JP2023502501A

JP2023502501A - 眼内血管新生のための長時間作用型ｖｅｇｆ阻害剤

Info

Publication number: JP2023502501A
Application number: JP2022529850A
Authority: JP
Inventors: フェラーラ，ナポレオン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2023-01-24
Also published as: EP4065150A4; US11382955B2; US11433118B2; IL293131A; AU2020393842A1; CN114867487A; EP4065150A1; WO2021108255A1; US20220088129A1; CA3168512A1; KR20220104756A; US20230029307A1; US11576948B2; MX2022006241A; US20220144918A1; US20220088128A1; BR112022010113A2; US20230136080A1

Abstract

必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する眼の障害を治療するための組成物および方法であって、Ｆｃ－ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含む治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を対象に硝子体内投与することを含み、ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含む。【選択図】図５Ｄ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年１１月２５日に提出された米国仮出願第６２／９３９，７５６号の優先権の利益を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１１月１９日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名称は２４９７８－０５９５＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは５４，４８０バイトである。

本発明は、眼内血管新生のための新規の長時間作用型ＶＥＧＦ阻害剤に関する。

血管は、組織および臓器に栄養素を運び、異化産物を除去するため、新生血管供給または血管新生の発達は、重要な恒常性維持の役割を果たす^１。しかしながら、血管の制御不能な成長は、腫瘍および眼内血管障害を含む多数の疾患プロセスを促進するか、または容易にする可能性がある^１。多数の血管新生因子が最初に同定され、特徴付ける^２が、多くの実験室で行われた作業は、ＶＥＧＦを正常および病理学的血管新生、ならびに血管透過性^{３４}の主要な調節因子として確立している。代替的なエクソンスプライシングは、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５およびＶＥＧＦ_１８９を含む、ヘパリンに対する親和性が異なる複数のアイソフォームの生成をもたらす。ＶＥＧＦ_１２１は、有意なヘパリン結合を欠いている。ＶＥＧＦ_１６５は、単一のエクソン７コードされたヘパリン結合ドメインを有するが、ＶＥＧＦ_１８９は、エクソン６およびエクソン７^{５６}によってコードされる２つのヘパリン結合ドメインを有する。多くの実験的証拠は、血管新生に必要な生化学的勾配の確立におけるヘパリン結合ＶＥＧＦアイソフォームの重要な役割を記録している^７－９。ＶＥＧＦは、Ｐ１ＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、およびＶＥＧＦ－Ｄも含む遺伝子ファミリーのメンバーである。３つの関連する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）がＶＥＧＦリガンド：ＶＥＧＦＲ１^１０、ＶＥＧＦＲ２^１１およびＶＥＧＦＲ３^１２に結合することが報告されている。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の両方に結合し、ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦ－Ｂは、ＶＥＧＦＲ１と選択的に相互作用する。ＶＥＧＦＲ３は、リンパ脈管新生^{１３１４}に関与しているＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄに結合する。このＲＴＫクラスの各メンバーは、細胞外部分^１５つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する。ＶＥＧＦＲ－２がＶＥＧＦ^１４の主要なシグナル伝達受容体であるが、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦＲ２^１５よりも実質的に高い新和性でＶＥＧＦと結合すると考えられている。

ＶＥＧＦ阻害剤は、複数の腫瘍の標準的な治療法となり、重度の視力低下および法的盲の主な原因である、新生血管型の加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜静脈閉塞症などの眼内新生血管障害の治療に転換をもたらした^{１６３１７}。現在、ベバシズマブ、ラニビズマブ、およびアフリベルセプト^３の３つの抗ＶＥＧＦ薬が、眼科的適応症に米国で広く使用されている。ベバシズマブは、ＶＥＧＦ^１８を標的とする全長ＩｇＧ抗体である。ベバシズマブは眼科的適応症用に開発されていないが、その低コストにより適応外で広く使用されている。ラニビズマブは、親和性成熟抗ＶＥＧＦＦａｂである^１９。アフリベルセプトは、ＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質^２０であり、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、およびＶＥＧＦ－Ｂ^２１に結合するＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２からの要素を有する。重要なことに、ラニビズマブまたはベバシズマブで５年間治療した後、新生血管ＡＭＤ患者の約半数は良好な視力、すなわち視力２０／４０以上を示し、抗ＶＥＧＦ剤が利用可能になる前にはできなかったであろう転帰である^２２。しかしながら、実際の臨床設定では、多くの患者は臨床試験よりも少ない抗ＶＥＧＦ注射を受けており、これが満足のいく視覚的転帰と相関しないとの仮説が立てられている^２３。したがって、眼内に注射した場合に持続時間がより長い薬剤を開発し、結果として注射の頻度を減らす必要があり、この目的のために多くのアプローチが試みられてきた^{２４２５}。アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）は、２ｍｇの用量を８週間ごとに投与することにより、毎月のラニビズマブ（０．５ｍｇ）の有効性に匹敵する可能性があることを示す臨床試験に基づいて承認された。しかしながら、アフリベルセプトに切り替えることによって硝子体内注射の回数が減ると予測されているにもかかわらず、最近の研究ではそうではないことが示唆されている^２６。したがって、半減期が改善された硝子体内抗ＶＥＧＦ剤に対する未だ満たされていない医学的必要性が依然として残っている。

１９９６年、ＶＥＧＦＲ１中のＶＥＧＦ結合エレメントを同定することを目的とした構造機能研究の過程で、Ｉｇ様ドメイン（Ｄ）２の欠失は、他のＤの欠失ではなく、ＶＥＧＦまたはＰＩＧＦ結合を停止することを見出した２７。ＶＥＧＦＲ３のＤ２をＶＥＧＦＲ１Ｄ２で置き換えることにより、ＶＥＧＦＲ３にＶＥＧＦＲ１のリガンド特異性が付与された１２７。その後の研究は、Ｘ線結晶学によってＤ２とＶＥＧＦ（またはＰｌＧＦ）との間の相互作用を実証した^{２８－３０}。しかしながら、Ｄ３は最適なＶＥＧＦ結合にとって重要であった^{２７２８}。最初の研究は、Ｆｃ－ｌｇＧに融合したＶＥＧＦＲ１の最初の３つのＩｇ様Ｄ（Ｆｌｔ－１－３－ＩｇＧ）を含む、構築物の設計につながった^２７。Ｆｌｔ－１－３－ＩｇＧは、生理学的および病理学的血管新生のインビトロおよびいくつかのインビボモデルでＶＥＧＦを中和する強力な能力を示した^{３１－３４３５３６}。しかしながら、Ｄ３には塩基性残基のクラスターが存在するため、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合し、各組織に隔離されるため、全身投与後のこの分子の半減期は、比較的短いものであった。

２００２年、Ｈｏｌａｓｈら^２１は、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２（結合要素）およびＶＥＧＦＲ２Ｄ３から構成されるＩｇＧ融合構築物を説明したが、これはＶＥＧＦＲ１Ｄ３よりもはるかに低いヘパリン親和性を有する。この分子は、今日ではアフリベルセプト、ジブアフリベルセプトまたはＥＹＬＥＡとして知られており、Ｆｌｔ－（１－３－ｌｇＧ）よりも有意に全身半減期が長いことが報告されている^２１。これらのＰＫ特性は、ＶＥＧＦに対する高い結合親和性と、ＰｌＧＦとＶＥＧＦ－Ｂとを結合する能力と組み合わせて、アフリベルセプトが他のＶＥＧＦ阻害剤よりもより効果的な抗腫瘍剤であると予測されるに至った^{２１３７}。しかしながら、アフリベルセプトは結腸直腸がんの二次治療のみでＦＤＡの承認を得ており、一方ベバシズマブおよび抗ＶＥＧＦＲ２抗体ラムシルマブは、複数のがんタイプ^{３１７}においていくつかのＦＤＡ承認を受けており、上記の特徴が治療上の利点を提供しなかったことが示唆されている。明らかに、アフリベルセプトは、眼の血管障害の硝子体内治療として、その主要な臨床的影響を有している。

本発明は、ＶＥＧＦの活性を阻害し、同時に強力なヘパリン結合特性を有し、それにより優れた薬物動態を提供する、すなわち、硝子体内投与後の治療薬の半減期がより長い抗ＶＥＧＦ剤を投与することを含む、血管新生を阻害するための、および加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、近視に続発する脈絡膜新生血管、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ポリープ状脈絡膜血管症を含むが、これらに限定されない眼の疾患などのＶＥＧＦに関連する状態を治療するための組成物および方法を提供する。

実施形態では、本発明は、必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する眼の障害を治療するための組成物および方法を提供し、本方法は、第１の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を対象に硝子体内投与することと、先の投与から１０～３０週間以内に第２の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を対象に硝子体内投与することと、を含む。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、Ｆｃ－ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含み、このＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含む。

実施形態では、第２の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、先の投与から１６～２４週間以内に硝子体内投与される。実施形態では、本方法は、前の投与から１０～３０週間以内に少なくとも１年間、硝子体内投与される治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤の後続投与を含む。

実施形態では、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、約１～１０ｍｇである。実施形態では、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、約３～６ｍｇである。実施形態では、第１、第２、および後続の治療有効量は同一である。実施形態では、第１、第２、および後続の治療有効量は、異なる。

実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ結合特性を有するドメインおよびヘパリンプロテオグリカンに結合するドメインを融合させるＦｃ－ＩｇＧ構築物である。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ヘパリンに結合する能力を有し、ＶＥＧＦ結合特性を有する１つ以上のドメインを含有するＦｃ－ＩｇＧ構築物である。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦおよびヘパリンへの結合について改善された効力を有する融合タンパク質である。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、内毒素レベルが非常に低い融合タンパク質である。

実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ受容体の要素を含むＩｇＧキメラタンパク質である。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体の細胞外部分に７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインのうちの１つ以上の断片を含む。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、Ｆｃ－ＩｇＧと融合したＶＥＧＦＲ－１の１つ以上の細胞外ドメイン断片を含む。実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインＶＥＧＦＲ－１ドメイン２および少なくとも１つの追加のＶＥＧＦＲ－１ドメイン１または３を含み、ドメイン４を含まないＩｇＧキメラタンパク質を提供する。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、Ｆｃ－ＩｇＧと融合したＶＥＧＦＲ－２の１つ以上の細胞外ドメイン断片を含む。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、Ｆｃ－ＩｇＧと融合したＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２の１つ以上の細胞外ドメイン断片を含む。

実施形態では、本発明は、Ｆｃ－ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含む抗ＶＥＧＦ剤を提供し、このＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含み、この抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトよりも優れたＶＥＧＦ刺激有糸分裂誘発阻害能力を有する。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合能力を有することを提供する。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖阻害能力を有することを提供する。実施形態では、本発明は、薬剤が、アフリベルセプトと比較して、インビボで増加した半減期を有することを提供する。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン１、２、および３（Ｖ_{１－２－３}）からなることを提供する。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２および３（Ｖ_２－３）からなることを提供する。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン１、２、３、および３（Ｖ_{１－２－３－３}）からなることを提供する。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２、３、および３（Ｖ_{２－３－３}）からなることを提供する。

実施形態では、本発明は、治療有効量の、特許請求の範囲に定義される抗ＶＥＧＦ剤および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。実施形態では、本発明は、必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する障害を治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の、定義される抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することを含む。抗ＶＥＧＦ剤は、眼などの罹患組織または臓器に直接注射することができる。

実施形態では、本発明は、眼の疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦと比較して２：１のモル比に対応する投薬量で眼に局所的に投与される。実施形態では、本発明は、眼の疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、硝子体内注射によって投与される。

実施形態では、本発明は、眼の疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、１０～３０週間に１回、硝子体内投与される。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、１６～２４週間に１回、硝子体内投与される。実施形態では、治療は少なくとも１年間継続される。

一実施形態によれば、本発明は、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を眼に局所的に投与することを含む、眼の疾患を治療するための方法を提供し、治療は、潜在型（ｏｃｃｕｌｔ）、古典的最小型（ｍｉｎｉｍａｌｌｙｃｌａｓｓｉｃ）、および古典的優性型（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｃｌａｓｓｉｃ）の滲出型黄斑変性症の治療に有効であり、薬剤は融合タンパク質である。

実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ治療から恩恵を受ける新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼の腫瘍、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、または非腫瘍性障害を含む多種多様なＶＥＧＦに関連する疾患を治療するために使用することができる。

