JP2023116709A

JP2023116709A - 眼疾患のための遺伝子療法

Info

Publication number: JP2023116709A
Application number: JP2023098376A
Authority: JP
Inventors: ベネット，ジャン; Bennett Jean; サン，ジャンウェイ; Junwei Sun; ベニセリ，ジャネット; Bennicelli Jeannette
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2023-08-22
Also published as: WO2018232149A1; EP3638316A1; EP3638316A4; US11827898B2; JP2020527335A; US20200172929A1

Abstract

【課題】被験者における眼疾患の処置のための組成物及び方法を提供する。【解決手段】１つの側面において、ＣＮＧＡ３をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ関連ウイルスベクターを提供する。別の側面において、ＣＮＧＢ３をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ関連ウイルスベクターを提供する。別の側面において、ＲＥＰ－１をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ関連ウイルスベクターを提供する。望ましい態様において、被験者は、ヒト、ネコ、イヌ、ヒツジ又は非－ヒト霊長類である。【選択図】なし

Description

被験者における眼疾患の処置のための組成物及び方法を提供する。１つの側面において、ＣＮＧＡ３をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ関連ウイルスベクターを提供する。別の側面において、ＣＮＧＢ３をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ関連ウイルスベクターを提供する。別の側面において、ＲＥＰ－１をコードする配列を含む核酸分子を含むアデノ関連ウイルスベクターを提供する。望ましい態様において、被験者はヒト、ネコ、イヌ、ヒツジ又は非－ヒト霊長類である。

電子形態で提出された材料の文献援用
出願人は、電子形態で添付して申請される配列表材料を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。このファイルは“１７－８３１８ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と標識される。

発明の背景
コロイデレミア（ＣＨＭ）は、Ｘ－連鎖遺伝性網膜疾患であり、光受容体、網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び脈絡毛細管板の変性を特徴とする。症状は夜間視覚の悪さ（夜盲症）及び周辺視覚の進行的な喪失の病訴を以て生後１０歳未満又は２０歳未満に現れる。疾患の進行とともに視野は狭まる。これは、早い場合には３０歳代に、中心視覚（視力）の喪失及び失明を以て最高点に達する。１４０種類を超えるＣＨＭ遺伝子中の突然変異がコロイデレミアを引き起こすことが見出された。突然変異は異常に小さい、非機能性及び／又は不安定なＲａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）タンパク質の産生、タンパク質の機能における低下又はＲＥＰ－１タンパク質産生の喪失を生ずる場合がある。正常なＲＥＰ－１の欠如は、細胞内トラフィッキングを助けるＲａｂタンパク質の能力を崩壊させる。細胞内におけるタンパク質及び細胞小器官の移動不全は細胞の機能を衰えさせ、かつ早死にをもたらす。

コロイデレミア遺伝子のＣＨＭは、膜トラフィッキングの調節に含まれるアミノ酸６５３個のタンパク質であるＲａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）をコードする。ＣＨＭ遺伝子座はＸ－染色体上にあるので、コロイデレミアは典型的に男性においてのみ診断される。疾患の女性保因者は通常無症候性であるが、網膜検査は多くの場合に網膜及びＲＰＥのまだらな変性を明らかにし、かつ女性被験者は正常なＸ染色体のＸ－不活性化（ライオニゼイション）の程度に応じて発症する場合がある。引用により本明細書に取り込まれる引用により本明細書に取り込まれる非特許文献１。引用により本明細書に取り込まれる非特許文献２も参照されたい。

色覚異常は常染色体劣性遺伝性網膜疾患のヘテロ接合グループ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｇｒｏｕｐ）であり、初期に発症する視力低下、不完全又は完全な色覚の異常、眼振、光回避（ｐｈｏｔｏａｖｅｒｓｉｏｎ）及び錐体光受容体機能の喪失により特徴付けられる。色覚異常被験者の約８０％は錐体光受容体のｃＧＭＰ調節カチオンチャンネル環状ヌクレオチド－感受性チャンネル（ＣＮＧ）のアルファ又はベータサブユニット（Ａ３及びＢ３）における突然変異を示す。ヒトの疾患に相同性があるＣｎｇａ３欠損マウスは罹患した錐体光受容体の機能不全及び変性に導く錐体特異的な機能の喪失を明らかにする。

従って、ヒトの被験者におけるＲＥＰ－１，ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３の発現に有用な組成物が必要である。

Ｃｏｕｓｓａ，ＲＧ，Ｔｒａｂｏｕｌｓｉ，ＥＩ（２０１２）Ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｇｅｎｅｒａｌｆｉｎｄｉｎｇｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＯｐｈｔｈａｌｍｉｃＧｅｎｅｔ３３（２）：５７－６５Ｖａｓｉｒｅｄｄｙら、ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｉｎｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄｍｏｄｅｌｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１３Ｍａｙ７；８（５）：ｅ６１３９６

発明の概略
コロイデレミア（ＣＨＭ）はＸ－連鎖網膜変性であり、それは生後１０歳未満又は２０歳未満に夜盲症及び周辺視覚の喪失を引き起こして発症する。疾患は中年期を通じて進行し、その頃にほとんどの被験者は失明する。ＣＨＭは遺伝子増強療法（ｇｅｎｅａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙ）のための好ましい標的であり、それは疾患が網膜細胞の健康に必要なタンパク質、ＣＨＭ遺伝子によりコードされるＲａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）の機能の喪失の故だからである。ヒトの遺伝子療法研究において確立された実績を有する組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）中にＣＨＭｃＤＮＡをパッケージングする場合がある。さらに、Ｒａｂ２７のようなＲａｂタンパク質をプレニル化し、ＲＥＰ－１欠損細胞中のプレニル化の欠如の故のＲａｂ２７局在化及びトラフィッキングにおける欠陥を修正するＲＥＰ１の能力を含むその活性を実証（ｄｏｃｕｍｅｎｔ）するための高感度かつ定量的なアッセイがある。

１つの側面において、Ｒａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列を提供する。１つの態様において、コドン最適化ｃＤＮＡ配列は配列番号３の変異体である。別の態様において、コドン最適化ｃＤＮＡ配列は配列番号１である。別の態様において、ｃＤＮＡ配列はヒトにおける発現のためにコドン最適化される。

別の態様において、発現カセットはＲＥＰ－１をコードするコドン最適化核酸配列を含む。１つの態様において、発現カセットは配列番号１のｃＤＮＡ配列を含む。さらに別の態様において、ＲＥＰ－１コード配列は、５’及び３’ＡＡＶＩＴＲ配列の間に位置する。１つの態様において、ベクターゲノムは５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの間の及びそれらを含む核酸配列のすべてを含む。

別の態様において、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＡＡＶベクターはＡＡＶキャプシド及びＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸配列及びヒトＲａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）をコードする核酸配列及び宿主細胞におけるＲＥＰ－１の発現を方向付ける発現調節配列を含む。１つの態様において、ＲＥＰ－１配列は全長ＲＥＰ－１タンパク質をコードする。１つの態様において、ＲＥＰ－１配列は配列番号２のタンパク質配列である。

１つの側面において、環状ヌクレオチド感受性チャンネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列を提供する。１つの態様において、コドン最適化ｃＤＮＡ配列は配列番号１３又は配列番号１５の変異配列である。別の態様において、コドン最適化ｃＤＮＡ配列は配列番号９又は配列番号１１である。別の態様において、ｃＤＮＡ配列はヒトにおける発現のためにコドン最適化される。

別の側面において、ＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列が提供される。１つの態様において、コドン最適化ｃＤＮＡ配列は配列番号１９又は２１又は２３の変異体である。別の態様において、コドン最適化ｃＤＮＡ配列は配列番号４５である。別の態様において、ｃＤＮＡ配列はヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。

別の側面において、発現カセットは環状ヌクレオチド感受性チャンネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）をコードするコドン最適化核酸配列を含む。１つの態様において、発現カセットは配列番号９、配列番号１１、配列番号１３又は配列番号１５のｃＤＮＡ配列を含む。さらに別の態様において、ＣＮＧＡ３コード配列は５’及び３’ＡＡＶＩＴＲ配列の間に位置する。

別の側面において、発現カセットは環状ヌクレオチド感受性チャンネルベータ３（ＣＮＧＢ３）をコードするコドン最適化核酸配列を含む。１つの態様において、発現カセットは配列番号１９又は配列番号２１又は配列番号２３又は配列番号４５のｃＤＮＡ配列を含む。さらに別の態様において、ＣＮＧＢ３コード配列は５’及び３’ＡＡＶＩＴＲ配列の間に位置する。

別の態様において、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＡＡＶベクターはＡＡＶキャプシド及びＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸配列及びヒトＣＮＧＡ３をコードする核酸配列及び宿主細胞におけるＣＮＧＡ３の発現を方向付ける発現調節配列を含む。１つの態様において、ＣＮＧＡ３配列は全長ＣＮＧＡ３タンパク質をコードする。１つの態様において、ＣＮＧＡ３配列は配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４のタンパク質配列である。

別の態様において、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＡＡＶベクターはＡＡＶキャプシド及びＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸配列及びヒトＣＮＧＢ３をコードする核酸配列及び宿主細胞におけるＣＮＧＢ３の発現を方向付ける発現調節配列を含む。１つの態様において、ＣＮＧＢ３配列は全長ＣＮＧＢ３タンパク質をコードする。１つの態様において、ＣＮＧＢ３配列は配列番号２０のタンパク質配列である。

別の側面において、ＡＡＶ８キャプシド及び発現カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで該発現カセットはＲＥＰ－１をコードする核酸配列と、逆位末端反復配列と、宿主細胞におけるＲＥＰ－１の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。１つの態様において、発現調節配列はニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターをサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと一緒に含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号１を含む。

さらに別の側面において、ＡＡＶ８キャプシド及び発現カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで該発現カセットはＣＮＧＡ３をコードする核酸配列と、逆位末端反復配列と、宿主細胞におけるＣＮＧＡ３の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。１つの態様において、発現調節配列はロドプシンキナーゼプロモーターを含む。１つの態様において、発現調節配列はヒト錐体アレスチンプロモーターを含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号９を含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号１１を含む。

さらに別の側面において、ＡＡＶ８キャプシド及び発現カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで該発現カセットはＣＮＧＢ３をコードする核酸配列と、逆位末端反復配列と、宿主細胞におけるＣＮＧＢ３の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。

別の側面において、ＡＡＶ２キャプシド及び発現カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで該発現カセットはＲＥＰ－１をコードする核酸配列と、逆位末端反復配列と、宿主細胞におけるＲＥＰ－１の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。１つの態様において、発現調節配列はＣＢＡプロモーターをＣＭＶエンハンサーと一緒に含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号１を含む。

別の側面において、ＡＡＶ２キャプシド及び発現カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで該発現カセットはＣＮＧＡ３をコードする核酸配列と、逆位末端反復配列と、宿主細胞におけるＣＮＧＡ３の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。１つの態様において、発現調節配列はロドプシンキナーゼプロモーターを含む。１つの態様において、発現調節配列はヒト錐体アレスチンプロモーターを含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号９を含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号１１を含む。

さらに別の側面において、ＡＡＶ２キャプシド及び発現カセットを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで該発現カセットはＣＮＧＢ３をコードする核酸配列と、逆位末端反復配列と、宿主細胞におけるＣＮＧＢ３の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。

さらに別の側面において、ＡＡＶ９キャプシド並びに発現カセットを含み、前記発現カセットがＣＮＧＡ３をコードする核酸配列、逆位末端反復配列及び宿主細胞におけるＣＮＧＡ３の発現を方向付ける発現調節配列を含む、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。１つの態様において、発現調節配列はロドプシンキナーゼプロモーターを含む。１つの態様において、発現調節配列はヒト錐体アレスチンプロモーターを含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号９を含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号１１を含む。

さらに別の側面において、ＡＡＶ９キャプシド並びに発現カセットを含み、前記発現カセットがＣＮＧＢ３をコードする核酸配列、逆位末端反復配列及び宿主細胞におけるＣＮＧＢ３の発現を方向付ける発現調節配列を含む、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。

別の側面において、ＡＡＶ９キャプシド並びに発現カセットを含み、前記発現カセットがＲＥＰ－１をコードする核酸配列、逆位末端反復配列及び宿主細胞におけるＲＥＰ－１の発現を方向付ける発現調節配列を含む、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。１つの態様において、発現調節配列はＣＢＡプロモーターをＣＭＶエンハンサーと一緒に含む。１つの態様において、核酸配列は配列番号１を含む。

別の側面において、製薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤と、本明細書に説明される少なくとも１つのウイルスベクターとを含む製薬学的組成物を提供する。

さらなる側面において、製薬学的組成物は製薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤と、核酸配列、プラスミド、ベクター又は本明細書に特定的に説明されるｒＡＡＶのようなウイルスベクターとを含む。

別の側面において、コロイデレミアの処置方法を提供する。１つの態様において、該方法は本明細書に説明されるＲＥＰ－１をコードするＡＡＶベクターを含む組成物を必要とする被験者に投与することを含む。

別の側面において、色覚異常の処置方法を提供する。１つの態様において、該方法は本明細書に説明されるＣＮＧＡ３をコードするＡＡＶベクターを含む組成物を必要とする被験者に投与することを含む。

別の側面において、色覚異常の処置方法を提供する。１つの態様において、該方法は本明細書に説明されるＣＮＧＢ３をコードするＡＡＶベクターを含む組成物を必要とする被験者に投与することを含む。

さらに別の側面において、ＡＡＶベクターの作製のためのプラスミドを提供する。１つの態様において、該プラスミドは本明細書に説明されるＲＥＰ－１をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含む。別の態様において、前記プラスミドは本明細書に説明されるＣＮＧＡ３をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含む。別の態様において、前記プラスミドはＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含み、それは配列番号１９又は配列番号２１と少なくとも７０％の同一性を共有する配列である。さらに別の態様では、プラスミドは本明細書に説明されるＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含む。１つの態様において、前記プラスミドはモジュール的（ｍｏｄｕｌａｒ）である。

別の側面において、ｒＡＡＶウイルスの作製方法を提供する。該方法は、感染性ＡＡＶエンベロープ又はキャプシド中に遺伝子発現カセットウイルスゲノムをパッケージングすることを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下で本明細書に説明されるプラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することを含む。別の側面において、前記方法に従って作製される組換えＡＡＶを提供する。

本発明の他の側面及び利点は以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。

図１Ａ及び図１Ｂは、培養された８４－３１ＨＥＫ細胞のトランスフェクション後の試験管内ＲＥＰ－１タンパク質発現を示すゲルである。各ゲルの第１レーンはプラスミドｐ９４４から発現した本明細書に説明されるコドン最適化ＲＥＰ－１の発現を示す。第２レーンはプラスミドｐ７４２からの天然のＲＥＰ－１の発現を示す。第３のレーンは、プラスミドでトランスフェクションされなかった８４－３１細胞によるＲＥＰ－１の内在性発現を示す。最後のレーンはブランクである。ゲルは、本明細書に説明されるコドン最適化ＲＥＰ－１配列が天然のＲＥＰ－１配列より高いレベルのタンパク質発現を生ずることならびに外部からトランスフェクションされたプラスミドからの発現のレベルが内在性ＲＥＰ－１発現より何倍も高いことを示す。図２Ａから図２Ｆは、配列番号１の天然のＲＥＰ－１コード配列対配列番号３のコドン最適化ＲＥＰ－１コード配列のアラインメントである。図３Ａから図３Ｆは、配列番号１３の天然のＣＮＧＡ３コード配列対配列番号９のコドン最適化ＣＮＧＡ３コード配列のアラインメントである。図４Ａから図４Ｆは、ＣＮＧＢ３天然ＯＲＦ（配列番号１９）対ＣＮＧＢ３改変ＯＲＦ（配列番号２１）対改変された末端を有するＣＮＧＢ３改変ｏｒｆ（配列番号２３）のアラインメントである。点突然変異が強調されている。図５は、本明細書に説明されるｐ５８４のプラスミドマップである。ｐ５８４の配列は配列番号７に示される。図６は、本明細書に説明されるＡＡＶ．ｈＣＨＭｃｏ．バージョン２ａのプラスミドマップである。バージョン２ａの配列は配列番号２５に示される。図７は、本明細書に説明されるＡＡＶ．ｈＣＨＭｃｏ．バージョン２ｂのプラスミドマップである。バージョン２ｂの配列は配列番号２６に示される。図８は、本明細書に説明されるＡＡＶ．ｈＣＨＭｃｏ．バージョン３ａのプラスミドマップである。バージョン３ａの配列は配列番号２７に示される。図９は、本明細書に説明されるＡＡＶ．ｈＣＨＭｃｏ．バージョン３ｂのプラスミドマップである。バージョン３ｂの配列は配列番号２８に示される。図１０は、本明細書に説明されるＡＡＶ．ｈＣＨＭ．バージョン１のプラスミドマップである。バージョン１の配列は配列番号２９に示される。図１１は、ＡＡＶ産物不純物へのラムダインサートの効果のグラフである。ｑＰＣＲ試験から、すべてのａ－バージョン（ラムダ含有）ベクターはずっと減少したＫａｎ＋シグナルを有する。図１２Ａは、ＡＡＶ８．２ｂを５×１０⁹（５Ｅ９）（高用量）個のベクターゲノムコピーにおいて注入されたＣＤ－１マウスの眼組織における～７５－８０ｋＤａのタンパク質のヒト抗ＲＥＰ－１抗体検出を示すウェスタンブロットである。５×１０⁸個（低用量）においてＡＡＶ８．２ｂを注入された動物は～７５－８０ｋＤａにおいて非常に弱いタンパク質バンドを示した。図１２Ｂは、抗ＲＥＰ－１抗体を用いて検出されたＡＡＶ８．３ｂ注入ＣＤ１マウス（グループ当たり２匹のマウス）の眼組織のウェスタンブロット分析であり、それは低用量で注入された１個の眼及び高用量のＡＡＶ８．３ｂを注入された両眼における～７５－８０ｋＤａのタンパク質の存在を明らかにした。注入されなかったマウスの眼組織において、ＲＥＰ－１発現は検出されなかった。図１３Ａ及び図１３Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＲＫ１－天然ＣＮＧＡ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３０に示される。図１４Ａ及び図１４Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＲＫ１－コドン最適化ＣＮＧＡ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３１に示される。図１５Ａ及び図１５Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＲＫ１－コドン最適化ＣＮＧＡ３変異体３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３２に示される。図１６Ａ及び図１６Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－天然ＣＮＧＡ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３３に示される。図１７Ａ及び図１７Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－コドン最適化ＣＮＧＡ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３４に示される。図１８Ａ及び図１８Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－コドン最適化ＣＮＧＡ３変異体３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３５に示される。図１９Ａ及び図１９Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＣＢＡ－天然ＣＮＧＡ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３６に示される。図２０Ａ及び図２０Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＣＢＡ－コドン最適化ＣＮＧＡ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３７に示される。図２１Ａ及び図２１Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＣＢＡ－コドン最適化ＣＮＧＡ３変異体３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３８に示される。図２２Ａ及び図２２Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＲＫ１－天然ＣＮＧＢ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号３９に示される。図２３Ａ及び図２３Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＲＫ１－コドン最適化ＣＮＧＢ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号４０に示される。図２４Ａ及び図２４Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－天然ＣＮＧＢ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号４１に示される。図２５Ａ及び図２５Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－コドン最適化ＣＮＧＢ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号４２に示される。図２６Ａ及び図２６Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＣＢＡ－天然ＣＮＧＢ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号４３に示される。図２７Ａ及び図２７Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＣＢＡ－コドン最適化ＣＮＧＢ３のプラスミドマップを提供する。配列は配列番号４４に示される。図２８は、記載されるベクターを形質導入された８４－３１細胞でのｈＣＮＧＡ３タンパク質発現を示すウェスタンブロットである。形質導入の４８時間後、タンパク質を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）しウェスタンブロッティングを実施した。天然及びコドン最適化（ｈｏｐｔ）タンパク質は７９ｋＤａであると予想され、Ｖ３－ｈｏｐｔは８５ｋＤａであると予想される。図２９は、記載されるベクターを形質導入された８４－３１細胞でのｈＣＮＧＡ３タンパク質発現を示すウェスタンブロットである。形質導入の４８時間後、タンパク質を回収しウェスタンブロッティングを実施した。天然及びコドン最適化（ｈｏｐｔ）タンパク質は７９ｋＤａであると予想され、Ｖ３－ｈｏｐｔは８５ｋＤａであると予想される。図３０は、３つの記載されるベクターについてＲＴ－ＰＣＲにより測定されるベクター／プラスミド発現を示す３つの棒グラフである。図３１は、実施例８に説明される、記載されるベクターで処置されたＣＮＧＡ３ヌルマウスについての錐体ＥＲＧの結果を示す棒グラフである。すべての群でｎ＞５、エラーバーは標準偏差を表す。図３２Ａ及び図３２Ｂは、非形質導入（図３２Ａ）及び形質導入（図３２Ｂ）細胞の蛍光強度を示す２つの折れ線グラフである。これらの結果は、ｃＧＭＰ添加後の形質導入対非形質導入８４－３１細胞におけるカルシウム取込みを示している。各系列は、一細胞である。図３３は、実施例９に説明される、記載されるベクターで処置されたＣＮＧＢ３ヌルマウスについての錐体ＥＲＧの結果を示す棒グラフである。図３４は、ＡＡＶ産物不純物に対するラムダインサートの効果のグラフである。図３５は、指示されたｒＡＡＶを、眼当たり５Ｅ７ベクターゲノムコピーにおいて注入されたＣＤ－１マウスの眼組織における約７５～８０ｋＤａのタンパク質のヒト抗ＲＥＰ－１抗体検出を示すウェスタンブロットである。Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ動物１、２及び３を示す。図３６は、指示されたｒＡＡＶを、眼あたり１Ｅ８ベクターゲノムコピーにおいて注入されたＣＤ－１マウスの眼組織における約７５～８０ｋＤａのタンパク質のヒト抗ＲＥＰ－１抗体検出を示すウェスタンブロットである。Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ動物１、２及び３を示す。図３７は、指示されたｒＡＡＶを、眼あたり５Ｅ８ベクターゲノムコピーにおいて注入されたＣＤ－１マウスの眼組織における約７５～８０ｋＤａのタンパク質のヒト抗ＲＥＰ－１抗体検出を示すウェスタンブロットである。Ａ１及びＡ２はそれぞれ動物１及び２を示す。図３８は、指示されたｒＡＡＶを、眼あたり５Ｅ９ベクターゲノムコピーにおいて注入されたＣＤ－１マウスの眼組織における約７５～８０ｋＤａのタンパク質のヒト抗ＲＥＰ－１抗体検出を示すウェスタンブロットである。Ａ１及びＡ２はそれぞれ動物１及び２を示す。図３９Ａ及び図３９Ｂは、指示されたｒＡＡＶを、眼あたり５Ｅ９ベクターゲノムコピー（図３９Ａ）又は眼あたり１Ｅ１０ベクターゲノムコピー（図３９Ｂ）において注入されたＣＤ－１マウスの眼組織における約７５～８０ｋＤａのタンパク質のヒト抗ＲＥＰ－１抗体検出を示すウェスタンブロットである。Ａ３、Ａ４、Ａ５、及びＡ６はそれぞれ動物３、４、５、及び６を示す。図４０は、ＰＢＷＴ３．１細胞又はＢＭＣ１細胞における種々の投与量でのＡＡＶ８．ＣＭＶ／ＣｂＡ－ＧＦＰ（物質（ａｒｔｉｃｌｅ）６と示される）及びＡＡＶ２．ＣＭＶ／ＣｂＡ－ＧＦＰ（物質５と示される）の形質導入効率のグラフである。バックグラウンドよりも上のＧＦＰの倍変化はｙ軸にプロットし、単位ベクターゲノムコピーの投与量はｘ軸上に示した。図４１は、図４４で説明される細胞中でのカスパーゼ３陽性細胞のパーセントを示す棒グラフを提供する。Ｓｔａｕｒｏはスタウロスポリン処置細胞を示し、ＵＮＴは非処置細胞である。物質１はＡＡＶ２．Ｖ２ａであり；物質２はＡＡＶ８．Ｖ３ａであり；物質３はＡＡＶ８．Ｖ１である。図４２は、ＡＡＶ８．Ｖ２ａ、ＡＡＶ８．Ｖ３ａ及びＡＡＶ８．Ｖ１での形質導入後のＣＨＭ患者由来ｉＰＳＣにおける標的ＲＡＢタンパク質のプレニル化を示す棒グラフを提供する。ＣＨＭ患者由来ｉＰＳＣ細胞株ＪＢ５８８は、Ａｒｇ５５５停止（ＡＧＡからＴＧＡへ）のＣＨＭ突然変異を示している。ＣＨＭ患者由来ｉＰＳＣ細胞株ＪＢ５２７は、ＣＨＭのＥｘ２～４の欠失を示している。ＣＨＭ患者由来ｉＰＳＣ細胞株ＪＢ４１５は、Ｅｘ１０ｃ．１３２７～１３２８ｄｅｌＡＴのＣＨＭ突然変異を示している。左パネルでは、非形質導入ｉＰＳＣ細胞に正規化された組み込まれた³ＨＧＧＰＰはｙ軸にプロットした。右パネルでは、組み込まれた³ＨＧＧＰＰのｐｍｏｌでの量はｙ軸にプロットした。図４３Ａは、実施例１６において説明される試験物質についての注入５～７週間後の錐体応答の結果を示している。ＷＴ＝野生型、Ｕｎ＝非注入のＣｎｇａ３ヌルマウス、Ｅｘ＝賦形剤を注入されたＣｎｇａ３ヌルマウス；ＯＰＴ＝コドン最適化、ＮＡＴ＝天然の、Ｖ３＝変異体３；ＮＡ＝該当なし、Ｌ＝低用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）、Ｈ＝高用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）；エラーバー＝標準偏差、閾値＝賦形剤平均よりも上の４標準偏差、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。図４３Ｂは、実施例１６において説明される試験物質についての注入５～７週間後の杆体応答の結果を示している。ＷＴ＝野生型、Ｕｎ＝非注入のＣｎｇａ３ヌルマウス、Ｅｘ＝賦形剤を注入されたＣｎｇａ３ヌルマウス；ＯＰＴ＝コドン最適化、ＮＡＴ＝天然の、Ｖ３＝変異体３；ＮＡ＝該当なし、Ｌ＝低用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）、Ｈ＝高用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）；エラーバー＝標準偏差、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。図４４Ａは、実施例１６において説明される試験物質についての注入１２～１５週間後の錐体応答の結果を示している。ＷＴ＝野生型、Ｕｎ＝非注入のＣｎｇａ３ヌルマウス、Ｅｘ＝賦形剤を注入されたＣｎｇａ３ヌルマウス；ＯＰＴ＝コドン最適化、ＮＡＴ＝天然の、Ｖ３＝変異体３；ＮＡ＝該当なし、Ｌ＝低用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）、Ｈ＝高用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）；エラーバー＝標準偏差、閾値＝賦形剤平均よりも上の４標準偏差、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。図４４Ｂは、実施例１６において説明される試験物質についての注入１２～１５週間後の杆体応答の結果を示している。ＷＴ＝野生型、Ｕｎ＝非注入のＣｎｇａ３ヌルマウス、Ｅｘ＝賦形剤を注入されたＣｎｇａ３ヌルマウス；ＯＰＴ＝コドン最適化、ＮＡＴ＝天然の、Ｖ３＝変異体３；ＮＡ＝該当なし、Ｌ＝低用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）、Ｈ＝高用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）；エラーバー＝標準偏差、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。図４５Ａ及び図４５Ｂは、本明細書に説明されるｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－天然－ＣＮＧＡ３－ＷＰＲＥ（ｐ１１２２）のプラスミドマップを提供する。ｐＡＡＶ－ｈＣＡＲ－天然－ＣＮＧＡ３－ＷＰＲＥ（ｐ１１２２）の配列は配列番号４６に示されている。

