JP2022524951A - 腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境にコロニー形成するよう操作した免疫刺激性細菌 - Google Patents

腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境にコロニー形成するよう操作した免疫刺激性細菌 Download PDF

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Abstract

腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍常在免疫細胞へのコロニー形成が増加し、抗腫瘍活性が増強した送達免疫刺激性細菌が提供される。免疫刺激性細菌は、鞭毛をコードする遺伝子の欠失による修飾または機能的鞭毛が産生されないように遺伝子の修飾および／またはｐａｇＰの欠失による修飾または不活性ＰａｇＰ産物を産生するようｐａｇＰの修飾により修飾される。その結果、免疫刺激性細菌はフラジェリン”および／またはｐａｇＰ’である。免疫刺激性細菌は、所望により細菌がアデノシンおよび／またはプリン栄養要求株となるさらなるゲノム修飾を有する。細菌は、所望によりａｓｃｔ、ｐｕｒＩ’およびｍｓｂＢ’の１以上のである。サルモネラ種などの免疫刺激性細菌は、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)発現を誘導するタンパク質またはＩ型ＩＦＮ発現を誘導する活性が増加したそのバリアントまたはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすそのバリアントをコードするよう修飾される。細菌は、ヒトＳＴＩＮＧと比較して低ＮＦ－κＢシグナル伝達活性、および、所望により、高Ｉ型ＩＦＮ経路シグナル伝達活性である、非ヒト種からの修飾インターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)タンパク質をコードし得る。細菌は、優先的に腫瘍微小環境における免疫細胞または腫瘍常在免疫細胞に感染するおよび／または他の細胞より免疫細胞で細胞死を誘導しない。免疫刺激性細菌の投与による固形腫瘍の増殖を阻害するまたは体積を低減する方法もまた提供される。

Description

関連出願
出願人アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッドおよび発明者クリストファー・ディ・サノス、ローラ・ヒックス・グリックマン、ジャスティン・スコーブル、アレクサンドル・チャールズ・ミシェル・イアネッロおよびハイシン・キーオの、「Immunostimulatory Bacteria Engineered To Colonize Tumors, Tumor-Resident Immune Cells, And The Tumor Microenvironment」なる表題の２０２０年１月１６日出願の米国仮出願６２／９６２,１４０に基づく優先権の利益を主張する。
出願人アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッドおよび発明者クリストファー・ディ・サノス、ローラ・ヒックス・グリックマン、ジャスティン・スコーブルおよびアレクサンドル・チャールズ・ミシェル・イアネッロの、「Immunostimulatory Bacteria Engineered To Colonize Tumors And The Tumor Microenvironment」なる表題の２０１９年１１月１２日出願の米国仮出願６２／９３４,４７８に基づく優先権の利益も主張する。
出願人アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッドおよび発明者クリストファー・ディ・サノス、ローラ・ヒックス・グリックマン、ジャスティン・スコーブルおよびアレクサンドル・チャールズ・ミシェル・イアネッロの、「Salmonella Strains Engineered To Colonize Tumors And The Tumor Microenvironment」なる表題の２０１９年４月０３日出願の米国仮出願６２／８２８,９９０に基づく優先権の利益も主張する。
出願人アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッドおよび発明者クリストファー・ディ・サノス、ローラ・ヒックス・グリックマン、ジャスティン・スコーブルおよびアレクサンドル・チャールズ・ミシェル・イアネッロの、「Tumor-Targeting Microorganisms that Promote Immuno-Stimulation of the Tumor Microenvironment」なる表題の２０１９年２月２７日出願の米国仮出願６２／８１１,５２１に基づく優先権の利益も主張する。
許容される限り、これら出願の各々の主題を、引用により全体として本明細書に包含させる。これら出願の各々において提供される免疫刺激性細菌を本明細書に記載のとおり修飾でき、かつこのような細菌は、引用により本明細書に包含させる。
電子的に提出した配列表の参照による取り込み
配列表の電子バージョンをここに提出し、その内容を、引用により全体として本明細書に包含させる。電子ファイルは２０２０年２月２７日に作成し、６０３キロバイトサイズであり、1706SEQPC.txtなる名称である。
背景
腫瘍は、深く免疫抑制性の環境を発展させてきた。免疫監視を回避する複数の機構を創始し、抗腫瘍免疫細胞を免疫抑制させるために再プログラム化し、最新癌治療に対する抵抗性を継続的に変異させている(例えば、Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8):561-584)。癌免疫療法分野は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント抗体の臨床的成功により証明されるとおり、大きな進歩を遂げている(例えば、Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125: 3377-3383; Hodi et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3392-4000;およびChen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391参照)。現在の免疫療法の自己免疫性関連毒性を制限しながら、免疫耐容性および回避を克服する免疫療法の設計は、癌免疫学分野の課題である。それ故に、付加的かつ革新的免疫療法および他の治療が必要である。
概要
ここに提供されるのは、抗癌治療のために免疫刺激性であるように修飾された細菌である。ここに提供される免疫刺激性細菌は、抗腫瘍治療に多面的アプローチを提供する。細菌は、抗腫瘍免疫刺激性活性を引き出す多くの経路をもたらすプラットフォームを提供する。ここで提供するサルモネラ種のような細菌は、腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および／または腫瘍微小環境(ＴＭＥ)の中に蓄積または標的とする能力の増強により、強力な抗腫瘍活性を有するように綿密に調製されている。これは、例えば、それらが感染できる細胞のタイプ(指向性)、毒性、補体による不活性化回避などの免疫系を回避する能力および／または増殖できる環境を変える修飾により達成され得る。免疫刺激性細菌はまた、例えば、免疫応答を誘導または増強する産物および他の治療剤／抗癌剤もコードできる。ここに提供される免疫刺激性細菌は、腫瘍／腫瘍微小環境／腫瘍常在免疫細胞のコロニー形成および補体および他の抗細菌免疫応答に対する抵抗性の改善により、全身投与され得る。
細菌は、生来免疫系を刺激する；細菌感染は免疫および炎症経路ならびに応答を誘導し、その一部は抗腫瘍処置に望ましく、他方は望ましくない。望ましくない炎症応答をもたらす遺伝子および産物の欠失または修飾および望ましい免疫刺激性抗腫瘍応答を誘導する遺伝子の付加または修飾による細菌の修飾は、細菌の抗腫瘍活性を改善する。
細菌は腫瘍細胞および組織に蓄積し、その中で複製することにより細胞を溶解できる。細菌は投与部位から移動し、他の(例えば、遠位／転移)腫瘍および腫瘍細胞に蓄積して、遠達効果を提供できる。ここに提供される細菌は、優先的に腫瘍常在免疫細胞、腫瘍および腫瘍微小環境に感染かつ蓄積し、治療抗癌タンパク質をコードするプラスミドおよび産物を送達するように修飾される。ここで、その細菌のこれらの性質は、個々にかつ相乗的に作用し得る複数の抗腫瘍活性および性質を伴う確実に免疫刺激性の細菌を生じるよう利用されている。
ここに提供される細菌のゲノムは腫瘍および腫瘍常在免疫細胞およびまた腫瘍微小環境における蓄積が増加するように修飾される。これは、ここでは、上皮細胞などの非腫瘍細胞の感染または侵襲を担う遺伝子の欠失または無効化および／または特に免疫細胞および腫瘍常在免疫細胞への細菌の細胞病原性の低下により実施される。
腫瘍常在免疫細胞への蓄積により、真核生物制御シグナル制御下に、プラスミドにコードされたタンパク質が発現され、ＴＭＥに分泌される。ここに提供される免疫刺激性細菌は、抗腫瘍免疫応答の修飾によるような抗癌活性を有するタンパク質をコードする。ここに提供される細菌は、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすタンパク質をコードする。このようなタンパク質は、ＳＴＩＮＧ(インターフェロン遺伝子刺激物質)およびＩ型ＩＦＮの発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である他の免疫刺激性タンパク質および、またＩ型ＩＦＮの発現を増加させるまたはＩＦＮの構成的発現をもたらすこれらタンパク質のバリアントを含む。例えば、免疫刺激性タンパク質は、機能獲得型変異を有するものなどのサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの構成的活性型バリアントを含む。
組成物、その使用および癌の処置を含む疾患の処置のために免疫応答を調節する方法が提供される。組成物は、ここに提供される免疫刺激性細菌を含む。処置方法および処置のための細菌の使用もまた提供される。処置対象は、ヒトおよび他の霊長類、イヌおよびネコなどのペットならびにウマ、ウシおよびその他の農業用のおよび動物園の動物などの他の動物を含む。
免疫刺激性細菌を含む医薬組成物ならびに疾患および障害、特に固形腫瘍および血液系腫瘍を含む腫瘍などの増殖性障害の処置のための方法および使用が提供される。
免疫刺激性細菌または医薬組成物の投与によりまたは処置のための組成物の使用により固形腫瘍の増殖を阻害するまたは体積を低減する方法もまた提供される。例えば、固形腫瘍癌を有するヒト患者などの対象に、単回投与量で有効量のサルモネラ種などの免疫刺激性細菌を含む組成物を投与するまたは使用する方法が提供される。
Ｉ型ＩＦＮの発現を刺激または誘起する構成的活性型タンパク質をコードする免疫刺激性細菌が提供される。免疫刺激性細菌はまたＲＮＡｉおよびサイトカインおよびケモカインなどの他の抗腫瘍治療剤をコードでき、ここに記載する他の細菌およびプラスミドの修飾を、あらゆる所望の組み合わせで組み合わせ得る。
腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍常在免疫細胞のコロニー形成が増強されたおよび抗腫瘍活性が増強された免疫刺激性細菌が提供される。免疫刺激性細菌は、鞭毛をコードする遺伝子の欠失および／または機能的鞭毛が産生されないよう遺伝子の修飾および／またはｐａｇＰの欠失または不活性ＰａｇＰ産物を産生するようｐａｇＰの修飾により修飾される。その結果、免疫刺激性細菌はフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－である。これとは別にまたはこれに加えて、免疫刺激性細菌はｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－であり得る。
免疫刺激性細菌は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードする内因性遺伝子の全てまたは一部の破壊または欠失によるなどアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－(ａｓｄ－)であり得て、それにより内因性ａｓｄは発現されない。免疫刺激性細菌は、細菌がインビボで複製が制限されるように、インビトロで細菌増殖のために細菌プロモーター制御下にプラスミドでアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードするように修飾され得る。
免疫刺激性細菌は、所望により、細菌がアデノシンまたはプリン栄養要求株であるようなさらなるゲノム修飾を有する。細菌は、所望によりａｓｄ－、ｐｕｒＩ－およびｍｓｂＢ－の１以上であり得る。サルモネラ種などの免疫刺激性細菌は、腫瘍微小環境における抗腫瘍活性を付与する免疫刺激性タンパク質をコードするように修飾されるおよび／または細菌が腫瘍微小環境または腫瘍常在免疫細胞における免疫細胞に優先的に感染するおよび／または他の細胞より少ない免疫細胞の細胞死を誘導するように修飾される。免疫刺激性細菌の投与による固形腫瘍の増殖を阻害するまたは体積を低減する方法もまた提供される。
免疫刺激性細菌のゲノムがフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)であり、それにより鞭毛が産生されないおよび／またはｐａｇＰ－であるように修飾することによる、サルモネラ種などのような免疫刺激性細菌の腫瘍コロニー形成を増加させる方法が提供される。特に、細菌はフラジェリン－ アデノシン栄養要求株であり、ａｓｄ－でもある。フラジェリン－である細菌は、鞭毛を発現する細菌種由来である。
細菌はまた抗腫瘍剤、対象の免疫応答を増加させるタンパク質および／またはインターフェロン－βを含むＩ型インターフェロン(ＩＦＮ)のような免疫刺激タンパク質の構成的発現または発現増加をもたらすタンパク質などの治療産物をコードするプラスミドも含む。これは、Ｉ型ＩＦＮ発現をもたらす経路の一部として免疫系を刺激するタンパク質であって、特に、このようなタンパク質を構成的活性型とするもののコード化を含む。プラスミドはまた、対象における抗腫瘍免疫応答を増加するサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質もコードし得る。細菌は、免疫チェックポイント遺伝子および産物および免疫抑制性である経路で役割を有する他の標的を抑制、阻害、妨害または他にサイレンシングするよう設計されたマイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡなどの抗癌治療剤をコードするプラスミドを含む。細菌はまた腫瘍に対する免疫応答を刺激するプラスミドに腫瘍抗原もコードし得る。コード化タンパク質は、哺乳動物および動物またはウイルスプロモーターなどの真核生物により認識されるプロモーターの制御下に発現される。細菌は、機能獲得型免疫刺激性タンパク質および／またはサイトカインの組み合わせを含む、１個、２個またはそれ以上の治療タンパク質／産物を発現し得る。これら異種タンパク質は、真核生物宿主により認識される、ＲＮＡポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターなどのプロモーター制御した、プラスミド上にコード化される。
真核生物プロモーター制御下に産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激性細菌であって、免疫刺激性細菌のゲノムが修飾され、それにより細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－である細菌が提供される。細菌は、フラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)およびｐａｇＰ－の一方または両方であり得る。これらの免疫刺激性細菌は、腫瘍／腫瘍微小環境および腫瘍常在免疫細胞コロニー形成の増加を示し、増加した抗腫瘍活性を有する。
真核生物プロモーター制御下に治療産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激性細菌であって、免疫刺激性細菌のゲノムが修飾され、それにより細菌がｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である細菌もまた提供される。これらの細菌は、腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境のコロニー形成も増加する。細菌膜および構造の結果的変化により、補体活性などの宿主免疫応答が、細菌が全身投与により排除されないよう改変される。これらの細菌はフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)であってもよく、細胞の、感染し、腫瘍微小環境、腫瘍および腫瘍常在免疫細胞における蓄積をもたらし得るよう改変する修飾を含む、ここに記載する他の修飾も含み得る。それ故に、ここに提供される免疫刺激性細菌を全身投与し、高レベルの腫瘍／腫瘍微小環境および／または腫瘍常在免疫細胞コロニー形成を示し得る。免疫刺激性細菌は、ｐｕｒＩ－(ｐｕｒＭ－)、ａｓｄ－およびｍｓｂＢ－の１以上およびフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)およびｐａｇＰ－の一方または両方であり得る。
免疫刺激性細菌は、ｐｕｒＩ－(ｐｕｒＭ－)、ｍｓｂＢ－、ｐｕｒＤ－、フラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)、ｐａｇＰ－、ａｄｒＡ－、ｃｓｇＤ－、ｑｓｅＣ－、ｈｉｌＡ－、ｌｐｐＡ－およびｌｐｐＢ－および特にフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－および／またはｍｓｂＢ－／ｐａｇＰ－の１以上であり得る。例えば、免疫刺激性細菌は、宿主における非免疫細胞の毒性または感染性を低減する欠失または破壊などの、ゲノムにおける変異を含み得る。例えば、免疫刺激性細菌はｐａｇＰ－であり得る。他の例として、免疫刺激性細菌はフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)であり得て、かつｐａｇＰ－でもあり得る。細菌を、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境(ＴＭＥ)に蓄積し、治療産物を発現し、それにより免疫療法抗腫瘍産物を有益な活性を有する環境に送達し、他の細胞／環境における発現による有害なまたは毒性副作用を回避するように修飾し得る。免疫刺激性タンパク質／治療産物をコードする核酸は、発現のために分泌シグナルをコードする核酸に操作可能に連結でき、それにより、発現により、宿主において、免疫刺激性タンパク質／治療産物が腫瘍微小環境に分泌される。
上記のとおり、免疫刺激性細菌のゲノムは、細菌が腫瘍常在免疫細胞などの免疫細胞に優先的に感染するようにも修飾されるおよび／またはゲノムは細菌が非修飾細菌より少ない腫瘍常在免疫細胞の細胞死を誘導する(パイロトーシス減少)ように修飾される。その結果、免疫刺激性細菌は、腫瘍または腫瘍微小環境または腫瘍常在免疫細胞に蓄積するか、または修飾がないものより大きな程度で蓄積し、それにより免疫刺激性タンパク質およびその構成的活性型バリアントおよび他の治療産物を細胞に送達し、Ｉ型インターフェロンの発現を刺激または誘導する。細菌は、フラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)、ｐａｇＰ－およびｍｓｂＢ－の１以上であり得て、ここに記載するような他の修飾を含み得る。
免疫刺激性細菌は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードする内因性遺伝子の全てまたは一部の破壊または欠失によるなど、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－(ａｓｄ－)でもあり得て、それにより内因性ａｓｄは発現されない。これらの免疫刺激性細菌は、細菌がインビトロで産生され得るように、細菌プロモーター制御下にプラスミドでアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードするように修飾され得る。
免疫刺激性細菌は、アデノシンおよびアデニンなどの腫瘍微小環境で多いまたは蓄積される特定の栄養素に対して栄養要求性とし得る。また、複製能を低減または排除するために、このような栄養素に対して栄養要求性であるよう修飾し得る。不活性化／欠失細菌ゲノム遺伝子は、宿主により認識されるプロモーター制御下にそれらを置くことにより補われ得る。
さらに、免疫刺激性細菌のゲノムを、腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するように修飾する。これは、細菌侵襲性または感染性に役割を有するおよび／または細胞死誘導に役割を有する細菌遺伝子の欠失または破壊により達成される。細菌は、腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するおよび／または非修飾細菌よりもしくは細菌が感染できる他の細胞より少ない細胞死をこのような細胞に誘導するように修飾される。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、細菌が誘導する腫瘍常在免疫細胞の細胞死が少なくなる細菌ゲノムの修飾；および／または細菌が腫瘍、ＴＭＥまたは腫瘍常在免疫細胞により効率的に蓄積するようにする細菌ゲノムの修飾を含み得る。これらの免疫刺激性細菌を、細菌が腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するように修飾できるおよび／または免疫刺激性細菌のゲノムを、腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少ない(パイロトーシス減少)ように修飾でき、それにより免疫刺激性細菌が腫瘍または腫瘍微小環境または腫瘍常在免疫細胞に蓄積し、それによりＩ型ＩＦＮ発現を刺激または誘導するように構成的活性型免疫刺激性タンパク質または他の治療産物を細胞に送達する。
免疫刺激性細菌は、ＳＰＩ－１依存的侵襲(および／またはＳＰＩ－２)に関与する１以上の遺伝子またはオペロンの欠失または修飾を含み得て、それにより免疫刺激性細菌は上皮細胞に侵襲または感染しない。欠失または不活性化され得る遺伝子の例は、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢおよびｓｐｔＰの１以上である。上皮細胞に感染する能力の排除は、ｒｃｋ、ｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢおよびｓｒｇＣから選択される遺伝子の１以上などの、ＳＰＩ－１非依存的侵襲に関与するタンパク質をコードする遺伝子のノックアウトまたは欠失を含むように、ここに記載する免疫刺激性細菌を操作することにより達成され得る。同様に、免疫刺激性細菌は、例えば、細菌がサルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)を回避するように、ＳＰＩ－２における遺伝子および／またはオペロンの欠失を含み得る。これらの遺伝子は、例えば、ｓｉｆＡ、ｓｓｅＪ、ｓｓｅＬ、ｓｏｐＤ２、ｐｉｐＢ２、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｓｐｖＢおよびｓｔｅＡを含む。
例えば、免疫刺激性細菌は、修飾がない細菌と比較して、病原性が低減し、それにより上皮および／または他の非免疫細胞の感染が低減するように修飾できる。これらは、３型分泌装置(Ｔ３ＳＳ)または４型分泌装置(Ｔ４ＳＳ)の修飾、例えば、ここに記載し、例示するサルモネラのＳＰＩ－１経路またはＴ３ＳＳ系の修飾を含む。細菌は、さらに、細菌の病原性を低減する、ＰａｇＰ(リピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ)をコードする核酸の欠失または破壊によるなど、細胞死の誘導が少ないよう修飾され得る。
ここに提供される免疫刺激性細菌のゲノムを、食細胞のような免疫細胞、特に腫瘍微小環境における免疫細胞の感染を増加または促進するように修飾され得る。これは、上皮細胞のような非免疫細胞の感染低減または免疫細胞の感染増加を含み得る。細菌はまた免疫細胞におけるパイロトーシスが減少するように修飾され得る。細菌ゲノムの多数の修飾は、免疫細胞の感染増加およびパイロトーシスの減少の一方または両方を行い得る。ここに提供される免疫刺激性細菌は、例えば、ｈｉｌＡの破壊または欠失のようなＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ経路に関与する遺伝子の欠失および／または破壊および／またはフラジェリン、棒状タンパク質(ＰｒｇＪ)、針状タンパク質(ＰｒｇＩ)およびＱｓｅＣをコードする遺伝子の破壊／欠失などの修飾を含む。
ヒトのような真核生物宿主で発現するためのプラスミドにコードされる治療産物は、ＲＮＡポリメラーゼIIまたはIIIにより認識されるプロモーターのような真核生物プロモーターを含む真核生物制御配列の制御下にある。これらは、ウイルスおよび哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターを含む。
ウイルスプロモーターの例は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、エプスタイン・バールウイルス(ＥＢＶ)プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーターおよびアデノウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。他のＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターは、伸長因子－１(ＥＦ－１)アルファプロモーターまたはＵｂＣプロモーター(レンチウイルス)またはＰＧＫ(３－ホスホグリセラートキナーゼ)プロモーター、合成ＭＮＤプロモーターおよびＣＡＧＧ(またはＣＡＧ)プロモーターなどの合成プロモーターを含むが、これらに限定されない。合成ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)初期エンハンサー要素(Ｃ)；ニワトリベータ－アクチン遺伝子(Ａ)のプロモーター、第一エクソンおよび第一イントロン；およびウサギベータ－グロビン遺伝子(Ｇ)のスプライスアクセプターを含む。ＭＮＤは、修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域と骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー(マウス白血病ウイルス由来ＭＮＤプロモーター(骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換；例えば、Li et al. (2010) J. Neurosci. Methods 189:56-64参照)を含む、合成プロモーターである。他の強い制御可能または構成的プロモーターが使用され得る。プロモーターの例は、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＥＩＦ４Ａ１、ＣＡＧおよびＣＤ６８プロモーターである。制御配列はまたターミネーター、エンハンサー、分泌および他の輸送シグナルも含む。
免疫刺激性細菌に含まれるプラスミドは、低コピー数複製起点のような中乃至低コピー数をもたらす複製起点の選択によるような、低コピー数または中コピー数で存在し得る。細菌の抗腫瘍活性および他の性質が、プラスミドが低乃至中コピー数で存在するとき改善されることがここで示され、ここで、中コピー数は１５０未満または約１５０未満かつ２０または約２０超または２０もしくは２５～１５０であり、低コピー数は２５未満または２０未満または約２５未満または約２０未満のコピーである。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、ここに記載しかつ例示するように、免疫刺激性タンパク質を発現および／または腫瘍微小環境もしくは腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染および／またはその中の免疫細胞に低毒性であるようにさらに修飾された、米国出願１６／０３３,１８７に記載の株および細菌の何れかを含む。
コード化治療タンパク質／産物
免疫刺激性細菌は、細菌のプラスミド上に、哺乳動物対象で発現されたとき、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を付与するまたは貢献する治療タンパク質または産物を、真核生物プロモーターの制御下にコードする。
免疫刺激性細菌によりコードされる産物は、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質およびそのバリアントを含む。これらは、活性が増加したバリアントタンパク質およびＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらすバリアントタンパク質を含む。これらはまた、天然にまたは変異により、望ましくない免疫応答をもたらす経路におけるシグナル伝達活性が減少しているが、天然ヒトタンパク質と同等以上のＩ型インターフェロン刺激活性および／またはインターフェロン－β刺激活性を有する、タンパク質も含む。特に、免疫刺激性細菌は、非修飾形態で、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である、免疫刺激性タンパク質の機能獲得型(ＧＯＦ)バリアントをコードする。例は、ヒトにおいて、インターフェロン症を促進するまたは引き起こす、免疫刺激性タンパク質の機能獲得型、構成的活性型バリアントであり、ここで、免疫刺激性細菌のゲノムが細菌が腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するように修飾されているおよび／または免疫刺激性細菌のゲノムが腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少ない(パイロトーシス減少)ように修飾されており、それにより免疫刺激性細菌が腫瘍または腫瘍微小環境または腫瘍常在免疫細胞に蓄積し、それによりＩ型ＩＦＮの発現を刺激または誘導するように細胞に構成的活性型免疫刺激性タンパク質を送達する。バリアントは、免疫刺激性タンパク質におけるリン酸化部位を排除する変異を含み得て、それにより活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達を低減する。これらは、例えば、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００およびそのバリアント、例えばインターフェロン症で発現されるものおよび構成的活性を有するかまたは活性が増加したその保存的変種を含む。ある実施態様において、これらは、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５のようなＩ型ＩＦＮを誘導するタンパク質および活性が増加したまたは構成的活性を有するそのバリアントを含み、ここで、免疫刺激性タンパク質はＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５である。
それ故に、ここで、非修飾形態で、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である免疫刺激性タンパク質の機能獲得型バリアントをコードする異種核酸を含むプラスミドを含む、免疫刺激性細菌が提供される。これらの機能獲得型タンパク質は、プロモーターおよび所望により他の制御シグナル、例えばエンハンサー、ポリＡおよび転写ターミネーターを含む真核生物制御シグナルの制御下、プラスミド上にコード化される。プラスミド上のタンパク質／産物をコードする核酸は多重化されていてよく、それにより複数の産物がコードされる。多遺伝子共発現のための戦略は、単一ベクターにおける複数のプロモーター、融合タンパク質、遺伝子間のタンパク質切断部位、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)および「自己開裂」(リボソームスキッピング)２Ａペプチドの使用を含む。２Ａペプチドは、真核生物細胞における翻訳中、ポリペプチドの「開裂」に介在する、１８～２２アミノ酸(ａａ)長ウイルスオリゴペプチドである。それ故に、コーディング部分間にＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＥ２Ａなどの２Ａ自己開裂ペプチドを包含させることによる、単一プロモーター制御下、プラスミドで治療産物をコードするプラスミドが提供される。
非修飾形態の免疫刺激性タンパク質は、シグナル伝達経路におけるサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡを感知するタンパク質である。それらは、活性を増加させるおよび／または活性を構成的とするアミノ酸置換または欠失で修飾されたタンパク質を含む。提供されるのは、免疫刺激性タンパク質の機能獲得型、構成的活性型バリアントをコードするプラスミドを含む、免疫刺激性細菌である。これらの機能獲得型タンパク質は、ヒトにおいて、インターフェロン症を促進するまたは引き起こすタンパク質およびＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらすように修飾された、選択されている、機能獲得型変異体を含む、シグナル伝達経路においてＩ型インターフェロンの発現をもたらすタンパク質を含む。非修飾形態の免疫刺激性タンパク質は、直接的または、シグナル伝達経路の一部として、間接的に、Ｉ型インターフェロンの発現を誘導するように、サイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドを感知または相互作用し、バリアントタンパク質はサイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)の感知または相互作用非存在下で、Ｉ型インターフェロンの発現を誘導する。包含されるのは、Ｉ型インターフェロンの発現をもたらすのに、サイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドを必要としない機能獲得型バリアントである。このようなタンパク質の例は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００を含む。
これらの免疫刺激性細菌において、コード化バリアント機能獲得型タンパク質は、免疫刺激性タンパク質におけるリン酸化部位が排除され、それにより活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達が低減されるものであり得る。あるいは、細菌は、リン酸化部位でのアミノ酸セリン(Ｓ)またはスレオニン(Ｔ)の、リン酸化模倣体であり、活性増加または構成的活性をもたらす、アスパラギン酸(Ｄ)への１以上の置換を含み得る。Ｉ型インターフェロン発現をもたらすシグナル伝達経路におけるタンパク質の例は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７およびＭＤＡ５である。ここに記載されるのは、これらのタンパク質の各々について機能獲得型活性をもたらす変異の例である。変異は、コード化免疫刺激性タンパク質がバリアントＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５であり、ウイルス感染の結果リン酸化される１以上のセリン(Ｓ)またはスレオニン残基がアスパラギン酸(Ｄ)に置き換えられ、それにより得られたバリアントは、Ｉ型インターフェロンを構成的に誘導するリン酸化模倣体である。例えば、免疫刺激性タンパク質が、３８５位、３８６位、３９６位、３９８位、４０２位、４０４位および４０５位の残基に１以上の置換を有し、残基がアスパラギン酸残基で置き換えられているＩＲＦ－３である免疫刺激性細菌が提供され；これは、配列番号３１２を基準として、置換３９６Ｄを有するＩＲＦ－３および配列番号３１２を基準として、変異３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄを含むＩＲＦ－３を含む。他の例は、免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－７およびＲＩＧ－Ｉから選択され、変異が次のａ)ＳＴＩＮＧにおいて、配列番号３０５～３０９のヒトＳＴＩＮＧを基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１以上；ｂ)ＭＤＡ５において、配列番号３１０を基準として、Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２ＦおよびＡ４５２Ｔの１以上；ｃ)ＲＩＧ－Ｉにおいて、配列番号３１１を基準として、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；およびｄ)ＩＲＦ－７において、配列番号３１３を基準として、Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ、Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ、Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７ＤおよびΔ２４７－４６７の１以上から選択される、免疫刺激性細菌である。これらの置き換えの何れも、下記例示的保存的アミノ酸置換の表に従う保存的変異で置き換え得る。
上記および本明細書の他の箇所に記載される機能獲得型タンパク質および他の治療産物をコードする核酸を含む、エクソソーム、リポソーム、腫瘍溶解性ウイルス、ナノ粒子、免疫刺激性細菌および他のこのような媒体などの送達媒体もまた提供される。例えば、Ｉ型インターフェロンの発現をもたらすシグナル伝達経路の一部である、機能獲得型免疫刺激性タンパク質をコードする核酸、一般にＤＮＡを含む、送達媒体が提供される。機能獲得型バリアントは、Ｉ型インターフェロンの発現を構成的とし得る。例えば、これらのバリアントは、修飾ＳＴＩＮＧなどのここに記載した何れかを含み、ここで、ＳＴＩＮＧにおける修飾は、その活性を構成的とし、活性のためにｃＧＡＭＰ(または他のリガンド／ＣＤＮ)を必要としない；修飾ＳＴＩＮＧは、修飾ＴＭＥＭ１７３遺伝子によりコードされる；修飾はアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む；そして修飾ＳＴＩＮＧは、非修飾ＳＴＩＮＧと比較して増強された免疫刺激性活性を有する。配列番号３０５～３０９を基準として、ＳＴＩＮＧにおけるこれらのアミノ酸置換は、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１以上を含む。
ここに提供される免疫刺激性細菌はまた、哺乳動物対象で発現されたとき、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を付与するまたは貢献する、免疫刺激性タンパク質をコードするヌクレオチドの配列も含み得る；免疫刺激性タンパク質は、真核生物プロモーターの制御下、細菌におけるプラスミド上にコード化される。プロモーターの例は、伸長因子－１(ＥＦ１)アルファプロモーターまたはＵｂＣプロモーターまたはＰＧＫプロモーターまたはＣＡＧＧまたはＣＡＧプロモーターを含むが、これらに限定されない。
免疫刺激性細菌はまた、哺乳動物対象で発現されたとき、抗腫瘍免疫を付与するまたは貢献する、阻害性ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)もコードし得る。ＲＮＡｉは、真核生物プロモーターの制御下、細菌におけるプラスミド上にコード化される。免疫刺激性細菌のゲノムは、腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少ないおよび／または腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境／腫瘍に蓄積されるように、修飾される。
ここに提供される免疫刺激性細菌はまた他の免疫刺激性タンパク質もコードし得る。免疫刺激性タンパク質は、ケモカインのようなサイトカインであり得る。免疫刺激性タンパク質の例は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５)、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－１８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員／残留性に関与するまたは効果があるまたは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド(ＯＸ４０Ｌ)、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド(４－１ＢＢＬ)、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーメンバーおよび腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーメンバーを含む。ある実施態様において、これらは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５)、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱したＩＬ－２、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－１８、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように修飾されたＩＬ－２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員／残留性に関与するまたは影響するまたは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーメンバー、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストおよび腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーメンバーを含む。
免疫刺激性細菌は、所望により免疫チェックポイントの発現を阻害、抑制または妨害する阻害性ＲＮＡ(ＲＮＡｉ)をコードするヌクレオチドの配列も含み得る。ＲＮＡｉは、細菌のプラスミド上にコード化され得る。免疫刺激性タンパク質および所望によりＲＮＡｉをコードするヌクレオチドは、低乃至中コピー数で存在するプラスミドにあり得る。
免疫刺激性細菌はまた免疫チェックポイントの発現を阻害、抑制または妨害するＲＮＡｉまたはＣＲＩＳＰＲカセットまたは阻害、抑制または破壊が対象における抗腫瘍免疫応答を増加させる他の標的などの治療産物もコードできる；ＲＮＡｉまたはＣＲＩＳＰＲカセットは、細菌のプラスミド上にコード化される。他の治療産物は、例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＣＴＬＡ－４抗体など、例えば、活性を阻害するように免疫チェックポイントに結合する抗体を含む。
ＲＮＡｉは、標的化核酸の発現のサイレンシングに使用され得る全形態の二本鎖ＲＮＡを含む。ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)を含む。これらの形態の何れも、ここに開示かつ記載される実施態様において相互交換可能に使用され得る。一般に、ＲＮＡｉは、細菌のプラスミド上にコード化される。プラスミドは、細菌に活性または産物を調節または付加する目的の産物または細菌で処置する対象の免疫系を調節できる他のこのような産物をコードする他の異種核酸を含み得る。細菌遺伝子はまた付加、欠失または破壊され得る。これらの遺伝子は、細菌の増殖および複製のための産物または宿主の細菌への免疫応答をまた調節する産物をコードし得る。
細菌種は、例えば、サルモネラ、シゲラ(Shigella)、リステリア(Listeria)、大腸菌(E. coli)およびビフィドバクテリア(Bifidobacteriae)の株を含むが、これらに限定されない。例えば、種は、ソンネ赤痢菌(Shigella sonnei)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、トリチフス菌(Salmonella gallinarum)およびゲルトネル菌(Salmonella enteritidis)を含む。
種は、例えば、サルモネラ、シゲラ、大腸菌、ビフィドバクテリア、リケッチア(Rickettsia)、ビブリオ(Vibrio)、リステリア、クレブシエラ(Klebsiella)、ボルデテラ(Bordetella)、ナイセリア(Neisseria)、エロモナス(Aeromonas)、フランシセラ(Francisella)、コレラ(Cholera)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、サイトロバクター(Citrobacter)、クラミジア(Chlamydia)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ブルセラ(Brucella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、レジオネラ(Legionella)、ロドコッカス(Rhodococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ヘリコバクター(Helicobacter)、バシラス(Bacillus)およびエリジペロスリックス(Erysipelothrix)の株または前記細菌株の何れかの弱毒株もしくは修飾株を含む。
他の適当な細菌種は、リケッチア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、ビブリオ、バシラスおよびエリジペロスリックスを含む。例えば、斑点熱リケッチア(Rickettsia rickettsiae)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、ツツガムシ病リケッチア(Rickettsia tsutsugamuchi)、発疹熱リケッチア(Rickettsia mooseri)、リケッチア・シビリカ(Rickettsia sibirica)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、エロモナス・オイクレノフィラ(Aeromonas eucrenophila)、エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、野兎病菌(Francisella tularensis)、ヒツジ偽結核菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、サイトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、在郷軍人病菌(Legionella pneumophila)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、ロシャリメア・クインターナ(Rochalimaea quintana)およびアグロバクテリウム・ツメルファシウム(Agrobacterium tumerfacium)を含む。
サルモネラ、特に、ネズミチフス菌株、例えばＹＳ１６４６(ATCC #202165)と命名された株またはＶＮＰ２０００９およびATCC #14028として寄託された株またはATCC #14028の同定された特徴全てを有する株がここに例示される。他の株は、例えば、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１およびχ８４６８を含む。ここに提供されるサルモネラ株の例は、免疫刺激性細菌株ＡＳＴ－１０４、ＡＳＴ－１０５、ＡＳＴ－１０６、ＡＳＴ－１０８、ＡＳＴ－１１０、ＡＳＴ－１１２、ＡＳＴ－１１３、ＡＳＴ－１１５、ＡＳＴ－１１７、ＡＳＴ－１１８、ＡＳＴ－１１９、ＡＳＴ－１２０、ＡＳＴ－１２１、ＡＳＴ－１２２およびＡＳＴ－１２３である。これらの株を、Ｉ型インターフェロンまたは他の免疫調節性タンパク質の発現をもたらすシグナル伝達経路におけるタンパク質の機能獲得型バリアントである免疫刺激性タンパク質をコードするようにさらに修飾し得る。免疫刺激性細菌はまたサイトカインなどの腫瘍微小環境における免疫応答を増加させる免疫刺激性タンパク質もコードし得る。免疫刺激性細菌はまた、ここに記載するとおり、優先的に腫瘍微小環境における免疫細胞に感染するまたは腫瘍常在免疫細胞に感染するおよび／またはこのような免疫細胞における細胞死の誘導が少ないようにも修飾され得る。その配列および説明は、詳細な記載、実施例および配列表に提供される。免疫刺激性細菌は、細菌弱毒株由来であってよく、またはａｓｄ欠失などのここに記載する修飾により弱毒化となり、それにより複製がインビボに限定される。
細菌遺伝子が修飾されかつここに言及される場合、免疫刺激性細菌が産生され得る細菌の例である、サルモネラ種におけるその命名(名称)を基準として記載することは理解される。当業者は、他の種が対応するタンパク質を有するが、その命名または名称はサルモネラにおける名称と異なり得ることを認識する。しかしながら、本明細書における一般的記載は、他の細菌種にも適用され得る。例えば、ここに示すとおり、サルモネラにおけるフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰの欠失または不活性化は、腫瘍のコロニー形成を増加させる。鞭毛の類似の遺伝子または感染の類似の機能を、腫瘍コロニー形成増加を達成するために、他の細菌種で修飾し得る。同様に、ここに記載するとおり、ｐａｇＰおよび／またはｍｓｂＢの産物などの細菌産物の不活性化／欠失は、補体活性化および／または他の炎症性応答を低減でき、それにより腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境へのターゲティングを増加できる。補体経路または他の炎症性経路の活性化に関与する他の種における対応する遺伝子を、ここでサルモネラにより例示されるとおり、欠失させ得る。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、抗腫瘍免疫応答の低減に寄与する種々の遺伝子の阻害剤をコードするおよび／または免疫系を刺激し、それにより免疫刺激性である遺伝子および／または遺伝子産物および／または産物を発現する。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、それらを免疫刺激性とする性質を有する。アデノシン栄養要求性はまた免疫刺激性である。それらはまた、プラスミドに、機能獲得型／構成的活性型ＳＴＩＮＧ変異体および他の免疫刺激性タンパク質などの治療剤ペイロードをコードし得る。この組み合わせの効果は、アデノシンリッチ免疫抑制性腫瘍微小環境(ＴＭＥ)への優先的蓄積または動員を提供する、アデノシンに対する栄養要求性であるここに提供される株により増強される。このようなＴＭＥにおけるアデノシン低減は、免疫刺激性効果をさらに増強する。既知のまたは治療投与用に操作され得る細菌株の何れかの形質のこのような組み合わせは、類似の免疫刺激性効果を提供する。
ここに提供されるネズミチフス菌免疫刺激性細菌などの操作した免疫刺激性細菌は、腫瘍が持続性抗腫瘍免疫を打ち破るおよび回避するために利用する免疫チェックポイント経路を阻害しながら、腫瘍抗原特異的免疫応答を促進するための非炎症性腫瘍(cold tumor)の免疫再活性化を誘導する複数の相乗的モダリティを含む。本実施態様に含まれるのは、アデノシン栄養要求性および血管破壊増強である。アデノシン栄養要求性を介する腫瘍ターゲティング改善および血管破壊増強は、他の免疫療法モダリティで観察される全身性サイトカイン暴露および自己免疫性毒性を限定するために炎症を局在化させながら、効力を増加させる。
免疫刺激性タンパク質および機能獲得型免疫刺激性タンパク質などの異種タンパク質およびＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼII(ＲＮＡＰ II)およびＲＮＡポリメラーゼIII(ＲＮＡＰ III)プロモーターなどの真核生物宿主細胞転写機構により認識されるプロモーター制御下に、プラスミドに発現される。ＲＮＡＰ IIIプロモーターは、一般に真核生物宿主で構成的に発現される；ＲＮＡＰ IIプロモーターは制御され得る。治療産物／免疫刺激性タンパク質は、細菌により安定に発現されるプラスミドに提供される。このような細菌の例はサルモネラ株、一般に、継代または他の方法またはアデノシン栄養要求性などのここに記載する修飾により弱毒化されている、弱毒株である。サルモネラ株の例は、欠損ａｓｄ遺伝子を有する修飾ネズミチフス菌株である。これらの細菌は、導入されたプラスミドに機能的ａｓｄ遺伝子の担持を含むように修飾され得る；これは、抗生物質ベースのプラスミド維持／選択系が必要でないように、プラスミドの選択を維持する。プラスミドに機能的ａｓｄ遺伝子を含まないａｓｄ欠損株は、宿主で自己融解される。
プロモーターは、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)で発現されるプロモーター、低酸素条件で発現されるプロモーターまたはｐＨが７未満である条件で発現されるプロモーターなど、腫瘍細胞の環境に対して選択され得る。
上に記載し、挙げた細菌の何れかにおけるプラスミドは治療産物をコードする。プラスミドは、多いまたは少ないコピーで存在し得る。これは、複製起点などの要素の選択により制御され得る。低および高および中コピー数プラスミドおよび複製起点は当業者に周知であり、選択され得る。ここでの免疫刺激性細菌の実施態様において、プラスミドは、約１５０または１５０以下のコピーなどの低乃至中コピー数から約２５未満または約２０または２５コピーである低コピー数で存在し得る。複製起点の例は、ｐＢＲ３２２、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ｐＭＢ１、ｃｏｌＥ１、ｃｏｌＥ２、ｐＰＳ１０、Ｒ６Ｋ、Ｒ１、ＲＫ２およびｐＵＣ由来のものである。
プラスミドは、インターフェロン症で発現されるものなどの、Ｉ型インターフェロンを誘導するポリペプチドなどの治療ポリペプチドおよび／またはここに記載するおよび／または癌治療における使用が当業者に知られる何れかの治療タンパク質をコードする。プラスミドはまたシグナル配列を欠くリステリオリシンＯ(ＬＬＯ)タンパク質(ｃｙｔｏＬＬＯ)、ＣｐＧモチーフ、ＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)およびレチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)結合要素をコードする、核酸の配列を含み得る。核酸を含む免疫刺激性細菌は、トール様受容体９(ＴＬＲ９)により認識されるＣｐＧモチーフを含み得る。ＣｐＧモチーフは、プラスミド上にコード化され得る。ＣｐＧモチーフは、プラスミド上にコード化される細菌遺伝子に包含され得るかまたはその一部であり得る。例えば、ＣｐＧを含む遺伝子は、プラスミド上にコード化されるａｓｄであり得る。ここに提供される免疫刺激性細菌は、ＣｐＧモチーフ、プラスミド維持のためのａｓｄ遺伝子選択可能マーカーおよびＤＮＡ核ターゲティング配列の１以上を含み得る。
免疫刺激性細菌は、鞭毛をコードする遺伝子の欠失または破壊によるなど、フラジェリン欠損であり得る。例えば、フラジェリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの一方または両方をコードする遺伝子に欠失を含み、それにより細菌が鞭毛欠損であり、ここで、野生型細菌が鞭毛を発現する免疫刺激性細菌が提供される。免疫刺激性細菌はまたエンドヌクレアーゼＩ(ｅｎｄＡ)をコードする遺伝子に欠失または修飾を有し得て、それによりｅｎｄＡ活性が阻害または排除される。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、ＤＡＰ添加培地での増殖を可能とするが、処置対象に投与したときインビボでの複製を制限するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－(ａｓｄ－)であり得る。このような細菌は、処置のために有利であり得る自己限定的である。細菌は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードする内因性遺伝子の全てまたは一部の破壊または欠失によりａｓｄ－であり得て、それにより内因性ａｓｄは発現されない。他の実施態様において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、インビボ発現のためにプラスミドに包含され得る。
ここに提供される免疫刺激性細菌の何れも、一般に、プラスミド上に、ＣｐＧモチーフまたはＣｐＧ島を含む核酸を含み得て、ここで、ＣｐＧモチーフはトール様受容体９(ＴＬＲ９)により認識される。ＣｐＧモチーフまたは島をコードする核酸は原核生物に豊富であり、故に、ＣｐＧモチーフは、プラスミド上にコード化される細菌遺伝子に包含され得るかまたはその一部であり得る。例えば、細菌遺伝子ａｓｄは、免疫刺激性ＣｐＧを含む。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、アデノシンまたはアデノシンとアデニンに対して栄養要求性であり得る。ここでの細菌の何れも、アデノシンに対して栄養要求性とし得て、これは、アデノシンが多くの腫瘍で蓄積され、免疫抑制性であるため、抗腫瘍活性を有利に増加させ得る。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、野生型細菌が鞭毛を含むとき、フラジェリン欠損であり得る。鞭毛をコードする１以上の遺伝子の全てまたは一部の破壊または欠失により、フラジェリン欠損とし得る。例えば、フラジェリンサブユニットＦｌｉＣおよびＦｌｊＢの一方または両方をコードする遺伝子に欠失を有し、それにより細菌が鞭毛欠損である、免疫刺激性細菌が提供される。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、周辺質分泌シグナル配列を欠き、サイトゾルに蓄積するリステリオリシンＯ(ＬＬＯ)タンパク質であるｃｙｔｏＬＬＯをコードする核酸を含み得る。この変異は、ａｓｄ－細菌と有利に組み合わせられる。ＬＬＯは、細菌のファゴソーム回避に介在するリステリア・モノサイトゲネスからのコレステロール依存性孔形成溶血素である。自己融解株がヒトのようなの腫瘍担持宿主に導入されたとき、細菌は貪食免疫細胞により取り込まれ、空胞に入る。この環境で、ＤＡＰの欠失は細菌複製を防止し、空胞における細菌の自己融解をもたらす。次いで、融解がプラスミドを放出し、蓄積されたＬＬＯがコレステロール含有空胞膜に孔を形成し、プラスミドの宿主細胞のサイトゾルへの送達を可能とする。ここで、治療産物は宿主細胞機構を使用して発現され得て、抗腫瘍治療を行うために腫瘍微小環境に放出される。
免疫刺激性細菌は、プラスミド上にコード化されたＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)、例えば、ＳＶ４０ ＤＴＳを含み得る。
免疫刺激性細菌は、エンドヌクレアーゼ－１(ｅｎｄＡ)をコードする遺伝子に欠失または修飾を有し得て、それによりｅｎｄＡ活性が阻害または排除される。これらの例は、ＣｐＧモチーフ、プラスミド維持のためのａｓｄ遺伝子選択可能マーカーおよびＤＮＡ核ターゲティング配列の１以上を含む免疫刺激性細菌である。
免疫刺激性細菌は、プラスミド上に、免疫チェックポイントの発現を阻害、抑制または妨害する２以上の異なるＲＮＡ分子または免疫抑制性であるまたは免疫抑制性経路にある代謝物の阻害剤をコードするＲＮＡ分子をコードする核酸を含み得る。
ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのようなＲＮＡｉをコードする核酸は、ＲＮＡコード化核酸の後、転写ターミネーターを含み得る。全実施態様において、免疫刺激性細菌でプラスミド上にコード化されたＲＮＡｉは、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)またはマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)であり得る。
免疫刺激性細菌の何れかにおけるプラスミドはまたレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)のアゴニストまたはＲＩＧ－Ｉ結合要素であるヌクレオチドの配列をコードし得る。
免疫刺激性細菌は、ｐｕｒＩ－(ｐｕｒＭ－)、ｍｓｂＢ－、ｐｕｒＤ－、フラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)、ｐａｇＰ－、ａｄｒＡ－、ｃｓｇＤ－およびｈｉｌＡ－の１以上などの、遺伝子の１以上の欠失を含み得る。免疫刺激性細菌は、ｍｓｂＢ－であり得る。例えば、免疫刺激性細菌は、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ欠失およびａｄｒＡ欠失の１以上および所望によりｃｓｇＤ欠失を含み得る。細菌遺伝子欠失／修飾の例は、次の何れかである。
ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡおよびｌｐｘＴの１以上から選択されるリポ多糖の生合成を改変する遺伝子における１以上の変異；および／または
自殺遺伝子を導入し、ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌまたはｐｈｌＡの１以上から選択される１以上の変異；および／または
細菌融解遺伝子を導入し、ｈｌｙおよびｃｌｙの一方または両方から選択される１以上の変異；および／または
ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃおよびａｃｔから選択される１以上の病原性因子における変異；および／または
ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐおよびｇｒｏＥＬから選択されるストレス応答を修飾する１以上の変異；および／または
細胞周期を妨害するｍｉｎにおける変異；および／または
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱおよびｏｍｐＲから選択される制御機能を妨害または不活性化する１以上の変異。
免疫刺激性細菌は、サルモネラ、シゲラ、大腸菌、ビフィドバクテリア、リケッチア、ビブリオ、リステリア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コレラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、バシラスまたはエリジペロスリックスの株または前記細菌株の何れかの弱毒株もしくは修飾株であり得る。
免疫刺激性細菌の例は、プラスミドがシグナル配列を欠くリステリオリシンＯ(ＬＬＯ)タンパク質(ｃｙｔｏＬＬＯ)、ＣｐＧモチーフ、ＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)およびレチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)結合要素をコードする核酸の配列の１以上を含むものである。
プラスミドが２以上の治療産物を別々のプロモーターの制御下に含むとき、それぞれは、少なくとも約７５ヌクレオチドまたは少なくとも７５ヌクレオチドから約または少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００ヌクレオチド(または塩基対)まで、約１６００または１６００ヌクレオチド(または塩基対)までまたは７５～１５００または１６００ヌクレオチド(または塩基対)離される。
他の免疫刺激性細菌の例は、アデノシンに対して栄養要求性であり、鞭毛をコードする遺伝子に１以上の欠失；ｅｎｄＡに欠失；ＣｙｔｏＬＬＯをコードするプラスミド；核局在化配列；およびａｓｄプラスミド補完系を含み、ここに記載する何れかのような、非修飾形態では、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である免疫刺激性タンパク質の機能獲得型バリアントを含む治療産物をコードするものである。
このような免疫刺激性細菌は、ＡＴＣＣ寄託番号１４０２８下に寄託されている株またはＡＴＣＣ寄託番号１４０２８下に寄託された株の同定された特徴の全てを有する株などの野生型ネズミチフス菌株のような、サルモネラの株を含む。他の株は、例えば、ＡＳＴ－１００、ＶＮＰ２０００９または株ＹＳ１６４６(ATCC #202165)と命名された株、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１およびχ８４６８から選択される弱毒化ネズミチフス菌株を含む。
免疫刺激性細菌は、腫瘍細胞における蓄積を増加させるおよび／または細胞死を低減させる修飾に加えて、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ欠失およびａｄｒＡ欠失の１以上を含み得て、ここに記載する免疫刺激性タンパク質をコードできる。免疫刺激性細菌はまた
ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡおよびｌｐｘＴの１以上から選択されるリポ多糖の生合成を改変する遺伝子における１以上の変異；および／または
自殺遺伝子を導入し、ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌおよびｐｈｌＡの１以上から選択される１以上の変異；および／または
細菌融解遺伝子を導入し、ｈｌｙおよびｃｌｙの一方または両方から選択される１以上の変異；および／または
ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃおよびａｃｔから選択される１以上の病原性因子における変異；および／または
ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐおよびｇｒｏＥＬから選択されるストレス応答を修飾する１以上の変異；および／または
細胞周期を妨害するｍｉｎにおける変異；および／または
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱおよびｏｍｐＲから選択される制御機能を妨害または不活性化する１以上の変異
も含み得る。
株は、ｍｓｂＢ－、ａｓｄ－、ｈｉｌＡ－および／またはフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－の１以上であり得る。非修飾形態では、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である免疫刺激性タンパク質の機能獲得型バリアント、ＲＮＡｉおよびケモカイン／サイトカインなどの免疫刺激性タンパク質などの治療産物は、ここに記載されるとおり、ＲＮＡＰ IIIプロモーターまたはＲＮＡＰ IIプロモーターのような宿主により認識されるプロモーターの制御下に発現される。免疫刺激性細菌は、サルモネラ、シゲラ、大腸菌、ビフィドバクテリア、リケッチア、ビブリオ、リステリア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コレラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、バシラスまたはエリジペロスリックスの株または前記細菌株の何れかの弱毒株もしくは修飾株であり得る。一般に、株は、感染する細胞およびある細胞または全細胞で複製する能力を含み、弱毒株としてまたはその性質を変える修飾により、宿主において弱毒化されているものである。ネズミチフス菌のようなサルモネラ株が細菌の例である。株の例は、ＡＳＴ－１００、ＶＮＰ２０００９または株ＹＳ１６４６(ATCC #202165)と命名された株、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、χ８４６８および野生型株ATCC #14028由来のネズミチフス菌株を含む。
免疫刺激性細菌を含む組成物が提供される。このような組成物は、細菌および薬学的に許容される賦形剤または媒体を含む。免疫刺激性細菌は、ここにまたはここに包含する特許／出願に記載のまたは当業者に知られる何れをも含む。このような細菌は、Ｉ型インターフェロンの発現をもたらすシグナル伝達経路の一部である免疫刺激性タンパク質のバリアントをコードするよう修飾される。ＳＴＩＮＧタンパク質などのタンパク質は、インターフェロン－αまたはインターフェロン－βのようなＩ型インターフェロンの活性が増加するおよび／または構成的発現をもたらすように修飾される。細菌は、サイトカインなどの、腫瘍微小環境または腫瘍において抗腫瘍活性を増加させる免疫刺激性タンパク質もコードし得る。細菌のゲノムは、免疫細胞の感染性が増加するおよび／または非免疫細胞の感染性が低減するおよび／または免疫細胞に細胞死を誘導する能力が低減するように修飾され得る。それ故に、細菌は、腫瘍または腫瘍微小環境または腫瘍常在免疫細胞における蓄積および／または抗腫瘍活性を促進する免疫刺激性タンパク質の送達のために、ここに記載するとおり修飾される。免疫刺激性細菌は、免疫チェックポイントを標的とするまたは他に細菌の抗腫瘍活性を増強するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉまたはＣＲＩＳＰＲカセットをコードするプラスミドをさらに含み得る。
１回量は、免疫刺激が処置をもたらす疾患または障害の処置に治療上有効である。このような刺激の例は、特異的免疫応答および非特異的免疫応答の一方または両方、特異的および非特異的免疫応答、先天性応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化およびサイトカイン発現を含むが、これらに限定されない免疫応答である。
ｃＧＡＳアゴニストである免疫刺激性細菌が提供される。このような細菌の例は、ｃＧＡＳアゴニストおよびインターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)アゴニストの一方または両方である、ネズミチフス菌のようなサルモネラ種である。これらは、例えば、サイトゾルＤＮＡが産生または蓄積される放射線療法および化学療法などの使用または方法において、投与され得る。ＳＴＩＮＧは、サイトゾルにおける核酸を感知する応答において自然免疫を活性化する。下流シグナル伝達は、サイトゾル二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)への結合に応答する細菌または宿主酵素ｃＧＡＳにより合成される、環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)の結合を介して活性化される。細菌が産生するＣＤＮと宿主が産生するＣＤＮのリン酸架橋構造は異なり、これによりＳＴＩＮＧを活性化する能力が異なる。ＣＤＮは、サイトゾルｄｓＤＮＡの結合に応答して細菌または宿主酵素ｃＧＡＳにより合成される。ＩＦＮ－βは、活性化ＳＴＩＮＧのシグネチャーサイトカインである。
修飾非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびＳＴＩＮＧタンパク質キメラならびに細菌、リポソーム、エクソソーム、ミニ細胞、ナノ粒子、ベクター、例えば、腫瘍溶解性ウイルスを含む、ここに記載の何れかを含む、送達媒体、タンパク質および／または送達媒体を含む医薬組成物、これらＳＴＩＮＧタンパク質をコードするまたは含むおよび／または送達媒体を含む細胞およびその癌を処置するための使用および方法もまた提供される。修飾非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびＳＴＩＮＧタンパク質キメラならびに送達媒体、細胞、免疫刺激性細菌、使用、方法および医薬組成物は、次のものを含むが、これらに限定されない。
１. 修飾非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質であって、ここで、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質はヒトＳＴＩＮＧタンパク質より低いＮＦ－κＢ活性化を有し、かつ、所望により、野生型(ＷＴ)ヒトＳＴＩＮＧタンパク質と比較して、高いＩ型インターフェロン活性化／シグナル伝達活性を有するものである。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、活性が増加するまたはサイトゾル核酸シグナル伝達非存在下で構成的に作用するように、１以上の変異を含むよう修飾される。変異は、ヒトＳＴＩＮＧについて上記したような、一般にヒトにおいてインターフェロン症で生じるアミノ酸変異である。対応する変異は、非ヒト種ＳＴＩＮＧタンパク質に導入され、ここで、対応するアミノ酸残基は、アライメントにより同定される(例えば、図１～１３参照)。また、ある実施態様において、ＳＴＩＮＧタンパク質のＣ末端テイル(ＣＴＴ)におけるＴＲＡＦ６結合部位は欠失し、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減される。
２. ヒトなどのある種からのＳＴＩＮＧタンパク質におけるＣＴＴ(Ｃ末端テイル)領域が、ヒトＳＴＩＮＧより低ＮＦ－κＢシグナル伝達活性および／または高Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有する、他の、非ヒト種のＳＴＩＮＧタンパク質からのＣＴＴで置き換えられているキメラである、修飾ＳＴＩＮＧタンパク質、特にヒトＳＴＩＮＧタンパク質。また、ＴＲＡＦ６結合部位は、これらキメラにおいて所望によりＣＴＴから欠失される。
３. １の変異も含む、２の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
４. １～３の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、エクソソーム、ミニ細胞、リポソーム、ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルスおよび他のウイルスベクターを含む、ここに提供するまたは当業者に知られる何れかの免疫刺激性細菌などの送達媒体。
５. ＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧと比較してＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減しており、かつ所望によりＩ型インターフェロン刺激／シグナル伝達活性が増加している非ヒト種からの非修飾ＳＴＩＮＧをコードする、エクソソーム、ミニ細胞、リポソーム、ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルスおよび他のウイルスベクターを含む、ここに提供するまたは当業者に知られる何れかの免疫刺激性細菌などの送達媒体。
６. 細胞治療に使用する細胞、例えばＴ細胞および幹細胞および１～３の何れかのタンパク質の産生に使用する細胞などの細胞(ヒトであるならば、非接合子)。
７. １～３のＳＴＩＮＧタンパク質または４および５の送達媒体または６の細胞を含む、医薬組成物。
８. 免疫刺激性細菌についてここに記載するとおり、１～７の何れかの投与により、癌を処置するための使用および方法。
９. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、特にヒトＳＴＩＮＧと比較して低いＮＦ－κＢ活性(シグナル伝達活性)および類似のまたは高いＩ型インターフェロン刺激活性またはインターフェロン－β刺激活性を有する何れかをコードする免疫刺激性細菌もまた提供される。
ＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢ活性(シグナル伝達活性)およびＩ型インターフェロン刺激活性またはインターフェロン－β刺激活性を評価するアッセイおよび方法がここに記載され、また当業者に知られる。方法は、例えば、de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175に記載のものを含み、これは、とりわけ、ヒトを含む種々の種からのＳＴＩＮＧタンパク質のインターフェロン－βおよびＮＦ－κＢシグナル伝達活性、それによりヒトＳＴＩＮＧより低いＮＦ－κＢ活性を有するおよびまたヒトＳＴＩＮＧと同等または高いインターフェロン－β活性を有する種々の種からのＳＴＩＮＧタンパク質の同定を記載する。de Oliveira Mann et al. (2019)は種アライメントを記載し、ＣＴＴドメインを含む各種におけるＳＴＩＮＧのドメインを同定する(また、Supplemental Information for de Oliveira Mann et al. (2019)も参照)。
非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、次の種からのＳＴＩＮＧタンパク質であり得るが、これらに限定されない：タスマニアンデビル(Sarcophilus harrisii；配列番号３３１)、マーモセット(Callithrix jacchus；配列番号３４１)、ウシ(Bos taurus；配列番号３４２)、ネコ(Felis catus；配列番号３３８)、ダチョウ(Struthio camelus australis；配列番号３４３)、トキ(Nipponia nippon；配列番号３４４)、シーラカンス(Latimeria chalumnae；配列番号３４５～３４６)、イノシシ(Sus scrofa；配列番号３４７)、コウモリ(Rousettus aegyptiacus；配列番号３４８)、マナティ(Trichechus manatus latirostris；配列番号３４９)、ゾウギンザメ(Callorhinchus milii；配列番号３５０)、マウス(Mus musculus；配列番号３５１)およびゼブラフィッシュ(Danio rerio；配列番号３３０)。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質はヒト細胞で容易に免疫シグナル伝達を活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物で共有されていることを示す(de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。
免疫刺激性細菌の何れかおよび他の送達媒体を含む医薬組成物もまた提供される。癌の処置のためのその使用および癌を処置する方法も同様である。方法および使用は、ヒトなどの対象に免疫刺激性細菌または医薬組成物を投与することを含む、癌を有する対象の処置を含む。免疫刺激性細菌を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法が提供される。
方法および使用は、第二の抗癌剤または処置が適用される、組み合わせ治療を含む。第二抗癌剤は、サイトゾルＤＮＡをもたらす化学療法剤または放射線療法または抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの免疫チェックポイント阻害剤またはＣＡＲ－Ｔ細胞または幹細胞、ＴＩＬ細胞および癌治療のための修飾細胞などの他の治療細胞であり得る。
投与は、非経腸などの何れかの適当な経路であってよく、送達を促進または増強し得るさらなる薬剤を含んでよい。投与は経口または直腸または肺へのエアロゾルまたは腫瘍内、静脈内、筋肉内または皮下であり得る。投与は、例えば、経口または直腸または肺へのエアロゾル、腫瘍内、静脈内、筋肉内または皮下を含む、非経腸のような全身または局所または外用を含む、何れかの適当な経路であり得る。
癌は、リンパ腫、白血病、胃癌および乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の癌などの、しかし、これらに限定されない固形腫瘍および血液系腫瘍を含む。
免疫刺激性細菌は、懸濁液など、投与用組成物に製剤化され得る。乾燥させ、粉末として保管し得る。免疫刺激性細菌と他の抗癌剤の組み合わせもまた提供される。
癌および悪性腫瘍の処置のための組み合わせ治療が提供される。免疫刺激性細菌は、放射線療法、化学療法、特にサイトゾルＤＮＡをもたらす遺伝毒性化学療法および抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体を含むチェックポイント阻害剤抗体および他のこのような免疫療法などの免疫療法を含む他の癌治療の前に、後に、間欠的にまたは同時に投与し得る。
免疫刺激性細菌を含むまたはここに記載する機能獲得型バリアントタンパク質および他の治療生をコードする核酸を含むエクソソーム、リポソームおよび他のこのような媒体などの他の送達媒体の何れかを含む単離細胞もまた提供される。細胞は、免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞、初代細胞株および細胞治療に使用される他の細胞を含むが、これらに限定されない。細胞の例は、例えば、Ｔ細胞および造血幹細胞のような造血細胞を含む。造血細胞は、マクロファージのようなキメラ抗原骨髄細胞であり得る。送達媒体および免疫刺激性細菌を、エクスビボで細胞に導入し得る。それ故に、例えば、免疫刺激性細菌を含む単離細胞が提供され、ここで、免疫刺激性細菌は、腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するように修飾されおよび／または免疫刺激性細菌のゲノムを腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少ないように修飾され；そして細胞は免疫細胞、幹細胞、初代細胞株からの細胞または腫瘍細胞である。細胞は、癌の処置のためなど、細胞治療の方法において使用される。細胞は、処置対象に対して同種でも自己でもよい。
免疫刺激性細菌による腫瘍／腫瘍微小環境コロニー形成を増加する方法もまた提供される。方法は、例えば、細菌のゲノムを細菌フラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－とするよう修飾することを含む。
用いられる用語および表現は、記述のために使用し、限定するものではなく、示し、かつ記載する性質の何らかの同等物またはその一部を除外する意図でこのような用語および表現を使用しておらず、むしろ、種々の修飾が意図されることが認識される。
野生型ヒトおよびタスマニアンデビルＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびマーモセットＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびウシＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびネコＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびダチョウＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびトキＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびシーラカンス(配列番号３４５)ＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびゼブラフィッシュＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびイノシシＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびコウモリＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびマナティＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびゾウギンザメＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
野生型ヒトおよびマウスＳＴＩＮＧタンパク質のアライメントを記載する。
詳細な記載
概要
Ａ. 定義
Ｂ. 免疫刺激性細菌の概要
Ｃ. 癌免疫療法
１. 免疫療法
２. 養子免疫療法
３. 癌ワクチンおよび腫瘍溶解性ウイルス
Ｄ. 細菌癌免疫療法
１. 細菌治療
２. 細菌およびウイルスに対する免疫応答の比較
３. サルモネラ治療
ａ. 腫瘍指向性細菌
ｂ. ネズミチフス菌(Salmonella enterica serovar typhimurium)
ｃ. 細菌弱毒化
ｉ. ｍｓｂＢ－変異体
ii. ｐｕｒＩ－変異体
iii. 弱毒化変異の組み合わせ
iv. ＶＮＰ２０００９および他の弱毒化ネズミチフス菌株
ｖ. 巨大分子を送達するよう操作したネズミチフス菌
４. 腫瘍常在免疫細胞における治療指数および発現増加のための免疫刺激性細菌の増強
ａ. ａｓｄ遺伝子欠失
ｂ. アデノシン栄養要求性
ｃ. フラジェリン欠損株
ｄ. ＬＰＳ生合成経路における遺伝子の欠失
ｅ. バイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失
ｆ. サルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)を回避するよう操作したサルモネラ
ｇ. 鞭毛の欠失を含む、細菌が上皮細胞に感染する能力を排除するためのＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２遺伝子および／または他の遺伝子の欠失
ｉ. サルモネラ病原性島１(ＳＰＩ－１)
ＳＰＩ－１依存性宿主細胞侵襲
ＳＰＩ－１非依存的宿主細胞侵襲
ii. サルモネラ病原性島２(ＳＰＩ－２)
ｈ. プラスミド送達を増加するためのエンドヌクレアーゼ－１(ｅｎｄＡ)変異
ｉ. ＲＩＧ－Ｉ結合配列
ｊ. ＤＮａｓｅ II阻害
ｋ. ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害
ｌ. スタビリン－１／ＣＬＥＶＥＲ－１阻害
ｍ. ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧ島
５. 免疫細胞によるサルモネラなどのグラム陰性細菌の取り込みを増加させかつ免疫細胞死を低減する修飾
ａ. 免疫細胞による細菌取り込み
ｂ. マクロファージパイロトーシス
ｉ. フラジェリン
ii. ＳＰＩ－１タンパク質
棒状タンパク質(ＰｒｇＪ)
針状タンパク質(ＰｒｇＩ)
iii. ＱｓｅＣ
６. 細菌培養条件
７. 腫瘍コロニー形成増加
Ｅ. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質および腫瘍微小環境において免疫応答を刺激するためのタンパク質における機能獲得型変異
１. Ｉ型インターフェロンおよび経路
２. Ｉ型インターフェロン症および機能獲得型変異体
３. ＳＴＩＮＧ介在免疫活性化
４. ＴＭＥＭ１７３アレル
５. 構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型変異
６. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質および活性が増加したまたは構成的であるそのバリアントおよびＳＴＩＮＧキメラおよび活性が増加したまたは構成的であるそのバリアント
７. サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーとして作用する他の遺伝子産物および構成的バリアント
ａ. レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)様受容体(ＲＬＲ)
ｂ. ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１
ｃ. ＲＩＧ－Ｉ
ｄ. ＩＲＦ－３およびＩＲＦ－７
８. 他のＩ型ＩＦＮ制御タンパク質
９. 他の治療産物
Ｆ. タンパク質をコードする免疫刺激性細菌および例示的プラスミドおよび送達媒体の構築
１. 複製起点およびプラスミドコピー数
２. プラスミド維持／選択成分
３. ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
４. ＤＮＡ核ターゲティング配列
５. ＣＲＩＳＰＲ
Ｇ. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびＩ型インターフェロンおよび他の治療産物を構成的に誘導する機能獲得型修飾タンパク質をコードする他の送達媒体
１. エクソソーム、細胞外小胞および他の小胞送達媒体
２. 腫瘍溶解性ウイルス
ａ. アデノウイルス
ｂ. 単純ヘルペスウイルス
ｃ. ポックスウイルス
ｄ. 麻疹ウイルス
ｅ. レオウイルス
ｆ. 水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)
ｇ. ニューカッスル病ウイルス
ｈ. パルボウイルス
ｉ. コクサッキーウイルス
ｊ. セネカバレーウイルス
Ｈ. 医薬品、組成物および製剤
１. 製造
ａ. 細胞バンク製造
ｂ. 原薬製造
ｃ. 製剤製造
２. 組成物
３. 製剤
ａ. 液体、注射、エマルジョン
ｂ. 乾燥させた熱安定性製剤
４. 他の投与経路用組成物
５. 用法・用量
６. 包装および製品
Ｉ. 処置方法および使用
１. 腫瘍
２. 投与
３. モニタリング
Ｊ. 実施例
Ａ. 定義
他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の開示全体を通して引用される全ての特許、特許出願、公開出願および刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよび他の刊行物は、断らない限り、それら全体として引用により本明細書に包含させる。ここで用語に複数の定義があるならば、本セクションのものが優先する。ＵＲＬまたは他のこのような識別子またはアドレスが参照されるとき、このような識別子は変わることがあり、インターネット上の特定の情報は現れては消えることがあるが、インターネットの検索により、同等な情報が見つかり得ることは理解される。それらの言及は、このような情報が入手可能であり、公に頒布されていることを証明する。
ここで使用する治療細菌は、ヒトなどの対象に投与したとき、癌または抗腫瘍治療などの治療をもたらす細菌である。
ここで使用する免疫刺激性細菌は、対象に導入されたとき、腫瘍のような免疫特権組織(immunopriviledged tissue)および細胞に蓄積するおよび複製するおよび／または免疫刺激性であるまたは免疫刺激をもたらす産物を発現する、治療細菌である。例えば、免疫刺激性細菌は、主に免疫特定環境以外、免疫刺激性細菌は産物を複製および／または発現できない(または複製／産物発現が低減)ように、毒性または病原性低減および／または毒性または病原性を低減するコード化産物により宿主において弱毒化される。ここに提供される免疫刺激性細菌は、免疫刺激性とする、１以上の産物をコードするまたは形質もしくは性質を示すよう、修飾される。このような産物、性質および形質は、例えば、サイトカインまたは共刺激分子などの免疫刺激性タンパク質；ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーまたはその機能獲得型バリアント(例えば、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ)；ＴＲＥＸ１および／またはＰＤ－Ｌ１などのチェックポイント遺伝子を標的とし、妨害し、または阻害するｓｉＲＮＡ(ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ)などのＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ；または抗免疫チェックポイント抗体などの免疫チェックポイントの阻害剤の少なくとも一つを含むが、これらに限定されない。免疫刺激性細菌はまた、細菌をアデノシンなどの免疫抑制性であるまたは免疫抑制性経路にある代謝物に対して栄養要求性とする修飾も含み得る。
ここで使用する菌株表示ＶＮＰ２０００９(例えば、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／１３０５３参照、米国特許６,８６３,８９４もまた参照)およびＹＳ１６４６および４１.２.９は相互交換可能に使用され、各々American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ２０２１６５を付与された株をいう。ＶＮＰ２０００９は、ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩに欠失を有し、野生型株ＡＴＣＣ １４０２８から産生されたネズミチフス菌の修飾弱毒株をいう。
ここで使用する菌株表示ＹＳ１４５６および８.７は相互交換可能に使用され、各々ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ２０２１６４を付与された株をいう(米国特許６,８６３,８９４参照)。
ここで使用するインターフェロン症は、インターフェロンの発現を制御または誘導する経路に関与する遺伝子産物の変異によるインターフェロンの上方制御と関連する障害をいう。産物の活性は、通常サイトゾルＤＮＡまたはＲＮＡまたはヌクレオチドなどのメディエーターにより制御される；変異したとき、活性は構成的である。Ｉ型インターフェロン症は、アイカルディ・グティエール症候群(ＡＧＳ)の重症形態および軽度家族性チルブランループス(ＦＣＬ)を含む、一連の状態を含む。これらの性質を有する変異産物をコードする核酸分子を、正常な活性を有するアレルの産物と比較して、産物に機能獲得をもたらすまたはここに記載する疾患関連機能獲得型変異体と比較して、さらに機能獲得型を有する変異の選択によるなど、インビトロで産生し得る。
ここで使用する機能獲得型変異は、変異がない同じタンパク質と比較して、タンパク質の活性が増加したものである。例えば、タンパク質が受容体であるならば、リガンドへの親和性が増加している；酵素であるならば、構成的活性を含む活性の増加がある。
ここで使用する複製起点は、染色体、プラスミドまたはウイルスで複製が開始される、ＤＮＡの配列である。細菌プラスミドおよび小ウイルスを含む小ＤＮＡについては、単一の起点で十分である。
複製起点は、選択した複製起点に依存して、ベクターコピー数を決定する。例えば、発現ベクターが低コピー数プラスミドｐＢＲ３２２由来であるならば、約２５～５０コピー／細胞であり、高コピー数プラスミドｐＵＣ由来であるならば、１５０～２００コピー／細胞であり得る。
ここで使用する細胞におけるプラスミドの中コピー数は、約１５０もしくは１５０または１５０未満であり、低コピー数は１５～３０、例えば２０または２０未満である。低乃至中コピー数は、１５０未満である。高コピー数は、１５０コピー／細胞を超える。
ここで使用する２Ａペプチドは、真核生物細胞における翻訳中のポリペプチドの開裂に介在する、１８～２２アミノ酸(ａａ)長ウイルスオリゴペプチドである。名称「２Ａ」は、ウイルスゲノムの特異的領域をいい、異なるウイルス２Ａは、一般にそれが由来するウイルスに由来して名付けられている。これらの例は、Ｆ２Ａ(口蹄疫ウイルス２Ａ)、Ｅ２Ａ(馬鼻炎Ａウイルス)、Ｐ２Ａ(豚テシオウイルス－１ ２Ａ)およびＴ２Ａ(Thosea asignaウイルス２Ａ)である(例えば、コード化配列についてLiu et al. (2017) Scientific Reports 7:2193、図１参照；また、配列番号３６７～３７０も参照)。
ここで使用するＣｐＧモチーフは、中央ＣｐＧ(「ｐ」は、連続するＣとＧ間のヌクレオチドホスホジエステル結合をいう)に隣接する(３’および５’側)少なくとも一つの塩基に囲まれた、非メチル化中央ＣｐＧを含む、塩基のパターンをいう。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、非メチル化ＣｐＧを含む
オリゴデオキシヌクレオチドである。少なくとも５’ＣＧ３’のＣは非メチル化である。
ここで使用するＲＩＧ－Ｉ結合配列は、５’三リン酸(５’ｐｐｐ)構造を直接的に、またはＲＩＧ－Ｉとの相互作用によりＲＩＧ－Ｉ経路を介してＩ型ＩＦＮを活性化できるポリ(ｄＡ－ｄＴ)配列からＲＮＡ ｐｏｌ IIIにより合成されたものをいう。ＲＮＡは、少なくとも４個のＡリボヌクレオチド(Ａ－Ａ－Ａ－Ａ)を含む；これは、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上含み得る。ＲＩＧ－Ｉ結合配列は、ポリＡの転写のために、細菌におけるプラスミドに導入される。
ここで使用する「サイトカイン」は広範であり、大まかに細胞シグナル伝達に重要である小タンパク質(約５～２０kDa)のカテゴリーである。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子を含む。サイトカインは、免疫応答における細胞間コミュニケーションを助け、炎症、感染および外傷の部位に向けた細胞の移動を刺激する細胞シグナル伝達分子である。
ここで使用する「ケモカイン」は、ケモカイン受容体に結合する化学誘引物質(走化性)サイトカインをいい、天然源から単離されたおよび組み換え手段または化学合成により合成されたタンパク質を含む。ケモカインの例は、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＣＰ－２、ＧＲＯ－α、ＧＲＯ－β、ＧＲＯ－γ、ＥＮＡ－７８、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ III、ＮＡＰ－２、ＬＡＰＦ－４、ＭＩＧ(ＣＸＣＬ９)、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＰＦ４、ＩＰ－１０、ＳＤＦ－１α、ＳＤＦ－１β、ＳＤＦ－２、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＣＰ－５、ＭＩＰ－１α(ＣＣＬ３)、ＭＩＰ－１β(ＣＣＬ４)、ＭＩＰ－１γ、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－２α、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－４、ＭＩＰ－５、ＭＤＣ、ＨＣＣ－１、ＡＬＰ、ラングカイン、Ｔｉｍ－１、エオタキシン－１、エオタキシン－２、Ｉ－３０９、ＳＣＹＡ１７、ＴＲＡＣ、ＲＡＮＴＥＳ(ＣＣＬ５)、ＤＣ－ＣＫ－１、リンホタクチンおよびフラクタルカインおよび当業者に知られるその他を含むが、これらに限定されない。ケモカインは、免疫細胞の炎症部位への遊走ならびに免疫細胞の成熟および適応免疫応答の産生に関与する。
ここで使用する「免疫刺激性タンパク質」は、腫瘍微小環境で抗腫瘍免疫応答を示すまたは促進するタンパク質をいう。このようなタンパク質の例は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５)、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の潜在的動員／残留性に関与する分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド(ＯＸ４０Ｌ)、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド(４－１ＢＢＬ)、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーメンバーおよびＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを含むが、これらに限定されない、サイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子を含む。
ここで使用するサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路は、Ｉ型インターフェロン産生をもたらす、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチドおよび／または環状ジヌクレオチドまたは他の核酸分子の存在により開始されるものである。サイトゾルにおける核酸分子は、ウイルスまたは細菌または放射線または他のこのような暴露から生じ、宿主における免疫応答の活性化をもたらす。
ここで使用するＩ型インターフェロン誘導など自然免疫応答を誘導する免疫刺激性タンパク質は、Ｉ型インターフェロンなどの免疫応答メディエーターの発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部であるタンパク質である。例えば、ここに記載しかつ当業者に知られるとおり、サイトゾルＤＮＡはｃＧＡＳにより感知され、ｃＧＡＭＰ産生およびその後のＳＴＩＮＧ(インターフェロン遺伝子刺激物質)／ＴＢＫ１(ＴＡＮＫ結合キナーゼ１)／ＩＲＦ３(インターフェロン制御因子)シグナル伝達およびＩ型ＩＦＮ産生をもたらす。細菌環状ジヌクレオチド(細菌環状ジ－ＡＭＰなどのＣＤＮ)は、ＳＴＩＮＧも活性化する。それ故に、ＳＴＩＮＧは、Ｉ型インターフェロンを誘導する免疫刺激性タンパク質である。５’－三リン酸ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡはＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ－５単独またはＭＤＡ－５／ＬＧＰ２により感知される。これは、ミトコンドリアＭＡＶＳ(ミトコンドリア抗ウイルス－シグナル伝達タンパク質)の重合に至り、ＴＢＫ１およびＩＲＦ３も活性化する。このような経路におけるタンパク質は、Ｉ型インターフェロンなどの自然免疫応答メディエーターの発現をもたらす免疫刺激性タンパク質である。ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路における免疫刺激性タンパク質は、活性が増加するかまたは構成的に、サイトゾル核酸の非存在下で、作用して、Ｉ型インターフェロンの発現などの免疫応答をもたらすよう修飾され得る。
ここで使用する自然免疫タンパク質ＳＴＩＮＧの「カルボキシ末端テイル」または「Ｃ末端テイル」(ＣＴＴ)は、ＳＴＩＮＧタンパク質のＣ末端部分をいい、これは、野生型ＳＴＩＮＧタンパク質において、可撓性リンカー領域によりｃＧＡＭＰ結合ドメインに係留されている。ＣＴＴは、ＩＲＦ３結合部位、ＴＢＫ１結合部位およびＴＲＡＦ６結合部位を含む。ＳＴＩＮＧは、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１(ＴＢＫ１)によるＳＴＩＮＧタンパク質Ｃ末端テイル(ＣＴＴ)のリン酸化を経て、インターフェロンベータ(ＩＦＮ－β)産生の誘導を促進する。ＳＴＩＮＧとＴＢＫ１の相互作用は、ＳＴＩＮＧのカルボキシ末端テイル(ＣＴＴ)の進化的に保存された８アミノ酸残基のストレッチが介在する。ＴＲＡＦ６は、ＳＴＩＮＧのＫ６３結合ユビキチン鎖の形成を触媒し、転写因子ＮＦ－κＢの活性化および代替的ＳＴＩＮＧ依存性遺伝子発現プログラムの誘導をもたらす。ＣＴＴにおけるＴＲＡＦ６結合部位の欠失は、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を低減し得る。ヒトＣＴＴ(またはその一部)の低ＮＦ－κＢ活性化である種のＳＴＩＮＧからのＣＴＴ(またはその対応する部分)での置換は、ヒトＳＴＩＮＧによるＮＦ－κＢ活性化を低減し得る。ＳＴＩＮＧ ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要な配列モチーフを含む、約４０アミノ酸の非構造化ストレッチである(de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。ヒトＳＴＩＮＧ残基３６６は、インターフェロンシグナル伝達を活性化する自然免疫アダプタータンパク質で共有されるＬｘＩＳモチーフの一部である、一次ＴＢＫ１リン酸化部位として同定されている(de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴは、ＴＢＫ１結合に必要な残基Ｌ３７４を含む第二ＰｘＰＬＲモチーフを含む；ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲ配列は、脊椎動物ＳＴＩＮＧアレルで保存されている(de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。ＳＴＩＮＧ ＣＴＴ配列およびＩＲＦ３、ＴＢＫ１およびＴＲＡＦ６結合部位の例を、下表に示す。
Figure 2022524951000002
ここで使用する「腫瘍常在免疫細胞に少ない細胞死を誘導する」ように修飾される細菌は、修飾がない細菌より低毒性であるまたは修飾がない細菌と比較して病原性が低減したものをいう。このような修飾の例は、パイロトーシスを排除するものおよび細菌のＬＰＳプロファイルを改変するものを含む。これらの修飾は、フラジェリン遺伝子、ｈｉｌＡ、棒状タンパク質、針状タンパク質、ＱｓｅＣおよびｐａｇＰなどのＳＰＩ－１経路の１以上の成分の破壊または欠失を含む。
ここで使用する「腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するよう修飾された」細菌は、免疫細胞以外の細胞に感染する能力を低減する修飾をゲノムに有する。このような修飾の例は、３型分泌系または４型分泌系または細菌が非免疫細胞に侵襲する能力に影響する他の遺伝子もしくはシステムを破壊する修飾である。例えば、サルモネラによる、上皮細胞などの細胞の感染に必要であるが、食細胞などの免疫細胞の感染に影響しないＳＰＩ－１成分の破壊／欠失がある。
ここで使用する「修飾」は、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸分子のヌクレオチド配列の修飾に関連し、それぞれ、アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドを修飾する方法は、組み換えＤＮＡ方法の使用によるなど、当業者には日常的である。
ここで使用する細菌ゲノムまたはプラスミドもしくは遺伝子の修飾は、核酸の欠失、置換および挿入を含む。
ここで使用するＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)は、ＲＮＡ分子が、標的化ｍＲＮＡ分子を標的化遺伝子の翻訳およびそれにより発現を阻害するよう中和することにより、遺伝子発現または翻訳を阻害する生物学的過程である。
ここで使用するＲＮＡｉを介して働くＲＮＡ分子は、標的化遺伝子発現のサイレンシングにより、阻害性と称する。発現サイレンシングは、標的化遺伝子の発現が低減または抑制または阻害されることを意味する。
ここで使用するＲＮＡｉを経る遺伝子サイレンシングは、標的化遺伝子の発現を阻害、抑制、破壊またはサイレンスさせると言える。標的化遺伝子は、阻害性ＲＮＡの配列に対応し、それにより阻害性ＲＮＡがｍＲＮＡの発現をサイレンスさせる、ヌクレオチドの配列を含む。小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)は、通常約２１ヌクレオチド長の、二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡの小片であり、特異的配列でメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)に結合し、分解を促進することにより、タンパク質の翻訳に「干渉」するのに使用される３’オーバーハング(２ヌクレオチド)を各末端に有する。その際に、ｓｉＲＮＡは、対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づき、特異的タンパク質の産生を阻止する。過程はＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)と呼ばれ、またｓｉＲＮＡサイレンシングまたはｓｉＲＮＡノックダウンとも称される。短ヘアピンＲＮＡまたは小ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)は、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を経る標的遺伝子発現のサイレンスに使用できる、密接なヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、一般にプラスミドの送達またはウイルスもしくは細菌ベクターを介して達成される。