別の態様によれば、本発明は、眼などへの局所投与のための薬学的に許容される担体製剤中に抗ＶＥＧＦ剤を含む医薬製剤を提供する。

実施形態では、本発明は、新規構築物を開示し、この構築物は、ＶＥＧＦの活性を強く中和すると同時に、強力なヘパリン結合特性を有する。

ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（Ｄ）の編成および本研究で設計されたＦｃ融合構築物の編成を示す。赤い標識は、ヘパリン結合ドメインを示す。Ｄ２は、リガンド特異性^２７に関与する、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦに不可欠な結合エレメントである。Ｄ３は、結合親和性および安定性^{２７２８３０}において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦＲ１のＤ３は、ＶＥＧＦＲ２のＤ３ではないが、主要なヘパリン結合部位である。Ｖ２３およびアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）はＤ３のみで異なり、これはアフリベルセプトのＶＥＧＦＲ２とは異なる。Ｄ４もヘパリン結合部位であり、受容体二量体化およびホモタイプ相互作用^３０に関与している。各構築物が単純化のためにモノマーとして示されるが、組換えタンパク質が二量体であるのは、Ｆｃによって強制的に二量体化されるためである。精製された組換えタンパク質の特徴付けを示す。図２Ａは、精製された組換え融合タンパク質およびＥＹＬＥＡの銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥ（４～２０％のＴｒｉｓ）を示す。各タンパク質２００ｎｇを還元条件下で電気泳動に供した。染色を、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって行った。図２Ｂは、Ｖ２３、Ｖ２３３、Ｖ１２３３およびＥＹＬＥＡ（各々の２５μｇ）の分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す。Ｙ軸はミリ吸光度単位で吸光度の強度（Ａ２８０）を表し、Ｘ軸は分単位で溶出時間を表す。阻害剤のＩＣ_５０値を示す。ウシ脈絡内皮細胞をアプローチに記載されているように維持した。アッセイのために、細胞を低密度でプレートした。阻害剤は、図に示されるように、様々な濃度で細胞に添加された。ＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加する。細胞密度を５日後に評価する。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア，ＣＡ）を使用して計算した。示されるデータは、高度に精製されたタンパク質で得られた２つの独立した実験に基づいており、多数の以前のアッセイと一致する。ウシの硝子体への結合を示す。成人マウスのレーザー誘導脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に対する対照ＩｇＧ、ＥＹＬＥＡ、またはＶＥＧＦＲ１Ｆｃ融合タンパク質の効果を示す。図５Ａは、各タンパク質が、レーザー治療の１日前に、２．５μｇの用量でマウスの硝子体内に注射された。ＥＹＬＥＡも２５μｇで試験された。アスタリスクは、適切なＩｇＧ対照群と比較した有意差（スチューデントのｔ検定）を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。データは、１群当たり少なくとも５匹のマウスを用いた３つの独立した実験に基づいている。ＥＹＬＥＡの有効性は、同じモデルで発表された文献に沿っていることに留意されたい。図５Ｂは、傷害前の注射時間がＣＮＶ領域に及ぼす影響を示す。２．５μｇの用量のＥＹＬＥＡは、－１日目に注射した場合にのみ有意に減少した。対照的に、同じ用量のＶ１２３３は、注射の７日前または１４日前に注射された場合でも、ＣＮＶ面積を有意に減少させた。左のパネルは、代表的なＣＤ３１免疫蛍光画像を示す。アスタリスクは、適切なＩｇＧ対照群と比較した有意差（スチューデントのｔ検定）を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。ｎ＝５。２つの独立した実験において、同様の結果を得た。図５Ｃは、等モル用量（ＥＹＬＥＡおよびＶ２３の４．８μｇ、Ｖ２３３の６．３μｇおよびＶ１２３３の７．２μｇ）で試験したＶ２３、Ｖ２３３およびＶ１２３３を示し、ＥＹＬＥＡと比較してより優れた有効性を示す。すべての薬剤を、レーザー治療の１４日前に投与した。７日後、目を採取し、データを分析した。アスタリスクは、適切なＩｇＧ対照群と比較した有意差（スチューデントのｔ検定）を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。図５Ｄは、硝子体内注射後の異なる時点でのマウスにおけるＥＹＬＥＡ、Ｖ２３、Ｖ２３３またはＶ１２３３の血清レベルを示す。各分子を等モル量で両眼に注射した。ＥＹＬＥＡおよびＶ２３を２．４ｍｇ、Ｖ２３３を３．１５ｍｇ、Ｖ１２３３を３．６ｍｇとした。１日、３日、７日、１４日および２１日後に、尾静脈から末梢血を採取した。ヒトＦｃレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。示される値は、平均±ＳＥＭである。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１。ｎ＝８／点。ＯＩＲモデルにおける新生血管形成を阻害するＶ１２３３の硝子体内注射を示す。図６Ａは、アフリベルセプト、Ｖ１２３３、および対照（ＩｇＧ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにおいてＰ７で硝子体内注射を行ったことを示す。３．２５μｇの用量の対照ＩｇＧに対して、１２．５μｇ、２．５μｇ、または１．２５μｇの用量の０．５ｐｌのアフリベルセプト（Ｅ）の体積を僚眼に注射した。同腹仔には、Ｖ１２３３（３．８μｇまたは１．６５ｐｇ）および対照を注射した。ＩｇＧ対照、アフリベルセプト２．５μｇおよびＶ１２３３３．８μｇの濃度は等モルであった（図１０の凡例も参照）。次いで、動物をＰ７からＰ１２まで７５％の酸素に曝露し、続いて室内空気に戻した。Ｐ１７において、動物を灌流固定し、眼を除去し、解剖し、ＢＳＬ－ＦＩＴＣで染色し、平らに取り付けた。図６Ｂは、Ｘｉａｏｅｔａｌ．（ｒｅｆ．１１６）によって説明されているように、自動化されたソフトウェアを使用して血管拡張および新生血管形成を分析したことを示している。血管新生領域は黄色、新生血管の房は赤色で示す。図６Ｃは、新生血管形成の定量化は、Ｖ１２３３（３．８および１．６５ｐｇ）または高用量アフリベルセプト（１２．５μｇ）での対照と比較して、新生血管形成における有意な低減（ｐ＜０．０５ウェルチ矯正によるｔ－試験）を示すが、２．５または１．２５μｇでのアフリベルセプトでの低減ではない。ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１２１によって刺激されたＢＣＥＣ増殖に対する融合タンパク質の阻害効果を示す。結果は、対照に対するＶＥＧＦ刺激増殖の抑制の％として表される。細胞数は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）５３０／５９０（励起／放出）、３連の平均によって決定した。ＨＵＶＥＣ増殖に対する組換えＶＥＧＦ受容体Ｆｃ融合タンパク質の阻害効果を示す。３日間、ＶＥＧＦＩ６５（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに、Ｖ１２３、Ｖ１２３３、Ｖ２３３、Ｖ２３またはＥＹＬＥＡ（１０～２０００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、細胞生存率を決定した。結果は、対照に対するＶＥＧＦ刺激増殖の抑制の％として表される。細胞数は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）５３０／５９０（励起／放出）、３連の平均によって決定した。統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアにおいて２元配置分散分析によって行った。統計学的有意性^＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０００１は、ＶＥＧＦ単独と比較することによって計算した。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２複合体（３Ｖ２Ａ）の結晶構造を、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ１複合体（５Ｔ８９）の結晶構造に重ね合わせたことを示す。潜在的にＶＥＧＦと相互作用することができ、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２との間で異なるＶＥＧＦＲ１残基を標識する。黄色および青色のグレースケール：ＶＥＧＦグリーングレースケール：ＶＥＧＦＲ１Ｄ２。白色：ＶＥＧＦＲ１Ｄ３。分析は、ＶＥＧＦＲ２Ｄ３と比較して、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１Ｄ３との間のより広範な相互作用を指摘する。ウシ内皮細胞増殖に対するＶ１２３３の効果を示す。ウシ脈絡膜微小血管内皮細胞（ＢＣＥＣ、ＶＥＣＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％ウシ仔牛血清を補充した低グルコースＤＭＥＭ中の９６ウェルプレートに播種し、１０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、Ｖ１２３３（バッチ１およびバッチ２）およびＥＹＬＥＡ（ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の連続希釈液とともにインキュベートした。５または６日後、細胞をＡｌａｍａｒＢｌｕｅと４時間インキュベートした。蛍光を、５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。ＰｒｏｍｅｇａＶＥＧＦにおけるＶＥＧＦ誘導ＶＥＧＦＲ２活性化の阻害を示す。ＰｒｏｍｅｇａＶＥＧＦバイオアッセイ（ＧＡ２００１，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＫＤＲ／ＮＦＡＴ－ＲＥＨＥＫ２９３細胞においてＶＥＧＦ１６５によって誘導される刺激を阻害するＶ１２３３の能力を測定し、２０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５の存在下でＶ１２３３（バッチ１およびバッチ２）、ＥＹＬＥＡおよびヒトＩｇＧ１（ＢＥ０２９７，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）の連続希釈液とともにインキュベートした。６時間のインキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ８０試薬を添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５マイクロプレートリーダーを使用して発光を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを４ＰＬｘ（登録商標）曲線に適合させた。ＶＥＧＦＲ１がＣＨＯ細胞培養培地中で濃度を構築することに対するヘパリンの効果を示す。プール細胞（Ｖ１２３、Ｖ１２３３、Ｖ２３３、およびＶ２３）を、１００μｇ／ｍｌのヘパリン（＃Ｈ３１４９，Ｓｉｇｍａ）の有無にかかわらずＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ培地に分割し、加湿雰囲気および１２５ｒｐｍで３７℃で、５％ＣＯ２とともに９６時間インキュベートする。培地を収集し、ＶＥＧＦＲ１ＥＣＤの発現をＥＬＩＳＡにより評価した。ＣＨＯ発現Ｖ１２３３がマウスＣＮＶモデルにおいて完全に活性であることを示す。６～８週目の雄のＣ５７／Ｂｌ６マウスを使用した（ｎ＝６）。レーザー誘導後、約５μｇのＣＨＯ細胞由来および２９３細胞由来のＶ_１２３３を各眼に硝子体内（１μｌ）で注射した。１０日後、脈絡膜－強膜複合体を採取し、固定した。新生血管領域をＣＤ３１免疫蛍光全マウント染色によって示した。図は各群における３つの代表的な新生血管領域を示している。構築物Ｖ_{１－２－３}のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号１および配列番号２を有する。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメインについてのアミノ酸配列および核酸配列は、記載の通り、図内に提供する。Ｖ_１のアミノ酸配列は、配列番号１５であり、構築物Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、構築物Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７である。構築物Ｖ_２－３のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号３および配列番号４を有する。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメインについてのアミノ酸配列および核酸配列は、記載の通り、図内に提供する。Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７である。構築物Ｖ_{１－２－３－３}のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号５および配列番号６である。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメインについてのアミノ酸配列および核酸配列は、記載の通り、図内に提供する。Ｖ_１のアミノ酸配列は、配列番号１５であり、Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７である。構築物Ｖ_{２－３－３}のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号７および配列番号８を有する。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメインについてのアミノ酸配列および核酸配列は、記載の通り、図内に提供する。Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７である。構築物Ｖ_{１－２－３－３－４}のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号９および配列番号１０を有する。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメインについてのアミノ酸配列および核酸配列は、記載の通り、図内に提供する。Ｖ_１のアミノ酸配列は、配列番号１５であり、Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７であり、Ｖ_４のアミノ酸配列は、配列番号１８である。構築物Ｖ_{２－３－４}のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号１１および配列番号１２を有する。構築物Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７であり、Ｖ_４のアミノ酸配列は、配列番号１８である。構築物Ｖ_２－４のヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号１３および配列番号１４を有する。Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６であり、Ｖ_４のアミノ酸配列は、配列番号１８である。

本出願で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語、ならびに任意の頭字語は、本発明の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施に使用され得るが、例示的な方法、装置、および材料が本明細書に記載される。

本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を使用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技法は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄｐｅｒｉｏｄｉｃｕｐｄａｔｅｓ）、ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０^ｔｈｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２^ｔｈｅｄ．，（ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓａｎｄＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙａｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１２）などの文献で完全に説明されている。

本明細書で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙ）」、またはそれらの任意の他の変形は、別途明示的に示される任意の制限を条件とする、列挙される構成成分の非排他的な包括を包含することを意図する。例えば、要素（例えば、構成成分、特徴、またはステップ）のリストを「含む」、融合タンパク質、薬学的組成物、および／または方法は、必ずしもそれらの要素（または構成成分もしくはステップ）のみに限定されないが、明示的に列記されていない、または融合タンパク質、薬学的組成物および／もしくは方法に固有ではない他の要素（または構成成分もしくはステップ）を含み得る。

本明細書で使用する場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆ）」および「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という移行句は、指定されていない任意の要素、ステップ、または構成成分を除外する。例えば、特許請求の範囲で使用される「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆ）」または「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」は、通常関連する不純物（つまり、所定の構成成分内の不純物）を除いて、特許請求の範囲に具体的に列挙される構成成分、材料、またはステップに特許請求の範囲を限定する。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆ）」または「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という語句が、プリアンブルの直後ではなく、特許請求の範囲の本文の節に出現する場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆ）」または「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という句は、その節に記載される要素（または構成成分もしくはステップ）のみを限定し、他の要素（または構成成分）は、全体として特許請求の範囲から除外されない。

本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」および「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という移行句は、文字通りに開示されるものに加えて、材料、ステップ、特徴、構成成分、または要素を含む、融合タンパク質、薬学的組成物、および／または方法を定義するために使用されるが、但し、これらの追加の材料、ステップ、特徴、構成成分、または要素が、特許請求された発明の基本的かつ新規の特性（複数可）に実質的に影響を与えないものとする。「本質的に～からなる」という用語は、「備える」と「～からなる」との間の妥協点を占める。

本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味すると意図される。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙される要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。

２つ以上の項目の列挙において「および／または」という用語が使用される場合、列挙された項目のいずれか１つを単独で使用しても、または列挙された項目のいずれか１つ以上と組み合わせて使用してもよいことを意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢの一方または両方、すなわち、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡとＢとの組み合わせを意味することが意図される。「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢとの組み合わせ、ＡとＣとの組み合わせ、ＢとＣとの組み合わせ、またはＡとＢとＣとの組み合わせを意味することが意図される。

本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」および／または「から本質的になる」を含むことが理解される。

範囲形式での説明は、便宜上かつ簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、考えられるすべての部分範囲とその範囲内の個々の数値が具体的に開示されるとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６が具体的に開示されるとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。また、本明細書では、値または範囲は、「約」、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、として表され得る。そのような値または範囲が表される場合、開示される他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値まで、列挙された特定の値を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。本明細書で開示される値がいくつかあり、各値が、本明細書では、値自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることがさらに理解されよう。実施形態では、「約」は、例えば、列挙された値の１０％以内、列挙された値の５％以内、または列挙された値の２％以内を意味するために使用され得る。

本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」は、治療されるヒトまたは動物の対象を意味する。

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される組成物を指し、組成物は、薬学的に活性な薬剤を含み、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に活性な薬剤と担体との組み合わせであってもよい。

「組み合わせ」という用語は、１つの投薬単位形態における固定された組み合わせ、または組み合わせ投与のためのパーツキットのいずれかを指し、１つ以上の活性化合物と組み合わせパートナー（例えば、「療法剤」または「補助薬剤」とも称される、以下で説明される別の薬物）とが同時に独立して、または時間間隔内に別々に投与され得る。いくつかの状況では、組み合わせパートナーは協同的効果、例えば、相乗効果を示す。本明細書で利用される場合、「併用投与」または「組み合わせ投与」などの用語は、選択された組み合わせパートナーを、それを必要としている単一の対象（例えば、患者）に投与することが包含されることを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路または同じ時間で投与されるわけではない治療レジメンが含まれることを意図する。本明細書で使用される場合、「医薬の組み合わせ」という用語は、２つ以上の活性成分の混合または組み合わせによって得られ、活性成分の組み合わせが固定されているものも固定されていないものも含まれる生成物を意味する。「固定された組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が、特定の時間的制約を設けることなく別々の実体として同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、または連続して患者に投与されることを意味し、ここで、そのような投与によって、２つの化合物が療法上有効な濃度で患者の体内で提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用される。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物での使用に安全である他の製剤に加えて、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方、一般に認められている他の薬局方に列挙されていることを意味する。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、脱メチレン化化合物とともに投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはビヒクルを指す。そのような担体は、水および油などの無菌液体であってよく、油には、石油、動物、植物、または合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒が含まれる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を作成する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態において、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３）を参照されたい。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、本組成物におけるそのような使用が企図される。

本明細書で使用される場合、「治療的有効量」は、疾患および病態に関連する症状を治療もしくは改善するか、または何らかの様式で低減するのに十分である薬学的に活性な化合物の量を指す。方法に関して使用される場合、その方法は、疾患または状態に関連する症状を治療もしくは改善する、または何らかの様式で低減するのに十分有効である。例えば、疾患に関して有効量は、その発病を阻止もしくは予防するか、あるいは疾患病状が始まっている場合は、その疾患の進行を緩和、改善、安定化、回復、もしくは遅延させるか、またはその疾患の病理学的結果を低減させるのに十分である量である。いずれの場合も、有効量は単回投与で与えても、または分割投与で与えてもよい。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、患者における疾患に関連する症状を少なくとも改善することを包含し、その場合、改善は、広い意味で使用され、例えば、治療されている疾患または状態に関連する症状などのパラメータの低度が少なくとも低減することを指す。したがって、「治療」には、疾患、障害、または病的状態、または少なくともそれらに関連する症状が、完全に阻害される（例えば、発生が予防される）かまたは停止され（ｓｔｏｐｐｅｄ）（例えば、停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ））、患者がそれ以上その状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状に罹患することがないようにする状況が含まれる。