発明の詳細な説明
本明細書に説明される方法及び組成物は、眼疾患、主にコロイデレミアのような失明疾患の処置のために哺乳類被験者にＲＥＰ－１をコードする最適化ＣＨＭを送達するための組成物及び方法を含む。さらに、本明細書に説明される方法及び組成物は、眼疾患、主に色覚異常のような失明疾患の処置のために哺乳類被験者に最適化ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３を送達するための組成物及び方法を含む。１つの態様において、そのような組成物はＲ
ＥＰ－１、ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３コード配列のコドン最適化を含む。これらの特徴は産物の有効性を向上させ、より低用量の試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）が用いられるので安全性を向上させると思われる。この導入遺伝子カセットの最適化は、内在性配列を用いて産生され得るレベルと比較して実験的タンパク質の産生のレベルを理論的に最大にする場合があると思われる。しかしながら、それぞれ配列番号３、配列番号１３及び配列番号１９に示されるような天然のＲＥＰ１、ＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３コード配列を含む組成物も本明細書に含まれる。ＲＥＰ－１、ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３のいずれかに関して態様が説明される場合、類似の態様が他に引用されることが意図されていることが理解されるべきである。

本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の熟練者により、及び出版された本への参照により通常理解されると同じ意味を有し、出版された本は本出願中で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当該技術分野における熟練者に与える。本明細書中に含有される定義は、本明細書中の成分及び組成物の説明において明白性のために与えられ、特許請求される本発明を制限することを意図していない。

コロイデレミア遺伝子、ＣＨＭは膜トラフィッキングに含まれると考えられる６５３個のアミノ酸のタンパク質であるＲａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）をコードする。本明細書で用いられる場合、「ＲＥＰ－１」及び「ＣＨＭ」という用語は、コード配列を指す場合には互換的に用いられる。ＣＨＭ遺伝子座はＸ－染色体上にあるので、コロイデレミアは典型的に男性のみにおいて診断される。疾患の女性保因者は通常無症候性であるが、網膜検査は多くの場合に網膜及びＲＰＥのまだらな変性を明らかにし、かつ女性被験者は正常なＸ染色体のＸ－不活性化（ライオニゼイション）の程度に応じて冒され得る。上記で引用されたＣｏｕｓｓａを参照されたい。ヒトＲＥＰ－１をコードする天然のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｐ２４３８６において報告され、本明細書において配列番号２で再現される。ＣＨＭの天然のヒト核酸配列は本明細書において配列番号３で再現される（受け入れ番号ＮＭ＿０００３９０．２）。

環状ヌクレオチド－感受性（ＣＮＧ）イオンチャンネルは、網膜及び嗅覚受容体におけるシグナル伝達の基礎となる重要媒介物である。錐体ＣＮＧチャンネルの２つの構造的に関連するサブユニットをコードするＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３における遺伝子的欠陥は色覚異常を生ずることが知られている。ＣＮＧＡ３は６９４アミノ酸タンパク質である。ＣＮＧＢは８０９アミノ酸タンパク質である。

色覚異常は先天性常染色体劣性網膜疾患のヘテロ接合グループであり、それは初期発症錐体光受容体機能障害、重度に低下した視力、損なわれた又は完全な色覚異常及び羞明により顕症する。ヒトＣＮＧＡ３をコードする天然の核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＭ＿０１１２１０５５４．１に報告されており、配列番号１３に再現されている。ヒトＣＮＧＡ３をコードする天然の核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＭ＿０１１２１０５５４．１に報告されており、配列番号１３に再現されている。追加のエキソンを含むヒトＣＮＧＡ３Ｘ１変異体に関する天然の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００１２９８．２に報告されており、配列番号１５に再現されている。ヒトＣＮＧＢ３をコードする天然の核酸配列は配列番号１９に再現されている。

本発明の一部の態様において、被験者は「眼疾患」を有し、本発明の成分、組成物及び方法はそれの処置のために設計される。本明細書で用いられる場合、「被験者」という用語はヒト、獣医学的又は農場動物、家畜又はペット及び臨床研究のために通常用いられる動物を含む哺乳類動物を意味する。１つの態様において、これらの方法及び組成物の被験者はヒトである。さらに別の適切な被験者にはネズミ、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ
、ヒツジ、非－ヒト霊長類及び他が含まれるがこれらに限られない。本明細書で用いられる場合、「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」と互換的に用いられる。

本明細書で用いられる場合、「眼疾患」にはスターガルト病（常染色体優性又は常染色体劣性）、網膜色素変性症及びパターンジストロフィーを含むがこれらに限られないコーンロッドジストロフィー（ｃｏｎｅ－ｒｏｄｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）及び網膜疾患が含まれる。１つの態様において、被験者は色覚異常を有する。他の態様において、被験者はコロイデレミア又はＸ－連鎖遺伝性網膜変性を有する。そのような眼疾患の臨床的徴候は、周辺視覚の低下、中心（読書（ｒｅａｄｉｎｇ））視覚の低下、夜間視覚の低下、色覚の喪失、視力の低下、光受容体機能の低下、色素変化（ｐｉｇｍｅｎｔａｒｙｃｈａｎｇｅｓ）及び究極的に失明を含むがこれらに限られない。

本明細書で用いられる場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、眼疾患の１つ又はそれより多くの症状の改善の目的で本明細書に説明される１種もしくはそれより多い化合物又は組成物を被験者に投与することを含んで定義される。かくして「処置」は、与えられる被験者における眼疾患の発症又は進行の軽減、疾患の予防、疾患の症状の重度の軽減又は失明の進行を含むそれらの進行の遅延、疾患の症状の除去、疾患の発症の遅延又は疾患の進行若しくは治療の有効性の監視の１つ又はそれより多くを含む場合がある。

核酸配列又はタンパク質を説明するために用いられる場合、「外来性」という用語は、核酸又はタンパク質が染色体又は宿主細胞中でそれが存在している位置に自然には存在しないことを意味する。外来性核酸配列は、同じ宿主細胞又は被験者に由来し、その中に挿入されるが、非－自然の状態、例えば異なるコピー数で又は異なる調節要素の調節下で存在する配列も指す。

核酸配列又はタンパク質を説明するために用いられる場合、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、核酸又はタンパク質が、それが発現される宿主細胞又は被験者と異なる生物か、同じ生物の異なる種かに由来することを意味する。プラスミド、発現カセット又はベクター中のタンパク質又は核酸に言及して用いられる場合、「異種」という用語は、タンパク質又は核酸が、問題のタンパク質又は核酸が自然には互いに同じ関係で一緒に見出されない、別の配列又はサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）と一緒に存在することを示す。

核酸配列の状況下における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」又は「パーセント同一の」という用語は、対応させるために整列させた時に同じである２つの配列中の塩基を指す。パーセント同一性は、比較されるべき配列にわたって（ｏｖｅｒ）最適条件下で並べられた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性比較の長さはＲＥＰ－１、ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３コード配列の全長又は少なくとも約１００～１５０個のヌクレオチドのフラグメントにわたるか、又は所望通りの場合がある。しかしながら、例えば少なくとも約９個のヌクレオチド、通常少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個か又はそれより多くのヌクレオチドのより小さいフラグメント間の同一性が望ましい場合もある。核酸配列に関して複数の配列アラインメントプログラムも入手可能である。そのようなプログラムの例には“ＣｌｕｓｔａｌＷ”、“ＣＡＰＳｅｑｕｅｎｃｅＡｓｓｅｍｂｌｙ”、“ＢＬＡＳＴ”、“ＭＡＰ”及び“ＭＥＭＥ”が含まれ、それらはインターネット上のウェブサーバーを介して利用可能である。そのようなプログラムに関する他の供給源は当該技術分野における熟練者に既知である。あるいはまた、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩユーティリティーも用いられる。上記のプログラム中に含まれるものを含
んで、ヌクレオチド配列同一性の測定に用いられ得る当該技術分野において既知の複数のアルゴリズムもある。別の例として、ＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムであるＦａｓｔａ^TMを用いてポリヌクレオチド配列を比較することができる。通常入手可能な配列分析ソフトウェア、もっと特定的にＢＬＡＳＴ又は公共のデータベースにより与えられる分析ツールが用いられる場合もある。

「単離されている」という用語は、材料がその最初の環境（例えばそれが自然に存在するなら自然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば生きている動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自然界で共存する材料の一部又は全部から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その後自然界に再導入されるとしても単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部となり得、及び／又は、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部となり得るが、それでもまだそのようなベクター又は組成物はその自然環境の一部でない点で単離されている。

「操作される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」により、本明細書に説明されるＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３タンパク質をコードする核酸配列を組み立て、例えば非－ウイルス送達系（例えばＲＮＡに基づく系、裸のＤＮＡなど）の作製のため、又は、パッケージング宿主細胞中にウイルスベクターを作製するため、及び／又は、被験者中の宿主細胞に送達するために、ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３配列を運搬して宿主細胞に転移させるいずれかの適切な遺伝的要素、例えば裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどの中に置くことを意味する。１つの態様において、遺伝的要素はプラスミドである。そのような操作されたコンストラクトの作製のために用いられる方法は核酸操作における熟練者に既知であり、遺伝子操作、組換え操作及び合成法が含まれる。例えばＧｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

本明細書で用いられる場合、「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」という用語は外来性の又は操作されたタンパク質コード核酸配列を意味し、それは本明細書で説明される発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、組換えプラスミド又は産生プラスミド（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ）、ベクターあるいは宿主細胞中でプロモーター又は発現調節配列の調節下にある。一部の態様において、導入遺伝子は機能性ＲＥＰ－１タンパク質をコードするヒトＣＨＭ（ＲＥＰ－１）配列である。いくつかの態様において、導入遺伝子は配列番号２に示されるＲＥＰ－１アミノ酸配列をコードするコドン最適化核酸ＣＨＭ（ＲＥＰ－１）である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１に示される配列によりコードされる。一部の態様において、ＲＥＰ－１導入遺伝子は配列番号５に示される配列によりコードされる。配列番号５は改変された末端を含み、それは本明細書に説明される産生プラスミドのようなプラスミド中へのクローニングのための制限部位を含む。

一部の態様において、導入遺伝子は機能性ＣＮＧＡ３タンパク質をコードするヒトＣＮＧＡ３配列である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１０の配列をコードするコドン最適化ＣＮＧＡ３である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号９に示される配列によりコードされる。１つの態様において、導入遺伝子は配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８に示されるもののような改変された末端を含み、それは本明細書に説明されるプラスミドのようなプラスミド中へのクローニングのための制限部位を含む。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１２の配列をコードするコドン最適化ＣＮＧＡ３である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１１に示される配列によりコードされる。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１３に示されるＣＮＧＡ３の天然
のコード配列によりコードされる。

一部の態様において、導入遺伝子は機能性ＣＮＧＢ３タンパク質をコードするヒトＣＮＧＢ３配列である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１９又は２１と少なくとも７０％の同一性を共有する配列である配列をコードするコドン最適化ＣＮＧＢ３である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号２３に示される配列によりコードされる。配列番号２３は改変された末端を含み、それは本明細書に説明される産生プラスミドのようなプラスミド中へのクローニングのための制限部位を含む。配列番号２３のヌクレオチド１３から２４４８はＣＮＧＢ３のためのＯＲＦを与える。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号２０の配列をコードするコドン最適化ＣＮＧＢ３である。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号１９に示される配列によりコードされる。一部の態様において、導入遺伝子は配列番号２１に示される配列によりコードされる。一部の態様において、導入遺伝子は本明細書に説明されるプラスミドのようなプラスミド中へのクローニングのために改変された末端を含む。配列番号２１は、あるサイレント突然変異が天然のコード配列に導入されている新規なｃＤＮＡ配列である。ある特定の態様において、ＣＮＧＢ３配列は配列番号４５に示されるコドン最適化配列である。本明細書に説明される天然の配列へのさらなる改変は本発明が意図するものである。

１つの態様において、ＲＥＰ－１、ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードする核酸配列は、それに共有結合した標識ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。標識ポリペプチドは、ｍｙｃ標識ポリペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ標識ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質標識ポリペプチド、ｍｙｃ－ピルビン酸キナーゼ標識ポリペプチド、Ｈｉｓ６標識ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、フラッグ標識ポリペプチド及びマルトース結合タンパク質標識ポリペプチドを含むがこれらに限られない既知の「エピトープ標識」から選ばれる場合がある。

本明細書で用いられる場合、「ベクター」は、外来性又は異種又は操作された核酸導入遺伝子を中に挿入する場合がある核酸分子であり、それを次に適切な宿主細胞中に導入する場合がある。ベクターは、好ましくは１つ以上の複製起点及び中に組換えＤＮＡを挿入する場合がある１つ以上の部位を有する。ベクターは多くの場合、ベクターがある細胞をベクターがない細胞から選択することができる簡便な手段を有し、例えばそれらは薬剤耐性遺伝子をコードする。通常のベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム及び（主に酵母及びバクテリア中の）「人工の染色体」が含まれる。一部のプラスミドは本明細書に説明される。

「ウイルスベクター」は、外来性又は異種ＣＨＭ（ＲＥＰ－１）又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３核酸導入遺伝子を含む複製欠損ウイルスと定義される。１つの態様において、本明細書に説明される発現カセットを、薬剤送達のため又はウイルスベクターの作製のために用いられるプラスミド上で操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）場合がある。適切なウイルスベクターは好ましくは複製欠損性であり、眼細胞を標的とするものの中から選ばれる。ウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、パルボウイルスなどを含むが、これらに限られない遺伝子療法に適したいずれのウイルスを含む場合もある。しかしながら、理解を容易にするために本明細書では代表的なウイルスベクターとしてアデノ関連ウイルスに言及する。

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、問題の遺伝子を含む発現カセットがウイルスキャプシド又はエンベロープ中にパッケージングされており、ここでやはりウイルスキャプシド又はエンベロープ中にパッケージングされているいずれかのウイルスゲノム配列が複製欠損性である合成又は組換えウイルス粒子を指し；すなわちそれらは子孫ビリオンを産生できないが標的細胞に感染する能力を保持している。１つの態様において
、ウイルスベクターのゲノムは複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムを、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに挟まれた興味ある導入遺伝子のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作することができる）、産生中にこれらの遺伝子を供給する場合がある。従って、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いて、子孫ビリオンによる複製及び感染は起こり得ないので、それは遺伝子療法における使用に関して安全であるとみなされる。

さらに別の態様において、本明細書に説明されるもののいずれをも含む発現カセットを用いて組換えＡＡＶゲノムを作製する。

本明細書で用いられる場合、「宿主細胞」という用語は産生プラスミドから組換えＡＡＶが作製されるパッケージング細胞株を指す場合がある。あるいはまた、「宿主細胞」という用語は、導入遺伝子の発現が望まれているいずれかの標的細胞を指す場合がある。かくして「宿主細胞」は、いずれかの手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、顕微注入、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡコーテッドペレット（ｈｉｇｈｖｅｌｏｓｉｔｙＤＮＡ－ｃｏａｔｅｄｐｅｌｌｅｔ）、ウイルス感染及びプロトプラスト融合により細胞中に導入された外来性又は異種ＤＮＡを含む原核又は真核細胞を指す。

本明細書中の一部の態様において、「宿主細胞」という用語は、本明細書に説明される組成物の試験管内評価のための種々の哺乳類種の眼細胞の培養物を指す。本明細書中の他の態様において、「宿主細胞」という用語はウイルスベクター又は組換えウイルスを作製しかつパッケージングするために用いられる細胞を指す。さらに別の態様において、「宿主細胞」という用語は眼疾患に関して生体内で処置されている被験者の眼細胞を指すことが意図されている。

本明細書で用いられる場合、「眼細胞」という用語は、眼の中の又は眼の機能と関連するいずれの細胞をも指す。その用語は、杆体光受容体、錐体光受容体及び光感受性神経節細胞を含む光受容体細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、脈絡膜細胞、双極細胞、水平細胞ならびにアマクリン細胞のいずれか１つを指す場合がある。１つの態様において、眼細胞は光受容体細胞である。他の態様において、眼細胞はＲＰＥ細胞である。

「プラスミド」は一般に本明細書において、当該技術分野における熟練者に良く知られている標準的な命名規則に従い、小文字のｐとその前及び／又は後の大文字及び／又は数字により称される。本発明に従って用いられ得る多くのプラスミドならびに他のクローニング及び発現ベクターは当該技術分野における熟練者に周知であり、容易に入手可能である。さらに、熟練者は本発明における使用に適した他のプラスミドのいくつでも容易に構築することができる。本発明におけるそのようなプラスミドならびに他のベクターの性質、構築及び使用は、本開示から熟練者に容易に明らかになるであろう。

本明細書で用いられる場合、「転写調節配列」又は「発現調節配列という用語は、それらが作動可能に連結されているタンパク質コード核酸配列の転写を誘導、抑制その他他調節する開始配列（ｉｎｉｔｉａｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、エンハンサー配列及びプロモーター配列のようなＤＮＡ配列を指す。

本明細書で用いられる場合、「作動可能に連結する」又は「作動可能に関連する」という用語は、ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードする核酸配列と連続している発現調節配列ならびに／あるいはそれらの転写及び発現を調節するためにトランスで（ｉｎｔｒａｎｓ）又は離れて働く発現調節配列の両方を指す。

本明細書で用いられる場合、「ＡＡＶ」又は「ＡＡＶ血清型」という用語は、多数の自然に存在しかつ入手可能なアデノ関連ウイルスならびに人工のＡＡＶｓを指す。ヒト又は非－ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離されたか又は操作され、十分に特性が調べられたＡＡＶｓの中で、ヒトＡＡＶ２は遺伝子転移ベクターとして開発された最初のＡＡＶである；それは種々の標的組織及び動物モデルにおける有効な遺伝子転移実験のために広く用いられてきた。他に特記されなければ、本明細書に説明されるＡＡＶキャプシド、ＩＴＲｓ及び他の選ばれたＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８及びＡＡＶＡｎｃ８０か、既知の又は言及されたＡＡＶｓのいずれかの変異体か、未発見のＡＡＶｓあるいはそれらの変異体又は混合物を含むがこれらに限られないいずれのＡＡＶかの中からも容易に選ばれる場合がある。例えば引用により本明細書に取り込まれる国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレットを参照されたい。別の態様において、ＡＡＶキャプシドは優先的に双極細胞を標的とするＡＡＶ８ｂｐキャプシドである。引用により本明細書に取り込まれる国際公開第２０１４／０２４２８２号パンフレットを参照されたい。別の態様において、ＡＡＶキャプシドは外側網膜（ｏｕｔｅｒｒｅｔｉｎａ）への優先的送達を示したＡＡＶ７ｍ８キャプシドである。引用により本明細書に取り込まれるＤａｌｋａｒａら、ＩｎＶｉｖｏ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａＮｅｗＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｆｏｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＯｕｔｅｒＲｅｔｉｎａｌＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙｆｒｏｍｔｈｅＶｉｔｒｅｏｕｓ，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ５，１８９ｒａ７６（２０１３）を参照されたい。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ８キャプシドである。別の態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ９キャプシドである。別の態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ５キャプシドである。別の態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ２キャプシドである。

ＡＡＶに関して本明細書で用いられる場合、変異体という用語は既知のＡＡＶ配列から誘導されるＡＡＶ配列を意味し、アミノ酸又は核酸配列全体にわたって少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％又はそれより高い配列同一性を共有するものを含む。他の態様において、ＡＡＶキャプシドは、いずれかの説明された又は既知のＡＡＶキャプシド配列からの最高で約１０％の変異を含む場合がある変異体を含む。すなわちＡＡＶキャプシドは、本明細書で提示された及び／又は当該技術分野において既知のＡＡＶキャプシドに約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶキャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドのパーセント同一性を決定する場合、様々な（ｖａｒｉａｂｌｅ）タンパク質（例えばｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３）のいずれかについて比較を行う場合もある。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ８ｖｐ３と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の態様において、自己相補性ＡＡＶが用いられる。

ＩＴＲｓ又は他のＡＡＶ成分は、当該技術分野における熟練者に利用可能な方法を用い、ＡＡＶから容易に単離されるか又は操作される場合がある。そのようなＡＡＶは学究的な、商業的な又は公共の供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離されるか、操作されるか又は得られる場合がある。あるいはまた、ＡＡＶ配列は、文献で又は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのようなデータベースにおいて入手可能であるような公開された配列への参照により、合成的又は他の適切な手段を介して操作される場合がある。ＡＡＶウイルスを通常の分子生物的方法により操作し、核酸配列の細胞特異的な送達のため、免疫原性を最少にするため、安定性及び粒子寿命を調整するため、有効な分解のため、核への正確
な送達のためなどにこれらの粒子を最適化することを可能にする場合がある。

本明細書で用いられる場合、「人工ＡＡＶ」は自然に存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味するがこれに限られない。そのような人工キャプシドは、選ばれたＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を、異なる選ばれたＡＡＶ、同じＡＡＶの非－連続部分、非－ＡＡＶウイルス供給源から又は非－ウイルス供給源からから得られる場合がある異種配列と組み合わせて用い、適切な方法により作製される場合がある。人工ＡＡＶは偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド又は「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」ＡＡＶキャプシドの場合があるが、これに限られない。１ある種のＡＡＶのキャプシドが別種のキャプシドタンパク質で置き換えられている偽型ベクターは本発明において有用である。１つの態様において、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は代表的な偽型ベクターである。

「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミド又はベクターを指す。感染すると、第２の鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分（ｔｗｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｈａｌｖｅｓ）が会合して、即時複製及び転写への準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成するであろう。例えばＤＭＭｃＣａｒｔｙら、”Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓｐｒｏｍｏｔｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ２００１），Ｖｏｌ８，Ｎｕｍｂｅｒ１６，ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶｓは、例えば米国特許第６，５９６，５３５；７，１２５，７１７及び７，４５６，６８３号明細書に説明されており、それらのそれぞれの記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる。

方法において用いられる「投与」により、眼疾患により特徴付けられる標的が選択された細胞（ｔａｒｇｅｔｓｅｌｅｃｔｅｄｃｅｌｌ）に組成物を送達することを意味する。１つの態様において、前記方法は組成物を網膜下注入によりＲＰＥ、光受容体細胞又は他の眼細胞に送達することを含む。別の態様において、眼細胞への硝子体内注入が用いられる。さらに別の態様において、眼瞼静脈を介する眼細胞への注入が用いられる場合がある。さらに別の投与方法は、本開示を与えられて当該技術分野における熟練者により選択される場合がある。「投与」又は「投与経路」は、製薬学的担体又は賦形剤と一緒の又はそれらを含まない本明細書に説明される組成物の被験者への送達である。投与経路は、望ましいなら組み合わされる場合がある。いくつかの態様において、投与は周期的に繰り返される。本明細書に説明される製薬学的組成物は、いずれかの適切な経路又は種々の経路の組み合わせによる必要とする被験者への送達のために設計される。眼への直接送達（任意的に眼内送達、網膜下注入、網膜内注入、硝子体内、局所的を介する）又は全身的経路、例えば動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の非経口的投与経路を介する送達。本明細書に説明される核酸分子及び／又はベクターを単一の組成物中で又は複数の組成物中で送達する場合がある。任意的に２種以上のＡＡＶあるいは複数種のウイルスを送達する場合がある［例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレット及び国際公開第２０１３／０４９４９３号パンフレットを参照されたい］。別の態様において、複数のウイルスは異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶ及びアデノウイルス）を単独で又はタンパク質と組み合わせて含む場合がある。

本明細書に説明される一部の組成物は、ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードする新規なコドン最適化配列を与える単離されたかあるいは合成的に又は組換え的に操作された核酸配列である。１つの態様において、ヒトＲＥＰ－１をコードする単離され
たか又は操作されたコドン最適化核酸配列を提供する。１つの態様において、コドン最適化配列は配列番号１である。別の態様において、コドン最適化配列はクローニングのためのＮ末端及びＣ末端制限部位を含む。１つの態様において、配列番号５に開示されるもののように、ＲＥＰ－１コード配列はコザック共通配列の他にＮ末端ＮｏｔＩ制限部位及びＣ末端ＢａｍＨＩ制限部位を含む。さらにいくつかの態様において、コドン最適化配列はエピトープ標識のようなマーカーの付加を許すための１つ以上追加の制限部位を含む。天然の核酸配列と並べられると、コドン最適化ＲＥＰ－１は、範囲の間のいずれの整数も含んで、少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％のパーセント同一性を有する場合がある。１つの態様において、コドン最適化ＲＥＰ－１は、天然の配列と少なくとも５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のパーセント同一性を有する。１つの態様において、天然の核酸配列番号３と並べられると、コドン最適化ＲＥＰ－１（配列番号１）はわずか７４％のパーセント配列同一性を有することが明らかになった（図２を参照されたい）。