ここで使用する標的化遺伝子の阻害、抑制、破壊またはサイレンシングは、標的化遺伝子の翻訳などの発現を改変し、それにより標的化遺伝子によりコードされる産物の活性または発現が低減する、過程をいう。低減は、完全なノックアウトまたは部分的ノックアウトを含み、それにより、ここに提供される免疫刺激性細菌およびここでの投与に関連して、処置が実施される。
ここで使用する腫瘍微小環境(ＴＭＥ)は、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリクス(ＥＣＭ)を含み、腫瘍が存在する細胞環境である。存在する状態は、血管新生増加、低酸素状態、低ｐＨ、乳酸濃度増加、ピルビン酸濃度増加、間質液圧増加および、腫瘍の兆候である、高アデノシンレベルなどの代謝物もしくは代謝改変を含むが、これらに限定されない。
ここで使用するヒトＩ型インターフェロン(ＩＦＮ)は、免疫系の活性を制御するインターフェロンタンパク質のサブグループである。全てのＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮ－α受容体などの特異的細胞表面受容体複合体に結合する。Ｉ型インターフェロンは、とりわけ、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含む。ＩＦＮ－βタンパク質は線維芽細胞により産生され、主に自然免疫応答に含まれる抗ウイルス活性を有する。２タイプのＩＦＮ－βは、ＩＦＮ－β１(ＩＦＮＢ１)およびＩＦＮ－β３(ＩＦＮＢ３)である。
ここで使用する核酸またはコード化ＲＮＡが遺伝子を標的とするとの記載は、それが、何らかの機構により遺伝子の発現を阻害または抑制またはサイレンスすることを意味する。一般に、このような核酸は、標的化遺伝子は少なくとも相補的である部分を含み、ここで、部分は、相補的部分とハイブリッドを形成するのに十分である。
ここで使用する「欠失」は、核酸またはポリペプチド配列と対比するとき、標的ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは天然もしくは野生型配列などの配列と比較して、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の削除をいう。
ここで使用する「挿入」は、核酸またはアミノ酸配列対比するとき、標的、天然、野生型または他の関連配列内への１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加包含をいう。それ故に、野生型配列と比較して１以上の挿入を含む核酸分子は、配列の直線長に１以上の付加ヌクレオチドを含む。
ここで使用する核酸およびアミノ酸配列への「付加」は、他の配列と比較して、何れかの末端へのヌクレオチドまたはアミノ酸の付加をいう。
ここで使用する「置換」または「置き換え」は、分子の長さ(残基の数により表される)を変えることなく、天然、標的、野生型または他の核酸またはポリペプチド配列における１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の代替的ヌクレオチドまたはアミノ酸への置き換えをいう。それ故に、分子における１以上の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変えない。特定のポリペプチドと比較したアミノ酸置換は、ポリペプチド配列の長さに沿ったアミノ酸残基の数に関して表現され得る。
ここで使用する配列表に示すような配列と「対応する位置」またはそのヌクレオチドまたはアミノ酸位置に「対応する」ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置ついての記載は、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準的アライメントアルゴリズムを使用して同一性を最大化するように、開示する配列とアライメントして同定されたヌクレオチドまたはアミノ酸位置をいう。配列の整列により、当業者は、例えば、保存および同一アミノ酸残基をガイドとして使用して、対応する残基を同定できる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最上位マッチが得られるように配列される(例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991;およびCarrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照)。
ここで使用する配列のアライメントは、２以上のヌクレオチドの配列またはアミノ酸の整列のための相同性の使用をいう。一般に、５０％以上の同一性により関連する２以上の配列が整列される。整列された配列セットは、対応する位置で整列される２以上の配列をいい、ＥＳＴなどのＲＮＡ由来の配列およびゲノムＤＮＡ配列と整列された他のｃＤＮＡの整列を含む。関連またはバリアントポリペプチドまたは核酸分子は、当業者に知られる何らかの方法で整列され得る。このような方法は、一般にマッチを最大化し、手動アライメントを使用するおよび利用可能な多数のアライメントプログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＰ)の使用によるおよび当業者に知られるその他などの方法を含む。ポリペプチドまたは核酸の配列の整列により、当業者は、保存および同一アミノ酸残基をガイドとして使用して、類似部分または位置を同定できる。さらに、当業者は、保存アミノ酸またはヌクレオチド残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列間の対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基も発見できる。対応する位置はまた、例えばタンパク質構造をコンピューター・シミュレーションしたアライメントの使用により、構造的アライメントにも基づき得る。他の例において、対応する領域が同定され得る。当業者はまた保存アミノ酸残基をガイドとして使用して、ヒト配列と非ヒト配列間の対応するアミノ酸残基も発見し得る。
ここで使用する抗体などのポリペプチドの「性質」は、結合特異性、構造的配置または立体構造、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、立体構造的安定性、熱的耐容性およびｐＨ条件に対する耐容性を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドにより示されるあらゆる性質をいう。性質の変化は、ポリペプチドの「活性」を改変し得る。例えば、抗体ポリペプチドの結合特異性における変化は、ポリペプチドの親和性またはアビディティーまたはインビボ活性などの、抗原に結合する能力および／または種々の結合活性を改変し得る。
ここで使用する抗体などのポリペプチドの「活性」または「機能的活性」は、ポリペプチドにより示されるあらゆる活性をいう。このような活性は、経験的に決定され得る。活性の例は、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合もしくは二量体化を介して生体分子と相互作用する能力または酵素活性、例えば、キナーゼ活性またはタンパク分解活性を含むが、これらに限定されない。抗体(抗体フラグメントを含む)について、活性は、特定の抗原に特異的に結合する能力、抗原結合の親和性(例えば、高または低親和性)、抗原結合のアビディティー(例えば、高または低アビディティー)、結合速度、解離速度、抗原中和または排除、ウイルス中和を促進する能力などのエフェクター機能および病原体の感染または侵襲を防止するまたは排除もしくは体内の特定の組織または流体または細胞への浸透を促進する能力などのインビボ活性を含むが、これらに限定されない。活性は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、結合または解離速度を測定するための表面プラズモン共鳴または同等のアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーおよび結合アッセイ(例えば、パニングアッセイ)などの認識されたアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで評価され得る。
ここで使用する「結合」、「結合した」またはその文法的異形は、２つの分子が互いに近接近する安定な会合をもたらす、他の分子との何らかの誘引性相互作用への分子の参加をいう。結合は、非共有結合、共有結合(例えば可逆性および不可逆性共有結合)を含むが、これらに限定されず、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質および薬物に含まれる化学化合物などの小分子を含むが、これらに限定されない分子間の相互作用を含む。
ここで使用する「抗体」は、天然であれ、組み換えにより産生など一部または完全に合成されたものであれ、免疫グロブリンならびに抗原結合部位の形成に十分であり、組み立てたとき、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域の少なくとも一部を含む、そのフラグメントを含む、免疫グロブリンフラグメントをいう。それ故に、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン(抗体結合部位)と相同または実質的に相同である結合ドメインを有する、あらゆるタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖(ＨおよびＨ’と表示され得る)および２つの軽鎖(ＬおよびＬ’と表示され得る)を含み、各重鎖が完全長免疫グロブリン重鎖または抗原結合部位の形成に十分であるその一部(例えば、重鎖は、ＶＨ鎖、ＶＨ－ＣＨ１鎖およびＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない)であってよく、各軽鎖が完全長軽鎖または抗原結合部位の形成に十分であるその一部(例えば、軽鎖は、ＶＬ鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない)であってよい、抗体をいう。各重鎖(ＨおよびＨ’)は、一つの軽鎖(各ＬおよびＬ’)と対形成する。一般に、抗体は、最小限で可変重(ＶＨ)鎖および／または可変軽(ＶＬ)鎖の全てまたは少なくとも一部を含む。抗体は、定常領域の全てまたは一部も含み得る。
ここでの目的のために、用語抗体は、完全長抗体および抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを含むその一部を含む。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｄｓＦｖ)、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、一本鎖Ｆａｂ(ｓｃＦａｂ)、二重特異性抗体、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体または上記何れかの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体はまた合成抗体、組み換えにより産生された抗体、多特異的抗体(例えば、二特異的抗体)、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体およびイントラボディも含む。ここで提供される抗体は、あらゆる免疫グロブリンクラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、あらゆるサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブ・サブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)のメンバーを含む。
ここで使用する「核酸」は、一般に、ホスホジエステル結合により結合された、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)およびリボ核酸(ＲＮＡ)を含む、少なくとも２つの結合されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体をいう。用語「核酸」は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、ホスホロチオエートＤＮＡおよび他のこのようなアナログおよび誘導体またはこれらの組み合わせなどの核酸のアナログもまた含む。核酸はまた、例えば、ホスホジエステル結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミダート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合(ペプチド核酸)以外のヌクレオチドアナログまたは「主鎖」結合を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体も含む。本用語はまた、等価物として、誘導体、ヌクレオチドアナログ、一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖核酸から製造されるＲＮＡまたはＤＮＡのバリアントおよびアナログも含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについて、ウラシル塩基はウリジンである。
ここで使用する単離核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものをいう。ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、他の細胞物質または組み換え技術により産生されたとき培養培地が実質的にないまたは化学合成されたとき化学前駆体または他の化学物質が実質的にないものであり得る。ここで提供される単離核酸分子の例は、抵抗される抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸分子を含む。
ここで使用する核酸配列、領域、要素またはドメインに関して「操作可能に連結した」は、核酸領域が互いに機能的に関連することを意味する。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連結でき、それにより核酸が機能的融合タンパク質を発現するよう転写および翻訳され得て、ここで、リーダーペプチドは、融合ポリペプチドを分泌させる。いくつかの例において、第一ポリペプチド(例えば、リーダーペプチド)をコードする核酸は、第二ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連結され、核酸は単一ｍＲＮＡ転写物として転写されるが、ｍＲＮＡ転写物の翻訳は、２つのポリペプチドの一方の発現をもたらし得る。例えば、アンバー停止コドンが、部分的アンバーサプレッサー細胞に導入されたとき、得られた単一ｍＲＮＡ転写物が第一および第二ポリペプチドを含む融合タンパク質を産生するよう翻訳され得るかまたは第一ポリペプチドのみを産生するよう翻訳されるように、第一ポリペプチドをコードする核酸と第二ポリペプチドをコードする核酸の間に位置し得る。他の例において、プロモーターを、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連結でき、それにより、プロモーターは、核酸の転写を制御または仲介する。
例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して、ここで使用する「合成」は、組み換え方法および／または化学合成方法により産生された核酸分子またはポリペプチド分子をいう。
ここで使用する天然に存在するα－アミノ酸の残基は、ヒトにおいて、同族ｍＲＮＡコドンによる搭載ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に取り込まれる、天然に見られる２０種のα－アミノ酸の残基である。
ここで使用する「ポリペプチド」は、共有結合により結合された２以上のアミノ酸をいう。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ここでは相互交換可能に使用される。
ここで使用する「ペプチド」は、２から約４０またはちょうど４０アミノ酸長であるポリペプチドをいう。
ここで使用する「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２以上のアミノ酸を含む。ここでの目的のために、提供される抗体に含まれるアミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸(下表参照)、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログ(例えば、α－炭素が側鎖を有するアミノ酸)を含む。ここに記載するポリペプチドの種々のアミノ酸配列に存在するここで使用するアミノ酸は、周知の、三文字または一文字略称(下表参照)により特定される。種々の核酸分子およびフラグメントに存在するヌクレオチドは、当分野で日常的に使用される標準的一文字命名で指定される。
ここで使用する「アミノ酸残基」は、ペプチド結合でのポリペプチドの化学消化(加水分解)により形成されたアミノ酸をいう。ここに記載されるアミノ酸残基は、一般に「Ｌ」異性型である。「Ｄ」異性型の残基は、所望の機能的性質がポリペプチドにより保持される限り、何らかのＬ－アミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、37 C.F.R. §§ 1.821-1.822で承認された標準的ポリペプチド命名法に従って、アミノ酸残基の略語を下表に示す。
Figure 2022524951000003
式によりここに示される全てのアミノ酸残基の配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の慣用の方向で左から右配向を有する。用語「アミノ酸残基」は、上記対応表に列記されたアミノ酸、修飾、非天然および異常なアミノ酸を含むことが定義される。アミノ酸残基配列の始点または終点の点線は、１以上アミノ酸残基のさらなる配列またはＮＨ２などのアミノ末端基もしくはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示す。
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適当な保存的置換は当業者に知られ、一般に得られる分子の生物学的活性を変えることなくなされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変えないことを認識する(例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224参照)。
ここに記載しかつ提供される機能獲得型変異におけるなどのこのような置換は、下表に示す置換セット例に従い、行い得る。
Figure 2022524951000004
他の置換もまた許容され、経験的にまたは他の既知保存的または非保存的置換に従い決定され得る。
ここで使用する「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチドに存在する２０種のＬ－アミノ酸をいう。
ここで使用する用語「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸に類似の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するよう構造的に修飾されている、有機化合物をいう。故に、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸のアナログを含み、アミノ酸のＤ－立体異性体を含むが、これらに限定されない。非天然アミノ酸の例は当業者に知られ、２－アミノアジピン酸(Ａａｄ)、３－アミノアジピン酸(ｂＡａｄ)、β－アラニン／β－アミノ－プロピオン酸(Ｂａｌａ)、２－アミノ酪酸(Ａｂｕ)、４－アミノ酪酸／ピペリジン酸(４Ａｂｕ)、６－アミノカプロン酸(Ａｃｐ)、２－アミノヘプタン酸(Ａｈｅ)、２－アミノイソ酪酸(Ａｉｂ)、３－アミノイソ酪酸(Ｂａｉｂ)、２－アミノピメリン酸(Ａｐｍ)、２,４－ジアミノ酪酸(Ｄｂｕ)、デスモシン(Ｄｅｓ)、２,２’－ジアミノピメリン酸(Ｄｐｍ)、２,３－ジアミノプロピオン酸(Ｄｐｒ)、Ｎ－エチルグリシン(ＥｔＧｌｙ)、Ｎ－エチルアスパラギン(ＥｔＡｓｎ)、ヒドロキシリシン(Ｈｙｌ)、アロ－ヒドロキシリシン(Ａｈｙｌ)、３－ヒドロキシプロリン(３Ｈｙｐ)、４－ヒドロキシプロリン(４Ｈｙｐ)、イソデスモシン(Ｉｄｅ)、アロ－イソロイシン(Ａｉｌｅ)、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン(ＭｅＧｌｙ)、Ｎ－メチルイソロイシン(ＭｅＩｌｅ)、６－Ｎ－メチルリシン(ＭｅＬｙｓ)、Ｎ－メチルバリン(ＭｅＶａｌ)、ノルバリン(Ｎｖａ)、ノルロイシン(Ｎｌｅ)およびオルニチン(Ｏｒｎ)を含むが、これらに限定されない。
ここで使用するＤＮＡ構築物は、天然で見られない様式で組み合わせかつ並列されたＤＮＡのセグメントを含む、一本鎖または二本鎖、直線状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒト操作の結果として存在し、操作分子のクローンおよび他のコピーを含む。
ここで使用するＤＮＡセグメントは、特定された属性を有する大型ＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’方向に読んだとき、特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする、プラスミドまたはプラスミドフラグメントなどの長いＤＮＡ分子の一部である。
ここで使用する用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端に読むデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然起源から単離され、インビトロで合成されまたは天然分子と合成分子の組み合わせから調製されることができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ここではヌクレオチド(略語「ｎｔ」)または塩基対(略語「ｂｐ」)のとして示す。用語ヌクレオチドは、可能である限り、一本鎖および二本鎖分子に対して使用する。本用語が二本鎖分子に対して適用されるとき、全体的長さを意味するよう使用され、用語塩基対と同等であることが理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの鎖長はわずかに異なってもよく、その末端はずれていてよいことは当業者により認識される；故に、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全ヌクレオチドは対形成され得ない。このような不対末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
ここで使用する組み換え方法による産生は、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための分子生物学の周知方法の使用を意味する。
ここで使用する「異種核酸」は、それが発現される細胞によりインビボで通常産生されない産物(すなわち、ＲＮＡおよび／またはタンパク質)をコードする核酸または通常存在しない座位にあるまたは転写、翻訳もしくは他の制御可能な生化学的過程に影響することによりＤＮＡなどの内因性核酸の発現を変えるメディエーターを仲介またはコードする核酸である。ＤＮＡなどの異種核酸は外来核酸とも称される。当業者が発現される細胞に対して異種または外来であると認識するまたはみなすＤＮＡなどのあらゆる核酸がここでは異種核酸により包含される；異種核酸は、内因性にも発現される外因的に加えられた核酸を含む。異種核酸は、一般に導入される細胞に内因性ではなく、他の細胞から得られるかまたは合成により調製されるかまたは天然に生じないゲノム座位に導入されるかまたはその発現が天然制御配列または配列と異なる１以上の制御配列の制御下にある。
ここでの異種核酸の例は、ＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路におけるタンパク質またはその機能獲得型バリアントまたは腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を付与するまたは貢献するサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。免疫刺激性細菌において、異種核酸は、一般に導入されたプラスミドにコード化されるが、細菌産物の発現を変えるプロモーターなど細菌のゲノムに導入され得る。ＤＮＡなどの異種核酸は、何らかの方法で、治療産物をコードするＤＮＡの発現に介在できるまたは、何らかの方法で、治療産物の発現に、直接的または間接的に、介在するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードできる、核酸を含む。
ここで使用する細胞治療は、疾患または状態を処置するための対象への細胞の送達を含む。同種または自己であり得る細胞は、対象に導入されたとき産物を送達または発現するように、細胞をここに提供される免疫刺激性細菌で感染させるなど、エクスビボで修飾される。
ここで使用する遺伝子治療は、このような治療が探究されている障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの標的細胞などのある細胞への、ＤＮＡなどの異種核酸の導入を含む。ＤＮＡなどの核酸は、ＤＮＡなどの異種核酸が発現され、それによりコードされる治療産物が産生されるような方法で、選択した標的細胞に導入される。遺伝子治療はまた、欠損遺伝子を複製するまたは導入する哺乳動物もしくは細胞により産生される遺伝子産物を補う遺伝子産物をコードする核酸の送達にも使用され得る。導入された核酸は、哺乳動物宿主で通常産生されないまたは治療有効量でもしくは治療上有用な時間産生されない治療化合物、例えば増殖因子もしくはその阻害剤または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えばその受容体をコードし得る。治療産物をコードするＤＮＡなどの異種核酸は、産物またはその発現を増強するかまたは他に変えるために、罹患宿主の細胞への導入前に修飾され得る。遺伝子治療はまた遺伝子発現の阻害剤またはリプレッサーまたは他のモジュレーターの送達にも関与し得る。
ここで使用する「発現」は、ポリヌクレオチドの転写および翻訳によりポリペプチドが産生される過程をいう。ポリペプチドの発現レベルは、例えば、宿主細胞から産生されるポリペプチドの量を決定する方法を含む、当分野で知られる何れかの方法を使用して評価され得る。このような方法は、ＥＬＩＳＡによる細胞可溶化物におけるポリペプチドの定量、ゲル電気泳動後のクマシーブルー染色、ローリータンパク質アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイを含み得るが、これらに限定されない。
ここで使用する「宿主細胞」は、ベクターを受け、維持し、再生しおよび／または増幅する細胞をいう。宿主細胞をまたベクターによりコードされるポリペプチドの発現にも使用し得る。ベクターに含まれる核酸は、宿主細胞が分裂したとき複製され、それにより核酸が増幅される。
ここで使用する「ベクター」は、ベクターが適切な宿主細胞に形質転換されたとき発現され得る、１以上の異種タンパク質が複製可能な核酸である。ベクターの記載は、一般に、制限消化およびライゲーションにより、ポリペプチドをコードする核酸またはそのフラグメントが導入され得るベクターを含む。ベクターの記載はまた、修飾抗ＥＧＦＲ抗体などのポリペプチドをコードする核酸を含むベクターも含む。ベクターを使用して、ポリペプチドをコードする核酸を、核酸増幅または核酸によりコードされるポリペプチドの発現／提示のために宿主細胞に導入する。ベクターは、一般にエピソームに留まるが、遺伝子またはその一部のゲノムの染色体への組込みを行うよう設計され得る。また考慮されるのは、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体のような人工染色体であるベクターである。このような媒体の選択および使用は当業者に周知である。ベクターは「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」も含む。ウイルスベクターは、細胞に外来遺伝子を導入(媒体またはシャトルとして)するために外来遺伝子に操作可能に連結された操作されたウイルスである。
ここで使用する「発現ベクター」は、プロモーター領域などの制御配列と操作可能に連結されたＤＮＡの発現が可能なベクターを含み、制御配列は、このようなＤＮＡフラグメントの発現を実施できる。このような付加的セグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み得て、所望により１以上の複製起点、１以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来しまたは両者の要素を含み得る。それ故に、発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入により、クローン化ＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたは他のベクターなどの組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をいう。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核生物細胞および／または原核生物細胞で複製可能であるおよびエピソームに留まるまたは宿主細胞ゲノムに統合されるものを含む。
ここで使用する「一次配列」は、ポリペプチドのアミノ酸残基の配列または核酸分子のヌクレオチド配列をいう。
ここで使用する「配列同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における、同一または類似のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数をいう。配列同一性は、類似性または同一性の領域を同定するための、核酸またはタンパク質配列の配列アライメントにより決定され得る。ここでの目的のために、配列同一性は、一般に同一残基を同定するためのアライメントにより決定される。アライメントは局所的でも包括的でもよい。マッチ、ミスマッチおよびギャップを比較配列間で同定し得る。ギャップは、同一または類似の特性が整列されるよう、整列配列の残基間に挿入されたヌルアミノ酸またはヌクレオチドである。一般に、内部および末端ギャップが存在し得る。ギャップペナルティを使用するとき、配列同一性は、末端ギャップに関してはペナルティなしで決定され得る(例えば、末端ギャップはペナルティが科せられない)。あるいは、配列同一性は、ギャップを考慮することなく、同一位置数／総整列配列の長さ×１００として決定され得る。
ここで使用する「包括的アライメント」は、２つの配列を始めから末端まで、各配列の各文字を１回のみ整列させて、整列させるアライメントである。アライメントは、配列間に類似性または同一性があるかないかに関わらず作成される。例えば、「包括的アライメント」に基づく５０％配列同一性は、各１００ヌクレオチド長の２つの比較配列の完全配列のアライメントにおいて、残基の５０％が同一である。包括的アライメントはまた整列配列の長さが同じでなくても、配列同一性の決定に使用され得ることは理解される。配列の末端の差異を、「末端ギャップについてペナルティなし」が選択されない限り、配列同一性の決定において考慮する。一般に、包括的アライメントは、その長さの大部分にわたり相当な類似性を共有する配列に使用する。包括的アライメントの実施のためのアルゴリズムの例は、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443を含む)。包括的アライメントを実施するためのプログラムの例は公に利用可能であり、アメリカ国立生物工学情報センター(ＮＣＢＩ)ウェブサイト(ncbi.nlm.nih.gov/)で入手可能なGlobal Sequence Alignment Toolおよびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで利用可能なプログラムを含む。
ここで使用する「局所アライメント」は、２つの配列を整列するが、類似性または同一性を共有する配列の部分のみ整列するアライメントである。それ故に、局所アライメントは、一方の配列のサブセグメントが他方の配列に存在するかを決定する。類似性がなければ、アライメントは回答されない。局所アライメントアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴまたはSmith-Watermanアルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))を含む。例えば、「局所アライメント」に基づく５０％配列同一性は、何らかの長さの２つの比較配列の完全配列のアライメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、その類似性または同一性の領域で同一である５０％の残基を有することを意味する。
ここでの目的のために、配列同一性は、各供給者により確立されたデフォルトギャップペナルティを用いて使用する、標準的アライメントアルゴリズムプログラムにより決定され得る。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータは、(１)Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載のGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745による単項比較マトリクス(一致について１および非一致について０の値を含む)および重みつき比較マトリクス；(２)各ギャップにペナルティ３.０および各ギャップにおける各記号に付加的０.１０ペナルティ；および(３)末端ギャップについてペナルティなしを含み得る。何れかの２つの核酸分子のヌクレオチド配列または何れかの２つのポリペプチドのアミノ酸配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」またはパーセント同一性を使用する他の類似の相異を有するかは、局所アライメントまたは包括的アライメントに基づく既知コンピューターアルゴリズムを使用して、決定され得る(例えば、多数の既知のおよび公に利用可能なアライメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供するwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software参照)。一般に、ここでの目的のために配列同一性は、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome)で利用可能なNeedleman-Wunsch包括的配列アライメントツール；ＬＡｌｉｇｎ(Huang and Millerアルゴリズムを実装するWilliam Pearson(Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357))；およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで利用可能なXiaoqui Huangのプログラムなどの包括的アライメントに基づくコンピューターアルゴリズムを使用して決定される。一般に、比較ポリペプチドまたはヌクレオチドの各々の完全長配列は、包括的アライメントにおける各配列の完全長にわたり整列される。局所アライメントはまた比較される配列が実質的に同じ長さであるときも使用され得る。
それ故に、ここで使用する用語「同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較またはアライメントをいう。ある非限定的例において、「少なくとも９０％同一」は、対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して９０～１００％のパーセント一致をいう。９０％以上のレベルの同一性は、例示目的のために、１００アミノ酸またはヌクレオチドの試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド長さを比較したと仮定して、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける対照ポリペプチドと異なるアミノ酸またはヌクレオチドが１０％(すなわち、１００中１０)を超えないとの事実の指標である。類似の比較を試験ポリヌクレオチドと対照ポリヌクレオチド間で実施し得る。このような差異は、アミノ酸配列の全長にわたり無作為に分散している点変異を表し得るかまたは許容できる最大、例えば、１０／１００アミノ酸差異までの種々の長さの１以上の位置がクラスター化し得る(約９０％同一性)。差異はまたアミノ酸残基の欠失または短縮化によるものであり得る。差異は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義され得る。比較配列の長さによって、約８５～９０％を超える相同性または一致レベルで、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットに非依存的であり得る；このような高レベルの同一性は、しばしば、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価され得る。
ここで使用する「疾患または障害」は、感染、後天的状態および遺伝的状態を含むが、これに限定されない原因または状態に起因し、識別可能な症状により特徴づけられる生物における病態をいう。
ここで使用する疾患または状態を有する対象の「処置」は、処置後対象の症状が部分的にまたは完全に軽減するかまたは静止したままであることを意味する。
ここで使用する処置は、疾患または障害の症状を好転させる、何らかの効果をいう。処置は、予防、治療および／または治癒を含む。処置はまたここに提供する免疫刺激性細菌または組成物の何れかの薬学的用途も包含する。
ここで使用する予防は、疾患の可能性の予防および／または症状悪化もしくは疾患進行の予防をいう。
ここで使用する「予防」または防止およびその文法的に等価な形態は、疾患または状態を発症するリスクまたは可能性を低減する方法をいう。
ここで使用する「薬学的に有効な薬剤」は、例えば、麻酔剤、血管収縮剤、分散剤ならびに小分子薬物および治療タンパク質を含む慣用の治療薬物を含むが、これらに限定されないあらゆる治療剤または生物活性剤を含む。
ここで使用する「治療効果」は、対象の処置に起因する、疾患または状態の症状を変える、一般に改善または好転するまたは疾患または状態を治癒する、効果をいう。
ここで使用する「治療有効量」または「治療有効用量」は、対象への投与後、少なくとも治療効果を生じるのに十分である、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の量をいう。それ故に、疾患または障害の症状の予防、治癒、好転、抑止または部分的抑止に必要な量である。
ここで使用する「治療有効性」は、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物が投与されている対象において、治療効果を生じる、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の能力をいう。
ここで使用する「予防有効量」または「予防有効用量」は、対象に投与したとき、意図する予防効果、例えば、予防または疾患または症状の発症または再発の遅延、疾患または症状の発症または再発の可能性の低減またはウイルス感染の発生率減少を有する、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の量をいう。１回投与で完全な予防効果が必ずしも生じず、一連の投与後のみ生じ得る。それ故に、予防有効量は１回以上の投与で投与され得る。
ここで使用する医薬組成物または他の治療剤の投与によるなどの処置による特定の疾患または障害の症状の改善は、組成物または治療の投与によるまたは関連するものであり得る、症状の、持続的であれ一過性であれ、何らかの低減をいう。
ここで使用する「抗癌剤」は、悪性細胞および組織に破壊的または毒性であるあらゆる薬剤をいう。例えば、抗癌剤は、癌細胞を死滅させるかまたは他の点で腫瘍または癌細胞の増殖を阻害もしくは障害させる薬剤を含む。抗癌剤の例は化学療法剤である。
ここで使用する「治療活性」は、治療ポリペプチドのインビボ活性をいう。一般に、治療活性は、疾患または状態の処置と関連する活性である。
ここで使用する用語「対象」は、ヒトなどの哺乳動物を含む動物をいう。
ここで使用する患者は、ヒト対象をいう。
ここで使用する動物は、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカおよびヒツジなどの反芻動物；およびブタおよび他の動物などの、しかし、これらに限定されないあらゆる動物を含む。非ヒト動物は、考慮される動物としてヒトを除外する。ここに提供されるポリペプチドは、あらゆる起源、動物、植物、原核生物および真菌由来である。大部分のポリペプチドは、哺乳動物起源を含む動物起源である。
ここで使用する「組成物」は、何らかの混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの何らかの組み合わせであり得る。
ここで使用する「組み合わせ」は、２以上のアイテムの何らかの結びつきをいう。組み合わせは、２つの組成物または２つのコレクションなどの２以上の別々のアイテム、２以上のアイテムの単一混合物などのそれらの混合物またはその何らかの変形物をいう。組み合わせの要素は、一般に機能的に結びついているかまたは関連している。
ここで使用する組み合わせ治療は、２以上の異なる治療剤の投与をいう。異なる治療剤は、別々に、逐次的に、間欠的に提供および投与してよくまたは単一組成物で提供してよい。
ここで使用するキットは、活性化、投与、診断および生物学的活性または性質の評価を含むが、これらに限定されない目的のために、所望により付加的試薬および組み合わせまたはその要素の使用指示などの他の要素を含む、包装された組み合わせをいう。
ここで使用する「単位剤形」は、当分野で知られるとおり、ヒトおよび動物対象に適し、かつ個々に包装された、物理的に別個の単位をいう。
ここで使用する「単回投与量製剤」は、直接投与のための製剤をいう。
ここで使用する多回用量製剤は、治療剤の複数用量を含み、治療剤の数回の１回量を提供するために直接投与され得る、製剤をいう。分、時間、週、日または月にわたり複数用量を投与し得る。多回用量製剤は、用量調節、用量蓄積および／または用量分割を可能とし得る。多回用量製剤は時間をかけて使用されるため、一般に微生物増殖を阻害するために１以上の防腐剤を含む。
ここで使用する「製品」は、製造および販売される生産物である。本明細書を通して使用される限り、本用語は、包装物に含まれる、ここに提供される組成物の何れかを包含することを意図する。
ここで使用する「流体」は、流動できるあらゆる組成物をいう。流体は、故に、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のこのような組成物の形態である組成物を包含する。
ここで使用する単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質(例えば、単離抗体または抗原結合そのフラグメント)またはその生物学的活性部分(例えば、単離抗原結合フラグメント)は、タンパク質が由来する細胞または組織からの細胞物質または他の夾雑タンパク質が実質的にないまたは化学合成されたとき化学前駆体または他の化学物質が実質的にない。薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)など当業者にこのような純度の評価のために使用される標準的分析方法で容易に検出可能な不純物がないように見えるまたはさらなる精製が物質の酵素および生物学的活性などの物理的および化学性質を検出可能に変えないのに十分純粋であるならば、調製物は実質的に他を含まないと決定できる。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は当業者に知られる。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。このような場合、さらなる精製は、化合物の比活性を増加する。ここで使用する「細胞抽出物」または「溶解物」は、溶解または破壊細胞から製造される調製物またはフラクションをいう。
ここで使用する「対照」は、試験パラメーターで処置されない、または、血漿サンプルであるならば、問題の状態を有しない正常ボランティア由来であり得る以外、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルをいう。対照は内部対照でもあり得る。
ここで使用する単数表現は、明らかに異なる指示がない限り、複数の指示対象を含む。それ故に、例えば、「免疫グロブリンドメイン」を含むポリペプチドの記載は、１個または複数の免疫グロブリンドメインを有するポリペプチドを含む。
ここで使用する用語「または」は、代替のみをいうまたは代替が相互排他的であることが明確に示されない限り、「および／または」を意味するために使用される。
ここで使用する範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。約はまたちょうどの量も示す。故に、「約５アミノ酸」は「約５アミノ酸」およびまた「５アミノ酸」を意味する。
ここで使用する「任意の」または「所望により」は、その後に記載される事象または状況が生じるまたは生じないことを意味し、本記載は、該事象または状況が生じる場合および生じない場合を含む。例えば、所望によりバリアント部分は、部分がバリアントまたは非バリアントであることを意味する。
ここで使用する保護基、アミノ酸および他の化合物の何れかの略語は、特に断らない限り、その一般的使用、認識されている略語またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureに従う(Biochem. (1972) 11(9):1726-1732参照)。
開示を明確化するためかつ限定の目的ではなく、詳細な記載をさらなる小区分に分ける。
Ｂ. 免疫刺激性細菌の概要
腫瘍で蓄積および／または複製し、処置対象におけるＲＮＡの発現による、阻害、抑制またはサイレンシングが効果腫瘍治療を発揮する遺伝子を標的とする、設計されたｓｈＲＮＡおよび設計されたマイクロＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡをコードする、ここで免疫刺激性細菌と称する修飾細菌が提供される。修飾のための細菌株は、治療使用に適する何れでもよい。修飾ここに提供される免疫刺激性細菌は、癌を処置するための使用および方法のためである。細菌は、このような使用および方法のために修飾される。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、炎症性応答を減弱するため細菌遺伝子の欠失または修飾により修飾され、かつ該細菌で処置される宿主における抗腫瘍免疫応答を増強するため修飾される。例えば、宿主において、抗腫瘍産物などの治療産物をコードするプラスミドが細菌に包含され、細菌はアデノシンに対して栄養要求性であり得る。細菌に対する炎症性応答の減弱は、宿主におけるＴＮＦ－アルファを減少させるｍｓｂＢ遺伝子の欠失および／またはフラジェリン遺伝子ノックアウトにより行われ得る。細菌は、例えば、免疫刺激性タンパク質、ＳＴＩＮＧタンパク質、バリアントＳＴＩＮＧタンパク質および宿主免疫チェックポイントを標的とするタンパク質をコードするプラスミドの付加および核酸へのＣｐＧの付加により、宿主抗腫瘍活性を刺激するよう修飾される。
細菌株は、弱毒株または標準的方法により弱毒化されたもしくはここに提供される修飾により、コロニー形成する能力が主に免疫特権組織および臓器、特に免疫および固形腫瘍を含む腫瘍細胞に限定されたことにより、弱毒化された株であり得る。ここでの目的のために、細菌はそれ自体弱毒化される必要はなく、むしろ、細菌により感染される細胞を制限するまたは変えるゲノム修飾などの修飾を含む。細菌は、例えば、サルモネラ、シゲラ、リステリア、大腸菌およびビフィドバクテリアの株を含むが、これらに限定されない。例えば、種は、ソンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、志賀赤痢菌、リステリア・モノサイトゲネス、チフス菌、ネズミチフス菌、トリチフス菌およびゲルトネル菌を含む。他の適当な細菌種は、リケッチア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、ビブリオ、バシラスおよびエリジペロスリックス。例えば、斑点熱リケッチア、発疹チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、気管支敗血症菌、髄膜炎菌、淋菌、エロモナス・オイクレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、野兎病菌、ヒツジ偽結核菌、サイトロバクター・フレウンディイ、肺炎クラミジア、ヘモフィルス・ソムナス、ウシ流産菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、在郷軍人病菌、ロドコッカス・エクイ、緑膿菌、ヘリコバクター・ムステラエ、コレラ菌、枯草菌、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリティカ、ロシャリメア・クインターナおよびアグロバクテリウム・ツメルファシウムを含む。
細菌は、免疫特権組織または臓器または環境への拡散、遊走および走化性を含む１以上の性質により、栄養素もしくは栄養要求性である他の分子を提供する環境および／または細菌の侵入および複製のための環境を提供する複製細胞を含む環境に蓄積する。ここに提供される免疫刺激性細菌およびこのような治療を発揮する種は、サルモネラ種、リステリアおよび大腸菌を含む。細菌は、ＲＮＡポリメラーゼ(ＲＮＡＰ)IIまたはIIIプロモーターなどの真核生物プロモーターの制御下に１以上の治療産物をコードするプラスミドを含む。一般に、ＲＮＡＰIII(ＰＯＬIIIとも称される)プロモーターは構成的であり、ＲＮＡＰII(ＰＯＬIIとも称される)は制御され得る。複数の産物がコードされるとき、各発現は異なるプロモーターの制御下にあってよい。
ここに提供される細菌の中でも、アデノシンに対して栄養要求性であるように修飾された細菌である。これは、プリン合成、代謝または輸送に関与する遺伝子の修飾または欠失により達成され得る。例えば、チフス菌などのサルモネラ種におけるｔｓｘ遺伝子の破壊はアデノシン栄養要求性をもたらす。アデノシンは免疫抑制性であり、腫瘍に高濃度で蓄積される；アデノシンに対して栄養要求性は、細菌がアデノシンに富む組織で選択的に複製するため、細菌の抗腫瘍活性を改善する。
ａｓｄ遺伝子が欠損するように修飾された細菌もまた提供される。インビボでの使用のためのこれらの細菌は、導入されたプラスミドに機能的ａｓｄ遺伝子の運搬を含むよう修飾される；これは抗生物質ベースのプラスミド維持／選択系を不要とするようにプラスミドの選択を維持する。また提供されるのは、プラスミドに機能的ａｓｄ遺伝子を含まず、故に、宿主において自己融解であるように操作したａｓｄ欠損株の使用である。
鞭毛の産生が不可能であるように修飾された細菌もまた提供される。これは、フラジェリンサブユニットをコードする遺伝子の欠失の手段により細菌を修飾することにより達成され得る。フラジェリンを欠く修飾細菌は低炎症性であり、それ故により忍容性が高く、かつより強力な抗腫瘍応答を誘導する。
食細胞におけるプラスミド送達を改善するリステリオリシンＯを産生するように修飾された細菌もまた提供される。
低コピー、ＣｐＧ含有プラスミドを担持するよう修飾された細菌もまた提供される。プラスミドは他の修飾をさらに含み得る。
細菌はまた細菌が、サルモネラ種であるならば、毒性ＳＰＩ－１(サルモネラ病原性島－１)遺伝子をあまり発現しないような方法で増殖させるように修飾できる。サルモネラにおいて、病原性、侵襲、生存および腸外拡散を担う遺伝子はサルモネラ病原性島(ＳＰＩ)に位置する。
細菌を、プラスミド維持の選択、特に抗生物質を用いない選択、株の調製を含む他の望ましい形質のためにさらに修飾し得る。免疫刺激性細菌は、所望により抗腫瘍治療ポリペプチドを含む治療ポリペプチドおよび薬剤をコードし得る。
ここに提供される免疫刺激性細菌も例は、サルモネラ種である。ここに記載される修飾のための細菌の例は、ａｓｄ遺伝子ノックアウトおよび無抗生物質プラスミド維持を補うためにプラスミドで操作された株ＹＳ１６４６(ATCC Catalog # 202165；また、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／１３０５３も参照、ＶＮＰ２０００９とも称される)などのネズミチフス菌の操作した株である。
アデノシンに対して栄養要求性とした修飾免疫刺激性細菌株は、腫瘍および癌を処置する方法における使用のために、ヒトなどの対象への投与用に製剤化された、このような株を含む医薬組成物としてここに提供される。
操作したここに提供される免疫刺激性細菌は、腫瘍が持続性抗腫瘍免疫を打ち破るおよび回避するために利用する免疫チェックポイント経路を阻害しながら、非炎症性腫瘍の免疫再活性化を誘導しかつ腫瘍抗原特異的免疫応答を促進する複数の相乗的モダリティを含む。アデノシン栄養要求性および血管破壊増強を介して改善された腫瘍ターゲティングは、他の免疫療法モダリティで観察される全身性サイトカイン暴露および自己免疫性毒性を制限するために炎症を局在化させながら、改善された効力を有する。このように修飾された細菌の例は、株ＹＳ１６４６、特にａｓｄ－株および野生型株のこのような修飾を含む、ネズミチフス菌株である。
Ｃ. 癌免疫療法
腫瘍微小環境(ＴＭＥ)内で見られる免疫抑制性環境は、腫瘍開始および進行の駆動機構である。癌は、免疫系が腫瘍の制御および封じ込めに失敗した後、出現する。複数の腫瘍特異的機構は、免疫系が腫瘍およびその細胞を、排除ではなく、許容するよう強いられる腫瘍環境を作る。癌免疫療法の目標は、腫瘍を排除する免疫系の天然の能力の奪還である。
１. 免疫療法
数種の臨床的癌免疫療法が、抗腫瘍免疫に対する免疫抑制を平衡を混乱させることを探究する。ＩＬ－２およびＩＦＮ－αなどのサイトカインの直接投与を介する免疫刺激の戦略は、少数の患者で中程度の臨床応答がみられるが、重度全身性炎症関連毒性を誘導する(Sharma et al. (2011) Nat. Rev. Cancer 11:805-812)。免疫系は、Ｔ細胞のプログラム細胞死タンパク質１(ＰＤ－１)、および、抗原提示細胞(ＡＰＣ)および腫瘍細胞両者で発現される同族リガンド、プログラム死－リガンド１(ＰＤ－Ｌ１)へのその結合の上方制御などの、自己免疫を制御するいくつかのチェックおよびバランスを進化させている。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞シグナル伝達経路を妨害し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を傷害し、Ｔ細胞耐容性を誘導する。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は、多数の阻害性「免疫チェックポイント」の２例であり、免疫応答の下方制御により機能する。他の阻害性免疫チェックポイントは、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４(ＣＴＬＡ－４)、シグナル制御タンパク質α(ＳＩＲＰα)、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー(ＶＩＳＴＡ)、プログラム死－リガンド２(ＰＤ－Ｌ２)、インドールアミン２,３－ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)１および２、リンパ球－活性化遺伝子３(ＬＡＧ３)、Ｇａレクチン－９、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体(ＴＩＧＩＴ)、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン－ドメイン含有－３(ＴＩＭ－３、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２(ＨＡＶＣＲ２)としても知られる)、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(ＨＶＥＭ)、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３(ＣＤ２７６としても知られる)、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ８０(Ｂ７－１)、ＣＤ８６(Ｂ７－２)、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４(２Ｂ４)、Ｂ－およびＴリンパ球アテニュエーター(ＢＴＬＡまたはＣＤ２７２)および癌胎児性抗原関連細胞接着分子１(ＣＥＡＣＡＭ１またはＣＤ６６ａ)を含む。
抗ＰＤ－１(例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ)および抗ＰＤ－Ｌ１(例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ)などの免疫チェックポイントを遮断するよう設計された抗体は、持続的なＴ細胞アネルギー防止および免疫耐容性破壊が成功している。治療を受けた患者のうち、臨床的な効果が得られるのはごく一部であり、そのような患者はしばしば自己免疫関連の毒性を示す(例えば、Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373:1490-1492; Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454参照)。これは、より有効でありかつ低毒性である、ここに提供される治療の必要性をさらに証明する。
他のチェックポイント遮断戦略は、Ｔ細胞のＣＴＬＡ－４の阻害であり、ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０またはＣＤ８６などのＡＰＣ上の共刺激受容体と結合し、阻害し、同じ受容体に、しかし、低親和性で結合する共刺激分化抗原群２８(ＣＤ２８)を打ち負かす。これは、ＣＴＬＡ－４からの阻害性シグナルを伝達し、Ｔ細胞活性化を防止しながら、ＣＤ２８からの刺激シグナルを遮断する(Phan et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:8372-8377参照)。抗ＣＴＬＡ－４治療(例えば、イピリムマブ)は、一部患者で臨床的成功および持続性があるが、重度免疫関連有害事象のさらに大きな発生を示す(例えば、Hodi et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363:711-723; Schadendorf et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33:1889-1894参照)。腫瘍は抗免疫チェックポイント抗体に対する耐性を獲得することが示されており、ここに提供されているような、より持続性の抗癌治療の必要性を強調する。
２. 養子免疫療法
非炎症性腫瘍をより免疫原性とするための再活性化の追求において、養子細胞治療(ＡＣＴ)として知られる一群の免疫療法は、免疫細胞を利用し、抗腫瘍活性を有するようそれらを再プログラム化する多様な戦略を包含する(Zielinski et al. (2011) Immunol. Rev. 240:40-51)。樹状細胞ベースの治療は、より免疫刺激性の性質を有する遺伝子操作樹状細胞(ＤＣ)を導入する。これらの治療は、癌への免疫耐容性の破壊ができないため、成功していない(例えば、Rosenberg et al. (2004) Nat. Med. 12:1279参照)。ＧＶＡＸとして知られる、ＤＣ動員を刺激するための内因性腫瘍抗原および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)を含む照射腫瘍細胞全体を使用する方法は、腫瘍耐容性を破壊する能力がないため、同様に臨床で失敗している(Copier et al. (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12:14-20)。別の自己細胞ベースの治療、シプロイセルＴ(Provenge)は、２０１０年、去勢抵抗性前立腺癌に対してＦＤＡで承認された。患者から回収したＡＰＣを利用し、Ｔ細胞応答を刺激するための前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)抗原を発現するよう再武装させ、次いで、リンパ除去後再導入される。残念ながら、観察される客観的応答率が低く、高価なことからその広い適用は制限され、その使用は前立腺癌の早期段階に限定されている(Anassi et al. (2011) P T. 36(4):197-202)。同様に、自己Ｔ細胞治療(ＡＴＣ)は、患者自身のＴ細胞を回収し、エクスビボで腫瘍耐容性を克服するよう再活性化され、次いで、リンパ除去後患者に導入される。ＡＴＣの臨床的成功は限定的であり、黒色腫のみであり、同時に有用性を制限する重度安全性および実現可能性問題を生じる(Yee et al. (2013) Clin. Cancer Res. 19:4550-4552)。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞(ＣＡＲ－Ｔ)治療は、Ｔ細胞受容体と抗体Ｉｇ可変細胞外ドメインの融合タンパク質を発現するよう再操作されている、患者から採取したＴ細胞である。これは、抗体の抗原認識性質と活性化Ｔ細胞の細胞溶解性質を付与する(Sadelain (2015) Clin. Invest. 125:3392-400)。成功は、致命的免疫関連有害事象という代償を払って、Ｂ細胞および造血悪性腫瘍に限定されている(Jackson et al. (2016) Nat. Rev. Clin. Oncol. 13:370-383)。腫瘍はまたＣＤ１９(Ruella et al., (2016) Comput Struct Biotechnol J. 14: 357-362)およびＥＧＦＲｖIII(O'Rourke et al. (2017) Sci Transl Med. Jul. 19; 9(399):eaaa0984)を含む標的抗原による認識を回避するよう変異もでき、それにより免疫回避を助長する。ＣＡＲ－Ｔ治療は血液系腫瘍の状況で承認されているが、固形腫瘍処置の実現可能性について、相当な障害である固形腫瘍微小環境の高度な免疫抑制性質の克服に直面している。既存のＣＡＲ－Ｔ治療への多数の付加的修飾が、固形腫瘍に対する実現可能性を提供する可能性のために、必要である(Kakarla, et al. (2014) Cancer J. Mar-Apr; 20(2):151-155)。
３. 癌ワクチンおよび腫瘍溶解性ウイルス
非炎症性腫瘍は、Ｔ細胞および樹状細胞(ＤＣ)浸潤を欠き、非Ｔ細胞炎症性である(Sharma et al. (2017) Cell 9;168(4):707-723)。非炎症性腫瘍をより免疫原性とするための再活性化の追求において、他のクラスの免疫療法は、天然にまたは操作により腫瘍に蓄積する微生物を利用する。これらは、腫瘍抗原を発現し、それにより腫瘍を排除する免疫系の活性化および再プログラム化をするための免疫系を刺激するよう設計されたウイルスを含む。ウイルスベースの癌ワクチンは、ウイルスベクター自体への既存のまたは後天的免疫および腫瘍抗原での発現のための十分な免疫原性の欠如を含む、多数の因子により臨床的に失敗している(Larocca et al. (2011) Cancer J. 17(5):359-371)。ＡＰＣの適切なアジュバント活性化の欠如はまたＤＮＡワクチンなどの他の非ウイルスベクター癌ワクチンを妨害する。腫瘍溶解性ウイルスは、健常組織より分裂腫瘍細胞で優先的に複製し、それにより、その後の腫瘍細胞融解が免疫原性腫瘍細胞死およびさらにウイルス伝搬に至る。修飾単純ヘルペスウイルスとＤＣ動員サイトカインＧＭ－ＣＳＦの組み合わせを使用する腫瘍溶解性ウイルスタリモジンラヘルパレプベク(Ｔ－ＶＥＣ)は、転移黒色腫に対してＦＤＡで承認されている(Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21)。一部黒色腫患者で臨床的利益が示され、他の免疫療法より免疫毒性が少ないが、その有効性は限定的である；遠位腫瘍有効性がなく、他の腫瘍タイプへの広範な適用がない。数ある中で、パラミクソウイルス、レオウイルスおよびピコルナウイルスを利用するような他の腫瘍溶解性ウイルス(ＯＶ)ベースのワクチンは、全身抗腫瘍免疫の誘導において同様の限界に遭遇している(Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300)。腫瘍溶解性ウイルスの全身投与は、特有の課題がある。ＩＶ投与により、ウイルスは容易に希釈され、故に肝毒性をもたらし得る高力価を必要とする。既存の免疫が存在するならば、ウイルスは血中で急速に中和され、その後後天的免疫が反復投与を制限する(Maroun et al. (2017) Future Virol. 12(4):193-213)。
ウイルスベースのワクチンベクターおよび腫瘍溶解性ウイルスの制限の中で、最大の制限はウイルス自体であり得る。ウイルス抗原は、腫瘍抗原と比較してヒトＴ細胞受容体(ＴＣＲ)に際だって高い親和性を有する(Aleksic et al. (2012) Eur J Immunol. 42(12):3174-3179)。硬度に活性化ＡＰＣの表面にＭＨＣ－１によりウイルスベクター抗原と共に提示される腫瘍抗原は、ＴＣＲへの結合について打ち負かされ、抗原特異的抗腫瘍免疫が非常に悪くなる。高親和性Ｔ細胞エピトープをそれ自体提供しないここで提供する腫瘍ターゲティング免疫刺激性ベクターは、これらの制限を回避し得る。
Ｄ. 細菌癌免疫療法
ここに提供されるのは、腫瘍常在免疫細胞に蓄積され、上皮性または他の細胞に感染しないように修飾された免疫刺激性細菌である。免疫刺激性細菌は、宿主認識プロモーターの制御下、Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらす、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である免疫刺激性タンパク質などの治療産物をコードおよび発現する、プラスミドを含む。それ故に、免疫刺激性細菌は、細菌ゲノムの修飾およびコード化治療産物により、免疫療法を直接腫瘍微小環境に送達する癌治療である。ここに提供する細菌および方法および使用は、他の癌免疫療法で遭遇した先の課題を解決する。Ｉ型ＩＦＮの発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である免疫刺激性タンパク質は、ここに提供される免疫刺激性細菌の発現に加えて、エクソソーム、リポソーム、腫瘍溶解性ウイルスおよび遺伝子治療ベクターなどの他の送達媒体によりコード化または提供される。
１. 細菌治療
微生物感染に付随する急性炎症は、数世紀にわたる観測に基づいて腫瘍の自然排出と関連づけられている。細菌が抗癌活性を有するとの認識は、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)に感染した患者の腫瘍退縮が数名の医師により観察された１８００年代に戻る。William Coleyは、末期癌の処置のための細菌の使用の初めての研究を開始し、ストレプトコッカス・ピオゲネス(S. pyogenes)およびセラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)からなるワクチンを開発した。このワクチンは、肉腫、癌腫、リンパ腫および黒色腫を含む多様な癌の処置への使用で成功した。それ以来、クロストリジウム(Clostridium)、マイコバクテリウム、ビフィズス菌(Bifidobacterium)、リステリア、例えばリステリア・モノサイトゲネス(L. monocytogenes)およびエシェリキア(Escherichia)の種を含む多数の細菌が、抗癌ワクチンの源として研究されている(例えば、公開国際ＰＣＴ出願ＷＯ１９９９／０１３０５３およびＷＯ２００１／０２５３９９; Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199; Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21;およびPawelek et al. (2003) Lancet Oncol.4:548-556参照)。
細菌は動物およびヒト細胞に感染でき、一部は、ＤＮＡを細胞のサイトゾルに送達する先天的能力を有する。細菌はまた経口投与でき、インビトロおよびインビボで容易に繁殖し、凍結乾燥状態で保管および輸送できるため、治療剤として適当である。細菌遺伝子は、操作が容易であり、多くの株の完全なゲノムが十分特徴づけされている(Felgner et al. (2016) mbio 7(5):e01220-16)。その結果、細菌は、サイトカイン、血管形成阻害剤、毒素およびプロドラッグ変換酵素をコードするものを含む多様な遺伝子の送達および発現に使用されている。例えば、サルモネラは、腫瘍処置のためにＩＬ－１８(Loeffler et al. (2008) Cancer Gene Ther. 15(12):787-794)、ＬＩＧＨＴ(Loeffler et al. (2007) PNAS 104(31):12879-12883)およびＦａｓリガンド(Loeffler et al. (2008) J. Natl. Cancer Inst. 100:1113-1116)などの免疫刺激分子を発現するために使用されている。細菌ベクターはまたウイルスベクターより安価かつ製造が容易であり、細菌送達は、必要であれば、抗生物質により迅速に排除され得て、安全な代替案となるため、ウイルス送達より好都合である。
しかしながら、使用するためには、株は病原性でなく、または治療剤として使用するために、修飾後に病原性ないべきである。例えば、癌の処置において、治療細菌株は、全身性疾患および／または敗血症性ショックを引き起こさないために弱毒化または十分に非毒性とし、なお腫瘍に有効にコロニー形成するために一定レベルの感染性を維持すべきである。直接殺腫瘍性効果を誘発するおよび／または殺腫瘍性分子を送達するための抗腫瘍剤として使用される遺伝子修飾細菌が記載されている(Clairmont, et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199; Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:755-760; Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652)。これらに含まれるのは生物工学によって作られたネズミチフス菌(S. typhimurium)の株である。これらの細菌は、正常組織より腫瘍に優先的に＞１,０００倍多く蓄積し、腫瘍組織に均一に分散する(Pawelek, J. et al. (1997) Cancer Res. 57:4537-4544; Low, K. B. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:37-41)。優先的複製により、細菌は、正常組織への毒性を最小化しながら、腫瘍内で直接高濃度で多様な抗癌治療剤を産生および送達できる。これらの弱毒化細菌は、静脈内投与したとき、マウス、ブタおよびサルで安全であり(Zhao, M. et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:755-760; Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res 66:7647-7652; Tjuvajev J. et al. (2001) J. Control Release 74:313-315; Zheng, L. et al. (2000) Oncol. Res. 12:127-135)、ある生存弱毒化サルモネラ株は、ヒト臨床試験で経口投与後忍容性が良好であることが示されている(Chatfield, S. N. et al. (1992) Biotechnology 10:888-892; DiPetrillo, M. D. et al. (1999) Vaccine 18:449-459; Hohmann, E. L. et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:1408-1414; Sirard, J. C. et al. (1999) Immunol. Rev. 171:5-26)。ネズミチフス菌ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱオペロンは、膜関連センサーキナーゼ(ＰｈｏＱ)およびサイトゾル転写レギュレーターからなる、典型的細菌２成分制御システムである(PhoP: Miller, S. I. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:5054-5058; Groisman, E. A. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 7077-7081)。ＰｈｏＰ／ｐｈｏＱは病原性に必要であり、その欠失は、マクロファージにおけるこの細菌の生存を不十分とし、マウスおよびヒトにおける顕著な弱毒化をもたらす(Miller, S. I. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:5054-5058; Groisman, E. A. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 7077-7081; Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb Pathog 6:433-443; Fields, P. I. et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:51)。ＰｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失株は有効なワクチン送達媒体として用いられている(Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb Pathog 6:433-443; Fields, P. I. et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:5189-5193; Angelakopoulos, H. and Hohmann, E. L. (2000) Infect Immun 68:2135-2141)。弱毒化サルモネラ属菌(Salmonellae)は、殺腫瘍性タンパク質の標的化送達に使用されている(Bermudes, D. et al. (2002) Curr Opin Drug Discov Devel 5:194-199; Tjuvajev J. et al. (2001) J Control Release 74:313-315)。
細菌ベースの癌治療の臨床的利益は限定的であることが示されている。ノービー菌(Clostridium novyi)(Dang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(26):15155-15160；米国特許公開２０１７／００２０９３１および２０１５／０１４７３１５；および米国特許７,３４４,７１０および３,９３６,３５４)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)(米国特許公開２０１５／０２２４１５１および２０１５／００７１８７３)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)(Kimura et al. (1980) Cancer Res. 40:2061-2068)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)(Yasutake et al. (1984) Med Microbiol Immunol. 173(3):113-125)、リステリア・モノサイトゲネス(Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868; Starks et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427；米国特許公開２００６／００５１３８０)および大腸菌(Escherichia coli)(米国特許９,３２０,７８７)を含む多様な細菌種は、抗癌治療のための可能性のある薬剤として研究されている。
例えば、カルメット・ゲラン桿菌(ＢＣＧ)株は、ヒトにおける膀胱癌の処置に承認され、膀胱内化学療法よりも有効であり、しばしば第一選択処置として使用される(Gardlik et al. (2011) Gene therapy 18:425-431)。他のアプローチは、マウスにおいて発現された腫瘍抗原に対して惹起される強力なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導できる生存弱毒化細胞内細菌であるリステリア・モノサイトゲネスである(Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868)。腫瘍抗原メソテリンを取り込むリステリアベースのワクチンの臨床試験において、プライム・ブーストアプローチで同種膵臓癌ベースのＧＶＡＸワクチンと合わせて、進行型膵臓癌を有する患者で６.１カ月の中央生存が示され、対して、ＧＶＡＸワクチン単独で処置された患者の中央生存は３.９カ月であった(Le et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33(12):1325-1333)。これらの結果は大規模フェーズ２ｂ治験で再現されず、おそらくメソテリンなどの低親和性自己抗原に対する免疫を誘導する試みの難しさを示す。
細菌株は、ここに記載するとおり修飾され得る。株は弱毒化できまたは細胞標的を、標準的方法および／または遺伝子の欠失または修飾および、細菌をインビボで、主に、ＴＭＥ、腫瘍細胞、腫瘍常在免疫細胞および固形腫瘍などの免疫特権環境で増殖可能とする遺伝子の変更または導入により修飾し得る。ここに記載する修飾のための出発株は、例えば、シゲラ、リステリア、大腸菌、ビフィドバクテリアおよびサルモネラから選択され得る。例えば、ソンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、志賀赤痢菌、リステリア・モノサイトゲネス、チフス菌、ネズミチフス菌、トリチフス菌およびゲルトネル菌。他の適当な細菌種はｍリケッチア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、ビブリオ、バシラスおよびエリジペロスリックスを含む。例えば、斑点熱リケッチア、発疹チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、気管支敗血症菌、髄膜炎菌、淋菌、エロモナス・オイクレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、野兎病菌、ヒツジ偽結核菌、サイトロバクター・フレウンディイ、肺炎クラミジア、ヘモフィルス・ソムナス、ウシ流産菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、在郷軍人病菌、ロドコッカス・エクイ、緑膿菌、ヘリコバクター・ムステラエ、コレラ菌、枯草菌、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリティカ、ロシャリメア・クインターナおよびアグロバクテリウム・ツメルファシウム。免疫刺激性を含む何らかの治療用に知られる細菌は、ここに記載するとおり修飾され得る。
２. 細菌およびウイルスに対する免疫応答の比較
ウイルスなどの細菌は、天然に免疫刺激性である利点を有する。細菌およびウイルスは、宿主細胞パターン認識受容体(ＰＲＲ)により感知される、病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰ)として知られる保存構造を含む。ＰＲＲによるＰＡＭＰの認識は、下流シグナル伝達カスケードを誘導し、これはサイトカインおよびケモカインの誘導および病原体排除に至る免疫応答の開始をもたらす(Iwasaki and Medzhitov (2010) Science 327(5963):291-295)。自然免疫系がＰＡＭＰにより結合される方法およびどのタイプの感染因子由来かは、侵入病原体と闘う適切な適応免疫応答を決定する。
Ｔｏｌｌ様受容体(ＴＬＲ)として知られるＰＲＲクラスは、細菌およびウイルス起源由来のＰＡＭＰを認識し、細胞内の種々の区画に位置する。ＴＬＲは、リポ多糖(ＴＬＲ４)、リポタンパク質(ＴＬＲ２)、フラジェリン(ＴＬＲ５)、ＤＮＡにおける非メチル化ＣｐＧモチーフ(ＴＬＲ９)、二本鎖ＲＮＡ(ＴＬＲ３)および一本鎖ＲＮＡ(ＴＬＲ７およびＴＬＲ８)を含む、一定範囲のリガンドと結合する(Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680; Kawai and Akira (2005) Curr. Opin. Immunol. 17(4):338-344)。例えば、ネズミチフス菌の宿主監視は、大部分ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５を介して媒介される(Arpaia et al. (2011) Cell 144(5):675-688)。これらのＴＬＲは、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦアダプター分子を介してシグナル伝達し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＦＮ－γなどのＮＦ－κＢ依存的炎症促進性サイトカインの誘導に介在する(Pandey et. al. (2015) Cold Spring Harb Perspect Biol 7(1):a016246)。
ＰＲＲの他のカテゴリーは、ｎｏｄ様受容体(ＮＬＲ)ファミリーである。これらの受容体は宿主細胞のサイトゾルに存在し、細胞内ＰＡＭＰを認識する。例えば、ネズミチフス菌フラジェリンは、感染マクロファージのパイロプトーシス細胞死に至る、カスパーゼ－１開裂および炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の誘導をもたらす、ＮＬＲＣ４／ＮＡＩＰ５インフラマソーム経路を活性化することが示された(Fink et al. (2007) Cell Microbiol. 9(11):2562-2570)。
ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５およびインフラマソームの関与は、細菌排除を誘導する炎症促進性サイトカインを媒介するが、抗腫瘍免疫に必要なＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞ではなく、主に好中球、マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の動員および活性化をもたらすＮＦ－κＢ駆動シグナル伝達カスケードを活性化する(Liu et al. (2017) Signal Transduct Target Ther. 2:e17023)。ＣＤ８＋Ｔ細胞介在抗腫瘍免疫を活性化するために、ＩＲＦ３／ＩＲＦ７依存性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングのためのＤＣ活性化および腫瘍抗原交差提示に重要である(Diamond et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):1989-2003; Fuertes et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):2005-2016)。Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β)は、２つの異なるＴＬＲ依存性およびＴＬＲ非依存的シグナル伝達経路により誘導されるシグネチャーサイトカインである。ＩＦＮ－βを誘導するためのＴＬＲ依存性経路は、病原体のエンドサイトーシス後に生じ、それによりＴＬＲ３、７、８および９は、エンドソーム内の病原体由来ＤＮＡおよびＲＮＡ要素を検出する。ＴＬＲ ７および８は、ウイルスヌクレオシドおよびヌクレオチドを認識し、レシキモドおよびイミキモドなどのそれらの合成アゴニストが臨床的に評価されている(Chi et al. (2017) Frontiers in Pharmacology 8:304)。ポリイノシン・ポリシチジン酸(ポリ(Ｉ：Ｃ))およびＲＮａｓｅ消化に耐えるようポリＬリシンを用いて製剤化したアナログであるポリＩＣＬＣなどの合成ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ３およびＭＤＡ５経路のアゴニストであり、ＩＦＮ－βの強力なインデューサーである(Caskey et al. (2011) J. Exp. Med. 208(12):2357-66)。ウイルスおよび細菌ＤＮＡに存在するエンドソームＣｐＧモチーフのＴＬＲ９検出は、ＩＲＦ３を介してＩＦＮ－βも誘導する。さらに、ＴＬＲ４は、ＩＲＦ３のＭｙＤ８８非依存的ＴＲＩＦ活性化を介してＩＦＮ－βを誘導することが示されている(Owen et al. (2016) mBio.7:1 e02051-15)。その後、ＤＣのＴＬＲ４活性化はＩ型ＩＦＮ非依存的であることが示され、故に、Ｉ型ＩＦＮを介してＤＣを活性化するＴＬＲ４の能力は、生物学的に関連する可能性はない(Hu et al. (2015) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112(45):13994-13999)。さらに、ＴＬＲ４シグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接動員または活性化することは示されていない。
ＴＬＲ非依存的Ｉ型ＩＦＮ経路の中で、一つは、サイトゾルにおける一本鎖(ｓｓ)および二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡが介在する宿主認識である。これらは、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)、黒色腫分化関連遺伝子５(ＭＤＡ－５)を含むＲＮＡヘリカーゼにより、およびＩＲＦ－３転写因子のＩＦＮ－βプロモータ刺激因子１(ＩＰＳ－１；ミトコンドリア抗ウイルス－シグナル伝達タンパク質またはＭＡＶＳとしても知られる)アダプタータンパク質介在リン酸化を介して感知され、ＩＦＮ－βの誘導をもたらす(Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919)。合成ＲＩＧ－Ｉ結合要素はまたＵ６プロモーター転写開始部位のＡＡジヌクレオチド配列の形で、一般的レンチウイルスｓｈＲＮＡベクターにおいても意図せずに発見されている。プラスミドにおけるその後の欠失は、標的外Ｉ型ＩＦＮ活性化の混乱を阻止した(Pebernard et al. (2004) Differentiation. 72:103-111)。
第二タイプのＴＬＲ非依存的Ｉ型インターフェロン誘導経路は、現在、感染性病原体または異常宿主細胞損傷からのサイトゾルｄｓＤＮＡを感知する中央メディエーターとして認識されている、サイトゾルＥＲ常在アダプタータンパク質であるインターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)を介して介在される(Barber (2011) Immunol. Rev 243(1):99-108)。ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ(ＴＢＫ１)／ＩＲＦ３軸およびＮＦ－κＢシグナル伝達軸を活性化し、ＩＦＮ－βならびに自然免疫および適応免疫を強力に活性化する他の炎症促進性サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす(Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518)。ＳＴＩＮＧを介するサイトゾルｄｓＤＮＡの感知は、ｄｓＤＮＡに直接結合する、宿主細胞ヌクレオチジルトランスフェラーゼである環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ(ｃＧＡＳ)を必要とし、応答して、ＳＴＩＮＧに結合し、活性化する環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)第二メッセンジャー、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ(ｃＧＡＭＰ)を合成する(Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791; Wu et al. (2013) Science 339(6121):826-830)。細胞内リステリア・モノサイトゲネスから産生されたｃ－ジ－ＡＭＰなどの細菌由来ＣＤＮはマウスＳＴＩＮＧに直接結合できるが、５つのヒトＳＴＩＮＧアレル中３つのみにしか結合できない。２つのプリンヌクレオシドが３’－３’結合のリン酸架橋により結合している細菌により産生されるＣＤＮと異なり、哺乳動物ｃＧＡＳにより合成されたｃＧＡＭＰのヌクレオチド間リン酸架橋は、非標準的２’－３’結合により結合する。これらの２’－３’分子は、細菌３’－３’ ＣＤＮより３００倍良好な親和性でＳＴＩＮＧに結合し、故に、ヒトＳＴＩＮＧのより強力な生理学的リガンドである(例えば、Civril et al. (2013) Nature 498(7454):332-337; Diner et al. (2013) Cell Rep. 3(5):1355-1361; Gao et al. (2013) Sci. Signal 6(269):pl1; Ablasser et al. (2013) Nature 503(7477):530-534参照)。
ヒトにおけるｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、細菌病原体よりウイルス病原体に優先的に応答するよう進化しており、これは、先の宿主腫瘍抗原を担持する細菌ワクチンがヒトでＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングベクターとして不十分であったかを説明し得る。慣用のＤＣからのＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によるＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＬＲ非依存的活性化は、ウイルスが検出される一次機構であり、形質細胞様ＤＣによるＴＬＲ依存性Ｉ型ＩＦＮ産生と共に、ＳＴＩＮＧ経路がウイルス性に不活性化されているときのみ作動する(Hervas-Stubbs et al. (2014) J. Immunol. 193:1151-1161)。さらに、ネズミチフス菌などの細菌について、ＴＬＲ４を介するＩＦＮ－βの誘導は可能であるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、排除または保護的免疫を誘導せずまたは必要でもない(Lee et al. (2012) Immunol Lett. 148(2): 138-143)。ネズミチフス菌を含む多くの細菌株で生理学的に関連するＣＤ８＋Ｔエピトープがないことは、細菌ワクチン開発およびその後の感染に対する保護的免疫を、同じ遺伝子株由来でも妨害した(Lo et al. (1999) J. Immunol. 162:5398-5406)。細菌ベースの癌免疫療法は、Ｉ型ＩＦＮが、腫瘍抗原交差提示および持続性抗腫瘍免疫促進に必要な、ＣＤ８＋Ｔ細胞の動員および活性化を誘導する能力により生物学的に制限される。しかしながら、ここに提供される免疫刺激性細菌は、この課題を解決するよう操作された。ここに提供される免疫刺激性細菌は、ＴＬＲ依存性細菌免疫シグナル伝達ではなく、優先的にＣＤ８＋Ｔ細胞介在抗腫瘍免疫を誘導する、ウイルス様ＴＬＲ非依存的Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を含む。
ＳＴＩＮＧは、サイトゾルにおける核酸を感知する応答において自然免疫を活性化する。下流シグナル伝達は、サイトゾルｄｓＤＮＡへの結合に応答して細菌または宿主酵素ｃＧＡＳにより合成される、ＣＤＮの結合を介して活性化される。細菌が産生するＣＤＮと宿主が産生するＣＤＮのリン酸架橋構造は異なり、これによりＳＴＩＮＧを活性化する能力が異なる。ＩＦＮ－βは、活性化ＳＴＩＮＧのシグネチャーサイトカインであり、細菌性に誘導されるＩＦＮではなく、ウイルス性に誘導されるＩ型ＩＦＮであり、有効なＣＤ８＋Ｔ細胞介在抗腫瘍免疫に必要である。ここに提供される免疫刺激性細菌は、ＳＴＩＮＧアゴニストであるものおよびＳＴＩＮＧを発現するものを含む。
３. サルモネラ治療
サルモネラは、癌治療剤として使用できる細菌属の例である。ここで例示されるサルモネラは、弱毒化種またはここに記載する修飾により、癌治療剤としての使用のために、毒性が低減されているものである。
ａ. 腫瘍指向性細菌
多数の細菌種が、遠位部位から注射されたとき、固形腫瘍内での優先的複製を示している。これらは、サルモネラ種、ビフィズス菌(Bifodobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)およびエシェリキアを含むが、これらに限定されない。細菌の天然の腫瘍帰巣性質と、細菌感染に対する宿主の自然免疫応答の組み合わせは、抗腫瘍応答を媒介すると考えられる。この腫瘍組織向性は、種々の程度まで腫瘍のサイズを減少することが示されている。これらの細菌種の腫瘍向性に対する寄与因子は、無酸素または低酸素環境で複製する能力である。多数のこれらの天然に腫瘍指向性細菌は、抗腫瘍応答効力を増加するためにさらに操作されている(Zu et al. (2014) Crit Rev Microbiol. 40(3):225-235; and Felgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078にレビュー)。
ｂ. ネズミチフス菌
ネズミチフス菌は、抗癌治療剤として使用される細菌種の例である。細菌を癌に対する宿主免疫刺激に使用するアプローチは、腫瘍微小環境を含む体の低酸素および壊死性領域に優先的に蓄積するグラム陰性通性嫌気性生物ネズミチフス菌を介するものである。ネズミチフス菌は、組織壊死からの栄養素の利用可能性、漏れやすい腫瘍脈管構造および免疫系回避腫瘍微小環境で生存する可能性の増加により、これら環境に蓄積する(Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-394)。ネズミチフス菌は有酸素および無酸素両者の条件下で生存可能である；それ故に、あまり低酸素ではない小腫瘍およびより低酸素である大腫瘍にコロニー形成できる。
ネズミチフス菌は、糞口経路により伝播される、グラム陰性、通性病原体である。局在化消化器感染を引き起こし得るだけでなく、経口摂取後血流およびリンパ系に入り、肝臓、脾臓および肺などの全身性組織に感染する。野生型ネズミチフス菌の全身投与はＴＮＦ－α誘導を過剰刺激し、処置しなければ、致命的であり得るサイトカインカスケードおよび敗血症性ショックに至る。その結果、ネズミチフス菌などの病原性細菌株は、効率的に腫瘍組織にコロニー形成する能力を完全に抑制することなく、全身性感染を防止するために弱毒化しなければならない。弱毒化は、しばしば細菌外膜などの免疫応答を誘導し得る細胞構造の変異または補助的栄養素非存在下での複製能力の制限により達成される。
ネズミチフス菌は、マクロファージなどの骨髄細胞により迅速に取り込まれ、または上皮細胞などの非食細胞における自身の取り込みを誘導できる細胞内病原体である。細胞内に入ったら、サルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)内で複製でき、また一部上皮細胞のサイトゾルに回避し得る。ネズミチフス菌病原性の分子決定因子の多くが同定されており、遺伝子はサルモネラ病原性島(ＳＰＩ)にクラスター化されている。二つの最も特徴づけられた病原性島は、非食細胞の細菌侵襲の介在を担うＳＰＩ－１およびＳＣＶ内での複製に必要なＳＰＩ－２である(Agbor and McCormick (2011) Cell Microbiol. 13(12):1858-1869)。これらの病原性島の両者は、宿主膜を超えてエフェクタータンパク質を転座できるタイプ３分泌系(Ｔ３ＳＳ)と称される巨大分子構造をコードする(Galan and Wolf-Watz (2006) Nature 444:567-573)。
ｃ. 細菌弱毒化
癌処置剤として投与するための治療細菌は、疾患を引き起こさないように修飾されなければならない。これを達成するための種々の方法は、当分野で知られる。例えば、細菌が必須栄養素を合成することを不可能とする、栄養要求性変異およびａｒｏ、ｐｕｒ、ｇｕａ、ｔｈｙ、ｎａｄおよびａｓｄなどの遺伝子における欠失／変異(米国特許公開２０１２／０００９１５３)は、広範に使用される。これらの遺伝子が関与するにより産生される栄養素は、しばしば宿主細胞で入手不可能であり、そのため、細菌生存は挑戦的である。例えば、サルモネラおよび他の種の弱毒化は、芳香族アミノ酸生合成への解糖に接続する、シキミ酸経路の一部であるａｒｏＡ遺伝子の欠失により達成され得る(Felgner et al. (2016) mbio 7(5):e01220-16)。ａｒｏＡの欠失は、それ故に芳香族アミノ酸に対する細菌栄養要求性およびその後の弱毒化をもたらす(米国特許公開２００３／０１７０２７６、２００３／０１７５２９７、２０１２／０００９１５３および２０１６／０３６９２８２；国際出願公開ＷＯ２０１５／０３２１６５およびＷＯ２０１６／０２５５８２)。同様に、ａｒｏＣおよびａｒｏＤを含む芳香族アミノ酸の生合成経路における他の酵素は、弱毒化を達成するために欠失されている(米国特許公開２０１６／０３６９２８２；国際出願公開ＷＯ２０１６／０２５５８２)。例えば、ネズミチフス菌株Ｌ７２０７は、芳香族アミノ酸栄養素要求株(ａｒｏＡ－変異体)であり；株Ａ１およびＡ１－Ｒはロイシン－アルギニン栄養要求株である。ＶＮＰ２０００９は、プリン栄養素要求株(ｐｕｒＩ－変異体)である。ここに示すとおり、免疫抑制性ヌクレオシドアデノシンに対する栄養要求性でもある。
細菌を弱毒化するための変異は、ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡおよびｌｐｘＴなどのリポ多糖生合成を変える遺伝子の変異；ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌまたはｐｈｌＡなどの自殺遺伝子を導入する変異；ｈｌｙおよびｃｌｙなどの細菌融解遺伝子を導入する変異；ｉｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃおよびａｃｔなどの病原性因子における変異；ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐおよびｇｒｏＥＬなどのストレス応答を修飾する変異；ｍｉｎなどの細胞周期を破壊する変異；およびｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱおよびｏｍｐＲなどの制御機能を破壊または不活性化する変異を含むが、これらに限定されない(米国特許公開２０１２／０００９１５３、２００３／０１７０２７６、２００７／０２９８０１２；米国特許６,１９０,６５７；国際出願公開ＷＯ２０１５／０３２１６５；Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177; Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178; Frahm et al. (2015) mBio 6(2):e00254-15; Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038; Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(47):19414-19419)。理想的には、遺伝的弱毒化は、病原性表現型への復帰をもたらす自発的代償性変異を阻止するために、点変異ではなく遺伝子欠失を含む。
ｉ. ｍｓｂＢ－変異体
ネズミチフス菌においてｍｓｂＢ遺伝子によりコードされる酵素リピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼは、リポ多糖(ＬＰＳ)のリピドＡドメインへの末端ミリスチル基の付加を触媒する(Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。故に、ｍｓｂＢの欠失は、グラム陰性細菌外膜の主成分である、ＬＰＳのリピドＡドメインのアシル組成を変える。この修飾は、ＬＰＳが敗血症性ショックを誘導する能力を顕著に低減し、細菌株を弱毒化し、ＴＮＦαの有害な可能性のある産生を低減し、そうして、全身性毒性を低減する。ネズミチフス菌ｍｓｂＢ変異体は、マウスで他の組織よりも腫瘍に優先的にコロニー形成する能力を維持し、抗腫瘍活性を保持し、そうして、サルモネラベースの免疫療法の治療指数を高める(例えば、米国特許公開２００３／０１７０２７６、２００３／０１０９０２６、２００４／０２２９３３８、２００５／０２５５０８８および２００７／０２９８０１２参照)。
例えば、ネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢの欠失は、天然ヘキサアシル化ＬＰＳより低毒性であるペンタアシル化ＬＰＳの優勢な産生をもたらし、毒素ショックを誘導することなく、全身性送達が可能となる(Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25)。病原性を劇的に低減し、低毒性を提供し、高用量での投与を可能とする他のＬＰＳ変異は、サルモネラ株を含むここに提供される細菌株に導入され得る。
ii. ｐｕｒＩ－変異体
プリン(例えば、アデニン)、ヌクレオシド(例えば、アデノシン)またはアミノ酸(例えば、アルギニンおよびロイシン)などの１以上の必須栄養素に対して栄養要求性とすることにより弱毒化され得る免疫刺激性細菌が用いられる。特に、ネズミチフス菌などのここに提供される免疫刺激性細菌の実施態様において、細菌は、腫瘍微小環境に優先的に蓄積するアデノシンに対する栄養要求性とされる。それ故に、ここに記載される免疫刺激性細菌の株は、増殖にアデノシンを必要とし、下記のとおり、アデノシンが豊富なＴＭＥに優先的にコロニー形成するため、弱毒化される。
ｐｕｒＩ遺伝子(ｐｕｒＭ遺伝子と同義)によりコードされる酵素であるホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼは、プリンの生合成経路に関与する。故に、ｐｕｒＩ遺伝子の破壊は、細菌をプリンに対して栄養要求性とする。弱毒化に加えて、ｐｕｒＩ－変異体は、腫瘍環境で濃縮され、相当な抗腫瘍活性を有する(Pawelek et al. (1997) Cancer Research 57:4537-454)。このコロニー形成は、迅速な細胞代謝回転の結果として、腫瘍の間質液に存在するプリンが高濃度であることによりもたらされると以前に記載された。ｐｕｒＩ－細菌がプリンの合成ができないため、アデニンの外部供給源を必要とし、これがプリン富化腫瘍微小環境に限定された増殖をもたらすと考えられた(Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225)。ＶＮＰ２０００９株は、当初はｐｕｒＩ遺伝子の欠失を含むと報告されたが(Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59)、その後のＶＮＰ２０００９のゲノム全体の分析は、ｐｕｒＩ遺伝子が欠失しているのではなく、染色体逆位により破壊されたことを示した(Broadway et al. (2014) Journal of Biotechnology 192:177-178)。遺伝子全体は、挿入配列により隣接された、ＶＮＰ２０００９染色体の二つの部分内に含まれる(その一方はアクティブなトランスポザーゼを有する)。
ここで、ｐｕｒＩ変異体ネズミチフス菌株が、腫瘍微小環境で高度に豊富なヌクレオシドアデノシンに対して栄養要求性であることが示される。それ故に、ＶＮＰ２０００９を使用したとき、アデノシン栄養要求性を達成するために、何らかのさらなる修飾を導入する必要はない。他の株および細菌について、ｐｕｒＩ遺伝子を、ＶＮＰ２０００９におけるように破壊できまたは野生型遺伝子への復帰を阻止するために、ｐｕｒＩ遺伝子の全てまたは一部の欠失を含み得る。
iii. 弱毒化変異の組み合わせ
染色体の異なる領域における遺伝子欠失の手段により複数の遺伝的弱毒化を伴う細菌は、野生型遺伝子材料との相同組み換えによる遺伝子の獲得による病原性表現型への復帰の可能性を低減しながら、弱毒化が増加され得るため、細菌免疫療法に望ましい。相同組み換えによる病原性の復活は、同じ生物で２つの別々の組み換え事象が生じる必要がある。理想的には、免疫療法剤における使用のために選択された弱毒化変異の組み合わせは、効力を落とすことなく忍容性を増加させ、それにより治療指数を増加させる。
例えば、下記のとおり、ネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ遺伝子の破壊が、腫瘍ターゲティングおよび増殖抑制のために使用されており、動物モデルにおいて低毒性が誘導される(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; Bermudes et al. (2000) Cancer Gene Therapy: Past Achievements and Future Challenges, edited by Habib Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp. 57-63; Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59; Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25; Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225; Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178; Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883; Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508)。しかしながら、ＶＮＰ２０００９は、ヒト治験で同じ腫瘍蓄積および抗腫瘍活性を示さない。故に、何らかの抗腫瘍活性が現れるために必要である高用量は、毒性のために不可能である。治療指数を改善する望ましい性質で、とりわけ、例えば、病原性を低減する、忍容性を増加する、上皮性(および他の非免疫)細胞の細菌感染を低減または排除する、腫瘍常在免疫細胞における蓄積を増加するおよび腫瘍常在免疫細胞の細胞死を減少する、遺伝子修飾の組み合わせを含むここに提供される免疫刺激性細菌は、この課題に取り組む。
