JP2022524866A - 機能不全ｒｎａ分子へのサイレンシング活性の導入、及び関心遺伝子に対する特異性の改変 - Google Patents

機能不全ｒｎａ分子へのサイレンシング活性の導入、及び関心遺伝子に対する特異性の改変 Download PDF

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Abstract

細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成する方法であって、（ａ）ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列を同定することと；（ｂ）ＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列の転写を判定することと；（ｃ）所定の配列相同性範囲を示す、異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の転写物の低分子ＲＮＡへのプロセシング性を判定することと；（ｄ）ＲＩＳＣと会合し、第１の標的ＲＮＡ又は関心標的ＲＮＡに対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、異常にプロセシングされる転写可能な核酸配列の核酸配列を改変することと、を含む方法が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１９年３月１４日出願の英国特許出願第１９０３５１９．５号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
配列表に関する記述
本願の出願と同時に提出された、２０２０年３月１２日に作成された２２１，２８３バイトの８１３２０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題されたＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に援用される。
発明の分野及び背景技術
本発明は、その幾つかの実施形態では、真核細胞におけるサイレンシング機能不全ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）にサイレンシング活性を付与し、場合によっては、内因性又は外因性の関心標的ＲＮＡのサイレンシングに対するＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を改変することに関する。
近年のゲノム編集技術の進歩により、生存細胞のゲノム中の数十億個のヌクレオチドのうちのわずか数個を編集することによって、生存細胞におけるＤＮＡ配列を変化させることが可能になった。過去１０年間で、ヒトの体細胞及び多能性細胞等においてゲノム編集を使用するためのツール及び専門的技術が増加し、現在ではこのアプローチがヒトの疾患を治療するための戦略として広く展開されるまでになっている。その基本的なプロセスは、ゲノム中に部位特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、次いで、細胞の内因性ＤＳＢ修復機構にその切断を修復させることに依る（例えば、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）等による、後者では、外因的に提供されたドナーテンプレートを用いてＤＮＡ配列に対して正確にヌクレオチドを変化させることができる［Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２０１６）５６：１６３－９０］。
例えば、有力な治療法については、３つの主要なアプローチで細胞の変異原性ゲノム編集（ＮＨＥＪ）が使用される：（ａ）空間的に正確な挿入又は欠失を引き起こすことにより、機能性遺伝要素をノックアウトする、（ｂ）原因であるフレームシフト変異を補う挿入又は欠失を作り出して、部分的に機能性又は非機能性の遺伝子を再活性化させる、及び（ｃ）規定の遺伝子欠失を作り出す。幾つかの異なる用途でＮＨＥＪによる編集が使用されるが、相同組換え（ＨＲ）によるゲノム編集が最も広い応用範囲を提供する可能性が最も高い。これは、ＨＲは稀な事象であるが、外因的に提供されたテンプレートに依存して修復プロセス中に特定の所定の配列をコピーするので精度が高いためである。
現在、ＨＲが媒介するゲノム編集の４種の主な用途は、（ａ）遺伝子の修正（すなわち、単一遺伝子における点変異によって引き起こされる疾患の修正）、（ｂ）機能性遺伝子の修正（すなわち、遺伝子全体に点在する変異によって引き起こされる疾患の修正）、（ｃ）セーフハーバー遺伝子の付加（すなわち、正確な調節が必要ない場合又は非生理的レベルのトランスジーンが望ましい場合）、及び（ｄ）標的となるトランスジーンの付加（すなわち、正確な調節が必要な場合）［Ｐｏｒｔｅｕｓ（２０１６），前掲］である。
様々な真核生物（例えば、マウス、ヒト、エビ、植物）におけるＲＮＡ分子のゲノム編集に関するこれまでの研究は、例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子の活性をノックアウトしたり、標的ＲＮＡにおける結合部位を変化させたりすることに重点的に取り組んでいた。
ヒト細胞におけるゲノム編集に関しては、Ｊｉａｎｇら［Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）１１（１０）：１２４３－９］は、ＨｅＬａ細胞でヒトｍｉＲ－９３の５’領域を標的とすることによってクラスターからヒトｍｉＲ－９３を欠失させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した。ドローシャプロセシング部位（すなわち、二本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であるドローシャが、宿主細胞の核内で一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に結合し、切断し、それによって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡにプロセシングする位置）及びシード配列（すなわち、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡへの結合に不可欠な保存された７塩基（ｈｅｐｔａｍｅｔｒｉｃａｌ）の配列、典型的にはｍｉＲＮＡの５’末端から２～７番目に位置する）を含む標的となる領域において、様々な小さなインデルが誘導された。Ｊｉａｎｇらによれば、１ヌクレオチドの欠失であっても、標的ｍｉＲＮＡが高い特異性で完全にノックアウトされた。
マウス種におけるゲノム編集に関しては、Ｚｈａｏら［Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４：３９４３］が、マウス細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用するｍｉＲＮＡ阻害戦略を提供した。Ｚｈａｏは、特別に設計したｓｇＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによってｍｉＲＮＡ遺伝子を単一部位で切断し、その結果、これら細胞でｍｉＲＮＡがノックアウトされた。
植物のゲノム編集に関しては、Ｂｏｒｔｅｓｉ及びＦｉｓｃｈｅｒ［Ｂｏｒｔｅｓｉ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５）３３：４１－５２］が、植物におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術の使用について、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと比較して論じており、Ｂａｓａｋ及びＮｉｔｈｉｎ［Ｂａｓａｋ ａｎｄ Ｎｉｔｈｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１５）６：１００１］は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術が、シロイヌナズナ及びタバコ等のモデル植物、並びにコムギ、トウモロコシ、及びイネを含む作物において、タンパク質をコードしている遺伝子のノックダウンに応用されていることを教示している。
ｍｉＲＮＡ活性又は標的結合部位の破壊に加えて、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を介した内因性及び外因性の標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを使用する遺伝子サイレンシングが実現されている［Ｔｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４）８６：１］。ｍｉＲＮＡと同様に、ａｍｉＲＮＡは一本鎖であり、約２１ヌクレオチド（ｎｔ）長であり、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ内の二重鎖の成熟ｍｉＲＮＡ配列を置換することによって設計される［Ｔｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）前喝］。これらａｍｉＲＮＡは、人工発現カセット（プロモーター、ターミネーター等を含む）内にトランスジーンとして導入され［Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｐ．１１３．２３４９８９］、低分子ＲＮＡのバイオジェネシス及びサイレンシング機構を介してプロセシングされ、標的の発現をダウンレギュレートする。Ｓｃｈｗａｂら［Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１８，１１２１－１１３３］によれば、ａｍｉＲＮＡは、組織特異的又は誘導性プロモーターの下で発現したときに活性を有し、特に、幾つかの関連するが同一ではない標的遺伝子をダウンレギュレートする必要があるときに、植物における特異的遺伝子サイレンシングに使用することができる。
Ｓｅｎｉｓら［Ｓｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７）Ｖｏｌ．４５（１）：ｅ３］は、内因性ｍｉＲＮＡ遺伝子座へのプロモーターレス抗ウイルスＲＮＡｉヘアピンの導入を開示している。具体的には、Ｓｅｎｉｓらは、Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮヌクレアーゼ等の配列特異的ヌクレアーゼによって誘導される相同性依存性ＤＮＡ組み換えによって、天然に存在するｍｉＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲ１２２）に隣接するａｍｉＲＮＡ前駆体トランスジーン（ヘアピン型ｐｒｉ－ａｍｉＲＮＡ）を挿入する。このアプローチでは、天然のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１２２）を発現する転写的に活性のあるＤＮＡを利用することによってプロモーター及びターミネーターのないａｍｉＲＮＡを使用する、すなわち、内因性のプロモーター及びターミネーターが、挿入されたａｍｉＲＮＡトランスジーンの転写を駆動し、調節した。
ＤＮＡを使わずにＲＮＡ及び／又はタンパク質を細胞内に導入する様々な方法が、既に報告されている。例えば、エレクトロポレーション及びリポフェクションを用いたＲＮＡトランスフェクションが、米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号に記載されている。Ｃｈｏ［Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７－１１８０］によって、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ複合体のマイクロインジェクションによるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の細胞への直接送達が記載されている。Ｋｉｍ［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２－１０１９］によって、エレクトロポレーションを介したＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ複合体の送達が記載されている。Ｚｕｒｉｓ［Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１］によって、リポソームを介したＣａｓ９タンパク質関連ｓｇＲＮＡ複合体の送達が報告されている。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列を同定することと；（ｂ）当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列の転写を判定することと；（ｃ）当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の転写物の低分子ＲＮＡへのプロセシング性を判定することであって、当該ＲＮＡ分子が異常にプロセシングされることと；（ｄ）ＲＩＳＣと会合し、かつ第１の標的ＲＮＡに対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、当該所定の配列相同性範囲を示す異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の核酸配列を改変し、それによって、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＲＮＡ分子がＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシングされるようになる核酸配列の変化を有するＲＮＡ分子をコードしているポリヌクレオチド配列を含むゲノムを含む遺伝的に改変された細胞であって、核酸配列が変化していない同一起源の野生型細胞には当該ＲＮＡ分子のプロセシングが存在しない、遺伝的に改変された細胞が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って生成された植物細胞が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の植物細胞を含む植物が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、標的遺伝子の発現が低下した植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと；（ｂ）関心標的ＲＮＡの発現が低下した後代植物、又は関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡ分子におけるサイレンシング特異性を含み、かつＤＮＡ編集剤を含まない後代を選択し、それによって、標的遺伝子の発現が低下した植物を生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと；（ｂ）関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む後代植物、又は関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡ分子におけるサイレンシング特異性を含み、かつＤＮＡ編集剤を含まない後代を選択し、それによって、関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む植物を生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、繁殖を可能にする条件下で植物又は植物細胞を成長させることを含む、本発明の幾つかの実施形態の植物又は植物細胞を生成する方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の植物又は本発明の幾つかの実施形態によって生成される植物の種子が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、疾患の治療を、それを必要としている被験体においてする方法であって、本発明の幾つかの実施形態の方法に従ってサイレンシング活性及び／又は特異性を有するＲＮＡ分子を生成することを含み、当該ＲＮＡ分子が、当該疾患の発症又は進行に関連する遺伝子の転写物に対するサイレンシング活性を有し、それによって、当該被験体を治療することを含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、細胞内の第１のＲＮＡ分子にサイレンシング活性を導入する方法であって、
（ａ）
ｉ．第１の核酸配列が、細胞内で第１のＲＮＡ分子に転写され；
ｉｉ．当該第１のＲＮＡ分子の配列が、配列同一性を除いて、第２のＲＮＡ分子の配列と部分的な相同性を有し、当該第２のＲＮＡ分子が、サイレンシング活性を有する第３のＲＮＡ分子にプロセシング可能であり、当該第２のＲＮＡ分子が、当該細胞内の第２の核酸配列によってコードされており；かつ
ｉｉｉ．当該第１のＲＮＡ分子がプロセシング不可能であるか又は第２のＲＮＡ分子とは異なってプロセシング可能であり、その結果、当該第１のＲＮＡ分子が、第３のＲＮＡ分子と同じ性質のサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にはプロセシングされない、
当該細胞内の第１の核酸配列を選択することと、
（ｂ）改変された第１のＲＮＡ分子をコードするように当該第１の核酸配列を改変することであって、当該改変された第１のＲＮＡ分子が、当該第２のＲＮＡ分子が当該第３のＲＮＡ分子にプロセシング可能であるのと同様に第４のＲＮＡにプロセシング可能であり、その結果、第４のＲＮＡ分子が、当該第３のＲＮＡ分子と同じ性質のサイレンシング活性を有し、
それによって、当該第１のＲＮＡ分子にサイレンシング活性を導入することと、
を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、同定された核酸配列によってコードされている工程（ａ）のＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣと会合する及び／又はＲＩＳＣと会合する分子にプロセシングされるＲＮＡ分子に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｄ）におけるプロセシング性の付与は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列の核酸配列によってコードされているＲＮＡ分子に対して標準的なプロセシングを付与することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、工程（ａ）の所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列のゲノム上の位置を決定することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、非コード遺伝子内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、非コード遺伝子のイントロン内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、コード遺伝子内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、コード遺伝子のエキソン内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、コード遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードしているエキソン内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、コード遺伝子のイントロン内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、非コード遺伝子に位置する核酸配列によってコードされている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、コード遺伝子に位置する核酸配列によってコードされている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、コード遺伝子のエキソン内に位置する核酸配列によってコードされている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、コード遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードしているエキソン内に位置する核酸配列によってコードされている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、コード遺伝子のイントロン内に位置する核酸配列によってコードされている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ゲノム上の位置は、非コード遺伝子のイントロン内である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して７５％～９９．６％の同一性を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｂ）及び／又は（ｃ）は、低分子ＲＮＡの発現データの細胞のゲノムへのアライメント及び各ゲノム上の位置にマッピングされるリードの量の決定によって影響を受ける。
本発明の幾つかの実施形態によれば、低分子ＲＮＡのアライメントは、ミスマッチのない細胞のゲノム中の所定の位置へのアライメントである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、転写可能な核酸配列の核酸配列を改変することで、異常にプロセシングされるＲＮＡ分子の構造が付与され、その結果、ＲＮＡ分子が、ＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシングされるようになる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、所定の配列相同性範囲を示す異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の核酸配列の改変は、第１の標的ＲＮＡに対する結合部位に対応するもの以外の核酸で行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、プロセシング性は、ダイサー、アルゴノート、ｔＲＮＡ切断酵素、及びＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）関連タンパク質からなる群から選択される細胞ヌクレアーゼによってもたらされる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｄ）における改変は、第１の標的ＲＮＡに向けて異常にプロセシングされるＲＮＡ分子のサイレンシング活性を再活性化するＤＮＡ編集剤を細胞に導入し、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを更に含み、当該方法は、第１の標的ＲＮＡとは異なる関心標的ＲＮＡに向けてＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするＤＮＡ編集剤を細胞に導入し、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、ＤＮＡ編集剤が、第１の標的ＲＮＡとは異なる関心標的ＲＮＡに向けてＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトし、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変する、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを更に含み、当該方法は、第１の標的ＲＮＡとは異なる関心標的ＲＮＡに向けてＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするＤＮＡ編集剤を細胞に導入し、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）で同定されたＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングがその二次構造に依存するサイレンシングＲＮＡ分子をコードしている遺伝子と相同である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）のＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、ｍｉＲＮＡ前駆体をコードしている遺伝子と相同である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングが二次構造に依存するサイレンシングＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子のＲＮＡ、並びに長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、プロセシングは、標準的なプロセシングである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ断片（ｔＲＦ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、転位性及び／又はレトロ転位性由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及び／又はレトロ転位性ＲＮＡからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ｄＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＰとして細胞に適用される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、細胞内での発現をモニタリングするためにレポーターに連結される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、レポーターは、蛍光タンパク質である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、細胞に対して内因性である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、細胞に対して外因性である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、関心標的ＲＮＡのＲＮＡ又はタンパク質のレベルを測定することによって判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、表現型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子の特異性は、細胞サイズ、成長の速度／阻害、細胞形状、細胞膜の完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の着色、生物のサイズ、作物収量、代謝プロファイル、果実形質、生物的ストレス抵抗性、非生物的ストレス抵抗性、感染パラメータ、及び炎症パラメータからなる群から選択される少なくとも１つの表現型を決定することによって表現型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、遺伝子型的に判定される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、細胞は、真核細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、真核細胞は、植物、哺乳類、無脊椎動物、昆虫、線形動物、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、真菌類、及び藻類からなる群から選択される真核生物から得られる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、真核細胞は、植物細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物細胞は、プロトプラストである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、非トランスジェニックである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、トランスジェニック植物である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、遺伝的に改変されていない（非ＧＭＯ）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、遺伝的に改変されている（ＧＭＯ）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、育種は、交配又は自殖を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、真核細胞は、非ヒト動物細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、真核細胞は、非ヒト哺乳類細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、真核細胞は、ヒト細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、配列番号３５２～３９２のいずれかに記載の核酸配列からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、真核細胞は、全能性幹細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、疾患の発症又は進行に関連する遺伝子は、病原体の遺伝子を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、疾患の発症又は進行に関連する遺伝子は、被験体の遺伝子を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、疾患は、感染性疾患、一遺伝子性劣性遺伝障害、自己免疫疾患、及びがん性疾患からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、それがサイレンシング活性を有するＲＮＡにプロセシングされることを可能にする二次構造を有するＲＮＡ分子であり、任意で、当該サイレンシング活性は、ＲＩＳＣとの会合を通して媒介される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性を有するＲＮＡにプロセシングされることを可能にする二次構造を有するＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子のＲＮＡ、並びに長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、第１の核酸配列は、改変された第１のＲＮＡ分子が第４のＲＮＡ分子にプロセシングされることを可能にする二次構造をもたらす。
本発明の幾つかの実施形態によれば、第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が第２のＲＮＡ分子と本質的に同じ二次構造を有するように、当該配列を改変することを含む。
幾つかの実施形態によれば、二次構造は、第２のＲＮＡ分子の二次構造と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は１００％同一である（例えば、第１のＲＮＡ分子の二次構造が線状の紐形態に翻訳され、第２のＲＮＡ分子の二次構造の紐形態と比較された場合）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、第１の核酸分子は、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）由来の遺伝子であって、配列番号３５２～３９２のいずれかに記載の配列を有する遺伝子からなる群から選択される遺伝子である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、被験体は、ヒト被験体である。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施態様の実施又は試験で用いることができるが、例示的な方法及び／又は材料について以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、そして、必ずしも限定を意図するものではない。
本発明の幾つかの実施形態について、添付の図面を参照して、単なる例示として本明細書で説明する。次に図面を詳細に具体的に参照するが、示されている特徴は、一例であり、本発明の実施形態について例示的に論じることを目的とするものであることを強調する。これに関連して、図面に付随する説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにするものである。
図中、
図１は、機能不全非コードＲＮＡ分子のサイレンシング活性を付与し、そのサイレンシング特異性をリダイレクトするための、実施形態の計算パイプラインのフローチャートである。なお、計算ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）パイプラインは、生物学的メタデータを適用し、ｍｉＲＮＡ遺伝子を最小限しか編集せずに新たに機能を獲得させる、すなわち、関心標的配列に対するそのサイレンシング能力をリダイレクトするために使用されるＧＥｉＧＳ ＤＮＡテンプレートを自動生成することを可能にする。 図２は、機能性ｍｉＲＮＡのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑプロファイリングのｍｉＲｂａｓｅ表示を示す写真である。２本の成熟ｍｉＲＮＡ鎖の検出の違いに注目されたい。リード数の多いｍｉＲＮＡは、典型的には、機能性のもの（ガイド鎖）であり、リード数がほとんど又は全くない他方は、典型的には、細胞内で分解される（パッセンジャー鎖）。しかし、成熟ｍｉＲＮＡの両鎖が機能性である（それぞれが異なる転写物を標的とする）場合もある。 図３は、ｍｉＲＮＡ様配列を網羅するＲＮＡ－ｓｅｑリード数を示すグラフである。ｘ軸は、異なる種で発現しているｍｉＲＮＡ様配列を表す。ｙ軸は、ｍｉＲＮＡ様配列を網羅する異なるＲＮＡｓｅｑリード数を表し、「ｈａｓ」は、ヒト、「ａｔｈ」は、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、「ｃｅｌ」は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を意味する。 図４は、ＧＥｉＧＳテンプレートを作製するための計算パイプラインの実施形態のフローチャートである。計算ＧＥｉＧＳパイプラインは、生物学的メタデータを適用し、内因性非コードＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子）を最小限しか編集せずに新たに機能を獲得させる、すなわち、関心遺伝子発現を標的とするようにそのサイレンシング能力をリダイレクトするために使用されるＧＥｉＧＳ ＤＮＡドナーテンプレートを自動的に作製することを可能にする。 図５は、内因性ｍｉＲＮＡを、ＰＤＳ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに置き換え、それによって、内因性ＰＤＳ遺伝子の遺伝子サイレンシングを誘導する、ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）の実施形態のフローチャートである。改変を導入するために、２成分系を使用している。第１に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系は、ＧＦＰ含有ベクターにおいて、設計された特定のガイドＲＮＡを通して、選択された遺伝子座において切断を行って、その部位における相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を促進する。第２に、新たに割り当てられた遺伝子を標的とするためにｍｉＲＮＡの配列を所望の通り改変したＤＯＮＯＲ配列を、ＨＤＲのテンプレートとして導入する。この系は、プロトプラストの形質転換に使用され、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターのＧＦＰシグナルに起因してＦＡＣＳによって濃縮され、回収され、植物に再生される。 図６Ａ～Ｃは、ＰＤＳ遺伝子のサイレンシングが光退色を引き起こすことを示す写真である。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）（図６Ａ～Ｂ）及びシロイヌナズナ（図６Ｃ）の植物におけるＰＤＳ遺伝子をサイレンシングすると、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（図６Ｂ）及びシロイヌナズナ（図６Ｃ、右側）で光退色が引き起こされる。ＰＤＳのサイレンシングの３週間半後に写真を撮影した。 図７は、本発明に係るＲＮＡ転写物におけるサイレンシング活性を再活性化又はリダイレクトするためのプロセスの実施形態の概略図を提供する。 図８Ａ～Ｂは、（図８Ａ）野生型ｍｉＲＮＡの前駆体、「Ｄｅａｄ」ｍｉＲＮＡ様分子の前駆体、及びサイレンシング活性が再活性化された「Ｄｅａｄ」ｍｉＲＮＡ様分子の前駆体、並びに（図８Ｂ）サイレンシング活性が再活性化された「Ｄｅａｄ」ｍｉＲＮＡ様分子の前駆体、及びサイレンシング活性がＰＤＳ３遺伝子を標的とするようにリダイレクトされている「Ｄｅａｄ」ｍｉＲＮＡ様分子の前駆体のプロセシング性及びサイレンシング活性を試験するために、本明細書において以下の実施例２に記載する通り、シロイヌナズナのプロトプラストをトランスフェクトするために使用したベクターの概略図を提供する。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図９Ａ～Ｈは、以下を提供する：（図９Ａ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ４０５ａ、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ８５９＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｂに提示される。（図９Ｃ）及び（図９Ｄ）（図９Ａ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。（図９Ｅ）以下のｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様遺伝子によってコードされている、以下のシロイヌナズナ前駆体の予測二次構造の概略図：野生型ｍｉＲ８１７４、ｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ、サイレンシング活性が再活性化されたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿再活性化）、及びサイレンシング活性が活性化され、ＰＤＳ３遺伝子に向けてリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ（ｍｉＲ１３３４＿リダイレクト）。各構造における灰色のボックスは、成熟ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様前駆体における対応する位置のガイド鎖をマークし、各ガイド鎖及びその標的配列に対するアラインメントが、更に図９Ｆに提示される。（図９Ｇ）及び（図９Ｈ）（図９Ｅ）に示したベクターを発現しているベクターをシロイヌナズナのプロトプラストにトランスフェクトしたときに観察されたサイレンシング活性（ルシフェラーゼ、ＬＵＣと正規化蛍光タンパク質、ＦＰとの間の比の減少によって測定）を比較した棒グラフ。濃い色の棒は、実験的処理を表し、薄い色の棒は、それぞれの対照を表し、グラフ中の括弧内に記載されているｐ値は、スチューデントのｔ検定によるものであり、エラーバーは、標準誤差を表す。 図１０Ａ～Ｎは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４（ＭＩ００２６８０４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１０Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４、ｃｈ３位置１６５８９４１４～１６５８９５２７に位置する）と完全に一致した、根の２０ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１０Ｇは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１０Ｈは、ｃｈｒ５位置１３６４４９０５～１３６４５００に位置するｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２０ｂｐのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全ての分布プロットを示す。図１０Ｎは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４の二次構造を示す。 図１０Ａ～Ｎは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４（ＭＩ００２６８０４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１０Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４、ｃｈ３位置１６５８９４１４～１６５８９５２７に位置する）と完全に一致した、根の２０ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１０Ｇは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１０Ｈは、ｃｈｒ５位置１３６４４９０５～１３６４５００に位置するｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２０ｂｐのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全ての分布プロットを示す。図１０Ｎは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４の二次構造を示す。 図１０Ａ～Ｎは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４（ＭＩ００２６８０４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１０Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４、ｃｈ３位置１６５８９４１４～１６５８９５２７に位置する）と完全に一致した、根の２０ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１０Ｇは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１０Ｈは、ｃｈｒ５位置１３６４４９０５～１３６４５００に位置するｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２０ｂｐのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全ての分布プロットを示す。図１０Ｎは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４の二次構造を示す。 図１０Ａ～Ｎは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４（ＭＩ００２６８０４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１０Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４、ｃｈ３位置１６５８９４１４～１６５８９５２７に位置する）と完全に一致した、根の２０ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１０Ｇは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１０Ｈは、ｃｈｒ５位置１３６４４９０５～１３６４５００に位置するｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２０ｂｐのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全ての分布プロットを示す。図１０Ｎは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４の二次構造を示す。 図１１Ａ～Ｊは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２４７及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１８０（ＭＩ００２６８１０）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１１Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１１Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１１Ｊは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２４７の二次構造を示す。 図１１Ａ～Ｊは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２４７及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１８０（ＭＩ００２６８１０）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１１Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１１Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１１Ｊは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２４７の二次構造を示す。 図１１Ａ～Ｊは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２４７及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－８１８０（ＭＩ００２６８１０）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１１Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１１Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、根の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１１Ｊは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２４７の二次構造を示す。 図１２Ａ～Ｉは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－４０５ａ（ＭＩ０００１０７４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１２Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－４０５ａ）と完全に一致した、２４ｂｐ長の根のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１２Ｄは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１２Ｅは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、２３ｂｐ長の根のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１２Ｉは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９の二次構造を示す。 図１２Ａ～Ｉは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－４０５ａ（ＭＩ０００１０７４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１２Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－４０５ａ）と完全に一致した、２４ｂｐ長の根のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１２Ｄは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１２Ｅは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、２３ｂｐ長の根のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１２Ｉは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９の二次構造を示す。 図１２Ａ～Ｉは、シロイヌナズナ由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡａｔｈ－ｍｉｒ－４０５ａ（ＭＩ０００１０７４）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１２Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ａｔｈ－ｍｉｒ－４０５ａ）と完全に一致した、２４ｂｐ長の根のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１２Ｄは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１２Ｅは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、２３ｂｐ長の根のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１２Ｉは、ｍｉｒ様前駆体ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９の二次構造を示す。 図１３Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５（ＭＩ００１９０６６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１３Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌｌ－ｍｉｒ－５５４５の前駆体配列と完全に一致した、胚の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１３Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１３Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１３Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、若年成体の２２ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１３Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９の二次構造を示す。 図１３Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５（ＭＩ００１９０６６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１３Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌｌ－ｍｉｒ－５５４５の前駆体配列と完全に一致した、胚の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１３Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１３Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１３Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、若年成体の２２ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１３Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９の二次構造を示す。 図１４Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ３６３及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５（ＭＩ００１９０６６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１４Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５の前駆体配列と完全に一致した、胚の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１４Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１４Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１４Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、Ｌ４ ２２ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１４Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ３６３の二次構造を示す。 図１４Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ３６３及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５（ＭＩ００１９０６６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１４Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５の前駆体配列と完全に一致した、胚の２１ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１４Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１４Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１４Ｆは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、Ｌ４ ２２ｂｐ長のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１４Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ３６３の二次構造を示す。 図１５Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５３７及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－８１９６ｂ（ＭＩ００２６８３７）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１５Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－８１９６ｂ）と完全に一致した、２３ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１５Ｆは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１５Ｇは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１５Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５３７の二次構造を示す。なお、ＷＴ配列とｍｉｒ様配列との違いは、非常に少数の塩基のみである。従って、これらの二次構造は非常に類似しているか、又は更には同一であると予測される。 図１５Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５３７及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－８１９６ｂ（ＭＩ００２６８３７）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１５Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－８１９６ｂ）と完全に一致した、２３ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１５Ｆは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１５Ｇは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１５Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５３７の二次構造を示す。なお、ＷＴ配列とｍｉｒ様配列との違いは、非常に少数の塩基のみである。従って、これらの二次構造は非常に類似しているか、又は更には同一であると予測される。 図１５Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５３７及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－８１９６ｂ（ＭＩ００２６８３７）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１５Ａは、ＷＴ前駆体配列（ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－８１９６ｂ）と完全に一致した、２３ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。図１５Ｆは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１５Ｇは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１５Ｈは、ｍｉｒ様前駆体ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５３７の二次構造を示す。なお、ＷＴ配列とｍｉｒ様配列との違いは、非常に少数の塩基のみである。従って、これらの二次構造は非常に類似しているか、又は更には同一であると予測される。 図１６Ａ～Ｊは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４０２４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－５２３（ＭＩ０００３１５３）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１６Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－５２３の前駆体配列と完全に一致した、２１ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１６Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１６Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１６Ｉは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、肺のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１６Ｆは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４０２４の二次構造を示す。 図１６Ａ～Ｊは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４０２４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－５２３（ＭＩ０００３１５３）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１６Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－５２３の前駆体配列と完全に一致した、２１ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１６Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１６Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１６Ｉは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、肺のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１６Ｆは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４０２４の二次構造を示す。 図１６Ａ～Ｊは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４０２４及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－５２３（ＭＩ０００３１５３）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１６Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－５２３の前駆体配列と完全に一致した、２１ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１６Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１６Ｅは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１６Ｉは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、肺のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１６Ｆは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４０２４の二次構造を示す。 図１７Ａ～Ｊは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４５７３及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂ（ＭＩ０００６３３６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１７Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂの前駆体配列と完全に一致した全ての２１ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１７Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１７Ｃは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂの二次構造を示す。図１７Ｄは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１７Ｊは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４５７３の二次構造を示す。 図１７Ａ～Ｊは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４５７３及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂ（ＭＩ０００６３３６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１７Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂの前駆体配列と完全に一致した全ての２１ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１７Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１７Ｃは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂの二次構造を示す。図１７Ｄは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１７Ｊは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４５７３の二次構造を示す。 図１７Ａ～Ｊは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４５７３及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂ（ＭＩ０００６３３６）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１７Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂの前駆体配列と完全に一致した全ての２１ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１７Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１７Ｃは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体ｈｓａ－ｍｉｒ－６６３ｂの二次構造を示す。図１７Ｄは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、２２ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１７Ｊは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５４５７３の二次構造を示す。 図１８Ａ～Ｅは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５００７８及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－１２７３ｈ（ＭＩ００２５５１２）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１８Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－１２７３ｈの前駆体配列と完全に一致した全ての２３ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１８Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１８Ｃは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１８Ｄは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１８Ｅは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５００７８の二次構造を示す。 図１８Ａ～Ｅは、ヒト由来のｍｉＲＮＡ様遺伝子ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５００７８及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉｒ－１２７３ｈ（ＭＩ００２５５１２）のｓｍａｌｌＲＮＡの分布及び二次構造のプロットを提供する。各ｍｉｒ様遺伝子及びそれに対応するＷＴ ｍｉＲＮＡについては、１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、対応する前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１８Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｈｓａ－ｍｉｒ－１２７３ｈの前駆体配列と完全に一致した全ての２３ｂｐ長の脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１８Ｂは、ＷＴ前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１８Ｃは、前述したＷＴ ｍｉＲＮＡ前駆体の二次構造を示す。図１８Ｄは、ｍｉｒ様遺伝子前駆体配列と完全に一致した、脳のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１８Ｅは、ｍｉｒ様前駆体ｈｓａ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ５００７８の二次構造を示す。 図１９Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－７１（ＭＩ０００００４２）のｓｍａｌｌＲＮＡ分布及び二次構造のプロットを提供する。１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、ｍＲＮＡ前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１９Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の前駆体配列と完全に一致した全ての２１ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１９Ｂは、前駆体配列と完全に一致した、２３ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１９Ｈは、ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の二次構造を示す。 図１９Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－７１（ＭＩ０００００４２）のｓｍａｌｌＲＮＡ分布及び二次構造のプロットを提供する。１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、ｍＲＮＡ前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１９Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の前駆体配列と完全に一致した全ての２１ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１９Ｂは、前駆体配列と完全に一致した、２３ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１９Ｈは、ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の二次構造を示す。 図１９Ａ～Ｈは、線虫由来のｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－７１（ＭＩ０００００４２）のｓｍａｌｌＲＮＡ分布及び二次構造のプロットを提供する。１９～２４ｂｐ長の７つの異なるリードサイズ群及び全てのサイズのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑのリードを表す低分子と命名された群を使用して、ｍＲＮＡ前駆体配列と完全に一致するリードの分布をプロットした。リードカウントをＲＰＫＭに対して正規化し、対応する前駆体配列と完全に一致するリードが少なくとも１０個存在していた場合、特定のサイズ群のプロットを作成した。ＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージのＲＮＡｐｌｏｔモジュールを用いて、各前駆体配列の二次構造を作成した。具体的には、図１９Ａは、ＷＴ ｍｉＲＮＡ遺伝子ｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の前駆体配列と完全に一致した全ての２１ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。各プロットにおける下側の棒グラフは、プロットされた前駆体の成熟配列の位置をマークし、レジェンドは、成熟配列のサイズを示す。同様に、図１９Ｂは、前駆体配列と完全に一致した、２３ｂｐ長の胚のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑリードの全てについての分布プロットを示す。図１９Ｈは、ｍｉＲＮＡｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の二次構造を示す。