別の態様において、ヒトＣＮＧＡ３をコードする単離されたか又は操作されたコドン最適化核酸配列を提供する。１つの態様において、コドン最適化配列は配列番号９である。１つの態様において、コドン最適化配列は配列番号１１に示されるＣＮＧＡ３変異体である。別の態様において、コドン最適化配列はクローニングのためのＮ末端及びＣ末端制限部位を含む。１つの態様において、ＣＮＧＡ３コード配列はコザック共通配列の他にＮ末端ＮｏｔＩ制限部位及びＣ末端ＢｇＩＩＩ制限部位を含む。そのような改変を含むＣＮＧＡ３配列の例は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８に見出され得る。さらにいくつかの態様において、コドン最適化配列はエピトープ標識のようなマーカーの付加を許すための１つ以上の追加の制限部位を含む。天然の核酸配列と並べられると、コドン最適化ＣＮＧＡ３は、範囲の間のいずれの整数も含んで少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％のパーセント同一性を有する場合がある。１つの態様において、コドン最適化ＣＮＧＡ３は天然の配列と少なくとも５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のパーセント同一性を有する。１つの態様において、天然の核酸配列番号１３と並べられると、コドン最適化ＣＮＧＡ３（配列番号９）はわずか８０％のパーセント配列同一性を有することが明らかになった（図３を参照されたい）。

別の態様において、ヒトＣＮＧＢ３をコードする単離されたか又は操作されたコドン最適化核酸配列を提供する。１つの態様において、コドン最適化配列は配列番号１９又は配列番号２１と少なくとも７０％の同一性を共有する配列である。一態様において、コドン最適化配列は配列番号４５に示される配列であり、この配列は配列番号２１の改変ＣＮＧＢ３配列と約７６％同一性を共有する。別の態様において、コドン最適化配列は例えば配列番号２３に示されるように、クローニングのためのＮ末端及びＣ末端制限部位を含む。さらにいくつかの態様において、コドン最適化配列はエピトープ標識のようなマーカーの付加を許すための１つ以上の追加の制限部位を含む。天然の核酸配列（配列番号１９又は配列番号２１の改変配列に示されるような）と並べられると、コドン最適化ＣＮＧＢ３は、範囲の間のいずれの整数も含んで少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％のパーセント同一性を有する場合がある。１つの態様において、コドン最適化ＣＮＧＢ３は天然の配列と少なくとも５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５
、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のパーセント同一性を有する。

１つの態様において、本明細書に説明されるＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３コンストラクトをコードする最適化核酸配列を適切な遺伝的要素、例えば裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、エピソームなどの中に操作して導入し、それらは例えばＤＮＡ又はＲＮＡを保有するナノ粒子、パッケージング宿主細胞中のウイルスベクターを作製するため及び／又は被験者中の宿主細胞に送達するために、上に保有するＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３配列を宿主細胞に転移させる。１つの態様において、遺伝的要素はプラスミドである。

選ばれた遺伝的要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡ－コーテッドペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含むいずれかの適切な方法により送達される場合がある。そのようなコンストラクトの作製に用いられる方法は核酸操作における熟練者に既知であり、遺伝子操作、組換え操作及び合成法が含まれる。例えばＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

ＲＥＰ－１タンパク質の発現のために配列番号１又は５を用いる多様な発現カセットを提供する。１つの態様において、そのような発現カセットを含むプラスミドの例を配列番号２５に示す。１つの態様において、そのような発現カセットを含むプラスミドの例を配列番号２６に示す。１つの態様において、そのような発現カセットを含むプラスミドの例を配列番号２７に示す。１つの態様において、そのような発現カセットを含むプラスミドの例を配列番号２８に示す。本明細書で用いられる場合、「ベクターゲノム」はＩＴＲｓ自身を含んで５’及び３’ＩＴＲｓの間にパッケージングされる核酸配列である。いくつかの態様において、「ベクターゲノム」という用語は「発現カセット」と互換的に用いられる。かくして１つの態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、コザック配列、コドン最適化ＣＨＭ、ｂＧＨポリＡならびに３’ＩＴＲを含む。１つの態様において、ベクターゲノムは配列番号２５のヌクレオチド（ｎｔ）１～４２３３を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号２６のヌクレオチド１～４２３３を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号２７のヌクレオチド１～４２３３を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号２８のヌクレオチド１～４２３３を含む。

別の態様において、ＣＮＧＡ３タンパク質の発現のために配列番号９、１１又は１３を用いる多様な発現カセットを提供する。一態様において、そのような発現カセットを含むプラスミドの例は配列番号３０～３８に示されている。一態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＲＫ１プロモーター、コドン最適化ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。別の態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＲＫ１プロモーター、天然ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。別の態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＲＫ１プロモーター、コドン最適化ＣＮＧＡ３変異体３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。したがって、一態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＣＡＲプロモーター、コドン最適化ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。別の態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＣＡＲプロモーター、天然ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。別の態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＣＡＲプロモーター、コドン最適化ＣＮＧＡ３変異体３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。
したがって、一態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、コドン最適化ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ並びに３’ＩＴＲを含む。別の態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、天然ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ並びに３’ＩＴＲを含む。別の態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、コドン最適化ＣＮＧＡ３変異体３、ｂＧＨポリＡ並びに３’ＩＴＲを含む。

一態様において、ベクターゲノムは配列番号３０のヌクレオチド１～３１８９を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３１のヌクレオチド１～３１８９を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３２のヌクレオチド１～３３５４を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３３のヌクレオチド１～３５８３を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３４のヌクレオチド１～３５８０を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３５のヌクレオチド１～３７４８を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３６のヌクレオチド１～４３５７を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３７のヌクレオチド１～４３５７を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号３８のヌクレオチド１～４５２２を含む。

別の態様において、ＣＮＧＢ３タンパク質の発現のために配列番号１９、２１、２３又は４５を用いる多様な発現カセットを提供する。

一態様において、そのような発現カセットを含むプラスミドの例は配列番号３９～４４に示されている。一態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＲＫ１プロモーター、コドン最適化ＣＮＧＢ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。別の態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＲＫ１プロモーター、天然ＣＮＧＢ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。一態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＣＡＲプロモーター、コドン最適化ＣＮＧＢ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。別の態様では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＣＡＲプロモーター、天然ＣＮＧＢ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含む。一態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、コドン最適化ＣＮＧＢ３、ｂＧＨポリＡ並びに３’ＩＴＲを含む。別の態様において、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、天然ＣＮＧＢ３、ｂＧＨポリＡ並びに３’ＩＴＲを含む。

一態様において、ベクターゲノムは配列番号３９のヌクレオチド１～３５３７を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号４０のヌクレオチド１～３５３６を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号４１のヌクレオチド１～３９３０を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号４２のヌクレオチド１～３９３０を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号４３のヌクレオチド１～４７０４を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号４４のヌクレオチド１～４７０４を含む。別の態様において、ベクターゲノムは配列番号４６のヌクレオチド１～４１５４を含む。

本明細書で用いられる場合、「発現カセット」は最適化ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３タンパク質のためのコード配列、プロモーターを含み、かつそれらのための他の調節配列を含む場合がある核酸分子を指し、そのカセットを遺伝的要素又はプラスミド中に操作して導入するならびに／あるいはウイルスベクター（例えばウイルス粒子）のキャプシド中にパッケージングする場合がある。

１つの態様において、発現カセットはＲＥＰ－１をコードするコドン最適化核酸配列を
含む。１つの態様においてカセットは、ＲＥＰ－１をコードするコドン最適化核酸配列の宿主細胞における発現を方向付ける発現調節配列と作動可能に関連するコドン最適化ＲＥＰ－１を与える。

別の態様において、発現カセットはＣＮＧＡ３をコードするコドン最適化核酸配列を含む。１つの態様においてカセットは、ＣＮＧＡ３をコードするコドン最適化核酸配列の宿主細胞における発現を方向付ける発現調節配列と作動可能に関連するコドン最適化ＣＮＧＡ３を与える。

別の態様において、発現カセットはＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列を含む。１つの態様においてカセットは、ＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列の宿主細胞における発現を方向付ける発現調節配列と作動可能に関連するコドン最適化ＣＮＧＢ３を与える。

別の態様において、ＡＡＶベクター中における使用のための発現カセットを提供する。その態様において、ＡＡＶ発現カセットは少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。別の態様において、発現カセットは５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。１つの態様において、５’及び３’ＩＴＲｓは、任意的にＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列の宿主細胞における発現を方向付ける追加の配列と一緒に、ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列にフランキングする。かくして本明細書に説明される場合、ＡＡＶ発現カセットは、その５’末端において５’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）により及びその３’末端において３’ＡＡＶＩＴＲに挟まれた上記の発現カセットを説明するものとする。かくしてこのｒＡＡＶゲノムはＡＡＶウイルス粒子中に発現カセットをパッケージングするために必要な最小の配列、すなわちＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲｓを含む。ＡＡＶＩＴＲｓは、本明細書に説明されるようないずれのＡＡＶのＩＴＲ配列からも得られる場合がある。これらのＩＴＲｓは得られる組換えＡＡＶにおいて用いられるキャプシドと同じＡＡＶ起源のもの又は（ＡＡＶ偽型の作製のために）異なるＡＡＶ起源のものの場合がある。１つの態様において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が簡便のため及び規制に関する承認を速めるために用いられる。しかしながら他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲｓが選ばれる場合がある。それぞれのｒＡＡＶゲノムを次に産生プラスミド中に導入する場合がある。１つの態様において、産生プラスミドは本明細書に説明されるもの又は引用により本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１５８７５７号パンフレットに説明されるものである。ｒＡＡＶベクターの作製における使用のために種々のプラスミドが当該技術分野で既知であり、本明細書において有用である。産生プラスミドはＡＡＶｃａｐ及び／又はｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞中で培養される。宿主細胞において、それぞれのｒＡＡＶゲノムは保護され（ｒｅｓｃｕｅｄ）、キャプシドタンパク質又はエンベロープタンパク質中にパッケージングされ、感染性ウイルス粒子を形成する。

産生プラスミドの１つの型は配列番号７に示されるものであり、それはｐ５８４と呼ばれる。このプラスミドはｒＡＡＶ－ＲＥＰ－１ベクターの作製のために実施例中で用いられる。そのようなプラスミドは５’ＡＡＶＩＴＲ配列；選ばれたプロモーター；ポリＡ配列；及び３’ＩＴＲを含むものであり；さらにそれはラムダのようなスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列も含む。１つの態様において、非－コードラムダスタッファー領域はベクター主鎖中に含まれる。ＲＥＰ－１、ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードする核酸配列は、選ばれたプロモーターとポリＡ配列の間又は類似のプラスミドに挿入される。ＲＥＰ－１コード配列を含むｐ５８４の例を配列番号８に見出すことができる。別の態様において、産生プラスミドを最適化ベクタープラスミド産生効率のために改変する。そのような改変は、ベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを調節するための他の中性配列（
ｎｅｕｔｒａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の付加又はラムダスタッファー配列の一部もしくは全体の欠失を含む。そのような改変は本明細書に含まれる。他の態様において、ターミネーター及び他の配列がプラスミド中に含まれる。

さらなる態様において、ＲＥＰ－１、ＣＮＧＡ３及びＣＮＧＢ３コンストラクト及び本明細書に説明される最適化配列の送達のための組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶＤｎａｓｅ－耐性粒子であり、核酸配列が標的細胞への送達のためにキャプシド中にパッケージングされている。ＡＡＶキャプシドは６０個のキャプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から構成され、それらは選ばれるＡＡＶに応じて約１：１：１０～１：１：２０の比率で正二十面体対称性において配置されている。ＡＡＶｓは、上記で定義されるＡＡＶウイルスベクターのキャプシドのための源として選ばれる場合がある。例えば米国公開特許出願第２００７－００３６７６０－Ａ１号明細書；米国公開特許出願第２００９－０１９７３３８－Ａ１号明細書；欧州特許第１３１０５７１号明細書を参照されたい。国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号明細書及び米国特許第７２８２１９９号明細書（ＡＡＶ８）、国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット及び米国特許第７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９）ならびに国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット及び国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット（ｒｈ．１０）も参照されたい。これらの文書のそれぞれは引用によりその全体が取り込まれる。一部の態様では、ＡＡＶキャプシドは、列挙された文書において説明される核酸配列を使用して作製される。これらの文書はＡＡＶの作製のために選ばれることがある他のＡＡＶも説明しており、それらの記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。いくつかの態様において、ウイルスベクター中で用いるためのＡＡＶｃａｐを、上記で挙げたＡＡＶキャプシド又はそのコード核酸の１つの突然変異誘発により（すなわち挿入、欠失又は置換により）作製する場合がある。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは、前記で挙げたＡＡＶキャプシドたんぱく質の２つ又は３つ又は４つ又はそれより多くからのドメインを含むキメラである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは２又は３種のＡＡＶｓあるいは組換えＡＡＶｓからのＶｐ１、Ｖｐ２及びＶｐ３モノマーのモザイクである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は前記で挙げたＣａｐｓの１つより多くを含む。

別の態様において、ＡＡＶキャプシドは、いずれかの説明された又は既知のＡＡＶキャプシド配列からの最高で約１０％の変異を含む場合がある変異体を含む。すなわちＡＡＶキャプシドは、本明細書で提示された及び／又は当該技術分野において既知のＡＡＶキャプシドに約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶキャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドのパーセント同一性を決定する場合、様々なタンパク質（例えばｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３）のいずれかについて比較を行う場合もある。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ８ｖｐ３と少なくとも９５％同一性を共有する。別の態様において、自己相補性ＡＡＶが用いられる。１つの態様において、所望の標的細胞、例えば光受容体、ＲＰＥ又は他の眼細胞に関する親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示すＡＡＶキャプシドを用いるのが望ましい。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドは、一部の表面露出チロシン残基がフェニルアラニン（Ｆ）で置き換えられているチロシンキャプシド－突然変異体である。そのようなＡＡＶ変異体は例えばＭｏｗａｔら、Ｔｙｒｏｓｉｎｅｃａｐｓｉｄ－ｍｕｔａｎｔＡＡＶｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｔｏｔｈｅｃａｎｉｎｅｒｅｔｉｎａｆｒｏｍａｓｕｂｒｅｔｉｎａｌｏｒｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２１，９６－１０５（Ｊａｎｕａｒｙ
２０１４）に説明されており、引用により本明細書に取り込まれる。

発現カセット又はｒＡＡＶゲノム又は産生プラスミドをビリオン中にパッケージングするために、ＩＴＲｓは導入遺伝子と同じコンストラクト中においてシスで（ｉｎｃｉｓ）必要な唯一のＡＡＶ成分である。１つの態様において、複製（ｒｅｐ）及び／又はキャプシド（ｃａｐ）のためのコード配列はＡＡＶゲノムから除去され、ＡＡＶベクターの作製のためにトランスで又はパッケージング細胞株により供給される。例えば上記の通り、偽型ＡＡＶはＡＡＶキャプシドの源と異なる源からのＩＴＲｓを含む場合がある。さらに又は代わりに、キメラＡＡＶキャプシドが用いられる場合がある。さらに別のＡＡＶ成分が選ばれる場合がある。そのようなＡＡＶ配列の源は本明細書に説明されており、学究的な、商業的な又は公共の供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離されるか、操作されるか又は得られる場合もある。あるいはまた、ＡＡＶ配列は、文献で又は例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などのようなデータベースにおいて入手可能であるような公開された配列への参照により、合成的又は他の適切な手段を介して得られる場合がある。

被験者への送達に適切なＡＡＶウイルスベクターの作製及び単離方法は当該技術分野において既知である。例えば米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット；国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット及び米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書を参照されたい。１つの系において、ＩＴＲｓに挟まれた導入遺伝子をコードするコンストラクト及びｒｅｐとｃａｐをコードするコンストラクトを用いてプロデューサー細胞株（ｐｒｏｄｕｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅ）を一過的にトランスフェクションする。第２の系において、ｒｅｐとｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲｓに挟まれた導入遺伝子をコードするコンストラクトを用いて一過的にトランスフェクションする。これらの系のそれぞれにおいて、汚染ウイルスからのｒＡＡＶｓの分離を必要とするヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスの感染に反応して、ＡＡＶビリオンが産生される。もっと最近には、ＡＡＶの回収にヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発された－必要なヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４又はヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も系によりトランスで供給される。これらのより新しい系において、必要なヘルパー機能をコードするコンストラクトを用いる細胞の一過性トランスフェクションによりヘルパー機能を供給する場合があるか、又はヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むように細胞を操作することができ、その遺伝子の発現は転写レベル又は転写後レベルで調節され得る。

さらに別の系において、ＩＴＲｓに挟まれた導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バクロウイルスに基づくベクターを用いる感染により昆虫細胞中に導入する。これらの産生系についての総説に関し、一般に例えばＺｈａｎｇら、２００９，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｈｙｂｒｉｄｆｏｒｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０：９２２－９２９を参照されたく、その記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる。これら及び他のＡＡＶ産生系の作製及び使用方法は以下の米国特許にも説明されており、それらのそれぞれの記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５号明細書。一般的に例えばＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓａｓａｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ
ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｐｌｉｃａｔｉｏｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８，“Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．１０：７１７－７３３及び下記で引用される参照文献を参照されたく、それらのそれぞれの記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる。

本発明の態様の構築のために用いられる方法は核酸操作における熟練者に既知であり、遺伝子操作、組換え操作及び合成法が含まれる。例えばＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの作製方法は周知であり、適切な方法の選択は本発明についての制限ではない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

ｒＡＡＶベクターはＡＡＶキャプシド及び上記のようなＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードする配列を含むＡＡＶ発現カセットを含む。一部の態様において、ｒＡＡＶ発現カセットは、ＡＡＶ逆位末端反復配列と、ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列と、宿主細胞におけるコードされるタンパク質の発現を方向付ける発現調節配列とを含む。他の態様において、ｒＡＡＶ発現カセットは、イントロン、コザック配列、ポリＡ及び転写後調節要素の１つ又はそれより多くをさらに含む。眼への送達のための製薬学的組成物中で用いるためのそのようなｒＡＡＶベクターは、上記で定義された多くの既知のＡＡＶｓのいずれか由来のキャプシドを用いる場合がある。

発現カセット及びベクターの他の通常の成分は、例えば本明細書に説明される本明細書に説明されるようなコドン最適化を含む当該技術分野において既知の方法を用いて特定の種に関して最適化され得る他の成分を含む。カセット、ベクター、プラスミド及びウイルス又は本明細書に説明される他の組成物の成分には、発現調節配列の一部としてのプロモーター配列が含まれる。別の態様において、プロモーターは細胞特異的である。「細胞特異的」という用語は、組換えベクターのために選ばれる特定のプロモーターが特定の眼細胞型において最適化ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３導入遺伝子の発現を方向付ける場合があることを意味する。１つの態様において、プロモーターは光受容体細胞における導入遺伝子の発現に関して特異的である。別の態様において、プロモーターは杆体及び錐体における発現に関して特異的である。別の態様において、プロモーターは杆体における発現に関して特異的である。別の態様において、プロモーターは錐体における発現に関して特異的である。１つの態様において、光受容体特異的プロモーターはヒトロドプシンキナーゼプロモーターである。ロドプシンキナーゼ（ＲＫ１）プロモーターは、杆体及び錐体の両方において活性であることが示された。例えば引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＳｕｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｗｉｔｈａＰｒｏｍｏｔｅｒ
ＴａｒｇｅｔｉｎｇＢｏｔｈＲｏｄｓａｎｄＣｏｎｅｓＲｅｓｃｕｅｓＲｅｔｉｎａｌＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＣａｕｓｅｄｂｙＡＩＰＬ１Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１０Ｊａｎｕａｒｙ；１７（１）：１１７－１３１を参照されたい。１つの態様において、プロモーターはクローニングを助長するために１つ以上の制限部位を加えるように改変される。一態様において、ＲＫ１プロモーターは、配列番号３０のヌクレオチド１７５～６８４に示される。

ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）プロモーターが同定され、ＡＡＶ形質導入実験及び遺
伝子置換研究において利用されてきた。例えば、ＬｉＡ、ＺｈｕＸ、ＣｒａｆｔＣＭ．ＲｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｏｎｅａｒｒｅｓｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈａＣｉｓｅｌｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｄｉｓｔａｌｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．２００２；４３（５）：１３７５～１３８３；及びＣａｒｖａｌｈｏ、ＬｉｖｉａＳ．ら、“Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍａｎｄａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆ
ｖｉｓｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＣＮＧＢ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａｆｏｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．”Ｈｕｍａｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ２０．１６（２０１１）：３１６１～３１７５を参照されたい。遺伝子発現を特徴付けることを目的とする動物において実施した実験では、ヒト錐体アレスチンプロモーターは網膜において強力な発現を駆動した。Ｄｙｋａ、ＦｒａｎｋＭ．ら、“Ｃｏｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｍｏｔｅｒｆｏｒｕｓｅｉｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ．”ＲｅｔｉｎａｌＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＮｅｗＹｏｒｋ、２０１４．６９５～７０１を参照されたい。Ｄｙｋａらは、ｈＣＡＲプロモーターの特異性は不十分であり、杆体及びＲＰＥは明らかに形質導入されていることも報告している。ｈＣＡＲプロモーターの配列は、一般公開されている文献、データベース及び市販の製品を介して利用可能である。一態様において、ｈＣＡＲプロモーターの核酸配列は、配列番号３３のヌクレオチド１７５～ヌクレオチド１０７８に再現されている。別の態様において、ｈＣＡＲプロモーターの核酸配列は、配列番号３３のヌクレオチド１８１～ヌクレオチド１０７８に再現されている。

別の態様において、プロモーターはヒトロドプシンプロモーターである。１つの態様において、プロモーターはクローニングのために末端に制限を含むように改変される。例えば引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＮａｔｈａｎｓおよびＨｏｇｎｅｓｓ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅ
ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，ＰＮＡＳ，８１：４８５１－５（Ａｕｇｕｓｔ１９８４）を参照されたい。別の態様において、プロモーターはヒトロドプシンプロモーターの一部又はフラグメントである。別の態様において、プロモーターはヒトロドプシンプロモーターの変異体である。

他の代表的なプロモーターにはヒトＧ－タンパク質共役受容体タンパク質キナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＹ３２７５８０）が含まれる。別の態様において、プロモーターはＧＲＫ１プロモーターの２９２個のヌクレオチドのフラグメント（位置１７９３－２０８７）である（引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＢｅｌｔｒａｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０１０１７：１１６２－７４を参照されたい）。別の好ましい態様において、プロモーターはヒト光受容体間レチノイド－結合タンパク質近位（ＩＲＢＰ）プロモーターである。１つの態様において、プロモーターはｈＩＲＢＰプロモーターの２３５個のヌクレオチドのフラグメントである。１つの態様において、プロモーターはＲＰＧＲ近位プロモーターである（引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＳｈｕら、ＩＯＶＳ，Ｍａｙ２１０２）。本発明において有用な他のプロモーターには杆体オプシンプロモーター、赤－緑オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ－β－ホスホジエステラーゼプロモーター（Ｑｇｕｅｔａら、ＩＯＶＳ，ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．２０００Ｄｅｃ；４１（１３）：４０５９－６３）、マウスオプシンプロモーター（上記で引用したＢｅｌｔｒａｎｅｔａｌ２０１０）、ロドプシンプロモーター（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ，Ｊｕｌｙ２０１１，１８（７）：６３７－４５）；錐体トランスジューシンのアルファ－サブユニット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、ＢＭＣＤｅｖ，
Ｂｉｏｌ，Ｊａｎ２０１１，１１：３）；ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター；網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Ｎｉｃｏｒｄら、Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ，Ｄｅｃ２００７，９（１２）：１０１５－２３）；ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Ｌａｍｂａｒｄら、ＰｌｏＳＯｎｅ，Ｏｃｔ．２０１０，５（１０）：ｅｌ３０２５）、ＲＰＥ６５プロモーター；網膜変性スロー（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｌｏｗ）／ペリフェリン２（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（Ｃａｉら、ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．２０１０Ａｙｇ；９１（２）：１８６－９４）；及びＶＭＤ２プロモーター（Ｋａｃｈｉら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，２００９（２０：３１－９））が含まれるが、これに限られない。これらの文書のそれぞれは引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。別の態様において、プロモーターはヒトＥＦ１αプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼ、光受容体間結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、錐体オプシンプロモーター（赤－緑、青）、赤－緑錐体遺伝子座調節領域を含む錐体オプシン上流配列、錐体形質導入及び転写因子プロモーター（神経網膜ロイシンジッパー（ｎｅｕｒａｌｒｅｔｉｎａｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ）（Ｎｒｌ）及び光受容体特異的核受容体Ｎｒ２ｅ３、ｂＺＩＰ）から選ばれる。

別の態様において、プロモーターは遍在性又は構成的プロモーターである。適切なプロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー要素を有するハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。一態様において、ＣＢＡプロモーターの核酸配列は、ＣＭＶエンハンサーエレメントと一緒に配列番号３６のヌクレオチド１～ヌクレオチド５４４に示されている。一態様において、プロモーターは、配列番号３６のヌクレオチド５４６～ヌクレオチド８２３に示される配列のようなＣＢＡエキソン１及びイントロン配列を含む。

別の態様において、プロモーターはＣＢ７プロモーターである。他の適切なプロモーターにはヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子－１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０プロモーター及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。例えばＤａｍｄｉｎｄｏｒｊら、（Ａｕｇｕｓｔ２０１４）ＡＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓＬｏｃａｔｅｄｉｎＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｏｒｓ．ＰｌｏＳＯＮＥ９（８）：ｅ１０６４７２を参照されたい。さらに別の適切なプロモーターにはウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）が含まれる［例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレット及び国際公開第２０１３／０４９４３号パンフレットを参照されたい］。あるいはまた、生理学的合図に反応性のプロモーターが本明細書に説明される発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド及びウイルスにおいて用いられる場合がある。１つの態様において、ＡＡＶベクターのサイズ制限の故に、プロモーターは１０００塩基対（ｂｐ）より小さい小サイズのものである。別の態様において、プロモーターは４００ｂｐより小さい。他のプロモーターが当該技術分野における熟練者により選ばれる場合がある。１つの態様において、ＲＥＰ－１コンストラクトに遍在性プロモーターを導入する。別の態様において、ＣＮＧＡ３コンストラクトに光受容体特異的プロモーターを導入する。１つの態様において、ＲＥＰ－１コンストラクトはＣＭＶエンハンサー要素と一緒にＣＢＡプロモーターを含む。