iv. ＶＮＰ２０００９および他の弱毒化ネズミチフス菌株
ここに記載するとおり修飾され得る治療細菌の例は、ＶＮＰ２０００９(ATCC # 202165, YS1646)と命名された株である。臨床候補、ＶＮＰ２０００９(ATCC # 202165, YS1646)は、ｍｓｂＢおよびｐｕｒｌ両遺伝子の欠失により、安全性のために少なくとも５０,０００倍弱毒化された(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002; Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59; Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25)。弱毒化された類似のサルモネラの株も考慮される。上記のとおり、ｍｓｂＢの欠失は、グラム陰性細菌外膜の主成分であるリポ多糖のリピドＡドメインの組成を変える(Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。これは、ＴＮＦαの有害な可能性のある産生を低減しながら、リポ多糖誘導敗血症性ショックを阻止し、細菌株を弱毒化し、全身性毒性を低減する(Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41)。ｐｕｒＩ遺伝子の欠失は、細菌をプリンに対して栄養要求性とし、これは、さらに細菌を弱毒化し、腫瘍微小環境に濃縮させる(Pawelek et al. (1997) Cancer Res. 57:4537-4544; Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178)。
腫瘍におけるＶＮＰ２０００９の蓄積は、親株、ATCC #14028の固有の侵襲性、低酸素環境で複製する能力および腫瘍の間質液に存在する高濃度のプリンに対する要求を含む因子の組み合わせに起因する。ここでは、ＶＮＰ２０００９が腫瘍微小環境に病的高レベルで蓄積され、免疫抑制性腫瘍微小環境に寄与する、ヌクレオシドアデノシンに対しても栄養要求性であることも示される(Peter Vaupel and Arnulf Mayer Oxygen Transport to Tissue XXXVII, Advances in Experimental Medicine and Biology 876 chapter 22, pp. 177-183)。ＶＮＰ２０００９が同系またはヒト異種移植腫瘍を担持するマウスに投与されたとき、細菌は、３００～１０００：１を超える比で腫瘍の細胞外成分内に優先的に蓄積し、ＴＮＦα誘導を低減し、対照マウスと比較して、腫瘍増殖阻害および長期生存を示した(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002)。しかしながら、ヒトにおけるフェーズ１臨床試験結果は、ＶＮＰ２０００９が比較的安全かつ忍容性が良好であるもの、ヒト黒色腫腫瘍への不十分な蓄積が観察され、抗腫瘍活性はほとんど示されなかった(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152)。何らかの抗腫瘍活性を発揮するために必要であろう高用量は、高レベルの炎症促進性サイトカインと相関する毒性により不可能であった。
例えば、ロイシン－アルギニン栄養素要求株Ａ－１(Zhao et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(3):755-760; Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；米国特許８,８２２,１９４；米国特許公開２０１４／０１７８３４１)およびその誘導体ＡＲ－１(Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436; Kawaguchi et al. (2017) Oncotarget 8(12):19065-19073; Zhao et al. (2006) Cancer Res. 66(15):7647-7652; Zhao et al. (2012) Cell Cycle 11(1):187-193; Tome et al. (2013) Anticancer Research 33:97-102; Murakami et al. (2017) Oncotarget 8(5):8035-8042; Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882; Binder et al. (2013) Cancer Immunol Res. 1(2):123-133)；ａｒｏＡ－変異体ネズミチフス菌株Ｌ７２０７(Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；米国特許公開２０１２／０００９１５３、２０１６／０３６９２８２および２０１６／０１８４４５６)およびその偏性嫌気性誘導体ＹＢ１(国際出願公開ＷＯ２０１５／０３２１６５; Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436; Leschner et al. (2009) PLoS ONE 4(8):e6692)；ＳＬ１３４４(野生型)の誘導体である株ａｒｏＡ－／ａｒｏＤ－変異体ネズミチフス菌株ＢＲＤ５０９(Yoon et al. (2017) European J. of Cancer 70:48-61)；ａｓｄ－／ｃｙａ－／ｃｒｐ－変異体ネズミチフス菌株χ４５５０(Sorenson et al. (2010) Biologics: Targets & Therapy 4:61-73)およびｐｈｏＰ－／ｐｈｏＱ－ネズミチフス菌株ＬＨ４３０(国際出願公開ＷＯ２００８／０９１３７５)などの、ネズミチフス菌の他の株を、腫瘍標的化送達および治療に使用し得る。
株ＶＮＰ２０００９は、進行型黒色腫を有する患者が関与する治験で臨床的利益を示すことができなかったが、処置は、進行型癌患者に安全に投与された。最大耐用量(ＭＴＤ)が確立された。それ故に、この株および他の同様に操作した細菌株を、腫瘍ターゲティング治療送達媒体の出発物質として使用し得る。ここに提供される修飾は、治療剤の抗腫瘍効率および／または安全性および忍容性の増加により有効性を増加するための戦略を提供する。
ｖ. 巨大分子を送達するよう操作したネズミチフス菌
ネズミチフス菌はまた適応免疫を誘導するためのＡＰＣに対する腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)サバイビン(ＳＶＮ)を送達するようにも修飾されている(米国特許公開２０１４／０１８６４０１; Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270)。ＳＶＮは、細胞生存を延長し、細胞周期を制御し、全固形腫瘍に過発現され、正常組織でほとんど発現されないアポトーシスタンパク質(ＩＡＰ)の阻害剤である。この技術は、サルモネラ病原性島２(ＳＰＩ－２)およびそのタイプIII分泌装置(Ｔ３ＳＳ)を用いてＴＡＡをＡＰＣのサイトゾルに送達し、次いで、ＴＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および抗腫瘍免疫を誘導するように活性化される(Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21): 6260-6270)。リステリアベースのＴＡＡワクチンと同様、このアプローチは、マウスモデルで有望性が示されているが、ヒトにおける有効な腫瘍抗原特異的Ｔ細胞プライミングは、まだ示されていない。
遺伝子送達に加えて、ネズミチフス菌はまた癌治療のための小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)および短鎖ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)の送達に使用されている。例えば、弱毒化ネズミチフス菌は、ＳＴＡＴ３およびＩＤＯ１を標的とするようなある種のｓｈＲＮＡを発現するように修飾されている(国際出願公開ＷＯ２００８／０９１３７５；および米国特許９,４５３,２２７)。免疫抑制性遺伝子インドールアミンデオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)に対するｓｈＲＮＡプラスミドで形質転換したＶＮＰ２０００９は、マウス黒色腫モデルでＩＤＯ発現のサイレンスに成功し、腫瘍細胞死および好中球による顕著な腫瘍浸潤をもたらす(Blache et al. (2012) Cancer Res. 72(24):6447-6456)。このベクターとＰＥＧＰＨ２０(細胞外ヒアルロナンを枯渇させる酵素)の共投与の組み合わせは、膵管腺癌腫瘍処置で良い結果を示している(Manuel et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3(9):1096-1107；米国特許公開２０１６／０１８４４５６)。他の研究で、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失により弱毒化され、シグナル伝達性転写因子３(ＳＴＡＴ３)特異的ｓｈＲＮＡを発現するネズミチフス菌株は、Ｃ５７ＢＬ６マウスで腫瘍増殖を阻害し、転移臓器数を減らし、寿命を延長することが判明した(Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67(12):5859-5864)。他の例において、ネズミチフス菌株Ｌ７２０７は、β－カテニンをコードする遺伝子であるＣＴＮＮＢ１をターゲティングするｓｈＲＮＡの送達に使用されておりが(Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；米国特許公開２００９／０１２３４２６、２０１６／０３６９２８２)、一方ネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９は、ＳＴＡＴ３をターゲティングするｓｈＲＮＡの送達に利用されている(Manuel et al. (2011) Cancer Res. 71(12):4183-4191；米国特許公開２００９／０２０８５３４、２０１４／０１８６４０１および２０１６／０１８４４５６；国際出願公開ＷＯ２００８／０９１３７５およびＷＯ２０１２／１４９３６４)。オートファジー遺伝子Ａｔｇ５およびベクリン１をターゲティングするｓｉＲＮＡは、ネズミチフス菌株Ａ１－ＲおよびＶＮＰ２０００９を使用して、腫瘍細胞に送達されている(Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882)。より効率的に免疫応答を刺激し、ここに提供される免疫刺激性細菌のような他の有利な性質を有するようなこのような株の改善が必要である。種々の細菌のさらなるかつ代替的修飾は、公開国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１９／０１４３９８および米国公開２０１９／００１７０５０Ａ１に記載されている。これら公報の各々に記載され、かつここにも記載される細菌は、さらに免疫刺激性および腫瘍ターゲティング性質を改善するために、ここに記載するとおり修飾され得る。
細菌は、炎症性効果が低減し、故に、低毒性であるように、ここに記載するとおり修飾され得る。その結果、例えば、高投与量で投与され得る。これらのサルモネラの株ならびに当業者に知られるおよび／または上記およびここに挙げる他の細菌種の何れも、アデノシン栄養要求性の導入によるなど、ここに記載するとおり修飾され得る。例は、ここに記載するネズミチフス菌種である。
ここに提供される細菌株は、治療分子／産物を送達するよう操作される。ここでの株は、腫瘍微小環境で抗腫瘍免疫応答を促進する、Ｉ型ＩＦＮ発現および他のサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質を構成的に誘起／誘導できる、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの修飾機能獲得型バリアントを含む免疫刺激性タンパク質を送達する。株はまた、食細胞のパイロトーシスを低減し、それにより、より強い免疫応答を提供するおよび／または上皮細胞に感染／侵襲する能力が低減もしくは排除されるが、腫瘍および腫瘍常在免疫細胞により効率的に蓄積するように、食細胞に感染／侵襲する能力を保持するゲノム修飾も含み得る。細菌株は治療産物をコードする。腫瘍常在免疫細胞における蓄積は、コード化治療産物を発現させ、腫瘍微小環境に分泌させ、治療有効性を増加する。
４. 腫瘍常在免疫細胞における治療指数および発現増加のための免疫刺激性細菌の増強
ここに提供されるのは、毒性を低減し、抗腫瘍活性を改善する、免疫刺激性細菌の増強である。このような増強の例は以下である。それらは、サルモネラ、特にネズミチフス菌に関連して記載される；当業者が、他の細菌種および他のサルモネラ株で類似の増強を実施できることは理解される。
ａ. ａｓｄ遺伝子欠失
細菌のａｓｄ遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。ネズミチフス菌のａｓｄ－変異体は、細胞壁合成に必要であるジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)に対する偏性要求を有し、ＤＡＰを欠く環境で融解を受ける。このＤＡＰ栄養要求性を、ａｓｄ遺伝子が、プラスミドでｔｒａｎｓで補完されたとき、抗生物質を用いることなく、インビボでプラスミド選択およびプラスミド安定性の維持に使用できる。抗生物質を利用しないプラスミド選択系は有利であり、１)有害症状の場合には迅速な排除機構としての抗生物質の投与の使用および２)このような使用が一般に避けられるところでの産生の無抗生物質スケールアップを可能とする。ａｓｄ遺伝子補完系は、このような選択のために提供される(Galan et al. (1990) Gene 94(1):29-35)。腫瘍微小環境でプラスミドを維持するためのａｓｄ遺伝子補完系の使用は、ここに記載するとおり、ＳＴＩＮＧタンパク質および他の免疫刺激性タンパク質などのプラスミドコード化遺伝子および治療産物／タンパク質を送達するよう操作したネズミチフス菌の効力を増加させることが期待される。
ネズミチフス菌のａｓｄ変異体の別の使用は、宿主腫瘍に持続性にコロニー形成する能力なく、細胞に感染する巨大分子の送達のための自己融解(または自殺)株を産生するＤＡＰ栄養要求性の利用のためである。ａｓｄ遺伝子の欠失により、インビトロまたはインビボで増殖したとき、細菌をＤＡＰに対する栄養要求性とし(例えば、実施例３参照)、ＤＡＰに対して栄養要求性であり、治療産物をコードするが、ａｓｄ補完遺伝子を含まないプラスミドを含み、インビボで複製が欠損した株をもたらす、ａｓｄ欠失株を提供する。この株はＤＡＰ存在下、インビトロで繁殖し、正常に増殖し、次いでＤＡＰが存在しない哺乳動物宿主に免疫療法剤として投与される。自殺株は宿主細胞に侵襲できるが、哺乳動物組織にＤＡＰがないため複製できず、自動的に融解し、サイトゾルそのサイトゾル内容物(例えば、プラスミドまたはタンパク質)を送達する。
ここに提供する例において、ＶＮＰ２０００９のａｓｄ遺伝子欠失株を、内因性周辺質分泌シグナル配列を欠くＬＬＯタンパク質(ｃｙｔｏＬＬＯ)を発現するようにさらに修飾し、サルモネラのサイトゾルに蓄積するようにさせる。ＬＬＯは、細菌のファゴソーム回避に介在するリステリア・モノサイトゲネスからのコレステロール依存性孔形成溶血素である。自己融解株が腫瘍担持マウスに導入されたとき、細菌は貪食免疫細胞により取り込まれ、サルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)に入る。この環境で、ＤＡＰの欠失は細菌複製を防止し、ＳＣＶでの細菌の自己融解をもたらす。次いで、自殺株の融解によりプラスミドおよび蓄積ＬＬＯが放出され、コレステロール含有ＳＶＣ膜に孔を形成し、宿主細胞のサイトゾルへのプラスミドの送達を可能とする。ここで、真核生物プロモーターの制御下である、プラスミド上にコード化された遺伝子産物は、宿主細胞機構により発現され得る。
ｂ. アデノシン栄養要求性
トリプトファンおよびＡＴＰ／アデノシン経路由来の代謝物は、腫瘍内の免疫抑制性環境の形成における主要駆動機構である。細胞の内外に放出形態で存在するアデノシンは、免疫機能のエフェクターである。アデノシンはＮＦ－κＢのＴ細胞受容体誘導活性化を低減し、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＦＮ－γを阻害する。アデノシンはＴ細胞の細胞毒性を低減し、Ｔ細胞アネルギーを増加し、Ｆｏｘｐ３＋またはＬａｇ－３＋制御Ｔ細胞(Ｔ－ｒｅｇｓ)へのＴ細胞分化を増加する。ＮＫ細胞で、アデノシンＩＦＮ－γ産生を減少し、ＮＫ細胞の細胞毒性を抑制する。アデノシンは好中球接着および溢出を遮断し、食作用を低減し、スーパーオキシドおよび一酸化窒素のレベルを減衰させる。アデノシンはまたマクロファージのＴＮＦ－α、ＩＬ－１２およびＭＩＰ－１α(ＣＣＬ３)の発現を減少し、ＭＨＣクラスII発現を減衰し、ＩＬ－１０およびＩＬ－６のレベルを増加させる。アデノシン免疫調節活性は、腫瘍の細胞外空間への放出および標的免疫細胞、癌細胞または内皮細胞の表面でのアデノシン受容体(ＡＤＲ)の活性化後に生じる。腫瘍微小環境における高アデノシンレベルは、免疫系が癌細胞を排除する能力を制限する局所免疫抑制をもたらす。
細胞外アデノシンは、死亡したまたは瀕死の細胞から産生されるＡＴＰまたはＡＤＰのホスホ加水分解によるアデノシンの産生と共に、腫瘍間質細胞に発現される膜付随エクトエンザイム、ＣＤ３９およびＣＤ７３の続発的活性により産生される。ＣＤ３９は細胞外ＡＴＰ(またはＡＤＰ)を５’ＡＭＰに変換し、これは、ＣＤ７３によりアデノシンに変換される。内皮細胞のＣＤ３９およびＣＤ７３の発現は、腫瘍微小環境の低酸素条件下増加し、それによりアデノシンのレベルが増加する。腫瘍低酸素状態は、酸素の送達を障害する、不適切な血液供給および無秩序な腫瘍脈管構造に起因し得る(Carroll and Ashcroft (2005) Expert. Rev. Mol. Med. 7(6):1-16)。腫瘍微小環境で生じる低酸素状態は、アデノシンをＡＭＰに変換するアデニル酸キナーゼ(ＡＫ)も阻害し、きわめて高い細胞外アデノシン濃度に至る。低酸素腫瘍微小環境のアデノシンの細胞外濃度は１０－１００μMと測定され、典型的細胞外アデノシン濃度の約０.１μMより最大約１００～１０００倍高い(Vaupel et al. (2016) Adv Exp Med Biol. 876:177-183; Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857)。腫瘍の低酸素領域が微小血管から遠位であるため、腫瘍のある領域のアデニンの局所濃度は、他より高い可能性がある。
免疫系を阻害する効果を指示するため、アデノシンはまた癌細胞増殖、アポトーシスおよび血管形成に作用することにより、癌細胞増殖および伝搬を制御できる。例えば、アデノシンは、主に、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の刺激を介して、血管形成を促進できる。内皮細胞の受容体の刺激は、内皮細胞の細胞間接着分子１(ＩＣＡＭ－１)およびＥ－セクチンの発現を制御し、血管完全性を維持し、血管増殖を促進できる(Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857)。アデノシンによる種々の細胞のＡ２Ａ、Ａ２ＢまたはＡ３の１以上の活性化は、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、インターロイキン－８(ＩＬ－８)またはアンギオポエチン２などの血管新生促進因子の産生を刺激できる(Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857)。
アデノシンはまた癌細胞の受容体との相互作用を介して、腫瘍細胞増殖、アポトーシスおよび転移を直接制御もできる。例えば、ある乳癌細胞株でＡ１およびＡ２Ａ受容体の活性化は腫瘍細胞増殖を刺激し、結腸癌細胞でＡ２Ｂ受容体の活性化は癌増殖促進性質を有することを示す研究がある(Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857)。アデノシンは癌細胞のアポトーシスも誘導でき、種々の試験は、この活性と、Ａ３を介する外因性アポトーシス経路またはＡ２ＡおよびＡ２Ｂを介する内因性アポトーシス経路の活性化を関連づけている(Antonioli et al. (2013))。アデノシンは、細胞運動性増加、細胞外マトリクスへの接着ならびに細胞移動および運動性を促進する細胞付着タンパク質および受容体の発現により、腫瘍細胞遊走および転移を促進できる。
アデノシン三リン酸(ＡＴＰ)の細胞外放出は、刺激免疫細胞および損傷した、瀕死のまたはストレスを受けた細胞から生じる。ＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３(ＮＬＲＰ３)インフラマソームは、ＡＴＰのこの細胞外放出により刺激されたとき、カスパーゼ－１を活性化し、サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の分泌をもたらし、これが、その後自然免疫および適応免疫応答を活性化する(Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358)。ＡＴＰは、酵素ＣＤ３９およびＣＤ７３によりアデノシンに異化される。活性化アデノシンは、ネガティブ・フィードバック機構を介して高度に免疫抑制性の代謝物として作用し、低酸素腫瘍微小環境で複数の免疫細胞型に多面的効果を有する(Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358)。アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは多様な免疫細胞で発現され、ｃＡＭＰ介在シグナル伝達変化を促進するようにアデノシンにより刺激され、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球およびＮＫＴ細胞の免疫抑制性表現型をもたらす。この結果、アデノシンレベルは、ＣＤ７３などのエクトヌクレオチダーゼを過発現することが示されている、固形腫瘍などの病的組織で正常濃度の１００倍を超えて蓄積され得る。アデノシンは、腫瘍血管形成および進展を促進することも示されている。アデノシンに対して栄養要求性である操作した細菌は、故に、腫瘍ターゲティングおよびコロニー形成の増強を示す。
チフス菌などの免疫刺激性細菌は、ｔｓｘ遺伝子の欠失(Bucarey et al. (2005) Infection and Immunity 73(10):6210-6219)またはｐｕｒＤの欠失(Husseiny (2005) Infection and Immunity 73(3):1598-1605)により、アデノシンに対して栄養要求性とし得る。グラム陰性細菌イネ白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)において、ｐｕｒＤ遺伝子ノックアウト株はアデノシンに対して栄養要求性であることが示された(Park et al. (2007) FEMS Microbiol Lett 276:55-59)。ここに例示するとおり、ネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９は、ｐｕｒＩ欠失によりアデノシンに対して栄養要求性であり、それ故に、さらにアデノシンに対して栄養要求性とする修飾は必要ない。それ故に、ここで提供する免疫刺激性細菌株の実施態様は、アデノシンに対して栄養要求性である。このような栄養要求性細菌は腫瘍微小環境で選択的に複製し、さらに腫瘍における投与細菌の蓄積および複製を増加し、腫瘍内および周囲のアデノシンレベルを減少させ、それによりアデノシンの蓄積が原因の免疫抑制を低減または排除する。ここに提供するこのような細菌の例は、アデノシン栄養要求性を提供するためのｐｕｒＩ－／ｍｓｂＢ－変異を含むネズミチフス菌の修飾株である。他のゲノム変異も、ここに記載するとおり、細菌に他の有利な性質を付与するために包含させ得る。
ｃ. フラジェリン欠損株
鞭毛は、移動手段を提供するために、時計周りまたは反時計周りに回転できる回転モーターにフックを介して接続された長繊維からなる、細菌表面の小器官である。ネズミチフス菌における鞭毛は、走化性、および、消化管の粘液層を超える運動性を介在する能力により、経口経路を介する感染の確立に重要である。鞭毛はインビトロで腫瘍類円柱体への走化性およびコロニー形成に必要であり(Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209)、運動性は腫瘍浸透に重要であることが示されているが(Toley and Forbes (2012) Integr Biol (Camb). 4(2):165-176)、鞭毛は、細菌が静脈内投与されたとき、動物における腫瘍コロニー形成に必要ない(Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456)。各鞭毛フィラメントは、数万のフラジェリンサブユニットからなる。ネズミチフス菌染色体は、抗原性に異なるフラジェリン単量体をコードする、２つの遺伝子、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを含む。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ両者を欠損する変異体は、感染の経口経路で投与したとき非運動性および非病原性であるが、非経腸的に投与したとき、病原性を維持する。
フラジェリンは、サルモネラの主要な炎症促進性決定因子であり(Zeng et al. (2003) J. Immunol. 171:3668-3674)、細胞表面のＴＬＲ５およびサイトゾルのＮＬＲＣ４により直接認識される(Lightfield et al. (2008) Nat Immunol. 9(10):1171-1178)。何れの経路も、ＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を含むサイトカインの分泌をもたらす炎症促進性応答に至る。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢによりコードされるフラジェリンより強度の炎症を誘導する、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)フラジェリンＢを分泌するよう細菌を操作することにより、フラジェリンに対する炎症促進性応答を増加させることによる、より強力なサルモネラベースの癌免疫療法を作る試みがなされている(Zheng et al. (2017) Sci. Transl. Med. 9(376):eaak9537)。
炎症促進性シグナル伝達を低減するために、フラジェリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ両者を欠くよう操作したサルモネラ種ネズミチフス菌などの免疫刺激性細菌が提供される。例えば、ここに示すとおり、ＴＮＦ－アルファ誘導減少をもたらすｍｓｂＢを欠くサルモネラ株は、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢノックアウトと組み合わされる。得られたサルモネラ株は、ＴＮＦ－アルファ誘導低減およびＴＬＲ５認識低減の組み合わせを有する。これらの修飾、ｍｓｂＢ－、ｆｌｉＣ－およびｆｌｊＢ－を、例えば、ＳＴＩＮＧ経路機能獲得型タンパク質バリアント、免疫刺激性サイトカインおよび／または同様に阻害性ＲＮＡｉ分子などの、異種タンパク質の真核生物プロモーター制御下の発現を提供するように、所望により、ＣｐＧおよびまたｃＤＮＡ発現カセットを含む細菌プラスミドと組み合わせ得る。得られた細菌は、低減された炎症促進性シグナル伝達および強い抗腫瘍活性を有する。
鞭毛の排除は、細菌の治療指数を増加させる付加的な有利な性質を付与する。例えば、ここに示すとおり(例えば、実施例６参照)、鞭毛の排除(すなわち、サルモネラにおいて、ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)は、マウスマクロファージおよびヒト単球でパイロトーシスを減少させ、上皮細胞での感染を不可能とし、細菌の取り込みを腫瘍常在免疫／骨髄細胞に制限する。
本明細書で下におよび他の箇所に記載するとおり、鞭毛の欠失を、例えば、ａｓｄ－、ｍｓｂＢ－、ｐｕｒＩ－、ｐａｇＰ－、ｃｓｇＤ－、ａｄｒＡ－および／またはここに記載する他の修飾を含む、細菌の治療指数を改善する有利な性質を付与する１以上の他のゲノム修飾と組み合わせ得る。このような修飾細菌を、例えば、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその機能獲得型変異体、ならびにサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質を含む、対象における抗腫瘍免疫応答を増加する治療産物をコードするプラスミドで形質転換し得る。
例えば、ここで提供するとおり、ｆｌｉＣ－およびｆｌｊＢ－二重変異体を、ネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９のａｓｄ欠失株で構築した。ＰｕｒＩ／ｐｕｒＭの破壊により病原性について弱毒化したＶＮＰ２０００９は、ｍｓｂＢ欠失を含むようにも操作し、これは野生型リピドＡより低毒素産生性であるＬＰＳのリピドＡサブユニットの産生をもたらす。これは、野生型リピドＡを有する株と比較して、静脈内投与後マウスモデルにおけるＴＮＦ－α産生の低減をもたらす。また、ｆｌｉＣ－およびｆｌｊＢ－二重変異体を、ａｓｄ、ｐｕｒＩ／ｐｕｒＭおよびｍｓｂＢ欠失を含むネズミチフス菌の野生型株に構築した。得られた株は、ＴＬＲ２／４シグナル伝達を低減するためのリピドＡの修飾ならびにＴＬＲ５認識およびインフラマソーム誘導を低減するためのフラジェリンサブユニットの欠失により、細菌炎症について弱毒化した株の例である。ＬＰＳの修飾と組み合わせたフラジェリンサブユニットの欠失は、宿主における大きな忍容性、免疫刺激性タンパク質の産生に対する免疫刺激性応答の指示および／または抗腫瘍応答を誘導し、腫瘍に対する適応免疫応答を促進するＴＭＥにおける所望の標的に対するＲＮＡ干渉の送達を可能とする。
ｄ. ＬＰＳ生合成経路における遺伝子の欠失
グラム陰性細菌のリポ多糖(ＬＰＳ)は、細菌膜の外葉の主要成分である。３つの主要部分、リピドＡ、非反復コアオリゴサッカライドおよびＯ抗原(またはＯ多糖)からなる。Ｏ抗原は、ＬＰＳの最も外側の部分であり、細菌透過性に対する防護層として働くが、しかしながら、Ｏ抗原の糖組成は、株間で広範に変わる。リピドＡおよびコアオリゴサッカライドはあまり変わらず、より一般には同じ種の株内で保存的である。リピドＡはエンドトキシン活性を含むＬＰＳの部分である。一般に、複数の脂肪酸で装飾された二糖である。これらの疎水性脂肪酸鎖は、ＬＰＳを細菌膜に固定し、ＬＰＳの残りは、細胞表面から突出する。
リピドＡドメインは、グラム陰性細菌の大半の毒性を担う。一般に、血中のＬＰＳは、顕著な病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰ)として認識され、重度の炎症促進性応答を誘導する。ＬＰＳは、ＣＤ１４、ＭＤ２およびＴＬＲ４を含む膜結合受容体複合体のリガンドである。ＴＬＲ４は、ＮＦκＢ経路を刺激し、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βなどの炎症促進性サイトカインの産生をもたらすようＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ経路を介してシグナル伝達される膜貫通タンパク質であり、その結果は、致命的であり得るエンドトキシンショックであり得る。哺乳動物細胞のサイトゾルにおけるＬＰＳは、カスパーゼ４、５および１１のＣＡＲＤドメインに結合し、自己活性化およびパイロプトーシス細胞死をもたらす(Hagar et al. (2015) Cell Research 25:149-150)。
リピドＡの組成およびリピドＡバリアントの毒素原性は、文献の裏づけが十分にある。例えば、一リン酸化リピドＡは、複数のリン酸基を有するリピドＡよりはるかに炎症性が低い。リピドＡのアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に大きな影響を有し得る。大腸菌からの標準的リピドＡは６個のアシル鎖を有し、このヘキサ－アシル化は、強力に毒性である。ネズミチフス菌リピドＡは大腸菌のものに類似する；４つの一級および２つの二級ヒドロキシアシル鎖を有するグルコサミン二糖である((Raetz and Whitfield (2002) Annu. Rev. Biochem. 71:635-700)。上記のとおり、ネズミチフス菌のｍｓｂＢ－変異体はＬＰＳの末端ミリストイル化を受けず、ヘキサアシル化リピドＡより顕著に低毒性であるペンタアシル化リピドＡを主に産生する。パルミチン酸でのリピドＡの修飾は、パルミトイルトランスフェラーゼ(ＰａｇＰ)により触媒される。ｐａｇＰ遺伝子の転写は、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ系の制御下にあり、これは、例えば、ＳＣＶ内の低濃度のマグネシウムにより活性化される。それ故に、ネズミチフス菌のアシル含量は可変であり、野生型細菌では、ヘキサ－またはペンタ－アシル化であり得る。ネズミチフス菌がそのリピドＡをパルミチン酸化する能力は、ファゴリソソームに分泌される抗菌ペプチドへの抵抗性を増加する。
野生型ネズミチフス菌において、ｐａｇＰの発現は、ヘプタ－アシル化されたリピドＡをもたらす。ｍｓｂＢ－変異体(リピドＡの末端アシル鎖が付加され得ない)において、ｐａｇＰの誘導はヘキサアシル化ＬＰＳをもたらす(Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038)。ヘキサアシル化ＬＰＳは、最も炎症促進性であることが示されている。例えば、ヘキサアシル化ＬＰＳのみを産生させるためのｐａｇＰの欠失によるなど(Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177; Felgner et al. (2018) Oncoimmunology 7(2): e1382791)、この炎症促進性シグナルに関して他のグループによって研究されているが、これは、ＬＰＳのＴＮＦ－α介在炎症促進性質および逆説的に低い適応免疫により、忍容性を損ない得る(Kocijancic et al. (2017) Oncotarget 8(30):49988-50001)。
ＬＰＳは、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を誘導する強力なＴＬＲ４アゴニストである。１Ｅ９CFU／ｍ２でのＩ.Ｖ. ＶＮＰ２０００９臨床試験における用量規制毒性(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152)は、サイトカイン介在(発熱、低血圧)であり、２時間で血清でＴＮＦ－αレベル＞１００,０００pg／mlおよびＩＬ－６レベル＞１０,０００pg／mlであった。ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢ欠失および低減された発熱原性にも関わらず、ＬＰＳは、おそらくヘキサアシル化ＬＰＳの存在により、高用量でなお毒性であり得る。それ故に、ｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－株は、ヘキサアシル化ＬＰＳを産生できないため、高用量でより耐性が高く、ヒトに１Ｅ９CFU／ｍ２以上での投与を可能とする。高投与は腫瘍コロニー形成を増加させ、免疫刺激性細菌の治療有効性を増加させ得る。
ここで、ネズミチフス菌などのサルモネラ細菌は、炎症促進性シグナル伝達を低減するために、フラジェリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ両者を欠失するよう操作される。例えば、ここに示すとおり、ＴＮＦ－アルファ誘導減少をもたらすｍｓｂＢを欠くサルモネラ株は、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢノックアウトと組み合わされる。これは、ＴＮＦ－アルファ誘導低減およびＴＬＲ５認識低減の組み合わせを有するサルモネラ株をもたらす。これらの修飾は、ｐａｇＰ－およびここに記載する他のゲノム修飾の組み合わせであり得て、得られた細菌株は、所望によりＣｐＧを含む、免疫刺激性プラスミド(コード化免疫刺激性タンパク質)で形質転換され得る。得られた細菌は、炎症促進性シグナル伝達が低減されているが、強い抗腫瘍活性を有する。
ここに例示されるのは、ペンタアシル化ＬＰＳのみ産生でき、ｍｓｂＢ遺伝子の欠失を含み(上記のとおり、リピドＡの末端ミリストイル化を阻害する)、さらにｐａｇＰの欠失により修飾されている(パルミトイル化阻害)、ネズミチフスの例示株などの生存弱毒化サルモネラ株菌である。ペンタアシル化ＬＰＳを産生するように修飾された株は、異種免疫刺激タンパク質および／または、例えば、免疫チェックポイントに対する、干渉ＲＮＡなどの治療産物を発現するようにさらに修飾されたとき、炎症促進性サイトカインが低レベルであり、血中の安定性が改善し、補体固定への抵抗性が改善し、抗菌ペプチドに対する感受性が増加し、忍容性が増強し、抗腫瘍免疫が増加することが可能である。
ここで提供する、例えば、ｐａｇＰ－変異体はまたネズミチフス菌ＶＮＰ２０００９またはここに記載する他の株または野生型ネズミチフス菌のａｓｄ、ｍｓｂＢ、ｐｕｒＩ／ｐｕｒＭおよびｆｌｉＣ／ｆｌｊＢ欠失株にも構築され得る。得られた株は、ＴＬＲ２／４シグナル伝達を低減するためのリピドＡの修飾およびＴＬＲ５認識およびインフラマソーム誘導を低減するためのフラジェリンサブユニットの欠失およびペンタアシル化ＬＰＳを産生するためのｐａｇＰの欠失により、細菌炎症について減弱された株の例である。ＬＰＳの修飾と組み合わせたフラジェリンサブユニットの欠失は、宿主における大きな忍容性および血中の大きな安定性および補体固定に対する抵抗性を可能とし、免疫刺激性タンパク質などの何らかの遺伝子産物の産生に向けた免疫刺激性応答の指示および／または抗腫瘍応答を誘発し、腫瘍に対する適応免疫応答を促進するためのＴＭＥにおける所望の標的に対するＲＮＡ干渉の送達のための腫瘍部位への輸送を改善する。
ｅ. バイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失
細菌および真菌は、バイオフィルムと呼ばれる多細胞構造を形成できる。細菌バイオフィルムは、分泌され、集合的に細胞外ポリマー物質として知られる細胞壁関連多糖、糖タンパク質および糖脂質ならびに細胞外ＤＮＡの混合物内に封入される。これらの細胞外ポリマー物質は、細菌を洗浄剤、抗生物質および抗菌ペプチドなどの複数の侵襲から保護する。細菌バイオフィルムは、表面のコロニー形成を可能とし、注入ポートおよびカテーテルなどの補装具な感染の相当の原因である。バイオフィルムはまた、感染の経過中に組織に形成もされ得て、これは細菌残留性および排出の期間を延長させ、抗生物質治療の有効性を制限する。バイオフィルムにおける細菌の慢性残留性は、例えば、胆嚢のチフス菌(S. typhi)感染における腫瘍形成を増加させる(Di Domenico et al. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887)。
ネズミチフス菌バイオフィルム形成はＣｓｇＤにより制御される。ＣｓｇＤはｃｓｇＢＡＣオペロンを活性化し、これは、クルリ線毛サブユニットＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの産生増加をもたらす(Zakikhany et al. (2010) Molecular Microbiology 77(3):771-786)。ＣｓｇＡは、ＴＬＲ２によりＰＡＭＰとして認識され、ヒトマクロファージからのＩＬ－８産生を誘導する(Tukel et al. (2005) Molecular Microbiology 58(1):289-304)。さらに、ＣｓｇＤは、ジグアニル酸シクラーゼをコードするａｄｒＡ遺伝子の活性化により、間接的にセルロース産生を増加する。ＡｄｒＡにより産生される小分子環状ジ－グアノシンモノホスフェート(ｃ－ジ－ＧＭＰ)は、ほぼ全ての細菌種に見られるユビキタス二次メッセンジャーである。ｃ－ジ－ＧＭＰのＡｄｒＡ介在増加は、セルロースシンターゼ遺伝子ｂｃｓＡの発現を増加させ、これが、その後ｂｃｓＡＢＺＣおよびｂｃｓＥＦＧオペロンの刺激を経てセルロース産生を増加させる。ネズミチフス菌などの免疫刺激性細菌の、バイオフィルムを形成する能力の低減は、例えば、ｃｓｇＤ、ｃｓｇＡ、ｃｓｇＢ、ａｄｒＡ、ｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＺ、ｂｃｓＥ、ｂｃｓＦ、ｂｃｓＧ、ｄｓｂＡまたはｄｓｂＢなどの、バイオフィルム形成に関与する遺伝子の欠失により達成され得る(Anwar et al. (2014) PLoS One 9(8):e106095)。
ネズミチフス菌は、宿主免疫細胞による食作用に対する防御として、固形腫瘍にバイオフィルムを形成する。バイオフィルムを形成できないサルモネラ変異体は、宿主食細胞により、より迅速に取り込まれ、感染腫瘍から排除される(Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。食細胞内の細胞内局在化のこの増加は、細胞外細菌の残留性を低減し、ここに記載するとおり、プラスミド送達、発現およびＴＭＥへのコード化治療産物の放出ならびにＲＮＡ干渉による遺伝子ノックダウンの有効性を増強する。バイオフィルム形成が低減するよう操作された免疫刺激性細菌は、腫瘍／組織からの排除速度が増加し、それ故に治療の忍容性が増加し、患者における補装具のコロニー形成を阻止し、それによりこれらの株の治療利益を増加させる。アデノシン模倣体は、ネズミチフス菌バイオフィルム形成を阻止でき、腫瘍微小環境における高アデノシン濃度が、腫瘍関連バイオフィルム形成に寄与し得ることを示す(Koopman et al. (2015) AntiMicrob Agents Chemother 59:76-84)。ｐｕｒＩ破壊を含む(およびそれ故に、コロニー形成アデノシンリッチ腫瘍)およびまたバイオフィルム形成に必要な１以上の遺伝子の欠失によりバイオフィルム形成も阻止された、ここで提供するネズミチフス菌などの生存細菌弱毒株は、強い抗腫瘍免疫応答を刺激するために、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよび機能獲得型そのバリアントおよび他のサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質および干渉ＲＮＡなどの治療産物をコードするプラスミドを送達するために操作される。
ａｄｒＡ遺伝子は、ネズミチフス菌バイオフィルム形成に必要なｃ－ジ－ＧＭＰを産生するジグアニル酸シクラーゼをコードする。ｃ－ジ－ＧＭＰは、宿主サイトゾルタンパク質ＳＴＩＮＧに結合し、アゴニストである。ａｄｒＡの欠失によりｃ－ジ－ＧＭＰ産生が低減した免疫刺激性細菌は反直感的であるがバイオフィルムの形成ができないネズミチフス菌変異体などの細菌変異体(ａｄｒＡ変異体を含む)は、マウス腫瘍モデルで治療能の低減が示されている(Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。ＳＴＩＮＧの数種のヒトアレルは、細菌産生３’３’ ＣＤＮへの結合に抵抗性である(Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030)。
ここに記載するとおり、アデノシン栄養要求性であるように操作され、ＬＰＳの修飾および／またはフラジェリンの欠失および／またはバイオフィルム形成に必要な遺伝子の欠失により炎症促進性サイトカインを誘導する能力が低減されたネズミチフス菌株などの細菌株は、強い抗腫瘍免疫応答を促進するために、干渉ＲＮＡならびにサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよび機能獲得型そのバリアント(例えば、ＳＴＩＮＧおよびその他)およびサイトカインを含む免疫刺激性タンパク質などの他の治療用抗癌産物を送達するために、さらに修飾される。
ｆ. サルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)を回避するよう操作したサルモネラ
ネズミチフス菌などのサルモネラは、主にサルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)と称される膜結合区画で複製する細胞内病原体である。ネズミチフス菌は、一部上皮細胞株で、かつ低頻度であるが、複製できる場所であるサイトゾル内に回避することが示されている。高い効率でＳＣＶを回避するよう操作したサルモネラは、ＳＣＶの脂質二重層が電位障壁であるため、宿主細胞サイトゾルにプラスミドなどの巨大分子をより効率的に送達する。宿主サイトゾルへのプラスミド放出は、プラスミドにコードされた治療産物の発現を可能にし、これは、真核生物プロモーターなどの宿主認識制御シグナルの制御下にあり、特に細菌が腫瘍常在免疫細胞により貪食されたとき、治療産物の産生および送達の効率を上げ、細菌の治療指数を改善する。
ここに提供されるのは、ＳＣＶ回避の頻度が増強されたサルモネラ株および方法である。下記および本明細書の他の箇所に記載するとおり、これは、サルモネラ誘導繊維(ＳＩＦ)形成に必要な遺伝子の欠失により達成される。これらの変異体は、ＳＣＶ回避の頻度が増加し、宿主細胞のサイトゾルで複製できる。例えば、ネズミチフス菌のｓｉｆＡ変異体を使用するプラスミド送達増強が示されている。ｓｉｆＡ遺伝子は、宿主ＧＴＰａｓｅのＲｈｏＡファミリーを模倣または活性化するＳＰＩ－２ Ｔ３ＳＳ－２分泌エフェクタータンパク質をコードする(Ohlson et al. (2008) Cell Host & Microbe 4:434-446)。ＳＩＦ形成に関与する他の分泌エフェクターをコードする遺伝子は標的化され得る。これらは、例えば、ｓｓｅＪ、ｓｓｅＬ、ｓｏｐＤ２、ｐｉｐＢ２、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｓｐｖＢおよびｓｔｅＡを含む。ＳＩＦ形成の阻止によるネズミチフス菌の回避増強は、生存細菌を、複製可能な場所であるサイトゾルに放出させる。
ネズミチフス菌のＳＣＶ回避を増強し、プラスミドなどの巨大分子のサイトゾルへの送達を増加する他の方法は、ＳＣＶ膜の孔形成または破裂をもたらす異種溶血素の発現である。あるこのような溶血素は、ｈｌｙＡ遺伝子によりコードされる、リステリア・モノサイトゲネスからのリステリオリシンＯタンパク質(ＬＬＯ)である。ＬＬＯは、リステリア・モノサイトゲネスから分泌され、主にファゴソーム回避および宿主細胞のサイトゾルへの侵入を担う、コレステロール依存性孔形成細胞溶解素である。ネズミチフス菌からのＬＬＯの分泌は、細菌回避をもたらし得て、サイトゾルにおける複製に至る。無傷のネズミチフス菌がＳＣＶを回避し、サイトゾルで複製することを阻止するために、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチドを遺伝子から除去することができ、ｃｙｔｏＬＬＯを産生する。この方法で、活動的ＬＬＯは、ネズミチフス菌のサイトゾル内に含まれ、細菌が融解を受けたときのみＬＬＯが放出される(例えば、ａｓｄ－株における細胞内ＤＡＰ欠失のため)。ＳＣＶにおける細菌融解は、プラスミドの放出とｃｙｔｏＬＬＯ蓄積を可能とし、これは、ＳＣＶに孔を形成し、プラスミドの、コード化治療産物が発現され得る場所である、宿主細胞サイトゾルへの送達を可能とする。
ここで提供する、ＳＴＩＮＧタンパク質およびそのバリアントおよび他の免疫刺激性タンパク質などの治療産物発現のために、プラスミド送達を増強するようにｃｙｔｏＬＬＯを発現するよう操作したネズミチフス菌株ＶＮＰ２０００９などのサルモネラ株は、免疫刺激性細菌の治療効力が増加され得る。これは、細菌がここに記載するとおり腫瘍常在免疫細胞における蓄積のために操作され、それにより腫瘍微小環境に直接治療産物が放出されるため、有利である。
ｇ. 毛の欠失を含む、細菌が上皮細胞に感染する能力を排除するためのＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２遺伝子および／または他の遺伝子の欠失
上記のとおり、ネズミチフス菌などのサルモネラ種を含むある細菌種の病因は、サルモネラ病原性島(ＳＰＩ)と称される遺伝子クラスターが関与する。ネズミチフス菌は、マクロファージなどの骨髄細胞により迅速に取り込まれるまたは上皮細胞などの非食細胞への自身の取り込みを誘導できる細胞内病原体である。細胞に入ったら、サルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)内で複製でき、また一部上皮細胞でサイトゾルに回避する。二つの最も特徴づけされた病原性島は、上皮細胞などの非食細胞の細菌侵襲の介在を担うＳＰＩ－１およびＳＣＶ内での複製に必要なＳＰＩ－２である(Agbor and McCormick (2011) Cell Microbiol. 13(12):1858-1869)。ＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２は、宿主膜を超えてエフェクタータンパク質を転座できるタイプ３分泌系(Ｔ３ＳＳ)と称される巨大分子構造をコードする(Galan and Wolf-Watz (2006) Nature 444:567-573)。
ｉ. サルモネラ病原性島１(ＳＰＩ－１)
ＳＰＩ－１依存性宿主細胞侵襲
３型分泌装置(Ｔ３ＳＳ)を含む侵襲関連サルモネラ病原性島１(ＳＰＩ－１)は、サルモネラの取り込みに至るアクチン再配置を引き起こす、エフェクタータンパク質の宿主細胞のサイトゾルへの転座を担う。サルモネラは、ＳＰＩ－１によりコードされる３型分泌装置(Ｔ３ＳＳ)を使用して非食細胞腸上皮細胞に浸潤し、これは、エフェクタータンパク質を宿主細胞のサイトゾルに直接注入する針様構造を形成する。これらのエフェクタータンパク質は、真核生物細胞の細胞骨格の再配置をもたらし、腸上皮の侵襲を促進し、炎症促進性サイトカインも誘導する。ＳＰＩ－１座位は、この侵襲系の成分をコードする３９個の遺伝子からなる(例えば、Kimbrough et al. (2002) Microbes Infect. 4(1):75-82参照)。ＳＰＩ－１遺伝子は、ｓｉｔＡＢＣＤ、ｓｐｒＢ、ａｖｒＡ、ｈｉｌＣ、ｏｒｇＡＢＣ、ｐｒｇＫＪＩＨ、ｈｉｌＤ、ｈｉｌＡ、ｉａｇＢ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＣ、ｉａｃＰ、ｓｉｐＡＤＣＢ、ｓｉｃＡ、ｓｐａＯＰＱＲＳ、ｉｎｖＦＧＥＡＢＣＩＪおよびｉｎｖＨを含む多数のオペロンを含む。オペロンおよび遺伝子およびその機能は、例えば、Kimbrough et al. ((2002) Microbes Infect. 4(1):75-82)に記載および描写されている。ＳＰＩ－１遺伝子は、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢおよびｓｐｔＰを含むが、これらに限定されない。
Ｔ３ＳＳは、ＡＴＰ依存的様式で細菌タンパク質エフェクターを宿主細胞に直接注入することにより、グラム陰性細菌の感染性に大きな役割を有する複合体である。Ｔ３ＳＳ複合体は、内部および外部細菌膜を通過し、宿主細胞との接触により真核生物細胞膜に孔を形成する。それらは、排出装置、針複合体および針の先端のトランスロコンからなる(例えば、Kimbrough et al. (2002) Microbes Infect. 4(1):75-82参照)。針複合体は、複合体を細菌膜に固定する基底小体である針状タンパク質ＰｒｇＩを含み、タンパク質ＰｒｇＨ、ＰｒｇＫおよびＩｎｖＧおよびＩｎｖＨ、ＰｒｇＪ(棒状タンパク質)およびＩｎｖＪを含む他のタンパク質からなる。宿主細胞に孔を形成するトランスロコンは、タンパク質ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣおよびＳｉｐＤの複合体である。エフェクタータンパク質の転座を可能とする排出装置は、タンパク質ＳｐａＰ、ＳｐａＱ、ＳｐａＲ、ＳｐａＳ、ＩｎｖＡ、ＩｎｖＣおよびＯｒｇＢからなる。タンパク質分泌の一定の順序を確立するサイトゾルソーティングプラットフォームは、タンパク質ＳｐａＯ、ＯｒｇＡおよびＯｒｇＢからなる(例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364参照)。
Ｔ３ＳＳ－１(ＳＰＩ－１のＴ３ＳＳ)により宿主細胞に転座したエフェクターは、細胞侵襲に必須のＳｉｐＡ、ＳｉｐＣ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２およびＳｐｔＰを含む。例えば、ネズミチフス菌ｓｉｐＡ変異体は、侵襲の６０～８０％減少を示し、ｓｉｐＣ欠失は侵襲を９５％減少させ、ｓｏｐＢ欠失は侵襲を５０％減少させる(例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364参照)。他のエフェクターは、サルモネラ誘導炎症を制御するＡｖｒＡを含む。分泌タンパク質に結合し、それを分泌能力のある立体構造に維持するシャペロンは、ＳｉｃＡ、ＩｎｖＢおよびＳｉｃＰを含む。転写レギュレーターは、ＨｉｌＡ、ＨｉｌＤ、ＩｎｖＦ、ＳｉｒＣおよびＳｐｒＢを含む。III型分泌に種々の機能を有する未分類Ｔ３ＳＳ ＳＰＩ－１タンパク質は、ＯｒｇＣ、ＩｎｖＥ、ＩｎｖＩ、ＩａｃＰおよびＩａｇＢを含む(例えば、Kimbrough et al. (2002) Microbes Infect. 4(1):75-82参照)。
ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳは、消化管上皮層の横断に必須であるが、細菌が非経腸的に注入されたとき、感染に重要でない。一部タンパク質(例えば、ＰｒｇＩおよびＰｒｇＪ)および針複合体自体の注入も、インフラマソーム活性化および食細胞のパイロトーシスを誘導できる。この炎症促進性細胞死は、抗原提示細胞(ＡＰＣ)の死を直接誘導し、サイトカイン環境を記憶Ｔ細胞産生を阻止するよう修飾することにより、強い適応免疫応答の開始を制限できる。それ故に、ＳＰＩ－１に関与する１以上の遺伝子の不活性化またはノックアウトを介するＳＰＩ－１依存的侵襲不活性化は、細菌が上皮細胞に感染する能力を排除するが、腫瘍関連骨髄細胞などの貪食免疫細胞を含む食細胞に感染または侵入する能力に影響しない。これらのＳＰＩ－１遺伝子は、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢおよびｓｐｔＰの１以上を含むが、これらに限定されない。
ＳＰＩ－１非依存的宿主細胞侵襲
Ｔ３ＳＳ－１を欠くサルモネラ変異体は、インベイシンＲｃｋ、ＰａｇＮおよびＨｌｙＥを含む数タンパク質が関与するＴ３ＳＳ－１非依存的侵襲機構により、多数の細胞株／タイプに侵入することが示されている。ｒｃｋオペロンは、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢ、ｒｃｋおよびｓｒｇＣの６個のオープンリーディングフレームを含む。ｐｅｆＩは、Ｐｅｆ線毛の生合成に関与するｐｅｆオペロンの転写レギュレーターである。これらの線毛は、仔マウスにおけるバイオフィルム形成、マウス小腸への接着および流体蓄積に関与する。ＳｒｇＡは、Ｐｅｆ線毛の主要構造的サブユニットであるＰｅｆＡのジスルフィド結合を酸化する。ｓｒｇＤは、推定転写レギュレーターをコードする；ＳｒｇＤは、ＰｅｆＩと共に、鞭毛遺伝子発現の相乗的な負の制御の誘導のために働く。ｓｒｇＢは推定外膜タンパク質をコードし、ｓｒｇＣは推定転写レギュレーターをコードする(例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364参照)。
Ｒｃｋは、腸炎菌(S. Enteritidis)およびネズミチフス菌(S. Typhimurium)の大病原性プラスミドによりコードされる１７kDa外膜タンパク質であり、上皮細胞への接着および侵襲を誘導し、膜攻撃複合体の形成阻止により、補体による中和に対する高レベルの抵抗性を付与する。ｒｃｋ変異体は、野生型株と比較して上皮細胞侵襲の２～３倍減少を示すが、Ｒｃｋ過発現は、侵襲を増加させる。Ｒｃｋは、受容体介在過程により細胞侵入を誘導し、局所アクチンリモデリングおよび弱くかつ密着した膜拡張を促進する。それ故に、サルモネラは、Ｔ３ＳＳ－１複合体が介在するトリガー機構およびＲｃｋにより誘導されるジッパー機構の２つの異なる機構により細胞に侵入できる(例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364参照)。
インベイシンＰａｇＮは、またサルモネラ侵襲に役割を有することが示されている外膜タンパク質である。ｐａｇＮ発現は、ｐｈｏＰにより制御される。特定の刺激、例えば、酸性化マクロファージファゴソーム環境または低Ｍｇ２＋濃度がＰｈｏＱにより感知され、次いで、特異的遺伝子を制御するためにＰｈｏＰが活性化される。ネズミチフス菌におけるｐａｇＮの欠失は、細胞接着を変えることなく、腸細胞の侵襲の３倍減少をもたらすことが示されている。ＰａｇＮ介在侵入機構は十分には理解されていないが、アクチン重合が侵襲に必要であることが示されている。ＰａｇＮが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるサルモネラ生存に必要であり、ｐａｇＮ変異体が親株よりマウスの脾臓のコロニー形成に低競合的であることを示す研究がある。ｐａｇＮがＰｈｏＰにより活性化されるため、ＳＰＩ－１島コード化Ｔ３ＳＳ－１が下方制御されている細胞内で大部分発現される。故に、上皮細胞またはマクロファージを出る細菌が、最適ＰａｇＮ発現レベルを有することが可能であるが、その後宿主細胞破壊で遭遇するその後の他の細胞との相互作用を介在できるＴ３ＳＳ－１発現が低く、サルモネラ病因におけるＰａｇＮの役割を示す(例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364参照)。
ｈｌｙＥは、大腸菌ＨｌｙＥ(ＣｌｙＡ)溶血素と９０％を超える配列同一性を共有する。ＨｌｙＥタンパク質は、外膜小胞放出を介して細菌細胞から輸出されたとき上皮細胞を溶解し、上皮細胞侵襲に関与する。ＨｌｙＥはまた全身性サルモネラ感染の確立にも関与する(例えば、Manon et al. (2012), Salmonella, Chapter 17, eds. Annous and Gurtler, Rijeka, pp. 339-364参照)。
その結果、細菌が上皮細胞に感染する能力の排除は、遺伝子ｒｃｋ、ｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢおよびｓｒｇＣの１以上などのＳＰＩ－１非依存的侵襲に関与するタンパク質をコードする遺伝子のノックアウトまたは欠失／破壊を含むよう、ここに記載する免疫刺激性細菌を操作することによっても達成され得る。
ここに提供される免疫刺激性細菌は、ｈｉｌＡ遺伝子および／またはＴ３ＳＳ経路における他の遺伝子の欠失または破壊を有するものを含む。これらの細菌を、静脈内または腫瘍内などにより投与したとき、感染は、取り込みにＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳを必要としない、マクロファージおよび樹状細胞などの食細胞に向かって収束される。これは、ここに提供される免疫刺激性細菌の安全性プロファイルを増強する。標的外細胞侵襲を阻止し、糞口伝播を阻止する。上皮細胞などの非食細胞によるサルモネラの取り込みの低減に加えて、この経路における遺伝子の欠失または破壊はまたインフラマソーム活性化およびマクロファージのパイロトーシス阻止により食細胞の寿命も延長し、そうして、この経路に欠失を含まない細菌と比較して、ヒトマクロファージの細胞死をあまり誘導しない。例えば、ＳＰＩ－１経路(例えば、針および棒状タンパク質など)における遺伝子の欠失は、インフラマソーム活性化によるパイロトーシスを阻害するが、ＴＬＲ５シグナル伝達は維持することができる。これは、次に、ＳＴＩＮＧタンパク質またはここに提供される免疫刺激性細菌によりコードされる他の治療／抗癌産物などのコード化タンパク質の長期分泌を可能にし、腫瘍へのマクロファージ輸送を可能にし、故に免疫刺激性細菌の有効性を改善する。
ここに記載するとおり、上皮細胞に感染しないが、腫瘍常在免疫細胞を含む食細胞に感染する能力は維持し、それにより腫瘍微小環境に免疫刺激性細菌およびコード化治療産物を効率的にターゲティングするよう修飾された免疫刺激性細菌が提供される。これは、ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＰ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢおよびｓｐｔＰの１以上ならびにｒｃｋ、ｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢおよびｓｒｇＣの１以上の欠失を含むが、これらに限定されない、ＳＰＩ－１におけるタンパク質の何れかの欠失またはノックアウトにより達成される。
上皮細胞に感染しない免疫刺激性細菌を、例えば、Ｉ型インターフェロンを誘導する産物(例えば、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびそのＧＯＦバリアント)を含む、免疫系を刺激する治療産物をコードし、またサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質もコードするように、ここに記載するとおりさらに修飾し得る。細菌は、一般に哺乳動物宿主で複製不可能とするために、ａｓｄ欠失を有する。例えば、１以上のＳＰＩ－１遺伝子の欠失により修飾され、またｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失およびａｓｄ欠失の１以上により修飾され、さらにＩ型インターフェロンおよび／または免疫刺激性サイトカインを誘導するサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその機能獲得型変異体などの免疫系を刺激するタンパク質などの治療産物をコードするプラスミドの送達により修飾される、ネズミチフス菌の株が提供される。
例えば、ＳＰＩ－１関連３型分泌装置(Ｔ３ＳＳ－１)の発現に必要な制御遺伝子(例えば、ｈｉｌＡまたはｉｎｖＦ)、Ｔ３ＳＳ－１構造的遺伝子(例えば、ｉｎｖＧまたはｐｒｇＨ)および／またはＴ３ＳＳ－１エフェクター遺伝子(例えば、ｓｉｐＡまたはａｖｒＡ)が欠失した細菌が提供される。上記のとおり、この分泌装置は、細菌の取り込みを引き起こす、上皮細胞などの非食作用性宿主細胞のサイトゾルへのエフェクタータンパク質の注入を担う；これら遺伝子の１以上の欠失は、上皮細胞の感染／侵襲を排除する。ｈｉｌＡなどの１以上の遺伝子の欠失は、静脈内または腫瘍内投与できる免疫刺激性細菌を提供し、取り込みにＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳを必要としない食細胞の感染をもたらし、またこれら食細胞の寿命を延長する。ｈｉｌＡ変異はまた炎症促進性サイトカインの量を減少し、治療の忍容性および適応免疫応答の質を増加させる。
これに加えてまたはこれとは別に、免疫刺激性細菌は、遺伝子ｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢおよびｓｒｇＣの１以上などのＳＰＩ－１非依存的感染／侵襲に関与する産物を不活性化ための遺伝子のノックアウトまたは欠失を含み、細菌が上皮細胞に感染する能力を低減または排除し得る。
ここに記載するとおり、ＳＰＩ－１経路および細菌鞭毛に関与する遺伝子は、食細胞(免疫細胞)におけるインフラマソームを活性化し、パイロトーシスを誘導する。ＳＰＩ－１遺伝子および鞭毛をコードする遺伝子のノックアウトまたは破壊は、パイロトーシスを低減または排除し、また、上皮細胞の感染を排除し、食細胞の感染を増加させる。それ故に、免疫刺激性細菌は、インフラマソームにより直接認識されるタンパク質をコードする遺伝子など、腫瘍常在免疫細胞の細胞死を誘導する遺伝子産物の不活性化を誘導するためのノックアウトまたは欠失を含み得る；これらは、ｆｌｊＢ、ｆｌｉＣ、ｐｒｇＩおよびｐｒｇＪを含む。ここに示すとおり(例えば、実施例６参照)、鞭毛の排除(すなわち、サルモネラにおいて、ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)、マウスマクロファージおよびヒト単球でパイロトーシスを減少させ、上皮細胞での感染を不可能とし、細菌の取り込みを腫瘍常在免疫／骨髄細胞に制限する。
それ故に、ＲＮＡポリメラーゼIIなどの真核生物制御シグナルにより制御されるプラスミドにコードされた産物を発現する、食細胞、特に腫瘍常在免疫細胞に蓄積する免疫刺激性細菌が提供される。産物は、Ｉ型インターフェロンの発現を増加させる経路を介するなど、免疫応答を誘起するものを含み、これは、腫瘍微小環境における宿主免疫応答を増加させる。免疫刺激性細菌はまたＩＬ－２などの免疫刺激性タンパク質を含む他の産物もコードでき、さらに腫瘍微小環境における免疫応答が増強される。
ii. サルモネラ病原性島２(ＳＰＩ－２)
サルモネラはまた、細菌の宿主細胞への侵入後活性化され、ファゴソーム成熟を妨害し、サルモネラが細胞内生存および複製中常在する特殊化したサルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)の形成をもたらす、他のＴ３ＳＳをコードするサルモネラ病原性島２(ＳＰＩ－２)も有する。ＳＰＩ－２ Ｔ３ＳＳエフェクターは、細胞内細菌周囲のＦ－アクチンコートの組み立てを担うＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤおよびＳｐｉＣを含む；このアクチンコートは、ＳＣＶとアクチン含有またはアクチン推進小胞の融合を促進し、不都合な区画との融合を阻止する。ＳｉｆＡは、感染細胞における個々のＳＣＶを接続する細管であるサルモネラ誘導繊維(ＳＩＦ)の形成を担う。ＳｉｆＡは、ＳＣＶ完全性の維持に必須であり、ｓｉｆＡ変異体は宿主細胞のサイトゾルに放出される。ＳｓｅＦおよびＳｓｅＧは、細菌の生存および複製に必要な物質をＳＣＶに向ける、ＳＣＶ位置調整および細胞輸送過程に関与するＳＰＩ－２ Ｔ３ＳＳの成分である。ＳｓｅＦおよびＳｓｅＧはまたＳＩＦ形成にも関与する。他のＳＰＩ－２ Ｔ３ＳＳエフェクターは、ＳＩＦおよびＳＣＶ形成および空胞完全性維持に関与するＰｉｐＢ２、ＳｏｐＤ２およびＳｓｅＪ；宿主免疫シグナル伝達に関与するＳｐｖＣ、ＳｓｅＬおよびＳｓｐＨ１；および感染食細胞の遊走におけるＳＣＶ Ｆ－アクチン網の形成ならびに感染細胞におけるアクチン重合阻害およびＰ－ｂｏｄｙ脱集合に関与するＳｔｅＣ、ＳｓｐＨ２、ＳｒｆＨ／ＳｓｅＩおよびＳｐｖＢを含む(Coburn et al. (2007) Clinical Microbiology Reviews 20(4):535-549; Figueira and Holden (2012) Microbiology 158:1147-1161)。
ここに記載する免疫刺激性細菌は、ＳＣＶおよびＳＩＦなどの関連構造の形成または完全性に影響するＳＰＩ－２ Ｔ３ＳＳ遺伝子の何れかに欠失または修飾を含み得る。これらの変異体は、ＳＣＶ回避の頻度が増加し、サイトゾルにおける複製ができる。例えば、ＳＣＶを回避するよう操作したサルモネラ種などの免疫刺激性細菌は、ＳＣＶの脂質二重層が電位障壁であるため、プラスミドなどの巨大分子の宿主細胞サイトゾルへの送達により効率的である。ＳＩＦ形成阻止によるＳＣＶからの細菌の回避の増強は、宿主細胞機構制御下(すなわち、真核生物プロモーターなどの真核生物制御要素制御下)コード化治療産物またはタンパク質を複製および発現できる場所である、サイトゾルに生存細菌を放出する。これは、細菌の治療有効性を増強し、例えば、ｓｉｆＡ、ｓｓｅＪ、ｓｓｅＬ、ｓｏｐＤ２、ｐｉｐＢ２、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｓｐｖＢおよびｓｔｅＡを含む、サルモネラ誘導繊維(ＳＩＦ)形成に必要な遺伝子の欠失または変異により達成される。
ＳＣＶを回避できる免疫刺激性細菌を、例えば、Ｉ型インターフェロンを誘導する産物を含む免疫系を刺激する産物をコードしまたサイトカインもコードするように、さらにここに記載するとおり修飾し得る。細菌は、一般にａｓｄ欠失を有し、哺乳動物宿主での複製が不可能である。
ｈ. プラスミド送達を増加するためのエンドヌクレアーゼ－１(ｅｎｄＡ)変異
ｅｎｄＡ遺伝子(例えば、配列番号２５０)は、グラム陰性細菌のペリプラズムで二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)分解に介在するエンドヌクレアーゼ(例えば、配列番号２５１)である。実験室大腸菌の最も一般的な株は、ｅｎｄＡ遺伝子の変異がプラスミドＤＮＡの高い収率を可能とするため、ｅｎｄＡ－である。この遺伝子は、種間で保存されている。無傷のプラスミドＤＮＡ送達を促進するため、操作した免疫刺激性細菌のｅｎｄＡ遺伝子は、エンドヌクレアーゼ活性を阻害するため欠失または変異される。このような変異の例は、Ｅ２０８Ｋアミノ酸置換(Durfee, et al. (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606)または目的の種における対応する変異である。Ｅ２０８を含むｅｎｄＡは、サルモネラを含む細菌種間で保存されている(例えば、配列番号２５１参照)。それ故に、Ｅ２０８Ｋ変異を使用して、サルモネラ種を含む他の種のエンドヌクレアーゼ活性を排除し得る。当業者は、ｅｎｄＡ活性を排除するための他の変異または欠失を導入できる。サルモネラにおけるようなここでの免疫刺激性細菌におけるｅｎｄＡ活性を排除するための遺伝子のこの変異または欠失または破壊の実施は、無傷のプラスミドＤＮＡ送達の効率を増加し、それによりコード化治療産物の発現を増加し、抗腫瘍有効性を増強する。
ｉ. ＲＩＧ－Ｉ結合配列
上記のとおり、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β)は、異なるＴＬＲ依存性およびＴＬＲ非依存性シグナル伝達経路により誘導されるシグネチャーサイトカインである。ＴＬＲ非依存的Ｉ型ＩＦＮ経路で、一つは、サイトゾルにおける一本鎖(ｓｓ)および二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡの宿主認識が介在する。これらは、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)、黒色腫分化関連遺伝子５(ＭＤＡ－５)を含むＲＮＡヘリカーゼおよびＩＲＦ－３転写因子のＩＦＮ－βプロモータ刺激因子１(ＩＰＳ－１)アダプタータンパク質介在リン酸化を介して感知され、Ｉ型ＩＦＮの誘導に至る(Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919)。ＲＩＧ－Ｉは、５’－三リン酸を担持するｄｓＲＮＡおよびｓｓＲＮＡを認識する。この部分はＲＩＧ－Ｉに直接結合できまたはポリＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIII(Ｐｏｌ III)によりポリ(ｄＡ－ｄＴ)鋳型から合成され得る(Chiu, Y. H. et al. (2009) Cell 138(3):576-91)。２つのＡＡジヌクレオチド配列を含むポリ(ｄＡ－ｄＴ)鋳型は、一般的レンチウイルスｓｈＲＮＡクローニングベクターのＵ６プロモーター転写開始部位で生ずる。プラスミドにおけるその後の欠失がＩ型ＩＦＮ活性化を阻害する(Pebernard et al. (2004) Differentiation. 72:103-111)。ＲＩＧ－Ｉ結合配列は、ここに提供されるプラスミドに包含され得る；この包含は、ここに記載する免疫刺激性細菌の抗腫瘍活性を増加するＩ型ＩＦＮ産生の誘導により、免疫刺激を増加することができる。
ｊ. ＤＮａｓｅ II阻害
外来および自己ＤＮＡの分解を担う他のヌクレアーゼは、エンドソーム区画に存在し、アポトーシス後ＤＮＡを分解するエンドヌクレアーゼであるＤＮａｓｅ IIである。ＤＮａｓｅ II(マウスにおけるＤｎａｓｅ２ａ)の欠失は、サイトゾルに回避し、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化するエンドソームＤＮＡの蓄積をもたらす(Lan Y. Y. et al. (2014) Cell Rep. 9(1):180-192)。ヒトにおけるＤＮａｓｅ II欠失は、自己免疫性Ｉ型インターフェロン症を伴う。癌で、腫瘍常在マクロファージにより貪食される瀕死の腫瘍細胞は、エンドソーム区画内でのＤＮＡのＤＮａｓｅ II消化を介して、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ活性化および潜在的自己免疫を阻害する(Ahn et al. (2018) Cancer Cell 33:862-873)。それ故に、腫瘍微小環境でＤＮａｓｅ IIを阻害できる産物をコードするここで提供する免疫刺激性細菌株の実施態様は、強力なｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧアゴニストとして作用できる場所である、サイトゾルにおける細胞内に取り込まれたアポトーシス腫瘍ＤＮＡの蓄積を誘導できる。
ｋ. ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害
ＴＲＥＸ１(３プライム修復エキソヌクレアーゼ１)およびＤＮａｓｅ IIは、異常ＤＮＡ蓄積の浄化に機能し、ＲＮａｓｅ Ｈ２は、同様にサイトゾルでＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの病原性蓄積の排除に機能する。ＲＮａｓｅ Ｈ２の欠失はまたエカルディ・グティエール症候群の自己免疫性表現型に寄与する(Rabe, B. (2013) J. Mol. Med. 91:1235-1240)。ＲＮａｓｅ Ｈ２およびその後のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはゲノム包埋リボヌクレオチド基質の蓄積欠失は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化することが示されている(MacKenzie et al. (2016) EMBO J. Apr. 15;35(8):831-44)。それ故に、ＲＮａｓｅ Ｈ２の発現を阻害または低減する産物をコードし、それによりＲＮａｓｅ Ｈ２を阻害する免疫刺激性細菌株の実施態様は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化し、抗腫瘍免疫を増強する腫瘍由来ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびその誘導体をもたらす。
ｌ. スタビリン－１／ＣＬＥＶＥＲ－１阻害
主に単球で発現され、免疫制御に関与する他の分子は、スタビリン－１である(遺伝子名ＳＴＡＢ１、ＣＬＥＶＥＲ－１、ＦＥＥＬ－１としても知られる)。スタビリン－１は、炎症後、内皮細胞およびマクロファージで、特に、腫瘍関連マクロファージで上方制御されるＩ型膜貫通タンパク質である(Kzhyshkowska et al. (2006) J. Cell. Mol. Med. 10(3):635-649)。炎症性活性化により、スタビリン－１はスカベンジャーとして働き、創傷治癒およびアポトーシス小体排除を助け、肝線維症などの組織傷害を予防できる(Rantakari et al. (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(33):9298-9303)。スタビリン－１の上方制御は抗原特異的Ｔ細胞応答を直接阻害し、単球におけるｓｉＲＮＡによるノックダウンは、炎症促進性機能を増強することが示された(Palani, S. et al. (2016) J. Immunol. 196:115-123)。それ故に、腫瘍微小環境におけるスタビリン－１／ＣＬＥＶＥＲ－１の発現を阻害または低減する産物をコードする免疫刺激性細菌株の実施態様は、腫瘍常在マクロファージの炎症促進性機能を増強する。
ｍ. ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧ島
非メチル化シチジン－ホスフェート－グアノシン(ＣｐＧ)モチーフは、細菌ゲノムＤＮＡで優勢であるが、脊椎動物では違う。病原性ＤＮＡおよび合成オリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)含有ＣｐＧモチーフは宿主防御機構を活性化し、自然および後天的免疫応答を導く。非メチル化ＣｐＧモチーフは、中央非メチル化ＣＧジヌクレオチドと隣接領域を含む。ヒトにおいて、構造および誘導する免疫応答の性質の差異に基づいて、４つの異なるクラスのＣｐＧ ＯＤＮが、同定されている。Ｋ型ＯＤＮ(Ｂ型とも称される)は、一般にホスホロチオエート主鎖に、１～５個のＣｐＧモチーフを含む。Ｄ型ＯＤＮ(Ａ型とも称される)は、混合ホスホジエステル／ホスホロチオエート主鎖を含み、一ＣｐＧモチーフを有し、ステムループ構造の形成を可能にするパリンドローム配列ならびに３’および５’末端にポリＧモチーフが隣接する。Ｃ型ＯＤＮは、ホスホロチオエート主鎖を有し、ステムループ構造または二量体を形成できる複数のパリンドロームＣｐＧモチーフを含む。Ｐ－クラスＣｐＧ ＯＤＮは、ホスホロチオエート主鎖を有し、ＧＣリッチ３’末端でヘアピンを形成できる二重パリンドロームを伴う複数のＣｐＧモチーフを含む(Scheiermann and Klinman (2014) Vaccine 32(48):6377-6389)。ここでの目的のために、ＣｐＧは、プラスミドＤＮＡにコード化される；モチーフとしてまたは遺伝子に導入され得る。
トール様受容体(ＴＬＲ)は、病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰ)感作および病原体に対する自然免疫活性化のためのカギとなる受容体である(Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680)。ＴＬＲ９は、哺乳動物ＤＮＡに天然に存在しない原核生物のＤＮＡにおける低メチル化ＣｐＧモチーフである(McKelvey et al. (2011) J. Autoimmunity 36:76-86)。免疫細胞サブセットのエンドソームへの病原体の食作用によるＣｐＧモチーフの認識は、ＩＲＦ７依存性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を誘導し、自然免疫および適応免疫を活性化する。
ＣｐＧ島／モチーフを含むプラスミドを担持するサルモネラ種などのネズミチフス菌などの免疫刺激性細菌株が、ここで提供される。これらの細菌は、ＴＬＲ９を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ介在自然免疫および適応免疫を誘導できる。ここに例示するとおり、低メチル化ＣｐＧ島を含む細菌プラスミドは、自然および適応抗腫瘍免疫応答を誘導でき、機能獲得型バリアントＳＴＩＮＧタンパク質などのコード化産物と組み合わせて、相乗的なまたは増強された抗腫瘍活性を有し得る。例えば、ａｓｄ遺伝子(例えば、配列番号４８参照)は、高頻度の低メチル化ＣｐＧ島をコードする。ＣｐＧモチーフは、ここに記載するまたは本記載から明らかなＳＴＩＮＧタンパク質およびその変異体などの治療産物の何れかと組み合わせで、免疫刺激性細菌に包含され得て、それによりＴＬＲ９などのＴＬＲの調節により、抗腫瘍免疫応答を増強または改善する。
免疫刺激性ＣｐＧは、一般に細菌遺伝子(例えば、ａｓｄ)からの遺伝子産物をコードする核酸を包含させ、ＣｐＧモチーフを含む核酸を加えることにより、プラスミドに包含させ得る。ここでのプラスミドは、ＣｐＧモチーフを含み得る。ＣｐＧモチーフの例は知られる(例えば、米国特許８,２３２,２５９、８,４２６,３７５および８,２４１,８４４参照)。これらは、例えば、１０～１００、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０または１０～７５塩基対長の、一般式：
(ＣｐＧ)ｎ(ここで、ｎは反復数である)
を有する、合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。
一般に、少なくとも１または２反復が使用される；非ＣＧ塩基が組み入れられていてよい。当業者は、ＴＬＲ、特にＴＬＲ９調節による免疫応答誘導のための、ＣｐＧモチーフの一般的使用を極めて熟知している。
５. 免疫細胞によるサルモネラなどのグラム陰性細菌の取り込みを増加させかつ免疫細胞死を低減する修飾
ネズミチフス菌の株例などのここに提供される免疫刺激性細菌を、腫瘍常在免疫細胞などの免疫細胞による取り込みを増加させ、上皮細胞などの非免疫細胞による取り込みを減少するよう修飾し得る。細菌はまたマクロファージパイロトーシス低減によるなど、免疫細胞死を低減するために修飾し得る。多数の細菌ゲノムの修飾は、免疫細胞の感染増加およびパイロトーシスの減少の一方または両方をなし得る。ここに提供される免疫刺激性細菌は、ｈｉｌＡ、棒状タンパク質および／または針状タンパク質の破壊または欠失などの、例えば、ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ経路に関与する遺伝子の欠失および／または破壊および／またはフラジェリンをコードする他の細菌遺伝子の破壊／欠失などの修飾を含む。これらの修飾は、細菌が、コード化治療産物を発現でき、腫瘍微小環境に直接それを放出する場所である腫瘍常在免疫細胞に蓄積することを可能とし、治療有効性を増加する。さらに、例えば、パイロトーシスの減少により、腫瘍常在マクロファージの寿命を延長し、コード化治療産物の効率的な産生および腫瘍微小環境における免疫応答の活性化を可能とし、さらに細菌の抗腫瘍治療有効性を増強する。
ａ. 免疫細胞による細菌取り込み
ここに提供される免疫刺激性細菌のゲノムは、食細胞などの免疫細胞、特に腫瘍微小環境における免疫細胞の感染を増加または促進するよう修飾され得る。これは、上皮細胞などの非免疫細胞の感染低減または免疫細胞の感染増加を含む。サルモネラなどのグラム陰性細菌の侵襲性表現型は、宿主細胞の侵襲を促進する経路におけるコード化遺伝子の活性に由来し得る。サルモネラの侵襲関連サルモネラ病原性島１(ＳＰＩ－１)は一例である。ＳＰＩ－１は、宿主細胞のサイトゾルへのエフェクタータンパク質の転座を担う３型分泌装置(Ｔ３ＳＳ)である。これらのタンパク質は、サルモネラの取り込みに至るアクチン再配置を引き起こし得る。Ｔ３ＳＳエフェクターは、上皮細胞などの非食作用性宿主細胞へのネズミチフス菌の取り込みに介在する。ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳは、腸の上皮層の横断に必須であるが、例えば、細菌が非経腸的に注入されたとき、感染に重要でない。ＳＰＩ－１変異体は、上皮細胞侵襲に欠損を有し、経口病原性は劇的に低減するが、マクロファージなどの食細胞に通常どおり取り込まれる(Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419)。
ここに提供されるネズミチフス菌などの免疫刺激性細菌株は、ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ遺伝子に変異を有するよう操作しでき、上皮細胞による取り込みを阻止し、腫瘍関連マクロファージなどの免疫細胞に収束させ、抗腫瘍免疫応答を増強する。さらに、ここに示すとおり(例えば、実施例６参照)、鞭毛の排除は、上皮細胞での感染を不可能とし、細菌の取り込みを腫瘍常在免疫／骨髄細胞に制限する。それ故に、ここでの実施態様において、免疫刺激性細菌は、ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳにおける遺伝子の欠失または破壊および／または鞭毛をコードする遺伝子の欠失または破壊により修飾でき、非食細胞(例えば、上皮細胞)による感染を阻止または低減し、腫瘍常在骨髄細胞への感染を増加するまたはそれに限定させる。このような細菌はまたＩ型ＩＦＮおよび免疫刺激性サイトカインを誘導するなどの治療産物をコードするプラスミドで修飾でき、さらに腫瘍常在免疫細胞における治療産物の発現により、抗腫瘍免疫応答および治療有効性を増強する。
ｂ. マクロファージパイロトーシス
自然免疫および抗微生物応答に役割を有するマクロファージＮＬＲＣ４インフラマソームは、サイトゾル病原体を認識し、カスパーゼ－１の自己触媒的活性化を提供する、大きな多タンパク質複合体である。カスパーゼ－１の活性化は、炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の成熟および放出を誘導し、マクロファージ細胞死の迅速な炎症形態であるパイロトーシスを誘導する。この炎症促進性細胞死は、抗原提示細胞(ＡＰＣ)の死により直接誘導される強い適応免疫応答の開始を制限し、記憶Ｔ細胞の産生を阻止するようサイトカイン環境を修飾し得る。
ネズミチフス菌および緑膿菌などのあるグラム陰性細菌コード化３型または４型分泌系による感染は、サルモネラ病原性島－１ III型分泌装置(ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ)による宿主細胞サイトゾルへの転座後、針状タンパク質、棒状タンパク質およびフラジェリンなどの細菌リガンドの認識によりＮＬＲＣ４インフラマソームの活性化を誘導する。パイロトーシスは、マクロファージに限定されない；カスパーゼ－１依存死は、サルモネラでの感染後樹状細胞で観察されている(Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447; Chen et al. (2014) Cell Reports 8:570-582; Fink and Cookson (2007) Cellular Microbiology 9(11):2562-2570)。ここに示すとおり、パイロトーシスの誘導に関与するサルモネラゲノムにおける遺伝子のノックアウトは、抗腫瘍免疫応答を増強する。これは、細菌感染後のマクロファージを含む免疫細胞の喪失を阻止する。例えば、ＨｉｌＡ、棒状タンパク質(ＰｒｇＪ)、針状タンパク質(ＰｒｇＩ)、フラジェリンおよび／またはＱｓｅＣをコードする遺伝子が、ここに提供される免疫刺激性細菌においてノックアウト／破壊され得る。
ｉ. フラジェリン
上記のとおり、サルモネラなどの一部細菌種について、ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳに加えて、フラジェリンが、マクロファージにおけるパイロトーシスの誘導に必要であり、マクロファージＮＬＲＣ４インフラマソームにより検出され、活性化する。鞭毛の主要成分であるフラジェリンは、ＴＬＲ５により認識される。サルモネラは、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの２つのフラジェリン遺伝子をコードする；フラジェリンサブユニットの排除は、マクロファージにおけるパイロトーシスを低減する。例えば、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢが欠失したネズミチフス菌は、野生型株と比較してＩＬ－１β分泌が有意に減少するが、細菌の細胞取り込みおよび細胞内複製は影響されないままである。これは、フラジェリンがインフラマソーム活性化に顕著な役割を有することを示す。さらに、ＦｌｉＣを構成的に発現するよう操作したネズミチフス菌株は、マクロファージパイロトーシスを誘導することが判明した(例えば、Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447; Fink and Cookson (2007) Cellular Microbiology 9(11):2562-2570;およびWinter et al. (2015) Infect. Immun. 83(4):1546-1555参照)。
ここでの免疫刺激性細菌のゲノムを、ネズミチフス菌におけるフラジェリン遺伝子ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠失、破壊または変異するよう修飾でき、マクロファージなどの腫瘍常在免疫細胞の細胞死を低減し、免疫刺激性細菌の抗腫瘍免疫応答を増強する。
ii. ＳＰＩ－１タンパク質
ＳＰＩ－１タンパク質はまたマクロファージにおけるＮＬＲＣ４インフラマソームも活性化し、カスパーゼ－１を活性化し、パイロトーシスを経る細胞死に至る。これらのエフェクターは、棒状タンパク質(ＰｒｇＪ)および針状タンパク質(ＰｒｇＩ)、例えばを含むが、これらに限定されない。
棒状タンパク質(ＰｒｇＪ)
ＮＬＲＣ４インフラマソームはまた脱鞭毛ネズミチフス菌でも検出される。フラジェリン非依存的応答は、ネズミチフス菌におけるＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ棒状タンパク質であるＰｒｇＪの検出による。精製ＰｒｇＪタンパク質のマクロファージサイトゾルへの送達は、フラジェリンにより誘導される効果に類似して、迅速なＮＬＲＣ４依存性カスパーゼ－１活性化およびＩＬ－１βの分泌に至る(Miao et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(7):3076-3080)。それ故に、ネズミチフス菌におけるＰｒｇＪコード遺伝子の変異またはノックアウトは、マクロファージパイロトーシスを低減でき、これは、該細菌による死滅に感受性である免疫細胞の保存により、免疫刺激性細菌の抗腫瘍免疫効果を増強する。
針状タンパク質(ＰｒｇＩ)
ネズミチフス菌におけるＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ針状タンパク質であるＰｒｇＩも、ＮＬＲＣ４インフラマソームにより認識され、活性化される。ヒト初代単球由来マクロファージのサイトゾルへのネズミチフス菌ＰｒｇＩの送達は、ＩＬ－１β分泌およびその後の細胞死をもたらす。ＰｒｇＩを発現するが、フラジェリンはしないサルモネラ変異体は、フラジェリン発現株より後の時点まで、一次単球由来マクロファージにおけるインフラマソームの活性化を示した(Kortmann et al. (2015) J. Immunol. 195:815-819)。そうして、ここに提供される免疫刺激性細菌は、ネズミチフス菌における針状タンパク質をコードする遺伝子を変異または欠失するよう修飾でき、免疫細胞パイロトーシスを阻害し、抗腫瘍免疫効果を増強する。
iii. ＱｓｅＣ
センサータンパク質ＱｓｅＣは、多くのグラム陰性細菌でみられ、環境に応答し、数種の病原性因子の発現を制御する、高度に保存された膜ヒスチジンセンサーキナーゼである。これらの病原性因子は、例えば、ネズミチフス菌における鞭毛生合成のマスターレギュレーターをコードするｆｌｈＤＣ遺伝子；非食細胞の侵襲、サルモネラ含有液胞(ＳＣＶ)の早期成熟および輸送制御ならびにＳＣＶ－リソソーム融合の阻止に役割を有するタンパク質をコードするｓｏｐＢ遺伝子；およびＳＣＶ維持および膜完全性に必要なｓｉｆＡ遺伝子を含む。
ＬＥＤ２０９によるＱｓｅＣの選択的阻害は、病原性関連遺伝子発現(例えば、ｆｌｈＤＣ、ｓｉｆＡおよびｓｏｐＢ)のＱｓｅＣ介在活性化の阻害により、ネズミチフス菌増殖を抑制することなく細菌病原性を阻止し、ネズミチフス菌または野兎病菌での感染後、マウスを死から部分的に保護することが示されている。ＱｓｅＣ遮断は、感染マクロファージにおける過剰なインフラマソーム活性化阻害により、マクロファージのカスパーゼ－１活性化、ＩＬ－１β放出およびネズミチフス菌誘導パイロトーシスを阻害することが判明した。ＱｓｅＣの阻害はまた鞭毛遺伝子発現および運動性を抑制し、上皮細胞におけるネズミチフス菌の侵襲および複製能を抑制する(Li et al. (2016) Scientific Reports 6:37447)。それ故に、ＱｓｅＣをコードする遺伝子を変異またはノックアウトするここでの免疫刺激性細菌の修飾は、ネズミチフス菌感染を非上皮細胞に収束させ、マクロファージにおけるパイロトーシスの防止によるなど、免疫細胞における細胞死を低減することにより、抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
６. 細菌培養条件
細菌の培養条件は、遺伝子発現に影響し得る。ネズミチフス菌は、ＳＰＩ－１およびその関連Ｔ３ＳＳ－１が関与する機構により、感染３０～６０分以内に、マクロファージの迅速な炎症促進性カスパーゼ依存性細胞死を誘導できるが、上皮細胞ではできないことが示されている(Lundberg et. al (1999) Journal of Bacteriology 181(11):3433-3437)。この細胞死は、インフラマソームの活性化が介在し、その後のカスパーゼ－１を活性化し、これはＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の成熟および放出を促進し、パイロトーシスと称される新規形態の細胞死を開始させることが現在知られる(Broz and Monack (2011) Immunol. Rev. 243(1):174-190)。このパイロプトーシス活性は、対数期細菌を使用して誘導でき、一方静止期細菌は、マクロファージにこの迅速な細胞死を誘導しない。ＳＰＩ－１遺伝子は、細菌対数増殖期間に誘導される。それ故に、静止期に治療に使用するネズミチフス菌を採取することにより、マクロファージの迅速なパイロトーシスは阻止され得る。マクロファージは、自然免疫系の重要なメディエーターであり、適切な抗腫瘍応答の確立に重要であるサイトカインを分泌するよう作用する。さらに、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８などの炎症促進性サイトカインの分泌の制限は、投与されたネズミチフス菌治療剤の忍容性を改善する。静止期に採取されたここで提供する免疫刺激性ネズミチフス菌は、抗腫瘍応答の誘導に使用される。
７. 腫瘍コロニー形成増加
ＶＮＰ２０００９は、癌の処置のために開発された弱毒化ネズミチフス菌ベースの微生物癌治療剤である。ＶＮＰ２０００９は、遺伝子ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ(ｐｕｒＭ)の欠失を介して弱毒化される。ｐｕｒＩ欠失は、微生物をプリンまたはアデノシンに対して栄養要求性とする。ｍｓｂＢ遺伝子の欠失は、リピドＡドメインの末端ミリスチル基の付加の阻止により細菌リポ多糖(ＬＰＳ)と関連する毒性を低減し、リピドＡからの毒性をあまり生じない(Khan et al. (1998) Mol. Microbiol. 29:571-579)。
ＶＮＰ２０００９が腫瘍にコロニー形成する能力は、マウスとヒトで差がある。ＶＮＰ２０００９の全身投与は、マウス腫瘍のコロニー形成をもたらした；一方ヒト患者へのＶＮＰ２０００９の全身投与は腫瘍コロニー形成をほとんどもたらさなかった。マウスにおいて、ＶＮＰ２０００９は、全身投与後高度の腫瘍コロニー形成を示すことが判明した(例えば、Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；およびBermudes et al. (2001) Biotechnol Genet Eng Rev. 18:219-33参照)。しかしながら、進行型黒色腫患者のフェーズ１治験において、３０分静脈内点滴後、ヒト腫瘍でＶＮＰ２０００９はほとんど検出されなかった(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:142-52参照)。ＶＮＰ２０００９の長い４時間点滴を評価するフォローアップ治験に入った患者も、腫瘍生検後、検出可能なＶＮＰ２０００９がないことが示された(Heimann et al. (2003) J. Immunother. 26:179-180)。腫瘍内投与後、ＶＮＰ２０００９の誘導体のコロニー形成は検出された(Nemunaitis et al. (2003) Cancer Gene Ther. 10:737-44)。ヒト腫瘍へのＶＮＰ２０００９の直接腫瘍内投与は腫瘍コロニー形成をもたらし、ヒト腫瘍が高レベルでコロニー形成され得て、マウスとヒトの間の腫瘍コロニー形成差異は全身投与後のみ生じることを示す。
ＶＮＰ２０００９などの株は、低腫瘍コロニー形成に至る、ヒト補体により不活性化される。補体に対する抵抗性が改善した株がここに提供される。これらの株は、細菌ゲノムにおける修飾を含み、本明細書の他の箇所に記載するとおり、所望により複製について提供される遺伝子(真核生物プロモーター制御下のａｓｄ)をコードする、一般に低または中コピー数のプラスミドおよびサイトカイン、Ｉ型インターフェロン産生および他のこのような治療遺伝子／産物を刺激するタンパク質の機能獲得型変異体を含むが、これらに限定されない治療産物をコードする核酸も担持し得る。
下表は、細菌遺伝子型／修飾、その機能的効果および効果／利益を要約する。
Figure 2022524951000005
ここに提供される株は、鞭毛を有さないようにΔＦＬＧおよび／またはΔｐａｇＰである。さらに、株は、ΔｐｕｒＩ(ΔｐｕｒＭ)、ΔｍｓｂＢおよびΔａｓｄ(細菌ゲノムにおける)の１以上であり得る。プラスミドは、宿主認識プロモーター(例えば、真核生物および動物ウイルス由来のものを含む、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターなどの真核生物プロモーター)制御下に産物をコードするよう修飾される。プラスミドは、所望によりインビボでの複製を可能とするためのａｓｄならびに本明細書の他の箇所に記載する他の有益な機能を有する核酸(例えば、ＣｐＧ)および遺伝子産物をコードできる。
免疫刺激性細菌は、弱毒化および野生型または他の非弱毒株を含む適当な細菌株由来である。細菌株は、弱毒株でよくまたは標準的方法により弱毒化されたもしくは、ここに提供される修飾により、コロニー形成する能力が主に免疫特権組織および臓器、特に免疫および固形腫瘍を含む腫瘍細胞に制限された点で弱毒化されている株であり得る。細菌は、例えば、サルモネラ、シゲラ、リステリア、大腸菌およびビフィドバクテリアの株を含むが、これらに限定されない。例えば、種は、ソンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、志賀赤痢菌、リステリア・モノサイトゲネス、チフス菌、ネズミチフス菌、トリチフス菌およびゲルトネル菌を含む。他の適当な細菌種は、リケッチア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、ビブリオ、バシラスおよびエリジペロスリックス。例えば、斑点熱リケッチア、発疹チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、発疹熱リケッチア、リケッチア・シビリカ、気管支敗血症菌、髄膜炎菌、淋菌、エロモナス・オイクレノフィラ、エロモナス・サルモニシダ、野兎病菌、ヒツジ偽結核菌、サイトロバクター・フレウンディイ、肺炎クラミジア、ヘモフィルス・ソムナス、ウシ流産菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、在郷軍人病菌、ロドコッカス・エクイ、緑膿菌、ヘリコバクター・ムステラエ、コレラ菌、枯草菌、ブタ丹毒菌、エルシニア・エンテロコリティカ、ロシャリメア・クインターナおよびアグロバクテリウム・ツメルファシウムを含む。
ここに提供される免疫刺激性細菌の例は、サルモネラ種である。ここに記載される修飾のための細菌の例は、寄託番号１４０２８としてＡＴＣＣに寄託された株の全ての同定された特徴を有する株などの、野生型サルモネラの株である。ａｓｄ遺伝子ノックアウトを補完するためおよび無抗生物質プラスミド維持のためにプラスミドで操作された株ＹＳ１６４６(ATCC Catalog # 202165；ＶＮＰ２０００９とも称する、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／１３０５３も参照)などの操作したネズミチフス菌の株が提供される。次いで、株は、フラジェリン遺伝子欠失および／またはｐａｇＰ欠失のために修飾される。株は、またプリン、特にアデノシン栄養要求性とされ、ａｓｄ－およびｍｓｂＢ－である。ａｓｄ遺伝子は、真核生物宿主での複製のためにプラスミドに提供され得る。これらの欠失およびプラスミドは、本明細書の他の箇所に記載される。本明細書の他の箇所に記載されるおよび／または当業者に知られる治療産物および免疫刺激性タンパク質および他の産物をコードする核酸の何れかをプラスミドに包含させ得る。プラスミドは、一般に本明細書の他の箇所に記載されるとおり、低乃至中コピー数で存在する。治療産物は、Ｉ型ＩＦＮ発現および他のサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質を構成的に誘起／誘導できる、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答を促進するサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの機能獲得型変異体およびここに記載する他のこのような産物を含む。
Ｅ. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質および腫瘍微小環境において免疫応答を刺激するためのタンパク質における機能獲得型変異
抗腫瘍または抗ウイルス免疫応答を促進または刺激する産物を含む、治療産物、特に抗癌産物である遺伝子産物をコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌が提供される。治療産物に含まれるのは、細胞のサイトゾルでＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチドおよび他のこのような分子などの核酸に曝されたとき、免疫応答を誘起する、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーと称される産物である。ここでの免疫刺激性細菌は、活性が増加したまたは構成的に免疫応答を誘起し、サイトゾルにおけるＤＮＡ／ＲＮＡ産物の存在を必要としない、修飾産物である。例は、腫瘍微小環境で免疫応答を増加させる、機能獲得型変異を含むコード化タンパク質である。免疫刺激性細菌が提供されるだけでなく、他の送達媒体がこのような免疫刺激性タンパク質またはコード化タンパク質の送達に使用され得る。これらの送達媒体は、エクソソーム、ベクターおよびウイルスを含む。例えば、腫瘍溶解性ウイルス、特にサイトゾルウイルスであるワクシニアウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルスは、機能獲得型産物を発現するようにも修飾され得る。コード化機能獲得型産物は、エクソソーム、リポソームおよび一般に腫瘍に標的化された他の適当な媒体に送達され得る。
機能獲得型産物(および／または他の治療産物)をコードする免疫刺激性細菌は、優先的に腫瘍常在免疫細胞を含む腫瘍に感染する免疫刺激性細菌および／またはゲノムが細菌が腫瘍常在免疫細胞の低細胞死を誘導し、それにより免疫刺激性細菌が腫瘍細胞および腫瘍常在免疫細胞に蓄積し、それにより腫瘍に対する免疫応答を刺激するために、構成的活性型タンパク質および／または他の治療産物を細胞および腫瘍微小環境に送達するように修飾された免疫刺激性細菌を含む。免疫刺激性細菌は、さらに特定の腫瘍に対する応答を増強するように対象における腫瘍抗原をコードできる。ここに提供され、かつ上記および下記の免疫刺激性細菌の何れも、このような機能獲得型産物をコードするよう修飾され得る。産物は、プロモーターおよびヒトまたは他の動物または哺乳動物などの真核生物対象において認識されている何らかの他の所望の制御配列の制御下、プラスミドにコード化される。一般に、機能獲得型産物をコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターの制御下にある。
ＳＴＩＮＧタンパク質およびここに記載するＩ型インターフェロンシグナル伝達経路における他のタンパク質および他の抗癌産物を含む機能獲得型バリアントを含む治療産物は、真核生物プロモーターの制御下発現される。プロモーターは、例えば、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＥＩＦ４Ａ１、ＣＡＧ、ＣＤ６８および合成ＭＮＤプロモーター；Ｏ、ＭＳＣＶおよびＴＬＲプロモーターおよび呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーターなどのウイルスプロモーター；ＥＩＦ－１ａなどの細胞プロモーター；ｔｅｔ－ＣＭＶなどの誘導型キメラプロモーター；および組織特異的プロモーターを含む(Chang et al. (2013) Cold Spring Harb Protoc;doi:10.1101/pdb.prot075853)。
さらに、サルモネラの株、シゲラ、大腸菌、ビフィドバクテリア、リケッチア、ビブリオ、リステリア、クレブシエラ、ボルデテラ、ナイセリア、エロモナス、フランシセラ、コレラ、コリネバクテリウム、サイトロバクター、クラミジア、ヘモフィルス、ブルセラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、レジオネラ、ロドコッカス、シュードモナス、ヘリコバクター、バシラスおよびエリジペロスリックスまたはその弱毒株またはその修飾株の何れかなどの、ここに修飾について記載する細菌の何れか、エクソソーム、リポソームおよび腫瘍溶解性ウイルスを、宿主により認識されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下機能獲得型産物をコードする核酸を含むプラスミドまたは細菌におけるプラスミド上にコード化することにより、修飾し得る。機能獲得型産物は、感染対象の細胞で発現される。免疫刺激性細菌は、ここに記載するとおり、腫瘍および腫瘍常在免疫細胞に蓄積または優先的に感染するよう修飾されたものを含む。例えば、インターフェロン(ＩＦＮ)－ベータなどのＩ型ＩＦＮの発現または構成的発現をもたらす機能獲得型産物をコードする免疫刺激性細菌を、さらに、上皮細胞に感染する能力を低減させるかまたは排除するが、腫瘍常在免疫細胞を含む食細胞に感染できるよう修飾するおよび／または細菌を、感染食細胞を死滅させないように修飾する。
ここでの免疫刺激性細菌は、細胞のサイトゾルにおいて、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチドおよび他のこのような分子などの核酸に曝されたとき、免疫応答を誘起するサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーと称する産物をコードし得る。ここでの免疫刺激性細菌は、構成的に免疫応答を誘起し、サイトゾルにおけるＤＮＡ／ＲＮＡおよび他のヌクレオチドの存在を必要としない修飾産物をコードする。このような例は、Ｉ型インターフェロン発現を誘導する経路の成分である。ここで意図される産物は、Ｉ型インターフェロンが細胞のサイトゾルにおけるヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチド、環状ジヌクレオチドおよび他のこのようなリガンドの非存在下で発現または産生されるように、構成的活性または増加した活性(機能獲得型産物)を有するこれらＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの修飾携帯である。細胞、特に腫瘍細胞および腫瘍常在免疫細胞におけるこれら修飾産物の発現は、腫瘍微小環境におけるインターフェロン－βを含むＩ型インターフェロンの構成的発現をもたらす。これらの機能獲得型産物を発現する免疫刺激性細菌およびまた腫瘍溶解性ウイルス(および他の送達媒体ここに記載するとおり)が腫瘍細胞および腫瘍常在免疫細胞に蓄積するまたは優先的に感染するため、産物は腫瘍微小環境で発現され、腫瘍微小環境における免疫応答増加および治療有効性増強をもたらす。