本明細書で使用される場合、特に指定しない限り、「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、疾患もしくは障害、またはそれらの１つ以上の症状の発病、再発、または蔓延の予防を指す。ある特定の実施形態において、これらの用語は、症状の発病前に、特に本明細書に提供される疾患または障害のリスクのある対象への、１つ以上の他の追加の活性剤を伴うかまたは伴わない、本明細書に提供される化合物または剤形による治療またはそれらの投与を指す。これらの用語は、特定の疾患の症状の阻害または低減を包含する。ある特定の実施形態において、疾患の家族歴を有する対象は、予防レジメンの潜在的な候補である。ある特定の実施形態において、再発する症状の病歴を有する対象もまた、予防の潜在的な候補である。この点に関して、「予防」という用語は、「予防的治療」という用語と互換的に使用され得る。

本明細書で使用される場合、特に指定しない限り、化合物の「予防的有効量」は、疾患もしくは障害を予防するか、またはその再発を予防するのに十分な量である。予防的有効量の化合物は、単独で、または１つ以上の他の薬剤と組み合わせて、疾患の予防において予防的利益を提供する療法剤の量を意味する。「予防的有効量」という用語は、全体的な予防を改善するか、または別の予防剤の予防有効性を増強させる量を包含し得る。

本明細書で使用される場合、「治療薬」、「抗ＶＥＧＦ剤」、「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」という用語は、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含み、「治療薬」、「抗ＶＥＧＦ剤」、「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」は、ＶＥＧＦの活性を阻害する。キメラタンパク質は、第１または第２のポリペプチドに作動可能に連結された第３、第４、もしくは第５、または他のポリペプチドを任意選択的に含み得る。キメラタンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドを含み得る。キメラタンパク質は、同じポリペプチドの複数のコピーを含み得る。キメラタンパク質はまた、ポリペプチドのうちの１つ以上に１つ以上の変異を含み得る。キメラタンパク質を作製する方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、「治療薬」、「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」という用語は、Ｉｇ様ドメインのうちの１つ以上、またはＦｃ－ＩｇＧを有するＶＥＧＦＲ－１および／もしくはＶＥＧＦＲ－２のドメイン断片を作動可能に連結するペプチドまたはタンパク質を含むがこれらに限定されない、発現または合成される任意の構築物を指す。

「Ｉｇ様ドメイン」という用語は、ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン１～７を指す。「Ｉｇ様ドメイン断片」という用語は、全長ドメインの一部、一般的にはヘパリンおよび／またはそのＶＥＧＦ結合もしくは可変領域を含む。ドメイン断片の例には、全長ドメインの少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％のセグメントを含み、１００％の配列同一性およびその変化を含むアミノ酸配列が含まれる。本開示により包含されるように、融合タンパク質のアミノ酸配列における変化が企図されるが、但し、アミノ酸配列の変化が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持するものとする。７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性など、中間のある特定の割合が含まれる。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、側鎖に関連しているアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、以下のファミリーに分類される。（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸の他のファミリーには、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、ならびに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで単独置換する、またはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で類似置換することは、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合、得られる分子の結合または特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは妥当である。アミノ酸変化が機能的な融合タンパク質をもたらすかどうかは、融合タンパク質誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。融合タンパク質の断片または類似体は、当業者により容易に調製され得る。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界の近くに存在する。

本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」融合タンパク質は、融合タンパク質が存在する主要な種（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）であり、好ましくは実質的に精製された画分が、融合タンパク質が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物であることを意味する。一般的に、精製された組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を構成する。最も好ましくは、融合タンパク質は、本質的に均一になるまで精製され（汚染物質種は従来の検出方法では組成物において検出することができない）、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。

一態様では、本発明は、治療薬を含む組成物を開示し、この治療薬は、ＶＥＧＦＲ－１またはＶＥＧＦＲ－２の１つ以上のヘパリン結合ドメイン、および１つ以上のＶＥＧＦ結合ドメインを含み、それにより、ＶＥＧＦのその同族受容体への結合を阻害する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、Ｆｃ－ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含み、このＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含む。

実施形態では、本発明は、必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する眼の障害を治療するための組成物および方法を提供し、本方法は、第１の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を対象に硝子体内投与することと、先の投与から８週間超以内、または１０～３０週間以内に第２の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を対象に硝子体内投与することと、を含む。実施形態では、第２の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、先の投与から１６～２４週間以内に硝子体内投与される。実施形態では、本方法は、前の投与から１０～３０週間以内に少なくとも１年間、硝子体内投与される治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤の後続投与を含む。本発明は、投与レジメンを必要としている任意の特定の個々の対象に対して必要とされ得るかかる投与レジメンを提供し、第２の投与および後続の投与は、アフリベルセプトよりも高いヘパリン結合効率のために等モル量のアフリベルセプトに対して必要とされるよりも頻度が低い。本発明は、眼内投与後、個体における抗ＶＥＧＦ剤の血漿レベルが、等モル量のアフリベルセプトの眼内投与後の個体におけるアフリベルセプトの血漿レベルよりも低いことをさらに提供し、これは、有害な神経発達効果などの望ましくない全身的効果を回避する。

実施形態では、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、約１～１０ｍｇである。実施形態では、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、約３～６ｍｇである。実施形態では、第１、第２、および後続の治療有効量は同一である。実施形態では、第１、第２、および後続の治療有効量は、異なる。本発明は、任意の特定の抗ＶＥＧＦ剤に対して、それを必要としている任意の特定の個々の対象に必要とされ得る治療有効量のそのような用量を提供する。

ＶＥＧＦＲＶＥＧＦ結合ドメインは、当技術分野で周知である。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメインＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、およびＶ_４の例示的なアミノ酸配列および核酸配列はそれぞれ、図１４～２０内に提供され、図１４～２０は、記載されるように、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ断片およびＶＥＧＦＲ－１ドメイン全体を提示する。ＶＥＧＦＲ－１の個々のヒトＩｇＧ様ドメインＶ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、およびＶ_４のアミノ酸配列もまた、それぞれ配列番号１５～１８に個別に提供される。Ｖ_１のアミノ酸配列は、配列番号１５（配列番号１内にある、図１４の黄色のグレースケールのアミノ酸配列）である。Ｖ_２のアミノ酸配列は、配列番号１６（配列番号１内にある、図１４の青色のグレースケールのアミノ酸配列）である。Ｖ_３のアミノ酸配列は、配列番号１７（配列番号１内にある、図１４の灰色のグレースケールのアミノ酸配列）である。Ｖ_４のアミノ酸配列は、配列番号１８（配列番号９内にある、図１８のグリーンのグレースケールのアミノ酸配列）である。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン１、２、および３（Ｖ_{１－２－３}）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含む。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２および３（Ｖ_２－３）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号３で定義されるアミノ酸配列を含む。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン１、２、３、および３（Ｖ_{１－２－３－３}）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号５で定義されるアミノ酸配列を含む。

実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２、３、および３（Ｖ_{２－３－３}）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号７で定義されるアミノ酸配列を含む。

実施形態では、本発明は、必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する眼の障害を治療する際に使用するための薬学的組成物を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、本明細書で定義される通りである。実施形態では、本発明は、治療有効量の、特許請求の範囲に定義される抗ＶＥＧＦ剤および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。実施形態では、本発明は、必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する障害を治療する方法を提供し、本方法は、定義される治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することを含む。抗ＶＥＧＦ剤は、眼などの罹患組織または臓器に直接注射することができる。

実施形態では、本発明は、眼の疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、１６週間に２回以上、硝子体内投与される。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、１６～２４週間に２回以上、硝子体内投与される。実施形態では、治療は少なくとも１年間継続される。実施形態では、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、約１～１０ｍｇである。実施形態では、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤は、約３～６ｍｇである。

実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ治療から恩恵を受ける、新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼の腫瘍、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、または非腫瘍性障害を含む多種多様なＶＥＧＦに関連する疾患を治療するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、治療薬は、治療薬、および追加の賦形剤、担体、アジュバント、溶剤、または希釈剤を含む投与可能な剤形である。

いくつかの実施形態では、本発明は、対象を治療する、および／または予防的に治療するのに好適な薬学的組成物を開示し、この抗ＶＥＧＦ剤は、その意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療薬または組成物は、注射によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物または治療薬は、罹患臓器または組織に直接注射される。いくつかの実施形態では、治療薬は、例えば、罹患臓器または組織へのパッチもしくは直接適用によって、またはイオン導入によって局所投与することができる。治療薬は、例えば、米国特許第５，６７２，６５９号および同第５，５９５，７６０号に記載されるものなどの徐放性組成物で提供されてもよい。即時または徐放性組成物の使用は、治療される状態の性質に依存する。状態が急性または過急性（ｏｖｅｒ－ａｃｕｔｅ）の障害からなる場合、即時放出型による治療は、徐放性組成物よりも好ましい。代替的に、ある特定の予防的または長期的治療については、徐放性組成物が適切であり得る。

抗ＶＥＧＦ剤はまた、眼内インプラントなどであるがこれに限定されないインプラントを使用して送達されてもよい。そのようなインプラントは、生分解性および／または生体適合性のインプラントであり得るか、または非生分解性のインプラントであり得る。インプラントは、活性剤に透過性または不透過性であり得る。治療薬を送達するための特定のインプラントは、罹患組織または臓器、ならびに治療される状態の性質の両方に依存する。そのようなインプラントの使用は、当技術分野で周知である。

本発明に記載の抗ＶＥＧＦ剤は、特定の組織への正確な送達を提供し、また放出制御療法を提供するために、ナノ粒子または他の薬物製剤に製剤化され得る。

この出願に記載されている抗ＶＥＧＦ剤は、精製された組換えタンパク質としてだけでなく、遺伝子療法アプローチによっても送達することができる。組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）または他の好適なベクターを使用して、網膜下または硝子体内送達によってＶＥＧＦ阻害剤を送達することができる^{４３，４４}。

関連する態様では、本発明は、対象におけるＶＥＧＦに関連するまたは新生血管の障害を治療するための方法を提供し、本方法は、対象に、（ａ）有効量の、ヘパリンに結合し、望ましくない新生血管の発達を減少または予防することができる融合タンパク質を投与することを伴う。融合タンパク質は、ＶＥＧＦに特異的な抗体または抗体断片、ＶＥＧＦ受容体に特異的な抗体、チロシンキナーゼシグナル伝達を阻害、制御、および／または調節する化合物、ＶＥＧＦポリペプチド、核酸レベルでＶＥＧＦ発現を阻害するオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡ、ならびに血管新生阻害活性を有する様々な有機化合物および他の薬剤を含むが、これらに限定されない他の抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせることができる。

本発明は、ＶＥＧＦＲ１のＤ３（または他のＩｇ様ドメイン）によって媒介されるヘパリン結合^２８が、全身投与には不利であるが、硝子体内（または他の局所）投与に重要な利点を付与することができることを提供する。実際、細胞外マトリックスの主要構成成分であるＨＧＰＳＧに結合する能力^２９は、硝子体における蓄積および網膜浸透を促進する^３０。本発明は、ＨＳＰＧと相互作用する異なる能力を有する一連のＶＥＧＦＲ－１Ｆｃ融合構築物を提供する。これにより、異なる臨床条件下で有用である、眼における持続時間／半減期が異なるＶＥＧＦ阻害剤を選択することができる。

本発明の特徴および他の詳細は、ここでより具体的に記載され、好ましい技術および実験結果を記載する以下の実施例において示される。実施例は、本発明を例示する目的で提供され、限定するものとして解釈されるべきではない。

より効果的で長期間持続する眼内使用のためのＶＥＧＦ阻害剤を同定するために、ＶＥＧＦＲ１Ｄにおけるヘパリン結合の多様性を研究した。これを受けて、８つのＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ融合構築物を、差次ヘパリン結合を有するように設計し、これにより、ＨＰＳＧ親和性のスペクトルを提供した。図１は、これらのタンパク質のドメイン構造を示し、ヘパリン結合ドメインを強調する。すべてのタンパク質は、リガンド特異性^２７の主要な決定因子であるＤ２を含む。２つの構築物（Ｖ１２３３およびＶ２３３）は、重複したＤ３を有する。アフリベルセプトのドメイン構造も示す。

初期の実験では、いくつかの構築物の発現レベルは低く、Ｖ１２３４、Ｖ１２３３、Ｖ２３４およびＶ１２４は、条件付けされた培地中の低いレベルで検出可能であった。興味深いことに、以前の研究では、ヘパリン（ＶＥＧＦ１８９またはＶＥＧＦ２０６）に高い親和性を有するＶＥＧＦアイソフォームが、トランスフェクトされた細胞の馴化培地ではほぼ検出されず、細胞表面または細胞外マトリックスに大部分結合したことを示した^{３８９}。しかしながら、それらはヘパリンまたはヘパリナーゼの添加により可溶性形態で放出され得、結合部位がＨＳＰＧからなる^{３８９}ことを示す。したがって、この実施例は、ヘパリンの添加が組換えＶＥＧＦＲ－１融合タンパク質のレベルにも影響を及ぼし得るかどうかを決定した。実際、トランスフェクトされた細胞の培地にヘパリンを添加すると、培地中の組換えタンパク質の濃度が用量依存的に増加した（データは示さず）。

単に従来のプロテインＡ（ＰＡ）親和性クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製を試みた。しかしながら、この方法では、予想される質量の主要なバンドが得られ、強塩基性でヘパリン結合性で、宿主細胞由来のＨＳＰＧおよび他のアニオン性分子との組換えタンパク質の相互作用を反映している可能性が高い多数の小さいバンドがあった。したがって、方法に記載されているように、そのような不純物を取り除くプロトコルが開発された。タンパク質がＰＡに結合されるときに、１．２ＭのＮａＣｌの存在下で高ｐＨ（９．２）で洗浄すると、多数の汚染物質が放出された。次のステップの陰イオン交換クロマトグラフィーは、精製されたタンパク質がフロースルー状態である間に、汚染物質および凝集物の大部分を除去するのに非常に効果的であった。最終精製調製物のＬＰＳレベルは＜０．１ＥＵ／ｍｇ（範囲０．０２～０．０８）であり、前臨床研究との互換性のレベルは非常に低かった^３９。図２Ａに示すように、銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥで評価した組換えタンパク質の純度は、＞９５％であり、ＦＤＡ承認薬物のＥＹＬＥＡの純度と同等であった。図２Ｂは、ＥＹＬＥＡの隣にある３つの最も有望な候補、Ｖ２３、Ｖ１２３３、およびＶ２３３の分析的ＳＥＣプロファイルを示す。ＥＹＬＥＡと同様に、３つのタンパク質は、有意な凝集を伴わずに、予想される保持時間で単一のピークとして溶出した。