本発明は、その幾つかの実施形態では、真核細胞におけるサイレンシング機能不全ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）にサイレンシング活性を付与し、場合によっては、内因性又は外因性の関心標的ＲＮＡのサイレンシングに対するＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を改変することに関する。
図面及び付随する説明を参照することで、本発明の原理及び操作をより深く理解することができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の明細書に記載されるか又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法及び異なる生物において実施若しくは実行することができる。また、本明細書で使用される語句及び用語は説明目的のためのものであり、限定するものであるとみなされるべきではないことを理解されたい。
様々な生物（例えば、マウス、ヒト、植物）におけるＲＮＡ分子のゲノム編集に関するこれまでの研究は、遺伝子導入を使用してｍｉＲＮＡの活性又は標的結合部位を破壊することに重点的に取り組んでいた。植物におけるゲノム編集は、モデル植物の遺伝子又は挿入をノックダウンするために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮ等のヌクレアーゼを用いることに集中していた。更に、人工ｍｉＲＮＡトランスジーンを用いて内因性及び外因性の標的遺伝子をサイレンシングする、植物における遺伝子サイレンシングも報告されている［Ｍｏｌｎａｒ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．（２００９）５８（１）：１６５－７４．Ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－３１３Ｘ．２００８．０３７６７．ｘ．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊａｎ １９；Ｂｏｒｇｅｓ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｜ ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ４ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ４０８５］。人工ｍｉＲＮＡトランスジーンは、人工発現カセット（プロモーター、ターミネーター、選択マーカー等を含む）内で植物細胞に導入され、標的の発現をダウンレギュレートする。
哺乳類生物で開発された遺伝子治療技術（例えば、ヒトの治療用）として、ウイルストランスジーンの発現により、失われた遺伝子機能を回復させることができる遺伝子治療、及び標的ｍＲＮＡのノックダウンにより欠陥遺伝子の抑制を媒介するＲＮＡｉが挙げられる。また、近年のゲノム編集技術の進歩により、ゲノムの所望の位置において部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導した後に、ゲノム編集（ＮＨＥＪ及びＨＲ）等によってヒト患者の細胞で１つ以上のヌクレオチドを編集することによって、生存細胞のＤＮＡ配列を変化させることも可能となっている。ＮＨＥＪが、それのみではないが主にノックアウトを目的として使用されるのに対し、ＨＲは、点変異等の特定の部位の正確な編集を導入したり、天然に存在する又は遺伝的に受け継がれた有害な変異を修正したりするために使用される。
本発明は、ＲＮＡ分子をコードしている遺伝子の同定に部分的に基づいており、（１）同定された遺伝子によってコードされているＲＮＡ分子は、同じ生物由来の対応する標準的なサイレンシングＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡ前駆体）に対して相同性を示し；（２）同定された遺伝子は、ＲＮＡ分子に転写され；かつ（３）同定された遺伝子によって発現されるＲＮＡは、対応する相同な標準的なサイレンシング分子のようにはＲＮＡにプロセシングされない（すなわち、同定された遺伝子によって発現されるＲＮＡは、異常にプロセシングされるか又はプロセシングされない）。本明細書において以下に例示するように、このような遺伝子は様々な生物で同定されている。理論や機序に束縛されるものではないが、このような異常にプロセシングされるＲＮＡは、サイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にプロセシングされないため、同定された遺伝子は、サイレンシング機能不全のＲＮＡ分子をコードしている。
本発明を実用化するにあたり、本発明者らは、機能不全ＲＮＡ分子に標準的なプロセシング性を付与することを目的とする遺伝子編集技術であって（例えば、ダイサー等のＲＮＡｉ因子によるプロセシング）、当該機能不全ＲＮＡ分子が、同一生物における標準的にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている相同な核酸配列に対して少なくとも１つの核酸配列の変化を含み、更に、当該機能不全ＲＮＡ分子が、細胞内で転写される技術を考案した。
本発明者らは更に、プロセシング可能なＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を、サイレンシングＲＮＡが元々標的とはしていなかった関心標的遺伝子（細胞に対して内因性又は外因性）の発現を標的とし、干渉するようにリダイレクトする遺伝子編集技術を利用した。具体的には、本発明者らは、例えば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）を含む真核細胞の内因性ＲＮＡ分子を利用し、任意の関心ＲＮＡ標的を標的とするように改変することができるゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）プラットフォームを設計した。本方法では、ＧＥｉＧＳを用いて、これら内因性ＲＮＡ分子における数個のヌクレオチドを編集し、それによって、その活性及び／又は特異性をリダイレクトして、任意の関心ＲＮＡを有効かつ特異的に標的とさせることができる。本明細書に記載の遺伝子編集技術は、プロモーター、ターミネーター、選択マーカーを有する発現カセットを含む、標準的な分子遺伝学的ツール及びトランスジェニックツールを必要としない。更に、本発明の幾つかの実施形態の遺伝子編集技術は、ＲＮＡ分子（例えば内因性）のゲノム編集を含むが、安定かつ遺伝可能である。
従って、本発明の一態様によれば、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列を同定することと；（ｂ）当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列の転写を判定することと；（ｃ）当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の転写物の低分子ＲＮＡへのプロセシング性を判定することであって、当該ＲＮＡ分子が異常にプロセシングされることと；（ｄ）ＲＩＳＣと会合し、かつ第１の標的ＲＮＡに対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、当該所定の配列相同性範囲を示す異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の核酸配列を改変し、それによって、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することと、を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態によれば、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成する方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列を選択することであって、選択が、（１）当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列の転写を判定すること；及び（２）当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、当該所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の転写物の低分子ＲＮＡへのプロセシング性を判定することであって、当該ＲＮＡ分子が異常にプロセシングされることを含み；（ｂ）ＲＩＳＣと会合し、かつ第１の標的ＲＮＡに対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、当該所定の配列相同性範囲を示す異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の核酸配列を改変し、それによって、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することと、を含む方法が、本明細書で提供される。
一実施形態によれば、細胞は、真核細胞である。
用語「真核細胞」とは、本明細書で使用するとき、真核生物の任意の細胞を指す。真核生物は、単細胞生物及び多細胞生物を含む。単細胞真核生物としては、酵母、原生生物、粘菌、及び藻類が挙げられるが、これらに限定されない。多細胞真核生物としては、動物（例えば、哺乳類、昆虫、無脊椎動物、線形動物、鳥類、魚類、爬虫類、及び甲殻類）、植物、真菌類、及び藻類（例えば、褐藻、紅藻、藍藻）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、細胞は、植物細胞である。
特定の実施形態によれば、植物細胞は、プロトプラストである。
プロトプラストは、任意の植物組織、例えば、果実、花、根、葉、胚、胚細胞懸濁液、カルス、又は実生組織（後述の通り）に由来する。
特定の実施形態によれば、植物細胞は、胚形成細胞である。
特定の実施形態によれば、植物細胞は、体細胞胚形成細胞である。
一実施形態によれば、真核細胞は、植物の細胞ではない。
一実施形態によれば、真核細胞は、動物細胞（例えば、非ヒト動物細胞）である。
一実施形態によれば、真核細胞は、脊椎動物の細胞である。
一実施形態によれば、真核細胞は、無脊椎動物の細胞である。
特定の実施形態によれば、無脊椎動物の細胞は、昆虫、カタツムリ、ハマグリ、タコ、ヒトデ、ウニ、クラゲ、及び芋虫の細胞である。
特定の実施形態によれば、無脊椎動物の細胞は、甲殻類の細胞である。例示的な甲殻類としては、エビ、クルマエビ、カニ、ロブスター、及びザリガニ等が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、無脊椎動物の細胞は、魚類の細胞である。例示的な魚類としては、サケ、マグロ、スケソウダラ、ナマズ、タラ、コダラ、クルマエビ、シーバス、ティラピア、ホッキョクイワナ、及びコイが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、真核細胞は、哺乳類細胞（例えば、非ヒト哺乳類細胞）である。
特定の実施形態によれば、哺乳類細胞は、げっ歯類、ウサギ、ブタ、ヤギ、反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジ、カモシカ、シカ、及びキリン）、イヌ、ネコ、ウマ、及び非ヒト霊長類等であるがこれらに限定されない、非ヒト生物の細胞である。
特定の実施形態によれば、真核細胞は、ヒトの細胞である。
一実施形態によれば、真核細胞は、初代細胞、細胞株、体細胞、生殖細胞、幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、配偶子細胞、接合体細胞、胚盤胞細胞、胚、胎児、及び／又はドナー細胞である。
本明細書で使用するとき、語句「幹細胞」とは、特定の特殊な機能を有する他の細胞型（例えば、完全に分化した細胞）に分化するように誘導されるまで、培養下で長期間にわたって未分化な状態のままでいることができる細胞（例えば、全能性、多能性、又は複能性の幹細胞）を指す。受精後最初の数回しか細胞分裂していない胚細胞等の全能性細胞は、胚細胞及び胚外細胞に分化することができ、そして、発生して生存可能なヒトになることができる唯一の細胞である。好ましくは、語句「多能性幹細胞」とは、３つの胚性生殖層、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全てに分化することができるか、又は未分化な状態のままの細胞を指す。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）が挙げられる。複能性幹細胞としては、成体幹細胞及び造血幹細胞が挙げられる。
語句「胚性幹細胞」とは、３つの胚性生殖層（すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉）の全ての細胞に分化することができるか、又は未分化な状態のままでいることができる胚細胞を指す。語句「胚性幹細胞」は、妊娠後（例えば、胚盤胞）、胚の着床前（すなわち、着床前胚盤胞）に形成された胚組織から得られる細胞、着床後／原腸胚形成前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号を参照）、妊娠中の任意の時点、好ましくは妊娠１０週前の胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞、及び単為生殖によって刺激された未受精卵を起源とする細胞（単為生殖生物）を含み得る。
本発明の幾つかの実施形態の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒトの胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトの生体内着床前胚又は体外受精（ＩＶＦ）した胚から得られる。あるいは、単細胞のヒト胚を胚盤胞の段階まで拡張することもできる。
市販されている幹細胞を本発明の幾つかの実施形態に従って使用してもよいことが理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｒａｎｔｓ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ］から購入することができる。
また、胚性幹細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１２７：２２４－７］、ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１６３：２８８－９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．３６：１３０－８；Ｇｒａｖｅｓ ＆ Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．１９９３，３６：４２４－３３］、幾つかの家畜種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５－６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ １９９４，Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．６：５６３－８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｏｎｉｎｇ．３：５９－６７］、及び非ヒト霊長類種（アカゲザル及びマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９２：７８４４－８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４－９］を含む様々な種から得ることができる。
「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ；胚様幹細胞）とは、多能性が与えられた（すなわち、３つの胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉に分化することができる）成体の体細胞を脱分化させることによって得られる細胞を指す。本発明の幾つかの実施形態によれば、このような細胞は、分化した組織（例えば、皮膚等の体細胞組織）から得られ、胚性幹細胞の特徴を獲得するように細胞を再プログラムする遺伝子操作によって、脱分化を受ける。本発明の幾つかの実施形態によれば、人工多能性幹細胞は、体細胞幹細胞においてＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４、及びｃ－Ｍｙｃの発現を誘導することによって形成される。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）（胚様幹細胞）は、例えば、繊維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞等の体細胞に、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫＬＦ４等の転写因子をレトロウイルス形質導入することによる、体細胞の遺伝子操作によって体細胞から生成することができる［例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５１：１４１－１４６に記載］。
語句「成体幹細胞」（「組織幹細胞」又は体細胞組織由来の幹細胞とも呼ばれる）とは、［出生後又は出生前の動物（特にヒト）の］体細胞組織に由来する任意の幹細胞を指す。成体幹細胞は、一般的に、複能性幹細胞であると考えられ、複数の細胞型に分化することができる。成体幹細胞は、脂肪組織、皮膚、腎臓、肝臓、前立腺、膵臓、腸、骨髄、及び胎盤等、任意の成人、新生児、又は胎児の組織に由来していてよい。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態によって利用される幹細胞は、造血幹細胞、間質幹細胞、又は間葉系幹細胞を含む骨髄（ＢＭ）由来の幹細胞である［Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ．１５：２８－３７］。ＢＭ由来の幹細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、又は他の髄腔から得ることができる。
成体組織幹細胞と称される場合もある造血幹細胞（ＨＳＣ）は、任意の年齢の個体の血液若しくは骨髄組織、又は新生児個体の臍帯血から得られた幹細胞を含む。本発明の幾つかの実施形態のこの態様に係る好ましい幹細胞は、胚性幹細胞であり、好ましくは、ヒト又は霊長類（例えば、サル）起源のものである。
胎盤及び臍帯血幹細胞は、「若年幹細胞」と称される場合もある。
形成性多能性芽細胞である間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、サイトカイン等の生理活性因子からの様々な影響に依存して、１つ以上の間葉系組織（例えば、脂肪、骨、軟骨、弾性及び線維性結合組織、筋芽細胞）、並びに胚の中胚葉を起源とする組織以外の組織（例えば、神経細胞）を生じさせる。このような細胞は、胚の卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児及び青年の皮膚、血液、並びに他の組織から単離することができるが、ＢＭにおける存在量が他の組織における存在量をはるかに上回っているため、現在ではＢＭから単離することが好ましい。
成体組織幹細胞は、Ａｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．［Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．（２００３）２００（５）：５４７－５０］によって開示されているもの等、当技術分野において公知の様々な方法を用いて単離することができる。胎児の幹細胞は、Ｅｖｅｎｔｏｖ－Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｓら［ＰｌｏＳ Ｍｅｄ．（２００６）３：ｅ２１５］によって開示されているもの等、当技術分野において公知の様々な方法を用いて単離することができる。
造血幹細胞は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」，Ｒｏｂｅｒｔ Ｌａｎｚｅ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００４年，Ｃｈａｐｔｅｒ ５４，ｐｐ６０９－６１４，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｇｅｒａｌｄ Ｊ Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ及びＷｉｌｌｉａｍ Ｂ Ｓｔａｙｔｏｎ著によって開示されているもの等、当技術分野において公知の様々な方法を用いて単離することができる。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離、精製、及び拡張させる方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号においてＣａｐｌａｎ及びＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈによって、そして、Ｊｏｎｅｓ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６（１２）：３３４９－６０によって開示されているものが挙げられる。
一実施形態によれば、真核細胞は、その自然環境（例えば、人体）から単離される。
一実施形態によれば、真核細胞は、健常細胞である。
一実施形態によれば、真核細胞は、罹患細胞又は疾患に罹りやすい細胞である。
一実施形態によれば、真核細胞は、がん細胞である。
一実施形態によれば、真核細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞等）である。
一実施形態によれば、真核細胞は、病原体（例えば、細菌、ウイルス、又は真菌の病原体）に感染した細胞である。
用語「サイレンシング活性を有するＲＮＡ分子」又は「ＲＮＡサイレンシング分子」とは、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）分子、すなわち、アミノ酸配列に翻訳されず、タンパク質をコードしておらず、ＲＮＡサイレンシング又は干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができるＲＮＡ配列を指す。
用語「ＲＮＡサイレンシング」又は「ＲＮＡｉ」とは、非コードＲＮＡ分子（「サイレンシング活性を有するＲＮＡ分子」又は「ＲＮＡサイレンシング分子」）が、配列特異的に、遺伝子の発現又は翻訳の転写同時又は転写後の阻害を媒介する細胞調節機序を指す。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、転写中にＲＮＡの抑制を媒介することができる（転写同時遺伝子サイレンシング）。
特定の実施形態によれば、転写同時遺伝子サイレンシングは、エピジェネティックサイレンシング（例えば、機能性遺伝子発現を妨げる染色体の状態）を含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、転写後のＲＮＡ抑制（転写後遺伝子サイレンシング）を媒介することができる。
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）とは、典型的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の分解又は切断の（典型的には、細胞の細胞質内で生じる）プロセスを指し、これは、翻訳を妨げることによってその活性を低下させる。例えば、以下に詳述する通り、ＲＮＡサイレンシング分子のガイド鎖は、ｍＲＮＡ分子における相補的な配列と対合し、例えば、アルゴノート２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する。具体的には、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質ファミリーのメンバーは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内のＲＮＡサイレンシング分子の直接相互作用パートナーとして機能する。ＲＮＡサイレンシング分子は、ＲＩＳＣをその標的ｍＲＮＡに導く役割を果たし、一方、Ａｇｏタンパク質複合体は、ｍＲＮＡの翻訳を抑制したり、脱アデニル化依存的なｍＲＮＡの崩壊を誘導したりして、遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす。
転写同時遺伝子サイレンシングは、典型的には、遺伝子活性の不活性化（すなわち、転写抑制）を指し、典型的には細胞核内で起こる。このような遺伝子活性の抑制は、標的ＤＮＡ及びヒストンをメチル化するメチル基転移酵素等のエピジェネティック関連因子によって媒介される。このように、転写同時遺伝子サイレンシングでは、低分子ＲＮＡと標的ＲＮＡとの結合（低分子ＲＮＡ－転写物相互作用）により、標的新生転写物が不安定化し、遺伝子の活性及び転写を抑制する構造へのクロマチンのリモデリングを誘導する、ＤＮＡ及びヒストンを修飾する酵素（すなわち、エピジェネティック因子）を動員する。また、転写同時遺伝子サイレンシングでは、クロマチンに結合した長鎖非コードＲＮＡスカフォールドが、低分子ＲＮＡとは独立してクロマチン修飾複合体を動員し得る。これら転写同時サイレンシング機序は、不適切な転写事象を検出し、サイレンシングするＲＮＡ監視システムを形成し、自己強化型エピジェネティックループを介してこれら事象の記憶を提供する［Ｄ．Ｈｏｃｈ ａｎｄ Ｄ．Ｍｏａｚｅｄ，ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２０１５）１６（２）：７１－８４に記載の通り］。
以下は、本発明の特定の実施形態に従って使用することができる、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合し、内在性のＲＮＡｉ活性を有する（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子である）ＲＮＡサイレンシング分子についての詳細な説明である。
完全及び不完全ベースの対合したＲＮＡ（すなわち、二本鎖ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ－細胞内に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサー（エンドリボヌクレアーゼダイサー又はＲｎａｓｅモチーフを有するヘリカーゼとしても知られている）は、植物では典型的にはダイサー様（ＤＣＬ）タンパク質と称される酵素である。植物によってＤＣＬ遺伝子の数は異なるので、例えば、シロイヌナズナゲノムは、典型的には、４つのＤＣＬ遺伝子を有し、イネは、８つのＤＣＬ遺伝子を有し、トウモロコシゲノムは、５つのＤＣＬ遺伝子を有する。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来するｓｉＲＮＡは、典型的には、約２１～約２３ヌクレオチド長であり、２つの３’ヌクレオチドのオーバーハングを有する約１９塩基対の二重鎖を含む。
一実施形態によれば、２１ｂｐよりも長いｄｓＲＮＡ前駆体が使用される。様々な研究により、長鎖ｄｓＲＮＡを用いて、ストレス応答を誘導することも著しいオフターゲット作用を引き起こすこともなく、遺伝子発現をサイレンシングできることが実証されている－例えば、［Ｓｔｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３－３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５－１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１－３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３－１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７－１３４］を参照。
用語「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害性ＲＮＡ二重鎖（一般的には１８～３０塩基対）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央に１９ｂｐの二重鎖領域を有し、末端に対称的な２塩基の３’オーバーハングを有する２１ｍｅｒとして化学的に合成されるが、最近、２５～３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖が、同じ位置にある２１ｍｅｒと比較して効力が１００倍も増加し得ることが報告されている。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを用いて得られる効力の増大が観察されたことは、ダイサーに生成物（２１ｍｅｒ）ではなく基質（２７ｍｅｒ）を与えたことに起因しており、これがｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの侵入の速度又は効率を改善することが示唆される。
３’オーバーハングの組成ではなく位置がｓｉＲＮＡの効力に影響を与え、アンチセンス鎖に３’オーバーハングを有する非対称的な二重鎖は、一般的に、センス鎖に３’オーバーハングを有するものよりも効力が高いことが判明している（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、接続してヘアピン又はステムループの構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成することができる。従って、前述のように、本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡサイレンシング分子は、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
短鎖ヘアピン型ＲＮＡ、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用するとき、ステムループ構造を有し、相補的配列の第１及び第２の領域を含み、当該領域の相補性の程度及び配向が当該領域間で塩基対合が生じるのに十分であり、当該第１及び第２の領域がループ領域によって接合され、当該ループがループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）間の塩基対合の欠如から生じる、ＲＮＡ分子を指す。ループにおけるヌクレオチド数は、３以上２３以下、又は５以上１５以下、又は７以上１３以下、又は４以上９以下、又は９以上１１以下の数である。ループにおけるヌクレオチドの一部は、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’－ＣＡＡＧＡＧＡ－３’及び５’－ＵＵＡＣＡＡ－３’（国際公開第２０１３１２６９６３号及び同第２０１４１０７７６３号）が挙げられる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループ又はヘアピンの構造を形成することを、当業者であれば認識するであろう。
本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡサイレンシング分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを更に包含する。
トランス作用型ｓｉＲＮＡ（Ｔａ－ｓｉＲＮＡ又はＴａｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ（Ｒａ－ｓｉＲＮＡ）、及び天然アンチセンス転写物由来のｓｉＲＮＡ（Ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）を含む、様々な種類のｓｉＲＮＡが本発明によって企図される。
一実施形態によれば、サイレンシングＲＮＡは、約２６及び３１ヌクレオチド長のＰｉｗｉ結合ＲＮＡのクラスである「ｐｉＲＮＡ」を含む。ｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質との相互作用を通じてＲＮＡ－タンパク質複合体を形成する、すなわち、アンチセンスｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質（例えば、Ｐｉｗｉ、Ａｇｏ３、及びＡｕｂｅｒｇｉｎｅ（Ａｕｂ））にロードされる。
ｍｉＲＮＡ－別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子はｍｉＲＮＡであってもよい。
用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」は同義であり、遺伝子発現を調節する約１９～２４ヌクレオチド長の非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合体を指す。ｍｉＲＮＡは、広範な生物（例えば、昆虫、哺乳類、植物、線形動物）にみられ、発生、恒常性、及び疾患の病因において役割を果たすことが示されている。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、最初、長い不完全な二本鎖のステムループＲＮＡとして存在し、ダイサーによって、成熟ガイド鎖（ｍｉＲＮＡ）及びパッセンジャー鎖として知られている同様のサイズの断片（ｍｉＲＮＡ＊）を含むｓｉＲＮＡ様二重鎖に更にプロセシングされる。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来し得る。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリーにみられることもあるが、典型的には、ｍｉＲＮＡよりも低頻度である。
最初はｍｉＲＮＡ＊と共に二本鎖種として存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的には、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体に一本鎖ＲＮＡとして組み込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、これによって、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制又は活性化）、及びｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどちらの鎖がＲＩＳＣにロードされるかが変化し得る。
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣにロードされたとき、ｍｉＲＮＡ＊は除去され、分解される。ＲＩＳＣにロードされるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、５’末端がそれほど緊密に対合していない方の鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両端がほぼ等価な５’対合を有する場合、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有し得る。
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高いレベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡの２～８番目のヌクレオチド（「シード配列」と称される）によって標的核酸を特定する。
翻訳を効率的に阻害するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対合要件については、多くの研究によって調べられている（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６－２８１により概説）。ゲノム全体におけるｍｉＲＮＡの結合を解析した計算機による研究では、ｍｉＲＮＡの５’側の２～８番目の塩基（「シード配列」とも称される）が標的との結合において特別な役割を果たすことが示唆されているが、通常「Ａ」であることが判明している最初のヌクレオチドの役割も認識されている（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｅｌｌ １２０－１５）。同様に、Ｋｒｅｋら（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７－４９５）は、１～７番目又は２～８番目のヌクレオチドを用いて標的を同定し、検証した。ｍＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はコード領域に存在し得る。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが、同じ部位又は複数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節することがある。ほとんどの遺伝的に同定された標的に複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの協同作用が最も効率的な翻訳阻害をもたらすことを示している可能性がある。
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断又は翻訳抑制という２つの機序のいずれかによって遺伝子発現をダウンレギュレートするようにＲＩＳＣに指示することができる。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対してある程度の相補性を有している場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指定することができる。ｍｉＲＮＡが切断を誘導する場合、典型的には、ｍｉＲＮＡの１０及び１１番目の残基に対するヌクレオチド対合間で切断される。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有しない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制することができる。動物ではｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度が低い場合があるので、翻訳抑制は、動物においてより広く存在している可能性がある。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の任意の対の５’末端及び３’末端にはばらつきがある場合があることに留意すべきである。このばらつきは、切断部位に対するドローシャ及びダイサーの酵素的プロセシングのばらつきに起因している可能性がある。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の５’末端及び３’末端におけるばらつきは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因している可能性もある。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団につながる可能性がある。ステム構造におけるばらつきは、ドローシャ及びダイサーによる切断の生成物のばらつきにもつながる可能性がある。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ダイサーとは独立して、例えばアルゴノート２によってプロセシングされ得る。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～９０、６０～８０、又は６０～７０ヌクレオチドを含み得、一方、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～３０，０００、５０～２５，０００、１００～２０，０００、１，０００～１，５００、又は８０～１００ヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。
アンチセンス－アンチセンスは、ある遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることによってその遺伝子の発現を阻止又は阻害するように設計された一本鎖ＲＮＡである。標的ＲＮＡをコードしているｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて、標的ＲＮＡのダウンレギュレーションを行うことができる。
転位因子ＲＮＡ
転位性遺伝要素（Ｔｅ）は、膨大なＤＮＡ配列を含み、その全てが、カットアンドペースト機序によって直接（トランスポゾン）又はＲＮＡ中間体を介して間接的に（レトロトランスポゾン）ゲノム中の新たな部位に移動する能力を有している。Ｔｅは、転位に必要なタンパク質をコードしているＯＲＦを有しているかどうかに応じて、自律性クラスと非自律性クラスに分けられる。ＲＮＡが媒介する遺伝子サイレンシングは、ゲノムがＴｅ活性、並びにゲノムの遺伝的な及びエピジェネティックな不安定性に由来する有害な影響を制御する機序のうちの１つである。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、ＲＩＳＣとは会合し得るが、標準的な（内在性の）ＲＮＡｉ活性を有しない場合がある（例えば、標準的なＲＮＡサイレンシング分子ではない又はその標的が同定されていない）。このようなＲＮＡサイレンシング分子としては、以下が挙げられる。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）又は転移ＲＮＡ断片（ｔＲＦ）である。用語「ｔＲＮＡ」とは、核酸のヌクレオチド配列とタンパク質のアミノ酸配列とを物理的に連結させる役割を果たすＲＮＡ分子を指し、以前は可溶性ＲＮＡ又はｓＲＮＡと称されていた。ｔＲＮＡは、典型的には、約７６～９０ヌクレオチド長である。一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。用語「ｒＲＮＡ」とは、リボソーム、すなわち、リボソーム小サブユニット又はリボソーム大サブユニットのいずれかのＲＮＡ構成要素を指す。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）である。用語「ｓＲＮＡ」又は「Ｕ－ＲＮＡ」は、真核細胞における細胞核のスプライシングスペックル及びカハール体内にみられる低分子ＲＮＡ分子を指す。ｓｎＲＮＡは、典型的には、約１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）である。用語「ｓｎｏＲＮＡ」とは、他のＲＮＡ、例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｓｎＲＮＡの化学修飾を主に誘導する低分子ＲＮＡ分子のクラスを指す。ｓｎｏＲＮＡは、典型的には、２つのクラスのうちの１つに分類される：Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には約７０～１２０ヌクレオチド長であり、メチル化に関連しており、Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には約１００～２００ヌクレオチド長であり、プソイドウリジン化に関連している。
ＲＮＡ成熟においてｓｎｏＲＮＡと同様の役割を果たすｓｃａＲＮＡ（すなわち、低分子カハール体ＲＮＡ遺伝子）はｓｎｏＲＮＡに類似しているが、その標的はスプライセオソームｓｎＲＮＡであり、（核のカハール体において）スプライセオソームｓｎＲＮＡ前駆体の部位特異的な修飾を行う。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）である。用語「ｅｘＲＮＡ」は、それが転写された細胞の外に存在するＲＮＡ種を指す（例えば、エキソソームＲＮＡ）。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。用語「ｌｎｃＲＮＡ」又は「長鎖ｎｃＲＮＡ」とは、典型的には２００ヌクレオチドよりも長い非タンパク質コード転写物を指す。
特定の実施形態によれば、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、転位因子ＲＮＡ（例えば、自律性及び非自律性の転位性ＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ分子（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡｉ分子の非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、方法は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列（例えば、ＲＮＡｉ様又はｍｉＲＮＡ様配列）に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列を同定することを含む。
一実施形態によれば、工程（ａ）のＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣと会合する及び／又はＲＩＳＣと会合する分子にプロセシングされるＲＮＡ分子に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示す。
用語「ＲＮＡｉ様」とは、ＲＮＡサイレンシング分子に対して配列相同性を有するが、ＲＮＡサイレンシング分子の配列と同一ではないゲノム中の配列を指す。
用語「ｍｉＲＮＡ様」とは、ｍｉＲＮＡに対して配列相同性を有するが、ｍｉＲＮＡ配列と同一ではないゲノム中の配列を指す。
このような非コードＲＮＡ関連分子（すなわち、ｍｉＲＮＡ様分子）は、機能性であってもよく（例えば、後述するように、プロセシング可能である及び／又はサイレンシング活性を有する）、あるいは機能不全であってもよい（例えば、後述するように、プロセシング不可能である、又は異常にプロセシングされる、及び／又はサイレンシング活性を有しない）。一実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、５０％～９９．９％、６０％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、９５％～９９．９％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、５０％～７５％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、５０％～９９．９％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、７０％～９９．９％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、７５％～９９．６％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、８５％～９９．６％の同一性を含む。
一実施形態によれば、配列相同性は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．６％、又は９９．９％の同一性を含む。
一実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、５０％～９９．９％、６０％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、９５％～９９．９％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、５０％～７５％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、５０％～９９．６％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、７０％～９９．９％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、７５％～９９．６％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、８５％～９９．６％の同一性を含む。
一実施形態によれば、配列相同性は、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子をコードしており、それにプロセシングされる核酸配列に対して、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．６％、又は９９．９％の同一性を含む。
一実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、５０％～９９．９％、６０％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、９５％～９９．９％の同一性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、５０％～７５％の配列相同性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、５０％～９９．６％の配列相同性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、７０％～９９．９％の配列相同性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、７５％～９９．６％の配列相同性を含む。
特定の実施形態によれば、配列相同性範囲は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、８５％～９９．６％の配列相同性を含む。
一実施形態によれば、配列相同性は、ＲＩＳＣと会合する成熟ＲＮＡサイレンシング分子の核酸配列に対して、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．６％、又は９９．９％の同一性を含む。
幾つかの実施形態によれば、語句「所定の配列相同性範囲」とは、本明細書で使用するとき、配列カバレッジ及び配列相同性の組み合わせを指す。当業者に知られている通り、用語「配列カバレッジ」とは、ゲノム領域等の第２の配列と完全に一致する少なくとも幾つかのヌクレオチドを含有するクエリー配列の長さを指す（例えば、１００塩基のクエリー配列の最後の９０塩基だけが第２の配列と一致するヌクレオチドを含有する場合、カバレッジは９０％である）。当業者に知られている通り、カバーされている配列内には様々な程度の相同性が存在する場合がある（例えば、カバレッジが９０％である配列は、異なる数の同一ヌクレオチド、異なるギャップ等を有する場合があるので、相同性の程度も異なる）。当技術分野において公知の任意の方法を用いて配列カバレッジ及び配列相同性を評価することができ、例えば、Ｂｌａｓｔ等の配列アライメントプログラムは、配列の長さ及びアライメント領域の長さを提供し、そこから配列カバレッジを求めることができる。
幾つかの実施形態によれば、所定の配列相同性範囲は、アライメントされた配列の約５０％～１００％、場合によってはアライメントされた配列の約７０％～１００％の配列カバレッジを含む。他の実施形態によれば、所定の配列相同性範囲は、約５％～１００％、２５％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、７０％～１００％、又は７５％～１００の配列カバレッジを含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
幾つかの実施形態によれば、所定の配列相同性範囲は、以下を含む：（１）アラインメントされた配列の約５０％～１００％、場合によってはアラインメントされた配列の約７０％～１００％の配列カバレッジ；及び（２）約７５％～１００％、場合によっては約８５％～１００％の配列相同性。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。幾つかの実施形態によれば、所定の配列相同性範囲は、少なくとも約７５％の相同性と共に約５０％のカバレッジを少なくとも含む。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列は、以下の場合、対応するサイレンシングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をコードしている核酸配列に対して所定の配列相同性範囲を有する：（ａ）対応するｎｃＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）に対する、デフォルトパラメータ（例えば、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／Ｂｌａｓｔ／ＢＬＡＳＴｏｐｔｉｏｎｓ（ｄｏｔ）ｊｓｐ）を使用した対応するサイレンシングＲＮＡ（又はその一部）とのｂｌａｓｔサーチにおいて見出された場合、及び（ｂ）その配列が、対応するサイレンシングＲＮＡの成熟配列（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列）の少なくとも５０％をカバーしており、当該成熟配列が、恐らく１９～２４ｎｔ長、恐らく１９～２１ｎｔ長である場合。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
一実施形態によれば、配列相同性は、１００％の同一性を有しない。
相同性（例えば、相同性パーセント、配列同一性＋配列類似性）は、ペアワイズ配列アラインメントを計算する任意の相同性比較ソフトウェアを用いて求めることができる。
本明細書で使用するとき、２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、アライメントしたときに同じである、２つの配列中の残基に対する言及を含む。タンパク質に関して配列同一性パーセントを用いる場合、同一ではない残基の位置は、多くの場合、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されるので分子の機能的特性が変化しない保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。保守的置換で配列が異なる場合、置換の保存的な性質を補正するために、配列同一性パーセントを上方調整してもよい。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するとみなされる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、保守的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、配列同一性パーセントを高めることを含む。従って、例えば、同一アミノ酸にスコア１を与え、非保存的置換にスコア０を与える場合、保存的置換には０と１との間のスコアを与える。保守的置換のスコアリングは、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧのアルゴリズム［Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５－９］に従って計算される。
同一性（例えば、相同性パーセント）は、例えば、デフォルトパラメータを使用すること等によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを含む任意の相同性比較ソフトウェアを用いて求めることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、同一性は、グローバル同一性、すなわち、本発明のアミノ酸又は核酸の配列全体にわたる同一性であり、その一部にわたる同一性ではない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、用語「相同性」又は「相同」とは、２つ以上の核酸配列の同一性；又は２つ以上のアミノ酸配列の同一性；又は１つ以上の核酸配列に対するアミノ酸配列の同一性を指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、相同性は、グローバル相同性、すなわち、本発明のアミノ酸又は核酸の配列全体にわたる相同性であり、その一部にわたる相同性ではない。
２つ以上の配列間の相同性又は同一性の程度は、様々な公知の配列比較ツールを用いて求めることができる。以下は、本発明の幾つかの実施形態と共に使用することができる、このようなツールの非限定的な説明である。
ポリヌクレオチド配列で出発して、他のポリヌクレオチド配列と比較する場合、ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ｅｍｂｏｓｓ（ｄｏｔ）ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ（ｄｏｔ）ｎｅｔ／ａｐｐｓ／ｃｖｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｐｐｓ／ｎｅｅｄｌｅ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌから入手可能）を以下のデフォルトパラメータで使用することができる：（ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１）ｇａｐｏｐｅｎ＝１０；ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５；ｄａｔａｆｉｌｅ＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ｂｒｉｅｆ＝ＹＥＳ。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムで使用されるパラメータは、ｇａｐｏｐｅｎ＝１０；ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．２；ｄａｔａｆｉｌｅ＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ｂｒｉｅｆ＝ＹＥＳである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドとを比較するためのＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して相同性を求めるために使用される閾値は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
幾つかの実施形態によれば、相同性の程度を求めるには、更に、（タンパク質－タンパク質比較又はヌクレオチド－ヌクレオチド比較用の）Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する必要がある。
ＧｅｎＣｏｒｅ６．０ Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのデフォルトパラメータは以下を含む：ｍｏｄｅｌ＝ｓｗ．ｍｏｄｅｌ。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して相同性を求めるために使用される閾値は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、関心ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対するグローバル相同性を実施する前に（例えば、配列全体に対して８０％のグローバル相同性）、関心ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対するローカル相同性（例えば、配列長の６０％にわたって６０％の同一性）によって事前に選択された配列に対して、グローバル相同性を実施する。例えば、第１の段階ではＢｌａｓｔｐ及びｔＢｌａｓｔｎアルゴリズムをフィルタとするＢＬＡＳＴソフトウェアを用いて相同配列を選択し、第２の段階ではｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）又はＦｒａｍｅ＋アルゴリズムによるアライメントを行う。ローカル同一性（Ｂｌａｓｔアラインメント）は、グローバルアライメント段階のためのフィルタとしてのみ使用されるので、非常に許容的なカットオフ－配列長の６０％の範囲に対して６０％の同一性で定義される。この特定の実施形態（ローカル同一性を使用する場合）では、Ｂｌａｓｔパッケージのデフォルトフィルタリングを利用しない（パラメータ「－Ｆ Ｆ」を設定することにより）。
第２の段階では、コア遺伝子のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％のグローバル同一性に基づいてホモログを定義する。幾つかの実施形態によれば、相同性は、ローカル相同性又はローカル同一性である。
ローカルアラインメントツールとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰ、ＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、又はＴＢＬＡＳＴＮソフトウェア、ＦＡＳＴＡ、及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、相同性は、ＢｌａｓｔＮバージョン２．７．１＋を用いて、以下のデフォルトパラメータで求められる：ｔａｓｋ＝ｂｌａｓｔｎ、ｅｖａｌｕｅ＝１０、ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝２、ｍａｔｃｈ＝１、ｍｉｓｍａｔｃｈ＝－１、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝１１、ｍａｘ ｓｃｏｒｅｓ－２５、ｍａｘ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ＝１５、ｑｕｅｒｙ ｆｉｌｔｅｒ＝ｄｕｓｔ、ｑｕｅｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ－ｎ／ａ、ｍａｔｒｉｘ＝ｎｏ ｄｅｆａｕｌｔ。
一実施形態によれば、方法は、工程（ａ）の所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列のゲノム上の位置を決定することを更に含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、非コード遺伝子（例えば、非タンパク質コード遺伝子）に位置する。ゲノムの例示的な非コード部分としては、非コードＲＮＡの遺伝子、エンハンサー及び遺伝子座制御領域、インスレーター、Ｓ／ＭＡＲ配列、非コード偽遺伝子、非自律性のトランスポゾン及びレトロトランスポゾン、並びに染色体のセントロメア及びテロメア領域の非コード単純反復が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、非コード遺伝子のイントロン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、遍在的に発現する非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、組織特異的に発現する非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、誘導的に発現する非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、発生的に調節される非コード遺伝子に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、遺伝子と遺伝子との間、すなわち、遺伝子間領域に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）のエキソン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）の非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードしているエキソン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）の翻訳されたエキソン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、コード遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）のイントロン内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、遍在的に発現するコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、組織特異的に発現するコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、誘導的に発現するコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）をコードしている核酸配列は、発生的に調節されるコード遺伝子内に位置する。
一実施形態によれば、方法は、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列の転写を判定することを含む。
語句「転写可能な核酸配列」とは、ＲＮＡに転写可能なＤＮＡセグメントを指す。
核酸配列の転写の評価は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑによって実施することができる。
前述のように、本発明の幾つかの実施形態の方法によって、転写は可能であるが、ＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにはプロセシングされないＲＮＡサイレンシング分子を同定することが可能になる。
一実施形態によれば、方法は、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている異常にプロセシングされる（例えば、プロセシング不可能な）転写可能な核酸配列を選択するために、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の転写物の低分子ＲＮＡへのプロセシング性を判定することを含む。
用語「プロセシング」又は「プロセシング性」とは、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合可能な低分子ＲＮＡ形態に切断されるバイオジェネシスを指す。例示的なプロセシング機序としては、以下で更に論じるように、例えば、ダイサー及びアルゴノートが挙げられる。例えば、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、例えばダイサーによって成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
用語「標準的なプロセシング」とは、特定のクラスのサイレンシングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）のＲＮＡ前駆体に関して本明細書で使用され、プロセシングパターン（例えば、結果として生じる低分子ＲＮＡ分子の数、サイズ、及び／又は位置）がそのクラスのサイレンシングＲＮＡ分子の前駆体に典型的なものである、ＲＮＡ分子の低分子ＲＮＡ分子へのプロセシングを指す。典型的には、標準的なプロセシングの結果生じる低分子ＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣと会合し、天然の標的ＲＮＡ（すなわち、第１の標的ＲＮＡ）に結合することができる。幾つかの実施形態によれば、本明細書で使用される野生型プロセシングに対する言及は、標準的なプロセシングを指す。幾つかの実施形態によれば、野生型サイレンシング分子に対する言及は、標準的なサイレンシング分子（すなわち、当技術分野におけるそのクラスのサイレンシング分子の既知の挙動に従って作用する、構造を有する、及び／又はプロセシングされるもの）を指す。
用語「異常にプロセシングされる」とは、本明細書で使用するとき、比較用語であり、特定のクラスのサイレンシングＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）のＲＮＡ前駆体に関して、プロセシングが標準的なプロセシングではないような、ＲＮＡ分子の低分子ＲＮＡ分子へのプロセシングを指す。非限定的な例では、その前駆体（標準的にプロセシングされる）とは異なってプロセシングされる、特定のクラスのサイレンシングＲＮＡ分子の前駆体（例えばｍｉＲＮＡの前駆体）に相同なＲＮＡ分子は、異常にプロセシングされる。
幾つかの実施形態によれば、異常にプロセシングされるとは、プロセシングされない（すなわち、低分子ＲＮＡ分子が全く生成されない）及び標準的なプロセシングと比較して異なってプロセシングされる（すなわち、標準的なプロセシングで達成されるものとは異なる数、サイズ、及び／又は位置の低分子ＲＮＡ分子にプロセシングされる）からなる群から選択される。異常なプロセシングの結果生じる低分子ＲＮＡ分子は、典型的には（標準的なプロセシングから得られる低分子ＲＮＡ分子と比較して）異常なサイズである、ＲＩＳＣと会合しない、及び／又はその天然の標的ＲＮＡ（すなわち、第１の標的ＲＮＡ）と相補的ではない。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
