記第1の溶液に追加し、前記第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子の粒径成長を制御することを含む、請求項6に記載の方法。
  8. 前記水混和性有機溶剤は、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、テトラヒドロフラン(THF)、アセトン、およびアセトニトリルからなる群から選択される、請求項6または7に記載の方法。
  9. 前記第2の溶液の極性は、HOによる希釈により反転する、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液は、継続的なフラッシュナノ複合体形成(FNC)技術により調製される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第1の粒径を有する複数の核酸/脂質ナノ粒子を含む第1の溶液は、手動のピペット混合およびボルテックス(vertexing)法により調製される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
  12. 約100μg/mLの入力核酸濃度を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、ガイドRNA、プラスミドDNA、ベクターDNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA、およびsiRNAからなる群から選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記核酸は、1つまたは複数の異なる種の核酸を含む、請求項13に記載の方法。
  15. 前記核酸は、1つまたは複数のプラスミドDNAを含む、請求項14に記載の方法。
  16. 前記核酸/脂質ナノ粒子は、正電荷脂質、中性脂質、負電荷脂質、ペグ化脂質、およびイオン化脂質からなる群から選択される1つまたは複数の脂質を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記核酸/脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む、請求項16に記載の方法。
  18. 前記カチオン性脂質は、N1-[2-((1S)-1-[(3-アミノプロピル)アミノ]-4-[ジ(3-アミノ-プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]-3,4-ジ[オレイルオキシ]-ベンズアミド、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、O-アルキルホスファチジルコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(12:0 EPD)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:0 EPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0 EPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(18:0 EPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(18:1 EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、および1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)、N-(4-カルボキシベンジル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オレオイルオキシ)プロパン-1-アミニウム(DOBAQ)、1,2-ジステアロイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(18:0 DAP)、1,2-ジパルミトイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(16:0 DAP)、1,2-ジミリストイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(14:0 DAP)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)(18:1 DAP)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(14:0 TAP)、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(16:0 TAP)、1,2-ステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(18:0 TAP)、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(18:1 TAP(DOTAP))、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、3β-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC-コレステロール・HCl)、DC-コレステロール、N4-コレステリル-スペルミン(GL67)、1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、2,3,-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミネカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパントリフルオロアセテート(DOSPA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジオレオイルカルバミル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DOCDAP)、1,2-ジリネオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DLINDAP)、ジラウリル(C12:0)トリメチルアンモニウムプロパン(DLTAP)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、DC-Choi、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-ベータ-オキシブタン-4-オキシ)-1-(シス,シス-9,12-オクタデカジエノキシ)プロパン(CLinDMA)、2-[5’-(コレスト-5-エン-3[ベータ]-オキシ)-3’-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(シス,シス-9’,12’-オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、およびN,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、および1,2-N,N’-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン(DOcarbDAP)、ならびにそれらの組み合わせおよび薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
  19. 前記カチオン性脂質は、DOTAPである、請求項18に記載の方法。
  20. 請求項1~19のいずれか一項に記載の方法により調製された、核酸/脂質ナノ粒子。
  21. 血漿DNAを含む脂質ナノ粒子であって、約210nm~約1,200nmの範囲を有する平均粒径を有する、ナノ粒子。
  22. 以下の1つまたは複数のための、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法により調製された複数の核酸/脂質ナノ粒子の使用:
    (a)ウイルスベクター生産のためのin vitroトランスフェクション、
    (b)治療用細胞および遺伝子編集のためのex vivoトランスフェクション、
    (c)in vivoトランスフェクション、
    (d)in vivo局所投与、および
    (e)組織特異的送達。
  23. 前記ウイルスベクター生産のためのin vitroトランスフェクションは、1つまたは複数の細胞を前記複数の核酸/脂質ナノ粒子に接触させることを含む、請求項22に記載の使用。
  24. 前記複数の核酸/脂質ナノ粒子を、前記1つまたは複数の細胞の単層培養液または前記1つまたは複数の細胞の懸濁培養液に投与することを含む、請求項23に記載の使用。
  25. 前記1つまたは複数の細胞は、ウイルスパッケージングHEK293細胞を含む、請求項23または24に記載の方法。
  26. 前記1つまたは複数の細胞は、HEK293S細胞、HEK293T細胞、HEK293F細胞、HEK293FT細胞、HEK293FTM細胞、HEK293SG細胞、HEK293SGGD細胞、HEK293H細胞、HEK293E細胞、HEK293MSR細胞、またはHEK293A細胞を含む、請求項25に記載の方法。
  27. 前記1つまたは複数の細胞は、HEK293T細胞を含む、請求項26に記載の方法。
  28. 前記1つまたは複数の細胞は、懸濁培養液に適したHEK293T細胞を含む、請求項27に記載の方法。
  29. 前記in vivo局所投与は、肝内注射、皮内注射、硝子体内注射、筋肉内注射、外耳道内注射、および腫瘍内注射からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
  30. 前記組織特異的送達は、鼻腔内送達、経口送達、および舌下送達からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
  31. 肝細胞、ケラチノサイト、成体幹細胞および前駆細胞、多能性幹細胞、T細胞、NK細胞、ならびに腫瘍細胞の1つまたは複数をトランスフェクトすることを含む、請求項22に記載の方法。
JP2023549081A 2021-02-16 2022-02-16 in vitroおよびin vivoトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドDNA/脂質粒子の調製方法 Pending JP2024509743A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163149985P 2021-02-16 2021-02-16
US63/149,985 2021-02-16
PCT/US2022/016580 WO2022177977A1 (en) 2021-02-16 2022-02-16 Methods for preparation of plasmid dna/lipid particles with defined size for in vitro and in vivo transfection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024509743A true JP2024509743A (ja) 2024-03-05