組換えタンパク質は、ＢＣＥＣにおけるＶＥＧＦ_１６５（１０ｎｇ／ｍｌ）によって誘導された有糸分裂誘発を阻害する能力について試験された。図に示されているように、組換えタンパク質には阻害効果があり、ＩＣ_５０値は、約１ｎＭの範囲であったが、Ｖ１２４およびＶ２４はそれほど強力ではなかった（図３）。また、ＶＥＧＦ_１２１によって刺激されたＢＣＥＣ有糸分裂誘発を阻害するそれらの能力を記録した（図７）。興味深いことに、ＥＹＬＥＡは、ほぼすべての実験（１０回以上）において、ＩＣ_５０が約１ｎＭと低濃度でも活性を示し、強力であったが、試験した最高濃度でもＶＥＧＦ刺激による増殖を約８０％以上抑制しなかった。ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを用いて同様の結果を得た（図８）。対照的に、ＶＥＧＦＲ１構築物（Ｖ１２４およびＶ２４を除く）は、ＶＥＧＦ誘導増殖を完全に遮断した。そのような差異を検出する能力は、ＶＥＧＦ刺激に応答してのＢＣＥＣ増殖アッセイの比較的高いダイナミックレンジ（約４倍の増加）を反映する可能性が高い。ＶＥＧＦＲ１Ｄ３は、特に、ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ２^{４０４１}よりも著しく効果的にＶＥＧＦに結合することを考慮して、ＶＥＧＦＲ２からのＤ３よりも優れた相互作用面を提供し得る。この仮説を検証するために、各受容体からのＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦ複合体（５Ｔ８９）^３０およびＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦ複合体（３Ｖ２Ａ）^４２のタンパク質データバンクファイルと重ね合わせたＤ２－Ｄ３との比較を行った。この分析はこの仮説を支持している。例えば、ＶＥＧＦＲ１－Ｄ３のＡｒｇ２８０は、ＶＥＧＦＰｈｅ３６の側鎖と相互作用するが、ＶＥＧＦＲ２は、そこにＡｓｐを有する。同様に、ＶＥＧＦＲ１において、Ａｒｇ２６１およびＡｓｎ２９０の両方がＶＥＧＦＧｌｕ６４と相互作用し、ＶＥＧＦＲ２において、Ａｒｇ２６１がＧｌｙによって置き換えられ、したがって、ＶＥＧＦＲ２において、Ａｓｎ２９０を置き換えるＬｙｓのみがＶＥＧＦＧｌｕ６４と相互作用することができる。図９は、潜在的にＶＥＧＦと相互作用することができ、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２との間で異なるＶＥＧＦＲ１残基を示す。

治療に関連する相互作用をさらに定義するために、組換えタンパク質がインビトロでウシ硝子体に結合するかどうかを評価した。図４に図示するように、ＥＹＬＥＡ、対照ＩｇＧ、またはベバシズマブは、ほとんどまたはまったく結合しなかったが、タンパク質は有意な結合を示した。最強の結合剤は、Ｖ１２３３、Ｖ２３３、Ｖ１２３４、続いてＶ１２３であった。Ｖ２３は、ＥＹＬＥＡ（または対照ＩｇＧ）とＶ１２３３との中間的な結合特性を示した。硝子体結合は、用量依存的様態でヘパリンによって置換された。

組換えタンパク質をマウスＣＮＶモデルで試験し、対照ＩｇＧまたはＥＹＬＥＡと比較した。広範な文献は、このモデルにおける抗ＶＥＧＦ剤の新生血管形成を抑制する能力を文書化する^{４３４４４５}。概念実証試験には、様々な構築物間の効力および耐久性の違いを明らかにするのに最適である比較的低用量が選択された。また、ＩｇＧ１アイソタイプの比較的高用量の抗体の硝子体内投与は、ＦｃｇＲＩおよびｃ－Ｃｂｌを介したＦｃシグナルによって媒介される標的外の血管阻害作用を有し、マクロファージの遊走障害を引き起こす可能性が報告されている^４６。これらの効果は、データの解釈を混乱させる可能性がある。用いられる照射量は、有効であると同時に、そのようなオフターゲット効果を回避するはずである。最初は、各タンパク質は、レーザー治療の１日前に２．５μｇの用量で硝子体内に注射された。ＥＹＬＥＡも２５μｇで試験された。図５Ａに示されるように、ＥＹＬＥＡは、２．５μｇの用量で約３０％の阻害、２５μｇで約５０％の阻害をもたらした。これらの知見は、発表された文献とほぼ一致する。例えば、Ｓａｉｓｈｉｎらは、約５μｇのアフリベルセプトの硝子体内注射により、マウスのＣＮＶ領域が約３０％阻害されたと報告した^４４。実際、４０μｇの用量は、マウスＣＮＶモデルにおいてアフリベルセプトの最大阻害性効果を達成するために一般的に使用される^４７。

予想外の知見だったのは、Ｖ１２３、Ｖ２３、Ｖ１２３３およびＶ２３３の構築物のいくつかの効力が高かったことである。損傷の１日前にこれらのタンパク質を２．５μｇ投与すると、２５μｇのＥＹＬＥＡで達成された阻害レベルと一致するか、それを超えた。しかしながら、Ｄ４を含む構築物はいずれも、有意なＣＮＶ阻害を示さなかった（図５Ａ）。

ヘパリン結合が単回投与後に永続的治療効果をもたらすかどうかを決定するために、Ｖ１２３３、ＥＹＬＥＡ、または対照ＩｇＧを、レーザー誘導損傷の１日、７日、または１４日前に硝子体内に注射した（２．５μｇ）。図５Ｂに示されるように、ＥＹＬＥＡは、損傷の１日前に投与した場合にのみ有意な阻害をもたらした。対照的に、Ｖ１２３３は、損傷の７日または１４日前に投与した場合にも有意な阻害をもたらした。

その後の研究では、傷害の１４日前に等モル量のＥＹＬＥＡ、Ｖ２３、Ｖ１２３３およびＶ２３３（ＥＹＬＥＡおよびＶ２３の４．８μｇ、Ｖ２３３の６．３μｇおよびＶ１２３３の７．２μｇ）を投与した。図５Ｃは、試験した用量において、ＥＹＬＥＡがＣＮＶにほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。対照的に、Ｖ２３、Ｖ１２３３、およびＶ２３３は、有意なＣＮＶ阻害をもたらした。この仮説の予測は、強いヘパリン結合特性を有する阻害剤は、ＥＹＬＥＡと比較して低い全身曝露を有するであろうというものである。図５Ｄに示すように、両眼に等モル量のＥＹＬＥＡ、Ｖ２３、Ｖ２３３またはＶ１２３３を硝子体内に注射し、硝子体内投与の２１日後までの異なる時点でヒトＦｃ血清レベルを測定した。ＥＹＬＥＡ投与は、実験全体を通して最高の血清レベルをもたらした。単一のヘパリン結合ドメインを有するＶ２３は、ＥＹＬＥＡよりも低い血清レベルをもたらしたが、Ｖ１２３３またはＶ２３３よりも高い傾向があった。

最後に、ＯＩＲモデルにおけるＶ１２３３とＥＹＬＥＡの複数回投与を比較した。ＣＮＶモデルの所見と一致して、Ｖ１２３３は、ＥＹＬＥＡよりも新生血管形成を阻害することに強力であった図６。

図７は、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１２１によって刺激されたＢＣＥＣ増殖に対する融合タンパク質の阻害効果を示す。結果は、対照に対するＶＥＧＦ刺激増殖の抑制の％として表される。細胞数は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）５３０／５９０（励起／放出）、３連の平均によって決定した。

図８は、ＨＵＶＥＣ増殖に対する組換えＶＥＧＦ受容体Ｆｃ融合タンパク質の阻害効果を示す。３日間、ＶＥＧＦＩ６５（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに、Ｖ１２３、Ｖ１２３３、Ｖ２３３、Ｖ２３、またはＥＹＬＥＡ（１０～２０００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、細胞生存率を決定した。結果は、対照に対するＶＥＧＦ刺激増殖の抑制の％として表される。細胞数は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）５３０／５９０（励起／放出）、３連の平均によって決定した。統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアにおいて２元配置分散分析によって行った。統計学的有意性^＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０００１は、ＶＥＧＦ単独と比較することによって計算した。

図９は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２複合体（３Ｖ２Ａ）の結晶構造を、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ１複合体（５Ｔ８９）の結晶構造に重ね合わせたことを示す。潜在的にＶＥＧＦと相互作用することができ、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２との間で異なるＶＥＧＦＲ１残基を標識する。黄色および青色のグレースケール：ＶＥＧＦグリーングレースケール：ＶＥＧＦＲ１Ｄ２。白色：ＶＥＧＦＲ１Ｄ３。分析は、ＶＥＧＦＲ２Ｄ３と比較して、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１Ｄ３との間のより広範な相互作用を指摘する。

精製したＣＨＯ発現Ｖ１２３３の活性を、２つの独立したバイオアッセイで試験した。ＢＣＥＣ増殖（図１０）およびＰｒｏｍｅｇａＶＥＧＦバイオアッセイ（図１１）。両方のアッセイは、２つの独立したバッチの精製されたＶ１２３３が、ＥＹＬＥＡと同様の（より大きくはないが）効力を有するＶＥＧＦ刺激成長または受容体活性化を阻害することを示す。

また、２９３細胞（Ｅｘｐｉ－２９３系）とは対照的に、ＣＨＯ細胞における構築物の発現は、培地へのヘパリンの添加に依存しないと判断し（図１２）、大きな利点となった。さらに、ＣＨＯ由来Ｖ１２３３がマウスＣＮＶモデルにおいて完全に活性であり、２９３発現Ｖ１２３３に劣らず強力であることが決定された（図１３）。

考察
Ｄ３とＨＰＳＧとの相互作用は、様々な組織内での隔離に起因するＶＥＧＦＲ１ベースの抗ＶＥＧＦ戦略の制限と長い間考えられており、結果として全身半減期が低下する。そのような問題を克服するために、ＨｏｌａｓｈらはＶＥＧＦＲ１Ｄ３をＶＥＧＦＲ２Ｄ３^２１に置き換えた。同じ目的のために、Ｌｅｅらは、より最近、ＶＥＧＦＲ１Ｄ３にグリコシル化部位を導入し、正電荷を効果的に中和し、したがって、Ｄ３媒介性ＨＳＰＧ結合^４８を排除した。両方の場合において、全身半減期は、元のＶＥＧＦＲ１構築物^{２１４８}と比較して増加した。

本研究は、ＨＳＰＧと相互作用する異なる能力を有する一連のＶＥＧＦＲ－１Ｆｃ融合構築物を設計する。前提は、ＶＥＧＦＲ１Ｄ３（またはＤ４^４９などの他のＩｇ様Ｄ）によって媒介されるヘパリン結合は、全身治療には不利であるが、ａ）阻害剤を硝子体内または眼内の他の構造内のＨＰＳＧまたは他の陰イオン分子に固定し、したがってその半減期を増加させるべきであることから、硝子体内投与に使用されるＶＥＧＦ阻害剤に独自の利点を付与し得ることであり、ｂ）そのような阻害剤は、ＶＥＧＦに効果的に結合し、遮断するために、一様に分布する必要はなく、または眼の構造内に深く浸透する必要はないため、硝子体内投与に使用するＶＥＧＦ阻害剤には独特の利点を与えるかもしれないということである。様々な研究により、ＶＥＧＦがＨＰＳＧまたは血管系または他の部位における受容体分布によって決定される生化学的勾配に応答して、その産生部位からかなりの距離まで拡散することができることが示された^{５０８９}。例えば、ＶＥＧＦは、血管系からかなりの距離であっても腫瘍細胞によって産生されるが、ＶＥＧＦ受容体への親和性が高いため、血管内に拡散し、蓄積する^{５１－５３}。したがって、硝子体結合ＶＥＧＦＲ１バリアントは、強い勾配を生成し、ＶＥＧＦを引き寄せ、中和することができると予想される。

非常に緊密な結合剤を有するＳＰＲ（Ｋｄ＜１００ｐｍ）^５４などのセンサープラットフォームを使用して正確な親和性測定を取得する際の課題、他のＶＥＧＦ阻害剤^{２１５５}に対するアフリベルセプトの親和性に関する矛盾するデータ、およびＶＥＧＦに対する中和抗体と他の標的^{５６５７}との間の結合親和性と治療的効力／有効性との間の相関性の低さを考慮して、本研究は、生体ＩＣ_５０データに焦点を当て、より生理学的に関連性があることを選択した。図４に示されているように、組換えタンパク質には阻害効果があり、ＩＣ_５０値は、約１ｎＭの範囲であったが、Ｖ１２４およびＶ２４はそれほど強力ではなかった。

これらのタンパク質がウシの硝子体に結合する。最強の結合剤は、Ｖ１２３３、Ｖ１２３４、続いてＶ１２３であった。Ｖ２３は有意であったが、硝子体結合が低かった。対照ＩｇＧ、ＥＹＬＥＡ、またはＡＶＡＳＴＩＮでは、代わりに結合が最小限であった。

我々の研究で予想外の知見だったのは、Ｖ１２３、Ｖ２３、Ｖ１２３３およびＶ２３３の構築物のいくつかの効力が高かったことである。損傷の１日前にこれらの構築物を２．５μｇ投与すると、２５μｇのＥＹＬＥＡで達成された阻害レベルと一致するか、それを超えた。ＥＹＬＥＡではなくＶ１２３３が、損傷の７日または１４日前に投与した場合にＣＮＶの予防に有意な効果があるという知見は、効果の永続性および治療的価値を実証する。

また、これらのヘパリン結合タンパク質の硝子体内注射は、ＥＹＬＥＡよりもはるかに低い全身レベルをもたらすことが分かった。この特性は、例えば、ＲＯＰの治療に特に有用であり得る。これは、顕著な全身曝露を有する抗ＶＥＧＦ剤での治療が、有害な神経発達効果を有し得ることが報告されているためである^{５８５９}。

興味深いことに、これらの分子（Ｖ_２－４を除く）がインビトロでＶＥＧＦ刺激有糸分裂誘発を阻害する能力を示したという事実にもかかわらず、Ｄ４を含有する構築物（Ｖ１２３４、Ｖ２３４、Ｖ１２４、Ｖ２４）のいずれもインビボで顕著な阻害をもたらさなかった（少なくとも試験した用量で）ことである。しかしながら、これらの構築物はすべて、非還元条件下のＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（図示せず）によって評価されるように、オリゴマーまたは凝集体を形成する傾向を示した。初期の研究^６０では、Ｄ４（Ｄ７と一緒に）がＶＥＧＦＲ－１二量体化の要件として同定されたが、そのような効果はリガンド依存性であることが既知である。結晶構造研究は、そのような同型相互作用の原因となるＤ４のループを明らかにした^３０。高濃度および／またはＦｃ構築物によって課せられる強制的な二量体化がリガンド非依存性相互作用をもたらし、凝集をもたらす可能性があると考えられる。いずれにしても、炎症および免疫原性の可能性を考えると、凝集体は望ましい医薬品ではない^{６１、６２}。重要なことに、Ｄ４を含むタンパク質の有意な有効性の欠如は、すべてのタンパク質が同じ方法論によって精製され、強力なヘパリン結合特性を有するため、汚染物質が観察された有効性に関与している可能性を主張する。