免疫刺激性細菌におよび他の媒体でコード化され得る遺伝子産物の例は、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡを認識する先天性経路を感知または含まれ、Ｉ型インターフェロン産生を活性化するタンパク質を含むが、これらに限定されない。Ｉ型インターフェロンを活性化する先天性ＤＮＡ／ＲＮＡ認識に関与するタンパク質は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１／ＲＩＰＫ１、Ｓｅｃ５／ＥＸＯＣ２、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２／ＤＨＸ５８、ＤＤＸ３／ＤＤＸ３Ｘ、ＤＨＸ９／ＤＤＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５／ＤＤＸ１５、ＤＨＸ３３／ＤＤＸ３３、ＤＨＸ３６／ＤＤＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、これらに限定されない。構成的Ｉ型インターフェロン発現をもたらすこれらのタンパク質の何れかの機能獲得型変異は知られまたは同定でき、細胞の感染または腫瘍細胞のターゲティングおよび結合によるなど、腫瘍微小環境に、免疫刺激性細菌または他のベクターおよびエクソソームまたはリポソームなどの送達媒体により送達され得る。機能獲得型変異は、構成的Ｉ型インターフェロン発現に起因する障害を有する個体から同定されたものを含む。機能獲得型産物の例は、インターフェロン症を有する対象で生じるものである。上記のとおり、変異は、同様に機能獲得型産物を産生するスクリーニングにより同定され得る。
ここでの免疫刺激性細菌は、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびＳＴＩＮＧタンパク質のバリアントおよび構成的に免疫応答を誘起およびサイトゾルにおけるＤＮＡ／ＲＮＡまたは他のヌクレオチドリガンドの存在を必要としない他のＤＮＡ／ＲＮＡセンサーを含む、ＳＴＩＮＧなどのこのようなタンパク質をコードする。この例は、Ｉ型インターフェロン発現を誘導する経路の成分である。
同定された機能獲得型変異体産物をコードする核酸をさらに修飾して、発現に関する性質を改善し得る。修飾は、例えば、哺乳動物、特にヒト対象における転写効率を増加させるＧＣ含量またはＣｐＧジヌクレオチド含量低減、潜在的スプライシング部位除去、陰性ＣｐＧ島、シャイン・ダルガノ(ＳＤ)配列置換およびＴＡＴＡボックスおよび／または末端シグナル置換など、転写効率を増加させるコドン最適化を含む。また、コドンを、コドン使用バイアスの改変、ＧＣ含量低減、ｍＲＮＡ二次構造低減、中途ポリＡ部位除去、ＲＮＡ不安定性モチーフ(ＡＲＥ)除去、ｍＲＮＡの安定な自由エネルギー除去、内部カイ部位およびリボソーム結合部位修飾およびＲＮＡ二次構造低減により、翻訳効率を増加するために最適化し得る。
１. Ｉ型インターフェロンおよび経路
一本鎖および二本鎖ＲＮＡおよび環状ジ－ヌクレオチドおよび核酸の他のこのような形態などの核酸の宿主認識により介在されるＩ型インターフェロン誘導経路は、Ｉ型ＩＦＮを誘導することが知られる。サイトゾルにおける一本鎖(ｓｓ)および二本鎖(ｄｓ)ＲＮＡの宿主認識が介在するトール様受容体(ＴＬＲ)非依存的Ｉ型ＩＦＮ経路もある。これらの核酸は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)、黒色腫分化関連遺伝子５(ＭＤＡ－５)を含むＲＮＡヘリカーゼおよびＩＲＦ－３転写因子のＩＦＮ－βプロモータ刺激因子１(ＩＰＳ－１)アダプタータンパク質介在リン酸化を介して感知され、ＩＦＮ－ベータの誘導をもたらす(Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919)。ここに記載するとおり、これらの経路におけるタンパク質は修飾され得るかまたはバリアントとして存在でき、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含むＩ型インターフェロン(インターフェロン１型とも称される)の構成的発現をもたらす。ここに提供されるのは、バリアントタンパク質をコードする、免疫刺激性細菌およびエクソソーム、リポソームおよび腫瘍溶解性ウイルスを含む他の送達媒体である。これらの送達媒体を使用して、対象に直接投与することによりおよび／または細胞治療プロトコールにおける使用のために細胞、同種または自己に投与することにより、癌を処置し得る。
Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ；インターフェロン１型とも称される)はＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βを含み、抗ウイルス、抗腫瘍および免疫制御活性を有する多面的サイトカインである。ＩＦＮ－βは大部分の細胞型により産生される；ＩＦＮ－αは、主に造血細胞、特に形質細胞様樹状細胞により産生される。Ｉ型ＩＦＮは、パターン認識受容体(ＰＲＲ)およびサイトカインによる、微生物およびウイルス核酸およびＬＰＳ(リポ多糖)を含む病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰ)の感知後産生される。ウイルスを含む病原性感染に対する自然免疫応答に含まれ、抗原提示を促進し、ＤＣ成熟に介在し、細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬｓ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞およびマクロファージを活性化し、高親和性抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答および免疫学的記憶の発展を促進により、適応免疫系を活性化する、強力な免疫調節因子である。
Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍に抗増殖性およびアポトーシス促進効果を示し、腫瘍血管新生に抗血管形成効果を有する。腫瘍細胞表面にＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導し、腫瘍細胞の免疫原性を増加させ、それに対する細胞毒性を活性化する。Ｉ型ＩＦＮは、癌およびウイルス感染の処置のための治療剤として使用されている。例えば、ＩＦＮ－α(商品名Intron(登録商標)／Roferon(登録商標)-Aで販売)は、ヘアリー細胞白血病、悪性黒色腫、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫および濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置に対して承認されている；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、腎臓細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、多発性骨髄腫、非濾胞性非ホジキンリンパ腫、類腱腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫の処置にも使用されている(Ivashkiv and Donlin (2014) Nat. Rev. Immunol. 14(1):36-49; Kalliolias and Ivashkiv (2010) Arthritis Research & Therapy 12(Suppl 1):S1; Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。
腫瘍および腫瘍微小環境におけるＩ型インターフェロンの発現は、とりわけ免疫刺激性細菌およびここでの他の送達媒体が誘起するよう設計された免疫応答である。Ｉ型インターフェロンの誘導または誘起は、癌処置のための抗腫瘍免疫を提供する。
２. Ｉ型インターフェロン症および機能獲得型変異体
Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの誘導は、病原体感染を予防または阻止する免疫応答の具備に必要である。この応答はまた抗腫瘍剤として有効であり得る。ここに提供する免疫刺激性細菌および他の送達媒体は、Ｉ型ＩＦＮを構成的に誘導するタンパク質をコードする。特にこれらのタンパク質で、免疫応答モジュレーターの過産生が関与する種々の疾患または障害を有する個体で生ずるものである。例えば、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカインの過産生または過剰な産生または不完全な負の制御は、炎症疾患および自己免疫疾患など望ましくない効果をもたらし得る。Ｉ型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカインの、一般に慢性の、過産生に関与する障害は、インターフェロン症と称される(例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118; and Konno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123参照)。Ｉ型インターフェロン症と関連する障害および臨床的表現型は、エカルディ・グティエール症候群(ＡＧＳ)、乳児期発症ＳＴＩＮＧ関連脈管障害(ＳＡＶＩ)、シングルトン・メルテン症候群(ＳＭＳ)、非定型ＳＭＳ、家族性凍瘡様ループス(ＦＣＬ)、全身エリテマトーデス(ＳＬＥ)、両側線条体壊死(ＢＳＮ)、脳血管疾患(ＣＶＤ)、遺伝性対側性色素異常症(ＤＳＨ)、痙性対麻痺(ＳＰ)、Ｘ連鎖網状色素性障害(ＸＬＰＤＲ)、プロテアソーム関連自己炎症症候群(ＰＲＡＡＳ)、頭蓋内石灰化(ＩＣＣ)、メンデル遺伝型マイコバクテリア易感染症(ＭＳＭＤ)および脊椎内軟骨異形成症(ＳＰＥＮＣＤ)を含む(例えば、Rodero et al. (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527-2538参照)。これらの表現型は、Ｉ型ＩＦＮの誘導に関与する産物の構成的活性に至る遺伝子変異が関与する特定の遺伝子型と関連する。
インターフェロンシグナル伝達の持続的活性化は、１)サイトゾルＤＮＡ増加(例えば、ＴＲＥＸ１およびＳＡＭＨＤ１の変異)またはサイトゾルＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド増加(例えば、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ＲＮＡＳＥＨ２ＣおよびＰＯＬＡ１の変異)に至る機能喪失型変異；２)ＲＮＡ編集の欠損およびサイトゾルにおける自己核酸ＲＮＡ種の異常感知をもたらす機能喪失型変異(例えば、ＡＤＡＲ１の変異)；３)サイトゾルＩＦＮシグナル伝達経路構成的活性化／サイトゾル核酸リガンドに対する感受性増加に至る機能獲得型変異(例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＳＴＩＮＧの変異)；４)折り畳まれていないタンパク質の応答の妨害により引き起こされるＭＡＶＳを介する異常ＲＮＡシグナル伝達に至る機能喪失型変異(例えば、ＳＫＩＶ２Ｌの変異)；５)未制御ＩＦＮ刺激遺伝子(ＩＳＧ)産生に至るＩＦＮ受容体(ＩＦＮＡＲ１／２)シグナル伝達の制限を担う分子の機能喪失型変異(例えば、ＵＳＰ１８およびＩＳＧ１５変異)；６)未知機構を介するＩＦＮシグナル伝達増加に至るプロテアソーム機能不全(例えば、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＢ４およびＰＳＭＢ８の変異)；および７)Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に至る機構が不明なままであるＴＲＡＰ／ＡＣＰ５およびＣ１ｑにおける機能喪失型変異によるものであり得る(Rodero et al. (2016) J. Exp. Med. 213(12):2527-2538)。
ここで興味深いのは、機能獲得型に至る変異である。ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５およびＲＩＧ－Ｉにおける、コード化タンパク質の構成的活性化および／または感受性増強または内因性リガンドへの親和性もしくは結合の増加をもたらす、機能獲得型(ＧＯＦ)と関連する変異が知られている。例えば、ＳＴＩＮＧにおけるＧＯＦ変異はＳＡＶＩおよびＦＣＬと関連する；ＭＤＡ５におけるＧＯＦ変異はＡＧＳおよびＳＭＳと関連する；そしてＲＩＧ－ＩにおけるＧＯＦ変異は非定型ＳＭＳと関連する。
機能獲得型変異を有するこれらのタンパク質をコードするここに提供する免疫刺激性細菌および腫瘍溶解性ウイルスは、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカイン産生増加のために、これらのタンパク質の構成的活性化を利用する。機能獲得型変異を有するＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５および／またはＲＩＧ－Ｉをコードする腫瘍ターゲティング免疫刺激性細菌ならびに腫瘍溶解性ウイルスおよび他の送達媒体が、ここで提供される。このような免疫刺激性細菌および他の送達媒体は、腫瘍微小環境におけるＩ型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカインの産生を増加し、免疫刺激性細菌の抗腫瘍免疫応答を増強し、治療有効性を改善する。ＳＴＩＮＧをコードする遺伝子はＴＭＥＭ１７３、ＭＤＡ５をコードする遺伝子はＩＦＩＨ１、そしてＲＩＧ－Ｉをコードする遺伝子はＤＤＸ５８と称される。各遺伝子に多数のアレルがあり、機能獲得型をもたらすアレルの何れかを有する遺伝子で生じ得る変異が知られる。下に挙げる変異は単独で生じ得てまたは何らかの組み合わせで使用され得る。機能獲得型をもたらす他の変異は、日常的スクリーニング／変異プロトコールにより同定され得る。下表は、ＳＴＩＮＧ／ＴＭＥＭ１７３(配列番号３０５～３０９)、ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１(配列番号３１０)およびＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８(配列番号３１１)の各々の機能獲得型変異例を挙げる。ＳＴＩＮＧにおける３２４－３２６ ＳＬＳ→ＡＬＡなどの１以上のリン酸化部位の欠失または置換およびＳＴＩＮＧにおけるまたは核因子－κＢ(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達を使用する他のタンパク質におけるこのようなシグナル伝達を低減するためのリン酸化部位を排除する他の置き換えなどの他の変異も導入され得る。
得られたタンパク質は、ここに提供される免疫刺激性細菌をコードし得る。タンパク質は免疫刺激性細菌においてプラスミドにコード化され、または腫瘍溶解性ウイルスのゲノムにコード化されまたはエクソソームまたはリポソームなどの送達媒体を介して送達され得る。
Figure 2022524951000006
Figure 2022524951000007
配列番号３０５～３０９に示すヒトＳＴＩＮＧの配列を対照とするアミノ酸残基Ｒ１９７、Ｄ２０５、Ｒ３１０、Ｒ２９３、Ｔ２９４、Ｅ２９６、Ｓ２７２、Ｑ２７３、Ｅ３１６、Ｄ２３１、Ｒ２３２、Ｋ２３６、Ｓ３５８、Ｅ３６０、Ｓ３６６およびＲ２３８は、それぞれ、配列番号３５１に示すマウスＳＴＩＮＧの配列を対照とするアミノ酸残基Ｒ１９６、Ｄ２０４、Ｒ３０９、Ｒ２９２、Ｔ２９３、Ｅ２９５、Ｓ２７１、Ｑ２７２、Ｅ３１５、Ｄ２３０、Ｒ２３１、Ｋ２３５、Ｓ３５７、Ｅ３５９、Ｓ３６５およびＲ２３７に対応する。
３. ＳＴＩＮＧ介在免疫活性化
ＳＴＩＮＧ(インターフェロン遺伝子刺激物質)、膜貫通タンパク質１７３(ＴＭＥＭ１７３としても知られる)、ＩＲＦ３活性化のメディエーター(ＭＩＴＡ)、メチオニン－プロリン－チロシン－セリン(ＭＰＹＳ)および小胞体(ＥＲ)ＩＦＮスティミュレーター(ＥＲＩＳ)は、小胞体に生じる３７９アミノ酸タンパク質であり、シグナル伝達アダプタータンパク質として機能し、Ｉ型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカインなどの免疫応答遺伝子の転写を制御する。ＳＴＩＮＧ経路の刺激は内皮細胞を活性化し、培養においてインターフェロン－応答遺伝子、アポトーシス経路遺伝子の上方制御および凝固カスケードの強力なイニシエーターである組織－因子発現における内皮細胞死を誘導する(Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518)。
ＩＦＮ産生および炎症促進におけるその役割により、ヒトＳＴＩＮＧは、癌および感染症の免疫療法標的である。例えば、試験は、リガンド環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)によるＳＴＩＮＧの直接活性化が腫瘍死を誘導できることを示す。その結果、ＳＴＩＮＧ発現が増加した腫瘍は、ＳＴＩＮＧ介在細胞死経路の活性化により直接死滅される。樹状細胞(ＤＣ)におけるＳＴＩＮＧ経路の活性化はＤＣ成熟を促進し、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞介在細胞毒性応答を介しし、癌再発を防止する記憶応答を産生する。ＳＴＩＮＧはまた処置に由来する放出されたＤＮＡにより、放射線療法および化学療法の治療有効性も増強できる。マウスにおいて、Pneumovax23(登録商標)ワクチンの有効性は、該ワクチンがヒトＨＡＱ機能喪失型アレルのマウスモデルで無効であるため、ＳＴＩＮＧに依存する。ＣＤＮはＨＡＱマウスでアジュバント活性を失い、感染におけるＳＴＩＮＧの役割を示す。
ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、腫瘍抗原の宿主免疫認識をブーストし、強力な抗腫瘍応答をもたらす。ＳＴＩＮＧ発現およびシグナル伝達が結腸直腸癌を含む多くの癌で抑制され、このＳＴＩＮＧシグナル伝達抑制がＤＮＡ損傷応答および抗腫瘍Ｔ細胞プライミングを抑制することを示す研究がある。ＳＴＩＮＧ発現はまた多くの原発および転移黒色腫およびバーキットリンパ腫、乳癌、白血病、リンパ腫、ＨＰＶ＋癌、ＨＣＶまたはＨＢＶ関連肝細胞癌およびヘルペスウイルス関連癌でも喪失／脱制御される。細胞内ＤＮＡシグナル伝達が欠損している２９３ＴおよびＭＣＦ７などの癌細胞株へのＳＴＩＮＧの再構築は細胞内経路を奪還し、Ｉ型ＩＦＮおよび他のシグナル伝達経路を誘導できる(例えば、米国特許出願公開２０１８／００８５４３２参照)。その結果、ＳＴＩＮＧアゴニストが癌免疫療法のために開発されている。米国特許出願公開２０１８／００８５４３２は、細菌、真菌、寄生虫およびウイルスによる感染などの外来因子により引き起こされるものなどの疾患の処置およびまた抗腫瘍応答誘導のための免疫系の調節のための野生型ＳＴＩＮＧをコードする核酸配列の使用を記載する。ＳＴＩＮＧは、ＳＴＩＮＧ、抗体などを発現するベクターにおける、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして癌の処置のために患者に投与され得る。ベクターは、ウイルスベクター(アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＶＳＶおよびレトロウイルス)、リポソーム、他の脂質含有複合体および宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達に介在できる他の巨大分子複合体を含む(米国公開２０１８／００８５４３２)。米国公開２０１８／０３１１３４３は、構成的活性型ヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡと腫瘍、ウイルスまたは細菌抗原などの目的の抗原をコードするｍＲＮＡの、該抗原に対する免疫応答をもたらすための投与を記載する。
ＳＴＩＮＧは、サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーとして自然免疫に重要な役割を有する。ＳＴＩＮＧは、サイトゾルｄｓＤＮＡからの産物との相互作用により、感染性病原体または異常宿主細胞損傷のサイトゾルｄｓＤＮＡを「感知」する。ＳＴＩＮＧを介するサイトゾルｄｓＤＮＡの感知は、宿主細胞ヌクレオチジルトランスフェラーゼである環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ(ｃＧＡＳ)を必要とし、これは、ｄｓＤＮＡに直接結合し、応答して、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ(ｃＧＡＭＰ)である環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)第二メッセンジャーを合成し、これはＳＴＩＮＧに結合し、活性化する(例えば、Barber (2011) Immunol. Rev. 243(1):99-108; Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791; and Wu et al. (2013) Science 339(6121):826-830)。ＳＴＩＮＧはまた環状ジ－ＧＭＰおよび環状ジ－ＡＭＰを含むサイトゾルにおいて細菌により合成されるＣＤＮにより活性化される。ＣＤＮに結合後ＳＴＩＮＧは二量体化し、ＴＡＮＫ結合キナーゼ(ＴＢＫ１)を活性化し、次いで、それがＩＲＦ－３およびＮＦ－кＢ転写因子をリン酸化する。ＩＲＦ３－、ＩＲＦ７－およびＮＦ－кＢ依存性シグナル伝達経路の活性化は、自然免疫および適応免疫を強力に活性化するＩＦＮ－βおよびＴＮＦ－α、ＩＬ－１２ｐ４０およびＩＦＮ－γなどの他の炎症促進性サイトカインの産生を誘導する(Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518)。ＣＤＮと結合することなく構成的に作用する異常またはバリアントＳＴＩＮＧは、インターフェロン症を有する対象で生ずる。それにより、Ｉ型ＩＦＮの産生が構成的に誘導され得る。ＳＴＩＮＧは、ＴＭＥＭ１７３によりコードされる。
４. ＴＭＥＭ１７３アレル
インターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)は、約７kb長遺伝子である膜貫通タンパク質１７３(ＴＭＥＭ１７３)遺伝子によりコードされる。ヒトＴＭＥＭ１７３遺伝子はアレルの相当な不均一性および集団の構造化により特徴づけられる。最も一般的なヒトＴＭＥＭ１７３アレルはＲ２３２と称される(残基２３２のアミノ酸を参照；種々のヒトＴＭＥＭ１７３アレル配列を示す配列番号３０５～３０９参照)。アメリカ人集団の半数以上がＲ２３２／Ｒ２３２ではない。二番目に一般的なアレルは、Ｒ７１Ｈ－Ｇ２３０Ａ－Ｒ２９３Ｑ(ＨＡＱ)である。他の一般的アレルは、ＡＱ(Ｇ２３０Ａ－Ｒ２９３Ｑ)、Ｑ２９３およびＨ２３２を含む。ＨＡＱ／ＨＡＱ細胞は、ごく低い程度でＳＴＩＮＧタンパク質を発現し、Ｒ２３２／Ｒ２３２細胞と比較して、ＴＭＥＭ１７３転写物のレベルが低いことが判明した。Ｒ２３２／Ｒ２３２はヨーロッパ人で最も一般的な遺伝子型であり、一方ＨＡＱ／Ｒ２３２は東アジア人で最も一般的な遺伝子型である。アフリカ人はＨＡＱ／ＨＡＱ遺伝子型を有さず、Ｑ２９３アレルを有し、アフリカ人の約４％がＡＱ／ＡＱであり、これは他の民族集団では存在しない。ＨＡＱおよびＨ２３２は、機能喪失型アレルである可能性があり、東アジア人の約３０％およびヨーロッパ人の約１０％がＨＡＱ／ＨＡＱ、ＨＡＱ／Ｈ２３２またはＨ２３２／Ｈ２３２である(Patel and Jin (2018) Genes & Immunity, doi:10.1038/s41435-018-0029-9)。
５. 構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型変異
ＴＭＥＭ１７３の、遺伝性およびデノボの数種の活性化または機能獲得型(ＧＯＦ)変異が、ＳＡＶＩ(乳児期発症ＳＴＩＮＧ関連脈管障害)として知られる稀な自己炎症性疾患と結びつけられている。ＳＡＶＩは、常染色体優性疾患であり、全身性炎症、間質性肺疾患、皮膚脈管炎および反復性細菌感染により特徴づけられる。デノボＴＭＥＭ１７３変異を有するＳＡＶＩは、一般に早期発症(＜８週)であり、重度表現型であるが、家族性変異は後期発症(１０代から成人)であり、軽度臨床症状である。遺伝性ＴＭＥＭ１７３活性化変異はＧ１６６ＥおよびＶ１５５Ｍを含み、一方デノボ変異はＮ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｃ２０６Ｙ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８１ＱおよびＳ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌを含む(Patel and Jin (2018) Genes & Immunity, doi:10.1038/s41435-018-0029-9)。同定されている他の活性化ＴＭＥＭ１７３変異は、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４ＴおよびＲ３７５Ａを含む(米国特許公開２０１８／０３１１３４３)。ＴＭＥＭ１７３における他の機能獲得型変異は、高度に構成的活性型ＳＴＩＮＧをもたらし、活性化ＣＤＮ非存在下で自然免疫シグナル伝達を誘導し、炎症促進性サイトカインの慢性産生に至ることが判明した、Ｒ２８４Ｓである(Konno et al. (2018) Cell Reports 23:1112-1123)。
Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５ＭおよびＶ１４７Ｌおよび／または上記表に挙げる変異の何れかなどのＴＭＥＭ１７３変異は、単独でまたは何らかの組み合わせで、構成的活性型であり、リガンド刺激に超感受性であり、ＳＴＩＮＧインターフェロン経路の慢性活性化に至る、機能獲得型ＳＴＩＮＧをもたらす。これは、示されている(Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518)。変異ＴＭＥＭ１７３(置換Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍおよび機能喪失型変異体Ｖ１５５Ｒの各々を伴う)および非変異ＴＭＥＭ１７３の構築物をＳＴＩＮＧ陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＳＴＩＮＧリガンド、ｃＧＡＭＰで刺激した。Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５ＭおよびＶ１４７Ｌ変異体でトランスフェクトした細胞のＩＦＮＢ１(ＩＦＮ－βをコードする遺伝子)レポーター活性が高度に上昇し、これは、ＳＴＩＮＧリガンドｃＧＡＭＰの刺激で顕著にブーストされなかった。機能喪失型変異体(Ｖ１５５Ｒ)、非変異ＴＭＥＭ１７３または対照プラスミドでトランスフェクトした細胞は、顕著なベースライン活性化がなかった。ｃＧＡＭＰでの刺激は、非変異ＴＭＥＭ１７３を有する細胞の用量依存的様式での応答をもたらし、機能喪失型変異体を発現する細胞で最高ｃＧＡＭＰ濃度でのみ最小応答をもたらした(Liu et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371:507-518)。これらの結果は、ｃＧＡＭＰによる刺激がなくても、活性化ＴＭＥＭ１７３変異がＳＴＩＮＧの構成的活性化をもたらすことを示す。
Ｇ２０７Ｅは、脱毛症、光線過敏症、甲状腺機能不全およびＳＡＶＩ特性を引き起こす他の機能獲得型ＳＴＩＮＧ変異である。Ｇ２０７Ｅ変異は、ＨＥＫ細胞における炎症関連経路の構成的活性化ならびに患者末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)における異常インターフェロンシグネチャーおよびインフラマソーム活性化をもたらす。Ｒ２３２またはＨ２３２アレルおよびＧＯＦ変異Ｇ２０７Ｅを有するＳＴＩＮＧバリアントを使用して、ＣＤＮでの刺激後、Ｒ２３２＋Ｇ２０７ＥバリアントはＩＦＮ－βおよびＳＴＡＴ１／２経路の活性をわずかに増加させ、一方、Ｈ２３２＋Ｇ２０７Ｅバリアントでは、ＩＦＮ－βレベルは一定のままであり、ＳＴＡＴ１／２は活性低下を示した。両バリアントは、刺激後類似のＳＴＡＴ３およびＮＦ－κＢ経路活性化を示した。これらの結果は、２３２位のＲがｃＧＡＭＰ結合およびＩＦＮ誘導に重要であることを示し、Ｇ２０７Ｅ変異体がＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の構成的活性化およびＮＦ－κＢ経路のリガンド依存性超活性化をもたらすことを示す。Ｒ２３２アレルおよびＧ２０７Ｅを有する患者は、疾患がより重度である；この多型は、変異体ＳＴＩＮＧの構成的活性化を強め、ＩＦＮ、ＩＬ１－βおよびＩＬ－１８などの下流標的の過発現に至る(例えば、doi.org/10.1101/394353で入手可能なKeskitalo et al. (2018)参照)。
マウスＳＴＩＮＧにおける６７アミノ酸(例えば、配列番号３５１参照)は、環状ジ－ＧＭＰ(ｃ－ジ－ＧＭＰ)結合および／またはＩＦＮ誘導に関与するアミノ酸を同定するために、個々にまたは群で変異されている(Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518)。とりわけ同定された変異体は、低レベルのトランスフェクションでＩＦＮを自発的に誘導し、ｃ－ジ－ＧＭＰに応答しない、過活動変異体Ｒ１９６Ａ／Ｄ２０４Ａ、Ｓ２７１Ａ／Ｑ２７２Ａ、Ｒ３０９Ａ／Ｅ３１５Ａ、Ｅ３１５Ａ、Ｅ３１５Ｎ、Ｅ３１５ＱおよびＳ２７１Ａ(配列番号３０５～３０９に示すヒトＳＴＩＮＧの配列を基準として、それぞれＲ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６ＱおよびＳ２７２Ａに対応)、および過発現したときＩＦＮを誘導するが、ｃ－ジ－ＧＭＰに応答しない変異体Ｒ３７４Ａ、Ｒ２９２Ａ／Ｔ２９３Ａ／Ｅ２９５Ａ／Ｅ２９９Ａ、Ｄ２３０Ａ、Ｒ２３１Ａ、Ｋ２３５Ａ、Ｑ２７２Ａ、Ｓ３５７Ａ／Ｅ３５９Ａ／Ｓ３６５Ａ、Ｄ２３０Ａ／Ｒ２３１Ａ／Ｋ２３５Ａ／Ｒ２３７ＡおよびＲ２３７Ａ(配列番号３０５～３０９に示すヒトＳＴＩＮＧを基準として、それぞれＲ３７５Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ(ヒトＳＴＩＮＧにＥ２９９Ａの等価物はない)、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８ＡおよびＲ２３８Ａに対応)であった。
野生型ＳＴＩＮＧをコードする核酸の投与は、免疫応答を誘導できる；腫瘍標的化送達媒体におけるここで提供する構成的活性を有する機能獲得型ＳＴＩＮＧ変異体の投与は、より強力な免疫応答およびより有効な抗癌治療をもたらす。構成的活性型ＳＴＩＮＧまたはここで提供するＭＤＡ５またはＲＩＧ－Ｉの機能獲得型変異体などの他のこのような修飾ＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの腫瘍標的化投与による免疫応答増強は、治療的により有効な抗癌処置を提供する。例えば、ここに記載するとおり、上皮細胞に感染しないが、腫瘍常在免疫細胞を含む食細胞に感染する能力を保持するような免疫刺激性細菌の修飾は、免疫刺激性細菌を腫瘍微小環境に効率的に標的化し、治療効率を改善し、望ましくない全身免疫応答を防止する。これらの腫瘍標的化細菌は、機能獲得型ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５またはＲＩＧ－Ｉ変異体をコードするよう操作され、これは、例えば、リガンド刺激非存在下でも、構成的活性型であり、腫瘍微小環境における抗癌免疫応答の改善のために強力なＩ型ＩＦＮ応答を提供する。
故に、例えば、構成的活性型化されたＳＴＩＮＧの投与は、免疫療法癌の処置のためのＳＴＩＮＧシグナル伝達のブーストの代替的手段を提供する。ある実施態様において、ここに提供される腫瘍ターゲティング免疫刺激性細菌およびまた腫瘍溶解性ウイルスは、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ２７２Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｆ２７９Ｌ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｓ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６ＡおよびＲ３７５Ａから選択される機能獲得型変異を有するＳＴＩＮＧ／ＴＭＥＭ７３１(配列番号３０５～３０９)をコードするよう修飾され得る。
６. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質および活性が増加したまたは構成的であるそのバリアントおよびＳＴＩＮＧキメラおよび活性が増加したまたは構成的であるそのバリアント
上記のとおり、サイトゾル二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)は、転写因子インターフェロン制御因子３(ＩＲＦ３)を活性化する小胞体(ＥＲ)常在アダプタータンパク質ＳＴＩＮＧ(ＩＦＮ遺伝子のスティミュレーター)を介する、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)産生を刺激する。ＴＡＮＫ結合キナーゼ(ＴＢＫ１)／ＩＲＦ３軸は、樹状細胞(ＤＣ)のＩ型ＩＦＮの誘導および活性化およびＣＤ８＋Ｔ細胞介在抗腫瘍免疫を活性化するための腫瘍抗原の交差提示をもたらす。ＳＴＩＮＧシグナル伝達はまた活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達軸を活性化し、炎症促進性応答をもたらすが、抗腫瘍免疫に必要なＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらさない。
２’３’ ｃＧＡＭＰの認識により、ゴルジ体を介する小胞体からのＳＴＩＮＧ転座により、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１(ＴＢＫ１)の動員および転写因子ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢの活性化が可能となる。ＳＴＩＮＧのカルボキシル末端テイル(Ｃ末端テイルまたはＣＴＴ)領域は、ＴＢＫ１活性化およびＩＲＦ３リン酸化刺激に必要かつ十分である；ＮＦ－κＢシグナル伝達にも関与する。ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要な配列モチーフを含む、約４０アミノ酸の非構造化ストレッチである。ＩＲＦ３およびＮＦ－κＢ下流シグナル伝達は、脊椎動物種間で保存的なＳＴＩＮＧのＣ末端テイル(ＣＴＴ)内の特異的配列モチーフに帰する。ＩＲＦ３、ＴＢＫ１およびＴＲＡＦ６結合モジュールを含むＣＴＴにおけるモジュールモチーフは、細胞シグナル伝達および免疫応答の強度および特異性を制御する。
種およびＳＴＩＮＧ ＣＴＴ個別要素の各性質により、ＩＲＦ－３およびＮＦ－κＢ下流応答は影響を受け得て、正反対となることがある。ＳＴＩＮＧ ＣＴＴ要素は、２つのシグナル伝達経路を区別し、微調整し、異なる生物学的応答をもたらす。ヒトおよびマウス免疫細胞において、例えば、ＳＴＩＮＧ依存性ＩＲＦ－３活性化は、優勢にＩ型インターフェロン応答をもたらす。ヒト細胞におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達はまたＴＲＡＦ６動員を介する標準的およびおそらく非標準的ＮＦ－κＢ経路を介して、炎症促進性応答も駆動する。ヒトＳＴＩＮＧ残基３６６(例えば、配列番号３０５～３０９参照)は、ＩＲＦ３結合に必要なＣＴＴにおけるＬｘＩＳモチーフの一部である一次ＴＢＫ１リン酸化部位であり、一方、残基Ｌ３７４を含む第二ＰｘＰＬＲモチーフは、ＴＢＫ１結合に必要である。ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲモチーフは、全脊椎動物ＳＴＩＮＧアレルに高度に保存される。他の種において、ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、優勢にＮＦ－κＢシグナル伝達軸の活性化をもたらす。例えば、ＮＦ－κＢシグナル伝達の超活性化を担うゼブラフィッシュＣＴＴは、極Ｃ末端に、ヒトおよび哺乳動物ＳＴＩＮＧアレルに存在しない高度に保存されたＰｘＥｘｘＤモチーフの拡張を有する；このモチーフは、腫瘍壊死因子受容体関連因子６(ＴＲＡＦ６)結合部位と類似性を共有する。ヒトＳＴＩＮＧシグナル伝達におけるＴＲＡＦ６の役割は必須ではないが、ＴＲＡＦ６動員はゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ誘導ＮＦ－κＢ活性化に必須である。ヒトＳＴＩＮＧを、ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ ＣＴＴモジュールＤＰＶＥＴＴＤＹを含むように操作したヒト－ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧキメラは、ＮＦ－κＢ活性化の１００倍を超える活性化を誘導し、この領域が直接ＮＦ－κＢシグナル活性化増強に必要かつ十分であることを示す。ゼブラフィッシュＣＴＴの付加はまたＳＴＩＮＧインターフェロン応答増加ももたらす(de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。
ＩＲＦ３シグナル伝達とＮＦ－κＢシグナル伝達のバランスの種間の差異は、ＳＴＩＮＧタンパク質がＴＭＥに送達され発現されたとき、非修飾ＳＴＩＮＧタンパク質として得られた応答が抗腫瘍／抗ウイルス応答が増加するように、ここで、ＮＦ－κＢシグナル伝達低減および／または所望により、ＩＲＦ３シグナル伝達増加を有する修飾ＳＴＩＮＧタンパク質の産生のために利用される。
ある実施態様において、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低いまたはない種由来のＳＴＩＮＧタンパク質を、ここに記載するまたは当業者に知られる免疫刺激性細菌の何れかならびに他の送達媒体、例えば、腫瘍溶解性ベクターを含むウイルスベクター、ミニ細胞、エクソソーム、リポソームを含む送達媒体ならびに細胞、例えば、細胞治療に使用されるおよび細菌および腫瘍溶解性ベクターなどの媒体送達に使用されるＴ細胞に提供する。
非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、タスマニアンデビル(Sarcophilus harrisii；配列番号３３１)、マーモセット(Callithrix jacchus；配列番号３４１)、ウシ(Bos taurus；配列番号３４２)、ネコ(Felis catus；配列番号３３８)、ダチョウ(Struthio camelus australis；配列番号３４３)、トキ(Nipponia nippon；配列番号３４４)、シーラカンス(Latimeria chalumnae；配列番号３４５～３４６)、イノシシ(Sus scrofa；配列番号３４７)、コウモリ(Rousettus aegyptiacus；配列番号３４８)、マナティ(Trichechus manatus latirostris；配列番号３４９)、ゾウギンザメ(Callorhinchus milii；配列番号３５０)およびマウス(Mus musculus；配列番号３５１)の種由来のＳＴＩＮＧタンパク質を含むが、これらに限定されない。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質はヒト細胞で容易に免疫シグナル伝達を活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物間で共有されることを示す(de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。
他の実施態様において、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、上のセクション５に記載するヒトＳＴＩＮＧに対する、非ヒトＳＴＩＮＧに対応する座位に、構成的ＳＴＩＮＧ発現および機能獲得型変異の何れかを含む(アライメント例を提供する図１～１３および種々の種における対応する変異を提供する実施例２８参照)。
他の実施態様において、ＳＴＩＮＧタンパク質のキメラが提供される。キメラにおいて、第一種ＳＴＩＮＧタンパク質のＮＦ－κＢシグナル伝達／活性を付与するまたは参加するＣＴＴ領域またはその一部を、ＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いまたはごくわずかである第二種からの対応するＣＴＴまたは部分と置き換える。第二種からのＣＴＴは同様にまたは代替的に、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が増加する。一般に、第一種はヒトであり、ＣＴＴまたはその部分は、ＮＦ－κＢ活性がはるかに低いタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンスおよびゾウギンザメなどの種のＳＴＩＮＧ由来である。それにより、抗腫瘍活性に重要であるＩ型インターフェロンを誘導し、抗腫瘍治療で望ましくないＮＦ－κＢ活性が限定的またはないＳＴＩＮＧタンパク質をもたらす。キメラは、さらに構成的ＳＴＩＮＧ発現およびＩ型インターフェロン活性を増加するかまたは構成的とするために対応する座位における機能獲得型変異を含む。全実施態様において、ＴＲＡＦ６結合モチーフは、抗腫瘍治療で望ましくない活性をさらに低減または排除するために、欠失され得る。
これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、キメラおよび変異体は、腫瘍溶解性ウイルスベクター、細胞治療に使用される幹細胞およびＴ細胞などの細胞、エクソソーム、ミニ細胞、リポソームおよび腫瘍常在免疫細胞に蓄積し、コード化タンパク質を腫瘍微小環境および腫瘍に送達するここに提供される免疫刺激性細菌を含む、ここに記載するまたは当業者に知られる何れかなどの送達媒体に提供される。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質、修飾ＳＴＩＮＧタンパク質およびキメラは、ここに記載するとおり腫瘍の処置のための治療剤としてまたは当業者に知られる他の方法で使用される。ＳＴＩＮＧタンパク質、送達媒体およびコード化核酸を含む医薬組成物もまた提供される。
７. サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーとして作用する他の遺伝子産物および構成的バリアント
ａ. レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)様受容体(ＲＬＲ)
サイトゾル核酸を感知または相互作用する他の遺伝子産物は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)様受容体(ＲＬＲ)であり、これは、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５(黒色腫分化関連タンパク質５)を含む。ＲＬＲは、ウイルスｄｓＲＮＡのサイトゾルセンサーであり、細菌により分泌される核酸であり、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＬＧＰ２(ラボラトリー・オブ・ジェネティクス・アンド・フィジオロジー２)を含む。ウイルスｄｓＲＮＡなどのリガンドの結合により、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５はミトコンドリア抗ウイルス－シグナル伝達アダプタータンパク質またはＭＡＶＳを活性化し、ミトコンドリアの外膜にシグナル伝達複合体を組み立てるために、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)受容体関連因子(ＴＲＡＦ)を動員する。下流シグナル伝達成分は、さらにＴＲＡＦにより動員され、ＩＲＦ－３(インターフェロン制御因子３)、ＩＲＦ－７、ＮＦ－κＢ(活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー)およびＡＰ－１(アクティベータータンパク質１)のリン酸化および活性化をもたらす。その結果、炎症促進性サイトカインであるＩＦＮおよび病原体排除に関与する他の遺伝子の発現が誘導される(例えば、Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118参照)。
ＳＴＩＮＧと同様、機能獲得型変異によるＭＤＡ５およびＲＩＧ－Ｉの構成的活性化はＩ型ＩＦＮの誘導をもたらし、これは、免疫刺激性細菌および腫瘍溶解性ウイルスにおける抗腫瘍免疫応答の増強に影響し得る。
ｂ. ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１
他のインターフェロン症遺伝子は、サイトゾルＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡ受容体のＲＩＧ－Ｉ様ファミリーのメンバーである、黒色腫分化関連タンパク質５(ＭＤＡ５)としても知られるヘリカーゼＣドメイン含有タンパク質１(ＩＦＩＨ１)を伴うＩＦＮ誘導型である。ＩＦＩＨ１によりコードされるＭＤＡ５は、ウイルス二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を感知し、サイトゾルにおける細菌核酸を分泌し、アダプター分子、ＭＡＶＳ(ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質)を介するＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化する、１０２５アミノ酸サイトゾルパターン認識受容体である。ＭＡＶＳは、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)受容体関連因子(ＴＲＡＦ)を動員し、これが、その後下流シグナル伝達成分を動員し、ＩＲＦ－３(インターフェロン制御因子３)、ＩＲＦ－７、ＮＦ－κＢ(活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー)およびＡＰ－１(アクティベータータンパク質１)のリン酸化および活性化をもたらす。これは、炎症促進性サイトカインであるＩＦＮおよび病原体排除に関与する他の遺伝子の発現をもたらす(Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282; Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509; Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118)。
機能獲得型(ＧＯＦ)ＩＦＩＨ１バリアントは、顕著な血管炎症により特徴づけられる、エカルディ・グティエール症候群(ＡＧＳ)およびシングルトン・メルテン症候群(ＳＭＳ)を含む自己免疫障害を有する対象で生ずる。ＡＧＳは、特に脳および皮膚に影響する炎症性疾患であり、インターフェロン誘導転写物の上方制御により特徴づけられる。ＡＧＳは、一般にＲＮａｓｅ Ｈ２エンドヌクレアーゼ複合体の３非アレル成分であるＤＮＡエクソンヌクレアーゼＴＲＥＸ１をコードする遺伝子、デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼＡＭＨＤ１および二本鎖ＲＮＡ編集酵素ＡＤＡＲ１の何れかの変異により生ずる。ＡＧＳを有する一部患者は、これら６遺伝子の何れにも変異を有しないが、ＩＦＩＨ１にＧＯＦ変異を有し、この遺伝子がＡＧＳにも関与することを示唆する。シングルトン・メルテン症候群(ＳＭＳ)は、血管(例えば、石灰化)、歯(例えば、早期発症歯周炎、歯根吸収)および骨(例えば、骨減少症、先端骨溶解、骨粗鬆症)における異常により特徴づけられる常染色体優性障害である。インターフェロンシグネチャー遺伝子は、ＳＭＳ患者で上方制御され、ＩＦＩＨ１におけるＧＯＦ変異と関連づけられている(Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509; Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282)。
野生型ＩＦＩＨ１およびＡＧＳ患者で同定される６つのＩＦＩＨ１ ＧＯＦ変異体(Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ３３７Ｇ、Ｒ７７９Ｃ、Ｇ４９５Ｒ、Ｄ３９３Ｖ)のＩＦＮ－βレポーター刺激活性を、低レベルの内因性ウイルスＲＮＡ受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で比較した。野生型ＩＦＩＨ１は、長(＞１kb)ｄｓＲＮＡアナログポリイノシン・ポリシチジン酸(ｐｏｌｙＩ：Ｃ)の結合により誘導されるが、短１６２bp ｄｓＲＮＡではされず、外来性ＲＮＡの非存在下で、最小活性を有する。ＩＦＩＨ１変異体は、ｐｏｌｙＩ：Ｃに応答した強いシグナル伝達に加えて、短１６２bp ｄｓＲＮＡに応答したＩＦＮシグナル伝達の顕著な誘導を提示した。変異体はまた外来性リガンド非存在下で、４～１０倍高いレベルのベースラインシグナル伝達活性も提示した(Rice et al. (2014) Nat. Genet. 46(5):503-509)。
他の機能獲得型ＩＦＩＨ１変異、Ｒ８２２Ｑは、Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導することによりＳＭＳを引き起こし、早期動脈性石灰化および歯炎症および吸収に至るとして同定された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞(最低内因性ＩＦＩＨ１発現レベルを有する)を使用して、野生型およびＲ８２２Ｑ ＭＤＡ５を過発現させた。野生型ＩＦＩＨ１発現は、用量依存的様式でＩＦＮＢ１(インターフェロン、ベータ１、線維芽細胞)発現増加をもたらし、一方変異ＩＦＩＨ１は、約２０倍多いＩＦＮＢ１発現をもたらした。ＤｓＲＮＡアナログポリ(Ｉ：Ｃ)での刺激後、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１は、野生型ＩＦＩＨ１より高いレベルのＩＦＮＢ１発現をもたらし、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１が非自己ｄｓＲＮＡに過活動であることを示す。ＳＭＳ患者からの全血サンプルでＩＦＩ２７、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩＴ１、ＩＳＧ１５、ＲＳＧ１５、ＲＳＡＤ２およびＳＩＧＬＥＣ１などのインターフェロンシグネチャー遺伝子の発現も高く、これは、Ｒ８２２Ｑ ＩＦＩＨ１によるＩＦＮＢ１の高い発現レベルに一致した(Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282)。
他のＩＦＩＨ１ ＧＯＦ変異を有する患者で観察されるインターフェロンシグネチャー、Ａ４８９Ｔは、Ｉ型インターフェロン症の指標である；ＩＦＩＨ１ Ａ４８９Ｔは、インターフェロン産生増加ならびに凍瘡状ループス、ＡＧＳおよびＳＭＳを模倣する表現型と関連する(Bursztejn et al. (2015) Br. J. Dermatol. 173(6):1505-1513)。Ａ４８９Ｔバリアントは、長ｄｓＲＮＡアナログポリ(Ｉ：Ｃ)だけでなく、短ｄｓＲＮＡでの刺激後ＩＦＮ誘導をもたらす。ＩＦＩＨ１における２つの付加的機能獲得型変異、Ｔ３３１ＩおよびＴ３３１Ｒは、ＩＦＮ誘導転写物の顕著な上方制御を提示するＳＭＳ表現型を有する患者で同定された。Ｔ３３１ＩおよびＴ３３１Ｒバリアントは、ＭＤＡ５の構成的活性化の観察に一致して、外来性ｄｓＲＮＡリガンドがなくても、ＩＦＮ－βの発現を増加させた(Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118)。
Ａ９４６Ｔは、Ｉ型ＩＦＮの産生増加に至る他のＩＦＩＨ１ ＧＯＦ変異であり、炎症を促進し、自己免疫のリスクを高める。ＩＦＩＨ１のＡ９４６Ｔ変異は、ＴＭＥＭ１７３ Ｒ２３２アレルおよびＧ２０７Ｅ ＧＯＦ変異と組み合わさったとき相加効果をもたらし、ＳＡＶＩに類すると特性を有する重度早期発症表現型をもたらす(doi.org/10.1101/394353から入手可能な印刷前Keskitalo et al. (2018))。Ｇ８２１Ｓは、マウスモデルでループス様自己免疫性症状の自然発症性進展に至ることが示されているＩＦＩＨ１におけるＧＯＦ変異であり(Rutsch et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:275-282)、一方ＡＧＳの個体で同定されたＩＦＩＨ１ミスセンス変異Ａ４５２Ｔ、Ｒ７７９ＨおよびＬ３７２Ｆは、Ｉ型インターフェロン過産生を引き起こすことが示された(Oda et al. (2014) Am. J. Hum. Genet. 95:121-125)。
ここに提供される腫瘍ターゲティング免疫刺激性細菌およびまた腫瘍溶解性ウイルスは、単独でまたは何らかの組み合わせで、Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ｒ３３７Ｇ、Ｌ３７２Ｆ、Ｄ３９３Ｖ、Ａ４５２Ｔ、Ａ４８９Ｔ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｇ８２１Ｓ、Ｒ８２２ＱおよびＡ９４６Ｔから選択される機能獲得型変異を有するＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１(配列番号３１０)をコードするよう修飾され得る。
ｃ. ＲＩＧ－Ｉ
レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)、ＤＤＸ５８(ＤＥＸＤ／Ｈボックスヘリカーゼ５８としても知られる)は、構成的活性化が非定型ＳＭＳなどのインターフェロン症の進展と結びつけられている他のタンパク質である。ＲＩＧ－Ｉは、ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１と同様、ＲＩＧ－Ｉ様受容体(ＲＬＲ)ファミリーのメンバーであり、ウイルスｄｓＲＮＡの検出に機能する９２５残基サイトゾルパターン認識受容体である。ＲＩＧ－Ｉは、Ｉ型およびIII型ＩＦＮおよび炎症促進性サイトカインの発現を促進する非依存的経路を介して、ウイルスＲＮＡに対する自然免疫応答を介しする(Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274; Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118)。
ホールマークの歯異常がないが、緑内障、大動脈石灰化および骨格異常を含む種々の表現型を有する非定型ＳＭＳは、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ(ＲＩＧ－Ｉ)をコードするＤＥＸＤ／Ｈボックスヘリカーゼ５８遺伝子(ＤＤＸ５８)の変異により引き起こされることが判明している。特に、ＤＤＸ５８における変異Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆは、ＲＩＧ－Ｉにおける機能獲得型を引き起こすとして同定された。変異ＤＤＸ５８の量の増加は、ＮＦ－κＢレポーター遺伝子活性の基底レベルの顕著な増加と関連し、この活性がさらにｄｓＲＮＡアナログポリ(Ｉ：Ｃ)での刺激により増加された。ＲＩＧ－Ｉ変異はまた基底レベルでＩＲＦ－３リン酸化および二量体化を誘導し、基底およびポリ(Ｉ：Ｃ)トランスフェクトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞両者で、ＩＦＮＢ１、インターフェロン刺激遺伝子１５(ＩＳＧ１５)およびケモカイン(Ｃ－Ｃモチーフ)リガンド５(ＣＣＬ５)の発現増加をもたらした。これらの結果は、変異ＤＤＸ５８／ＲＩＧ－Ｉが構成的活性化をもたらし、ＩＦＮ活性およびＩＦＮ刺激遺伝子発現増加に至ることを示す(Jang et al. (2015) Am. J. Hum. Genet. 96:266-274; Lu and MacDougall (2017) Front. Genet. 8:118)。
ここに提供する腫瘍ターゲティング免疫刺激性細菌および腫瘍溶解性ウイルスは、単独でまたは組み合わせで、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆなどであるが、これらに限定されない機能獲得型変異を有するＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８(配列番号３１１)をコードするよう修飾され得る。
ｄ. ＩＲＦ－３およびＩＲＦ－７
病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰ)は、ＲＩＧ－Ｉ様受容体、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５などの宿主パターン認識受容体(ＰＲＲ)により認識され、転写因子ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７およびＮＦ－кＢを介して下流シグナル伝達をもたらし、Ｉ型ＩＦＮ産生に至る。
ＩＲＦ－３(インターフェロン制御因子３)およびＩＲＦ－７は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子のカギとなるアクティベーターである。ウイルス誘導Ｃ末端リン酸化(ＴＢＫ１による)後、活性化ＩＲＦ－３およびＩＲＦ－７はホモ二量体を形成し、サイトゾルから核に転座し、ＩＦＮ刺激応答要素(ＩＳＲＥ)と結合して、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導する。ＩＲＦ－３は、非刺激細胞で構成的に発現され、不活性サイトゾル形態として存在し、一方ＩＲＦ－７は細胞で構成的に発現せず、ＩＦＮ、リポ多糖およびウイルス感染により誘導される。ＩＲＦ－３の過発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子のウイルス介在発現を顕著に増加させ、抗ウイルス状態の誘導をもたらす。ＩＲＦ－３活性化はまたウイルス感染後ＣＣ－ケモカインＲＡＮＴＥＳ(ＣＣＬ５)転写を上方制御することが示されている(Lin et al. (1999) Mol. Cell Biol. 19(4):2465-2474)。
ＩＲＦ－３のＣ末端ドメインにおける残基Ｓ３８５、Ｓ３８６、Ｓ３９６、Ｓ３９８、Ｓ４０２、Ｔ４０４およびＳ４０５は、ウイルス感染後リン酸化され、ＩＲＦ－３の活性化もたらす立体構造変化を誘導する。ＩＲＦ－３活性化は、ウイルス感染だけでなく、リポ多糖(ＬＰＳ)およびポリ(Ｉ：Ｃ)によっても誘導される。ＩＲＦ－３のＣ末端クラスターでリン酸化され得る７残基のうち、単一点突然変異、Ｓ３９６ＤがＩＲＦ－３の構成的活性形態の産生に十分である。ＩＲＦ－３(Ｓ３９６Ｄ)は、野生型ＩＲＦ－３と比較して、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－βおよびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化をそれぞれ１３倍、１４倍および１１倍増強する。他の変異体、ＩＲＦ－３(Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ)は、野生型ＩＲＦ－３よりＩＦＮα１、ＩＦＮ－βおよびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化をそれぞれ１３倍、１２倍および１２倍増強する。ＩＲＦ３の他の構成的活性型変異体は、３９６位、３９８位、４０２位、４０４位および４０５位のセリンまたはスレオニン残基がリン酸化模倣体アスパラギン酸残基(ＩＲＦ－３(Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄ))で置き換わっているＩＲＦ－３(５Ｄ)である。Ｉ型インターフェロン誘導などの免疫応答メディエーターの構成的活性に至る類似の機能獲得型変異は、免疫応答シグナル伝達経路にある、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＳＴＩＮＧなどの他のタンパク質におけるセリン残基のリン酸化模倣体アスパラギン酸への変異により達成され得る。
ＩＲＦ－３(５Ｄ)は、構成的ＤＮＡ結合およびトランス活性化活性、二量体形成、転写コアクティベーターｐ３００(ＥＰ３００またはＥ１Ａ結合タンパク質ｐ３００とも称される)／ＣＢＰ(ＣＲＥＢ結合タンパク質またはＣＲＥＢＢＰとしても知られる)との会合および核局在化を提示する。そのトランス活性化活性は、さらにウイルス感染によっては誘導されない。ＩＲＦ－３(５Ｄ)は、ＩＦＮ－βおよびＩＳＧ１５遺伝子発現の極めて強いアクティベーターである；ＩＲＦ－３(５Ｄ)単独は、ウイルス感染と同程度の強度でＩＦＮ－β発現を刺激し、ＩＦＮα１、ＩＦＮ－βおよびＲＡＮＴＥＳプロモーターのトランス活性化をそれぞれ野生型ＩＲＦ－３の９倍、５.５倍および８倍増強する(例えば、Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327; Lin et al. (1998) Mol. Cell Biol. 18(5):2986-2996; Servant et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(11):9441-9447参照)。位置Ｓ３８５、Ｓ３８６、Ｓ３９６、Ｓ３９８、Ｓ４０２、Ｔ４０４およびＳ４０５の何れも、単独でまたは組み合わせて変異して、ここに提供する免疫刺激性細菌、腫瘍溶解性ウイルスおよびエクソソームなどの他の送達剤において、構成的活性型ＩＲＦ－３変異体を産生し得る。
ＩＲＦ－７の構成的活性形態は、ＩＲＦ－７(Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ)、ＩＲＦ－７(Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ)およびＩＲＦ－７(Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄ)を含む種々のＣ末端セリンがリン酸化模倣体Ａｓｐで置換された変異体を含む。ＩＲＦ－７(Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ)は、ＩＦＮＡおよびＲＡＮＴＥＳ遺伝子発現の強いトランスアクティベーターであり、ウイルス感染がなくても、遺伝子発現を刺激する。ＩＲＦ－７(Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ)およびＩＲＦ－７(Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄ)は、ＩＲＦ－７(Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ)のトランス活性化活性をさらに増強しないが、全３変異体のトランス活性化活性は、ウイルス感染によりさらに刺激される。非感染細胞における核に局在化する変異体ＩＲＦ－７(Δ２４７－４６７)は、ＩＲＦ－７の極めて強い構成的形態である；非刺激およびウイルス感染細胞において、野生型ＩＲＦ－７より１５００倍高く転写を活性化する(Lin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(44):34320-34327)。ここに提供される免疫刺激性細菌、ウイルスおよびエクソソームなどの他の送達剤は、残基４７５～４７７、４７９、４８３および４８７で置き換えおよびアミノ酸欠失を含む、構成的活性型ＩＲＦ－７変異体をコード化および発現できる。免疫刺激性細菌は、ヒトを含む哺乳動物宿主により認識されるプロモーターおよび何らかの他の所望の制御シグナルの制御下、プラスミドにこれらのタンパク質をコードする。
８. 他のＩ型ＩＦＮ制御タンパク質
Ｉ型ＩＦＮ応答を活性化するＤＮＡ／ＲＮＡの認識に関与する他のタンパク質を、構成的Ｉ型ＩＦＮ発現を産生するよう変異し得る。非修飾および／または修飾タンパク質を、ここに提供する免疫刺激性細菌、腫瘍溶解性ウイルスならびにエクソソームおよびリポソームなどの他の送達媒体においてコード化でき、Ｉ型ＩＦＮ発現を増加させるために、腫瘍常在免疫細胞などの腫瘍微小環境にタンパク質を送達するのに使用し得る。
これらのタンパク質は、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００を命名されるタンパク質を含むが、これらに限定されない。
Figure 2022524951000008
Figure 2022524951000009
Figure 2022524951000010
部位特異的変異誘発を、インビトロで実施して、高レベルおよび／または構成的Ｉ型ＩＦＮ発現をもたらす活性が増強した変異を同定し得る。インタクトなゲノムＤＮＡを、自己免疫および自己炎症性症状を経験した無関係の患者および健常個体から得て、発現がＩ型ＩＦＮ発現を増加または構成的とする他の産物をスクリーニングおよび同定し得る。全エクソームシーケンスを実施でき、イントロンおよびエクソンを、Ｉ型インターフェロンの発現増加または構成的発現と関連する経路における変異を有するタンパク質が同定されるよう、分析できる。変異の同定後、同定された変異を伴うおよび伴わない完全長遺伝子をコードするｃＤＮＡ分子を、Ｉ型インターフェロンの発現を測定するレポーター細胞株にトランスフェクトする。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βのプロモーター下に配置されるレポーター細胞株が産生され得る。構成的活性である機能獲得型変異体はＩＦＮ－β発現を促進するが、非刺激野生型タンパク質はしない。刺激は、ウイルス感染、細菌感染、細菌核酸、ＬＰＳ、ｄｓＲＮＡ、ポリ(Ｉ：Ｃ)またはタンパク質のリガンド(例えば、ＣＤＮ)の外来性レベル増加により得る。同定されたタンパク質はまた対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強するものを含む。免疫応答は、(ｉ)Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達刺激；(ii)ＮＦ－кＢ経路シグナル伝達刺激；(iii)炎症性応答刺激；(iv)サイトカイン産生刺激；(ｖ)樹状細胞開発、活性または動員刺激；(vi)発現が免疫応答を増強する産物の指標である何らかの他の応答；および(vii)(ｉ)～(vi)の何れかの組み合わせの１以上により特徴づけられる細胞または液性免疫応答を含む。
９. 他の治療産物
免疫刺激性タンパク質
免疫刺激性細菌はまた、特に腫瘍、腫瘍微小環境および／または腫瘍常在免疫細胞で発現したとき、抗腫瘍免疫応答を増強または刺激または誘起するケモカインを含むサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質もコードし得る。ここでの免疫刺激性細菌は、抗腫瘍応答を促進または誘導または誘起する免疫刺激性タンパク質をコードするよう修飾され得る。免疫刺激性タンパク質は、ヒトなどの、真核生物対象、特に免疫刺激性細菌が投与される対象における発現のために、ＲＮＡポリメラーゼIIにより認識されるプロモーターなどの真核生物プロモーターの制御下、細菌のプラスミド上にコード化され得る。免疫刺激性タンパク質をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞の分泌または表面での発現などの細胞における発現または輸送のための他の制御シグナルを含み得る。
ここでの免疫刺激性細菌は、抗腫瘍応答を促進または誘導または誘起する免疫刺激性タンパク質をコードするよう修飾され得る。免疫刺激性タンパク質は、ヒトなどの、真核生物対象、特に免疫刺激性細菌が投与される対象における発現のために、ＲＮＡポリメラーゼIIにより認識されるプロモーターなどの真核生物プロモーターの制御下、細菌のプラスミド上にコード化され得る。免疫刺激性タンパク質をコードする核酸は、真核生物プロモーターに加えて、細胞の分泌または表面での発現などの細胞における発現または輸送のための他の制御シグナルを含み得る。
免疫刺激性タンパク質は、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)などの適切な環境で、免疫刺激性細菌が投与される対象における抗腫瘍応答を促進または参加または増強できるものである。免疫刺激性タンパク質は、サイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子を含むが、これらに限定されない。これらは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８などの、しかしこれらに限定されないサイトカイン；ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１などの、しかしこれらに限定されないケモカイン；および／またはＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーおよびＢ７－ＣＤ２８ファミリーメンバーなどの、しかしこれらに限定されない共刺激分子を含む。当業者に知られる、腫瘍処置に使用されるまたは抗腫瘍応答を促進、増強または他に増加もしくは誘起できる他のこのような免疫刺激性タンパク質は、ここに提供される免疫刺激性細菌におけるコード化のために意図される。
ある実施態様において、ここでの免疫刺激性細菌は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２(ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５))、ＩＬ－１５(およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体)およびＩＬ－１８を含むが、これらに限定されない免疫系を刺激するサイトカインを発現するよう操作される。サイトカインは腫瘍部位で免疫エフェクター細胞および間質細胞を刺激し、細胞毒性細胞による腫瘍細胞認識を増強する。ある実施態様において、免疫刺激性細菌は、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１などのケモカインを発現するよう操作される。これらの修飾およびそれをコードする細菌は、上に記載され、下に例示される。
免疫刺激性細菌コード化サイトカインおよびケモカイン
ある実施態様において、ここでの免疫刺激性細菌は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２(ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５))、ＩＬ－１５(およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体)およびＩＬ－１８を含むが、これらに限定されない免疫系を刺激するサイトカインを発現するよう操作される。サイトカインは腫瘍部位で免疫エフェクター細胞および間質細胞を刺激し、細胞毒性細胞による腫瘍細胞認識を増強する。ある実施態様において、免疫刺激性細菌は、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１などのケモカインを発現するよう操作される。
免疫刺激性タンパク質は、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)などの適切な環境で、免疫刺激性細菌が投与される対象における抗腫瘍応答を促進または参加または増強できるものである。免疫刺激性タンパク質は、サイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子を含むが、これらに限定されない。これらは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８などの、しかしこれらに限定されないサイトカイン；ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１などの、しかしこれらに限定されないケモカイン；および／またはＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーおよびＢ７－ＣＤ２８ファミリーメンバーなどの、しかしこれらに限定されない共刺激分子を含む。当業者に知られる、腫瘍処置に使用されるまたは抗腫瘍応答を促進、増強または他に増加もしくは誘起できる他のこのような免疫刺激性タンパク質は、ここに提供される免疫刺激性細菌におけるコード化のために意図される。
ここに提供される免疫刺激性細菌のゲノムはまた食細胞などの免疫細胞、特に腫瘍微小環境における免疫細胞の感染を増加または促進するようにも修飾され得る。細菌はまた免疫細胞でのパイロトーシスを低減するようにも修飾され得る。免疫刺激性細菌は、本明細書に記載し、他の箇所に例示するとおり、例えば、ｈｉｌＡの破壊または欠失などのＳＰＩ－１経路を破壊／阻害するおよび／またはフラジェリン遺伝子、棒状タンパク質、針状タンパク質および／またはｐａｇＰを欠失および／または破壊する修飾を有するものを含む。
ＩＬ－２
癌の処置に初めて承認されたサイトカインであるインターロイキン－２(ＩＬ－２)は、ＣＴＬ増殖の活性化および促進、リンホカイン－活性化キラー(ＬＡＫ)細胞産生、Ｔｒｅｇ細胞成長および増殖促進、ＴＩＬ刺激ならびにＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞増殖および分化促進を含む、数機構により、免疫系の活性化と関連付けられる。組み換えＩＬ－２(ｒＩＬ－２)は、転移腎臓細胞癌腫(ＲＣＣ)および転移黒色腫の処置に対してＦＤＡが承認した(Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166)。
ＩＬ－７
ＩＬ－２スーパーファミリーメンバーであるＩＬ－７は、Ｔ細胞の生存、増殖および恒常性と関連付けられる。ＩＬ－７受容体における変異は、Ｔ細胞の喪失および重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)の発症をもたらすことが示されており、Ｔ細胞進展におけるＩＬ－７が果たす重要な役割が強調される。ＩＬ－７は、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞を休息させる連続的シグナルを提供する恒常性サイトカインであり、リンパ球減少症の状態の間に蓄積され、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞レパートリー多様性両者の増加をもたらす。ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－７は、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御Ｔ細胞より拡張ＣＤ８＋Ｔ細胞に選択的である。組み換えＩＬ－７は、マウスでワクチン接種および養子細胞治療後抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することが示されている。ＩＬ－７はまた造血幹細胞移植の化学療法後、Ｔ細胞回復の促進にも役割を有し得る。進行型悪性腫瘍を有する患者の初期臨床試験は、組み換えＩＬ－７は忍容性が良好であり、生物学的活性用量(すなわち、循環ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数が３～４倍増加する)で毒性は限定的であることを示す(Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。ＩＬ－７は、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、前立腺癌および神経膠芽腫などの腫瘍で抗腫瘍効果を有し、マウスモデルにおけるＩＬ－７のインビボ投与は、癌細胞増殖の低減をもたらしたことが示されている。ＩＬ－７はまたラット神経膠腫腫瘍でＩＦＮ－γの抗腫瘍効果を増強し、黒色腫増殖阻害をもたらす、単球によるＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－α産生を誘導することも示されている。さらに、小児肉腫処置後の組み換えＩＬ－７投与は、免疫回復の促進をもたらす(Lin et al. (2017) Anticancer Research 37:963-968)。
ＩＬ－１２(ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５)
細胞介在免疫を促進する生理活性ＩＬ－１２(ＩＬ－１２ｐ７０)は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットからなるヘテロ二量体であり、一方ＩＬ－１２ｐ４０単量体およびホモ二量体はＩＬ－１２アンタゴニストとして作用する。抗原提示細胞により分泌されるＩＬ－１２は、ＮＫおよびＴ細胞からのＩＦＮ－γ分泌を促進し、腫瘍血管形成を阻害し、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖をもたらし、ＣＤ４＋Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化を増強し、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を促進する。ＩＬ－１２は、黒色腫、結腸癌、乳癌および肉腫のマウスモデルで抗腫瘍効果を示すことが示されている(Kalinski et al. (2001) Blood 97:3466-3469; Sheikhi et al. (2016) Iran J. Immunol. 13(3):148-166; Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５：ＩＬ－１５ＲαＴ細胞
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と構造的に類似し、ＩＬ－２およびＩＬ－１５両者は、増殖および活性化の早期刺激を提供するが、ＩＬ－１５はＩＬ－２誘導アポトーシスを遮断し、これは、刺激Ｔ細胞排除およびＴ細胞耐容性の誘導に至る過程であり、記憶Ｔ細胞応答を制限し、おそらくＩＬ－２単独の治療有効性を制限する。ＩＬ－１５はまた長期抗腫瘍免疫維持のための記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の残留も指示し、前臨床マウスモデルで、抗原非依存的方法でのＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の直接活性化を介して、顕著な抗腫瘍活性が示されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞に加えて、ＩＬ－１５は、エフェクターナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の進展、増殖および活性化を担う(Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893; Han et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810)。
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５受容体アルファ(ＩＬ－１５Ｒα)は、単球および樹状細胞などの抗原提示細胞により協調して発現され、ＩＬ－１５はＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の表面に発現されるＩＬ－１５ＲβγＣ受容体複合体に対して、ＩＬ－１５Ｒαによりトランスで提示される。可溶性１Ｌ－１５：ＩＬ１５－Ｒα複合体は、ＩＬ－１５ＲβγＣ複合体を介して免疫応答を調節することが示されており、ＩＬ－１５の生物学的活性は、ＩＬ－１５単独と比較して、半減期が延長したＩＬ－１５と可溶性ＩＬ－１５Ｒαの予形成した複合体の投与により５０倍増加することが示されている。ＩＬ－１５Ｒαとの前会合によるＩＬ－１５治療有効性のこの顕著な増加は、マウス腫瘍モデルで示されている(Han et al. (2011) Cytokine 56(3):804-810)。
ＩＬ－１８
ＩＬ－１８は、ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を誘導し、毒性を増強する。ＩＬ－１８はまたマクロファージを活性化し、Ｔｈ１ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の進展を刺激する。ＩＬ－１８は、数前臨床マウスモデルにおいて、有望な抗腫瘍活性が示されている。例えば、組み換えＩＬ－１８(ｒＩＬ－１８)投与は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化および／またはＮＫ細胞介在応答を介して、同系マウスにおける黒色腫または肉腫退縮をもたらす。ＩＬ－１８抗腫瘍効果がＩＦＮ－γにより介在され、抗血管新生機構が関与することを示す研究もある。ＩＬ－１８とＩＬ－１２などの他のサイトカインまたはＣＤ８０などの共刺激分子の組み合わせは、ＩＬ－１８介在抗腫瘍効果を増強する。進行型固形腫瘍およびリンパ腫を有する患者におけるフェーズＩ臨床試験は、ＩＬ－１８投与が安全であり、患者における免疫調節性活性ならびに血清ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦレベル増加および中程度の臨床応答をもたらすことを示した。臨床試験は、ＩＬ－１８をモノクローナル抗体、細胞毒性薬物またはワクチンなどの他の抗癌治療剤と組み合わせ得ることを示した(Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675; Lee, S. and Margolin, K. (2011) Cancers 3:3856-3893)。
ＩＬ－１８を発現するよう操作したネズミチフス菌の弱毒化株は、全身投与後、何ら毒性効果なく、同系マウスにおける皮下(ｓ.ｃ.)腫瘍または肺転移増殖を阻害した。この操作した細菌での処置は、腫瘍におけるＴ細胞、ＮＫ細胞および顆粒球の蓄積を誘導し、サイトカインの腫瘍内産生をもたらした(Fabbi et al. (2015) J. Leukoc. Biol. 97:665-675)。
ケモカイン
ケモカインは、傷害または炎症領域への白血球遊走に介在し、免疫および炎症性応答介在に関与する、小サイトカインのファミリーである。ケモカインは、配列のシステイン残基に基づき、４サブファミリー、すなわちＸＣ－、ＣＣ－、ＣＸＣ－およびＣＸ３Ｃ－ケモカインリガンドまたはＸＣＬ、ＣＣＬ、ＣＸＣＬおよびＣＸ３ＣＬに分類される。ケモカインリガンドは同族受容体に結合し、免疫細胞の循環、ホーミングおよび保持を制御し、各ケモカインリガンド－受容体対は、選択的に特定タイプの免疫細胞を制御する。異なるケモカインは、異なる白血球集団を誘引し、インビボで濃度勾配を形成し、誘引免疫細胞は、高濃度のケモカインに向かう勾配を介して移動する(Argyle D. and Kitamura, T. (2018) Front. Immunol. 9:2629; Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335)。ケモカインは、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞を誘導する免疫細胞の腫瘍への浸潤の増加および腫瘍排出リンパ節への抗原提示細胞(ＡＰＣ)の移動促進により抗腫瘍免疫応答を改善できる(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340)。ここでの免疫刺激性細菌は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１を含むが、これらに限定されないケモカインをコードするよう操作され得る。
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５は高度の相同性を共有し、ヒトおよびマウス両者で、未成熟ＤＣおよびＴ細胞を含む数細胞型でＣＣＲ５(ＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５)およびＣＣＲ１(ＣＣＬ３およびＣＣＬ５)と結合する。治療Ｔ細胞は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５の腫瘍特異的分泌を介して、自然免疫細胞の腫瘍部位への走化性を誘導することが示されている(Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335)。
Ｔヘルパー細胞型１(Ｔｈ１)応答の誘導は、ＣＣＬ３を放出させる。マウスのインビボおよびインビトロ試験により、ＣＣＬ３が好中球および単球両者に走化性であることが示されている；具体的に、ＣＣＬ３は骨髄からの骨髄前駆体細胞(ＭＰＣ)動員に介在でき、ＭＰＣ制御および刺激効果を有する。ＣＣＬ３をトランスフェクトしたヒト卵巣癌腫細胞は、抗腫瘍応答改善をもたらす腫瘍内のＴ細胞浸潤およびマクロファージ増強を示し、好中球のＣＣＬ３介在走化性が、腫瘍増殖を抑制したことが示された。ＣＣＬ３により動員された腫瘍抗原ヒト黒色腫関連遺伝子(ＭＡＧＥ)－１でトランスフェクトしたＤＣは、黒色腫のマウスモデルでリンパ球増殖増加、細胞溶解能、生存および腫瘍増殖低減を含む、優れた抗腫瘍効果を示した。ＣＣＬ３とＭＡＧＥ－１に関する抗原特異的プラットフォームの組み合わせ使用も胃癌処置において使用された。高度に免疫原性のマウス結腸腫瘍であるＣＴ２６により産生されるＣＣＬ３は、インビボ腫瘍増殖を減速させた；この過程は、ＣＸＣＬ９およびＣＸＬＣ１０の産生に至る、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、故に、ＩＦＮγのＣＣＬ３依存性蓄積により駆動されることが示された(Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598; Schaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060)。
ＣＣＬ３は、癌の処置のアジュバントとして使用されている。マウス肝細胞癌における高周波アブレーション後のＣＣＬ３活性バリアント、ＥＣＩ３０１投与は、腫瘍特異的応答を増加させ、この機構はさらにＣＣＲ１発現に依存的であることが示された。ＣＣＬ３はまた全身性癌におけるアジュバントとしての成功が示されており、それにより白血病／リンパ腫のモデルにおけるＣＣＬ３およびＩＬ－２または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)をワクチン接種したマウスは、生存延長を示した(Schaller et al. (2017) Expert Rev. Clin. Immunol. 13(11):1049-1060)。
ＣＣＬ３およびＣＣＬ４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を、黒色腫および結腸癌における原発腫瘍部位に向ける役割を有する。ＣＣＬ４の腫瘍産生は、ＣＤ１０３＋ＤＣの蓄積に至る；ＷＮＴ／β－カテニン依存性経路を介するＣＣＬ４の抑制は、黒色腫腫瘍のＣＤ１０３＋ＤＣ浸潤を阻止した(Spranger et al. (2015) Nature 523(7559):231-235)。ＣＣＬ３はまた結腸癌のマウスモデルで原発腫瘍部位へのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を増強することも示された(Allen et al. (2017) Oncoimmunology 7(3):e1393598)。
ＣＣＬ３またはＣＣＬ５のその受容体(それぞれＣＣＲ１およびＣＣＲ５)への結合は、循環から未成熟ＤＣ、単球および記憶およびＴエフェクター細胞を炎症または感染の部位に移動させる。例えば、結腸直腸腫瘍におけるＣＣＬ５発現は、Ｔリンパ球化学誘引および生存に寄与する。ＣＣＬ３およびＣＣＬ５は、いくつかの前臨床モデルで、腫瘍退縮および免疫を誘導するために、単独でまたは組み合わせ治療に使用されている。例えば、ＣＣＬ３を発現するよう遺伝子修飾したチャイニーズハムスター卵巣細胞の皮下注射は、腫瘍阻害および好中球浸潤をもたらすことが研究で示された。他の研究で、ＣＣＬ５を発現する組み換え腫瘍溶解性アデノウイルス(Ａｄ－ＲＡＮＴＥＳ－Ｅ１Ａ)は、乳癌マウスモデルで原発腫瘍退縮をもたらし、転移を遮断した(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340)。
結腸直腸癌のトランスレーショナル研究において、ＣＣＬ５は、マクロファージで「抗ウイルス応答パターン」を誘導した。結腸直腸癌における肝臓転移の侵襲性周縁部でのリンパ球のＣＸＣＲ３介在遊走の結果として、ＣＣＬ５は産生される。ＣＣＲ５、ＣＣＬ５受容体の遮断は、ＩＦＮを産生するマクロファージおよび活性酸素種により駆動される腫瘍死をもたらした。マクロファージは腫瘍微小環境に存在するが、ＣＣＲ５阻害は、Ｍ２からＭ１表現型への表現型シフトを誘導する。ＣＣＲ５遮断はまた結腸直腸癌患者における臨床応答ももたらす(Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601)。
ＣＣＬ３、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５は、リンパ性腫瘍、膀胱癌、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌または肝臓癌を含む状態の処置に使用され得る(米国特許公開ＵＳ２０１５／０２３２８８０；国際特許公開ＷＯ２０１５／０５９３０３、ＷＯ２０１７／０４３８１５、ＷＯ２０１７／１５６３４９およびＷＯ２０１８／１９１６５４)。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１
ＣＸＣＬ９(ＭＩＧ)、ＣＸＣＬ１０(ＩＰ１０)およびＣＸＣＬ１１(ＩＴＡＣ)は、ＩＦＮ－γの産生により誘導される。これらのケモカインは、優先的に活性化Ｔ細胞に発現され、血管新生抑制ならびに白血球の動員および活性化両者で機能する、ＣＸＣＲ３に結合する。結腸直腸癌の予後は、腫瘍浸潤Ｔ細胞、特にＴｈ１およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞と強く相関する；ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１の高腫瘍内発現は、予後良好の指標である。例えば、結腸癌を有する１６３名の患者のサンプルで、高レベルのＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１１は、術後生存の延長を示し、高ＣＸＣ発現を有する患者は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ－ヘルパー細胞およびＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞数が有意に高かった。結腸直腸癌患者の肝臓転移で、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０レベルは侵襲性周縁部で増加し、エフェクターＴ細胞密度と相関した。ＣＸＣＲ３に対するＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の作用を介するリンパ球遊走の刺激は、侵襲性周縁部でのＣＣＬ５産生に至る(Halama et al. (2016) Cancer Cell 29(4):587-601; Kistner et al. (2017) Oncotarget 8(52):89998-90012)。
インビボで、ＣＸＣＬ９は、腫瘍浸潤リンパ球、活性化末梢血リンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞およびＴｈ１リンパ球の化学誘引物質として機能する。ＣＸＣＬ９は、皮膚腫瘍のＴ細胞介在抑制にも重要である。例えば、全身性ＩＬ－２と組み合わせたとき、ＣＸＣＬ９は、ＣＸＣＲ３＋単核細胞の腫瘍内浸潤増加により腫瘍増殖を阻害することが示されている。結腸癌のマウスモデルで、ｈｕＫＳ１／４－ＩＬ－２融合タンパク質とＣＸＣＬ９遺伝子治療の組み合わせは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球化学誘引および活性化を介して、優れた抗腫瘍効果および寿命延長を達成した(Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335; Ruehlmann et al. (2001) Cancer Res. 61(23):8498-8503)。
活性化単球、線維芽細胞、内皮細胞およびケラチン生成細胞により産生されるＣＸＣＬ１０は、活性化Ｔ細胞に走化性であり、インビボで血管形成の阻害剤として作用し得る。結腸直腸腫瘍でのＣＸＣＬ１０発現は、細胞毒性Ｔリンパ球化学誘引および生存延長に貢献することが示されている。ＩＬ－１２などの免疫刺激性サイトカインの投与は、ＣＸＣＬ１０により産生される抗腫瘍効果を増強することが示されている。腫瘍細胞可溶化物でプライムされ、ＣＸＣＬ１０でトランスフェクトされたＤＣワクチンは、マウスで免疫学的防御および有効性が増加した；動物は、腫瘍負荷に抵抗性を示し、腫瘍増殖が遅延し、生存時間が延長した。ＣＸＣＬ１０－ムチン－ＧＰＩ融合タンパク質を使用したマウスでのインビボおよびインビトロ試験は、融合タンパク質で処理しなかった腫瘍と比較して、腫瘍におけるＮＫ細胞動員のレベルが高かった。インターフェロン(形質細胞様樹状細胞により産生され得る；これらの細胞は、原発黒色腫病変と関連し、ＣＣＬ２０により腫瘍部位に動員され得る)は、腫瘍ＤＣサブセット、例えば、ＣＤ１０３＋ＤＣに働き、これは、マウス黒色腫モデルでＣＸＣＬ９／１０を産生することが示されており、ヒト疾患におけるＣＸＣＬ９／１０と関連した。ＣＸＣＬ１０はまた原発黒色腫サンプルと比較して、ヒト転移黒色腫サンプルで高い発現を示した。治療的、アジュバントＩＦＮ－α黒色腫治療はＣＸＣＬ１０産生を上方制御し、一方化学療法剤シスプラチンは、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を誘導する(Dubinett et al. (2010) Cancer J. 16(4):325-335; Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271; Li et al. (2007) Scand. J. Immunol. 65(1):8-13; Muenchmeier et al. (2013) PLoS One 8(8):e72749)。
ＣＸＣＬ１０／１１およびＣＸＣＲ３発現は、基底細胞癌腫(ＢＣＣ)由来ヒトケラチン生成細胞で確立されている。ＣＸＣＬ１１はまたヒト基底細胞癌腫で免疫抑制性インドールアミン２,３－ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)発現を促進でき、何らかの浸潤ＣＸＣＲ３＋エフェクターＴ細胞の抗腫瘍活性を低減し得るケラチン生成細胞増殖を増強できる(Kuo et al. (2018) Front. Med. (Lausanne) 5:271)。
ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１は、癌処置のために、腫瘍溶解性ウイルスでコード化され得る(米国特許公開ＵＳ２０１５／０２３２８８０；国際特許公開ＷＯ２０１５／０５９３０３)。ＣＸＣＬ１０の遺伝子をコードするシュードタイプ腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子操作細菌も、癌処置に使用され得る(国際出願公開ＷＯ２０１８／００６００５およびＷＯ２０１８／１２９４０４)。
共刺激分子
共刺激分子は、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強し、共刺激経路は、腫瘍形成を促進するために瘍細胞により阻止される。ここでの免疫刺激性細菌を、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０(ＣＤ１３４)、ＯＸ４０Ｌ(ＣＤ２５２)、他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー(例えば、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、Ｆａｓ受容体、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＴＮＦ－Ｒ、ＨＶＥＭ、ＲＡＮＫ)、Ｂ７およびＣＤ２８などの共刺激分子を発現するようにも操作し得る。ここでの免疫刺激性細菌はまた抗腫瘍免疫応答を増強するよう共刺激分子に対するアゴニスト抗体を発現するようにも操作され得る。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
リガンドのＴＮＦスーパーファミリー(ＴＮＦＳＦ)およびその受容体(ＴＮＦＲＳＦ)は、腫瘍および免疫エフェクター細胞の増殖、分化、活性化および生存に関与する。このファミリーのメンバーは、アポトーシスを誘導するＣＤ３０、Ｆａｓ－Ｌ、ＴＲＡＩＬ－ＲおよびＴＮＦ－ＲならびにＢおよびＴ細胞免疫応答を制御するＣＤ２７、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ－Ｌおよび４－１ＢＢＬを含む。他のメンバーは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(ＨＶＥＭ)を含む。ここに記載する免疫刺激性細菌によるＴＮＦＳＦおよびＴＮＦＲＳＦ発現は、抗腫瘍免疫応答を増強し得る。例えば、マウス腫瘍における４－１ＢＢＬ発現が免疫原性を増強し、ＯＸ４０Ｌ発現が増加した樹状細胞(ＤＣ)の腫瘍内注射がマウスモデルで腫瘍拒絶をもたらし得ることが示されている。研究により、Ｂ１６黒色腫細胞への組み換えＧＩＴＲを発現するアデノウイルスの注射がＴ細胞浸潤を促進し、腫瘍体積を低減させることが示されている。４－１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲなどの分子に対する刺激抗体も、免疫系を刺激するために免疫刺激性細菌によりコード化され得る。例えば、アゴニスト抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は抗腫瘍ＣＴＬ応答を増強することが示されており、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体は移植可能腫瘍モデルで抗腫瘍活性を増加させることが示されている。さらに、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体は、抗腫瘍応答および免疫を増強することが示されている(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Peggs et al. (2009) Clinical and Experimental Immunology 157:9-19)。
ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーであるＣＤ４０はＡＰＣおよびＢ細胞により発現され、一方、そのリガンド、ＣＤ４０Ｌ(ＣＤ１５４)は、活性化Ｔ細胞により発現される。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用は、Ｂ細胞を刺激して、サイトカインを産生させ、Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞死をもたらす。研究により、抗腫瘍免疫応答は、Ｔ細胞のＣＤ４０Ｌまたは樹状細胞のＣＤ４０発現を伴い障害されることが示されている。ＣＤ４０は、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性白血病および慢性リンパ球性白血病などの数種のＢ細胞腫瘍の表面に発現され、ＣＤ４０Ｌとのその相互作用は、ＣＤ４０＋腫瘍細胞におけるＢ７.１／ＣＤ８０、Ｂ７.２／ＣＤ８６およびＨＬＡクラスII分子の発現を増加させ、抗原提示能を増強することが示されている。多発性骨髄腫のマウスモデルにおけるＣＤ４０Ｌのトランスジェニック発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、局所および全身抗腫瘍免疫応答の誘導および腫瘍増殖低減をもたらす。抗ＣＤ４０アゴニスト抗体も抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導した(Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39; Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207; Murugaiyan et al. (2007) J. Immunol. 178:2047-2055)。
４－１ＢＢおよび４－１ＢＢＬ
４－１ＢＢ(ＣＤ１３７)は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞ならびにＤＣ、Ｂ細胞および単球を含むＡＰＣにより発現される誘導型共刺激受容体であり、そのリガンド、４－１ＢＢＬへの結合により、免疫細胞増殖および活性化が誘導される。４－１ＢＢは、より長く、より広く広がった活性化Ｔ細胞の応答をもたらす。抗４－１ＢＢアゴニストおよび４－１ＢＢＬ融合タンパク質は、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ＋Ｔ細胞および腫瘍特異的ＣＴＬ活性が介在する肉腫および肥胖細胞腫腫瘍に対する免疫介在抗腫瘍活性が増加することが示されている(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39)。
ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌ
ＯＸ４０(ＣＤ１３４)は、活性化エフェクターＴ細胞に発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーであり、一方、そのリガンド、ＯＸ４０Ｌは、ＴＬＲアゴニストによる活性化およびＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌシグナル伝達後、ＤＣ、Ｂ細胞およびマクロファージを含むＡＰＣに発現される。ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化、増強、増殖および生存ならびにＮＫ細胞機能調節およびＴｒｅｇの抑制活性の阻害をもたらす。ＯＸ４０を介するシグナル伝達は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞応答をブーストするサイトカイン(ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＦＮ－γ)の分泌ももたらす。ＴＩＬによる腫瘍抗原認識は、ＴＩＬによるＯＸ４０の発現増加をもたらし、これは、予後改善と相関する。抗ＯＸ４０アゴニスト抗体またはＦｃ－ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質での処置は、黒色腫、肉腫、結腸癌および乳癌のマウスモデルで腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および生存延長をもたらし、一方腫瘍細胞ワクチンに取り込まれたＦｃ－ＯＸ４０Ｌは、乳癌細胞でのその後の負荷からマウスを保護したことが研究により示された(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:39)。
Ｂ７－ＣＤ２８ファミリー
ＣＤ２８は、Ｔ細胞表面に共刺激分子として発現され、抗原提示細胞に発現する共刺激分子であるＢ７－１(ＣＤ８０)およびＢ７－２(ＣＤ８６)の受容体として作用する。ＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達はＴ細胞活性化および生存に必要であり、Ｔ細胞アネルギーを防止し、ＩＬ－６などのインターロイキンの産生をもたらす。
最適Ｔ細胞プライミングは、(１)ＭＨＣ提示抗原のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)認識および(２)Ｔ細胞ＣＤ２８とＡＰＣで発現されるＢ７－１(ＣＤ８０)またはＢ７－２(ＣＤ８６)のライゲーションに起因する共刺激シグナルの２つのシグナルを必要とする。Ｔ細胞活性化後、ＣＴＬＡ－４受容体が誘導され、次いで、それはＣＤ２８のＢ７－１およびＢ７－２リガンドへの結合を打ち負かす。腫瘍細胞による抗原提示は、Ｂ７－１／ＣＤ８０およびＢ７－２／ＣＤ８６などの共刺激分子の発現を欠くため不十分であり、Ｔ細胞受容体複合体の活性化ができない。その結果、腫瘍細胞表面のこれら分子の上方制御は、免疫原性を増強できる。固形腫瘍および血液系腫瘍の免疫療法は、例えば、Ｂ７または可溶性Ｂ７－免疫グロブリン融合タンパク質の腫瘍細胞発現により、Ｂ７での誘導が成功している。ＩＣＡＭ－３およびＬＦＡ－３などの他の共刺激リガンドと組み合わせたＢ７のウイルス介在腫瘍発現は、前臨床ならびに慢性リンパ球性白血病および転移黒色腫の処置の臨床試験で成功している。さらに、可溶性Ｂ７融合タンパク質は、単剤免疫療法として、固形腫瘍の免疫療法をもたらす有望性が示されている(Lechner et al. (2011) Immunotherapy 3(11):1317-1340; Dotti et al. (2002) Blood 100(1):200-207)。
Ｆ. タンパク質をコードする免疫刺激性細菌および例示的プラスミドおよび送達媒体の構築
上記のものを含む治療産物は、プラスミド上でここに提供される免疫刺激性細菌にコード化され、一般に宿主認識制御シグナルの制御下にある。ここに提供される免疫刺激性細菌は、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境における蓄積増加のために修飾される。上記のとおり、細菌ゲノム、細菌発現および宿主細胞侵襲の修飾を含み、例えば、腫瘍、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍微小環境へのターゲティングまたは蓄積が改善または増加され、また、細菌プロモーターを含む細菌でならびに適宜適切な真核生物プロモーターおよび他の制御領域を含むことにより、宿主で発現される産物をコードするプラスミドを含む。免疫刺激性細菌は、細菌がａｓｄ－、ｍｓｂＢ－およびｐａｇＰ－の１以上であり、アデノシン栄養要求株であるように、鞭毛の欠失および他の修飾によるなど、上記のとおり修飾される。
プラスミドを導入するために、細菌は、日常的分子生物学ツールおよび方法(ＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ制限酵素消化およびリガーゼでの適合性突出末端フラグメントライゲーション)で構築された精製ＤＮＡプラスミドのエレクトロポレーションなど、標準的方法を使用して形質転換される。下記および本明細書の他の箇所に記載するとおり、プラスミドは、インターロイキンおよび／または修飾機能獲得型タンパク質などの免疫刺激性タンパク質などのタンパク質を、宿主認識プロモーター制御下コードする。これらのコード化タンパク質は、特に腫瘍微小環境で免疫系を刺激する。
細菌は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ(ＲＮＡＰ)IIまたはIIIプロモーターなどの真核生物プロモーターの制御下発現される、プラスミドに他の産物をコードし得る。一般に、ＲＮＡＰIII(ＰＯＬIIIとも称される)プロモーターは構成的であり、ＲＮＡＰII(ＰＯＬIIとも称される)は制御され得る。ここで提供するネズミチフス菌を含むサルモネラの株などの細菌株は、腫瘍微小環境でアデノシンに対して栄養要求性であり、治療タンパク質、例えばＳＴＩＮＧおよびＩ型ＩＦＮの発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である他の免疫刺激性タンパク質およびまたＩ型ＩＦＮの発現を増加させるもしくはＩ型ＩＦＮの構成的発現をもたらすこれらのタンパク質のバリアントをコードするプラスミドを担持するよう修飾されまたは同定される。