別の態様において、プロモーターは誘導可能なプロモーターである。誘導可能なプロモーターは、ラパマイシン／ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）プロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン－反応性プロモーター及びテトラサイクリン－反応性プロモーター又はヘテロダイマーリプレッサースイッチを含む既知のプロモーターから選ばれる場合がある。引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＳｏｃｈｏｒら、ＡｎＡｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙＲｅｇｕｌａｔｅｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒ
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＯｃｕｌａｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ．２０１５Ｎｏｖ２４；５：１７１０５及びＤａｂｅｒＲ，ＬｅｗｉｓＭ．，Ａｎｏｖｅｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｗｉｔｃｈ．Ｊ
ＭｏｌＢｉｏｌ２００９Ａｕｇ２８；３９１（４）：６６１－７０，Ｅｐｕｂ
２００９Ｊｕｎ２１を参照されたい。

別の態様において、本明細書に説明されるカセット、ベクター、プラスミド及びウイルスコンストラクトは、他の適切な転写開始、終結（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｎ）、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような有効なＲＮＡプロセシングシグナルと、ＴＡＴＡ配列と、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列と、翻訳効率を増強する配列（すなわちコザック共通配列）と、イントロンと、タンパク質安定性を増強する配列と、所望なら、コードされる産物の分泌を増強する配列とを含む。別の態様において、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。発現カセット又はベクターは本明細書に説明される要素を何も含まないか、いずれかの１つ又はそれより多くを含む場合がある。適切なポリＡ配列の例には、例えばＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びＴＫポリＡが含まれる。適切なエンハンサーの例には、中でも例えばＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ－結合グロブリンプロモーター／アルファ－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）が含まれる。１つの態様において、正しい開始コドンからの翻訳を増強するために、コザック配列が導入遺伝子コード配列の上流に含まれる。別の態様において、ＣＢＡエキソン１及びイントロンが発現カセット中に含まれる。１つの態様において、導入遺伝子はハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの調節下に置かれる。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサーと、近位ニワトリβアクチンプロモーターと、イントロン１配列に挟まれたＣＢＡエキソン１とからなる。配列番号３６ヌクレオチド１～８２３を参照されたい。

アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶキャプシド及びＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸配列及びヒトＲａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）をコードする配列番号１の核酸配列及び宿主細胞におけるＲＥＰ－１の発現を方向付けるＣＢＡプロモーターをＣＭＶエンハンサーと一緒に含む発現調節配列を含む。

一態様において、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸配列及びヒト環状ヌクレオチド感受性チャンネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）をコードする配列番号９又は配列番号１１の核酸配列、及び宿主細胞におけるＣＮＧＡ３の発現を方向付ける発現調節配列をそこにパッケージングしているＡＡＶキャプシドを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。一態様において、ＣＮＧＡ配列は配列番号９及びロドプシンキナーゼ１（ＲＫ１）プロモーターを含む。別の態様において、ＲＫ１プロモーター配列は配列番号３０のヌクレオチド１７５～６８４である。別の態様において、ＣＮＧＡ配列は配列番号１１及びヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）プロモーターを含む。別の態様において、ｈＣＡＲプロモーター配列は、配列番号３３のヌクレオチド１７５～ヌクレオチド１０７８又は配列番号３３のヌクレオチド１８１～ヌクレオチド１０７８に示される配列である。

別の態様において、ＡＡＶ逆位末端反復配列を含む核酸配列及びヒト環状ヌクレオチド感受性チャンネルベータ３（ＣＮＧＢ３）をコードする配列番号４５の核酸配列、及び宿主細胞におけるＣＮＧＢ３の発現を方向付ける発現調節配列をそこにパッケージングしているＡＡＶキャプシドを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。一態様において、発現調節配列はＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター、ＲＫ１プロモーター又はｈＣＡＲプロモーターを含む。

別の態様において、発現カセットは５’ＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、コザック配列、ヒトコドン最適化ＣＨＭ配列（配列番号１）、ｂＧＨポリＡならびに３’ＩＴＲを含む。

さらに別の側面において、これらの核酸配列、ベクター、発現カセット及びｒＡＡＶウイルスベクターは製薬学的組成物において有用であり、それは製薬学的に許容され得る担体、緩衝剤、希釈剤及び／又は添加剤なども含む。そのような製薬学的組成物は、そのような組換え的に操作されたＡＡＶｓ又は人工ＡＡＶｓによる送達を介して眼細胞において最適化ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３を発現させるために用いられる。

核酸配列、ベクター、発現カセット及びｒＡＡＶウイルスベクターを含むこれらの製薬学的組成物の調製のために、配列又はベクター又はウイルスベクターは、好ましくは通常の方法により汚染に関して評価され、次いで眼への投与に適切な製薬学的組成物に調製される。そのような調製は、製薬学的及び／又は生理学的に許容されるビヒクル又は担体、特にｐＨを適切な生理学的レベルに保つための緩衝食塩水又は他の緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳのような眼への投与に適切なものならびに任意的に他の医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
ａｇｅｎｔｓ）、製薬学的薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｇｅｎｔｓ）、安定剤、緩衝剤、担体、添加剤、希釈剤などの使用を含む。注入のために、担体は典型的に液体であろう。代表的な生理学的に許容され得る担体には発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）を含まない滅菌水及び発熱物質を含まない滅菌リン酸塩緩衝食塩水が含まれる。多様なそのような既知の担体が引用により本明細書に取り込まれる米国特許公開第７，６２９，３２２号明細書に提供されている。１つの態様において、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の態様において、担体は平衡塩溶液である。１つの態様において、担体はｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存するべき場合、それをグリセロール又はＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結する場合がある。

１つの代表的な特定の態様において、担体又は賦形剤の組成物は、０．０００１％－０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（ＰＦ６８）と一緒に１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰｉ，ｐＨ７．３を含む。緩衝剤の食塩水成分の正確な組成は、１６０ｍＭ～１８０ｍＭのＮａＣｌの範囲である。任意的に、特定的に説明される緩衝剤の代わりに異なるｐＨ緩衝剤（おそらくＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム、ＴＲＩＳ）が用いられる。さらにまた、０．９％のＮａＣｌを含む緩衝剤が有用である。

任意的に、本発明の組成物はｒＡＡＶ及び／又は変異体ならびに担体の他に、防腐剤又は化学的安定剤のような他の通常の製薬学的成分を含有すことがある。適切な代表的な防腐剤にはクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学的安定剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。

本明細書に説明されるような少なくとも１種の複製欠損ｒＡＡＶウイルスを含む製薬学的組成物を、遺伝子転移及び遺伝子療法用途における使用のために生理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤を用いて調製する場合がある。ＡＡＶウイルスベクターの場合、調製物又は懸濁液中に含有される用量の尺度としてゲノムコピー（”ＧＣ”）、ベクターゲノム（“ＶＧ”）又はウイルス粒子の定量を用いる場合がある。本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数の決定のために、当該技術分野において既知のいずれの方法を用いることもできる。ＡＡＶＧＣ数滴定を行うための１つの方法は以下の通りである：精製されたＡＡＶベクター試料を最初にＤｎａｓｅで処理して産生プロセスからのキャプシドでパッケージングされていないＡＡＶゲノムＤＮＡ又は汚染プラスミドＤＮＡを取り除く。次いでＤｎａｓｅ耐性粒子を熱処理に供してキャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムを、次いでウイルスゲノムの特定の領域（
通常ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを用いるリアルタイムＰＣＲにより定量する。別の方法において、最適化ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３導入遺伝子をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ関連ウイルスの有効な用量を、引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＳ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に説明されている通りに測定する。

本明細書で用いられる場合、「用量」という用語は、処置の経過中に被験者に送達される全用量あるいは１単位（又は複数単位若しくは分割用量（ｓｐｌｉｔｄｏｓａｇｅ））投与において送達される量を指す場合がある。製薬学的ウイルス組成物を、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで約１．０×１０⁶個のＧＣ～約１．０×１０¹⁵個のＧＣの
範囲内である量の本発明に説明されるＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列を保有する複製欠損ウイルスを含むように、投薬単位において調製する場合がある。一態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たり少なくとも１×１０⁷、２×１０⁷、３×１０⁷、４×１０⁷、５×１０⁷、
６×１０⁷、７×１０⁷、８×１０⁷、又は９×１０⁷ＧＣを含むように処方される。一態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たり少なくとも１×１０⁸、２×１０⁸、３×１０⁸、４×１０⁸、５×１０⁸、６×１０⁸、７×１０⁸、８×
１０⁸、又は９×１０⁹ＧＣを含むように処方される。１つの態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０⁹、２×１０⁹、３×１０⁹、４×１０⁹、５×１０⁹、６×１０⁹、７×１０⁹、８×１０⁹又は９×１０⁹個
のＧＣを含むように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０¹⁰、２×１０¹⁰、３×１０¹⁰、４×１０¹⁰、５×１０¹⁰、６×１０¹⁰、７×１０¹⁰、８×１０¹⁰又は９×１０¹⁰個のＧＣを含むように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０¹¹、２×１０¹¹、３×１０¹¹、４×１０¹¹、５×１０¹¹、６×１０¹¹、７×１０¹¹、８×１０¹¹又は９×１０¹¹個のＧＣを含むように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０¹²、２×１０¹²、３×１０¹²、４×１０¹²、５×１０¹²、６×１０¹²、７×１０¹²、８×１０¹²又は９×１０¹²個のＧＣを含むように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０¹³、２×１０¹³、３×１０¹³、４×１０¹³、５×１０¹³、６×１０¹³、７×１０¹³、８×１０¹³又は９×１０¹³個のＧＣを含むように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０¹⁴、２×１０¹⁴、３×１０¹⁴、４×１０¹⁴、５×１０¹⁴、６×１０¹⁴、７×１０¹⁴、８×１０¹⁴又は９×１０¹⁴個のＧＣを含むように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに少なくとも１×１０¹⁵、２×１０¹⁵、３×１０¹⁵、４×１０¹⁵、５×１０¹⁵、６×１０¹⁵、７×１０¹⁵、８×１０¹⁵又は９×１０¹⁵個のＧＣを含むように調製される。１つの態様において、ヒトへの適用のために用量は、すべての整数又は分数量を範囲内に含んで用量当たりに１×１０¹⁰～約１×１０¹²個のＧＣの範囲である場合がある。すべての用量は、例えば引用により本明細書に取り込まれるＭ．Ｌｏｃｋら、ＨｕｍＧｅｎｅＭｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ａｐｒ．２５（２）：１１５－２４．Ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１に説明されているｏｑＰＣＲ又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による測定を含むいずれかの既知の方法によって測定される場合がある。

これらの前記用量を、処置されるべき領域の寸法、用いられるウイルス力価、投与経路及び所望の方法の効果に応じて、すべての数を範囲内に含む約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の多様な容積の担体、賦形剤又は緩衝剤調製物中で投与する場合がある。１つの態様において、担体、賦形剤又は緩衝剤の容積は少なくとも約２５μＬである。１つの態様において、容積は約５０μＬである。別の態様において、容積は約７５μＬであ
る。別の態様において、容積は約１００μＬである。別の態様において、容積は約１２５μＬである。別の態様において、容積は約１５０μＬである。別の態様において、容積は約１７５μＬである。さらに別の態様において、容積は約２００μＬである。別の態様において、容積は約２２５μＬである。さらに別の態様において、容積は約２５０μＬである。さらに別の態様において、容積は約２７５μＬである。さらに別の態様において、容積は約３００μＬである。さらに別の態様において、容積は約３２５μＬである。別の態様において、容積は約３５０μＬである。別の態様において、容積は約３７５μＬである。別の態様において、容積は約４００μＬである。別の態様において、容積は約４５０μＬである。別の態様において、容積は約５００μＬである。別の態様において、容積は約５５０μＬである。別の態様において、容積は約６００μＬである。別の態様において、容積は約６５０μＬである。別の態様において、容積は約７００μＬである。別の態様において、容積は約７００～１０００μＬである。

１つの態様において、マウスのような小動物の被験者のために約１μＬ～約３μＬの容積において少なくとも１×１０⁷～約１×１０¹¹個のＧＣｓの用量でウイルスコンストラ
クトを送達する場合がある。ヒトの眼と大体同じ寸法の眼を有するより大きな獣医学的被験者のために、上記で述べた比較的多いヒト用の用量及び容積が有用である。種々の獣医学的動物への物質の投与のための実務指針の議論に関し、例えばＤｉｅｈｌら、Ｊ．ＡｐｐｌｉｅｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５－２３（２００１）を参照されたい。この文書は引用により本明細書に取り込まれる。

毒性、網膜異形成及び剥離のような望ましくない影響の危険を減らすために、最低有効濃度のウイルスその他の送達ビヒクルを用いるのが望ましい。処置されている被験者、好ましくはヒトの身体的状態、被験者の年齢、特定の眼疾患及びもし進行性なら疾患が現れた程度を考慮して、主治医によりこれらの範囲内のさらに別の用量が選ばれる場合がある。

本明細書に説明されるさらに別の側面は、コロイデレミアを有する又は発症する危険にある哺乳類被験者における失明の進行を処置、遅延又は停止するための方法である。１つの態様において、好ましくは生理学的に適合性の担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤中に懸濁されたＲＥＰ－１コドン最適化配列を保有するｒＡＡＶを、ヒトの被験者を含む所望の被験者に投与する場合がある。この方法は、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクター又はｒＡＡＶベクターあるいはそれらを含む組成物のいずれかを必要とする被験者投与することを含む。１つの態様において、組成物を網膜下に送達する。別の態様において、組成物を硝子体内に送達する。さらに別の態様において、眼疾患の処置に適した投与経路の組み合わせを用いて組成物を投与し、眼瞼静脈を介するかあるいは他の静脈内又は通常の投与経路を介する投与も含む場合がある。

本明細書に説明されるさらに別の側面は、色覚異常を有する又は発症する危険にある哺乳類被験者における失明の進行を処置、遅延又は停止するための方法である。１つの態様において、好ましくは生理学的に適合性の担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤中に懸濁されたＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３天然、改変又はコドン最適化配列を保有するｒＡＡＶを、ヒトの被験者を含む所望の被験者に投与する場合がある。この方法は、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクター又はｒＡＡＶベクターあるいはそれらを含む組成物のいずれかを必要とする被験者投与することを含む。１つの態様において、組成物を網膜下に送達する。別の態様において、組成物を硝子体内に送達する。さらに別の態様において、眼疾患の処置に適した投与経路の組み合わせを用いて組成物を投与し、眼瞼静脈を介するかあるいは他の静脈内又は通常の投与経路を介する投与も含む場合がある。

これらの方法における使用のために、各用量の容積及びウイルス力価は本明細書でさらに説明される通りに個別に決定され、同じ又は反対側の眼において行われる他の処置と同じか又は異なる場合がある。用量、投与又は管理は、本明細書の説明を与えられて主治医が決定する場合がある。１つの態様において、組成物は１個の罹患した眼において上記で挙げたものから選ばれる１回の用量で投与される。別の態様において、組成物は両方の罹患した眼において同時に又は連続的に、上記で挙げたものから選ばれる１回の用量として投与される。連続的投与は、１つの眼から他の眼への投与の数分、数時間、数日、数週間又は数か月の間隔の時間差を意味する場合がある。別の態様において、方法は組成物を２つ以上の用量において（例えば分割用量）眼に投与することを含む。別の態様において、同じ眼の異なる部分において複数の注入を行う。別の態様において、選ばれた発現カセット（例えばＣＨＭ含有カセット）を含むｒＡＡＶの２回目の投与を後のタイムポイントで行う。そのようなタイムポイントは、１回目の投与から数週間、数か月又は数年後の場合がある。１つの態様において、そのような２回目の投与は、１回目の投与からのｒＡＡＶと異なるキャプシドを有するｒＡＡＶを用いて行われる。別の態様において、１回目及び２回目の投与からのｒＡＡＶは同じキャプシドを有する。

さらに別の態様において、本発明に説明される組成物を１つの組成物又は複数の組成物において送達する場合がある。任意的に２種又はそれより多種のＡＡＶあるいは複数のウイルスを送達する場合がある［例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレット及び国際公開第２０１３／０４９４９３号パンフレットを参照されたい］。別の態様において、複数のウイルスは異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶ及びアデノウイルス）を含む場合がある。

本発明の一部の態様において、治療のために標的とされるべき杆体及び錐体光受容体の領域を同定するために、非－侵襲性網膜画像化及び機能性研究（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙ）を行うのが望ましい。これらの態様において、１回以上の網膜下注入のための正確な位置を決定するために、臨床的診断試験が用いられる。これらの試験は、処置されている被験者の種、それらの身体的状態又は健康ならびに用量に応じて網膜電図記録法（ＥＲＧ）、視野測定法、共焦点走査型レーザー眼底検査法（ｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｌａｓｅｒｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙ）（ｃＳＬＯ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による網膜の層のトポグラフィー的マッピング（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｍａｐｐｉｎｇ）及びその層の厚さの測定、補償光学（ＡＯ）を介する錐体密度のトポグラフィー的マッピング、眼の機能性検査（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｙｅｅｘａｍ）などを含む場合がある。画像化及び機能性研究の観点から、本発明のいくつかの態様において、罹患した眼の種々の領域を標的とするために、同じ眼において１回以上の注入が行われる。各注入の容積及びウイルス力価は本明細書でさらに説明される通りに個別に決定され、同じ又は反対側の眼において行われる他の注入と同じか又は異なる場合がある。別の態様において、眼全体を処置するために１回の比較的大きい容積の注入が行われる。１つの態様において、ｒＡＡＶ組成物の容積及び濃度は、損なわれた眼細胞の領域のみに影響を及ぼすように選ばれる。別の態様において、ｒＡＡＶ組成物の容積及び／又は濃度は、損なわれていない光受容体を含む眼のもっと大きい部分に達するために、もっと多量である。

本明細書に説明される方法の１つの態様において、本明細書に説明される組成物の１回の眼内送達、例えば最適化ＲＥＰ－１カセットのＡＡＶ送達は、コロイデレミアを発症する危険にある被験者における視覚喪失及び失明の予防において有用である。本明細書に説明される方法の別の態様において、本明細書に説明される組成物の１回の眼内送達、例えば最適化ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３カセットのＡＡＶ送達は、色覚異常を発症する危険にある被験者における視覚喪失及び失明の予防に有用である。

かくして１つの態様において、組成物を疾患の発症の前に投与する。別の態様において、組成物を視覚の損傷又は喪失の開始の前に投与する。別の態様において、組成物を視覚の損傷又は喪失の開始後に投与する。さらに別の態様において、罹患していない眼と比較して杆体及び／又は錐体あるいは光受容体の９０％未満が機能しているか又は残っている時に組成物を投与する。

別の態様において、方法は追加の研究、例えば処置の有効性の決定のための機能性及び画像化研究を行うことを含む。動物における検査のために、そのような試験は杆体及び錐体光受容体機能を見る網膜電図（ＥＲＧｓ）、視覚運動性眼振、瞳孔測定、水迷路試験、明－暗選択（ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、光干渉断層撮影（網膜の種々の層の厚さの測定のため）、組織学（網膜の厚さ、外顆粒層中の顆粒（ｎｕｃｌｅｉ）の列、導入遺伝発現を実証するための免疫蛍光法、錐体光受容体カウンティング、錐体光受容体シース（ｓｈｅａｔｈｓ）を同定するピーナツアグルチニンを用いる網膜切片の染色）を介する網膜及び視覚機能評価を含む。

ヒト被験者のために特定的に、本明細書に説明される用量の組成物の投与に続き、杆体及び錐体光受容体機能を検査するための網膜電図（ＥＲＧｓ）、瞳孔測定視力、コントラスト感度色覚試験（ｃｏｎｔｒａｓｔｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｃｏｌｏｒｖｉｓｉｏｎｔｅｓｔｉｎｇ）、視野試験（ハンフリー（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ）視野／ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎｎ）視野）、視野移動性試験（ｐｅｒｉｍｅｔｒｙｍｏｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔ）（障害物コース（ｏｂｓｔａｃｌｅｃｏｕｒｓｅ））及び読み取り速度試験を用いて処置の有効性に関して被験者を調べる。本明細書に説明される製薬学的組成物を用いる処置に続いて被験者をさらす他の有用な処置－後有効性試験は、機能性磁気共鳴画像化（ｆＭＲＩ）、全面光感度試験（ｆｕｌｌ－ｆｉｅｌｄｌｉｇｈｔｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ）、光干渉断層撮影を含む網膜構造研究、眼底写真、眼底自家蛍光、補償光学レーザー走査型眼底検査法、移動性試験、読み取り速度及び正確さの試験、マイクロペリメトリー（ｍｉｃｒｏｐｅｒｉｍｅｔｒｙ）及び／又は眼底検査法である。これら及び他の有効性試験は、引用により本明細書に取り込まれる米国特許第８，１４７，８２３号明細書；同時係属国際特許出願公開国際公開第２０１４／０１１２１０号パンフレット又は国際公開第２０１４／１２４２８２号パンフレットに説明されている。

さらに別の態様において、上記の方法のいずれかを別の又は二次的な治療と組み合わせて行う。さらに別の態様において、これらの眼疾患の処置の方法は、本明細書に詳細に説明される組成物を抗生剤処置、痛みの緩和処置などのような別の治療と組み合わせて用いて被験者を処置することを含む。追加の治療は、これらの突然変異又は欠陥あるいはそれらと関連するいずれかの影響を予防するか、止めるか又は改善することを助けるいずれかの現在既知の又はまだ未知の治療の場合がある。二次的な治療を上記の組成物の投与の前、それと同時又はその後に施す場合がある。１つの態様において、二次的な治療は、神経栄養因子、酸化防止剤、抗アポトーシス剤（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｇｅｎｔｓ）の投与のような網膜細胞の健康を保持するための非特異的な方法を含む。非特異的な方法はタンパク質、組換えＤＮＡ、組換えウイルスベクター、幹細胞、胎児組織又は遺伝子的に改変された細胞の注入を介して達成される。後者は、カプセル封入された遺伝子的に改変された細胞を含み得る。

１つの態様において、組換えｒＡＡＶの作製方法は、上記のＡＡＶ発現カセットを含むプラスミドを得、感染性ＡＡＶエンベロープ又はキャプシド中にＡＡＶウイルスゲノムをパッケージングすることを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下でプラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することを含む。ｒＡＡＶベクター作製の特定の方法は上記に説明され、それは上記及び下記の実施例中に説明される発現カセット及びゲノム中
のコドン最適化ＲＥＰ－１又はＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３を送達することができるｒＡＡＶベクターの作製に用いられる場合がある。

さらに別の態様において、本明細書に説明される発現カセットのいずれかを含むベクターを提供する。上記の通り、そのようなベクターは多様な起源のプラスミドであることができ、本明細書でさらに説明される組換え複製欠損ウイルスの作製のための一部の態様において有用である。

１つの別の態様において、ベクターは発現カセットを含むプラスミドであり、ここで発現カセットはＡＡＶ逆位末端反復配列及びＲＥＰ－１をコードするコドン最適化核酸配列及び宿主細胞におけるコードされるタンパク質の発現を方向付ける発現調節配列を含む。

別の態様において、ベクターは発現カセットを含むプラスミドであり、ここで発現カセットはＡＡＶ逆位末端反復配列及びＣＮＧＡ３をコードするコドン最適化核酸配列及び宿主細胞におけるコードされるタンパク質の発現を方向付ける発現調節配列を含む。

別の態様において、ベクターはＡＡＶ発現カセットを含むプラスミドであり、ここで発現カセットはＡＡＶ逆位末端反復配列及びＣＮＧＢ３をコードするコドン最適化核酸配列及び宿主細胞におけるコードされるタンパク質の発現を方向付ける発現調節配列を含む。

“ａ”又は“ａｎ”という用語は１つ又はそれより多くを指すことに注意するべきである。従って“ａ”（又は“ａｎ”）、「１つ又はそれより多く」（“ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ”）及び「少なくとも１つ」（“ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ”）は本明細書で互換的に用いられる。

「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”）、「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”）及び「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）という用語は排他的にではなく包含的に解釈されるべきである。「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔ”）、「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ”）という用語及びその変形は包含的にではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の種々の態様は「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）の語法（ｌａｎｇｕａｇｅ）を用いて提示されるが、他の状況下で、関連する態様は「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ”）又は「本質的にからなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ”）の語法を用いて解釈されるべきことも意図されており、そのように説明される。

本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、他に特定されなければ与えられる基準から１０％の変動を意味する。

「調節」という用語又はその変形は、本明細書で用いられる場合、生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する組成物の能力を指す。

本明細書で他に定義されなければ、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は、当該技術分野における通常の熟練者により、及び出版された本への参照により通常理解されると同じ意味を有し、出版された本は本出願中で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当該技術分野における熟練者に与える。

以下の実施例は例示のみであり、本発明を制限することを意図しない。

実施例１－多能性幹細胞のＲＰＥへの分化
コロイデレミアは関連するマウスモデルを欠いており、かつイヌモデルはなく、従って疾患のヒト網膜細胞モデルにおいて形質導入及び発現を調べる。生存する被験者から網膜細胞を得るのは不可能なので、人工多能性幹細胞からＲＰＥを作製する。引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＢｕｃｈｈｏｌｚら、ＲａｐｉｄａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＤｉｒｅｃｔｅｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｔｏＲｅｔｉｎａｌＰｉｇｍｅｎｔｅｄＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３；２：３８４－３９３により説明されているプロトコルを用い、多能性幹細胞をＲＰＥに方向付ける。引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＣｅｒｅｓｏら、ＰｒｏｏｆｏｆｃｏｎｃｅｐｔｆｏｒＡＡＶ２／５－ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｉｎｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄｒｅｔｉｎａｌ
ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｏｆａｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａｐａｔｉｅｎｔ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１４）１，１４０１１も参照されたい。ＲＰＥの作製のための他の方法は当該技術分野において既知である。

要するに、ヒト人工多能性幹細胞株を、マイトマイシンＣ－処理されたか又は照射されたマウス胚線維芽細胞支持細胞層上で、２ｍＭＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、２０％ノックアウトセラムリプレースメント（ｋｎｏｃｋｏｕｔｓｅｒｕｍｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、０．１ｍＭＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍＮｏｎ－ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ（ＭＥＭＮＥＡＡ）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール及び４ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦを含ダルベッコ変法イーグル培地：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で維持する。