結論として、アフリベルセプトは、腫瘍学的適応症の全身半減期を改善するために、ヘパリン結合ヘパリンドメインを排除するように設計された。本研究で説明される構築物は、代わりに硝子体における結合および保持を促進して、より持続的で治療に関連する相互作用を確実にするように設計されている。

ＣＨＯ細胞を発現系として用いた実験では、トランスフェクト細胞の培地にヘパリンを添加する要件は、培地にヘパリンを添加することで組換えタンパク質濃度の非常に小さな増加がもたらされるように、大幅に減少した。これは、２９３細胞とＣＨＯ細胞との間のＨＳＰＧ組成／濃度の差によって説明される可能性が高い。

方法
ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ発現プラスミドの構築のために、シグナルペプチドをコードする核酸断片と、ＶＥＧＲＦ１２７（遺伝子ＩＤ：２３２１）のうちの１～４個の細胞外Ｉｇ様ドメインの組み合わせをＧｅｎＳｃｒｅｐＵＳＡＩｎｃ．によって合成した。以下の構築物を行った：Ｖ１２３、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３、Ｖ２３、Ｄ２およびＤ３、Ｖ１２３３、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ３、Ｖ２３３Ｄ２、Ｄ３およびＤ３、Ｖ１２３４、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４、Ｖ２３４、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４、Ｖ１２４、Ｄ１、Ｄ２およびＤ４、Ｖ２４、Ｄ２およびＤ４。合成された断片は、ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩ部位でｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、＃ｐｆｕｓｅ－ｈｇｉｆｃ１）に挿入され、様々なＶＥＧＦＲ１ＥＣＤを含有するプラスミドが生成された。次に、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＢａｓａｌＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｒ０４６Ａ）を使用して、ＥＣＤとＦｃ断片との間のインターバルアミノ酸ＲおよびＳ（ＢｇＩＩＩ部位）を除去し、２２７アミノ酸ヒトＩｇＧ１－Ｆｃを有するＶＥＧＦＲ１ＥＣＤの融合タンパク質を発現するプラスミドを生成した。

トランスフェクションおよび馴化培地の調製
製造業者の指示に従い、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１４５２４）を使用して、精製用の馴化培地を生成した。簡潔に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、８％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地中で懸濁培養した。細胞密度が２５０万／ｍｌに達したら、プラスミドＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を混合し、５分間インキュベートし、細胞に添加した。ＤＮＡおよびトランスフェクトされた試薬の最終濃度は、それぞれ、１μｇおよび２．７μｌ／ミリリットルであった。トランスフェクションの５時間後、１００μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３１４９）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル１：４００（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１８６０）を細胞に添加した。トランスフェクションの１６時間後、エンハンサー試薬１および２を添加した。トランスフェクションの９６時間後、馴化培地を採取した。製造業者の指示に従い、ヒトＦｃＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＳｙｄＬａｂｓ、ＥＫ００００９５－ＨＵＦＣ－２）を使用して、Ｆｃ融合タンパク質濃度についてアリコートを試験した。プロテアーゼ阻害剤をバルクに添加し（１：５００）、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

組換えタンパク質の精製
発熱物質不含試薬を使用した。使用する前に、カラムおよび機器（ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒＳｙｓｔｅｍ）を０．５ＮのＮａＯＨに曝露して消毒した。トランスフェクトされた細胞からの馴化培地を、ＰＢＳ、０．０１％のポリソルベート（ＰＳ）２０に調整した。ＰＳ２０を、すべてのステップで緩衝液に添加した。２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した後、上清を、Ｈｉ－ＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（５ｍｌ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するプロテインＡ（ＰＡ）親和性クロマトグラフィーにかけた。ローディング後、カラムを、２０ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ９．２、１．２ＭのＮａＣｌで洗浄した後、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０で溶出し、これをすぐに中和した。次に、ＰＡ溶出プールを、２０ｍＭのジエタノールアミン、ｐＨ９．２に希釈し、Ｈｉ－ＴｒａｐＱ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）陰イオン交換カラムに適用した。結合した物質を、ＮａＣｌの勾配で溶出した。精製された組換えタンパク質を含有するフロースルーを、直ちに２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８に調整し、ヘパリン－セファロース（Ｈｉ－Ｔｒａｐ（商標）－ＨＳ）への結合により濃縮した。０．２～０．４５ＭのＮａＣｌ（構築物に依存）で洗浄した後、組換えＶＥＧＦＲ１融合タンパク質を１ＭのＮａＣｌで溶出した。最終的な研磨ステップは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からなった。最後に、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、１０ｍＭのヒスチジン、５～７％のスレアロース（ｔｈｒｅａｌｏｓｅ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＰＳ２０への透析により、タンパク質を緩衝液交換した。目標は、等浸透圧製剤（約３００ｍＯｓｍ）に近いものを得ることである。内毒素レベルを決定するために、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＬＡＬＥｎｄｏｔｏｘｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌ００３５０）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。

細胞増殖アッセイ
内皮細胞増殖アッセイは、本質的に以前に記載されているように実施された^{６３６４}。初代ウシ脈絡膜内皮細胞（ＢＣＥＣ）（継代数＜１０）（ＶＥＣＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＲｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ、カタログ番号ＢＣＭＥ－４）をトリプシン処理し、再懸濁し、１０％ウシ仔牛血清、２ｍＭグルタミンおよび抗生物質を補充した低グルコースＤＭＥＭ中の９６ウェルプレート（コーティングなし）に、２００μｌ容量でウェル当たり１０００細胞の密度で播種した。ｒｈＶＥＧＦ_１６５（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９３－ＶＥ－０１０）またはｒｈＶＥＧＦ_１２１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４６４４－ＶＳ０１０）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）は薬局から購入した。阻害剤は、リガンドを添加する前に、図に示されるように、様々な濃度で細胞に添加された。５または６日後、細胞をＡｌａｍａｒＢｌｕｅと４時間インキュベートした。蛍光を、５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定した。

プールしたドナー（Ｌｏｎｚａカタログ番号Ｃ２５１９Ａ）、継代５～９由来の初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＧＭ－２内皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）中の０．１％ゼラチンコーティングプレート上で培養した。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃に維持した。細胞増殖を測定するため、０．５％ＦＢＳを含有する２００μｌの内皮基底増殖培地ＥＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ）中に懸濁した１８００個のＨＵＶＥＣを、９６ウェルプレートに播種した。４時間後、１０、２０、５０、２５０、５００、１０００および２０００ｎｇ／ｍｌの濃度の組換えＦｃ融合タンパク質およびＥＹＬＥＡを、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５とともに細胞に添加した。細胞を３日間培養し、製造業者の指示に従って、細胞生存率をａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存率試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。

ウシの硝子体へのインビトロ結合
ウシ硝子体試料（ＩｎＶｉｓｉｏｎＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を４℃で解凍し、次いでＰＢＳで１：１で希釈し、０．２２ｐｍのフィルターで濾過し、分取し、－８０℃で保存した。総タンパク質濃度を、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質アッセイによって測定した。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡストリップウェルを、室温で４時間、硝子体（１ｐｇ／ウェル）でコーティングし、続いて、ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ－Ｔ）で１回洗浄した。各ウェルに、０．０８～１０ｎＭのキメラＶＥＧＦ受容体タンパク質を５０ｐｌ体積で添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１８８３２）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、室温で１５～３０分間、１ステップＰＮＰＰ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，＃３７６２１）を添加した。吸光度は４０５ｎｍで測定されるであろう。Ｓ

レーザー誘導脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週）を、レーザー治療の前にケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。ＣＮＶ病変は、ダイオードレーザー（ＩＲＩＤＥＸ，ＯｃｕｌｉｇｈｔＧＬ）、ならびにスポットサイズ５０ｕｍ、出力１８０ｍＷ、および露光時間１００ｍｓの細隙灯（Ｚｅｉｓｓ）を使用するレーザー光凝固によって誘導された。^{４７，６５}．典型的には、４つのレーザー火傷が、各眼の視神経乳頭の周りの３、６、９、および１２時の位置で誘導された。異なる構築物またはＩｇＧアイソタイプを、１ｐｌの容量の２．５μｇ／眼の用量で硝子体内に注射した。ＥＹＬＥＡは、２．５または２５μｇで陽性対照として使用された。注射の１日後にレーザー治療を行い、レーザー治療の７日後に、眼を摘出し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。別の一連の研究では、レーザー治療の１日、７日、または１４日前に、選択された構築物を１回注射した。脈絡膜－強膜複合体および網膜を分離し、網膜および脈絡膜組織の両方の全体マウント染色により血管系を証明するために抗ＣＤ３１免疫蛍光法（ＩＦ）を実施した。ＣＤ３１ＩＦの場合、ラット抗マウス抗体ＢＤ５５０２７４を、１：１００に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。二次抗ラット抗体（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＡ１１００６）との４時間のインキュベーション後、全体マウントを４８８ｎｍで撮像した。病変領域の新生血管および網膜の血管密度の定量化は、ＩｍａｇｅＪによって行われた。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって評価された（有意な変化、ｐ＜０．０５）。

酸素誘発性網膜症モデル
酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）マウスモデルは、虚血性血管性眼疾患の分子変化を描写するのに有用であることが証明されている確立された方法である^{６６６７}。密閉チャンバを使用して、新生仔マウスを産後７日目（Ｐ７）からＰ１２まで７５％の酸素に曝露した後、２１％の酸素（室内空気）に戻す。この高酸素症への曝露は、虚血性脈管障害の血管遮断期を模倣して、中心網膜の血管退縮と正常な橈骨血管の成長の停止を引き起こす。室内空気に戻ると、網膜の無血管領域は低酸素になる^{６８６９}。この低酸素は、血管新生因子、特にＶＥＧＦ７０の発現を誘導し、血管網膜と無血管網膜の接合部における異常な網膜新生血管の成長をもたらす。阻害剤の効果を試験するために、新生血管相の阻害を試験するために、高酸素症に曝露する前に硝子体内注射を実施する。Ｐ７の野生型Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスは、げっ歯類のフェイスマスクを通って流れるイソフルランを使用して麻酔される。まぶたは、Ｖａｎｎａｓマイクロディセクションハサミを使用して開き、引き戻して目を露出させる。次に、ピコスプリッツァーＩＩＩ（ＰａｒｋｅｒＨａｎｎｉｆｉｎ）に取り付けられた引っ張られたガラス製マイクロピペットを用いて、０．５ｐｌの溶液を硝子体内に注射する。注射後、針は３０秒間目に残し、漏れを最小限に抑えるためにゆっくりと引き抜かれる。この手順は、対照として等モルのヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ，ＷｅｓｔＬａｂａｎｏｎ，ＮＨ）を注射して、僚眼で繰り返される。ＥＹＬＥＡ、種々の構築物を、種々の用量で対照ＩｇＧ１に対して試験する。まぶたは抗生物質の軟膏で覆われていた。次いで、リッターをＰ７－Ｐ１２由来の７５％過酸素チャンバ内に配置して、ＯＩＲ表現型を生成する。新生血管形成のピーク時であるＰ１７では、動物を屠殺し、目を除去し、解剖し、血管をＢＳＬ－ＦＩＴＣで染色する。網膜を平らに取り付け、共焦点顕微鏡によって画像化した。新生血管形成の程度を、前網膜血管芽の体積を測定することによって定量化した^{６７７０－７２}。血管遮断および新生血管形成を、記載したように自動ソフトウェアを使用して分析した^７３。

ＣＨＯ細胞研究
プラスミドの構築および発現
ＶＥＧＦＲ１のシグナルペプチド（遺伝子ＩＤ：２３２１）およびヒトＩｇＧ１－Ｆｃドメイン（遺伝子ＩＤ：３５００）で１～３個の細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＥＣＤ）をコードする核酸断片をＧｅｎＳｃｒｅｐＵＳＡＩｎｃ．によって合成した。断片を、ＸｂａＩおよびＥＣｏＲ１部位でｐＤ２５３５ｎｔ－ＨＤＰデュアルＥＦ１ａプロモーターベクター（ＡＴＵＭ）に挿入し、２２７アミノ酸ヒトＩｇＧ１－ＦｃでＶＥＧＦＲ１ＥＣＤの融合タンパク質を発現するプラスミドを生成した。ＶＥＧＦＲ１ＥＣＤ構築物は以下の通りである。Ｖ１２３はＥＣＤ１、２および３を含み、Ｖ１２３３はＥＣＤ１、２、３および３を含み、Ｖ２３３はＥＣＤ２、３および３を含み、Ｖ２３はＥＣＤ２および３を含む。すべての構築物の真偽を配列解析によって検証した。

ＣＨＯＫ１グルタミン合成酵素（ＧＳ）ヌル細胞（ＨＤ－ＢＩＯＰ３，Ｈｏｒｉｚｏｎ）を安定発現のために使用し、Ｎｅｏｎ（商標）トランスフェクションシステム（＃ＭＰＫ１００９６，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクションを実施した。簡潔に述べると、線形化した構築物ＤＮＡを、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙによって提供されるプロトコルに従って、ＨＤ－ＢＩＯＰ３細胞中にエレクトロポレーションによってトランスフェクションし、細胞を、４ｍＭのＬ－グルタミン（＃２５０３００８１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（＃Ａ１１４８３０１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で４８時間培養した。２日目の回収後、培地を選択培地、５０μＭのＭＳＸを含有するＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ（＃７６０７８、Ｓｉｇｍａ）で変更した。最大２０日間の培養のために、ＶＥＧＦＲ１ＥＣＤの４つのプールを選択し、バンクした。培地中のＶＥＧＦＲ１融合タンパク質の発現を、ヒトＦｃＥＬＩＳＡキット（ＥＫ００００９５－ＨＵＦＣ－２、ＳｙｄＬａｂＩｎｃ．）および抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ抗体（Ａ－１０６４８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるウエスタンブロッティングによって評価した。４つのプールの発現レベルは、１００万個の細胞当たり１．９～１３μｇであった（平均でＶ１２３で７．１、Ｖ１２３３で１．９８、Ｖ２３３で４．７、Ｖ２３で１２．７）。

