JP2021511042A

JP2021511042A - Ａｌｄｈ２発現を阻害するための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2021511042A
Application number: JP2020539274A
Authority: JP
Inventors: ユトサフサクセナ
Original assignee: ディセルナファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2021-05-06
Also published as: CA3086409A1; US20210380984A1; EP3710588A4; CN111601891A; MX2020007582A; EP3710588A1; AU2019209324A1; KR20200109311A; IL275539A; WO2019143621A1; US11661603B2

Abstract

本開示は、特に肝実質細胞でのＡＬＤＨ２発現を低減させるために有用なオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法に関する。ＡＬＤＨ２発現を低減させるための本開示のオリゴヌクレオチドは、二本鎖であってもよく又は一本鎖であってもよく、ヌクレアーゼに対するより強力な耐性及びより低い免疫原性等の特徴の向上のために修飾されていてもよい。また、ＡＬＤＨ２発現を低減させるための本開示のオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞等の特定の細胞又は臓器を標的とするための標的指向性リガンドを含んでいてもよく、アルコール中毒及び関連状態を治療するために使用することができる。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１月１６日に出願された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧＡＬＤＨ２ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ」と題する米国特許仮出願第６２／６１７６９２号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。この文献の内容は全て、参照により本明細書に組み込まれる。

本出願は、オリゴヌクレオチド、及びそれらの使用、特にアルコール中毒及び関連状態の治療に関する使用に関する。

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、２０１９年１月１５日に作成された、サイズが１２８キロバイトでファイル名がＤ０８００．７００１０ＷＯ００−ＳＥＱ．ｔｘｔのファイルとして提供されている。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

アセトアルデヒドは、身体によるアルコール酸化の中間物質である。アセトアルデヒド代謝が阻害されると、アセトアルデヒドが蓄積して、中毒症状及び大きな不快感の発生がもたらされる。ミトコンドリアアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ２）は、体内でのアセトアルデヒド解毒に主要な役割を有する酵素である。ヒトＡＬＤＨ２の遺伝子多型は、広範囲の民族集団で良好に調査されている。異常遺伝子がヘテロ接合又はホモ接合である個体は、より低いＡＬＤＨ２酵素活性を有し、この欠損は、アルコール消費後の顔面潮紅、悪心、及び心悸亢進により明らかになる。研究により、こうした個体ではアルコール中毒の有病率が低減され、それはこうした不快効果に起因することが明らかになっている。従って、ＡＬＤＨ２活性の妨害は、ヒトのアルコール耐容性及びアルコール消費の欲求を減少させることができる。ＡＬＤＨ２を標的とする薬学的化合物が、ヒトのアルコール嫌悪を誘導するために使用されている。

例えば、ジスルフィラムは、ＡＬＤＨ２酵素を阻害することによりアセトアルデヒドの代謝をｉｎｖｉｖｏで妨害する化合物である。ジスルフィラム投与の１２時間以内のアルコール消費は、他の症状の中でも、顔面潮紅、頭頸部の拍動、悪心、嘔吐、発汗、及びめまいをもたらす場合がある。しかしながら、ジスルフィラムには、眠気、頭痛、及び頻度はより低いが神経毒性等の一連の副作用のため、臨床的な制限がある。更に、ジスルフィラム及び類似治療薬が有効であるには、典型的には毎日投与が必要とされるため、こうした薬物には、患者服薬遵守が非常に低いという問題がある。

本開示の態様は、対象のアルコール中毒を治療するためのオリゴヌクレオチド及び関連方法に関する。一部の実施形態では、対象のＡＬＤＨ２発現を選択的に阻害するための強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを開発した。一部の実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＡＬＤＨ２活性を低減させ、それによりアルコール耐容性及び／又はアルコール消費の欲求を減少させるために有用である。一部の実施形態では、本明細書において、そのようなオリゴヌクレオチドに基づく手法を使用して特に標的とし易いＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの重要な領域（ホットスポットと呼ばれる）を特定した（実施例１を参照）。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドには、修飾ホスフェート、ニック付きテトラループ構造、並びに／又は活性、生物学的利用能を向上させ、及び／若しくはｉｎｖｉｖｏ投与後の酵素分解の程度を最小限に抑える他の修飾が組み込まれている。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＡＬＤＨ２活性の持続的低減をもたらすことができるため、ＡＬＤＨ２の既存の低分子阻害剤の毎日投与に関連する服薬遵守問題を克服する。

本開示の１つの態様は、ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示されている配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列を含むセンス鎖を更に含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列からなる。

本開示の１つの態様は、ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号６０１〜６０７のいずれか１つに示されているＡＬＤＨ２の標的配列との相補性領域を有する。一部の実施形態では、相補性領域は、長さが少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１連続ヌクレオチドである。一部の実施形態では、相補性領域は、ＡＬＤＨ２の標的配列と完全に相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１９〜２７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜４０ヌクレオチドのセンス鎖であって、アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成するセンス鎖を更に含む。一部の実施形態では、センス鎖は、長さが１９〜４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、二重鎖領域は、長さが少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２との相補性領域は、長さが少なくとも１９連続ヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示されている配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ１はＳ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３〜５ヌクレオチドのループを形成する。

本開示の別の態様は、ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７ヌクレオチドであり、ＡＬＤＨ２との相補性領域を有し、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ１−Ｌ−Ｓ２として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ１はＳ２と相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に長さが３〜５ヌクレオチドのループを形成し、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、長さが少なくとも１９ヌクレオチドの二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていない、オリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、相補性領域は、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１連続ヌクレオチドと完全に相補的である。一部の実施形態では、Ｌはテトラループである。一部の実施形態では、Ｌは、長さが４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２７ヌクレオチドであり、センス鎖は、長さが２５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、長さが２５ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖に長さが２ヌクレオチドの３’突出配列を更に含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々が２１〜２３ヌクレオチドの長さの範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１９〜２１ヌクレオチドの範囲である二重鎖構造を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１又は複数ヌクレオチドの３’突出配列を含み、３’突出配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２ヌクレオチドの３’突出配列を含み、３’突出配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖は、長さが２１ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は長さが２３ヌクレオチドであり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが２１ヌクレオチドの二重鎖を形成する。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは２’修飾を含む。一部の実施形態では、２’修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏメチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’―デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全てが修飾されている。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’炭素は、ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。一部の実施形態では、ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である。一部の実施形態では、ステム−ループのＬの最大で４ヌクレオチドが各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドはアプタマーを含む。

本開示の別の態様は、本開示のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物を提供する。本開示の別の態様は、本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、対象のエタノール耐容性の減少をもたらす。一部の実施形態では、本方法は、対象によるエタノール摂取の阻害をもたらす。一部の実施形態では、本方法は、対象のエタノール消費欲求の減少をもたらす。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、アルコール中毒を罹患している。

本開示の別の態様は、ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、長さが１５〜４０ヌクレオチドのセンス鎖及び長さが１５〜３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖はアンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００から選択される相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表４に示されている表の行から選択される１対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。

本明細書に組み込まれており、本明細書の一部分を構成する添付の図面は、ある実施形態を図示するものであり、記載されている説明と共に、本明細書で開示されている組成物及び方法のある態様の非限定的な例を提供する役目を果たす。

細胞モデル及び動物モデルで試験するための化合物を選択するために、及びＡＬＤＨ２の発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドを開発するために使用される実験設計を示すフローチャートである。ＨｅｐＧ２細胞で２８８個のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドをスクリーニングした後に残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフである。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿０００６９０．３のヌクレオチド位置が、Ｘ軸に示されている。ＨｅｐＧ２細胞で３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）にて９６個のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドをＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドスクリーニングした後に残存したｍＲＮＡのパーセンテージを示す１セットのグラフである。ＨｅｐＧ２細胞で３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）にて９６個のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドをＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドスクリーニングした後に残存したｍＲＮＡのパーセンテージを示す１セットのグラフである。ＨｅｐＧ２細胞で３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）にて９６個のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドをＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドスクリーニングした後に残存したｍＲＮＡのパーセンテージを示す１セットのグラフである。ＨｅｐＧ２細胞で３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）にて９６個のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドをＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドスクリーニングした後に残存したｍＲＮＡのパーセンテージを示す１セットのグラフである。４つのＧａｌＮＡｃ部分（菱形）にコンジュゲートされているニック付きテトラループ構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの非限定的な例を示す模式図である。様々な修飾パターンを有するように構成された、３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）の、ニック付きテトラループ構造の異なる塩基配列のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを使用して、ＨｅｐＧ２細胞でスクリーニングした結果を示す１セットのグラフである。様々な修飾パターンを有するように構成された、３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）の、ニック付きテトラループ構造の異なる塩基配列のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを使用して、ＨｅｐＧ２細胞でスクリーニングした結果を示す１セットのグラフである。様々な修飾パターンを有するように構成された、３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）の、ニック付きテトラループ構造の異なる塩基配列のＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを使用して、Ｈｅｐａ１−６細胞でスクリーニングした結果を示すグラフである。ニック付きテトラループ構造のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏ活性評価を示すグラフである。３つの異なるオリゴヌクレオチド配列を試験した。オリゴヌクレオチドを、３ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照に対して正規化された、投与後４日目に残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を示す。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における、様々な修飾パターンを有するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの持続期間研究の結果を示すグラフである。単一用量（３ｍｇ／ｋｇ）のオリゴヌクレオチドを、非ヒト霊長類に皮下投与した。データは、投与前のＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量と比べて、投与４、１２、及び１６週間後に残存するＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を示す。「^*」は、１頭の非ヒト霊長類を安楽死させ、１６週間の分析には含めなかったことを意味する。マウスにおいてＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを低減するオリゴヌクレオチドの活性を増強する修飾パターンを特定するための、様々な修飾パターンを有するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏアッセイスクリーニングの結果を示すグラフである。マウスでのＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルの低減における、様々な修飾パターンを有するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの活性の比較を示すグラフである。オリゴヌクレオチドを、０．５ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照に対して正規化された、投与後４日目に残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を示した。ＣＤ−１マウスにおける、表示されているＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの用量漸増研究の結果を示すグラフである。オリゴヌクレオチドを、０．１、０．３、０．５ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照に対して正規化され、オリゴヌクレオチド投与の７２時間後に残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を示した。様々な修飾パターンを有するＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドのＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ抑制活性の比較を示すグラフである。オリゴヌクレオチドを、０．５ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照に対して正規化され、投与後４日目に残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を示した。マウスにおける、表示されているＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの持続期間研究の結果を示すグラフである。オリゴヌクレオチドを、３ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与した。データは、ＰＢＳ対照に対して正規化され、投与後３５日目まで残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を示した。

一部の態様によると、本開示は、アルコール中毒を治療するための、細胞、特に肝臓細胞（例えば、肝実質細胞）におけるＡＬＤＨ２発現の低減に効果的な、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。従って、関連態様では、本開示は、アルコール中毒を治療するための方法であって、肝臓におけるＡＬＤＨ２遺伝子発現を選択的に低減させることを含む方法を提供する。ある実施形態では、本明細書で提供されるＡＬＤＨ２標的指向性オリゴヌクレオチドは、標的組織の選択された細胞（例えば、肝臓肝実質細胞）に送達して、対象のアルコール中毒を治療するために設計されている。