ＩＸＢ２７、ＩＸＮ２及びＩＸＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で多能性幹細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に直接継代培養する。０日から２日に、５０ｎｇ／ｍｌＮｏｇｇｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ
Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌＩＧＦ１及び１０ｍＭニコチンアミドを基本培地に加える。２日から４日に、１０ｎｇ／ｍｌＮｏｇｇｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌＤｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌＩＧＦ１、５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ及び１０ｍＭニコチンアミドを基本培地に加える。４日から６日に、１０ｎｇ／ｍｌＤｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌＩＧＦ１及び１００ｎｇ／ｍｌＡｃｔｉｖｉｎＡ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を基本培地に加える。６日から１４日に、１００ｎｇ／ｍｌＡｃｔｉｖｉｎＡ、１０μＭＳＵ５４０２（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１ｍＭＶＩＰを基本培地に加える。基本培地のみ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７、Ｎ２及びＮＥＡＡ）中で対照標準実験を行う。

非－ＲＰＥ形態を有する細胞を削り取ることにより、細胞を機械的に濃縮する。続いてＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で５分間、残るＲＰＥを消化する（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）。細胞に３０－μｍのシングル－セルストレイナー（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ）を通過させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌがコーティングされた組織培養プラスチックＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜又はＣＣ２処理されたチャンバースライド上に播種する。濃縮された細胞を１％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ及びピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ－高グルコース中で３０日間培養する。

実施例２－ＡＡＶ－ＲＥＰ－１を用いて形質導入された細胞
要するに、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより、ＲＥＰ－１コドン最適化配列が導入されたＡＡＶ２／８ＣＭＶ．ＣＢＡ－ＲＥＰ－１ウイルスベクターを作製し、ポリエチレングリコールを用いていずれかの（ｅｉｔｈｅｒ）上澄み液からウイル
ス粒子を沈殿させる。例えば引用により本明細書に取り込まれるＧｕｏら、Ｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，Ｊ．ＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２０１２Ａｕｇ；１８３（２）：１３９－１４６を参照されたい。ベクターを二重ＣｓＣｌ遠心により精製し、透析し、ドットブロットアッセイにより滴定する。

プレニル化実験のために、ＲＰＥを２４－ウェルプレートに播種し、１．２×１０⁶個
の細胞をコンフルエント状態で概算する。細胞当たり１００，０００個のベクターゲノム（ｖｇ）を用いて細胞を形質導入し、形質導入から４週間後にプレニル化アッセイを行う。同じ条件の実験を３回繰り返して行う。

実施例３－プレニル化
上記で引用したＶａｓｉｒｅｄｄｙら、ＰｌｏＳＯｎｅ．２０１３Ｍａｙ７；８（５）：ｅ６１３９６に説明されている通りに、プレニル基ドナーとして［３Ｈ］－ゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ．Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用い、組換えＲａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ及びＲＡＢ２７の存在下で試験管内プレニル化アッセイを行う。ＲＡＢ２７タンパク質中への放射性標識プレニル基の導入をシンチレーションカウンターにより測定する。一貫性のために、対照標準値を１００に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）し、基本値として用いる。すべての実験を３回繰り返して行い、実験グループと対照標準グループの間のプレニル化の統計的な比較を両側非対スチューデントのテスト（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄｕｎｐａｉｒｅｄ
ｓｔｕｄｗｎｔ’ｓｔｅｓｔ）を用いて評価する。

要するに、形質導入されたＲＥＰ細胞を形質導入から４８時間後に冷ＰＢＳを用いて洗浄する。細胞ペレットを集め、冷ＰＢＳを用いて十分に洗浄する。ＲＩＰＡ＋プロテアーゼ阻害剤（ＲＩＰＡ＋Ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）を用いて氷上で３０分間、細胞を溶解する。別のプロトコルでは、細胞を超音波処理する。４℃において１－２時間に及ぶ７５，０００－１０００００ｇにおける細胞溶解液の遠心により、細胞質ゾル画分を集める。

プレニル化反応のための原液（ｓｔｏｃｋ）を以下の通りに調製する。

プレニル化のために用いられる最終的な反応容積は２５μＬである。

反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションする。９：１エタノール／ＨＣｌの添加により反応を停止させ、３０分間インキュベーションする。真空ろ過によりタンパク質をガラス繊維濾紙（Ｗｈａｔｍａｎｐａｐｅｒｓ）上に集める（０．１ｍｌ）。冷リン酸塩緩衝液を用いてフィルターを注意深く３回洗浄し、未結合材料を除去する。膜を注意深く乾燥する。フィルターを５ｍｌのシンチレーションカクテル中に入れ、シンチレーションカウンティングを行う。引用によりその全体が本明細書に取り込まれるＴｏｌｍａｃｈｏｖａら、ＣＨＭ／ＲＥＰ１ｃＤＮＡｄｅｌｉｖｅｒｙｂｙｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｐｒｏｖｉｄｅｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｎｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｏｆｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａｍｉｃｅ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２；１４－１５８－６８も参照されたい。

ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３の概念実証のためのアッセイは、自然発生の突然変異動物モデル（例えばＣｎｇａ３－／－マウス又はＡｗａｓｓｉヒツジ）の使用を含む場合がある。マウスモデルを「オール－錐体（ａｌｌ－ｃｏｎｅ）」光受容体マウスであるＮｒｌ－／－マウスと一緒に飼育し、二重ノックアウトを得ることができる。後者（Ｃｎｇａ３－／－Ｎｒｌ－／－）のマウスは有効性の同定を速める場合がある。有効性は視力及びコントラストの尺度である瞳孔測定（例えば視線運動学（ｏｐｔｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）を用いる）、網膜電図及び視覚行動により測定され得る。結局、組織学は他の尺度より向上した成果とともに導入遺伝子の発現を実証するであろう。組織学的方法は錐体光受容体への介入の効果を実証するためにも用いられるであろう（錐体光受容体の合計数、密度、位置など）。

上記で議論したコロイデレミアと同様に、ＣＮＧＡ３－又はＣＮＧＢ３－関連色覚異常のための遺伝子増強療法に関する概念実証のためのアッセイは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）モデルの使用を含む場合がある。ＣＮＧＡ３又はＣＮＧＢ３突然変異の故の色覚異常を有する被験者から作製されたｉＰＳＣモデルを、試験管内で網膜前駆体及び／又は光受容体細胞に分化させる。組換えＡＡＶを用いてこれらの細胞に野生型ＣＮＧＡ３（又はＣＮＧＢ３）ｃＤＮＡを送達し、これらのサブユニットにより構成される関連する（環状ヌクレオチド－感受性、ＣＮＧ）チャンネルの生合成及び機能の保存に関して細胞を分析する。膜パッチについての電気生理学によりチャンネル機能を評価する。チャンネルの復元はｃＧＭＰ－活性化電流をレスキューするはずである。追加の研究は、生理学的リガンドへの野生型ＣＮＧｃＤＮＡの送達の前後のチャンネル機能の感度に関して調べること
ができる。

実施例４：ＡＡＶ．コドン最適化ヒトＣＨＭの試験管内発現
この研究の目的は、コドン最適化ＣＨＭ遺伝子（配列番号１）をコードする一系列の次世代ＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクターを用いる遺伝子送達後の８４－３１及びＣＯＳ－７細胞株におけるＡＡＶ媒介ＣＨＭ発現の能力を評価することであった。

ＣＨＭの発現を最大にするために、コドン最適化ＣＨＭ配列を作製した（配列番号１）。コドン最適化プラスミドを合成し、すべての次世代ＣＨＭ導入遺伝子発現カセットの作製において用いた。起こり得る非－機能性ＡＡＶゲノムの汚染の問題を克服するために、ベクター主鎖中に非－コードラムダスタッファー領域が含まれた。スタッファーの導入はプラスミドの長さを増加させるのみでなく、ＡＡＶをパッケージングする間のプラスミドＤＮＡ主鎖汚染の可能性を減少させもする。プラスミドＤＮＡ不純物を除去するためのベクター主鎖におけるスタッファー領域の導入の影響は、独立した研究として行われた。２つの組換えＡＡＶプロウイルスプラスミド（高コピー及び低コピー）主鎖を用いて、種々のコンストラクトを作製した。高コピープラスミドはｐＵＣベクター起源（ｏｒｉｇｉｎ）に基づいて設計された。低コピープラスミドはｐ１５Ａ起源に基づいて設計された。正しい開始コドンからの翻訳をさらに増強するために、開始コドンの上流にコザック配列を導入した。

本研究及び以下の実施例中に説明される研究のために合計で４つのプラスミドを作製した（表１）。さらに、現在臨床試験で用いられているＣＨＭ天然配列を保有するプラスミドも作製した（バージョン１）。バージョン２ａ、２ｂ、３ａ及び３ｂならびにバージョン１のそれぞれに関するプラスミドマップをそれぞれ図６－１０に示す。

これらのコンストラクトの試験管内発現をＣＯＳ－７及び８４－３１細胞株において調べた。次世代ＣＨＭコンストラクトの操作された特徴を表１に説明する。

コドン最適化ヒトＣＨＭｃＤＮＡ（ｈＣＨＭ）（配列番号１）を導入遺伝子カセット中にクローニングすることにより、組換えＡＡＶプロウイルス高コピープラスミド及び低コピープラスミドを作製した。導入遺伝子はハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの調節下に置かれた。このプロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター及びイントロン１配列に挟まれたＣＢＡエキソン１からなる。プロウイルス高コピー数プラスミド及び低コピー数プラスミドはＡＡＶ逆位末端反復配列及びポリＡ配列も含む。現在の研究に用いられる次世代プラスミド主鎖はラムダファージフラグメントスタッファーを含み、それにカナマイシン
バクテリア選択遺伝子（ｋａｎａｍｙｃｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
ｇｅｎｅ）が続く。追加のプラスミドはスタッファーを欠いているが、カナマイシン選択遺伝子を含む。高－コピー数ベクターはｐＵＣプラスミドのそれに類似である（バクテリア細胞当たりに約３００個のコピー）。低コピー数プラスミド（バクテリア細胞当たりに約１０個のコピー）はｐ１５Ａを起源とする。正しい開始コドンからの翻訳を増強するために、すべての次世代コンストラクトは開始コドン、ＡＴＧの上流にコザック共通配列を含む。作製されたプラスミドを、プロモーター＋エンハンサー伸長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）配列又はコドン最適化ＣＨＭ配列のいずれかを特異的に標的とすることができるプライマーを用いて配列検証する。５つのコンストラクトすべてのプラスミドマップ及び配列を図６－１０に示す。リン酸カルシウムを用いる標準的な三重トランスフェクションを用いて下記に挙げるＡＡＶベクターを作製した（ベクターの定性（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関して表２を参照されたい）。ＡＡＶ２及びＡＡＶ８血清型のベクターの両方を作製し、結果が血清型－非依存性であることを確かめた。

８４－３１細胞株は２９３ＨＥＫ細胞株（ヒト胚腎臓細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓ））のサブクローンであり、アデノウイルスＥ４タンパク質を構成的に発現してＡＡＶウイルスの形質導入を増強する。ＣＯＳ－７細胞はサル腎臓組織に由来する線維芽細胞様細胞株である。８４－３１細胞及びＣＯＳ－７細胞の両方を６－ウェル細胞培養プレートにおいて別々に培養し、５種類の感染多重度（ＭＯＩｓ）で１０の試験物質（ｔｅｓｔａｒｔｉｃｌｅｓ）（ＡＡＶ２又はＡＡＶ８のいずれか）の１つを用いて形質導入した。３６－４８時間後、細胞を回収し、溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び続くウェスタンブロット分析のためにタンパク質試料を調製し、外来性ＣＨＭの発現を検出した。

５％ＣＯ₂が供給される環境において３７℃で、１０％胎仔ウシ血清及び１％ペニ
シリン／ストレプトマイシンを有するダルベッコ変法イーグル培地ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－高グルコース中で８４－３１及びＣＯＳ－７細胞の両方を培養した。形質導入の前日（１８－２４時間前）、３×１０⁵（３Ｅ５）の密度における細胞を６
－ウェル細胞培養皿の各ウェル中の２ｍｌの細胞培地中に播種した。播種された細胞を５％ＣＯ₂が供給される環境において３７℃でインキュベーションした。ＣＯＳ－７及び８
４－３１細胞の両方のウェルを下記に挙げるＡＡＶベクターに種々の感染多重度（ＭＯＩ）において感染させた（表３及び表４）。陰性対照標準細胞（形質導入されない細胞）にはウイルスを加えなかった。要するに、組織培地を除去し、新しい２ｍｌの培地のアリコートを６ウェル培養皿の各ウェルに加えた。次いであらかじめ決定された量のＡＡＶベクターを測定し（原液から直接）、各ウェルに加えた（表３及び表４）。１×１０⁴のＭＯ
Ｉのために、それぞれのウイルス原液の１μＬを細胞培地で１０μＬに希釈した。この溶
液からあらかじめ決定された容積のウイルスを各ウェルに加えた（表３及び４）。５％ＣＯ₂を用いて３７℃において、細胞をＡＡＶウイルスと一緒に回収まで３６－４８時間イ
ンキュベーションした。異常に関する検査のために、回収の前に細胞を顕微鏡下で観察した。

最初に、ＣＯＳ７及び８４－３１細胞株の両方を用いて、ＣＨＭの試験管内発現が細胞株非依存性であるかどうかを調べた。非依存性を確定したら、ＡＡＶを用いる優れた形質導入効率を示した８４－３１細胞のみにおいてすべての後続の実験を行った。８４－３１細胞のウェルを下記に挙げるＡＡＶベクターに種々のＭＯＩにおいて感染させた（表３及び４を参照されたい）。

ウェスタンブロット分析：１．細胞溶解液を調製した。感染から３６－４８時間後に、
ＡＡＶ形質導入された細胞を未処理の対照標準細胞と共に、十分なＰＢＳ洗浄の後に回収した。次いでプロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液を用いて、細胞を氷上で溶解した。１３，０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心により細胞溶解液を透明にした。２．タンパク質の定量及び調製。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＭｉｃｒｏＢＣＡＴＭＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔを用い、製造者の指示に従って細胞溶解液のタンパク質定量を行った。５６２ｎｍにおけるＯＤ読み取り値を得ることにより、タンパク質濃度を決定した。ＣＨＭの試験管内発現を評価するために、４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上に４０－６０μｇの測定されたタンパク質を負荷した。３．既知のプロトコルに従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びブロッティングＳＤＳ－ＰＡＧＥならびにウェスタンブロット分析を行った。要するに、タンパク質ゲルをニトロセルロース膜上に転移させ、ミルク中でブロッキングし、一次抗体と一緒にインキュベーションした。抗ヒトＲＥＰ－１２Ｆ１抗体（２Ｆ１，１：１０００希釈）及び以下：抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１０００希釈）、抗アクチン抗体（１：１０００希釈）又は抗チューブリン抗体（１：５０００希釈）の１つを各ブロットのための一次抗体として用いた。ブロットの洗浄後、１：５０００の濃度におけるＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧ抗体及び／又は抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた。製造者の指示に従ってＥＣＬ試薬を用いる化学発光により、ブロットを発光させた。対照標準：１．負荷対照標準：以下：抗アクチン抗体、抗チューブリン抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体の１つを、ゲルの各ウェル中のタンパク質の等しい負荷を示すために負荷対照標準として用いた。抗チューブリン抗体は～５１ｋＤａのタンパク質を検出し、抗アクチン抗体は～４２ｋＤａのタンパク質を検出し、抗ＧＡＰＤＨ抗体は～３９ｋＤａのタンパク質を検出する。抗チューブリン抗体又は抗アクチン抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体のいずれかをそれらの利用可能性に応じて用いて最初のブロットを調べた（ｐｒｏｂｅｄ）。最初の実験の後、一貫性のために、抗ＧＡＰＤＨ抗体を負荷対照標準として用いた。２．陽性対照標準：ＡＡＶ２．Ｖ２ａ形質導入されたＣＯＳ－７細胞においてｈＲＥＰ－１タンパク質の産生が確定した後、後のウェスタンブロット実験における陽性対照標準としてＡＡＶ２．Ｖ２ａ－Ｃｏｓ－７細胞溶解液を用いた。３．陰性対照標準：陰性対照標準として未処理の細胞を用いた。種々の細胞株におけるＲＥＰ－１タンパク質産生のウェスタンブロット結果の分析を表．５にまとめる。

モノクローナルヒトＲＥＰ－１特異的抗体は、次世代ＡＡＶ２．ｃｏｐｔ．ＣＨＭ／ＡＡＶ８．ｃｏｐｔ．ＣＨＭを用いて形質導入された細胞において１つの～７５－８０ｋＤａ単一ｈＲＥＰ－１タンパク質を検出した。未処理対照標準細胞の細胞溶解液において７５－８０ｋＤａバンドは観察されなかった。抗アクチン／抗チューブリン／抗ＧＡＰＤＨ抗体のいずれかを用いるブロットの探査は、未処理の対照標準を含んでウェスタンブロットのすべての列において等しい濃度のバンドを示した。抗アクチン抗体は～４２ｋＤａにおけるタンパク質分子量バンドを検出し、抗チューブリン抗体は～５１ｋＤａにおけるタンパク質を検出し、抗ＧＡＰＤＨ抗体は～３９ｋＤａにおけるタンパク質を検出した。すべての抗体は予測されるサイズ分子量の特異的なバンドのみを検出した。ブロットのいずれにおいても非特異的なバンドは観察されなかった。あらかじめ染色された分子量マーカーを用い、問題のタンパク質の分子量を比較した。

要するに、ＡＡＶ２．Ｖ２ａ、ＡＡＶ２．Ｖ２ｂ、ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．Ｖ３ａ及びＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．Ｖ３ｂを用いて形質導入されたＣＯＳ－７及び８４－３１細胞においてＲＥＰ－１タンパク質は予測されたサイズで観察された。未処理の対照標準は予測されたサイズのヒトＲＥＰ－１タンパク質の存在を明らかにしなかった。抗アクチン抗体を用いるブロットの標識は、ゲルのすべての列において～４２ｋＤａで同じ強度のタンパク質バンドを検出した。あらかじめ染色されたタンパク質ラダーを用い、ＲＥＰ－１及びアクチンの分子量を比較した。データは示されない。

結果は、次世代プラスミドを含むＡＡＶ２及びＡＡＶ８血清型ベクターが８４－３１及びＣＯＳ－７細胞を有効に形質導入することができることを示している。次世代プラスミドにおけるＣＨＭの発現は検出可能な範囲内であり、用量依存的傾向を示した。次世代ｈＣＨＭウイルスを用いる細胞の形質導入は、予測されるサイズのＲＥＰ－１タンパク質の
産生をもたらした。

実施例５：ＡＡＶ．コドン最適化．ヒトＣＨＭとＡＡＶ天然．ヒトＣＨＭの試験管内タンパク質発現の比較
この研究の目的は、８４－３１細胞株に基づく研究モデルにおけるＲＥＰ－１タンパク質のレベルを測定することにより、ＣＨＭ－含有導入遺伝子カセットの種々のバージョンを含むＡＡＶベクター（血清型２及び８）の形質導入効率を説明する（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）ことであった。

プラスミド及びベクター：合計５つの導入遺伝子プラスミドをＡＡＶ２又はＡＡＶ８のいずれかにおいて比較した：バージョン１（進行中の臨床試験において以前に用いられていた）及び４つの次世代バージョン（Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ３ａ及びＶ３ｂ）。実施例４に説明される通りにプラスミドが作成され、それらの特徴を表１に示す。上記の表２は作製されるＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクターのまとめ及びウイルス原液の濃度を示す。

研究設計（例えば処理グループ）
１．パイロット実験において、ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．バージョン１、バージョン２ａ及びバージョン２ｂを用いてＣＯＳ－７及び８４－３１細胞を形質導入した。ウェスタンブロットを行い、２つの細胞株における形質導入効率レベルを比較した。

２．１０の試験物質（ＡＡＶ２又はＡＡＶ８背景のいずれか中のバージョン１、２ａ、２ｂ、３ａ及び３ｂ）の１つを３×１０⁵のＭＯＩにおいて用い、６－ウェルプレート中
で培養された８４－３１細胞を形質導入した。３６－４８時間後、細胞を回収し、溶解した。細胞溶解液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上に負荷し、さらなるウェスタンブロット分析に供した。ＲＥＰ－１タンパク質のレベルをすべてのコンストラクトバージョンの間で比較する。各ＡＡＶ２．ＣＨＭ又はＡＡＶ８．ＣＨＭ実験のために２つの別々のプレートを用意し、個別に分析した。

試験材料投与
３．４．１細胞培養
５％ＣＯ₂が供給される環境中で３７℃において、１０％胎仔ウシ血清及び１％ペニシ
リン／ストレプトマイシンを有するダルベッコ変法イーグル培地ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）－高グルコース中で８４－３１細胞及びＣＯＳ－７の両方を培養した。

３．４．２形質導入のための細胞の調製
形質導入の前日（１８－２４時間前）、８４－３１及びＣＯＳ－７細胞を６－ウェル細胞培養皿のウェル当たり２ｍｌの細胞培地中に３×１０⁵（３Ｅ５）の密度で播種した。
播種された細胞を５％ＣＯ₂が供給される環境において３７℃でインキュベーションした
。

３．４．３形質導入
８４－３１細胞及びＣＯＳ－７のウェルを、下記に説明されるＡＡＶベクターに３×１０⁵のＭＯＩにおいて感染させた（パイロット実験に関して表６、第２組の実験に関して
表７を参照されたい）。陰性（形質導入されない）対照標準にはウイルスを加えなかった。要するに、６ウェル細胞培養皿中の各ウェルにおいて最初に組織培地を除去し、ウェル当たり２ｍｌの新しい培地で置き換えた。次いであらかじめ決定された量のＡＡＶベクター（形質導入のために用いられるベクター容積に関し、表２を参照されたい）を（原液から）測定し、各ウェルに直接加えた。５％ＣＯ₂を用いて３７℃において、細胞をＡＡＶ
ウイルスと一緒に回収まで３６－４８時間インキュベーションした。回収前に、異常の検査のために細胞を顕微鏡下で観察した。実施例４に説明した通りにウェスタンブロット分
析を行った。

結果：８４－３１及びＣＯＳ－７細胞における天然ｈＣＨＭ（ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．Ｖ１）対コドン最適化ＣＨＭＡＡＶ２ａ及び２ｂバージョンの発現の比較
この実験において、ベクターなしで（未処理対照標準）、ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．バージョン１、ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．バージョン２ａ又はＡａｖ２．ｈＣＨＭ．バージョン２ｂを用いて８４－３１及びＣＯＳ－７細胞を形質導入した。抗ヒトＲＥＰ－１抗体を用いるウェスタンブロット分析は、すべてのＡＡＶ２（Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ）形質導入試料において、かつ両方の細胞株においてＲＥＰ－１タンパク質レベルが～７５－８０ｋＤａにおいて検出可能であることを示した（データは示されない）。８４－３１細胞株においてわずかに優れたタンパク質発現が見られた（表８）。抗ＲＥＰ１抗体は、未処理の細胞において無視し得る量のＲＥＰ－１タンパク質を検出した。ＧＡＰＤＨ抗体を用いるブロットの標識は、未処理の細胞を含むすべての細胞溶解液中で～３９ｋＤａにおけるバンドを検出した。

ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いるブロットの濃度測定的評価（タンパク質レベルの定量）は、値を内在性ＧＡＰＤＨタンパク質の発現に正規化した後、形質導入効率は８４－３１及びＣＯＳ－７細胞において類似であることを示した。（結果に関して表８を参照されたい）。これに基づき、ヒト起源からのものである８４－３１細胞株をさらなる実験のために用いた。

結局、ＡＡＶ２．Ｖ１、ＡＡＶ２．Ｖ２ａ及びＡａｖ２．Ｖ２ｂは８４－３１及びＣＯＳ－７細胞の両方において、ＲＥＰ－１タンパク質の産生を類似の形質導入効率で誘導した。

８４－３１細胞における天然ＣＨＭ対コドン最適化ＣＨＭＡＡＶ２ベクターの発現の比較：ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．Ｖ２ａ、Ｖ３ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ３ｂ及びＶ１を用いて形質導入された８４－３１細胞の抗ヒトＲＥＰ－１抗体を用いるウェスタンブロット分析は、すべての条件において～７５－８０ｋＤａにおけるバンドを検出した（データは示されない）。抗ＲＥＰ１抗体は、未処理の細胞において無視し得る量のＲＥＰ－１タンパク質を検出した。ＧＡＰＤＨ抗体を用いるブロットの標識は、未処理の細胞を含むすべての細胞溶解液中で～３９ｋＤａにおけるバンドを検出した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いるブロットの濃度測定的評価（発現レベルの定量）は、値を内在性ＧＡＰＤＨタンパク質の産生に正規化した後、ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．Ｖ１と比較してＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．Ｖ２ａ、３ａ、２ｂ及び３ｂの発現増加を示した。結果に関して表９及び１０を参照されたい。

８４－３１細胞における天然ＣＨＭ対ＡＡＶ８．Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ３ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ３ｂベクター中のコドン最適化ＣＨＭの発現の比較：ＡＡＶ８．Ｖ１、ＡＡＶ８．Ｖ２ａ、ＡＡＶ８．Ｖ３ａ、ＡＡＶ８．２ｂ、ＡＡＶ８．３ｂを用いて形質導入された細胞の抗ヒトＲＥＰ－１抗体を用いるウェスタンブロット分析は、形質導入された細胞のすべてにおいて～７５－８０ｋＤａにおけるバンドを検出した（データは示されない）。抗ＲＥＰ１抗体は、未処理の細胞において無視し得る量のＲＥＰ－１タンパク質を検出した。ＧＡＰＤＨ抗体を用いるブロットの標識は、未処理の細胞を含むすべての細胞溶解液中で～３９ｋＤａにおけるバンドを検出した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いるブロットの濃度測定的評価は、ＡＡＶ８．Ｖ１と比較してＡＡＶ８．ｈＣＨＭ．Ｖ２ａ；３ａ；２ｂ；３ｂのより高い発現を示した。値は、ＣＨＭ値を最初にそれぞれの内在性ＧＡＰＤＨタンパク質の発現に正規化し、次いでバージョン１の平均の発現レベルに正規化した後に得た。結果に関し、表１１及び表１２を参照されたい。

結論：比較発現研究は、８４－３１細胞において、次世代ＡＡＶ．ｈＣＨＭ．バージョン２ａ、２ｂ、３ａ及び３ｂを保有するＡＡＶベクターの適用がＡＡＶ２及びＡＡＶ８血清型ベクターの両方において、バージョン１（現在臨床試験で用いられている）と比較してＲＥＰ－１タンパク質産生の増加を誘導することを示した。