単一細胞クローンスクリーニングのために、プール細胞を希釈し、プロトコルに従って選択した（Ｈｏｒｉｚｏｎ）。約６０日間の培養後、合計３９個のクローンを選択し、ストックした。８個はＶ１２３、１１個はＶ１２３３、９個はＶ２３３、１１個はＶ２３である。各クローンの培養培地中のＶＥＧＦＲ１融合タンパク質の発現をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより評価した。発現レベルは、１００万個の細胞当たり３．０～１８．３μｇである（平均して、Ｖ１２３で１２、Ｖ１２３３で３．７、Ｖ２３３で６．５、およびＶ２３で１３）。

大規模な培地調製のために、細胞（単一細胞クローン）を、０．５×１０^６／ｍｌの密度でスピナーフラスコに播種し、５％のＣＯ２で、加湿雰囲気および１２５ｒｐｍ（２５ｍｍ軌道を有する軌道シェーカー）で、１：１０００アンチクランピング剤（＃００１００５７ＡＥ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および１：２００プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｐ１８６０、Ｓｉｇｍａ）を補充したＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯの培地中で３７℃で培養した。細胞生存率および密度を毎日モニタリングし、培地を５～７日間のインキュベーション後に回収した（細胞密度は７．０～１０×１０６／ｍｌ、生存率は＞９０％）。クローン、Ｖ１２３３－２６、Ｖ２３３－５２／６７およびＶ２３－５を大型培養培地調製に使用した。培地中のＶＥＧＦＲ１融合タンパク質の発現をＥＬＩＳＡにより検証し、ウェスタンブロットおよび培地を－８０℃で保存してさらなる精製を行った。発現レベルは、２０～１１５μｇ／ｍｌであった（Ｖ１２３３は２３μｇ／ｍｌ、Ｖ２３３は４７μｇ／ｍｌ、Ｖ２３は１０５μｇ／ｍｌの平均）。

精製
より高いレベルのＶ１２３３タンパク質（２０～３０ｕｇ／ｍｌ）クローン１４、２６、４４および４６を発現するＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＨＤ）－ＢＩＯＰ３ＣＨＯ細胞を精製する。４つのクローンはすべて、同様の最終生成物を得たので、その後の精製のために、クローン２６を使用した。Ｖ１２３３－２６からおよそ１０ｍｇに相当する条件培地を以下のように行った。３７℃で解凍した条件培地を５％ＰＢＳおよび０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０に調整し、２０，０００ｇで３０分間４℃で遠心分離した。１×ＰＢＳおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｓｕｒｅ５ｍｌ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、明確化した抽出物を適用した。カラムを、高ｐＨ、高塩緩衝液（５ＣＶ：２０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．２、１．２ＭのＮａｃｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）、および結合したタンパク質を０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ３．０）によって溶出させ、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）の体積の１／５を添加することによって直ちに中和した。Ｆｌｔ１タンパク質を含有する画分をプールし、２０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１０倍に希釈し、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＱＨＰ５ｍｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）アニオン交換カラムに適用した。フロースルーに存在するＦｌｔ１タンパク質を、１０％ｖ／ｖの０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）を添加することによってｐＨ６．８に調整し、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で平衡化したＨｉＴｒａｐ（商標）ＨＰヘパリン１ｍｌカラムに適用した。カラムを緩衝液中の０．４５ＭのＮａＣｌで洗浄し、続いて１ＭのＮａＣｌ中で最終溶出した。Ｆｌｔ１陽性画分をプールし、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２、０．４ｍＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中のＨｉＬｏａｄＳｕｐｅｒｄｅｘ１６×６００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）中のゲル濾過クロマトグラフィーに供した。高分子量凝集塊を除く画分をプールし、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＨｅｐａｒｉｎＨＰ１ｍｌカラムに結合した後に濃縮し、続いて前述のように１ＭのＮａＣｌ溶出を行った。

溶出したタンパク質を、Ｆｌｏａｔ－Ａ－ＬｙｚｅｒＲＧ２透析装置、ＭＷＣＯ１００ｋＤまたは５０ｋＤ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して透析し、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターＵｌｔｒａＣｅｌ５０ｋを使用して濃縮した。

大規模精製（５０ｍｇタンパク質に相当する条件培地）のために、方法を以下のように変更した。プロテインＡクロマトグラフィーは、０．１Ｍのクエン酸中で最終溶出する前に、緩衝液１（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１．２ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）および緩衝液２（２５ＭＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）を使用して、２つの洗浄ステップを有するＨｉＴｒａｐＰｒｉｓｍＡ５ｍｌカラムを使用して行った。ＨｉＴｒａｐＱを２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）を用いて実施し、わずかに高い塩（０．５５Ｍ）を用いてＨｉＴｒａｐヘパリンカラムを洗浄した。ゲル濾過工程を、緩衝液１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０、８０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０中のより広いカラム（ＨｉＬｏａｄ２６×６００）で行った。透析の代わりに、ＰＤ１０カラムを緩衝液交換に使用し、最終的なタンパク質を、ｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム、７％のトレハロース、および０．０１％のＴｗｅｅｎ２０中に保存した。

クロマトグラフィーをＦＰＬＣシステムＡＫＴＡＡｖａｎｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。カラムおよび器具は、各実行の前に０．５ＮのＮａＯＨによって消毒（所定の場所での洗浄）された。各工程後のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび銀染色によって、タンパク質の純度を測定した。最終的なタンパク質調製の質は、分析的ゲル濾過によって決定した。