用語の定義の説明を含む本開示の更なる態様が下記に提供されている。

Ｉ．定義
アルコール中毒：本明細書で使用される場合、用語「アルコール中毒」は、有害な結果が再発するにも関わらず個体により繰り返されるエタノール使用を指し、耐容性、使用中止、及び／又はアルコール消費に対する制御しがたい衝動が伴っていてもよく又はいなくともよい。アルコール中毒は、アルコール乱用、アルコール使用障害、又はアルコール依存症として分類される場合がある。様々な手法を使用して、アルコール中毒を罹患している個体を特定することができる。例えば、世界保健機構は、依存症を含むアルコール誤使用の可能性を特定するためのツールとしてアルコール使用障害特定試験（ＡＵＤＩＴ、ＡｌｃｏｈｏｌＵｓｅＤｉｓｏｒｄｅｒｓＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＴｅｓｔ）を確立させており、ミシガンアルコールスクリーニング試験（ＭＡＳＴ、ＭｉｃｈｉｇａｎＡｌｃｏｈｏｌＳｃｒｅｅｎｉｎｇＴｅｓｔ）を含む他の類似試験が開発されている。ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、平均赤血球容積（赤血球細胞サイズ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、炭水化物欠損トランスフェリン（ＣＤＴ）、エチルグルクロニド（ＥｔＧ）、硫酸エチル（ＥｔＳ）、及び／又はホスファチジルエタノール（ＰＥｔｈ）のレベルを検出するための検査を含む臨床検査を使用して、飲酒の長期使用及び／又は再発を検出するための血液マーカーを評価してもよい。アルコール中毒の動物モデル（例えば、マウスモデル）が確立されている（例えば、ＲｉｊｋＨ、ＣｒａｂｂｅＪＣ、ＲｉｇｔｅｒＨ．、Ａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ．ＰｈｙｓｉｏｌＢｅｈａｖ．１９８２年１１月；２９巻（５号）：８３３〜９頁；ＥｌｉｚａｂｅｔｈＢｒａｎｄｏｎ−Ｗａｒｎｅｒら、ＲｏｄｅｎｔＭｏｄｅｌｓｏｆＡｌｃｏｈｏｌｉｃＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅ：ＯｆＭｉｃｅａｎｄＭｅｎ、Ａｌｃｏｈｏｌ．２０１２年１２月；４６巻（８号）：７１５〜７２５頁；及びＡｄｅｌｉｎｅＢｅｒｔｏｌａら、Ｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｃｈｒｏｎｉｃａｎｄｂｉｎｇｅｅｔｈａｎｏｌｆｅｅｄｉｎｇ（ｔｈｅＮＩＡＡＡｍｏｄｅｌ）、ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ８巻，６２７〜６３７頁（２０１３年）を参照）。

ＡＬＤＨ２：本明細書で使用される場合、用語「ＡＬＤＨ２」は、アルデヒド脱水素酵素２ファミリー（ミトコンドリア）遺伝子を指す。ＡＬＤＨ２は、アルデヒド脱水素酵素のタンパク質ファミリーに属し、エタノールからアセテート（酢酸）を合成するアルコール代謝の酸化経路の２番目の酵素として機能するタンパク質をコードする。ＡＬＤＨ２の相同体は、ヒト、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類種等を含む一連の種にわたって保存されている（例えば、ＮＣＢＩＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：５５４８０を参照）。また、ＡＬＤＨ２は、例えばＡＬＤＨ１Ａ１を含む、他のアルデヒド脱水素酵素コード遺伝子と相同性を有する。ヒトでは、ＡＬＤＨ２は、各々がそれぞれ異なるアイソフォームＮＰ＿０００６８１．２（アイソフォーム１）及びＮＰ＿００１１９１８１８．１（アイソフォーム２）をコードする、少なくとも２つの転写物、すなわちＮＭ＿０００６９０．３（バリアント１）及びＮＭ＿００１２０４８８９．１（バリアント２）をコードする。転写物バリアント２は、転写物バリアント１と比較して、５’コード領域のインフレームエクソンを欠如し、アイソフォーム１と比較して、より短いアイソフォーム（２）をコードする。ＡＬＤＨ２の遺伝子多型が特定されている（例えば、ＣｈａｎｇＪＳ、ＨｓｉａｏＪＲ、ＣｈｅｎＣＨ．、ＡＬＤＨ２ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄａｌｃｏｈｏｌ−ｒｅｌａｔｅｄｃａｎｃｅｒｓｉｎＡｓｉａｎｓ：ａｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．、ＪＢｉｏｍｅｄＳｃｉ．、２０１７年３月３日；２４巻（１号）：１９頁、総説を参照）。

およそ：本明細書で使用される場合、１つ又は複数の目的の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、表記されている参照値と同様である値を指す。ある実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別様の記述がない限り又は別様に状況から明白でない限り（そのような数値が、可能な値の１００％を超えてしまう場合を除く）、表記されている参照値のいずれかの方向に（よりも大きな又は未満の）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれよりも小さな値内に入る値の範囲を指す。

投与：本明細書で使用される場合、用語「投与する」又は「投与」は、物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を、薬理学的に有用な様式で（例えば、対象の状態を治療するために）対象に提供することを意味する。

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用される場合、用語「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」は、大きな４８ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−１）及び小さな４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−２）により形成される二分Ｃ型レクチンを指す。ＡＳＧＰＲは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有する。

相補的：本明細書で使用される場合、用語「相補的」は、ヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にするヌクレオチド（例えば、一本鎖核酸鎖の向かい合う核酸又は向かい合う領域の２つのヌクレオチド）間の構造的関係性を指す。例えば、向かい合う核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的な一方の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、相補的ヌクレオチドは、ワトソン−クリック様式の、又は安定的二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式の塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載のような、相補性領域を形成するように互いに相補的なヌクレオチド配列を有していてもよい。

デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位に水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又は糖、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。

二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、実質的に二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に別々の核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合的に連結されている核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域の相補的塩基対合は、フォールディングして（例えば、ヘアピンにより）互いに塩基対を形成するヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供する一本鎖核酸鎖で形成される。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖である２つの共有結合的に別々の核酸鎖を含む。しかしながら、一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖であり、例えば一方の又は両方の末端に突出を有する２つの共有結合的に別々の核酸鎖を含む。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であり、従って、内部ミスマッチ又は末端ミスマッチを含んでいてもよい１つ又は複数のミスマッチを有していてもよいヌクレオチドの逆平行配列を含む。

二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する用語「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。

賦形剤：本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の稠度又は安定化効果を提供又は寄与するように組成物に含まれていてもよい非治療剤を指す。

肝実質細胞：本明細書で使用される場合、用語「肝実質細胞」又は「肝実質細胞（複数）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。こうした細胞は、肝臓質量のおよそ７０〜８５％を占め、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及び凝固因子のプロトロンビングループ（第３因子及び第４因子を除く）を製造する。肝実質細胞系統細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミンシンテターゼ（Ｇｌｕｌ）、肝実質細胞核内因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝実質細胞核内因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を挙げることができる。成熟肝実質細胞のマーカーとしては、これらに限定されないが、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（Ｆａｈ）、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２−２Ｆ８を挙げることができる。例えば、Ｈｕｃｈら（２０１３年）、Ｎａｔｕｒｅ、４９４巻（７４３６号）：２４７〜２５０頁を参照されたい。この文献の肝実質細胞マーカーに関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

ループ：本明細書で使用される場合、用語「ループ」は、互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域により隣接される核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非対合領域を指し、非対合領域を隣接する２つの逆平行領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中で、細胞中で）ハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成する。

修飾ヌクレオチド間連結：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド間連結」は、リン酸ジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間連結と比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチド間連結を指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然連結である。典型的には、修飾ヌクレオチド間連結は、修飾ヌクレオチド間連結が存在する核酸に１つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。

修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はホスフェート基に１つ又は複数の化学的修飾を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ又は複数の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース環の２’位に２’−Ｏメチル置換又は２’−Ｆ置換を含む。

ニック付きテトラループ構造：「ニック付きテトラループ構造」は、
別々のセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖）が存在することにより特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、センス鎖は、２つの鎖が二重鎖を形成するようにアンチセンス鎖との相補性領域を有し、鎖の少なくとも一方、一般にはセンス鎖は、二重鎖から伸長し、伸長は、テトラループ及びテトラループに隣接するステム領域を形成する２つの自己相補的配列を含み、テトラループは、少なくとも一方の鎖の自己相補的配列により形成される隣接ステム領域を安定させるように構成されている構造である。

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、長さが１００ヌクレオチド未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／又は修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよく又は有していなくともよい。１セットの非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ、ｄｉｃｅｒｓｕｂｓｔｒａｔｅｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。

突出：本明細書で使用される場合、用語「突出」は、１つの鎖又は領域がそれと二重鎖を形成する相補的鎖の末端を越えて伸長する１つの鎖又は領域から生じる末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から伸長する１つ又は複数の非対合ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、突出は、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖にある３’突出又は５’突出である。

ホスフェート類似体：本明細書で使用される場合、用語「ホスフェート類似体」は、ホスフェート基の静電気特性及び／又は立体特性を模倣する化学部分を指す。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、酵素的に除去され易いことが多い５’−ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置されている。一部の実施形態では、５’ホスフェート類似体は、ホスファターゼ耐性連結を含む。ホスフェート類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’−ＭＰ）及び５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）等の５’ホスホネートが挙げられる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドの糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。４’−ホスフェート類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’−炭素に）又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号パンフレット、２０１６年９月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの５’末端には、他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号パンフレット；米国特許第８，９２７，５１３号明細書；及びＰｒａｋａｓｈら（２０１５年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照、これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。

発現の低減：本明細書で使用される場合、遺伝子の「発現の低減」という用語は、遺伝子によりコードされるＲＮＡ転写物若しくはタンパク質の量の減少、及び／又は適切な参照細胞若しくは参照対象と比較した細胞若しくは対象の遺伝子の活性の量の減少を指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処理する行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、ＲＮＡ転写物、タンパク質、及び／又は酵素活性（例えば、ＡＬＤＨ２遺伝子によりコードされる）の量の減少をもたらすことができる。同様に、「発現を低減する」は、本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、ＡＬＤＨ２）の発現の低減をもたらす行為を指す。

相補性領域：本明細書で使用される場合、用語「相補性領域」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、例えばリン酸緩衝液中、細胞中等で、ヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にするために、ヌクレオチドの逆平行配列（例えば、ｍＲＮＡ内の標的ヌクレオチド配列）と十分に相補的である核酸（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）のヌクレオチドの配列を指す。相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分内に存在する標的ヌクレオチド配列）と完全に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と完全に相補的である相補性領域は、ｍＲＮＡの対応する配列とミスマッチ又はギャップ無しで相補的であるヌクレオチドの連続配列を有する。或いは、相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分内に存在するヌクレオチド配列）と部分的に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と部分的に相補的である相補性領域は、相補性領域が適切なハイブリダイゼーション条件下でｍＲＮＡと依然としてハイブリダイズ可能である限り、ｍＲＮＡの対応する配列と相補的であるが、ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチ又はギャップ（例えば、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くのミスマッチ又はギャップ）を含むヌクレオチドの連続配列を有する。

リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオチド」は、その２’位にヒドロキシル基を含むリボースをそのペントース糖として有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又はリボース、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、２’位以外の原子の１つ又は複数の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドである。

ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部分は、標的ｍＲＮＡの切断に際してアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより使用される、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（又はそのアンチセンス鎖の一部分）は、標的ｍＲＮＡの切断に際してＡｇｏ２エンドヌクレアーゼにより使用される、一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。

鎖：本明細書で使用される場合、用語「鎖」は、ヌクレオチド間連結（例えば、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結）を介して共に連結されているヌクレオチドの単一の連続配列を指す。一部の実施形態では、鎖は、２つの遊離末端、例えば、５’−末端及び３’−末端を有する。

対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は、「対象」と同義的に使用される場合がある。

合成：用語「合成」は、人為的に合成されたか（例えば、機械（例えば、固相核酸合成機）を使用して）、又はそうでなければ通常その分子を産生する天然供給源（例えば、細胞又は生物）に由来しない核酸又は他の分子を指す。

標的指向性リガンド：本明細書で使用される場合、用語「標的指向性リガンド」は、目的の組織又は細胞の同種分子（例えば、受容体）と選択的に結合し、他方の物質を目的の組織又は細胞へと標的化するために別の物質にコンジュゲート可能である分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質）を指す。例えば、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織又は細胞へと標的化するためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、細胞表面受容体と選択的に結合する。従って、一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされると、細胞の表面に発現された受容体との選択的結合により、並びにオリゴヌクレオチド、標的指向性リガンド、及び受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内部移行により、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にする。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞中で標的指向性リガンドから放出されるように、細胞内部移行後に又は細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。

テトラループ：本明細書で使用される場合、用語「テトラループ」は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの１セットのループから平均して予想される隣接ステム二重鎖のＴ_mよりも高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔ_m）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、１０ｍＭＮａＨＰＯ₄中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度を、長さが少なくとも２塩基対の二重鎖を含むヘアピンに付与することができる。一部の実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接ステム二重鎖中の塩基対を安定させることができる。加えて、テトラループのヌクレオチド間の相互作用としては、これらに限定されないが、非ワトソン−クリック型塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられる（Ｃｈｅｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年８月１６日；３４６巻（６２８５号）：６８０〜２頁；Ｈｅｕｓ及びＰａｒｄｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年７月１２日；２５３巻（５０１６号）：１９１〜４頁）。一部の実施形態では、テトラループは、３〜６個のヌクレオチドを含むか又はからなり、典型的には４〜５個のヌクレオチドである。ある実施形態では、テトラループは、修飾されていてもよく又はされていなくともよい（例えば、標的指向性部分にコンジュゲートされていてもよく又はされていなくともよい）３、４、５、又は６個のヌクレオチドを含むか又はからなる。一実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドからなる。任意のヌクレオチドをテトラループに使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５年）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１３巻：３０２１〜３０３０頁に記載の、そのようなヌクレオチドの標準ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ記号を使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、その位置には任意の塩基が存在してもよいことを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、その位置にはＡ（アデニン）又はＧ（グアニン）が存在してもよいことを意味するために使用することができ、「Ｂ」は、その位置にはＣ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）が存在してもよいことを意味するために使用することができる。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９０年１１月；８７巻（２１号）：８４６７〜７１頁；Ａｎｔａｏら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９１年１１月１１日；１９巻（２１号）：５９０１〜５頁）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻（４８号）、１４２８１〜１４２９２頁、２００２年。ＳＨＩＮＪＩら、ＮｉｐｐｏｎＫａｇａｋｋａｉＫｏｅｎＹｏｋｏｓｈｕ第７８巻；２号；７３１頁（２０００年）を参照されたい。これらの文献は、それらの関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、テトラループは、ニック付きテトラループ構造内に含まれている。

治療する：本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、既存の状態（例えば、疾患、障害）と比べて対象の健康及び／又は安寧を向上させるために、又は状態の発生の可能性を予防若しくは減少させるために、例えば、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）を対象に投与することにより、それを必要とする対象に療治を提供する行為を指す。一部の実施形態では、治療は、対象が経験している状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、又は寄与要因の頻度又は重症度を低減させることを含む。

ＩＩ．オリゴヌクレオチドに基づく阻害剤
ｉ．ＡＬＤＨ２標的指向性オリゴヌクレオチド
本明細書では、複数の異なる種（ヒト、カニクイザル、及びマウス（例えば、実施例１を参照））のｍＲＮＡを含むＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの調査並びにｉｎｖｉｔｒｏ試験及びｉｎｖｉｖｏ試験により、強力なオリゴヌクレオチドが特定された。そのようなオリゴヌクレオチドを使用すると、ＡＬＤＨ２活性を低減することにより、並びに結果的にアルコール耐容性及び／又はアルコール消費の欲求を減少させることにより、アルコール中毒対象のための治療利益を達成することができる。例えば、本明細書では、表４に提供されている表にも配置されている（例えば、配列番号５８１に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号５９１に示されている配列を含むアンチセンス鎖）ような、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなるセンス鎖、及び配列番号５９１〜６００から選択される相補的配列を含むか又はからなるアンチセンス鎖を有する強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが提供される。

配列は、複数の異なるオリゴヌクレオチド構造（又は形式）に入れることができる。例えば、一部の実施形態では、配列は、両方とも長さが１７〜３６ヌクレオチドの範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。一部の実施形態では、それらのセンス鎖の３’伸長内にテトラループ構造、及びそのアンチセンス鎖の３’末端に２個の末端突出ヌクレオチドを有するそのような配列が組み込まれているオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、２個の末端突出ヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、アンチセンス鎖の２個の末端ＧＧヌクレオチドの一方又は両方は、標的と相補的ではない。

一部の実施形態では、両方とも長さが２１〜２３ヌクレオチドの範囲であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むそのような配列が組み込まれているオリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、長さが１又は２ヌクレオチドである３’突出が、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に提供される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２３ヌクレオチドのガイド鎖及び２１ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、パッセンジャー鎖の３’−末端及びガイド鎖の５’−末端は平滑末端を形成し、ガイド鎖は２ヌクレオチドの３’突出を有する。

一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのある領域は、他の領域よりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を起こし易いため、標的化のホットスポットであることが発見された。一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２のホットスポット領域は、配列番号６０１〜６０７のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなる。ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのこうした領域は、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ発現を阻害するための本明細書で考察されているオリゴヌクレオチドを使用して標的とすることができる。

従って、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞中のｍＲＮＡを標的としその発現を阻害するための、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ（例えば、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのホットスポット内の）に対する相補性領域を有するように設計されている。相補性領域は、一般に、オリゴヌクレオチド（又はその鎖）がＡＬＤＨ２ｍＲＮＡにアニーリングしてその発現を阻害することを可能にするのに好適な長さ及び塩基内容である。

一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのホットスポット領域内にマッピングされる配列を含む、配列番号１〜１４及び１７〜２９０に示されている配列と少なくとも部分的に相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１４及び１７〜２９０に示されている配列と完全に相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。一部の実施形態では、配列番号１〜１４及び１７〜２９０に示されている配列の連続ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の長さ全体にわたる。一部の実施形態では、配列番号１〜１４及び１７〜２９０のいずれか１つに示されている配列の連続ヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の長さ全体の部分にわたる（例えば、アンチセンス鎖の３’末端の２個のヌクレオチドを除いて）。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号５８１〜５９０に示されている配列のヌクレオチド１〜１９にわたる連続したひと続きのヌクレオチドと少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。

一部の実施形態では、相補性領域は、長さが少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、長さが１２〜３０（例えば、１２〜３０、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７、又は１５〜３０）ヌクレオチドの範囲である、ＡＬＤＨ２との相補性領域を有する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである、ＡＬＤＨ２との相補性領域を有する。

一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２との相補性領域は、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチを有してもよい。オリゴヌクレオチドにある相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＬＤＨ２ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持する限り、最大１つ、最大２つ、最大３つ、最大４つ、最大５つ等のミスマッチを有してもよい。或いは、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＬＤＨ２ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持する限り、１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、又は５つ以下のミスマッチを有してもよい。一部の実施形態では、相補性領域に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、オリゴヌクレオチドが適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＬＤＨ２ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持する限り、連続的に（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれよりも多くが連続して）配置されていてもよく、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。

更に、一部の実施形態では、本明細書に提供されている二本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に提供されている表に配置されているような（例えば、配列番号１に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号２９１に示されている配列を含むアンチセンス鎖）、配列番号１〜１４及び１７〜２９０のいずれか１つに示されている配列を有するセンス鎖、並びに配列番号２９１〜３０４及び３０７〜５８０から選択される相補的配列を含むアンチセンス鎖を含むか又はからなる。

ｉｉ．オリゴヌクレオチド構造
本開示の方法でＡＬＤＨ２を標的とするのに有用なオリゴヌクレオチドには、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等を含む様々な構造が存在する。本明細書又は他所に記載されている構造のいずれかをフレームワークとして使用して、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号６０１〜６０７に示されているもの等の、ＡＬＤＨ２のホットスポット配列）を組み込むか又は標的とすることができる。ＡＬＤＨ２発現を標的とするための二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ経路により）は、一般に、互いに二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されていない。しかしながら、一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されている。

一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２の発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす。例えば、各鎖が、１〜５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’突出を有する１９〜２５ヌクレオチドのサイズを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号明細書を参照）。ダイサーにより処理されて活性ＲＮＡｉ産物を生成するより長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号明細書を参照）。更なる研究により、鎖の一方が熱力学的に安定なテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の末端が二重鎖標的指向性領域を越えて伸長している伸長二本鎖オリゴヌクレオチドがもたらされた（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号明細書及び第８，９２７，７０５号明細書並びに国際公開第２０１００３３２２５号パンフレットを参照。これらの文献は、それらのオリゴヌクレオチドの開示について参照により本明細書に組み込まれる）。そのような構造としては、一本鎖伸長（分子の一方又は両方の側での）並びに二本鎖伸長を挙げることができる。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２１〜２３ヌクレオチドの範囲であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に突出（例えば、長さが１、２、又は３ヌクレオチドの）を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡｓ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスである２１ヌクレオチドのガイド鎖、及び相補的パッセンジャー鎖を含み、両鎖はアニーリングして、１９ｂｐ二重鎖、及びいずれかの又は両方の３’末端に２ヌクレオチドの突出を形成する。例えば、米国特許第９０１２１３８号明細書、米国特許第９０１２６２１号明細書、及び米国特許第９１９３７５３号明細書を参照されたい。これらの文献の各々の内容は、それらの関連開示について本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス−センス二重鎖を越えて伸長する領域を含む３６ヌクレオチドのセンス鎖を有し、伸長領域は、ステムが６塩基対の二重鎖であり、テトラループが４個のヌクレオチドを有するステム−テトラループ構造を有する。こうした実施形態にあるものでは、テトラループヌクレオチドの３個又は４個は各々、一価ＧａｌＮａｃリガンドにコンジュゲートされている。