実施例６：ｑＰＣＲ力価分析（ｑＰＣＲＴｉｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓ）によるＡＡＶベクター産生へのラムダスタッファーの効果の評価
ＤＮＡ不純物の量へのラムダスタッファー配列の効果を評価するために、上記の表２に示される８つのＡＡＶベクターのすべてについて１回のｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行った。アッセイ標準の作製に線状化ＡＡＶプラスミド標準を用いた。正しくパッケージングされたＡＡＶゲノムの定量のためにＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター領域又は逆パッケージングのためにカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）コード領域のいずれかの上にプライマー－プローブセットを設計した。標準及びベクター試料を、ＣＭＶ／ＣＢＡプライマー－プローブセットを用いる１つ及びＫａｎＲセットを用いる他の２つのセットにおいて実験した。各標準曲線のそれぞれからベクター試料値（ｍＬ当たりのウイルスゲノムコピー）を決定した。ＣＭＶ／ＣＢＡ含有配列に対して各ベクターロット中のＫａｎＲ－含有不純物の相対的な量を比較することにより、スタッファー配列の効果を評価した。試薬：
導入遺伝子－含有ウイルスベクター力価：
参照標準：ＣＭＶ－ＣＢＡプロモーター
プライマー：ＣＭＶ－Ｆ：ＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡ
ＣＭＶ－Ｒ：ＧＣＣＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＡＡ
ＦＡＭ－プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＣＡＴＡＡＴＧＣＣ／ＺＥＮ／ＡＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／
不純物－含有ウイルスベクター力価：
参照標準：カナマイシン耐性遺伝子
プライマー：
ＫＡＮ－Ｆ：ＧＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＴＡＡ
ＫＡＮ－Ｒ：ＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴ
ＦＡＭ－プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＣＣＧＴＣＡＧＣＣ／ＺＥＮ／ＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＣＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／
希釈試薬：希釈剤Ｑ（ヌクレアーゼ非含有水中の０．００１％ＰＦ－６８）：無菌水を用いて１％ＰＦ－６８溶液を１０００－倍に希釈。希釈剤Ｓ：希釈剤Ｑ＋２ｎｇ／μＬサケ精子ＤＮＡ（ＡｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣａｔ＃２０１１９０）。ＡＢＩＴａｑＭａｎＴＭＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０４４３７／４３２６７０８）
ＱｕｉａｇｅｎＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ２８１０４）
・ＡＢＩＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ＦｌｅｘＳｙｓｔｅｍ

試料調製
以下：Ｄｎａｓｅ緩衝液（１０Ｘ）５μＬ、ヌクレアーゼ非含有Ｈ₂Ｏ３０μＬ、
ＤｎａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０６８－０１５）５μＬを混合することにより、Ｄｎａｓｅ消化（ｄｉｇｅｓｔ）溶液を調製した。

１０μＬの各ＡＡＶベクター試料を混ぜ入れ、周囲温度で１０分間インキュベーションした。５０μＬのＳＤＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＣｌ溶液（０．２％ＳＤＳ／５ｍＭＥＤＴＡ／０．２ＭＮａＣｌ）の添加により消化混合物を不活性化し、９５℃で１０分間インキュベーションした。各ＡＡＶベクター試料をｑＰＣＲ分析のために希釈剤Ｓ中で１０－１００，０００倍に希釈した。

ｑＰＣＲ標準調製
ＸｈｏＩを用いてプラスミドｐ１００８（スタッファーなしの低コピー導入遺伝子プラスミド）を消化し、ＱｕｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて精製することにより、参照標準ＤＮＡ（線状化）を調製した。精製された材料をアガロースゲル上で分析して身元を確認し、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより定量した。以下の等式（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）：１ｂｐ＝１．０９６×１０^-21ｇを用いてＤＮＡコピー数を原液濃度から決定した。ｑＰ
ＣＲ標準を以下の表に従って調製した：

ＰＣＲ反応設定
抽出されたＤＮＡ試料を１回のｑＰＣＲ実験において同じ条件の実験を３回繰り返して（３つのウェル）分析した。実験は参照ＤＮＡ標準をウェル当たり１０３～１０８個のコピーの範囲で含み、同じ条件を実験を３回繰り返した。陰性対照標準としてテンプレートなしの対照標準（ｎｏ－ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＴＣ）を含んだ。ＣＭＶ／ＣＢＡ及びＫａｎＲプライマー／プローブセットの両方を用いて各ＡＡＶベクター調製物を分析した。同様に、各セットの定量のために、標準もＣＭＶ／ＣＢＡ及びＫａｎＲプライマー／プローブセットの両方を用いて分析した。

ＰＣＲ反応条件を以下の通りに設定した：５０℃ ２分１サイクル；９５℃ １０分
１サイクル；９５℃ １５秒４０サイクル；６０℃ １分４０サイクル
実験性能。ウェル当たり１０３～１０８個のＤＮＡコピーにおいて標準を調製し、実験した。この実験のためにアッセイ感度は重要な因子ではないので、アッセイの下限を１０００個のコピーに設定した。標準コピー数及び標準のＣＴ（閾サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ））値を用いて実験に関する標準曲線を作成した。ＡＢＩソフトウェアを用いて標準の線形回帰を行った（データは示されない）。標準曲線適合は、０．９９８かそれより大きい相関係数（Ｒ２値）を有し、信頼性のある適合モデルを示した。標準曲線の傾きは－３．５であった。傾きを用いて増幅反応の効率を算出し、－３．２～－３．６の値は９０％～１１０％の増幅効率を示した。両方の標準反応は９２．６～９３．８％の高率で行われた（ｒｕｎ）。三重のウェルの精度は２～１０％の範囲であり、複製産物の間の優れた一致を示した。テンプレートなしの対照標準（ＮＴＣ）は、アッセイの下限より低い定量不可能な増幅を生じた。

結果：
試料値決定：試料値（ＡＡＶゲノム及び逆－パッケージングコピー数）を、ＣＴ値を用いて各適合標準曲線（ＣＭＶ／ＣＢＡ又はＫａｎＲ）から内挿した。内挿されたＤＮＡコピー数を初期希釈及び／又は消化希釈に関して修正した。試料中の二本鎖ＤＮＡ標準及び一本鎖ＤＮＡの間の差を説明するために補正係数２を追加で適用した。

８つのＡＡＶベクターに関する分析結果を、導入遺伝子－含有ＡＡＶ濃度（ＣＭＶ／ＣＢＡ）及びＫａｎＲ－含有不純物濃度の間の定量的な比較と一緒に下記の表にまとめる。結果の分析は、導入遺伝子中へのラムダスタッファーの挿入がＡＡＶ産生の間にプラスミド－主鎖ＤＮＡ（すなわちＫａｎＲ）パッケージングの発生を～７－２０倍有効に減少させることを示す（図１１）。

実施例６：ウェスタンブロットによるｉＰＳ細胞における次世代ＡＡＶ８ベクターの試験管内発現
この研究の目的は、コドン最適化ＲＥＰ－１－コード遺伝子を保有する一系列の次世代ＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクターを用いる遺伝子送達の後の人工多能性細胞株（ｉＰＳＣ）におけるＡＡＶ媒介ＣＨＭ発現の能力を評価することであった。

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞法は、眼疾患を含むいくつかの概念実証及び遺伝子療法研究において、遺伝子療法ベクターの試験のためのプラットフォームとして用いられて成功してきた。これらの被験者特異的なｉＰＳ細胞は、疾患の病因の研究及び関連する動物モデルが入手不可能である場合に遺伝子療法の概念実証の試験用のモデルの確立のための有用な試験管内モデル系を与える。コロイデレミア（ＣＨＭ）のための我々のＡＡＶ－媒介遺伝子増強療法を試験するための予備的な段階として、我々はＲａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ－１）をコードする原因遺伝子ＣＨＭにおける突然変異を有するヒト被験者からｉＰＳ細胞を作製した（実施例１を参照されたい）（方法はＮＣＰ．００３に説明されている）。作製されるｉＰＳ細胞を用いて我々の次世代ＡＡＶ．コドン最適化．ＣＨＭコンストラクトの試験管内発現を評価した。

プラスミド及びベクターは実施例４に説明された通りであった。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は体細胞、末梢血単核細胞から実験室で作製される幹細胞であり、それは初期化されて多能性状態に戻された。血液細胞の初期化は治療的用途のための個別化された試験管内細胞モデルの開発を可能にする。この報告において、ウェスタンブロット分析を介してＲＥＰ－１タンパク質の試験管内在性産を調べるために、ＣＨＭに罹患した被験者からのｉＰＳ細胞を用いた。以下の表（表１７）は、研究されたｉＰＳ細胞の詳細及びそれらのそれぞれのＣＨＭ疾患を引き起こす突然変異を説明する。

研究設計（例えば処理グループ）
１．１２ウェル細胞培養プレート上で培養されたｉＰＳ細胞をＡＡＶ２．ｈＣＨＭバージョン１、バージョン２ａ；バージョン２ｂ；バージョン３ａ；バージョン３ｂ（ＡＡＶ２．Ｖ１；Ｖ２ａ；Ｖ２ｂ；Ｖ３ａ；Ｖ３ｂ）に１×１０⁵又は３×１０⁵のいずれかのＭＯＩにおいて感染させる。２４時間の形質導入の後、１ｍｌのｉＰＳ細胞培地を細胞に加えた。３６－４８時間の形質導入の後、細胞を回収し、溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び続くウェスタンブロット分析のために処理した。すべてのバージョンのコンストラクトを用いて形質導入された細胞においてＲＥＰ－１タンパク質の産生を評価し、未処理の対照標準と比較した。

２．パイロット実験として、１２ウェル細胞培養プレート上で培養された３種のｉＰＳ細胞株を、ＡＡＶ８．ｈＣＨＭバージョン１及びＡＡＶ８．ｈＣＨＭバージョン２ａ（ＡＡＶ８．Ｖ１；ＡＡＶ８．Ｖ２ａ）を用いて１×１０⁶のＭＯＩで形質導入する。ｉＰＳ
細胞株は、ＲＥＰ１遺伝子における無関係な突然変異を有する３人のＣＨＭに罹患した被験者に由来し、この目的のために個別のプレートで培養された。３６－４８時間後、細胞を回収し、溶解し、未処理の細胞溶解液と比較されるウェスタンブロット分析に供した。

試験材料投与
３．４．１細胞培養
ＣＨＭ被験者からのｉＰＳ細胞の培養。要するに、５％ＣＯ₂及び５％Ｏ₂が供給される環境中で３７℃において、ｉＰＳ細胞培地中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ、支持細胞）上でｉＰＳ細胞を培養した。

３．４．２形質導入のための細胞の調製
細胞を播種する前日、１２－ウェル皿に、参照文献ＮＣＰ．００３（ＮＣＰ．００３：ＣｕｌｔｕｒｉｎｇｏｆｉＰＳｃｅｌｌｓｆｒｏｍＣＨＭｐａｔｉｅｎｔａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｓ）に説明されているＭａｔｒｉｇｅｌをコーティングした。それぞれＡＡＶ２又はＡＡＶ８ウイルスベクターを用いてｉＰＳ細胞を形質導入する前に、ＭＥＦｓ上で培養されている細胞をＭＥＦｓなしのＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種した（支持細胞なしの培養）。１２－ウェル細胞培養皿の各ウェル中の１ｍｌのｉＰＳ細胞培地に４．５×１０⁵（４．５＋Ｅ５）～６×１０⁵個の密度で細胞を播種した。播種された細胞を５％ＣＯ₂，５％Ｏ₂が供給される環境中で３７℃においてインキュベーションした。

３．４．３形質導入
ｉＰＳ細胞をウイルスベクターに感染させるために、細胞を約５０－６０％コンフルエントまで生育させた。（これは支持細胞なしの条件で２－４日かかり得る）。５０－６０％コンフルエントに達したら、１２－ウェル中の１つのウェルを分離し、細胞カウントを行ってウェル当たりの細胞数の合計を決定した。次いでｉＰＳ細胞のウェルを下記に挙げるＡＡＶベクターに、あらかじめ決定されたＭＯＩ（表１８及び１９を参照されたい）で感染させた。形質導入の前に、古いｉＰＳ細胞培地をプレートから除去し、各ウェルに新しい１ｍｌのｉＰＳ細胞培地を加えた。原液からあらかじめ決定された容積のウイルスを直接各ウェルに加えた。感染した細胞数の合計、ＭＯＩ及び感染のために用いられたウイルスの容積についての情報に関し、表１８及び表１９を参照されたい。次いで５％ＣＯ₂
，５％Ｏ₂が供給される環境中で３７℃において、細胞を１８－４８時間インキュベーシ
ョンした。１８－２４時間の形質導入の後、異常又は細胞死に関して顕微鏡下で細胞を観察した。このタイムポイントで、感染及び非感染細胞を含む各ウェルにさらに１ｍｌの新しいｉＰＳ細胞培地を加え、５％ＣＯ₂，５％Ｏ₂が供給される環境中で３７℃においてさらに追加の１８－２４時間インキュベーションした。回収の前に、細胞死又は異常な外観を評価するために細胞を顕微鏡下で観察した。

成果測定法－本明細書に説明される通りにウェスタンブロット分析を行った。

結果
５．１ＪＢ５８８ｉＰＳ細胞株におけるＡＡＶ２－ｈＣＨＭＶ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂの発現：モノクローナルヒトＲＥＰ－１特異的抗体は、形質導入されたＪＢ５８８ｉＰＳ細胞において１つの～７５－８０ｋＤａ単一ｈＲＥＰ－１タンパク質を検出した（データは示されない）。未処理対照標準の場合、バンドは観察されず、疾患の存在を確認した（データは示されない）。３×１０⁵のＭＯＩにおけるＲＥＰ－１
タンパク質バンドの強度はすべてのベクターにおいて１×１０⁵のＭＯＩと比較してより
強いことが観察された。ｉＰＳ細胞へのｈＣＨＭ遺伝子の組換えＡＡＶ２．ｈＣＨＭウイルス媒介送達は、ＲＥＰ－１タンパク質の用量－依存性産生を生じた。ＧＡＰＤＨ抗体を用いるブロットの探査は、すべての細胞溶解液において等しい濃度のバンドを示した。ＧＡＰＤＨは～３９ｋＤａにおけるタンパク質を検出した。ＲＥＰ－１及びＧＡＰＤＨ抗体の両方は予測される分子量の特異的なバンドのみを検出した。ブロットにおいて非特異的なバンドは観察されなかった。

ｉＰＳ細胞におけるＡＡＶ８－ｈＣＨＭ．Ｖ１、Ｖ２ａの発現：モノクローナルヒトＲＥＰ－１特異的抗体は、形質導入されたＪＢ５２７、ＪＢ５００及びＪＢ５８８被験者由来ｉＰＳ細胞において１つの～７５－８０ｋＤａ単一ＲＥＰ－１タンパク質を検出した（データは示されない）。未処理対照標準の場合、タンパク質バンドは観察されなかった。（データは示されない）。ＧＡＰＤＨ抗体を用いるブロットの探査は、未処理の細胞からの細胞溶解液を含むすべての細胞溶解液において等しい濃度のバンドを示した。抗ＧＡＰＤＨ抗体は特異的な～３９ｋＤａタンパク質バンドを検出した。ＲＥＰ－１及びＧＡＰＤ
Ｈ抗体の両方は予測されるサイズ分子量における特異的なタンパク質バンドのみを検出した。ブロットにおいて検出可能な非特異的タンパク質バンドは観察されなかった。

結論
本報告において提示される予備的な結果は以下の観察を明らかにした：ウェスタンブロット分析は３つの被験者－由来ｉＰＳＣｓ（ＪＢ５８８、ＪＢ５００、ＪＢ５２７）のそれぞれにおけるＣＨＭ（ＲＥＰ－１タンパク質の欠如）の存在を確認した。試験管内発現研究は、ＡＡＶ２．ｈＣＨＭ．バージョン２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ及びＡＡＶ２．ｈＣＨＭバージョン１（現在の臨床試験候補）へのＣＨＭ被験者からのｉＰＳ細胞の感染が、すべての調べられたＭＯＩｓにおいてＲＥＰ－１タンパク質の産生を誘導することを示した。ＡＡＶ８．ｈＣＨＭ．バージョン２ａ及びＡＡＶ８．ｈＣＨＭバージョン１への１×１０⁶のＭＯＩにおけるｉＰＳ細胞の感染は、３つのＣＨＭｉＰＳ細胞株のすべてにおい
てＲＥＰ１タンパク質の産生をもたらした。ＲＥＰ１産生のレベルは、ＡＡＶ８．ｈＣＨＭ．Ｖ１に感染したｉＰＳＣｓよりＡＡＶ８．ｈＣＨＭ．Ｖ２ａに感染したものにおいてより高かった。

実施例７：ＡＡＶ８．コドン最適化．ヒトＣＨＭ対ＡＡＶ．天然．ヒトＣＨＭの生体内発現の比較
複数の網膜疾患のための遺伝子療法は、適切な標的細胞の有効な形質導入に依存しており、コロイデレミアの場合、適切な標的細胞は網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び光受容体細胞である。この研究報告は、天然ＣＨＭ配列に基づくコンストラクト（バージョン１）及びＡＡＶ８主鎖中にパッケージングされた４つの次世代導入遺伝子カセットにより誘導される野生型マウスにおける生体内発現の比較に焦点を当てる。ここで我々は光受容体細胞への遺伝子転移を向上させる目的のためにＡＡＶ８血清型を評価した。

以下の疑問に答えるように我々の実験を設計した：ａ．光受容体の生体内形質導入に関してこれらのベクターをどのように比較するか：特に次世代ＡＡＶ８．ＣＨＭはそれぞれの試験物質の網膜下注入の後にバージョン１と比較していかに有効に光受容体を形質導入するか。ｂ．用量反応：次世代ＡＡＶ８．ＣＨＭと、ＡＡＶ８．ＣＨＭ－バージョン１ベクターとは遺伝子発現の用量反応において異なるか。

実験的詳細：
プラスミド及びベクターは実施例４において説明された通りであった。マウス（動物）：ＲＥＰ－１タンパク質の産生により評価されるＣＨＭの生体内発現を調べるために、野生型ＣＤ１マウスを用いた。ＣＤ１マウス株は非近交系スイスマウス株であり、そのコロニーを我々は学内で維持する。研究の詳細はＣＡＲＯＴ研究プロトコルＰＣＰＲ０２．０１の下に説明されている。

３．３研究設計（例えば処理グループ）
３．３．１動物飼育：～２０－３０グラムの体重の雄及び雌の両方のマウス（～３－４月令）に説明される試験物質を注入した。動物をペンシルバニア大学のジョンモルガン大学実験室動物資源（ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ’ｓＪｏｈｎＭｏｒｇａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）（ＵＬＡＲ）施設に、ペンシルバニア大学のＵＬＡＲ規制に従って収容した。マウスを１２－時間明／１２－時間暗サイクルで保持した。食物及び水は随意に与えられた。すべての動物は耳の標識番号で同定された。

３．４試験材料投与：ＣＡＲＯＴＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅにより与えられる試験物質調製物を用量投与のために用いた。試験材料を－６０～－８０℃において保存した。投薬の前に試験材料を氷上で解凍した。眼内注入のために、調製表２０に説明される通りに
リン酸塩－緩衝食塩水を用いて試験物質を標的濃度に希釈する。合計で６０μｌのマスターミックスを調製した。

網膜下注入の前の注入ログ（ＩｎｊｅｃｔｉｏｎＬｏｇ）の準備
試験物質の網膜下注入の前に、注入ログを以下の情報と一緒に保持した：
・ゲージ番号／マウス番号
・研究の同定
・株
・生年月日
・注入日
・研究者／注入者の名前
・注入される眼（左又は右）
・注入される材料（ベクター／血清型）
・用量及び容積
・投与経路（ＲＯＡ）

網膜下注入：外科医による網膜下注入により注入を行った。要するに、注入の前に動物を麻酔した。Ｈａｍｉｌｔｏｎ３３Ｇシリンジを用いて試験物質の網膜下注入を行った。試験物質及び注入の詳細を表２１に説明する。調製された注入マスター混合液から、注入当たりに１．５μｌの容積を投与した。動物当たり１つの眼に、眼当たり５×１０⁸個
のベクターゲノム（ｖｇ）を注入し、反対側の眼に眼当たり５×１０⁹個のベクターゲノ
ムを注入した。

成果測定法
動物屠殺（ＡｎｉｍａｌＳａｃｒｉｆｉｃｅ）：ａ．動物に試験物質を注入した後、すべての動物を注入後関連異常に関して４８時間観察した。Ｂ．注入から２１－３５日後、眼底検査法を用いて動物を眼の異常に関して観察した。Ｃ．注入から９０－１２－日後、動物を屠殺し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びその後のウェスタンブロット分析による外来性ＲＥＰ－１タンパク質の産生の評価のために、眼組織を回収した。

眼組織の収集：鋭い手術用メスの刃を用いて眼からレンズを除去した後、ウェスタンブロット分析のための眼組織を集めた。眼（レンズがない）をフリーザーチューブ（ｆｒｅｅｚｅｒｔｕｂｅｓ）中に集め、それを適切に標識する。

ウェスタンブロット分析
要するに：１．組織細胞溶解液の調製
ａ．２種類の用量の次世代ＡＡＶ８．ＣＨＭ及びＡＡＶ８．Ｖ１が注入された動物の眼組織を、非注入対照標準動物組織と共に、動物を屠殺することにより注入から２１－３５日後に集めた。Ｂ．次いでプロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液を用いて組織を氷上で溶解した。
ｃ．１３，０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心により組織細胞溶解液を清澄化した。

２．タンパク質の定量及び調製
ａ．ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＭｉｃｒｏＢＣＡＴＭＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔを用い、製造者の指示に従って細胞溶解液のタンパク質定量を行った。Ｂ．５６２ｎｍにおけるＯＤ読み取り値を得ることにより、タンパク質濃度を決定した。Ｃ．ＣＨＭの生体内発現を評価するために、４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上に２０－４０μｇの測定されたタンパク質を負荷した。

３．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット
タンパク質ゲルをニトロセルロース膜上に転移させ、ミルク中でブロッキングし、一次抗体と一緒にインキュベーションした。抗ヒトＲＥＰ－１２Ｆ１抗体（２Ｆ１，１：１０００希釈）及び／又は抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１０００希釈）を一次抗体として用いた。ブロットの洗浄後、１：５０００の濃度におけるＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体及び／又は抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた。製造者の指示に従ってＥＣＬ試薬を用いる化学発光により、ブロットを発光させた。

４．対照標準
ａ）負荷対照標準：ゲルの各ウェル中のタンパク質の等しい負荷を示すために、抗ＧＡ
ＰＤＨ抗体を負荷対照標準として用いた。抗ＧＡＰＤＨ抗体は～３９ｋＤａのタンパク質を検出する。Ｂ）陽性対照標準：ＡＡＶ２．Ｖ２ａが形質導入されたＣＯＳ－７細胞溶解液を陽性対照標準として用いた。Ｃ）陰性対照標準：注入されない動物の眼組織を陰性対照標準として用いた。

試料値決定
ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いる分析によるウェスタンブロット分析の定量。要するに、この報告に提示される濃度測定的評価を対応する試料のＧＡＰＤＨタンパク質の内在性発現のレベルに最初に正規化する。次いで発現レベルを非注入対照標準の平均ＲＥＰ－１発現レベルに再び正規化する。

ＲＥＰ－１タンパク質の発現を示すための濃度測定的評価及び倍変化計算の詳細を表２２及び２３として提示する。

簡単な説明：
１．表２２及び２３において、第２列はＲＥＰ－１タンパク質の生の値を示し、第３列はＧＡＰＤＨタンパク質の生の値を示す。
２．各試料のＧＡＰＤＨ値を最初にＡＡＶ８．Ｖ１の動物－１のＧＡＰＤＨ値に正規化し、それを表２２において第４列に示す。
３．各試料の値をＡＡＶ８．Ｖ１の動物－２のＧＡＰＤＨ値にも正規化し、それを表２２において第５列に示す。
４．次いでＲＥＰ－１の値（第２列）を動物１に正規化されたＧＡＰＤＨ（第４列）又は前に動物２に正規化されたＧＡＰＤＨ（第５列）のいずれかに正規化する。これらをそれぞれ第６列及び第７列に示す。
５．正規化されたＲＥＰ－１の値を次いで相対値（ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ）に転換する。
６．それぞれのＲＥＰ－１の値をＡＡＶ８．Ｖ１が注入されたグループの動物１又は動物２のいずれかにおけるＲＥＰ－１の発現に正規化し、相対値として表す（第８及び９列）。
７．第１０列はＲＥＰ－１タンパク質発現における平均相対値を示す。

結果
天然ＣＨＭＡＡＶ８．Ｖ１対コドン最適化ＣＨＭベクター：ＡＡＶ８．Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ３ａ及びＶ３ｂを用いるＣＨＭ発現の比較：野生型ＣＤ１マウスに２種類の用量の各ＡＡＶ８ベクター：眼当たり５×１０⁹個のベクターゲノムの高用量及び眼当たり５×
１０⁸個のベクターゲノムの低用量を注入した。以下の結果は、高用量及び低用量のＡＡ
Ｖ８．Ｖ１、ＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａを用いる注入の後のＲＥＰ１タンパク質のレベルを説明している。

高用量（眼当たり５×１０⁹個のベクターゲノム）のウイルスベクターが注入された動
物におけるＡＡＶ８．Ｖ１対ＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａ（スタッファーを有するベクター）の発現の比較。ヒト抗ＲＥＰ－１抗体を用いるウェスタンブロット分析は、次世代ＡＡＶ８．Ｖ２ａ又はＶ３ａあるいは元のＡＡＶ８．バージョン１のいずれかで処理された各動物の両方の（低及び高用量を注入された）眼組織において～７５－８０ｋＤａｈＲＥＰ－１タンパク質バンドを検出した。両方の注入されない対照標準マウスの場合、非常に弱い（最小）バンドが観察される。バージョン１を用いて形質導入された組織と比較して、次世代ベクター（ＡＡＶ８Ｖ．２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａ）を用いて形質導入された組織において強度が増したバンドが観察された。抗ＧＡＰＤＨ抗体は、注入されない対照標準を含むウェスタンブロットのすべての列において、等しい強度の～３９ｋＤａのバンドを示した。問題のタンパク質の分子量の比較のために、あらかじめ染色され
たタンパク質マーカーを用いる。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いるブロットの濃度測定的評価（発現レベルの定量）は、次世代ＡＡＶ８．高及び低用量コンストラクト（Ｖ２ａ又はＶ３ａ）の１つが注入された動物においてＲＥＰ－１の産生が増加することを示した。（値に関して表２２を参照されたい。）