総タンパク質推定を、タンパク質アッセイ染料試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、およびヒトＦｃタンパク質およびヒトＩｇＧ（ＳｙｄＬａｂｓ）のＦｃＥＬＩＳＡキットによって行った。全体的なタンパク質回収率はおよそ１０％であり、最終的なタンパク質は０．００４ＥＵ／ｍｇ前後、ＨＣＰ１５０ｎｇ／ｍｇ前後のエンドトキシンレベルを達成した。
参考文献
［１］ＦｏｌｋｍａｎＪ，ＫｌａｇｓｂｒｕｎＭ：Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８７，２３５：４４２－７．
［２］ＫｌａｇｓｂｒｕｎＭ，Ｄ’ＡｍｏｒｅＰＡ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｓｉｏｌ１９９１，５３：２１７－３９．
［３］ＦｅｒｒａｒａＮ，ＡｄａｍｉｓＡＰ：Ｔｅｎｙｅａｒｓｏｆａｎｔｉ－ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ２０１６，１５：３８５－４０３．
［４］ＦｅｒｒａｒａＮ，ＧｅｒｂｅｒＨＰ，ＬｅＣｏｕｔｅｒＪ：ＴｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆＶＥＧＦａｎｄｉｔｓｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ２００３，９：６６９－７６．
［５］ＨｏｕｃｋＫＡ，ＦｅｒｒａｒａＮ，ＷｉｎｅｒＪ，ＣａｃｈｉａｎｅｓＧ，ＬｉＢ，ＬｅｕｎｇＤＷ：Ｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｆｏｕｒｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｏｆＲＮＡ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１９９１，５：１８０６－１４．
［６］ＴｉｓｃｈｅｒＥ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＲ，ＨａｒｔｍａｎＴ，ＳｉｌｖａＭ，ＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚＤ，ＦｉｄｄｅｓＪＣ，ＡｂｒａｈａｍＪＡ：Ｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｅｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｍｓａｒｅｅｎｃｏｄｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｅｘｏｎｓｐｌｉｃｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９１，２６６：１１９４７－５４．
［７］ＰａｒｋＪＥ，ＫｅｌｌｅｒＧ－Ａ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｓｏｆｏｒｍｓ（ＶＥＧＦ）：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｔｏｔｈｅｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘａｎｄｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ－ｂｏｕｎｄＶＥＧＦ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ１９９３，４：１３１７－２６．
［８］ＲｕｈｒｂｅｒｇＣ，ＧｅｒｈａｒｄｔＨ，ＧｏｌｄｉｎｇＭ，ＷａｔｓｏｎＲ，ＩｏａｎｎｉｄｏｕＳ，ＦｕｊｉｓａｗａＨ，ＢｅｔｓｈｏｌｔｚＣ，ＳｈｉｍａＤＴ：Ｓｐａｔｉａｌｌｙｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｐａｔｔｅｒｎｉｎｇｃｕｅｓｐｒｏｖｉｄｅｄｂｙｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇＶＥＧＦ－Ａｃｏｎｔｒｏｌｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｂｒａｎｃｈｉｎｇｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ２００２，１６：２６８４－９８．
［９］ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘａｎｄｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ｔｗｏｋｅｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｃｔｉｏｎ．ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ２０１０２１：６８７－９０．
［１０］ｄｅＶｒｉｅｓＣ，ＥｓｃｏｂｅｄｏＪＡ，ＵｅｎｏＨ，ＨｏｕｃｋＫ，ＦｅｒｒａｒａＮ，ＷｉｌｌｉａｍｓＬＴ：Ｔｈｅｆｍｓ－ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ａｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９２，２５５：９８９－９１．
［１１］ＴｅｒｍａｎＢＩ，ＤｏｕｇｈｅｒＶｅｒｍａｚｅｎＭ，ＣａｒｒｉｏｎＭＥ，ＤｉｍｉｔｒｏｖＤ，ＡｒｍｅｌｌｉｎｏＤＣ，ＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚＤ，ＢｏｈｌｅｎＰ：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＫＤＲｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅａｓａｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｉｏｐｈｙｓ－Ｒｅｓ－Ｃｏｍｍｕｎ１９９２，１８７：１５７９－８６ｉｓｓｎ：０００６－２９１ｘ．
［１２］ＪｏｕｋｏｖＶ，ＰａｊｕｓｏｌａＫ，ＫａｉｐａｉｎｅｎＡ，ＣｈｉｌｏｖＤ，ＬａｈｔｉｎｅｎＩ，ＫｕｋｋＥ，ＳａｋｓｅｌａＯ，ＫａｌｋｋｉｎｅｎＮ，ＡｌｉｔａｌｏＫ：Ａｎｏｖｅｌｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ－Ｃ，ｉｓａｌｉｇａｎｄｆｏｒｔｈｅＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ－３）ａｎｄＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ－２）ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｓ．ＥＭＢＯ－Ｊ１９９６，１５：１７５１ｉｓｓｎ：０２６１－４１８９．
［１３］ＡｌｉｔａｌｏＫ，ＴａｍｍｅｌａＴ，ＰｅｔｒｏｖａＴＶ：Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ２００５，４３８：９４６－５３．
［１４］ＯｌｓｓｏｎＡＫ，ＤｉｍｂｅｒｇＡ，ＫｒｅｕｇｅｒＪ，Ｃｌａｅｓｓｏｎ－ＷｅｌｓｈＬ：ＶＥＧＦｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ－ｉｎｃｏｎｔｒｏｌｏｆｖａｓｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２００６，７：３５９－７１．
［１５］ＦｅｒｒａｒａＮ：ＶＥＧＦａｎｄｔｈｅｑｕｅｓｔｆｏｒｔｕｍｏｕｒａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｆａｃｔｏｒｓ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ２００２，２：７９５－８０３．
［１６］ＭｉｌｌｅｒＪＷ，ＬｅＣｏｕｔｅｒＪ，ＳｔｒａｕｓｓＥＣ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｉｎｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ２０１３，１２０：１０６－１４．
［１７］ＡｐｔｅＲＳ，ＣｈｅｎＤＳ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＶＥＧＦｉｎＳｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄＤｉｓｅａｓｅ：ＢｅｙｏｎｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ２０１９，１７６：１２４８－６４．
［１８］ＰｒｅｓｔａＬＧ，ＣｈｅｎＨ，Ｏ’ＣｏｎｎｏｒＳＪ，ＣｈｉｓｈｏｌｍＶ，ＭｅｎｇＹＧ，ＫｒｕｍｍｅｎＬ，ＷｉｎｋｌｅｒＭ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＨｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎＡｎｔｉ－ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｔｈｅＴｈｅｒａｐｙｏｆＳｏｌｉｄＴｕｍｏｒｓａｎｄＯｔｈｅｒＤｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９７，５７：４５９３－９．
［１９］ＣｈｅｎＹ，ＷｉｅｓｍａｎｎＣ，ＦｕｈＧ，ＬｉＢ，ＣｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒＨＷ，ＭｃＫａｙＰ，ｄｅＶｏｓＡＭ，ＬｏｗｍａｎＨＢ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｔｉ－ＶＥＧＦａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎａｆｆｉｎｉｔｙ－ｍａｔｕｒｅｄＦａｂｉｎｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈａｎｔｉｇｅｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１９９９，２９３：８６５－８１．
［２０］ＣｈａｍｏｗＳＭ，ＲｙｌｌＴ，ＬｏｗｍａｎＨＢ，ＦａｒｓｏｎＤ：ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＦｃ－ＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｓ．ＷｉｌｅｙＢｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１４．
［２１］ＨｏｌａｓｈＪ，ＤａｖｉｓＳ，ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓＮ，ＣｒｏｌｌＳＤ，ＨｏＬ，ＲｕｓｓｅｌｌＭ，ＢｏｌａｎｄＰ，ＬｅｉｄｉｃｈＲ，ＨｙｌｔｏｎＤ，ＢｕｒｏｖａＥ，ＩｏｆｆｅＥ，ＨｕａｎｇＴ，ＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉＣ，ＢａｉｌｅｙＫ，ＦａｎｄｌＪＰ，ＤａｌｙＴ，ＷｉｅｇａｎｄＳＪ，ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓＧＤ，ＲｕｄｇｅＪＳ：ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ：ａＶＥＧＦｂｌｏｃｋｅｒｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００２，９９：１１３９３－８．
［２２］ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＡｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄＭａｃｕｌａｒＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＴｒｅａｔｍｅｎｔｓＴｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＧ，ＭａｇｕｉｒｅＭＧ，ＭａｒｔｉｎＤＦ，ＹｉｎｇＧＳ，ＪａｆｆｅＧＪ，ＤａｎｉｅｌＥ，ＧｒｕｎｗａｌｄＪＥ，ＴｏｔｈＣＡ，ＦｅｒｒｉｓＦＬ，３ｒｄ，ＦｉｎｅＳＬ：Ｆｉｖｅ－ＹｅａｒＯｕｔｃｏｍｅｓｗｉｔｈＡｎｔｉ－ＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＮｅｏｖａｓｃｕｌａｒＡｇｅ－ＲｅｌａｔｅｄＭａｃｕｌａｒＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＴｈｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＡｇｅ－ＲｅｌａｔｅｄＭａｃｕｌａｒＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＴｒｅａｔｍｅｎｔｓＴｒｉａｌｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ２０１６，１２３：１７５１－６１．
［２３］ＨｏｌｚＦＧ，ＴａｄａｙｏｎｉＲ，ＢｅａｔｔｙＳ，ＢｅｒｇｅｒＡ，ＣｅｒｅｄａＭＧ，ＣｏｒｔｅｚＲ，ＨｏｙｎｇＣＢ，ＨｙｋｉｎＰ，ＳｔａｕｒｅｎｇｈｉＧ，ＨｅｌｄｎｅｒＳ，ＢｏｇｕｍｉｌＴ，ＨｅａｈＴ，ＳｉｖａｐｒａｓａｄＳ：Ｍｕｌｔｉ－ｃｏｕｎｔｒｙｒｅａｌ－ｌｉｆｅｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｏｆａｎｔｉ－ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｗｅｔａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＢｒＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ２０１５，９９：２２０－６．
［２４］ＲｅｇｕｌａＪＴ，ＬｕｎｄｈｖｏｎＬｅｉｔｈｎｅｒＰ，ＦｏｘｔｏｎＲ，ＢａｒａｔｈｉＶＡ，ＣｈｅｕｎｇＣＭ，ＢｏＴｕｎＳＢ，ＷｅｙＹＳ，ＩｗａｔａＤ，ＤｏｓｔａｌｅｋＭ，ＭｏｅｌｌｅｋｅｎＪ，ＳｔｕｂｅｎｒａｕｃｈＫＧ，ＮｏｇｏｃｅｋｅＥ，ＷｉｄｍｅｒＧ，ＳｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒＰ，ＫｏｓｓＭＪ，ＫｌｅｉｎＣ，ＳｈｉｍａＤＴ，ＨａｒｔｍａｎｎＧ：ＴａｒｇｅｔｉｎｇｋｅｙａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｐａｔｈｗａｙｓｗｉｔｈａｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＣｒｏｓｓＭＡｂｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｏｒｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｅｙｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ＥＭＢＯＭｏｌＭｅｄ２０１６，８：１２６５－８８．
［２５］ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＧＡ，ＭａｓｏｎＭ，ＣｈｒｉｓｔｉｅＬＡ，ＨａｎｓｅｎＣ，ＨｅｒｎａｎｄｅｚＬＭ，ＢｕｒｋｅＪ，ＬｕｈｒｓＫＡ，ＨｏｈｍａｎＴＣ：ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｂｉｃｉｐａｒ－Ｐｅｇｏｌ，ａｎＡｎｔｉ－ＶＥＧＦＤＡＲＰｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＴｈａｔＰｏｔｅｎｔｌｙＩｎｈｉｂｉｔｓＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＶａｓｃｕｌａｒＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２０１８，５９：５８３６－４６．
［２６］ＶｏｒｕｍＨ，ＯｌｅｓｅｎＴＫ，ＺｉｎｃｋＪ，ＨｅｄｅｇａａｒｄＭ：Ｒｅａｌｗｏｒｌｄｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｕｓｅｏｆａｎｔｉ－ＶＥＧＦｔｈｅｒａｐｙｉｎＤｅｎｍａｒｋ．ＣｕｒｒＭｅｄＲｅｓＯｐｉｎ２０１６：１－３２．
［２７］Ｄａｖｉｓ－ＳｍｙｔｈＴ，ＣｈｅｎＨ，ＰａｒｋＪ，ＰｒｅｓｔａＬＧ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＶＥＧＦｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｒｅｃｅｐｔｏｒＦｌｔ－１ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｍａｙｉｎｉｔｉａｔｅａｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｃａｓｃａｄｅ．ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１９９６，１５：４９１９－２７．
［２８］ＷｉｅｓｍａｎｎＣ，ＦｕｈＧ，ＣｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒＨＷ，ＥｉｇｅｎｂｒｏｔＣ，ＷｅｌｌｓＪＡ，ｄｅＶｏｓＡＭ：Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｔ１．７ＡｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆＶＥＧＦｉｎｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｄｏｍａｉｎ２ｏｆｔｈｅＦｌｔ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ１９９７，９１：６９５－７０４．
［２９］ＣｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒＨＷ，ＦｕｈＧ，ｄｅＶｏｓＡＭ，ＷｉｅｓｍａｎｎＣ：ＴｈｅＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰｌａｃｅｎｔａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｉｎＣｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈＤｏｍａｉｎ２ｏｆＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒ－１．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００４，２７９：１０３８２－８．
［３０］Ｍａｒｋｏｖｉｃ－ＭｕｅｌｌｅｒＳ，ＳｔｕｔｔｆｅｌｄＥ，ＡｓｔｈａｎａＭ，ＷｅｉｎｅｒｔＴ，ＢｌｉｖｅｎＳ，ＧｏｌｄｉｅＫＮ，ＫｉｓｋｏＫ，ＣａｐｉｔａｎｉＧ，Ｂａｌｌｍｅｒ－ＨｏｆｅｒＫ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＦｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈＶＥＧＦＲ－１ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＤｏｍａｉｎｉｎＣｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈＶＥＧＦ－Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２０１７，２５：３４１－５２．
［３１］ＦｅｒｒａｒａＮ，ＣｈｅｎＨ，Ｄａｖｉｓ－ＳｍｙｔｈＴ，ＧｅｒｂｅｒＨ－Ｐ，ＮｇｕｙｅｎＴ－Ｎ，ＰｅｅｒｓＤ，ＣｈｉｓｈｏｌｍＶ，ＨｉｌｌａｎＫＪ，ＳｃｈｗａｌｌＲＨ：Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｃｏｒｐｕｓｌｕｔｅｕｍａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１９９８，４：３３６－４０．
［３２］ＧｅｒｂｅｒＨＰ，ＶｕＴＨ，ＲｙａｎＡＭ，ＫｏｗａｌｓｋｉＪ，ＷｅｒｂＺ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＶＥＧＦｃｏｕｐｌｅｓｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｄｕｒｉｎｇｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌｂｏｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ１９９９，５：６２３－８．
［３３］ＧｅｒｂｅｒＨＰ，ＨｉｌｌａｎＫＪ，ＲｙａｎＡＭ，ＫｏｗａｌｓｋｉＪ，ＫｅｌｌｅｒＧ－Ａ，ＲａｎｇｅｌｌＬ，ＷｒｉｇｈｔＢＤ，ＲａｄｔｋｅＦ，ＡｇｕｅｔＭ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＶＥＧＦｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｎｅｏｎａｔａｌｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１９９９，１２６：１１４９－５９．
［３４］ＧｅｒｂｅｒＨＰ，ＫｏｗａｌｓｋｉＪ，ＳｈｅｒｍａｎＤ，ＥｂｅｒｈａｒｄＤＡ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｘｅｎｏｇｒａｆｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｓｂｌｏｃｋａｄｅｏｆｂｏｔｈｔｕｍｏｒａｎｄｈｏｓｔｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０００，６０：６２５３－８．
［３５］ＬｉｓｓｂｒａｎｔＩＦ，ＨａｍｍａｒｓｔｅｎＰ，ＬｉｓｓｂｒａｎｔＥ，ＦｅｒｒａｒａＮ，ＲｕｄｏｌｆｓｓｏｎＳＨ，ＢｅｒｇｈＡ：ＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＶＥＧＦｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈａｓｏｌｕｂｌｅｃｈｉｍｅｒｉｃＶＥＧＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｆｌｔ（１－３）ＩｇＧｉｎｈｉｂｉｔｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｐｒｏｓｔａｔｅｇｒｏｗｔｈｉｎｃａｓｔｒａｔｅｄｍｉｃｅ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ２００４，５８：５７－６５．
［３６］ＺｈｅｎｇＭ，ＤｅｓｈｐａｎｄｅＳ，ＬｅｅＳ，ＦｅｒｒａｒａＮ，ＲｏｕｓｅＢＴ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｅｒｐｅｔｉｃｓｔｒｏｍａｌｋｅｒａｔｉｔｉｓ．ＪＶｉｒｏｌ２００１，７５：９８２８－３５．
［３７］ＫｉｍＥＳ，ＳｅｒｕｒＡ，ＨｕａｎｇＪ，ＭａｎｌｅｙＣＡ，ＭｃＣｒｕｄｄｅｎＫＷ，ＦｒｉｓｃｈｅｒＪＳ，ＳｏｆｆｅｒＳＺ，ＲｉｎｇＬ，ＮｅｗＴ，ＺａｂｓｋｉＳ，ＲｕｄｇｅＪＳ，ＨｏｌａｓｈＪ，ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓＧＤ，ＫａｎｄｅｌＪＪ，ＹａｍａｓｈｉｒｏＤＪ：ＰｏｔｅｎｔＶＥＧＦｂｌｏｃｋａｄｅｃａｕｓｅｓｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｏｐｔｅｄｖｅｓｓｅｌｓｉｎａｍｏｄｅｌｏｆｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００２，９９：１１３９９－４０４．
［３８］ＨｏｕｃｋＫＡ，ＬｅｕｎｇＤＷ，ＲｏｗｌａｎｄＡＭ，ＷｉｎｅｒＪ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｄｕａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｂｙｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ－Ｂｉｏｌ－Ｃｈｅｍ１９９２，２６７：２６０３１－７．
［３９］ＭａｌｙａｌａＰ，ＳｉｎｇｈＭ：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｌｉｍｉｔｓｉｎｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｆｏｒｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＪＰｈａｒｍＳｃｉ２００８，９７：２０４１－４．
［４０］ＳｈｉｂｕｙａＭ：ＶＥＧＦＲａｎｄｔｙｐｅ－ＶＲＴＫａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｅｒｓｐｅｃｔＢｉｏｌ２０１３，５：ａ００９０９２．
［４１］ＰａｒｋＪＥ，ＣｈｅｎＨＨ，ＷｉｎｅｒＪ，ＨｏｕｃｋＫＡ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｐｌａｃｅｎｔａｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ，ａｎｄｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｔｏＦｌｔ－１ｂｕｔｎｏｔｔｏＦｌｋ－１／ＫＤＲ．Ｊ－Ｂｉｏｌ－Ｃｈｅｍ１９９４，２６９：２５６４６－５４ｉｓｓｎ：００２１－９２５８．
［４２］ＢｒｏｚｚｏＭＳ，ＢｊｅｌｉｃＳ，ＫｉｓｋｏＫ，ＳｃｈｌｅｉｅｒＴ，ＬｅｐｐａｎｅｎＶＭ，ＡｌｉｔａｌｏＫ，ＷｉｎｋｌｅｒＦＫ，Ｂａｌｌｍｅｒ－ＨｏｆｅｒＫ：ＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄＶＥＧＦＲ－２ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ２０１２，１１９：１７８１－８．
［４３］ＫｗａｋＮ，ＯｋａｍｏｔｏＮ，ＷｏｏｄＪＭ，ＣａｍｐｏｃｈｉａｒｏＰＡ：ＶＥＧＦｉｓｍａｊｏｒｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｉｎｍｏｄｅｌｏｆｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２０００，４１：３１５８－６４．
［４４］ＳａｉｓｈｉｎＹ，ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＬｉｍａｅＳｉｌｖａＲ，ＨｙｌｔｏｎＤ，ＲｕｄｇｅＪＳ，ＷｉｅｇａｎｄＳＪ，ＣａｍｐｏｃｈｉａｒｏＰＡ：ＶＥＧＦ－ＴＲＡＰ（Ｒ１Ｒ２）ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＶＥＧＦ－ｉｎｄｕｃｅｄｂｒｅａｋｄｏｗｎｏｆｔｈｅｂｌｏｏｄ－ｒｅｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒ．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ２００３，１９５：２４１－８．
［４５］ＣａｍｐａＣ，ＫａｓｍａｎＩ，ＹｅＷ，ＬｅｅＷＰ，ＦｕｈＧ，ＦｅｒｒａｒａＮ：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｏｎｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ：ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｔｏｑｕａｎｔｉｆｙｖａｓｃｕｌａｒｃｈａｎｇｅｓ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２００８，４９：１１７８－８３．
［４６］ＢｏｇｄａｎｏｖｉｃｈＳ，ＫｉｍＹ，ＭｉｚｕｔａｎｉＴ，ＹａｓｕｍａＲ，ＴｕｄｉｓｃｏＬ，ＣｉｃａｔｉｅｌｌｏＶ，Ｂａｓｔｏｓ－ＣａｒｖａｌｈｏＡ，ＫｅｒｕｒＮ，ＨｉｒａｎｏＹ，ＢａｆｆｉＪＺ，ＴａｒａｌｌｏＶ，ＬｉＳ，ＹａｓｕｍａＴ，ＡｒｐｉｔｈａＰ，ＦｏｗｌｅｒＢＪ，ＷｒｉｇｈｔＣＢ，ＡｐｉｃｅｌｌａＩ，ＧｒｅｃｏＡ，ＢｒｕｎｅｔｔｉＡ，ＲｕｖｏＭ，ＳａｎｄｏｍｅｎｉｃｏＡ，ＮｏｚａｋｉＭ，ＩｊｉｍａＲ，ＫａｎｅｋｏＨ，ＯｇｕｒａＹ，ＴｅｒａｓａｋｉＨ，ＡｍｂａｔｉＢＫ，ＬｅｕｓｅｎＪＨ，ＬａｎｇｄｏｎＷＹ，ＣｌａｒｋＭＲ，ＡｒｍｏｕｒＫＬ，ＢｒｕｈｎｓＰ，ＶｅｒｂｅｅｋＪＳ，ＧｅｌｆａｎｄＢＤ，ＤｅＦａｌｃｏＳ，ＡｍｂａｔｉＪ：ＨｕｍａｎＩｇＧ１ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎａｔａｒｇｅｔ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＴａｒｇｅｔＴｈｅｒ２０１６，１．
［４７］ＳｉｌｖａＲＬＥ，ＫａｎａｎＹ，ＭｉｒａｎｄｏＡＣ，ＫｉｍＪ，ＳｈｍｕｅｌｉＲＢ，ＬｏｒｅｎｃＶＥ，ＦｏｒｔｍａｎｎＳＤ，ＳｃｉａｍａｎｎａＪ，ＰａｎｄｅｙＮＢ，ＧｒｅｅｎＪＪ，ＰｏｐｅｌＡＳ，ＣａｍｐｏｃｈｉａｒｏＰＡ：ＴｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｂｌｏｃｋｉｎｇｃｏｌｌａｇｅｎＩＶ－ｄｅｒｉｖｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｏｃｕｌａｒｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｌｅａｋａｇｅ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ２０１７，９．
［４８］ＬｅｅＪＥ，ＫｉｍＣ，ＹａｎｇＨ，ＰａｒｋＩ，ＯｈＮ，ＨｕａＳ，ＪｅｏｎｇＨ，ＡｎＨＪ，ＫｉｍＳＣ，ＬｅｅＧＭ，ＫｏｈＧＹ，ＫｉｍＨＭ：ＮｏｖｅｌｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄＶＥＧＦｄｅｃｏｙｒｅｃｅｐｔｏｒｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＥＧＦ－Ｇｒａｂ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｔｕｍｏｒａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ２０１５，１４：４７０－９．
［４９］ＰａｒｋＭ，ＬｅｅＳＴ：Ｔｈｅｆｏｕｒｔｈｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｌｏｏｐｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｏｆＦＬＴ－１，ａＶＥＧＦｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｉｎｃｌｕｄｅｓａｍａｊｏｒｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９９９，２６４：７３０－４．
［５０］ＧｅｒｈａｒｄｔＨ，ＧｏｌｄｉｎｇＭ，ＦｒｕｔｔｉｇｅｒＭ，ＲｕｈｒｂｅｒｇＣ，ＬｕｎｄｋｖｉｓｔＡ，ＡｂｒａｍｓｓｏｎＡ，ＪｅｌｔｓｃｈＭ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＣ，ＡｌｉｔａｌｏＫ，ＳｈｉｍａＤ，ＢｅｔｓｈｏｌｔｚＣ：ＶＥＧＦｇｕｉｄｅｓａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｓｐｒｏｕｔｉｎｇｕｔｉｌｉｚｉｎｇｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｔｉｐｃｅｌｌｆｉｌｏｐｏｄｉａ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ２００３，１６１：１１６３－７７．
［５１］ＤｖｏｒａｋＨＦ，ＳｉｏｕｓｓａｔＴＭ，ＢｒｏｗｎＬＦ，ＢｅｒｓｅＢ，ＮａｇｙＪＡ，ＳｏｔｒｅｌＡ，ＭａｎｓｅａｕＥＪ，ＶａｎｄｅＷａｔｅｒＬ，ＳｅｎｇｅｒＤＲ：Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）ｉｎｔｕｍｏｒｓ：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｕｍｏｒｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ１９９１，１７４：１２７５－８．
［５２］ＰｌａｔｅＫＨ，ＢｒｅｉｅｒＧ，ＷｅｉｃｈＨＡ，ＲｉｓａｕＷ：Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｕｍｏｕｒａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｆａｃｔｏｒｉｎｈｕｍａｎｇｌｉｏｍａｓｉｎｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ１９９２，３５９：８４５－８．
［５３］ＱｕＨ，ＮａｇｙＪＡ，ＳｅｎｇｅｒＤＲ，ＤｖｏｒａｋＨＦ，ＤｖｏｒａｋＡＭ：Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）ｔｏｔｈｅａｂｌｕｍｉｎａｌｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｖｅｓｉｃｕｌｏｖａｃｕｏｌａｒｏｒｇａｎｅｌｌｅｓｏｆｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９５，４３：３８１－９．
［５４］ＹａｎｇＤ，ＳｉｎｇｈＡ，ＷｕＨ，Ｋｒｏｅ－ＢａｒｒｅｔｔＲ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｉｏｓｅｎｓｏｒｐｌａｔｆｏｒｍｓｉｎｔｈｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇｋｉｎｅｔｉｃｓ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２０１６，５０８：７８－９６．
［５５］ＹａｎｇＪ，ＷａｎｇＸ，ＦｕｈＧ，ＹｕＬ，ＷａｋｓｈｕｌｌＥ，ＫｈｏｓｒａｖｉａｎｉＭ，ＤａｙＥＳ，ＤｅｍｅｕｌｅＢ，ＬｉｕＪ，ＳｈｉｒｅＳＪ，ＦｅｒｒａｒａＮ，ＹａｄａｖＳ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｉｎｄｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｉｎｖｉｔｒｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｒｅｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａ．ＭｏｌＰｈａｒｍ２０１４，１１：３４２１－３０．
［５６］ＧｅｒｂｅｒＨＰ，ＷｕＸ，ＹｕＬ，ＷｅｉｓｓｍａｎＣ，ＬｉａｎｇＸＨ，ＬｅｅＣＶ，ＦｕｈＧ，ＯｌｓｓｏｎＣ，ＤａｍｉｃｏＬ，ＸｉｅＤ，ＭｅｎｇＹＧ，ＧｕｔｉｅｒｒｅｚＪ，ＣｏｒｐｕｚＲ，ＬｉＢ，ＨａｌｌＬ，ＲａｎｇｅｌｌＬ，ＦｅｒｒａｎｄｏＲ，ＬｏｗｍａｎＨ，ＰｅａｌｅＦ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＭｉｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｈｕｍａｎｉｚｅｄｆｏｒｍｏｆＶＥＧＦ－Ａｍａｙｐｒｏｖｉｄｅｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｓａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｎｔｉ－ＶＥＧＦａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００７，１０４：３４７８－８３．
［５７］ＢａｃｈｍａｎｎＭＦ，ＫａｌｉｎｋｅＵ，ＡｌｔｈａｇｅＡ，ＦｒｅｅｒＧ，ＢｕｒｋｈａｒｔＣ，ＲｏｏｓｔＨ，ＡｇｕｅｔＭ，ＨｅｎｇａｒｔｎｅｒＨ，ＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌＲＭ：Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄａｖｉｄｉｔｙｉｎａｎｔｉｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７，２７６：２０２４－７．
［５８］ＭｏｒｉｎＪ，ＬｕｕＴＭ，ＳｕｐｅｒｓｔｅｉｎＲ，ＯｓｐｉｎａＬＨ，ＬｅｆｅｂｖｒｅＦ，ＳｉｍａｒｄＭＮ，ＳｈａｈＶ，ＳｈａｈＰＳ，ＫｅｌｌｙＥＮ，ＣａｎａｄｉａｎＮｅｏｎａｔａｌＮ，ｔｈｅＣａｎａｄｉａｎＮｅｏｎａｔａｌＦｏｌｌｏｗ－ＵｐＮｅｔｗｏｒｋＩ：ＮｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＯｕｔｃｏｍｅｓＦｏｌｌｏｗｉｎｇＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂＩｎｊｅｃｔｉｏｎｓｆｏｒＲｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｏｆＰｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ２０１６，１３７．
［５９］ＳａｎｋａｒＭＪ，ＳａｎｋａｒＪ，ＣｈａｎｄｒａＰ：Ａｎｔｉ－ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｄｒｕｇｓｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ．ＣｏｃｈｒａｎｅＤａｔａｂａｓｅＳｙｓｔＲｅｖ２０１８，１：ＣＤ００９７３４．
［６０］ＢａｒｌｅｏｎＢ，ＴｏｔｚｋｅＦ，ＨｅｒｚｏｇＣ，ＢｌａｎｋｅＳ，ＫｒｅｍｍｅｒＥ，ＳｉｅｍｅｉｓｔｅｒＧ，ＭａｒｍｅＤ，Ｍａｒｔｉｎｙ－ＢａｒｏｎＧ：ＭａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅｓｉｔｅｓｆｏｒｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎａｔｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒＦＬＴ－１．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９７，２７２：１０３８２－８．
［６１］ＲｏｂｅｒｔｓＣＪ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１４，３２：３７２－８０．
［６２］ＲａｔａｎｊｉＫＤ，ＤｅｒｒｉｃｋＪＰ，ＤｅａｒｍａｎＲＪ，ＫｉｍｂｅｒＩ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ２０１４，１１：９９－１０９．
［６３］ＹｕＬ，ＷｕＸ，ＣｈｅｎｇＺ，ＬｅｅＣＶ，ＬｅｃｏｕｔｅｒＪ，ＣａｍｐａＣ，ＦｕｈＧ，ＬｏｗｍａｎＨ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂａｎｄＭｕｒｉｎｅＶＥＧＦ－Ａ：ＡＲｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２００８，４９：５２２－７．
［６４］ＸｉｎＨ，ＺｈｏｎｇＣ，ＮｕｄｌｅｍａｎＥ，ＦｅｒｒａｒａＮ：ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒＰｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＶＥＧＦ－Ａｘ．Ｃｅｌｌ２０１６，１６７：２７５－８４ｅ６．
［６５］ＬａｍｂｅｒｔＶ，ＬｅｃｏｍｔｅＪ，ＨａｎｓｅｎＳ，ＢｌａｃｈｅｒＳ，ＧｏｎｚａｌｅｚＭＬ，ＳｔｒｕｍａｎＩ，ＳｏｕｎｎｉＮＥ，ＲｏｚｅｔＥ，ｄｅＴｕｌｌｉｏＰ，ＦｏｉｄａｒｔＪＭ，ＲａｋｉｃＪＭ，ＮｏｅｌＡ：Ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｏｒｏｉｄａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｔｏｓｔｕｄｙａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ２０１３，８：２１９７－２１１．
［６６］ＳｍｉｔｈＬＥ，ＫｏｐｃｈｉｃｋＪＪ，ＣｈｅｎＷ，ＫｎａｐｐＪ，ＫｉｎｏｓｅＦ，ＤａｌｅｙＤ，ＦｏｌｅｙＥ，ＳｍｉｔｈＲＧ，ＳｃｈａｅｆｆｅｒＪＭ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｉｎｉｓｃｈｅｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９７，２７６：１７０６－９．
［６７］ＣｈｅｎＪ，ＣｏｎｎｏｒＫＭ，ＡｄｅｒｍａｎＣＭ，ＳｍｉｔｈＬＥ：Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｄｅｃｒｅａｓｅｓｖａｓｃｕｌａｒｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｍｉｃｅ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００８，１１８：５２６－３３．
［６８］ＧａｒｄｉｎｅｒＴＡ，ＧｉｂｓｏｎＤＳ，ｄｅＧｏｏｙｅｒＴＥ，ｄｅｌａＣｒｕｚＶＦ，ＭｃＤｏｎａｌｄＤＭ，ＳｔｉｔｔＡＷ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａｉｍｐｒｏｖｅｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｒｅｄｕｃｅｓｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ２００５，１６６：６３７－４４．
［６９］ＣｈｅｎＪ，ＣｏｎｎｏｒＫＭ，ＡｄｅｒｍａｎＣＭ，ＷｉｌｌｅｔｔＫＬ，ＡｓｐｅｇｒｅｎＯＰ，ＳｍｉｔｈＬＥ：ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｂｙｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓｉＲＮＡｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２００９，５０：１３２９－３５．
［７０］ＡｉｅｌｌｏＬＰ，ＰｉｅｒｃｅＥＡ，ＦｏｌｅｙＥＤ，ＴａｋａｇｉＨ，ＣｈｅｎＨ，ＲｉｄｄｌｅＬ，ＦｅｒｒａｒａＮ，ＫｉｎｇＧＬ，ＳｍｉｔｈＬＥ：Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｕｓｉｎｇｓｏｌｕｂｌｅＶＥＧＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ－Ｎａｔｌ－Ａｃａｄ－Ｓｃｉ－Ｕ－Ｓ－Ａ１９９５，９２：１０４５７－６１ｉｓｓｎ：００２７－８４２４．
［７１］ＳｍｉｔｈＬＥ，ＳｈｅｎＷ，ＰｅｒｒｕｚｚｉＣ，ＳｏｋｅｒＳ，ＫｉｎｏｓｅＦ，ＸｕＸ，ＲｏｂｉｎｓｏｎＧ，ＤｒｉｖｅｒＳ，ＢｉｓｃｈｏｆｆＪ，ＺｈａｎｇＢ，ＳｃｈａｅｆｆｅｒＪＭ，ＳｅｎｇｅｒＤＲ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｂｙｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１９９９，５：１３９０－５．
［７２］ＬａｎｇｅＣ，ＥｈｌｋｅｎＣ，ＭａｒｔｉｎＧ，ＫｏｎｚｏｋＫ，ＭｏｓｃｏｓｏＤｅｌＰｒａｄｏＪ，ＨａｎｓｅｎＬＬ，ＡｇｏｓｔｉｎｉＨＴ：Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅｐａｒｉｎａｎａｌｏｇ５－ａｍｉｎｏ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｒｅｄｕｃｅｓｒｅｔｉｎａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ．ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ２００７，８５：３２３－７．
［７３］ＸｉａｏＳ，ＢｕｃｈｅｒＦ，ＷｕＹ，ＲｏｋｅｍＡ，ＬｅｅＣＳ，ＭａｒｒａＫＶ，ＦａｌｌｏｎＲ，Ｄｉａｚ－ＡｇｕｉｌａｒＳ，ＡｇｕｉｌａｒＥ，ＦｒｉｅｄｌａｎｄｅｒＭ，ＬｅｅＡＹ：Ｆｕｌｌｙａｕｔｏｍａｔｅｄ，ｄｅｅｐｌｅａｒｎｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｉｍａｇｅｓ．ＪＣＩＩｎｓｉｇｈｔ２０１７，２．