一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２５ヌクレオチドのセンス鎖、及びダイサー酵素による作用を受けると成熟ＲＩＳＣに組み込まれているアンチセンス鎖がもたらされる２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。

本明細書で開示されている組成物及び方法で使用するための他のオリゴヌクレオチド設計としては、以下のものが挙げられる：１６量体ｓｉＲＮＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ．、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（編）、ＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年を参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ又はそれよりも短いステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅら、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０年；６２９巻：１４１〜１５８頁を参照）、平滑末端ｓｉＲＮＡ（例えば、長さが１９ｂｐｓの；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ及びＢａｋｅｒ、ＲＮＡ１２巻、１６３〜１７６頁（２００６年）を参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ；例えば、Ｓｕｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６巻、１３７９〜１３８２頁（２００８年）を参照）、非対称短鎖二重鎖ｓｉＲＮＡ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｈｏｒｔｅｒ−ｄｕｐｌｅｘｓｉＲＮＡ）（例えば、Ｃｈａｎｇら、ＭｏｌＴｈｅｒ．２００９年４月；１７巻（４号）：７２５〜３２頁を参照）、フォーク型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、５５７巻、１〜３号；２００４年１月、１９３〜１９８頁を参照）、一本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３０巻、１０６３頁（２０１２年））、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅら、ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ１２９巻：１５１０８〜１５１０９頁（２００７年）を参照）、及び低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｎａｌｌｙｓｅｇｍｅｎｔｅｄｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）（ｓｉｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００７年９月；３５巻（１７号）：５８８６〜５８９７頁を参照）。上述の参考文献の各々は、その中の関連開示についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＬＤＨ２の発現を低減又は阻害するために一部の実施形態で使用することができるオリゴヌクレオチド構造の更なる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡである（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、ＥｍｂｏＪ．、２００２年、２１巻（１７号）：４６７１〜４６７９頁を参照；また米国特許出願公開第２００９００９９１１５号明細書を参照）。

ａ．アンチセンス鎖
一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２を標的とするための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号２９１〜３０４、３０７〜５８０、及び５９１〜６００のいずれか１つに示されている配列を含むか又はからなるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２９１〜３０４、３０７〜５８０、及び５９１〜６００のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１２（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むか又はからなるアンチセンス鎖を含む。

一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが最大で４０ヌクレオチド（例えば、長さが最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２７、最大で２５、最大で２１、最大で１９、最大で１７、又は最大で１２ヌクレオチド）のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも３８ヌクレオチド）のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０）ヌクレオチドの範囲のアンチセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有してもよい。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる場合がある。例えば、アンチセンス鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と係合し、アルゴノートタンパク質に結合するか、又は１つ若しくは複数の類似因子と係合若しくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指図する場合、それをガイド鎖と呼ぶことができる。一部の実施形態では、ガイド鎖と相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる場合がある。

ｂ．センス鎖
一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２を標的とするための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１４、１７〜２９０、及び５８１〜５９０のいずれか１つに示されているセンス鎖配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１４、１７〜２９０、及び５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列の少なくとも１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むか又はからなるセンス鎖を有する。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが最大で４０ヌクレオチド（例えば、長さが最大で４０、最大で３５、最大で３０、最大で２７、最大で２５、最大で２１、最大で１９、最大で１７、又は最大で１２ヌクレオチド）のセンス鎖（又はパッセンジャー鎖）を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも３８ヌクレオチド）のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０、又は３２〜４０）ヌクレオチドの範囲のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドのセンス鎖を有してもよい。

一部の実施形態では、センス鎖は、その３’−末端にステム−ループ構造を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、その５’−末端にステム−ループ構造を含む。一部の実施形態では、ステムは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４ヌクレオチドの二重鎖である。一部の実施形態では、ステム−ループは、分解（例えば、酵素的分解）に対するより良好な保護を分子に提供し、標的細胞へと送達するための標的指向性特徴を容易にする。例えば、一部の実施形態では、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に影響を及ぼさず修飾を行うことができる、追加のヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、センス鎖が（例えば、その３’−末端に）Ｓ₁−Ｌ−Ｓ₂として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ₁は、Ｓ₂と相補的であり、Ｌは、Ｓ₁とＳ₂との間に長さが最大で１０ヌクレオチド（例えば、長さが３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド）のループを形成するオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。

一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）は、テトラループである（例えば、ニック付きテトラループ構造内の）。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せを含んでいてもよい。典型的には、テトラループは、４〜５ヌクレオチドを有する。

ｃ．二重鎖の長さ
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１）ヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１２〜３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２〜３０、１２〜２７、１２〜２２、１５〜２５、１８〜３０、１８〜２２、１８〜２５、１８〜２７、１８〜３０、１９〜３０、又は２１〜３０ヌクレオチド）の範囲である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の長さ全体にはわたっていない。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの長さ全体にわたる。ある実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の長さ全体にわたる。

ｄ．オリゴヌクレオチド末端
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に、３’−突出が存在する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、一方の５’末端が、他方の５’末端と比較して熱力学的により不安定である。一部の実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３’末端に突出を含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’突出は、長さが１〜８ヌクレオチド（例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７、又は８ヌクレオチド）である。

典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２ヌクレオチドの突出を有する。しかしながら、他の突出が可能である。一部の実施形態では、突出は、１〜６ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヌクレオチドの長さを含む３’突出である。しかしながら、一部の実施形態では、突出は、１〜６ヌクレオチド、任意選択で１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヌクレオチドの長さを含む５’突出である。

一部の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端の１つ又は複数の（例えば、２、３、４個の）末端ヌクレオチドは修飾されている。例えば、一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１個又は２個の末端ヌクレオチドは修飾されている。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドは修飾されており、例えば２’−修飾、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個又は２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個又は２個のヌクレオチドは、標的と相補的でない。一部の実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端は、逆向きキャップヌクレオチドを有する。

ｅ．ミスマッチ
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間には１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの）ミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、連続的に配置されていてもよく（例えば、２つ、３つ、又はそれよりの多くが連続して）、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。一部の実施形態では、センス鎖の３’−末端は、１つ又は複数のミスマッチを含む。一実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’−末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化は、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を向上させた。

ｉｉｉ．一本鎖オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、本明細書に記載のような、ＡＬＤＨ２発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、これらに限定されないが、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを挙げることができる。最近の努力により、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉら（２０１６年５月）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ、２４巻（５号）、９４６〜９５５頁を参照）。しかしながら、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載して、特定の核酸の標的とされているセグメントの逆相補体を含み、（例えば、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）として）細胞での標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ誘導性切断を誘導するように、又は（例えば、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）として）細胞での標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように好適に修飾されている核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本開示で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５６７，５８７号明細書に示されているものを含む、当該技術で公知の任意の好適な様式で修飾することができる（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、及び核酸塩基のヘテロ環部分の変更を含む）。更に、アンチセンス分子は、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために、数十年にわたって使用されている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｓｅｎｓｅＤｒｕｇｓ，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５７巻：８１〜１０５頁を参照）。

ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
オリゴヌクレオチドは、種々の方法で修飾して、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布、及び細胞取り込み、及び治療使用又は研究使用に関連する他の特徴を向上又は制御することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁；Ｂｒａｍｓｅｎ及びＫｊｅｍｓ（ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、３巻（２０１２年）：１〜２２頁を参照されたい。従って、一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の好適な修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はホスフェート基に修飾を有する。

オリゴヌクレオチドの修飾の数及びそうしたヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を及ぼす場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、それらを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は類似の担体にコンジュゲートすることにより又は包含させることにより、ｉｎｖｉｖｏ送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体により保護されていない場合（例えば、「ネイキッド送達」）、そのヌクレオチドの少なくとも一部を修飾することが有利であり得る。従って、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれかのある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全て又は実質的に全てが修飾されている。ある実施形態では、ヌクレオチドの半分よりも多くが修飾されている。ある実施形態では、ヌクレオチドの半分未満が修飾されている。典型的には、ネイキッド送達の場合、全ての糖の２’位が修飾されている。こうした修飾は、可逆的であってもよく又は不可逆的であってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素的分解からの保護、ｉｎｖｉｖｏ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性）をもたらすのに十分な数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。

ａ．糖修飾
一部の実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）としては、例えば、糖の２’、３’、４’、及び／又は５’炭素位置に１つ又は複数の修飾が生じる修飾デオキシリボース又はリボース部分が挙げられる。また、一部の実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら（１９９８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ５４巻、３６０７〜３６３０頁を参照）、アンロックド核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄら（２０１３年）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ−ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ、２巻、ｅ１０３頁を参照）、及び架橋核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａ（２００２年）、ＴｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６５３〜１６５９頁を参照）に存在するもの等の、非天然代替炭素構造を含んでいてもよい。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、並びにＩｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａは、糖修飾に関するそれらの開示が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、糖のヌクレオチド修飾は、２’−修飾を含む。ある実施形態では、２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏメチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、又は２’―デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸であってもよい。典型的には、修飾は、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチルである。しかしながら、オリゴヌクレオチドに使用するために開発された種々様々な２’位修飾を、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドに使用することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２００９年、３７巻、２８６７〜２８８１頁を参照されたい。一部の実施形態では、糖の修飾は、糖環の１つ又は複数の炭素の修飾を含んでいてもよい、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’−炭素と１’−炭素又は４’−炭素との間の連結を含んでいてもよい。例えば、連結は、エチレン架橋又はメチレン架橋を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’−炭素と３’−炭素との結合を欠如する非環式糖を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば糖の４’位にチオール基を有する。

一部の実施形態では、末端３’−末端基（例えば、３’−ヒドロキシル）は、ホスフェート基、或いは例えば、リンカー、アダプター、若しくは標識を付着させるために、又はオリゴヌクレオチドを別の核酸と直接ライゲーションさせるために使用することができる他の基である。

ｂ．５’末端ホスフェート
オリゴヌクレオチドの５’−末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を増強してもよく又は一部の場合では増強する。しかしながら、５’−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素による分解に感受性であってもよく、それによりｉｎｖｉｖｏでのそれらの生物学的利用能を制限することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性である５’ホスフェートの類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’−ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分（「ホスフェート模倣体」）に付着されている（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら（２０１５年）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１５年３月３１日；４３巻（６号）：２９９３〜３０１１頁を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。５’末端に付着させることができるホスフェート模倣体が数多く開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号明細書を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。オリゴヌクレオチドの５’末端のための他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号パンフレットを参照。この文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着されている。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’−炭素位置にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ばれる）。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号パンフレット、２０１６年９月２日に出願された、４’−ＰｈｏｓｐｈａｔｅＡｎａｌｏｇｓａｎｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇｔｈｅＳａｍｅと題する米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号明細書、及び２０１６年９月１２日に出願された、４’−ＰｈｏｓｐｈａｔｅＡｎａｌｏｇｓａｎｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇｔｈｅＳａｍｅと題する第６２／３９３，４０１号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチドに４’−ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’−炭素に）又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子が糖部分又はその類似体の４’−炭素に結合されているチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートである。ある実施形態では、４’−ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネートである。一部の実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式−Ｏ−ＣＨ₂−ＰＯ（ＯＨ）₂又は−Ｏ−ＣＨ₂−ＰＯ（ＯＲ）₂により表され、式中Ｒは、独立してＨ、ＣＨ₃、アルキル基、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＯＣＯＣ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、又は保護基から選択される。ある実施形態では、アルキル基はＣＨ₂ＣＨ₃である。より典型的には、Ｒは、独立してＨ、ＣＨ₃、又はＣＨ₂ＣＨ₃から選択される。