低用量（眼当たり５×１０⁸個のベクターゲノム）のウイルスベクターが注入された動
物におけるＡＡＶ８．Ｖ１対ＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａの発現の比較
５×１０⁸個の用量で次世代ＡＡＶ８．Ｖ２ａ、Ｖ３ａ及びＡＡＶ８．バージョン１が
注入された動物の眼組織のヒト抗ＲＥＰ－１抗体、ウェスタンブロット分析は、注入されたマウスの組織において～７５－８０ｋＤａｈＲＥＰ－１タンパク質バンドを検出した。両方の注入されない対照標準マウスの眼組織細胞溶解液において、ＲＥＰ－１の弱い（最小）バンドが観察された。バージョン１を用いて形質導入された細胞溶解液と比較して、次世代ベクターを用いて形質導入された組織細胞溶解液において強度が増したバンドが観察された。抗ＧＡＰＤＨ抗体は、すべての組織溶解液において、～３９ｋＤａにおける等しい強度のタンパク質バンドを検出した。このデータは、ＡＡＶ８を介する次世代Ｖ２
ａＣＨＭの送達がＡＡＶ８．Ｖ３ａ又はＡＡＶ８．Ｖ１の注入後に産生されるレベルと比較して確固としたレベルのＲＥＰ－１タンパク質を生ずることを示す。

ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いるブロットの濃度測定法の評価（発現レベルの定量）は、バージョン１と比較して次世代ＡＡＶ８．ＣＨＭコンストラクト（特にＶ２ａ）が注入された動物におけるＲＥＰ－１の産生の増加をさらに示した。数値に関して表２３を参照されたい。

ＣＤ１マウスにおけるＡＡＶ８．Ｖ２ｂの発現
進行中の本研究及びｑＰＣＲ力価分析によるＡＡＶベクター作製へのラムダスタッファーの効果の評価を同時に行った。我々は研究プロトコルＰＣＰＲ．０２に説明される生体内発現研究のためのすべての動物注入を行い、すべての試料を回収した。（上記の）ラムダスタッファー要素についてのｑＰＣＲ研究が完結した後、我々はＡＡＶ８．２ｂ及びＡＡＶ８．３ｂのようなスタッファーのないＡＡＶベクターの発現を調べるだけのためにウェスタンブロット実験を行い、さらなる分析（バージョン１との比較のような）からそれらを除外することを決定した。

ヒト抗ＲＥＰ－１抗体は、５×１０⁹個（高用量）のベクターゲノムコピーでＡＡＶ８
．２ｂが注入されたＣＤ－１マウスの眼組織において～７５－８０ｋＤａのタンパク質を検出した（図１２Ａ）。５×１０⁸個（低用量）でＡＡＶ８．２ｂが注入された動物は、
～７５－８０ｋＤａにおいて非常に弱いタンパク質バンドを示した（図１２Ａ）。注入されない対照標準動物からの眼組織の溶解液はＲＥＰ－１タンパク質の存在を示さなかった。抗ＧＡＰＤＨ抗体は、注入されない対照標準を含むすべての眼組織溶解液において～３９ｋＤａのタンパク質を検出した。このデータは、ＡＡＶ８．２ｂに関する最少用量を確定することができる。

ＣＤ１マウスにおけるＡＡＶ８．Ｖ３ｂの発現
我々はＡＡＶ８．３ｂが注入されたＣＤ１マウス（グループ当たり２匹のマウス）の眼組織について、抗ＲＥＰ－１抗体を用いるウェスタンブロット分析を行い、それは低用量で注入された１つの眼において及び高用量のＡＡＶ８．３ｂを注入された両眼において～７５－８０ｋＤａのタンパク質の存在を明らかにした。未注入マウスの眼組織に、ＲＥＰ－１発現は検出されなかった（図１２Ｂ）。産生されるＲＥＰ－１のレベルはＡＡＶ８．３ｂが注入された動物において用量依存性であった。高用量のＡＡＶ８．３ｂ（５×１０⁹個のベクターゲノム）を用いる注入は、低用量が注入された眼（５×１０⁸個のベクターゲノム）と比較してより多量のＲＥＰ－１を誘導した。抗ＧＡＰＤＨ抗体は、すべての注入された及び注入されない動物の眼組織細胞溶解液において～３９ｋＤａのタンパク質を検出した。

これらの結果は、以下の観察を明らかにした：
１）次世代ベクターＡＡＶ８．バージョン２ａ、２ｂ、３ａ及び３ｂは眼組織を有効に形質導入することができる。２）導入遺伝子（コドン最適化ＣＨＭ）の発現は、次世代ベクターのすべてに関して検出可能であった。３）導入遺伝子（コドン最適化ＣＨＭ）の発現は、用量依存性である。４）ＡＡＶ８．バージョン２ａ及びＡＡＶ８．バージョン２ｂは、ＣＤ－１マウスの眼組織においてＡＡＶ８．バージョン１と比較して増加したＲＥＰ－１タンパク質の産生を誘導した。５）同じ用量を注入された眼の間で導入遺伝子タンパク質の産生の正確なレベルに変動があり、外科手術的送達法におけるばらつきを反映している。しかしながら、レベルの差は低（５×１０⁸個）及び高（５×１０⁹個）用量の間で大きい。６）ＡＡＶ８．ＣＨＭ．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａは、マウスにおいて網膜下に高用量（５×１０⁹個のベクターゲノム）のベクターを生体内投与した後、ＡＡＶ８．
Ｖ１よりずっと高いレベルのＲＥＰ－１タンパク質産生を生ずる。

実施例８－ＣＮＧＡ３の発現
ＣＮＧＡ３の発現を最大にするため、コドン最適化ＣＮＧＡ３配列を作製した（配列番号９）。加えて、ＣＮＧＡ３変異体をコドン最適化した（配列番号１１）。これらの配列、並びに天然ＣＮＧＡ３コード配列は、本明細書に説明される産生プラスミド（配列番号３０～３８）に組み込んでＡＡＶベクターを作製した。ＡＡＶ８及びＡＡＶ９キャプシドを使用するベクターを、以下に説明する通りに作製した。

タンパク質発現は、ＲＥＰ－１について上で説明した通りに評価した。ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＣＢＡ発現は、３種のＣＮＧＡ３ベクターのそれぞれを２つの異なるＭＯＩで形質導入した８４－３１細胞において観察される。図２８。使用した陽性対照は、ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＣＢＡ－天然ＣＮＧＡ３を注入後回収したマウス網膜タンパク質である。ＣＮＧＡ
３プラスミドをコドン最適化すると、３種の異なるプロモーター（ＣＭＶ／ＣＢＡ（図２８）、ＲＫ－１及びｈＣＡＲ（図２９））での発現が増強されていることを示した。ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターでの増強は低用量のほうが明白である（高用量ほど飽和していると推定される）。

ＡＡＶ８＆９を使用する外来性ｈＣＮＧＡ３発現を生体内で試験した。

生後３０～１２０日のＷｔマウスの網膜下注入を実施した。マウスは注入後３～４週間目で屠殺し、組織を収集してエンドポイントを測定した。正常なマウスでは、ＣＮＧＡ３の発現は図３０に示される通りにｑＰＣＲにより測定した。ヌルマウスでは、網膜中のＣＮＧＡ３タンパク質の発現は、ウェスタン及びＩＨＣを使用して測定し、網膜病理組織を調べる。

ＣＮＧＡ３マウスモデル：ミスセンス変異を含むＣＰＦＬ５（エキソン５）を有するＣＮＧＡ３ヌルマウス

表現型：
５週間：ひどく減少した錐体特異的ＥＲＧ
１０週間：錐体オプシン色素の減少及び誤った局在化
５ヶ月：減少した視線運動反射

ＣＮＧＡ３－色覚異常のための遺伝子置換療法：
ＣＮＧＡ３ヌルマウスは、記述されたベクターの２つの用量の１つを網膜下にｐ１６～１８で注入された。低用量：８Ｅ８ｖｇ／眼；高用量：８Ｅ９ｖｇ／眼。グループ当たり少なくとも５動物に注入した。ＥＲＧ及びＯＫＲは５～７週間目及び１２～１５週間目に実施した。屠殺時には、ＩＨＣ、ウェスタンブロット及び組織学的検査を実施した。

網膜の機能に関する客観的情報を提供し、前臨床研究において有効性のパラメータとしての役目を果たすため、閃光に対する網膜の細胞の電気的応答である網膜電図（ＥＲＧ）を、従来の方法及びユーザーマニュアルに従ってマウスで評価した。例えば、Ｍａｒｍｏｒ，ＭｉｃｈａｅｌＦ．ら、“Ｓｔａｎｄａｒｄｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ（２００４ｕｐｄａｔｅ）．”Ｄｏｃｕｍｅｎｔａ
ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ１０８．２（２００４）：１０７～１１４；及びＣｒｏｎｉｎ，Ｔｈｅｒｅｓｅ，ＡｒｋａｄｙＬｙｕｂａｒｓｋｙ，ａｎｄＪｅａｎＢｅｎｎｅｔｔ．“Ｄａｒｋ－ｒｅａｒｉｎｇｔｈｅｒｄ１０ｍｏｕｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｙ．”ＲｅｔｉｎａｌＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＵＳ，２０１２．１２９～１３６を参照されたい。

手短に言えば、動物の眼底検査評価はＥＲＧ測定に先立って完了させた。潜在的にＥＲＧの結果を損ない得る眼欠陥のあるマウスは排除される。これらは、白内障、角膜損傷又は炎症などの角膜混濁を含む。次に、マウスは少なくとも４時間暗順応させ、暗条件下で体重を量り、腹腔内に麻酔薬を注入した（ケタミン／キシラジンカクテルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）と一緒に、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）。色素沈着マウスの瞳孔は１％のトロピカミド溶液を使用して広げ、アルビノマウスはやはり瞳孔拡張を必要とした。動物は、加熱プラットホーム上の吸収性床敷で飼いつつ、参照電極をマウスの身体と接触するように置き、記録電極はそれぞれの眼の角膜の上方に置き、角膜にそっと触れさせた。必要な場合には、拡大鏡を使用した操作を実施した。

刺激装置は下に示す通りに設置した。指示がない限り、あらゆる色又は色消しの刺激を
使用することができる。試験プロトコルＩはステップ１：０．０１０７６暗所視ｃｄｓ
ｍ^-2（１平方メートル当たりのカンデラ秒（ｃｄ／ｍ²））；ステップ２：５００暗所
視ｃｄｓｍ^-2、色消しキセノンフラッシュ；及びステップ３：背景強度１００暗所視ｃｄｍ^-2、刺激：５００暗所視ｃｄｓｍ^-2を含む。刺激強度ＳｅｔＩＩでは、すべてのステップで、以下の刺激が１００暗所視ｃｄｍ^-2（１平方メートル当たりのカンデラ（ｃｄ／ｍ²））グリーン（５２０ｎｍ）背景照明で放出された。試験プロトコル
ＩＩは、ステップ１：５００暗所視ｃｄｓｍ^-2、色消しキセノンフラッシュ；ステップ２：０．００１５ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ（刺激時間間隔、連続フラッシュ間の時間間隔）１．５ｓ；ステップ３：０．００４ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ１．５ｓ；ステップ４：０．０１ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ２ｓ；ステップ５：０．０３ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ２ｓ；ステップ６：４ｓｃｏｔｃｄｓｍ^-2、グリーン（５２０ｎｍ）、ｉｓｉ
２ｓ；ステップ７：１０ｓｃｏｔｃｄｓｍ^-2、グリーン（５２０ｎｍ）、ｉｓｉ
２ｓ；ステップ８：２５ｓｃｏｔｃｄｓｍ^-2、グリーン（５２０ｎｍ）、ｉｓｉ
２ｓ；及びステップ９：５００暗所視ｃｄｓｍ^-2、色消しキセノンフラッシュを含む。試験プロトコルＩ及びＩＩはそれぞれの動物で引き続いて実行した。

使用されたＣＮＧ３Ａ／Ｂ３ヌルマウスは正常に機能する杆体を有しているので、杆体発生ＥＲＧを網膜状態のシグネチャーとして利用した。パラメータは飽和ａ波の振幅であった。明るい閃光で刺激すると、速い角膜負電圧はＥＲＧの最初の（時間的順番では）成分であった。ａ波の振幅は、閃光後２０ｍｓまでの時間間隔中ＥＲＧの最も負の点と閃光後３ｍｓ時点で測定されるＥＲＧシグナルの基線値の間の差であった。「ゼロ」としての３ｍｓデータポイントの選択は、閃光アーチファクトの排除及びドリフトの効果の最小化を可能にした。刺激強度の漸進的増加に従って、ａ波の振幅は飽和に達するまで増加した。マウスＥＲＧのａ波は網膜杆体光電流の大きさに正比例し（Ｌｙｕｂａｒｓｋｙ，ＡｒｋａｄｙＬ．，ａｎｄＥｄｗａｒｄＮ．ＰｕｇｈＪｒ．”Ｒｅｃｏｖｅｒｙｐｈａｓｅｏｆｔｈｅｍｕｒｉｎｅｒｏｄｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｒｏｍｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｉｃｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ．”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１６．２（１９９６）：５６３～５７１）、したがって、杆体機能の最も直接的な尺度である。

基線と閃光後７～１０ｍｓで起きる最初のトラフの間の電位差としてのａ波の振幅は、試験プロトコルＩにより得られたデータを使用して両眼について測定した。錐体ＥＲＧの振幅は、試験プロトコルＩＩにより得られたデータを使用して測定した。錐体ＥＲＧの大きさは、それぞれの眼由来の飽和ａ波の振幅で割った。注入した眼由来のａ波の振幅が対照眼由来のａ波の振幅の５０％未満である場合、この動物はさらなる処理から除外し、注入すると重傷を負うと見なした。得られた結果は計算し正規化した。注入した眼と非注入眼由来の正規化錐体ＥＲＧのセット間の対応ｔ検定を実施した。処置した眼の統計的に有意な改善は、成功した処置のシグネチャーであることになった。

網膜機能は、野生型、賦形剤注入及び非注入眼の網膜機能と比べた場合の、記述されたベクターの投与に続く生後５～７週間目に評価した。ベクター／投与量ごとに３種の光強度（０．０１ｃｄ．ｓ／ｍ²、１０ｃｄ．ｓ／ｍ²及び２５ｃｄ．ｓ／ｍ²）から測定され
た結果は下の表２５及び図３１に示されている。これらの結果は、ＲＫ－１プロモーターが、最適化ＣＮＧＡ３発現カセットと一緒になって、マウスモデルにおけるＥＲＧ機能を修正することができることを明らかにしている。

ｃＧＭＰ添加後の形質導入対非形質導入８４－３１細胞におけるカルシウム取込みは図３２に示されている。

実施例９－ＣＮＧＢ３
ＣＮＧＢ３配列は、ＲＥＰ－１及びＣＮＧＡ３について上で説明される通りにベクター内に取り込まれた。ＡＡＶ８及びＡＡＶ９キャプシドを使用するベクターを下に説明する通りに作製した。

ＣＮＧＢ３ヌルマウスは、記述されたベクターの２つの用量の１つを網膜下にｐ１６～１８で注入された。低用量：１Ｅ９ｖｇ／眼；高用量：１Ｅ１０ｖｇ／眼。グループ当たり少なくとも５頭の動物に注入した。ＥＲＧ及びＯＫＲは５～７週間目及び１２～１５週間目に実施した。屠殺時には、ＩＨＣ、ウェスタンブロット及び組織学的検査を実施した。

網膜機能は、野生型、賦形剤注入及び非注入眼の網膜機能と比べた場合の、記述されたベクターの投与に続く生後１２～１６週間目に評価した。ベクター／投与量ごとに３種の光強度（０．０１ｃｄ．ｓ／ｍ²、１０ｃｄ．ｓ／ｍ²及び２５ｃｄ．ｓ／ｍ²）から測定
された結果は下に及び図３３に示されている。系列５、８及び９はそれぞれ０．０１ｃｄ．ｓ／ｍ²、１０ｃｄ．ｓ／ｍ²及び２５ｃｄ．ｓ／ｍ²の光強度である。

これらの結果は、ｈＣＡＲとＲＫ－１プロモーターの両方が、最適化されたＣＮＧＢ３発現カセットと一緒になって、ＣＮＧＢ３マウスモデルにおいてＥＲＧ機能を修正することができることを明らかにしている。

本明細書に説明されるコンストラクトを用いた使用に適したＥＲＧ研究は、例えば、２０１７年４月１４日提出の国際公開第１７／２７５２９号パンフレットに説明されており、この特許文献は引用により本明細書に取り込まれる。

実施例１０．マウスの網膜電図（ＥＲＧ）
網膜の機能に関する客観的情報を提供し、前臨床研究において有効性のパラメータとしての役目を果たすため、閃光に対する網膜の細胞の電気的応答である網膜電図（ＥＲＧ）を、従来の方法及びユーザーマニュアルに従ってマウスで評価した。例えば、Ｍａｒｍｏｒ，ＭｉｃｈａｅｌＦ．ら、“Ｓｔａｎｄａｒｄｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ（２００４ｕｐｄａｔｅ）．”Ｄｏｃｕｍｅｎｔａ
ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ１０８．２（２００４）：１０７～１１４；及びＣｒｏｎｉｎ，Ｔｈｅｒｅｓｅ，ＡｒｋａｄｙＬｙｕｂａｒｓｋｙ，ａｎｄＪｅａｎＢｅｎｎｅｔｔ．“Ｄａｒｋ－ｒｅａｒｉｎｇｔｈｅｒｄ１０ｍｏｕｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｙ．”ＲｅｔｉｎａｌＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＵＳ，２０１２．１２９～１３６を参照されたい。

手短に言えば、動物の眼底検査評価はＥＲＧ測定に先立って完了させた。潜在的にＥＲＧの結果を損ない得る眼欠陥のあるマウスは排除される。これらは、白内障、角膜損傷又は炎症などの角膜混濁を含む。次に、マウスは少なくとも４時間暗順応させ、暗条件下で体重を量り、腹腔内に麻酔薬を注入した（ケタミン／キシラジンカクテルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）と一緒に、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）。色素沈着マウスの瞳孔は１％のトロピカミド溶液を使用して広げ、アルビノマウスはやはり瞳孔拡張を必要とした。動物は、加熱プラットホーム上の吸収性床敷で飼いつつ、参照電極はマウスの身体と接触するように置き、記録電極はそれぞれの眼の角膜の上方に置き、角膜にそっと触れさせた。必要な場合には、拡大鏡を使用した操作を実施した。

刺激装置を下に示す通りに設置した。指示がない限り、あらゆる色又は色消しの刺激を使用することができる。試験プロトコルＩはステップ１：０．０１０７６暗所視ｃｄｓ
ｍ^-2（１平方メートル当たりのカンデラ秒（ｃｄ／ｍ²））；ステップ２：５００暗所
視ｃｄｓｍ^-2、色消しキセノンフラッシュ；及びステップ３：背景強度１００暗所視ｃｄｍ^-2、刺激：５００暗所視ｃｄｓｍ^-2を含む。刺激強度ＳｅｔＩＩでは、すべてのステップで、以下の刺激が１００暗所視ｃｄｍ^-2（１平方メートル当たりのカンデラ（ｃｄ／ｍ²））グリーン（５２０ｎｍ）背景照明で放出された。試験プロトコル
ＩＩは、ステップ１：５００暗所視ｃｄｓｍ^-2、色消しキセノンフラッシュ；ステップ２：０．００１５ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ（刺激時間間隔、連続フラッシュ間の時間間隔）１．５ｓ；ステップ３：０．００４ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ１．５ｓ；ステップ４：０．０１ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ２ｓ；ステップ５：０．０３ｃｄｓｍ^-2、ＵＶ（３６５ｎｍ）、ｉｓｉ２ｓ；ステップ６：４ｓｃｏｔｃｄｓｍ^-2、グリーン（５２０ｎｍ）、ｉｓｉ
２ｓ；ステップ７：１０ｓｃｏｔｃｄｓｍ^-2、グリーン（５２０ｎｍ）、ｉｓｉ
２ｓ；ステップ８：２５ｓｃｏｔｃｄｓｍ^-2、グリーン（５２０ｎｍ）、ｉｓｉ
２ｓ；及びステップ９：５００暗所視ｃｄｓｍ^-2、色消しキセノンフラッシュを含む。試験プロトコルＩ及びＩＩはそれぞれの動物で引き続いて実行した。

使用されたＣＮＧ３マウスは正常に機能する杆体を有しているので、杆体発生ＥＲＧを網膜状態のシグネチャーとして利用した。パラメータは飽和ａ波の振幅であった。明るい閃光で刺激すると、速い角膜負電圧はＥＲＧの最初の（時間的順番では）成分であった。ａ波の振幅は、閃光後２０ｍｓまでの時間間隔中ＥＲＧの最も負の点と閃光後３ｍｓ時点で測定されるＥＲＧシグナルの基線値の間の差であった。「ゼロ」としての３ｍｓデータポイントの選択は、閃光アーチファクトの排除及びドリフトの効果の最小化を可能にした。刺激強度の漸進的増加に従って、ａ波の振幅は飽和に達するまで増加した。マウスＥＲＧのａ波は網膜杆体光電流の大きさに正比例し（Ｌｙｕｂａｒｓｋｙ，ＡｒｋａｄｙＬ．，ａｎｄＥｄｗａｒｄＮ．ＰｕｇｈＪｒ．“Ｒｅｃｏｖｅｒｙｐｈａｓｅｏｆｔｈｅｍｕｒｉｎｅｒｏｄｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｅｄｆｒｏｍｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｉｃｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ．”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１６．２（１９９６）：５６３～５７１）、したがって、杆体機能の最も直接的な尺度である。

実施例１１－ラムダスタッファー効果の評価
実施例６に説明される実験に付け加えて、残留プラスミドＤＮＡのパーセンテージを評価し得られたデータを図３４にプロットした。結果は、ＡＡＶ２とＡＡＶ８の両方でトリプルトランスフェクション作製中特大スタッファー配列はＤＮＡ不純物を～８０％減少させることを示した。

実施例１２－ｒＡＡＶの生体内発現
実施例７に説明される実験に付け加えて、ＡＡＶ８．Ｖ２ａ、ＡＡＶ８．Ｖ３ａ及びＡＡＶ８．Ｖ１の種々の投与量（眼当たり５Ｅ７のベクターゲノムコピー（ｖｇ／眼）、１Ｅ８ｖｇ／眼、５Ｅ８ｖｇ／眼、５Ｅ９ｖｇ／眼、及び１Ｅ１０ｖｇ／眼）を生後約３～４ヶ月のＣＤ－１マウスに注入した。眼球を回収し、そのＲＥＰ１タンパク質発現をウェスタンブロットにより評価した。代表的な結果は図３５～３９に示している。定量化を実施し下の表に示した。結果は、ＡＡＶ８．Ｖ１と比べて、ＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａが５Ｅ８ｖｇ／眼、５Ｅ９ｖｇ／眼でＲＥＰ１タンパク質のより高い発現レベルを示すことを明らかにした。ＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａの網膜下送達により、網膜細胞へのＣＨＭ導入遺伝子の頑強で再現性のある送達が生じた。ＣＨＭ遺伝子の組換えＡＡＶ８．ＣＨＭ媒介送達により、ＲＥＰ１タンパク質産生に対する用量依存性効果が生じた。

実施例１３－ｒＡＡＶの注入による網膜病理組織診断
網膜病理組織診断の分析は、実施例７及び実施例１２に説明される通りに処置されたマウスから回収した網膜で実施した。Ｈ＆Ｅ染色を実施して、光受容体上の変化並びに免疫性浸潤の存在を明らかにした。タネル染色を実施して、アポトーシスの存在を明らかにした。Ｖｅ処置細胞は陽性対照として提供した。表現画像は示されていない。観察の要約は表として下に提供した。結果は、ＣＨＭ遺伝子の組換えＡＡＶ８．ＣＨＭ媒介送達により、ＲＥＰ１タンパク質産生及び網膜病理組織診断に対する用量依存性効果が生じることを示した。最も高用量のＡＡＶ８．Ｖ２ａ、ＡＡＶ８．Ｖ３及びＡＡＶ８．Ｖ１を注入したマウス眼は、炎症、網膜変性症及びアポトーシスを示した。

実施例１４－ｉＰＳＣ

ＡＶＶ８がヒトｉＰＳＣにおいてＡＡＶ２ベクターとしてＧＦＰレポーターの比較可能な形質導入／発現を達成するのに必要な感染多重度（ＭＯＩ）を決定するため、並びに高ＭＯＩでのＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａの細胞傷害性を調べるため、以下の実
験を実施した。ｉＰＳＣ細胞にＡＡＶ２．ＣＭＶ／ＣβＡ－ＧＦＰ及びＡＡＶ８．ＣＭＶ／ＣβＡ－ＧＦＰを複数のＭＯＩ（１Ｅ４～１Ｅ７）で形質導入した。培養ウェルを画像化しＧＦＰを定量してＡＡＶ２ベクターのＡＡＶ８ＭＯＩ相互比較性を判定した。結果は図４０にプロットしており、１Ｅ７ｖｇ／細胞のＡＡＶ８．ＣＭＶ／ＣβＡ－ＧＦＰで達成された形質導入効率が約２Ｅ５ｖｇ／細胞でのＡＡＶ２．ＣＭＶ／ＣβＡ－ＧＦＰに匹敵することを示している。

さらに、細胞はＡＡＶ８．Ｖ２ａ及びＡＡＶ８．Ｖ３ａを１Ｅ７ｖｇで、ＡＡＶ２．Ｖ１を２Ｅ５ｖｇで形質導入した。次に、細胞は染色し、カスパーゼ３（アポトーシスマーカー）について計数した。１μＭのスタウロスポリンで処置した、非処置の、細胞当たり２Ｅ５ベクターゲノムコピーのＡＡＶ２．Ｖ２ａを形質導入した、細胞当たり１Ｅ７ベクターゲノムコピーのＡＡＶ８．Ｖ３ａを形質導入した、及び細胞当たり１Ｅ７ベクターゲノムコピーのＡＡＶ８．Ｖ１を形質導入したｉＰＳＣの免疫蛍光染色を実施した（画像は示していない）。スタウロスポリンはアポトーシスを誘導するのに使用した。それによって処置された細胞は陽性対照として役立たせた。物質１はＡＡＶ２．Ｖ２ａであり；物質２はＡＡＶ８．Ｖ３ａであり；物質３はＡＡＶ８．Ｖ１である。