ここに提供される免疫刺激性細菌における、例えば、プラスミド上のコード化治療産物は、Ｉ型ＩＦＮを誘導するサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーおよびその構成的活性型バリアントを含む。これらは、例えばＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３およびＩＲＦ－７ならびに構成的にＩ型ＩＦＮを誘導するおよび／またはＣＤＮを含むサイトゾル核酸などリガンドによる刺激の非存在下で活性化され、Ｉ型ＩＦＮを誘導するそのＧＯＦバリアントを含む。コード化ＳＴＩＮＧタンパク質は、野生型およびヒトＳＴＩＮＧのＧＯＦバリアント(アレルバリアントを含む)ならびに低ＮＦ－κＢ活性を示し得て、所望により、ＩＲＦ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が増加したタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウスおよびゾウギンザメなどの他の種からの野生型または修飾ＳＴＩＮＧ(例えば、ＧＯＦバリアント)を含む。他の治療産物は、サイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子などの免疫刺激性タンパク質を含む。
ネズミチフス菌などの細菌は、腫瘍細胞およびマクロファージを含む複数の細胞型に感染できる。ネズミチフス菌などの免疫刺激性細菌での細胞感染について、プラスミドが放出され、コード化タンパク質が宿主ＲＮＡポリメラーゼにより転写され、腫瘍微小環境および腫瘍に分泌される。
１. 複製起点およびプラスミドコピー数
プラスミドは、複製起源の手段により細菌内に維持される、自律複製染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子である。コピー数は、プラスミド安定性に影響する。高コピー数は、細胞分裂でランダム分割が生じたとき、一般にプラスミドの高い安定性をもたらす。プラスミドの数が多いと、一般に増殖速度が低減し、故に、おそらく細胞は、速く増殖するため、少ないプラスミドで培養を支配することが可能となる。複製起点もプラスミドの適合性(同じ細菌細胞内の他のプラスミドと合わせたその複製能)を決定する。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌細胞に共存できない。同じ適合性群に属すると言える。同じ適合性群からの第二プラスミドの形態での新規起源の導入は、常在プラスミドの複製の結果を模倣する。それ故に、２つのプラスミドが正しい複製前コピー数を作るよう異なる細胞に分離される後まで、さらなる何らかの複製が阻止される。
Figure 2022524951000011
上記表に挙げるものを含む、多数の細菌複製起点が当業者に知られる。起源は、所望のコピー数が達せ得されるよう選択され得る。複製起点は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを介するプラスミド複製の開始部位として認識されている配列を含む(del Solar et al. (1998) Microbiology And Molecular Biology Reviews 62(2):434-464)。異なる複製起点は、各細胞内で種々のプラスミドコピーレベルを提供し、細胞あたり１～数百コピーの範囲であり得る。一般に使用される細菌プラスミド複製起点は、極めて高いコピー誘導体を有するｐＭＢ１由来起源、低コピー数を有するＣｏｌＥ１起源、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２およびその他を含むが、これらに限定されない。このような起源は当業者に周知である。ｐＵＣ１９起源は、細胞あたり５００～７００コピーのコピー数をもたらす。ｐＢＲ３２２起源は、１５～２０のコピー数を有することが知られる。これらの起源は、一塩基対によってのみ異なる。ＣｏｌＥ１起源コピー数は１５～２０であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどの誘導体は、３００～５００の範囲のコピー数を有する。ｐＡＣＹＣ１８４であるｐ１５Ａ起源は、例えば、約１０のコピー数をもたらす。ｐＳＣ１０１起源は、約５のコピー数を付与する。起源が得られ得る他の低コピー数ベクターは、例えば、ｐＷＳＫ２９、ｐＷＫＳ３０、ｐＷＫＳ１２９およびｐＷＫＳ１３０を含む(Wang et al. (1991) Gene 100:195-199参照)。中乃至低コピー数は１５０未満または１００未満である。低コピー数は、２０、２５または３０未満である。当業者は、低または高コピー数のプラスミドを同定できる。例えば、コピー数が高または低であるかを実験的に決定する方法の一つは、ミニプレップである。高コピープラスミドは、１ml ＬＢ培養あたり３～５μg ＤＮＡを生じ；低コピープラスミドはＬＢ培養１mlあたり０.２～１μg ＤＮＡを生じる。
複製起点の同定および配列決定を含む細菌プラスミドの配列は、周知である(例えば、snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/参照)。高コピープラスミドは、インビトロでタンパク質の異種発現について、遺伝子投与量が染色体遺伝子に比例して増加し、タンパク質の高い比産出率をもたらすため、治療細菌について、コード化治療剤の高治療投与量のために、選択される。しかしながら、ここで、ここに提供される免疫刺激性細菌による治療産物をコードするプラスミの送達について、低コピー数がより有効であることが示されている。
細菌が高コピープラスミドを維持するための要求は、発現された分子が生物に毒性であるならば、問題であり得る。これらのプラスミドの維持のための代謝要求は、インビボでの複製適応度の費用に降りかかる。治療産物をコードするプラスミドの送達のための最適プラスミドコピー数は、プラスミドの送達のために操作した株の弱毒化の機構に依存し得る。必要であれば、当業者は、本明細書の開示に鑑み、特定の免疫刺激性種および細菌の株に適切なコピー数を選択し得る。ここで、低コピー数が有利であり得ることが示されている。
２. プラスミド維持／選択成分
実験室でのプラスミド維持は、通常プラスミドへの抗生物質抵抗性遺伝子の包含および増殖培地における抗生物質の使用により確実にされる。上記のとおり、プラスミドでの機能的ａｓｄ遺伝子で補われたａｓｄ欠失変異体の使用は、インビトロでの抗生物質を用いないプラスミド選択を可能とし、インビボでのプラスミド選択を可能とする。ａｓｄ遺伝子補完系は、このような選択のために提供される(Galan et al. (1990) Gene 94(1):29-35)。腫瘍微小環境でプラスミドを維持するためのａｓｄ遺伝子補完系の使用は、プラスミドコード化治療タンパク質または干渉ＲＮＡの送達のために操作したネズミチフス菌の効力を増加させる。
３. ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
真核生物細胞において、ＤＮＡは、ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、IIおよびIIIの３タイプのＲＮＡポリメラーゼにより転写される。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩはリボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)遺伝子のみを転写し、ＲＮＡ Ｐｏｌ IIはＤＮＡをｍＲＮＡおよび小核ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)に転写し、ＲＮＡ Ｐｏｌ IIIはＤＮＡをリボソーム５Ｓ ｒＲＮＡ(Ｉ型)、導入ＲＮＡ(ｔＲＮＡ)(II型)およびＵ６ ｓｎＲＮＡ(III型)などの他の小ＲＮＡに転写する。Ｔ７、ｐＢＡＤおよびｐｅｐＴプロモーターを含む原核生物プロモーターは、転写が細菌細胞で生じるとき、利用され得る(Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；米国特許公開２０１２／０００９１５３、２０１６／０３６９２８２；国際出願公開ＷＯ２０１５／０３２１６５、ＷＯ２０１６／０２５５８２)。ここに提供される細菌が宿主細胞転写／翻訳機構による発現のためにプラスミドを腫瘍常在免疫細胞に送達するよう設計されるため、治療タンパク質／産物をコードする核酸は、ＲＮＡＰIIおよびＲＮＡＰIIIプロモーターなどの真核生物プロモーターに操作可能に連結される。
ＲＮＡ ｐｏｌ IIIプロモーターは、一般に構成的発現に使用される。誘導型発現のために、ＲＮＡ ｐｏｌ IIプロモーターが使用される。例は、Ｌ－アラビノースにより誘導可能なｐＢＡＤプロモーター；ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ、ＩＰＴ、ＴＲＥ－ＣＭＶ、Ｔｅｔ－ＯＮおよびＴｅｔ－ＯＦＦなどのテトラサイクリン誘導性プロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ＬａｃＩ、Ｌａｃ－Ｏ応答性プロモーターなどのＩＰＴＧ誘導性プロモーター；ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ系プロモーター(米国特許８,４２６,６７５；国際出願公開ＷＯ２０１６／０２５５８２)；および低酸素状態誘導プロモーターであるｐｅｐＴを含む(Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436)。これらのプロモーターは周知である。これらのプロモーターの例は、ヒトＵ６(配列番号７３)およびヒトＨ１(配列番号７４)である。
Figure 2022524951000012
組織特異的プロモーターは、黒色腫細胞およびメラニン形成細胞のＴＲＰ２プロモーター；乳房および乳癌細胞のＭＭＴＶプロモーターまたはＷＡＰプロモーター、腸細胞のビリンプロモーターまたはＦＡＢＰプロモーター、膵臓ベータ細胞のＲＩＰプロモーター、ケラチン生成細胞のケラチンプロモーター、前立腺上皮のプロバシンプロモーター、ＣＮＳ細胞／癌のネスチンプロモーターまたはＧＦＡＰプロモーター、ニューロンのチロシンヒドロキシラーゼ１００プロモーターまたは神経細線維プロモーター、肺癌のクララ細胞分泌タンパク質プロモーターおよび心臓細胞のアルファミオシンプロモーターを含む(米国特許８,４２６,６７５)。Ｉ型インターフェロンを発現を増加させるか構成的とすることにより誘導するタンパク質の機能獲得型バリアントなどのコード化治療産物の発現を制御する他のプロモーターは、例えば、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＥＩＦ４Ａ１、ＣＡＧおよびＣＤ６８プロモーターを含む。
４. ＤＮＡ核ターゲティング配列
ＳＶ４０ ＤＴＳなどのＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)は、核孔複合体を介してＤＮＡ配列の転座に介在する。この輸送の機構は、核局在化配列を含むＤＮＡ結合タンパク質の結合に依存的であることが報告されている。プラスミドへの核輸送増加および発現のためのＤＴＳの包含は、示されており(例えば、Dean, D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res. 253(2):713-722参照)、ネズミチフス菌により送達されるプラスミドからの遺伝子発現増加に使用されている(例えば、Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419参照)。
大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子のＴ１ターミネーターなどのＲｈｏ非依存的またはクラスＩ転写ターミネーターは、転写伸長複合体の解離を引き起こす二次構造を形成するＤＮＡの配列を含む。転写ターミネーターは、ネズミチフス菌転写機構によるコード化治療産物の発現を防止するために、プラスミドに含まれ得る。これにより、コード化産物の発現が、宿主細胞転写機構に限局されることを確実とする。
ここに記載する癌治療剤として、ネズミチフス菌などのサルモネラの形質転換に使用するプラスミドは、次の性状の全てまたは一部を含む：１)ＣｐＧ島、２)細菌複製起点、３)プラスミド維持のためのａｓｄ遺伝子選択可能マーカー、４)１以上発現カセット、５)ＤＮＡ核ターゲティング配列および６)転写ターミネーター。
５. ＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲカセットをコードする免疫刺激性細菌を使用して、目的の標的遺伝子を部位特異的にノックアウトするために、ヒト免疫、骨髄または造血細胞に感染させ得る。使用する株はａｓｄ－であってよく、相補的ａｓｄカセットを欠くプラスミドを含んでよく、ｋａｎカセットを含む。液体培地でインビトロで株を増殖するために、ａｓｄ－遺伝子欠乏を補うためのＤＡＰを加える。ヒト細胞の感染後、株はもはや複製できず、ＣＲＩＳＰＲカセットコード化プラスミドが送達される。株はまた、食細胞のパイロトーシス(炎症性介在細胞死)を低減または防止するｈｉｌＡ－であるかまたはＳＰＩ－１の１以上の部分を欠くかまたはフラジェリンまたはそれらの何らかの組み合わせを欠いてよい。
Ｇ. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質およびＩ型インターフェロンおよび他の治療産物を構成的に誘導する機能獲得型修飾タンパク質をコードする他の送達媒体
ここに記載するとおり、インターフェロン－βおよびインターフェロン－αを含むＩ型インターフェロン(ＩＦＮ)を、直接的にまたは経路を介して間接的に誘導する、タンパク質などの治療産物をコードする核酸を含む、免疫刺激性細菌、腫瘍溶解性ウイルスおよびエクソソーム、リポソームおよびナノ粒子などの他の送達媒体が提供される。このようなタンパク質は、ヒトおよび非ヒトＳＴＩＮＧおよびその他、例えば、ＲＩＧ－１およびＭＤＡ５タンパク質およびＩ型インターフェロンが構成的に発現されるように、活性を構造的とする変異を含むそのＧＯＦ変異体を含む。サイトカインおよび他の免疫刺激性タンパク質などの他の治療産物もこれら送達媒体にコード化されるおよび／またはこれらにより送達されることができる。媒体は、腫瘍常在免疫細胞などの腫瘍細胞または腫瘍微小環境に蓄積する。
１. エクソソーム、細胞外小胞および他の小胞送達媒体
エクソソームおよびナノ粒子を製造および使用およびターゲティングする多数の方法が当業者に知られる(例えば、公開米国出願２０１３／０３３７０６６、２０１４／００９３５５７、２０１８／０１０４１８７、２０１８／０１９３２６６および２０１８／０２３６１０４参照)。エクソソームは、種々の細胞型により分泌される、小さな、３０～１００nm小胞である。核酸送達の媒体として適応されている。腫瘍に標的化され得る。例えば、表面に腫瘍ターゲティングリガンドを発現するよう操作され得る。
エクソソームは、多胞体と原形質膜の融合後細胞外環境に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。エクソソームのサイズは、直径３０～１００nmの範囲である。その表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二重層からなり、エクソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含み、表面に親細胞からの膜タンパク質を示す。
エクソソームは、インビトロおよびインビボで多くのタイプの細胞により内因性に分泌されるナノ粒子であり、通常血液、尿および悪性腹水などの体液から単離され得る。エクソソームは、小胞からエンドソーム内腔への内向き出芽および限定的膜切断により形成され得る、ｃｕｐ様多胞体(ＭＶＢ)である。ＭＶＢ形成中、膜貫通および末梢膜タンパク質は、小胞膜に吸収され、同時に、サイトゾル成分は小胞に包埋される。この過程が進行するに連れ、ＭＶＢは最終的に細胞膜と融合し、細胞からのエクソソームの放出が誘導される。
エクソソームは、由来する細胞型により、種々の組成および機能を示す。エクソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、肥満細胞(ＭＣ)および樹状細胞(ＤＣ)を含む多くの細胞により産生される。ヒトにおいて、エクソソームは血漿、尿、気管支肺胞洗浄液、腸上皮細胞および腫瘍組織で生じる。エクソソームは、細胞への核酸導入に使用されており、免疫系の細胞を含む体のあらゆる細胞に標的化され得る。エクソソームは、インビトロで増殖する細胞および人体からを含む、種々の起源の細胞から単離され得る。それらは、それ自体の遺伝子材料を欠くように産生され得る。遺伝子材料を欠くエクソソームを産生する方法は当業者に知られる。ＵＶ暴露、エクソソームにＲＮＡを運搬するタンパク質の変異、エレクトロポレーションおよびエクソソーム膜を開孔する化学処理を含む。方法は、何らかの核酸のエクソソームへの充填を修飾する何らかのタンパク質の変異／欠失を含む。ＲＮＡまたはＤＮＡの遺伝的構築物は、インビトロ形質転換、トランスフェクションおよびマイクロインジェクションなどの慣用の分子生物学技術の使用により、エクソソームに導入され得る。
ここに提供されるのは、機能獲得型修飾タンパク質をコードするまたはサイトゾルＩＦＮシグナル伝達経路の構成的活性化／サイトゾル核酸リガンドへの感受性増加に至る、コード化タンパク質(例えば、ここに記載するとおり、機能獲得型ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５およびＳＴＩＮＧの変異)を細胞に含む、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、エクソソームおよび他の細胞外小胞および他のこのような媒体である。これらの媒体は、例えば、サイトカインを含む免疫応答を増強する免疫刺激性タンパク質などの付加的タンパク質をコードし得る。エクソソームおよび他の媒体は、腫瘍常在免疫細胞および腫瘍細胞を含む、腫瘍微小環境における細胞を標的とするまたは蓄積するよう設計され得る。
２. 腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍で蓄積および複製し、腫瘍退縮をもたらす、腫瘍細胞融解ならびに放出された腫瘍抗原およびウイルス産物への免疫応答を導き得る。腫瘍溶解性ウイルスは、循環腫瘍細胞などの転移腫瘍細胞を含む腫瘍細胞にコロニー形成または蓄積することにより、処置を発揮する。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞で発現される治療産物をコードするよう操作され得る。
腫瘍溶解性ウイルスは、とりわけ、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)、コクサッキーウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、セネカバレーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、センダイウイルス、デングウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、テナガザル白血病ウイルスおよびシンドビスウイルスを含むが、これらに限定されない、天然に存在するおよび操作した組み換えウイルスを含む。多くの場合、腫瘍選択性は、ワクシニアウイルスおよび他の腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルスの固有の性質である。腫瘍溶解性ウイルスは、当業者に知られるものを含むが、これらに限定されず、例えば、水疱性口内炎ウイルス(例えば、米国特許７,７３１,９７４、７,１５３,５１０および６,６５３,１０３；米国特許公開２０１０／０１７８６８４、２０１０／０１７２８７７、２０１０／０１１３５６７、２００７／００９８７４３、２００５／０２６０６０１および２００５／０２２０８１８；および欧州特許１３８５４６６、１６０６４１１および１５２０１７５参照)；単純ヘルペスウイルス(例えば、米国特許７,８９７,１４６、７,７３１,９５２、７,５５０,２９６、７,５３７,９２４、６,７２３,３１６および６,４２８,９６８；および米国特許公開２０１１／０１７７０３２、２０１１／０１５８９４８、２０１０／００９２５１５、２００９／０２７４７２８、２００９／０２８５８６０、２００９／０２１５１４７、２００９／００１０８８９、２００７／０１１０７２０、２００６／００３９８９４および２００４／０００９６０４参照)；レトロウイルス(例えば、米国特許６,６８９,８７１、６,６３５,４７２、６,６３９,１３９、５,８５１,５２９、５,７１６,８２６および５,７１６,６１３；および米国特許公開２０１１／０２１２５３０参照)；およびアデノ随伴ウイルス(例えば、米国特許８,００７,７８０、７,９６８,３４０、７,９４３,３７４、７,９０６,１１１、７,９２７,５８５、７,８１１,８１４、７,６６２,６２７、７,２４１,４４７、７,２３８,５２６、７,１７２,８９３、７,０３３,８２６、７,００１,７６５、６,８９７,０４５および６,６３２,６７０参照)を含む。当業者は、治療のために腫瘍溶解性ウイルスを増殖、選択および修飾する方法を知っている。
ここに提供される腫瘍溶解性ウイルスは、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達および／またはＮＦ－κＢシグナル伝達を活性化するポリペプチドなどＩ型インターフェロンの発現を誘導する産物をコードするよう修飾される。これらのタンパク質は、ヒトおよび非ヒトＳＴＩＮＧおよびＳＴＩＮＧの機能獲得型変異体およびここに記載するものを含む、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５およびその機能獲得型変異体を含む、他のこのようなタンパク質を含む。腫瘍溶解性ウイルスはまた、インターロイキン２(ＩＬ－２)を含むサイトカインなどの免疫刺激性タンパク質をコードし得る。これらのタンパク質はウイルスプロモーターの制御下にあるまたは他のＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターの制御下にあり得る。腫瘍溶解性ウイルスはまたＴＲＥＸ１などの免疫応答を抑制する受容体または他の標的を標的とする、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなどのＲＮＡｉなどの他の治療産物もコードし得る。ウイルスは、静脈内、腫瘍内および腹腔内投与などの非経腸投与を含むが、これらに限定されない、何らかの適当な方法で投与される。ウイルスは当業者に知られるどれでもよく、付加的治療産物をコードし得る。ウイルスを、卵巣腫瘍のためのシスプラチンまたは膵臓腫瘍のためのゲムシタビンなど腫瘍に適する他の治療剤と組み合わせ得る。腫瘍溶解性ウイルスの例は、下記のものである。
ａ. アデノウイルス
アデノウイルス(Ａｄ)は、線形ゲノムを有する非エンベロープ型ｄｓ－ＤＮＡウイルスである。ヒトＡｄは、交差感受性に基づき５７血清型(Ａｄ１～Ａｄ５７)にならびに病原性および組織向性に基づき７サブグループ(Ａ～Ｇ)に分類されている。アデノウイルス血清型５(Ａｄ５)は、腫瘍溶解性ウイルス療法に最も一般に使用されるアデノウイルスである。ヒトへの感染は穏やかであり、風邪様症状をもたらし(Yokoda et al. (2018) Biomedicines 6, 33)、全身投与は肝臓向性をもたらし、肝毒性に至り得るが(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837)、Ａｄは治療目的では安全と考えられる。Ａｄは、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体(ＣＡＲ)に結合し、その後細胞表面のαｖβ３およびαｖβ５インテグリンおよびアデノウイルスペントン塩基のＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐトリペプチドモチーフ(ＲＧＤ)と相互作用して、細胞に侵入する(Jiang et al. (2015) Curr. Opin. Virol. 13:33-39)。ＣＡＲは大部分の正常細胞表面に発現されるが、発現は癌細胞型にわたり高度に可変である。他方で、ＲＧＤ関連インテグリンは癌細胞により高度に発現されるが、正常細胞にはるかに低レベルで発現される(Jiang et al. (2015))。その結果、アデノウイルスは、ＲＧＤモチーフを介して癌細胞に標的化され得る。
Ａｄは、形質転換細胞における高形質導入効率、宿主ゲノムへの組込み欠如／挿入変異欠如、ゲノム安定性、大治療遺伝子をそのゲノムに挿入する能力およびのウイルスプロモーターの癌組織選択的プロモーターへの置換など遺伝子操作により腫瘍選択性とする能力により腫瘍溶解性ウイルスとして誘引性である(Yokoda et al. (2018) Biomedicines 6, 33; Choi et al. (2015) J. Control. Release 10(219):181-191)。
腫瘍特異的プロモーターを有する腫瘍溶解性Ａｄの例は、前立腺特異的抗原プロモーター制御下にアデノウイルス早期領域１Ａ(Ｅ１Ａ)遺伝子を有する前立腺癌処置のＣＶ７０６およびＥ１Ａ遺伝子発現制御のためにテロメラーゼ逆転写酵素(ＴＥＲＴ)プロモーターを利用するＯＢＰ－３０１を含む(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837)。腫瘍選択性を誘導する他の方法は、網膜芽細胞腫(Ｒｂ)経路における異常またはｐ５３変異など、欠損遺伝子が腫瘍細胞で通常みられる遺伝的変異により機能的に補完される場所である、ＡｄゲノムのＥ１領域における変異の導入である(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837)。例えば、腫瘍溶解性Ａｄ ＯＮＹＸ－０１５およびＨ１０１は、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子に欠失を有し、これは、ｐ５３を不活性化する。これらの変異体は、正常アポトーシス防御経路を遮断できず、ｐ５３腫瘍サプレッサー経路が欠損した新生物細胞の感染により、腫瘍選択性をもたらす(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Uusi-Kerttula et al. (2015) Viruses 7:6009-6042)。Ｅ１ＡΔ２４は、Ｅ１Ａ遺伝子に２４bp変異を含む腫瘍溶解性Ａｄであり、Ｒｂ結合ドメインを破壊し、Ｒｂ経路変異を有する癌細胞でのウイルス複製を促進する。ＩＣＯＶＩＲ－５は、Ｅ２Ｆプロモーターにより制御されるＥ１Ａ転写、Ｅ１ＡのΔ２４変異およびアデノウイルス繊維へのＲＧＤ－４Ｃ挿入の組み合わせを含む、腫瘍溶解性Ａｄである(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Uusi-Kerttula et al. (2015))。デルタ－２４－ＲＧＤまたはＤＮＸ－２４０１は、Δ２４主鎖がＲＧＤモチーフの挿入により修飾された腫瘍溶解性Ａｄであり、インビトロおよびインビボで腫瘍溶解性効果を示す(Jiang et al. (2015))。
腫瘍選択性を改善する代替的戦略は、細胞外マトリクス(ＥＣＭ)のターゲティングによる、固形腫瘍の物理的障壁の克服である。例えば、ＶＣＮ－０１などのヒアルロニダーゼを発現する腫瘍溶解性Ａｄを使用して、腫瘍中へのコード化産物およびウイルスの送達を促進し得る。ＡｄはまたＥＣＭを破壊するためのレラキシンを発現するよう操作もされ得る(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Shaw and Suzuki (2016) Curr. Opin. Virol. 21:9-15)。シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)およびＨＳＶ－１チミジンキナーゼ(ＴＫ)などの自殺遺伝子を発現するＡｄは、ＡｄがＧＭ－ＣＳＦを発現するＯＮＣＯＳ－１０２などの免疫刺激性サイトカインを発現するとして、インビボで抗腫瘍有効性増強が示されている(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Shaw and Suzuki (2016) Curr. Opin. Virol. 21:9-15)。抗ＣＴＬＡ４抗体を発現するΔ２４ベースの腫瘍溶解性Ａｄは、前臨床試験で有望性が示されている(Jiang et al. (2015))。
アデノウイルスＨ１０１(商品名Oncorine(登録商標)で入手可能)は、２００５年、進行型鼻咽頭癌患者処置のために、化学療法との組み合わせで中国で臨床使用が承認された初めての腫瘍溶解性Ａｄであった。臨床試験は、広範な癌の処置に対する腫瘍溶解性アデノウイルスの使用を示している。例えば、転移膵臓癌を有する患者におけるＩＬ－１２をコードする腫瘍溶解性Ａｄ(ＮＣＴ０３２８１３８２)；膵臓腺癌、卵巣癌、胆道癌および結腸直腸癌を有する患者におけるＴＭＸ－ＣＤ４０Ｌおよび４１ＢＢＬを発現する免疫刺激性Ａｄ５(ＬＯＡｄ７０３)(ＮＣＴ０３２２５９８９)；膵臓癌を有する患者におけるゲムシタビンおよびｎａｂ－パクリタキセルと組み合わせたＬＯＡｄ７０３(ＮＣＴ０２７０５１９６)；膵臓腺癌を含む進行型固形腫瘍を有する患者におけるゲムシタビンおよびアブラキサン(登録商標)と組み合わせたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼ(ＶＣＮ－０１)をコードする腫瘍溶解性アデノウイルス(ＮＣＴ０２０４５６０２；ＮＣＴ０２０４５５８９)；肝細胞癌を有する患者におけるヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)プロモーターを含む腫瘍選択性を有する腫瘍溶解性ＡｄであるＴｅｌｏｍｅｌｙｓｉｎ(登録商標)(ＯＢＰ－３０１)(ＮＣＴ０２２９３８５０)；肝細胞癌を有する患者における経カテーテル肝動脈化学塞栓療法(ＴＡＣＥ)と組み合わせたＥ１Ｂ遺伝子欠失Ａｄ５(ＮＣＴ０１８６９０８８)；膀胱癌患者におけるＧＭ－ＣＳＦを発現し、Ｅ１Ａの発現を駆動する癌特異的Ｅ２Ｆ－１プロモーターを含む腫瘍溶解性ＡｄであるＣＧ００７０(ＮＣＴ０２３６５８１８；ＮＣＴ０１４３８１１２)；結腸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌および腎臓細胞癌腫を有する患者におけるＡｄ１１ｐ／Ａｄ３キメラグループＢ腫瘍溶解性ウイルスであるEnadenotucirev(Ｃｏｌｏ－Ａｄ１)(ＮＣＴ０２０５３２２０)；および神経膠芽腫を有する患者におけるテモゾロミドと組み合わせた(ＮＣＴ０１９５６７３４)またはＩＦＮγと組み合わせた(ＮＣＴ０２１９７１６９)ＤＮＸ－２４０１(Ａｄ５ Ｅ１ＡΔ２４ＲＧＤ)が臨床試験されているおよび治験中である。
ｂ. 単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)は、ヘルペスウイルス科に属し、遺伝子操作の理想的候補となる、ウイルス複製に必須でない多くの遺伝子を含む大線形二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。他の利点は、広範囲の細胞型に感染する能力、アシクロビルおよびガンシクロビルなどの抗ウイルス剤への感受性および挿入変異の欠如を含む(Sokolowski et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:207-219; Yin et al. (2017) Front. Oncol. 7:136)。ＨＳＶ Ｉ型(ＨＳＶ－１)およびII型(ＨＳＶ－２)の２タイプのＨＳＶがあり、腫瘍溶解性ＨＳＶの大部分はＨＳＶ－１由来である。ヒトにおいて、ＨＳＶ－１は、熱性疱疹疾患をもたらし、細胞表面のネクチン、糖タンパク質およびヘルペスウイルス侵入メディエーター(ＨＶＥＭ)への結合により上皮細胞、ニューロンおよび免疫細胞に感染する(Kohlhapp and Kaufman (2016) Clin. Cancer Res. 22(5):1048-1054)。
多くの種々の腫瘍溶解性ＨＳＶ－１ウイルスが今日までに産生されている。何れも、ここに記載するとおり、修飾ＤＮＡ／ＲＮＡ機能獲得型タンパク質をコードするようさらに修飾でき、その結果、腫瘍および腫瘍微小環境への蓄積により、そのように修飾されたＨＳＶは、Ｉ型インターフェロンなどの免疫応答メディエーターを構成的にするようコード化タンパク質を発現する。例えば、ＨＳＶ－１は、乳癌および卵巣癌、胃癌および神経膠芽腫などのＨＥＲ－２過発現腫瘍をターゲティングする、抗ＨＥＲ－２抗体トラスツズマブを発現するよう操作され得る。トラスツズマブをコードする遺伝子は、ＨＳＶ－１ ｇＤ糖タンパク質遺伝子内の２つの領域に挿入され、２つの腫瘍溶解性ＨＳＶ、Ｒ－ＬＭ１１３およびＲ－ＬＭ２４９を産生する。Ｒ－ＬＭ１１３およびＲ－ＬＭ２４９は、ヒト乳癌および卵巣癌ならびにＨＥＲ２＋神経膠芽腫のマウスモデルに対する前臨床活性を示している。他の腫瘍溶解性ＨＳＶ－１、ｄｌｓｐｔｋ ＨＳＶ－１は、チミジンキナーゼ(ＴＫ)のウイルスホモログをコードするユニーク長２３(ＵＬ２３)遺伝子の欠失を含み、一方、ｈｒＲ３ ＨＳＶ－１変異体は、遺伝子ＵＬ３９によりコードされるＩＣＰ６としても知られるリボヌクレオチドレダクターゼ(ＲＲ)の大サブユニットのＬａｃＺ挿入変異を含む。その結果、ｄｌｓｐｔｋおよびｈｒＲ３ ＨＳＶ－１変異体は、それぞれ、ＴＫおよびＲＲを過発現する癌細胞でのみ複製できる(Sokolowski et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:207-219)。
ＨＦ１０は、ＵＬ４３、ＵＬ４９.５、ＵＬ５５、ＵＬ５６および潜伏性転写物をコードする遺伝子を欠き、ＵＬ５３およびＵＬ５４を過発現する自然発生変異腫瘍溶解性ＨＳＶ－１である。ＨＦ１０は、前臨床試験で有望な結果が示され、高腫瘍選択性、高ウイルス複製、強力な抗腫瘍活性および好都合な安全性プロファイルが示された(Eissa et al. (2017) Front. Oncol. 7:149)。ＨＦ１０を調査する臨床試験は、難治性頭頸部癌、皮膚扁平上皮細胞癌、乳癌および悪性黒色腫を有する患者におけるフェーズＩ治験(ＮＣＴ０１０１７１８５)および切除不能膵臓癌を有する患者における化学療法(ゲムシタビン、Ｎａｂ－パクリタキセル、ＴＳ－１)と組み合わせたＨＦ１０のフェーズＩ治験(ＮＣＴ０３２５２８０８)を含む。ＨＦ１０は抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブとも組み合わされ、ステージIIIｂ、IIIｃまたはIV切除不能または転移黒色腫を有する患者で治療有効性改善が示された(ＮＣＴ０３１５３０８５)。フェーズII臨床試験は、切除可能ステージIIIｂ、IIIｃおよびIV黒色腫を有する患者における抗ＰＤ－１抗体ニボルマブとＨＦ１０の組み合わせ(ＮＣＴ０３２５９４２５)および切除不能または転移黒色腫を有する患者におけるイピリムマブとの組み合わせ(ＮＣＴ０２２７２８５５)が調査されている。パクリタキセルおよびＨＦ１０の組み合わせ治療は、何れかの処置単独と比較して、腹膜結腸直腸癌モデルで優れた生存率をもたらし、ＨＦ１０およびエルロチニブの組み合わせ処置は、インビトロおよびインビボでＨＦ１０またはエルロチニブ単独より膵臓異種移植片に対して活性が改善した(Eissa et al. (2017) Front. Oncol. 7:149)。
OncoVEXGM-CSFとして以前は知られたタリモジンラヘルパレプベク(Imlygic(登録商標)、Ｔ－ＶＥＣ)は、ＨＳＶ－１のＪＳ１株から産生され、顆粒球マクロファージ刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)を発現するよう遺伝子操作された、進行型黒色腫の処置にＦＤＡが承認した腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスである(Aref et al. (2016) Viruses 8:294)。Ｔ－ＶＥＣで、ＧＭ－ＣＳＦ発現は抗腫瘍細胞毒性免疫応答を増強し、感染細胞タンパク質３４.５(ＩＣＰ３４.５)遺伝子両者のコピーの欠失は、正常組織での複製を抑制し、ＩＣＰ４７遺伝子欠失は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を増加し、感染細胞への抗原提示が可能となる(Eissa et al. (2017))。Ｔ－ＶＥＣは、癌細胞表面のネクチンとの結合により腫瘍選択性を示し、破壊された発癌性および抗ウイルスシグナル伝達経路、特にタンパク質キナーゼＲ(ＰＫＲ)およびＩ型ＩＦＮ経路を利用して、腫瘍細胞で優先的に複製する。正常細胞で、ＰＫはウイルス感染により活性化され、次いで、真核生物開始因子－２Ａタンパク質(ｅＩＦ－２Ａ)をリン酸化し、不活性化し、次に、細胞性タンパク質合成を阻害し、細胞増殖を阻止し、ウイルス複製を抑止する。野生型ＨＳＶは、ｅＩＦ－２Ａを脱リン酸化し、感染細胞におけるタンパク質合成を回復するホスファターゼを活性化するＩＣＰ３４.５タンパク質の発現により、抗ウイルス応答を回避する。それ故に、ＩＣＰ３４.５の欠失は、正常細胞におけるＴ－ＶＥＣのウイルス複製を不可能とする。しかしながら、癌細胞でＰＫＲ－ｅＩＦ－２Ａ経路は破壊され、連続的細胞増殖および無抑制ウイルス複製が可能となる(Kohlhapp and Kaufman (2016) Clin. Cancer Res. 22(5):1048-1054; Yin et al. (2017) Front. Oncol. 7:136)。ＧＭ－ＣＳＦの発現は、樹状細胞蓄積を引き起こし、抗原提示を促進し、Ｔ細胞応答をプライミングすることにより、Ｔ－ＶＥＣの免疫原性を改善する(Kohlhapp and Kaufman (2016) Clin. Cancer Res. 22(5):1048-1054)。
Ｔ－ＶＥＣは、乳癌、結腸直腸腺癌、黒色腫、前立腺癌および神経膠芽腫を含む多様な異なる癌細胞株で優先的に複製することが示されている。臨床試験は、例えば、Ｔ－ＶＥＣを膵臓癌(ＮＣＴ０３０８６６４２、ＮＣＴ００４０２０２５)、反復性乳癌(ＮＣＴ０２６５８８１２)、小児進行型非ＣＮＳ腫瘍(ＮＣＴ０２７５６８４５)、非黒色腫皮膚癌(ＮＣＴ０３４５８１１７)、非筋肉侵襲性膀胱移行細胞癌腫(ＮＣＴ０３４３０６８７)および悪性黒色腫(ＮＣＴ０３０６４７６３)におけるならびにＴ－ＶＥＣを転移トリプルネガティブ乳癌および肝転移を有する転移結腸直腸癌(ＮＣＴ０３２５６３４４)の患者でアテゾリズマブとの組み合わせ、トリプルネガティブ乳癌を有する患者でパクリタキセルとの組み合わせ(ＮＣＴ０２７７９８５５)、難治性リンパ腫または進行型／難治性非黒色腫皮膚癌を有する患者でパニボルマブとの組み合わせ(ＮＣＴ０２９７８６２５)、進行型頭頸部癌を有する患者でシスプラチンおよび放射線療法との組み合わせ(ＮＣＴ０１１６１４９８)ならびに肝臓腫瘍(ＮＣＴ０２５０９５０７)、頭頚部癌(ＮＣＴ０２６２６０００)、肉腫(ＮＣＴ０３０６９３７８)および黒色腫(ＮＣＴ０２９６５７１６、ＮＣＴ０２２６３５０８)を有する患者でペムブロリズマブとの組み合わせで調査している。
ＧＭ－ＣＳＦに加えて、治療有効性増加をもたらす、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＴＮＦα、ＩＦＮα／βおよびｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンドをコードするものを含む、多数の他の免疫刺激遺伝子が腫瘍溶解性ＨＳＶに導入されている(Sokolowski et al. (2015); Yin et al. (2017))。
他の腫瘍溶解性ＨＳＶ－１、Ｒ３６１６は、破壊されたＰＫＲ経路を有する癌細胞にターゲティングするＩＣＰ３４.５をコードする、ＲＬ１(γ１３４.５としても知られる)遺伝子の両コピーに欠失を有する。ＮＶ１０２０(またはＲ７０２０)は、神経病原性低減および癌選択性をもたらす、ＵＬ５５、ＵＬ５６、ＩＣＰ４、ＲＬ１およびＲＬ２遺伝子に欠失を含むＨＳＶ－１変異体である。ＮＶ１０２０は、頭頚部扁平上皮細胞癌、類表皮癌腫および前立腺腺癌のマウスモデルで有望な結果を示した(Sokolowski et al. (2015))。さらに、臨床試験は、肝臓に転移した結腸直腸癌におけるＮＶ１０２０の安全性および有効性を調査している(ＮＣＴ００１４９３９６およびＮＣＴ０００１２１５５)。
Ｇ２０７(またはＭＧＨ－１)は、ＵＬ３９神経病原性遺伝子にＲＬ１(γ１３４.５)欠失およびＬａｃＺ不活性化挿入を有する他のＨＳＶ－１変異体である。Ｇ２０７を利用する臨床試験は、進行性または反復性テント上脳腫瘍の小児におけるＧ２０７投与単独または単回放射線投与の調査(ＮＣＴ０２４５７８４５)、反復性脳癌(神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫)を有する患者におけるＧ２０７の安全性および有効性の調査(ＮＣＴ０００２８１５８)および悪性神経膠腫を有する患者におけるＧ２０７投与と続く放射線療法の効果の調査(ＮＣＴ００１５７７０３)を含む。
Ｇ２０７は、さらにＩＣＰ４７をコードする遺伝子に欠失を含む、Ｇ４７Δの産生に使用された。他のＨＳＶ－１由来腫瘍溶解性ウイルスは、ＲＬ１に欠失を含むが、インタクトなＵＬ３９遺伝子を有し、活発に分裂している細胞で選択的に複製するＨＳＶ１７１６および最初期ウイルス遺伝子発現の喪失および癌細胞選択性をもたらすＵＬ４８およびＲＬ２遺伝子に挿入を有するＫＭ１００変異体である(Sokolowski et al. (2015); Yin et al. (2017) Front. Oncol. 7:136)。
腫瘍溶解性ウイルスはまたＨＳＶ－２にも由来している。例えば、ＦｕｓＯｎ－Ｈ２は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ(ＰＫ)ドメインをコードするＩＣＰ１０遺伝子のＮ末端領域に欠失を有するＨＳＶ－２腫瘍溶解性ウイルスである。このＰＫは、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質Ｒａｓ－ＦＡＰのリン酸化を担い、Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ分裂促進的経路を活性化し、効率的ＨＳＶ－２複製に必要なｃ－Ｆｏｓを誘導および安定化する。正常細胞は、通常不活性化Ｒａｓシグナル伝達経路を有する。それ故に、ＦｕｓＯｎ－Ｈ２は、活性化Ｒａｓシグナル伝達経路を有する腫瘍細胞でのみ複製することにより、腫瘍選択性を示す(Fu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(10):3152-3157)。ＦｕｓＯｎ－Ｈ２は、膵臓癌異種移植片(Fu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(10):3152-3157)、シクロホスファミドと組み合わせてルイス肺癌異種移植ならびに同系マウス乳房腫瘍および神経芽腫(Li et al. (2007) Cancer Res. 67:7850-7855)に対する活性が示されている。
ｃ. ポックスウイルス
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルスの例である。ワクシニアは、サイトゾルウイルスであり、そうして、ライフサイクル中そのゲノムを宿主ゲノムに挿入しない。ワクシニアウイルスは、単一連続的ポリヌクレオチド鎖からなる約１８０,０００塩基対長の線形、二本鎖ＤＮＡゲノムを有する(Baroudy et al. (1982) Cell 28:315-324)。構造は、１０,０００塩基対逆方向反復配列(ＩＴＲ)の存在による。ＩＴＲはゲノム複製に関与する。ゲノム複製は、自己プライミングに関与し、高分子量コンカテマー(感染細胞から単離)の形成をもたらし、それは、その後開裂され、修復されて、ウイルスゲノムとなる(例えば、Traktman, P., Chapter 27, Poxvirus DNA Replication, pp. 775-798, in DNA Replication in Eukaryotic Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)参照)。ゲノムは約２５０遺伝子含む。一般に、非セグメント化、非感染性ゲノムが、中心に位置する遺伝子がウイルス複製(および故に、保存)に必須であり、２つの末端近辺の遺伝子は、宿主範囲および病原性などのより末端の機能を発揮するように配置される。ワクシニアウイルスは、一般的原則として、重複しないように、セットで配置されたオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を利用することにより、示差的遺伝子発現を実行する。
ワクシニアウイルスは、広い宿主および細胞型範囲および低毒性を含む、癌遺伝子治療およびワクチン接種に使用するための多様な特性を有する。例えば、大部分の腫瘍溶解性ウイルスは天然病原体であるが、ワクシニアウイルスは、ヒトにおける安全性の確立された実績がある天然痘ワクチンとしてその利用が広まった特有の来歴がある。ワクシニア投与に関連する毒性は、症例の０.１％未満で生じ、免疫グロブリン投与で効率的に対処できる。さらに、ワクシニアウイルスは、外来遺伝子を運搬する大きなキャパシティ(外来性ＤＮＡフラグメント最大２５kb、ワクシニアゲノムサイズの約１２％がワクシニアゲノムに挿入され得る)および他の株で修飾ウイルスを設計および産生するための種々の株間の高配列相同性を有する。遺伝子操作により修飾ワクシニア株を産生する技術は確立されている(Moss (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 86-90; Broder and Earl (1999) Mol. Biotechnol. 13: 223-245; Timiryasova et al. (2001) Biotechniques 31: 534-540)。ワクシニアウイルス株は、固形腫瘍に特異的にコロニー形成し、他の臓器に感染しないことが示されている(例えば、Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67:10038-10046; Yu et al. (2004) Nat. Biotech. 22:313-320; Heo et al. (2011) Mol. Ther. 19:1170-1179; Liu et al. (2008) Mol. Ther. 16:1637-1642; Park et al. (2008) Lancet Oncol. 9:533-542参照)。
ワクシニアウイルスの例は、リスター(Elstreeとしても知られる)、ニューヨーク市衛生局(ＮＹＣＢＨ)、大連、池田、ＬＣ１６Ｍ８、ウェスタン・リザーブ(ＷＲ)、コペンハーゲン(Ｃｏｐ)、タシケント、天壇、ワイス、Ｄｒｙｖａｘ、ＩＨＤ－Ｊ、ＩＨＤ－Ｗ、ブライトン、アンカラ、修飾ワクシニアアンカラ(ＭＶＡ)、大連Ｉ、ＬＩＰＶ、ＬＣ１６Ｍ０、ＬＩＶＰ、ＷＲ ６５－１６、ＥＭ６３、ベルン、パリ、ＣＶＡ３８２、ＮＹＶＡＣ、ＡＣＡＭ２０００およびコノート株を含むが、これらに限定されない。ワクシニアウイルスは、創傷および癌遺伝子治療における使用に特に適当とする多様な特性を有する腫瘍溶解性ウイルスである。例えば、ワクシニアは、サイトゾルウイルスであり、そうして、ライフサイクル中そのゲノムを宿主ゲノムに挿入しない。宿主の転写機構を必要とする多くの他のウイルスと異なり、ワクシニアウイルスは、ウイルスゲノムでコードされる酵素を使用して、宿主細胞サイトゾルで自身の遺伝子発現を支持できる。ワクシニアウイルスはまた広い宿主および細胞型範囲を有する。特に、ワクシニアウイルスは、腫瘍および／または転移を含み、損傷された組織および細胞もまた含む免疫特権細胞または免疫特権組織に蓄積される。さらに、他の腫瘍溶解性ウイルスと異なり、ワクシニアウイルスは一般に対象の免疫系の活性により、ウイルスが投与された対象から排除され得て、故に、アデノウイルスなどの他のウイルスより低毒性である。それ故に、ウイルスは一般に対象の免疫系の活性により、ウイルスが投与された対象から排除され得るが、それにも変わらず、ウイルスは、腫瘍などの疫特権細胞および組織で、このような免疫特権領域が宿主の免疫系から単離されるため、蓄積、生存および増殖できる。
ワクシニアウイルスはまた異種遺伝子挿入による修飾が容易であり得る。これは、ウイルスの弱毒化をもたらしおよび／または治療タンパク質の送達を可能とし得る。例えば、ワクシニアウイルスゲノムには、２５kbの外来性ＤＮＡフラグメント(ワクシニアゲノムサイズの約１２％)が挿入できる、外来遺伝子の大きな運搬キャパシティを有する。ワクシニア株のいくつかのゲノムは、完全に配列決定され、多くの必須および非必須遺伝子が同定されている。種々の株間での高配列相同性により、一つのワクシニア株のゲノム情報を使用して、他の株の修飾ウイルスの設計および産生ができる。最後に、遺伝子操作により修飾ワクシニア株を産生する技術は十分に確立されている(Moss (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3:86-90; Broder and Earl (1999) Mol. Biotechnol. 13:223-245; Timiryasova et al. (2001) Biotechniques 31:534-540)。
種々のワクシニアウイルスは、抗腫瘍活性を示すことが示されている。ある試験で、例えば、非転移結腸腺癌細胞担持ヌードマウスに、ワクシニア増殖因子欠失を有し、チミジンキナーゼ座位に挿入した増強緑色蛍光タンパク質により修飾されたワクシニアウイルスのＷＲ株を全身性に注射した。ウイルスは、修飾ウイルスにおける外来性治療遺伝子がないにも関わらず、１匹の完全奏効を含み、抗腫瘍効果を有することが観察された(McCart et al. (2001) Cancer Res. 1:8751-8757)。他の試験で、ワクシニア黒色腫腫瘍融解物(ＶＭＯ)を、黒色腫患者のフェーズIII臨床試験で黒色腫陽性リンパ節に近位の部位に注射した。対照として、ニューヨーク市衛生局株ワクシニアウイルス(ＶＶ)を黒色腫患者に投与した。ＶＭＯで処置した黒色腫患者の生存率は未処置患者より良好であったが、ＶＶ対照で処置した患者と同等であった(Kim et al. (2001) Surgical Oncol. 10:53-59)。
ワクシニアウイルスのＬＩＶＰ株も、腫瘍の診断および治療ならびに傷つき、炎症した組織および細胞の処置にも使用されている(例えば、Lin et al. (2007) Surgery 142:976-983; Lin et al. (2008) J. Clin. Endocrinol. Metab. 93:4403-7; Kelly et al. (2008) Hum. Gene Ther. 19:774-782; Yu et al. (2009) Mol. Cancer Ther. 8:141-151; Yu et al. (2009) Mol. Cancer 8:45；米国特許７,５８８,７６７；米国特許８,０５２,９６８；および米国公開２００４／０２３４４５５参照)。例えば、静脈内投与したとき、ＬＩＶＰ株は、インビボで内部腫瘍の種々の部位に蓄積することが示されており、乳房腫瘍、甲状腺腫瘍、膵臓腫瘍、胸膜中皮腫の転移腫瘍、扁平上皮細胞癌、肺癌および卵巣腫瘍を含むが、これらに限定されない種々の組織起源のヒト腫瘍を効率的に処置することが示されている。ワクシニアのＬＩＶＰ株は、その弱毒化形態を含み、ワクシニアウイルスのＷＲ株より低毒性であり、処置した腫瘍担持動物モデルにおける生存増加および延長をもたらす(例えば、米国公開２０１１／０２９３５２７参照)。
ｄ. 麻疹ウイルス
麻疹ウイルス(ＭＶ)は、パラミクソウイルス科に属する、マイナス鎖ゲノムを有する
エンベロープ型、一本鎖ＲＮＡウイルスである。その非セグメント化ゲノムは安定であり、病原性形態への変異および復帰のリスクが低く、そのサイトゾルでの複製により、感染細胞における挿入ＤＮＡ変異原性のリスクがない。ＭＶは、Edmonstonと称される患者から１９５４年に最初に単離され、優れた安全性プロファイルを有する生存ワクチンへと展開され、複数のインビトロ継代後の弱毒化により、５０年にわたり世界で１０億を超える人の保護に成功している(Aref et al. (2016) Viruses 8:294; Hutzen et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:109-118)。ＭＶ－Ｅｄｍと名付けられたこの株の誘導体は、腫瘍溶解性治療試験おける最も一般に利用されるＭＶ株である。Schwarz/Moraten麻疹ワクチン株は、Ｅｄｍ誘導体よりも弱毒化され、免疫原性であり、より安かつより免疫調節性である(Veinalde et al. (2017) Oncoimmunology 6(4):e1285992)。野生型ＭＶの腫瘍溶解性効果は１９７０年代に、急性リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫およびホジキンリンパ腫を有する患者の改善を報告する文献が出された(Aref et al. (2016))。
ＭＶは、標的細胞に侵入するためのＣＤ４６、ネクチン－４およびシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)の３つの主要受容体を使用する(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015))。活性化ＢおよびＴ細胞、未成熟胸腺細胞、単球および樹状細胞で発現されるＳＬＡＭは、野生型株の主受容体であるが、弱毒化および腫瘍選択的ＭＶ－Ｅｄｍ株は、多くの腫瘍細胞で過発現される補体活性化のレギュレーターであるＣＤ４６受容体を主に標的とする(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015); Jacobson et al. (2017) Oncotarget 8(38):63096-63109; Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4):483-502)。呼吸器上皮で優勢に発現されるネクチン－４は、野生型および弱毒化ＭＶ株両者により利用される(Aref et al. (2016); Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4):483-502)。他の腫瘍溶解性ウイルスと同様、腫瘍細胞のＩＦＮ抗ウイルス応答の欠損もまたＭＶの腫瘍選択性を促進する(Aref et al. (2016); Jacobson et al. (2017) Oncotarget 8(38):63096-63109)。多発性骨髄腫(ＮＣＴ０２１９２７７５、ＮＣＴ００４５０８１４)、頭頸部癌(ＮＣＴ０１８４６０９１)、中皮腫(ＮＣＴ０１５０３１７７)および卵巣癌(ＮＣＴ００４０８５９０、ＮＣＴ０２３６４７１３)を含む、数種の癌の処置におけるＭＶを調査する臨床試験が実施されている。
ＭＶは、例えば、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－ベータ、ＧＭ－ＣＳＦおよびヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質(ＮＡＰ)をコードするものを含む、免疫刺激および免疫調節性遺伝子を発現するよう遺伝子操作されている(Aref et al. (2016)、Hutzen et al. (2015); Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4):483-502)。腫瘍溶解性ＭＶと抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－Ｌ１抗体を利用する組み合わせ治療は、黒色腫マウスモデルで有効である(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015))。
腫瘍マーカー癌胎児性抗原(ＣＥＡ)を発現するよう遺伝子操作されたＭＶ－ＣＥＡは、癌細胞の感染後患者の血流へのＣＥＡの放出をもたらし、ＣＥＡレベルの検出および故にインビボでのウイルス感染の追跡を可能とする(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015))。ＭＶ－ＣＥＡの治療使用は前臨床および卵巣癌の処置のフェーズＩ臨床試験(ＮＣＴ００４０８５９０)で示されている。
ｅ. レオウイルス
通常レオウイルスとして知られる呼吸器腸病原性孤児ウイルスは、ヒトに非病原性であるレオウイルス科の非エンベロープ型二本鎖ＲＮＡウイルスである。野生型レオウイルスは、環境に遍在性であり、一般集団の７０～１００％血清反応陽性をもたらす(Gong et al. (2016) World J. Methodol. 6(1):25-42)。１型Ｌａｎｇ、２型Ｊｏｎｅｓ、３型Ａｂｎｅｙおよび３型Ｄｅａｒｉｎｇ(Ｔ３Ｄ)を含むレオウイルスの３つの血清型がある。Ｔ３Ｄが前臨床および臨床試験で最も一般に使用される天然に存在する腫瘍溶解性レオウイルス血清型である。
腫瘍溶解性レオウイルスは、癌細胞に特徴的である活性化Ｒａｓシグナル伝達により腫瘍選択的である(Gong et al. (2016)); Zhao et al. (2016) Mol. Cancer Ther. 15(5):767-773)。Ｒａｓシグナル伝達経路の活性化は、通常ウイルスタンパク質合成阻止を担うタンパク質であるｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ(ＰＫＲ)のリン酸化阻害により、細胞の抗ウイルス応答を破壊する(Zhao et al. (2016))。Ｒａｓ活性化はまたウイルス脱コートおよび脱集合も増強し、ウイルス子孫産生および感染性の増強をもたらし、アポトーシスの増強を介して子孫の放出を加速する(Zhao et al. (2016))。全ヒト腫瘍の約３０％が異常Ｒａｓシグナル伝達を提示すると推定される(Zhao et al. (2016))。例えば、悪性神経膠腫の大部分は活性化Ｒａｓシグナル伝達経路を有し、レオウイルスは、インビトロで悪性神経膠腫細胞およびインビボでヒト悪性神経膠腫モデルの８３％ならびにエクスビボで神経膠腫検体の１００％に抗腫瘍活性を示す(Gong et al. (2016) World J. Methodol. 6(1):25-42)。さらに、膵臓腺癌は、極めて高いＲａｓ変異率(約９０％)を示し、レオウイルスはインビトロで試験した膵臓細胞株の１００％に強力な細胞毒性を示し、インビボで皮下腫瘍マウスモデルの１００％に退縮を誘導した(Gong et al. (2016))。
レオウイルスは、結腸、乳房、卵巣、肺、皮膚(黒色腫)、神経学、血液、前立腺、膀胱および頭頸部癌を含む、一連の悪性腫瘍にわたり広い抗癌活性が前臨床で示されている(Gong et al. (2016))。レオウイルス治療は、放射線療法、化学療法、免疫療法および手術と組み合わせて試験されている。レオウイルスと放射線療法の組み合わせは、インビトロで頭頚部、結腸直腸および乳癌細胞株ならびにインビボで結腸直腸癌および黒色腫モデルの処置に有益性が示されている(Gong et al. (2016))。レオウイルスとゲムシタビンならびにレオウイルス、パクリタキセルおよびシスプラチンの組み合わせは、マウス腫瘍モデルで成功が示されている(Zhao et al. (2016))。Ｂ１６黒色腫マウスモデルでの前臨床試験は、腫瘍溶解性レオウイルスと抗ＰＤ－１治療の組み合わせが、レオウイルス単独と比較して抗癌有効性を改善することを示している(Gong et al. (2016); Zhao et al. (2016); Kemp et al. (2015) Viruses 8, 4)。
レオウイルスにより示されている有望な前臨床結果により、多くの臨床試験に至っている。カナダの会社であるOncolytics Biotech Inc.により開発されたReolysin(登録商標)レオウイルスは、臨床開発にある唯一の治療野生型レオウイルスであり、単独でおよび他の治療との組み合わせで多くの悪性腫瘍に抗癌活性を示している。例えば、反復性悪性神経膠腫処置におけるReolysin(登録商標)レオウイルスのフェーズＩ臨床試験(ＮＣＴ００５２８６８４)により、レオウイルスが忍容性良好であることが判明し、フェーズＩ／II治験により、Reolysin(登録商標)レオウイルスが白金化学療法に応答しなかった卵巣上皮性癌、原発腹膜癌または卵管癌患者において正常細胞を損傷することなく、腫瘍細胞を死滅させることが判明した(ＮＣＴ００６０２２７７)。Reolysin(登録商標)レオウイルスのフェーズII臨床試験は、骨および肺への軟組織肉腫転移を有する患者の処置の安全性および有効性を示した(ＮＣＴ００５０３２９５)。転移結腸直腸癌を有する患者におけるＦＯＬＦＩＲＩおよびベバシズマブと組み合わせたReolysin(登録商標)レオウイルスのフェーズＩ臨床試験(ＮＣＴ０１２７４６２４)が実施されている。化学療法ゲムシタビンと組み合わせたReolysin(登録商標)レオウイルスのフェーズII臨床試験が進行型膵臓腺癌を有する患者で(ＮＣＴ００９９８３２２)で実施され、フェーズII臨床試験で転移去勢抵抗性前立腺癌におけるドセタキセルと組み合わせたReolysin(登録商標)の治療能が調査され(ＮＣＴ０１６１９８１３)、フェーズII臨床試験で進行型／転移乳癌を有する患者におけるReolysin(登録商標)レオウイルスとパクリタキセルの組み合わせが調査された(ＮＣＴ０１６５６５３８)。フェーズIII臨床試験は、白金難治性頭頸部癌におけるパクリタキセルおよびカルボプラチンと組み合わせたReolysin(登録商標)の有効性を調査し(ＮＣＴ０１１６６５４２)、この組み合わせ治療を用いるフェーズII臨床試験が、非小細胞肺癌(ＮＣＴ００８６１６２７)および転移黒色腫(ＮＣＴ００９８４４６４)を有する患者で実施された。再発または難治性多発性骨髄腫を有する患者におけるカルフィルゾミブおよびデキサメサゾンと組み合わせせたReolysin(登録商標)のフェーズＩ臨床試験が継続中である(ＮＣＴ０２１０１９４４)。
ｆ. 水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)
水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)は、ラブドウイルス科内のベジクロウイルス属のメンバーである。マイナス鎖極性を有する一本鎖ＲＮＡからなるそのゲノムは、１１,１６１ヌクレオチドからなり、ヌクレオカプシドタンパク質(Ｎ)、ホスホタンパク質(Ｐ)、マトリクスタンパク質(Ｍ)、糖タンパク質(Ｇ)および大ポリメラーゼタンパク質の５つの遺伝子をコードする(Bishnoi et al. (2018) Viruses 10(2), 90)。ＶＳＶは、昆虫ベクターにより媒介され、疾患は、ウマ、ウシおよびブタを含むその天然宿主に限定され、ヒトでは軽度および無症候性感染である(Bishnoi et al. (2018) Viruses 10(2), 90)。ＶＳＶは、感染細胞のアポトーシスの強力かつ迅速なインデューサーであり、化学療法耐性腫瘍細胞を感作することが示されている。ＶＳＶは、腫瘍脈管構造に感染し、腫瘍への血流の喪失、凝血および血管新生の融解をもたらす。このウイルスはまた低酸素組織で複製し、細胞傷害性効果および細胞融解を誘導できる。さらに、ＷＴ ＶＳＶは多様な組織培養細胞株で高力価まで増殖し、大規模ウイルス産生を促進し、小さくかつ操作が容易であるゲノムを有し、宿主細胞形質転換のリスクなくサイトゾルで複製する(Bishnoi et al. (2018); Felt and Grdzelishvili (2017) Journal of General Virology 98:2895-2911)。これらの因子は、ヒトに病原性ではなく、一般にＶＳＶに対する免疫をヒトが有していないとの事実と共に、ウイルス腫瘍治療に対する良好な候補とする。
ＶＳＶは、遍在性に発現される細胞表面分子と結合し、「汎親和性」とし得るが、ＷＴ ＶＳＶはＩ型ＩＦＮ応答に感受性であり、故に、腫瘍のＩ型ＩＦＮシグナル伝達の欠損または阻害に基づき、腫瘍親和性とし得る(Felt and Grdzelishvili (2017))。正常細胞への感染性により、ＶＳＶは神経病原性を引き起こし得るが、マトリクスタンパク質および／または糖タンパク質の修飾により弱毒化し得る。例えば、マトリクスタンパク質は欠失させ得るかまたはマトリクスタンパク質の５１位のメチオニン残基を欠失またはアルギニンで置換させ得る(Bishnoi et al. (2018); Felt and Grdzelishvili (2017))。他のアプローチは、ＶＳＶの糖タンパク質を、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(ＬＣＭＶ)(ｒＶＳＶ－ＧＰ)のものと置換する(Bishnoi et al. (2018); Felt and Grdzelishvili (2017))。ＶＳＶを、腫瘍溶解性活性を増強するために、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＴＫ)などの自殺遺伝子を含むようまたはＩＬ－４、ＩＬ－１２およびＩＦＮβなどの免疫刺激サイトカインまたは顆粒球－マクロファージ－コロニー刺激因子１(ＧＭ－ＣＳＦ１)などの共刺激剤を発現するよう遺伝子修飾し得る(Bishnoi et al. (2018))。ＮＩＳおよびＩＦＮβをコードするＶＳＶ－ＩＦＮβ－ヨウ化ナトリウム共輸送体(ＶＳＶ－ＩＦＮβ－ＮＩＳ)は、米国で、いくつかのフェーズＩ臨床試験で試験されている(詳細はClinicalTrials.govの治験ＮＣＴ０２９２３４６６、ＮＣＴ０３１２０６２４およびＮＣＴ０３０１７８２０を参照のこと)。
水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)は、多様なマウス癌モデルに静脈内(ＩＶ)投与したとき、有効な腫瘍溶解性治療である。ある試験で、ｒＶＳＶ－ＧＰは、免疫不全マウスモデルで、皮下移植Ｇ６２ヒト神経膠芽腫細胞の腫瘍内処置および同所性Ｕ８７ヒト神経膠腫細胞の静脈内処置に成功した。ｒＶＳＶ－ＧＰの腫瘍内注射は、頭蓋内ＣＴ２Ａマウス神経膠腫細胞に対しても有効であった(Muik et al. (2014) Cancer Res. 74(13):3567-3578)。ｒＶＳＶ－ＧＰは検出可能な中和抗体応答を誘発せず、この遺伝子修飾腫瘍溶解性ウイルスがヒト補体に非感受性であり、実験の期間にわたり安定なままであることが判明した(Muik et al. (2014))。他の例において、ｒＶＳＶ－ＧＰの腫瘍内投与は、マウスモデルに移植したヒトＡ３７５悪性黒色腫細胞およびマウスＢ１６黒色腫細胞株に効率的に感染し、殺すことが判明した(Kimpel et al. (2018) Viruses 10, 108)。腫瘍溶解性ウイルスの静脈内注射は成功せず、腫瘍内投与群でも、全腫瘍は、Ｉ型ＩＦＮ応答により最終的に増殖した(Kimpel et al. (2018))。他の研究で、Ａ２７８０ヒト卵巣癌細胞の皮下異種移植マウスモデルをｒＶＳＶ－ＧＰの腫瘍内注射で処置し、腫瘍寛解が神経毒性なく初期には観察されたもの、寛解は一過性であり、腫瘍は再発した。これは、Ｉ型ＩＦＮ応答によるものであることが判明し、ｒＶＳＶ－ＧＰとＪＡＫ１／２阻害剤ルキソリチニブの組み合わせによる抗ウイルス状態の回復が観察された(Dold et al. (2016) Molecular Therapy - Oncolytics 3, 16021)。
ｇ. ニューカッスル病ウイルス
ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)は、家禽に感染し、ヒトには一般に非病原性であるが、インフルエンザ様症状を引き起こすこともある、陰性極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有するトリパラミクソウイルスである(Tayeb et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:49-62; Cheng et al. (2016) J. Virol. 90:5343-5352)。サイトゾル複製、宿主ゲノム組込みおよび組み換え欠失ならびに高ゲノム安定性により、ＮＤＶおよび他のパラミクソウイルスは、レトロウイルスまた一部ＤＮＡウイルスなどの他の腫瘍溶解性ウイルスのより安全かつより魅力的な代替を提供する(Matveeva et al. (2015) Molecular Therapy - Oncolytics 2, 150017)。ＮＤＶは腫瘍選択性を示すことが示されており、正常細胞より腫瘍細胞で１０,０００倍複製が多く、直接細胞傷害性効果および免疫応答の誘導により、腫瘍溶解をもたらす(Tayeb et al. (2015); Lam et al. (2011) Journal of Biomedicine and Biotechnology, Article ID: 718710)。ＮＤＶの腫瘍選択性の機構は全部が明らかではないが、腫瘍細胞におけるインターフェロン産生およびＩＦＮシグナル伝達への応答の欠損により、ウイルスが複製および拡散可能となる(Cheng et al. (2016); Ginting et al. (2017) Oncolytic Virotherapy 6:21-30)。癌細胞に対するパラミクソウイルスの高親和性は、シアル酸を含む、癌細胞表面へのウイルス受容体の過発現にもより得る(Cheng et al. (2016); Matveeva et al. (2015); Tayeb et al. (2015))。
操作していないＮＤＶ株は、ニワトリにおける病原性に基づき、長潜伏期性(非毒性)、亜病原性(中間)または短潜伏期性(病原性)と分類され、短潜伏期性および亜病原性株は、複数のヒト癌細胞株で複製(および融解)可能であるが、長潜伏期性株は不可能である(Cheng et al. (2016); Matveeva et al. (2015))。ＮＤＶ株はまた溶解性または非溶解性としても分類され、溶解性株のみが生存可能かつ感染性の子孫を産生できる(Ginting et al. (2017); Matveeva et al. (2015))。他方で、非溶解性株の腫瘍溶解性効果は、主に抗腫瘍活性をもたらす免疫応答を刺激する能力に由来する(Ginting et al. (2017) Oncolytic Virotherapy 6:21-30)。通常腫瘍治療に利用される亜病原性溶解性株はＰＶ７０１(ＭＫ１０７)、ＭＴＨ－６８／Ｈおよび７３－Ｔを含み、通常利用される長潜伏期性非溶解性株は、ＨＵＪ、UlsterおよびHitchner-B1を含む(Tayeb et al. (2015); Lam et al. (2011); Freeman et al. (2006) Mol. Ther. 13(1):221-228)。
ＮＤＶ株ＰＶ７０１は、フェーズ１治験で結腸直腸癌に対する活性を示し(Laurie et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(8):2555-2562)、ＮＤＶ株７３－Ｔは、線維肉腫、骨肉腫、神経芽腫および子宮頸癌を含む種々のヒト癌細胞株に対するインビトロ腫瘍溶解性活性ならびにヒト神経芽腫、線維肉腫異種移植片および結腸、肺、乳房および前立腺癌異種移植片を含む、数癌腫異種移植片を担持するマウスでのインビボ治療効果を示している(Lam et al. (2011))。ＮＤＶ株ＭＴＨ－６８／Ｈは、ＰＣ１２、ＭＣＦ７、ＨＣＴ１１６、ＤＵ－１４５、ＨＴ－２９、Ａ４３１、ＨＥＬＡおよびＰＣ３細胞を含む腫瘍細胞株の顕著な退縮をもたらし、吸入により投与したとき、進行型癌を有する患者で好都合な応答を示した(Lam et al. (2011))。非溶解性株Ｕｌｓｔｅｒは、結腸癌に対する細胞毒性効果を示し、一方溶解性株Ｉｔａｌｉｅｎは、ヒト黒色腫を効率的に死滅させた(Lam et al. (2011))。長潜伏期性ＮＤＶ株ＨＵＪは、患者に静脈内投与したとき、再発性多形性膠芽腫に対する腫瘍溶解性活性を示し、一方長潜伏期性株ＬａＳｏｔａは、結腸直腸癌患者の生存を延長し(Lam et al. (2011); Freeman et al. (2006) Mol. Ther. 13(1):221-228)、非小細胞肺癌(Ａ５４９)、神経膠芽腫(Ｕ８７ＭＧおよびＴ９８Ｇ)、乳腺腺癌(ＭＣＦ７およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３)および肝細胞癌(Ｈｕｈ７)細胞株に感染し、これらの癌細胞を殺すことができた(Ginting et al. (2017) Oncolytic Virotherapy 6:21-30)。
遺伝子操作ＮＤＶ株はまた腫瘍溶解性治療についても評価された。例えば、インフルエンザＮＳ１遺伝子、ＩＦＮアンタゴニストは、ＮＤＶ株Hitchner-B1のゲノムに導入され、多様なヒト腫瘍細胞株およびＢ１６黒色腫のマウスモデルで腫瘍溶解性効果増強をもたらした(Tayeb et al. (2015))。ＮＤＶの抗腫瘍／免疫刺激性効果は、ウイルスゲノムへのＩＬ－２またはＧＭ－ＣＳＦ遺伝子導入により増強されている(Lam et al. (2011))。腫瘍内ＮＤＶ注射と全身性ＣＴＬＡ－４抗体投与を利用する組み合わせ治療は、予め締め確立された遠位腫瘍の効率的拒絶をもたらした(Matveeva et al. (2015))。
ｈ. パルボウイルス
Ｈ－１パルボウイルス(Ｈ－１ＰＶ)は、パルボウイルス科に属する小さな、非エンベロープ型一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その天然宿主はラットである(Angelova et al. (2017) Front. Oncol. 7:93; Angelova et al. (2015) Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3:55)。Ｈ－１ＰＶはヒトに非病原性であり、好都合な安全性プロファイル、ヒトにおける既存のＨ－１ＰＶ免疫がないことおよび宿主細胞ゲノム組込み欠如により、腫瘍溶解性ウイルスとして魅力的である(Angelova et al. (2015))。Ｈ－１ＰＶは、乳房、胃、頸部、脳、膵臓および結腸直腸癌の前臨床モデルを含む固形腫瘍ならびにリンパ腫および白血病を含む血液系腫瘍に対する広い腫瘍抑制活性が示されている(Angelova et al. (2017))。Ｈ－１ＰＶは、腫瘍関連抗原提示増加、樹状細胞成熟および炎症促進性サイトカイン放出を介して、抗腫瘍応答を刺激する(Moehler et al. (2014) Frontiers in Oncology 4:92)。Ｈ－１ＰＶはまた腫瘍選択性示し、これは、細胞複製および転写因子の利用性、腫瘍細胞でＮＳ１の機能的制御に関与するが、正常細胞ではしない代謝経路のＮＳ１パルボウイルスタンパク質および活性化と相互作用する細胞タンパク質の過発現によると考えられる。Ｈ－１ＰＶの無毒の性質により、野生型株がしばしば利用され、遺伝子操作による弱毒化の必要性が否定される(Angelova et al. (2015))。
ヒト神経膠腫細胞の腫瘍溶解性Ｈ－１ＰＶ感染は、効率的な殺細胞をもたらし、高悪性度神経膠腫幹細胞モデルも、溶解性Ｈ－１ＰＶ感染に許容的であったことが研究により示された。殺神経膠腫細胞増強は、ウイルスが腫瘍細胞照射直後に適用されたとき観察され、このプロトコールが切除不可能反復性神経膠芽腫に有用であり得ることが示される(Angelova et al. (2017))。脳内または全身Ｈ－１ＰＶ注射は、同所性ＲＧ－２腫瘍を有する免疫適格性ラットおよびヒトＵ８７神経膠腫を移植した免疫不全動物で、毒性副作用なく、神経膠腫の退縮をもたらした(Angelova et al. (2015))。高感染性を有し、ヒト形質転換細胞株で拡散している適応度バリアントであるＤｅｌ Ｈ－１ＰＶは、膵臓癌および子宮頸癌異種移植モデルでインビボで腫瘍溶解性効果を示した(Geiss et al. (2017) Viruses 9, 301)。Ｈ－１ＰＶはまた５つのヒト骨肉腫細胞株(ＣＡＬ ７２、Ｈ－ＯＳ、ＭＧ－６３、ＳａＯＳ－２、Ｕ－２ＯＳ)のパネル(Geiss et al. (2017) Viruses 9, 301)およびヒト黒色腫細胞(ＳＫ２９－Ｍｅｌ－１、ＳＫ２９－Ｍｅｌ－１.２２)(Moehler et al. (2014) Frontiers in Oncology 4:92)に対して、腫瘍溶解性活性を示した。他の研究で、子宮頸癌異種移植片担持ヌードラットは、Ｈ－１ＰＶでの処置後用量依存的腫瘍増殖停止および退縮を示した(Angelova et al. (2015))。Ｈ－１ＰＶの腫瘍内および静脈内投与はまた免疫不全マウスにおけるヒト乳癌異種移植片の顕著な増殖抑制も示した(Angelova et al. (2015))。ヒト胃癌またはヒトバーキットリンパ腫担持マウスの腫瘍内Ｈ－１ＰＶ注射は、腫瘍退縮および増殖抑制をもたらした(Angelova et al. (2015))。
反復性多形神経膠芽腫患者における腫瘍溶解性Ｈ－１ＰＶ(ParvOryx01)のフェーズＩ／IIａ臨床試験(臨床試験ＮＣＴ０１３０１４３０)は、腫瘍内または静脈内注射で無進行生存、臨床的安全性および患者忍容性を示した(Angelova et al. (2017); Geiss et al. (2017) Viruses 9, 301; Geletneky et al. (2017) Mol. Ther. 25(12):2620-2634)。この治験は、Ｈ－１ＰＶが用量依存的様式で血液－脳障壁を通過し、優勢に、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球による白血球浸潤ならびに局所処置腫瘍におけるパーフォリン、グランザイムＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＣＤ２５およびＣＤ４０Ｌを含む免疫細胞活性化の数種のマーカーの検出により特徴づけられる免疫原性抗腫瘍応答を確立したことを示した(Geletneky et al. (2017) Mol. Ther. 25(12):2620-2634)。
Ｈ－１ＰＶはまたゲムシタビンに耐性のものを含む、インビトロでの高度に攻撃的膵管腺癌(ＰＤＡＣ)細胞の効率的殺滅を示し、Ｈ－１ＰＶの腫瘍内注射は、ＰＤＡＣの同所性ラットモデルの腫瘍退縮および動物生存延長をもたらした(Angelova et al. (2017); Angelova et al. (2015))。選択的腫瘍ターゲティングおよび毒性欠如を含む類似の結果は、免疫不全ヌードラットＰＤＡＣモデルで示された(Angelova et al. (2015))。Ｈ－１ＰＶと細胞増殖抑制剤(シスプラチン、ビンクリスチン)または標的化剤(スニチニブ)の組み合わせは、ヒト黒色腫細胞のアポトーシスの相乗的誘導をもたらした(Moehler et al. (2014))。Ｈ－１ＰＶとＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸の組み合わせは、頸部および膵臓癌細胞に対する相乗的細胞毒性を示し(Angelova et al. (2017))、一方ゲムシタビンの治療効率は、２段階プロトコールでＨ－１ＰＶと組み合わせたとき、改善した(Angelova et al. (2015))。他のウイルスと同様、Ｈ－１ＰＶを、抗癌分子を発現するよう操作し得る。例えば、研究により、Apoptinを発現するパルボウイルス－Ｈ１由来ベクターは、野生型Ｈ－１ＰＶよりアポトーシス誘導能が大きいことが示されている(Geiss et al. (2017))。
ｉ. コクサッキーウイルス
コクサッキーウイルス(ＣＶ)は、エンテロウイルス属およびピコルナウイルス科に属し、宿主細胞ゲノムに統合されないプラス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムである。ＣＶは、マウスにおける効果に基づきＡ群およびＢ群に分類され、ヒトで軽度上部呼吸器感染をもたらし得る(Bradley et al. (2014) Oncolytic Virotheraphy 3:47-55)。腫瘍溶解性ウイルス療法について一般に調査されているコクサッキーウイルスは、弱毒化コクサッキーウイルスＢ３(ＣＶ－Ｂ３)、ＣＶ－Ｂ４、ＣＶ－Ａ９およびＣＶ－Ａ２１を含む(Yla-Pelto et al. (2016) Viruses 8, 57)。ＣＶ－Ａ２１は、黒色腫、乳房、結腸、子宮内膜、頭頚部、膵臓および肺癌ならびに多発性骨髄腫および悪性神経膠腫を含む腫瘍細胞ではるかに高レベルで発現される、ＩＣＡＭ－１(またはＣＤ５４)およびＤＡＦ(またはＣＤ５５)受容体を介して細胞に感染する。ＣＶ－Ａ２１は、悪性骨髄腫、黒色腫および前立腺、肺、頭頸部および乳癌細胞株に対するインビトロでの前臨床抗癌活性およびインビボでヒト黒色腫異種移植片担持マウスならびにマウスにおける原発乳癌腫瘍およびその転移に対する有望性が示された(Yla-Pelto et al. (2016); Bradley et al. (2014))。CAVATAKTMとしても知られるＣＶ－Ａ２１の誘導体、ＣＶ－Ａ２１－ＤＡＦｖが、ＤＡＦ発現、ＩＣＡＭ－１陰性横紋筋肉腫(ＲＤ)細胞でＣＶ－Ａ２１の連続継代により野生型Kuykendall株で産生され、親株と比較して腫瘍溶解性質が増強されたことが示された。CAVATAKTMはＤＡＦ受容体にのみ結合し、これが、癌細胞に対する向性増強に貢献し得る(Yla-Pelto et al. (2016))。
ＣＶ－Ａ２１はまた塩酸ドキソルビシンとの組み合わせでも研究されており、ヒト乳房、結腸直腸および膵臓癌細胞株ならびにヒト乳癌の異種移植マウスモデルに対する何れかの単独処置と比較して増強された腫瘍溶解性効率を示した(Yla-Pelto et al. (2016))。集団の相当部分がＣＶに対する中和抗体を既に獲得していたため、ＣＶ－Ａ２１治療を、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤と組み合わせ(Bradley et al. (2014))、媒体細胞を介する送達の良好な候補である。
臨床試験は、ステージIIIｃまたはIV悪性黒色腫の患者におけるCAVATAKTM(ＮＣＴ０１６３６８８２；ＮＣＴ００４３８００９；ＮＣＴ０１２２７５５１)および非筋肉侵襲性膀胱癌を有する患者にけるCAVATAKTM単独または低用量マイトマイシンＣと組み合わせ(ＮＣＴ０２３１６１７１)の使用を調査している。臨床試験はまた黒色腫、乳房および前立腺癌を含む固形腫瘍の処置におけるＣＶ－Ａ２１の静脈内投与の効果も試験している(ＮＣＴ００６３６５５８)。継続中の臨床試験は、非小細胞肺癌を有する患者の処置のためのCAVATAKTM単独またはペムブロリズマブとの組み合わせ(ＮＣＴ０２８２４９６５、ＮＣＴ０２０４３６６５)および膀胱癌(ＮＣＴ０２０４３６６５)；ぶどう膜黒色腫および肝臓転移患者(ＮＣＴ０３４０８５８７)および進行型黒色腫を有する患者(ＮＣＴ０２３０７１４９)におけるイピリムマブと組み合わせたCAVATAKTM；および進行型黒色腫を有する患者におけるペムブロリズマブと組み合わせたCAVATAKTM(ＮＣＴ０２５６５９９２)の調査を含む。
ｊ. セネカバレーウイルス
セネカバレーウイルス(ＳＶＶ)は、ピコルナウイルス科内のセネカウイルス属のメンバーであり、プラス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、神経芽腫、横紋筋肉腫、髄芽腫、ウィルムス腫瘍、神経膠芽腫および小細胞肺癌を含む神経内分泌癌に選択的である(Miles et al. (2017) J. Clin. Invest. 127(8):2957-2967; Qian et al. (2017) J. Virol. 91(16):e00823-17; Burke, M. J. (2016) Oncolytic Virotherapy 5:81-89)。研究により、しばしば正常細胞と比較して腫瘍細胞の表面に発現される炭疽毒素受容体１(ＡＮＴＸＲ１)がＳＶＶの受容体として同定されているが、先の研究はまたシアル酸が小児科神経膠腫モデルにおけるＳＶＶ受容体の成分であり得ることも示している(Miles et al. (2017))。ＳＶＶ単離株００１(ＳＶＶ－００１)は、静脈内投与後固形腫瘍を標的および浸透できる、強力な腫瘍溶解性ウイルスであり、挿入変異欠如ならびに癌細胞に対する選択的向性およびヒトおよび動物における非病原性により、魅力的である。さらに、ヒトにおける先の暴露は稀であり、免疫が先在する割合は低い(Burke, M. J. (2016) Oncolytic Virotherapy 5:81-89)。
ＳＶＶ－００１は、小細胞肺癌、副腎皮質癌、神経芽腫、横紋筋肉腫およびユーイング肉腫細胞株に対して有望なインビトロ活性を示し、小児科ＧＢＭ、髄芽腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫および神経芽腫の同所性異種移植マウスモデルにおける有望なインビボ活性を示す(Burke (2016))。Neotropix(登録商標)により開発された腫瘍溶解性ＳＶＶ－００１であるＮＴＸ－０１０は、再発／難治性固形腫瘍を有する小児患者の、単独でまたはシクロホスファミドと組み合わせての処置に対するが、中和抗体獲得により、その治療有効性が制限された(Burke et al. (2015) Pediatr. Blood Cancer 62(5):743-750)。臨床試験は、神経内分泌特性を有する固形腫瘍におけるＳＶ－００１(ＮＣＴ００３１４９２５)、再発または難治性神経芽腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、副腎皮質癌腫またはカルチノイド腫瘍を有する患者におけるシクロホスファミドと組み合わせたＮＴＸ－０１０／ＳＶＶ－００１(ＮＣＴ０１０４８８９２)および小細胞肺癌を有する患者における化学療法後のＮＴＸ－０１０／ＳＶＶ－００１(ＮＣＴ０１０１７６０１)の使用の試験を含む。
Ｈ. 医薬品、組成物および製剤
ここに提供されるのは、ここに提供される免疫刺激性細菌の何れかおよび薬学的に許容される賦形剤または添加物を含む、医薬組成物および製剤を製造する方法である。医薬組成物は、腫瘍または癌などの過増殖性疾患または状態などの疾患の処置に使用され得る。免疫刺激性細菌は、単剤療法で投与しても、さらなる薬剤または処置との組み合わせ治療で投与してもよい。組成物は、単回投与または複数回投与のために製剤化され得る。薬剤は、直接投与のために製剤化され得る。組成物は、液体または乾燥製剤として提供され得る。
１. 製造
ａ. 細胞バンク製造
ここに記載する免疫療法の活性成分が操作した自己複製細菌からなるため、選択組成物は、長期保存のためにおよび原薬製造のための出発物質として維持される、一連の細胞バンクに拡張される。細胞バンクは、連邦規制基準(ＣＦＲ)２１パート２１１または他の関連規制当局に従う適切な製造施設における医薬品適正製造基準(ｃＧＭＰ)下実施される。免疫療法の活性剤が生存細菌であるため、ここに記載される製品は、定義により、非無菌であり、末期的に滅菌されてはならない。汚染を防止するために、製造過程をとおして無菌方法が確実に使用されるよう、注意を払うべきである。すなわち、全ての原材料および溶液は、製造過程での使用前に滅菌されなければならない。
マスター細胞バンク(ＭＣＢ)が、汚染物が出発物質に存在しないことを確実にするため、選択した細菌株の一連の連続単一コロニー単離により産生される。無菌培地(複合培地、例えば、ＬＢまたはＭＳＢＢまたは定義された培地、例えば、適切な栄養素が添加されたＭ９であり得る)を含む無菌培養容器に、単一の十分に単離された細菌コロニーを接種し、細菌を、例えば、３７℃で振盪しながらのインキュベーションにより、複製させる。次いで、細菌を１以上の凍結防止剤を含む溶液中の懸濁液により凍結保存する。
凍結防止剤の例は、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリンなどのタンパク質；単糖(ガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど)およびその非還元誘導体(例えば、メチルグルコシド)、二糖(トレハロース、スクロースなど)、シクロデキストリンおよび多糖(ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど)を含む炭水化物；アミノ酸(グルタミン酸、グリシン、アラニン、アルギニンまたはヒスチジン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなど)；ベタインなどのメチルアミン；３価または高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどのポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；界面活性剤、例えば、プルロニック；またはジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)などの有機硫黄化合物およびこれらの組み合わせを含む。凍結保存溶液は、塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム)および／またはリン酸ナトリウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(ＴＲＩＳ)、４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジンエタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)および当業者に知られる他のこのような緩衝剤などの緩衝剤も含み得る溶液に、１以上の凍結防止剤を含み得る。
凍結保存溶液における細菌の懸濁液は、１以上の濃縮凍結防止剤を、凍結および解凍過程中細菌の生存能を保持する最終濃度を達成するために培養物質に加えることにより(例えば、最終濃度０.５％～２０％のグリセロール)または細菌を(例えば、遠心分離により)採取し、適切な最終濃度の凍結防止剤を含む凍結保護溶液に懸濁することにより達成される。次いで、凍結保存溶液における細菌の懸濁液を、凍結条件下、閉鎖完全性の維持ができる容器閉鎖系(例えば、ブチルストッパーおよびクリンプシール)を備えた適切な無菌バイアル(プラスチックまたはガラス)に充填する。次いで、マスター細胞バンクのバイアルを凍結させ得る(速度制御フリーザーの手段によりゆっくりまたは直接フリーザーに入れることにより急速に)。次いで、ＭＣＢを、長期生存能を維持する温度で凍結させる(例えば、－６０℃以下)。解凍マスター細胞バンク物質は、適切な当局の規制に従い、同一性、純度および活性を確認するために徹底的に特徴づけされる。
作業細胞バンク(ＷＣＢ)は、マスター細胞バンクとほぼ同じ方法で産生されるが、出発物質はＭＣＢ由来である。ＭＣＢ物質を、上記のとおり、無菌培地含有発酵容器に直接導入し、拡張させ得る。次いで、細菌を凍結保存溶液に懸濁し、容器に充填し、密封し、－２０℃以下で凍結する。複数のＷＣＢをＭＣＢ物質から製造でき、ＷＣＢ物質を使用して、付加的細胞バンク(例えば、製造業者の作業細胞バンクＭＷＣＢ)を製造し得る。ＷＣＢは凍結保存され、同一性、純度および活性を確認するために特徴づけされる。ＷＣＢ物質は、一般に操作した細菌などのバイオ医薬品の原薬の産生に使用される出発物質である。
ｂ. 原薬製造
原薬は、上記のとおりｃＧＭＰ下の無菌過程を使用して、製造される。作業細胞バンク物質は、一般にｃＧＭＰ下の原薬の製造のための出発物質として使用されるが、しかしながら、他の細胞バンク(例えば、ＭＣＢまたはＭＷＣＢ)も使用され得る。無菌処理は、細菌細胞ベースの治療剤を含む、全細胞治療剤の産生に使用される。細胞バンクからの細菌は、発酵により拡張される；これは、前培養(例えば、シェーカーフラスコ)の産生または発酵槽の直接接種により達成され得る。発酵は、一回用使い捨てまたは再使用可能であり得る無菌バイオリアクターまたはフラスコで達成される。細菌を、濃縮(例えば、遠心分離、連続的遠心分離またはタンジェント流濾過)により採取する。濃縮細菌を、培地の緩衝液への交換(例えば、ダイアフィルトレーションによる)により、培地成分および細菌代謝物から精製する。バルク製剤を、中間体(例えば、凍結または乾燥により)として製剤化および保存しまたは製剤に直接加工する。原薬を、同一性、強度、純度、効力および品質について試験する。
ｃ. 製剤製造
製剤は、最終容器に含まれる活性物質の最終製剤として定義される。製剤は、ｃＧＭＰ下、無菌過程を使用して製造される。製剤は原薬から産生される。原薬を必要に応じて解凍または再構成し、次いで適切な標的強度で製剤化する。製剤の活性成分が生存する操作した細菌であるため、強度は、懸濁液内に含まれるCFU数により決定される。バルク製品を、下記保存および使用に適切な最終製剤に記載する。容器を充填し、容器閉鎖系で密封し、製剤をラベルする。製剤を、安定性の保持に適切な温度で保存し、同一性、強度、純度、効力および品質について試験し、特定の合否基準を満たせば、ヒト使用のために発売される。
２. 組成物
薬学的に許容される組成物は、動物およびヒトにおける使用のために一般に認識されている薬局方に従い、調製される、規制当局または他の当局の承認の観点で調製される。組成物は、溶液、懸濁液、粉末または持続的放出製剤として調製され得る。一般に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して、医薬組成物に製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照)。製剤は、投与方法に適するべきである。
組成物を、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内注射、皮下、腫瘍内、硬膜外、経鼻、経口、膣、直腸、局所、局所、耳、吸入、バッカル(例えば、舌下)および経皮投与または何らかの投与経路を含む、当業者に知られるあらゆる経路による投与のために製剤化され得る。他の投与方法も考慮される。投与は、処置部位に応じて局所、局所または全身であり得る。処置を必要とする領域への局所投与は、例えば、手術中の局所点滴、例えば、手術後の創傷包帯材と関連した局所適用、注射、カテーテルの手段、坐薬の手段またはインプラントの手段を含むが、これらに限定されない。組成物はまた他の生物学的活性剤と、逐次的に、間欠的にまたは同じ組成物でも投与され得る。投与はまた制御放出製剤およびポンプの手段によるなどデバイス制御放出を含む、制御放出系を含み得る。
ある症例の最も適当な経路は、疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度および使用される特定の組成物などの多様な因子に依存する。医薬組成物は、各投与経路に適する剤形に製剤され得る。特に、組成物は、全身、局所腹腔内、経口または直接投与のための何らかの適当な医薬製剤に製剤化され得る。例えば、組成物は、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内投与のために製剤化され得る。投与方法は、活性剤が、抗原性および免疫原性応答を介する免疫学的介入などの分解過程に曝されるのを低減するために用い得る。このような方法の例は、処置部位への局所投与または連続的点滴を含む。
免疫刺激性細菌は、経口投与用溶液、懸濁液、錠剤、分散可能錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続的放出製剤またはエリキシルならびに経皮パッチ製剤乾燥粉末吸入器などの適当な医薬製剤に製剤化され得る。一般に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して、医薬組成物に製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照)。一般に、製剤の方法は、投与経路による。組成物を、乾燥(凍結乾燥または他のガラス化の形態)または液体形態に製剤化し得る。組成物が乾燥形態で提供されるならば、適切な緩衝液、例えば、無菌食塩水溶液の添加により、使用直前に再構成され得る。
３. 製剤
ａ. 液体、注射、エマルジョン
製剤は、一般に投与経路に適するものとされる。一般に皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内への注射または点滴により特徴づけられる非経腸投与は、ここで考慮される。非経腸投与のための細菌の調製物は、すぐに注射できる懸濁液(直接投与)または使用前解凍する凍結懸濁液、使用直前再懸濁溶液に加えるための、凍結乾燥粉末などの乾燥可溶性製品およびエマルジョンを含む。凍結乾燥製剤などの乾燥させた熱安定性製剤は、後の使用のために単位用量を保存するために使用され得る。
医薬製剤は、凍結液体形態、例えば懸濁液であり得る。凍結液体形態で提供されるならば、製剤は、使用前解凍し、治療有効濃度まで希釈する濃縮製剤として提供され得る。
医薬製剤はまた使用のための解凍または希釈を必要としない剤形でも提供され得る。このような液体製剤は、必要に応じて、懸濁化剤(例えば、ソルビトール、セルロース誘導体または水素化食用脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステルまたは分画植物油)；および微生物治療剤での使用に適する防腐剤などの薬学的に許容される添加物と共に、慣用の手段により調製され得る。医薬製剤は、使用前水または他の無菌適当な媒体での再構築のための、凍結乾燥または噴霧乾燥などの乾燥形態で提示され得る。
適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロースまたはグリセロールである。溶液は、水性でも非水性でもよい。静脈内投与するならば、適当な担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)および静脈内水和に使用される他の緩衝化溶液を含む。グルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなどの濃化剤を含む腫瘍内投与溶液について、油性エマルジョンおよびそれらの混合物が、注入物質の局在化維持に適切であり得る。
医薬組成物は、担体または他の賦形剤を含み得る。例えば、ここに提供される医薬組成物は、希釈剤、アジュバント、抗接着剤、結合剤、コーティング、増量剤、風味剤、着色剤、滑沢剤、流動促進剤、防腐剤、界面活性剤または吸着剤およびそれらの組み合わせまたは修飾治療細菌の投与に用いる媒体の何れか１以上を含み得る。例えば、非経腸製剤に使用される薬学的に許容される担体または賦形剤は、水性媒体、非水性媒体、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。液体製剤を含む製剤は、薬学的に許容される添加物または賦形剤を用いて、慣用の手段により調製され得る。
医薬組成物は、組成物の投与に用いる希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体などの担体を含み得る。適当な医薬担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martinに記載される。このような組成物は、一般に精製形態または部分的精製形態の、治療有効量の化合物または薬剤を、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適当な量の担体と共に含む。このような医薬担体は、水および石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱油およびゴマ油を含む油などの無菌液体であり得る。水は典型的担体である。食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射用溶液の液体担体として用い得る。組成物は、活性成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸水素カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースなどの希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルクなどの滑沢剤；およびデンプン、アカシアガムなどの天然ガム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に知られる他のこのような結合剤などの結合剤を含み得る。適当な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールを含む。例えば、適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。組成物は、所望であれば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度エンハンサーおよび例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアートおよびシクロデキストリンなどの他のこのような薬剤など、他の小量の非毒性補助物質も含み得る。
非経腸製剤で使用される薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張デキストロース注射、無菌水注射、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射を含む。非水性非経腸媒体は、植物起源、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびピーナツ油の固定油を含む。等張剤は、塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。緩衝液は、リン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、例えば、ポリソルベート８０(ＴＷＥＥＮ ８０)などのポリソルベートを含む。ＥＤＴＡなどの金属イオンの封鎖またはキレート剤を包含させ得る。医薬担体はまた水混和性媒体のためのポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含む。抗微生物ではない防腐剤を包含させ得る。
医薬組成物はまた湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度エンハンサーおよび例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアートおよびシクロデキストリンなどの他のこのような薬剤などの他の微量の非毒性補助物質も含み得る。一定レベルの投与量が維持される(例えば、米国特許３,７１０,７９５参照)のような徐放または持続的放出系のインプラントもまた、ここで考慮される。このような非経腸組成物に含まれる活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質ならびに化合物の活性および対象の必要性に高度に依存する。
ｂ. 乾燥させた熱安定性製剤
細菌は、乾燥させ得る。凍結乾燥または噴霧乾燥粉末およびガラス固化体などの乾燥させた熱安定性製剤を、溶液、エマルジョンおよび他の混合物としての投与のために再構成し得る。乾燥させた熱安定性製剤は、上記懸濁液などの液体製剤の何れかから調製し得る。医薬製剤は、使用前に水または他の適当な媒体で再構築するための凍結乾燥またはガラス化形態で提供され得る。
熱安定な製剤を、乾燥化合物を無菌溶液で再構成することにより、投与用に調製し得る。溶液は、活性物質または粉末から調製した再構成溶液の安定性または他の薬理学的特質を改善する賦形剤を含み得る。熱安定な製剤は、クエン酸、リン酸ナトリウムまたはカリウムなどの適当な緩衝液または当業者に知られる他のこのような緩衝液に、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適当な薬剤などの賦形剤を溶解することにより、調製する。次いで、原薬を得られた混合物に加え、混合されるまで撹拌する。得られた混合物を、乾燥用バイアルに配分する。各バイアルは、バイアルあたり１×１０５～１×１０１１CFUを含む単回投与量を含む。乾燥後、製品バイアルを、密封バイアルに湿気または汚染物が入るのを阻止する容器閉鎖系で密封する。乾燥製品を、－２０℃、４℃または室温などの適切な条件下に保存できる。水または緩衝溶液でのこの乾燥製剤の再構築により、非経腸投与に使用するための製剤が提供される。厳密な量は、処置適応症および選択化合物による。このような量は、経験的に決定され得る。
４. 他の投与経路用組成物
処置される状態に依存して、非経腸に加えて、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与などの他の投与経路も、ここで考慮される。上記懸濁液および粉末は経口投与できまたは経口投与のために再構成され得る。直腸投与のための医薬剤形は、全身作用のための直腸坐薬、カプセルおよび錠剤およびゲルカプセルである。直腸坐薬は、体温で融解または軟化し、１以上の薬理学的または治療活性成分を放出する、直腸への挿入のための固体である。直腸坐薬における薬学的に許容される物質は、基剤または媒体および融点を上げる薬剤である。基剤の例は、カカオバター(カカオオイル)、グリセリン－ゼラチン、カーボワックス(ポリオキシエチレングリコール)および脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリドの適切な混合物を含む。種々の基剤の組み合わせが使用され得る。坐薬の融点を上げる薬剤は、鯨蝋および蝋を含む。直腸坐薬は、圧縮方法または鋳造により調製され得る。直腸坐薬の典型的重量は、約２～３gmである。直腸投与用錠剤およびカプセルは、経口投与用製剤と同じ薬学的に許容される物質および同じ方法を使用して、製造される。直腸投与に適する製剤は、単位用量坐薬として提供され得る。これらを、原薬と１以上の慣用の固体担体、例えば、カカオバターを混合し、次いで、得られた混合物を成型することにより調製し得る。
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化メイズデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容される賦形剤と、慣用の手段により調製された錠剤またはカプセルの形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によりコーティングされ得る。
バッカル(舌下)投与に適する製剤は、例えば、風味付けされた基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントに活性化合物を含むロゼンジ；およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤に化合物を含むトローチを含む。
局所混合物は、局所および全身投与について記載したとおり調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであってよく、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、フォーム、エアロゾル、灌注、スプレー、坐薬、バンデージ、経皮パッチまたは局所投与に適する何らかの他の製剤として製剤され得る。
組成物は、吸入によるなど局所適用のためのエアロゾルとして製剤化され得る(例えば、肺疾患処置に有用なステロイドの送達のためのエアロゾルを記載する米国特許４,０４４,１２６；４,４１４,２０９および４,３６４,９２３参照)。呼吸管への投与のためのこれらの製剤は、単独でまたはラクトースなどの不活性担体と組み合わせて、エアロゾルまたはネブライザー用溶液または吹送法のための超微粒子粉末の形であり得る。このような場合、製剤の粒子は、一般に５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径を有する。
化合物は、ゲル、クリームおよびローションの形で、皮膚および眼におけるなどの粘膜への局所適用および眼適用または大槽内もしくは髄腔内適用のためなどに、局所または外用適用のために製剤化され得る。局所投与は、経皮送達および眼もしくは粘膜への投与または吸入治療が意図される。活性化合物単独または他の薬学的に許容される賦形剤との組み合わせの経鼻溶液も投与され得る。