本明細書で使用するとき、用語「低分子ＲＮＡ形態」又は「低分子ＲＮＡ」又は「低分子ＲＮＡ分子」とは、成熟低分子ＲＮＡが標的ＲＮＡ（又はその断片）とハイブリダイズできることを指す。
本明細書で使用するとき、語句「機能不全ＲＮＡ分子」とは、ＲＩＳＣと会合することができる低分子ＲＮＡにプロセシングされず、天然の標的ＲＮＡ（すなわち、第１の標的ＲＮＡ）をサイレンシングしないＲＮＡ分子（例えば、非コードＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡｉ分子）を指す。一実施形態によれば、機能不全ＲＮＡ分子は、その二次ＲＮＡ構造を変化させ、異常にプロセシングするように（例えば、プロセシング不可能に）させる配列変化（例えば、前駆体配列における配列変化）を含む。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ形態は、サイレンシング活性を有する。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡは、２５０ヌクレオチド以下の長さを有し、例えば、１５～２５０個、１５～２００個、１５～１５０個、１５～１００個、１５～５０個、１５～４０個、１５～３０個、１５～２５個、１５～２０個、２０～３０個、２０～２５個、３０～１００個、３０～８０個、３０～６０個、３０～５０個、３０～４０個、３０～３５個、５０～１５０個、５０～１００個、５０～８０個、５０～７０個、５０～６０個、１００～２５０個、１００～２００個、１００～１５０個、１５０～２５０個、１５０～２００個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～５０個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～３０個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２９個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２３個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２２個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２３個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２４個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２５個のヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～５０個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２０～３０個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２９個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１～２３個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２１個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２２個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２３個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２４個のヌクレオチドからなる。
特定の実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、２５個のヌクレオチドからなる。
典型的には、プロセシング性は、本明細書では構造のオリジナリティとも称されるＲＮＡ分子の構造、すなわち、二次ＲＮＡ構造（すなわち、塩基対合プロファイル）に依存する。二次ＲＮＡ構造は、純粋に配列に依存するのではなく構造に依存する、ＲＮＡ分子の低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ等）への正確かつ効率的なプロセシングに重要である。
従って、一実施形態によれば、工程（ａ）のＲＮＡ分子をコードしている選択又は同定された核酸配列は、そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングがその二次構造に依存するサイレンシングＲＮＡ分子をコードしている遺伝子と相同である。
幾つかの実施形態によれば、そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングが二次構造に依存するサイレンシングＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子のＲＮＡ、並びに長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される。
一実施形態によれば、細胞内ＲＮＡｉプロセシング機構、すなわち細胞内ＲＮＡｉプロセシング及び実行因子が、ＲＮＡ分子を低分子ＲＮＡにプロセシングする。
一実施形態によれば、細胞内ＲＮＡｉプロセシング機構は、ＤＩＣＥＲタンパク質ファミリー（例えば、ＤＣＲ１及びＤＣＲ２）、ＤＩＣＥＲ－ＬＩＫＥタンパク質ファミリー（例えば、ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３、ＤＣＬ４）、ＡＲＧＯＮＡＵＴＥタンパク質ファミリー（例えば、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、ＡＧＯ４）、ｔＲＮＡ切断酵素（例えば、ＲＮＹ１、ＡＮＧＩＯＧＥＮＩＮ、Ｒｎａｓｅ Ｐ、Ｒｎａｓｅ Ｐ様、ＳＬＦＮ３、ＥＬＡＣ１、及びＥＬＡＣ２）、及びＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）関連タンパク質（例えば、ＡＧＯ３、ＡＵＢＥＲＧＩＮＥ、ＨＩＷＩ、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＰＩＷＩ、ＡＬＧ１、及びＡＬＧ２）が挙げられるがこれらに限定されないリボヌクレアーゼを含む。
一実施形態によれば、細胞内ＲＮＡｉプロセシング機構がＲＮＡサイレンシング分子を生成するが、具体的な標的は同定されていない。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、二重鎖構造の一本鎖ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、非構造化ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードしているＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、非コードＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ前駆体（例えば、完全及び不完全な塩基対合を含む）からプロセシングされる。
一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、２つの異なる相補的なＲＮＡに由来していてもよく、又はｄｓＲＮＡを形成するためにそれ自体に折り重ねられる単一のＲＮＡに由来していてよい。
プロセシングの評価は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、例えば、ｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑ、ノーザンブロット、ｓｍａｌｌＲＮＡｑＲＴ－ＰＣＲ、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）によって実施することができる。
例えば、異常にプロセシングされる（例えば、プロセシング不可能な）核酸配列の選択には、ｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑ、ノーザンブロット、ｓｍａｌｌＲＮＡｑＲＴ－ＰＣＲ、及びｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法が適用できる。
機能的なプロセシング性は、比較構造解析によって判定することもできる。例えば、機能不全ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ様の構造を、ＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡ分子にプロセシング可能な対応するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと比較する（例えば、前駆体構造を比較する）。機能不全構造の変化は、プロセシングされないか、又はＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシング可能な対応するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとは異なってプロセシングされることを示唆する。プロセシングは、低分子ＲＮＡ解析によって検証することができる。
一実施形態によれば、工程（ｂ）及び／又は（ｃ）は、低分子ＲＮＡ発現データの細胞のゲノムへのアライメント及び各ゲノム上の位置にマッピングされるリードの量の決定によって影響を受ける。
幾つかの実施形態によれば、プロセシングを判定するための低分子ＲＮＡ解析は、特定の細胞又は組織で発現した低分子ＲＮＡの配列を、その対応するゲノム上の位置（例えば、潜在的な機能不全ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ様分子をコードしている遺伝子内）にアラインメントして、各ｓＲＮＡが発現する位置及び各位置におけるｓＲＮＡリード数を決定することを含む。特定の実施形態によれば、プロセシングを判定するための、発現した低分子ＲＮＡの配列のその対応するゲノム上の位置（すなわち、所定の位置）とのアライメントは、ミスマッチのないアライメントである。
前述のように、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている、異常にプロセシングされる転写可能な核酸配列が選択される。
一実施形態によれば、方法は、ＲＩＳＣと会合し、第１の標的ＲＮＡ（例えば、後述する天然の標的ＲＮＡ）に対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、異常にプロセシングされる（例えば、プロセシング不可能な）転写可能な核酸配列の核酸配列を改変することを含み、これは、本明細書ではサイレンシング活性の「再活性化」とも称される。
一実施形態によれば、工程（ｄ）における改変は、異常にプロセシングされるＲＮＡ分子のサイレンシング活性を第１の標的ＲＮＡに向けて再活性化するＤＮＡ編集剤を細胞に導入し、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することを含む。
一実施形態によれば、方法は、ＤＮＡ編集剤が、第１の標的ＲＮＡとは異なる関心標的ＲＮＡに向けてＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトし、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変する、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを更に含む。
一実施形態によれば、第１の標的ＲＮＡに対するサイレンシングを活性化するための改変と特異性の改変との間の違いは、ＧＥｉＧＳを行う際に異なるＧＥｉＧＳオリゴを使用することであり得る（すなわち、特異性を改変するためのＧＥｉＧＳオリゴは、特異性を変化させるために成熟ｍｉＲＮＡの配列を改変することを更に含む）。
以下は、ＲＮＡサイレンシング分子をコードしている遺伝子に核酸の変化を導入するために使用される方法及びＤＮＡ編集剤、並びに本開示の特定の実施形態に従って使用することができるそれを実行するための剤の様々な非限定的な例の説明である。
遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集－このアプローチは、人工的に遺伝子操作されたヌクレアーゼを用いて、典型的には、ゲノム中の所望の位置（複数可）で切断し、特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出し、次いで、相同組換え（ＨＲ）又は非相同末端接合（ＮＨＥＪ）等の細胞の内因性プロセスによって修復する逆遺伝学的方法を指す。ＮＨＥＪは、二本鎖切断（ＤＳＢ）のＤＮＡ末端を最小限の末端トリミングを用いて又は用いずに直接接合させるが、ＨＲは、切断部位における欠損したＤＮＡ配列を再生／コピーするためのテンプレート（すなわち、Ｓ期に形成される姉妹染色分体）として相同なドナー配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特定のヌクレオチド改変を導入するためには、所望の配列を含有するドナーＤＮＡ修復テンプレート（外因的に提供される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）が、ＨＲの間存在していなければならない。
従来の制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノム編集を実施することはできないが、その理由は、ほとんどの制限酵素がＤＮＡ上の数個の塩基対を標的として認識し、これらの配列はゲノム全体にわたって多くの箇所にみられることが多いため、所望の箇所に限定されない複数の切断が生じるためである。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖又は二本鎖の切断（ＤＳＢ）を作り出すために、これまでに幾つかの異なるクラスのヌクレアーゼが発見され、バイオエンジニアリングされてきた。これらは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む。
メガヌクレアーゼ－メガヌクレアーゼは、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘファミリー、及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを１又は２コピー有していることを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造エレメント、ひいては、ＤＮＡ認識配列の特異性及び触媒活性に関して、互いに大きく異なっている。メガヌクレアーゼは、微生物種に一般的にみられ、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという固有の特性を有しているため、天然で所望の箇所における切断についての特異性が非常に高くなる。
これを利用して、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することができる。当業者であれば、これら天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、突然変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を用いて、固有の配列を認識するメガヌクレアーゼのバリアントが生み出されている。例えば、様々なメガヌクレアーゼを融合させて、新たな配列を認識するハイブリッド酵素が生み出されている。
あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸を変化させて、配列特異的なメガヌクレアーゼを設計することもできる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照）。メガヌクレアーゼは、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３－９７５、米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、又は同第８，１６３，５１４号に記載の方法を用いて設計することができる。あるいは、市販されている技術、例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を用いて、部位特異的な切断特性を有するメガヌクレアーゼを得ることもできる。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ－ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）という２つの異なるクラスの遺伝子操作されたヌクレアーゼは、いずれも標的となる二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製するのに有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一連のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピートのいずれか）に連結する非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、そのＤＮＡ認識部位と切断部位とが互いに分離している制限酵素が選択される。切断部分が分離され、次いで、ＤＮＡ結合ドメインに連結し、それによって、所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素は、Ｆｏｋｌである。更に、Ｆｏｋｌには、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とするという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識したときに特異性が劇的に高まることを意味する。この効果を強化するために、Ｆｏｋｌヌクレアーゼは、ヘテロ二量体としてのみ機能し、高い触媒活性を有することができるように遺伝子操作されている。ヘテロ二量体で機能するヌクレアーゼは、不要なホモ二量体活性の可能性を回避するので、二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異性を高める。
従って、例えば、特定の部位を標的とするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはヌクレアーゼ対として構築され、当該対の各メンバーは標的となる部位で隣接する配列に結合するように設計される。細胞内で一過的に発現すると、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量体化して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路を通してこれら二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復すると、多くの場合、小さな欠失又は小さな配列挿入（インデル）が生じる。ＮＨＥＪによって行われる各修復は固有のものであるので、単一のヌクレアーゼ対を使用して、標的部位に様々な異なる挿入又は欠失を有する対立遺伝子群を作り出すことができる。
一般的に、ＮＨＥＪは比較的正確である（ヒト細胞におけるＤＳＢの約７５～８５％が、検出から約３０分以内にＮＨＥＪによって修復される）。遺伝子編集では、修復が正確である場合、修復産物が変異原性になり、認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが消失／変異するまで又は一過的に導入されたヌクレアーゼがもはや存在しなくなるまでヌクレアーゼが切断を続けるので、誤ったＮＨＥＪに頼ることになる。
典型的には、欠失の長さは、数塩基対から数百塩基対のいずれかの範囲であるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって、細胞培養下でより大きな欠失を生じさせることに成功している（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。更に、標的領域と相同なＤＮＡ断片をヌクレアーゼ対と併せて導入すると、（例えば、ドナーテンプレートの存在下で）相同組換え（ＨＲ）を介して二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復して、特定の改変を生じさせることができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これら遺伝子操作されたヌクレアーゼ間の違いは、そのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮはＣｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに、そして、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依拠している。これらＤＮＡ認識ペプチドドメインはいずれも、天然ではそのタンパク質において組み合わせでみられるという特徴を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れたリピートでみられ、様々な核酸相互作用タンパク質に多様な組み合わせでみられる。他方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されるヌクレオチド対との間の認識比が１対１であるリピートでみられる。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥはいずれも反復パターンで生じるので、多様な配列特異性を生み出すために様々な組み合わせを試すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、例えば、モジュラーアセンブリ（トリプレット配列と相関したジンクフィンガーを、必要な配列をカバーするように並べて結合させる）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドを低ストリンジェントに選択し、続いて、細菌系においてペプチドの組み合わせ対最終標的を高ストリンジェントに選択する）、及びとりわけ、ジンクフィンガーライブラリの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮは、例えばＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で設計され、商業的に入手することもできる。
ＴＡＬＥＮを設計及び入手する方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４６０－５；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９－５３に記載されている。ゲノム編集用途のためのＴＡＬ及びＴＡＬＥＮコンストラクトを設計するために、Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄと命名された最近開発されたウェブベースのプログラムがＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃによって導入された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇを通してアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で設計され、商業的に入手することもできる。
Ｔ－ＧＥＥシステム（標的遺伝子のゲノム編集エンジン）－標的細胞内においてインビボで集合し、所定の標的核酸配列と相互作用することができる、ポリペプチド部分及び特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含有するプログラム可能な核タンパク質分子複合体が提供される。プログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集する、並びに／又は標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードしており、（ｉ）標的部位を改変することができる機能性ドメイン及び（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド分子と、（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列及び（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含む。組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対合を通して、高い特異性及び分子複合体の標的核酸への結合能力を有するように、所定の核酸配列標的を正確に、確実に、かつコスト効率よく改変することを可能にする。組成物は、遺伝毒性が低く、モジュール式に集合し、カスタマイズすることなく単一のプラットフォームを利用し、専門のコア施設外で独立して使用するのに実用的であり、開発期間が短く、かつコストが低い。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及びその全てのバリアント（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ」とも称される）－多くの細菌及び古細菌は、侵入してきたファージ及びプラスミドの核酸を分解することができる内因性ＲＮＡベースの適応免疫系を含む。これら系は、ＲＮＡ構成要素を生成するクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレオチド配列と、タンパク質構成要素をコードしているＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドのＤＮＡに相同な短いストレッチを含み、対応する病原体の相補的核酸を分解するようにＣａｓヌクレアーゼに指示するためのガイドとして作用する。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に相同な２０塩基対を含有するｃｒＲＮＡ、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の３つの構成要素がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、合わせると配列特異的なヌクレアーゼ活性に十分になることが示されている（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６－８２１）。
更に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体で構成される合成キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、インビトロにおいてｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示することができることが実証された。また、Ｃａｓ９を合成ｓｇＲＮＡと併せて一過的に発現させることを用いて、様々な異なる種において標的となる二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できることも実証された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ，ｂ；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｓｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９という２つの異なる構成要素を含有する。
ｓｇＲＮＡ（本明細書では短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称される）は、典型的には、単一のキメラ転写物において標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）とｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結させる内因性細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせをコードしている２０ヌクレオチドの配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｓｇＲＮＡ配列と相補的なゲノムＤＮＡとの間の塩基対合によって標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合を成功させるためには、ゲノム上の標的配列が、標的配列の直後に正しいプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含有していなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合により、Ｃａｓ９がＤＮＡの両鎖を切断して二重鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができるように、Ｃａｓ９がゲノム上の標的配列に局在する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生じる二本鎖切断（ＤＳＢ）は、相同組換え又はＮＨＥＪを受けることができ、ＤＮＡ修復中に特異的配列改変を受けやすい。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、それぞれが異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能性ドメインＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。これらドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きな利点は、このシステムが、高い効率性と、合成ｓｇＲＮＡを容易に作製できる能力とを兼ね備えている点である。このことから、異なるゲノム部位での改変を標的とする及び／又は同じ部位での異なる改変を標的とするように容易に変更可能なシステムが得られる。更に、複数の遺伝子を同時に標的とすることができるプロトコールも確立されている。変異を保有する細胞の大部分は、標的となる遺伝子に二対立遺伝子変異が存在する。
しかし、ｓｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡの標的配列との間の塩基対合相互作用における見かけの柔軟性によって、標的配列との一致が不完全でもＣａｓ９によって切断することが可能になる。
ＲｕｖＣ－又はＨＮＨ－のいずれかの単一の不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインを１つだけしか有しないので、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖だけを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作り出す。一本鎖切断又はニックは、ほとんどの場合、ＰＡＲＰ（センサー）及びＸＲＣＣ１／ＬＩＧ ＩＩＩ複合体（ライゲーション）等であるがこれらだけではないタンパク質が関与する一本鎖切断修復機序によって修復される。トポイソメラーゼＩの毒又は天然に存在するＳＳＢにおいてＰＡＲＰ１を捕捉する薬物によって一本鎖切断（ＳＳＢ）が生成された場合、これらは存続し得、細胞がＳ期に入り、複製フォークがこのようなＳＳＢに遭遇したときに、ＨＲによってのみ修復可能な片端ＤＳＢとなる。しかし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近接する逆鎖のニックは二本鎖切断として扱われ、多くの場合「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムと称される。ダブルニックは基本的に非平行ＤＳＢであり、他のＤＳＢと同様に、遺伝子標的に対する所望の効果及びドナー配列の存在及び細胞周期のステージに応じて、ＨＲ又はＮＨＥＪによって修復され得る（ＨＲは、はるかに存在量が少なく、細胞周期のＳ及びＧ２期でしか生じ得ない）。従って、オフターゲット作用の減少及び特異性が重要である場合、ごく近接して、ゲノムＤＮＡの逆鎖に標的配列を有する２つのｓｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作製するためにＣａｓ９ニッカーゼを使用すると、いずれかのｓｇＲＮＡだけではゲノムＤＮＡを変化させる可能性のないニックが生じるので、これら事象が不可能ではないとしても、オフターゲット作用は減少するであろう。
２つの不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョン（ｄｅａｄ Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９）はヌクレアーゼ活性を有しないが、ｓｇＲＮＡの特異性に基づいて依然としてＤＮＡに結合することはできる。ｄＣａｓ９は、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合させることによって遺伝子発現を活性化又は抑制するためのＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列にｄＣａｓ９が単独で結合すると、遺伝子の転写に干渉することができる。
本発明の幾つかの実施形態によって使用することができるＣａｓ９の追加のバリアントとしては、ＣａｓＸ及びＣｐｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。ＣａｓＸ酵素は、Ｃａｓ９に比べてサイズが小さく、細菌でみられる（典型的には、ヒトではみられない）ＲＮＡ誘導型のゲノムエディターの特徴的なファミリーを含むので、ヒトにおける免疫系／応答を惹起する可能性が低い。また、ＣａｓＸは、Ｃａｓ９と比べて異なるＰＡＭモチーフを利用するので、Ｃａｓ９のＰＡＭモチーフがみられない配列を標的とするために使用することができる［Ｌｉｕ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．（２０１９）５６６（７７４３）：２１８－２２３．を参照］。Ｃａｓ１２ａとも称されるＣｐｆ１は、Ｃａｓ９のＰＡＭ（ＮＧＧ）の存在量がはるかに少ないＡＴリッチ領域の編集に特に有利である［Ｌｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ．（２０１９）３７（１）：２１－２７；Ｍｕｒｕｇａｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．（２０１７）６８（１）：１５－２５を参照］。
別の実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ切断ドメイン等の様々なエフェクタードメインと融合させてもよい。ＤＮＡ切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。ＤＮＡ切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｒ Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．を参照）。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの切断ドメインは、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼドメイン又は改変Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼドメインである。更に、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）を使用することも別の選択肢である。Ｈｅは、細菌、古細菌、及び単細胞真核生物でみられる小さなタンパク質（＜３００アミノ酸）である。Ｈｅの際立った特徴は、制限酵素等の他の部位特異的エンドヌクレアーゼ（４～８ｂｐ）に比べて比較的長い配列（１４～４０ｂｐ）を認識することである。Ｈｅは、歴史的に、小さな保存アミノ酸モチーフによって分類されてきた。少なくとも５つのこのようなファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ；ＧＩＹ－ＹＩＧ；ＨＮＨ；ＥｄｘＨＤ酵素に関連しており、一部には別のファミリーとみなされているＨｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘ及びＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫが同定されてい。構造レベルでは、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ及びＥｄｘＨＤ酵素と同様に、ＨＮＨ及びＨｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘは共通のフォールド（ββα－メタルと命名）を共有している。各ファミリーの触媒及びＤＮＡ認識戦略は様々であり、様々な用途のための遺伝子操作に様々な程度適している。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１４）１１２３：１－２６を参照。本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができる例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、及びＩ－Ｓｓｐ６８０３１が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲの改変バージョン、例えば、ｄｅａｄ ＣＲＩＳＰＲ（ｄＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ）は、ＣＲＩＳＰＲ転写阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）又はＣＲＩＳＰＲ転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）にも利用することができる。例えば、Ｋａｍｐｍａｎｎ Ｍ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１８）１３（２）：４０６－４１６；Ｌａ Ｒｕｓｓａ ＭＦ ａｎｄ Ｑｉ ＬＳ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１５）３５（２２）：３８００－９を参照］。
本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができるＣＲＩＳＰＲの他のバージョンとしては、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を他の酵素と共に使用して、細胞のＤＮＡ又はＲＮＡに直接点変異を入れるゲノム編集が挙げられる。
従って、一実施形態によれば、編集剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤である。
一実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、塩基編集を惹起する。
用語「塩基編集」とは、本明細書で使用するとき、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ切断を作製することなく、細胞のＤＮＡ又はＲＮＡに点変異を入れることを指す。
塩基編集において、ＤＮＡ塩基エディターは、典型的には、触媒作用が損なわれたＣａｓヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に作用する塩基修飾酵素との融合を含む。その標的ＤＮＡ遺伝子座に結合すると、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖とが塩基対合して、「Ｒループ」における一本鎖ＤＮＡの小さなセグメントが置換される。このｓｓＤＮＡバブル内のＤＮＡ塩基は、塩基編集酵素（例えば、デアミナーゼ酵素）によって改変される。真核細胞における効率を改善するために、触媒作用を失ったヌクレアーゼは、編集されていないＤＮＡ鎖にもニックを生成し、編集された鎖をテンプレートとして用いて編集されていない鎖を修復するように細胞を誘導する。
Ｃ－Ｇ塩基対をＴ－Ａ塩基対に変換するシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）及びＡ－Ｔ塩基対をＧ－Ｃ塩基対に変換するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の２つのクラスのＤＮＡ塩基エディターが報告されている。まとめると、ＣＢＥ及びＡＢＥは、４つの可能な対変異（Ｃ→Ｔ、Ａ→Ｇ、Ｔ→Ｃ、及びＧ→Ａ）を全て媒介することができる。ＲＮＡにおいても同様に、標的とするアデノシンからイノシンへの変換は、アンチセンス及びＣａｓ１３誘導型ＲＮＡ標的法の両方を利用する。
一実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ）を含む。
一実施形態によれば、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼは、不活性Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）である。
一実施形態によれば、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼは、不活性Ｃａｓ１３（例えば、ｄＣａｓ１３）である。
一実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、エピジェネティックな編集（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はヒストンタンパク質に化学的変化を与える）が可能な酵素を含む。
例示的な酵素としては、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、例示的な酵素としては、例えば、ＤＮＡ（シトシン－５）メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、１０－１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）、リジン（Ｋ）特異的デメチラーゼ１Ａ（ＬＳＤ１）、並びにカルシウム及びインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）が挙げられる。
触媒作用を失ったヌクレアーゼに加えて、本発明のＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、核酸塩基デアミナーゼ酵素及び／又はＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含んでいてもよい。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、ｓｇＲＮＡと共に、ＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ）、又はＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）－ＵＧＩ）を含む。ＡＰＯＢＥＣ１は、デアミナーゼの完全長又は触媒的に活性のある断片であり、ＸＴＥＮは、タンパク質リンカーであり、ＵＧＩは、後でＵ：Ｇミスマッチが修復されてＣ：Ｇ塩基対に戻るのを防ぐためのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤であり、ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）は、編集されていない鎖のみにニックを入れてＨＮＨドメインの触媒活性を回復させ、新たに合成されるＤＮＡを刺激し、所望のＵ：Ａ生成物を生じさせるためにｄＣａｓ９を元の状態に戻したニッカーゼである。
本発明の幾つかの実施形態に係る塩基編集に使用することができる追加の酵素は、その全体が参照により本明細書に援用されるＲｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８に明記されている。
標的配列の選択及び／又は設計に役立てるのに利用可能なツールに加えて、バイオインフォマティクスに基づいて決定された異なる種における異なる遺伝子に固有のｓｇＲＮＡのリストが多数公的に利用可能であり、例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ－ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム中の特定のＣａｓ９標的を同定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ等であるが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するためには、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ）の両方が標的細胞において（例えば、リボ核タンパク質複合体として）発現又は存在していなければならない。挿入ベクターが１つのプラスミド上に両方のカセットを含有していてもよく、又はカセットは２つの別々のプラスミドから発現する。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ，Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ・Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９）製のｐｘ３３０プラスミドのように市販されている。植物ゲノムを改変するためのクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）ガイドＲＮＡ技術及びＣａｓエンドヌクレアーゼの使用は、少なくとも、その全体が参照により本明細書に具体的に援用されるＳｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６９（２）：９３１－９４５；Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｊａｉｎ，２０１５，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ６６：４７－５７；及び米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号にも開示されている。ｓｇＲＮＡと共にＤＮＡ編集を行うために使用することができるＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ．１６３（３）：７５９－７１）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
「ヒット・アンド・ラン」又は「イン・アウト」－２段階の組み換え手順を含む。最初の工程では、二重陽性／陰性選択可能マーカーカセットを含む挿入型ベクターを使用して、所望の配列変化を導入する。挿入ベクターは、標的となる遺伝子座に相同な単一の連続領域を含有し、関心変異を有するように改変される。このターゲティングコンストラクトを、相同な領域内の１つの部位で制限酵素を用いて線状化し、細胞内に導入し、陽性選択を行って相同組換えが媒介する事象を単離する。相同配列を有するＤＮＡは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖のオリゴとして提供され得る。これら相同組換え体は、選択カセットを含む介在ベクター配列によって分離されている局所的重複を含有する。第２の工程では、標的とするクローンを陰性選択に供して、重複する配列間の染色体内組換えを介して選択カセットが失なわれた細胞を同定する。局所的な組み換え事象によって重複が取り除かれ、組み換えの部位に応じて、対立遺伝子は導入された変異を保持するか又は野生型に戻る。最終的には、任意の外因性配列を保持することなく、所望の改変が導入される。
「二重置換」又は「タグ及び交換」戦略－ヒット・アンド・ランアプローチに類似する２段階の選択手順を含むが、２つの異なるターゲティングコンストラクトを使用する必要がある。最初の工程では、３’及び５’に相同性アームを有する標準的なターゲティングベクターを使用して、変異を導入したい箇所の近傍に二重陽性／陰性選択可能カセットを挿入する。システムの構成要素を細胞に導入し、陽性選択を適用した後、ＨＲが媒介する事象を同定することができる。次に、所望の変異と相同な領域を含む第２のターゲティングベクターを標的となるクローンに導入し、陰性選択を適用して選択カセットを除去し、変異を導入する。最終的な対立遺伝子は、所望の変異を含有すが、不要な外因性配列は排除されている。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／エンドヌクレアーゼである。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、例えば、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９、又はｓｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９である。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／０５８２５５号に開示されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、塩基編集を惹起する。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ編集剤は、エピジェネティックな編集用の酵素を含む。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＴＡＬＥＮである。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＺＦＮである。
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼである。
一実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、細胞（例えば、真核細胞）内での発現をモニタリングするためにレポーターに連結される。
一実施形態によれば、レポーターは、蛍光レポータータンパク質である。
用語「蛍光タンパク質」とは、蛍光を発するポリペプチドを指し、典型的には、フローサイトメトリー、顕微鏡、又は任意の蛍光イメージングシステムによって検出可能であり、従って、このようなタンパク質を発現している細胞の選択の基礎として使用することができる。
レポーターとして使用することができる蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及び赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）であるが、これらに限定されない。蛍光又は他のレポーターの非限定的なリストとしては、発光（例えば、ルシフェラーゼ）又は比色アッセイ（例えば、ＧＵＳ）によって検出可能なタンパク質が挙げられる。特定の実施形態によれば、蛍光レポーターは、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）又はＧＦＰである。
新たなクラスの蛍光タンパク質及び用途についての概説は、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅｒｉｋ Ａ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚ．；Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａｔｓｕｓｈｉ；Ｐａｌｍｅｒ，Ａｍｙ Ｅ．；Ｓｈｕ，Ｘｉａｏｋｕｎ；Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎ；Ｔｓｉｅｎ，Ｒｏｇｅｒ Ｙ．“Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｏｗｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１６．０９．０１０］に見出すことができる。
別の実施形態によれば、レポーターは、植物の内因性遺伝子である。例示的なレポーターは、カロテノイド生合成経路における重要な酵素のうちの１つをコードしているフィトエン不飽和化酵素遺伝子（ＰＤＳ３）である。そのサイレンシングにより、アルビノ／白化表現型が生じる。従って、ＰＤＳ３の発現が低下した植物は、完全なアルビノ及び矮性に至るまでクロロフィルレベルが低下する。本教示に従って使用することができる追加の遺伝子としては、作物保護に関与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態によれば、レポーターは、抗生物質選択マーカーである。レポーターとして使用することができる抗生物質選択マーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）であるが、これらに限定されない。本教示に従って使用することができる追加のマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｃＣ３）抵抗性並びにブレオマイシン及びフレオマイシン抵抗性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
酵素ＮＰＴＩＩは、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネチン（又はＧ４１８）、及びパロモマイシン等の多数のアミノグリコシド抗生物質をリン酸化によって不活性化することが理解されるであろう。これらのうち、カナマイシン、ネオマイシン、及びパロマイシンは、多様な植物種で使用され、Ｇ４１８は、形質転換された哺乳類細胞の選択に日常的に使用されている。
別の実施形態によれば、レポーターは、毒性選択マーカーである。レポーターとして使用することができる例示的な毒性選択マーカーは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）遺伝子を用いたアリルアルコール選択であるが、これに限定されない。アルコールとアルデヒド又はケトンとの間の相互変換を触媒し、同時にＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を還元するデヒドロゲナーゼ酵素群を含むＡＤＨ１は、組織内のアルコール性毒性物質を分解する。ＡＤＨ１の発現が低下した植物は、アリルアルコールに対する耐性の増大を示す。従って、ＡＤＨ１が低下した植物は、アリルアルコールの毒性作用に対して抵抗性である。
使用するＤＮＡ編集剤にかかわらず、本発明の方法は、異常にプロセシングされる（例えば、プロセシング不可能な）転写可能なＲＮＡサイレンシング分子をコードしている遺伝子が、欠失、挿入、又は点変異のうちの少なくとも１つによって改変されるように使用される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子の構造化領域が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のループ領域が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子の非構造化領域が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域が改変される。
一実施形態によれば、所定の配列相同性範囲を示す異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の核酸配列の改変は、第１の標的ＲＮＡ（例えば、天然の標的ＲＮＡ）との結合部位に対応するもの以外の核酸、例えば、天然の標的と結合することができるＲＮＡｉの成熟配列をコードしているもの以外の核酸に影響を及ぼす。
一実施形態によれば、改変は、ＲＮＡサイレンシング分子のＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与する。
特定の実施形態によれば、改変は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１～５００ヌクレオチド、約１～２５０ヌクレオチド、約１～１５０ヌクレオチド、約１～１００ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～２５ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの改変を含む。
一実施形態によれば、改変は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は最大で５００ヌクレオチドの改変を含む。
一実施形態によれば、連続核酸配列（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００塩基）が改変され得る。
一実施形態によれば、例えば、２０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、５０００個の核酸の配列全体にわたって非連続的に改変され得る。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２４ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２３ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２２ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２１ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で２０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で１０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によれば、改変は、最大で５ヌクレオチドの改変を含む。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子の認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが、元のＰＡＭ認識部位を消失させるように改変される。
特定の実施形態によれば、ＰＡＭモチーフにおける少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の核酸が改変される。
一実施形態によれば、改変は、挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１～５００ヌクレオチド、約１～２５０ヌクレオチド、約１～１５０ヌクレオチド、約１～１００ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～２５ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの挿入を含む。
一実施形態によれば、挿入は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は最大で５００ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２００ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１５０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１００ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で５０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２５ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２４ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２３ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２２ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２１ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で２０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１５ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で１０ヌクレオチドの挿入を含む。
特定の実施形態によれば、挿入は、最大で５ヌクレオチドの挿入を含む。
一実施形態によれば、改変は、欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１～５００ヌクレオチド、約１～２５０ヌクレオチド、約１～１５０ヌクレオチド、約１～１００ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～２５ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの欠失を含む。
一実施形態によれば、欠失は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は最大で５００ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２００ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１５０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１００ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で５０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２５ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２４ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２３ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２２ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２１ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で２０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１５ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で１０ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によれば、欠失は、最大で５ヌクレオチドの欠失を含む。
一実施形態によれば、改変は、点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１～５００ヌクレオチド、約１～２５０ヌクレオチド、約１～１５０ヌクレオチド、約１～１００ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～２５ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約１０～２５０ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約１００～２００ヌクレオチドの点変異を含む。
一実施形態によれば、点変異は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は最大で５００ヌクレオチドの点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２００ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１５０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１００ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で５０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２５ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２４ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２３ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２２ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２１ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で２０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１５ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で１０ヌクレオチドにおける点変異を含む。
特定の実施形態によれば、点変異は、最大で５ヌクレオチドにおける点変異を含む。
一実施形態によれば、改変は、欠失、挿入、及び／又は点変異のいずれかの組み合わせを含む。
一実施形態によれば、改変は、ヌクレオチド置換（例えば、ヌクレオチド交換）を含む。
特定の実施形態によれば、交換は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１～５００ヌクレオチド、１～４５０ヌクレオチド、１～４００ヌクレオチド、１～３５０ヌクレオチド、１～３００ヌクレオチド、１～２５０ヌクレオチド、１～２００ヌクレオチド、１～１５０ヌクレオチド、１～１００ヌクレオチド、１～９０ヌクレオチド、１～８０ヌクレオチド、１～７０ヌクレオチド、１～６０ヌクレオチド、１～５０ヌクレオチド、１～４０ヌクレオチド、１～３０ヌクレオチド、１～２０ヌクレオチド、１～１０ヌクレオチド、１０～１００ヌクレオチド、１０～９０ヌクレオチド、１０～８０ヌクレオチド、１０～７０ヌクレオチド、１０～６０ヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド、１０～４０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、１０～１５ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２０～７０ヌクレオチド、３０～４０ヌクレオチド、３０～５０ヌクレオチド、３０～７０ヌクレオチド、４０～５０ヌクレオチド、４０～８０ヌクレオチド、５０～６０ヌクレオチド、５０～７０ヌクレオチド、５０～９０ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、６０～８０ヌクレオチド、７０～８０ヌクレオチド、７０～９０ヌクレオチド、８０～９０ヌクレオチド、９０～１００ヌクレオチド、１００～１１０ヌクレオチド、１００～１２０ヌクレオチド、１００～１３０ヌクレオチド、１００～１４０ヌクレオチド、１００～１５０ヌクレオチド、１００～１６０ヌクレオチド、１００～１７０ヌクレオチド、１００～１８０ヌクレオチド、１００～１９０ヌクレオチド、１００～２００ヌクレオチド、１１０～１２０ヌクレオチド、１２０～１３０ヌクレオチド、１３０～１４０ヌクレオチド、１４０～１５０ヌクレオチド、１６０～１７０ヌクレオチド、１８０～１９０ヌクレオチド、１９０～２００ヌクレオチド、２００～２５０ヌクレオチド、２５０～３００ヌクレオチド、３００～３５０ヌクレオチド、３５０～４００ヌクレオチド、４００～４５０ヌクレオチド、又は約４５０～５００ヌクレオチドの交換を含む。
一実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、（異常にプロセシングされる転写可能なＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は最大で５００ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２００ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１５０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１００ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で５０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２５ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２４ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２３ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２２ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２１ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で２０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１５ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で１０ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大で５ヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。
一実施形態によれば、改変が挿入又は交換である場合、ドナーオリゴヌクレオチドが利用される（後述の通り）。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子のＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、上記改変のいずれか１つ又は組み合わせを実施してよい。