得られたデータは図４１に提示しており、ＭＯＩが１Ｅ７ｖｇ／細胞でのＡＡＶ８血清型ベクターにより、形質導入されたｉＰＳＣでの頑強な導入遺伝子発現が得られ、アポトーシスは生じなかった。

実施例１５－ＲＡＢのプレニル化
ＣＨＭはＲａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）をコードし、ＲＥＰ１は標的ＲＡＢタンパク質のプレニル化に必要とされる。したがって、実施例３に説明するように、試験ｒＡＡＶの形質導入後のＣＨＭ患者誘導ｉＰＳＣにおける標的ＲＡＢタンパク質のプレニル化（³ＨＧＧＰＰ基質の組込みを使用する）を評価した。ｉＰＳＣ細胞を作製し実
施例１に説明される通りに処置する。手短に言えば、ＣＨＭ患者誘導ｉＰＳＣ細胞株ＪＢ
５８８、ＪＢ５２７及びＪＢ４１５を作製し維持した。ＡＡＶ８．Ｖ２ａ、ＡＡＶ８．Ｖ３ａ及びＡＡＶ８．Ｖ１のＭＯＩが１Ｅ７での形質導入を実施した。非処置細胞は陰性対照としての役目を果たした。

結果は図４２に示している。非形質導入ｉＰＳＣと比べると、形質導入細胞は、³Ｈ
ＧＧＰＰ基質の絶対的組込みと正規化された組込みの両方の増加を示した。

実施例１６－Ｃｎｇａ３ヌルマウスに対するｈＣＮＧＡ３遺伝子療法の治療効果
概念研究の証明を実施して、ＡＣＨＭのＣｎｇａ３ノックアウトマウスモデルを使用してｈＣＮＧＡ３媒介ＡＣＨＭ疾患に対する療法として遺伝子増加の実行可能性を試験した。それをするため、我々は、それぞれが３種の異なるプロモーター（ＲＫ１、ＣＭＶ／ＣＢＡ、及びｈＣＡＲ）のうちの１つを保有している１４の独特な導入遺伝子カセットを作製し、ＡＡＶベクター血清型８又は９にパッケージングした。これら１４の試験ベクターの間で使用されるｃＤＮＡ配列は、天然、コドン最適化、又は天然に存在する変異体３のコドン最適化バージョンであった。２つの異なる用量のいずれかでの試験物質の網膜下注入はＰ１６とＰ１９の間で実施し、一般的臨床観察及び眼底検査試験をすべての研究動物で実施した。研究動物の網膜及び視覚機能は、網膜電図（ＥＲＧ）及び視線運動反射（ＯＫＲ）検査により評価した。注入された動物のコホートは研究エンドポイントで安楽死させて、網膜病理組織診断を評価した。網膜光受容体薄片の追加の組織学的分析は、ＣＮＧＡ３についてのタネル（ＴＵＮＥＬ）染色及び蛍光免疫組織化学を使用して実施した。

５～７週の間で実施された眼底検査により、用量依存性組織病理学的変化が明らかにされた。ＯＫＲ結果は決定的ではなかった。ＥＲＧ解析により、用量依存性効果と共に賦形
剤処置眼と比べて錐体光受容体機能の改善が明らかにされた。光受容体特異的プロモーターを組み込んでいる導入遺伝子カセットを使用して、光学応答が見出された。

結果により、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９ウイルスベクターを利用するｈＣＮＧＡ３遺伝子送達が、８Ｅ８ｖｇ／眼で注入された場合には優れた予備安全性を示すことが明らかになった。最小眼炎症が観察され、試験物質の網膜下送達に続く有害反応はなかった。さらに、試験物質注入眼由来の組織の組織病理学的分析により、８Ｅ８ｖｇ／眼では網膜へ毒性は最小であり、導入遺伝子タンパク質の局在化が光受容体に限られていることが明らかになった。さらに、ｈＣＮＧＡ３のＡＡＶ媒介送達は錐体応答を改善するには十分であり、ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３．Ｏｐｔ及びＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３．Ｖ３では杆体応答への影響は最小であった。

概要
ｈＣＮＧＡ３の生体内発現及び機能を、Ｂ６．ＲＨＪ－Ｃｎｇａ^3cpfl5／ＢｏｃＪ（今後Ｃｎｇａ３^-/-と呼ぶ）マウスにおいて試験した。試験物質は、３種のプロモーター（
ＲＫ１、ｈＣＡＲ及びＣＭＶ／ＣβＡ）の組合せからなっていた。ロドプシンキナーゼ（ＲＫ１）プロモーターは光受容体特異的発現を駆動し、ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）プロモーターは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）エンハンサーと一緒に又はこれなしで、錐体での発現を駆動し、サイトメガロウイルスエンハンサーは、ニワトリベータアクチンプロモーターと一緒に（ＣＭＶ／ＣβＡ）発現を一様に駆動する。使用した３つの対立遺伝子は、天然対立遺伝子（Ｎａｔ）、コドン最適化対立遺伝子（Ｏｐｔ）、及びこれもコドン最適化されていた天然に存在する変異体３（Ｖ３）であった。これらのプロモーター／エンハンサー及び対立遺伝子の組合せはＡＡＶ８又はＡＡＶ９血清型においてカプセルに入れた。試験物質希釈：試験物質はすべてダルベッコリン酸緩衝生理食塩水からなる賦形剤中に希釈し、賦形剤又は低用量は左眼に注入し、高用量は右眼に注入した。

網膜下注入を実施して以下の試験物質のうちの１つを送達した：グループ１－上流ＲＫ１プロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化天然ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ２－上流ＲＫ１プロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ３－上流ＲＫ１プロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒト変異体３ＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ４－上流ヒトＣＡＲプロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化天然ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ５－上流ヒトＣＡＲプロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ６－上流ヒトＣＡＲプロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒト変異体３ＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ８－上流サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＭＶ／ＣβＡ）配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ１０－ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を有する上流ヒトＣＡＲプロモーター配列により制御されたＡＡＶ８キャプシドパッケージング化天然ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ１１－上流ＲＫ１プロモーター配列により制御されたＡＡＶ９キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；グループ１２－上流ヒトＣＡＲプロモーター配列により制御されたＡＡＶ９キャプシドパッケージング化コドン最適化ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター；又はグループ１４－ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を有する上流ヒトＣＡＲプロモーター配列により制御されたＡＡＶ９キャプシドパッケージング化天然ヒトＣＮＧＡ３導入遺伝子ベクター。

一般的臨床観察、及び眼底検査試験をすべての研究動物で実施した。研究動物における視覚機能は、網膜電図（ＥＲＧ）及び視線運動反射（ＯＫＲ）検査により評価した。注入された動物のコホートは研究エンドポイントで安楽死させて、眼を処理し病理組織診断のためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。網膜光受容体薄片の追加の組織学的分析は、ＣＮＧＡ３についてのタネル染色及び蛍光免疫組織化学を使用して実施した。

結果－概要
ｈＣＮＧＡ３導入遺伝子を保有するすべての試験材料の網膜下投与により、手術後に眼に軽い炎症性の変化が生じた。送達された試験物質に対する炎症又は有害反応の結果として安楽死させる必要があったのは０頭だった。ベクターを注入された１８２頭の動物の子のうち、１６９頭が離乳時期に研究に残り、１６２頭が完了まで研究に残った。５～７週の間で実施された眼底検査により、大半の眼が変性組織病理学的変化に関連する炎症の低い～中程度の証拠を示すことが明らかにされた（付録３）。具体的には、高用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）でのすべてのベクターの注入により、低用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）でベクターを注入した眼よりも大きな程度の光受容体の消失の徴候が生じた。低用量で注入された眼の間では、同じコホートの眼の間での網膜変化の程度の変動は外科的送達手順の変わりやすさをおそらく反映している。全体的に見て、最良の結果は、低用量のＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３天然、ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化、ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３、ＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３天然、及びＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３を受けた眼において観察された。

ＥＲＧによる網膜及び視覚機能の試験は、対照と比べて、低用量のＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３天然、ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化、ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化、及びＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３変異体３を注入した眼においてより優れた機能性を明らかにした。図４３Ａ～４４Ｂを参照されたい。

網膜電図結果
動物を暗順応させていた１２時間に続いてＥＲＧ記録を集めた。それぞれの記録は、杆体－、Ｓ－タイプ、又はＬ／Ｍ－タイプ錐体駆動応答を誘発する１０サイクルの光刺激からなっていた。錐体応答を使用して治療効果を測定し、杆体応答を使用して毒性を測定した。

グループ１（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３天然）：
８Ｅ８ｖｇ／眼及び８Ｅ９ｖｇ／眼を注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１５週目で錐体応答に頑強で有意な改善を示した。８Ｅ８ｖｇ／眼のベクターを注入した眼では、注入後５～７又は１２～１５週目で賦形剤注入された眼と比べて、杆体機能に変化はなかった。しかし、８Ｅ９ｖｇ／眼の注入により、注入後５～７週目で杆体機能に大きく有意な減少が生じた。杆体機能は、注入後１２～１５週までにわずかに改善した。

グループ２（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）：
８Ｅ８ｖｇ／眼及び８Ｅ９ｖｇ／眼を注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１５週目で錐体応答に頑強で有意な改善を示した。８Ｅ８ｖｇ／眼を注入した眼では、注入後５～７及び１２～１５週目で杆体応答に軽度であるが有意な減少があった。杆体応答の減少は、８Ｅ９ｖｇ／眼を注入した眼でのほうがはるかに大きかった。

グループ３（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３変異体３）：
８Ｅ８ｖｇ／眼を注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１
５週目で錐体応答に何の変化も示さなかったが、５～７週目で杆体応答に大きく有意な改善を確かに示した。８Ｅ９ｖｇ／眼を注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１５週目で錐体応答に頑強で有意な改善があった。しかし、８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、注入後５～７及び１２～１５週目で杆体応答に大きく有意な減少を示した。

グループ４（ＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３天然）：
８Ｅ８ｖｇ又は８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１５週目で錐体応答に頑強で有意な改善を示した。８Ｅ８ｖｇを注入した眼では、注入後５～７週目で杆体応答に変化は観察されなかったが、これらの眼の杆体応答は賦形剤注入対照と比べて、注入後１２～１５週までに確かに有意に減少した。８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、両方の時点で杆体応答の減少を示した。

グループ５（ＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）：
８Ｅ８又は８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１５週目で錐体応答に中程度から頑強までの有意な改善を示した。８Ｅ８ｖｇを受けた眼では、注入後５～７週目で杆体応答に変化は観察されなかったが、注入後１２～１５週までに機能が有意に減少した。８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、両方の時点で杆体応答の減少も観察された。

グループ６（ＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３変異体３）：
８Ｅ８ｖｇを注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７及び１２～１５週目で錐体応答に頑強で有意な改善を示した。これらの眼ではどちらの時点でも杆体応答に変化は観察されなかった。８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、賦形剤注入対照と比べて、注入後５～７週目に錐体機能に頑強で有意な増加を示したが、１２～１５週目では示さなかった。これらの眼は杆体機能に両方の時点で有意な減少を示した。

グループ８（ＡＡＶ８．ＣＭＶ／ＣＢＡ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）：
どちらの用量で注入された眼でも注入後５～７又は１２～１５週目で賦形剤注入眼と比べて錐体応答に変化はなかった。さらに、両方の用量は、両方の時点で杆体応答に有意な減少を生じた。

グループ１０（ＷＰＲＥを有するＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３天然）：
いずれの用量で注入した眼でも、注入後５～７と１２～１５週目の両方で賦形剤注入対照と比べて錐体応答の有意な改善を示した。８Ｅ８ｖｇを注入した眼では、注入後５～７週目で錐体応答に変化はなかったが、杆体応答は８Ｅ９ｖｇを注入した眼では注入後５～７週目までに確かに有意に減少した。さらに、両方の用量は注入後１２～１５週目で杆体応答の減少をもたらした。

グループ１１（ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）：
８Ｅ８ｖｇを注入した眼は、注入後５～７と１２～１５週目の両方で錐体応答に頑強で有意な改善を示し、杆体応答に変化はなかった。８Ｅ９ｖｇを注入した眼も、両方の時点で錐体応答の有意な改善を示したが、それらの眼は杆体応答の減少も示した。

グループ１２（ＡＡＶ９．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）：
８Ｅ８ｖｇを注入した眼ではどちらの時点でも錐体応答に有意な改善はなかった。８Ｅ９ｖｇを注入した眼は両方の時点で錐体応答に有意な改善を確かに示したが、杆体応答は注入後５～７週目までに有意に減少した。

グループ１４（ＷＰＲＥを有するＡＡＶ９．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３天然）：
８Ｅ８又は８Ｅ９ｖｇを注入した眼は、注入後５～７と１２～１５週目の両方で錐体応答に中程度から頑強までの増加を示した。しかし、いずれの用量の注入でも、注入後１２～１５週目までに杆体応答に有意な減少をもたらした。

グループ１（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３天然）、２（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）、１１（ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）、６（ＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３）、及び１４（ＷＰＲＥを有するＡＡＶ９．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３天然）での低用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）のＡＡＶは、注入後両方の時点で杆体機能の保持及び錐体機能の改善をもたらした。

これらの試験グループ間ではＳ－又はＬ／Ｍタイプの錐体機能に有意差はない。

ＡＡＶグループ１１（ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）は、グループ１（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３天然）、２（ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）、及び１４（ＷＰＲＥを有するＡＡＶ９．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３天然）で使用されるＡＡＶよりも杆体機能に対する影響は有意に低い。

グループ１１（ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）及び１２（ＡＡＶ９．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）での高用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）のＡＡＶは、両方の時点で杆体機能の保持及び錐体機能の改善をもたらした。

杆体機能は、注入後１２～１５週目のグループ１１（ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）では８Ｅ９ｖｇ／眼よりも８Ｅ８ｖｇ／眼でのほうが有意に良好である。

注入後１２～１５週目ではグループ１１（ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）と１２（ＡＡＶ９．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化）の間には８Ｅ９ｖｇ／眼では杆体機能に違いはない。

組織診断、免疫組織化学、及びタネルアッセイ結論：
組織学的評価により、高いほうの投与量のすべての試験物質を注入したマウスにおいて光受容体の消失、炎症及び異常な網膜構造の存在が明らかにされた。

ｈＣＮＧＡ３の発現がプロモーターＣＭＶ．ＣβＡにより駆動された、ＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３を注入されたマウスの網膜構造は、有意に損傷を受けていることがわかった。

試験物質を低いほうの投与量８Ｅ８ｖｇ／眼で注入されたマウスでは、有意な組織学的変化又は炎症の存在は明らかにされなかった。

試験物質を高いほうの投与量８Ｅ９ｖｇ／眼で注入されたマウスでは、有意な組織学的変化又は炎症が示された。網膜構造をもたらす上でのベクター間の変動に注目した。

それぞれＲＫ１及びｈＣＡＲプロモーターで駆動させるコドン最適化及びコドン最適化変異体３ｈＣＮＧＡ３を用いたｈＣＮＧＡ３ヌルマウス網膜組織の形質導入により、ｈＣＮＧＡ３の光受容体細胞への局在化がもたらされた。局在化は、注入された投与量ではすべての試験物質の間で類似していた。

ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化及びＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３を注入したマウス間でのｈＣＮＧＡ３の発現の変わりやすさは相対的に低い。ＡＡＶ９．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化を注入されたマウスでは、ｈＣＮＧＡ３の発現は同じコホートの動物間で不定であることがわかった。

アポトーシス細胞の存在は、任意の試験物質を注入されたマウスの網膜において明らかではなかった。

全体的な結論：ＡＡＶ．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３、ＡＡＶ．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３の網膜下注入により、網膜の光受容体細胞へのｈＣＮＧＡ３導入遺伝子の頑強な送達がもたらされた。高いほうの用量（８Ｅ９ｖｇ／眼）でのすべての試験物質の網膜下送達により、網膜において炎症及び変性的変化が生じた。網膜の組織病理学的変化の重症度は、使用されるプロモーターへの依存性を示した。ｈＣＮＧＡ３の発現がＣＭＶ－ＣβＡにより駆動されるベクターはより重症の網膜変性的変化をもたらし、続いてＲＫ１、次にｈＣＡＲであった。炎症性変化は低いほうの用量（８Ｅ８ｖｇ／眼）のベクターを注入した後で炎症性変化が気づかれたが、それほど重症ではなかった。この報告の結果により、ウイルス用量８Ｅ８ｖｇ／眼での、光受容体特異的プロモーターにより駆動されるｈＣＮＧＡ３コドン最適化ｃＤＮＡのＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシドによる送達、又はＡＡＶ８キャプシドによる送達を通じた光受容体特異的プロモーターにより駆動されるｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３ｃＤＮＡの送達が、最小限の毒性で網膜光受容体におけるｈＣＮＧＡ３タンパク質の産生に十分であることが確立される。

死後の組織病理診断により、高用量でのすべての試験物質の網膜下送達により、網膜に炎症及び変性的変化が生じることが明らかにされた（付録６）。低用量で注入された眼の間では、ＣＭＶ／ＣβＡプロモーターを有するベクターを受けた眼は重度の網膜組織病理学的変化を示した。組織病理学的所見では、浸潤細胞が存在する、賦形剤を注入された試料を含む１０８の試料が明らかにされた。網膜層は、賦形剤を注入された試料を含む９８の網膜で悪化していた。スコア化された３２０の眼のうちの４０が、脈絡膜又は硝子体に炎症細胞を示し、これはグループ全体にわたって分布しており、３２の試料が網膜下腔で観察された稀なマクロファージを含んでいた。

３つの試験物質、ＡＡＶ８．ＣＭＶ／ＣβＡ－ｈＣＮＧＡ３天然、ＡＡＶ８．ＣＭＶ／ＣβＡ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３、及びＡＡＶ９．ＣＭＶ／ＣβＡ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化は、そのすべてが構成的プロモーターにより駆動された場合、組織損傷を引き起こし、したがって、この研究報告に含めなかった。観察された減少した錐体機能は、Ｃｎｇａ^-/-マウスの以前報告された表現型と一致していた。眼炎症は、遺伝子療法
ベクター又は賦形剤対照を用いた網膜下注入に続いて１頭の動物だけで検出された。ウイルス試験物質を受けた動物は疾病率も瀕死も増加を示さなかった。ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化又はＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３の８Ｅ８ｖｇ／眼の送達により、賦形剤処置眼と比べて、網膜組織像の有意な保存及び改善された視覚機能がもたらされた。これらの結果をもとに、ＡＡＶ８．ＲＫ１－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化又はＡＡＶ８．ｈＣＡＲ－ｈＣＮＧＡ３コドン最適化変異体３の網膜下送達はＣｎｇａ３^-/-マウスにおいてＡＣＨＭの進行を止めるのに十分であると、我々は結
論付ける。

２０１５年１２月１４日に申請された仮特許出願第６２／２６６，７８９号明細書、２０１７年６月１４日に申請された仮特許出願第６２／５１９，８２１号明細書、国際公開第２０１７／１０６２０２号パンフレットを含む本明細書において引用されたすべての公開文書は、引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。同様に、本明細書で言及されかつ添付の配列表中に現れる配列番号は引用することにより本明細書の内容となる。特定の態様に言及して本発明を説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修正を成し得ることはわかるであろう。そのような修正は添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。

以下の情報は、識別番号＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列について提供される。

Claims

ＡＡＶキャプシドと、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む核酸配列と、ヒト環状ヌクレオチド感受性チャンネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）をコードする核酸配列と、宿主細胞におけるＣＮＧＡ３の発現を方向付ける発現調節配列とを含む、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
前記ＣＮＧＡ３配列が配列番号１０又は配列番号１２のタンパク質配列をコードする請求項１に記載のＡＡＶベクター。
前記ＣＮＧＡ３配列が配列番号９を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のＡＡＶベクター。
前記ＣＮＧＡ３配列が配列番号１１を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のＡＡＶベクター。
前記ＣＮＧＡ３配列が配列番号９を含み、発現調節配列がロドプシンキナーゼ１（ＲＫ１）プロモーターを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ＲＫ１プロモーター配列が配列番号３０のヌクレオチド１７５－６８４である請求項５に記載のＡＡＶベクター。
前記ＣＮＧＡ３配列が配列番号１１を含み、発現調節配列がヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）プロモーターを含むことを特徴とする請求項１、２及び４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ｈＣＡＲプロモーター配列が配列番号３３のヌクレオチド１７５－１０７８又は配列番号３３のヌクレオチド１８１－１０７８で表されるものであることを特徴とする請求項７に記載のＡＡＶベクター。
配列番号４５を含む環状ヌクレオチド感受性チャンネルベータ３（ＣＮＧＢ３）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列。
請求項９に記載のｃＤＮＡ配列を含む発現カセット。
ＡＡＶキャプシドと、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む核酸配列と、ヒト環状ヌクレオチド感受性チャンネルベータ３（ＣＮＧＢ３）をコードする配列番号４５の核酸配列と、宿主細胞における前記ＣＮＧＢ３の発現を方向付ける発現調節配列とを含む、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
前記発現調節配列がＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター、ＲＫ１プロモーター又はｈＣＡＲプロモーターを含むことを特徴とする請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
前記発現調節配列が眼細胞特異的プロモーターを含むことを特徴とする請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
前記発現調節配列はヒトＥＦ１αプロモーター、代謝型グルタミン酸受容体６（ｍＧｌｕＲ６）プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、及び転写因子プロモーター（神経網膜ロイシンジッパー（Ｎｒｌ）及び光受容体特異的核受容体Ｎｒ
２ｅ３、ｂＺＩＰ）から選ばれるプロモーターを含む請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
前記発現調節配列は、誘導可能なプロモーター、構成的プロモーター及び組織特異的プロモーターから選ばれる１のプロモーターを含む請求項１１に記載のＡＡＶ。
前記プロモーターは、ラパマイシン／ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）プロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン－反応性プロモーター、テトラサイクリン－反応性プロモーター、及びヘテロダイマーリプレッサースイッチから選ばれる誘導可能なプロモーターである、請求項１５に記載のＡＡＶベクター。
ＡＡＶキャプシドとＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む核酸配列と、ヒトＲａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ－１）をコードする配列番号１の核酸配列と、宿主細胞において前記ＲＥＰ－１の発現を方向付けるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを有するニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含む発現調節配列とを含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
イントロン、コザック配列、ポリＡ及び転写後調節要素の１つ以上をさらに含む、請求項１から８又は請求項１１から１７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７ｍ８及びそれらの変異体から選ばれる請求項１から８又は１１から１８のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ベクターがＡＡＶＡ８キャプシドを有するｒＡＡＶである請求項１から８又は１１から１９のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ベクターがＡＡＶＡ９キャプシドを有するｒＡＡＶである請求項１から８又は１１から２０のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ＩＴＲ配列が前記キャプシドタンパク質を供給するものとは異なるＡＡＶに由来する請求項１から８又は１１から２１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
前記ＩＴＲ配列がＡＡＶ２に由来する請求項１から８又は１１から２２のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
薬学的に許容され得る担体と請求項１から８又は１１から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターの少なくとも１を含む薬学的組成物。
請求項１７又は１８から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターを必要とする被験者に投与することを含む、コロイデレミアの処置方法。
請求項２から８，１１から１６，及び１８から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターを必要とする被験者に投与することを含む、色覚異常の処置方法。
前記ＡＡＶベクターを網膜下に投与する、請求項２５又は２６に記載の方法。
前記被験者は哺乳類である、請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
前記被験者はヒトである、請求項２８に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターを別の治療との組み合わせにおいて投与する、請求項２５から２９のいずれかに記載の方法。
前記ＡＡＶベクターを約１０⁷個～約１０¹³個のベクターゲノム（ＶＧ）の用量で投与す
る、請求項２５から３０のいずれかに記載の方法。
前記ＡＡＶベクターを約１００μＬ～約５００μＬの容積で投与する、請求項２５から３１のいずれかに記載の方法。
前記ＡＡＶベクターを１回以上投与する、請求項２５から３２のいずれかに記載の方法。
ＡＡＶベクターを作製するためのプラスミドであって、該プラスミドは配列番号１又は配列番号９又は配列番号２５又は配列番号２６又は配列番号２７又は配列番号２８又は配列番号３０から４４のいずれか、あるいはそれらと少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含むプラスミド。
請求項３４のプラスミドを保有するパッケージング細胞を、感染性ＡＡＶエンベロープ又はキャプシド中への遺伝子発現カセットウイルスゲノムのパッケージングを可能とするのに十分なウイルス配列の存在下で培養することを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスの作製方法。
請求項３５の方法に従って作製される組換えＡＡＶ。
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、又は配列番号２８のいずれかのヌクレオチド１－４２３３を含むベクターゲノムを含む、ウイルスベクター。
５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＢＡエキソン１及びイントロン、コザック配列、コドン最適化ＲＥＰ－１、ｂＧＨポリＡ、及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含むウイルスベクター。
５’ＩＴＲ、ＲＫ１プロモーター，配列番号９のコドン最適化ＣＮＧＡ３，ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含むウイルスベクター。
５’ＩＴＲ、ｈＣＡＲプロモーター、配列番号１１のコドン最適化ＣＮＧＡ３、ｂＧＨポリＡ及び３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを含むウイルスベクター。
配列番号３１のヌクレオチド１－３１８９を含むベクターゲノムを含むウイルスベクター。
配列番号３５のヌクレオチド１－３７４８を含むベクターゲノムを含む、ウイルスベクター。
請求項２から８、１１から１６又は１８から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター又は請求項３９から４２のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む、色覚異常の治療方法における使用のための組成物。
色覚異常の治療のための薬剤の製造における、請求項２から８、１１から１６又は１８から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター又は請求項３９から４２のいずれか１項に記載のウイルスベクターの使用。
請求項１７又は１８から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター又は請求項３７又は３８に記載のウイルスベクターを含む、コロイデレミアの治療方法における使用のための組成物。
コロイデレミアの治療のための薬剤の製造における、請求項１７又は１８から２３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター又は請求項３７又は３８に記載のウイルスベクターの使用。