経皮投与に適する製剤が提供される。レシピエントの表皮と長期にわたり密接な接触の維持に適合する別個のパッチなどの何らかの適当な形態で提供され得る。このようなパッチは、活性化合物に関して、例えば、０.１～０.２Ｍ濃度の所望により緩衝化された水溶液に活性化合物を含む。経皮投与に適する製剤は、イオン泳動によっても送達でき(例えば、Tyle, P, (1986) Pharmaceutical Research 3(6):318-326)、一般に活性化合物所望により緩衝化された水溶液の形をとる。
医薬組成物はまた制御放出製剤および／または送達デバイスによっても投与され得る(例えば、米国特許３,５３６,８０９；３,５９８,１２３；３,６３０,２００；３,８４５,７７０；３,９１６,８９９；４,００８,７１９；４,７６９,０２７；５,０５９,５９５；５,０７３,５４３；５,１２０,５４８；５,５９１,７６７；５,６３９,４７６；５,６７４,５３３および５,７３３,５６６参照)。
５. 用法・用量
組成物は、単回投与または複数回投与のための医薬組成物として製剤化され得る。免疫刺激性細菌は、処置する患者に望ましくない副作用なく、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれ得る。例えば、薬学的活性化合物の濃度は、注射が所望の薬理学的効果を生じるための有効量を提供するよう調節される。治療有効濃度は、ここに記載するまたは当分野で知られるアッセイの使用によるなど、既知インビトロおよびインビボ系における免疫刺激性細菌の試験により、経験的に決定され得る。例えば、標準的臨床的技術が用いられ得る。インビトロアッセイおよび動物モデルを、最適投与量範囲の決定の補助に用い得る。経験的に決定され得る厳密な用量は、患者または動物の年齢、体重、体表面積および状態、特定の免疫刺激性細菌投与、投与経路、処置する疾患のタイプおよび疾患の重症度に依存し得る。
それ故に、厳密な投与量および処置期間は、処置する疾患の関数であり、既知試験プロトコールを使用して、またはインビボまたはインビトロ試験データの外挿により経験的に決定され得ることは理解される。濃度および投与量の値はまた軽減すべき状態の重症度により変わり得る。ある特定の対象について、具体的投与量レジメンは個々の必要性により時間とともにおよび組成物を投与するまたは投与を監督する者の専門的判断により調節されるべきであり、ここに示す濃度範囲は単なる例示であり、それを含む組成物および組み合わせの範囲または使用を限定する意図はないことはさらに理解されるべきである。組成物は、時間毎に、毎日、毎週、毎日、または毎年に１回投与され得る。一般に、投与量レジメンは、毒性が制限されるよう選択される。担当医は、毒性または骨髄、肝臓または腎臓または他の組織機能不全により治療をやめる、中断するまたは低用量に調節する方法および時機を知っていることは注意すべきである。逆に、担当医は、臨床応答が適正でないならば、処置を高レベルにする方法および時機を知っているべきである(毒性副作用を起こさないようにして)。
免疫刺激性細菌は、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で組成物に包含される。例えば、量は、癌などの過増殖性疾患または状態の処置に治療効果を達成するものである。
薬学的および治療活性化合物およびその誘導体は、一般に複数の単位剤形または複数の剤形に製剤され、投与される。各単位用量は、必要な医薬担体、媒体または希釈剤と共に、所望の治療効果を生ずるのに十分な予定された量の治療活性化合物を含む。単位剤形は、適当な量の化合物または薬学的に許容されるその誘導体を含む錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、非経腸懸濁液および経口溶液または懸濁液および水中油型エマルジョンを含むが、これらに限定されない。単位剤形は、バイアル、アンプルおよびシリンジに入れられまたは個々に包装された錠剤またはカプセルであり得る。単位剤形は、その一部または複数を投与され得る。複数の剤形は、分離された単位剤形で投与される単一容器に包装された複数の同一単位剤形である。複数の剤形の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセルのボトルまたはパイントもしくはガロンのボトルを含む。それ故に、複数の剤形は、包装で分けられていない複数の単位用量を含む。一般に、０.００５％～１００％の範囲の活性成分を含み、残りは非毒性担体である剤形または組成物が調製され得る。医薬組成物は、各投与経路に適する剤形に製剤され得る。
単位用量非経腸製剤は、アンプル、バイアルまたは針付きシリンジに包装される。薬学的活性化合物を含む液体溶液または再構成粉末製剤の体積は、処置する疾患および包装に選択される特定の製品の関数である。非経腸投与のための全製剤は、当分野で知られ、実施されているとおり、無菌でなければならない。
記載するとおり、ここで提供される組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内注射、硬膜外、膣、直腸、局所、耳、経皮投与または何らかの投与経路を含むが、これらに限定されない当業者に知られるあらゆる経路のために製剤化され得る。このような経路に適する製剤は当業者に知られる。組成物はまた他の生物学的活性剤と、逐次的に、間欠的にまたは同じ組成物で投与され得る。
医薬組成物は、制御放出製剤および／または送達デバイスにより投与され得る(例えば、米国特許３,５３６,８０９；３,５９８,１２３；３,６３０,２００；３,８４５,７７０；３,８４７,７７０；３,９１６,８９９；４,００８,７１９；４,６８７,６６０；４,７６９,０２７；５,０５９,５９５；５,０７３,５４３；５,１２０,５４８；５,３５４,５５６；５,５９１,７６７；５,６３９,４７６；５,６７４,５３３および５,７３３,５６６参照)。種々の送達系が知られ、選択組成物の投与に使用でき、ここでの使用に意図され、このような粒子は容易に製造され得る。
６. 包装および製品
包装材料、何らかのここに提供される医薬組成物および組成物がここに記載する疾患または状態の処置に使用されるものであることを示すラベルを含む製品もまた提供される。例えば、ラベルは、処置が腫瘍または癌に対することを示し得る。
ここに記載する免疫刺激性細菌および他の治療剤の組み合わせも、製品に包装され得る。一例として、製品は、免疫刺激性細菌を含む医薬組成物組成物を含み、さらなる薬剤または処置剤を含まない。他の例として、製品は、異なる抗癌剤などの他のさらなる治療剤を含み得る。この例では、これら薬剤は、製品として包装するために、一括してまたは個別に提供され得る。
ここに提供される製品は、包装材料を含む。医薬製品の包装に使用される包装材料は、当業者に周知である。例えば、各々全体として本明細書に包含させる、米国特許５,３２３,９０７、５,０５２,５５８および５,０３３,２５２参照。医薬包装材料の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、シリンジ、ボトルおよび選択した製剤および意図される投与方法および処置に適するあらゆる包装材料を含むが、これらに限定されない。製品の例は、一チャンバーおよびデュアルチャンバー容器を含む容器である。コンテナは、チューブ、ボトルおよびシリンジを含むが、これらに限定されない。コンテナは、さらに静脈内投与用の針を含み得る。
パッケージの選択は、薬剤およびこのような組成物を一緒にまたは別々に包装するかによる。一般に、包装は、その中に含まれる組成物と非反応性である。他の例として、成分の一部を、混合物として包装し得る。他の例として、全成分を個別に包装し得る。故に、例えば、成分を、投与直前に混合することにより、直接一括して投与され得る個別の組成物として包装し得る。あるいは、成分は、個別に投与するための個別の組成物として包装され得る。
製品を含む選択組成物は、キットとしても提要され得る。キットは、ここに記載する医薬組成物および製品として提供される投与用物品を含み得る。組成物は、投与のための物品に含まれてよくまたは後に加えるため個別に提供されてよい。キットは、所望により、投与量、投与レジメンおよび投与方法の指示を含む、適用の指示を含む。キットはまたここに記載する医薬組成物および診断用の物品も含み得る。
Ｉ. 処置方法および使用
ここに提供される方法は、免疫刺激性細菌を投与または使用する方法であって、癌などのこのような細菌の投与により症状が好転または軽減され得る疾患または状態を有する対象を処置するための方法を提供する。具体的例において、疾患または状態は腫瘍または癌である。さらに、抗癌剤または抗ヒアルロン薬剤などの処置のための１以上の付加的薬剤との組み合わせ治療の方法もまた提供される。細菌は、腫瘍内、静脈内、直腸、経口、筋肉内、粘膜および他の経路などの、非経腸、全身、外用および局所を含むが、これらに限定されないあらゆる適当な経路におり投与され得る。それぞれに適する製剤が提供される。当業者は、適当なレジメンおよび用量を確立でき、経路を選択できる。
１. 腫瘍
ここに提供される免疫刺激性細菌、組み合わせ、使用および方法は、癌を含む全タイプの腫瘍、特に肺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌および前立腺癌を含む固形腫瘍の処置に適用可能である。方法はまたは血液癌にも使用され得る。
ここに提供される使用および方法による処置に付される腫瘍および癌は、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、膵臓、消化管、中枢および末梢神経系、腎臓系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、関節を含む結合組織系、脂肪組織および血管壁を含む循環系起源のものを含むが、これらに限定されない。ここに提供される免疫刺激性細菌で処置され得る腫瘍の例は、癌腫、神経膠腫、肉腫(脂肪肉腫を含む)、腺癌、腺肉腫および腺腫を含む。このような腫瘍は、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頸または肝臓を含む、事実上体の全部分で生じ得る。
骨格系の腫瘍は、例えば、肉腫および芽腫、例えば骨肉腫、軟骨肉腫および軟骨芽細胞腫を含む。筋肉および心臓腫瘍は、骨格筋および平滑筋両者の腫瘍、例えば、平滑筋腫(平滑筋の良性腫瘍)、平滑筋肉腫、横紋筋腫(骨格筋の良性腫瘍)、横紋筋肉腫および心臓肉腫を含む。消化管の腫瘍は、例えば、口腔、食道、胃、小腸、結腸の腫瘍および結腸直腸腫瘍ならびに唾液腺、肝臓、膵臓および胆管などの消化器分泌臓器の腫瘍を含む。中枢神経系の腫瘍は、脳、網膜および脊髄の腫瘍を含み、また関連結合組織、骨、血管または神経組織に由来し得る。末梢神経系の腫瘍の処置も意図される。末梢神経系の腫瘍は、悪性末梢神経鞘腫瘍を含む。腎臓系の腫瘍は、腎臓のもの、例えば、腎臓細胞癌腫ならびに輸尿管および膀胱の腫瘍を含む。生殖器系の腫瘍は、子宮頸、子宮、卵巣、前立腺、精巣および関連分泌腺の腫瘍を含む。免疫系の腫瘍はリンパ腫、例えば、ホジキンおよび非ホジキンを含む、血液ベースのおよび固形腫瘍両者を含む。呼吸器系の腫瘍は、鼻孔、気管支および肺の腫瘍を含む。乳房の腫瘍は、例えば、小葉癌および腺管癌両者を含む。
ここに提供される免疫刺激性細菌および方法で処理され得る腫瘍の他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、消化器および腎臓癌腫および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫(例えば多形神経膠芽腫)および平滑筋肉腫を含む。ここに提供するとおり処置され得る他の癌の例は、リンパ腫、芽腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫および白血病またはリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。このような癌の例は、血液系腫瘍、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫(バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆体細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、成熟を伴うＡＭＬ、未分化ＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む、急性骨髄性白血病などの骨髄腫瘍、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害；神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫および網膜芽細胞腫などの中枢神経系の腫瘍；頭頚部(例えば、鼻咽頭癌、唾液腺癌および食道癌)、肺(例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌)、消化器系(例えば、消化器癌を含む胃癌または胃の癌、胆管または胆道癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌および肛門部癌)、生殖器系(例えば、精巣、陰茎または前立腺癌、子宮、膣、外陰、子宮頸、卵巣および子宮内膜癌)、皮膚(例えば、黒色腫、基底細胞癌腫、扁平上皮細胞癌、光線性角化症、皮膚黒色腫)、肝臓(例えば、肝臓癌、肝臓癌腫、肝細胞癌および肝細胞癌)、骨(例えば、骨巨細胞腫および溶骨性骨癌)、付加的組織および臓器(例えば、膵臓癌、膀胱癌、腎臓または腎臓癌、甲状腺癌、乳癌、腹膜癌およびカポジ肉腫)の固形腫瘍、血管系腫瘍(例えば、血管肉腫および血管外皮腫)、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、骨肉腫およびユーイング肉腫を含む。
２. 投与
ここでの使用および方法の実施に際し、ここに提供される免疫刺激性細菌を、腫瘍を有するもしくは新生物細胞を有する対象または免疫化すべき対象を含む対象に投与し得る。免疫刺激性細菌の投与に適する状態を有するとの対象の診断、対象の免疫能の決定、対象の免疫化、化学療法剤での対象の処置、放射線での対象の処置または対象の外科的処置を含むが、これらに限定されない１以上の段階を、免疫刺激性細菌の対象への投与の前、同時または後に実施できる。
治療目的での免疫刺激性細菌の腫瘍担持対象を含む実施態様について、対象は、一般に先に新生物状態を有すると診断されている。診断方法はまた新生物状態のタイプの決定、新生物状態のステージの決定、対象における１以上の腫瘍のサイズ決定、対象のリンパ節における転移または新生物細胞の存在または非存在の決定または対象の転移の存在の決定も含み得る。
対象に免疫刺激性細菌を投与するための治療方法ある実施態様は、原発腫瘍のサイズまたは新生物疾患のステージを決定する段階を含み、原発腫瘍のサイズが閾値以上であるかまたは新生物疾患のステージが閾値ステージ以上であるならば、免疫刺激性細菌を対象に投与する。類似の実施態様において、原発腫瘍のサイズが閾値体積以下であるかまたは新生物疾患のステージが閾値ステージ以下であるならば、免疫刺激性細菌をまだ対象に投与しない；このような方法は、対象を腫瘍サイズまたは新生物疾患ステージが閾値量に達するまでモニタリングし、次いで免疫刺激性細菌を対象に投与することを含む。閾値サイズは、腫瘍の増殖速度、免疫刺激性細菌が腫瘍に感染する能力および対象の免疫能を含む、いくつかの因子により変わり得る。一般に、閾値サイズは、免疫刺激性細菌が、宿主の免疫系により完全に除去されずに、腫瘍またはその近位で蓄積および複製するのに十分なサイズであり、一般にまた宿主が腫瘍細胞に対する免疫応答を具備するのに十分に長い時間、一般に約１週間以上、約１０日以上または約２週間以上、細菌感染を維持するのに十分なサイズである。閾値ステージの例は、最低ステージ(例えば、ステージＩまたは同等)を超えるあらゆるステージまたは原発腫瘍が閾値サイズより大きいあらゆるステージまたは転移細胞が検出されるあらゆるステージである。
投与方法が免疫刺激性細菌が腫瘍または転移に入ることを可能とする限り、微生物を対象に投与するあらゆる方法が使用できる。投与方法は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、腫瘍内、多穿刺、吸入、鼻腔内、経口、腔内(例えば、カテーテルを介する膀胱への投与、坐薬または浣腸による消化管への投与)、耳、直腸および眼投与を含み得るが、これらに限定されない。
当業者は、対象および細菌と適合する、細菌を腫瘍および／または転移に到達させる可能性も高い何れかの投与方法を選択できる。投与経路は、疾患の性質、腫瘍の種類および医薬組成物に含まれる特定の細菌を含む、多様な因子の何れかにより当業者により選択され得る。標的部位への投与は、例えば、コロイド分散系として、弾道送達により実施できまたは全身投与は動脈への注射により実施できる。
投与量レジメンは、多様な方法および量の何れでもよく、既知臨床因子により当業者により決定され得る。１回量は、免疫刺激が処置をもたらす疾患または障害の処置に治療的に有効であり得る。このような刺激の例は、特異的免疫応答および非特異的免疫応答の一方または両方、特異的および非特異的両者の応答、先天性応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化およびサイトカイン発現を含むが、これらに限定されない免疫応答である。
医学分野で知られるとおり、対象に対する投与量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫能および一般的健康、投与する特定の細菌、期間および投与経路、疾患の種類およびステージ、例えば、腫瘍サイズおよび同時投与される薬物などの他の化合物を含む、多くの因子に依存し得る。上記因子に加えて、このようなレベルは、当業者により決定され得るとおり、細菌の感染性および細菌の性質により影響を受け得る。本方法において、適切な細菌の最小投与量レベルは、腫瘍または転移において細菌が生存、増殖および複製するのに十分なレベルであり得る。６５kgヒトに細菌を投与する最小レベルの例は、少なくとも約５×１０６コロニー形成単位(CFU)、少なくとも約１×１０７CFU、少なくとも約５×１０７CFU、少なくとも約１×１０８CFUまたは少なくとも約１×１０９CFUを含み得る。本方法において、適切な細菌の最大投与量レベルは、約１日後または約３日後または約７日後、宿主に毒性ではないレベル、３倍以上の脾腫を引き起こさないレベルおよび／または正常組織または臓器にコロニーまたはプラークをもたらさないレベルであり得る。６５kgヒトに細菌を投与する最大レベルの例は、約５×１０１１CFU未満、約１×１０１１CFU未満、約５×１０１０CFU未満、約１×１０１０CFU未満または約１×１０９CFU未満を含み得る。
ここに提供される方法および使用は、免疫刺激性細菌の細菌への１回投与または免疫刺激性細菌の細菌への複数回投与または他の抗腫瘍治療および／または処置との組み合わせ治療を含む、多様なレジメンのその他を含み得る。これらは、修飾免疫細胞投与などの細胞療法、ＣＡＲ－Ｔ治療、ＣＲＩＳＰＲ治療、抗体(例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ－４抗体)などの免疫チェックポイント阻害剤、ヌクレオシドアナログなどの化学療法／化学療法化合物、手術および放射線療法を含む。
ある実施態様において、細菌がコロニー形成でき、対象における抗腫瘍応答を引き起こすまたは増強することができる場所である、腫瘍における免疫刺激性細菌の確立に、単回投与が十分である。他の実施態様において、ここでの方法における使用のために提供される免疫刺激性細菌は、種々の機会に、一般に少なくとも１日離れて、投与され得る。別々の投与は、先の投与が細菌を腫瘍または転移に送達することができなかった可能性のある場所である、腫瘍または転移への細菌の送達の可能性を増加させ得る。ある実施態様において、別々の投与は、細菌コロニー形成／増殖が生じ得るまたは他に腫瘍の細菌蓄積の力価が増加し得る場所である、腫瘍または転移の位置で増加され得て、宿主の抗腫瘍免疫応答の誘導または増強を増加する。
別々の投与が実施されるとき、各投与は、別の回の投与量と同一または異なる投与量であり得る。ある実施態様において、全ての回の投与量は同一である。他の実施態様において、最初の投与量は、１以上のその後の投与量より多い、例えば、その後の投与量より少なくとも１０倍多い、少なくとも１００倍多いまたは少なくとも１０００倍多いものであり得る。最初の投与量が１以上のその後の投与量より多い個別々の投与の方法ある例において、その後の全投与量は、同じ、最初の投与より少ない量であり得る。
別々の投与は、２回、３回、４回、５回または６回投与を含む、２回以上のあらゆる数の投与を含み得る。当業者は、治療方法をモニタリングする既知方法およびここに提供される他のモニタリング方法により、実施すべき投与回数または１以上の付加的投与を実施する望ましさを容易に決定できる。従って、ここに提供される方法は、投与回数が対象のモニタリングにより決定され、モニタリングの結果に基づき、１以上の付加的投与を提供するか否かを決定する、免疫刺激性細菌の１以上の投与を対象に提供する方法を含む。１以上の付加的投与を提供するか否かの決定は、腫瘍増殖の指標または腫瘍増殖阻害、新規転移出現または転移阻害、対象の抗細菌抗体力価、対象の抗腫瘍抗体力価、対象の全体的健康および対象の体重を含むが、これらに限定されない多様なモニタリング結果に基づき得る。
投与の間の時間は、多様な時間の何れかであり得る。投与間の時間は、投与回数に関連して記載したモニタリング工程、対象が免疫応答を具備する時間、対象が細菌を正常組織から浄化する時間または細菌が腫瘍または転移にコロニー形成／増殖する時間を含む多様な因子の何れかの関数であり得る。一例として、時間は、対象が免疫応答を具備する時間の関数であり得る；例えば、時間は、約１週間を超える、約１０日を超える、約２週間を超えるまたは約１か月を超えるなど、対象が免疫応答を具備する時間を超えるものであり得る；他の例において、時間は、約１週間未満、約１０日未満、約２週間未満または約１か月未満など対象が免疫応答を具備する時間未満であり得る。他の例において、時間は、細菌が腫瘍または転移にコロニー形成／増殖する時間の関数であり得る；例えば、時間は、約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間または約１か月など、検出可能マーカーを発現する微生物の投与後、腫瘍または転移で検出可能なシグナルが生じる時間を超えるものであり得る。
ここで使用される方法は、またここに提供される免疫刺激性細菌を含む懸濁液および他の製剤などの組成物の投与によっても実施され得る。このような組成物は、ここに提供するまたは当業者に知られるとおり、細菌および薬学的に許容される賦形剤または媒体を含む。
上記のとおり、ここに提供される使用および方法はまた対象への免疫刺激性細菌の投与に加えて、対象への抗腫瘍化合物または他の癌治療などの１以上の治療化合物の投与も含み得る。治療化合物は、腫瘍治療効果について、免疫刺激性細菌と無関係にまたは連動して作用し得る。無関係に作用し得る治療化合物は、免疫刺激性細菌が腫瘍に蓄積する、腫瘍で複製するおよび対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすまたは増強する能力を低減することなく、腫瘍増殖阻害、転移増殖および／または形成阻害、腫瘍または転移のサイズ減少または腫瘍または転移排除ができる、あらゆる多様な既知化学療法化合物を含み得る。このような化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタンおよびトリロスタン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４(５)－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン(フェアストン)を含む抗エストロゲン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび５－フルオロウラシル(５－ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリンおよびトリメトレキサート；アジリジン、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルメラミン；葉酸補充薬、例えばフォリン酸；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロライド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン；白金アナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えばアルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンおよび５－ＦＵ；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルおよびそのアルブミン化形態(すなわち、ｎａｂ－パクリタキセルおよびｎａｂ－ドセタキセル)、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；チミジル酸シンターゼ阻害剤(例えばトムデックス)；およびアセグラトンを含む付加的化学療法；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォスファミド；デメコルチン；ジアジクオン；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；エフロルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；ガリウムニトレート；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２’、２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド(「Ａｒａ－Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；エトポシド(ＶＰ－１６)；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ－１１；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；およびトポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカンを含むが、これらに限定されない。上記お何れかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も使用され得る。
免疫刺激性細菌と連動して作用する治療化合物は、例えば、細菌の免疫応答誘導性質を増加させる化合物を含む。例えば、遺伝子発現を変える化合物は、ＳＴＩＮＧタンパク質などの外来性遺伝子などの細菌における遺伝子の転写を誘導または増加し得る。ＩＰＴＧおよびＲＵ４８６を含む、遺伝子発現を変えることができる何らかの広範な化合物が当分野で知られる。発現が上方制御され得る遺伝子の例は、毒素、プロドラッグを抗腫瘍薬物に変換し得る酵素、サイトカイン、転写制御タンパク質、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムを含む、タンパク質およびＲＮＡ分子を含む。他の実施態様において、細菌のコロニー形成／増殖または免疫応答誘導性質を増加するよう免疫刺激性細菌と連動して作用し得る治療化合物は、細菌発現遺伝子産物と相互作用でき、そのような相互作用が腫瘍細胞死滅増加または対象における抗腫瘍免疫応答増加をもたらし得る、化合物である。細菌発現遺伝子産物と相互作用できる治療化合物は、例えば投与形態で対象に毒性または他の生物学的活性がわずかであるかまたはないプロドラッグまたは他の化合物であるが、細菌発現遺伝子産物との相互作用後、化合物は、細胞毒性、アポトーシスを誘導する能力または免疫応答を誘導する能力を含むが、これらに限定されない腫瘍細胞死をもたらす性質を獲得し得る。ガンシクロビル、５－フルオロウラシル、６－メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン－ドキソルビシン、４－[(２－クロロエチル)(２－メスロキシエチル)アミノ]ベンゾイル－Ｌ－グルタミン酸、アセトアミノフェン、インドール－３－酢酸、ＣＢ１９５４、７－エチル－１０－[４－(１－ピペリジノ)－１－ピペリジノ]カルボニルオキシカンプトテシン、ビス－(２－クロロエチル)アミノ－４－ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、１－クロロメチル－５－ヒドロキシ－１,２－ジヒドロ－３Ｈ－ベンズ[ｅ]インドール、エピルビシン－グルクロニド、５’－デオキシ５－フルオロウリジン、シトシンアラビノシドおよびリナマリンを含む、多様なプロドラッグ様物質が当分野で知られる。
３. モニタリング
ここに提供される方法は、さらに対象のモニタリング、腫瘍のモニタリングおよび／または対象への免疫刺激性細菌投与モニタリングの１以上の段階を含み得る。腫瘍サイズのモニタリング、転移の存在および／またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリング、対象の体重または血液もしくは尿マーカーを含む他の健康指標のモニタリング、抗細菌抗体力価のモニタリング、検出可能な遺伝子産物の細菌発現のモニタリングおよび対象の腫瘍、組織または臓器における細菌力価の直接モニタリングを含むが、これらに限定されない多様なモニタリング段階の何れもここに提供される方法に包含できる。
モニタリングの目的は、対象の健康状態または対象の治療処置の進行を単に評価するためでよくまたは同一または異なる免疫刺激性細菌のさらなる投与が保証されるか否かの決定または治療方法の有効性の増加に作用し得るまたは対象に投与した細菌の病原性で低減し得る化合物を対象にいつ投与するか投与すべきか否かをさらに決定するためでよい。
ある実施態様において、ここに提供される方法は、１以上の細菌により発現された遺伝子のモニタリングを含み得る。ここに提供するまたは他に当分野で知られるような細菌は、検出可能タンパク質を含むが、これに限定されない、１以上の検出可能遺伝子産物を発現できる。
ここで提供する細菌で発現される検出可能な遺伝子産物の測定は、対象に存在する細菌のレベルの正確な決定を提供し得る。ここにさらに提供されるとおり、例えば、断層撮影方法を含む造影方法による、検出可能遺伝子産物の位置の測定は、対象における細菌の局在化を決定し得る。従って、検出可能な細菌遺伝子産物のモニタリングを含むここに提供される方法は、対象の１以上の臓器または組織における細菌の存在または非存在および／または対象の腫瘍または転移における細菌の存在または非存在の決定に使用され得る。さらに、検出可能な細菌遺伝子産物のモニタリングを含むここに提供される方法は、１以上の臓器、組織、腫瘍または転移に存在する細菌の力価の決定に使用され得る。対象における細菌の局在化および／または力価のモニタリングを含む方法は、正常組織および臓器の細菌感染および特に感染のレベルが細菌の病原性を示し得るため、細菌の病原の決定に使用され得る。対象における免疫刺激性細菌の局在化および／または力価のモニタリングを含む方法は、複数の時点で実施でき、従って、対象の１以上の臓器または組織における細菌複製を速度を含む、対象における細菌複製速度を決定し得る；従って、細菌遺伝子産物のモニタリングを含む方法は、細菌の複製能の決定に使用され得る。ここに提供される方法はまた多様な臓器または組織および腫瘍または転移に存在する免疫刺激性細菌の量の定量化に使用でき、それにより対象における細菌の優先的蓄積の程度を示し得る；従って、細菌遺伝子産物モニタリングは、細菌が正常組織または臓器に優先して腫瘍または転移に蓄積する能力を決定する方法において使用され得る。ここに提供される方法で使用される免疫刺激性細菌が腫瘍全体に蓄積できるかまたは腫瘍の複数の部位に蓄積できかつ転移にも蓄積できるため、ここに提供される細菌遺伝子産物をモニタリングする方法は、対象に存在する腫瘍のサイズまたは転移の数の決定に使用され得る。一定期間にわたる腫瘍または転移におけるこのような細菌遺伝子産物存在のモニタリングは、腫瘍の増殖もしくは縮小または新規転移の出現もしくは転移消失を含む腫瘍または転移の変化の評価に使用できおよびまた腫瘍の増殖または縮小または新規転移の出現または転移消失の速度または腫瘍の増殖または縮小または新規転移の出現または転移消失の速度の変化の決定にも使用され得る。従って、細菌遺伝子産物のモニタリングは、腫瘍の増殖または縮小または新規転移の出現または転移消失の速度または腫瘍の増殖または縮小または新規転移の出現または転移消失の速度の変化の決定により、対象における新生物疾患のモニタリングまたは新生物疾患の処置有効性の決定に使用できる。
多様な検出可能タンパク質の何れも、モニタリングにより検出でき、その例は、多様な蛍光タンパク質の何れか(例えば、緑色蛍光タンパク質)、多様なルシフェラーゼ、トランスフェリンまたは他の鉄結合タンパク質；または受容体、結合タンパク質および抗体であって、受容体、結合タンパク質または抗体に特異的に結合する化合物が検出可能剤であり得るまたは検出可能物質(例えば、放射性核種または造影剤)で標識され得る。
腫瘍および／または転移サイズは、外部評価方法または断層撮影または磁気造影方法を含む、当分野で知られる多様な方法の何れかによりモニターされ得る、ここに提供される方法、例えば、モニタリング細菌遺伝子発現を、腫瘍および／または転移サイズのモニタリングに使用し得る。
数時点にわたるサイズのモニタリングは、腫瘍または転移のサイズの増加または減少に関する情報を提供でき、対象における腫瘍の追加および／または転移の存在に関する情報も提供できる。数時点にわたる腫瘍サイズのモニタリングは、対象における新生物疾患処置の有効性を含む、対象における新生物疾患の進展に関する情報を提供し得る。
ここに提供される方法はまた、対象への免疫刺激性細菌の投与に応答して産生された抗体を含む、対象における抗体力価のモニタリングも含み得る。ここに提供される方法で投与された細菌は、内因性細菌抗原に対する免疫応答を誘導し得る。ここに提供される方法で投与された細菌はまた細菌により発現される外来性遺伝子に対する免疫応答も誘導し得る。ここに提供される方法で投与された細菌はまた腫瘍抗原に対する免疫応答も誘導し得る。細菌抗原、細菌により発現された外来性遺伝子産物または腫瘍抗原に対する抗体力価のモニタリングは、細菌の毒性、処置方法の有効性または産生および／または収集のための遺伝子産物または抗体のレベルのモニターに使用され得る。
抗体力価モタリングは、細菌の毒性のモニターに使用され得る。細菌に対する抗体力価は、対象に細菌を投与後時間と共に変化し得て、ある特定の時点で、低抗(細菌抗原)抗体力価が高い毒性を示し得て、一方他の時点で、高抗(細菌抗原)抗体力価が高い毒性を示し得る。ここに提供される方法で使用される細菌は免疫原性であり得て、それ故に、対象に細菌を投与して間もなく、免疫応答を誘導し得る。一般に、対象の免疫系が強い免疫応答を具備できる免疫刺激性細菌は、対象の免疫系が全正常臓器または組織から細菌を除去し得るとき、低毒性である細菌であり得る。それ故に、ある実施態様において、対象に細菌を投与して間もなくの細菌抗原に対する高抗体力価は、細菌の低毒性を示し得る。
他の実施態様において、抗体力価のモニタリングは、処置方法の有効性のモニターに使用され得る。ここに提供される方法において、抗(腫瘍抗原)抗体力価などの抗体力価は、新生物疾患を処置する治療方法などの治療方法の有効性を示し得る。ここに提供される治療方法は、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすまたは増強することを含み得る。それ故に、抗(腫瘍抗原)抗体力価のモニタリングにより、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすまたは増強する治療方法の有効性をモニターすることが可能である。
他の実施態様において、抗体力価のモニタリングを産生および／または収集のための遺伝子産物または抗体のレベルのモニタリングに使用し得る。ここで提供する方法は、腫瘍に蓄積されている微生物における外来性遺伝子の発現による、タンパク質、ＳｈＲＮＡなどのＲＮＡ分子または他の化合物の産生に使用され得る。タンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に対する抗体力価のモニタリングは、腫瘍蓄積微生物によるタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物の産生レベルを示ことができまたこのようなタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に特異的な抗体のレベルを直接示すことができる。
ここに提供される方法はまた対象の健康のモニタリング方法も含み得る。ここに提供される方法の一部は、新生物疾患治療方法を含む治療方法である。対象の健康のモニタリングは、当分野で知られるとおり、治療方法の有効性の決定に使用され得る。ここに提供される方法はまたここに提供するとおり、免疫刺激性細菌を対象に投与する段階を含む。対象の健康のモニタリングは、対象に投与した免疫刺激性細菌の病原性の決定に使用され得る。新生物疾患、感染性疾患または免疫関連疾患などの疾患をモニタリングするための多様な健康診断方法を、当分野で知られるとおり、モニターし得る。例えば、対象の体重、血圧、脈、呼吸、色、体温または他の観察可能な状態が、対象の健康を示し得る。さらに、対象からのサンプルにおける１以上の成分の存在または非存在またはレベルが、対象の健康を示し得る。典型的サンプルは、血液および尿サンプルを含み、１以上の成分の存在または非存在またはレベルは、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断試験実施により決定され得る。対象の健康を示す成分の例は、白血球数、ヘマトクリットおよびｃ－反応性タンパク質濃度を含むが、これらに限定されない。
ここに提供される方法は、治療のモニタリングを含み、ここで、治療決定は、モニタリングの結果に基づき得る。ここに提供される治療方法は、対象への免疫刺激性細菌の投与を含み、細菌は腫瘍および／または転移に優先的に蓄積できるおよび細菌は抗腫瘍免疫応答を引き起こすまたは増強することができる。このような治療方法は、特定の免疫刺激性細菌の複数の投与、第二の免疫刺激性細菌の投与または治療化合物の投与を含む、多様な段階を含み得る。対象に投与すべき免疫刺激性細菌または化合物の量、タイミングまたはタイプの決定は、対象のモニタリングの１以上の結果に基づき得る。例えば、対象における抗体力価を、免疫刺激性細菌、そして所望により、化合物の投与が望ましいか否か、投与する細菌および／または化合物の量および投与する細菌および／または化合物のタイプの決定に使用でき、例えば、低抗体力価は付加的免疫刺激性細菌、異なる免疫刺激性細菌および／または細菌遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物または免疫刺激性細菌と無関係に有効である治療化合物の投与の望ましさを示すことができる。
他の例において、対象の全体的健康状態を、免疫刺激性細菌、そして所望により、化合物の投与が望ましいか否か、投与する細菌および／または化合物の量および投与する細菌および／または化合物のタイプの決定に使用でき、例えば、対象が健康であるとの決定は付加的免疫刺激性細菌、異なる免疫刺激性細菌および／または細菌遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物または免疫刺激性細菌と無関係に有効である治療化合物の投与の望ましさを示すことができる。他の例において、検出可能な細菌により発現された遺伝子産物のモニタリングを、免疫刺激性細菌、そして所望により、化合物の投与が望ましいか否か、投与する細菌および／または化合物の量および投与する細菌および／または化合物のタイプの決定に使用でき、例えば、対象が健康であるとの決定は付加的免疫刺激性細菌、異なる免疫刺激性細菌および／または細菌遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物または免疫刺激性細菌と無関係に有効である治療化合物の投与の望ましさを示すことができる。このようなモニタリング方法を、治療方法が有効であるか否か、治療方法が対象に病原性であるか否か、細菌が腫瘍または転移に蓄積されているか否かおよび細菌が正常組織または臓器に蓄積されているか否かの決定に使用できる。このような決定に基づき、さらなる治療方法の望ましさおよび形態が導かれ得る。
他の例において、モニタリングは、免疫刺激性細菌が対象の腫瘍または転移に蓄積しているか否かを決定できる。このような決定により、さらに付加的細菌、異なる免疫刺激性細菌および、所望により、化合物を対象に投与する決定がなされ得る。
Ｊ. 実施例
次の実施例は、説明の目的でのみ記載され、本発明の範囲を限定する意図はない。
操作した免疫刺激性細菌株および命名例の要約：
Figure 2022524951000013
Figure 2022524951000014
Figure 2022524951000015
実施例１
栄養要求性ネズミチフス菌の株
サルモネラ株ＹＳ１６４６はアデノシンに対して栄養要求性である
ここに提供される株は、アデノシンに対して栄養要求性であるよう操作される。その結果、低アデノシン濃度の正常組織で複製できず、主にアデノシンが高レベルである固形腫瘍微小環境(ＴＭＥ)にコロニー形成が起こるため、インビボで弱毒化される。サルモネラ株ＹＳ１６４６は野生型株ATCC #14028の誘導株であり、ｐｕｒＩ遺伝子(ｐｕｒＭと同義)の破壊によりプリンに栄養要求性であるように操作された(Low et al. (2004) Methods Mol. Med 90:47-60)。ＹＳ１６４６のゲノム全体のその後の分析によりｐｕｒＩ遺伝子が実際欠失しておらず、むしろ染色体逆位により破壊され(Broadway et al. (2014) J. Biotechnol. 192:177-178)、遺伝子全体は、挿入配列により隣接された、ＶＮＰ２０００９染色体の二つの部分内になお含まれる(その一方はアクティブなトランスポザーゼを有する)。染色体再係合の手段により破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝的配列の存在は、野生型遺伝子への復帰の可能性を残す。ＹＳ１６４６のプリン栄養要求性がインビトロで＞１４０連続継代後安定であったことが先に示されたが、復帰率は未知であった(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002)。
アデノシンと共に提供されたとき、ＹＳ１６４６は最小培地で複製でき、一方、野生型親株、ATCC #14028は、アデノシンを添加していない最小培地で増殖できることがここで示された。ＹＳ１６４６を一夜溶原性ブロス(ＬＢ)培地で増殖し、Ｍ９最小培地で洗浄し、アデノシンを含まないまたは漸増濃度のアデノシンを含むＭ９最小培地で希釈した。増殖SpectraMax(登録商標)M3分光光度計(Molecular Devices)を使用して、３７℃で測定し、１５分毎にＯＤ６００を読んだ。
結果は、全濃度のアデノシンで増殖できた野生型株(ATCC #14028)と異なり、ＹＳ１６４６株がアデノシンが１１～３００マイクロモル濃度範囲の濃度で提供されたときのみ複製できるが、Ｍ９単独または１３０ナノモル濃度アデノシン添加Ｍ９で完全に複製不可能であったことを示す。これらのデータは、ｐｕｒＩ変異体が腫瘍微小環境でみられるアデノシン濃度で複製できるが、正常組織でみられる濃度ではできないことを示す。ここに例示する操作したアデノシン栄養要求性株の野生型への復帰を防止するために、染色体からｐｕｒＩオープンリーディングフレームの全てまたは一部が欠失した株を含む。このような遺伝子欠失は、下記ラムダ・レッド系を含む、当業者に知られる方法の何れかにより達成され得る。
サルモネラ株ＹＳ１６４６はＡＴＰに対して栄養要求性である
プリンおよびアデノシン栄養要求性に加えて、ｐｕｒＩ欠失株がＡＴＰも除去できるか否かが決定された。ＡＴＰは、瀕死の腫瘍細胞からの漏出により、腫瘍微小環境に高レベルで蓄積される。ＡＴＰを提供したとき、株ＹＳ１６４６は最小培地で複製できるが、ＡＴＰを添加しないとき増殖できないことがここで示された。これを証明するために、株ＹＳ１６４６を一夜ＬＢ培地で増殖し、Ｍ９最小培地で洗浄し、ＡＴＰを含まないまたは漸増濃度のＡＴＰを含むＭ９最小培地で希釈した(Fisher)。増殖SpectraMax(登録商標)M3分光光度計(Molecular Devices)を使用して、３７℃で測定し、１５分毎にＯＤ６００を読んだ。結果は、株ＹＳ１６４６はＡＴＰが０.０１２ミリモル濃度の濃度で存在するときまたはＭ９単独で複製できることを示した。
実施例２
細胞内複製における欠損はｍｓｂＢ変異に帰する
ＹＳ１６４６株は、複製を高濃度のプリン、アデノシンまたはＡＴＰを含む部位に制限するｐｕｒＩおよびＴＬＲ４介在炎症促進性シグナル伝達低減のためにリポ多糖(ＬＰＳ)表面コートを変えるｍｓｂＢに変異を含む。野生型サルモネラと異なり、株ＹＳ１６４６はマクロファージで複製できないことも確立された。これら遺伝的変異が野生型株、ＡＴＣＣ １４０２８内にこの表現型を与えることを担うかを決定する実験を実施した。
このアッセイで、マウスＲＡＷマクロファージ細胞(InvivoGen, San Diego, Ca.)を、３０分間、細胞あたり約５細菌の感染効率(ＭＯＩ)でｐｕｒＩ、ｍｓｂＢまたは両者に欠失を含む野生型サルモネラ株を感染させ、次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ゲンタマイシン含有培地を、細胞外細菌を死滅させるために加えた。細胞内細菌は、細胞膜を通過できないためゲンタマイシンにより死滅しない。感染後種々の時点で、細胞単層を水との浸透圧ショックにより溶解し、細胞可溶化物を希釈し、生存コロニー形成単位(CFU)を数え上げるためにＬＢ寒天に播種した。
下表に示すとおり、ｐｕｒＩ変異のみを含む野生型サルモネラ株は、なお複製できた。これは、ｐｕｒＩ欠失単独で、腫瘍微小環境への高度の特異性を達成しながら、忍容性の中程度の改善しか観察されないかを説明する。ｍｓｂＢ－変異のみを含む株ならびにｐｕｒＩ－およびｍｓｂＢ－変異を含む株は複製できず、４８時間以内に迅速に細胞から排除された。
Figure 2022524951000016
実施例３
サルモネラａｓｄ遺伝子ノックアウト株操作および特徴づけ
株ＹＳ１６４６Δａｓｄを調製した。ａｓｄ遺伝子を欠失するように操作されている、株ＹＳ１６４６(ATCC, Catalog # 202165で購入可能)由来の弱毒化ネズミチフス菌株である。この実施例では、ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６Δａｓｄを、下記Datsenko and Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000))の方法の変法を使用して操作した。
ラムダ・レッドヘルパープラスミドの株ＹＳ１６４６への導入
ＹＳ１６４６株は、先に記載(Sambrook J. (1998) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)のとおり、ＬＢで培養物を増殖させ、１００倍濃縮し、次いで氷冷１０％グリセロールで３回洗浄して、エレクトロコンピテントとして調製した。エレクトロコンピテント株を、下記設定で０.２cmギャップキュベットを使用して、ラムダ・レッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６(配列番号２１８)に電気穿孔した：２.５kV、１８６オーム、５０μF。ｐＫＤ４６担持形質転換体を、アンピシリンおよび１mM Ｌ－アラビノース含有５mL ＳＯＣ培地で３０℃で増殖させ、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレートで選択した。ラムダ・レッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６を含むＹＳ１６４６クローンを、次いで、株ＹＳ１６４６について上記のとおりエレクトロコンピテントとした。
ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットの構築
株ＹＳ１６４６のゲノムからのａｓｄ遺伝子(Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178)を、ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットの設計に使用した。それぞれａｓｄ遺伝子の左手側および右手側領域と相同性の２０４bpおよび２０３bpを含むプラスミドを、ＤＨ５－アルファコンピテント細胞に形質転換した(Thermo Fisher Scientific)。ｌｏｘ Ｐ部位が隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、このプラスミドにクローン化した。次いで、ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットをＰＣＲプライマーａｓｄ－１およびａｓｄ－２(表１)を使用して増幅し、ゲル精製した。
ａｓｄ遺伝子欠失
プラスミドｐＫＤ４６を担持するＹＳ１６４６株を、ゲル精製線形ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットで電気穿孔した。電気穿孔細胞をＳＯＣ培地に回収し、カナマイシン(２０μg／mL)およびジアミノピメリン酸(ＤＡＰ、５０μg／mL)添加ＬＢ寒天プレートに播種した。この工程中、ラムダ・レッドリコンビナーゼは、染色体ａｓｄ遺伝子とｋａｎカセットの相同組み換えを誘導し(染色体ａｓｄ遺伝子上流および下流の相同隣接配列の存在による)、ａｓｄ遺伝子の染色体コピーのノックアウトが生じた。選択したカナマイシン耐性クローンにおける破壊されたａｓｄ遺伝子の存在を、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム(プライマーａｓｄ－３)および多クローニング部位(プライマーｓｃＦｖ－３)からのプライマーを用い、ＰＣＲ増幅により確認した(表１)。コロニーは、ＤＡＰ栄養要求性を示す補助的ＤＡＰを添加し、してないＬＢプレートにレプリカ播種した。Ａｓｄ遺伝子が欠失した全クローンは補助的ＤＡＰ非存在下で増殖できず、ＤＡＰ栄養要求性を示した。
Figure 2022524951000017
カナマイシン遺伝子カセット除去
ｋａｎ選択可能マーカーを、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組み換え系の使用により除去した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ遺伝子ＫａｎＲ変異体を、ｃｒｅリコンビナーゼ(配列番号２２４)を発現する温度感受性プラスミドであるｐＪＷ１６８で形質転換した。ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した；ｐＪＷ１６８を、４２℃での増殖によりその後除去した。選択クローンを、カナマイシン添加および非添加ＬＢ寒天プレートへのレプリカ播種により、ｋａｎ喪失について試験し、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノムからのプライマーを使用するＰＣＲ検証により確認した(プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４、プライマー配列について、表１参照)。
機能的ａｓｄ欠失変異株ＹＳ１６４６Δａｓｄ(ＡＳＴ－１０１とも称する)の確認
Δａｓｄ変異体は３７℃でＬＢ寒天プレートで増殖できなかったが、５０μg／mLジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)含有ＬＢプレートで増殖できた。Δａｓｄ変異体増殖速度をＬＢ液体培地で評価した；６００nMの吸光度の測定により決定して、液体ＬＢで増殖できなかったが、５０μg／mL ＤＡＰ添加ＬＢで増殖できた。
ａｓｄ遺伝子欠失後の株ＹＳ１６４６Δａｓｄにおけるａｓｄ座位配列の配列確認
ａｓｄ遺伝子欠失株を、プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４を使用するＤＮＡ配列決定により決定した。ａｓｄ座位に隣接する領域の配列決定を実施し、配列は、ａｓｄ遺伝子がＹＳ１６４６染色体から欠失したことを確認した。
プラスミドからのａｓｄ発現によるａｓｄ欠失の補完
プラスミド(ｐＡＴＩＵ６)を化学的に合成し、組み立てた(配列番号２２５)。プラスミドは次の特性を含んだ：高コピー(ｐＵＣ１９)複製起点、短ヘアピンの発現を駆動するＵ６プロモーター、その後の除去のためのＨｉｎｄIII制限部位に隣接されたアンピシリン耐性遺伝子および開始コドンの上流８５塩基対配列を含むａｓｄ遺伝子(配列番号２４６)。このベクターに、マウスＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡをＳｐｅＩおよびＸｈｏＩでの制限消化およびライゲーションにより導入し、大腸菌ＤＨ５－アルファ細胞にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１と名付けた。
免疫刺激性細菌株へのプラスミドのエレクトロポレーション
免疫刺激性タンパク質および機能的ａｓｄ遺伝子をコードする発現カセットを含む選択プラスミドを、下記設定で０.２cmギャップキュベット(BTX, San Diego, Calif.)を使用するＢＴＸ６００エレクトロポレーターで、ａｓｄ遺伝子を欠くネズミチフス菌株に電気穿孔した：２.５kV、１８６オーム、５０μF。電気穿孔細胞を５０μMジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)を添加した１mL ＳＯＣに加え、１時間、３７℃でインキュベートし、次いでＤＡＰを含まない寒天プレートに広げ、機能的ａｓｄ遺伝子を有するプラスミドを受けた株を選択した。単一コロニー単離後、細胞バンクを、無菌溶原性ブロス(ＬＢ)のフラスコにネズミチフス菌の単一の十分に単離されたコロニーを接種し、２５０RPMで撹拌しながら３７℃でインキュベートして、産生した。培養物が静止期まで増殖したら、細菌を１０％グリセロール含有ＰＢＳで洗浄し、－６０℃未満の温度で小分けして凍結して保存した。
プラスミドｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１を大腸菌で増殖させ、エレクトロポレーションおよびＬＢ ａｍｐプレートでのクローン選択によりＹＳ１６４６Δａｓｄ株に形質転換するために精製し、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１を産生した。ｐＡＴＩＵ６由来プラスミドで補完させたＹＳ１６４６Δａｓｄ変異体は、ＤＡＰ非存在下、ＬＢ寒天および液体培地で増殖できた。
その後のイテレーションで、ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１からのアンピシリン耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。これは、ＨｉｎｄIIIでのｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミド消化と続くＡｍｐＲ遺伝子除去のためのゲル精製により達成された。カナマイシン耐性(ＫａｎＲ)遺伝子を、プライマーＡＰＲ－００１およびＡＰＲ－００２(それぞれ配列番号２２６および配列番号２２７)を使用するＰＣＲで増幅させ、続いてＨｉｎｄIIIで消化させ、ゲル精製、消化ｐＡＴＩＵ６プラスミドにライゲーションした。
その後のイテレーションで、単一点変異を、Ｑ５(登録商標)部位特異的変異導入キット(New England Biolabs)およびプライマーＡＰＲ－００３(配列番号２２８)およびＡＰＲ－００４(配列番号２２９)を使用してｐＵＣ１９複製起点でｐＡＴＩＫａｎプラスミドに導入し、１４８位のヌクレオチドＴをＣに変えた。この変異により、複製起点が、プラスミドコピー数を減らすために、低コピー複製起点であるｐＢＲ３２２複製起点と相同となった。
ａｓｄ補完系を使用するインビボで示されたプラスミド維持
この例では、ＣＴ２６腫瘍担持マウスを、ＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを発現するプラスミドを含む株ＹＳ１６４６(ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１)または機能的ａｓｄ遺伝子およびＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを含むプラスミドを含むＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株(ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１)で処理した。
ＣＴ２６(結腸腫瘍＃２６)は、高悪性度、未分化およびチェックポイント難治性ヒト結腸直腸癌腫を再現する高度に転移性の癌腫をもたらす、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＮ－ニトロ－Ｎ－メチルウレタン(ＮＭＵ)への暴露に由来する腫瘍モデルである(Castle et al. (2014) BMC Genomics 15(1):190)。結腸の同所性と逆の脇腹の皮下に移植したとき、腫瘍免疫表現型は、はるかにより免疫抑制性かつチェックポイント難治性である。Ｔ細胞浸潤を大部分欠くが、腫瘍はマクロファージなどの骨髄細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)に富む(Zhao et al. (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787)。このモデルがヒトマイクロサテライト安定(ＭＳＳ)結腸直腸癌をより模倣するため、ここに提供される治療アプローチを評価する理想的モデルである。
この実験のために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(３マウス／群)の右脇腹に、ＣＴ２６(ＡＴＣＣから購入)腫瘍細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を皮下(ＳＣ)接種した。８日齢の確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、８日、１５日および２３日に５×１０６CFUのＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株または親株ＹＳ１６４６の３用量をＩＶ注射した。プラスミドは、治療産物の例としてｓｈＴＲＥＸ１をコードする；あらゆる１以上の治療産物または産物に置き換え得る。
体重および腫瘍を週２回測定した。腫瘍測定を、電子ノギス(Fowler, Newton, MA)を使用して実施した。腫瘍体積を、修飾楕円体式、１／２(長さ×幅２)を使用して、計算した。マウスを、ＩＡＣＵＣ規制に従い、腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したときまたは壊死性となったとき、屠殺した。
最終サルモネラ注射１２日後、腫瘍を均質化し、ホモジネートを連続希釈し、存在するコロニー形成単位(CFU)の総数を数え上げるためにＬＢ寒天プレートにまたはカナマイシン耐性コロニーを数え上げるためにカナマイシン含有ＬＢプレートに播種した。
結果は、ネズミチフス菌ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１は、ｓｈＲＮＡプラスミドを維持するための選択圧を有さず、パーセントカナマイシン耐性(ＫａｎＲ)コロニーが１０％未満であったため、顕著なプラスミドを示すことを示した。プラスミド維持のためにａｓｄ遺伝子補完系を使用した株、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１のカナマイシン耐性およびカナマイシン感受性ＣＦＵはほぼ同数であった。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子補完系がマウスにおける腫瘍微小環境の状況でのプラスミドの維持に十分であることを示す。
ａｓｄ補完系を使用する抗腫瘍有効性の増強
ａｓｄ補完系を、インビボでプラスミド喪失を防止し、ネズミチフス菌株による治療産物送達の抗腫瘍有効性を増強するよう設計する。これを試験するために、ＳｈＴＲＥＸ１プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ株(ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１)または機能的ａｓｄ遺伝子カセットを含むスクランブル対照(ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ)を、マウス結腸癌モデルで抗腫瘍有効性を、ａｓｄ遺伝子カセットを欠き、それ故にプラスミド維持の機構を有しないプラスミドｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１を含む株ＹＳ１６４６(ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１)と比較した。ｓｈＴＲＥＸ１は、治療産物の例である。
この実験のために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(８マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０６CFUのＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１またはＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１を８日および１８日に２回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
ＹＳ１６４６－ｓｈＴＲＥＸ１株ｄは、経時的プラスミド喪失が示されたにも関わらず、ＰＢＳと比較して腫瘍制御の増強を示した(７０％腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)、２８日目)。Ａｓｄ遺伝子補完系およびｓｈＴＲＥＸ１を有するプラスミドを含むΔａｓｄ株(ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１)は、ＰＢＳと比較して優れた腫瘍増殖阻害を示した(８２％ＴＧＩ、ｐ＝０.００２、２５日目)。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子補完系がないプラスミドを含むＹＳ１６４６と比較して、ａｓｄ補完系およびｓｈＴＲＥＸ１送達を使用してプラスミド喪失を防止することにより効力の改善が達成されることを示す。それ故に、ａｓｄ補完系を有する株は、優れた抗癌治療である。
実施例４
ＣｐＧ要素を含むプラスミドを有する修飾ネズミチフス菌株は、ＹＳ１６４６親株と比較して抗腫瘍活性の増強を示す
トール様受容体(ＴＬＲ)は、病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰ)を感知し、病原体に対する自然免疫を活性化する重要な受容体である(Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680)。これらの中で、ＴＬＲ９は、哺乳動物ＤＮＡで天然に生じない病原性ＤＮＡにおける低メチル化ＣｐＧモチーフの認識を担う(McKelvey et al. (2011) J. Autoimmunity 36:76)。免疫細胞サブセットにおけるエンドソームへの病原体の食作用によるＣｐＧモチーフの認識がＩＦＲ７依存性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を誘導し、自然免疫および適応免疫を活性化させる。修飾ネズミチフス菌プラスミドＣｐＧを含むモチーフを担持するネズミチフス菌株ＹＳ１６４６(ＹＳ１６４６ ｐＥＱＵ６スクランブル)が、プラスミドがないＹＳ１６４６株と比較して、同様にＴＬＲ９を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ介在自然免疫および適応免疫を誘導することがここで判明した。
ここで使用した操作したプラスミドにおけるＣｐＧモチーフを表２に示す。株ＡＳＴ－１０３におけるｐＥＱＵ６ ｓｈＳＣＲ(非同族ｓｈＲＮＡ)プラスミドは３６２個のＣｐＧモチーフを有し、サルモネラベースのプラスミド送達が免疫刺激であり、このプラスミドで形質転換していない同じサルモネラと比較したとき、抗腫瘍効果を有することができることを示す。マウス結腸癌モデルにおける腫瘍増殖阻害を誘導するＹＳ１６４６内のＣｐＧ含有プラスミドの能力を評価するために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(９マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０６CFUのＹＳ１６４６(ＡＳＴ－１００)またはＣｐＧモチーフを有するｓｈＲＮＡスクランブルプラスミドを含むＹＳ１６４６(ＡＳＴ－１０３)を毎週３回IV注し、ＰＢＳ対照と比較した。
Figure 2022524951000018
ＹＳ１６４６(ＡＳＴ－１００)株は、ＰＢＳと比較して、中程度の腫瘍制御(３２％ＴＧＩ、ｐ＝ｎｓ、２８日目)を示した。非同族スクランブルｓｈＲＮＡをコードするＣｐＧ含有プラスミドの付加のみＹＳ１６４６と異なるＡＳＴ－１０３株は、非形質転換であり、それ故にプラスミドを欠くＹＳ１６４６単独と比較して、高度に有意な腫瘍増殖阻害を示した(ｐ＝０.００４、３２日目)。
ａｓｄ遺伝子は２３４個のＣｐＧモチーフを有し(表２参照)、それを含むプラスミドが免疫刺激性質を有し得ることを示す。ＡＳＴ－１０９(スクランブルｓｈＲＮＡを有するＹＳ１６４６－ＡＳＤ)は、ＰＢＳ単独と比較して５１％腫瘍増殖阻害を有し、強い免疫刺激効果を示す。
これらのデータは、ネズミチフス菌の腫瘍を標的とする弱毒化株内のＴＬＲ９活性化ＣｐＧモチーフを含むプラスミドＤＮＡの強力な免疫刺激性質を示す。
実施例５
ベクター合成
プラスミドからのａｓｄ発現によるａｓｄ欠失の補完
プラスミド(ｐＡＴＩＵ６)を化学的に合成し、組み立てた(配列番号２２５)。プラスミドは、次の特性を含む：高コピー(ｐＵＣ１９)複製起点、短ヘアピンの発現を駆動するＵ６プロモーター、その後の除去のためのＨｉｎｄIII制限部位に隣接されたアンピシリン耐性遺伝子および開始コドンの上流８５塩基対配列を含むａｓｄ遺伝子(配列番号２４６)。このベクターに、マウスＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡまたはスクランブル、非同族ｓｈＲＮＡ配列をＳｐｅＩおよびＸｈｏＩでの制限消化およびライゲーションにより導入し、大腸菌ＤＨ５－アルファにクローニングした。それぞれｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１およびｐＡＴＩ－ｓｈＳＣＲと名付けた得られたプラスミドを大腸菌で増幅し、エレクトロポレーションによるａｓｄノックアウト株ＡＳＴ－１０１への形質転換およびＬＢ ａｍｐプレートでのクローン選択のために精製して、それぞれ株ＡＳＴ－１０８およびＡＳＴ－１０７を産生した。あるいは、ここに記載するサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの機能獲得型バリアントを含む他の治療産物をコードする他の核酸分子をこのベクターに導入する。ｐＡＴＩＵ６由来プラスミドで補完したａｓｄ－変異体は、ＤＡＰ非存在下、ＬＢ寒天および液体培地で増殖できた。
その後のイテレーションで、ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１からのアンピシリン耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。これは、ＨｉｎｄIIIでｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを消化し、続いてＡｍｐＲ遺伝子を除去するためにゲル精製し、プライマーＡＰＲ－００１およびＡＰＲ－００２(それぞれ配列番号２２６および配列番号２２７)を使用してカナマイシン耐性(ＫａｎＲ)遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄIIIで消化させ、ゲル精製、消化ｐＡＴＩＵ６プラスミドにライゲーションすることにより達成した。
その後のイテレーションで、単一点変異を、Ｑ５(登録商標)部位特異的変異導入キット(New England Biolabs)およびプライマーＡＰＲ－００３(配列番号２２８)およびＡＰＲ－００４(配列番号２２９)を使用してｐＵＣ１９複製起点でｐＡＴＩＫａｎプラスミドに導入して１４８位のヌクレオチドＴをＣに変えた。この変異により、複製起点が、プラスミドコピー数を減らすために、低コピー複製起点であるｐＢＲ３２２複製起点と相同となった。
Figure 2022524951000019
ｐＡＴＩ２.０
次の特性を含むプラスミドを設計し、合成した：ｐＢＲ３２２複製起点、ＳＶ４０ ＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)、ｒｒｎＢターミネーター、プロモーターおよびｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをクローニングするための隣接制限部位が続くｓｈＲＮＡの発現を駆動するためのＵ６プロモーター、ａｓｄ遺伝子、ｒｒｎＧターミネーター、除去のためのＨｉｎｄIII部位が隣接するカナマイシン耐性遺伝子および多クローニング部位(配列番号２４７)。さらに、２つの別々のｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの発現のためのプラスミドを設計し、合成した。このプラスミドは、次の特性を含む：ｐＢＲ３２２複製起点、ＳＶ４０ ＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)、ｒｒｎＢターミネーター、プロモーターおよびｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをクローニングするための隣接制限部位が続くｓｈＲＮＡの発現を駆動するためのＵ６プロモーター、第二のｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの発現を駆動するためのＨ１プロモーター、Ｈ１とＵ６プロモーター間に配置された４５０bpの無作為に産生されたスタッファー配列、ａｓｄ遺伝子、ｒｒｎＧターミネーター、除去のためのＨｉｎｄIII部位が隣接するカナマイシン耐性遺伝子および多クローニング部位(配列番号２４５)。
実施例６
ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子の欠失によるネズミチフス菌フラジェリンノックアウト
株操作および特徴づけ
この例では、ａｓｄ遺伝子欠失を含む生存弱毒化ネズミチフス菌ＹＳ１６４６株を、両フラジェリンサブユニットを除去するために、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子を欠失するようさらに操作した。これは、炎症促進性シグナル伝達を低減し、抗腫瘍適応免疫を改善するために、炎症促進性ＴＬＲ５活性化を排除する。
ｆｌｉＣ遺伝子の欠失
この例では、ｆｌｉＣ遺伝子を、上に詳述したDatsenko and Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000))の方法の変法を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ株の染色体から欠失させた。簡潔には、ｆｌｉＣ遺伝子に隣接する相同配列の２２４塩基および２４５塩基を含んだ合成ｆｌｉＣ遺伝子相同性アーム配列を、ｐＳＬ０１４７(配列番号２３０)と称するプラスミドにクローン化した。次いで、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位が隣接するカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１４７にクローン化し、ｆｌｉＣ遺伝子ノックアウトカセットを次いでプライマーｆｌｉｃ－１(配列番号２３２)およびｆｌｉｃ－２(配列番号２３３)でＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、次いでエレクトロポレーションにより温度感受性ラムダ・レッド組み換えプラスミドｐＫＤ４６を担持するＹＳ１６４６Δａｓｄ株に導入した。電気穿孔細胞をＳＯＣ＋ＤＡＰ培地およびカナマイシン(２０μg／mL)に回収し、ジアミノピメリン酸(ＤＡＰ、５０μg／mL)添加ＬＢ寒天プレートに播種した。コロニーを、プライマーｆｌｉｃ－３(配列番号２３４)およびｆｌｉｃ－４(配列番号２３５)を使用するＰＣＲにより、ノックアウトフラグメントの挿入のために選択し、スクリーニングした。次いで、選択したカナマイシン耐性株を４２℃で培養することによりｐＫＤ４６を除去し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングした。次いで、カナマイシン耐性マーカーをＣｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド(ｐＪＷ１６８)のエレクトロポレーションにより除去し、ＡｍｐＲコロニーを３０℃で選択した；ｐＪＷ１６８を、４２℃で増殖培養することにより、その後除去した。次いで、選択ｆｌｉＣノックアウトクローンを、破壊の部位(ｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４)に隣接するプライマーを使用するＰＣＲおよびアガロースゲル上での電気泳動移動度の評価により、カナマイシンマーカーの喪失について試験した。
ｆｌｊＢ遺伝子の欠失
次いで、ｆｌｊＢを上記方法の変法を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ株で欠失させた。ｆｌｊＢ遺伝子に隣接する、それぞれ、左手側および右手側配列の２４９塩基および２１３塩基を含む合成ｆｌｊＢ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１４８(配列番号２３１)と称するプラスミドにクローン化した。次いで、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位が隣接するカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１４８にクローン化し、ｆｌｊＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｆｌｊｂ－１(配列番号２３６)およびｆｌｊｂ－２(配列番号２３７)(表１参照)でＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、エレクトロポレーションにより温度感受性ラムダ・レッド組み換えプラスミドｐＫＤ４６を担持する株ＹＳ１６４６Δａｓｄに導入した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子を上記のとおりｃｒｅ介在組み換えにより除去し、温度感受性プラスミドを、非許容温度での増殖により除去した。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子ノックアウト配列を、それぞれプライマーｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４またはｆｌｊｂ－３(配列番号２３８)およびｆｌｊｂ－４(配列番号２３９)を使用するＰＣＲにより増幅し、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＹＳ１６４６のこの変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｉＣ／ΔｆｌｊＢまたは略してＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧと名付けた。
操作したネズミチフス菌フラジェリンノックアウト株のインビトロ特徴づけ
ここでＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧと称するｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ両者の欠失を有するＹＳ１６４６由来ａｓｄ－変異株を、水泳プレート(ＬＢ含有０.３％寒天および５０ ｍｇ／mL ＤＡＰ)に１０マイクロリットルの一夜培養物をスポットすることにより、水泳運動性を評価した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ株で運動性は観察されたが、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株で運動性は明らかではなかった。次いで、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株をａｓｄ遺伝子を含むプラスミドで電気穿孔し、ＤＡＰ非存在下でのその増殖速度を評価した。ａｓｄ補完プラスミドを有するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は、補助的ＤＡＰの非存在下でＬＢで複製でき、ａｓｄ補完プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ株と同等の速度で増殖した。これらのデータは、フラジェリンの除去がインビトロでのネズミチフス菌の適応度を減少させないことを示す。
鞭毛の排除は、マウスマクロファージにおけるパイロトーシスを低減させる
５×１０５マウスＲＡＷマクロファージ細胞(InvivoGen, San Diego, Ca.)を、ゲンタマイシン防御アッセイにおいて、約１００のＭＯＩで何れもａｓｄ補完プラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ株で感染させた。感染２４時間後、培養上清を集め、PierceTM LDH細胞毒性アッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma.)を使用して、細胞死マーカーとして乳酸デヒドロゲナーゼ放出をアッセイした。ＹＳ１６４６Δａｓｄ株は、７５％最大ＬＤＨ放出を誘導し、一方ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は５４％最大ＬＤＨを誘導し、感染マクロファージのネズミチフス菌誘導パイロトーシスが低減されることを示した。
鞭毛欠失変異体は、感染ヒト単球における低パイロトーシスをもたらす
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株がマクロファージで細胞死を引き起こす能力が低減していることを示すために、ＴＨＰ－１ヒトマクロファージ細胞(ATCC Catalog # 202165)を、プラスミド維持を確実にするために、機能的ａｓｄ遺伝子をコードするプラスミドを含むΔａｓｄ株と共にネズミチフス菌株ＹＳ１６４６およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧで感染させた。５×１０４細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳと９６ウェル皿に入れた。細胞を、細胞あたり１００CFUのＭＯＩで、１時間、洗浄したネズミチフス菌の対数期培養物で感染させ、次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地細胞外細菌を死滅させるために５０μg／mL ゲンタマイシンおよび単球をマクロファージ表現型に変換するための５０ng／mLのＩＦＮγを含む培地に置き換えた。２４時間後、ＴＨＰ－１細胞をCellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で染色し、生存可能細胞のパーセンテージを、発光を定量するためのSpectraMax(登録商標)プレートリーダーを使用する発光細胞生存能アッセイを使用して決定した。ＹＳ１６４６株で感染させた細胞は３８％生存能しか有さず、一方ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株で感染させた細胞は５１％生存能を有し、フラジェリン遺伝子の欠失は、極めて高くかつ超生理学的であるＭＯＩにも関わらず、ヒトマクロファージの細胞死をあまり誘導しないことを示した。
鞭毛は、全身投与後の腫瘍コロニー形成に必要ない
結腸癌のマウスモデルに投与されたフラジェリンノックアウト株の影響を評価するために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(５マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。１０日の確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、３×１０５CFUのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株または親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株を１回ＩＶ注射した。腫瘍植え込み３５日後、マウスを屠殺し、腫瘍を均質化し、腫瘍組織グラム当たりコロニー形成単位(CFU)数を数え上げるため、ＬＢプレートに播種した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株は、腫瘍組織グラムあたり平均５.９×１０７CFUで腫瘍にコロニー形成し、一方鞭毛欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株は、ほぼ２倍増加した平均１.１×１０８CFU／腫瘍組織ｇで腫瘍にコロニー形成した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株の脾臓コロニー形成は、平均１.５×１０３CFU／脾臓組織ｇと計算され、一方、鞭毛欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株の脾臓コロニー形成はわずかに少なく、平均１.２×１０３CFU／脾臓組織ｇであった。
これらのデータは、鞭毛の非存在がＩＶ投与後の腫瘍コロニー形成に負の影響を有するだけでなく、鞭毛インタクトな株と比較して腫瘍コロニー形成を増強することを示す。重要なことに、鞭毛の欠失は脾臓コロニー形成をわずかに低減させ、腫瘍対脾臓比を１００,０００倍とする。これらのデータは、技術からの予想に反し、鞭毛が腫瘍コロニー形成に不要であるだけでなく、その除去が、脾臓コロニー形成を低減させながら腫瘍コロニー形成を増加させることも示す。
鞭毛欠失株は、マウスで抗腫瘍活性増強を示す
結腸癌のマウスモデルに投与されたフラジェリンノックアウト株の影響を評価するために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(５マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、３×１０５CFUのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株またはＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株を１回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。マウスを、腫瘍増殖のノギス測定によりモニターした。
結果は、鞭毛を形成できないＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株が親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株と比較して腫瘍制御の増強(２７％ＴＧＩ、２４日目)、ＰＢＳ対照と比較して有意な腫瘍制御(７３％ＴＧＩ、ｐ＝０.０４、２４日目)を示した。これらのデータは、鞭毛が腫瘍コロニー形成に不要であるだけでなく、その喪失が抗腫瘍有効性を増強できることを示す。
鞭毛欠失株は、マウス腫瘍モデルにおける適応免疫増強を示す
鞭毛の欠失の免疫応答に対する影響およびＳｈＲＮＡのＳＴＩＮＧチェックポイント遺伝子ＴＲＥＸ１への腫瘍骨髄細胞送達によるＳＴＩＮＧ活性化が適応Ｉ型ＩＦＮ免疫シグネチャーを促進するか否かを評価した。結腸癌のＣＴ２６マウスモデルを使用し、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(５マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０６CFUのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株、親ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１またはスクランブルプラスミド対照株ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲを、腫瘍植え込み１１日後ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。マウスは、投与７日後、ナトリウムヘパリン被覆チューブ(Beckton Dickinson)に採血した。次いで、非凝固血液を同じ体積のＰＢＳで希釈し、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Lympholyte(登録商標)-M細胞分離試薬(Cedarlane)を使用して全血の相間層から分離した。単離ＰＢＭＣを、１３００RPMで３分間、室温での遠心分離によりＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、流動緩衝液に再懸濁した。１００万ＰＢＭＣを、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルあたりに播種した。細胞を１３００RPMで３分間、室温(ＲＴ)で遠心分離し、１００μLの蛍光色素コンジュゲートＡＨ１ペプチド：ＭＨＣクラスＩ四量体(MBL International)および細胞表面フローサイトメトリー抗体ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６.７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１.４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４.１５.２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５.５クローンＭ１／６９(全てBioLegend)を含む流動緩衝液に、４５分間、室温および暗所で再懸濁した。４５分後、細胞を、１２００RPMで３分間の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞をＤＡＰＩ(死／生存染色)含有ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、データをNovoCyte(登録商標)フローサイトメーター(ACEA Biosciences, Inc.)を使用してすぐに得て、FlowJoTMソフトウェア(Tree Star, Inc.)を使用して分析した。
次の細胞型を、総生存細胞のパーセンテージとして数えた：ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋好中球(おそらくＭＤＳＣであるが、エクスビボ機能的アッセイにおけるさらなる表現型決定が必要である)、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞および、マウス白血病ウイルス(ＭｕＬＶ)関連細胞表面抗原のエンベロープ遺伝子の産物であるＣＴ２６腫瘍拒絶抗原ｇｐ７０(ＡＨ１)を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞(Castle et al. (2014) BMC Genomics 15(1):190)。
下表に要約する結果は、非特異的スクランブルｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ株がＰＢＳ(ｐ＝０.０２)、鞭毛インタクトなＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株(ｐ＝０.０２)および、最低レベルの循環好中球を有した鞭毛欠失株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１(ｐ＝０.０１)と比較して、好中球の有意な増加の典型的抗細菌免疫プロファイルを示した。同様に、細菌性に誘導されるマクロファージも、ＰＢＳ(ｐ＝０.０１)、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＴＲＥＸ１株(ｐ＝０.０１)およびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株(ｐ＝０.０１)と比較して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｓｈＳＣＲ株に応答して有意に増加した。それ故に、Ｉ型ＩＦＮ誘導ペイロードを担持する両株は、好中球およびマクロファージを介して細菌感染を浄化し、適応Ｔ細胞介在免疫を誘導しない、正常抗細菌免疫応答を重ね書きできる。しかしながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的循環レベルは全群で類似したが、鞭毛欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｓｈＴＲＥＸ１株は、ＰＢＳと比較して、ＡＨ１－四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの有意な増加を示した(ｐ＝０.０４)。
これらのデータは、ウイルス様Ｉ型ＩＦＮ誘導プラスミドを腫瘍常在骨髄細胞に送達するよう細菌を操作する実現可能性を示す。これは、よりウイルス性であり、低細菌性である、免疫プロファイルに向けた、免疫応答の劇的再プログラム化をもたらした。鞭毛の欠失は、細菌性に動員された好中球およびマクロファージから、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加へのシフトをさらに増強させた。それ故に、細菌ＴＬＲ５介在炎症の排除が、適応免疫を増強し得る。
Figure 2022524951000020
鞭毛欠失株は、インビボで食細胞骨髄免疫細胞区画に制限される
文献によると、ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ株は、非食細胞へのＳＰＩ－１介在侵入に関連する多くの下流遺伝子の抑制を示す。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株も非食細胞取り込みを欠損するか否かを決定するために、細菌ｒｐｓＭプロモーター下にｍＣｈｅｒｒｙを構成的に発現するＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株を、ＭＣ３８皮下腫瘍担持マウス脇腹にＩＶ投与した。
ＭＣ３８(マウス結腸腺癌＃３８)モデルは、変異誘発を使用するＣＴ２６モデルと同様に導かれるが、ジメチルヒドラジンを用い、Ｃ５７ＢＬ／６マウス株である(Corbett et al. (1975) Cancer Res. 35(9):2434-9)。ＣＴ２６と同様に、皮下植え込みは、結腸に同所性に移植したときよりも、Ｔ細胞排除的であり、免疫抑制性である腫瘍微小環境をもたらした(Zhao et al. (2017) Oncotarget 8(33):54775-54787)。ＭＣ３８は、ＣＴ２６より高度な遺伝子変異量を有し、類似のウイルス由来ｇｐ７０抗原(ｐ１５Ｅ)はＣＤ８＋Ｔ細胞により検出され得るが、拒絶抗原とは考えられなかった。ＭＣ３８のバリアントは、チェックポイント治療に部分的に応答性であるが、ここで使用するＭＣ３８細胞を含む、細胞株の大部分のバリアントは、チェックポイント難治性およびＴ細胞排除的であると考えられる(Mariathasan et al. (2018) Nature 555:544-548)。
６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)の右脇腹に、ＭＣ３８細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)をＳＣ接種した。大きな確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、３４日目に１×１０６CFUのＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ株をＩＶ注射した。腫瘍をＩＶ投与７日後に摘出し、２～３mm片に切って、２.５mL 酵素ミックス(１mg／mLコラゲナーゼIVおよび２０μg／mL ＤＮａｓｅ Ｉ添加ＲＰＭＩ－１６４０ １０％ＦＢＳ)を満たしたgentleMACSTM Ｃチューブ(Miltenyi Biotec)に入れた。腫瘍片をOctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特異的解離プログラム(マウス移植腫瘍)を使用して解離し、全細胞調製物を、４５分間、３７℃で撹拌しながらインキュベートした。４５分のインキュベーション後、第二ラウンドの解離をOctoMACSTM(マウス移植腫瘍プログラム)を使用して実施し、得られた単細胞懸濁液を７０μMナイロンメッシュで濾過して５０mLチューブに入れた。ナイロンメッシュを５mLのＲＰＭＩ－１６４０ １０％ＦＢＳで１回洗浄し、細胞を、新規７０μMナイロンメッシュを使用して、新規５０mLチューブに２回目の濾過をして入れた。ナイロンメッシュを５mLのＲＰＭＩ－１６４０ １０％ＦＢＳで洗浄し、次いで、濾過細胞を１０００RPMで７分間遠心分離した。得られた解離細胞をＰＢＳに再懸濁し、染色過程前は氷上に維持した。
フローサイトメトリー染色のために、１００μLの単細胞懸濁液を、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに播種した。死／生存染色(Zombie AquaTM, BioLegend)およびＦｃ遮断試薬(BD Biosciences)を含むＰＢＳを１００μL／ウェルで加え、氷上で、３０分間、暗所でインキュベートした。３０分後、細胞を、１３００RPMで３分間の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体(ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６.７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１.４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４.１５.２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５.５クローンＭ１／６９、全てBioLegendから)を含むＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、氷上で、３０分間、暗所でインキュベートした。３０分後、細胞を、１３００RPMで３分間の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液(ThermoFisher Scientific)に再懸濁した。フローサイトメトリーデータをNovoCyte(登録商標)フローサイトメーター(ACEA Biosciences, Inc.を使用して取得し、FlowJoTMソフトウェア(Tree Star, Inc.)を使用して分析した。
結果は、腫瘍微小環境で、７.２７％の腫瘍浸潤単球が鞭毛欠失ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んだことを示す。同様に、８.９６％の腫瘍関連マクロファージ(ＴＡＭ)集団および３.３３％の腫瘍浸潤樹状細胞(ＤＣ)は鞭毛欠失ｍＣｈｅｒｒｙ株を取り込んだ。対照的に、間質および腫瘍細胞に対応するＣＤ４５－集団内で、わずか０.０７６％がｍＣｈｅｒｒｙ発現に陽性を示した(０.０６７％バックグラウンド染色と比較)。これらのデータは、鞭毛およびＳＰＩ－１に影響するその下流シグナル伝達が上皮細胞感染性を可能とするのに必要であり、その欠失は、細菌の取り込みを腫瘍微小環境の貪食免疫細胞区画(すなわち、腫瘍常在免疫／骨髄細胞)に限定することを示す。
鞭毛の欠失は、適応免疫を抑制するＴＬＲ５誘導炎症性サイトカインの除去、マクロファージパイロトーシスの低減および、取り込みが腫瘍常在食細胞に限定される、全身投与よる腫瘍特異的富化維持(または増強)を含む、複数の利益を免疫刺激性ネズミチフス菌株に与えること。
実施例７
プラスミド送達増強のためにｃｙｔｏＬＬＯを発現するよう操作したネズミチフス菌
この例では、実施例３に記載のＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株(ＡＳＴ－１０１)を、サルモネラのサイトゾル株に蓄積されるシグナル配列を欠くリステリオリシンＯ(ＬＬＯ)タンパク質(ここではｃｙｔｏＬＬＯと称する)を発現するようさらに修飾した。ＬＬＯは、リステリア・モノサイトゲネスから分泌されるコレステロール依存性孔形成細胞溶解素であり、細菌のファゴソーム回避に介在する。コドン２～２４欠失を有するＬＬＯをコードする遺伝子を、サルモネラでの発現に最適化したコドンで合成した。ｃｙｔｏＬＬＯのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の配列を配列番号２４０に示す。ｃｙｔｏＬＬＯ遺伝子を、ネズミチフス菌での転写を誘導するプロモーター制御下に置いた(配列番号２４１、下記複製)。ｃｙｔｏＬＬＯ発現カセットを、上記のとおり、Datsenko and Wanner(Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:6640-6645)の方法の変法を使用して、ａｓｄ欠失株ＡＳＴ－１０１のノックアウトａｓｄ座位に単一コピーで挿入した。
Figure 2022524951000021
ａｓｄ座位に挿入されたｃｙｔｏＬＬＯ発現カセットを有するａｓｄ欠失株(ここではＡＳＤ／ＬＬＯまたはＡＳＴ－１１４と称する)を、株が外来性ＤＡＰ非存在下で増殖し、プラスミド維持について選択することを可能とし、また上記のとおりｓｈＴＲＥＸ１の発現を駆動するＵ６プロモーターを含むａｓｄ遺伝子をコードするｐＡＴＩプラスミドのエレクトロポレーションによりさらに修飾した(ここではＡＳＤ／ＬＬＯ(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)またはＡＳＴ－１１５とも称する)。ＡＳＤ／ＬＬＯ(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)株、ＡＳＴ－１１５は同じプラスミドを含むａｓｄ欠失株(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)、ＡＳＴ－１１０と同様の速度で増殖し、ＬＬＯノックインはインビトロで細菌適応度に影響しないことを示す。
ｃｙｔｏＬＬＯを産生するよう操作したネズミチフス菌は、強力な抗腫瘍活性を示す
ｃｙｔｏＬＬＯ遺伝子ノックインが抗腫瘍有効性を提供するか否かを決定するために、ＡＳＤ／ＬＬＯ(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)株ＡＳＴ－１１５を結腸癌のマウスモデルで評価した。この試験について、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(８マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０６CFUのＡＳＴ－１１５を１回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
株ＡＳＤ／ＬＬＯ(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)へのｃｙｔｏＬＬＯ遺伝子付加は、ＰＢＳ対照と比較して高度に有意な腫瘍制御(７６％ＴＧＩ、ｐ＝０.００２、２８日目)および１回投与後、ＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド含有株を複数回与えた先の試験と同等な有効性を提供した。これらのデータは、ｃｙｔｏＬＬＯが、大きな遺伝子ノックダウンをもたらす、より多くのプラスミドをサイトゾルに送達する利点をもたらし、それによりＴＲＥＸ１などの標的に対するＲＮＡｉの治療有効性を改善することを示す。
実施例８
ネズミチフス菌のアデノシン栄養要求性株
ここに提供される株は、アデノシンに対して栄養要求性であるよう操作される。その結果、低アデノシン濃度の正常組織で複製できず、それ故に、アデノシンレベルが高い固形腫瘍微小環境に主にコロニー形成するために、インビボで弱毒である。サルモネラ株ＹＳ１６４６(ＡＳＴ－１００)は野生型株ＡＴＣＣ １４０２８の誘導体であり、ｐｕｒＩ遺伝子破壊によりプリンに対して栄養要求性であるよう操作された(Low et al., (2004) Methods Mol. Med 90:47-60)。ＹＳ１６４６のゲノム全体のその後の分析により、ｐｕｒＩ遺伝子(ｐｕｒＭと同義)が実際欠失しているのではなく、染色体逆位により破壊され(Broadway et al. (2014) J.Biotechnol. 192:177-178)、遺伝子全体がなお挿入配列(その一方はアクティブなトランスポザーゼを有する)が隣接するＹＳ１６４６染色体の２つの部分内に含まれることを示した。染色体再係合の手段により破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝的配列の存在は、野生型遺伝子への復帰の可能性を残す。ＹＳ１６４６のプリン栄養要求性がインビトロで連続継代後安定であったことが先に示されたが、復帰率は未知であった(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002)。
アデノシンと共に提供されたとき、ＹＳ１６４６は最小培地で複製できる；一方野生型親株ＡＴＣＣ １４０２８は、アデノシンを添加していない最小培地で増殖できることがここで示された。ＹＳ１６４６を一夜ＬＢ培地で増殖し、Ｍ９最小培地で洗浄し、アデノシンを含まないまたは漸増濃度のアデノシンを含むＭ９最小培地で希釈した。増殖SpectraMax(登録商標)M3分光光度計(Molecular Devices)を使用して、３７℃で測定し、１５分毎にＯＤ６００を読んだ。
ＹＳ１６４６は、アデノシンが１１～３００マイクロモル濃度範囲の濃度で提供されたとき複製できたが、Ｍ９単独または１３０ナノモル濃度アデノシン添加Ｍ９で完全に複製不可能であった。これらのデータは、ｐｕｒＩ変異体が腫瘍微小環境でみられるアデノシン濃度で複製できるが、正常組織でみられる濃度ではできないことを示す。ここに例示する操作したアデノシン栄養要求性株は、野生型への復帰を防止するために、染色体からｐｕｒＩオープンリーディングフレームの全てまたは一部が欠失した株を含む。このような遺伝子欠失は、上記のとおりラムダ・レッド系を利用して達成され得る。
ｐｕｒＩ破壊を含み、上記のとおりａｓｄ遺伝子欠失(ＡＳＤ)を含むようにまたはａｓｄ遺伝子欠失を含み、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ(ＡＳＤ／ＦＬＧ)の欠失を有するようにさらに操作した(実施例６に記載のとおり)さらに操作したサルモネラ株またはｃｙｔｏＬＬＯ(ＡＳＤ／ＬＬＯ)を発現するようさらに操作され(実施例７に記載のとおり)、ａｓｄ(それぞれ株ＡＳＴ－１１７、ＡＳＴ－１１８およびＡＳＴ－１１９)を発現する低コピー数プラスミド(ｐＡＴＩｌｏｗ)で補完されたａｓｄ変異体も、Ｍ９最小培地での増殖を評価した。データは、各株が、アデノシンが１１～３００マイクロモル濃度範囲の濃度で提供されたとき複製可能であるが、Ｍ９単独または１３０ナノモル濃度アデノシン添加Ｍ９で完全に複製不可能であったことを示した。
実施例９
インビトロでのａｓｄ遺伝子補完系の特徴づけおよび使用
ａｓｄ遺伝子補完を有する株の増殖
プラスミドを含む細菌株の適応度を評価するために、増殖曲線をSpectraMax(登録商標)プレートリーダーで３７℃を使用してＬＢ液体培地で実施し、ＯＤ６００を１５分毎に読んだ。低コピープラスミドｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１を含むＹＳ１６４６(ＡＳＴ－１０４)は、プラスミドを含まないＹＳ１６４６(ＡＳＴ－１００)と同等に増殖した。ａｓｄ栄養要求性を補完し得るａｓｄ遺伝子を有する高コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを担持するａｓｄ変異株(ＡＳＴ－１１０)は、ＤＡＰ非存在下でＬＢで複製できたが、ＹＳ１６４６よりゆっくり増殖した。低コピー数複製起点およびａｓｄ栄養要求性を補完し得るａｓｄ遺伝子を有するｓｈＴＲＥＸ－１発現プラスミドを含むａｓｄ欠失株(ｐＡＴＩ Ｌｏｗ－ｓｈＴＲＥＸ１)、株ＡＳＴ－１１７は、ＡＳＴ－１１０より速い速度で増殖した。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子栄養要求性を補完する低コピー数プラスミドが、インビトロでのネズミチフス菌のより迅速な複製を可能とするため、高コピー数プラスミドよりも優れていることを示す。
ａｓｄ補完株の細胞内増殖
高および低コピー数プラスミドで補完されたａｓｄのａｓｄ変異体の適応度を測定するために、細菌株がマウス腫瘍細胞株の細胞内で複製する能力を、ゲンタマイシン防御アッセイを使用して評価した。このアッセイで、マウス黒色腫Ｂ１６.Ｆ１０細胞またはマウス結腸癌ＣＴ２６細胞を、相補的ａｓｄ遺伝子を含むプラスミドを含み、高コピー複製起点、ＡＳＴ－１１０(ＡＳＤ ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)または低コピー複製起点、ＡＳＴ－１１７(ＡＳＤ ｐＡＴＩ低コピー－ｓｈＴＲＥＸ１)を有する、ａｓｄ変異体サルモネラ株で感染させた。細胞を、細胞あたり約５細菌の多重度で感染させ、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ゲンタマイシン含有培地を、細胞外細菌を死滅させるために加えた。細胞内細菌は、細胞膜を通過できないためゲンタマイシンにより死滅しない。感染後種々の時点で、細胞単層を水との浸透圧ショックにより溶解し、細胞可溶化物を希釈し、生存コロニー形成単位(CFU)を数え上げるためにＬＢ寒天に播種した。
高コピープラスミドで補完されたａｓｄ変異株、ＡＳＴ－１１０は初期にCFUが減少したが、Ｂ１６.Ｆ１０細胞で増殖でき、ＣＴ２６細胞ではできず、ａｓｄ遺伝子補完系が哺乳動物腫瘍細胞内で増殖の支持に十分であることを示す。低コピープラスミドを含むａｓｄ変異株、ＡＳＴ－１１７は、両細胞型に侵入および複製でき、低コピープラスミドのａｓｄ遺伝子補完が、哺乳動物細胞内で強いａｓｄ変異体増殖を可能とすることを示す。低コピープラスミドを有する株は、高コピープラスミドを有する株と比較して、両腫瘍細胞型で複製される数が多かった。これは、低コピープラスミドを有するサルモネラ株が、高コピープラスミドを有する株より増強された適応度を有することを示す。
ａｓｄ補完系を使用する腫瘍におけるプラスミド維持
この例では、ＣＴ２６腫瘍担持マウスを、ＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡ(ｐＥＱＵ６－ＴＲＥＸ１)を発現するプラスミドを含むＹＳ１６４６、株ＡＳＴ－１０４または機能的ａｓｄ遺伝子およびＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡを含むプラスミドを含むＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)、株ＡＳＴ－１１０で処理した。最終サルモネラ注射１２日後、腫瘍を均質化し、ホモジネートを連続希釈し、存在する総CFUを数え上げるためにＬＢ寒天プレートに播種しまたはカナマイシン耐性コロニー数を数え上げるためにカナマイシン含有ＬＢプレートに播種した。