特定の実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチド（後述の通り）と組み合わせた遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用）によって欠失及び挿入の改変（例えば、交換）が影響を受け、その結果、機能不全ＲＮＡサイレンシング分子のプロセシング性及びサイレンシング活性が得られる。このような方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／０５８２５５号に開示されている。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、細胞に対して内因性（天然に存在、例えば、ネイティブ）である。また、ＲＮＡ分子は、細胞に対して外因性（すなわち、外部から添加され、細胞内で天然には存在しない）であってもよいことが理解されるであろう。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、内在性の翻訳阻害活性を有する。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、内在性のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を有する。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子（すなわち、ＲＮＡｉ分子、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）の前駆体核酸配列は、構造のオリジナリティを保持し、細胞のＲＮＡｉプロセシング及び実行因子によって認識及びプロセシングされるように改変される。
特定の実施形態によれば、機能不全ＲＮＡサイレンシング分子（すなわち、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ等）の前駆体核酸配列は、細胞のＲＮＡｉプロセシング及び実行因子によって認識及びプロセシングされるように改変される。
特定の実施形態によれば、ＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与することは、例えば、機能不全ＲＮＡサイレンシング分子の二次構造を線状の紐形態に翻訳させ、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子（例えば、野生型前駆体）にプロセシングされる相同なＲＮＡサイレンシング分子の二次構造の紐形態と比較したとき等に、機能不全ＲＮＡサイレンシング分子の構造を復元することによって行われる（例えば、ＲＩＳＣと会合するＲＮＡ分子（例えば、野生型前駆体）にプロセシングされる対応する相同なＲＮＡサイレンシング分子の構造の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、二次構造を一連の紐に翻訳させ、それを、ＲＮＡｆｏｌｄ等であるがこれに限定されない別の一連の紐と比較することができる。
特定の実施形態によれば、機能不全ＲＮＡサイレンシング分子（すなわち、ｔａｓｉＲＮＡ等）の核酸配列は、サイレンシング活性及び／又はサイレンシングＲＮＡへのプロセシングを可能にする因子及び／又はオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）に結合するように改変される。非限定的な例では、機能不全ＲＮＡサイレンシング分子は、トランス活性化ＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）分子と相同であるが、アンプリファイアＲＮＡ分子と結合することができないため、サイレンシング低分子ＲＮＡへのプロセシングは不可能である。従って、このようなＲＮＡサイレンシング分子は、サイレンシング活性を可能にする因子（例えば、アンプリファイア）に結合するように改変される。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様）は、内在性の翻訳阻害活性も内在性のＲＮＡｉ活性も含まない（すなわち、ＲＮＡ様分子は、内在性のＲＮＡサイレンシング活性を有しない）。
特定の実施形態によれば、細胞がシロイヌナズナの細胞である場合、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている異常にプロセシングされる転写可能な核酸配列は、本明細書において以下の表２に列挙するものを含む。
特定の実施形態によれば、細胞が線虫の細胞である場合、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている異常にプロセシングされる転写可能な核酸配列は、本明細書において以下の表３に列挙するものを含む。
特定の実施形態によれば、細胞がヒトの細胞である場合、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている異常にプロセシングされる転写可能な核酸配列は、本明細書において以下の表４に列挙するものを含む。
一実施形態によれば、改変は、第１の標的ＲＮＡに結合する低分子ＲＮＡへのＲＮＡサイレンシング分子のプロセシング性を付与する。
本発明の実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、第１の標的ＲＮＡ（例えば、天然の標的ＲＮＡ）に特異的であり、（後述の通り）そうするように設計されていない限り、関心標的ＲＮＡを相互阻害することもサイレンシングすることもなく、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、免疫組織化学的検査、及び／又はフローサイトメトリー、シーケンシング、又は任意の他の検出方法によってＲＮＡ又はタンパク質のレベルで求めたときに、標的遺伝子に対して１００％以下のグローバル相同性、例えば、標的遺伝子に対して９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満のグローバル相同性を示す。
一実施形態によれば、方法は、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子（例えば、サイレンシング活性が付与されたＲＮＡ分子）の特異性を改変することを更に含み、当該方法は、第１の標的ＲＮＡとは異なる関心標的ＲＮＡに向けてＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするＤＮＡ編集剤を細胞に導入し、それによって、当該細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変することを含む。
本明細書で使用するとき、用語「サイレンシング特異性をリダイレクトする」とは、ＲＮＡサイレンシング分子の元々の特異性を、ＲＮＡサイレンシング分子の非天然の標的に向けるように再プログラムすることを指す（本明細書では、サイレンシング活性の「リダイレクション」とも称される）。従って、ＲＮＡサイレンシング分子の元々の特異性は破壊され（すなわち、機能喪失）、新たな特異性は天然の標的とは異なるＲＮＡ標的（すなわち、関心ＲＮＡ）に対するものとなる、すなわち機能獲得である。
本明細書で使用するとき、用語「第１の標的ＲＮＡ」は、ＲＮＡサイレンシング分子が天然で結合するＲＮＡ配列を指す。従って、第１の標的ＲＮＡは、当業者には、（例えば、そのＲＮＡサイレンシング分子によってサイレンシングされる）ＲＮＡサイレンシング分子の基質とみなされる。
幾つかの実施形態によれば、ＲＮＡｉ様分子（例えば、ｍｉＲＮＡ様分子）に言及する場合、第１の標的ＲＮＡとは、このようなＲＮＡｉ様分子の標準的なホモログと同様にプロセシングされていれば、そのＲＮＡｉ様分子によって標的とされていたであろうＲＮＡ配列を指す（例えば、第１の標的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ様分子の成熟ｍｉＲＮＡ配列となっていたであろう配列に対応するＲＮＡ配列である）。
本明細書で使用するとき、用語「関心標的ＲＮＡ」とは、設計されたＲＮＡサイレンシング分子によってサイレンシングされるＲＮＡ配列（コード又は非コード）を指す。
本明細書で使用するとき、語句「標的遺伝子をサイレンシングする」とは、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物が存在しないか又は観察可能にレベルが低下することを指す。従って、本発明の設計されたＲＮＡサイレンシング分子によって標的とはされない標的遺伝子と比較して、標的遺伝子は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％サイレンシングされ得る。
一実施形態によれば、所定の配列相同性範囲を示す異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列の核酸配列を改変すると、ＲＩＳＣと会合し、関心標的ＲＮＡに対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性が付与される。
一実施形態によれば、転写可能な核酸配列の核酸配列を改変することで、異常にプロセシングされるＲＮＡ分子の構造が付与され、その結果、ＲＮＡ分子が、ＲＩＳＣと会合し、関心ＲＮＡを標的とする低分子ＲＮＡにプロセシングされる。
サイレンシングの結果は、真核細胞若しくは生物（例えば、植物細胞又は植物全体）の外見上の特性を調べることによって、又は生化学的技術（後述の通り）によって確認することができる。
本発明の幾つかの実施形態の設計されたＲＮＡサイレンシング分子は、真核細胞又は生物の成長、分化、又は機能に影響を与えない限り、例えば、植物の農業的に価値のある形質（例えば、バイオマス、収量、成長等）に影響を与えない限り、幾つかのオフターゲット特異性効果（複数可）を有し得ることが理解されるであろう。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、真核細胞に対して内因性である。
動物細胞（例えば、哺乳類細胞）における例示的な内因性の関心標的ＲＮＡとしては、がん及び／又はアポトーシスに関連する遺伝子の産物が挙げられるが、これらに限定されない。例示的ながんに関連する標的遺伝子としては、以下に詳述するように、ｐ５３、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、及びＦＡＳの遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
植物細胞における例示的な内因性の関心標的ＲＮＡとしては、ストレス、感染、除草剤に対する感受性を付与する遺伝子の産物、又は以下で更に論じるように、植物の成長速度、作物の収量に関連する遺伝子の産物が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、真核細胞、例えば植物細胞に対して外因性である（本明細書では異種とも称される）。このような場合、関心標的ＲＮＡは、天然では真核細胞のゲノム（例えば、植物のゲノム）の一部ではない遺伝子の産物である。
動物細胞（例えば、哺乳類細胞）における例示的な外因性標的ＲＮＡとしては、本明細書において以下で更に論じるように、病原体（例えば、昆虫、ウイルス、細菌、真菌、線形動物）の遺伝子等、感染性疾患に関連する遺伝子の産物が挙げられるが、これらに限定されない。
植物細胞における例示的な外因性の関心標的ＲＮＡとしては、本明細書において以下で更に論じるように、昆虫、ウイルス、細菌、真菌、線形動物等であるがこれらに限定されない植物病原体の遺伝子の産物が挙げられるが、これらに限定されない。
外因性標的ＲＮＡ（コード又は非コード）は、真核生物（例えば、植物）の内因性ＲＮＡ配列と配列同一性を共有する核酸配列を含んでいてよい（例えば、内因性核酸配列と部分的に相同であってよい）。
ＲＮＡサイレンシング分子と標的ＲＮＡとの特異的な結合は、計算アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって決定し、例えば、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ等を含む方法によって検証することができる。
用語「相補性」又は「相補的」の使用は、ＲＮＡサイレンシング分子（又はプロセシングされた低分子ＲＮＡの形態で存在するその少なくとも一部、又は二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一本の鎖若しくはその一部、又は一本鎖ポリヌクレオチドの一部）が生理学的条件下で標的ＲＮＡ又はその断片にハイブリダイズして、標的遺伝子の調節又は機能又は抑制を引き起こすことを意味する。例えば、幾つかの実施形態では、ＲＮＡサイレンシング分子は、標的ＲＮＡ（又は所与の標的遺伝子のファミリーメンバー）における１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドの配列と比較して、１００パーセントの配列同一性、又は少なくとも約３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９パーセントの配列同一性を有する。
本明細書で使用するとき、ＲＮＡサイレンシング分子又はそのプロセシングされた低分子ＲＮＡの形態は、５’→３’に読んだ配列の一方の全てのヌクレオチドが、３’→５’に読んだときの他方の配列の全てのヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ヌクレオチド配列に対して完全に相補的なヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補的配列と同一の配列を示す。
配列の相補性を判定する方法は、当技術分野において周知であり、当技術分野において周知のバイオインフォマティクスツール（例えば、ＢＬＡＳＴ、多重配列アラインメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子がｓｉＲＮＡであるか又はｓｉＲＮＡにプロセシングされる場合、相補性は、その標的配列に対して９０～１００％（例えば、１００％）の範囲である。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子がｍｉＲＮＡ若しくはｐｉＲＮＡであるか又はｍｉＲＮＡ若しくはｐｉＲＮＡにプロセシングされる場合、相補性は、その標的配列に対して３３～１００％の範囲である。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子がｍｉＲＮＡである場合、シード配列（すなわち、５’から２～８番目のヌクレオチド）の相補性は、その標的配列に対して８５～１００％（例えば、１００％）の範囲である。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡの配列に対して、少なくとも約３３％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には１００％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低３３％の相補性を有するように設計される（例えば、８５～１００％のシードマッチ）。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低４０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低５０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低６０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低７０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低８０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低９０％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低９５％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低９６％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低９７％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低９８％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して最低９９％の相補性を有するように設計される。
特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して１００％の相補性を有するように設計される。
サイレンシング活性を有するＲＮＡ分子の特異性を改変するために、上述のＤＮＡ編集剤のいずれを使用してもよい。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して約５０～１００％の相補性を有するようにガイド鎖（サイレンシング鎖）が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、関心標的ＲＮＡに対して約５０～１００％の相補性を有するようにパッセンジャー鎖（相補鎖）が改変される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、シード配列（例えば、５’末端から２～８番目のｍｉＲＮＡヌクレオチドの場合）が標的配列と相補的になるように改変される。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡにプロセシング性を付与するための核酸配列の改変は、ＲＮＡサイレンシング分子の特異性の改変前に行われる。
一実施形態によれば、低分子ＲＮＡにプロセシング性を付与するための核酸配列の改変は、ＲＮＡサイレンシング分子の特異性の改変と同時に行われる。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子の特異性の改変は、プロセシング性を損なうことなく行われる。
従って、ＲＮＡサイレンシング分子が非必須構造（すなわち、その適切なバイオジェネシス及び／又は機能において役割を果たさないＲＮＡサイレンシング分子の二次構造）を含有する場合、又は純粋にｄｓＲＮＡ（すなわち、完全又はほぼ完全なｄｓＲＮＡを有するＲＮＡサイレンシング分子）である場合、プロセシング性を付与し、任意でＲＮＡサイレンシング分子の特異性を改変するために、幾つかの改変（例えば、２０～３０ヌクレオチド、例えば、１～１０ヌクレオチド、例えば、５ヌクレオチド）が導入される。
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子が必須構造を有する（すなわち、ＲＮＡサイレンシング分子の適切なバイオジェネシス及び／又は活性がその二次構造に依存する）場合、プロセシング性を付与し、任意でＲＮＡサイレンシング分子の特異性を改変するために、より大きな改変（例えば、１～５００ヌクレオチド、１０～２５０ヌクレオチド、５０～１５０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド超かつ２００ヌクレオチド以下、３０～２００ヌクレオチド、３５～２００ヌクレオチド、３５～１５０ヌクレオチド、３５～１００ヌクレオチド）が導入される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子をコードしている遺伝子は、内因性ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）の配列を、選択したＲＮＡサイレンシング配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）と交換することによって改変される。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ前駆体（ｄｓＲＮＡ）等のＲＮＡサイレンシング分子のガイド鎖は、構造のオリジナリティを保持し、同じ塩基対合プロファイルを維持するように改変される。
一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｉ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ前駆体（ｄｓＲＮＡ）等のＲＮＡサイレンシング分子のパッセンジャー鎖は、構造のオリジナリティを保持し、同じ塩基対合プロファイルを維持するように改変される。
追加の編集事象によって追加の変異を導入できる（すなわち、同時又は逐次）ことが理解されるであろう。
本発明のＤＮＡ編集剤は、（例えば、発現ベクターによる）ＤＮＡ送達法を用いて又はＤＮＡフリーの方法を用いて細胞（例えば、真核細胞）に導入してよい。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡ（又は使用されるＤＮＡ編集システムに応じて、使用される任意の他のＤＮＡ認識モジュール）をＲＮＡとして細胞に提供してもよい。
従って、本技術は、ＲＮＡトランスフェクション（例えば、ｍＲＮＡ＋ｓｇＲＮＡトランスフェクション）又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）トランスフェクション（例えば、タンパク質－ＲＮＡ複合体トランスフェクション、例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体トランスフェクション）等の一過的なＤＮＡ又はＤＮＡフリーの方法を用いてＤＮＡ編集剤を導入することに関することが理解されるであろう。
例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ発現プラスミドとして、インビトロ転写物（すなわち、ＲＮＡ）として、又はリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）におけるＲＮＡ部分に結合した組換えタンパク質として導入することができる。ｓｇＲＮＡは、例えば、ＤＮＡプラスミドとして又はインビトロ転写物（すなわち、ＲＮＡ）として送達することができる。
例えば、マイクロインジェクション［参照により本明細書に援用されるＣｈｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７－１１８０に記載］、エレクトロポレーション［参照により本明細書に援用されるＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２－１０１９に記載］、又は例えばリポソームを用いた脂質媒介トランスフェクション［参照により本明細書に援用されるＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１に記載］等であるがこれらに限定されない、ＲＮＡ又はＲＮＰトランスフェクションのための当技術分野において公知の任意の方法を、本教示に従って使用することができる。ＲＮＡトランスフェクションの更なる方法は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号に記載されている。
本発明のＲＮＡトランスフェクション方法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターフリーである点である。ＲＮＡトランスジーンは、任意の追加の配列（例えば、ウイルス配列）を必要とすることなく、最小限の発現カセットとして細胞に送達され、そこで発現することができる。
一実施形態によれば、本発明の外因性ＤＮＡ編集剤を細胞内で発現させるために、ＤＮＡ編集剤をコードしているポリヌクレオチド配列を、細胞発現に好適な核酸コンストラクトにライゲーションさせる。このような核酸コンストラクトは、構成的又は誘導的に細胞内のポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。
本発明の幾つかの実施形態の核酸コンストラクト（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを真核生物における複製及び組み込みに適したものにする追加の配列（例えば、シャトルベクター）を含む。更に、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳の開始配列、転写及び翻訳のターミネーター、並びにポリアデニル化シグナルを含有していてもよい。一例として、このようなコンストラクトは、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２の鎖のＤＮＡの合成起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。
真核生物のプロモーターは、典型的には、ＴＡＴＡボックス及び上流のプロモーターエレメントという２種類の認識配列を含有する。転写開始点の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するように指示することに関与していると考えられている。他の上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
好ましくは、本発明の幾つかの実施形態の核酸コンストラクトによって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性を有する。細胞型特異的及び／又は組織特異的なプロモーターの例としては、肝臓特異的なアルブミン［Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７］、リンパ球特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５］等のプロモーター；特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３］及び免疫グロブリン；［Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３７２９－７４０］、ニューロフィラメントプロモーター等の神経細胞特異的プロモーター［Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６］、又はミルクホエイプロモーター等の乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。
植物細胞で発現させる場合、使用する植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、キメラプロモーター、又は発生的に調節されるプロモーターであってよい。
（植物細胞における）本発明の幾つかの実施形態の方法に有用な好ましいプロモーターの例を、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶに提示する。
Figure 2022524866000001
Figure 2022524866000002
Figure 2022524866000003
Figure 2022524866000004
Figure 2022524866000005
誘導性プロモーターは、特定の植物組織において、発生段階によって、又は例えば光、温度、化学物質、乾燥、高塩分、浸透圧ショック、酸化剤条件を含むストレス条件若しくは病原性の場合等の特定の刺激によって誘導されるプロモーターであり、エンドウｒｂｃＳ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子由来のプロモーター、乾燥時に活性を有するプロモーターＤＲＥ、ＭＹＣ、及びＭＹＢ、高塩分及び浸透圧ストレスにおいて活性を有するプロモーターＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ ｈｓｐ１７．７Ｇ４、及びＲＤ２１、並びに病原性ストレスにおいて活性を有するプロモーターｈｓｒ２０３Ｊ及びｓｔｒ２４６Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、プロモーターは、病原体誘導性プロモーターである。これらプロモーターは、細菌、真菌、ウイルス、線形動物、及び昆虫等の病原体に感染した後に、植物において遺伝子の発現を指示する。このようなプロモーターとしては、病原体の感染後に誘導される病原性関連タンパク質（ＰＲタンパク質）由来のもの；例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ等が挙げられる。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ ８９：２４５－２５４；Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：６４５－６５６；及びＶａｎ Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１－１１６を参照。
一実施形態によれば、発現ベクターにおいて１つを超えるプロモーターが使用される場合、プロモーターは同一である（例えば、全て同一である、少なくとも２つが同一である）。
一実施形態によれば、発現ベクターにおいて１つを超えるプロモーターが使用される場合、プロモーターは異なっている（例えば、少なくとも２つが異なっている、全てが異なっている）。
一実施形態によれば、植物細胞において発現させるための発現ベクターにおけるプロモーターとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓ、２ｘ ＣａＭＶ ３５Ｓ、ＣａＭＶ １９Ｓ、ユビキチン、ＡｔＵ６２６、又はＴａＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物細胞において発現させるための発現ベクターのプロモーターは、３５Ｓプロモーターを含む。
特定の実施形態によれば、植物細胞において発現させるための発現ベクターのプロモーターは、Ｕ６プロモーターを含む。
エンハンサーエレメントは、連結された相同又は異種のプロモーターからの転写を最大１，０００倍に刺激することができる。エンハンサーは、転写開始点の下流又は上流に配置されたときに活性になる。ウイルス由来の多くのエンハンサーエレメントは、広範な宿主範囲を有し、様々な組織で活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に好適である。本発明の幾つかの実施形態に好適な他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒト又はマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；マウス白血病ウイルス、マウス又はラウス肉腫ウイルス、及びＨＩＶ等の様々なレトロウイルス由来の末端反復配列が挙げられる。参照により本明細書に援用されるＥｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８３を参照。
発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、異種転写開始点から、その自然環境における転写開始点からの距離とほぼ同じ距離に位置する。しかし、当技術分野において公知のように、プロモーターの機能を失うことなく、この距離の多少のばらつきに対応することができる。
また、ｍＲＮＡの翻訳効率を高めるために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに付加してもよい。正確かつ効率的なポリアデニル化には、２つの異なる配列エレメント：ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵ又はＵリッチな配列、及び１１～３０ヌクレオチド上流に位置する６ヌクレオチドの高度に保存された配列ＡＡＵＡＡＡが必要である。本発明の幾つかの実施形態に好適な終結及びポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。
特定の実施形態によれば、植物細胞において発現させるための発現ベクターは、Ｇ７終結配列、ＡｔｕＮｏｓ終結配列、又はＣａＭＶ－３５Ｓ終結配列等の終結配列等であるがこれらに限定されない終結配列を含む。
既に説明したエレメントに加えて、本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターは、典型的には、クローニングされた核酸の発現レベルを高めることを意図するか又は組換えＤＮＡを保有する細胞の同定を容易にすることを意図する他の特殊なエレメントを含有していてよい。例えば、多くの動物ウイルスは、許容性の細胞型でウイルスゲノムの余分な染色体複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらウイルスのレプリコンを有するプラスミドは、プラスミド又は宿主細胞のゲノムに保有されている遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。
ベクターは、真核生物のレプリコンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合、ベクターは適切な選択可能マーカーを用いて真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まない場合、エピソームの増幅は不可能である。その代わり、組換えＤＮＡが遺伝子操作細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を指示する。
本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターは、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等の単一ｍＲＮＡから幾つかのタンパク質を翻訳することを可能にする追加のポリヌクレオチド配列、及びプロモーター－キメラポリペプチドをゲノムに組み込むための配列を更に含んでいてもよい。
発現ベクターに含まれる個々のエレメントは、様々な構成で配置できることが理解されるであろう。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーター等、及び更にはＤＮＡ編集剤をコードしているポリヌクレオチド配列（複数可）は、「ヘッド・ツー・テイル」の構成で配置されてもよく、逆相補体として存在してもよく、相補的な構成において逆平行鎖として存在してもよい。このような多様な構成は、発現ベクターの非コードエレメントで生じる可能性が高いが、発現ベクター内のコード配列の別の構成も想定される。
哺乳類の発現ベクターの例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、及びｐＢＫ－ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、並びにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
また、レトロウイルス等の真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターを使用してもよい。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が挙げられる。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしては、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしては、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、７５イナライズド（ｉｎａｌｉｚｅｄ）７５プロモーター、又は真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
ウイルスは、多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化してきた、非常に特殊な感染体である。典型的には、ウイルスは、特定の細胞型に感染し、増殖する。ウイルスベクターのターゲティング特異性は、所定の細胞型を特異的に標的とするためにその天然の特異性を利用し、それによって、組換え遺伝子を感染細胞に導入する。従って、本発明の幾つかの実施形態によって使用されるベクターの種類は、形質転換される細胞型に依存する。形質転換される細胞型に応じて好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのため、選択の検討に関する一般的な説明は本明細書には提供しない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）を用いて標的とされ得、腎臓細胞は、Ｌｉａｎｇ ＣＹ ｅｔ ａｌ．，２００４（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１４９：５１－６０）に記載の通りバキュロウイルスであるオートグラファカリフォルニカ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）中に存在する異種プロモーターを用いて標的とされ得る。
組換えウイルスベクターは、水平感染及びターゲティング特異性等の利点を与えるので、ＤＮＡ編集剤のインビボ発現に有用である。水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有のものであり、単一の感染細胞が多くの子孫ウイルス粒子を生み出し、それが芽体となって母体から分離し、近傍の細胞に感染するプロセスである。その結果、広い領域が急速に感染するが、そのほとんどは、最初は元のウイルス粒子に感染していないものであった。これは、感染病原体が娘の子孫を通じてのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。また、水平方向には広がることができないウイルスベクターを生成することもできる。この特徴は、所望の目的が、特定の遺伝子を限られた数の標的とする細胞にのみ導入することである場合に有用であり得る。
一実施形態によれば、植物細胞において発現させるための核酸コンストラクトは、バイナリーベクターである。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩＢ－ＨＹＧ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎ、又はｐＰＺＰである（Ｈａｊｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９（１９９４）及びＨｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，４４６（２０００））。
植物細胞にＤＮＡを送達する他の方法（例えば、以下で論じるようなトランスフェクション、エレクトロポレーション、ボンバードメント、ウイルス接種等）において使用される他のベクターの例は、ｐＧＥ－ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．２０１６ ７：１２６９７）、ｐＪＩＴ１６３－Ｕｂｉ－Ｃａｓ９（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４ ３２，９４７－９５１）、ｐＩＣＨ４７７４２：：２ｘ３５Ｓ－５’ＵＴＲ－ｈＣａｓ９（ＳＴＯＰ）－ＮＯＳＴ（Ｂｅｌｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３ １１；９（１）：３９）、ｐＡＨＣ２５（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｈ．＆ Ｐ．Ｈ．Ｑｕａｉｌ，１９９６．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ａｎｄ／ｏｒ ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ｐｌａｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２１３－２１８）、ｐＨＢＴ－ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）－ＮＯＳ（Ｓｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｌｉｇｈｔ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｉｚｅ，ＥＭＢＯ Ｊ．１２（９），３４９７－３５０５（１９９３）である。
一実施形態によれば、機能性ＤＮＡ編集剤を発現させるために、切断モジュール（ヌクレアーゼ）がＤＮＡ認識ユニットの一体部分ではない場合、発現ベクターは、切断モジュール及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合はｓｇＲＮＡ）をコードしていてよい。
あるいは、切断モジュール（ヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）を別々の発現ベクターにクローニングしてもよい。このような場合、少なくとも２つの異なる発現ベクターを同じ真核細胞に形質転換しなければならない。
あるいは、ヌクレアーゼを利用しない場合（すなわち、細胞に対して外因性源から投与しない場合）、単一の発現ベクターを使用してＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）をクローニングし、発現させてもよい。
一実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、真核細胞において活性を有するシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結された少なくとも１つのＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）をコードしている核酸剤を含む。
一実施形態によれば、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、同じ発現ベクターからコードされている。このようなベクターは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットの両方を発現させるために、真核細胞において活性を有する単一のシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）を含んでいてよい。あるいは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットはそれぞれ、真核細胞において活性を有するシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結されていてもよい。
一実施形態によれば、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、それぞれが真核細胞において活性を有するシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結されている異なる発現ベクターからコードされている。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを含まない。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が挿入である場合、方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が欠失である場合、方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が欠失及び挿入（例えば、交換）である場合、方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態によれば、改変が点変異である場合、方法は、細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む。
本明細書で使用するとき、用語「ドナーオリゴヌクレオチド」又は「ドナーオリゴ」とは、外因性ヌクレオチド、すなわちゲノムに正確な変化を生じさせるために細胞に外部から導入されるヌクレオチドを指す。一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、合成である。
一実施形態によれば、ドナーオリゴは、ＲＮＡオリゴである。
一実施形態によれば、ドナーオリゴは、ＤＮＡオリゴである。
一実施形態によれば、ドナーオリゴは、合成オリゴである。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖（ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、（上述の通り）交換のためのＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、非発現ベクターフォーマット又はオリゴで提供される。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡドナープラスミド（例えば、環状又は線状化されたプラスミド）を含む。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、約５０～５０００、約１００～５０００、約２５０～５０００、約５００～５０００、約７５０～５０００、約１０００～５０００、約１５００～５０００、約２０００～５０００、約２５００～５０００、約３０００～５０００、約４０００～５０００、約５０～４０００、約１００～４０００、約２５０～４０００、約５００～４０００、約７５０～４０００、約１０００～４０００、約１５００～４０００、約２０００～４０００、約２５００～４０００、約３０００～４０００、約５０～３０００、約１００～３０００、約２５０～３０００、約５００～３０００、約７５０～３０００、約１０００～３０００、約１５００～３０００、約２０００～３０００、約５０～２０００、約１００～２０００、約２５０～２０００、約５００～２０００、約７５０～２０００、約１０００～２０００、約１５００～２０００、約５０～１０００、約１００～１０００、約２５０～１０００、約５００～１０００、約７５０～１０００、約５０～７５０、約１５０～７５０、約２５０～７５０、約５００～７５０、約５０～５００、約１５０～５００、約２００～５００、約２５０～５００、約３５０～５００、約５０～２５０、約１５０～２５０、又は約２００～２５０ヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、及びキメラＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
特定の実施形態によれば、ｓｓＯＤＮ（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約２００～５００ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態によれば、ｄｓＯＤＮ（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約２５０～５０００ヌクレオチドを含む。
本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができる例示的なドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡは、本明細書において以下の表１Ａ及び１Ｂに記載される。
一実施形態によれば、内因性ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）を選択したＲＮＡサイレンシング配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）に遺伝子交換するために、発現ベクター、ｓｓＯＤＮ（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）、又はｄｓＯＤＮ（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）が細胞内で発現する必要はなく、非発現テンプレートとして機能することができる。特定の実施形態によれば、このような場合、ＤＮＡ形態で提供された場合には、ＤＮＡ編集剤（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡモジュール）のみが発現すればよい。
幾つかの実施形態によれば、ヌクレアーゼを使用することなく内因性ＲＮＡサイレンシング分子を遺伝子編集するために、ＤＮＡ編集剤（例えば、ｇＲＮＡ）を（例えば、本明細書で論じられるオリゴヌクレオチドドナーＤＮＡ又はＲＮＡ）を使用して又は使用せずに真核細胞に導入してよい。
一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドの細胞への導入は、上述の方法のいずれかを用いて（例えば、発現ベクター又はＲＮＰトランスフェクションを用いて）行われる。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを細胞（例えば、真核細胞）に同時導入する。任意の追加の因子（例えば、ヌクレアーゼ）をそれと同時に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを、（例えば、ボンバードメント銃を介して）植物細胞に同時導入する。任意の追加の因子（例えば、ヌクレアーゼ）をそれと同時に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡを、ＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に（例えば、数分又は数時間以内に）細胞に導入する。任意の追加因子（例えば、ヌクレアーゼ）をｓｇＲＮＡ又はＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に、同時に、又は後に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ｓｇＲＮＡを、ＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの後に（例えば、数分又は数時間以内に）細胞に導入する。任意の追加因子（例えば、ヌクレアーゼ）をｓｇＲＮＡ又はＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に、同時に、又は後に導入してもよいことが理解されるであろう。
一実施形態によれば、ゲノム編集のための、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。
一実施形態によれば、ゲノム編集のための、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）、及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。
一実施形態によれば、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、植物で発現可能なプロモーターに動作可能に連結される。
本発明の幾つかの実施形態のＤＮＡ編集剤及び任意でドナーオリゴは、単一の細胞に、細胞群（例えば、上述の植物細胞、初代細胞、又は細胞株）に、又は生物（例えば、上述の植物、哺乳類、鳥類、魚類、及び昆虫）に投与してよい。
様々な方法を用いて、本発明の幾つかの実施形態の発現ベクター又はドナーオリゴを真核細胞（例えば、幹細胞又は植物細胞）に導入することができる。このような方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）、及びＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に記載されており、例えば、安定的又は一過的トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。更に、陽性－陰性選択法については、米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照。
従って、核酸の送達は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及び／若しくはタンパク質、又は核酸とペプチドとの組み合わせを細胞に送達する方法において、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照）；乾燥／阻害が媒介するＤＮＡの取り込みによる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３－８）；エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照）；炭化ケイ素繊維と共に撹拌することによる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号を参照）；アグロバクテリウムが媒介する形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号、及び同第６，３８４，３０１号を参照）；ＤＮＡでコーティングされた粒子の加速による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、及び同第６，４０３，８６５号を参照）、並びにナノ粒子、ナノキャリア、及び細胞透過性ペプチドによる（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号、同第２００９０４６３８４Ａ１号、同第２００８１４８２２３Ａ１号）ものが挙げられるがこれらに限定されない当業者に公知の任意の方法によって、本発明の実施形態における細胞に導入してよい。
トランスフェクションの他の方法としては、トランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ－Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，４８９７－９０２）、細胞透過性ペプチド（Ｍaｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６９（２）：１０１－７）、又はポリアミン（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，２０１０，Ｓｈｏｒｔ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９－３６６）の使用が挙げられる。
特定の実施形態によれば、細胞（例えば、植物細胞、例えば、プロトプラスト）にＤＮＡを導入するために、方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が媒介するＤＮＡの取り込みを含む。更なる詳細については、Ｋａｒｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．９：５７５－５７８；Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：２２１－２２６；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３－３７３を参照。
ウイルス感染による細胞（例えば、真核細胞）への核酸の導入は、リポフェクション及びエレクトロポレーション等の他の方法に比べて幾つかの利点をもたらすが、その理由は、ウイルスの感染性に起因して、より高いトランスフェクション効率を得ることができるためである。
現在、好ましいインビボ核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のウイルス又は非ウイルスコンストラクトによるトランスフェクション、及び脂質ベースのシステムが挙げられる。脂質が媒介する遺伝子の導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ－Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１４（１）：５４－６５（１９９６）］。遺伝子治療のために、好ましいコンストラクトはウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスコンストラクト等のウイルスコンストラクトは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー若しくは遺伝子座を定義するエレメント（複数可）、又はオルタナティブスプライシング、核内ＲＮＡ核外輸送、若しくはメッセンジャーの翻訳後修飾等の他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。このようなベクターコンストラクトは、既にウイルスコンストラクト内に存在していない限り、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及び使用するウイルスに適したプラス鎖及びマイナス鎖プライマー結合部位も含む。更に、このようなコンストラクトは、典型的には、それが配置される宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳類のシグナル配列又は本発明の幾つかの実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。任意で、コンストラクトは、ポリアデニル化を指示するシグナル、並びに１つ以上の制限部位、及び翻訳終結配列を含んでいてもよい。一例として、このようなコンストラクトは、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２の鎖のＤＮＡの合成起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。カチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマー等の非ウイルス性の他のベクターを使用してもよい。挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含む以外に、本発明の幾つかの実施形態の発現コンストラクトは、発現したペプチドの安定性、生成、精製、収量、又は毒性を高めるように遺伝子操作された配列を含んでいてもよい。
特定の実施形態によれば、真核細胞（例えば、非植物細胞、例えば、動物細胞、例えば、哺乳類細胞）に外来遺伝子を導入するために、ボンバードメント法が用いられる。一実施形態によれば、方法は、一過的である。真核細胞（例えば、哺乳類細胞）のボンバードメントは、参照により本明細書に援用されるＵｃｈｉｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．（２００９）１７９０（８）：７５４－６４にも教示されている。
一実施形態によれば、植物細胞は、本発明の幾つかの実施形態の核酸コンストラクトで安定的又は一過的に形質転換され得る。安定的な形質転換では、本発明の幾つかの実施形態の核酸分子は、植物のゲノムに組み込まれるので、安定的かつ遺伝性の形質を表す。一過的な形質転換では、核酸分子は、形質転換された細胞で発現するが、ゲノムには組み込まれないので、一過的な形質を表す。
単子葉植物及び双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５－２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４－２７６）。
外因性ＤＮＡを植物のゲノムＤＮＡに安定的に組み込むための基本的な方法は、２つの主なアプローチを含む：
（ｉ）アグロバクテリウムが媒介する遺伝子移入：Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７－４８６；Ｋｌｅｅ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．２－２５；Ｇａｔｅｎｂｙ，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｕｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９８９）ｐ．９３－１１２。
（ｉｉ）以下を含む、ＤＮＡの直接取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．５２－６８；ＤＮＡをプロトプラストに直接取り込む方法、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０７２－１０７４．植物細胞に短時間電気ショックを与えることによって誘導されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９－３８４．Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１－７９３．微粒子銃による植物の細胞又は組織へのＤＮＡ注入、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９－５６３；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３－９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６－２０９；マイクロピペットシステムの使用による：Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０－３６；Ｎｅｕｈａｕｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３－２１７；細胞培養物、胚、又はカルス組織のガラス繊維又は炭化ケイ素ウイスカー形質転換、米国特許第５，４６４，７６５号、又はＤＮＡを出芽花粉と共に直接インキュベーションすることによる、ＤｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，ｅｄｓ．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐ．１９７－２０９；及びＯｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５－７１９。
アグロバクテリウム系は、植物のゲノムＤＮＡに組み込まれる規定のＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターを使用することを含む。植物組織への接種方法は、植物種及びアグロバクテリウム送達系によって異なる。広く使用されているアプローチは、植物全体の分化を開始させるのに優れた資源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができるリーフディスク手順である。Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）ｐ．１－９．補助的なアプローチでは、真空浸透と組み合わせてアグロバクテリウム送達系を使用する。アグロバクテリウム系は、特にトランスジェニック双子葉植物の創出において実行可能である。
一実施形態によれば、アグロバクテリウムフリーの発現方法を用いて、植物細胞に外来遺伝子を導入する。一実施形態によれば、アグロバクテリウムフリーの発現方法は、一過的である。特定の実施形態によれば、ボンバードメント法を用いて、植物細胞に外来遺伝子を導入する。別の特定の実施形態によれば、植物の根へのボンバードメントを用いて、植物細胞に外来遺伝子を導入する。本発明の幾つかの実施形態に従って使用することができる例示的なボンバードメント法については、以下の実施例の項で論じる。
更に、本発明の幾つかの実施形態の教示に従って、様々なクローニングキット又は遺伝子合成を使用することができる。
安定的な形質転換後に、植物の繁殖を行う。植物の繁殖の最も一般的な方法は、種子によるものである。しかし、種子繁殖による再生では、メンデルの法則に支配される遺伝的分散に従って植物が種子を生成するので、ヘテロ接合性により作物の均一性が失われるという問題点がある。基本的に、それぞれの種子は遺伝子的に異なっており、それぞれが固有の形質を持って成長する。従って、形質転換された植物は、再生された植物が親トランスジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように生成されることが好ましい。従って、形質転換された植物は、遺伝的に同一の形質転換された植物を迅速に一貫して再生させる微細繁殖によって再生されることが好ましい。
微細繁殖とは、選択した親植物又は品種から切り取った単一の組織片から新しい世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスにより、所望の形質を有する植物を大量に再生させることが可能になる。新たに生成された植物は、元の植物と遺伝子的に同一であり、元の植物の特徴を全て有している。微細繁殖（又はクローン化）は、短期間で高品質の植物材料を大量に生産することができ、元のトランスジェニック又は形質転換植物の特徴を保持しつつ、選択した品種を迅速に増殖させられる。クローン植物の利点は、植物の増殖速度並びに生成される植物の品質及び均一性である。
微細繁殖は、段階間で培養培地又は生育条件を変更する必要がある多段階手順である。従って、微細繁殖プロセスは４つの基本的な段階を含む：段階１、初期組織培養；段階２、組織培養増殖；段階３、分化及び植物形成；並びに段階４、温室栽培及びハードニング。段階１の初期組織培養中に、組織培養を確立し、汚染物質のないことを証明する。段階２中に、生産目標を達成するのに十分な数の組織サンプルが生成されるまで、初期組織培養物を増殖させる。段階３中に、段階２で成長させた組織サンプルを分割し、個々の小植物に成長させる。段階４では、形質転換された小植物をハードニングのために温室に移し、そこで、自然環境で成長することができるように、光に対する植物の耐性を徐々に高める。
現在は安定的な形質転換が好ましいが、本発明の幾つかの実施形態によって、葉の細胞、分裂組織細胞、又は植物全体の一過的な形質転換も想定される。
一過的な形質転換は、上述の直接ＤＮＡ移入法のいずれか又は改変植物ウイルスを用いたウイルス感染によって行うことができる。
植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスとしては、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＴＲＶ、及びＢＶが挙げられる。植物ウイルスを用いた植物の形質転換については、米国特許第４，８５５，２３７号（ＢＧＶ）、欧州特許第６７，５５３号（ＴＭＶ）、特開昭第６３－１４６９３号（ＴＭＶ）、欧州特許第１９４，８０９号（ＢＶ）、欧州特許第２７８，６６７号（ＢＶ）；及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７２－１８９（１９８８）に記載されている。植物を含む多くの宿主における外来ＤＮＡの発現において使用するための偽ウイルス粒子は、国際公開第８７／０６２６１号に記載されている。
植物において非ウイルス性外因性核酸配列を導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参照文献に加えて、Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５－２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７－３１１；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４－１２９７；及びＴａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３－７６によっても示されている。
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、ウイルス自体に好適な改変を行ってよい。あるいは、外来ＤＮＡを有する所望のウイルスベクターを構築することを容易にするために、ウイルスをまず細菌プラスミドにクローニングしてよい。次いで、ウイルスをプラスミドから切り離してよい。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、ウイルスＤＮＡに細菌の複製起点を結合させ、次いで、細菌によって複製させてもよい。このＤＮＡの転写及び翻訳により、ウイルスＤＮＡをキャプシドで包むコートタンパク質が生成される。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、一般的にはウイルスをｃＤＮＡとしてクローニングし、プラスミドに挿入する。次いで、プラスミドを使用して、全ての構築を行う。次いで、プラスミドのウイルス配列が転写され、ウイルス遺伝子が翻訳されて、ウイルスＲＮＡをキャプシドで包むコートタンパク質（複数可）が生成されることによって、ＲＮＡウイルスが生成される。
本発明の幾つかの実施形態のコンストラクトに含まれるもの等の非ウイルス性外因性核酸配列を植物に導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参照文献に加えて、米国特許第５，３１６，９３１号によって示されている。
一実施形態では、ネイティブのコートタンパク質のコード配列がウイルス核酸から欠失しており、植物宿主において発現し、組換え植物ウイルス核酸をパッケージングし、宿主に確実に組換え植物ウイルス核酸を全身感染させることができる非ネイティブの植物ウイルスコートタンパク質のコード配列及び非ネイティブのプロモーター、好ましくは、非ネイティブのコートタンパク質のコード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている、植物ウイルス核酸が提供される。あるいは、タンパク質が生成されるように、その中に非ネイティブの核酸配列を挿入することによってコートタンパク質遺伝子を不活性化してもよい。組換え植物ウイルス核酸は、１つ以上の追加の非ネイティブのサブゲノムプロモーターを含んでいてもよい。各非ネイティブのサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子又は核酸配列を転写又は発現させることが可能であり、互いに、そして、ネイティブのサブゲノムプロモーターと組換えすることはできない。１つを超える核酸配列が含まれる場合、ネイティブの植物ウイルスサブゲノムプロモーター又はネイティブ及び非ネイティブの植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して、非ネイティブの（外来）核酸配列を挿入してよい。非ネイティブの核酸配列は、サブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写されて又は発現して所望の生成物を生成する。
第２の実施形態では、非ネイティブのコートタンパク質のコード配列の代わりに、非ネイティブのコートタンパク質のサブゲノムプロモーターのうちの１つに隣接してネイティブのコートタンパク質のコード配列が配置されることを除いて、第１の実施形態と同様に組換え植物ウイルス核酸が提供される。
第３の実施形態では、ネイティブのコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１つ以上の非ネイティブのサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている、組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非ネイティブのサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子を転写又は発現させることが可能であり、互いに、そして、ネイティブのサブゲノムプロモーターと組換えすることはできない。その配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物内において転写されて又は発現して所望の生成物を生成するように、非ネイティブのサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して非ネイティブの核酸配列を挿入してよい。
第４の実施形態では、ネイティブのコートタンパク質のコード配列が非ネイティブのコートタンパク質のコード配列に置換されていることを除いて、第３の実施形態と同様に組換え植物ウイルス核酸が提供される。
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によってコードされているコートタンパク質によってキャプシドで包まれて、組換え植物ウイルスが生成される。組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスを用いて、適切な宿主植物に感染させる。組換え植物ウイルス核酸は、所望のタンパク質を生成させるために、宿主において複製され、宿主において全身に拡散し、宿主において外来遺伝子（複数可）（単離された核酸）を転写又は発現させることが可能である。