ｃ．修飾ヌクレオシド間連結
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ホスフェート修飾又は置換は、少なくとも１つの（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの）修飾ヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドをもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１〜１０個の（例えば、１〜１０、２〜８、４〜６、３〜１０、５〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２個の）修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾ヌクレオチド間連結を含む。

修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロジチオエート連結、ホスホロチオエート連結、ホスホトリエステル連結、チオノアルキルホスホネート連結、チオノアルキルホスホトリエステル連結、ホスホラミダイト連結、ホスホネート連結、又はボラノホスフェート連結であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。

ｄ．塩基修飾
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。一部の実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に連結されている。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含んでいない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含んでいない（脱塩基）。

一部の実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位に、又は二重鎖に存在する場合、二重鎖の構造を実質的に変更することなく１つよりも多くのタイプの塩基の反対側に配置することができるヌクレオチド糖部分置換の等価位置に位置するヘテロ環式部分である。一部の実施形態では、標的核酸と完全に相補的な参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸で形成される二重鎖よりも低いＴ_mを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。しかしながら、一部の実施形態では、ユニバーサル塩基が、単一のミスマッチを生成するように塩基と置き換えられている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いＴ_mを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。

ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらの米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号明細書；ＶａｎＡｅｒｓｃｈｏｔら、Ａｎａｃｙｃｌｉｃ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅａｎａｌｏｇｕｅａｓａｍｂｉｇｕｏｕｓｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９５年１１月１１日；２３巻（２１号）：４３６３〜７０頁；Ｌｏａｋｅｓら、３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅａｎｄ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅａｓｕｎｉｖｅｒｓａｌｂａｓｅｓｉｎｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＰＣＲ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９５年７月１１日；２３巻（１３号）：２３６１〜６頁；Ｌｏａｋｅｓ及びＢｒｏｗｎ、５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅａｓａｎｕｎｉｖｅｒｓａｌｂａｓｅａｎａｌｏｇｕｅ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９４年１０月１１日；２２巻（２０号）：４０３９〜４３頁。上述の文献の各々はそれらの塩基修飾に関する開示について参照により本明細書に組み込まれている）。

ｅ．可逆的修飾
ある修飾をなして、標的細胞に到達する前のｉｎｖｉｖｏ環境からオリゴヌクレオチドを保護することができるが、それらは、標的細胞のサイトゾルに到達するとオリゴヌクレオチドの効力又は活性を低減させる場合がある。分子が細胞の外部で望ましい特性を維持するように可逆的修飾をなすことができ、その後可逆的修飾は、細胞のサイトゾル環境に進入すると除去される。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内部の化学条件により（例えば、細胞内グルタチオンによる還元により）除去することができる。

一部の実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート連結により創出される負電荷を遮蔽し、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を向上させるように、環式ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。元々はＴｒａｖｅｒｓａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．社に帰属する米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号明細書（「Ｔｒａｖｅｒｓａ」）、ＳｏｌｓｔｉｃｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｔｄ．社の国際公開第２０１５／１８８１９７号パンフレット（「Ｓｏｌｓｔｉｃｅ」）、Ｍｅａｄｅら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、３２巻：１２５６〜１２６３頁（「Ｍｅａｄｅ」）、ＭｅｒｃｋＳｈａｒｐ＆ＤｏｈｍｅＣｏｒｐ社の国際公開第２０１４／０８８９２０号パンフレットを参照されたい。これらの文献の各々は、そのような修飾の開示について参照により組み込まれる。ヌクレオチド間ジホスフェート連結のこの可逆的修飾は、サイトゾルの還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計されている。初期の例としては、細胞内部で切断可能であることが報告された中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３年、１２５巻：９４０〜９５０頁）。

一部の実施形態では、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の過酷な環境条件（例えば、ｐＨ）に曝されることになるｉｎｖｉｖｏ投与中（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソームコンパートメントを通過中）の保護を可能にする。修飾は、グルタチオンのレベルが細胞外空間と比較してより高い細胞のサイトゾルへと放出されると、元に戻り、その結果としてオリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部分を使用すると、不可逆的化学修飾を使用する場合に利用可能な選択肢と比較して、立体的により大きな化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、そうしたより大きな化学基は、サイトゾルで除去されるため、細胞のサイトゾル内部のオリゴヌクレオチドの生物学的活性を妨害するはずがないからである。結果として、そうしたより大きな化学基を組み込んで、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び低免疫原性等の種々の利点をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに付与することができる。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造を組み込んで、その放出の動力学を修飾することができる。

一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドである場合、糖の５’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオチドである場合、糖の３’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８２３９号パンフレット、及び２０１６年８月２３日に出願された、ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇＲｅｖｅｒｓｉｂｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＵｓｅｓＴｈｅｒｅｏｆと題する米国特許仮出願第６２／３７８，６３５号明細書を参照されたい。これらの文献の内容は、その関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。

ｖ．標的指向性リガンド
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを、１つ若しくは複数の細胞又は１つ若しくは複数の臓器に標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器における望ましくない効果の回避を支援することができるか、又はオリゴヌクレオチドが利益とならない細胞、組織、若しくは臓器へのオリゴヌクレオチドの過度の喪失を回避することができる。従って、一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、又は臓器の標的化を容易にするように、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易するように修飾されていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされているヌクレオチドを含む。

標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質若しくはタンパク質の一部分（例えば、抗体若しくは抗体断片）、又は脂質を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的指向性リガンドはアプタマーである。例えば、標的指向性リガンドは、腫瘍血管系又は神経膠腫細胞を標的とするために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍血管系若しくはストーマ、トランスフェリン、ラクトフェリンを標的とするためのＣＲＥＫＡペプチド、又はＣＮＳ血管系で発現されるトランスフェリン受容体を標的とするためのアプタマー、又は神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とするための抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。ある実施形態では、標的指向性リガンドは、１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ部分である。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）ヌクレオチドは各々、別々の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの２〜４個のヌクレオチドは各々、別々の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、標的指向性リガンドが歯ブラシの毛部分に相似し、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに相似するように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部分にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、例えば２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６／１００４０１号パンフレットに記載のような標的指向性リガンドに個々にコンジュゲートされていてもよい。この文献の関連内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２の発現を低減させるオリゴヌクレオチドを、対象の肝臓の肝実質細胞へと標的化することが望ましい。任意の好適な肝実質細胞指向性部分をこの目的に使用することができる。

ＧａｌＮＡｃは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）のための高親和性リガンドである。ＧａｌＮＡｃ部分を本開示のオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションすることにより（間接的又は直接的のいずれかで）、そうしたオリゴヌクレオチドを、そうした肝実質細胞上で発現されるＡＳＧＰＲへと標的化することができる。

一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つよりも多くの一価ＧａｌＮＡｃに直接的に又は間接的にコンジュゲートされている（つまり、２つ、３つ、又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされており、典型的には３つ又は４つの一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている）。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、又は６個の）ヌクレオチドは各々、ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ステム−ループのループ（Ｌ）の２〜４個のヌクレオチドは各々、別々のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛部分に相似し、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに相似するように、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の２〜４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端の２〜４個ヌクレオチドの突出又は伸長部分にコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端又は３’末端のいずれかにステム−ループを含んでいてもよく、ステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドは、個々にＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされている。例えば、各ＧａｌＮＡｃ部分が１個のヌクレオチドにコンジュゲートされる場合、４つのＧａｌＮＡｃ部分が、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。

適切な方法又は化学（例えば、クリック化学）を使用して、標的指向性リガンドをヌクレオチドに連結することができる。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、アセタールに基づくリンカーを使用して、標的指向性リガンドを、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１個のヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。アセタールに基づくリンカーは、例えば、２０１６年６月２３日に公開された国際公開第２０１６１００４０１号Ａ１パンフレットに開示されている。そのようなリンカーに関するこの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、かなり安定である。一部の実施形態では、二重鎖伸長部分（長さが最大で３、４、５、又は６塩基対）が、標的指向性リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に提供されている。

ＩＩＩ．製剤
オリゴヌクレオチド使用を容易にするための種々の製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び／若しくは取り込みを容易にするか、又は製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書には、ＡＬＤＨ２の発現を低減させるオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が提供される。そのような組成物は、標的細胞の直近環境に又は全身性のいずれかで対象に投与されると、十分な割合のオリゴヌクレオチドが細胞に進入して、ＡＬＤＨ２発現を低減するように好適に製剤化することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書で開示されているＡＬＤＨ２を低減するためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩溶液等の緩衝液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドで製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートを、水又は水溶液（例えば、ｐＨ調整剤を有する水）で製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートを、塩基性緩衝水溶液（例えば、ＰＢＳ）で製剤化される。

カチオン性脂質を有するオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）等のカチオン性脂質を使用することができる。好適な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＮＣ３８８（ＲｉｂｏｚｙｍｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社、ボールダー、コロラド州）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられ、これらは全て製造業者の使用説明書に従って使用することができる。

従って、一部の実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、若しくはナノ粒子を含むか、又はそうでなければそれを必要とする対象の細胞、組織、臓器、若しくは体内に投与するために製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、第２２版、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ、２０１３年を参照）。

一部の実施形態では、本明細書で開示されている製剤は、賦形剤を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、組成物に、安定性の向上、吸収の向上、溶解度の向上、及び／又は活性成分の治療増強を付与する。一部の実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、又は水酸化ナトリウム）又はビヒクル（例えば、緩衝溶液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱物油）である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その保管寿命を延長するために凍結乾燥され、その後使用（例えば対象への投与）前に溶液にされる。従って、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドン）、又は崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、フィコール、又はゼラチン）であってもよい。

一部の実施形態では、医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、径粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。典型的には、投与経路は、静脈内又は皮下である。

注射使用に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散物、及び無菌注射溶液又は分散物の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与又は皮下投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいだろう。無菌注射溶液は、必要とされる量のオリゴヌクレオチドを、上記に列挙されている成分の１つ又は組合せを有する選択された溶媒に組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。

一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％又はそれよりも多くの治療剤（例えば、ＡＬＤＨ２発現を低減するためのオリゴヌクレオチド）を含んでいてもよいが、活性成分のパーセンテージは、全組成物の質量又は容積の約１％〜約８０％又はそれよりも大きくてもよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品保管寿命等の要因、並びに他の薬学的考慮要因が、そのような医薬製剤を調製する当業者により企図されることになり、従って様々な投薬量及び治療レジメンが望ましくてもよい。