ｓｈＲＮＡプラスミド、ＡＳＴ－１０４を維持する選択圧を有しないネズミチフス菌は、パーセントカナマイシン耐性(ＫａｎＲ)コロニーが１０％未満として、プラスミド喪失を示した。プラスミド維持のためにａｓｄ遺伝子補完系を使用した株、ＡＳＴ－１１０のカナマイシン耐性およびカナマイシン感受性CFUはほぼ同数であった。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子補完系がマウスにおける腫瘍微小環境の状況でのプラスミドの維持に十分であることを示す。
ａｓｄ補完系を使用する抗腫瘍有効性増強
ａｓｄ補完系を、インビボでプラスミド喪失を防止し、ネズミチフス菌株により送達される阻害性ＲＮＡの抗腫瘍有効性を増強するよう設計する。これを試験するために、ｓｈＴＲＥＸ１プラスミド(ＡＳＴ－１１０)または機能的ａｓｄ遺伝子カセットを含むスクランブル対照(ＡＳＴ－１０９)を含むａｓｄ欠失株を、マウス結腸癌モデルにおける抗腫瘍有効性について、ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１(ＡＳＴ－１０４、ａｓｄ遺伝子カセットを欠き、それ故にプラスミド維持の機構を有しないプラスミド)を含む株ＹＳ１６４６と比較した。この実験のために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(８マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０６CFUのＡＳＴ－１０９(ＰＡＴＩ－ｓｈスクランブルで形質転換したＡＳＤ)、ＡＳＴ－１１０(ＰＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換したＡＳＤ)またはＡＳＴ－１０４(ＰＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換したＹＳ１６４６)を８日目および１８日目に２回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。
ＹＳ１６４６株ＡＳＴ－１０４は、経時的プラスミド喪失が示されたにも関わらず、ＰＢＳと比較して、腫瘍制御を示した(７０％ＴＧＩ、２８日目)。ａｓｄ遺伝子補完系を有するｐＡＴＩプラスミドにスクランブル対照を含むａｓｄ－株(ＡＳＴ－１０９)は、ＰＢＳと比較して腫瘍制御を示し(５１％ＴＧＩ、２５日目)、ＣｐＧプラスミドの送達維持が抗腫瘍応答を刺激することを示した。ａｓｄ遺伝子補完系およびｓｈＴＲＥＸ１を有するプラスミドを含むａｓｄ－株(ＡＳＴ－１１０)は、ＰＢＳと比較して、最高の腫瘍増殖阻害を示した(８２％ＴＧＩ、ｐ＝０.００２、２５日目)。これらのデータは、ａｓｄ補完系およびｓｈＴＲＥＸ１送達を使用してプラスミド喪失を防止することにより、遺伝子補完系またはｓｈＴＲＥＸ１(治療産物)がないプラスミドを含むＹＳ１６４６と比較して、効力の改善を示すことを示す。
低コピープラスミドを有するネズミチフス菌株は、高コピープラスミドを有する株と比較して、優れた抗腫瘍有効性および腫瘍コロニー形成を示す
高コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドと比較したａｓｄ補完系を有する低コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドの抗腫瘍有効性を比較するために、結腸癌のマウスモデルで、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(１０マウス／群)に、ＣＴ２６細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０６CFUのＡＳＴ－１１７(ＡＳＤ(ｐＡＴＩ Ｌｏｗ－ｓｈＴＲＥＸ１))またはＡＳＴ－１１０(ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１)を２回の毎週ＩＶ注射し、陰性対照としてのＰＢＳ注射と比較した。低コピープラスミドを有する株、ＡＳＴ－１１７は、高コピープラスミドを有する株、ＡＳＴ－１１０と比較して、優れた抗腫瘍有効性を示した(高、５９％ＴＧＩ；低７９％ＴＧＩ、ｐ＝０.０４２、２５日目)。
この腫瘍増殖阻害試験の最後に、各群からの４匹のマウスを屠殺し、腫瘍および脾臓を上記のとおり均質化して、腫瘍コロニー形成および腫瘍対脾臓コロニー形成比を評価した。低コピープラスミドを含む株、ＡＳＴ－１１７は、高コピープラスミドを有する株、ＡＳＴ－１１０より１００倍を超える高いレベルで腫瘍にコロニー形成した。腫瘍および脾臓から回収されたコロニー比を計算したとき、ＡＳＴ－１１７は、ＡＳＴ－１１０と比較して１０倍を超える高い腫瘍対脾臓コロニー形成比を有し、低コピープラスミドを有する株が高コピープラスミドを有する株より腫瘍コロニー形成の特異性が大きいことが示された。
これらのデータは、プラスミドを送達するよう操作したネズミチフス菌が、改善された腫瘍コロニー形成能および抗腫瘍活性を有する以前には未知であった特性を示す。
実施例１０
忍容性増加のために操作した株の例
ａｄｒＡまたはｃｓｇＤ欠失
この例では、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含み、干渉ＲＮＡをコードするプラスミドを送達するよう操作した生存ネズミチフス菌の弱毒化株を、さらに修飾して、ネズミチフス菌バイオフィルム形成に必要な遺伝子であるａｄｒＡを欠失させた。バイオフィルムを形成できないサルモネラは宿主食細胞により迅速に取り込まれ、かつより迅速に浄化される。細胞内局在化のこの増加は、プラスミド送達およびＲＮＡ干渉による遺伝子ノックダウンの有効性を増強する。腫瘍／組織からの排除速度増加は、治療の忍容性を増加させ、バイオフィルム形成の欠失は、患者の補装具および胆嚢のコロニー形成を阻止する。
他の例において、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含み、治療産物をコードするプラスミドを送達するよう操作した生存ネズミチフス菌の弱毒化株を、ｃｓｇＤを欠失するようにも修飾した(を有する株の操作は下記)。この遺伝子は、ａｄｒＡの活性化を担い、ＴＬＲ２アゴニストであるクルリ線毛の発現も誘導する。ｃｓｇＤの喪失はまたバイオフィルム形成も阻止し、ＴＬＲ２活性化阻害、それによりさらに細菌病原性低減およびコード化治療産物の送達増強の利益を加える。
ｐａｇＰ欠失
この例では、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失およびａｓｄ遺伝子欠失を含み、干渉ＲＮＡをコードするプラスミドを送達するよう操作した生存ネズミチフス菌の弱毒化株を、ｐａｇＰを欠失するようさらに修飾した。ｐａｇＰ遺伝子は、ネズミチフス菌の感染性ライフサイクル中に誘導され、リピドＡをパルミトイル化する酵素をコードする。野生型ネズミチフス菌で、ｐａｇＰの発現は、ヘプタ－アシル化であるリピドＡをもたらす。リピドＡの末端アシル鎖が付加され得ないｍｓｂＢ－変異体で、ｐａｇＰの発現はヘキサアシル化ＬＰＳをもたらす。ヘキサアシル化ＬＰＳは、最も炎症促進性であることが示されている。この例では、ｐａｇＰおよびｍｓｂＢ欠失株がペンタアシル化ＬＰＳしか産生できず、細菌を、干渉ＲＮＡまたは他の治療産物を送達するよう操作したとき、低炎症促進性サイトカイン、忍容性増強および適応免疫増加を可能とする。
実施例１１
ｐａｇＰ欠失変異体はペンタアシル化ＬＰＳを誘導し、炎症性サイトカイン低減を誘導する
サルモネラｐａｇＰ遺伝子ノックアウト株操作および特徴づけ
ｐａｇＰ遺伝子を、先の実施例に記載する方法の変法を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株から欠失させた。ｐａｇＰ遺伝子は、ネズミチフス菌の感染性ライフサイクル中に誘導され、リピドＡをパルミチン酸で修飾する酵素(リピドＡパルミトイルトランスフェラーゼ)をコードする。野生型ネズミチフス菌で、ｐａｇＰの発現は、ヘプタ－アシル化であるリピドＡをもたらす。リピドＡの末端アシル鎖が付加され得ないｍｓｂＢ－変異体で、ｐａｇＰの発現はヘキサアシル化ＬＰＳをもたらす。ヘキサアシル化ＬＰＳは高度に炎症促進性であり、ＴＬＲ４(野生型でみられるヘプタアシル化ＬＰＳは、ＴＬＲ４に最高親和性を有する)に高親和性であることが示されている。この例では、ｐａｇＰおよびｍｓｂＢ欠失株がペンタアシル化ＬＰＳしか産生できず、細菌を免疫調節性タンパク質をコードするプラスミドを送達するよう操作したとき、ＴＬＲ４への低親和性により低炎症促進性サイトカイン、忍容性増強および適応免疫増加を可能とする。
ΔｐａｇＰ株構築
ｐａｇＰ遺伝子に隣接する、それぞれ左手側および右手側配列の２０３塩基および２７９塩基を含む合成ｐａｇＰ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１９１(配列番号３１５)と称するプラスミドにクローン化した。次いで、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位が隣接するカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１９１にクローン化し、ｐａｇＰ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｐａｇｐ－１(配列番号３２１)およびｐａｇｐ－２(配列番号３２２)(表１参照)でＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、エレクトロポレーションにより温度感受性ラムダ・レッド組み換えプラスミドｐＫＤ４６を担持する株ＹＳ１６４６Δａｓｄに導入した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子を上記のとおりｃｒｅ介在組み換えにより除去し、温度感受性プラスミドを、非許容温度での増殖により除去した。ｐａｇＰ遺伝子ノックアウト配列を、プライマーｐａｇｐ－３(配列番号３２３)およびｐａｇｐ－４(配列番号３２４)を使用するＰＣＲで増幅し、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＹＳ１６４６の得られた変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰと名付けた。
ｐａｇＰ欠失変異体はペンタアシル化ＬＰＳを有し、低減された炎症性サイトカインを誘導する
ｐａｇＰ遺伝子をまたDatsenko and Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000))および上記のとおりラムダ由来Ｒｅｄ組み換え系を使用してＹＳ１６４６Δａｓｄ株から欠失させ、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰを産生した。次いで、この株を機能的ａｓｄ遺伝子を含むプラスミドで電気穿孔し、欠失ａｓｄ遺伝子を補い、インビボでのプラスミド維持を確実とした。次いで、リピドＡをこの株から抽出し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化マススペクトロメトリー(ＭＡＬＤＩ ＭＳ)により評価し、野生型ネズミチフス菌株ＡＴＣＣ １４０２８、ＹＳ１６４６株(ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩを欠失)およびＹＳ１６４６Δａｓｄ株のリピドＡと比較した。野生型サルモネラは、機能的ｍｓｂＢ遺伝子の存在により、質量数２０３４のマイナーなリピドＡピークおよび質量数１７９６のにメジャーなピークを有し、それぞれ、ヘプタ－アシル化およびヘキサアシル化種に対応する。ｍｓｂＢ欠失株 ＹＳ１６４６およびＹＳ１６４６Δａｓｄは、ヘキサ－アシル化およびペンタアシル化ＬＰＳの混合物に対応する、１８２８および１５８５にメジャーなピークを有した。ｍｓｂＢおよびｐａｇＰ欠失株、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰは、ペンタアシル化ＬＰＳに対応する１５８５の質量の単一ピークのみ有した。これらのデータは、ｐａｇＰの欠失がＬＰＳのパルミトイル化を防止し、それにより単一ペンタアシル化種に限定することを示す。
ΔｐａｇＰ変異株からのペンタアシル化ＬＰＳがＴＬＲ４シグナル伝達を低減することを示すために、野生型株、ＹＳ１６４６株またはＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株からの４μgの精製ＬＰＳをＴＨＰ－１ヒト単球性細胞に加え、２４時間後、上清を、Cytometric Bead Array(ＣＢＡ)キット(BD Biosciences)を使用して炎症性サイトカインの存在について評価した。結果は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株からのＬＰＳは、野生型ＬＰＳと比較２５％の量のＴＮＦαを誘導し、野生型ＬＰＳより７倍少ないＩＬ－６を誘導することを示す。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株からのＬＰＳは、株ＹＳ１６４６より２２倍少ないＩＬ－６を誘導し、ΔｐａｇＰ変異体からのペンタアシル化ＬＰＳ種は、ヒト細胞に顕著に低炎症性であることを示し、ΔｐａｇＰ変異体がヒトでより忍容性が高いことを示す。
ＰａｇＰの欠失は、初代ヒトＭ２マクロファージで顕著に低ＩＬ－６を誘導する
ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株も初代ヒトＭ２マクロファージから低炎症性および用量規制ＩＬ－６を誘導することを示すために、株を評価し、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧおよび親ＹＳ１６４６株と比較した。ヒトドナー由来Ｍ２マクロファージは、Ｔ細胞排除的固形腫瘍に高度に富む免疫抑制性表現型の代表である。健常ヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを、完全培地(ＲＰＭＩ－１６４０＋１Ｘ非必須アミノ酸＋５％ヒトＡＢ血清)で解凍し、１０分間、８００RPMで室温で遠心分離して洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、単球をＣＤ１６枯渇キット(StemCell Technologies)を使用して負に単離した。次いで、単離した未利用単球をＰＢＳ＋２％ＦＢＳでの遠心分離により洗浄し、１００ng／mLヒトマクロファージコロニー刺激因子(Ｍ－ＣＳＦ)および１０ng／mLヒトＩＬ－４を含む完全培地に再懸濁した。次いで、単離単球(３ｅ５／ウェル)を、７５０μLの最終体積で２４ウェルプレートに播種した。播種２日後、細胞培養培地を完全に吸引し、１００ng／mLヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ng／mLヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地と置き換えた。２日後(４日目)、５００μLのサイトカイン含有完全培地を、４８時間ウェルあたりに加えた。６日目、細胞培養培地を完全に吸引し、サイトカイン単独の新鮮完全培地に、２０のＭＯＩでネズミチフス菌株の対数期培養物を含む培地を伴わずにまたは伴い、置き換えた。細胞を１時間感染させ、次いでＰＢＳで洗浄し、培地を５０μg／mL ゲンタマイシンを含む新鮮培地に置き換えて、細胞外細菌を死滅させた。次いで、ウェルを洗浄し、新鮮培地で置き換え、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、製造業者の指示(BD Biosciences)に従い、ヒトＩＬ－６サイトメトリックビーズアレイ(ＣＢＡ)を使用してサイトカインについてアッセイした。
結果は、親株ＹＳ１６４６で感染させたヒト初代Ｍ２マクロファージから分泌されるＩＬ－６レベルは、平均１４８３９±９２６pg／mLであり、一方、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株からのＩＬ－６レベルは、２０７５±７２３pg／mLで有意に低い(ｐ＝０.００４)ことを示す。これは、さらに鞭毛の欠失およびＴＬＲ５シグナル伝達の排除がＩＬ－６の誘導に影響することを確認する。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰは、３３２±１００pg／mLで最低ＩＬ－６レベルを誘導し、この修飾ＬＰＳコーティングがＴＬＲ４を誘導刺激する能力の低減と、得られた劇的に低減した炎症性ＩＬ－６産生を示す。
鞭毛およびｐａｇＰ欠失組み合わせは、マウスにおける忍容性を顕著に増強する
上記修飾株が親株ＹＳ１６４６より弱毒化されていることを示すため、中央致死用量(ＬＤ５０)試験を実施した。６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス(５マウス／群)に、株ＹＳ１６４６または誘導株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰを３ｅ５～３ｅ７CFUの用量範囲で静脈内注射した。株ＹＳ１６４６と異なり、誘導株は、全身投与したとき顕著な毒性を示す、ＦＤＡが承認したサイトカインであるマウスＩＬ－２をコードするプラスミドも担持する。株ＹＳ１６４６のＬＤ５０は４.４×１０６CFU(２試験の平均)であることが判明し、ＹＳ１６４６の先に公開されたＬＤ５０報告および野生型ネズミチフス菌と比較した＞１０００倍改善に一致した(Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002)。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株のＬＤ５０は２.０７×１０７CFUであることが決定され、株ＹＳ１６４６と比較して、病原性の４.５倍を超える低減が示された。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株のＬＤ５０は１.３９×１０６CFUであることが決定され、株がなお高度に炎症性の鞭毛を有することから、予想通りである、病原性の３.２倍低減を示した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株のＬＤ５０は、投与した最高用量で全てのマウスが死ななかったため確率されなかったが、＞６.２×１０７CFUであった。それ故に、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株は、親株ＹＳ１６４６と比較して、病原性の＞１４倍低減を示す。これらのデータは、上記遺伝子修飾が臨床的ネズミチフス菌株ＹＳ１６４６の病原性を低減し、それ故に、ヒトにおける忍容性増加に至ることを示す。
ＶＮＰ２０００９のフェーズＩ臨床試験で(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152)、細菌の患者の腫瘍への僅かな部分的存在が試験した２つの最高用量、３×１０８CFU／ｍ２(３３％存在)および１×１０９CFU／ｍ２(５０％存在)で観察され、ＶＮＰ２０００９の容認できる用量が腫瘍コロニー形成の達成に低すぎることが示された。上記修飾を介する株の忍容性改善により、必要であれば、＞１４倍高用量が投与でき、腫瘍にコロニー形成される患者のパーセンテージを改善し、腫瘍あたりの治療コロニー形成レベルを増加させ、それによりＶＮＰ２０００９で観察された問題を解決する。
鞭毛およびｐａｇＰ欠失組み合わせは、マウスにおける抗ネズミチフス菌抗体の産生を顕著に制限する
３×１０６CFU投与群(ＹＳ１６４６投与群でのＮ＝４以外、Ｎ＝５)からの生存マウスを、ＩＶ投与４０日後まで維持し、その時点で血清を採血し、ネズミチフス菌に対する抗体力価を、修飾フローベースの抗体力価測定系で評価した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙの一夜培養物を洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液で固定した。先に処置したマウスおよびナイーブ対照マウスからの血清を９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＳで連続希釈した。次に、２５μLの１×１０６CFUを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ培養物を血清に加え、２５分間、ＲＴでインキュベートした。次いで、細菌を４０００RPMで５分間回転させることにより、ＰＢＳで２回洗浄した。最後の洗浄後、細菌を、二次ヤギ抗マウスＦｃ ＡＦ４８８ Ａｂ含有ＰＢＳ(原液から１／４００希釈)に再懸濁し、２５分間、ＲＴで暗所でインキュベートした。次いで、細菌を４０００RPMで５分間回転させることにより、ＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後、細菌をＰＢＳに再懸濁し、データをNovoCyte(登録商標)フローサイトメーター(ACEA Biosciences, Inc.)を使用して取得し、MFI FlowJoTMソフトウェア(Tree Star, Inc.)を使用して分析した。
フローサイトメトリーによる結果評価のために、全群のシグナルがある最高の希釈を選択し(１２５０×血清希釈)、対応する平均蛍光強度(ＭＦＩ)値をプロットした。検出限界(ＬＯＤ)を、染色なしおよびヤギ抗マウスＦｃ ＡＦ４８８ Ａｂのみでのバックグラウンド染色で得られたＭＦＩであるため、１０００のＭＦＩと選択した。それ故に、１０００を超えるＭＦＩは陽性シグナルとみなされ、この値以下の全ては、ＭＦＩ値を有するにも関わらず、陰性結果とみなされた。
このアッセイの結果は、ＹＳ１６４６が血清抗体(非中和である)を産生できる先に公開されたデータに一致して、３×１０６CFUのＹＳ１６４６株(２９１９６.３±２０７３０)処置マウスからの抗ネズミチフス菌血清抗体の高ＭＦＩ力価を確認する。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株(１１２５７±９２９０)処置マウスで検出された抗体は少なく、これは、鞭毛からのアジュバント活性の欠如により得る。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株処置マウスで、株ＹＳ１６４と比較して６(ｐ＝０.０３３)、有意に少ない抗体が産生され(４４９４±３８６１)、これは、改変されたＬＰＳ表面コーティングにより得る。血清抗体の最も有意な低減は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ処置群(１９３０±２４４５)で示され、数匹のマウスが１０００未満のＭＦＩ力価を有し、故に、血清抗体陰性とみなされた(ｐ＝０.０２１、対株ＹＳ１６４６)。それ故に、鞭毛の欠失およびｐａｇＰ遺伝子の組み合わせは、安全性改善および免疫原性の顕著な低減を可能とし、ヒトでの高CFUの反復投与を可能とする。
ｐａｇＰおよび鞭毛欠失株およびその組み合わせは、ＹＳ１６４６と比較してヒト血清で顕著に高い生存能を示す
株ＹＳ１６４６(ＶＮＰ２０００９)は、ヒトにおいて全身投与後限定的な腫瘍コロニー形成を示す。株ＹＳ１６４６がヒト血液における補体因子により不活性化されることがここで示された。これを証明するために、株ＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂを、細菌の表面を変える付加的変異を有するここに提供される例示的免疫刺激性細菌と比較した。これらの例示的修飾株は、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰであった。これらの３株を、ＹＳ１６４６および大腸菌Ｄ１０Ｂ培養物に加えて、貯蔵マウス血液または貯蔵健常ヒトドナー(ｎ＝３)からの血清または熱不活性化(ＨＩ)血清と、３時間、３７℃でインキュベートした。血清とインキュベーション後、細菌を連続希釈し、ＬＢ寒天プレートに播種し、コロニー形成単位(CFU)を培養した。
マウス血清で、全ての株は１００％生存可能なままであり、補体不活性化に完全に耐性であった。ヒト血清で、全ての株は、熱不活性化血清で１００％生存可能なままであった。大腸菌Ｄ１０Ｂ株は、全ヒト血清から３時間後完全に排除された。全ヒト血清で、ＹＳ１６４６株はわずか６.３７％の生存コロニーを示し、ＹＳ１６４６臨床的株の腫瘍コロニー形成が、ヒト血液における補体不活性化のために、限定的であることを示した。ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株について、３時間ヒト血清とインキュベーション後、３１.４７％の生存コロニーが残り、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ株について、７２.９％の生存コロニーが残った。組み合わせＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株は、ヒト血清における補体に完全に耐性であった。
これらのデータは、全身投与したとき、株ＹＳ１６４６(ＶＮＰ２０００９)の腫瘍コロニー形成が極めて低い理由を説明する。株ＹＳ１６４６は、ヒト血清における補体不活性化に高度に感受性であるが、マウス血清では違うことがここで示された。これらのデータは、ヒトにおいて限定的腫瘍コロニー形成が観察され、マウス腫瘍が高レベルでコロニー形成するかを説明する。ｆｌｊＢ／ｆｌｉＣまたはｐａｇＰ欠失またはこれらの変異の組み合わせは、部分的にまたは完全にこの表現型奪還を奪還する。それ故に、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｐａｇＰ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株でヒト血清で観察される安定性増強は、ヒト腫瘍コロニー形成増加を提供する。
これらのデータおよびここに提供されるその他の知見は、鞭毛および／またはｐａｇＰの欠失が免疫刺激性細菌の腫瘍コロニー形成を増加させ、忍容性を改善し、抗腫瘍活性を増加させることを示す。例えば、ｐａｇＰ－である免疫刺激性細菌からのＬＰＳは、ＹＳ１６４６からのＬＰＳより２２倍低いＩＬ－６を誘導し、それ故にヒト細胞で低炎症性であることを示す。さらに、ＦＬＧ、ｈｉｌＡおよびｐａｇＰ欠失変異体の各々および全ては、ＹＳ１６４６より弱毒化されている(下記実施例１２参照)。フラジェリン－およびｐａｇＰ－の一方または両方である、野生型株を含むサルモネラ株などの免疫刺激性細菌は、腫瘍／腫瘍微小環境コロニー形成増加および抗腫瘍活性増加の性質を示す。このような株を使用して、免疫療法産物および／または他の抗腫瘍産物などの治療ペイロードを送達でき、またｈｉｌＡおよび／またはｍｓｂＢ欠失、アデノシン栄養要求性および本明細書の他の箇所に記載する他の性質などの治療性質を改善する修飾を含み得る。得られた株は、ある細胞への感染性、毒性細胞および腫瘍環境に提供されるプリンへの栄養要求性などの栄養要求を変える修飾により、腫瘍／腫瘍微小環境により効率的に標的化される。
実施例１２
ＦＬＧおよびＰａｇＰ欠失変異体は、マウスにおいてＹＳ１６４６より弱毒化されている
上記修飾株がＹＳ１６４６より弱毒化されているか否かを確認するため、中央致死用量(ＬＤ５０)試験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、漸増濃度のＹＳ１６４６、ＦＬＧ／ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ＴＲＥＸ１)、ＨｉｌＡ／ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ＴＲＥＸ１)またはＰａｇＰ／ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ＴＲＥＸ１)を静脈内注射した。ＹＳ１６４６のＬＤ５０はこの株の公開された報告に一致して、１.６×１０６cfuであることが判明した。ＨｉｌＡ／ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ＴＲＥＸ１)株のＬＤ５０は５.３×１０６cfuであることが判明し、病原性の３倍低減を示した。ＰａｇＰ／ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ＴＲＥＸ１)株のＬＤ５０は６.９×１０６cfuであることが判明し、病原性の４倍低減を示した。ＦＬＧ／ＡＳＤ(ｐＡＴＩ－ＴＲＥＸ１)株のＬＤ５０は＞７×１０６cfuであることが判明し、ＹＳ１６４６と比較した病原性の＞４.４倍低減を示す。これらのデータは、上記遺伝子修飾がネズミチフス菌治療の病原性を低減し、ヒトにおける忍容性増加に至ることを示す。ＶＮＰ２０００９のフェーズＩ臨床試験で(Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152)、患者の腫瘍における細菌の存在は、試験した２つの最高用量、３Ｅ８CFU／ｍ２(３３％存在)および１Ｅ９CFU／ｍ２(５０％存在)で部分的にしか観察されないことが示され、ＶＮＰ２０００９の容認できる用量は、コロニー形成の達成に低すぎることが示された。上記修飾を介する株の忍容性改善により、ＶＮＰ２０００９より高用量で投与され得る。これは、腫瘍コロニー形成した患者のパーセンテージおよび腫瘍あたりの治療コロニー形成のレベルを改善する。
実施例１３
ネズミチフス菌免疫モジュレーター株は、ヒト単球における異種タンパク質の発現を示す
上記のとおり、ｈｉｌＡ遺伝子およびフラジェリン遺伝子ｆｌｊＢおよびｆｌｉＣを、ａｓｄ遺伝子欠失と共にネズミチフス菌のＹＳ１６４６株から欠失させ、それぞれ株ＨｉｌＡ／ＡＳＤおよびＦＬＧ／ＡＳＤ株を得た。さらに、ＦＬＧ／ＡＳＤ株を、サルモネラのサイトゾル株に蓄積されるシグナル配列を欠くリステリオリシンＯ(ＬＬＯ)タンパク質(ＦＬＧ／ＡＳＤ／ｃＬＬＯ)を発現するようさらに修飾した。これらの株を、ＥＦ－１αプロモーターおよびマウスサイトカインＩＬ－２の発現カセットを含むプラスミドで電気穿孔した。さらに、ＦＬＧ／ＡＳＤ株を、非同族サイトカイン対照としてＩＬ－１５δの発現プラスミドで電気穿孔した。付加的構築物を、ＣＭＶプロモーターを使用して作った。
発現プラスミドを含むこれらの株がヒト単球に感染し、マウスＩＬ－２の産生を誘導するか否かを決定するために、ＴＨＰ－１ヒト単球性細胞を５０,０００細胞／ウェルでＲＰＭＩ(Corning)＋１０％Ｎｕ血清(Gibco)に、感染１日前播種した。細胞を、ＲＰＭＩで１時間、５０のＭＯＩで感染させ、次いでＰＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００μｇ／ml ゲンタマイシン(Sigma)に再懸濁した。上清を４８時間後９６ウェルプレートから回収し、ＥＬＩＳＡ(R & D Systems)によりマウスＩＬ－２の濃度を評価した。ＦＬＧ／ＡＳＤ－ＩＬ１５δ対照ウェルで検出されたＩＬ－２濃度は予想通り極めて低く、内因性ヒトＩＬ－２とのある程度の交差反応性を反映する可能性がある(６.５２pg／mL)。対照的に、ＦＬＧ／ＡＳＤ－ＩＬ－２株は、平均３５.１pg／mlを誘導し、ＦＬＧ／ＡＳＤ／ｃＬＬＯ株でさらに高く、５９.８pg／mLであった。最高のレベルがＨｉｌＡ／ＡＳＤ－ＩＬ－２株で検出され、１０３.４pg／mLであった。これらのデータは、ネズミチフス菌免疫モジュレータープラットフォーム株からのＩＬ－２などの機能的異種タンパク質の発現および分泌の実現可能性を示す。
実施例１４
ΔｈｉｌＡ変異体での細胞感染は、低ヒト上皮細胞感染をもたらす
ｈｉｌＡ欠失ネズミチフス菌株の上皮細胞に感染する能力が低減されていることを示すために、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞を次のネズミチフス菌株で感染させた：プラスミド維持のために機能的ａｓｄ遺伝子をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６およびＹＳ１６４６ΔａｓｄおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡ。１×１０６ ＨｅＬａ細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む２４ウェル皿に入れた。細胞を、ネズミチフス菌の対数期培養物で１時間感染させ、次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を、細胞外細菌を死滅させるために５０μg／mL ゲンタマイシン含有培地に置き換えた。４時間後、ＨｅＬａ細胞単層をＰＢＳで洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ×１００融解緩衝液で溶解して、細胞内細菌を放出させた。溶解物を連続希釈し、ＬＢ寒天プレートに播種して、細胞内細菌数を定量した。ｈｉｌＡ欠失を有する株は、機能的ｈｉｌＡ遺伝子を有する株と比較して回収CFUの９０％低減を示し、ｈｉｌＡの欠失が、上皮性由来細胞のネズミチフス菌感染を顕著に減少させることを示す。
実施例１５
ΔｈｉｌＡまたはΔｆｌｊＢ／ｆｌｉＣ変異体での細胞感染は、ヒトマクロファージにおける低パイロトーシスに至る
ΔｈｉｌＡまたはΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣネズミチフス菌株のマクロファージの細胞死を引き起こす能力の低減を示すために、ＴＨＰ－１ヒトマクロファージ細胞を次のネズミチフス菌株で感染させた：プラスミド維持を確実にするために機能的ａｓｄ遺伝子をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６およびＹＳ１６４６Δａｓｄ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡ。５×１０４細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む９６ウェル皿に入れた。細胞を、細胞あたり１００CFUのＭＯＩで、１時間、ネズミチフス菌の洗浄対数期培養物で感染させた、次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地細胞外細菌を死滅させるために５０μg／mL ゲンタマイシンおよび５０ng／mLのインターフェロンガンマを含む培地に置き換えた。２４時間後、ＴＨＰ－１細胞をCellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で染色し、生存可能細胞のパーセンテージを、発光を定量するためのSpectraMax(登録商標)プレートリーダーを使用する発光細胞生存能アッセイを使用して決定した。ｈｉｌＡ欠失株で感染させた細胞は約７２％生存可能細胞を有し、一方ＹＳ１６４６感染細胞はわずか３８％生存能を有し、ｈｉｌＡの欠失がヒトマクロファージの細胞死を防止することを示す。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣを含むプラスミドで感染させた細胞はそれぞれ４０％および５１％生存能を有し、フラジェリン遺伝子の欠失もヒトマクロファージの細胞死を防止することを示す。
実施例１６
ＩＬ－２発現カセットをコードするプラスミドを含む免疫刺激性ネズミチフス菌株でのヒトマクロファージ感染はＩＬ－２の分泌に至る
ヒトＴＨＰ－１マクロファージを次のネズミチフス菌株で感染させた：真核生物プロモーター制御下にマウスＩＬ－２の発現カセットおよびプラスミド維持を確実にするために機能的ａｓｄ遺伝子をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｃｙｔｏＬＬＯおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡ。５×１０４細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む９６ウェル皿に入れた。細胞を、細胞あたり５０CFUのＭＯＩで、１時間、ネズミチフス菌の洗浄対数期培養物で感染させ、次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を、細胞外細菌を死滅させるために５０μg／mL ゲンタマイシン含有培地に置き換えた。４８時間後、細胞上清を取り、R & D SystemsTM Mouse IL-2 Quantikine(登録商標)ＥＬＩＳＡキットを使用してマウスＩＬ－２について試験した。残存細胞をCellTiter-Glo(登録商標)試薬(Promega)で染色し、生存可能細胞のパーセンテージを、発光を定量するためのSpectraMax(登録商標)プレートリーダーを使用する発光細胞生存能アッセイを使用して決定した。マウスＩＬ－２の発現カセットをコードするプラスミドを含む、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ－ｃｙｔｏＬＬＯおよびＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡ株は、それぞれ３５pg／mL、６０pg／mLおよび１０３pg／mLのＩＬ－２を発現した。
実施例１７
マウスＩＬ－２を発現するネズミチフス菌株は、インビボで強力な腫瘍増殖阻害を示す
ネズミチフス菌のＹＳ１６４６株のｈｉｌＡまたはフラジェリン遺伝子ｆｌｊＢおよびｆｌｉＣに欠失を含む免疫刺激性ネズミチフス菌株をａｓｄ遺伝子欠失と合わせて、それぞれ、株Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡおよびΔａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣを形成した。これらの株を、ＥＦ１αプロモーターおよびマウスサイトカインＩＬ－２のための発現カセットを含むプラスミドで電気穿孔した。
ＩＬ－２発現プラスミドを含むネズミチフス菌株が抗腫瘍有効性を誘導することを示すために、ｍｕＩＬ－２プラスミドを含むΔａｓｄ／ΔｈｉｌＡ株またはｍｕＩＬ－２プラスミドを含むΔａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ株を、媒体対照と比較した。６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)の右脇腹に、ＭＣ３８細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)をＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、５×１０５CFUのΔａｓｄ／ΔｈｉｌＡ(ｐＡＴＩ－ｍｕＩＬ－２)、Δａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ(ｐＡＴＩ－ｍｕＩＬ－２)またはＰＢＳ媒体対照を８日目にＩＶ注射した。体重および腫瘍を週２回測定した。腫瘍測定を、電子ノギス(Fowler, Newton, MA)を使用して実施した。腫瘍体積を、修飾楕円体式、１／２(長さ×幅２)を使用して、計算した。マウスを、ＩＡＣＵＣ規制に従い、腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したときまたは壊死性となったとき、屠殺した。
実験は、Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡ(ｐＡＴＩ－ｍｕＩＬ－２)株が、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍制御を誘導することを示した(Ｐ＝０.００３、Ｄ２１)。これらのデータは、Δａｓｄ／ΔｆｌｊＢ／ΔｆｌｉＣ(ｐＡＴＩ－ｍｕＩＬ－２)株で観察されたものと同等であり、これも、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍増殖阻害を示した(Ｐ＝０.００５、Ｄ２１)。それ故に、両株は、結腸直腸癌のモデルで腫瘍増殖を強力に阻害するために、ＩＬ－２を発現する能力を示した。
実施例１８
サルモネラｃｓｇＤ遺伝子ノックアウト株操作および特徴づけ
ΔａｎｓＢ株構築
Ｌ－アスパラギナーゼIIをコードするａｎｓＢ遺伝子を、先の実施例に記載する方法の変法を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ株から欠失させた。ａｎｓＢ遺伝子が隣接する、それぞれ左手側および右手側配列の２３６塩基および２５１塩基を含む合成ａｎｓＢ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０２３０(配列番号３７７)と称するプラスミドにクローン化した。次いで、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位が隣接するカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０２３０にクローン化し、ａｎｓＢ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーａｎｓｂ－１(配列番号３７２)およびａｎｓｂ－２(配列番号３７３)でＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、エレクトロポレーションにより温度感受性ラムダ・レッド組み換えプラスミドｐＫＤ４６を担持する株ＹＳ１６４６Δａｓｄに導入した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子を上記のとおりｃｒｅ介在組み換えにより除去し、温度感受性プラスミドを、非許容温度での増殖により除去した。ａｎｓＢ遺伝子ノックアウト配列を、プライマーａｎｓｂ－３(配列番号３７４)およびａｎｓｂ－４(配列番号３７５)(表１参照)を使用するＰＣＲで増幅し、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＹＳ１６４６の得られた変異誘導体をＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢと名付けた。
株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢを、ネズミチフス菌クルリ線毛形成、セルロース産生およびｃ－ジ－ＧＭＰ産生を制御するマスター遺伝子であるｃｓｇＤを欠失するようさらに修飾した。ｃｓｇＤ欠失は、セルロース介在バイオフィルム形成の可能性を排除し、炎症促進性シグナル伝達を低減し、宿主食細胞による取り込みを増強する。細胞内局在化のこの増加は、それによりプラスミド送達および免疫調節性タンパク質産生の有効性を増強する。
ΔｃｓｇＤ株構築
ｃｓｇＤ遺伝子を、先の実施例に記載する方法の変法を使用して、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株から欠失させた。ｃｓｇＤ遺伝子に隣接して、それぞれ左手側および右手側配列の２０７塩基および２０９塩基を含む合成ｃｓｇＤ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１９６(配列番号３１６)と称するプラスミドにクローン化した。次いで、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位が隣接するカナマイシン遺伝子カセットをｐＳＬ０１９６にクローン化し、ｃｓｇＤ遺伝子ノックアウトカセットをプライマーｃｓｇｄ－１(配列番号３１７)およびｃｓｇｄ－２(配列番号３１８)でＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、エレクトロポレーションにより温度感受性ラムダ・レッド組み換えプラスミドｐＫＤ４６を担持する株ＹＳ１６４６Δａｓｄに導入した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子を上記のとおりｃｒｅ介在組み換えにより除去し、温度感受性プラスミドを、非許容温度での増殖により除去した。ｃｓｇＤ遺伝子ノックアウト配列を、プライマーｃｓｇｄ－３(配列番号３１９)およびｃｓｇｄ－４(配列番号３２０)を使用するＰＣＲで増幅し、ＤＮＡ配列決定により確認した。得られた親株ＹＳ１６４６の変異誘導体を、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤと名付けた。
Figure 2022524951000022
ｃｓｇＤ欠失株はコンゴーレッドプレートでＲＤＡＲコロニーを形成できない
コンゴーレッドプレートで増殖後にラフ・ドライ・アンド・レッド(ＲＤＡＲ)コロニーを形成する能力は、細菌バイオフィルム形成について十分に検証されたアッセイである。粗くかつ乾燥した質感は、セルロース産生に由来し、赤色は、クルリ線毛表面構造による色素蓄積による。このアッセイについて、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株を、コンゴーレッド寒天プレートでインキュベーション後、ＲＤＡＲ表現型を形成する能力について、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株と比較した。コンゴーレッド寒天プレートを、ソイトン(１０ｇ／Ｌ)および酵母抽出物(５ｇ／Ｌ)(ＮａＣｌ不含修飾ＬＢ)を用い、コンゴーレッド(４０mg／Ｌ)およびクマシーブリリアントブルーＧ－２５０(２０mg／Ｌ)を補って調製した。５マイクロリットルの静止期細菌培養物をコンゴーレッドプレートにスポットし、３７℃で１６時間インキュベートし、次いで３０℃に移し、さらに１２０時間インキュベートした。コロニー形態および色の目視による分析を実施し、ＲＤＡＲコロニー形態型の存在または非存在を確認するため連日記録した。
２つの株のコロニー形態型を比較すると、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株は、平滑な表現型を有し、コロニーは色がない。比較して、ｃｓｇＤ遺伝子をなお含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株は、古典的な粗野かつ乾燥した見掛けおよび色素取り込みの明確な証拠を示した。それ故に、機能的アッセイは、クルリ線毛およびセルロース産生を欠くため、ΔｃｓｇＤ株がバイオフィルムを形成できないことを確認する。
ｃｓｇＤ欠失株は、トリプルネガティブ乳癌の高度難治性マウスモデルで優れた抗腫瘍有効性を示す
免疫刺激性細菌治療が腫瘍にコロニー形成するが、有効性が限定的であるモデルにおける、ｃｓｇＤ欠失の影響を評価した。これは、腫瘍常在骨髄細胞への取り込みを限定し得て、それにより治療利益を制限する、細菌産生セルロースの存在を示し得る(Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。ヒトトリプルネガティブ乳癌の代表的モデルである処置困難ＥＭＴ６モデルを利用した(Yu et al. (2018) PLoS ONE 13(11):e0206223)。ＥＭＴ６腫瘍細胞を乳房脂肪体に同所性に投与したとき、脇腹への皮下とは逆に、モデルは、Ｔ細胞排除性、高度に転移性かつ、全ての承認されたチェックポイント抗体を含む免疫療法に高度に難治性である(Mariathasan et al. (2018) Nature 554: 544-548)。
この実験のために、６～８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(５マウス／群)に、ＥＭＴ６腫瘍細胞(１００μL ＰＢＳ中２×１０５細胞)を左乳房脂肪体に接種した。１３日齢の確立された乳房腫瘍(約５５mm３)を担持するマウスに、１×１０７CFUのｃｓｇＤ欠失株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤまたは親ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ株を１回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。細菌株は、構成的活性型マウスＳＴＩＮＧを発現するプラスミドを含んだ(ＥＦ１ａ ｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ、詳細について下記実施例参照)。
ＰＢＳ処置マウスの腫瘍は一定に増殖し続け、３５日目に最大腫瘍体積に達した(１１９９.０±２９８.１mm３)。ｃｓｇＤインタクトな株、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢで処置したマウスは、このモデルで抗腫瘍有効性を示さず、同様に３５日目に最大腫瘍体積に達した(１６８９.１±５３７.０)。これらの腫瘍のエクスビボＬＢ播種は、全腫瘍のコロニー形成を示した。しかしながら、ｃｓｇＤ欠失株、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤは、５匹のマウス中３匹の原発およびあらゆる転移疾患両者の完全治癒をもたらした(６０＋日目)。ＴＧＩ全体は４５.７％であり、残り２匹のうち１匹の腫瘍は部分的応答し、その後最終的に増殖した。２つの細菌株は同じプラスミドペイロードを含んだが、一方のみが顕著な有効性を示した。それ故に、最も難治性かつ高度に転移性の同系腫瘍モデルの一つである同所性ＥＭＴ６で、ｃｓｇＤ欠失を有する株は全身抗腫瘍有効性を誘導し、６０％の完全奏効をもたらすことができた。
ｃｓｇＤ欠失株は、インビボ細胞内取り込み増強を示す
ｃｓｇＤ欠失株が腫瘍常在骨髄細胞への大きな細菌取り込みにより有効性改善を示すか否かを決定するために、エクスビボゲンタマイシン防御アッセイを実施した(ｓｅｅ、Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233)。この実験のために、６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(４マウス／群)の右脇腹に、ＭＣ３８細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)をＳＣ接種した。大きな確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、１７日目に１×１０７CFUのｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ株(Ｎ＝１２)または親ＹＳ１６４６株(Ｎ＝４)をＩＶ注射した。腫瘍をＩＶ投与７日後摘除し、重さを量り、１mg／mLコラゲナーゼIVおよび２０mg／mL ＤＮａｓｅ Ｉ添加ＲＰＭＩ中で刻み、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートして、単一細胞懸濁液を得た。３０分後、懸濁液を７０mmフィルターを通し、回収した体積を２つの別の、同一サンプルに分割した。ゲンタマイシン(Thermo Fisher Scientific)を、対のサンプルの各々の一方に２００mg／mLで加え、細胞外細菌を死滅させ、サンプルを振盪しながら３７℃で９０分間インキュベートした。次いで細胞懸濁液サンプルを洗浄し、０.０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで溶解し、ＣＦＵのために播種した。
結果は、ゲンタマイシン処置を伴わないＹＳ１６４６処置腫瘍のＣＦＵと比較して(１１９２５±１９８５９CFU)、ゲンタマイシン処置は、腫瘍で検出されるＣＦＵをほとんどなくした(５１±４５CFU)。これは、細菌が大部分これら腫瘍の細胞外に常在し、故に、ゲンタマイシン排除に感受性であったことを示す。ｃｓｇＤ欠失ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ／ΔｐａｇＰ／ΔａｎｓＢ／ΔｃｓｇＤ処置群において、非ゲンタマイシン処置腫瘍は、十分にコロニー形成した腫瘍からの予想どおり高ＣＦＵをもたらし、ゲンタマイシンでの処置は、低ＣＦＵ(１２７６±２４１０CFU)をもたらし、親ＹＳ１６４６株処置腫瘍よりはるかに多かった。これは、ｃｓｇＤ欠失細菌の大部分が細胞内に常在し、故にゲンタマイシンから保護されるためである。これらのデータは、ｃｓｇＤ欠失が細胞内細菌の取り込みを改善し、これはインビボで免疫調節性タンパク質のプラスミド送達を増強し得ることを示す。
実施例１９
プラスミド構築
ｐＡＴＩ－１.７５と名付けたプラスミドを設計し、合成した；それはは、次の特性を含む：ｐＢＲ３２２複製起点、ａｓｄ遺伝子、除去のためのＨｉｎｄIII部位が隣接するカナマイシン耐性遺伝子および発現カセット挿入のための多クローニング部位。ベクターをｐＡＴＩ－１.７５と名付けた。発現カセットは、種々の配置で組み立てられる、真核生物プロモーター、オープンリーディングフレーム、転写後制御要素およびポリアデニル化シグナルを含む、複数の要素からなる。
プロモーターの例は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)最初期エンハンサー配列のすぐ下流でコード化されるヒトＣＭＶ最初期コアプロモーターおよびヒト伸長因子－１アルファ(ＥＦ－１α)のコアプロモーターを含む。オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)は、各々タンパク質に翻訳され得て、２Ａ配列の挿入により別々のポリペプチドに分離され、それにより真核生物リボソームが２Ａ配列内のＧｌｙ残基とＰｒｏ残基間のペプチド結合の挿入ができなくなる、１以上の配列を含み得る。２Ａ配列の例は、Thosea asignaウイルス(ＴａＶ)カプシドタンパク質からのＴ２Ａペプチドおよび豚テシオウイルス(ＰＴＶ)からのＰ２Ａペプチドである。上流フーリン開裂部位(ＲＲＫＲ)および他のエンハンサー要素は発現タンパク質の開裂を促進するために上流に配置される。
転写後制御要素(ＰＲＥ)の例は、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ(ＷＰＲＥ)およびＢ型肝炎ウイルスＰＲＥ(ＨＰＲＥ)を含み、これは、サイトゾルへのｍＲＮＡ核輸出を促進し、３’末端処理および安定性を増強することにより、遺伝子のサイトゾルｍＲＮＡの蓄積を増加させる。ポリアデニル化シグナル配列の例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびウシ増殖ホルモンポリアデニル化シグナルを含み、この何れも、転写停止促進に働き、ＲＮＡ開裂複合体により認識される配列モチーフを含む、３’制御要素である。
実施例２０
インターフェロン症を促進する遺伝子における機能獲得型変異の同定
未知病因の重度自己炎症状態および血管障害を提示する対象の症例が起こり、しばしば変異に由来する。これら状態の原因は同定され得る。このような病理の変異的背景を同定するための過程は次のとおりである。第一段階で、インタクトなゲノムＤＮＡを、症状を示す患者および健常個体から得る。全エクソームシーケンスを実施し、次いでイントロンおよびエクソンを分析する。遺伝子分析およびＩ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現と関連する経路における産物の変異の同定を実施する。下表(および詳細な記載において)は、コード化タンパク質の構成的機能的活性化およびその後のＩ型ＩＦＮの永続性発現をもたらすことが知られる遺伝子の変異を挙げる。変異の同定後、同定された変異を有するまたは有しない完全長遺伝子をコードするｃＤＮＡを、Ｉ型ＩＦＮの発現の指標であるレポーター細胞株にトランスフェクトする。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βのためのプロモーターの制御下にあるレポーター細胞株が産生され得る。構成的活性である機能獲得型変異体はＩＦＮ－βの発現を促進し、一方非刺激野生型(ＷＴ)タンパク質はしない。既知ＳＴＩＮＧ ＳＡＶＩ(乳児期発症ＳＴＩＮＧ関連脈管障害)変異体の場合、ＩＦＮ－βのＷＴ－ＳＴＩＮＧ刺激は、直接ＷＴ－ＳＴＩＮＧを活性化するために増加させた外の付加を必要とする。構成的活性変異は、ｃＧＡＭＰ非依存的様式でＩＦＮ－βの発現を刺激する。ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７の各々の機能獲得型変異の例を下に示す。機能獲得型変異が対象で同定されるかインビトロ変異およびスクリーニングにより産生されることができる他のこのような遺伝子は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、これらに限定されない。
Figure 2022524951000023
配列番号３０５～３０９に示すヒトＳＴＩＮＧの配列を基準として、アミノ酸残基Ｒ１９７、Ｄ２０５、Ｒ３１０、Ｒ２９３、Ｔ２９４、Ｅ２９６、Ｓ２７２、Ｑ２７３、Ｅ３１６、Ｄ２３１、Ｒ２３２、Ｋ２３６、Ｓ３５８、Ｅ３６０、Ｓ３６６およびＲ２３８は、それぞれ、配列番号３５１に示すマウスＳＴＩＮＧの配列を基準として、アミノ酸残基Ｒ１９６、Ｄ２０４、Ｒ３０９、Ｒ２９２、Ｔ２９３、Ｅ２９５、Ｓ２７１、Ｑ２７２、Ｅ３１５、Ｄ２３０、Ｒ２３１、Ｋ２３５、Ｓ３５７、Ｅ３５９、Ｓ３６５およびＲ２３７に対応する。
置換の各々の保存的置換も含まれる(各アミノ酸について保存的変異の例を挙げる、定義セクションにおける表参照、すなわち、野生型がＳｅｒではないＳｅｒについてＡｌａ)。
変異の同定後、同定された変異を有するまたは有しない完全長遺伝子をコードするｃＤＮＡを、Ｉ型ＩＦＮの発現の指標であるレポーター細胞株にトランスフェクトする。例えば、ルシフェラーゼの発現がＩＦＮ－βのためのプロモーターの制御下にあるレポーター細胞株が産生され得る。構成的活性である機能獲得型(ＧＯＦ)変異体はＩＦＮ－βの発現を促進し、一方非刺激野生型(ＷＴ)タンパク質はしない。既知ＳＴＩＮＧ ＳＡＶＩ(乳児期発症ＳＴＩＮＧ関連脈管障害)変異体の場合、ＩＦＮ－βのＷＴ－ＳＴＩＮＧ刺激は、直接ＷＴ－ＳＴＩＮＧを活性化するためにｃＧＭＡＰの漸増外因性レベルの付加を必要とする。構成的活性変異は、ｃＧＡＭＰ非依存的様式でＩＦＮ－βの発現を刺激する。ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７の各々の機能獲得型変異の例を上に示し、本明細書の他の箇所に記載する。機能獲得型変異が対象で同定されるかインビトロ変異およびスクリーニングにより産生されることができる他のこのような遺伝子は、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－５、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ９、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００を含むが、これらに限定されない。機能獲得型変異は、Ｉ型ＩＮＦの発現を増加させるかまたは発現を構成的とする。
ヒト細胞における機能的構成的Ｉ型ＩＦＮ変異体の発現
特異的ヒトＳＴＩＮＧ(アレルＲ２３２)およびＩＲＦ３機能獲得型(ＧＯＦ)変異体をｐＡＴＩ－１.７５ベクターにクローン化し、配列をＰＣＲにより確認した。ＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３ ＧＯＦ発現プラスミドがヒト細胞で機能的Ｉ型ＩＦＮを誘導できるか否かを決定するために、プラスミドを内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧヌルレポーター細胞(InvivoGen)を使用して評価した。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ刺激応答要素(ＩＳＲＥ)プロモーターの制御下に置かれた分泌型胚アルカリホスファターゼ(ＳＥＡＰ)を発現し、ＩＳＲＥのコード配列は、ノックイン技術を使用してＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。Ｉ型インターフェロン活性を、細胞上清におけるＩ型ＩＦＮ刺激ＳＥＡＰ産生のモニタリングにより評価し得る。
ＧＯＦ変異体によるＩ型ＩＦＮの相対的産生を試験するために、１×１０５ 293T-DualTMヌル細胞を１日前にポリ－Ｌ－リシンで被覆されたプレートに播種し、２４ウェルプレートで８０％コンフルエンシーを達成した。トランスフェクション当日、２００ngのＳＴＩＮＧ野生型(ＷＴ)およびＩＲＦ３ ＷＴ対照およびヒト細胞で非機能的であることが文献で報告されている(Ｖ１５５Ｒ、ＳＴＩＮＧにおいて)陰性対照(ＮＣ)変異を含む、一団のＳＴＩＮＧおよびＩＲＦ３ ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドを無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でFuGENE(登録商標)トランスフェクション試薬(Promega)に加えた。一夜インキュベーション後各サンプルからの細胞培養上清を集め、１０μLの細胞培養上清を５０μL QUANTI-BlueTM試薬(InvivoGen)(ＳＥＡＰ測定のために使用)に加えた。Ｉ型インターフェロン活性化を、６５０nmの吸光度でSpectraMax(登録商標)Ｍ３分光光度計(Molecular Devices)でのＩＳＲＥ誘導ＳＥＡＰ活性の測定により決定した。
下表に示すとおり、全ＧＯＦ変異体は、Ｉ型ＩＦＮ活性を誘導しなかった野生型および陰性対照と比較して、ヒト細胞においてＳＴＩＮＧリガンド非依存的様式でＩ型ＩＦＮ活性を誘導できた。最高のレベルのＩ型ＩＦＮ誘導は、ヒトＳＴＩＮＧ Ｒ２８４ＧおよびＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄリン酸化模倣体バリアントで得られた。これらのデータは、ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドが、ｃＧＡＭＰ非依存的様式でＩ型ＩＦＮを誘導できる機能的、構成的ＳＴＩＮＧおよび構成的リン酸化模倣体ＩＲＦ３を産生する能力を支持する。
Figure 2022524951000024
構成的Ｉ型ＩＦＮ変異体をコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株の感染は、ヒトＭ２マクロファージをＩ型ＩＦＮ産生Ｍ１マクロファージに変換する
構成的Ｉ型ＩＦＮ ＧＯＦバリアントをコードするプラスミドを含む鞭毛欠失株で感染させた初代ヒトＭ２マクロファージが、Ｉ型ＩＦＮおよびＣＸＣＬ１０(ＩＰ－１０としても知られる)などの下流ケモカインのプロデューサーに変換されるか否かを決定した。
健常ヒトドナーから単離した凍結ヒトＰＢＭＣを、完全培地(ＲＰＭＩ－１６４０＋１Ｘ非必須アミノ酸＋５％ヒトＡＢ血清)で解凍し、１０分間、８００RPMで室温で遠心分離して洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、単球をＣＤ１６枯渇キット(StemCell Technologies)を使用して負に単離した。次いで、単離した未利用単球をＰＢＳ＋２％ＦＢＳでの遠心分離により洗浄し、１００ng／mLヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ng／mLヒトＩＬ－４を含む完全培地に再懸濁した。次いで、単離単球(３ｅ５／ウェル)を７５０マイクロリットルの最終体積で２４ウェルプレートに播種した。播種２日後、細胞培養培地を完全に吸引し、１００ng／mLヒトＭ－ＣＳＦおよび１０ng／mLヒトＩＬ－４を含む新鮮な完全培地と置き換えた。２日後(４日目)、ウェルあたりサイトカインを含む５００μLの完全培地を加え、４８時間インキュベートした。６日目、細胞培養培地を完全に吸引し、サイトカインがない新鮮完全培地に置き換えた。デュプリケートウェルを、次の株で１時間、４５０のＭＯＩで感染させた：野生型(ＷＴ)ヒト(ｈｕ)ＳＴＩＮＧをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ＨｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇバリアントをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ＷＴ ｈｕＩＲＦ３をコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；ＨｕＩＲＦ３ Ｓ３９６Ｄバリアントをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ；またはプラスミド対照を含む株。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩ＋１００μg／mL ゲンタマイシン(Sigma)に再懸濁した。対照として、臨床的化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログであるＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ ＲｐＲｐ ｃ－ジ－ＡＭＰ(InvivoGen)を、１０μg／mLで細胞に加えた。
２４時間後、細胞をβ－ＭＥ添加３５０μL 緩衝液ＲＬＴ(Qiagen)で溶解し、次の修飾をしたQiagen RNeasy Miniキットを使用してＲＮＡ抽出を実施した。RNase-Free DNaseキット(Qiagen)を使用するゲノムＤＮＡ除去段階を、総ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去するために加えた。総ＲＮＡ濃度をNanoDropTM OneC UV-Vis分光光度計(Thermo Scientific)を使用して測定した。各サンプルの純度もＡ２６０／Ａ２３０吸収比から評価した。ＲＮＡを、逆転写を実施するまで凍結－解凍せずに－８０℃で保存した。製造業者の指示に従い、３０μL反応でC1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)およびSuperScriptTM VILOTM Master Mix(Invitrogen)を使用して０.４～１μgの鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡの合成を実施した。
ｑＰＣＲをCFX96 Real-Time系(Bio-Rad)で実施した。ｈｕＣＸＣＬ１０(ｑＨｓａＣＥＤ００４６６１９)、ｈｕＩＲＦ３(ｑＨｓａＣＩＤ００１３１２２)、ｈｕＳＴＩＮＧ(ｑＨｓａＣＩＤ００１０５６５)およびｈｕＩＦＮＢ１(ｑＨｓａＣＥＤ００４６８５１)ＳＹＢＲ(登録商標)プライマーをBio-Radから購入した。ｑＰＣＲ反応(２０μL)を、iTaq Universal SYBR(登録商標)Green Supermix(Bio-Rad)を使用して、プロトコールに従い実施した。BioRad CFX96 Real-Time系の標準的熱循環プログラムは、９５℃変性を３０秒間、続いて４０サイクルの９５℃で５秒間および６０℃で３０秒間からなった。無鋳型対照との反応を各プレートのプライマーの各セットについて包含させた。全サンプルをデュプリケートで流し、平均Ｃｑ値を計算した。標的ｍＲＮＡの定量を、Ｇａｐｄｈ対照ｍＲＮＡ(Bio-Rad、qMmuCED0027497)を使用して正規化した。ΔＣｑを、標的遺伝子と対照遺伝子間の差異として計算した。ΔΔＣｑを、処置のΔＣｑ値を非処置対照のΔＣｑ値に対して正規化することにより得た。増加倍率を、２＾－ΔΔＣｑとして計算した。値を、デュプリケートウェルの平均として下表に示す。
下表に示すとおり、プラスミド対照の感染と比較して、ｈｕＳＴＩＮＧ ＷＴおよびｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇをコードするプラスミドを含むＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株は、小分子ＴＩＮＧアゴニストと比較して有意に高い、高レベルのＳＴＩＮＧ発現を誘導した。同様に、ｈｕＩＲＦ３ ＷＴおよびｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄをコードするプラスミドを含む株は、プラスミド対照または小分子ＴＩＮＧアゴニストより有意に高い、高レベルのＩＲＦ３発現を誘導した。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇバリアントをコードするプラスミドを含む細菌株は、ｈｕＳＴＩＮＧ ＷＴをコードするプラスミドを含む株と比較して、はるかに高いＩＦＮβおよびＣＸＣＬ１０発現を誘導した。これは、構成的ＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアントをコードするプラスミドを含む株が、ヒト初代、免疫抑制性Ｍ２マクロファージを、Ｍ１ Ｉ型ＩＦＮ産生細胞に変換することを示す。ｈｕＩＲＦ３ ＷＴおよびｈｕＩＲＦ３－Ｓ３９６Ｄトをコードするプラスミドを含む株は、ｈｕＳＴＩＮＧ－Ｒ２８４Ｇバリアントと比較して、何れもＩＦＮβを多く誘導するが、ＣＸＣＬ１０の誘導は少ない。
Figure 2022524951000025
これらのデータは、ヒト初代Ｍ２マクロファージにおける構成的ＧＯＦ Ｉ型ＩＦＮバリアントの発現およびこれらの細胞のＭ１様Ｉ型ＩＦＮ産生細胞への変換を示す。
実施例２１
ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７および他のインターフェロン経路遺伝子における機能獲得型変異改善を同定するためのタンパク質操作スクリーニング
構成的活性型であり、インターフェロン症を促進する機能獲得型(ＧＯＦ)アミノ酸変異体は、実施例２０に概説するとおり、ヒトから同定される。多くのＧＯＦ変異は、遺伝子の特定の位置のアミノ酸コドンを変える、一塩基対ヌクレオチド変化による。例えば、ＳＴＩＮＧにおいて、Ｖ１４７Ｌ変異は、ｃ.４３９Ｇ→Ｃの変異により起こる；Ｎ１５４Ｓは、ｃ.４６１Ａ→Ｇの変異により起こる；そしてＶ１５５Ｍはｃ.４６３Ｇ→Ａの変異により起こる。スクリーニングの目的は、高レベルのＩ型インターフェロン発現に至る構成的活性変異体の同定である。変異したときインターフェロン症を促進することが知られる部位での設計された変異は、多数のアミノ酸置換の試験を可能とする。この例では、設計されたアミノ酸での部位特異的変異誘発を変異が知られる位置で実施し(上記表(実施例２０)に概説)、高レベルＩ型インターフェロン発現に至る活性が増強された変異を同定する。
遺伝子からの相同ｃＤＮＡ配列を有する５’末端および３’末端で隣接する設計された置換を伴うＰＣＲプライマーを産生する。QuikChange(登録商標)部位特異的変異導入キット(Agilent)または他の同等な市販キットを使用して、設計された変異を含むＰＣＲ産物を産生する。ＰＣＲ増幅プラスミドをＤｐｎＩで処置し、次いで適格性大腸菌細胞に電気穿孔する。個々のクローンを単離し、プラスミドミニプレップを実施し、所望の変異の配列同一性を確認する。次いで、大規模プラスミドプレップを実施し(Qiagenキットを使用)、ＤＮＡを内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧレポーター細胞(InvivoGen)にトランスフェクトする。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に置かれた分泌型ルシフェラーゼであるLuciaTMルシフェラーゼを発現する；ＩＦＮ－βのコード配列は、ノックイン技術を使用してLuciaTMルシフェラーゼＯＲＦに置き換えられている。次いで、構成的活性型化された変異体を、ルシフェラーゼ活性のＩＦＮ－βプロモーター誘導発現の測定により同定し、ランク付けする。
実施例２２
構成的活性免疫刺激タンパク質をコードするプラスミドの免疫刺激性細菌株への形質転換
免疫刺激性タンパク質および機能的ａｓｄ遺伝子をコードする発現カセットを含む選択プラスミドを、下記設定の０.２cmギャップキュベット(BTX, San Diego, Calif.)を使用して、ＢＴＸ６００エレクトロポレーターを使用してａｓｄ遺伝子を欠くネズミチフス菌株に電気穿孔する：２.５kV、１８６オーム、５０μF。電気穿孔細胞を５０μMジアミノピメリン酸(ＤＡＰ)を添加した１mL ＳＯＣに加え、１時間、３７℃でインキュベートし、次いでＤＡＰを含まない寒天プレートに広げ、機能的ａｓｄ遺伝子を有するプラスミドを受けた株を選択した。単一コロニー単離後、細胞バンクを、無菌溶原性ブロス(ＬＢ)のフラスコにネズミチフス菌の単一の十分に単離されたコロニーを接種し、３７℃で２５０RPMで撹拌しながらインキュベートすることにより産生する。培養物が静止期まで増殖した後、細菌を１０％グリセロール含有ＰＢＳで洗浄し、－６０℃未満の温度で小分けして凍結して保存する。
実施例２３
プラスミドは、ヒト細胞における機能的ＳＴＩＮＧ機能獲得型変異体の発現を示す
免疫刺激性細菌株を、補完ａｓｄ遺伝子およびＳＴＩＮＧ機能獲得型(ＧＯＦ)変異体の真核生物プロモーター制御発現をする発現カセットを含むプラスミドで電気穿孔する。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ発現プラスミドがヒト細胞にトランスフェクトされ、機能的ＳＴＩＮＧタンパク質を発現するか否かを決定するために、内因性ＳＴＩＮＧを含まないＨＥＫ２９３Ｔ ＳＴＩＮＧレポーター細胞(InvivoGen)、が使用される。これらの細胞は、内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に置かれた分泌型ルシフェラーゼであるLuciaTMルシフェラーゼを発現する；ＩＦＮ－βのコード配列は、ノックイン技術を使用してLuciaTMルシフェラーゼＯＲＦに置き換えられている。環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)刺激を、ＩＦＮ刺激応答要素(ＩＳＲＥ)誘導分泌型胚アルカリホスファターゼ(ＳＥＡＰ)産生および／またはLuciaTMルシフェラーゼのＩＦＮ－β依存性発現モニタリングにより、293T-DualTM STING(ＩＳＧ／ＫＩ－ＩＦＮｂ)細胞(InvivoGen)で評価し得る。２種のレポータータンパク質、ＳＥＡＰおよびLuciaTMルシフェラーゼを、それぞれQUANTI-BlueTMおよびQUANTI-LucTMを使用して細胞培養上清で測定する。
このために、ｈｕＳＴＩＮＧ(ヒトＷＴ ＳＴＩＮＧ)、ｈｕＳＴＩＮＧ－ヌル(ヒトヌルＳＴＩＮＧ)またはＷＴ ｍＳＴＩＮＧ(マウスＳＴＩＮＧ)を含む５×１０５ ＨＥＫ293T-Dual細胞を、１日前にポリ－Ｌ－リシンで被覆されたプレートに播種し、８０％コンフルエンシーを達成する。トランスフェクション当日、一団のＳＴＩＮＧバリアントをコードするプラスミド(実施例２０または詳細な記載または実施例２１に記載のとおり設計)を無血清培地で希釈し、適切な試薬：ＤＮＡ比でFuGENE(登録商標)トランスフェクション試薬(Promega)に加え、細胞をｃＧＡＭＰ存在下または非存在下でインキュベートして、触接ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化させる。各サンプルからの細胞培養上清を、一夜インキュベーション後集め、１０μLの細胞培養上清を５０μL QUANTI-LucTM試薬(InvivoGen)に加える。Ｉ型インターフェロン活性化を、SpectraMax(登録商標)Ｍ３分光光度計(Molecular Devices)での分泌ルシフェラーゼレベルの測定により決定する。これらのデータは、トランスフェクトプラスミドが、ｃＧＡＭＰ非依存的様式でＩ型ＩＦＮを誘導できる機能的、構成的ＳＴＩＮＧを産生する能力を支持する。
実施例２４
ｍＳＴＩＮＧ機能獲得型(ＧＯＦ)コード化株は、マウスにおける顕著な抗腫瘍活性を示す
サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサーの構成的変異体をコードし、構成的Ｉ型ＩＦＮ発現に至るｍＳＴＩＮＧ ＧＯＦ株は、インビボでプラスミド含有標的株の抗腫瘍有効性を増強する。これを証明するために、実施例２３で試験したｍＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体の発現プラスミドを含むネズミチフス菌株を、マウス結腸癌モデルにおける腫瘍有効性について、ネズミチフス菌プラスミドベクター対照株および媒体対照と比較する。６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(９マウス／群)に、右脇腹にＭＣ３８細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)をＳＣ接種する。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、８日目に５×１０５CFUのｍＳＴＩＮＧ ＧＯＦコード化バリアント、ネズミチフス菌プラスミド対照またはＰＢＳ媒体対照で形質転換したネズミチフス菌をＩＶ注射する。体重および腫瘍を週２回測定する。腫瘍測定を電子ノギス(Fowler, Newton, MA)を使用して実施する。腫瘍体積を修飾楕円体式、１／２(長さ×幅２)を使用して計算する。マウスを、ＩＡＣＵＣ規制に従い、腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したときまたは壊死性となったとき、屠殺する。
実験は、ｍＳＴＩＮＧ機能獲得型産物をコードするネズミチフス菌などのサルモネラなどの免疫刺激性細菌は、ｍＳＴＩＮＧ機能獲得型を発現しない対照と比較およびＰＢＳと比較して、強力な腫瘍制御を誘導することを示す。
実施例２５
全身投与した構成的活性型ＳＴＩＮＧバリアントをコードする細菌は、インビボでＭＣ３８結腸腫瘍の増殖を阻害する
構成的活性型ＳＴＩＮＧをコードする発現プラスミドを含む免疫刺激性細菌株が、抗腫瘍有効性を誘導することを示すために、株ＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧ(フラジェリン遺伝子ｆｌｊＢおよびｆｌｉＣ両者のノックアウト)を、ヒト伸長因子－１アルファ(ＥＦ－１アルファ)プロモーター下にアレルＲ２３２およびＧＯＦ変異Ｖ１５５Ｍを有するヒトＳＴＩＮＧ(ＳＴＩＮＧ Ｒ２３２－Ｖ１５５Ｍ)の発現カセットを含むプラスミドを電気穿孔し、ＹＳ１６４６単独およびＰＢＳ媒体対照と比較した。ＳＴＩＮＧ Ｒ２３２－Ｖ１５５Ｍをコードする遺伝子は、ＤＮＡ合成を使用して産生した。６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)の右脇腹に、ＭＣ３８細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)をＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウス(ｎ＝５)に、８日目に次のとおりＶ注射した：(１)ＰＢＳ；(２)５×１０５CFUのＹＳ１６４６；および(３)５×１０５CFUのＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧ ＳＴＩＮＧ Ｒ２３２－Ｖ１５５Ｍ。腫瘍測定をノギスを使用して実施し、腫瘍体積を、修飾楕円体式、１／２(長さ×幅２)を使用して、計算した。
下表に示す結果は、ＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧヒトＳＴＩＮＧ Ｒ２３２－Ｖ１５５Ｍ株が、ＰＢＳと比較して有意な腫瘍制御(６０％ＴＧＩ)を誘導し(ｐ＜０.０５)、２０％の即時完全奏効を有した。それ故に、構成的活性型ＳＴＩＮＧバリアントを送達する免疫刺激性細菌株は、強力に腫瘍増殖を阻害し、結腸直腸癌のモデルで２０％治癒率を示すことができる。
Figure 2022524951000026
Ｎ.Ｓ.＝非有意
実施例２６
構成的活性型ＳＴＩＮＧバリアントをコードする免疫刺激性細菌は、インターフェロン制御因子(ＩＲＦ)プロモーターからの発現増強を刺激する
インターフェロン制御因子(ＩＲＦ)、例えばＩＲＦ－３およびＩＲＦ－は、ＩＦＮ転写を制御するタンパク質である。構成的活性型ＳＴＩＮＧをコードする免疫刺激性細菌のＩＲＦ活性化に対する効果を示すために、ＲＡＷ ２６４.７マウスマクロファージから産生したデュアルＩＲＦ－LuciaおよびＭＩＰ－２－ＳＥＡＰ(分泌型胚アルカリホスファターゼ)マウスレポーター細胞株(RAW-DualTM；InvivoGen)を使用した。これらのマクロファージは、トール様受容体(ＴＬＲ)、ｃＧＡＳおよびＳＴＩＮＧを含むいくつかのパターン認識受容体(ＰＲＲ)を発現する。レポーター細胞は、ＳＥＡＰ(分泌型胚アルカリホスファターゼ)およびLuciaルシフェラーゼをコードする２つのレポーター遺伝子を安定に発現する。Luciaルシフェラーゼレポーター遺伝子は、５つのＩＦＮ刺激応答要素(ＩＳＲＥ)と連動して、ＩＳＧ５４(インターフェロン刺激遺伝子５４)最小プロモーターの制御下にある。ＩＲＦ－３およびＩＲＦ－７などのＩＲＦが活性化されたとき、ＩＳＲＥに結合して、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導する。それ故に、Luciaルシフェラーゼの発現は、ＩＲＦの活性化を報告する。
RAW-DualTM(IRF-Lucia/KI-[MIP-2]SEAP)レポーター細胞(InvivoGen, Cat. Code: rawd-ismip)を、９６ウェル組織培養プレートに、抗生物質不含培地(ＤＭＥＭ含有グルコース、Ｌ－グルタミンおよび１０％ＦＢＳ)中２×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃で５％ＣＯ２中、一夜インキュベートした。５０μg／mL カナマイシンを含む３mLの修飾ＬＢ培養物(トリプトンをソイトンに置換)に、グリセロール原液から細菌株を直接接種し、一夜、振盪しながら３７℃でインキュベートした。株ＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧおよびＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡを、ヒト伸長因子－１アルファ(ＥＦ－１アルファ)プロモーター下、Ｒ２３２アレル(ｈｕＳＴＩＮＧ)またはＧＯＦ変異Ｖ１４７Ｌ(ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４７Ｌ)またはＶ１５５Ｍ(ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍ)を有するＳＴＩＮＧバリアントを有するヒトＳＴＩＮＧをコードするプラスミドで形質転換した。発現カセットをＤＮＡ合成により産生した。
翌日、一夜培養物をＯＤ６００nmで分析し、培養体積を、真核生物細胞培地(グルコース、Ｌ－グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含み、抗生物質を含まないＤＭＥＭ)での希釈により４×１０８CFU／mL濃度に調節した。細菌株での感染を、１００μL希釈培養／ウェルを加えることにより、２００のＭＯＩで実施し、５分間、１０００rcfで遠心分離し、続いて１時間、３７℃でインキュベーションした。次いで、感染を１００μL／ウェル無菌ＰＢＳで２回洗浄し、５０μg／mL ゲンタマイシンを含む新鮮培地を、細胞外細菌を死滅させるために加えた。環状ジヌクレオチド、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ(ＰＳ)２(Ｒｐ,Ｒｐ)(InvivoGen, Cat. Code: tlrl-nacda2r-01, tlrl-nacda2r)を、インターフェロン制御因子(ＩＲＦ)誘導の陽性対照として非感染ウェルに加えた(ＣＤＮ陽性対照)。ウェルあたり１μg 環状ジヌクレオチドを、１０μLの１００μg／mL原液を加えることにより、加えた。感染を４８時間、３７℃で続けた。非感染レポーター細胞を、ｍｕ－ＩＬ－２をコードする株ＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧで感染したレポーター細胞と同様、陰性対照として使用した。
ＩＲＦ経路誘導を、感染４８時間後分析した。ウェルあたり２０μL 上清を採取し、５０μLの新たに調製したQUANTI-LucTM検出培地(Luciaルシフェラーゼ検出試薬；InvivoGen, Cat. Code: rep-qlc1, rep-qlc2)と、黒色、平透明底９６ウェルプレート中で混合し、発光をSpectraMax(登録商標)Ｍ５マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で検出した。結果を下表に示す。非感染細胞およびＭｕ－ＩＬ－２をコードするＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧ(陰性対照)感染細胞は、最低量のＩＲＦ発光を示した。ＣＤＮを加えた非感染細胞(ＣＤＮ陽性対照)は、最高量のＩＲＦ発光を示した。ＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔＦＬＧ株で、Ｖ１４７Ｌ変異を有するｈｕＳＴＩＮＧは、ｈｕＳＴＩＮＧと比較してＩＲＦ発光が２５８％増加し、Ｖ１５５Ｍ変異を有するｈｕＳＴＩＮＧは、ｈｕＳＴＩＮＧと比較して２８２％増加した。ＹＳ１６４６－Δａｓｄ／ΔｈｉｌＡ株で、Ｖ１４７Ｌ変異を有するｈｕＳＴＩＮＧは、ｈｕＳＴＩＮＧと比較してＩＲＦ発光が１０８６％増加し、Ｖ１５５Ｍ変異を有するｈｕＳＴＩＮＧは、ｈｕＳＴＩＮＧと比較して２０１％増加した。それ故に、構成的活性型ＳＴＩＮＧバリアントは、下流ＩＲＦ経路シグナル伝達活性化のために、免疫刺激性細菌での感染を介してマクロファージに送達され得る。
Figure 2022524951000027
実施例２７
構成的Ｉ型ＩＦＮバリアントをコードするプラスミドを含む免疫刺激性細菌は、結腸直腸癌のマウスモデルで強力な抗腫瘍免疫を示す
ヒトＧＯＦ ＳＴＩＮＧ変異体は、マウスモデルで抗腫瘍活性を示す
構成的活性型ＳＴＩＮＧをコードする発現プラスミドを含む免疫刺激性細菌株バリアントが抗腫瘍有効性を誘導することを示すために、株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ(フラジェリン遺伝子ｆｌｊＢおよびｆｌｉＣ両者のノックアウト)を、ヒト伸長因子－１アルファ(ＥＦ－１α)プロモーター下に、アレルＲ２３２およびＧＯＦ変異Ｖ１５５Ｍを有するヒトＳＴＩＮＧ(ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍ)の発現カセットを含むプラスミドで電気穿孔し、株ＹＳ１６４６単独およびＰＢＳ媒体対照と比較した。ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍをコードする遺伝子は、ＤＮＡ合成を使用して産生し、ｐＡＴＩ－１.７５ベクターにクローン化した。構成的ヒトＳＴＩＮＧバリアントがマウスにおける抗腫瘍活性を示すか否かを評価するために、６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)に、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、８日目に５×１０５CFUの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍ、株ＹＳ１６４６またはＰＢＳ対照をＩＶ注射した。
結果は、先に公開されたデータに一致して、ＹＳ１６４６親株が抗腫瘍治療として穏やかにしか有効でなく、治癒的ではないことを示した(３５％ＴＧＩ、ｐ＝ＮＳ、２８日目)。しかしながら、構成的活性型ヒトＳＴＩＮＧ、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ ｈｕＳＴＩＮＧ Ｖ１５５Ｍをコードするプラスミドを含むより弱毒の株は、ＰＢＳと比較して、有意な腫瘍制御を誘導し(６０％ＴＧＩ、ｐ＜０.０５、２８日目)、２０％の治癒率であった。それ故に、構成的活性型ＳＴＩＮＧバリアントを送達する免疫刺激性細菌株は、結腸直腸腺癌モデルで腫瘍増殖を強力に阻害し、治癒的効果を示す。
マウスリン酸化模倣体ＩＲＦ３はインビボで治癒的効果を示す
リン酸化模倣体ヒトＩＲＦ３バリアントのマウス型を、設計し、ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄと命名し、マウス結腸直腸腺癌モデルで評価した。株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを、ヒト伸長因子－１アルファ(ＥＦ－１α)プロモーター下にＧＯＦ変異Ｓ３８８Ｄを有するマウスＩＲＦ３(ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄ)の発現カセットを含むプラスミドで電気穿孔し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄをコードする遺伝子は、ＤＮＡ合成を使用して産生し、ｐＡＴＩ－１.７５ベクターにクローン化した。６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)に、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、１０日目に５×１０５CFUの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ－ＥＦ－１α－ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８ＤをＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
治療は忍容性が極めて良好であり、初期体重減少は、最悪僅か０.３％であった。ＰＢＳと比較して、ｍｕＩＲＦ３－Ｓ３８８Ｄ ＧＯＦ変異体をコードするプラスミドを含む細菌株は高度に有効かつ治癒的であった(８１.８％ＴＧＩ、６０％治癒率、４２日目)。これらのデータは、腫瘍特異的様式での構成的Ｉ型ＩＦＮ誘導バリアント送達の効力および安全性を示す。
マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアントは、強力および治癒的抗腫瘍活性
ヒト患者で発見されたヒトＳＴＩＮＧバリアントの一団のマウスオルソログを設計した。これらのオルソログは、ヒトバリアントと１コドン異なり、ＥＦ－１αプロモーター制御下ｐＡＴＩ－１.７５ベクターにクローン化し、次の変異体セットを産生した：数あるなかでｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、Ｖ１５４Ｍ、Ｒ２８０Ｑ、Ｖ１４６Ｌ、Ｒ２８３ＧおよびＣ２０５Ｙ。ＳＴＩＮＧバリアントを、抗腫瘍有効性についてマウス腺癌ＭＣ３８モデルで評価した。試験のために、６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)に、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、Ｖ１５４Ｍ、Ｒ２８０Ｑ、Ｖ１４６ＬまたはＲ２８３ＧまたはスクランブルｓｈＲＮＡプラスミド対照発現を駆動するＥＦ－１αと共にプラスミドを含む５×１０５CFUの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを１０日目ＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
この実験で、ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ ＥＦ－１αプラスミド対照(ｓｈＳＣＲ)は、ＰＢＳ対照と比較して抗腫瘍有効性を示し(７３％ＴＧＩ、２６日目)、これは、ＹＳ１６４６親株が歴史的に示してきたよりはるかに強力であった。これは、ＣｐＧおよびＲＮＡｉ刺激要素などのプラスミド上の本質的に免疫刺激性の要素によるものであり得る。この治療は、忍容性が最低の群であり、最悪９.９％の体重減少を示し、治験の最後の最後でしか解消しなかった。対照的に、構成的マウスＳＴＩＮＧ変異体は、一過性であり、数日以内で解消する低い体重減少を示した。これらのバリアントの相対的抗腫瘍有効性は、活性の興味深い差異を確認し、２つのバリアントのみが治癒的効果を示し、プラスミド対照、Ｎ１５３ＳおよびＲ２８３Ｇより有効性が増強された。
Figure 2022524951000028
フォローアップ試験で、マウスＳＴＩＮＧ Ｃ２０５Ｙバリアントを、抗腫瘍有効性を比較するために、Ｒ２８３ＧおよびＮ１５３Ｓバリアントと共に試験した。６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)に、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、ＭｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、Ｒ２８３ＧまたはＣ２０５Ｙの発現を駆動するＥＦ－１αと共にプラスミドを含む５×１０５CFUの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧを９日目にＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。前記のとおり、ＳＴＩＮＧバリアントは忍容性が良好であり、体重の一過性落ち込みのみが観察され、すぐに解消した。これは、小分子ＴＩＮＧアゴニストでも観察されたため、標的上治療による可能性がある。２つの構成的活性マウスＳＴＩＮＧバリアント、Ｎ１５３ＳおよびＲ２８３Ｇの有効性は、先の治験とほぼ同一であったが、体重減少ははるかに少なく、その原因は不明である。Ｃ２０５Ｙバリアントも高度に有効であったが、治癒的ではなかった。
Figure 2022524951000029
これら試験からのＳＴＩＮＧ治癒マウスを、反対の脇腹に、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)をＳＣで、初期腫瘍植え込み４０日後再負荷した。全腫瘍が増殖したナイーブマウス(Ｎ＝５)と比較して、ＳＴＩＮＧ治癒マウスの全て腫瘍を拒絶し、適応免疫の関与を示す。
これらのデータは、結腸直腸癌のマウスモデルにおけるヒト構成的ＳＴＩＮＧバリアントのマウス版の安全性および効力を検証し、他のＳＴＩＮＧバリアントと比較して効力が増強した小サブセットを確認する。これらの高度に活性なバリアントはまた保護的免疫も誘導し、腫瘍特異的Ｉ型インターフェロン産生の効力を示す。
マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦバリアントは、ＩＶ投与後顕著な腫瘍リモデリングを示す
次に、構成的ＳＴＩＮＧバリアントをコードするプラスミドを含む細菌株が、ＩＶ投与後腫瘍微小環境(ＴＭＥ)をリモデリングする能力に差異を示すか否かを決定した。これを試験するために、６～８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(５マウス／群)に、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞(１００μL ＰＢＳ中５×１０５細胞)を右脇腹にＳＣ接種した。確立された脇腹腫瘍を担持するマウスに、８日目にｍｕＳＴＩＮＧ Ｎ１５３Ｓ、Ｖ１５４Ｍ、Ｒ２８０Ｑ、Ｖ１４６Ｌ、Ｒ２８３Ｇまたはプラスミド対照の発現を駆動するＥＦ－１αと共にプラスミドを含む５×１０５CFUの株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧをＩＶ注射し、ＰＢＳ媒体対照と比較した。
腫瘍植え込み２８日後、腫瘍を分析のために摘除した。腫瘍を、２～３mm片に切って、２.５mL 酵素ミックス(ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳと１mg／mLコラゲナーゼIVおよび２０μg／mL ＤＮａｓｅ Ｉ)を充填したgentleMACSTM Ｃチューブ(Miltenyi Biotec)に入れた。腫瘍片をOctoMACSTM(Miltenyi Biotec)特異的解離プログラム(マウス移植腫瘍)を使用して解離し、全細胞調製物を、４５分間、３７℃で撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション４５分後、第二ラウンドの解離をOctoMACSTM(マウス移植腫瘍プログラム)を使用して実施し、得られた単細胞懸濁液を７０μMナイロンメッシュで濾過して５０mLチューブに入れた。ナイロンメッシュを５mLのＲＰＭＩ－１６４０ １０％ＦＢＳで１回洗浄し、細胞を、新規７０μMナイロンメッシュを使用して、新規５０mLチューブに２回目の濾過をして入れた。ナイロンメッシュを５mLの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０で洗浄し、次いで、濾過細胞を１０００RPMで７分間遠心分離した。得られた解離細胞をＰＢＳに再懸濁し、染色過程前は氷上に維持した。
種々のＧＯＦ ｍｕＳＴＩＮＧ変異体をコードするプラスミドを含む株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧ投与後の、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、好中球、単球、樹状細胞(ＤＣ)、Ｍ１マクロファージおよびＭ２マクロファージを含む生存腫瘍浸潤白血球(ＴＩＬ)パーセンテージをフローサイトメトリーにより決定した。フローサイトメトリー染色のために、１００μLの単細胞懸濁液を、Ｖ底９６ウェルプレートのウェルに播種した。死／生存染色(Zombie AquaTM, BioLegend)およびＦｃ遮断試薬(BD Biosciences)を含むＰＢＳを１００μL／ウェルで加え、氷上で、３０分間、暗所でインキュベートした。３０分後、細胞を、１３００RPMで３分間の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、蛍光色素コンジュゲート抗体(ＣＤ４ ＦＩＴＣクローンＲＭ４－５；ＣＤ８ａ ＢＶ４２１クローン５３－６.７；Ｆ４／８０ ＡＰＣクローンＢＭ８；ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７クローンＭ１／７０；ＣＤ４５ ＢＶ５７０クローン３０－Ｆ１１；ＣＤ３ ＰＥクローン１４５－２Ｃ１１；Ｌｙ６Ｃ ＢＶ７８５クローンＨＫ１.４；Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＡＰＣ－Ｃｙ７クローンＭ５／１１４.１５.２；Ｌｙ６Ｇ ＢＶ６０５クローン１Ａ８；およびＣＤ２４ ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５.５クローンＭ１／６９；全てBioLegendから)を含むＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、氷上で、３０分間、暗所でインキュベートした。３０分後、細胞を、１３００RPMで３分間の遠心分離により、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液(Thermo Fisher Scientific)に再懸濁した。フローサイトメトリーデータをACEA NovoCyte(登録商標)フローサイトメーター(ACEA Biosciences, Inc.)により取得し、FlowJoTMソフトウェア(Tree Star, Inc.)を使用して分析した。
下表に示すとおり、ＥＦ－１αプラスミド対照を有する株ＹＳ１６４６Δａｓｄ／ΔＦＬＧは、おそらくプラスミド上の免疫刺激性要素により、ある程度のＣＤ８＋Ｔ細胞動員にも関わらず、優勢に高好中球浸潤を示した。対照的に、異なるｍｕＳＴＩＮＧバリアントは、特有の腫瘍浸潤免疫細胞シグネチャーを有し、ｍｕＳＴＩＮＧ Ｖ１４６ＬおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇなど一部は、ＰＢＳ対照より少ない免疫抑制性好中球をもたらした。最も好都合な免疫プロファイルは、ｍｕＳＴＩＮＧ変異体Ｒ２８３ＧおよびＮ１５３Ｓを投与されたマウスからの腫瘍で観察され、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が多く、好中球が少なく、これは、適応免疫応答産生に高度に好都合な条件を示す。これらの傾向は、下記のとおり、総細胞数でも再現された。それ故に、腫瘍常在骨髄細胞への構成的活性型ＳＴＩＮＧバリアントの送達は、自然免疫の促進および適応免疫の抑制により特徴づけられる、適応抗腫瘍表現型方向で、細菌表現型から離れる免疫抑制性腫瘍微小環境の完全なリモデリングをもたらす。
Figure 2022524951000030
Figure 2022524951000031
実施例２８
ヒトＳＴＩＮＧより強いＩ型ＩＦＮシグナル伝達および／または弱いＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導する脊椎動物ＳＴＩＮＧバリアントを発現するよう修飾した免疫刺激性細菌
ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、２つのシグナル伝達経路を活性化する。第一は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ(ＴＢＫ１)／ＩＲＦ３軸であり、Ｉ型ＩＦＮの誘導および樹状細胞(ＤＣ)の活性化および腫瘍抗原の交差提示をもたらし、ＣＤ８＋Ｔ細胞介在抗腫瘍免疫を活性化する。第二は、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達軸であり、炎症促進性応答をもたらすが、抗腫瘍免疫に必要なＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化はもたらさない。細菌ベースの癌免疫療法は、腫瘍抗原交差提示および持続性抗腫瘍免疫の促進のために必要なＣＤ８＋Ｔ細胞を動員および活性化するためにＩ型ＩＦＮを誘導する能力が限定的である。それ故に、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を誘導および／または増加し、ＮＦ－κＢシグナル伝達が減少し、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞介在抗腫瘍免疫の誘導が増加し、細菌の治療有効性が増強された、ここでの免疫刺激性細菌が提供される。上記免疫刺激性細菌は、野生型ＳＴＩＮＧと比較してＩ型ＩＦＮの誘導を増加するかまたはＩ型ＩＦＮ発現を構成的とすることができる、ＳＴＩＮＧの機能獲得型変異体である修飾ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする。この実施例において(およびまた詳細な記載において)、ＳＴＩＮＧタンパク質は、ＮＦ－κＢシグナル伝達活性を低減または排除し、Ｉ型ＩＦＮを誘導する能力を保持するよう修飾されるおよび／またはＩ型ＩＦＮ発現の増加または構成的発現のために修飾される。これは、抗腫瘍免疫を誘導し、通常細菌病原体による感染に起因するＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導しない(または誘導が少ない)免疫刺激性細菌をもたらす。
異なる種からのＳＴＩＮＧタンパク質は、異なるレベルのＩ型ＩＦＮおよびＮＦ－κＢシグナル伝達活性を示す。例えば、ヒトおよびマウス細胞におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達は、強いＩ型ＩＦＮ応答および弱い炎症促進性ＮＦ－κＢ応答をもたらす。サケおよびゼブラフィッシュなどの条鰭類におけるＳＴＩＮＧシグナル伝達は、比較して、主にＮＦ－κＢ駆動応答の強い活性化を誘導し、これは、ＩＲＦ３駆動(すなわち、Ｉ型ＩＦＮ誘導)応答と比較して１００倍を超えて高い。タスマニアンデビルなどの他の種で、ＳＴＩＮＧシグナル伝達はＩ型ＩＦＮ応答をもたらすが本質的にＮＦ－κＢ応答はもたらさない。ここに提供される免疫刺激性細菌は、ＳＴＩＮＧが、ＮＦ－κＢ応答の付随する誘導なく、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導する能力を探索するために、タスマニアンデビルＳＴＩＮＧなどの非ヒト種からのＳＴＩＮＧをコードする。ここに記載するとおり、これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質も、Ｉ型ＩＦＮ応答を増加させるためまたは構成的とするための変異により修飾される。ヒトＳＴＩＮＧにおけるこの効果を有する同定された変異を、非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質に導入する。対応する残基は、アライメントにより同定される。
ＳＴＩＮＧのＣ末端テイル(ＣＴＴ)がヒトなどのある種からＮＦ－κＢシグナル伝達活性をほとんどまたは全く示さない第二(例えば、非ヒト)種からのＣＴＴで置き換えた、キメラもまた提供される。ＣＴＴは、ＳＴＩＮＧリン酸化およびＩＲＦ３の動員に必要な配列モチーフを含む、約４０アミノ酸の非構造化ストレッチである。Ｉ型ＩＦＮとＮＦ－κＢシグナル伝達のバランスを変えることにより、下流免疫を形作り得る。これは、ＩＲＦ３、ＴＢＫ１およびＴＲＡＦ６結合モジュールを含むＣＴＴにおける非依存的モジュールを介して制御される。例えば、ヒトＳＴＩＮＧ残基３６６(例えば、配列番号３０５～３０９参照)は、ＣＴＴにおけるＬｘＩＳモチーフの一部である一次ＴＢＫ１リン酸化部位であり、これはＩＲＦ３結合に必要であり、一方、残基Ｌ３７４を含む第二ＰｘＰＬＲモチーフは、ＴＢＫ１結合に必要である。ＬｘＩＳおよびＰｘＰＬＲモチーフは、全脊椎動物ＳＴＩＮＧアレルにおいて高度に保存される。ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴの、例えば、タスマニアンデビルＳＴＩＮＧからのものへの置き換えは、Ｉ型ＩＦＮ応答を誘導するが、ＮＦ－κＢ応答は誘導しないＳＴＩＮＧをもたらす。
この例では、免疫刺激性細菌を、野生型(ＷＴ)ヒトＳＴＩＮＧ(配列番号３０５～３０９)と比較して、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が増加および／またはＮＦ－κＢシグナル伝達が低減したＳＴＩＮＧバリアントを発現するよう操作する。ＳＴＩＮＧバリアントは、哺乳動物、トリ、爬虫類、両生類または魚種など非ヒト脊椎動物からであり得る。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が由来する種は、タスマニアンデビル(Sarcophilus harrisii；配列番号３３１)、マーモセット(Callithrix jacchus；配列番号３４１)、ウシ(Bos taurus；配列番号３４２)、ネコ(Felis catus；配列番号３３８)、ダチョウ(Struthio camelus australis；配列番号３４３)、トキ(Nipponia nippon；配列番号３４４)、シーラカンス(Latimeria chalumnae；配列番号３４５および３４６)、イノシシ(Sus scrofa；配列番号３４７)、コウモリ(Rousettus aegyptiacus；配列番号３４８)、マナティ(Trichechus manatus latirostris；配列番号３４９)、ゾウギンザメ(Callorhinchus milii；配列番号３５０)およびマウス(Mus musculus；配列番号３５１)を含むが、これらに限定されない。これらの脊椎動物ＳＴＩＮＧタンパク質はヒト細胞で容易に免疫シグナル伝達を活性化し、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の分子機構が脊椎動物で共有されることを示す(例えば、de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175参照)。これらの種からのＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトＳＴＩＮＧより少ないＮＦ－κＢシグナル活性化および／または多いＩ型ＩＦＮシグナル活性化を誘導する例えば、de Oliveira Mann et al. (2019) Cell Reports 27:1165-1175、図１Ａ参照)。異なる非ヒト種からの野生型または修飾ＳＴＩＮＧタンパク質は、ヒトおよび非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質のキメラであるように、ここでの免疫刺激性細菌により発現され得る。