上記に加えて、本発明の幾つかの実施形態の核酸分子を葉緑体ゲノムに導入し、それによって、葉緑体発現を可能にすることもできる。
葉緑体のゲノムに外因性の核酸配列を導入する技術は、公知である。この技術は、以下の手順を含む。まず、１細胞あたりの葉緑体数が約１個に減少するように、植物細胞を化学的に処理する。次いで、葉緑体に少なくとも１つの外因性核酸分子を導入することを目的として、微粒子銃を介して細胞内に外因性核酸を導入する。外因性核酸は、葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる相同組換えを介して葉緑体のゲノムに組み込み可能であるように選択される。この目的のために、外因性核酸は、関心遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも１つの核酸ストレッチを含む。更に、外因性核酸は、逐次選択後の葉緑体ゲノムのコピーの全て又は実質的に全てが外因性核酸を含むことを確認するためのこのような選択手順によって役立つ選択可能なマーカーを含む。この技術に関する更なる詳細については、参照により本明細書に援用される米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，６９３，５０７号にみられる。このようにして、葉緑体のタンパク質発現系によってポリペプチドを生成し、葉緑体の内膜に組み込むことができる。
使用する形質転換／感染方法にかかわらず、本教示は、ゲノム編集事象を含む形質転換細胞を更に選択する。
特定の実施形態によれば、特定の遺伝子座において正確な改変（例えば、交換、挿入、欠失、点変異）に成功した細胞のみが選択されるように、選択を実行する。従って、意図しない遺伝子座に改変（例えば、挿入、欠失、点変異）を含む任意の事象を含む細胞は選択されない。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、表現型レベルで、分子事象の検出によって、蛍光レポーターの検出によって、又は選択（例えば、抗生物質又は他の選択マーカー、例えば、ＴＰ５３サイレンシングの場合は薬物、すなわちＮｕｔｌｉｎ３に対する抵抗性）の存在下における成長によって行うことができる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、新規に編集されたＲＮＡサイレンシング分子のバイオジェネシス及び発生（例えば、新規に編集されたｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ等の存在）を分析することによって行われる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子又はそのプロセシングされた低分子ＲＮＡ形態のサイレンシング活性及び／若しくは特異性を分析することによって、関心標的ＲＮＡをコードしている生物の少なくとも１つの真核細胞又は生物表現型、例えば、細胞サイズ、成長速度／阻害、細胞形状、細胞膜の完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の着色、生物のサイズ、生物における感染パラメータ（例えば、ウイルス量又は細菌量）、又は生物における炎症パラメータ（例えば、発熱又は発赤）、植物の葉の発色、例えば、葉及び他の器官におけるクロロフィルの部分的又は完全な消失（白化）、壊死パターンの有無、花の発色、果実の形質（例えば、保存期間、硬さ、及び香り）、成長速度、植物サイズ（例えば、矮性）、作物収量、生物的ストレス抵抗性（例えば、耐病性、線形動物の死亡率、甲虫の産卵率、又は細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、昆虫、雑草、及び栽培植物若しくは在来植物のいずれかに関連する他の抵抗性表現型）、作物収量、代謝プロファイル、果実の形質、生物的ストレス抵抗性、非生物的ストレス抵抗性（例えば、耐暑性／耐寒性、耐干性、耐塩性、アリルアルコールに対する抵抗性、又は例えばリン（Ｐ）等の栄養分の不足に対する抵抗性等）を検証することによって行われる。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性は、遺伝子の発現又は発現の欠如等によって、遺伝子型で判定される。
一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性は、表現型で判定される。
一実施形態によれば、真核細胞又は生物の表現型は、遺伝子型の前に判定される。
一実施形態によれば、真核細胞又は生物の遺伝子型は、表現型の前に決定される。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、関心標的ＲＮＡのＲＮＡレベルを測定することにより、関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング活性及び／又は特異性を分析することによって行われる。これは、例えば、ノーザンブロッティング、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、定量ＲＴ－ＰＣＲ、又はイムノブロッティング等、当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。
一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、求められる編集の種類、例えば挿入、欠失、挿入－欠失（インデル）、逆位、置換、及びこれらの組み合わせに応じて、本明細書において「変異」又は「編集」とも称されるＤＮＡ編集事象を含む真核細胞又はクローンを分析することによって行われる。
配列変化を検出する方法は、当技術分野において周知であり、ＤＮＡ及びＲＮＡのシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｒｎａｓｅ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマーエクステンション、サザンブロット、ノーザンブロット、及びドットブロット分析等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。また、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用される様々な方法、例えば、ＰＣＲベースのＴ７エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二重鎖、及びサンガーシーケンシング、又はＰＣＲに続いで制限酵素で消化して固有の制限部位（複数可）の出現若しくは消失を検出する等を用いてもよい。
インデル等のＤＮＡ編集事象の存在を検証する別の方法は、ミスマッチのあるＤＮＡを認識し、切断する構造選択的酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。
一実施形態によれば、形質転換細胞の選択は、蛍光レポーターが発する蛍光を示す形質転換細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で選択することによって行われる。ＦＡＣＳ選別の後、蛍光マーカーを提示する形質転換真核細胞の陽性選択されたプールを収集し、上述のようにＤＮＡ編集事象を試験するためにアリコートを使用することができる。
抗生物質選択マーカーを使用した場合、形質転換後に、選択（例えば、抗生物質）の存在下で、例えば細胞培養下で、又は植物細胞がコロニー、すなわちクローン及びマイクロカルスに発生するまで、真核細胞を培養する。次いで、細胞培養物の細胞の又はカルスの細胞の一部を、上述のようにＤＮＡ編集事象について分析（検証）する。
本発明の一実施形態によれば、方法は、形質転換細胞において、関心標的ＲＮＡに対する内在性ＲＮＡサイレンシング分子の相補性を検証することを更に含む。
前述のように、ＲＮＡサイレンシング分子をコードしている遺伝子の改変後、ＲＮＡサイレンシング分子は、対象とする標的ＲＮＡの配列に対して、少なくとも約３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更には１００％の相補性を有する。
設計されたＲＮＡサイレンシング分子又はそのプロセシングされた低分子ＲＮＡの形態と関心標的ＲＮＡとの特異的な結合は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、計算アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって判定し、例えば、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ等を含む方法によって検証することができる。
陽性の真核細胞又はクローン（例えば、植物細胞クローン）は、ＤＮＡ編集事象についてホモ接合性又はヘテロ接合性であり得ることが理解されるであろう。ヘテロ接合性細胞の場合、その細胞（例えば、二倍体の植物細胞の場合）は、ＲＮＡサイレンシング分子の改変遺伝子のコピー及び非改変遺伝子のコピーを含み得る。当業者であれば、意図する用途に応じて、更なる培養／再生のための細胞を選択するであろう。
一実施形態によれば、一過的な方法が望ましい場合、必要に応じてＤＮＡ編集事象の存在を示す真核細胞又はクローン（例えば、植物細胞クローン）を更に分析し、ＤＮＡ編集剤の存在、すなわち、ＤＮＡ編集剤をコードしているＤＮＡ配列の消失について選択する。これは、例えばＧＦＰの蛍光検出又はｑ－ＰＣＲ、ＨＰＬＣ等により、（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質レベルでの）ＤＮＡ編集剤の発現の消失を分析することによって行うことができる。
一実施形態によれば、一過的な方法が望ましい場合、真核細胞又はクローン（例えば、植物細胞クローン）を、本明細書に記載の核酸コンストラクト又はその一部、例えば、ＤＮＡ編集剤をコードしている核酸配列の存在について分析してもよい。これは、蛍光顕微鏡、ｑ－ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、及び又はサザンブロット、ＰＣＲ、シーケンシング、ＨＰＬＣ等の任意の他の方法によって確認することができる）。
陽性真核細胞クローンは、保存することができる（例えば、凍結保存）。
あるいは、真核細胞を更に培養し、例えば、未分化な状態で長期間維持してもよく、必要に応じて他の細胞種、組織、器官、又は生物への分化を誘導してもよい。
一実施形態によれば、真核生物が植物である場合、後述するように、ＤＮＡ編集剤（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含まない植物を得るために、植物を交配させる。
あるいは、植物組織培養法を用いて、まず植物細胞の群に成長させ、カルスに発生させ、次いで、カルスからシュートを再生させる（カルス発生（ｃａｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））ことによって、植物細胞（例えば、プロトプラスト）を植物全体に再生させることができる。プロトプラストをカルスに成長させ、シュートを再生させるには、組織培養培地に植物成長調節物質を適切なバランスで配合する必要があり、これは、各植物種ごとにカスタマイズしなければならない。
また、プロトプラストフュージョンと呼ばれる技術を用いて、プロトプラストを植物の育種に使用することもできる。電界又はポリエチレングリコールの溶液を用いることによって、異なる種由来のプロトプラストの融合を誘導する。この技術は、組織培養で体細胞ハイブリッドを生成するために使用することができる。
プロトプラストを再生させる方法は、当技術分野において周知である。幾つかの要因、すなわち、遺伝子型、ドナー組織及びその前処理、プロトプラストを単離するための酵素処理、プロトプラストの培養方法、培養、培養培地、並びに物理的環境が、プロトプラストの分離、培養、及び再生に影響を与える。完全な概説については、Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ：３－３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照。
再生した植物は、当業者が適切であると考えるように、更なる育種及び選択に供することができる。
従って、本発明の実施形態は、更に、本教示に従って生成された関心標的ＲＮＡをサイレンシングすることができるＲＮＡサイレンシング分子を含む植物、植物細胞、及び植物のプロセシング産物に関する。
本発明の一態様によれば、標的遺伝子の発現が低下した植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと、（ｂ）関心標的ＲＮＡの発現が低下した後代植物、又は関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡ分子におけるサイレンシング特異性を含み、かつＤＮＡ編集剤を含まない後代を選択し、それによって、標的遺伝子の発現が低下した植物を生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の一態様によれば、関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む植物を生成する方法であって、
（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと；
（ｂ）関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む後代植物、又は関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡ分子におけるサイレンシング特異性を含み、かつＤＮＡ編集剤を含まない後代を選択し、それによって、関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む植物を生成することと、を含む方法が提供される。
本発明の一態様によれば、繁殖を可能にする条件下で植物又は植物細胞を成長させることを含む、本発明の幾つかの実施形態の植物又は植物細胞を生成する方法が提供される。
用語「植物」は、本明細書で使用するとき、植物全体、接ぎ木された植物、植物の祖先及び子孫、並びに種子、シュート、茎、根（塊茎を含む）、台木、若枝、並びに植物の細胞、組織、及び器官を含む植物の一部を包含する。植物は、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含む任意の形態であってよい。本発明の方法において有用であり得る植物としては、緑色植物上科に属する全ての植物、具体的には、以下を含むリストから選択される飼料又は飼い葉植物、観賞植物、食用作物、樹木、又は低木を含む単子葉及び双子葉の植物が挙げられる：アカシア属（Ａｃａｃｉａ）の種、カエデ属（Ａｃｅｒ）の種、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）の種、トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）の種、アガティス・オーストラリス（Ａｇａｔｈｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）の種、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）の種、ビンロウジュ（Ａｓｅｃａ ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・シサー（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ属（Ｂｅｔｕｉｌａ）の種、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種、オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・９０イナライズ（Ｂｕｒｋｅａ ９０ｉｎａｌｉｚｅ）、ハナモツヤクノキ（Ｂｕｔｅａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・９０イナライズ（Ｃａｄａｂａ ９０ｉｎａｌｉｚｅ）、ベニゴウカン属（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）の種、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）の種、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、大麻、工業用大麻、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種、カシア属（Ｃａｓｓｉａ）の種、セントロエマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ属（Ｃｈａｃｏｏｍｅｌｅｓ）の種、シナニッケイ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルムム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｐａｎｅ）、タマザキクサフジ（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ ｖａｒｉａ）、コトネアスター・９０イナライズ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ ９０ｉｎａｌｉｚｅ）、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）の種、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）の種、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）、シルバー・ファーン（Ｃｙａｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ ｏｂｌｏｎｇａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オガルカヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）の種、シンシア・ディアルバータ（Ｃｙｎｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ、ヴェロニカ（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・９０イナライズド９０（Ｄａｖａｌｌｉａ ９０ｉｎａｌｉｚｅｄ９０）、ヌスビトハギ属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ディクソニア・スクアローサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ ｓｑｕａｒｏｓａ）、ジベテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｂｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ジオクレア属（Ｄｉｏｃｌｅａ）の種、フジマメ属（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ）の種、ドリクニウム・レクタム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ ｒｅｃｔｕｍ）、エチノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エーラフィア属（Ｅｈｒａｆｆｉａ）の種、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、スズメガヤ属（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ）の種、デイゴ属（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ）の種、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｆｕｓ）の種、ユークレア・シンペリー（Ｅｕｃｌｅａ ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビロサ（Ｅｕｌａｌｉａ ｖｉ／ｌｏｓａ）、ヅパ属（Ｐａｇｏｐｙｒｕｍ）の種、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ ｓｅｌｌｏｗｌａｎａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）の種、フレミンジア（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ）の種、フレイシネチア・バンクシイ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ ｂａｎｋｓｌｉ）、ゲンノショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、イチョウ（ＧｉｎＡｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、グリシン・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシディア属（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ）の種、アプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア属（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ）の種、グイボウルティア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、イワオウギ属（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ）の種、ヘマルチア・アルティッシマ（Ｈｅｍａｆｆｈｉａ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントルツス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ｃｏｎｔｏｆｆｕｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパーレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ ｒｕｆａ）、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペフェリア・ジソルテ（Ｈｙｐｅｆｆｈｅｌｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ）、インジゴ・インカマタ（Ｉｎｄｉｇｏ ｉｎｃａｍａｔａ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）の種、レプタルレナ・ピロリフォリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、レスペディザ属（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ）の種、レチュカ属（Ｌｅｔｔｕｃａ）の種、ギンネム（Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネスリ（Ｌｏｔｏｎｕｓ ｂａｉｎｅｓｌｉ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）の種、マクロチローマ・アキシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）の種、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｌｉｖａ）、メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンツム（Ｍｕｓａ ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、バナナ、ニコチアヌム属（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ）の種、オノブリョチス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）の種、オルニソプス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ）の種、イネ属（Ｏｒｙｚａ）の種、ペルトフォルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）の種、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）の種、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）の種、カナリーヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、フォルミウム・クッキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、カナメモチ属（Ｐｈｏｔｉｎｉａ）種、ピセア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖａｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｔｏｔａｒａ）、ポゴナルスリア・フレッキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナルスリア・セクアルローサ（Ｐｏｇｏｎａｆｆｈｒｉａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の種、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）の種、リャフィオレプシス・９０イナライズド（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ ９０ｉｎａｌｉｚｅｄ）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、セイヨウスグリ（Ｒｉｂｅｓ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）の種、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ属（Ｒｏｓａ）の種、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）種、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）の種、スキザクリウム・サングイネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、シアドピチス・ベフィシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ ｖｅｆｆｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の種、スポロボルス・フィムブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ属（Ｔａｄｅｈａｇｉ）の種、ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ ｔｒｉａｎｄｒａ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）の種、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）種、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）の種、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、オランダカイウ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アマランサス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ ｓｐｒｏｕｔｓ）、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉（ｃｏｌｌａｒｄ ｇｒｅｅｎｓ）、亜麻、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、チャノキ。あるいは、藻類及び他の非緑色植物を本発明の幾つかの実施形態の方法に使用することもできる。
特定の実施形態によれば、植物は、作物、花卉、又は樹木である。
特定の実施形態によれば、植物は、木本植物種、例えば、オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ））、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ））、ユリノキ（Ｆｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｔｕｌｉｐｅｒａ）（モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ））、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）（ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ））、ビャクダン（Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ）（ビャクダン科（Ｓａｎｔａｌａｃｅａｅ））、ニレ（Ｕｌｍｕｓ）（ニレ科（Ｕｌｍａｃｅａｅ））、並びにバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ））及びミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）（柑橘属（Ｃｉｔｒｕｓ）、ミカン属（Ｍｉｃｒｏｃｉｔｒｕｓ））の異なる種、裸子植物、例えば、カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）及びテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、森林樹（例えば、カバノキ科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、裸子植物、及び熱帯樹種）、果樹、低木又は草本、例えば、（バナナ、ココア、ココヤシ、コーヒー、ナツメヤシ、ブドウ、及びチャ）、並びにアブラヤシである。
特定の実施形態によれば、植物は、熱帯作物のもの、例えば、コーヒー、マカダミア、バナナ、パイナップル、タロ、パパイヤ、マンゴー、オオムギ、豆類、キャッサバ、ヒヨコマメ、カカオ（チョコレート）、ササゲ、トウモロコシ（コーン）、キビ、イネ、ソルガム、サトウキビ、サツマイモ、タバコ、タロ、チャ、ヤムである。
「子実」、「種子」、又は「豆」は、別の顕花植物に成長することができる顕花植物の生殖単位を指す。本明細書で使用するとき、これらの用語は同義的かつ互換的に使用される。
特定の実施形態によれば、植物は、植物細胞、例えば、胚細胞懸濁液中の植物細胞である。
特定の実施形態によれば、植物は、本発明の幾つかの実施形態の方法によって生成された植物細胞を含む。
一実施形態によれば、育種は、交配又は自殖を含む。
用語「交配」とは、本明細書で使用するとき、雄性植物（又は配偶子）による雌性植物（又は配偶子）の受精を指す。用語「配偶子」とは、配偶体から有糸分裂によって植物で生成され、異性の２つの配偶子が融合して二倍体の接合体を形成する有性生殖に関与する、半数体生殖細胞（卵又は精子）を指す。この用語は、一般的に、花粉（精細胞を含む）及び胚珠（卵細胞を含む）への言及を含む。従って、「交配」とは、一般的に、ある個体の胚珠と別の個体からの花粉との受精を指し、一方、「自殖」とは、ある個体の胚珠と同じ個体からの花粉との受精を指す。交配は、植物の育種において広く用いられており、母親からの１本の染色体と父親からの１本の染色体とが交配して、２つの植物の間でゲノム情報の混合が生じる。これにより、新しい組み合わせの遺伝的に受け継がれる形質が生じる。
上述したように、望ましくない因子、例えば、ＤＮＡ編集剤（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含まない植物を得るために、植物を交配してもよい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、非トランスジェニックである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、植物は、トランスジェニック植物である。
一実施形態によれば、植物は、非遺伝子改変（ｎｏｎ－ＧＭＯ）植物である。
一実施形態によれば、植物は、遺伝子改変（ＧＭＯ）植物である。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って生成された植物の種子が提供される。
一実施形態によれば、ストレス耐性が増大している、収量が増加している、成長速度が増加している、又は収量品質が向上している植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと、（ｂ）ストレス耐性が増大している、収量が増加している、成長速度が増加している、又は収量品質が向上している後代植物を選択することと、を含む方法が提供される。
語句「ストレス耐性」とは、本明細書で使用するとき、代謝、成長、生産性、及び／又は生存率に実質的な変化をもたらすことなく、植物が生物的又は非生物的なストレスに耐える能力を指す。
語句「非生物的ストレス」とは、本明細書で使用するとき、植物の代謝、成長、発育、繁殖、又は生存（まとめて「成長」）に悪影響を及ぼす非生存（「非生物的」）物理的又は化学的剤に、植物、植物細胞等が曝露されることを指す。例えば、水（例えば、洪水、干ばつ、又は脱水）、嫌気状態（例えば、より低濃度の酸素又は高濃度のＣＯ２）、異常な浸透圧状態（例えば、浸透圧ストレス）、塩分、又は温度（例えば、高温／熱、低温、凍結、又は霜）、汚染物質への曝露（例えば、重金属毒性）、嫌気生活、栄養欠乏（例えば、窒素欠乏又は窒素の制限）、大気汚染、又は紫外線照射等の環境要因によって、植物は非生物的ストレスに曝され得る。
語句「生物的ストレス」とは、本明細書で使用するとき、植物の代謝、成長、発育、繁殖、又は生存（まとめて「成長」）に悪影響を及ぼす生存（「生物的」）生物に、植物、植物細胞等が曝露されることを指す。生物的ストレスは、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、有益生物及び有害生物、雑草、並びに栽培植物又は在来植物によって引き起こされ得る。
語句「収量」又は「植物収量」は、本明細書で使用するとき、植物の成長（成長速度）の増加、作物の成長の増加、バイオマスの増加、及び／又は植物生成物の生産（子実、果実、種子等を含む）の増加を指す。
一実施形態によれば、ストレス耐性が増大している、収量が増加している、成長速度が増加している、又は収量品質が向上している植物を生成するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、ストレスに対する感受性、収量の減少、成長速度の低下、又は収量品質の低下をもたらす植物の遺伝子のものである関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、標的とされる（例えば、ノックアウトされる）例示的な敏感性植物遺伝子としては、ＭＬＯ（べと病遺伝子座Ｏ）として知られている遺伝子座に存在するもの等の敏感性Ｓ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。
一実施形態によれば、本方法によって生成される植物は、本方法によって生成されていない植物と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％のストレス耐性の増大、収量の増加、収量品質の向上、成長速度の増加を含む。
ストレス耐性の増大を評価するための当技術分野において公知の任意の方法は、本発明に従って使用することができる。ストレス耐性の増大を評価する例示的な方法としては、Ｙｏｏｎ，ＳＫ．，Ｂａｅ，ＥＫ．，Ｌｅｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｅｓ（２０１８）３２：８２３．ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｄｏｉ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００４６８－０１８－１６７５－２）に記載の塩ストレス耐性を増大させるためのポプラにおけるＰａｇＳＡＰ１のダウンレギュレーション、及びＳｌｂＺＩＰ３８のダウンレギュレーションによるトマトの耐干性の増大（参照により本明細書に援用されるＰａｎ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ２０１７，８，４０２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｇｅｎｅｓ８１２０４０２）が挙げられるが、これらに限定されない。
収量の増加を評価するための当技術分野において公知の任意の方法は、本発明に従って使用することができる。収量の増加を評価する例示的な方法としては、Ａｒ－Ｒａｆｉ Ｍｄ．Ｆａｉｓａｌ，ｅｔ ａｌ，ＡＪＰＳ＞ Ｖｏｌ．８ Ｎｏ．９，Ａｕｇｕｓｔ ２０１７ ＤＯＩ：１０．４２３６／ａｊｐｓ．２０１７．８９１４９に記載のイネにおけるＤＳＴ発現の減少；及びＷａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２００９ Ｊａｎ；２（１）：１９１－２００．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｎ０８８）に記載の収量を増加させるキャノーラにおけるＢｎＦＴＡのダウンレギュレーションが挙げられるが、これらに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
成長速度の増加を評価するための当技術分野において公知の任意の方法は、本発明に従って使用することができる。成長速度の増大を評価する例示的な方法としては、参照により本明細書に援用されるＭａｒｃｅｌｏ ｄｅ Ｆｒｅｉｔａｓ Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ（２０１７）１，１４－－－２５に記載の成長及びバイオマスを向上させるシロイヌナズナにおけるＢＩＧ ＢＲＯＴＨＥＲ又はＧＡ２－ＯＸＩＤＡＳＥの発現の低下が挙げられるが、これに限定されない。
収量品質の向上を評価するための当技術分野において公知の任意の方法は、本発明に従って使用することができる。収穫品質の向上を評価する例示的な方法としては、Ｙｅｈ Ｓ＿Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｒｉｃｅ（Ｎ Ｙ）．２０１５；８：３６に記載の、より多くの分げつ、より多くの子実が生産されるようになり、子実がより重くなる、イネにおけるＯｓＣＫＸ２のダウンレギュレーション；及びＶｅｒｍａ ＳＲ ａｎｄ Ｄｗｉｖｅｄｉ ＵＮ，Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ Ｖｏｌｕｍｅ ９１，Ｍａｒｃｈ ２０１４，Ｐａｇｅｓ １０７－１２５に記載の、リグニンの蓄積を変化させ、産業目的のために物質の吸収率を増加させる、多くの植物におけるＯＭＴレベルの低下が挙げられるが、これに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
一実施形態によれば、方法は、更に、甘味の増加、糖度の増加、香りの増加、熟成制御の改善、水ストレス耐性の増大、熱ストレス耐性の増大、及び塩耐性の増大を含む植物の生成を可能にする。当業者であれば、本明細書に記載の方法を利用して、改変するための標的ＲＮＡ配列を選択する方法について理解するであろう。
一実施形態によれば、病原体又は有害生物に耐性又は抵抗性のある植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと、（ｂ）病原体又は有害生物に耐性又は抵抗性のある後代植物を選択することと、を含む方法が提供される。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、病原体又は有害生物に対する感受性を付与する植物の遺伝子のものである。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、病原体の遺伝子のものである。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、有害生物の遺伝子のものである。
本明細書で使用するとき、用語「病原体」とは、定着、損傷、攻撃、又は感染することによって植物に悪影響を与える生物を指す。従って、病原体は、植物の成長、発育、繁殖、収穫、又は収量に影響を与える可能性がある。これには、疾患を蔓延させる及び／又は宿主に損傷を与える及び／又は宿主と栄養素をめぐって争う生物が含まれる。植物の病原体としては、真菌、卵菌、細菌、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様生物、ファイトプラズマ、原生動物、線形動物、昆虫、及び寄生植物が挙げられるが、これらに限定されない。
病原体の非限定的な例としては、長い触角を持つカミキリムシ（ｌｏｎｇ ｈｏｒｎｅｄ ｂｏｒｅｒ）等のカミキリムシ（Ｒｏｕｎｄｈｅａｄｅｄ Ｂｏｒｅｒ）；レッドガムラープキジラミ（ｒｅｄ ｇｕｍ ｌｅｒｐ ｐｓｙｌｌｉｄ）（グリカスピス・ブリンブレコンベイ（Ｇｌｙｃａｓｐｉｓ ｂｒｉｍｂｌｅｃｏｍｂｅｉ））、ブルーガムキジラミ（ｂｌｕｅ ｇｕｍ ｐｓｙｌｌｉｄ）、スポッティッドガムラープキジラミ（ｓｐｏｔｔｅｄ ｇｕｍ ｌｅｒｐ ｐｓｙｌｌｉｄ）、レモンガムラープキジラミ（ｌｅｍｏｎ ｇｕｍ ｌｅｐ ｐｓｙｌｌｉｄ）等のキジラミ；カメノコハムシ；ゾウムシ；ハムシ；ナラタケ；トウマストコリス・ペレグリヌス（Ｔｈａｕｍａｓｔｏｃｏｒｉｓ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ）；ユーカリアシブトコバチ（Ｌｅｐｔｏｃｙｂｅ ｉｎｖａｓａ）、オフェリムス・マスケッリ（Ｏｐｈｅｌｉｍｕｓ ｍａｓｋｅｌｌｉ）及びセリトリコデス・グロブレス（Ｓｅｌｉｔｒｉｃｈｏｄｅｓ ｇｌｏｂｕｌｅｓ）等の付着性のタマバチ（タマバチ科（Ｃｙｎｉｐｉｄａｅ））；雑食性シャクトリムシ（Ｏｍｎｉｖｏｒｏｕｓ ｌｏｏｐｅｒ）及びオレンジハマキガ（Ｏｒａｎｇｅ ｔｏｒｔｒｉｘ）等の食葉性毛虫類；ガラスのような羽を持つヨコバイ（Ｇｌａｓｓｙ－ｗｉｎｇｅｄ ｓｈａｒｐｓｈｏｏｔｅｒ）；並びにジャイアント・ホワイトフライ（Ｇｉａｎｔ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）等のコナジラミ類が挙げられるが、これらに限定されない。病原体の他の非限定的な例としては、ケアブラムシ亜科（Ｃｈａｉｔｏｐｈｏｒｕｓ）の種、クラウディーウィングド・コットンウッド（Ｃｌｏｕｄｙｗｉｎｇｅｄ ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ）及びニタイケアブラムシ属（Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌｕｓ）の種等のアブラムシ；リンゴカキカイガラムシ及びサンホセカイガラムシ等のマルカイガラムシ科のカイガラムシ（Ａｒｍｏｒｅｄ ｓｃａｌｅ）；ボクトウガの幼虫（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｗｏｒｍ）；アメリカスズメバチガ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｈｏｒｎｅｔ ｍｏｔｈ）及びウエスタン・ポピュラー・クリアウィング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｏｐｌａｒ ｃｌｅａｒｗｉｎｇ）等のスカシバガ（Ｃｌｅａｒｗｉｎｇ ｍｏｔｈ）穿孔虫；ブロンズバーチボーラー（Ｂｒｏｎｚｅ ｂｉｒｃｈ ｂｏｒｅｒ）及びブロンズポプラボーラー（Ｂｒｏｎｚｅ ｐｏｐｌａｒ ｂｏｒｅｒ）等のタマムシ類（Ｆｌａｔｈｅａｄｅｄ ｂｏｒｅｒ）；アメリカシロヒトリ（Ｆａｌｌ ｗｅｂｗｏｒｍ）、果樹ハマキムシ（Ｆｒｕｉｔ－ｔｒｅｅ ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ）、レッドハンプトキャタピラー（Ｒｅｄｈｕｍｐｅｄ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、ヤナギドクガ、キベリタテハ、テンマクケムシ（Ｔｅｎｔ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、ドクガ類（Ｔｕｓｓｏｃｋ ｍｏｔｈ）及びニシトラフアゲハ等の葉食性毛虫類；ポプラシールドベアラー（Ｐｏｐｌａｒ ｓｈｉｅｌｄ ｂｅａｒｅｒ）等のハモグリバエ；コットンウッドフシダニ（Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ ｇａｌｌ ｍｉｔｅ）等のフシダニ類並びに水疱ダニ類（ｂｌｉｓｔｅｒ ｍｉｔｅ）；ポプラ虫コブアブラムシ（Ｐｏｐｌａｒ ｐｅｔｉｏｌｅｇａｌｌ ａｐｈｉｄ）等の虫コブアブラムシ（Ｇａｌｌ ａｐｈｉｄ）；ガラスのような羽を持つヨコバイ（Ｇｌａｓｓｙ－ｗｉｎｇｅｄ ｓｈａｒｐｓｈｏｏｔｅｒ）；ハムシ類及びノミトビヨロイムシ類；コナカイガラムシ類；ポプラ及びヤナギの穿孔虫（Ｐｏｐｌａｒ ａｎｄ ｗｉｌｌｏｗ ｂｏｒｅｒ）；カミキリムシ；ハバチ類；オリーブカタカイガラムシ、ヒラタカタカイガラムシ、モミジワタカイガラムシ及びミズキカタカイガラムシ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｆｒｕｉｔ ｌｅｃａｎｉｕｍ）等のカタカイガラムシ類；バッファローツノゼミ（Ｂｕｆｆａｌｏ ｔｒｅｅｈｏｐｐｅｒ）等のツノゼミ；並びにグンバイ及びカスミカメ（Ｌｙｇｕｓ ｂｕｇ）等の半翅類昆虫が挙げられる。
ウイルス性植物病原体の他の非限定的な例としては、種：マメ早期褐変ウイルス（Ｐｅａ ｅａｒｌｙ－ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｖｉｒｕｓ：ＰＥＢＶ）、属：トブラウイルス（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）、種：トウガラシ輪紋ウイルス（ＰｅｐＲＳＶ）、属：トブラウイルス、種：スイカモザイクウイルス（ＷＭＶ）、属：ポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）、及びポティウイルス属由来の他のウイルス、種：タバコモザイクウイルス属（ＴＭＶ）、トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）及びトバモウイルス属由来の他のウイルス、種：ジャガイモウイルスＸ属（ＰＶＸ）、ポテックススウイルス（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）及びポテックスウイルス属由来の他のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本教示では、ＲＮＡウイルスに加えて、ＤＮＡウイルス（例えば、ジェミニウイルス又はビジェミニウイルス）を標的とすることも想定している。標的とすることができるジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスとしては、アブチロンモザイクビジェミニウイルス、カッコウアザミ葉脈黄化ビジェミニウイルス、インゲンマメカリコモザイクビジェミニウイルス（Ｂｅａｎ ｃａｌｉｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、インゲンマメゴールデンモザイクビジェミニウイルス、ビンディ（Ｂｈｅｎｄｉ）葉脈黄化ビジェミニウイルス、キャッサバアフリカモザイクビジェミニウイルス、キャッサバインドモザイクビジェミニウイルス、チノデル９５イナリ（Ｃｈｉｎｏ ｄｅｌ ９５ｉｎａｌｉ）ビジェミニウイルス、ワタ縮葉ビジェミニウイルス（Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｒｕｍｐｌｅ ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ワタ葉巻ビジェミニウイルス、クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）葉脈黄化モザイクビジェミニウイルス、フジマメ黄化モザイクビジェミニウイルス、ユーフォルビアモザイクビジェミニウイルス、ホースグラム黄化モザイクビジェミニウイルス、ナンヨウアブラギリモザイクビジェミニウイルス、ライマメゴールデンモザイクビジェミニウイルス、メロン葉巻ビジェミニウイルス、リョクトウ黄化モザイクビジェミニウイルス、オクラ葉巻ビジェミニウイルス、トウガラシワステコビジェミニウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ ｈａｕｓｔｅｃｏ ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、トウガラシテキサスビジェミニウイルス、ジャガイモ黄化モザイクビジェミニウイルス、タンキリマメモザイクビジェミニウイルス、セラーノ（ｓｅｒｒａｎｏ）ゴールデンモザイクビジェミニウイルス、カボチャ葉巻ビジェミニウイルス、タバコ葉巻ビジェミニウイルス、トマトオーストラリア葉巻ビジェミニウイルス、トマトゴールデンモザイクビジェミニウイルス、トマトインド葉巻ビジェミニウイルス、トマト縮葉ビジェミニウイルス、トマト斑紋ビジェミニウイルス、トマト黄化葉巻ビジェミニウイルス、トマト黄化モザイクビジェミニウイルス、スイカ退緑萎縮スタントビジェミニウイルス、及びスイカ葉巻斑紋ビジェミニウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「有害生物」とは、直接的又は間接的に植物に害を与える生物を指す。直接的な影響としては、例えば、植物の葉を食べることが挙げられる。間接的な影響としては、例えば、病因物質（例えば、ウイルス、細菌等）を植物に伝播することが挙げられる。後者の場合、有害生物は、病原体伝播のベクターとして機能する。
一実施形態によれば、有害生物は、無脊椎動物の生物である。
例示的な有害生物としては、昆虫、線形動物、カタツムリ、ナメクジ、クモ、イモムシ、サソリ、ダニ、マダニ、真菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
昆虫の有害生物としては、甲虫目（例えば、カブトムシ）、ハエ目（例えば、ハエ、カ）、ハチ目（例えば、ハバチ、スズメバチ、ミツバチ、及びアリ）、チョウ目（例えば、チョウ及びガ）、ハジラミ目（例えば、シラミ、例えば、ハジラミ（ｃｈｅｗｉｎｇ ｌｉｃｅ、ｂｉｔｉｎｇ ｌｉｃｅ、及びｂｉｒｄ ｌｉｃｅ）、カメムシ目（例えば、カメムシ）、腹吻亜目（例えば、アブラムシ、コナジラミ、及びカイガラムシ）、頚吻亜目（例えば、セミ、ヨコバイ、ツノゼミ、ウンカ、及びアワフキムシ）、及び鞘吻亜目（例えば、コケムシ（ｍｏｓｓ ｂｕｇｓ）及びカブトムシ（ｂｅｅｔｌｅ ｂｕｇｓ））を含む同翅目、バッタ目（例えば、バッタ、トノサマバッタ、並びにキリギリス及びウェタを含むコオロギ）、アザミウマ目（例えば、アザミウマ）、ハサミムシ目（例えば、ハサミムシ）、シロアリ目（例えば、シロアリ）、シラミ目（例えば、シラミ）、ノミ目（例えば、ノミ）、トビケラ目（例えば、トビケラ）等から選択される昆虫が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の昆虫の有害生物としては、トウモロコシ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）；アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ジュウイチホシウリハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）；クシコメツキ属（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ）種、コメツキムシの幼虫（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）；ノーザンマスクドコガネムシ（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫）；サザンマスクドシェイファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ９６ｉｎａｌｉｚｅｄ９６、ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫）；マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）；ミノハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）；トウモロコシゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）；トウモロコシアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）；コーンルートアフィド（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ、ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；アカアシトビバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）；ミグラトリーグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；タネバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）；コーンブロットリーフマイナー（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ、ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）；クサキイロアザミウマ（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）；シーフアント（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ、ｔｈｉｅｆ ａｎｔ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）；ソルガム：ソルガムボーラー（Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ）；ツマジロクサヨトウ；アメリカタバコガ；モロコシマダラメイガ；グラニュレートカットワーム（Ｆｅｌｔｉａ ９６ｉｎａｌｉｚｅｄ９６、ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ）；地虫（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ９６ｉｎａｌｉｚ）；エレオデス（Ｅｌｅｏｄｅｓ）属、コノデルス（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）属、及びアエオルス（Ａｅｏｌｕｓ）属の種、コメツキムシの幼虫；クビアカクビホソハムシ（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）；ミノハムシ；トウモロコシゾウムシ；トウモロコシアブラムシ；イエローシュガーケーンアフィド（Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ、ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ；ソルガムタマバエ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）；ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）；ナミハダニ；コムギ：ヨトウムシ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）；ツマジロクサヨトウ；モロコシマダラメイガ；ウエスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）；モロコシマダラメイガ；クビアカクビホソハムシ；オオタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ ９６ｉｎａｌｉｚｅ）；ジュウイチホシウリハムシ；ロシアコムギアブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）；ムギヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ）；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；ミグラトリーグラスホッパー；ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；ムギアカタマバエ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ）；ムギキモグリバエ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ ９７ｉｎａｌｉｚｅｄ）；コムギスイセンハナアブ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ）；ウスグロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）；コムギクキバチ（Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ、ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｓａｗｆｌｙ）；チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）；ヒマワリ：ヒマワリハマキガ（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）；サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）；サンフラワービートル（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）；キャロットビートル（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ、ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ）；サンフラワーシードミッジ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ、ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ）；ワタ：ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）；アメリカタバコガ；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）；ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）；メキシコワタミゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）；ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）；ワタノミハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ）；オンシツコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）；ミドリメクラカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー；ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）；ウスグロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）；ニセナミハダニ；ナミハダニ；イネ：サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ツマジロクサヨトウ；アメリカタバコガ；グレープコラスピス（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ、ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ）；イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）；ココクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）；クロスジツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）；アメリカコバネナガカメムシ；アオクサカメムシ；ダイズ：ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ９７ｉｎａｌｉｚｅ）；ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）；グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ、ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）；ヨーロッパアワノメイガ；タマナヤガ；シロイチモジヨトウ；ニセアメリカタバコガ；アメリカタバコガ；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）；モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）；ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ）；アオクサカメムシ；アカアシトビバッタ；ディファレンシャルグラスホッパー；タネバエ；ダイズアザミウマ（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）；ネギアザミウマ；イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ、ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；ナミハダニ；オオムギ：ヨーロッパアワノメイガ；タマナヤガ；ムギミドリアブラムシ、アメリカコバネナガカメムシ；アオクサカメムシ；チャイロカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）；タネバエ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ）；ヘシアンバエ；ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）；ナタネ：ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；フリービートル（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）；ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）；デリア（Ｄｅｌｉａ）属の種、根食い虫が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、病原体は線形動物である。
例示的な線形動物としては、ネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、線虫、ラドホルス・アラボコフェアエ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ａｒａｂｏｃｏｆｆｅａｅ）、ミナミネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、ネコブセンチュウ（メロイドギン属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の種）、シストセンチュウ（ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）及びグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の種）、ネグサレセンチュウ（プラチレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の種）、クキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、マツノザイセンチュウ（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）、ナコブス・アベルランス（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、及びアフェレンコイデス・ベッセイ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、病原体は、真菌である。例示的な真菌としては、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、レプトスファエリア・マキュランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）（キャベツ根朽病菌（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ））、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、イネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ）、イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ））、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａｌ）、プッチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）の種、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）の種、ウスティラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、メラムプソラ・リニ（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ ｌｉｎｉ）、ファコプソラ・パチリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、有害生物は、アリ、ミツバチ、スズメバチ、イモムシ、カブトムシ、カタツムリ、ナメクジ、線形動物、バグ、ハエ、コナジラミ、蚊、バッタ、ハサミムシ、アブラムシ、カイガラムシ、ツリガネムシ、クモ、ダニ、キジラミ、及びサソリである。
一実施形態によれば、病原体又は有害生物に抵抗性又は耐性のある植物を作るために、ＲＮＡサイレンシング分子は、病原体又は有害生物に対する感受性を付与する植物の遺伝子のものである関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
好ましくは、病原体又は有害生物の遺伝子をサイレンシングした結果、病原体又は有害生物が抑制、制御、及び／又は殺傷され、その結果、病原体又は有害生物が植物に与える損傷が制限される。有害生物の制御としては、有害生物を殺傷する、有害生物の発育を阻害する、有害生物が植物に与える損傷が少なくなるように有害生物の繁殖力若しくは成長を変化させる、生成される子孫の数を減少させる、あまり適合しない有害生物を生成する、捕食者の攻撃をより受けやすい有害生物を生成する、又は有害生物が植物を食べるのを阻止することが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、標的となる例示的な植物遺伝子としては、キュウリにおいてウイルス感染に対する感受性を付与する遺伝子であるｅＩＦ４Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、病原体に抵抗性又は耐性のある植物を作るために、ＲＮＡサイレンシング分子は、病原体の遺伝子のものである関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
植物又は病原体の標的遺伝子の決定は、ルーチンのバイオインフォマティクス解析等、当技術分野において公知の任意の方法を用いて達成することができる。
一実施形態によれば、線形動物病原体遺伝子は、バナナネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）の遺伝子であるカルレチキュリン１３（ＣＲＴ）又はコラーゲン５（ｃｏｌ－５）を含む。
一実施形態によれば、真菌病原体遺伝子は、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の遺伝子であるＦＯＷ２、ＦＲＰ１、及びＯＰＲを含む。
一実施形態によれば、病原体遺伝子としては、例えば、液胞ＡＴＰａｓｅ（ｖＡＴＰａｓｅ）、ｄｖｓｓｊ１及びｄｖｓｓｊ２、α－チューブリン、並びにｓｎｆ７が挙げられる。