幾つかの実施形態は、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達に関するが、他の組織標的化も企図される。

ＩＶ．使用方法
ｉ．細胞でのＡＬＤＨ２発現低減
一部の実施形態では、細胞でのＡＬＤＨ２の発現を低減させるための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、任意の適切な細胞タイプに有用である。一部の実施形態では、細胞は、ＡＬＤＨ２を発現するあらゆる細胞（例えば、肝実質細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺がん細胞、脳、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、胃腸管、膀胱、脂肪及び柔組織、並びに皮膚の細胞）である。一部の実施形態では、細胞は、対象から得られたものであり、細胞が実質的にその天然表現型特性を維持するように、継代の回数が限定的であってもよい初代細胞である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、ｅｘｖｉｖｏであってもよく又はｉｎｖｉｔｒｏであってもよい（つまり、培養中の細胞に、又は細胞が存在する生物に送達することができる）。具体的な実施形態では、肝実質細胞のみにおいてＡＬＤＨ２の発現を低減させるための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。

一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含む溶液を注射すること、オリゴヌクレオチドで覆われている粒子で衝撃すること、オリゴヌクレオチドを含む溶液を細胞又は生物と接触させること、又はオリゴヌクレオチドの存在下で細胞膜をエレクトロポレーションすることを含む、適切な核酸送達方法を使用して導入することができる。脂質媒介性担体輸送、化学媒介性輸送、及びリン酸カルシウム等のカチオン性リポソームトランスフェクション等の、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適切な方法を使用することができる。

阻害の結果は、細胞又は対象の１つ又は複数の特性を評価するための適切なアッセイにより、又はＡＬＤＨ２発現（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を示す分子を評価する生化学的技法により確認することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドが、ＡＬＤＨ２の発現レベルを低減する程度は、発現レベル（例えば、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベル）を適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていないか又は陰性対照が送達されている細胞又は細胞集団でのＡＬＤＨ２発現のレベル）と比較することにより評価される。一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定する必要がないように、所定のレベル又は値であってもよい。所定のレベル又は値は、様々な形態をとることができる。一部の実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均値等の、単一のカットオフ値であってもよい。

一部の実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの投与は、細胞でのＡＬＤＨ２発現レベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、ＡＬＤＨ２発現レベルの低減は、ＡＬＤＨ２の適切な対照レベルと比較して、１％若しくはそれよりも低い、５％若しくはそれよりも低い、１０％若しくはそれよりも低い、１５％若しくはそれよりも低い、２０％若しくはそれよりも低い、２５％若しくはそれよりも低い、３０％若しくはそれよりも低い、３５％若しくはそれよりも低い、４０％若しくはそれよりも低い、４５％若しくはそれよりも低い、５０％若しくはそれよりも低い、５５％若しくはそれよりも低い、６０％若しくはそれよりも低い、７０％若しくはそれよりも低い、８０％若しくはそれよりも低い、又は９０％若しくはそれよりも低い低減であってもよい。適切な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞集団でのＡＬＤＨ２発現レベルであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法による、細胞へのオリゴヌクレオチド送達の効果は、有限期間後に評価される。例えば、ＡＬＤＨ２のレベルは、オリゴヌクレオチドを細胞に導入した少なくとも８時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後に；又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、若しくは１４日後に、細胞にて分析してもよい。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞でオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子の形態で送達される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されている任意のオリゴヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド又は合成ｍＲＮＡ）を使用して送達してもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接注射してもよい。

ｉｉ．治療方法
本開示の態様は、対象のアルコール中毒を治療するためにＡＬＤＨ２発現を低減するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象に本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を投与することを含んでいてもよい。そのような治療は、例えば、対象のエタノール耐容性を減少させ、それにより対象によるエタノール摂取を阻害する（例えば、対象のエタノール消費欲求を減少させることにより）ために使用することができる。本開示は、アルコール中毒及び／又はアルコール中毒に関連する疾患若しくは障害のリスクがある（影響を受け易い）対象を処置するための予防法及び治療法の両方を提供する。

ある態様では、本開示は、対象に治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド又はそれをコードするベクター若しくは導入遺伝子）を投与することにより、本明細書に記載のような疾患又は障害を対象において予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、治療しようとする対象は、ＡＬＤＨ２タンパク質の量を、例えば肝臓において低減させることから治療的に利益を得ることになる対象である。

本明細書に記載の方法は、典型的には、有効量の、すなわち望ましい治療結果をもたらすことができる量のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。治療的に許容される量は、疾患又は障害を治療することが可能な量であってもよい。任意の１つの対象にとって適切な投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間及び経路、全体的な健康、並びに同時に投与されている他の薬物を含むある要因に依存することになる。

一部の実施形態では、対象には、本明細書で開示されている組成物のいずれか１つが、経腸的に（例えば、経口的に、経胃栄養チューブにより、十二指腸栄養チューブにより、胃瘻により、又は直腸的に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射又は注入、動脈内注射又は注入、筋肉内注射）、局所的に（例えば、上皮に、吸入により、目薬により、又は粘膜を介して）、又は標的臓器（例えば、対象の肝臓）への直接注射により投与される。典型的には、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、静脈内に又は皮下に投与される。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）の範囲の用量で投与される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の、又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。

非限定的なセットの例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、典型的には、１年に１回、１年に２回、四半期毎に（３か月毎に１回）、２か月に１回（２か月毎に１回）、毎月、又は毎週投与されるだろう。

一部の実施形態では、治療しようとする対象は、ヒト又は非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコ等の飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリ等の家畜；並びにマウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の動物が挙げられる。

実施例１：ヒト及びマウス細胞に基づくアッセイを使用したＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド阻害剤の開発
図１は、ヒト及びマウスに基づくアッセイを使用して、ＡＬＤＨ２発現を阻害するための候補オリゴヌクレオチドを開発するためのワークフローを示す。まず、コンピューターに基づくアルゴリズムを使用して、ＡＬＤＨ２を阻害するための候補オリゴヌクレオチド配列（２５〜２７量体）を生成した。その後、細胞に基づくアッセイ及びＰＣＲアッセイを使用して、候補オリゴヌクレオチドを、ＡＬＤＨ２発現を低減させるそれらの能力について評価した。

コンピューターに基づくアルゴリズムにより、ヒトＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ（配列番号６０８、表１）に相補的だったオリゴヌクレオチドがもたらされた。それらのある配列は、カニクイザルＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ（配列番号６０９、表１）及び／又はマウスＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ（配列番号６１０、表１）にも相補的だった。

アルゴリズムにより提供されたオリゴヌクレオチドのうち、２８８個のオリゴヌクレオチドを、ＨｅｐＧ２細胞に基づくアッセイでの実験評価の候補として選択した。このアッセイでは、ＡＬＤＨ２を発現するヒト肝癌細胞であるＨｅｐＧ２を、オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクション後ある期間にわたって細胞を維持し、その後残存ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に基づくｑＰＣＲアッセイを使用して調査した。２つのｑＰＣＲアッセイ、３’アッセイ及び５’アッセイを使用して、それぞれＨＥＸプローブ及びＦＡＭプローブにより測定されるｍＲＮＡレベルを決定した。２８８個のオリゴヌクレオチドを用いたＨｅｐＧ２細胞に基づくアッセイの結果は、図２に示されている。残存ｍＲＮＡパーセントは、３’アッセイ（円形）及び５’アッセイ（菱形）の各々について示されている。陰性対照と比較して２５％以下の残存ｍＲＮＡをもたらすオリゴヌクレオチドをヒットとみなした。ヒトゲノムとの相補性が低いオリゴヌクレオチドを陰性対照として使用した。

これらのオリゴヌクレオチドの活性及び位置に基づき、ヒトＡＬＤＨ２ｍＲＮＡのホットスポットを画定した。ホットスポットは、いずれかのアッセイにおいて対照と比較して２５％以下のｍＲＮＡレベルをもたらす少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに付随するひと続きのヒトＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ配列として特定した。従って、以下のホットスポットが、ヒトＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ配列内で特定された：１８１〜２７３；４４５〜５３９；６４６〜６９６；６９１〜７４９；１１６５〜１２３５；１７７０〜１８２１；及び１８２４〜１９１６。

ホットスポットの配列は、表２に概説されている。

用量応答分析
初期のＨｅｐＧ２細胞に基づくアッセイで評価した２８８個のオリゴヌクレオチドのうち、９６個の特に活性だったオリゴヌクレオチドを、ＡＬＤＨ２レベルをノックダウンするそれらの能力に基づいてヒットとして選択し、二次スクリーニングに供した。

この二次スクリーニングでは、候補オリゴヌクレオチドを、一次スクリーンと同じだが、３つの異なる濃度（１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ）でのアッセイを使用して試験した（図３Ａ〜３Ｄ）。標的ｍＲＮＡレベルを、試料にわたって安定的発現参照を提供するハウスキーピング遺伝子であるスプライシング因子アルギニン／セリンリッチ９（ＳＦＲＳ９）に対して正規化して、図３Ａ〜３Ｄに示されているｍＲＮＡパーセントを生成した。図３Ａ〜３Ｄの各々における試験したオリゴヌクレオチドは、陰性対照配列（ＮＣ１、ＮＣ５、ＮＣ７、ＢＣＡＴＮＣ）及び擬似トランスフェクションと比較して示されている。９６個のオリゴヌクレオチドは全て、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの組合せを含む、Ｍ１と表記されている同じ修飾パターンを有していた。試験した９６個のオリゴヌクレオチドの配列は、表３に提供されている（配列番号１５〜１６及び３０５〜３０６のデータは、図３Ａ〜３Ｄには示されていない）。

Ｈｓ：ヒト、Ｃｍ：カニクイザル、及びＭｍ：マウス。センス配列番号及びアンチセンス配列番号の欄は、ハイブリダイズして各オリゴヌクレオチドになるセンス鎖及び対応するアンチセンス鎖をそれぞれの順番で提供する。例えば、配列番号１のセンス鎖は、配列番号２９１のアンチセンス鎖とハイブリダイズし、配列番号２のセンス鎖は、配列番号２９３のアンチセンス鎖とハイブリダイズする。試験したオリゴヌクレオチドの各々は、同じ修飾パターンを有していた。

この段階で、試験で性能が最良だった８つのオリゴヌクレオチドを更なる試験のために選択した。選択したオリゴヌクレオチドを、ニック付きテトラループ構造形式（２２量体ガイド鎖を有する３６量体パッセンジャー鎖）に変換した。基本テトラループ構造は、図４を参照されたい。その後、こうしたオリゴヌクレオチドを以前と同様に試験し、ＨｅｐＧ２細胞においてＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ発現を低減するその能力について３つの濃度にて各オリゴヌクレオチドを評価した。図５Ａ〜５Ｂは、ニック付きテトラループ構造を有する異なる塩基配列で製作されており、各々が６つの異なる修飾パターンを有するように構成されているオリゴヌクレオチドのデータを示す。標的ｍＲＮＡレベルを、上記に記載のように正規化して、図５Ａ〜５Ｂに示されているｍＲＮＡパーセントを生成し、図５Ａ〜５Ｂの各々における試験したオリゴヌクレオチドは、陰性対照配列（ＢＣＡＴ、Ｃ１２１、ＮＣ１、ＮＣ７）及び擬似トランスフェクションと比較して示されている。配列番号５８１〜５８２及び配列番号５９１〜５９２のデータは、図５Ａ〜５Ｂには示されていない。