種々の非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、非ヒトＳＴＩＮＧがヒトＳＴＩＮＧより低ＮＦ－κＢ活性化を有し、所望により、高Ｉ型インターフェロン活性化を有するように修飾される。これらの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ活性が増加するか、サイトゾル核酸リガンド(例えば、ＣＤＮ)の非存在下で構成的に作用するように、１以上の変異を含むよう修飾される。変異は、一般にヒトにおけるインターフェロン症と関連する機能獲得型変異などのアミノ酸変異である。対応する変異は、非ヒト種ＳＴＩＮＧタンパク質に導入され、ここで、対応するアミノ酸残基は、アライメントにより同定される。例えば、変異は、配列番号３０５～３０９に示すヒトＳＴＩＮＧの配列を基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａを含むが、これらに限定されない。他の種からのＳＴＩＮＧにおける対応する変異は下表に挙げる。非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の得られたバリアントは、１以上のこれらの変異および所望により、ＣＴＴ置き換えおよび所望によりＴＲＡＦ６結合部位欠失を含み得る。
ＳＴＩＮＧバリアントは、リン酸化部位のアミノ酸セリン(Ｓ)またはスレオニン(Ｔ)に、活性の増加または構成的活性をもたらす、リン酸化模倣体であるアスパラギン酸(Ｄ)への１以上の置換を含む。他の変異は、ＳＴＩＮＧにおける３２４－３２６ ＳＬＳ→ＡＬＡなどの１以上のリン酸化部位の欠失または置換およびＳＴＩＮＧにおけるＮＦ－κＢシグナル伝達を低減するためにリン酸化部位を除去する他の置き換えを含む。さらに、ヒトＳＴＩＮＧのＣ末端テイル(ＣＴＴ)が低ＮＦ－κＢシグナル伝達活性および／または高Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有する他の種からのＳＴＩＮＧのＣＴＴで置き換えられている、ヒトＳＴＩＮＧと他の種からのＳＴＩＮＧのキメラが提供される。バリアントＳＴＩＮＧタンパク質は、ＮＦ－κＢシグナル伝達を低減するためＣＴＴのＴＲＡＦ６結合部位に欠失を含み得る。
Figure 2022524951000032
Figure 2022524951000033
Figure 2022524951000034
Figure 2022524951000035
例えば、修飾ＳＴＩＮＧバリアントは、変異Ｃ２０６Ｙ(配列番号３３２)またはＲ２８４Ｇ(配列番号３３３)を有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ；ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴ(配列番号３３４)で置き換えられたバリアント；変異Ｃ２０６Ｙ(配列番号３３５)またはＲ２８４Ｇ(配列番号３３６)を有し、ＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴで置き換えられたヒトＳＴＩＮＧ；ＴＲＡＦ６結合ドメイン(残基３７７～３７９に対応、ＤＦＳ)に欠失を有する野生型ヒトＳＴＩＮＧ(配列番号３３７)；変異Ｃ２０５Ｙ(配列番号３３９)またはＲ２８３Ｇ(配列番号３４０)を有するネコＳＴＩＮＧ；および他のこのような修飾ＳＴＩＮＧバリアントを含む。
ＳＴＩＮＧ変異の対応するアミノ酸残基を決定するために、種々の非ヒト種からの野生型ＳＴＩＮＧ配列を各々野生型ヒトＳＴＩＮＧ配列(配列番号３０５(Ｒ２３２アレル)または配列番号３０６(Ｈ２３２アレル)のアレルバリアントの)と整列する。アライメントを、ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/で入手可能なKalign配列アライメントツールまたはebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/で入手可能なＥＭＢＯＳＳ針配列アライメントツールを使用して実施した。ヒトＳＴＩＮＧとタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、トキ、シーラカンス、ゼブラフィッシュ、イノシシ、コウモリ、マナティ、ゾウギンザメおよびマウス種からのＳＴＩＮＧタンパク質の配列アライメント例を図１～１３に示す。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッドバリアントは、樹状細胞で顕著に増強されたＩ型インターフェロン対ＮＦ－κＢ比を示す
マウスにおける最高のレベルのＣＤ８＋Ｔ細胞ケモカインＣＸＣＬ１０を誘導する最適ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体を決定するために、マウス初代骨髄由来樹状細胞(ＢＭＤＣ)で一団の変異体を試験した。これらは、構成的ヒトＧＯＦ変異Ｃ２０６Ｙ(配列番号３３２)またはＲ２８４Ｇ(配列番号３３３)を有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ；マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体Ｃ２０５ＹまたはＲ２８３Ｇ；ならびにヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴ(配列番号３３４)で置き換えられ、野生型ヒトＳＴＩＮＧまたはヒトＳＴＩＮＧ変異Ｃ２０６Ｙ(配列番号３３５)またはＲ２８４Ｇ(配列番号３３６)を含むバリアントを含む。変異Ｃ２０５Ｙ(配列番号３３９)またはＲ２８３Ｇ(配列番号３４０)を有するネコＳＴＩＮＧおよび変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するヒトＳＴＩＮＧも含んだ。
これらを試験するために、マウス骨髄を単離し、１.５mLエッペンドルフチューブに流しいれ、１２００RPMで５分間回転させて、骨髄細胞を集めた。細胞をＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳで１回洗浄し、次いで６ウェルＴＣ処置プレートに、２０ng／ml ＧＭ－ＣＳＦ含有ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ中播種した。２日毎に、５０％の培地を新鮮完全培地と置き換えた。６日後、非接着細胞をウェルからピペットで除き、トランスフェクション用９６ウェルプレートに、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳで１ｅ５細胞／ウェルで再播種した。細胞を、製造業者の指示に従い、Viromer(登録商標)REDを使用してトランスフェクトした。簡潔には、一団のＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体ならびに非トランスフェクト対照からの２００ngのプラスミドＤＮＡを提供された緩衝液で希釈し、０.０８μLのViromer(登録商標)REDと混合し、室温で１５分間インキュベートして、Viromer(登録商標)複合体を形成させた。次いで、ＤＮＡ／Viromer(登録商標)RED複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくり加え(デュプリケートで)、プレートを３７℃でＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。上清を４８時間目に採取し、製造業者のプロトコールに従い、フローサイトメトリーベースのサイトカインビーズアレイ(ＣＢＡ)を使用してマウスＣＸＣＬ１０(ＩＰ－１０)についてアッセイした。
下表に示すとおり、マウスＣＸＣＬ１０の最高の発現を誘導する構築物は、タスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴに置き換えられたヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴ を含み、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異Ｒ２８４Ｇ(ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ)を含んだ。次に高いのは、ＧＯＦ変異Ｃ２０６Ｙを有するヒトＳＴＩＮＧ(ｈｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０６Ｙ)およびヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異Ｒ２８４Ｇを含むタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ(ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ)であった。興味深いことに、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体は、初代マウス樹状細胞で、マウスＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体(ｍｕＳＴＩＮＧ Ｃ２０５ＹおよびｍｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８３Ｇ)より強力であり、それはＣ２０５ＹおよびＲ２８３Ｇ ＧＯＦ変異を含むネコＳＴＩＮＧよりはるかに弱かった。
Figure 2022524951000036
これらのデータは、強力なＴ細胞動員ケモカインを誘導するための、タスマニアンデビルのような他の種から得たＳＴＩＮＧの利用およびこれらと構成的ＧＯＦヒトＳＴＩＮＧ変異の結合の実現可能性を示す。
ＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッドバリアントは、ヒト単球において顕著に増強されたＩ型インターフェロン対ＮＦ－κＢ比を示す
ＳＴＩＮＧ誘導Ｉ型インターフェロン対ＮＦ－κＢシグナル伝達の比が、他の種からのＳＴＩＮＧ ＧＯＦハイブリッドバリアントを使用して改変され得ることを示すために、ヒト単球細胞株で一団を試験した。一団は、野生型ヒトＳＴＩＮＧまたは構成的ＧＯＦ変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するヒトＳＴＩＮＧ；野生型タスマニアンデビルＳＴＩＮＧまたは構成的ＧＯＦ変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを有するタスマニアンデビルＳＴＩＮＧ；ヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴで置き換えられ、野生型ヒトＳＴＩＮＧまたはヒトＳＴＩＮＧ変異Ｃ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇを含むバリアント；および変異Ｃ２０５ＹまたはＲ２８３Ｇを有するマウスＳＴＩＮＧを含む。ＴＲＡＦ６結合ドメインに欠失を有する野生型ヒトＳＴＩＮＧ(残基３７７～３７９に対応、ＤＦＳ)、ネコ野生型ＳＴＩＮＧおよびゼブラフィッシュ野生型ＳＴＩＮＧもまた含まれる。
この実験のために、内因性ＳＴＩＮＧを欠失し、また内因性ＩＦＮ－βプロモーターの制御下に置かれた分泌型ルシフェラーゼであるLuciaTMルシフェラーゼを発現するよう改変されている、THP1-DUALTM KO STING細胞を利用した。次いで、構成的活性型ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体を同定し、ルシフェラーゼ活性のＩＦＮ－βプロモーター誘導発現の測定によりランク付けした。これらの細胞はまた、内因性ＮＦ－κＢプロモーター制御下に置かれた分泌型胚アルカリホスファターゼ(ＳＥＡＰ)を発現し、ここで、ＮＦ－κＢのコード配列は、ノックイン技術を使用してＳＥＡＰ ＯＲＦに置き換えられている。ＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体により誘導されるＮＦ－κＢ活性を、細胞上清のＳＥＡＰ産生のモニタリングにより評価し得る。
この実験のために、THP1-DUALTM KO STING細胞を、製造業者の指示に従い、Viromer(登録商標)REDを使用してトランスフェクトした。簡潔には、一団のＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異体ならびに非トランスフェクト対照からの２００ngのプラスミドＤＮＡを提供された緩衝液で希釈し、０.０８μLのViromer(登録商標)REDと混合し、室温で１５分間インキュベートして、Viromer(登録商標)複合体を形成させた。ＤＮＡ／Viromer(登録商標)RED複合体を９６ウェルプレートの各ウェルにゆっくり加え(デュプリケートで)、プレートを３７℃でＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。さらに、野生型ＳＴＩＮＧバリアントを、インキュベーション２４時間後細胞に１０μg／mLで加えた臨床的化合物ＡＤＵ－Ｓ１００のアナログであるＳＴＩＮＧアゴニスト３’５’ ＲｐＲｐ ｃ－ジ－ＡＭＰ(ＣＤＮ、InvivoGen)で処置するかまたはしなかった。上清を４８時間目に採取し、製造業者のプロトコールに従い、ＮＦ－κＢ－ＳＥＡＰおよびＩＦＮ－Luciaレポーターシグナルについてアッセイした。簡潔には、１０μLの細胞培養上清を５０μL QUANTI-BlueTM試薬(InvivoGen)(ＳＥＡＰ測定のために使用)に加えた。ＮＦ－κＢ活性化を、６５０nmの吸光度(Ａｂｓ)でSpectraMax(登録商標)Ｍ３分光光度計(Molecular Devices)でのＮＦ－κＢ誘導ＳＥＡＰ活性測定により決定した。ＩＦＮ－LuciaからのＩ型インターフェロン活性を測定するために、１０μLの細胞培養上清を、ルシフェラーゼ反応のためのセレンテラジン基質を含む５０μL QUANTI-LucTMに加え、これは、SpectraMax(登録商標)Ｍ３ルミノメーターを使用して定量でき、相対的光単位(ＲＬＵ)として表される光シグナルを産生する。
下表に示すとおり、最高のＩ型ＩＦＮ応答がヒトＳＴＩＮＧのＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧのＣＴＴで置き換えられ、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異Ｒ２８４Ｇを含む(ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴ)バリアントならびにＣＤＮ ＳＴＩＮＧアゴニストを有する野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧ(ｚｆＳＴＩＮＧ ＷＴ＋ＣＤＮ)で観察された。しかしながら、極めて高いＮＦ－κＢシグナル伝達を有した野生型ゼブラフィッシュＳＴＩＮＧと異なり、ｈｕＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ ｔａｚＣＴＴバリアントは高Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達と、はるかに低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有した。高Ｉ型ＩＦＮ対低ＮＦ－κＢシグナル伝達の最良の比が、ヒトＳＴＩＮＧ ＧＯＦ変異Ｒ２８４Ｇを含むタスマニアンデビルＳＴＩＮＧバリアント(ｔａｚＳＴＩＮＧ Ｒ２８４Ｇ)で観察された。
Figure 2022524951000037
これらのデータは、ヒト単球で免疫抑制性ＮＦ－κＢ活性を最小化しながら、有益なＩ型インターフェロン活性を増強するために、タスマニアンデビルからのＳＴＩＮＧタンパク質などの非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の使用およびこれらとヒト構成的機能獲得型ＳＴＩＮＧ変異の結合の実現可能性をさらに示す。
修飾が当業者に明らかであるため、本発明は、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (224)

  1. 非ヒト種からの修飾インターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)タンパク質であって、ここで、非ヒトＳＴＩＮＧがヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性および所望により、ヒトＳＴＩＮＧと比較して高いＩ型インターフェロン(ＩＦＮ)経路シグナル伝達活性を有し、
    非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が、活性が増加するまたはサイトゾル核酸の非存在下で構成的に作用するように１以上の変異を含むよう修飾され；
    変異がアミノ酸の挿入、欠失および／または置換であり；そして
    所望によりＳＴＩＮＧタンパク質がＴＲＡＦ６結合部位の欠失を有するものである、
    修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  2. 非ヒト種からの修飾インターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)タンパク質またはキメラヒトＳＴＩＮＧタンパク質またはキメラＳＴＩＮＧタンパク質のバリアントであり、修飾ＳＴＩＮＧタンパク質およびキメラＳＴＩＮＧタンパク質のバリアントが、コード化ＳＴＩＮＧタンパク質の構成的活性化および／または内因性リガンドに対する感受性増強または親和性もしくは結合増加をもたらす機能獲得型(ＧＯＦ)と関連する１以上の変異を含み：
    ＳＴＩＮＧタンパク質が、１以上のアミノ酸の挿入、欠失および置換の１以上により修飾され；
    キメラヒトＳＴＩＮＧタンパク質はヒトＳＴＩＮＧタンパク質の部分および非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の部分を含み；
    非ヒトまたはキメラＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して、ＩＦＮ－ベータシグナル伝達活性および減弱した活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達活性を有し；そして
    １以上の変異がＩＦＮ－ベータ産生を誘導するＳＴＩＮＧ活性増加または構成的活性をもたらすものである、
    修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  3. 非修飾ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３０５～３０９の何れかに示すアミノ酸の配列を含むまたは配列番号３０５～３０９の何れかに示すアミノ酸の配列と少なくとも９８％配列同一性を有するそのヒトアレルバリアントである、請求項１または請求項２の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  4. ＳＴＩＮＧタンパク質が、第一種からのＳＴＩＮＧタンパク質におけるＣ末端テイル(ＣＴＴ)領域の第二種からのＳＴＩＮＧタンパク質のＣＴＴでの置き換えを含むキメラであり；
    第二種のＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し；そして
    ＣＴＴにおけるＴＲＡＦ６結合部位が所望により欠失している、
    請求項１～３の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  5. １以上の変異がヒト自己炎症性疾患乳児期発症ＳＴＩＮＧ関連脈管障害(ＳＡＶＩ)と関連するものである、請求項１～４の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  6. キメラである修飾インターフェロン遺伝子刺激物質(ＳＴＩＮＧ)タンパク質であって、第一種からのＣＴＴ(Ｃ末端テイル)領域の第二種からのＳＴＩＮＧのＣＴＴへの置き換えを含み、
    第二種のＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性より低いＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有し；そして
    ＣＴＴにおけるＴＲＡＦ６結合部位が欠失している、
    修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  7. キメラがヒトＳＴＩＮＧタンパク質の部分および非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の部分を含み；および
    ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３０５～３０９の何れかに示すアミノ酸の配列を含むまたは配列番号３０５～３０９の何れかに示すアミノ酸の配列と少なくとも９８％配列同一性を有するそのヒトアレルバリアントである、請求項２～６の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  8. ２つの種からのＳＴＩＮＧタンパク質の部分を含むキメラであり、それにより得られたＳＴＩＮＧタンパク質がＩＦＮ－ベータシグナル伝達活性を有し、ここで、第一種がヒトであり、第二種がタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウスおよびゾウギンザメから選択される、請求項２および４～７の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  9. 非ヒトＳＴＩＮＧのＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質の少なくとも３０％または少なくとも約３０％である、請求項１～８の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  10. 非ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧ ＮＦ－κＢシグナル伝達活性の３０％未満、２０未満％、１５％未満、１０％未満または５％未満である、請求項１～９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  11. 非ヒト種または第二種がタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウスおよびゾウギンザメから選択される、請求項１～１０の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  12. ＳＴＩＮＧの修飾が、ヒトＳＴＩＮＧを基準として、アラインメントして、インターフェロン症を生ずる変異に対応する１以上の変異であり、アライメントが実施されるヒトＳＴＩＮＧの配列が配列番号３０５～３０９の何れかに示すものである、請求項１～１１の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  13. Ｃ末端テイル(ＣＴＴ)の、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較してＮＦ－κＢシグナル伝達活性が低減した第二ＳＴＩＮＧタンパク質からのＣＴＴへの置き換えを含む、請求項１～１２の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  14. ＣＴＴにおけるＴＲＡＦ６結合部位が欠失している、請求項１～１３の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  15. 第二ＣＴＴがタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウスまたはゾウギンザメＳＴＩＮＧタンパク質からである、請求項１３または請求項１４の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  16. 第二ＣＴＴがタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウスまたはゾウギンザメＳＴＩＮＧタンパク質からであり、ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴを置き換える、請求項１３または請求項１４の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  17. 置き換えＣＴＴが次の種から選択され、次の配列を有するまたは少なくとも９８％配列同一性を有するこれらの配列の各々のアレルバリアントである、請求項１３～１６の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質：
    Figure 2022524951000038
  18. ヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴが配列EKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS(配列番号３５２)を含むまたはそれと少なくとも９８％配列同一性を有するアレルバリアントである、請求項４～１７の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  19. 修飾ＳＴＩＮＧタンパク質がヒトＳＴＩＮＧ ＣＴＴがタスマニアンデビルＳＴＩＮＧからのＣＴＴで置換されているキメラである、請求項４～１８の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  20. タスマニアンデビルＳＴＩＮＧからのＣ末端テイル(ＣＴＴ)が配列：RQEEFAIGPKRAMTVTTSSTLSQEPQLLISGMEQPLSLRTDGF(配列番号３５３)を含むまたはそれと少なくとも９８％配列同一性を有するアレルバリアントである、請求項１９の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  21. ＴＲＡＦ６結合部位の欠失を含む、請求項１～２０の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  22. ＳＴＩＮＧがヒトＳＴＩＮＧであり、ＴＲＡＦ６結合部位がＣ末端にアミノ酸残基ＤＦＳを含む、請求項２１の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  23. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達活性を増加させるまたはサイトゾル核酸の非存在下で活性を構成的とする修飾を含む、請求項１～２２の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  24. 修飾が、ヒトＳＴＩＮＧを基準として、アラインメントして、インターフェロン症を生ずる変異に対応し、ここで、ヒトＳＴＩＮＧは、配列番号３０５～３０９の何れかに示す配列を有する、請求項２３の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  25. 活性を増加させるまたは構成的活性とする修飾が、配列番号３０５～３０９の何れかに示すヒトＳＴＩＮＧの配列を基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａの１以上に対応する１以上のアミノ酸置換である、請求項１～２４の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  26. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３３１のタスマニアンデビルＳＴＩＮＧタンパク質または配列番号３３１のＳＴＩＮＧタンパク質と少なくとも９８％配列同一性を有するそのアレルバリアントである、請求項１～２５の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  27. 配列番号３０５～３０９の何れかに示すヒトＳＴＩＮＧの配列を基準としてＣ２０６ＹまたはＲ２８４Ｇに対応する置換を含む、請求項１～２６の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  28. 配列番号３３２または３３３に示すアミノ酸の配列を含む、請求項２７の修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  29. 非ヒト種ＳＴＩＮＧタンパク質の配列が配列番号３３１、３３８および３４１～３５１に示すものまたは非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質がそれと少なくとも９８％配列同一性を有する配列番号３３１、３３８および３４１～３５１の何れかのアレルバリアントである、請求項１～２５の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質。
  30. 請求項１～２９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質をコードするまたは非ヒト種からのＳＴＩＮＧタンパク質をコードするプラスミドを含み、ここで、ＳＴＩＮＧタンパク質がＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有し、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して減弱したＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有する、免疫刺激性細菌。
  31. 非ヒト種がタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウスおよびゾウギンザメから選択される、請求項３０の免疫刺激性細菌。
  32. 非修飾形態で、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)の発現をもたらすサイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部の免疫刺激性タンパク質の機能獲得型バリアントをコードするプラスミドを含む、免疫刺激性細菌。
  33. 機能獲得型(ＧＯＦ)バリアントが、ヒトにおいてインターフェロン症を促進するまたは引き起こす免疫刺激性タンパク質の構成的活性バリアントである；および
    免疫刺激性細菌のゲノムが細菌が腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するように修飾されているおよび／または免疫刺激性細菌のゲノムが腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少ない(パイロトーシス減少)ように修飾されており、それにより免疫刺激性細菌が腫瘍または腫瘍微小環境または腫瘍常在免疫細胞に蓄積し、それにより構成的活性型免疫刺激性タンパク質が宿主細胞に送達され、Ｉ型ＩＦＮの発現が刺激または誘導される、請求項３２の免疫刺激性細菌。
  34. ＧＯＦバリアントタンパク質が免疫刺激性タンパク質におけるリン酸化部位を排除する変異を含み、それにより活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(ＮＦ－κＢ)シグナル伝達を低減する、請求項３２または請求項３３の免疫刺激性細菌。
  35. Ｉ型ＩＦＮを誘導する免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５である、請求項３２～３４の何れかの免疫刺激性細菌。
  36. Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導する免疫刺激性タンパク質または活性が増加したもしくは構成的活性を有するバリアントをコードするプラスミドを含み、免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５である、免疫刺激性細菌。
  37. 免疫刺激性タンパク質がＩ型ＩＦＮの発現増加をもたらす機能獲得型変異を含むＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５のバリアントである、請求項３２～３６の何れかの免疫刺激性細菌。
  38. 免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＭＤＡ５のバリアントであり、ウイルス感染の結果としてリン酸化される１以上のセリン(Ｓ)またはスレオニン(Ｔ)残基がアスパラギン酸(Ｄ)残基で置換され、それにより得られたバリアントタンパク質が構成的にＩ型ＩＦＮを誘導するリン酸化模倣体である、請求項３２～３７の何れかの免疫刺激性細菌。
  39. バリアントタンパク質がＩＲＦ－３であり、配列番号３１２を基準として位置３８５、３８６、３９６、３９８、４０２、４０４および４０５に対応する残基に１以上の置換を含み；そして
    残基がアスパラギン酸残基で置き換えられる、
    請求項３８の免疫刺激性細菌。
  40. バリアントＩＲＦ－３タンパク質が、配列番号３１２を基準として、置換３９６Ｄを有する、請求項３９の免疫刺激性細菌。
  41. バリアントＩＲＦ－３タンパク質が、配列番号３１２を基準として、置換Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄまたはその保存的置換を含む、請求項３９の免疫刺激性細菌。
  42. バリアントＩＲＦ－３タンパク質が、配列番号３１２を基準として、置換Ｓ３９６Ｄ／Ｓ３９８Ｄ／Ｓ４０２Ｄ／Ｔ４０４Ｄ／Ｓ４０５Ｄを含む、請求項３９の免疫刺激性細菌。
  43. 免疫刺激性タンパク質が、対象で発現されたとき、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現に至るバリアントである、請求項３２～４２の何れかの免疫刺激性細菌。
  44. 修飾免疫刺激性タンパク質または修飾ＳＴＩＮＧタンパク質が対応する非修飾タンパク質と少なくとも９５％配列同一性を有するまたは挿入、欠失および置換から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸修飾を有する、請求項３０～４３の何れかの免疫刺激性細菌。
  45. 免疫刺激性タンパク質が、対象で発現されたとき、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現に至るバリアントである、請求項３２～４４の何れかの免疫刺激性細菌。
  46. 免疫刺激性タンパク質が、その非修飾形態で、サイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドを感知するまたは直接的もしくは間接的に相互作用し、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導し、バリアントタンパク質がサイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドの感知または相互作用非存在下でＩ型ＩＦＮの発現を誘導する、請求項３２～４４の何れかの免疫刺激性細菌。
  47. 免疫刺激性タンパク質がＩ型ＩＦＮの発現をもたらすのにサイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドを必要としない機能獲得型(ＧＯＦ)バリアントである、請求項４６の免疫刺激性細菌。
  48. 免疫刺激性タンパク質が、非修飾形態で、Ｉ型ＩＦＮを活性化するまたは発現を誘導する、請求項３２～４７の何れかの免疫刺激性細菌。
  49. 免疫刺激性タンパク質の非修飾形態がＩ型ＩＦＮを活性化する自然サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡ認識に関与する、請求項３２～４８の何れかの免疫刺激性細菌。
  50. Ｉ型ＩＦＮがインターフェロン－αまたはインターフェロン－βである、請求項４９の免疫刺激性細菌。
  51. 免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００から選択される、請求項３２～５０の何れかの免疫刺激性細菌。
  52. 免疫刺激性タンパク質がＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００から選択される、請求項３２～５０の何れかの免疫刺激性細菌。
  53. サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡセンサー経路の一部である免疫刺激性タンパク質が、機能獲得型変異またはＩ型インターフェロンまたは他の免疫メディエーター／モジュレーターの発現を構成的とする変異を含むバリアントである、請求項３２～５２の何れかの免疫刺激性細菌。
  54. サイトゾルＤＮＡ／ＲＮＡを感知する免疫刺激性タンパク質がバリアントＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ－７またはＩＲＦ－３タンパク質であり；
    非修飾ＳＴＩＮＧが、配列番号３０５～３０９の何れかに示す配列を有し、非修飾ＭＤＡ５が配列番号３１０に示す配列を有し、非修飾ＲＩＧ－Ｉが配列番号３１１に示す配列を有し、非修飾ＩＲＦ－７が配列番号３１３に示す配列を有し、非修飾ＩＲＦ－３が配列番号３１２に示す配列を有し；そして
    修飾免疫刺激性タンパク質が置換、欠失および挿入から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸修飾を有する、
    請求項５３の免疫刺激性細菌。
  55. 免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７およびＲＩＧ－Ｉから選択され、ＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７またはＲＩＧ－Ｉを構成的に活性とし、それによりＩ型ＩＦＮ発現を構成的とする機能獲得型変異を含む、請求項３２～５４の何れかの免疫刺激性細菌。
  56. アミノ酸置換である修飾が次のもの：
    ａ)ＳＴＩＮＧにおいて、配列番号３０５～３０９を基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ３７５Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１以上；
    ｂ)ＭＤＡ５において、配列番号３１０を基準として、Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２ＦおよびＡ４５２Ｔの１以上；
    ｃ)ＲＩＧ－Ｉにおいて、配列番号３１１を基準として、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；
    ｄ)ＩＲＦ－３において、配列番号３１２を基準として、Ｓ３９６Ｄ；
    ｅ)ＩＲＦ－７において、配列番号３１３を基準として、Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ、Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９ＤおよびＳ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄの１以上；および
    ｆ)Ｉ型インターフェロンの活性を増加するか発現を構成的とする保存的アミノ酸置換
    から選択される、請求項５４または請求項５５の免疫刺激性細菌。
  57. 免疫刺激性タンパク質が、配列番号３０５～３０９を基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１以上のアミノ酸置換を含むバリアントＳＴＩＮＧである、請求項５４～５６の何れかの免疫刺激性細菌。
  58. 非修飾形態で、サイトゾルＲＮＡ／ＤＮＡを感知する免疫刺激性タンパク質である修飾ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸を含み、ここで、ＳＴＩＮＧタンパク質がプラスミドにコード化され、コード化核酸が真核生物宿主により認識される制御配列に操作可能に連結されている、免疫刺激性細菌。
  59. 修飾ＳＴＩＮＧタンパク質が活性に環状ジヌクレオチド(ＣＤＮ)を必要としない、請求項５８の免疫刺激性細菌。
  60. ＳＴＩＮＧにおける修飾が活性にｃＧＡＭＰを必要としないよう活性を構成的とし；
    修飾ＳＴＩＮＧタンパク質が修飾ＴＭＥＭ１７３遺伝子によりコードされ；
    修飾がアミノ酸の挿入、欠失または置換を含み；そして
    修飾ＳＴＩＮＧタンパク質が、非修飾ＳＴＩＮＧタンパク質と比較して増強された免疫刺激性活性を有する、
    修飾ＳＴＩＮＧタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む、請求項５８または請求項５９の免疫刺激性細菌。
  61. ＳＴＩＮＧにおけるアミノ置換が、配列番号３０５～３０９を基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａおよびその保存的アミノ酸置換から選択される１以上である、請求項５９または請求項６０の免疫刺激性細菌。
  62. 宿主における非免疫細胞の毒性または感染性を低減する細菌のゲノムにおける変異を含む、請求項３０～６１の何れかの免疫刺激性細菌。
  63. 免疫刺激性細菌のゲノムが修飾され、それにより細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－である、請求項３０～６２の何れかの免疫刺激性細菌。
  64. 免疫刺激性細菌のゲノムが修飾され、それにより細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)である、請求項３０～６３の何れかの免疫刺激性細菌。
  65. 免疫刺激性細菌のゲノムが修飾され、それにより細菌がｐａｇＰ－／ｍｓｂＢ－である、請求項３０～６４の何れかの免疫刺激性細菌。
  66. 細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)およびｐａｇＰ－である、請求項３０～６３の何れかの免疫刺激性細菌。
  67. 免疫刺激性細菌がアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－(ａｓｄ－)である、請求項３０～６６の何れかの免疫刺激性細菌。
  68. 細菌がアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードする内因性遺伝子の全てまたは一部が破壊または欠失し、それにより内因性ａｓｄが発現されないことによりａｓｄ－である、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ－(ａｓｄ－)である、請求項３０～６６の何れかの免疫刺激性細菌。
  69. 細菌プロモーター制御下にプラスミドにアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ａｓｄ)をコードする、請求項３０～６８の何れかの免疫刺激性細菌。
  70. ｍｓｂＢ－である、請求項３０～６９の何れかの免疫刺激性細菌。
  71. ｐｕｒＩ－(ｐｕｒＭ－)である、請求項３０～７０の何れかの免疫刺激性細菌。
  72. ａｓｄ－、ｐｕｒＩ－、ｍｓｂＢ－、フラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)およびｐａｇＰ－である、請求項３０～７１の何れかの免疫刺激性細菌。
  73. ＳＰＩ－１依存的侵襲に関与する１以上の遺伝子またはオペロンが欠失または不活性化され、それにより免疫刺激性細菌が上皮細胞に侵入または感染しない、請求項３０～７２の何れかの免疫刺激性細菌。
  74. ａｖｒＡ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＤ、ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＥ、ｉｎｖＦ、ｉｎｖＧ、ｉｎｖＨ、ｉｎｖＩ、ｉｎｖＪ、ｉａｃＰ、ｉａｇＢ、ｓｐａＯ、ｓｐａＱ、ｓｐａＲ、ｓｐａＳ、ｏｒｇＡ、ｏｒｇＢ、ｏｒｇＣ、ｐｒｇＨ、ｐｒｇＩ、ｐｒｇＪ、ｐｒｇＫ、ｓｉｃＡ、ｓｉｃＰ、ｓｉｐＡ、ｓｉｐＢ、ｓｉｐＣ、ｓｉｐＤ、ｓｉｒＣ、ｓｏｐＢ、ｓｏｐＤ、ｓｏｐＥ、ｓｏｐＥ２、ｓｐｒＢおよびｓｐｔＰの１以上が欠失または不活性化されている、請求項７３の免疫刺激性細菌。
  75. ＳＰＩ－１非依存的侵襲に関与する１以上の遺伝子が欠失または不活性化され、
    免疫刺激性細菌が上皮細胞に侵入または感染しない；および
    １以上の遺伝子がｐａｇＮ、ｈｌｙＥ、ｐｅｆＩ、ｓｒｇＤ、ｓｒｇＡ、ｓｒｇＢおよびｓｒｇＣから選択される、
    請求項３０～７２の何れかの免疫刺激性細菌。
  76. 細菌が腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少なくなる、細菌ゲノムの修飾；および／または
    他の細胞型と比較して細菌が優先的に腫瘍常在免疫細胞に感染するようになる、細菌ゲノムの修飾
    を含む、請求項３０～７５の何れかの免疫刺激性細菌。
  77. 細菌がプラスミドにａｓｄをコードし、その発現が真核生物対象の腫瘍微小環境(ＴＭＥ)で発現されるプロモーターの制御下にある、請求項３０～７６の何れかの免疫刺激性細菌。
  78. アデノシンおよびアデニンに対して栄養要求性である、請求項３０～７７の何れかの免疫刺激性細菌。
  79. アデノシンに対して栄養要求性である、請求項３０～７７の何れかの免疫刺激性細菌。
  80. アデノシンに対して栄養要求性であり、鞭毛を欠き、ここで、野生型細菌が鞭毛を有する、請求項３０～７９の何れかの免疫刺激性細菌。
  81. 宿主における非免疫細胞の毒性または感染性を低減する細菌のゲノムにおける変異を含む、請求項３０～８０の何れかの免疫刺激性細菌。
  82. 細菌がｐａｇＰ－である、請求項３０～８１の何れかの免疫刺激性細菌。
  83. 免疫刺激性細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－およびｐｕｒＩ－(ｐｕｒＭ－)、ｍｓｂＢ－、ｐｕｒＤ－、ａｄｒＡ－、ｃｓｇＤ－、ｑｓｅＣ－およびｈｉｌＡ－、ｌｐｐＡ－またはｌｐｐＢ－の１以上である、請求項３０～８２の何れかの免疫刺激性細菌。
  84. 免疫刺激性細菌がｈｉｌＡ－、ｐａｇＰ－およびフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)である、請求項３０～８３の何れかの免疫刺激性細菌。
  85. ＣｐＧモチーフをコードする核酸を含み、ＣｐＧモチーフをコードする核酸がプラスミド上にコード化される細菌遺伝子に含まれるまたはその一部である、請求項３０～８４の何れかの免疫刺激性細菌。
  86. ＣｐＧを含む遺伝子がａｓｄであり、ここで、ａｓｄがプラスミド上にコード化される、請求項８５の免疫刺激性細菌。
  87. フラジェリン欠損であり、ここで、野生型細菌が鞭毛を含む、請求項３０～８６の何れかの免疫刺激性細菌。
  88. プラスミドが、シグナル配列を欠くリステリオリシンＯ(ＬＬＯ)タンパク質であるｃｙｔｏＬＬＯをコードする核酸を含む、請求項３０～８７の何れかの免疫刺激性細菌。
  89. プラスミド上にコード化されたＤＮＡ核ターゲティング配列(ＤＴＳ)を含む、請求項３０～８８の免疫刺激性細菌。
  90. ＤＴＳがＳＶ４０ ＤＴＳである、請求項８９の免疫刺激性細菌。
  91. エンドヌクレアーゼＩ(ｅｎｄＡ)をコードする遺伝子に欠失または修飾を有し、それによりｅｎｄＡ活性が阻害または排除される、請求項３０～９０の何れかの免疫刺激性細菌。
  92. プラスミドがＣｐＧモチーフ、プラスミド維持のためのａｓｄ遺伝子選択可能マーカーおよびＤＮＡ核ターゲティング配列の１以上を含む、請求項３０～９１の何れかの免疫刺激性細菌。
  93. 免疫刺激性細菌がｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ欠失およびａｄｒＡ欠失を含む、請求項３０～９２の何れかの免疫刺激性細菌。
  94. 請求項３０～９３の何れかの免疫刺激性細菌であって、
    ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡおよびｌｐｘＴの１以上から選択されるリポ多糖の生合成を改変する遺伝子における１以上の変異；および／または
    自殺遺伝子を導入し、ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌおよびｐｈｌＡの１以上から選択される１以上の変異；および／または
    細菌融解遺伝子を導入し、ｈｌｙおよびｃｌｙの一方または両方から選択される１以上の変異；および／または
    ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、viｒＧ、ｐｌｃおよびａｃｔから選択される１以上の病原性因子における変異；および／または
    ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐおよびｇｒｏＥＬから選択されるストレス応答を修飾する遺伝子における１以上の変異；および／または
    細胞周期を妨害するｍｉｎにおける変異；および／または
    ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱおよびｏｍｐＲから選択される制御機能を破壊または不活性化する遺伝子における１以上の変異
    を含む、免疫刺激性細菌。
  95. ｍｓｂＢ－／ａｓｄ－／ｐｕｒＩ－である、請求項３０～９４の何れかの免疫刺激性細菌。
  96. ｐｒｇＨおよび／またはｐｒｇＫが不活性化または欠失している、請求項３０～９５の何れかの免疫刺激性細菌。
  97. プラスミド上の免疫刺激性タンパク質またはＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸が分泌シグナルをコードする核酸に操作可能に連結し、それにより、宿主における発現により、産物が分泌される、請求項３０～９６の何れかの免疫刺激性細菌。
  98. 免疫刺激性タンパク質をコードするプラスミドが低コピー数または中コピー数で存在する、請求項３０～９７の何れかの免疫刺激性細菌。
  99. プラスミドが中乃至低コピー数複製起点を含む、請求項３０～９８の何れかの免疫刺激性細菌。
  100. プラスミドが低コピー数複製起点を含む、請求項３０～９８の何れかの免疫刺激性細菌。
  101. プラスミドが低コピー数で存在する、請求項３０～１００の何れかの免疫刺激性細菌。
  102. 中コピー数が１５０未満または約１５０未満および２０または約２０超または２０または２５～１５０である、請求項９８～１０１の何れかの免疫刺激性細菌。
  103. 低コピー数が２５未満または２０未満または約２５未満または約２０未満コピーである、請求項１０１の免疫刺激性細菌。
  104. プラスミドの複製起点がｐＢＲ３２２、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ｐＭＢ１、ｃｏｌＥ１、ｃｏｌＥ２、ｐＰＳ１０、Ｒ６Ｋ、Ｒ１、ＲＫ２およびｐＵＣ由来の起点から選択される、請求項３０～１０３の何れかの免疫刺激性細菌。
  105. 非修飾形態がサイトゾルＲＮＡ／ＤＮＡを感知する免疫刺激性タンパク質またはＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸がプラスミド上にあり、真核生物宿主により認識される制御配列に操作可能に連結されている、請求項３０～１０４の何れかの免疫刺激性細菌。
  106. プラスミドが真核生物プロモーター制御下に免疫刺激性タンパク質またはＳＴＩＮＧをコードする、請求項３０～１０５の何れかの免疫刺激性細菌。
  107. 制御配列がＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターを含む、請求項１０５または請求項１０６の免疫刺激性細菌。
  108. 制御配列がＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、ニワトリベータ－グロブリンおよびｒｂＧｌｏｂ(ウサギグロブリン)遺伝子から選択されるターミネーターおよび／またはプロモーターを含む、請求項１０５または請求項１０６の免疫刺激性細菌。
  109. プロモーターがＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターである、請求項１０７の免疫刺激性細菌。
  110. プロモーターがウイルスプロモーターまたは哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターであるＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターである、請求項１０７の免疫刺激性細菌。
  111. プロモーターがサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、エプスタイン・バールウイルス(ＥＢＶ)プロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーターおよびアデノウイルスプロモーターから選択されるウイルスプロモーターである、請求項１１０の免疫刺激性細菌。
  112. プラスミドでコード化異種タンパク質の１以上の発現を制御するプロモーターが伸長因子－１(ＥＦ－１)アルファプロモーターまたはＵＢＣプロモーターまたはＰＧＫプロモーターまたはＭＮＤプロモーターまたはＣＡＧＧプロモーターである、請求項１０５～１１０の何れかの免疫刺激性細菌。
  113. プロモーターがＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＭＮＤプロモーター、ＥＩＦ４Ａ１プロモーター、ＣＡＧプロモーターまたはＣＤ６８プロモーターである、請求項１０５～１１０の何れかの免疫刺激性細菌。
  114. プロモーターがＥＦ－１アルファプロモーターである、請求項１１３の免疫刺激性細菌。
  115. プロモーターが後期プロモーターであるウイルスプロモーターである、請求項１０５～１１３の何れかの免疫刺激性細菌。
  116. 細菌がグラム陰性細菌である、請求項３０～１１５の何れかの免疫刺激性細菌。
  117. 細菌が斑点熱リケッチア(Rickettsia rickettsiae)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、ツツガムシ病リケッチア(Rickettsia tsutsugamuchi)、発疹熱リケッチア(Rickettsia mooseri)、リケッチア・シビリカ(Rickettsia sibirica)、気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、エロモナス・オイクレノフィラ(Aeromonas eucrenophila)、エロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、野兎病菌(Francisella tularensis)、ヒツジ偽結核菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、サイトロバクター・フレウンディイ(Citrobacter freundii)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、在郷軍人病菌(Legionella pneumophila)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、ロシャリメア・クインターナ(Rochalimaea quintana)またはアグロバクテリウム・ツメルファシウム(Agrobacterium tumerfacium)または前記細菌株の何れかの弱毒株もしくは修飾株である、請求項３０～１１６の何れかの免疫刺激性細菌。
  118. 細菌がサルモネラの株、シゲラ(Shigella)、大腸菌(E. coli)、ビフィドバクテリア(Bifidobacteriae)、リケッチア(Rickettsia)、ビブリオ(Vibrio)、リステリア(Listeria)、クレブシエラ(Klebsiella)、ボルデテラ(Bordetella)、ナイセリア(Neisseria)、エロモナス(Aeromonas)、フランシセラ(Francisella)、コレラ(Cholera)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、サイトロバクター(Citrobacter)、クラミジア(Chlamydia)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ブルセラ(Brucella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、レジオネラ(Legionella)、ロドコッカス(Rhodococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、ヘリコバクター(Helicobacter)、バシラス(Bacillus)またはエリジペロスリックス(Erysipelothrix)または前記細菌株の何れかの弱毒株もしくは修飾株である、請求項３０～１１６の何れかの免疫刺激性細菌。
  119. 弱毒化細菌である、請求項３０～１１８の何れかの免疫刺激性細菌。
  120. サルモネラの株である、請求項３０～１１９の何れかの免疫刺激性細菌。
  121. ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)株である、請求項１２０の免疫刺激性細菌。
  122. 非修飾サルモネラが野生型株である、請求項１２０または請求項１２１の免疫刺激性細菌。
  123. 非修飾サルモネラ株が弱毒化されている、請求項１２０または請求項１２１の免疫刺激性細菌。
  124. 免疫刺激性細菌がＡＳＴ－１００、ＶＮＰ２０００９、ＹＳ１６４６(ATCC #202165)、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１およびχ８４６８と命名された株から選択されるまたはＡＴＣＣ寄託番号１４０２８として寄託された株の同定された特徴の全てを有する野生型細菌由来であるまたは株ＡＴＣＣ １４０２８である弱毒化ネズミチフス菌株である、請求項３０～１２３の何れかの免疫刺激性細菌。
  125. 請求項３０～１２４の何れかの免疫刺激性細菌であって、プラスミド上にコード化された、
    ａ)ＳＴＩＮＧの機能獲得型変異体、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７の１以上をコードする核酸；および
    ｂ)ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２ｐ７０(ＩＬ－１２ｐ４０＋ＩＬ－１２ｐ３５)、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖複合体、ＩＬ－２Ｒａへの結合が減弱したＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａに結合しないように修飾されたＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６ガンマ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、Ｔ細胞の動員／残留性に関与するまたは影響するまたは増強するタンパク質、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド(ＯＸ４０Ｌ)、４－１ＢＢ、４－１ＢＢリガンド(４－１ＢＢＬ)、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーメンバー、ＴＧＦ－ベータポリペプチドアンタゴニストおよび腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)スーパーファミリーメンバーの１以上をコードする核酸
    を含む、免疫刺激性細菌。
  126. ａ)における２個のタンパク質およびｂ)における２個のタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１２５の免疫刺激性細菌。
  127. 異なるプロモーターおよびターミネーターが各タンパク質の制御を発現する、請求項１２５または請求項１２６の免疫刺激性細菌。
  128. 遺伝子が単一プロモーターから発現され、単一ターミネーターを含み、各タンパク質をコードする配列が配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)を含み、それによりコード化核酸が多シストロン性である、請求項１２５または請求項１２６の免疫刺激性細菌。
  129. プロモーターがＥＦ－１アルファ、ＣＭＶおよびＧＡＰＤＨプロモーターから選択され、ターミネーターがＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨおよびｒｂＧｌｏｂから選択される、請求項１２５～１２８の何れかの免疫刺激性細菌。
  130. タンパク質をコードするプラスミドが、エンハンサー、プロモーター、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよびポリＡテイルを含む構築物を含む、請求項３０～１２９の何れかの免疫刺激性細菌。
  131. タンパク質をコードするプラスミドがエンハンサー、プロモーター、ＩＲＥＳ、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよびポリＡテイルを含む構築物を含む、請求項３０～１３０の何れかの免疫刺激性細菌。
  132. タンパク質をコードするプラスミドがエンハンサー、プロモーター、ＩＲＥＳ、局在化配列、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよびポリＡテイルを含む構築物を含む、請求項３０～１３１の何れかの免疫刺激性細菌。
  133. タンパク質をコードするプラスミドの構築物がウッドチャック肝炎ウイルス(ＷＨＰ)、転写後制御要素(ＷＰＲＥ)またはＢ型肝炎ウイルス転写後制御要素(ＨＰＲＥ)を含む、請求項３０～１３２の何れかの免疫刺激性細菌。
  134. ＳＰＩ－２複合体に欠失を有する、請求項３０～１３３の何れかの免疫刺激性細菌。
  135. 細菌が発熱原性を低減するためにポリミキシンで処理される、請求項３０～１３４の何れかの免疫刺激性細菌。
  136. 請求項１～２９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸を含む、送達媒体。
  137. 非ヒト種からのＳＴＩＮＧタンパク質をコードする核酸を含み、ここで、ＳＴＩＮＧタンパク質がＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性を有し、ヒトＳＴＩＮＧのＮＦ－κＢシグナル伝達活性と比較して減弱したＮＦ－κＢシグナル伝達活性を有するものである、送達媒体。
  138. ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３０５～３０９の何れかに示す配列または配列番号３０５～３０９の何れかに示すアミノ酸の配列と少なくとも９８％配列同一性を有するそのヒトアレルバリアントを含む、請求項１３６または請求項１３７の送達媒体。
  139. Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達活性が野生型ヒトＳＴＩＮＧの少なくとも３０％または少なくとも約３０％のＩ型ＩＦＮシグナル伝達活性である、請求項１３６～１３８の何れかの送達媒体。
  140. ＮＦ－κＢシグナル伝達活性がヒトＳＴＩＮＧの３０％未満、２０未満％、１５％未満、１０％未満または５％未満のＮＦ－κＢシグナル伝達活性である、請求項１３６～１３９の何れかの送達媒体。
  141. 非ヒト種がタスマニアンデビル、マーモセット、ウシ、ネコ、ダチョウ、イノシシ、コウモリ、マナティ、トキ、シーラカンス、マウス、ゼブラフィッシュまたはゾウギンザメである、請求項１３６～１４０の何れかの送達媒体。
  142. 対象で発現されたとき、Ｉ型ＩＦＮの構成的発現に至る免疫刺激性タンパク質をコードする核酸を含み、ここで、送達媒体がナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、細菌、ウイルス、細胞およびマイクロ小胞から選択される、送達媒体。
  143. 免疫刺激性タンパク質がサイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドを感知するまたは直接的もしくは間接的に相互作用するシグナル伝達経路にある、請求項１４２の送達媒体。
  144. サイトゾル核酸、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、環状ヌクレオチドまたは環状ジヌクレオチドを感知するまたは直接的もしくは間接的に相互作用するシグナル伝達経路にある免疫刺激性タンパク質がＩ型ＩＦＮを活性化する、請求項１４３の送達媒体。
  145. 免疫刺激性タンパク質がＩ型インターフェロンを活性化する先天性ＤＮＡ／ＲＮＡ認識に関与し、ＳＴＩＮＧ、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７、ＴＲＩＭ５６、ＲＩＰ１、Ｓｅｃ５、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＳＴＡＴ１、ＬＧＰ２、ＤＤＸ３、ＤＨＸ９、ＤＤＸ１、ＤＤＸ２１、ＤＨＸ１５、ＤＨＸ３３、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ６０およびＳＮＲＮＰ２００から選択される、請求項１４２～１４４の何れかの送達媒体。
  146. 免疫刺激性タンパク質がＳＴＩＮＧ、ＭＤＡ５、ＩＲＦ－３、ＩＲＦ－７およびＲＩＧ－１から選択される、請求項１４２～１４５の何れかの送達媒体。
  147. 非修飾ＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３０５～３０９の何れかに示す配列を有する；
    非修飾ＭＤＡ５タンパク質が配列番号３１０に示す配列を有する；
    非修飾ＲＩＧ－Ｉタンパク質が配列番号３１１に示す配列を有する；
    非修飾ＩＲＦ－３タンパク質が配列番号３１２に示す配列を有する；および
    非修飾ＩＲＦ－７タンパク質が配列番号３１３に示す配列を有する、
    請求項１４６の送達媒体。
  148. 免疫刺激性タンパク質が活性を構成的とするアミノ酸置換を含む、請求項１４２～１４７の何れかの送達媒体。
  149. 免疫刺激性タンパク質が、対象で生じたとき、インターフェロン症をもたらす、請求項１４２～１４８の何れかの送達媒体。
  150. 免疫刺激性タンパク質が１以上の機能獲得型変異を含むバリアントＳＴＩＮＧ、バリアントＭＤＡ５、バリアントＩＲＦ－３、バリアントＩＲＦ－７およびバリアントＲＩＧ－Ｉから選択される、請求項１４２～１４９の何れかの送達媒体。
  151. 機能獲得型変が構成的Ｉ型インターフェロンの発現をもたらす、請求項１５０の送達媒体。
  152. 変異が次のとおり：
    ａ)ＳＴＩＮＧにおいて、配列番号３０５～３０９を基準として、Ｓ１０２Ｐ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｍ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｇ１６６Ｅ、Ｃ２０６Ｙ、Ｇ２０７Ｅ、Ｓ１０２Ｐ／Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｌ、Ｒ２８１Ｑ、Ｒ２８４Ｇ、Ｒ２８４Ｓ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ１９７Ａ、Ｄ２０５Ａ、Ｒ３１０Ａ、Ｒ２９３Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｅ２９６Ａ、Ｒ１９７Ａ／Ｄ２０５Ａ、Ｓ２７２Ａ／Ｑ２７３Ａ、Ｒ３１０Ａ／Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ａ、Ｅ３１６Ｎ、Ｅ３１６Ｑ、Ｓ２７２Ａ、Ｒ２９３Ａ／Ｔ２９４Ａ／Ｅ２９６Ａ、Ｄ２３１Ａ、Ｒ２３２Ａ、Ｋ２３６Ａ、Ｑ２７３Ａ、Ｓ３５８Ａ／Ｅ３６０Ａ／Ｓ３６６Ａ、Ｄ２３１Ａ／Ｒ２３２Ａ／Ｋ２３６Ａ／Ｒ２３８Ａ、Ｓ３５８Ａ、Ｅ３６０Ａ、Ｓ３６６Ａ、Ｒ２３８Ａ、Ｒ３７５ＡおよびＳ３２４Ａ／Ｓ３２６Ａから選択される１以上；
    ｂ)ＭＤＡ５において、配列番号３１０を基準として、Ｔ３３１Ｉ、Ｔ３３１Ｒ、Ａ４８９Ｔ、Ｒ８２２Ｑ、Ｇ８２１Ｓ、Ａ９４６Ｔ、Ｒ３３７Ｇ、Ｄ３９３Ｖ、Ｇ４９５Ｒ、Ｒ７２０Ｑ、Ｒ７７９Ｈ、Ｒ７７９Ｃ、Ｌ３７２ＦおよびＡ４５２Ｔの１以上；
    ｃ)ＲＩＧ－Ｉにおいて、配列番号３１１を基準として、Ｅ３７３ＡおよびＣ２６８Ｆの一方または両方；
    ｄ)ＩＲＦ－３において、配列番号３１２を基準として、Ｓ３９６Ｄ；ａｎｄ
    ｅ)ＩＲＦ－７において、配列番号３１３を基準として、Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ、Ｓ４７５Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９ＤおよびＳ４７５Ｄ／Ｓ４７６Ｄ／Ｓ４７７Ｄ／Ｓ４７９Ｄ／Ｓ４８３Ｄ／Ｓ４８７Ｄの１以上
    である、請求項１５０または請求項１５１の送達媒体。
  153. 非修飾ＳＴＩＮＧが配列番号３０５～３０９の何れかに示す配列を有し、非修飾ＭＤＡ５が配列番号３１０に示す配列を有し、非修飾ＲＩＧ－Ｉが配列番号３１１に示す配列を有し、非修飾ＩＲＦ－３が配列番号３１２に示す配列を有し、非修飾ＩＲＦ－７が配列番号３１３に示す配列を有し、各修飾タンパク質が非修飾タンパク質と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項１５２の送達媒体。
  154. 細胞、エクソソーム、腫瘍溶解性ウイルスまたはウイルスベクター、リポソームまたは他の脂質ベースの媒体または免疫刺激性細菌である、請求項１３６～１５３の何れかの送達媒体。
  155. 送達媒体が幹細胞または免疫細胞である細胞である、請求項１５４の送達媒体。
  156. エクソソームである、請求項１３６～１５４の何れかの送達媒体。
  157. 腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１３６～１５４の何れかの送達媒体。
  158. 腫瘍溶解性アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ラブドウイルス、パピローマウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ピコルナウイルス、シンドビスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、セネカバレーウイルス、センダイウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、アルファウイルスおよびフラビウイルスから選択される腫瘍溶解性である、請求項１３６～１５の何れかの送達媒体。
  159. 腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルスまたはレオウイルスである、請求項１５８の送達媒体。
  160. 免疫刺激性タンパク質をコードする核酸が真核生物制御配列の制御下に発現される、請求項１３６～１５９の何れかの送達媒体。
  161. 免疫刺激性タンパク質をコードする核酸が真核生物プロモーターの制御下に発現される、請求項１３６～１６０の何れかの送達媒体。
  162. 免疫刺激性タンパク質が構成的活性型ＳＴＩＮＧタンパク質である、請求項１３６～１６１の何れかの送達媒体。
  163. 、哺乳動物対象で発現されたとき、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を付与するまたは貢献する免疫刺激性タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１３６～１６２の何れかの送達媒体。
  164. 免疫刺激性タンパク質がサイトカイン、ケモカイン、共刺激タンパク質または受容体またはサイトゾルドメイン欠失を有する共刺激受容体である、請求項１６３の送達媒体。
  165. 細胞である、請求項１３６～１６４の何れかの送達媒体。
  166. 細胞が幹細胞である、請求項１６５の送達媒体。
  167. 幹細胞が間葉性幹細胞(ＭＳＣ)である、請求項１６６の送達媒体。
  168. ＭＳＣが免疫調節性サイトカインの組み合わせを発現するよう遺伝子修飾される、請求項１６７の送達媒体。
  169. サイトカインがインターロイキン１２(ＩＬ－１２)およびインターロイキン２１(ＩＬ－２１)である、請求項１６８の送達媒体。
  170. Ｉ型インターフェロンがインターフェロン－αまたはインターフェロン－βである、請求項１～１６９の何れかの送達媒体、ＳＴＩＮＧタンパク質、免疫刺激性タンパク質または免疫刺激性細菌。
  171. 請求項１３６～１６４の何れかの送達媒体を含む、単離細胞。
  172. 免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞または初代細胞株である、請求項１７１の細胞。
  173. 造血細胞である、請求項１７２の細胞。
  174. Ｔ細胞である、請求項１７２の細胞。
  175. 細胞を送達媒体で感染させることによりエクスビボで産生される、請求項１７１～１７４の何れかの細胞。
  176. 免疫刺激性細菌を含む単離細胞であって、
    免疫刺激性細菌を腫瘍常在免疫細胞に優先的に感染するように修飾するおよび／または免疫刺激性細菌のゲノムを腫瘍常在免疫細胞の細胞死誘導が少ないように修飾する；および
    免疫細胞、幹細胞、初代細胞株からの細胞または腫瘍細胞であるものである、
    単離細胞。
  177. 免疫刺激性細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)であるサルモネラ種である、請求項１７６の細胞。
  178. 請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌を含む、単離細胞または培養細胞。
  179. Ｔ細胞または造血細胞である、請求項１７６～１７８の何れかの細胞。
  180. 細胞の免疫刺激性細菌での感染によりエクスビボで産生される、請求項１７７～１７９の何れかの細胞。
  181. 請求項１７６～１８０の何れかの細胞を、固形腫瘍を含むまたは造血器腫瘍である癌を有する対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
  182. 癌が固形腫瘍を含む、請求項１８１の方法。
  183. 癌が転移である、請求項１８１または請求項１８２の方法。
  184. 癌が乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の癌、胃癌、リンパ腫および白血病から選択される、請求項１８１～１８３の何れかの方法。
  185. 癌の処置のための、請求項１７６～１８０の何れかの細胞の使用。
  186. 癌が固形腫瘍または造血器腫瘍を含む、請求項１８５の使用。
  187. 癌が転移である、請求項１８５または請求項１８６の使用。
  188. 癌が乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の癌、胃癌、リンパ腫および白血病から選択される、請求項１８５～１８７の何れかの使用。
  189. 薬学的に許容される媒体中に請求項１～２９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質、請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌、請求項１３６～１７０の何れかの送達媒体または請求項１７１～１８０の何れかの細胞を含む、医薬組成物。
  190. 請求項１～２９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質、請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌または請求項１３６～１７０の何れかの送達媒体を含み、細胞が受精ヒト卵の接合子ではない、単離細胞。
  191. 免疫細胞、幹細胞、腫瘍細胞または初代細胞株である、請求項１９０の細胞。
  192. 造血細胞であり、造血細胞がマクロファージであるキメラ抗原骨髄細胞である、請求項１９１の細胞。
  193. Ｔ細胞である、請求項１９１の細胞。
  194. 細胞を修飾ＳＴＩＮＧタンパク質、免疫刺激性細菌または送達媒体で感染させることによりエクスビボで産生した、請求項１９０～１９３の何れかの細胞。
  195. 請求項１～２９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質または請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌または請求項１３６～１７０の何れかの送達媒体または請求項１７１～１８０および１９０～１９４の何れかの細胞または請求項１８９の医薬組成物または請求項１９０～１９４の何れかの細胞を、固形腫瘍を含むまたは造血器腫瘍である癌を有する対象に投与することを含む、癌を処置する方法。
  196. 癌が固形腫瘍を含む、請求項１９５の方法。
  197. 癌が転移である、請求項１９５または請求項１９６の方法。
  198. 癌がリンパ腫、白血病、胃癌および乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の癌から選択される、請求項１９５～１９７の何れかの方法。
  199. 癌の処置のための、請求項１～２９の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質または請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌または請求項１３６～１７０の何れかの送達媒体または請求項１７１～１８０および１９０～１９４の何れかの細胞または請求項１８９の医薬組成物または請求項１９０～１９４の何れかの細胞の使用。
  200. 癌が固形腫瘍または造血器腫瘍を含む、請求項１９９の使用。
  201. 癌が転移である、請求項１９９または請求項２００の使用。
  202. 癌がリンパ腫、白血病、胃癌および乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の癌から選択される、請求項１９９～２０１の何れかの使用。
  203. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質が配列番号３３１、３３８または３４１～３５１に示すアミノ酸配列を有するまたは配列番号３３１、３３８または３４１～３５１に示すアミノ酸配列と少なくとも９８％配列同一性を有する各種のアレルＳＴＩＮＧタンパク質のバリアントである、請求項１～２０２の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質、送達媒体、免疫刺激性細菌、医薬組成物、細胞、方法または使用。
  204. 非ヒトＳＴＩＮＧタンパク質またはキメラが配列番号３３２～３３７、３３９または３４０の何れかに示すアミノ酸配列を有する、請求項１～２０２の何れかの修飾ＳＴＩＮＧタンパク質、送達媒体、免疫刺激性細菌、医薬組成物、細胞、方法または使用。
  205. 薬学的に許容される媒体中に請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌を含む、医薬組成物。
  206. 希釈せずに投与するために製剤化される、請求項１８９または請求項２０５の医薬組成物。
  207. １回量として製剤化される、請求項１８９、２０５および２０６の何れかの医薬組成物。
  208. 非経腸投与用に製剤化される、請求項１８９および２０５～２０７の何れかの医薬組成物。
  209. 請求項１８９および２０５～２０８の何れかの医薬組成物を投与することを含む、対象における固形腫瘍を含むまたは造血器腫瘍である癌を処置する方法。
  210. 対象における固形腫瘍を含むまたは造血器腫瘍である癌の処置のための、請求項１８９および２０５～２０８の何れかの医薬組成物の使用。
  211. 対象における固形腫瘍を含むまたは造血器腫瘍である癌の処置に使用するための、請求項３０～１３５の何れかの免疫刺激性細菌。
  212. 対象がヒトである、請求項１９５～２０２および２０９～２１１の何れかの方法または使用または免疫刺激性細菌。
  213. 処置が、第二の抗癌剤または処置が適用される組み合わせ治療を含む、請求項１９５～２０２および２０９～２１２の何れかの方法または使用または免疫刺激性細菌。
  214. 第二の抗癌剤または処置が免疫刺激性細菌の前、同時、後または間欠的に投与される、請求項２１３の方法または使用または免疫刺激性細菌。
  215. 第二の抗癌剤または処置が免疫療法である、請求項２１４の方法または使用または免疫刺激性細菌。
  216. タンパク質、細胞、送達媒体、医薬組成物または免疫刺激性細菌の投与が非経腸的である、請求項１９５～２０２および２０９～２１５の何れかの方法または使用または免疫刺激性細菌。
  217. 投与が経口または直腸または肺へのエアロゾルまたは腫瘍内である、請求項１９５～２０２および２０９～２１６の何れかの方法または使用または免疫刺激性細菌。
  218. 投与が静脈内、筋肉内または皮下である、請求項１９５～２０２および２０９～２１６の何れかの方法または使用または免疫刺激性細菌。
  219. 癌が白血病、リンパ腫、胃癌および乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、結腸直腸、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸および肝臓の癌から選択される、請求項１９５～２０２および２０９～２１８の何れかの方法または使用または免疫刺激性細菌。
  220. 免疫療法が抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与を含む、請求項２１５の方法または使用または免疫刺激性細菌。
  221. ゲノムを修飾することを含み、それにより細菌がフラジェリン－(ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－)および／またはｐａｇＰ－である、治療細菌の腫瘍にコロニー形成する能力を増加させる方法。
  222. 治療細菌が免疫刺激性細菌である、請求項２２１の方法。
  223. 細菌がサルモネラ種である、請求項２２１または請求項２２２の方法。
  224. ヒト患者におけるインターフェロン症を促進する変異機能獲得型、構成的活性免疫刺激タンパク質を同定し；そして
    同定されたタンパク質をコードする核酸を腫瘍ターゲティング細菌またはウイルスに導入することを含み、それにより得られた細菌またはウイルスが、対象に導入されたとき、腫瘍微小環境の免疫刺激を促進するものである、
    癌処置のための免疫刺激性細菌または腫瘍溶解性ウイルスを産生する方法。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020014543A2 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
US12024709B2 (en) 2019-02-27 2024-07-02 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
KR20230066000A (ko) 2020-08-12 2023-05-12 액팀 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드 면역자극성 박테리아-기초 백신, 치료제, 및 rna 전달 플랫폼
CN112444629B (zh) * 2020-12-09 2023-09-29 青岛科技大学 基于发夹核酸分子信号放大线路的外泌体检测方法及应用
CN112852698B (zh) * 2021-01-30 2022-11-29 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用
WO2022212784A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
CN113249382B (zh) * 2021-04-12 2023-05-12 右江民族医学院 下调TRIM56基因表达的siRNA及其应用
CN113549621B (zh) * 2021-07-14 2022-07-19 山西大学 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子
WO2023064755A2 (en) * 2021-10-11 2023-04-20 University Of Florida Research Foundation, Incorporated A novel poultry salmonella vaccine and diagnostic methodology to control foodborne salmonellosis
WO2023086796A2 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment
CN115356320B (zh) * 2022-10-20 2023-01-17 上海诚益生物科技有限公司 基于均相时间分辨荧光技术的体外rig-i激活检测的方法
WO2024107827A1 (en) * 2022-11-16 2024-05-23 The Broad Institute, Inc. Therapeutic exploitation of sting channel activity

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US3936354A (en) 1974-04-29 1976-02-03 Lapointe Jean Rock Anti-tumour product of bacterial origin
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
GB8322007D0 (en) 1983-08-16 1983-09-21 Wellcome Found Pharmaceutical delivery system
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
ES2317646T3 (es) 1995-09-08 2009-04-16 Genzyme Corporation Vectores aav mejorados para terapia genica.
US7001765B2 (en) 1996-03-06 2006-02-21 Medigene Ag Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells
AU8828598A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Rubicon Laboratory, Inc. Retrovirus and viral vectors
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
BR9812079A (pt) 1997-09-10 2000-09-26 Vion Pharmaceuticals Inc Salmonella sp. mutante, lipopolissacarìdeo, processo para inibir o crescimento ou reduzir o volume de um câncer de tumor sólido, composição farmacêutica, e, processo aperfeiçoado para selecionar alterações genéticas em uma bactéria.
WO1999015685A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
EP1135468B1 (en) 1998-11-10 2010-01-06 University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
JP2001010973A (ja) 1999-06-29 2001-01-16 Dnavec Research Inc がんワクチン
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
AU7993600A (en) 1999-10-04 2001-05-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Non-invasive tumor imaging by tumor-targeted bacteria
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US6723316B2 (en) 1999-12-22 2004-04-20 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Herpes simplex virus-1 Glycoprotein C mutants for treating unwanted hyperproliferative cell growth
ATE378348T1 (de) 2000-01-14 2007-11-15 Us Health Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
ES2254359T3 (es) 2000-01-21 2006-06-16 Biovex Limited Cepa viral para el tratamiento oncolitico de canceres.
US7306902B2 (en) 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US20020096037A1 (en) 2001-01-25 2002-07-25 Richard Muller Color-coded melody text and method of teaching
US6653103B2 (en) 2001-03-30 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibition of nucleocytoplasmic transport by vesicular stomatitis virus M protein-like polypeptides
ATE500808T1 (de) 2001-05-11 2011-03-15 Wellstat Biologics Corp Onkolytische virustherapie
US20030044386A1 (en) 2001-07-11 2003-03-06 Barber Glen N. Recombinant VSV for the treatment of tumor cells
EP1281767A3 (en) 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
EP1446012B1 (en) 2001-11-21 2013-07-17 The Johns Hopkins University Combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
CA2474728A1 (en) 2002-02-06 2003-08-14 Johns Hopkins University School Of Medicine Methods and compositions for the targeting of a systemic immune response to specific organs or tissues
WO2003082200A2 (en) 2002-03-27 2003-10-09 Baylor College Of Medicine Potent oncolytic herpes simplex virus for cancer therapy
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
EP1539230A4 (en) 2002-06-21 2007-10-31 Wellstat Biologics Corp ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC VIRUSES
JP2005537802A (ja) 2002-09-09 2005-12-15 ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・ファウンデーション ラブドウイルスの組み換え型変異体及びその使用方法
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
CN1788088B (zh) 2003-03-27 2012-09-26 渥太华健康研究学会 突变的水泡性口炎病毒及其用途
ATE420160T1 (de) 2003-06-18 2009-01-15 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
HUE035567T2 (en) 2003-09-30 2018-05-28 Univ Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clusters, sequences, vectors and applications containing them
US7897146B2 (en) 2003-11-17 2011-03-01 Crusade Laboratories Limited Treatment using herpes simplex virus
US20070003520A1 (en) 2003-11-17 2007-01-04 Brown Susanne M Mutant viruses
GB0326798D0 (en) 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
US20070298012A1 (en) 2003-12-16 2007-12-27 Ivan King Compositions and Methods for Tumor-Targeted Delivery of Effector Molecules
JP2005299711A (ja) 2004-04-07 2005-10-27 Shonan Plastic Mfg Co Ltd 更生管及びその敷設方法
WO2005116224A2 (en) 2004-05-18 2005-12-08 Children's Memorial Hospital Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
US8501198B2 (en) 2004-06-07 2013-08-06 Qu Biologics Inc. Tissue targeted antigenic activation of the immune response to treat cancers
US7731952B2 (en) 2004-06-24 2010-06-08 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
KR101452905B1 (ko) 2004-06-29 2014-10-21 안티캔서, 인코포레이티드 암 선택적 영양요구균주
US20090208924A1 (en) 2004-12-01 2009-08-20 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of Replication Competent Viruses for Therapeutic Use
EP2270136A1 (en) 2004-12-17 2011-01-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using same
WO2007053184A2 (en) 2005-05-31 2007-05-10 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing micrornas
EP2963118B1 (en) 2005-06-01 2017-08-09 California Institute of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
EP1909849B1 (en) 2005-06-23 2013-08-07 The University Of Houston Use of mutant herpes simplex virus-2 for cancer therapy
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
US8426375B2 (en) 2005-10-12 2013-04-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
CN1974759B (zh) 2006-07-26 2010-06-09 吉林大学 运载重组质粒的减毒沙门氏菌及其在抗肿瘤中的应用
EP2415783B1 (en) 2006-10-16 2016-12-14 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
WO2008140621A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
WO2008099189A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Crusade Laboratories Limited Herpes simplex viruses and methods of viral replication
US8313896B2 (en) 2008-04-04 2012-11-20 The General Hospital Corporation Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer
WO2009148488A2 (en) 2008-05-29 2009-12-10 The General Hospital Corporation Use of oncolytic herpes viruses for killing cancer stem cells
EP2324044A4 (en) 2008-08-04 2012-04-25 Univ Miami STING (INTERFERON GENE STIMULATOR), A REGULATOR OF INDIAN IMMUNE RESPONSES
US8241844B2 (en) 2008-10-03 2012-08-14 Ralph Clark, legal representative Methods and compositions for modulating an immune response with immunogenic oligonucleotides
WO2010080909A1 (en) 2009-01-08 2010-07-15 Yale University Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus
US20120009153A1 (en) 2009-08-13 2012-01-12 Hongnian Guo Compositions for bacterial mediated gene silencing and methods of using the same
US20120315324A1 (en) 2010-02-05 2012-12-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosomal compositions and methods for the treatment of disease
WO2012149364A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Diamond Don J Tumor associated vaccines and compositions for disrupting tumor-derived immunosuppression for use in combination cancer immunotherapy
CN103857387B (zh) 2011-06-02 2017-03-15 加利福尼亚大学董事会 膜包封的纳米颗粒及使用方法
EP2620159A1 (en) 2012-01-24 2013-07-31 Institut Pasteur Improved cancer treatment by immunotherapy with bcg or antigenically related non-pathogenic mycobacteria
CN108102945B (zh) 2012-04-27 2021-08-24 山东新创生物科技有限公司 包含戈氏梭菌的衍生细菌菌株的组合物及其使用方法
ES2391108B1 (es) 2012-07-26 2013-10-07 Universitat Autonoma De Barcelona Uso de mycobacterium brumae para el tratamiento del cáncer de vejiga
US9539290B2 (en) 2012-12-24 2017-01-10 Anticancer Inc. Individualized bacterial treatment of pancreatic cancer
SG11201508585PA (en) 2013-04-18 2015-11-27 Tilt Biotherapeutics Oy Enhanced adoptive cell therapy
CA2917102A1 (en) 2013-07-03 2015-01-08 City Of Hope Anticancer combinations
US10987432B2 (en) 2013-09-05 2021-04-27 The University Of Hong Kong Therapeutic delivery and expression system, methods and uses thereof
AU2014338864C1 (en) 2013-10-25 2020-07-16 Akamis Bio Limited Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
MX2016012891A (es) 2014-03-31 2017-10-12 Univ Johns Hopkins Uso de bacterias, productos bacterianos, y otras entidades inmunorreguladoras en combinacion con anticuerpos anti antigeno 4 de linfocitos t citotoxicos (ctla-4) y/o anti proteina 1 de muerte celular programada (pd-1) para tratar neoplasias de tumor solido.
WO2016025582A2 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Forbes Neil S Targeting epigenetic regulators using a bacterial delivery system
US10646524B2 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Sillajen, Inc. Modified oncolytic vaccinia viruses expressing a cytokine and a car-boxylesterase and methods of use thereof
CA2997912A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
EP3426271A4 (en) * 2016-03-10 2019-10-16 Cold Genesys, Inc. METHODS OF TREATING SOLID OR LYMPHATIC TUMORS BY POLYTHERAPY
AU2017290828A1 (en) 2016-06-30 2019-01-24 Virogin Biotech Canada Ltd Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
WO2018075825A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Northwestern University Extracellular vesicle-based diagnostics and engineered exosomes for targeted therapeutics against cancer
CA3042015A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for enhancing immune responses and methods of use thereof
KR20180066296A (ko) * 2016-12-07 2018-06-19 서울대학교산학협력단 토파시티닙을 포함하는 고염증 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 토파시티닙을 포함하는 고염증 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물
US11471494B2 (en) 2017-01-06 2022-10-18 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
JP2020516590A (ja) 2017-04-14 2020-06-11 コールド ジェネシス， インコーポレイテッド 膀胱癌の治療方法
WO2019014398A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Actym Therapeutics, Inc. MODIFIED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF
JP2020527025A (ja) * 2017-07-12 2020-09-03 シンロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド 腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物

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