Family

ID=82931148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023549081A Pending JP2024509743A (ja) 2021-02-16 2022-02-16 in vitroおよびin vivoトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドDNA/脂質粒子の調製方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240115513A1 (ja)
EP (1) EP4294450A1 (ja)
JP (1) JP2024509743A (ja)
WO (1) WO2022177977A1 (ja)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103906504B (zh) * 2011-11-04 2017-11-17 日东电工株式会社 制备用于药物递送的脂质纳米颗粒的方法
EP3468537A1 (en) * 2016-06-14 2019-04-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3883394A2 (en) * 2018-11-20 2021-09-29 Sphera Encapsulation S.r.l. Multi-layered particles
CA3146675A1 (en) * 2019-07-23 2021-01-28 Translate Bio, Inc. Stable compositions of mrna-loaded lipid nanoparticles and processes of making

Also Published As

Publication number Publication date
US20240115513A1 (en) 2024-04-11
WO2022177977A1 (en) 2022-08-25
EP4294450A1 (en) 2023-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111295448A (zh) 非病毒的无衣壳dna载体的脂质纳米粒子制剂
CN108358812B (zh) 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
KR100908757B1 (ko) 백신 및 유전자 요법을 위한 고 역가 재조합 인플루엔자바이러스
CA3105953A1 (en) Fusosome compositions and uses thereof
US20230043128A1 (en) Multivalent influenza vaccines
JP2022518504A (ja) 閉端dna(cedna)ならびに遺伝子療法または核酸療法に関連する免疫応答を低減させる方法における使用
CN115916163A (zh) 新型脂质及其纳米颗粒组合物
JP2016539629A (ja) レトロウイルスベクター
JPWO2001072340A1 (ja) センダイウイルスベクターを用いたaidsウイルスワクチン
US20220040329A1 (en) Inducible expression cassette, and uses thereof
JP2017510293A (ja) ゲノムインスレーターエレメントおよびその使用
JP2023533174A (ja) ACE-tRNAのコード化及び発現
Li et al. Combinatorial synthesis and high-throughput screening of alkyl amines for nonviral gene delivery
CN117642380A (zh) 阳离子脂质及其组合物
US20240115513A1 (en) Methods for preparation of plasmid dna/lipid particles with defined size for in vitro and in vivo transfection
JP2023527747A (ja) 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物
CN118159278A (zh) 单链可变片段(scFv)修饰的脂质纳米颗粒组合物及其用途
CA3094859A1 (en) Proteolipid vesicles formulated with fusion associated small transmembrane proteins
CN116332776B (zh) 一种阳离子脂质化合物及其组合物和应用
US20240117376A1 (en) Composition of shelf-stable plasmid dna/polyethyleneimine (pei) particles with defined sizes for viral vector production and method for preparation of the same
JP2024506394A (ja) 細胞トランスフェクションのための規定サイズの保存安定性があるプラスミドdna/ポリカチオン粒子の調製方法
DE69810925T2 (de) Verwendung eines kationischen Polymer zur Herstellung von Nukleinsäure-Komplexe und verwandte Zusammensetzungen
JP2022523806A (ja) 閉端dna(cedna)および免疫調節化合物
US20230181762A1 (en) Genomic insulator element exhibiting enhancer blocking activities in lymphocytes and uses thereof
WO2024233557A2 (en) Kinetically controlled methods to prepare concentrated shelf-stable nucleic acid transfection vehicles