あるテトラループ修飾オリゴヌクレオチドを、各化合物について同じ修飾パターンを使用してＨｅｐａ１−６細胞において更に試験した（図６）。標的ｍＲＮＡレベルを、試料にわたって安定的発現参照を提供するハウスキーピング遺伝子であるヒポキサンチンリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に基づいて正規化した。図６における試験したオリゴヌクレオチドは、陰性対照配列（ＢＣＡＴＮＣ、ＮＣ１、ＮＣ５、ＮＣ７）及び擬似トランスフェクションと比較して示されている。

ｉｎｖｉｖｏマウス実験作業
上記のｉｎｖｉｔｒｏ実験のデータを評価して、マウス肝実質細胞でのＡＬＤＨ２発現低減活性を維持しつつ、送達特性を向上させることになるテトラループ及び修飾パターンを特定した。その後、この分析に基づいて、選択したオリゴヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした。４つのＧａｌＮＡｃ部分を、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートした。コンジュゲーションは、クリックリンカーを使用して実施した。使用したＧａｌＮＡｃは、下記に示されている通りだった。

Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミン（ＣＡＳ＃：１４１３１−６０−３）

ニック付きテトラループ構造を有する様々な修飾パターンを有する３つの異なる塩基配列の合計６つの非常に強力なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、３ｍｇ／ｋｇにてＣＤ−１マウスに皮下投与した。マウスを、投与後４日目に安楽死させた。肝臓試料を得、ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ｑＰＣＲによりＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを評価した。こうした測定に基づいて、ＰＢＳ対照ｍＲＮＡと比較したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡパーセントを決定した。それらは図７に示されている。

実施例２：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの持続期間研究
この研究は、様々な修飾パターン（例えば、異なる数の２’フルオロ修飾及び／又は異なる数のホスホロチオエート連結をアンチセンス鎖に有する修飾パターン）を有する単一用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの薬力学を評価するために設計した。この研究で試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１４、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１５、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１６、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１７、Ｓ５８７−ＡＳ５９７−Ｍ２３、及びＳ５８７−ＡＳ５９７−Ｍ２４だった。単一用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、非ヒト霊長類（各群ｎ＝４）に３ｍｇ／ｋｇにて皮下投与した。動物を一晩断食させ、翌朝給餌する前に、血清試料及び肝生検を収集した。各動物について順化中に１つの投薬前生検を収集し、投与の４、８、又は１２、又は１６週間後に、３つの生検を収集した。生検を２つの画分に分割し、一方を瞬間凍結して−８０℃で保管し、他方をＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で処理し、ｍＲＮＡレベル分析のために４℃で保管した。

投与前のＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量と比べた、投与の４、８、１２、又は１６週間後に残存したＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの量を、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で分析した。結果は、６つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドのうち４つが、約５０％のＡＬＤＨ２ｍＲＮＡ抑制を達成し、効果は、単一３ｍｇ／ｋｇ用量後の３か月にわたって維持されたことを示した（図８）。こうした結果により、提案された投薬頻度がヒトでは１四半期当たり１回以下であることが支持される。

血清試料を、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）を含む、肝機能パネル試験のために保管した。

実施例３：様々な修飾パターンを使用したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの向上
この研究は、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを低減させるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの活性に対する様々な修飾パターンの効果を評価するために設計した。図９に示されているように、数々の異なる修飾パターン（Ｍ１４〜Ｍ４０）の２つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５−ＡＳ５９５及びＳ５８７−ＡＳ５９７）を、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベル低減におけるそれらの活性について、マウスにおけるｉｎｖｉｖｏアッセイでスクリーニングした。５つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドが、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベル低減のより高い活性を示した（Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ２３、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ２４、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１６、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１７、及びＳ５８７−ＡＳ５９７−Ｍ２３）。

図９で試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの幾つかを、マウスにおけるＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベル低減のｉｎｖｉｖｏ活性についても試験した。単一用量のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、０．５ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与し、マウス肝臓でのＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを、投与４日後にｑＰＣＲで評価した。結果は、修飾パターンＭ２２、Ｍ１５、Ｍ２４、Ｍ１７、Ｍ２６、Ｍ３０、及びＭ３２が、修飾パターンＭ２１、Ｍ１４、Ｍ２３、Ｍ１６、Ｍ２５、Ｍ２９、及びＭ３１と比較して、試験したオリゴヌクレオチドの効力を押し上げたことを示した（図１０）。

次に、図９及び１０のＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベル低減により高い活性を示したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１５、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１６、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ１７、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ２４、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ２６、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ３１、Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ３２）を、マウスにおける用量漸増研究で試験した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、又は０．５ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与し、マウス肝臓でのＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを、投与７２時間後にｑＰＣＲで評価した。試験したオリゴヌクレオチドの全てで、用量依存的応答が観察された（図１１）。

２つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ３３及びＳ５８５−ＡＳ５９５−Ｍ３４）の活性に対するホスホロチオエート連結の数の効果を評価した。オリゴヌクレオチドを、アンチセンス鎖の５’末端に０、１、２、３、４、５、又は６つのホスホロチオエート連結を含むように更に修飾し、０．５ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与した。マウス肝臓での残存ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを、投与４日後にｑＰＣＲで評価した。結果は、異なる数のホスホロチオエート連結が、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの効力に異なる影響を及ぼしたことを示した（図１２）。

最後に、様々な修飾パターン（Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２４、及びＭ２６）を有するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５−ＡＳ５９５）を持続期間研究で試験した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、３ｍｇ／ｋｇにてマウスに皮下投与し、マウス肝臓でのＡＬＤＨ２ｍＲＮＡレベルを、投与７２時間後にｑＰＣＲで評価した。結果は、試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドのＡＬＤＨＮ２ｍＲＮＡ抑制活性が、少なくとも３５日間継続したことを示した（図１３）。

物質及び方法
トランスフェクション
最初のスクリーニングのため、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を使用して、効率的なトランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合体化した。オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉＭＡＸ、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭを、室温で２０分間一緒にインキュベートし、その後このミックスの５０μＬを、トランスフェクション前にプレートのウェルに添加した。活性継代細胞のフラスコから培地を吸引し、トリプシンの存在下で３〜５分間３７℃で細胞をインキュベートした。細胞がフラスコにもはや接着しなくなった後、細胞増殖培地（ペニシリン及びストレプトマイシンを欠如する）を添加してトリプシンを中和し、細胞を懸濁した。１０のμＬアリコートを取り出し、血球計算器で計数して、１ミリリットル当たりを基準にして細胞を定量化した。ＨｅＬａ細胞の場合、２５，０００個の細胞を、１ウェル当たり１００μＬの培地に接種した。希釈した細胞懸濁物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中にオリゴヌクレオチドを既に含んでいた９６ウェルトランスフェクションプレートに添加した。その後、トランスフェクションプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、各ウェルから培地を吸引した。細胞を、ＰｒｏｍｅｇａＲＮＡ単離キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。溶解緩衝液を、各ウェルに添加した。その後、溶解した細胞を、ＲＮＡ単離のためにＣｏｒｂｅｔｔＸｔｒａｃｔｏｒＧＥＮＥ（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ社）に移したか、又は−８０℃で保管した。

後のスクリーニング及び実験、例えば二次スクリーニングのために、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡｘを使用してリバーストランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合体化した。複合体は、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中でＲＮＡｉＭＡＸ及びｓｉＲＮＡを１５分間混合することにより製作した。トランスフェクション混合物を、多ウェルプレートに移し、細胞懸濁物をウェルに添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、その後ＰｒｏｍｅｇａＳＶ９６キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。真空マニホールドにてＳＶ９６プレートを使用してＲＮＡを精製した。その後、４マイクロリットルの精製ＲＮＡを、６５℃で５分間加熱し、４℃に冷却した。その後、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ逆転写キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を１０マイクロリットル反応中で使用してＲＮＡを逆転写に使用した。その後、ｃＤＮＡを無ヌクレアーゼ水で５０μＬに希釈し、多重化５’−エンドヌクレアーゼアッセイ及びＳＳｏＦａｓｔｑＰＣＲマスターミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）による定量ＰＣＲに使用した。

ｃＤＮＡ合成
ＣｏｒｂｅｔｔＸ−ｔｒａｃｔｏｒＧｅｎｅ（商標）（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ社）を使用して、組織培養中の哺乳動物細胞からＲＮＡを単離した。改変型ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩプロトコールを使用して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。単離したＲＮＡ（およそ５ｎｇ／μＬ）を６５℃に５分間加熱し、ｄＮＰ、ランダム六量体、オリゴｄＴ、及び水と共にインキュベートした。混合物を１５秒間冷却した。水、５×第一鎖緩衝液、ＤＴＴ、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（商標）（ＲＮＡ阻害剤）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴａｓｅからなる「酵素ミックス」を混合物に添加した。内容物を、サーモサイクラーを使用して４２℃に１時間、その後７０℃に１５分間加熱し、その後４℃に冷却した。その後、得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録商標）に基づくｑＰＣＲに供した。１反応当たり２つの５’エンドヌクレアーゼアッセイを含むように、ｑＰＣＲ反応を多重化した。

ｑＰＣＲアッセイ
ＳＹＢＲ（登録商標）に基づくｑＰＣＲを使用して、プライマーセットをまずスクリーニングした。融解曲線並びに「マイナスＲＴ」対照を評価することにより、アッセイ特異性を検証した。ＨｅＬａ細胞及びＨｅｐａ１−６細胞に由来するｃＤＮＡ鋳型の希釈物（１反応当たり２０ｎｇから０．０２ｎｇまでの１０倍系列希釈）を使用して、それぞれヒト（Ｈｓ）アッセイ及びマウス（Ｍｍ）アッセイを試験した。ｑＰＣＲアッセイを３８４ウェルプレートにセットアップし、ＭｉｃｒｏＡｍｐフィルムで覆い、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７９００ＨＴで実験した。試薬濃度及びサイクリング条件は、以下のものを含んでいた：２×ＳＹＢＲミックス、１０μＭフォワードプライマー、１０μＭリバースプライマー、ＤＤＨ₂Ｏ、及びｃＤＮＡ鋳型。これらで１０μＬの総容積にした。

クローニング
単一融解曲線を示したＰＣＲアンプリコンを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙベクターキットに、製造業者の使用説明書に従ってライゲーションした。製造業者のプロトコールに従って、ＪＭ１０９高効率細胞を、新たにライゲーションしたベクターで形質転換した。その後、アンピシリンを含むＬＢプレートに細胞をプレーティングし、コロニー増殖のために３７℃で一晩インキュベートした。