Claims

必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する眼の障害を治療する方法であって、第１の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を前記対象に硝子体内投与することと、前記先の投与から１０～３０週間以内に第２の治療有効量の前記抗ＶＥＧＦ剤を前記対象に硝子体内投与することと、を含み、前記抗ＶＥＧＦ剤が、Ｆｃ－ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含み、前記ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含む、方法。
前記第２の治療有効量の前記抗ＶＥＧＦ剤が、前記先の投与から１６～２４週間以内に硝子体内投与される、請求項１に記載の方法。
前記治療有効量の前記抗ＶＥＧＦ剤の後続投与が、前記先の投与から１０～３０週間以内に、少なくとも１年間、硝子体内投与される、請求項１に記載の方法。
前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合能力を有する、請求項１に記載の方法。
前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖阻害能力を有する、請求項１に記載の方法。
前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れたＶＥＧＦ刺激有糸分裂誘発阻害能力を有する、請求項１に記載の方法。
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン１、２、および３（Ｖ_{１－２－３}）からなる、請求項１に記載の方法。
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２および３（Ｖ_２－３）からなる、請求項１に記載の方法。
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン１、２、３および３（Ｖ_{１－２－３－３}）からなる、請求項１に記載の方法。
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２、３および３（Ｖ_{２－３－３}）からなる、請求項１に記載の方法。
前記治療有効量の前記抗ＶＥＧＦ剤が、約１～１０ｍｇである、請求項１に記載の方法。
前記治療有効量の前記抗ＶＥＧＦ剤が、約３～６ｍｇである、請求項１に記載の方法。
前記ＶＥＧＦに関連する眼の障害が、新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼の腫瘍、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、およびポリープ状脈絡膜血管症を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
必要としている対象において眼内新生血管を促進する方法であって、第１の治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を前記対象に硝子体内投与することと、先の投与から１０～３０週間以内に第２の治療有効量の前記抗ＶＥＧＦ剤を前記対象に硝子体内投与することと、を含み、前記抗ＶＥＧＦ剤が、Ｆｃ－ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含み、前記ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含む、方法。
必要としている対象においてＶＥＧＦに関連する眼の障害を治療する際に使用するための薬学的組成物であって、前記抗ＶＥＧＦ剤が、請求項１～１３のいずれか一項に定義される通りである、薬学的組成物。