特定の実施形態によれば、植物がアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、レプトスファエリア・マクランス（キャベツ根朽病菌）（例えば、根朽病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＭ９３３６１３．１に記載）；ノミトビヨロイムシ（Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）（フィロトレタ・ビッツラ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｖｉｔｔｕｌａ）又はハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＴ９５９２４５．１に記載）の遺伝子；又は菌核病菌の遺伝子（例えば、菌核病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿００１８２０８３３．１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、柑橘類潰瘍病（ＣＣＫ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥ００８９２５に記載）；カンジダタス・リベリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）種（例えば、カンキツグリーニング病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００１６７７．５に記載）；又はならたけ病の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＹ３８９２６７．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）の種（例えば、マンネンタケ根株腐朽病としても知られている基部腐朽（ＢＳＲ）を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ５６１２８．１に記載）、ヒロヘリアオイラガ（Ｎｅｔｔｌｅ Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）の遺伝子、又はフザリウム属の種、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）の種、フハイカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）の種、リゾクトニア・ソラニのいずれか１つの遺伝子（例えば、根腐れを引き起こす）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がワイルドストロベリー（Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａ）（例えば、バーティシリウム萎凋病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＳ５７２７１３．１に記載）；又はイチゴ萎黄病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ）の遺伝子（例えば、立ち枯れ病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＲ８５５８６８．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、ダイズさび病菌（Ｐ．ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）（例えば、アジアさび病（Ａｓｉａｎ ｒｕｓｔ）としても知られているダイズさび病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＱ０２６０６１．１に記載）；ダイズアブラムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＪ４５１４２４．１に記載）；ダイズ矮化病ウイルス（ＳｂＤＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３０５６．１に記載）；又はアオクサカメムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＷ＿０２０１１０７２２．１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、ワタ萎黄病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）（例えば、立ち枯れ病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＮ４１６６１４．１に記載）；ダイズアブラムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＪ４５１４２４．１に記載）；又はワタアカミムシの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＵ５５０９６４．１に記載）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、いもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｇｒｉｓｅａ）（例えば、イネいもち病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０２７９７９．１に記載）；イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）（フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ））の遺伝子（例えば、馬鹿苗病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ８６２１９２．１に記載）；又はテッポウムシ（Ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ）、例えば、イッテンオオメイガ（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ Ｗａｌｋｅｒ － Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）、イネシロオオメイガ（Ｓ．ｉｎｎｏｔａ Ｗａｌｋｅｒ － Ｗｈｉｔｅ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）、ニカメイガ（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ Ｗａｌｋｅｒ － Ｓｔｒｉｐｅｄ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）、イネヨトウ（Ｓｅｓａｍｉａ ｉｎｆｅｒｅｎｓ Ｗａｌｋｅｒ － Ｐｉｎｋ Ｓｔｅｍ Ｂｏｒｅｒ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＦ２９０７７３．１に記載）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（例えば、疫病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ８５５２１０．１に記載）；コナジラミ類であるタバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）の遺伝子（例えば、Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＸ３９０８７０．１に記載）；又はトマト黄化葉巻ジェミニウイルス（ＴＹＬＣＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＮ８４６６１０．１に記載）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、疫病菌（例えば、疫病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ０５０５３８．３に記載）；エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）の種の遺伝子（例えば、黒脚病及び軟腐病を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００１６５４．１に記載）；又はシストセンチュウ（Ｃｙｓｔ Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）の遺伝子（例えば、ジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）及びジャガイモシストセンチュウ（Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＦ９６３５１９．１に記載）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、担子菌であるカカオ霜白鞘病菌（Ｍｏｎｉｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｒｏｒｅｒｉ）（例えば、霜白鞘病を引き起こす）の遺伝子の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＡＴＸ０１００１５２１．１に記載）；天狗巣病菌（Ｍｏｎｉｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ）（例えば、天狗巣病を引き起こす）の遺伝子；又はメクラカメムシの変種（Ｍｉｒｉｄ）、例えば、ジスタンチエラ・１００イナライズド（Ｄｉｓｔａｎｔｉｅｌｌａ １００ｉｎａｌｉｚｅｄ）及びカカオカスミカメムシ（Ｓａｈｌｂｅｒｇｅｌｌａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、ヘロペルティス（Ｈｅｌｏｐｅｌｔｉｓ）属の種、モナロニオン属（Ｍｏｎａｌｏｎｉｏｎ）の種の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、クロステロウイルスＧＶＡ（例えば、ルゴースウッド病を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ００７４１５．２に記載）；ブドウリーフロール病ウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＪ４３６２３４．１に記載）；ブドウファンリーフ病ウイルス（ＧＦＬＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２０３．１に記載）；又はブドウフレック病（ＧＦｋＶ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３３４７．１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がトウモロコシ（コーンとも称される）である場合、関心標的ＲＮＡとしては、ツマジロクサヨトウ（Ｆａｌｌ Ａｒｍｙｗｏｒｍ）（例えば、ツマジロクサヨトウ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ４８８１８１．３に記載）の遺伝子；ヨーロッパアワノメイガの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＧＵ３２９５２４．１に記載）；又は北部及び西部コーンルートワーム（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０３９４０３．１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がサトウキビである場合、関心標的ＲＮＡとしては、穿孔性節足動物（Ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ Ｂｏｒｅｒ）（例えば、スジツトガ（Ｃｈｉｌｏ Ｓａｃｃｈａｒｉｆａｇｕｓ Ｉｎｄｉｃｕｓ）の遺伝子、サトウキビ白すじ病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ａｌｂｉｌｅｎｅａｎｓ）（例えば、白すじ病を引き起こす）の遺伝子；又はサトウキビ黄葉ウイルス（ＳＣＹＬＶ）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がコムギである場合、関心標的ＲＮＡとしては、コムギ黄さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）の遺伝子（例えば、黄さび病を引き起こす）又はアブラムシの遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がオオムギである場合、関心標的ＲＮＡとしては、オオムギ小さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｄｅｉ）（例えば、葉さび病を引き起こす）の遺伝子、オオムギ黄さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ．ｓｐ．Ｈｏｒｄｅｉ）（例えば、黄さび病を引き起こす）の遺伝子、又はアブラムシの遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がヒマワリである場合、関心標的ＲＮＡとしては、ヒマワリさび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ）（例えば、さび病を引き起こす）の遺伝子；ボエレマ・マクドナルディイ（Ｂｏｅｒｅｍａ ｍａｃｄｏｎａｌｄｉｉ）（例えば、フォーマ茎枯病（Ｐｈｏｍａ ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ）を引き起こす）の遺伝子；ゾウムシ（Ｓｅｅｄ ｗｅｅｉｌ）（例えば、赤及び灰）、例えばスミクロニクス・フルウス（Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ）（赤）；スミクロニクス・ソルディダス（Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｓｏｒｄｉｄｕｓ）（灰）の遺伝子；又は菌核病菌（例えば、茎腐れ病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｔａｌｋ）及び花蕾腐敗病を引き起こす）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がゴムの木である場合、関心標的ＲＮＡとしては、南米葉枯病菌（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｕｓ ｕｌｅｉ）（例えば、南米葉枯病（ＳＡＬＢ）を引き起こす）の遺伝子；パラゴムノキ根白腐病菌（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ）（例えば、根白腐病を引き起こす）の遺伝子；ガノデルマ・シュードフェレウム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｐｓｅｕｄｏｆｅｒｒｅｕｍ）の遺伝子（例えば、根湿腐病を引き起こす）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、植物がリンゴ植物である場合、関心標的ＲＮＡとしては、ネオネクトリア・ジチシマ（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）（例えば、リンゴ腐爛病を引き起こす）の遺伝子、モモうどんこ病（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）（例えば、リンゴうどんこ病を引き起こす）の遺伝子、又は黒星病菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）（例えば、リンゴさびを引き起こす）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、本方法によって生成された植物は、本方法によって生成されていない植物と比較して（すなわち、野生型の植物と比較して）、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％、病原体に対してより抵抗性又は耐性が高い。
植物の病原体に対する耐性又は抵抗性を評価するための当技術分野において公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。例示的な方法としては、Ｒａｍiｒｅｚ Ｖ１，Ｇａｒｃiａ－Ａｎｄｒａｄｅ Ｊ，Ｖｅｒａ Ｐ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｂｅｈａｖ．２０１１ Ｊｕｎ；６（６）：９１１－３．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ １に記載の通り、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に対する抵抗性を高めるシロイヌナズナにおけるＭＹＢ４６発現を低下させる；又はＧａｌｌｅｇｏ－Ｇｉｒａｌｄｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１１）１９０：６２７－６３９ ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４６９－８１３７．２０１０．０３６２１．ｘ）に記載の通り、植物における防御応答の活性化を促進するアルファルファにおけるＨＣＴをダウンレギュレーションすることが挙げられるが、これらに限定されず、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
一実施形態によれば、除草剤抵抗性植物を生成する方法であって、（ａ）本発明の幾つかの実施形態の植物を育種することと、（ｂ）除草剤抵抗性である後代植物を選択することと、を含む方法が提供される。
一実施形態によれば、除草剤は、色素体内（例えば、葉緑体内）に存在する経路を標的とする。
除草剤抵抗性植物を生成するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、葉緑体遺伝子ｐｓｂＡ（除草剤アトラジンの標的である光合成キノン結合膜タンパク質ＱＢをコードしている）及びＥＰＳＰ合成酵素（核タンパク質であるが、ＥＰＳＰの転写速度を増加させるので、更に酵素のターンオーバーを減少させることによって、その葉緑体における過剰発現又は蓄積により、除草剤グリホサートに対する植物の抵抗性が得られる）の遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない、関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、本方法によって生成された植物は、本方法によって生成されていない植物と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％、除草剤に対する抵抗性がより高い。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って生成された植物が提供される。
一実施形態によれば、ＲＮＡ分子がＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシングされるようになる核酸配列の変化を有するＲＮＡ分子をコードしているポリヌクレオチド配列を含むゲノムを含む遺伝的に改変された細胞であって、核酸配列が変化していない同一起源の野生型細胞にはプロセシングが存在しない、遺伝的に改変された細胞が提供される。
本発明の一態様によれば、疾患の治療を、それを必要としている被験体においてする方法であって、本発明の幾つかの実施形態の方法に従ってサイレンシング活性及び／又は特異性を有するＲＮＡ分子を生成することを含み、当該ＲＮＡ分子が、当該疾患の発症又は進行に関連する遺伝子の転写物に対するサイレンシング活性を有し、それによって、当該被験体を治療することを含む方法が提供される。
本発明の一態様によれば、疾患の治療を、それを必要としている被験体においてするための、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って生成されたサイレンシング活性及び／又は特異性を有するＲＮＡ分子であって、疾患の発症又は進行に関連する遺伝子の転写物に対するサイレンシング活性を有し、それによって、被験体を治療するＲＮＡ分子が提供される。
一実施形態によれば、疾患は、感染性疾患、一遺伝子性劣性遺伝障害、自己免疫疾患、及びがん性疾患である。
用語「治療」とは、病状（疾患、障害、又は病態）の発症を抑制、予防、若しくは阻止する、及び／又は病状の軽減、寛解、若しくは退縮を引き起こすことを指す。当業者であれば、病状の発症を評価するために様々な方法論及びアッセイを用いることができ、同様に、病状の軽減、寛解、又は退縮を評価するために様々な方法論及びアッセイを用いることができることを理解するであろう。
本明細書で使用するとき、用語「予防」とは、疾患のリスクを有している可能性があるが、未だ疾患を有するとは診断されていない被験体において、疾患、障害、又は病態が発症するのを防ぐことを指す。
本明細書で使用するとき、用語「被験体」又は「それを必要としている被験体」とは、病状に苦しんでいる任意の年齢又は性別の哺乳類を含む動物、好ましくはヒトを含む。好ましくは、この用語は、病状を発症するリスクを有する個体を包含する。
一実施形態によれば、疾患は、ウイルス、真菌、細菌、トリパノソーマ、又は原生動物の寄生生物（例えば、マラリア原虫）に由来する。
用語「感染性疾患」とは、本明細書で使用するとき、慢性感染性疾患、亜急性感染性疾患、急性感染性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原生動物性疾患、寄生生物性疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ疾患、及びプリオン疾患のいずれかを指す。
一実施形態によれば、被験体における感染性疾患を治療するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、感染性疾患の発症又は進行に関連する関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、疾患の発症又は進行に関連する遺伝子は、後述の通り、病原体の遺伝子を含む。
一実施形態によれば、疾患の発症又は進行に関連する遺伝子は、後述の通り、被験体の遺伝子を含む。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌等）に対する抵抗性を付与する真核細胞の遺伝子の産物を含む。例示的な遺伝子としては、ＣｙＰＡ－（シクロフィリン（ＣｙＰ））、シクロフィリンＡ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染の場合）、ＣＤ８１、スカベンジャー受容体クラスＢタイプＩ（ＳＲ－ＢＩ）、ユビキチン特異的ペプチダーゼ１８（ＵＳＰ１８）、ホスファチジルイノシトール４キナーゼＩＩＩアルファ（ＰＩ４Ｋ－ＩＩＩα）（例えば、ＨＳＶ感染の場合）、及びＣＣＲ５－（例えば、ＨＩＶ感染の場合）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、病原体の遺伝子の産物を含む。
一実施形態によれば、ウイルスは、アルボウイルス（例えば、水胞性口内炎インディアナウイルス－ＶＳＶ）である。一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、ＶＳＶ遺伝子の産物、例えば、Ｇタンパク質（Ｇ）、巨大タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質、マトリックスタンパク質（Ｍ）、又は核タンパク質を含む。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、ｇａｇ及び／又はｖｉｆ遺伝子（すなわち、ＨＩＶ－１における保存配列）；Ｐタンパク質（すなわち、ＲＳＶにおけるウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの必須サブユニット）；Ｐ ｍＲＮＡ（すなわち、ＰＩＶにおける）；コア、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５Ｂ（すなわち、ＨＣＶにおける）；ＶＡＭＰ関連タンパク質（ｈＶＡＰ－Ａ）、Ｌａ抗原、及びポリピリミジントラクト結合タンパク質（ＰＴＢ）（すなわち、ＨＣＶの場合）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がヒトである場合、関心標的ＲＮＡとしては、マラリアを引き起こす病原体の遺伝子；ＨＩＶウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８０２．１に記載）；ＨＣＶウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４１０２．１に記載）；及び寄生虫の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００３３７１６０４．１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がヒトである場合、関心標的ＲＮＡとしては、がん性疾患に関連する遺伝子（例えば、ｂｃｒ／ａｂｌ ｅ８ａ２融合タンパク質のヒトｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６９６９３．１に記載）、又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び血管疾患に関連する遺伝子（例えば、ヒトヘパリン結合血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３２９７７．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がウシである場合、関心標的ＲＮＡとしては、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００４８０１．１に記載）、例えばＢＲＤ（ウシ呼吸器病症候群）を引き起こす１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ１）；ブルータング病（ＢＴＶウイルス）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８２１１７０．１に記載）；ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４６１．１に記載）；例えば口蹄疫を引き起こすピコルナウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４００４．１に記載）；例えばＢＲＤを引き起こすパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ３）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０２８３６２．１に記載）；例えばウシ型結核（ｂＴＢ）を引き起こすウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０３７３４３．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がヒツジである場合、関心標的ＲＮＡとしては、サナダムシ病を引き起こす病原体（単包条虫生活環、単包条虫、ヒツジ条虫（Ｔａｅｎｉａ ｏｖｉｓ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、モニエジア属（Ｍｏｎｉｅｚｉａ）の種）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１２６６３．１に記載）；扁形動物病を引き起こす病原体（肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、巨大肝吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｉｄｅｓ ｍａｇｎａ）、槍形吸虫（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、ボビス住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｂｏｖｉｓ））の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６４４４５９．１に記載）；ブルータング病を引き起こす病原体（ＢＴＶウイルス、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＰ８２１１７０．１に記載）の遺伝子；並びに回虫病を引き起こす病原体（寄生性気管支炎、「フーズ（ｈｏｏｓｅ）」としても知られている、シュナイダー糸状虫（Ｅｌａｅｏｐｈｏｒａ ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、毛様線虫属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）の種、オステルターグ胃虫（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）種、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）種、ディクチョカウルス・１０５イナライズ（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ １０５ｉｎａｌｉｚｅ）、プロトストリンギルス・レフェセンス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｒｅｆｅｓｃｅｎｓ）、毛細肺虫（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）、腸結節虫属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）の種、ネオストロンギルス・リネアリス（Ｎｅｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）、大口腸線虫（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ ｏｖｉｎａ）、ヒツジ鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｏｖｉｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３２８３．１１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がブタである場合、関心標的ＲＮＡとしては、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）（例えばアフリカブタ熱を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１６５９．２に記載）；ブタコレラウイルス（例えば、ブタコレラを引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２６５７．１に記載）；及びピコルナウイルス（例えば口蹄疫を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４００４．１に記載）が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がニワトリである場合、関心標的ＲＮＡとしては、トリインフルエンザの遺伝子、トリパラミクソウイルス１（ＡＰＭＶ－１）（例えば、ニューカッスル病を引き起こす）の変種の遺伝子、又はマレック病を引き起こす病原体の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がカブトエビである場合、関心標的ＲＮＡとしては、ホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＳＶ）の遺伝子、イエローヘッドウイルス（ＹＨＶ）の遺伝子、又はタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、生物がサケである場合、関心標的ＲＮＡとしては、伝染性サケ貧血（ＩＳＡ）の遺伝子、伝染性造血器壊死症（ＩＨＮ）の遺伝子、フナムシ（例えば、レペオフテイルス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）属及びウオジラミ（Ｃａｌｉｇｕｓ）属の外部寄生性カイアシ類）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
治療の有効性の評価は、被験体の身体的健康の評価、血液検査、ウイルス／細菌量の評価等、当技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
本明細書で使用するとき、用語「単一遺伝子劣性障害」とは、常染色体上の単一の欠陥遺伝子の結果として引き起こされる疾患又は病態を指す。
一実施形態によれば、単一遺伝子劣性障害は、自然突然変異又は遺伝性突然変異の結果である。
一実施形態によれば、単一遺伝子劣性障害は、常染色体優性、常染色体劣性、又はＸ連鎖劣性である。
例示的な単一遺伝子劣性障害としては、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血友病、酵素欠損症、パーキンソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、フリードリヒ失調症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンター病、アイカルディ症候群、クラインフェルター症候群、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、被験体における単一遺伝子劣性障害を治療するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、単一遺伝子劣性障害に関連する関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、障害がパーキンソン病である場合、関心標的ＲＮＡは、ＳＮＣＡ（ＰＡＲＫ１＝４）、ＬＲＲＫ２（ＰＡＲＫ８）、Ｐａｒｋｉｎ（ＰＡＲＫ２）、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）、又はＡＴＰ１３Ａ２（ＰＡＲＫ９）遺伝子の産物を含む。
一実施形態によれば、障害が血友病又はフォン・ヴィルブランド病である場合、関心標的ＲＮＡは、例えば、アンチトロンビン遺伝子、凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子又は第ＩＸ因子遺伝子の産物を含む。
治療の有効性の評価は、被験体の身体的健康の評価、血液検査、骨髄穿刺等、当技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
自己免疫疾患の非限定的な例としては、心血管疾患、リウマチ性疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経疾患、筋肉疾患、腎疾患、生殖に関する疾患、結合組織疾患、及び全身性疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性心血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７－９）、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ２０００ Ａｕｇ ２５；１１２（１５－１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ－Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型巣状壊死性及び半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ ＬＨ．Ａｎｎ Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００ Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘発性心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ Ｆ．Ａｎｎ Ｉｔａｌ Ｍｅｄ Ｉｎｔ．１９９９ Ａｐｒ－Ｊｕｎ；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ ＪＷ．Ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９６ Ｍａｙ １５；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ ＤＧ．Ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８ Ｊａｎ；２８（３－４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９７ Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、シャーガス病における心臓自己免疫（Ｃｕｎｈａ－Ｎｅｔｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ Ｏｃｔ １５；９８（８）：１７０９）、並びに抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ ＡＰ．Ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１１（１）：９）が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性リウマチ性疾患の例としては、関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌ；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ Ｒ，ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ Ｓ Ａ １９９４ Ｊａｎ １８；９１（２）：４３７）及び強直性脊椎炎（Ｊａｎ Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ ２００１；３（３）：１８９）が挙げられるが、これらに限定されない。。
自己免疫性腺疾患の例としては、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、特発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎、及びＩ型多腺性自己免疫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。疾患としては、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ Ｌ．ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９６ Ｏｃｔ；３４ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２０００ Ｊｕｎ；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３ Ｍａｒ；９２（１）：７７）、特発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ－Ｍｕｌｌｅｎ Ｈ．ａｎｄ Ｙｕ Ｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、卵巣自己免疫（Ｇａｒｚａ ＫＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子性不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ ＡＢ．Ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＢ．Ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９７ Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、及びＩ型多腺性自己免疫症候群（Ｈａｒａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９１ Ｍａｒ １；７７（５）：１１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性胃腸疾患の例としては、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ Ｈｅｒｏｌａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ ＹＥ．Ａｎｄ Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ ２０００ Ｊａｎ １６；１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎、及びクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性皮膚疾患の例としては、例えば、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び落葉状天疱瘡等であるがこれらに限定されない、自己免疫性水疱性皮膚疾患が挙げられるが、これに限定されない。
自己免疫性肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９０ Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ ＤＥ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６ Ｎｏｖ；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ ＣＰ．Ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）、及び自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ ＭＰ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００ Ａｕｇ；３３（２）：３２６）が挙げられるが、これに限定されない。
自己免疫性神経疾患の例としては、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ ＡＨ．Ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００１ Ｊａｎ １；１１２（１－２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ ＡＪ．Ａｎｄ Ｋｒａｉｇ Ｅ，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８（１－２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０ Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ＡＪ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００ Ｍａｙ；７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群及び自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｓ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）；傍腫瘍性神経疾患、小脳萎縮症、傍腫瘍性小脳萎縮症、及びスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳ．Ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ Ｓ Ａ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３９８８）；非傍腫瘍性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、及び自己免疫性多腺性内分泌障害（Ａｎｔｏｉｎｅ ＪＣ．Ａｎｄ Ｈｏｎｎｏｒａｔ Ｊ．Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００ Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；免疫不全神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ－Ｏｒａｚｉｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ １９９９；５０：４１９）；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症（ａｒｔｈｒｏｇｒｙｐｏｓｉｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ １０８ｉｎａｌｉｚｅｄ１０８）（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９９８ Ｍａｙ １３；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９４ Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、並びに神経変性疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎、及び原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）、並びに平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９９９ Ｊｕｎ；５３（５－６）：２３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性腎疾患の例としては、腎炎及び自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ ＣＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９０ Ａｕｇ；１（２）：１４０）等が挙げられるが、これらに限定されない。
生殖に関する自己免疫疾患の例としては、繰り返される胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７－９）が挙げられるが、これに限定されない。
自己免疫性結合組織疾患の例としては、耳疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ ＴＪ．Ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４ Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、及び内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７ Ｄｅｃ ２９；８３０：２６６）が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫性全身疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １９９８；１７（１－２）：４９）及び全身性強皮症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ ＯＴ．Ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９９ Ｊｕｎ；１６９：１０７）。
一実施形態によれば、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む。
一実施形態によれば、被験体における自己免疫疾患を治療するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、自己免疫疾患に関連する関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、疾患がループスである場合、関心標的ＲＮＡは、例えばＢ細胞によって病的に産生される抗核抗体（ＡＮＡ）を含む。
治療の有効性の評価は、被験体の身体的健康の評価、血液検査、骨髄穿刺等、当技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
本発明の幾つかの態様の方法によって治療することができるがんの非限定的な例は、任意の固形癌若しくは非固形癌及び／又は癌転移若しくは前がん状態であってよく、例えば、胃腸管の腫瘍（結腸癌腫、直腸癌腫、結腸直腸癌腫、結腸直腸癌、結腸直腸腺腫、遺伝性非ポリポーシス１型、遺伝性非ポリポーシス２型、遺伝性非ポリポーシス３型、遺伝性非ポリポーシス６型；結腸直腸癌、遺伝性非ポリポーシス７型、小腸及び／又は大腸の癌腫、食道癌腫、食道癌を伴う肥厚化、胃癌腫、膵臓癌腫、膵内分泌腫瘍）、子宮内膜癌腫、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢癌腫、胆管腫瘍、前立腺癌、前立腺腺癌、腎臓癌（例えば、ウィルムス腫瘍２型又は１型）、肝臓癌（例えば、肝芽腫、肝細胞癌腫、肝細胞癌）、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、栄養膜腫瘍、精巣胚細胞性癌、卵巣、子宮、卵巣上皮の未熟型奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛癌、胎盤側栄養膜腫瘍、上皮の成人腫瘍、卵巣癌腫、漿液性卵巣癌、卵巣性索腫瘍、子宮頸癌、子宮頸癌腫、小細胞及び非小細胞肺癌腫、鼻咽頭癌腫、乳癌腫（例えば、乳管癌、浸潤性乳管内乳癌、散在性；乳癌、乳癌に対する感受性、４型乳癌、乳癌－１、乳癌－３；乳房－卵巣癌）、扁平上皮癌腫（例えば、頭頸部における）、神経原性腫瘍、星状膠細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺リンパ腫）、神経膠腫、腺癌腫、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質癌腫、脳悪性腫瘍（腫瘍）、様々な他の癌腫（例えば、気管支原性大細胞癌、線管癌、エールリッヒ腹水癌、類表皮癌、大細胞癌、ルイス肺癌、髄様癌、粘表皮癌、燕麦細胞癌、小細胞癌、紡錘体細胞癌、棘細胞癌、移行上皮細胞癌、未分化癌、癌肉腫、絨毛癌、嚢胞腺癌）、脳室上衣芽細胞腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド赤白血病、リンパ芽球赤白血病）、線維肉腫、巨細胞腫瘍、神経膠腫瘍、神経膠芽細胞腫（例えば、多形性神経膠芽細胞腫、星状膠細胞腫）、神経膠腫、ヘパトーム、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロミエローマ、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞ハイブリドーマ）、副腎腫、インスリノーマ、小島腫瘍、角化腫、平滑筋芽腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性前Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄性白血病、Ｂ細胞白血病、好塩基球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性白血病、Ｂ細胞白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球性白血病又は骨髄球性白血病、ヘアリーセル白血病、リンパ性白血病、巨核芽球性白血病、単球性白血病、単球－マクロファージ白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、形質細胞性白血病、前Ｂ細胞白血病、前骨髄球性白血病、亜急性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ系新生物、骨髄性悪性腫瘍に対する素因、急性非リンパ球性白血病）、リンパ肉腫、メラノーマ、乳腫瘍、肥満細胞腫、髄芽細胞腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽細胞腫、神経組織神経膠腫瘍、神経組織ニューロン腫瘍、神経鞘腫、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、骨軟骨腫、骨骨髄腫、骨肉腫（例えば、ユーイング骨腫）、乳頭腫、移行上皮細胞癌、クロム親和性細胞腫、下垂体腫瘍（侵襲性）、プラズマ細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞肉腫、イエンセン肉腫、骨原性肉腫、細網細胞肉腫）、シュワン鞘腫、皮下腫瘍、奇形癌（例えば、多能性奇形癌）、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫及び毛包上皮腫、胃癌、線維肉腫、多形性神経膠芽細胞腫；多発性グロムス腫瘍、リー・フロイメニ症候群、脂肪肉腫、リンチ癌家族性症候群ＩＩ、男性生殖細胞腫瘍、肥満細胞性白血病、髄様甲状腺癌、多発性髄膜腫、内分泌新生物、粘液肉腫、傍神経節腫、家族性非クロム親和性、毛基質細胞腫、乳頭状、家族性及び散発性、桿状素因症候群、家族性、桿状腫瘍、軟組織肉腫、並びに神経膠芽細胞腫を伴うターコット症候群が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法によって治療することができるがんは、血液悪性腫瘍を含む。例示的な血液悪性腫瘍は、ＡＢＬチロシンキナーゼが異なる他の染色体に悪性融合して、ＢＣＲ－ＡＢＬと呼ばれるものが生成され、次に、悪性融合タンパク質が生じるものを含む。従って、ｍＲＮＡにおける融合点を標的とすると、細胞に必須の正常タンパク質は温存しながら、ダウンレギュレーションのために融合ｍＲＮＡだけをサイレンシングすることができる。
一実施形態によれば、被験体におけるがん性疾患を治療するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、がん性疾患に関連する関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、がん遺伝子（例えば、変異したがん遺伝子）の産物を含む。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、腫瘍抑制因子の機能を回復させる。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、ＲＡＳ、ＭＣＬ－１、又はＭＹＣ遺伝子の産物を含む。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、アポトーシス関連遺伝子のＢＣＬ－２ファミリーの産物を含む。
例示的な標的遺伝子としては、変異体ドミナントネガティブＴＰ５３、Ｂｃｌ－ｘ、ＩＡＰｓ、Ｆｌｉｐ、Ｆａｉｍ３、及びＳＭＳ１等が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、がんがメラノーマである場合、関心標的ＲＮＡは、ＢＲＡＦを含む。本明細書では、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｇ、及びＶ６００Ｒを含む幾つかの形態のＢＲＡＦ変異を想定している。
一実施形態によれば、方法は、免疫細胞が悪性細胞（例えば、血液悪性腫瘍の細胞）を（直接的又は間接的に）殺傷することができるように、関心ＲＮＡを標的とするために、（例えば、患者由来又は細胞ドナー由来の）白血球等の健常免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞におけるＲＮＡサイレンシング分子を標的とすることによって影響を受ける。
一実施形態によれば、方法は、がんがネイティブの免疫系によって認識され、根絶され得るように、（すなわち、悪性腫瘍の認識からの免疫応答を抑制するために）がん因子によって操作されるタンパク質（すなわち、関心標的ＲＮＡ）をサイレンシングするためにＲＮＡサイレンシング分子を標的とすることによって影響を受ける。
治療の有効性の評価は、例えば、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ－ＣＴ、血液検査、超音波、Ｘ線等により、腫瘍の成長又は新生物若しくは転移の数を評価する等、当技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
本発明の一態様によれば、それを必要としてる被験体における化学療法剤の有効性及び／又は特異性を強化する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の方法に従ってサイレンシング活性及び／又は特異性を有するＲＮＡ分子を生成することを含み、当該ＲＮＡ分子が、当該化学療法剤の有効性及び／又は特異性の強化に関連する遺伝子の転写物に対するサイレンシング活性を有する方法が提供される。
本明細書で使用するとき、用語「化学療法剤」とは、新生物又は転移の成長を低減、予防、軽減、制限、及び／又は遅延させる、あるいは新生物の壊死若しくはアポトーシス又は任意の他の機序によって直接新生物細胞を殺傷する、あるいは別の方法で、新生物疾患（例えば、がん）を有する被験体における新生物又は転移の成長を低減、予防、軽減、制限、及び／又は遅延させるために薬学的に有効な量で使用することができる剤を指す。
化学療法剤としては、フルオロピリミジン；ピリミジンヌクレオシド；プリンヌクレオシド；抗葉酸剤、白金剤；アントラサイクリン／アントラセンジオン；エピポドフィロトキシン；カンプトテシン（例えば、カレニテシン）；ホルモン；ホルモン複合体；抗ホルモン剤；酵素、タンパク質、ペプチド、並びにポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体；免疫剤；ビンカアルカロイド；タキサン；エポチロン；抗微小管剤；アルキル化剤；代謝拮抗剤；トポイソメラーゼ阻害剤；抗ウイルス剤；並びに他の様々な細胞毒性及び細胞分裂阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、化学療法剤としては、アバレリックス、アルデスロイキン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバクジマブ、ベクサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダルベポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシンリポソーム、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットＢ液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル５－ＦＵ、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、酢酸ヒストレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシル酸塩、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、イリノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、酢酸ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、酢酸メゲストロール、メルファラン、Ｌ－ＰＡＭ、メルカプトプリン６－ＭＰ、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロンフェンプロピオン酸エステル、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシンミトラマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブマレイン酸塩、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシドＶＭ－２６、テストラクトン、チオグアニン６－ＴＧ、チオテパ、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノインＡＴＲＡ、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、並びにゾレドロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によれば、化学療法剤の効果は、関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング活性及び／又は特異性を付与するように設計されたＤＮＡ編集剤によって治療されていない対象における化学療法剤の効果と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％強化される。
化学療法剤の有効性及び／又は特異性の評価は、例えば、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ－ＣＴ、血液検査、超音波、Ｘ線等により、腫瘍の成長又は新生物若しくは転移の数を評価する等、当技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
一実施形態によれば、方法は、免疫細胞が化学療法に対するがんの抵抗性を低下させることができるように、関心ＲＮＡを標的とするために、（例えば、患者由来又は細胞ドナー由来の）白血球等の健常免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞におけるＲＮＡサイレンシング分子を標的とすることによって影響を受ける。
一実施形態によれば、方法は、免疫細胞が化学療法に対して抵抗性になるように、関心ＲＮＡを標的とするために、（例えば、患者由来又は細胞ドナー由来の）白血球等の健常免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞におけるＲＮＡサイレンシング分子を標的とすることによって影響を受ける。
一実施形態によれば、被験体における化学療法剤の有効性及び／又は特異性を強化するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、化学療法剤の有効性及び／又は特異性の抑制に関連する関心ＲＮＡを標的するように設計される。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、薬物代謝酵素遺伝子の生成物（例えば、シトクロムＰ４５０［ＣＹＰ］２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ［ＵＧＴ］１Ａ１、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ［ＳＵＬＴ］１Ａ１、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ［ＮＡＴ］、チオプリンメチルトランスフェラーゼ［ＴＰＭＴ］）、及び薬物トランスポーター（Ｐ－グリコプロテイン［多剤抵抗性１］、多剤抵抗性タンパク質２［ＭＲＰ２］、乳がん抵抗性タンパク質［ＢＣＲＰ］）を含む。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、抗アポトーシス遺伝子を含む。例示的な標的遺伝子としては、Ｂｃｌ－２ファミリーメンバー、例えば、Ｂｃｌ－ｘ、ＩＡＰ、Ｆｌｉｐ、Ｆａｉｍ３、及びＳＭＳ１が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一態様によれば、それ必要としてる被験体において細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の方法に従ってサイレンシング活性及び／又は特異性を有するＲＮＡ分子を生成することを含み、当該ＲＮＡ分子が、アポトーシスに関連する遺伝子の転写物に対するサイレンシング活性を有し、それによって、当該被験体において細胞のアポトーシスを誘導することを含む方法が提供される。
用語「細胞のアポトーシス」とは、本明細書で使用するとき、プログラム細胞死の細胞プロセスを指す。アポトーシスは、細胞質及び核における明確な形態変化、規則的に離間した部位におけるクロマチンの切断、並びにヌクレオソーム間部位でのゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断を特徴とする。これら変化としては、小疱形成、細胞の収縮、核の断片化、クロマチンの凝縮、及び染色体ＤＮＡの断片化が挙げられる。
一実施形態によれば、細胞のアポトーシスは、関心標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング活性及び／又は特異性を付与するＤＮＡ編集剤によって治療されていない対象における細胞のアポトーシスと比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％強化される。
細胞のアポトーシスの評価は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、細胞増殖アッセイ、ＦＡＣＳ分析等を用いて実施することができる。
一実施形態によれば、被験体において細胞のアポトーシスを誘導するために、ＲＮＡサイレンシング分子は、アポトーシスに関連する関心ＲＮＡを標的とするように設計される。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、アポトーシス関連遺伝子のＢＣＬ－２ファミリーの産物を含む。
一実施形態によれば、関心標的ＲＮＡは、抗アポトーシス遺伝子を含む。例示的な遺伝子としては、変異体ドミナントネガティブＴＰ５３、Ｂｃｌ－ｘ、ＩＡＰｓ、Ｆｌｉｐ、Ｆａｉｍ３、及びＳＭＳ１等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一態様によれば、真核非ヒト生物を生成する方法であって、当該真核非ヒト生物の細胞の少なくとも一部が、ＲＮＡ分子がＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシングされるようになる核酸配列の変化を有するＲＮＡ分子をコードしているポリヌクレオチド配列を含むゲノムを含み、核酸配列が変化していない同一起源の野生型細胞にはプロセシングが存在しない方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態のＤＮＡ編集剤、ＲＮＡ編集剤、及び任意でドナーオリゴ（又はそれを含む発現ベクター若しくはＲＮＰ複合体）は、それ自体を、又はそれを好適な担体若しくは賦形剤と混合した医薬組成物において、生物に投与することができる。
本明細書で使用するとき、「医薬組成物」とは、本明細書に記載の活性成分のうちの１つ以上と、生理学的に好適な担体及び賦形剤等の他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
本明細書では、用語「活性成分」とは、生物学的効果について説明できるＤＮＡ編集剤及び任意でドナーオリゴを指す。
以下、互換的に使用することができる語句「生理学的に許容し得る担体」及び「薬学的に許容し得る担体」とは、生物に著しい刺激をもたらすことなく、投与された化合物の生物学的活性及び特性を消失させることのない担体又は希釈剤を指す。アジュバントは、これら語句に含まれる。
本明細書では、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及び様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
薬物の処方及び投与に関する技術は、参照により本明細書に援用される“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見出すことができる。
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸内、あるいは筋肉内、皮下、及び髄内への注射に加えて、髄腔内、直接心室内、心臓内、例えば、右若しくは左の心室腔内、共通の冠動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼球内への注射を含む非経口送達を挙げることができる。
中枢神経系（ＣＮＳ）に薬物を送達するための従来のアプローチとしては、神経外科的戦略（例えば、脳内注射又は脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路のうちの１つを利用する試みにおける、剤の分子操作（例えば、内皮細胞表面分子に対して親和性を有する輸送ペプチドを、それ自体はＢＢＢを通過することができない剤と組み合わせて含むキメラ融合タンパク質の生成）；剤の脂質溶解度を高めるために設計された薬理学的戦略（例えば、脂質又はコレステロール担体に水溶性剤をコンジュゲートさせる）；及び高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入又はアンギオテンシンペプチド等の生物学的活性物質の使用から生じる）が挙げられる。しかし、これら戦略はそれぞれ、侵襲的な外科手術に関連する固有のリスク、内因性輸送システムに固有の制約により課されるサイズの制限、ＣＮＳ外で活性になり得るキャリアモチーフで構成されるキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、及びＢＢＢが破壊された脳の領域内での脳損傷のリスクの可能性等の制約を有するので、最適な送達方法にはならない。
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接医薬組成物を注射することを介して、医薬組成物を全身ではなく局所に投与してもよい。
本発明の幾つかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野において周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、封入、捕捉、又は凍結乾燥のプロセスを用いて製造することができる。
従って、本発明の幾つかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、活性成分の薬学的に使用し得る調製物への加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容し得る担体を用いて従来の方法で製剤化してよい。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水性溶液、好ましくは生理学的に適合するバッファ、例えば、ハンクス液、リンゲル液、又は生理的食塩水バッファ中で製剤化してよい。経粘膜投与の場合、浸透するバリアに適切な浸透剤を製剤で使用する。このような浸透剤は、一般的に、当技術分野において公知である。
経口投与の場合、活性化合物を当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって医薬組成物を容易に製剤化することができる。このような担体によって、患者による経口摂取のために、医薬組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤化することが可能になる。経口用途のための薬理学的調製物は、固体の賦形剤を用いて作製することができ、任意で、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠の核を得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、若しくはソルビトールを含む糖類；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム等のセルロース調製物；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理学的に許容し得るポリマー等の充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を添加してもよい。
糖衣錠の核には、好適なコーティングが施される。この目的のために、濃縮された糖液を使用してよく、これは、任意で、１１６イナリガム（ｇｕｍ １１６ｉｎａｌｉ）、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー液、及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有していてよい。識別のため又は異なる組み合わせの活性化合物の用量を特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに色素又は顔料を添加してもよい。
経口的に使用することができる医薬組成物としては、ゼラチンで作製される押し込み型カプセル剤、及びゼラチンとグリセロール又はソルビトール等の可塑剤とで作製される密閉軟カプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び任意で安定剤との混合物中に活性成分を含有し得る。軟カプセル剤では、活性成分を好適な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールに溶解又は懸濁させてもよい。更に、安定剤を添加してもよい。経口投与用の全ての製剤は、選択される投与経路に好適な投薬量でなければならない。
頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤された錠剤又はロゼンジ剤の形態をとり得る。
鼻腔吸入による投与の場合、本発明の幾つかの実施形態に従って使用するための活性成分は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、又は二酸化炭素を使用して、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーで提示される形態で便利に送達される。加圧式エアゾールの場合、定量を送達するための弁を設けることによって、投与単位を決定することができる。化合物の粉末混合物と乳糖又はデンプン等の好適な粉末ベースとを含有する、ディスペンサーで使用するためのゼラチン等のカプセル及びカートリッジを製剤化してもよい。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射用製剤は、任意で、添加される保存剤と共に、例えば、アンプル又は多回投与用容器等の単位剤形で提示され得る。組成物は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルションであってよく、そして、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤等の製剤化用の剤を含有していてもよい。
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性の形態の活性調製物の水溶液を含む。更に、活性成分の懸濁液は、適切な油性又は水ベースの注射用懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド、若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増大させる物質を含有していてもよい。任意で、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤又は活性成分の溶解度を増大させる剤を含有していてもよい。
あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌されたパイロジェンフリー水ベースの溶液で構成するための粉末形態であってよい。
また、本発明の幾つかの実施形態の医薬組成物は、例えば、カカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を用いて、坐剤又は停留浣腸等の直腸組成物に製剤化することもできる。
本発明の幾つかの実施形態の状況で使用するのに好適な医薬組成物としては、意図する目的を達成するのに有効な量の活性成分が含有されている組成物が挙げられる。より具体的には、治療的に有効な量とは、障害（例えば、がん又は感染性疾患）の症状を予防、軽減、又は寛解させたり、治療される被験体の生存期間を延長したりするのに有効な活性成分（例えば、ＤＮＡ編集剤）の量を意味する。
治療的に有効な量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な開示を踏まえて、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法で用いられる任意の調製物について、治療的に有効な量又は用量は、最初にインビトロ及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、所望の濃度又は力価を達成するために、動物モデルにおいて用量を決定することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
がん性疾患の動物モデルについては、例えば、Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．（２０１５）８（Ｓｕｐｐｌ １）：１１５－１１８に記載されている。感染性疾患の動物モデルについては、例えば、Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ：１ ＡＰＲ ２０１１，ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１９００ｓ９３に記載されている。
本明細書に記載の活性成分の毒性及び治療有効性は、インビトロ、細胞培養物、又は実験動物において標準的な薬学的手順によって判定することができる。これらインビトロ及び細胞培養物アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲の決定において用いることができる。投薬量は、使用される剤形及び利用される投与経路に依存して変動し得る。正確な処方、投与経路、及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，１９７５，ｉｎ“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照）。
投薬の量及び間隔は、生物学的効果を誘導又は抑制するのに十分な量の活性成分を提供するために個別に調整することができる（最小有効濃度、ＭＥＣ）。ＭＥＣは各調製物ごとに異なるが、インビトロのデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴及び投与経路に依存する。血漿濃度を求めるためには検出アッセイを用いることができる。
治療される病態の重症度及び応答性に応じて、１回又は複数回の投与が可能であり、治療期間は数日間から数週間、又は治癒するか若しくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、無論、治療される被験体、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断等に依存する。
本発明の幾つかの実施形態の組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得る、ＦＤＡに承認されたキット等のパック又はディスペンサー装置で提示されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属箔又はプラスチック箔を含んでいてよい。パック又はディスペンサー装置には、投与についての説明書を添付してもよい。また、パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用、又は販売を規制している政府機関が定めた形式の通知を容器と共に収容してもよく、この通知は、組成物の形態又はヒト若しくは獣医学的な投与についての政府機関の承認を反映するものである。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局に承認されたラベル又は承認された添付文書であってよい。また、適合する医薬担体に配合された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、更に上に詳述した通り、指定の病態の治療についてのラベルを貼ってもよい。
更に、以下が提供される：
幾つかの実施形態によれば、本明細書で使用するとき、サイレンシングＲＮＡのサイレンシング活性は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合することができるＲＮＡにプロセシングされるサイレンシングＲＮＡによって媒介される。幾つかの実施形態によれば、同定された遺伝子は、そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングがその二次構造に依存し、かつＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合することができるＲＮＡにプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしているサイレンシングＲＮＡ遺伝子をコードしている遺伝子と相同である。
本発明は、更に、同定された遺伝子がコードしているＲＮＡ分子にサイレンシング活性を付与することができる方法の開発にも部分的に基づいている。幾つかの実施形態によれば、同定された遺伝子は、サイレンシングＲＮＡ分子と相同なＲＮＡ分子をコードしている同定された遺伝子エレメントを更に含む。非限定的な例では、このような遺伝子エレメントは、ＲＮＡ分子のイントロン又はＵＴＲをコードしている領域であってよい。
幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性の付与は、同定された遺伝子によってコードされているＲＮＡがＲＩＳＣ結合ＲＮＡにプロセシングされるように、同定された遺伝子にヌクレオチドの変化を導入することを含む。幾つかの実施形態によれば、ヌクレオチドの変化により、相同な標準的ＲＮＡ（ＲＩＳＣ結合ＲＮＡにプロセシング可能である）の二次構造に対応するように、同定された遺伝子によってコードされているＲＮＡの二次構造を変化させることが可能になる。幾つかの実施形態によれば、同定された遺伝子によってコードされているＲＮＡ分子の成熟配列とは、対応する相同な標準的サイレンシングＲＮＡにおける成熟配列と配列位置が対応する配列を指す。
幾つかの実施形態によれば、付与されるサイレンシング活性は、同定された遺伝子によってコードされているサイレンシング機能不全ＲＮＡの成熟配列に対応する配列に対するものである（本明細書では、サイレンシング活性の「再活性化」とも称される）。他の実施形態によれば、付与されるサイレンシング活性は、選択した標的遺伝子に対するものであり、その結果、サイレンシング機能不全ＲＮＡの成熟配列が変化し（本明細書では、サイレンシング活性の「リダイレクション」とも称される）、この場合、他の標的遺伝子は、サイレンシングが付与される細胞に対して内因性であっても外因性であってもよい。理論又は機序に束縛されるものではないが、幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性の再活性化は、（以前のサイレンシング機能不全ＲＮＡ内の成熟配列のターゲティング特異性を維持しながら）同定された遺伝子がサイレンシング活性を有するサイレンシングＲＮＡにプロセシング可能である相同なＲＮＡ分子の二次構造と実質的に等価な二次構造を有するＲＮＡ分子をコードするように、同定された遺伝子にヌクレオチドの変化を導入することによって行われる。幾つかの実施形態によれば、この二次構造の変化により、同定された遺伝子によってコードされているＲＮＡが、ＲＩＳＣと結合することができるサイレンシングＲＮＡにプロセシングされることが可能になる。幾つかの実施形態によれば、例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／０５８２５５号に開示されているように、潜在的にテンプレートの導入と組み合わせて、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用）を通してヌクレオチドの変化が導入される。
幾つかの実施形態によれば、用語「同定された遺伝子」とは、エキソン、イントロン、又はＵＴＲ等であるがこれらに限定されない遺伝子エレメントを更に含む（すなわち、サイレンシング分子にプロセシング可能なＲＮＡと相同なＲＮＡをコードしている同定された配列は、スタンドアロン型の遺伝子ではなくてもよい）。
幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性を有するＲＮＡにプロセシング可能なＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣとの会合によって媒介されるサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にプロセシングされる。幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性を有するＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合することができるＲＮＡ分子である。
幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングがＲＮＡ分子の二次構造に依存するＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子である。
一実施形態によれば、サイレンシング活性を有するＲＮＡにプロセシングされることを可能にする二次構造を有するＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子のＲＮＡ、並びに長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される。
本発明の一態様によれば、本明細書では、細胞内の第１のＲＮＡ分子にサイレンシング活性を導入する方法（本明細書では「サイレンシング活性を導入する方法」とも称される）であって、
（ａ）
ｉ．第１の核酸配列が、当該細胞内で第１のＲＮＡ分子に転写され；
ｉｉ．当該第１のＲＮＡ分子の配列が、配列同一性を除いて、第２のＲＮＡ分子の配列と部分的な相同性を有し、当該第２のＲＮＡ分子が、サイレンシング活性を有する第３のＲＮＡ分子にプロセシング可能であり、当該第２のＲＮＡ分子が、当該細胞内の第２の核酸配列によってコードされており；かつ
ｉｉｉ．当該第１のＲＮＡ分子が、プロセシング不可能であるか又は第２のＲＮＡ分子とは異なってプロセシング可能であり（すなわち、非標準的なプロセシング）、その結果、当該第１のＲＮＡ分子が、当該第３のＲＮＡ分子と同じ性質のサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にはプロセシングされない、
当該細胞内の当該第１の核酸配列を選択することと、
（ｂ）改変された第１のＲＮＡ分子をコードするように当該第１の核酸配列を改変することであって、当該改変された第１のＲＮＡ分子が、当該第２のＲＮＡ分子が当該第３のＲＮＡ分子にプロセシング可能であるのと同様に第４のＲＮＡにプロセシング可能であり、その結果、当該第４のＲＮＡ分子が、当該第３のＲＮＡ分子と同じ性質のサイレンシング活性を有し、それによって、当該第１のＲＮＡ分子にサイレンシング活性を導入することと、
を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態によれば、第２の核酸配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコードしている遺伝子である。幾つかの実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡの前駆体である。
幾つかの実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子とは異なってプロセシング可能である第１のＲＮＡ分子は、第２のＲＮＡ分子に関して標準的なプロセシングを受けない。
幾つかの実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有することを可能にする二次構造を有していないので、サイレンシング活性を有しない。幾つかの実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、第３のＲＮＡ分子に対応するサイレンシング活性を有するＲＮＡサイレンシング分子にプロセシング不可能であるが、その理由は、第１のＲＮＡ分子の二次構造によって、第１のＲＮＡ分子がこのようなサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にプロセシング可能にはならないためである。非限定的な例では、第１のＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ前駆体である第２のＲＮＡ分子と相同であるが、第１のＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有するマイクロＲＮＡへのプロセシングを可能にする二次構造を有していない。
幾つかの実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、第２のＲＮＡ分子とは異なる二次構造を有しており、従って、第１のＲＮＡ分子はプロセシング可能であるが、第２のＲＮＡ分子とは異なってプロセシング可能であり、その結果、第１のＲＮＡ分子は、第３のＲＮＡ分子に対応するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にはプロセシングされない。非限定的な例では、第２のＲＮＡ分子はマイクロＲＮＡの前駆体であるが、第１のＲＮＡ分子の二次構造は第２のＲＮＡ分子の二次構造とは異なるので、第１のＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡに対応するサイレンシング活性を有する低分子ＲＮＡにプロセシング不可能である。
幾つかの実施形態によれば、第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が、サイレンシング活性を有する第４のＲＮＡ分子にプロセシングされることを可能にする二次構造を有するように、配列を改変することを含む。
幾つかの実施形態によれば、第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が第２のＲＮＡ分子と本質的に同じ二次構造を有するように、当該配列を改変することを含み、任意で、二次構造が、第２のＲＮＡ分子の二次構造と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は１００％同一であり、好ましくは、第２のＲＮＡ分子の二次構造と少なくとも９９％、９９．５％、９９．９％、又は１００％同一であるように、配列を改変することを含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
幾つかの実施形態によれば、二次構造は、第２のＲＮＡ分子の二次構造と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は１００％同一である（例えば、第１のＲＮＡ分子の二次構造が線状の紐形態に翻訳され、第２のＲＮＡ分子の二次構造の紐形態と比較された場合）。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、二次構造を一連の紐に翻訳し、それを、ＲＮＡｆｏｌｄ等であるがこれに限定されない別の一連の紐と比較することができる。
幾つかの実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有する第３のＲＮＡ分子にプロセシングされることを可能にする二次構造を有し、第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が第２のＲＮＡ分子と実質的に同じ二次構造を有するように配列を改変することを含む。
幾つかの実施形態によれば、（ｉ）第２のＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有する第３のＲＮＡ分子にプロセシングされることを可能にする二次構造を有し、（ｉｉ）第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が第２のＲＮＡ分子と実質的に同じ二次構造を有するように配列を改変することを含み、（ｉｉｉ）第１の核酸配列の改変は、第３のＲＮＡ分子に対応する位置のヌクレオチドを改変することを除外するので、その結果、サイレンシング活性を有する第４のＲＮＡ分子にプロセシング可能な、改変された第１のＲＮＡ分子が得られる。この実施形態では、それを選択した標的に導くことなく、第１のＲＮＡ分子内のサイレンシング活性を「再活性化」することについて説明する。他の実施形態によれば、（ｉ）第２のＲＮＡ分子は、サイレンシング活性を有する第３のＲＮＡ分子にプロセシングされることを可能にする二次構造を有し、（ｉｉ）第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が第２のＲＮＡ分子と実質的に同じ二次構造を有するように配列を改変することを含み、（ｉｉｉ）第１の核酸配列の改変は、第３のＲＮＡ分子に対応する位置のヌクレオチドを改変することを含み、その結果、第４のＲＮＡ分子は、選択した標的に対するサイレンシング活性を有する。この実施形態では、内因性であっても外因性であってもよい選択した標的にそれを導く、第１のＲＮＡ分子内のサイレンシング活性を「リダイレクト」することについて説明する。
幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性を導入する方法は、第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子の二次構造を、それらのヌクレオチド配列に基づいて予測することを更に含む。幾つかの実施形態によれば、サイレンシング活性を導入する方法は、二次ＲＮＡと本質的に同一になるように第１のＲＮＡの二次構造を変化させるために必要なヌクレオチドの変化を決定することを更に含む。
幾つかの実施形態によれば、第１の核酸配列の改変は、改変された第１のＲＮＡ分子が、ＲＩＳＣとの会合によって媒介されるサイレンシング活性を有する第４のＲＮＡ分子にプロセシング可能であるように、配列を改変することを含む。
幾つかの実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子の配列は、完全な同一性を除いて、第３のＲＮＡ分子をコードしている配列と第１のＲＮＡ分子内の対応する位置の配列との間に少なくとも部分的な相同性が存在するように、第２のＲＮＡ分子の配列に対して部分的な相同性を有する。
一実施形態によれば、第１の核酸分子は、ヒト由来の遺伝子であって、配列番号３５２～３９２のいずれかに記載されている配列を有する遺伝子からなる群から選択される遺伝子である。
本明細書で使用するとき、用語「約」は、±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びこれらの同根語は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。
用語「からなる」とは、「含み、これらに限定される」を意味する。
用語「から本質的になる」とは、追加の成分、工程、及び／又は部品が、請求される組成物、方法、又は構造の基本的かつ新規の特徴を実質的に変化させない場合に限り、組成物、方法、又は構造が追加の成分、工程、及び／又は部品を含んでいてもよいことを意味する。
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含み得る。
この出願全体を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提示する場合がある。範囲形式での記載は、単に便宜のため及び簡略化のためのものであり、そして、本発明の範囲に対する確固たる限定であると解釈されるべきではないことを理解すべきである。従って、範囲の記載は、その範囲内の具体的に開示された全ての可能な部分範囲及び個々の数値を含むとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲の記載は、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の具体的に開示された部分範囲、並びに例えば１、２、３、４、５、及び６等のその範囲内の個々の数字を含むとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書で数値範囲が指定されている場合は常に、指定範囲内の任意の引用されている数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の指定の数と第２の指定の数との「間の範囲である」及び第１の指定の数「から」第２の指定の数「までの範囲である」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１及び第２の指定の数とその間の全ての分数及び整数を含むことを意味する。
本明細書で使用するとき、用語「方法」とは、与えられた課題を達成するための作法、手段、技術、及び手順を指し、化学、薬学、生物学、生化学、及び医学の分野の専門家に知られているか、又は既知の作法、手段、技術、及び手順から容易に開発される作法、手段、技術、及び手順を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「治療する」とは、病態の進行を止める、実質的に阻害する、減速させる、若しくは逆行させる、病態の臨床的若しくは外観的な症状を実質的に寛解させる、又は病態の臨床的若しくは外観的な症状の出現を実質的に防ぐことを含む。
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴が、別個に、又は任意の好適なサブコンビネーションで、又は本発明の任意の他の説明された実施形態において好適に提供される場合もある。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、その要素なしでは実施形態が機能的に無効になる場合を除いて、その実施形態の必須の特徴であるとはみなされるべきではない。
上に描写し、以下の特許請求の範囲で請求する本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。
本願で開示される任意の配列識別番号（配列番号）は、その配列番号がＤＮＡ配列形式又はＲＮＡ配列形式でのみ表現されている場合であっても、その配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれを参照することもできることが理解される。例えば、配列番号１は、ＤＮＡ配列形式で表されているが（例えば、チミンのＴが記載されている）、それは、核酸配列に対応するＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子の核酸配列のＲＮＡ配列のいずれを参照することもできる。同様に、一部の配列はＲＮＡ配列形式で表されているが（例えば、ウラシルのＵが記載されている）、記載されている分子の実際の種類に応じて、ｄｓＲＮＡを構成するＲＮＡ分子の配列又は示されているＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれを参照することもできる。いずれにしても、任意の置換を有する開示されている配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
次に以下の実施例を参照し、上記の説明と合わせて、本発明を非限定的に説明する。
一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学、顕微鏡、及び組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、以下を参照されたい：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献において広く説明されており、例えば、以下を参照されたい：米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらは全て、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により援用される。他の一般的な参考資料は、この文書全体を通して記載されている。その中の手順は、当技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれる情報は全て、参照することにより本明細書に援用される。
一般的な材料及び実験手順
非コードＲＮＡのサイレンシング活性を付与し、リダイレクトするための設計
段階Ａ：ｍｉＲＮＡ様前駆体の同定
図１の工程（Ａ）に示すように、このスキームは、以下のように、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）前駆体、例えば、ｍｉＲＮＡ様前駆体に関連するが同一ではない配列を同定することから始まる：
・ 例えば、シロイヌナズナ、ヒト、及び線虫等の様々な宿主種における潜在的なｍｉＲＮＡ様前駆体を見つけるために、これらの生物の既知のｍｉＲＮＡに由来する配列を用いた。
・ 簡潔に述べると、特定の生物の機能性ｍｉＲＮＡ前駆体及び／又は成熟ｍｉＲＮＡ配列を用いて、対応する宿主ゲノムに対してＢｌａｓｔ検索を行い、機能性ｍｉＲＮＡと類似しているが同一ではない前駆体配列（すなわち、ｍｉＲＮＡ類似配列）を同定した。検索パラメータについては、以下の「候補セットの構築」で更に詳述する。
・ 同定されたｍｉＲＮＡ様配列のうち、各配列がタンパク質をコードしている遺伝子を起源とするか、コードしていない遺伝子を起源とするかを判定した。
・ 以下に詳述するように、ｍｉＲＮＡ様前駆体をコードしている候補遺伝子の初期リストを発現データに従って更にフィルタリングして、サイレンシング活性の再活性化（及び場合によってはリダイレクション）の基礎となり得るｎｃＲＮＡ前駆体を同定した。
段階Ｂ：転写されたｍｉＲＮＡ様分子のフィルタリング
次に、図１の工程（Ｂ）に示すように、スキームは、以下のように、転写されたｎｃＲＮＡ様分子、例えばｍｉＲＮＡ様分子のフィルタリングへと続く。
・ 類似の機能性ｍｉＲＮＡ前駆体の検出を回避するために、幾つかの公に利用可能なｓＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて機能不全前駆体に対するストリンジェントな検索を実施した。
・ 高感度発現検出（発現が遍在性ではない場合）のために、合計１４２の公に利用可能なｓＲＮＡｓｅｑサンプルを利用した。
・ 公に利用可能なリソースから合計１４２個のｓｍａｌｌＲＮＡ－ｓｅｑシーケンシングサンプルを抽出した。ヒトのデータセットには、肝臓からの７サンプル、１８個の血液サンプル、３４個の脳サンプル、２４個の肺サンプル、及び３個の膀胱サンプルが含まれていた。分析に使用したヒトのサンプルは全て健常個体由来であった。線虫のサンプルは、胚（２４サンプル）、若年成体（９サンプル）、Ｌ４（６サンプル）、及び混在した段階から３サンプルと、幾つかの発生段階に由来していた。シロイヌナズナのサンプルは、根（５サンプル）、シュート（２サンプル）、葉（３サンプル）、及び実生（７サンプル）と、植物の様々な部分に由来していた。
・ 特定のシーケンシングプライマーを検出及びトリミングするために、ｆａｓｔｑｃを用いて各ｓＲＮＡｓｅｑサンプルに対してＱＣ分析を行った。各サンプルのアダプター配列を同定し、ｃｕｔａｄａｐｔを用いてトリミングした（Ｍ．Ｍａｒｔｉｎ．Ｃｕｔａｄａｐｔ ｒｅｍｏｖｅｓ ａｄａｐｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ．ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ １７（１）：１０－１２，Ｍａｙ １１）。
・ 全てのｓＲＮＡｓｅｑサンプルを対応する種のゲノムに対してミスマッチなしでアラインメントし、次いで、出力されたｂａｍアラインメントをソートして、プロセシングされないｍｉＲＮＡ様分子を検出した。
段階Ｃ：プロセシングされないｍｉＲＮＡ様分子のフィルタリング
次に、図１の工程（Ｃ）に示すように、また、以下の「発現した候補の検出」及び「発現したプロセシングされない候補の検出」で更に論じるように、このスキームは、プロセシングされないｎｃＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ様分子のフィルタリングへと続き、その結果、発現するが野生型対応物のようにはプロセシングされないｎｃＲＮＡのみが選択される。簡潔に述べると、フィルタリングプロセスは、以下の通りである：
・ 野生型ホモログに対応するサイレンシング機能を有する短いＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ前駆体）を生じさせる候補遺伝子が、試験したゲノムにおいて検出されるのを避けるために、前述のｓＲＮＡｓｅｑサンプルにおいて低分子ＲＮＡ（１９～２４ｎｔ）に対する候補遺伝子のストリンジェントな検索を行った（ｓＲＮＡと候補遺伝子とが完全に一致した場合のみ）。ｓＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ等の前駆体からプロセシングされた成熟サイレンシングＲＮＡの長さであるので、１９～２４ｎｔであった。
・ 典型的には、ｍｉＲＮＡのプロセシングによって、成熟ｍｉＲＮＡ配列を作製する２種類の低分子ＲＮＡ：ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が生成される。図２に示すように、ｓＲＮＡ－ｓｅｑデータを調べると、典型的には、成熟ｍｉＲＮＡの一方の鎖がより多く存在する（図２ではヒトｍｉＲ－１００のガイド配列）が、他方の鎖は、典型的には、細胞内で分解されるため、低レベル又は検出不可能なレベルになる。
・ このように、標準的なサイレンシング活性を有する相同な対応物と同様にプロセシングされる、調べたゲノムにおける候補ｎｃＲＮＡ（この例では、ｍｉＲＮＡ様分子）をフィルタリングして除くことによって、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされないｍｉＲＮＡ様前駆体を選択する。
・ このようにするために、ｎｃＲＮＡホモログの発現パターンを高感度に検出するために、幾つかのｓＲＮＡｓｅｑデータセットを利用した（発現が遍在性ではない場合、すなわち、全ての組織で発現している訳ではない場合）。
段階Ｄ：プロセシングされないｍｉＲＮＡの構造変化の検証
次に、図１の工程（Ｄ）に示すように、このスキームは、以下のように、段階ＣのプロセシングされないｎｃＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡの構造変化の検証へと続く：
・ ｍｉＲＮＡ前駆体及び同定されたプロセシングされないｎｃＲＮＡの二次ＲＮＡ構造を、そのヌクレオチド配列に基づいて予測した。
・ 機能性前駆体と、同じ長さのプロセシングされないｍｉＲＮＡ様分子（すなわち、機能不全ｍｉＲＮＡ）の前駆体との間で比較構造解析を行った。
・ 発現するがプロセシングされないと段階Ｃで同定され、更に標準的なｍｉＲＮＡ構造から変化した構造を示した候補ｍｉＲＮＡ様前駆体を選択した。
・ なお、この検証工程は、二次構造によってそのサイレンシング活性が影響を受けるｎｃＲＮＡのホモログ、例えばｍｉＲＮＡを同定しようとする場合にのみ適切である。
段階Ｅ：候補の構造の復元及びサイレンシング活性の誘導
次に、図１の工程（Ｅ）で示されるように、このスキームは、同定されたｎｃＲＮＡのサイレンシング活性を回復させ、そして、潜在的に選択した標的に向けてリダイレクトすることへと続く。そうするために、ｎｃＲＮＡのサイレンシング活性を回復させるために必要なｎｃＲＮＡ配列におけるヌクレオチド変化を同定した。サイレンシング活性がその二次構造に少なくとも部分的に依存しているサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）との相同性を介して見出されたｎｃＲＮＡについては、サイレンシング活性の回復及び／又はリダイレクションのために必要なヌクレオチドの変化は、相同なサイレンシング分子と対応するようにｎｃＲＮＡの二次構造を回復させるのに必要なものを含んでいた。
サイレンシング活性の回復及び／又はリダイレクションに必要なヌクレオチドの変化は、例えば、本発明者のゲノム編集法を用いて導入することができる。具体的には、国際公開第２０１９／０５８２５５号（参照により本明細書に援用される）に記載されているような、また本明細書において以下に例示されるようなゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）を使用して、必要な変化を導入することができる。これは、ｎｃＲＮＡをコードしている遺伝子を所望の箇所で切断し（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用）、相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を介してそれを保有するＤＮＡドナーを提供することにより、ヌクレオチドの変化を導入することによって行うことができる。簡潔に述べると、これは、以下の通り、フィルタリングされた候補に対して実行することができる：
・ 候補遺伝子が発現する機能不全ｍｉＲＮＡ様前駆体分子の構造を、その配列に基づいて予測する（例えば、図１０Ａ～Ｎ、１１Ａ～Ｊ、及び１２Ａ～Ｉにおけるシロイヌナズナで同定されたｍｉＲＮＡ様遺伝子の予測構造を参照。
・ 候補ｍｉＲＮＡ様ＲＮＡ分子の二次構造を、対応する機能性ｍｉＲＮＡの二次構造と一致させる（それによって、それにサイレンシング活性を導入する）ために必要な配列の変化を決定する。これは、異なる組み合わせのヌクレオチドの変化を繰り返し試験することにより、計算機で行うことができる。なお、変化したヌクレオチドは、対応する機能性ｍｉＲＮＡ分子内の成熟ｍｉＲＮＡの箇所に対応する位置のヌクレオチドを除外していた。
・ 再活性化されたｍｉＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を関心ＲＮＡに向けるために、同定されたｍｉＲＮＡ様ＲＮＡ分子の配列における追加の必要な変化を決定する。これら変化は、対応する機能性ｍｉＲＮＡにおける成熟ｍｉＲＮＡに対応する箇所に存在する（後述の通り）。これら変化により、関心標的に対して強力なｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡの配列が導入される。
・ 必要なヌクレオチドの変化を導入してｍｉＲＮＡ様分子の二次構造を復元し、選択した標的遺伝子をサイレンシングするようにリダイレクトするためには、ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）を用いることができる。上述したように、これは、Ｃａｓ９機構、ｍｉＲＮＡ様遺伝子をコードしている遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡを細胞に導入することによって達成することができる。ドナーＤＮＡは、それを再活性化して選択した標的に導くために望ましい変化を有するｍｉＲＮＡ様遺伝子の配列を含む。国際公開第２０１９／０５８２５５号（参照により本明細書に援用される）に記載されているように、そして本明細書で以下に例示するように、これにより、ＨＤＲの使用を通じて所望の変化を導入することが可能になる。
・ 以下の表１Ａ～Ｂには、（シロイヌナズナで同定された）ｍｉＲＮＡ様遺伝子Ｄｅａｄ＿ｍｉｒ８５９及びＤｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４にサイレンシング活性を導入し、それを、シロイヌナズナのＰＤＳ３遺伝子を標的とするようにリダイレクトするために、上述のようにＧｅｉＧＳで使用することができるドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡの設計が列挙されている。本明細書において以下の実施例２に示すように、これらドナーＤＮＡ及びｓｇＲＮＡを使用することによって得ることができるものに対応するｍｉＲＮＡを使用することによって、サイレンシング活性の再活性化及びリダイレクションが達成された。
Figure 2022524866000006
Figure 2022524866000007
Figure 2022524866000008
Figure 2022524866000009
ゲノム、ゲノムアノテーション、及びｍｉＲＮＡ配列
ヒト、線虫、及びシロイヌナズナの全ての既知の前駆体ｍｉＲＮＡ配列、並びにそれに対応する成熟ガイド及びパッセンジャー配列のリストを、ｍｉＲＢａｓｅ（バージョン２２）［Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００４）３２：Ｄ１０９－Ｄ１１１］からダウンロードした。次に、各種の対応するゲノム及びアノテーションファイルを入手した。線虫については、ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ（ｒｅｌｅａｓｅ－９５）をダウンロードした。ヒトについては、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２（バージョン２９）をｇｅｎｅｃｏｄｅからダウンロードした。シロイヌナズナのゲノムについては、ＴＡＩＲ（バージョン１０）からダウンロードした。
候補セットの構築
上述（段階Ａ）のように、ｍｉＲＮＡ様分子をコードしている候補遺伝子の初期リストを特定するために、既知のｍｉＲＮＡの前駆体及び／又は成熟体の配列を用いて各種の対応するゲノムに対してｂｌａｓｔ検索を行い、その発現パターンについて更に調べた。各候補について、そのゲノム座標に基づいて配列を抽出し、ｂｌａｓｔ検索に従ってそれがマッピングされた既知のｍｉＲＮＡ（複数可）を記録した。対応する既知のｍｉＲＮＡに対する候補のアライメント、並びにガイド配列及びパッセンジャー配列の箇所に基づいて、候補の推定ガイド配列及びパッセンジャー配列を抽出し、対応する既知のｍｉＲＮＡのガイド配列及びパッセンジャー配列に対して異常にプロセシングされたかどうかについてマークした。更に、ゲノムアノテーションファイルを用いて、候補がイントロン領域内に位置するか又はエキソン領域内に位置するかを判定した。
シロイヌナズナ、線虫、及びヒトにおける候補遺伝子のリストを以下の通り作成した。幾つかの実施形態によれば、上記の段階Ａに好適であり、ｓＲＮＡの発現を判定すべきである初期候補遺伝子は、既存のｎｃＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）に対して少なくとも以下の所定の相同性パラメータを有していなければならない：
１． 初期候補遺伝子は、対応するｎｃＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）に対してデフォルトパラメータ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／Ｂｌａｓｔ／ＢＬＡＳＴｏｐｔｉｏｎｓ（ｄｏｔ）ｊｓｐ）を用いたｂｌａｓｔ検索を通して同定されたＲＮＡ分子をコードしており、かつ
２． 初期候補遺伝子は、同一生物由来の野生型ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡ配列の少なくとも５０％をカバーする配列を含む。幾つかの実施形態によれば、この配列は、１９～２４ｎｔ、場合によっては１９～２１ｎｔである。
シロイヌナズナ
ｍｉＲｂａｓｅから得られた既知のシロイヌナズナｍｉＲＮＡの前駆体配列を用いて、デフォルトパラメータ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／Ｂｌａｓｔ／ＢＬＡＳＴｏｐｔｉｏｎｓ（ｄｏｔ）ｊｓｐ）を用いてシロイヌナズナのゲノムに対してｂｌａｓｔ検索を行った。既知のｍｉＲＮＡ遺伝子のゲノム座標と交差するゲノム領域は破棄した。得られた初期候補のセットは、７９５個の異なるゲノム上の位置を含んでいた。各候補を、ｂｌａｓｔ検索で一致したｍｉＲｂａｓｅのｍｉＲＮＡに従って命名した。例えば、ａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４に基づいて同定されたｍｉＲＮＡ様分子は、ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４と命名した。従って、ｍｉＲＮＡ様分子のフルネームは、ａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４－ＭＩ００２６８０４．ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４と命名された。
次に、各候補のｆａｓｔａ配列を取得し、対応するＷＴ ｍｉＲＮＡに対する候補のアライメント（及びＷＴ ｍｉＲＮＡの成熟ガイド配列及び／又はパッセンジャー配列の箇所）に基づいて、その箇所において成熟ｍｉＲＮＡに対応する候補の配列（本明細書では候補の「成熟」配列とも称される）を同定した。更に、対応するゲノムアノテーションファイルを用いて、候補がイントロン領域内に位置するか又はエキソン領域内に位置するかを判定した。
以下の表２は、上述のようにして見出されたシロイヌナズナ候補のリストを提供する。
Figure 2022524866000010
Figure 2022524866000011
Figure 2022524866000012
Figure 2022524866000013
Figure 2022524866000014
Figure 2022524866000015
Figure 2022524866000016
線虫
ｍｉＲｂａｓｅから得られた既知の線虫ｍｉＲＮＡの成熟ガイド配列及び／又はパッセンジャー配列を用いて、線虫のゲノム（１３，９７１マッチ）に対するｂｌａｓｔ検索を行い、そこから既知のｍｉＲＮＡ（１３，５２２マッチ）を全て削除した。成熟ｍｉＲＮＡ配列（潜在的に「ガイド」又は「パッセンジャー」鎖）の少なくとも７０％と一致していた各位置について、野生型（ＷＴ）ｍｉＲＮＡにおけるガイド配列とパッセンジャー配列との間の距離よりも２０％以下長いか又は短い距離内で相補的な配列がゲノムにマッピングされるかどうかを確認した。前述の基準に合致する３８５対が見出され、これら対を含む遺伝子を候補とみなした。次いで、見出された３８５対を含む候補配列のｆａｓｔａ配列（ｆａｓｔａ配列の長さは、各候補と相同な野生型ｍｉＲＮＡの長さに対応する）を抽出し、そのゲノム上の位置を記録し、対応するゲノムアノテーションファイルに基づいて、候補がイントロン領域内にあるか、エキソン領域内にあるかを判定した。
以下の表３は、上述のようにして見出された線虫候補のリストを提供する。
Figure 2022524866000017
Figure 2022524866000018
Figure 2022524866000019
ヒト
初期候補のリストを作成するために、ｍｉＲｂａｓｅから得られた全ての既知のヒトｍｉＲＮＡ前駆体のリストをヒトゲノムに対してブラストした。その結果、８５，３９９箇所の候補位置のリストが得られ、そこから既知のｍｉＲＮＡ及び未同定のゲノム領域にマッピングされたケースを全て削除したところ、７３，３４０箇所の初期候補が残った。次に、全ての既知のヒトｍｉＲＮＡの成熟ガイド配列及びパッセンジャー配列をヒトゲノムにマッピングした。成熟配列が初期候補リストにおける箇所のいずれかに少なくとも５０％の配列類似性でマッピングされた場合、それを候補とみなした。最終的な候補リストは、５４０６候補からなっていた。次に、ＷＴ ｍｉＲＮＡにおける成熟ｍｉＲＮＡの位置が候補における同定された配列の位置に対応するように、各候補の配列を、最初に一致したＷＴ ｍｉＲＮＡの長さに合わせて伸ばした。最後に、各最終候補のｆａｓｔａ配列を抽出し、その成熟配列（複数可）の位置を、それに従って最初に得られたｍｉＲｂａｓｅ ｍｉＲＮＡにおける成熟配列の位置に基づいてマークした。更に、対応するゲノムアノテーションファイルを用いて、候補がイントロン領域内に位置するか又はエキソン領域内に位置するかを判定した。
表４は、上述のようにして見出されたヒト候補のリストを提供する。
Figure 2022524866000020
Figure 2022524866000021
Figure 2022524866000022
Figure 2022524866000023
Figure 2022524866000024
Figure 2022524866000025
発現した候補の検出
発現した候補を同定するために、ＩｎｔｅｒｓｅｃｔＢｅｄソフトウェアをストランド方式で使用して、各候補のゲノム座標と関連する生物からのｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑサンプルの全てとの間の重複を決定し、各候補遺伝子内の各ゲノム上の位置に一致したｓｍａｌｌＲＮＡリードの数を記録した。次いで、以下の式を用いて、生のリードカウントをＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ）に対して正規化した。
Figure 2022524866000026
（式中、Ｘｉ＝遺伝子ｉにマッピングされたリードの数、ｌｉ＝遺伝子ｉの長さ、及びＮ＝マッピングされたリードの総数である。）
同じゲノム上の位置に少なくとも１０個のリードが存在していた候補を、発現したとみなした。また、各対応するＷＴ ｍｉＲＮＡの発現も全く同じ方法で判定した。
発現した候補を同定するために、候補又は対応する既知のＷＴ ｍｉＲＮＡのゲノム上の位置と完全に一致した１９～２４ｂｐ及び≧１９ｂｐの長さのｓｍａｌｌＲＮＡ－ｓｅｑリードの数を記録した。全てのｓｍａｌｌＲＮＡ－ｓｅｑサンプルが候補及びその対応する既知のｍｉＲＮＡの全てにマッピングされたら、それぞれのゲノム上の位置に沿ったカバレッジプロットを作成し、分析した。前述のように、この分析後、発現した候補のみを選択した。
発現したプロセシングされない候補の検出
典型的には、上述の分析を用いると、標準的な様式でプロセシングされるｍｉＲＮＡは、成熟ガイド配列及び／又はパッセンジャー配列の長さ（典型的には、２１～２２ｂｐ長）と一致するｓｍａｌｌＲＮＡリードのピークを２つとはいかなくとも、少なくとも１つ有しており、従って、プロセシングされないｍｉＲＮＡを同定するために、各候補のｓｍａｌｌＲＮＡ発現プロットを調べ、標準的なｍｉＲＮＡと同様の発現パターンを示す（つまり、サイレンシングｍｉＲＮＡとしてプロセシングされるので、サイレンシングの再活性化／リダイレクションに使用することができない）かどうか又はプロセシングされない（つまり、野生型ｍｉＲＮＡとは異なる発現パターンを示す）かどうかを判定した。
図１３Ａ～Ｈは、例えば、野生型ｍｉＲＮＡであるｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５（ＭＩ００１９０６６）、及びその対応するｍｉＲＮＡ様遺伝子である場合のｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９のｓＲＮＡ発現を示す。図１３Ａは、２１ｂｐ長のリードに対して、胚におけるｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５のｓｍａｌｌＲＮＡｓｅｑ発現プロットを示す。ｘ軸は、５’→３’配向における前駆体配列のゲノム上の位置（ｃｈｒＩ、フォワード鎖における位置１１８８５５９６と１１８８５７０６の間）を示し、ｙ軸は、ＲＰＫＭでの発現値を意味する。下方のプロットは、ｍｉＲｂａｓｅに従って定義された成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置をマークしている。３’ｍｉＲＮＡは、３ｐ成熟ｍｉＲＮＡをマークするｘ軸方向の位置に沿って黒いバーでマークされており、５’ｍｉＲＮＡは、５ｐ成熟ｍｉＲＮＡを示すｘ軸方向の位置に沿って白いバーでマークされている。下方のプロットのレジェンドは、ｍｉＲｂａｓｅによる成熟ｍｉＲＮＡの長さを示す。プロセシングされるｍｉＲＮＡは、発現したｓｍａｌｌＲＮＡの箇所が成熟ｍｉＲＮＡの位置とアラインメントされる発現パターンを示す。図１３Ｃ及び図１３Ｄにおける成熟ｍｉＲＮＡの箇所及びｍｉＲＮＡの位置を見ることによって、ｃｅｌ－ｍｉｒ－５５４５がプロセシングを受けると判定することができる。同様に、図１３Ｆ及び図１３Ｇは、その推定前駆体配列のゲノム上の位置に沿って、ｍｉｒ－ｌｉｋｅ ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９のｓｍａｌｌＲＮＡの発現を示す。黒及び白のバーは、その成熟ｍｉＲＮＡの箇所を表し、上方のプロットは、発現パターンが成熟ｍｉＲＮＡの位置に位置するのではなく、ｍｉｒ様前駆体配列の中央部分に沿って位置することを示す。このように、ｃｅｌ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ２１９は発現するが、対応する野生型ｍｉＲＮＡのようにはプロセシングされないことが明らかに示される。
図１０Ａ～Ｎは、シロイヌナズナのｍｉＲＮＡ様候補遺伝子ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４（上述のように同定されたｍｉＲＮＡ様分子をコードしている、図１０Ｈ～Ｍ）及びその対応する野生型ｍｉＲＮＡであるａｔｈ－ｍｉｒ－８１７４（図１０Ａ～Ｆ）に対する、シュート及び根の組織からの様々なサイズのｓｍａｌｌＲＮＡの分布を示す。分かるように、野生型ｍｉＲＮＡのプロットは、ｓｍａｌｌＲＮＡの発現（各プロットの上方のグラフ）は、ｍｉＲＮＡの成熟配列のゲノム上の位置（各プロットの下方のグラフ）に対応しているが、ａｔｈ＿ｄｅａｄ＿ｍｉｒ１３３４に対応するｓＲＮＡは、その「成熟」配列があるはずのゲノム上の位置と交差していないことを示す。配列に基づいて予測されるＲＮＡの二次構造の分析は、当技術分野において公知であるように、野生型ｍｉＲＮＡの前駆体は標準的なｍｉＲＮＡのように折り畳まれるが（図１０Ｇ）、ｍｉＲＮＡ様遺伝子からのＲＮＡはそうではない（図１０Ｎ）ことを示し、更に、その野生型対応物に相当するサイレンシング活性を有しないことが確認された。図１０Ｇでは、成熟ｍｉＲＮＡのガイド鎖が灰色で強調されており、ｍｉＲＮＡ様候補のＲＮＡ「前駆体」の対応する配列は図１０Ｎで強調されている。
ｍｉＲＮＡ様遺伝子は発現するが、対応物である野生型ｍｉＲＮＡのようにはプロセシングされないことを示す、図１１Ａ～Ｊ及び図１２Ａ～Ｉはシロイヌナズナ、図１３Ａ～Ｈ、１４Ａ～Ｈ、及び１５Ａ～Ｈは線虫、並びに図１６Ａ～Ｊ、１７Ａ～Ｊ、及び１８Ａ～Ｅはヒトに由来する他のｍｉＲＮＡ様遺伝子について同様の分析を提示する。図１９Ａ～Ｇは、線虫由来の標準的な野生型ｍｉＲＮＡの発現解析を提示し、図１９Ｈは、野生型ｍｉＲＮＡ ｃｅｌ－ｍｉｒ－７１の予測ＲＮＡ二次構造を示す。
ｓｉＲＮＡの設計
標的特異的ｓｉＲＮＡは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの「ＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ」及びＩｎｖｉｖｏｇｅｎの「Ｆｉｎｄ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」等、公に利用可能なｓｉＲＮＡデザイナーによって設計される。
ｓｇＲＮＡの設計
上述したように、ｍｉＲＮＡ様分子をコードしている遺伝子等、同定された候補遺伝子（発現するが、対応する野生型サイレンシング分子のようにはプロセシングされないｎｃＲＮＡをコードしている）のサイレンシング活性は、遺伝子配列にヌクレオチドの変化を導入することによって再活性化（及び場合によっては、リダイレクト）することができる。必要なヌクレオチドの変化は、ＧＥｉＧＳ技術を用いて導入することができる。そうするためには、Ｃａｓ９等のエンドヌクレアーゼを、所望のヌクレオチドの変化を有する候補遺伝子の関連配列をコードしているドナーＤＮＡ分子と共に細胞に導入する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、更に細胞に導入されたｓｇＲＮＡの配列に基づいて、細胞内の候補遺伝子の配列を切断する。ｓｇＲＮＡは、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，（２０１５）３１（２４）：４０１４－４０１６に既に記載されているように、公に利用可能なｓｇＲＮＡデザイナーを用いて、ｍｉＲＮＡ様分子をコードしている内因性候補遺伝子を標的とするように設計される。各カセットにつき２つのｓｇＲＮＡを設計し、細胞１つあたり１つのｓｇＲＮＡを発現させて、導入されたドナーＤＮＡとの遺伝子交換を開始させる。ｓｇＲＮＡは、交換後に改変されることを意図するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ様配列に対応する。
効率的なｓｇＲＮＡの選択の機会を最大化するために、２つ以上の異なる公に利用可能なアルゴリズム（ＣＲＩＳＰＥＲ Ｄｅｓｉｇｎ：ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃｒｉｓｐｒ（ｄｏｔ）ｍｉｔ（ｄｏｔ）ｅｄｕ：８０７９／及びＣＨＯＰＣＨＯＰ：ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃｈｏｐｃｈｏｐ（ｄｏｔ）ｃｂｕ（ｄｏｔ）ｕｉｂ（ｄｏｔ）ｎｏ／）を使用し、各アルゴリズムから上位のスコアのｓｇＲＮＡを選択する。
交換ｓｓＤＮＡオリゴの設計
ＧＥｉＧＳで使用されるＤＮＡドナーを設計するには、上述のように、まずＧＥｉＧＳ－オリゴを設計する。ｍｉＲＮＡ様候補遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に基づいて、４００ｎｔのｓｓＤＮＡ（１００～１０００ｂｐのサイズ）のオリゴを設計する。標的遺伝子のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ様配列をドナーオリゴの中央に配置し（サイレンシング活性を再活性化／リダイレクトするための所望のヌクレオチド変化を含む）、ガイド（サイレンシング）ｓｉＲＮＡ鎖が標的に対して７０～１００％の相補性を維持するように、候補遺伝子の成熟様ｍｉＲＮＡ配列を選択した標的に対する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列で置換する（本明細書に記載の通り、サイレンシング特異性を再活性化又はリダイレクトするように改変するために、標的遺伝子のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ様配列に沿って追加のヌクレオチド変化を導入してよい）。パッセンジャーｓｉＲＮＡ鎖の配列は、同じ塩基対合プロファイルを維持するために、元のｍｉＲＮＡの構造を維持するように改変される。
交換プラスミドＤＮＡの設計
ｍｉＲＮＡ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に基づいて、４０００ｂｐ（２００～４０００ｂｐの範囲）のｄｓＤＮＡ断片を設計する。ＧＥｉＧＳ－ｏｌｉｇｏは、上記の通り、ｄｓＤＮＡ断片の中央に位置している。この断片を標準的なベクター（例えば、蛍光マーカーを含むか又は含まないＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にクローニングし、Ｃａｓ９システムの構成要素を用いて細胞にトランスフェクトする。
リダイレクトされたｎｃＲＮＡの可能性のある標的遺伝子
上記ｎｃＲＮＡは、例えば、以下を標的とするｓｉＲＮＡに改変される：
・ シロイヌナズナ宿主：ＴｕＭＶ、ルシフェラーゼ（標的及び対照）
・ ヒト宿主：ＨＩＶ、ルシフェラーゼ（標的及び対照）
・ 線虫宿主：ＵＮＣ－２２、ルシフェラーゼ（標的及び対照）
（後述の表５で論じる通り）
Figure 2022524866000027
ＧＥｉＧＳテンプレートを作製するための計算パイプライン
計算ＧＥｉＧＳパイプラインは、生物学的メタデータを適用し、非コードＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子）を最小限編集して、新たに機能を獲得させる、すなわち、関心配列を標的とするようにそのサイレンシング能力をリダイレクトさせるために使用されるＧＥｉＧＳ ＤＮＡテンプレートを自動生成することを可能にする。
図４に示すように、パイプラインは、ａ）ＧＥｉＧＳによってサイレンシングされる標的配列、ｂ）遺伝子編集され、ＧＥｉＧＳを発現する宿主生物、ｃ）ＧＥｉＧＳを遍在的に発現させるかどうかを選択できる、という入力項目を記入し、送信することから始まる。特定のＧＥｉＧＳの発現が必要な場合、幾つかの選択肢（特定の組織、発生段階、ストレス、熱／寒冷ショック等に特異的な発現）から選択することができる。
必要な入力項目が全て送信されると、計算プロセスは、ｍｉＲＮＡ（又は他の非コードＲＮＡ）のデータセット（例えば、低分子ＲＮＡシーケンシング、マイクロアレイ等）を検索し、入力条件に一致する関連ｍｉＲＮＡのみをフィルタリングすることを始める。次に、選択した成熟ｍｉＲＮＡの配列を標的配列に対してアラインメントし、相補性レベルの最も高いｍｉＲＮＡをフィルタリングする。次いで、これら天然に標的相補的な成熟ｍｉＲＮＡの配列を、標的の配列と完全に一致するように改変する。次いで、改変された成熟ｍｉＲＮＡ配列を、ｓｉＲＮＡの効力を予測するアルゴリズムにかけ、サイレンシングスコアが最も高い上位２０個をフィルタリングする。次いで、これら最終的な改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子を使用して、以下の通り、２００～５００ｎｔのｓｓＤＮＡ又は２５０～５０００ｎｔのｄｓＤＮＡの配列を生成する：
改変されたｍｉＲＮＡに隣接するゲノムＤＮＡ配列に基づいて、２００～５００ｎｔのｓｓＤＮＡオリゴ及び２５０～５０００ｎｔのｄｓＤＮＡ断片を設計する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列が、オリゴの中央に位置する。改変されたｍｉＲＮＡのガイド鎖（サイレンシング）配列は、標的に対して１００％相補的である。しかし、改変されたパッセンジャーｍｉＲＮＡ鎖の配列は、同じ塩基対合プロファイルを維持するために、元の（改変されていない）ｍｉＲＮＡの構造を保持するように更に改変される。
次に、改変された交換バージョンではなく、改変されていない元のｍｉＲＮＡ遺伝子を特異的に標的とするように、差分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ｓｇＲＮＡを設計する。最後に、改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子との間で比較制限酵素部位分析を行い、差分の制限部位をまとめる。
従って、パイプラインの出力は、以下を含む：
ａ）最小限しか改変されていないｍｉＲＮＡを有する２００～５００ｎｔのｓｓＤＮＡオリゴ又は２５０～５０００ｎｔのｄｓＤＮＡ断片配列
ｂ）元のｍｉＲＮＡ遺伝子を特異的に標的とし、改変されたｍｉＲＮＡは標的としない２～３個の差分ｓｇＲＮＡ
ｃ）改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子との間の差分制限酵素部位のリスト。
配列
標的（「Ｌｕｃ－センサーベクター」で使用される）：
１． Ｄｅａｄ／Ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ＿８５９ － 配列番号６及び９
ＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡＣＣＣＡＴ
２． Ｄｅａｄ／Ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ＿１３３４ － 配列番号２０及び２３
ＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＣＣＴＡＴＡＣＡＣＡＴ
３． ＷＴ＿Ａｃｔｉｖｅ＿４０５ａ － 配列番号３
ＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＡＴ
４． ＷＴ＿Ａｃｔｉｖｅ＿８１７４ － 配列番号１７
ＧＡＴＴＡＧＣＴＴＣＣＣＴＡＴＡＣＡＣＡＴ
５． Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ＿８５９ － 配列番号１２
ＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴ
６． Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ＿１３３４ － 配列番号２６
ＣＣＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴＡ
「ＧＥｉＧＳ－オリゴ」（「ＧＥｉＧＳ－オリゴ」ベクターで使用）
１． ｍｉＲ４０５ａ＿Ａｃｔｉｖｅ － 配列番号１
ＴＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＡＡＣＴＣＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＴＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＴＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＣＡＴＴＴＡ
２． ｍｉＲ８１７４＿Ａｃｔｉｖｅ － 配列番号１５
ＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＴＣＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＧＴＡＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＧＧＴＴＧ
３． ｍｉＲ８５９＿Ｄｅａｄ － 配列番号４
ＴＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＡＡＡＴＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＴＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＴＴＣＧＧＴＣＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＴＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡ
４． ｍｉＲ１３３４＿Ｄｅａｄ － 配列番号１８
ＡＴＴＣＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＴＡＣＧＴＴＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＧＧＡＣＴＡＧＡＴＴＧＴＣＣＧＡＡＴＴＡＣＴＣＡＴＧＴＧＴＡＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＣＧＴＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＡ
５． ｍｉＲ８５９＿ Ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ － 配列番号７
ＣＣＡＧＡＴＴＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡａｔｇｇｇｔｔｃｇｇｔｃａａｃｃｃａｔａａｃｔｃＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＴＣＡ
６． ｍｉＲ１３３４＿Ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ － 配列番号２１
ＴＣＡＣＧＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴａｔｇｔｇｔａｔａｇｇｇａａｇｃｔａａｔｃＧＴＣＣＣＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＧＡ
７． ｍｉＲ８５９＿Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ － 配列番号１０
ＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＧＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡａｔｇａａａａｔｔｔｔｇａｔｔｔａｃｇａａｔｔｇＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＡＧＧＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＡＧＣＣＡＧＴＴＡ
８． ｍｉＲ１３３４＿Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ － 配列番号２４
ＡＴＧＴＧＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＴＧＴＴＡＴＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＣＧＡＡＧＧＧＣＴＡＴＡＴＣＧＡＣＣＴＡＧＧＴＡＣＴＴｔａｔａｔｇａａｃａｔｔａａｔａａｃｔｇｇＣＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＴＧＴ
ｍｉＲＮＡオリゴを増幅させるためのＰＣＲ
インフュージョンクローニングに適合する末端を導入するために、Ｇｅｎｅｗｉｚから注文した合成テンプレートからｍｉＲＮＡオリゴを増幅させた。ＣｌｏｎｅＡｍｐ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を製造業者の指示書に従って使用した。
Ｆｗオリゴプライマーにおいて付加するため：５’ＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＧ（配列番号２９）
Ｒｅｖ標的プライマーにおいて付加するため：５’ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ（配列番号３０）
各ＰＣＲ反応には、Ｈ２Ｏを含む陰性対照（テンプレートなし）が含まれていた。
Figure 2022524866000028
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにロードし、製造業者の指示書に従ってＭｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて特異的なＰＣＲバンドを切り出し、精製した。
Figure 2022524866000029
アニーリングされたターゲットの多重クローニング部位標的へのクローニング
Ｌｕｃ－センサーベクターをＸｍａＩ及びＨｐａＩで制限酵素消化した。
Figure 2022524866000030
３７℃で４時間インキュベートした。
この体積を０．８％アガロースゲルで泳動し、製造業者の指示書に従ってＭｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、制限酵素処理されたバンドを精製した。
アニーリングされた標的オリゴの、ＸｍａＩ及びＨｐａＩで制限酵素処理されたＬｕｃセンサーベクターへのインフュージョンクローニング。
製造業者の指示書に従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて、アニーリングされた標的をＬｕｃ－センサーベクターの制限酵素処理されたＭＣＳにクローニングした。製造業者の指示書に従って、最終的なプラスミドをＳｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）に形質転換し、選択のためにＬＢカルベニシリン寒天プレート上に細胞をプレーティングし、３７℃で一晩成長させるためにインキュベートした。各反応から得られた３つのクローンについて培養を開始し、製造業者の指示書に従ってＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。サンガーシーケンシングによって、クローニングされたＤＮＡ配列を確認した。Ｓｎａｐｇｅｎｅソフトウェアを使用してシーケンシングの結果を解析した。
トランスフェクションに必要な量のベクターは、製造業者の指示書に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて入手した。
ＧＥｉＧＳオリゴの多重クローニング部位ＧＥｉＧＳオリゴへのクローニング
Ｌｕｃ－センサーベクターをＮｈｅＩ及びＸｂａＩで制限酵素消化した。
Figure 2022524866000031
３７℃で４時間インキュベートした。
この体積を０．８％アガロースゲルで泳動し、製造業者の指示書に従ってＭｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、制限酵素処理されたバンドを精製した。
ＧＥｉＧＳ－オリゴの、ＮｈｅＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理されたＧＥｉＧＳ－オリゴベクターへのインフュージョンクローニング。
製造業者の指示書に従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて、精製したＰＣＲ産物をＧＥｉＧＳ－オリゴベクターの制限酵素処理されたＭＣＳにクローニングした。
製造業者の指示書指示書に従って、最終的なプラスミドをＳｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）に形質転換し、選択のためにＬＢカルベニシリン寒天プレート上に細胞をプレーティングし、３７℃で一晩成長させるためにインキュベートした。各反応から得られた３つのクローンについて培養を開始し、製造業者の指示書に従ってＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。サンガーシーケンシングによって、クローニングされたＤＮＡ配列を確認した。Ｓｎａｐｇｅｎｅソフトウェアを使用してシーケンシングの結果を解析した。
トランスフェクションに必要な量のベクターは、製造業者の指示書に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて入手した。
プロトプラストの単離
植物材料（例えば、葉、カルス、細胞懸濁液）を消化溶液（１％セルラーゼ、０．３％マセロザイム、０．４Ｍマンニトール、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）中で、室温で穏やかに振盪しながら４～２４時間インキュベートすることにより、シロイヌナズナ（生態型Ｃｏｌ－０）のプロトプラストを単離した。消化後、残った植物材料をＷ５溶液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）で洗浄し、プロトプラスト懸濁液を４０μｍストレーナーで濾過した。室温において８０ｇで３分間遠心分離した後、プロトプラストを２ｍＬのＷ５バッファに再懸濁させ、氷中で重力により沈殿させた。最終的なプロトプラストペレットを２ｍＬのＭＭｇ（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁させ、血球計を用いてプロトプラスト濃度を測定した。トリパンブルー染色を用いてプロトプラストの生存率を推定した。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介したプラスミドのトランスフェクション
Ｗａｎｇによって報告された戦略［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ（２０１５）１９１：ｐ．８２－８９］の修正版を用いて、プロトプラストのＰＥＧトランスフェクションを行った。２～５×１０６個のプロトプラスト／ｍＬの密度でプロトプラストをＭＭｇ溶液に再懸濁させた。１００～２００μＬのプロトプラスト懸濁液を、プラスミドを含むチューブに添加した。プラスミド：プロトプラスト比は形質転換効率に大きく影響するため、プロトプラスト懸濁液中のプラスミド濃度を５～３００μｇ／μＬの範囲でアッセイした。ＰＥＧ溶液（１００～２００μＬ）を混合物に添加し、１０～６０分間の範囲の様々な時間にわたって２３℃でインキュベートした。ＰＥＧ４０００の濃度を最適化し、２００～４００ｍＭのマンニトール、１００～５００ｍＭのＣａＣｌ２溶液中２０～８０％の範囲のＰＥＧ４０００をアッセイした。次いで、プロトプラストをＷ５で洗浄し、８０ｇで３分間遠心分離した後、１ｍＬのＷ５に再懸濁させ、２３℃において暗所でインキュベートした。２４～７２時間培養した後、顕微鏡によって蛍光を検出した。
再活性化実験のためのＰＥＧトランスフェクション
Ｌｕｃ－センサーベクター：ＧＥｉＧＳ－オリゴベクターのモル比は１：４であった。これは、１回のトランスフェクションにつき５μｇのＬｕｃセンサーベクター及び約２０．５μｇのＧＥｉＧＳ－オリゴベクターとなる。
Figure 2022524866000032
全ての実験条件につき独立した３回の実験でトランスフェクションを行った。
リダイレクション実験のためのＰＥＧトランスフェクション
Ｌｕｃ－センサーベクター：ＧＥｉＧＳ－オリゴベクターのモル比は１：４であった。これは、１回のトランスフェクションにつき５μｇのＬｕｃセンサーベクター及び約２０．５μｇのＧＥｉＧＳ－オリゴベクターとなる。
Figure 2022524866000033
全ての実験条件にとき独立した３回の実験でトランスフェクションを行った。
ボンバードメント及び植物の再生
シロイヌナズナの根の調製
塩素ガスで滅菌したシロイヌナズナ（ｃｖ．Ｃｏｌ－０）の種子をＭＳマイナススクロースプレートに播種し、４℃において暗所で３日間春化処理した後、恒明下において２５℃で垂直に発芽させた。２週間後、根を１ｃｍの根の断片に切り取り、カルス誘導培地（ＣＩＭ：Ｂ５ビタミンを含む１／２ＭＳ、２％グルコース、ｐＨ５．７、０．８％寒天、２ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ、０．０５ｍｇ／Ｌカイネチン）プレート上に置いた。２５℃において暗所で６日間インキュベートした後、根の断片を濾紙ディスクに移し、ボンバードメントの準備において、ＣＩＭＭプレート（ビタミンを含まない１／２ＭＳ、２％グルコース、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５．７、及び０．８％寒天）上に４～６時間置いた。
ボンバードメント
ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＃１６５２２５７）を介してプラスミドコンストラクトを根の組織に導入するが、この手順を実行するためには、以下に概説する幾つかの予備段階が必要である。
金ストックの調製
０．６μｍの金（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；Ｃａｔ：１６５２２６２）４０ｍｇを１００％エタノール１ｍＬと混合し、パルス遠心分離してペレット化し、エタノールを除去する。この洗浄手順を更に２回繰り返す。
洗浄後、ペレットを１ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁させ、５０μＬのアリコート作業量で１．５ｍＬチューブに分注する。
ビーズの調製
簡潔に述べると、以下の通り実施する：
２枚のプレートのシロイヌナズナの根に衝撃を与えるには１本のチューブの金で十分であるので（プレート１枚あたり２ショット）、各チューブを４枚の（１，１００ｐｓｉ）Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｒｕｐｔｕｒｅディスク（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ：１６５２３２９）に分配する。
同一サンプルの複数枚のプレートを必要とするボンバードメントでは、サンプルの一貫性を維持し、全体的な調製を最小限にするために、チューブを合わせ、ＤＮＡ及びＣａＣｌ２／スペルミジン混合物の体積を適宜調整する。
以下のプロトコールは、金のチューブ１本を調製するプロセスを要約したものであり、これらは、使用する金のチューブの数に応じて調整しなければならない。
この後のプロセスは全て、エッペンドルフ製のサーモミキサーにおいて４℃で行う。
プラスミドＤＮＡサンプルを調製し、１１μｇのＤＮＡを含む各チューブに１０００ｎｇ／μＬの濃度で添加する。
１）４９３μＬのｄｄＨ２Ｏを１アリコート（７μＬ）のスペルミジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓ０２６６）に添加し、最終濃度を０．１Ｍスペルミジンとする。１２５０μＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２をスペルミジン混合物に添加し、ボルテックスし、氷上に置く。
２）予め調製しておいた金のチューブをサーモミキサーに入れ、１４００ｒｐｍの速度で回転させる。
３）１１μＬのＤＮＡをチューブに添加し、ボルテックスし、回転しているサーモミキサーに戻す。
４）ＤＮＡ／金粒子を結合させるために、７０μＬのスペルミジンＣａＣｌ２混合物を（サーモミキサー内の）各チューブに添加する。
５）チューブを１５～３０秒間激しくボルテックスし、約７０～８０秒間氷上に置く。
６）混合物を７０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、氷上に置く。
７）５００μＬの１００％エタノールを各チューブに添加し、ピペッティングによってペレットを再懸濁させ、ボルテックスする。
８）チューブを７０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
９）上清を除去し、ペレットを５０μＬの１００％エタノールに再懸濁させ、氷上で保存する。
マクロキャリアの調製
以下は、層流キャビネット内で行う：
１）マクロキャリア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；１６５２３３５）、ストッピングスクリーン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；１６５２３３６）、及びマクロキャリアディスクホルダーを滅菌し、乾燥させる。
２）マクロキャリアを、マクロキャリアディスクホルダーに平らに入れる。
３）ＤＮＡでコーティングした金の混合物をボルテックスし、各Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｒｕｐｔｕｒｅディスクの中央に広げる（５μＬ）。
エタノールを蒸発させる。
ＰＤＳ－１０００（ヘリウム粒子送達系）
簡潔に述べると、以下を実施する：
ヘリウムボトルの制御弁を、少なくとも１３００ｐｓｉの入力圧力に調整する。ｖａｃ／ｖｅｎｔ／ｈｏｌｄスイッチを押し、ｆｉｒｅスイッチを３秒間押し続けることによって、真空を作り出す。これにより、ヘリウムが配管内に確実に流れ出るようになった。
１１００ｐｓｉのラプチャーディスクをイソプロパノールに入れ、混合して、静電気を除去する。
１）ラプチャーディスク１枚をディスク保持キャップに入れる。
２）マイクロキャリアローンチアセンブリを構築する（ストッピングスクリーン及び金を含有するマイクロキャリアを用いて）。
３）ペトリ皿のシロイヌナズナの根のカルスをローンチアセンブリの６ｃｍ下方に置く。
４）真空圧を２７インチＨｇ（水銀）に設定し、ヘリウム弁を開く（約１１００ｐｓｉ）。
５）真空を解除し、マイクロキャリアローンチアセンブリ及びラプチャーディスク保持キャップを取り外す。
６）同じ組織に対してボンバードメントを行う（すなわち、各プレートに２回ボンバードメントを行う）。
７）その後、ボンバーメントされた根を、２５℃において暗所で更に２４時間ＣＩＭプレート上に置く。
同時ボンバードメント
ＧＥｉＧＳプラスミドの組み合わせをボンバードメントする場合、５μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）のｓｇＲＮＡプラスミドを８．５μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）の交換プラスミド（例えば、ＤＯＮＯＲ）と混合し、この混合物１１μＬをサンプルに添加する。より多くのＧＥｉＧＳプラスミドを同時にボンバードメントする場合は、使用するｓｇＲＮＡプラスミドの交換プラスミド（例えば、ＤＯＮＯＲ）に対する濃度比を１：１．７とし、この混合物１１μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）をサンプルに添加する。ＧＥｉＧＳ交換に関連しないプラスミドと同時ボンバードメントする場合は、等比で混合し、その混合物のうちの１１μｇ（１０００ｎｇ／μＬ）を各サンプルに添加する。
プロトプラストの顕微鏡観察
トランスフェクション効率を定性的にアッセイするために、トランスフェクションの４８時間後にＬｅｉｃａ ＤＭ６０００蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質（ＦＰ及びＦＰ２）の蛍光を可視化した。
トランスフェクションされたプロトプラストに対するルシフェラーゼアッセイ及び細胞分析
プラスミド送達の２４～７２時間後に細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ培地に再懸濁させた。溶液の半分をルシフェラーゼ活性の分析に用い、もう半分を低分子ＲＮＡシーケンシングについて分析した。製造業者の指示書に従ってＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、二重ルシフェラーゼアッセイの分析を実施した。製造業者の指示書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎａｄａ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。これらサンプル中の所望の成熟低分子ＲＮＡを同定するために、低分子ＲＮＡシーケンシングを行った。
植物の再生
シュートの再生には、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓら［Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（１９８８）８５（１５）：５５３６－５５４０］のプロトコールの修正版を実行する。ボンバードメントした根を、ビタミンＢ５を含む１／２ＭＳ、２％グルコース、ｐＨ５．７、０．８％寒天、５ｍｇ／Ｌ ２ｉＰ、０．１５ｍｇ／Ｌ ＩＡＡを含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）プレート上に置く。２５℃で１６時間明－２３℃で８時間暗のサイクルでプレートを放置する。１０日後、プレートを３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレートに１週間移し、次いで、新たな同様のプレートに移す。植物が再生したら、根から切り離し、分析するまで、３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレート上に置く。
ジェノタイピング
組織サンプルを処理し、Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｆ－１３０ＷＨ）を用いて製造業者の推奨に従ってアンプリコンを増幅する。これら増幅に使用されるオリゴは、ＤＮＡの組み込みと区別するために、ＧＥｉＧＳシステムの改変配列における領域からＨＤＲテンプレートとして使用される領域の外側まで及ぶゲノム領域を増幅するように設計される。改変された遺伝子座における異なる改変は、特別に選択された制限酵素によって与えられるアンプリコンの異なる消化パターンを通して同定される。
ＤＮＡ及びＲＮＡの単離
サンプルを液体窒素に収集し、加工するまで－８０℃で保存する。ドライアイスに入れたチューブの中で、プラスチック製のＴｉｓｓｕｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ Ｐｅｓｔｌｅｓ（Ａｘｙｇｅｎ，ＵＳ）を使用して、組織を粉砕する。ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｃａｔ．４８７００；Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎａｄａ）を使用して、製造業者の指示書に従って、粉砕した組織からＤＮＡ及び全ＲＮＡを単離する。ＲＮＡ画分の２６０／２３０比が低い（＜１．６）場合、単離したＲＮＡを、１μＬのグリコーゲン（ｃａｔ．１０８１４０１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）１０％Ｖ／Ｖ酢酸ナトリウム、３Ｍ ｐＨ５．５（ｃａｔ．ＡＭ９７４０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）、及び３倍の体積のエタノールを用いて－２０℃で一晩かけて沈殿させ、この溶液を４℃で３０分間、最高速度で遠心分離する。続いて、これを７０％エタノールで２回洗浄し、１５分間風乾し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（ｃａｔ．１０９７７０３５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）に再懸濁させる。
逆転写（ＲＴ）及び定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
単離された全ＲＮＡ１マイクログラムを、製造業者のマニュアルに従ってＤＮａｓｅ Ｉで処理する（ＡＭＰＤ１；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｃａｔ ４３６８８１４；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）の指導者のマニュアルに従って、サンプルを逆転写する。
遺伝子発現については、製造業者のプロトコールに従って、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳ）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（Ｓ４４３８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）において、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析を行い、Ｂｉｏ－ＲａｄＣＦＸマネージャープログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１）で分析する。
タンパク質サンプルの調製
タンパク質分析のために、以下のプロトコールを用いてタンパク質を抽出する：
１． プレート上の細胞を１×ＰＢＳで洗浄する
２． プレートから任意のアクセスＰＢＳを排出／吸引する
３． 溶解バッファ（６ｃｍのディッシュ１枚あたり１５０μＬ、例えば、溶解バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ Ｐｈ ７．５、２％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ＮＥＭ（Ｎ－エチルマレイミド）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ １ ｔａｂｌｅｔ Ｒｏｃｈｅを５０ｍＬの溶解バッファに投入）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（ＳＩＧＭＡ）をいずれも１：１００で使用）を用いて、プレート上の細胞を室温（ＲＴ）で溶解させる。
４． 溶解物をエッペンドルフチューブに回収する。
５． サンプルを９５℃で５分間煮沸して粘度を下げる
６． 製造業者のプロトコールに従ってＱｕａｎｔｉＰｒｏ（商標）ＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，ＱＰＢＣＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を用いて、タンパク質濃度を測定する。
７． 全てのサンプルを均等にする（溶解バッファで同体積及び同濃度にする）。
タンパク質の電気泳動及び転写
１． ＳＤＳローディングバッファ（×１－５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム；電気泳動グレード）、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１００ｍＭ β－メルカプトエタノール）を添加する。
２． ９５℃で５分間サンプルを煮沸する
３． サンプル及びタンパク質ラダーを、適切なプレキャストＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ；ＴｈｅｒｏｍＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）にロードする。
４． ランニングバッファ（ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させる。
５． ゲルカセットを分解し、トランスファーカセットを調製する
６． ニトロセルロースメンブレン、濾紙、及びパッドを転写バッファで予め湿らせる。カセットにパッド及び２層の濾紙を入れる（黒い部位（－）に、タンパク質は－から＋に移動）。
７． ゲルを濾紙の上に置き、慎重にのばす。
８． ニトロセルロースメンブレンをゲルの上に置き、ガラス棒を用いて慎重に気泡を押し出す。
９． カセットを閉じる前に、ニトロセルロースメンブレンの上に２層の濾紙を置き、続いて、予め湿らせておいたパッドを置く。
１０． １時間、１００Ｖでブロットを行う。低温を維持するためにアイスボックスに入れる。
１１． １×ポンソー溶液（３％酢酸中０．１％）でメンブレンを１～３分間染色して、タンパク質のバンドを可視化する。写真を撮影する。ポンソー溶液を除去し（次の使用のために溶液を再利用）、ポンソーバンドが消えるまで０．１Ｍ ＮａＯＨで洗浄する。ＤＤＷで洗浄する。
イムノブロッティング
１． ＰＢＳで３回、それぞれ５分間ずつ洗浄する。
２． シェーカー上の小さなタッパーウェアディッシュに入れた２０ｍＬの１×ＰＢＳ＋５％脱脂粉乳でメンブレンを１時間ブロッキングする。０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０（５μＬ／１０ｍＬ）を含有するＰＢＳで３回、それぞれ５分間洗浄する。
３． メンブレンをファルコンチューブに入れ、５０ｍＬのブロッキング溶液（５０ｍＬのＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０中２．５ｇｒの脱脂粉乳）を添加する。室温で少なくとも３０～６０分間（例えば、一晩）、穏やかに振盪しながらインキュベートする。
４． 一次ビオチン化抗体（ＡＢ）のインキュベーション：約３５ｍＬの洗浄溶液（２５ｍＬのブロッキング溶液を２５０ｍＬのＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０に）でメンブレンの入ったファルコンを短時間洗浄する。液体を廃棄する。
５． ５ｍＬの洗浄液及びビオチン標識された一次抗体（通常の希釈率１：１０００～５０００）（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を添加する。室温で少なくとも１時間インキュベートする
６． 約３５ｍＬの洗浄溶液でメンブレンの入ったファルコンを短時間洗浄する。液体を廃棄する。
７． ３５ｍＬの洗浄液を添加し、１０分間インキュベートし、洗浄を３回繰り返す。
８． 約３５ｍＬのリン酸洗浄液（２５０ｍＬのＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ＝８）中１．２５ｇｒの粉乳）で、メンブレンの入ったファルコンを短時間洗浄する。液体を廃棄する。
３５ｍＬのリン酸洗浄溶液を添加し、１０分間インキュベートし、この段階を３回繰り返す。
９． ４μＬのＡｖｉｄｉｎ－ＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を４ｍＬのリン酸洗浄溶液（１：１０００希釈）に添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートする。
１０． 洗浄：アビジン－ＡＰ。約３５ｍＬのＴＢＳＴでメンブレンの入ったファルコンを短時間洗浄する。液体を廃棄する。３５ｍＬのＴＢＳＴ溶液を添加し、１０分間インキュベートし、洗浄を３回繰り返す。
１１． 検出：製造業者のプロトコール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に従ってアルカリホスファターゼ基質を用いてメンブレンの現像を行う。
ＴｕＭＶ感染及び疾患からのシロイヌナズナの保護
植物材料
所望のＧＥｉＧＳ配列を有する植物から採取したシロイヌナズナの種子を塩素ガスで滅菌し、ＭＳ－Ｓ寒天培地プレートに１粒／ウェルで播種する。２週齢の実生を土壌に移す。２４℃において１６時間明／８時間暗サイクルで植物を栽培する。対照として、野生型の非改変（植物）を並行して栽培及び処理する。
ＴｕＭＶの植物への接種及び分析
ＴｕＭＶベクターの植物への接種及び分析の手順は、既に記載されているように実施する（Ｓａｒｄａｒｕ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１８）１９：１９８４－１９９４．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｍｐｐ．１２６７４）。要するに、４週齢のシロイヌナズナの実生に、ウイルスベクターを発現しているＴｕＭＶを既に記載されているように［Ｓaｎｃｈｅｚ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５（２）：２０７－２１９］又はＴｕＭＶ－ＧＦＰを既に記載されているように［Ｔｏｕｒｉnｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｐａｎｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６（Ｓ１），ｐ．４８］接種する。ＴｕＭＶの場合、接種の１０～２８日後に症状のスコアリングを行う。ＴｕＭＶ－ＧＦＰの場合、接種の７～１４日後にＧＦＰシグナルの分析を行う。
更に、接種の１４日後に、接種部位の上方に成長している新葉を採取し、製造業者の指示書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ，Ｃａｎａｄａ）を用いて全ＲＮＡを抽出する。これらサンプルについて、遺伝子発現及び低分子ＲＮＡ発現をプロファイリングするために、低分子ＲＮＡ解析及びＲＮＡ－ｓｅｑを実施する。
ＨＩＶ感染からのヒト細胞の保護
細胞株
製造業者の指示書に従ってＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、ＨＩＶ－１感受性ヒト細胞株［Ｒｅｉｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２０５（１）：３７１－３７５］にＧＥｉＧＳコンストラクトをトランスフェクトする。ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロットによって、ＨＩＶ－１の力価を測定する。サザンブロットを用いて、組み込まれたＨＩＶ－１のコピー数の分析を実施する。
線虫における内因性遺伝子のノックダウン
線虫の形質転換
既に記載されている通り［Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００９）５１８：１２３－１３３．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－５９７４５－２０２－１＿１０）線虫の形質転換を行う。ｑＲＴ＿ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、及びｓｍａｌｌＲＮＡ－ｓｅｑによって、遺伝子のノックダウンを評価する。
実施例１Ａ
ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）
ＧＥｉＧＳオリゴを設計するために、プロセシングされ、誘導体低分子サイレンシングＲＮＡ分子（成熟）を生じさせる、テンプレート非コードＲＮＡ分子（前駆体）が必要になる。ＧＥｉＧＳオリゴを作製するために、２つの前駆体源及びそれに対応する成熟配列を用いた。ｍｉＲＮＡについては、ｍｉＲＢａｓｅデータベースから配列を取得した［Ｋｏｚｏｍａｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１４）４２：Ｄ６８’AiＤ７３］。ｔａｓｉＲＮＡの前駆体及び成熟配列は、ｔａｓｉＲＮＡｄｂデータベースから取得した［Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０：１０４５，Ai１０４６］。
様々な宿主生物においてサイレンシング標的を選択した（データは示さない）。ｓｉＲＮＡｒｕｌｅｓソフトウェアを用いて、これら標的に対するｓｉＲＮＡを設計した［Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．，ＲＮＡ（２００６）１２：１６２０，Ai１６２５．］。これらｓｉＲＮＡ分子のそれぞれを使用して各前駆体中に存在する成熟配列を置き換え、「ナイーブ」なＧＥｉＧＳオリゴを作製した。これらナイーブな配列の構造を、ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ｖ２．６［Ｌｏｒｅｎｚ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ２．０．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）６：２６］を用いて可能な限り野生型前駆体の構造に近づくように調整した。構造を調整した後、配列数及び野生型オリゴと改変オリゴとの間の二次構造の変化を算出した。これら計算は、野生型に対して最小限の配列改変しか必要としない、潜在的に機能的なＧＥｉＧＳオリゴを同定するために必須である。
ＣａｓＯＴソフトウェア［Ｘｉａｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０：１１８０，Ai１１８２］を用いて、野生型前駆体に対するＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作製した。ＧＥｉＧＳオリゴを作製するために適用された改変がｓｇＲＮＡのＰＡＭ領域に影響を与えて、それを改変オリゴに対して無効なものにするｓｇＲＮＡを選択した。
実施例１Ｂ
内因性植物遺伝子の遺伝子サイレンシング－ＰＤＳ
ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）を用いて内因性遺伝子のサイレンシングを定量的に評価するためのハイスループットスクリーニングを確立するために、本発明者らは、幾つかの有望な視覚的マーカーについて検討した。本発明者らは、色素蓄積に関与する遺伝子、例えば、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）をコードしている遺伝子に注目することを選択した。ＰＤＳをサイレンシングすると光退色が引き起こされるため（図６Ｂ）、概念実証（ＰＯＣ）として遺伝子編集後にロバストな実生のスクリーニングとしてそれを用いることが可能になる。図６Ａ～Ｃは、ＰＤＳについてサイレンシングされたベンサミアナタバコ及びシロイヌナズナの植物を用いた代表的な実験を示す。植物は、カロテノイドの量が減少した植物でみられる特徴的な光退色表現型を示す。
ＰＯＣ実験では、以下の通りｓｉＲＮＡの選択を行った：
ＧＥｉＧＳアプリケーションを用いてＰＤＳ遺伝子に対するシロイヌナズナ又はベンサミアナタバコにおけるＲＮＡｉ機構を始動させるためには、ＰＤＳを標的とする有効な２１～２４ｂｐのｓｉＲＮＡを同定する必要がある。活性ｓｉＲＮＡの配列を見つけるために、２つのアプローチを使用する：１）文献をスクリーニング－ＰＤＳサイレンシングは多くの植物に置いて周知のアッセイであるので、本発明者らは、シロイヌナズナ又はベンサミアナタバコの遺伝子と１００％一致する可能性のある、異なる植物における十分に特徴付けられている短いｓｉＲＮＡ配列を同定する。２）所与の遺伝子に対する遺伝子サイレンシングの始動にどのｓｉＲＮＡが有効であるかを予測するために使用されているアルゴリズムが数多く公開されている。これらアルゴリズムの予測は１００％ではないので、本発明者らは、少なくとも２つの異なるアルゴリズムの成果である配列のみを使用している。
ＰＤＳ遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡ配列を使用するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、それを既知の内因性非コードＲＮＡ遺伝子配列と交換している（例えば、ｍｉＲＮＡ配列の変更、長鎖ｄｓＲＮＡ配列の変更、アンチセンスＲＮＡの作製、ｔＲＮＡの変更等）。特徴付けられている非コードＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡのデータベースは数多く存在するが、本発明者らは、発現プロファイルの異なる（例えば、構成的な発現が少ない、高発現している、ストレスで誘導される等）既知のシロイヌナズナ又はベンサミアナタバコの内因性非コードＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡを幾つか選択している。例えば、内因性ｍｉＲＮＡ配列を、ＰＤＳ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと交換するために、本発明者らは、ＨＲアプローチ（相同組み換え）を用いている。ＨＲを使用すると、２つの選択肢が想定される：例えば中央に改変ｍｉＲＮＡ配列を含む２５０～５００ｎｔ程度のドナーｓｓＤＮＡオリゴ配列を使用する、又はＰＤＳのｓｉＲＮＡに変更された２×２１ｂｐのｍｉＲＮＡ及び＊ｍｉＲＮＡ（図５に示すように、ｓｉＲＮＡの５００～２０００ｂｐ上流及び下流）を除いて植物ゲノム中のｍｉＲＮＡ周辺に対して最小限の変更しか含まない、１Ｋｂ～４Ｋｂのインサートを保有するプラスミドを使用する。トランスフェクションには、以下のコンストラクトが含まれる：陽性の形質転換細胞を追跡し、濃縮するためのＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９／ＧＦＰセンサー、挿入ベクター／オリゴに応じてＨＲにより修復される、Ｃａｓ９に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するようＣａｓ９を誘導するｇＲＮＡ。挿入ベクター／オリゴは、置換される標的となる遺伝子座を取り囲む２つの連続する相同性領域を含有し（すなわちｍｉＲＮＡ）、関心変異を保有するように改変される（すなわちｓｉＲＮＡ）。プラスミドを使用する場合、ターゲティングコンストラクトは、制限酵素認識部位を含むか又は含まず、ｍｉＲＮＡを選択したｓｉＲＮＡで置き換えることで終了する相同組換えのテンプレートとして使用される。プロトプラストへのトランスフェクション後、ＦＡＣＳを用いてＣａｓ９／ｓｇＲＮＡがトランスフェクションされる事象を濃縮し、プロトプラストを植物に再生し、白化した実生をスクリーニングし、スコアリングする（図５を参照）。対照として、ランダムな非ＰＤＳターゲティング配列を保有するオリゴをプロトプラストにトランスフェクトする。陽性の編集された植物は、ＰＤＳを標的とするｓｉＲＮＡ配列を生成すると予測されるので、ＰＤＳ遺伝子がサイレンシングされ、ｇＲＮＡを持たない対照と比べて実生が白く見える。元の塩基対合プロファイルは維持されるので、編集されたｍｉＲＮＡは、交換後も依然としてｍｉＲＮＡとしてプロセシングされることに留意することが重要である。しかし、新たに編集されたプロセシングされるｍｉＲＮＡは、標的に対して高い相補性（例えば１００％）を有するため、実際には、新たに編集された低分子ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとして作用する。
実施例１Ｃ
ＴｕＭＶウイルス感染に対するシロイヌナズナ植物の抵抗性の保有
機能不全非コードＲＮＡにサイレンシング特異性を導入して、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）又はランダムな配列（ＴｕＭＶ－サイレンシングの陰性対照）を標的とするように、シロイヌナズナのゲノムにおける変化を設計する。これら配列は、ゲノム遺伝子座の状況において伸長された相同性アームと共に、ＤＯＮＯＲと命名されたＰＵＣ５７ベクターに導入される。所望の遺伝子座でＤＮＡの切断を生じさせるために、ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターシステムに導入する。遺伝子ボンバードメントプロトコールを介してＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターシステムをＤＯＮＯＲベクターと同時に植物に導入して、ＨＤＲ（相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を通して所望の改変を導入する。
ゲノム中に所望の変化を有するシロイヌナズナの実生をジェノタイピングを通して同定し、ＴｕＭＶ又はＴｕＭＶ－ＧＦＰのいずれかを保有しているアグロバクテリウムを接種し、ウイルス応答についてスコアリングする。
実施例２
再活性化及びリダイレクトされた植物サイレンシングＲＮＡの機能性
そのサイレンシング活性が再活性化又はリダイレクトされたときに、ｍｉＲＮＡ様非コードＲＮＡがサイレンシング活性を獲得できることを実証するために、シロイヌナズナのプロトプラスト内の一過的な系において、そのバイオジェネシス及び活性を試験した。
使用した系は、野生型ｍｉＲＮＡ、野生型ｍｉＲＮＡと相同なｍｉＲＮＡ様候補分子、並びにそのサイレンシング活性が再活性化された（すなわち、元のｍｉＲＮＡ様分子の配列内に存在するガイド鎖の配列と相補的な標的配列を標的とする）又は再活性化及びリダイレクトされた（すなわち、選択した別の標的配列を標的とする）ｍｉＲＮＡ様分子のサイレンシング効率を比較することを目的としていた。上述したように、（発現するが、対応する野生型サイレンシング分子のようにはプロセシングされないｎｃＲＮＡをコードしている）候補遺伝子におけるサイレンシング活性の再活性化（又は再活性化及びリダイレクション）は、上述した通り、そして、例えば国際公開第２０１９／０５８２５５号に開示されているＧＥｉＧＳプラットフォームを用いて実現することができる。サイレンシング特異性を再活性化／リダイレクションするためにＧＥｉＧＳを用いて、「ＧＥｉＧＳ－オリゴ」と呼ばれるＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＧＥｉＧＳ－オリゴの配列は、所望のヌクレオチド変化（例えば、その遺伝子によってコードされているＲＮＡのサイレンシング特異性を選択した標的遺伝子に向けてリダイレクトするために必要なヌクレオチド変化）を含む、遺伝的に編集される遺伝子の配列を含む。次に、ＧＥｉＧＳ－オリゴが標的とする領域に隣接する編集される遺伝子の配列に対応する２つの配列の間に位置する「ＧＥｉＧＳ－オリゴ」を含むように、「ＧＥｉＧＳ－ドナー」と呼ばれるＤＮＡオリゴヌクレオチド（本明細書では「ドナー」とも称される）を設計する。ＧＥｉＧＳドナーを含むベクターを、Ｃａｓ９等のエンドヌクレアーゼ及び編集される遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡと一緒に細胞に導入すると、ＧＥｉＧＳ－オリゴが細胞のゲノムに導入され（ＨＤＲによって媒介）、その結果、編集された遺伝子が所望の変化を含むようになる（例えば、そのサイレンシング活性が再活性化及びリダイレクトされたｍｉＲＮＡ様遺伝子をコードする）。
従って、本明細書で使用する系は、上述のように、再活性化／リダイレクションに必要なヌクレオチドの変化をコードしているＧＥｉＧＳ－オリゴを用いて、細胞内でそのサイレンシング活性が再活性化／リダイレクトされるであろうｍｉＲＮＡ様分子のサイレンシング効率を定量するための比較実験アッセイも提供した。このように、野生型ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様分子の前駆体を発現させるために後述の系で使用される「ＧＥｉＧＳ－オリゴベクター」と称されるベクター内の配列は、上述のようにＧＥｉＧＳ－オリゴを用いてこのような前駆体配列が細胞に導入され得ることから「ＧＥｉＧＳ－オリゴ」とも称される。
使用した一過的な系では、プロトプラストに２つのプラスミドを同時にトランスフェクションした：
ｉ）「Ｌｕｃセンサーベクター」－試験したｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様によってサイレンシングされる標的配列（本明細書では「ＧＥｉＧＳ－ｓＲＮＡ標的部位」とも称される）がクローニングされたＭＣＳ（多重クローニング部位）に融合させた、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードしているレポーター配列を保有する。また、このベクターは、ＬＵＣシグナルの正規化に使用される追加の蛍光タンパク質（ＦＰ）マーカー（本明細書では「ノーマライザー」とも称される）も保有する。
ｉｉ）「ＧＥｉＧＳ－オリゴベクター」－（１）ＭＣＳにクローニングされた「ＧＥｉＧＳコンストラクト」（すなわち、ＧＥｉＧＳ－オリゴを使用することによって生成され得るｍｉＲＮＡ前駆体、ｍｉＲＮＡ様前駆体、又は再活性化／リダイレクトされたｍｉＲＮＡ様前駆体）及び（２）異なる蛍光タンパク質（ＦＰ２）マーカーを保有する。
「ＧＥｉＧＳ－オリゴ」（ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ様前駆体）が細胞内のＲＮＡｉ機構によってプロセシングされると、ｓＲＮＡが生成される。そのｓＲＮＡがサイレンシング活性を有し、ＬＵＣ転写物に融合した標的と一致した場合、そのｍＲＮＡは分解され、結果的にルシフェラーゼレベルが低下する。ｓＲＮＡが標的と一致しない場合、サイレンシングは行われず、ルシフェラーゼが蓄積し、その結果、より高い検出可能なシグナルが生じる。蛍光タンパク質（ＦＰ及びＦＰ２）については、ｓＲＮＡの同一性及びサイレンシング特異性にかかわらず、サイレンシングされないと予測された。トランスフェクション２日後から始めて蛍光タンパク質を検出するための蛍光顕微鏡によって、両プラスミドの定性的トランスフェクション効率を可視化した。
ＧＥｉＧＳ－ｏｌｉｇｏベクターにクローニングされたｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ様前駆体が発現した結果としてのＬｕｃセンサーベクターにクローニングされた標的配列のサイレンシングを測定するために、トランスフェクションの３日後にＬｕｃセンサー及びノーマライザーのシグナル（それぞれ発光及び蛍光）を測定した。次いで、以下に詳述するように、異なる実験条件でＬＵＣ／ＦＰ比を算出し、次いで、同じＬｕｃセンサーベクターを用いて、処理対対照処理の活性を考慮してサイレンシング値を算出した。
表１Ａ及び表１Ｂから分かるように、そして、以下に更に詳述するように、（Ｌｕｃ－センサーベクターにおける）標的配列及び（ＧＥｉＧＳ－ｏｌｉｇｏベクターにおける）試験したｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ様前駆体の以下の組み合わせについて調べた：
１． 野生型（標準的な）ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ４０５ａ又はｍｉＲ８１７４）の前駆体配列と、その成熟ｍｉＲＮＡ配列に対応する標的配列。陰性対照として、任意のｍｉＲＮＡ前駆体配列を発現していない第２のベクターと共に同じ標的ベクターを使用した。
２． 上記の通り見出された、その対応する標準的なｍｉＲＮＡ（Ｄｅａｄ＿ｍｉＲ８５９又はＤｅａｄ＿ｍｉｒ＿１３３４）としてプロセシングされないサイレンシング欠損ｍｉＲＮＡ様分子の前駆体配列と、（それぞれ、対応する野生型ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ４０５ａ又はｍｉＲ８１７４とのアライメントに従って）その成熟ｍｉＲＮＡが位置するであろう箇所に対応する標的配列。陰性対照として、任意のｍｉＲＮＡ前駆体配列を発現していない第２のベクターと共に同じ標的ベクターを使用した。
３． 再活性化された（元々サイレンシングが欠損していた）ｍｉＲＮＡ様分子（Ｄｅａｄ＿ｍｉＲ８５９）の前駆体配列と、その成熟ｍｉＲＮＡに対応する標的配列（（２）と同じもの）。陰性対照として、任意のｍｉＲＮＡ前駆体配列を発現していない第２のベクターと共に同じ標的ベクターを使用した。
４． ＡｔＰＤＳ３遺伝子由来の標的配列をサイレンシングするために再活性化及びリダイレクトされた、再活性化及びリダイレクトされたサイレンシング欠損ｍｉＲＮＡ様分子（Ｄｅａｄ＿ｍｉＲ８５９又はＤｅａｄ＿ｍｉｒ＿１３３４）の前駆体配列と、ＡｔＰＤＳ３遺伝子由来の標的配列。陰性対照として、ＡｔＰＤＳ３に対して標的とされない、再活性化されたサイレンシング欠損ｍｉＲＮＡ様分子（Ｄｅａｄ＿ｍｉＲ８５９又はＤｅａｄ＿ｍｉｒ＿１３３４）を発現している第２のベクターと共に、同じ標的ベクターを使用した。ＧＥｉＧＳ遺伝子編集法を用いて、Ｄｅａｄ＿ｍｉＲ８５９又はＤｅａｄ＿ｍｉｒ＿１３３４をコードしている遺伝子をＡｔＰＤＳ３に向けてリダイレクトさせるために、細胞内で使用することができるＧＥｉＧＳドナーオリゴヌクレオチド及びｓｇＲＮＡの配列を、上記表１Ａ及び１Ｂに提示する。
５． Ｍｏｃｋ－トランスフェクトされていない細胞。
予測されるサイレンシング結果（以下の結果によって確認）を含む上記の組み合わせを、図８Ａ～Ｂにまとめる。この実施例で用いた、ｍｉＲＮＡ様転写物の死から再活性化、又は再活性化及びリダイレクトへの変化の原理を、図７に模式的に示す。上述のように、試験したｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ様分子の予測される二次構造を図９Ａ～Ｂ及び９Ｅ～Ｆに提示する。
上記システムを用いた実験手順及び得られた結果を以下に提供する：
プロトプラスト顕微鏡検査－結果
全てのトランスフェクトされた処理について蛍光タンパク質（ＦＰ及びＦＰ２）の良好なシグナルが検出され、これは、プロトプラスト細胞集団のかなりの部分がＬｕｃセンサーベクター及びＧＥｉＧＳ－オリゴベクターのコトランスフェクションに成功したことを示した。陰性対照（Ｍｏｃｋ）については、蛍光タンパク質のシグナル（ＦＰ及びＦＰ２）は検出されなかった。
ｍｉＲＮＡ様分子の再機能化（再活性化）－結果
各処理について、上述及び図８Ａ～Ｂのように、Ｌｕｃセンサーベクター及びＧＥｉＧＳ－オリゴベクターをＣｏｌ－０プロトプラストにコトランスフェクトした。
前駆体有り又は無しの処理における比（それぞれ濃い灰色の棒対薄い灰色の棒）を比較したとき、野生型ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ４０５ａ（図９Ｃ）及びｍｉＲ８１７４（図９Ｇ）について、ＬＵＣ／ＦＰ比の有意な低下が観察された。サイレンシングを対照と比較して測定するように、各アッセイにおいて対照処理に対して値を正規化した。これら結果に従って、ｍｉＲ４０５ａ及びｍｉＲ８１７４のその標的配列をサイレンシングする効力は、それぞれ３８％と６４％であった。
前駆体有り及び無しの両処理についての比を比較したとき、「Ｄｅａｄ」ｍｉＲＮＡ様前駆体であるｍｉＲ８５９（図９Ｃ）及びｍｉＲ１３３４（図９Ｇ）について、ＬＵＣ／ＦＰ比の有意な低下は観察されなかった。これは予想通りであったが、その理由は、これらｍｉＲＮＡ様前駆体が、サイレンシング活性を有するｓＲＮＡにプロセシングされるとは予測していなかったからである。
再活性化されたｍｉＲ８５９（図９Ｃ）では、前駆体有り及び無しの両処理について、ＬＵＣ／ＦＰ比の統計的に有意な低下が観察された。再活性化されたｍｉＲ８５９のサイレンシング効力は、３２％であった。
再活性化されたｍｉＲＮＡのリダイレクション－結果
各処理について、上述及び図８Ａ～Ｂのように、Ｌｕｃセンサーベクター及びＧＥｉＧＳ－オリゴベクターをＣｏｌ－０プロトプラストにコトランスフェクションした。
ＡｔＰＤＳ３配列のサイレンシングを試験したとき、ＡｔＰＤＳ３に対して再活性化及びリダイレクトされたｍｉＲ８５９及びｍｉＲ１３３４の比を、再活性化されただけのｍｉＲ８５９及びｍｉＲ１３３４の比に対して比較したとき、ＬＵＣ／ＦＰ比の有意な低下が観察された（図９Ｄ及び９Ｈ）。再活性化及びリダイレクトされたｍｉＲ８５９及びｍｉＲ１３３４の抗ＰＤＳサイレンシング効力は、それぞれ５５％及び３３％であった。ｍｉＲ８５９及びｍｉＲ１３３４の予測されるｓＲＮＡの長さは、それぞれ２４ｎｔ及び２１ｎｔであった。観察されたサイレンシング効果は、リダイレクトされたオリゴが適切にプロセシングされ、成熟ｓＲＮＡがＰＤＳ３遺伝子におけるそれぞれの新たな標的配列を標的とすることができたことを意味する。
実施例３
ヒト細胞における再活性化されたサイレンシングＲＮＡの機能性
再活性化された非コードＲＮＡがヒトで機能することを確認するために、ｐｍｉｒＧＬＯ Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）の使用を通して、そのバイオジェネシス及び活性を一過的な系で試験する。製造業者の指示に従って、ｆＬＵＣ配列の下流のＭＣＳに標的配列を導入する。一過的な過剰発現のために、試験したＧＥｉＧＳ－ｏｌｉｇｏをＴ－ＲＥｘシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いてクローニングする。Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、ヒトの細胞株をトランスフェクトする。プラスミド送達の２４～７２時間後に、細胞の半分をルシフェラーゼ活性について分析し、残りの半分を低分子ＲＮＡシーケンシング分析に供する。製造業者の指示書に従ってＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、二重ルシフェラーゼアッセイを実施する。製造業者の指示書に従って、ＭｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出する。これらサンプル中の所望の成熟低分子ＲＮＡを同定するために、低分子ＲＮＡシーケンシング分析を行う。機能性である再活性化された非コードＲＮＡは、機能不全非コードＲＮＡ又は非ＬＵＣ特異的ｓｉＲＮＡにプロセシングされる再活性化された非コードＲＮＡを発現する対照コンストラクトと比較して、ＬＵＣ遺伝子をダウンレギュレートする。
実施例４
ヒト細胞における再活性化されたサイレンシングＲＮＡによるＨＩＶ－１に対する免疫
製造業者の指示書に従ってＧＥｉＧＳコンストラクトと共にＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、ＨＩＶ－１感受性ヒト細胞株［Ｒｅｉｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２０５（１）：３７１－３７５］をトランスフェクトする。シングルコロニーを単離し、ＧＥｉＧＳ事象の成功を同定するためにジェノタイピングし、更に維持する。ウイルスタンパク質ｐ２４及びｇｐ１２０を定量するためにウェスタンブロット分析を行い、加えて、ｑＲＴ－ＰＣＲによる転写レベルの分析を使用して、ウイルスの複製をモニタリングする。組み込まれたＨＩＶ－１のコピー数をサザンブロットによって評価する。
実施例５
線虫における再活性化されたサイレンシングＲＮＡの機能性
再活性化された非コードＲＮＡが線虫で機能することを確認するために、遍在的に発現するＧＦＰマーカーの使用を通して、そのバイオジェネシス及び活性を安定な遺伝子マーカーシステムで試験する。ＧＦＰトランスジーン配列を標的とするように、再活性化された非コードＲＮＡを有する線虫を作製する。編集された虫を、ＧＦＰの発現及び強度について試験する。機能性である再活性化された非コードＲＮＡを有する線形動物は、機能不全非コードＲＮＡ又は非ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡにプロセシングされる再活性化された非コードＲＮＡを発現する対照動物と発現比較して、ＧＦＰ遺伝子発現をダウンレギュレートする。顕微鏡解析、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、及びｓｍａｌｌＲＮＡ－ｓｅｑによって、ＧＦＰの発現を評価する。
実施例６
線虫におけるＧＥｉＧＳシステムを介した内因性遺伝子のノックダウン
内因性ＵＮＣ－２２遺伝子を標的とする非コードＲＮＡを生成するために、線虫のゲノムにおける変化を設計する。ゲノム遺伝子座の状況において伸長された相同性アームと共に、これら配列を生成し、ＤＯＮＯＲと命名する。所望の遺伝子座でＡＤＮＡの切断を生じさせるために、ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクターシステムに導入する。遺伝子ボンバードメントプロトコールを介してＤＯＮＯＲベクターと同時にこれらを植物に導入して、相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を通して所望の改変を導入する。線虫集団をこの２つの配列で形質転換して、ゲノム中に必要な変化を保有する線虫の集団を生成する。注入の２４～７２時間後に解剖顕微鏡を用いてＮＧＭプレート上で線形動物を分析する。ＵＮＣ－２２のノックダウンの証拠として、「単収縮」表現型を記録する。更に、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、及び低分子ＲＮＡ解析によりＵＮＣ－２２発現レベルを解析するために、これら線形動物を回収する。
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、当業者には多くの代替例、改変例、及び変形例が明らかになることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広義の範囲内の全てのこのような代替例、改変例、及び変形例を包含することが意図される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書に援用される。更に、本出願において任意の参考文献を引用又は特定することは、このような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めると解釈されるものではない。章の見出しが使用されている限りにおいて、それは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
また、本出願の任意の優先権書類（複数可）は、その全体が参照により本明細書に援用される。

Claims (50)

  1. 細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成する方法であって、
    （ａ）ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合するＲＮＡ分子をコードしている核酸配列に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示すＲＮＡ分子をコードしている核酸配列を同定することと；
    （ｂ）前記所定の配列相同性範囲を示す前記ＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、前記ＲＮＡ分子をコードしている前記核酸配列の転写を判定することと；
    （ｃ）前記所定の配列相同性範囲を示す前記ＲＮＡ分子をコードしている転写可能な核酸配列を選択するために、前記所定の配列相同性範囲を示す前記ＲＮＡ分子をコードしている前記転写可能な核酸配列の転写物の低分子ＲＮＡへのプロセシング性を判定することであって、前記ＲＮＡ分子が異常にプロセシングされることと；
    （ｄ）ＲＩＳＣと会合し、かつ第１の標的ＲＮＡに対して相補的な低分子ＲＮＡへのプロセシング性を付与するために、前記所定の配列相同性範囲を示す前記異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている前記転写可能な核酸配列の核酸配列を改変し、
    それによって、細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することと、
    を含む方法。
  2. 同定された核酸配列によってコードされている工程（ａ）の前記ＲＮＡ分子が、ＲＩＳＣと会合する及び／又はＲＩＳＣと会合する分子にプロセシングされるＲＮＡ分子に対して、完全な同一性を含まない、所定の配列相同性範囲を示す、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ｄ）におけるプロセシング性の付与が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合するＲＮＡ分子をコードしている前記核酸配列の核酸配列によってコードされているＲＮＡ分子に対して標準的なプロセシングを付与することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 工程（ａ）の前記所定の配列相同性範囲を示す前記ＲＮＡ分子をコードしている前記核酸配列のゲノム上の位置を決定することを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ゲノム上の位置が、非コード遺伝子内、任意で非コード遺伝子のイントロン内である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ゲノム上の位置が、コード遺伝子内、任意でコード遺伝子のエキソン内、任意でコード遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードしているエキソン内、又は任意でコード遺伝子のイントロン内である、請求項４に記載の方法。
  7. 工程（ｂ）及び／又は（ｃ）が、低分子ＲＮＡの発現データの前記細胞のゲノムへのアライメント及び各ゲノム上の位置にマッピングされるリードの量の決定によって影響を受ける、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記低分子ＲＮＡの前記アライメントが、ミスマッチのない前記細胞の前記ゲノム中の所定の位置へのアライメントである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記転写可能な核酸配列の前記核酸配列の前記改変によって、前記異常にプロセシングされるＲＮＡ分子の構造が付与され、その結果、前記ＲＮＡ分子が、ＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシングされるようになる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記所定の配列相同性範囲を示す前記異常にプロセシングされるＲＮＡ分子をコードしている前記転写可能な核酸配列の前記核酸配列の前記改変が、前記第１の標的ＲＮＡに対する結合部位に対応するもの以外の核酸で行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記プロセシング性が、ダイサー、アルゴノート、ｔＲＮＡ切断酵素、及びＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）関連タンパク質からなる群から選択される細胞ヌクレアーゼによってもたらされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 工程（ｄ）における改変が、前記第１の標的ＲＮＡに向けて前記異常にプロセシングされるＲＮＡ分子のサイレンシング活性を再活性化するＤＮＡ編集剤を細胞に導入し、それによって、前記細胞内でサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を生成することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 細胞内でサイレンシング活性を有する前記ＲＮＡ分子の特異性を改変することを更に含み、前記ＤＮＡ編集剤が、前記第１の標的ＲＮＡとは異なる関心標的ＲＮＡに向けて前記ＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトし、それによって、前記細胞内で前記サイレンシング活性を有する前記ＲＮＡ分子の前記特異性を改変する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程（ａ）で同定されたＲＮＡ分子をコードしている核酸配列が、そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングがその二次構造に依存するサイレンシングＲＮＡ分子をコードしている遺伝子と相同である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. そのサイレンシング活性及び／又は低分子サイレンシングＲＮＡへのプロセシングが二次構造に依存するサイレンシングＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子のＲＮＡ、並びに長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. ＲＮＡ分子がＲＩＳＣと会合する低分子ＲＮＡにプロセシングされるようになる核酸配列の変化を有する前記ＲＮＡ分子をコードしているポリヌクレオチド配列を含むゲノムを含む遺伝的に改変された細胞であって、前記核酸配列の変化がない同一起源の野生型細胞には前記ＲＮＡ分子の前記プロセシングが存在しない、遺伝的に改変された細胞。
  17. プロセシングが、標準的なプロセシングである、請求項１６に記載の遺伝的に改変された植物。
  18. 前記ＲＮＡ分子が、サイレンシング活性を有する、請求項１６又は１７に記載の遺伝的に改変された細胞。
  19. 前記ＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、フェーズド低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ断片（ｔＲＦ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、転位性及び／又はレトロ転位性由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及び／又はレトロ転位性ＲＮＡからなる群から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法又は請求項１６～１８のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された細胞。
  20. 細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することを更に含む、請求項１～１５又は１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＤＮＡ編集剤が、少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む、請求項１２～１５、１９、又は２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＤＮＡ編集剤が、エンドヌクレアーゼを含まない、請求項１２～１５、１９～２０、又は２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ＤＮＡ編集剤が、エンドヌクレアーゼを含む、請求項１２～１５、１９～２０、又は２１のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ＤＮＡ編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ｄＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである、請求項１２～１５又は１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９を含む、請求項２３又は２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＤＮＡ編集剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＰとして細胞に適用される、請求項１２～１５又は１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記関心標的ＲＮＡが、前記細胞に対して内因性又は外因性である、請求項１３～１５又は１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＲＮＡ分子の前記特異性が、細胞サイズ、成長の速度／阻害、細胞形状、細胞膜の完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の着色、生物のサイズ、作物収量、代謝プロファイル、果実形質、生物的ストレス抵抗性、非生物的ストレス抵抗性、感染パラメータ、及び炎症パラメータからなる群から選択される少なくとも１つの表現型を決定することによって表現型的に判定される、請求項１３～１５又は１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記細胞が、真核細胞である、請求項１３～１５若しくは１９～２８のいずれか一項に記載の方法又は請求項１６～１８若しくは１９のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された細胞。
  30. 前記真核細胞が、植物、哺乳類、無脊椎動物、昆虫、線形動物、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、真菌類、及び藻類からなる群から選択される真核生物から得られる、請求項２９に記載の方法又は遺伝的に改変された細胞。
  31. 前記真核細胞が、植物細胞である、請求項２９に記載の方法又は遺伝的に改変された細胞。
  32. 前記植物細胞が、プロトプラストである、請求項３１に記載の方法又は遺伝的に改変された細胞。
  33. 請求項１～１５又は１９～３２のいずれか一項に記載の方法に従って生成される植物細胞。
  34. 請求項３３に記載の植物細胞を含む植物。
  35. 前記植物が、非トランスジェニックである、請求項３４記載の植物。
  36. 標的遺伝子の発現が低下した植物を生成する方法であって、
    （ａ）請求項３４又は３５に記載の植物を育種することと；
    （ｂ）関心標的ＲＮＡの発現が低下した後代植物、又は前記関心標的ＲＮＡに対する前記ＲＮＡ分子におけるサイレンシング特異性を含み、かつ前記ＤＮＡ編集剤を含まない後代を選択し、
    それによって、標的遺伝子の発現が低下した前記植物を生成することと、
    を含む方法。
  37. 関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む植物を生成する方法であって、
    （ａ）請求項３４又は３５に記載の植物を育種することと；
    （ｂ）前記関心標的ＲＮＡに対する前記サイレンシング活性を有する前記ＲＮＡ分子を含む後代植物、又は前記関心標的ＲＮＡに対する前記ＲＮＡ分子におけるサイレンシング特異性を含み、かつ前記ＤＮＡ編集剤を含まない後代を選択し、
    それによって、関心標的ＲＮＡに対するサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子を含む植物を生成することと、
    を含む方法。
  38. 請求項３４又は３５に記載の植物又は植物細胞を生成する方法であって、繁殖を可能にする条件下で植物又は植物細胞を成長させることを含む方法。
  39. 前記育種が、交配又は自殖を含む、請求項３６又は３７記載の方法。
  40. 請求項３４若しくは３５のいずれか一項に記載の植物又は請求項３６～３９のいずれか一項により生成された植物の種子。
  41. 前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項２９に記載の方法又は遺伝的に改変された細胞。
  42. ＲＮＡ分子をコードしている核酸配列が、配列番号３５２～３９２のいずれかに記載の核酸配列からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法又は遺伝的に改変された細胞。
  43. 前記真核細胞が、全能性幹細胞である、請求項４１又は４２に記載の方法又は遺伝的に改変された細胞。
  44. 疾患の治療を、それを必要としている被験体においてする方法であって、請求項１～１５、１９～３２、又は４１～４３のいずれか一項に記載の方法に従ってサイレンシング活性及び／又は特異性を有するＲＮＡ分子を生成することを含み、前記ＲＮＡ分子が、前記疾患の発症又は進行に関連する遺伝子の転写物に対するサイレンシング活性を有し、それによって、前記被験体を治療する方法。
  45. 細胞内の第１のＲＮＡ分子にサイレンシング活性を導入する方法であって、
    （ａ）
    ｉ．第１の核酸配列が、細胞内で前記第１のＲＮＡ分子に転写され；
    ｉｉ．前記第１のＲＮＡ分子の配列が、配列同一性を除いて、第２のＲＮＡ分子の配列と部分的な相同性を有し、前記第２のＲＮＡ分子が、サイレンシング活性を有する第３のＲＮＡ分子にプロセシング可能であり、前記第２のＲＮＡ分子が、前記細胞内の第２の核酸配列によってコードされており；かつ
    ｉｉｉ．前記第１のＲＮＡ分子がプロセシング不可能であるか又は第２のＲＮＡ分子とは異なってプロセシング可能であり、その結果、第１のＲＮＡ分子が、第３のＲＮＡ分子と同じ性質のサイレンシング活性を有するＲＮＡ分子にはプロセシングされない、
    前記細胞内の前記第１の核酸配列を選択することと、
    （ｂ）改変された第１のＲＮＡ分子をコードするように前記第１の核酸配列を改変することであって、前記改変された第１のＲＮＡ分子が、前記第２のＲＮＡ分子が前記第３のＲＮＡ分子にプロセシング可能であるのと同様に第４のＲＮＡにプロセシング可能であり、その結果、第４のＲＮＡ分子が、第３のＲＮＡ分子と同じ性質のサイレンシング活性を有し、
    それによって、前記第１のＲＮＡ分子にサイレンシング活性を導入することと、
    を含む方法。
  46. 前記第２のＲＮＡ分子が、それがサイレンシング活性を有するＲＮＡにプロセシングされることを可能にする二次構造を有するＲＮＡ分子であり、任意で、前記サイレンシング活性は、ＲＩＳＣとの会合を通して媒介される、請求項４５に記載の方法。
  47. サイレンシング活性を有するＲＮＡにプロセシングされることを可能にする二次構造を有する前記ＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リピート由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子由来のＲＮＡ、自律性及び非自律性の転位性及びレトロ転位性因子のＲＮＡ、並びに長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記第１の核酸配列が、改変された第１のＲＮＡ分子が第４のＲＮＡ分子にプロセシングされることを可能にする二次構造をもたらす、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記第１の核酸配列を改変することが、改変された第１のＲＮＡ分子が第２のＲＮＡ分子と本質的に同じ二次構造、任意で、第２のＲＮＡ分子の二次構造と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は１００％同一である二次構造を有するように配列を改変することを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記第１の核酸分子が、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）由来の遺伝子であって、配列番号３５２～３９２のいずれかに記載の配列を有する遺伝子からなる群から選択される遺伝子である、請求項４５に記載の方法。
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