ＰＣＲスクリーニング及びプラスミドミニプレップ
ＰＣＲを使用して、ライゲーションされた目的のアンプリコンを含むベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを特定した。インサートを隣接するベクター特異的プライマーをＰＣＲ反応に使用した。その後、ＰＣＲ産物を全て１％アガロースゲルに流し、染色後にトランスイルミネーターで画像化した。ゲルを質的に評価して、どのプラスミドが、予想サイズのライゲーションされたアンプリコンを含むと考えられるかを決定した（およそ３００ｂｐ。アンプリコン、及び使用されたプライマーに特異的な隣接ベクター配列を含む）。

その後、ＰＣＲスクリーニングにより形質転換体であることが確認されたコロニーを、アンピシリンを有する２ｍＬのＬＢ培地からなる培養中で一晩３７℃にて振とうしながらインキュベートした。その後、大腸菌細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａ社のミニプレップキットを使用して目的のプラスミドを単離した。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によりプラスミド濃度を決定した。

プラスミド配列決定及び定量化
精製したプラスミドを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーター配列決定キットを使用して配列決定した。ベクター特異的プライマーであるＴ７を使用して、インサート全体にわたるリード長を得た。以下の試薬を配列決定反応に使用した：水、５×配列決定緩衝液、ＢｉｇＤｙｅターミネーターミックス、Ｔ７プライマー、及びプラスミド（１００ｎｇ／μＬ）。これらで１０μＬの容積にした。混合物を９６℃で１分間保持し、その後９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で１分１５秒間の１５サイクル；９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で１分３０秒間の５サイクル；及び９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で２分間の５サイクルに供した。その後、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のキャピラリー電気泳動シーケンサーを使用して、ダイターミネーション反応物を配列決定した。

その後、配列が検証されたプラスミドを定量化した。プラスミドを、単一の切断制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化した。線形性は、アガロースゲル電気泳動法を使用して確認した。プラスミド希釈物は全て、ポリプロピレンバイアルに対するプラスミドの非特異的結合を低減させるために、１ｍＬ緩衝液当たり１００μｇのｔＲＮＡを有するＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で製作した。

その後、線形化されたプラスミドを、１μＬ当たり１，０００，０００から０１コピーまで系列希釈し、ｑＰＣＲに供した。アッセイ効率を算出し、効率が９０〜１１０％の範囲だった場合、アッセイを許容可能とみなした。

多重化アッセイ
各標的について、ｍＲＮＡレベルを、２つの５’ヌクレアーゼアッセイで定量化した。一般に、幾つかのアッセイを各標的についてスクリーニングする。選択された２つのアッセイは、良好な効率、低検出限界、及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）の幅広い５’−＞３’網羅範囲の組合せを示した。異なるフルオロフォアをそれぞれのプローブに使用した場合は、１つのＧＯＩに対する両アッセイを１つの反応に組み合わせることができた。従って、それらが同じｑＰＣＲ中に混合されていたか又は「多重化」されていた場合、アッセイ検証の最終工程は、選択されたアッセイの効率を決定することだった。

１０倍希釈物での両アッセイための線形化プラスミドを一緒にして、ｑＰＣＲを実施した。各アッセイの効率を、上記に記載のように決定した。許容される効率割合は、９０〜１１０％だった。

線形化プラスミド標準物質を使用して多重化反応を検証しつつ、ｃＤＮＡを鋳型として使用して目的の標的のＣ_q値も評価した。ヒト標的又はマウス標的には、それぞれＨｅＬａｃＤＮＡ及びＨｅｐａ１−６ｃＤＮＡを使用した。この場合、ｃＤＮＡは、未トランスフェクト細胞からＣｏｒｂｅｔｔ（水中にて約５ｎｇ／μｌ）で単離したＲＮＡに由来した。このように、この試料ｃＤＮＡの観察されたＣ_q値は、９６ウェルプレートトランスフェクションの予想Ｃ_q値の代表だった。Ｃ_q値が３０よりも大きかった場合、目的の遺伝子がより高い発現レベルを示す他の細胞株を探した。各ヒト株及びマウス株からＣｏｒｂｅｔｔでのハイスループット法により単離された全ＲＮＡのライブラリーを生成し、それを使用して、標的発現の許容可能なレベルについてスクリーニングした。

オリゴヌクレオチド命名法の説明
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは全て、ＳＮ₁−ＡＳＮ₂−ＭＮ₃のいずれかとして表記される。以下の表記法が適用される：
・Ｎ₁：センス鎖配列の配列識別子番号
・Ｎ₂：アンチセンス鎖配列の配列識別子番号
・Ｎ₃：修飾パターンの参照番号であり、各番号は、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオチドのパターンを表わす。
例えば、Ｓ２７−ＡＳ３１７−Ｍ１は、配列番号２７により示されるセンス配列、配列番号３１７により示されるアンチセンス配列を有し、Ｍ１として特定されている修飾パターンを有するように構成されているオリゴヌクレオチドを表す。

本明細書にて適切に例示的に記載されている本開示は、本明細書で具体的に開示されていない任意の１つ若しくは複数の構成要素又は１つ若しくは複数の制限の非存在下で実施することができる。従って、例えば、本明細書中の各出現において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、説明のために使用されており、限定のためではない。そのような用語及び表現の使用において、図示及び説明されている特徴又はそれらの部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、特許請求されている本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されているが、当業者であれば、本明細書に開示されている概念の任意選択の特徴、改変、及び変異を実施することができ、そのような改変及び変異は、本明細書及び添付の特許請求の範囲により画定されている本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。

加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群又は選択肢の他のグループ化として記載されている場合、当業者であれば、本発明はそれにより、マーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又はメンバーの部分群としても記載されていることを認識するだろう。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を説明する際に、配列表に示されている配列を参照することができることが認識されるべきである。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、指定の配列と比較して、１つ若しくは複数の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ相当物又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ相当物）、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド、及び／又は１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド間連結、及び／又は１つ若しくは複数の他の修飾を有していてもよいが、指定の配列と本質的に同じ又は同様の相補性特性を維持する。

本発明の説明の状況における（特に以下の特許請求の範囲の状況における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示物は、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、本明細書に別様の指定がない限り、非限定的用語として解釈されるものとする（つまり、「含む」が「それに限定されない」ことを意味する）。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書に別様の指定がない限り、その範囲内に入る各個別の値を個々に参照するための簡略的方法としての役割を果たすことが意図されているに過ぎず、各個別の値は、それが個々に本明細書に記載されているかの如く、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的文言（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良好に説明することが意図されているに過ぎず、別様に特許請求されていない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。明細書中の文言が、任意の特許請求されていない構成要素を、本発明の実施に不可欠であるものとして示すと解釈されるべきでない。

本発明の実施形態が本明細書に記載されている。そうした実施形態の変異は、当業者であれば、上述の説明を読むと明白になる場合がある。

本発明者らは、当業者がそのような変異を必要に応じて使用することを予想しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されているものとは別様に実施されることになることを意図している。従って、本発明は、準拠法により許容される、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている主題の改変及び均等物を全て含む。更に、それらの全ての考え得る変異における上記に記載の構成要素の任意の組合せは、本明細書に別様の指定がない限り又は状況により明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。当業者であれば、日常的なものを超える実験作業を使用することなく、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多数の均等物を認識することになるか又は確認することができるだろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。

Claims

ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示される配列を含むアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド。
配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示される配列を含むセンス鎖を更に含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示される配列からなる、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示される配列からなる、請求項２又は３に記載のオリゴヌクレオチド。
ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号６０１〜６０７のいずれか１つに示されるＡＬＤＨ２の標的配列との相補性領域を有し、前記相補性領域は、長さが少なくとも１５連続ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド。
前記相補性領域は、前記ＡＬＤＨ２の標的配列と完全に相補的である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖は、長さが１９〜２７ヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７ヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
長さが１５〜４０ヌクレオチドのセンス鎖を更に含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖は、長さが１９〜４０ヌクレオチドである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
前記二重鎖領域は、長さが少なくとも１９ヌクレオチドである、請求項９又は１０に記載のオリゴヌクレオチド。
前記二重鎖領域は、長さが少なくとも２１ヌクレオチドである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
ＡＬＤＨ２との相補性領域は、長さが少なくとも１９連続ヌクレオチドである、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
ＡＬＤＨ２との相補性領域は、長さが少なくとも２１連続ヌクレオチドである、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示される配列を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示される配列を含む、請求項５〜１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示される配列からなる、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００のいずれか１つに示される配列からなる、請求項５〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記センス鎖は、その３’−末端に、Ｓ₁−Ｌ−Ｓ₂として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ₁は、Ｓ₂と相補的であり、Ｌは、Ｓ₁とＳ₂との間に長さが３〜５ヌクレオチドのループを形成する、請求項９〜１８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖は、長さが２１〜２７ヌクレオチドであり、ＡＬＤＨ２との相補性領域を有し、
前記センス鎖は、その３’末端に、Ｓ₁−Ｌ−Ｓ₂として示されるステム−ループを含み、式中Ｓ₁はＳ₂と相補的であり、Ｌは、Ｓ₁とＳ₂との間に長さが３〜５ヌクレオチドのループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、長さが少なくとも１９ヌクレオチドの二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていない、オリゴヌクレオチド。
前記相補性領域は、ＡＬＤＨ２ｍＲＮＡの少なくとも１９連続ヌクレオチドと完全に相補的である、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
Ｌは、テトラループである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
Ｌは、長さが４ヌクレオチドである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖は、長さが２７ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、長さが２５ヌクレオチドである、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖は、長さが２５ヌクレオチドの二重鎖領域を形成する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖に長さが２ヌクレオチドの３’−突出配列を更に含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
各々長さが２１〜２３ヌクレオチドの範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
長さが１９〜２１ヌクレオチドの範囲の二重鎖構造を含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
長さが１個又は複数個ヌクレオチドの３’突出配列を含み、前記３’突出配列は、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖に存在する、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド。
長さが２ヌクレオチドの３’突出配列を含み、前記３’突出配列は前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖は、長さが２１ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は長さが２３ヌクレオチドであり、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、長さが２１ヌクレオチドの二重鎖を形成する、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド。
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記修飾ヌクレオチドは、２’−修飾を含む、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
前記２’−修飾は、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、全て修飾されている、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
前記アンチセンス鎖の５’−ヌクレオチドの糖の４’−炭素は、ホスフェート類似体を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
各標的指向性リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド。
前記ＧａｌＮａｃ部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
前記ステム−ループのＬの最大で４個のヌクレオチドは、各々一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
前記標的指向性リガンドは、アプタマーを含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
請求項１〜４５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物。
対象にオリゴヌクレオチドを送達するための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
対象のエタノール耐容性を減少させるための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
対象のエタノール摂取を阻害するための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
対象のエタノール消費欲求を減少させるための方法であって、請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
前記対象は、アルコール中毒に罹患している、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜５０ヌクレオチドのセンス鎖及び長さが１５〜３０ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖は、配列番号５８１〜５９０のいずれか１つに示されている配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号５９１〜６００から選択される相補的配列を含むオリゴヌクレオチド。
ＡＬＤＨ２の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、表４に示される表の行から選択される１対のセンス及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド。