JP2021090395A - Novel soybean rhizobium, plant growth promoter, and method for growing soybean plants - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ダイズの根に共生して窒素固定を行う新規なダイズ根粒菌（ブラディリゾビウムBradyrhizobium属細菌）、当該ダイズ根粒菌を含む植物生育促進剤及び当該ダイズ根粒菌を利用したダイズ植物の栽培方法に関する。 The present invention is a novel soybean rhizobium (Bradyrhizobium genus bacterium) that coexists with soybean roots and fixes nitrogen, a plant growth promoter containing the soybean rhizobium, and a soybean plant using the soybean rhizobia. Regarding the cultivation method of soybean.
窒素固定細菌は作物根圏に緩く共生し、植物体に窒素栄養を供給することで生育促進効果を奏する細菌として知られている。窒素固定細菌のなかでもダイズの根に共生して窒素固定を行うダイズ根粒菌としては、ブラディリゾビウム ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）やブラディリゾビウム エルカニ（Bradyrhizobium elkanii）等が知られている。 Nitrogen-fixing bacteria are known as bacteria that coexist loosely in the rhizosphere of crops and exert a growth-promoting effect by supplying nitrogen nutrients to plants. Among the nitrogen-fixing bacteria, Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii are known as soybean rhizobia that coexist with soybean roots and fix nitrogen.
しかし、これら従来公知のダイズ根粒菌は、低温環境における感染能力が著しく低いため、使用できる温度環境を厳密にコントロールするか、寒冷地を除く土地で使用する必要があった。例えば、特許文献１には、低温環境でも共生窒素固定活性が高いヘアリーベッチ根粒菌（Rhizobium lecuminosarum）について記載されている。また、特許文献２には、アルファルファおよびクローバー根粒菌であるRhizobium melilotiに属する低温耐性菌について記載されている。
However, since these conventionally known soybean root nodule bacteria have extremely low infectivity in a low temperature environment, it is necessary to strictly control the temperature environment in which they can be used or to use them in a land other than cold regions. For example,
しかしながら、特許文献１に記載されたRhizobium lecuminosarum及び特許文献２に記載されたRhizobium melilotiのいずれもダイズ根に共生することはできず、ダイズ栽培における接種材として利用することはできない。
However, neither Rhizobium lecuminosarum described in
また、非特許文献１には、ベネゼイラの土壌から高塩濃度及び高アルミニウムイオン耐性を有するダイズ根粒菌を探知したことが開示されている。しかし、非特許文献１で単離されたダイズ根粒菌は、低温条件下においてダイズ根に共生することはできず、低温環境下のダイズ栽培における接種材として利用することはできない。
In addition,
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、低温環境においてダイズ植物の根に共生して窒素固定を行う新規なダイズ根粒菌、当該ダイズ根粒菌を利用した植物生育促進剤及びダイズ植物の栽培方法を提供することを目的とする。 Therefore, in view of the above-mentioned circumstances, the present invention presents a novel soybean rhizobia that coexists with the roots of soybean plants and fixes nitrogen in a low temperature environment, a plant growth promoter using the soybean rhizobia, and soybean plants. The purpose is to provide a cultivation method.
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、ドイズライプニッツ農業景観研究センター周辺の圃場の土壌を分離源として新規なダイズ根粒菌を単離、同定することができた。本発明は、これら新規ダイズ根粒菌が有する窒素固定能に基づいてなされたものである。 As a result of diligent studies by the present inventors in order to achieve the above-mentioned object, a novel soybean rhizobia could be isolated and identified from the soil of the field around the Doys Leibniz Agricultural Landscape Research Center as an isolation source. The present invention has been made based on the nitrogen-fixing ability of these novel soybean rhizobia.
本発明は以下を包含する。
（１）低温条件下においてダイズ植物に根粒を形成し、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属に分類されるダイズ根粒菌。
（２）受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032及びNITE P-03033で特定されるブラディリゾビウム エスピー（Bradyrhizobium sp.）GMF14株、GMM36株、GMF57株、GMM71株及びGEM96株のいずれか又はその変異株であることを特徴とする（１）記載のダイズ根粒菌。
（３）上記（１）又は（２）記載のダイズ根粒菌を含む、植物生育促進剤。
（４）上記（１）又は（２）記載のダイズ根粒菌若しくは上記（３）記載の植物生育促進剤をダイズ植物に作用させる、ダイズ植物の製造方法。
（５）上記ダイズ根粒菌又は上記植物生育促進剤を、上記ダイズ植物の根圏に供給することを特徴とする（４）記載のダイズ植物の製造方法。
（６）最高気温20℃以下の温度環境で上記ダイズ植物を栽培することを特徴とする（４）記載のダイズ植物の製造方法。
The present invention includes the following.
(1) Soybean root nodule bacteria that form root nodules in soybean plants under low temperature conditions and are classified into the genus Bradyrhizobium.
(2) Bradyrhizobium sp. Specified by accession numbers NITE P-03029, NITE P-03030, NITE P-03031, NITE P-03032 and NITE P-03033 GMF14 strain, GMM36 strain, GMF57 The soybean root granule according to (1), which is any one of a strain, a GMM71 strain and a GEM96 strain, or a mutant strain thereof.
(3) A plant growth promoter containing the soybean rhizobia according to the above (1) or (2).
(4) A method for producing a soybean plant, wherein the soybean root nodule fungus according to (1) or (2) above or the plant growth promoter according to (3) above is allowed to act on the soybean plant.
(5) The method for producing a soybean plant according to (4), wherein the soybean rhizobia or the plant growth promoter is supplied to the rhizosphere of the soybean plant.
(6) The method for producing a soybean plant according to (4), wherein the soybean plant is cultivated in a temperature environment having a maximum temperature of 20 ° C. or less.
本発明に係る新規なダイズ根粒菌は、低温環境下において優れた窒素固定能を有するため、ダイズ植物に対して優れた生育促進作用を示す。したがって、本発明に係るダイズ根粒菌を利用することによって、低温環境下で優れた生育促進作用を有する植物生育促進剤を提供することができる。また、本発明に係るダイズ根粒菌をダイズ植物の栽培に利用することによって、当該ダイズ植物の生育を低温環境下で促進できることとなり、植物製造に係るコストを大幅に低減することができる。 Since the novel soybean root nodule fungus according to the present invention has an excellent nitrogen-fixing ability in a low temperature environment, it exhibits an excellent growth promoting action on soybean plants. Therefore, by utilizing the soybean root nodule fungus according to the present invention, it is possible to provide a plant growth promoting agent having an excellent growth promoting action in a low temperature environment. Further, by utilizing the soybean rhizobia according to the present invention for the cultivation of soybean plants, the growth of the soybean plants can be promoted in a low temperature environment, and the cost related to plant production can be significantly reduced.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
＜新規ダイズ根粒菌＞
本発明に係るダイズ根粒菌は、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属に分類され、低温環境下でダイズ植物の根部に共生する細菌である。ここで、窒素固定能とは、気体の窒素分子（N2）をアンモニアに変換する能力を意味する。本発明に係るダイズ根粒菌は、窒素固定能を有するために、根圏に生息することによって植物に窒素を供給することができる。
<New soybean rhizobia>
The soybean rhizobia according to the present invention is classified into the genus Bradyrhizobium and is a bacterium that coexists in the roots of soybean plants in a low temperature environment. Here, the nitrogen-fixing ability means the ability to convert gaseous nitrogen molecules (N 2) into ammonia. Since the soybean rhizobia according to the present invention has a nitrogen-fixing ability, it can supply nitrogen to plants by inhabiting the rhizosphere.
窒素固定能については、いわゆるアセチレン還元法を用いて評価することができる。アセチレン還元法は、窒素固定を担うニトロゲナーゼがアセチレン等の窒素原子間の三重結合を有する化合物を還元する反応に基づいている。具体的に、アセチレン還元法では、アセチレンと根粒とを反応させ、エチレンの生成量を測定する。アセチレン還元法では、エチレンの生成量が多いほど、根粒菌による窒素固定能が高いと判断する。 The nitrogen fixation ability can be evaluated by using the so-called acetylene reduction method. The acetylene reduction method is based on a reaction in which nitrogenase, which is responsible for nitrogen fixation, reduces a compound having a triple bond between nitrogen atoms such as acetylene. Specifically, in the acetylene reduction method, acetylene is reacted with nodules to measure the amount of ethylene produced. In the acetylene reduction method, it is judged that the larger the amount of ethylene produced, the higher the nitrogen-fixing ability of rhizobia.
なお、窒素固定能については、例えば、窒素安定同位体自然存在比(δ15N値)を用いて評価することもできる。δ15N値は元素分析計を接続した質量分析計を用いて測定することができる。この方法は、土壌における15Nの自然存在比が高いために土壌由来窒素の原子量は重くなるのに対して、空気中における15Nの自然存在比が低いために空気由来窒素の原子量は軽くなるという原理に基づいている。すなわち、化学肥料由来の窒素や微生物による窒素固定で供給された窒素は、土壌中に存在する土壌由来の窒素原子より原子量が軽くなる。そのため、化学窒素肥料や微生物による窒素固定で供給された窒素を蓄積した植物体は、原子量の軽い窒素を多く含むこととなる。一方、土壌由来の窒素を吸収した植物体は、原子量の高い窒素を多く含むこととなる。したがって、供試微生物を植物体の根圏に生息させた後、当該植物体のδ15N値を測定することによって、微生物における窒素固定能を評価することができる。 The nitrogen-fixing ability can also be evaluated using, for example, the natural abundance ratio of stable nitrogen isotopes (δ 15 N value). The δ 15 N value can be measured using a mass spectrometer connected to an elemental analyzer. In this method, the atomic weight of nitrogen derived from soil is heavy due to the high natural abundance ratio of 15 N in soil, whereas the atomic weight of nitrogen derived from air is light due to the low natural abundance ratio of 15 N in air. It is based on the principle. That is, the atomic weight of nitrogen derived from chemical fertilizers and nitrogen supplied by nitrogen fixation by microorganisms is lighter than that of soil-derived nitrogen atoms existing in soil. Therefore, plants that have accumulated nitrogen supplied by chemical nitrogen fertilizer or nitrogen fixation by microorganisms contain a large amount of nitrogen having a light atomic weight. On the other hand, plants that have absorbed soil-derived nitrogen contain a large amount of nitrogen with a high atomic weight. Therefore, the nitrogen-fixing ability of the microorganism can be evaluated by measuring the δ 15 N value of the plant after inhabiting the test microorganism in the rhizosphere of the plant.
また、低温環境下でダイズ植物の根圏に共生するとは、例えば、栽培環境における最高気温が25℃以下、好ましくは20℃以下、より好ましくは18℃以下、更に好ましくは17℃以下といった低温条件下において、ダイズに対して根粒を形成することを意味する。すなわち、所定の細菌が低温環境下でダイズ植物の根圏に共生するか否かは、微生物として当該細菌のみを含む土壌を使用して上記低温条件下でダイズ植物を栽培し、栽培したダイズ植物における根粒の有無を確認する。根粒が形成されている場合には、供試した細菌が低温環境下でダイズ植物の根圏に共生する能力を有すると判断できる。 In addition, symbiosis in the rhizosphere of soybean plants in a low temperature environment means, for example, low temperature conditions such that the maximum temperature in the cultivation environment is 25 ° C or lower, preferably 20 ° C or lower, more preferably 18 ° C or lower, and further preferably 17 ° C or lower. Below, it means forming nodules for soybeans. That is, whether or not a predetermined bacterium coexists in the rhizosphere of a soybean plant in a low temperature environment depends on whether or not the soybean plant is cultivated under the above low temperature conditions using soil containing only the bacterium as a microorganism. Check for the presence of nodules in. When nodules are formed, it can be judged that the tested bacteria have the ability to coexist in the rhizosphere of soybean plants in a low temperature environment.
本発明者らは、このような手法によってドイズライプニッツ農業景観研究センター周辺の圃場の土壌からブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属に分類され、低温環境下でダイズ植物の根部に共生する新規なダイズ根粒菌を複数単離している。本発明者は、これらのうち５つの新規ダイズ根粒菌をそれぞれブラディリゾビウム エスピー（Bradyrhizobium sp.）GMF14株、GMM36株、GMF57株、GMM71株及びGEM96株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NITE特許微生物寄託センター：〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2019年9月26日付けで、それぞれ受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032及びNITE P-03033として寄託している。 The present inventors are classified into the genus Bradyrhizobium from the soil of the field around the Doizleibniz Agricultural Landscape Research Center by such a method, and a novel soybean that coexists with the roots of soybean plants in a low temperature environment. Multiple rhizobium have been isolated. The present inventor named five novel soybean root nodule bacteria among these as Bradyrhizobium sp. GMF14 strain, GMM36 strain, GMF57 strain, GMM71 strain and GEM96 strain, respectively. Foundation Organization Patent Microbial Deposit Center (NITE Patent Microbial Deposit Center: 2-5-8 Kazusa Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) dated September 26, 2019, with accession numbers NITE P-03029 and NITE P, respectively. Deposited as -03030, NITE P-03031, NITE P-03032 and NITE P-03033.
本発明に係るダイズ根粒菌は、当該受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032又はNITE P-03033で特定されるブラディリゾビウム エスピー（Bradyrhizobium sp.）GMF14株、GMM36株、GMF57株、GMM71株及びGEM96株並びに、当該GMF14株、GMM36株、GMF57株、GMM71株又はGEM96株と同一の株に分類され、且つ低温条件下で窒素固定能を有するブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌に微生物を含むこととなる。 The soybean root nodule fungus according to the present invention is Bradyrhizobium sp. Specified by the accession numbers NITE P-03029, NITE P-03030, NITE P-03031, NITE P-03032 or NITE P-03033. Brady is classified into the same strains as GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96, and the same GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 or GEM96, and has nitrogen-fixing ability under low temperature conditions. The bacteria of the genus Bradyrhizobium will contain microorganisms.
また、受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032及びNITE P-03033で特定されるブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌は、それぞれ配列番号１〜５に示す塩基配列を含む16SrDNAを有している。したがって、本発明に係るダイズ根粒菌は、配列番号１〜５に示す塩基配列のいずれかに対して95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列を含む16SrDNAを有するブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌であって、低温条件下で窒素固定能を有する細菌を含むこととなる。 In addition, the bacteria of the genus Bradyrhizobium identified by accession numbers NITE P-03029, NITE P-03030, NITE P-03031, NITE P-03032 and NITE P-03033 are listed in SEQ ID NOs: 1 to 5, respectively. It has 16S rDNA containing the indicated base sequence. Therefore, the soybean rhizobium according to the present invention has a base sequence having 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more homology to any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5. It is a bacterium of the genus Bradyrhizobium having 16 SrDNA containing, and includes a bacterium having a nitrogen-fixing ability under low temperature conditions.
さらに、受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032及びNITE P-03033で特定されるブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌は、それぞれ配列番号６〜１０に示す塩基配列を含むrecA遺伝子を有している。したがって、本発明に係るダイズ根粒菌は、配列番号６〜１０に示す塩基配列のいずれかに対して95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列を含むrecA遺伝子を有するブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌であって、低温条件下で窒素固定能を有する細菌を含むこととなる。 Furthermore, the bacteria of the genus Bradyrhizobium identified by accession numbers NITE P-03029, NITE P-03030, NITE P-03031, NITE P-03032 and NITE P-03033 are assigned to SEQ ID NOs: 6 to 10, respectively. It has a recA gene containing the indicated base sequence. Therefore, the soybean rhizobium according to the present invention has a base sequence having 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more homology to any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 6 to 10. It is a bacterium belonging to the genus Bradyrhizobium having a recA gene containing it, and includes a bacterium having a nitrogen-fixing ability under low temperature conditions.
さらにまた、受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032及びNITE P-03033で特定されるブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌は、それぞれ配列番号１１〜１５に示す塩基配列を含むatpD遺伝子を有している。したがって、本発明に係るダイズ根粒菌は、配列番号１１〜１５に示す塩基配列のいずれかに対して95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列を含むatpD遺伝子を有するブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌であって、低温条件下で窒素固定能を有する細菌を含むこととなる。 Furthermore, the bacteria of the genus Bradyrhizobium identified by accession numbers NITE P-03029, NITE P-03030, NITE P-03031, NITE P-03032 and NITE P-03033 are respectively SEQ ID NOs: 11 to 15. It has an atpD gene containing the nucleotide sequence shown in. Therefore, the soybean rhizobium according to the present invention has a base sequence having 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more homology to any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 15. It is a bacterium of the genus Bradyrhizobium having an atpD gene containing it, and includes a bacterium having a nitrogen-fixing ability under low temperature conditions.
＜植物生育促進剤＞
本発明に係るダイズ根粒菌における低温条件下における窒素固定能を利用することによって、植物に栄養窒素を供給することができる。すなわち、本発明に係るダイズ根粒菌は低温環境下において使用可能な植物生育促進剤として使用することができる。ここで、低温環境とは、例えば、栽培環境における最高気温が25℃以下、好ましくは20℃以下、より好ましくは18℃以下、更に好ましくは17℃以下である環境とすることができる。
<Plant growth promoter>
By utilizing the nitrogen-fixing ability of the soybean rhizobia according to the present invention under low temperature conditions, nutrient nitrogen can be supplied to plants. That is, the soybean rhizobia according to the present invention can be used as a plant growth promoter that can be used in a low temperature environment. Here, the low temperature environment can be, for example, an environment in which the maximum temperature in the cultivation environment is 25 ° C. or lower, preferably 20 ° C. or lower, more preferably 18 ° C. or lower, and further preferably 17 ° C. or lower.
本発明に係るダイズ根粒菌を植物生育促進剤として利用する場合、例えば、以下に例示列挙するような培地を使用して適切な条件下で培養する。すなわち、使用可能な培地としては、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌を培養可能な従来公知の培地を特に制限することなく使用することができる。例えば、Yeast extract-mannitol agar (YMA)培地（1Lの容量に対して、Yeast extract 0.4g、Mannitol 10g、K2HPO4 0.38g、MgSO4 7H2O 0.2g、NaCl 0.1g及びAgar 15g）等を使用することができる。また、培養条件としては、培養温度を20〜30度、好ましくは28度とすることができ、培地pHは6.8が望ましい。 When the soybean root nodule fungus according to the present invention is used as a plant growth promoter, for example, it is cultured under appropriate conditions using a medium as listed below. That is, as a usable medium, a conventionally known medium capable of culturing Bradyrhizobium bacteria can be used without particular limitation. For example, Yeast extract-mannitol agar (YMA) medium (Yeast extract 0.4 g, Mannitol 10 g, K 2 HPO 4 0.38 g, DDL 4 7H 2 O 0.2 g, NaCl 0.1 g and Agar 15 g for a volume of 1 L), etc. Can be used. As the culture conditions, the culture temperature can be 20 to 30 degrees, preferably 28 degrees, and the medium pH is preferably 6.8.
以上のように培養された本発明に係るダイズ根粒菌を植物生育促進剤とする場合、本発明に係るダイズ根粒菌を単独で使用しても良いが、当該ダイズ根粒菌と他の任意成分とを配合して特定の製剤としてもよい。製剤の形態としては、例えば、液剤、粉剤、粒剤、乳剤、油剤、懸濁剤、水和剤、水溶剤、粒剤、ペースト剤、カプセル剤、煙霧剤（エアゾール剤）等を挙げることができる。 When the soybean rhizobia according to the present invention cultured as described above is used as a plant growth promoter, the soybean rhizobia according to the present invention may be used alone, but with the soybean rhizobia and other optional components. May be blended to form a specific preparation. Examples of the form of the preparation include liquids, powders, granules, emulsions, oils, suspensions, wettable powders, aqueous solvents, granules, pastes, capsules, fumigants (aerosols) and the like. it can.
他の任意配合としては、例えば、液体担体や固体担体等のダイズ根粒菌を担持するための担体、乳化剤、分散剤、消泡剤、補助剤等が挙げられる。液体担体としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。固体担体としては、カオリン、粘土、タルク、ベントナイト、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、ホワイトカーボン、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、チャコール、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられる。また、固体担体としては、例えば、バーミキュライト、ケイ砂、雲母、軽石、石こう、炭酸カルシウム、ドロマイト、マグネシウム、消石灰、リン石灰、ゼオライト、硫安などの無機物質を使用しても良い。また、固体担体としては、例えば、コンポスト、ピート、籾殻、糠、大豆粉、タバコ粉、クルミ粉、小麦粉、木粉、でんぷん、結晶セルロースなどの植物性有機物質を使用しても良い。さらに、固体担体としては、クマロン樹脂、石油樹脂、アルキド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリアルキレングリコール、ケトン樹脂、エステルガム、コーパルガム、ダンマルガムなどの合成または天然の高分子化合物や、カルナバロウ、蜜ロウなどのワックス類及び尿素類等を使用しても良い。 Other optional formulations include, for example, carriers for supporting soybean rhizobia such as liquid carriers and solid carriers, emulsifiers, dispersants, antifoaming agents, auxiliary agents and the like. Examples of the liquid carrier include a phosphate buffer solution, a carbonate buffer solution, and a physiological saline solution. Solid carriers include natural mineral powders such as kaolin, clay, talc, bentonite, choke, quartz, attapulsite, montmorillonite, white carbon and diatomaceous earth, synthetic mineral powders such as silicic acid, alumina and silicate, charcoal and crystalline cellulose. , Cornstarch, gelatin, silicic acid and other high molecular weight natural products. Further, as the solid carrier, for example, an inorganic substance such as vermiculite, silica sand, mica, pumice, gypsum, calcium carbonate, dolomite, magnesium, slaked lime, phosphorus lime, zeolite, and sulfide may be used. Further, as the solid carrier, for example, vegetable organic substances such as compost, peat, rice husk, bran, soybean flour, tobacco flour, walnut flour, wheat flour, wood flour, starch and crystalline cellulose may be used. Further, examples of the solid carrier include synthetic or natural polymer compounds such as kumaron resin, petroleum resin, alkyd resin, polyvinyl chloride, polyalkylene glycol, ketone resin, ester gum, copal gum and dammar gum, and carnauba wax and beeswax. Waxes, ureas and the like may be used.
本発明に係る植物成長促進剤のダイズ根粒菌の含有量は、特に限定されないが、107〜108cfu/mlとすることができる。 The content of soybean rhizobia of the plant growth promoter according to the present invention is not particularly limited, but can be 10 7 to 10 8 cfu / ml.
一方、上述のように構成された植物生育促進剤は、特にダイズ植物ダイズ(Glycine max)の根圏に供給されることでダイズ植物の生育を促進する。但し、本発明に係る植物生育促進剤は、ダイズ以外の植物に対して利用され、ダイズ以外の植物の生育促進のために使用しても善い。ダイズ以外の植物としては、特に限定されないが、例えば、マメ科に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。マメ科植物としては、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）及びアカシア（Acacia）等をあげることができる。特に、本発明に係る植物生育促進剤は、ダイズ、アズキ等に使用することが好ましい。 On the other hand, the plant growth promoter configured as described above promotes the growth of soybean plants by being particularly supplied to the rhizosphere of soybean plant soybean (Glycine max). However, the plant growth promoter according to the present invention may be used for plants other than soybean and may be used for promoting the growth of plants other than soybean. Plants other than soybean are not particularly limited, and examples thereof include plants belonging to the family Leguminosae (see below), but are not limited to these plants. Legumes include peas (Pisum sativum), broad beans (Vicia faba), wisteria (Wisteria floribunda), peanuts (Arachis hypogaea), lotus japonicus (Lotus corniculatus var. And Acacia etc. can be mentioned. In particular, the plant growth promoter according to the present invention is preferably used for soybeans, adzuki beans and the like.
また、Mitchell Andrews et al., J. Mol. Sci. 2017, 18, 705に開示されるようにブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌が感染しうる植物として以下を列挙することができる。すなわち、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌が感染しうる植物としては、アカシア・アウリカリフォルミス（Acacia auriculiformis）、アカシア・マンギウム（Acacia mangium）、アカシア・マンギウム×アカシア（Acacia mangium × A. auriculiformis）、アカシア・メラノキシロン（Acacia melanoxylon）、アカシア ・サルグナ（Acacia saligna）、エスキノメネ・アフラスペラ（Aeschynomene afraspera）、エスキノメネ・アメリカーナ（Aeschynomene americana）、エスキノメネ・シリアタ（Aeschynomene ciliata）、エスキノメネ・エラフロキシロン（Aeschynomene elaphroxylon）、エスキノメネ・インディカ（Aeschynomene indica）、エスキノメネ・ルディス（Aeschynomene rudis）、エスキノメネ・スカブラ（Aeschynomene scabra）、エスキノメネ・センシティバ（Aeschynomene sensitiva）、エスキノメネ・シンペリ（Aeschynomene shimperi）、アモルファ・フルティコサ（Amorpha fruticosa）、アンフィカルパエア・ブラクレアタ（Amphicarpaea bracteata）、アンフィカルパエア・エジウオルティ（Amphicarpaea edgeworthii）、アラキス・デュラネンシス（Arachis duranensis）、アラキス・ヒポガイア（Arachis hypogaea）、アスパラサス・リネアリス（Aspalathus linearis）、カヤヌス・カジャン（Cajanus cajan）、カラガナ・インターメディア（Caragana intermedia）、セントロロビウム・パラエンセ（Centrolobium paraense）、セントロセマ・パセカオラム（Centrosema pascuorum）、セントロセマ・パベセンス（Centrosema pubescens）、クロタラリア・コモサ（Crotalaria comosa）、クロタラリア・ハイソピフォリア（Crotalaria hyssopifolia）、クロタラリア・ララチロイデス（Crotalaria lathyroides）、クロタラリア・パリダ（Crotalaria pallida）、シチサス・アエオリカス（Cytisus aeolicus）、シチサス・バランサエ（Cytisus balansae）、シチサス・ラバーナム（Cytisus laburnum）、シチサス・マルチフロラス（Cytisus multiflorus）、シチサス・プロリフェラス（Cytisus proliferus）、シチサス・パーガンス（Cytisus purgans）、シチサス・スコパリウス（Cytisus scoparius）、シチサス・ストリアタス（Cytisus striatus）、シチサス・ビロサス（Cytisus villosus）、ダルベルギア・バローニ（Dalbergia baroni）、ダルベルギア・ルーベリ（Dalbergia louveli）、ダルベルギア・マダガスカリエンシス（Dalbergia madagascariensis）、ダルベルギア・マリティマ（Dalbergia maritima）、ダルベルギア・モンティコラ（Dalbergia monticola）、ダルベルギア・プルプラセン（Dalbergia purpurascens）、ダルベルギア sp.（Dalbergia sp.）、デスモジウム・コーディタム（Desmodium caudatum）、デスモジウム・エレガンス（Desmodium elegans）、デスモジウム・ファラクス（Desmodium fallax）、デスモジウム・ガンゲティカム（Desmodium gangeticum）、デスモジウム・ヘテロカルパン（Desmodium heterocarpan）、デスモジウム・ミクロフィラム（Desmodium microphyllum）、デスモジウム・ラセモサム（Desmodium racemosum）、デスモジウム・セクアックス（Desmodium sequax）、デスモジウム・トリフロラム（Desmodium triflorum）、ファイデルビア・アルビダ（Faidherbia albida）、ジェニスタ・ヒステリック（Genista hystrix）、ジェニスタ・ステノペチュラ（Genista stenopetula）、ジェニスタ・ベルシカラー（Genista versicolor）、グリシン・マックス（Glycine max）、グリシン・ソジャ（Glycine soja）、インディゴフェラ・アストラガリナ（Indigofera astragalina）、インディゴフェラ・ヒルスタ（Indigofera hirsuta）、インディゴフェラ・セネガセンシス（Indigofera senegalensis）、インディゴフェラ・ティンクトリア（Indigofera tinctoria）、インガ・エデュリス（Inga edulis）、インガ・ラウリナ（Inga laurina）、クンメロビア・スティプラセア（Kummerowia stipulacea）、クンメロビア・ストリアタ（Kummerowia striata）、ラブラブ・パープレウス（Lablab purpureus）、レスペデザ・バイカラー（Lespedeza bicolor）、レスペデザ・カピタータ（Lespedeza capitata）、レスペデザ・クネアータ（Lespedeza cuneata）、レスペデザ・ダウリカ（Lespedeza daurica）、レスペデザ・ジュンセア（Lespedeza juncea）、レスペデザ・プロカンベンス（Lespedeza procumbens）、レスペデザ・スチプラセア（Lespedeza stipulacea）、レスペデザ・ストリアタ（Lespedeza striata）、ロトノニス sp（Lotononis sp.）、ロータス・ウリギノサス（Lotus uliginosus）、ルピナス・アルベセンス（Lupinus albescens）、ルピナス・アルバス（Lupinus albus）、ルピナス・アングスティフォリウス（Lupinus angustifolius）、ルピナス・ルテウス（Lupinus luteus）、ルピナス・マリアエ-ジョセファエ（Lupinus mariae-josephae）、ルピナス・ミクランサス（Lupinus micranthus）、ルピナス・モンタナス（Lupinus montanus）、ルピナス・ポリフィラス（Lupinus polyphyllus）、ルピナス sp（Lupinus sp.）、ミクロロビウス・フォエティダス（Microlobius foetidus）、ミレティア・レウカンサ（Milletia leucantha）、ミモザ・プディカ（Mimosa pudica）、ネオノトニア ・ウエイティ（Neonotonia wightii）、オーニトプス・コンプレサス（Ornithopus compressus）、オーニトプス・サティバス（Ornithopus sativus）、パキリヒス・エロサス（Pachyrhizus erosus）、パキリヒス・フェラギネウス（Pachyrhizus ferrugineus）、パキリヒス・ツベロス（Pachyrhizus tuberosus）、ファセオラス・ルナタス（Phaseolus lunatus）、ファセオラス・バルガリス（Phaseolus vulgaris）、プロソピス・アルバ（Prosopis alba）、ソラレア・ピンナタ（Psoralea pinnata）、プテロカルプス・インディカス（Pterocarpus indicus）、プテロカルプス・オフィシナリス（Pterocarpus officinalis）、プエラリア・パセオロイデス（Pueraria phaseoloides）、レタマ・モノスペルマ（Retama monosperma）、レタマ・レイタム（Retama raetam）、レタマ・スファエロカルパ（Retama sphaerocarpa）、リンコシア・ミニマ（Rhynchosia minima）、リンコシア・トッタ（Rhynchosia totta）、セスバニア・ロストラタ（Sesbania rostrata）、ソフォラ・フラベセンス（Sophora flavescens）、スパルチアム・ジュンセラム（Spartium junceum）、ストリフェノデンドロン sp（Stryphnodendron sp.）、テフィロシア・カペンシス（Tephrosia capensis）、テフィロシア・ファルシフォルミス（Tephrosia falciformis）、テフィロシア・パープレア（Tephrosia purpurea）、テフィロシア・ビローサ（Tephrosia villosa）、トリフォリウム・ファギフェラス（Trifolium fragiferum）、トリフォリウム・レペンス（Trifolium repens）、ユレックス・ユーロパエウス（Ulex europaeus）、ヴァケリア・ヌビカ（Vachellia nubica）、ヒグナ・アンギュラリス（Vigna angularis）、ヒグナ・ラジアータ（Vigna radiata）、ヒグナ・シネンシス（Vigna sinensis）、ヒグナ・サブテラナエ（Vigna subterranea）、ヒグナ・アングイカラタa（Vigna unguiculata）、キシリア・キシロカルパ（Xylia xylocarpa）及びゾロニア・グロキディアタ（Zornia glochidiata）を挙げることができる。 In addition, as disclosed in Mitchell Andrews et al., J. Mol. Sci. 2017, 18, 705, the following can be listed as plants that can be infected by Bradyrhizobium spp. That is, as plants that can be infected by Aeschynomene genus Acacia auriculiformis, Acacia mangium, Acacia mangium × A. auriculiformis. , Acacia melanoxylon, Acacia saligna, Aeschynomene afraspera, Aeschynomene americana, Aeschynomene americana, Aeschynomene ciliata, Aeschynomene aphra Aeschynomene indica, Aeschynomene rudis, Aeschynomene scabra, Aeschynomene sensitiva, Aeschynomene sensitiva, Aeschynomene shimperi, Aeschynomene shimperi, Aeschynomene shimperi, Aeschynomene shimperi, Aeschynomene shimperi, Aeschynomene shimperi Amphicarpaea bracteata, Amphicarpaea edgeworthii, Arachis duranensis, Arachis hypogaea, Aspalathus linearis, Aspalathus linearis, Kayanus cayanus ca Caragana intermedia, Centrolobium paraense, Centrosema pascuorum, Centrosema pubescens, Crotalaria comosa, Crotalaria comosa, Crotalaria comosa, Crotalaria comosa hyssopifolia ), Crotalaria lathyroides, Crotalaria pallida, Cytisus aeolicus, Cytisus balansae, Cytisus balansae, Cytisus laburnumus, Cytisus laburnum Cytisus proliferus, Cytisus purgans, Cytisus scoparius, Cytisus striatus, Cytisus villosus, Dalbergia baroni (Dalbergia baroni) Dalbergia louveli, Dalbergia madagascariensis, Dalbergia maritima, Dalbergia monticola, Dalbergia purpurascens, Dalbergia purpurascens, Dalbergia purpurascens , Desmodium caudatum, Desmodium elegans, Desmodium fallax, Desmodium gangeticum, Desmodium heterocarpan, Desmodium heterocarpan, Desmodium heterocarpan, Desmodium heterocarpan・ Desmodium racemosum, Desmodium sequax, Desmodium triflorum, Faidherbia albida, Genista hystrix, Genista hystrix, Genista steno Lupine versicolor, Glycine max, Glycine soja, Indigofera astragalina, Indigofera hirsuta, Indigofera senegalensis, Indigofera senegalensis Indigofera tinctoria, Inga edulis, Inga laurina, Kummerowia stipulacea, Kummerowia stipulacea, Kummerowia striata, love love lupine・ Bicolor (Lespedeza bicolor), Respedeza capitata (Lespedeza capitata), Respedeza cuneata (Lespedeza cuneata), Respedeza daurica (Lespedeza daurica), Respedeza juncea (Lespedeza juncea), Respedeza juncea Lespedeza stipulacea, Lespedeza striata, Lotononis sp., Lotus uliginosus, Lupinus albescens, Lupinus albescens, Lupinus albescens -Lupinus angustifolius, Lupinus luteus, Lupinus mariae-josephae, Lupinus micranthus, Lupinus micranthus, Lupinus montanus, Lupinus montanus Lupinus polyphyllus), Lupine sp (Lupinus sp.), Microlobius foetidus ), Milletia leucantha, Mimosa pudica, Neonotonia wightii, Ornithopus compressus, Ornithopus sativus, Ornithopus sativus Pachyrhizus ferrugineus, Pachyrhizus tuberosus, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Phaseolus vulgaris, Prosopis alba, Prosopis alba Indicus (Pterocarpus indicus), Pterocarpus officinalis, Pueraria phaseoloides, Retama monosperma, Retama raetam, Retama sphaerocarpa , Rhynchosia minima, Rhynchosia totta, Sesbania rostrata, Sophora flavescens, Spartium junceum, Strifenodendron sp (Spartium junceum) ), Tephrosia capensis, Tephrosia falciformis, Tephrosia purpurea, Tephrosia villosa, Trifolium fragiferum, Trifolium fragiferum Trifolium repens), Ulex eu ropaeus, Vachellia nubica, Vigna angularis, Vigna radiata, Vigna sinensis, Vigna subterranea, Vigna subterranea unguiculata), Xylia xylocarpa and Zornia glochidiata.
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the following Examples.
〔実施例１〕
（ダイズ根粒菌の分離）
2017年11月に、ドイツライプニッツ農業景観研究センター周辺の18か所の圃場から採取した土壌を、植物防疫所の手続きを経て、日本に同年12月に輸入した。これら18か所の圃場の情報を図１にまとめた。これら土壌からの根粒菌の分離は下記の手順で行った。ダイズは日本及び欧州の代表的な品種であるエンレイ及びメルリンを用いた。エンレイ及びメルリンはそれぞれ以下のような特徴を有する。なお、エンレイは日本の代表的な品種であり、外観品質がよく広域適応性の高い中生種である。エンレイはタンパク質含有率が高く豆腐加工に好適で、味噌加工にも適している。メルリンは中央欧州で広く用いられている早熟性の品種である。エンレイと比較すると低温耐性はあるが、タンパク質含有率は低く、家畜飼料として用いられている。
[Example 1]
(Isolation of soybean rhizobia)
In November 2017, soil collected from 18 fields around the Leibniz Agricultural Landscape Research Center in Germany was imported into Japan in December of the same year after undergoing procedures at the Plant Protection Station. Information on these 18 fields is summarized in FIG. Isolation of rhizobia from these soils was carried out according to the following procedure. For soybean, Enrei and Merlin, which are representative varieties of Japan and Europe, were used. Enrei and Merlin each have the following characteristics. Enrei is a representative variety of Japan, and is a mesophyll species with good appearance quality and high wide-area adaptability. Enrei has a high protein content and is suitable for tofu processing, and is also suitable for miso processing. Merlin is a precocious variety widely used in Central Europe. Although it is resistant to low temperatures compared to Enrei, it has a low protein content and is used as livestock feed.
<<手順>>
1. ダイズ種子の表面を70%エタノールで１分間、続いて3%次亜塩素酸で２分間殺菌した。
2. 速やかに滅菌蒸留水で繰り返し8回洗浄し、次亜塩素酸を十分に洗い流した。
3. 表面殺菌したダイズ種子を暗黒下で20℃、３日培養し、発芽させた。
4. オートクレーブで滅菌したバーミキュライト（ヒルイシ化学社製、Hirukon S）を300mlのガラス瓶に詰め、さらに上記土壌5gを全体に混合し、滅菌した窒素を含まない植物培養液で湿らせた。
5. 上記3.で発芽処理したダイズ種子を上記4.で調製した培地に深さ約1cmで播種した。
6. ダイズ植物を25℃、16時間明、8時間暗の光条件で２８日間栽培した。
7. 根に着生した根粒表面を70%エタノールで１分間、続いて3%次亜塩素酸で２分間殺菌した。
8. 上記7.で殺菌した根粒を、１個の根粒あたり0.5 mlの15%グリセロール溶液中でつぶし、懸濁液をYeast extract-mannitol (YEM)平面培地上に塗布した。
9. 30℃、暗条件のインキュベーター内で３〜７日間培養した。
10. 根粒菌の単一コロニーを取り、新しいYEM培地に移し替えた。
<< Procedure >>
1. The surface of soybean seeds was sterilized with 70% ethanol for 1 minute, followed by 3% hypochlorous acid for 2 minutes.
2. Immediately washed with sterile distilled
3. Surface-sterilized soybean seeds were cultured in the dark at 20 ° C. for 3 days to germinate.
4. Vermiculite sterilized by autoclave (Hirukon S, manufactured by Hiruishi Chemical Co., Ltd.) was packed in a 300 ml glass bottle, and 5 g of the above soil was further mixed and moistened with a sterilized nitrogen-free plant culture solution.
5. The soybean seeds germinated in 3. above were sown in the medium prepared in 4. above at a depth of about 1 cm.
6. Soybean plants were cultivated at 25 ° C. for 16 hours in light and 8 hours in dark light for 28 days.
7. The nodule surface on the roots was sterilized with 70% ethanol for 1 minute and then with 3% hypochlorous acid for 2 minutes.
8. The nodules sterilized in 7. above were crushed in 0.5 ml of 15% glycerol solution per nodule, and the suspension was applied on a Yeast extract-mannitol (YEM) flat medium.
9. Incubated in an incubator at 30 ° C. under dark conditions for 3 to 7 days.
10. A single colony of rhizobia was taken and transferred to fresh YEM medium.
上記10.においてYEM培地に塗布した単一コロニーを4、15、28、37又は44℃の各温度下で７〜１４日培養した。その結果、18種類の異なる土壌サンプルから77種類のダイズ根粒菌を得ることができ、その中でも15℃以下で生育できる5つの根粒菌を単離することができた。これら5つの根粒菌をGMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96と命名した。これらGMF14とGMF57は4℃という低温でも増殖できる根粒菌であることがわかった。また、これら全ての根粒菌は、44℃では増殖できず、37℃で増殖できることがわかった。 The single colonies applied to the YEM medium in 10. above were cultured at 4, 15, 28, 37 or 44 ° C. for 7 to 14 days. As a result, 77 types of soybean rhizobia could be obtained from 18 different soil samples, and among them, 5 types of rhizobia capable of growing at 15 ° C or lower could be isolated. These five rhizobia were named GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96. It was found that these GMF14 and GMF57 are rhizobia that can grow even at a low temperature of 4 ° C. It was also found that all of these rhizobia could not grow at 44 ° C, but at 37 ° C.
（分離したダイズ根粒菌の同定）
分離した5つの根粒菌GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96の全ゲノムDNAをDNA抽出キット（プロメガ社製、Wizard （登録商標）Genomic DNA Purification Kit）を用いてそれぞれ抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、分離した根粒菌の16SrRNA遺伝子、recA遺伝子及びatpD遺伝子のほぼ全領域をPCRで増幅した。なお、16SrRNA遺伝子、recA遺伝子及びatpD遺伝子を増幅するためのユニバーサルプライマーの塩基配列を表１に示した。
(Identification of isolated soybean rhizobia)
The whole genomic DNAs of the five isolated rhizobia GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 were extracted using a DNA extraction kit (Promega, Wizard® Genomic DNA Purification Kit). Using the extracted genomic DNA as a template, almost all regions of the isolated rhizobial 16S rRNA gene, recA gene, and atpD gene were amplified by PCR. Table 1 shows the nucleotide sequences of universal primers for amplifying the 16S rRNA gene, recA gene and atpD gene.
また、各遺伝子についてPCRの温度サイクル条件を表２に示した。 Table 2 shows the PCR temperature cycle conditions for each gene.
PCR産物はアガロースゲル電気泳動を行い、ニッポンジーン社製FastGene Gel/PCR Extractionキットにより精製後、ユーロフィンジェノミクス社のDNAシークエンス解析により塩基配列を決定した。そして、得られた塩基配列情報を用いてMultilocus sequence (MLSA)解析を行った。MLSA解析では、決定した16SrRNA遺伝子、recA遺伝子及びatpD遺伝子の塩基配列を合わせ、GenBankに登録されている既存の塩基配列と比較する方法を採用した。この方法により、GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96は、既存の菌株の中ではBradyrhizobium sp. VAF1269と最も相同性が高く、Bradyrhizobium sp.と同定された。ただし、比較した全ての塩基配列は100%一致ではなかったため、既存のBradyrhizobium sp. VAF1269とは異なる新規のBradyrhizobium sp.株であることが明らかとなった。 The PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, purified by the Fast Gene Gel / PCR Extraction kit manufactured by Nippon Gene, and then the nucleotide sequence was determined by DNA sequence analysis by Eurofin Genomics. Then, Multilocus sequence (MLSA) analysis was performed using the obtained nucleotide sequence information. In the MLSA analysis, a method was adopted in which the determined 16S rRNA gene, recA gene, and atpD gene base sequences were combined and compared with the existing base sequences registered in GenBank. By this method, GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 were identified as Bradyrhizobium sp., Which has the highest homology with Bradyrhizobium sp. VAF1269 among the existing strains. However, since all the base sequences compared were not 100% identical, it became clear that it was a novel Bradyrhizobium sp. Strain different from the existing Bradyrhizobium sp. VAF1269.
なお、本実施例で決定したGMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96における16SrRNA遺伝子、recA遺伝子及びatpD遺伝子の塩基配列に関する配列番号を表３にまとめて示した。 Table 3 shows the SEQ ID NOs of the 16S rRNA gene, recA gene, and atpD gene in GMF14, GMM36, GMF57, GMM71, and GEM96 determined in this example.
以上、本実施例では、18種類の異なる土壌サンプルから、GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96を含む77種類のダイズ根粒菌を分離したが、そのうち71％がブラディリゾビウム属と同定され、29％がリゾビウム属と同定された。 As described above, in this example, 77 types of soybean rhizobia including GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 were isolated from 18 different soil samples, and 71% of them were identified as Bradyrhizobium. 29% were identified as Hyphobium.
また、GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96について、nodD遺伝子及びnifH遺伝子の塩基配列を比較分析したところ、有意な違いは示されなかった。この結果から、GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96における共生遺伝子が1つのタイプのみに属することが示唆された。なお、nodD遺伝子は根粒を形成する際に働くタンパク質をコードし、nifHは窒素固定を担う酵素であるニトロゲナーゼタンパク質をコードしている。 Moreover, when the nucleotide sequences of the nodD gene and the nifH gene were compared and analyzed for GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96, no significant difference was shown. This result suggests that the symbiotic genes in GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 belong to only one type. The nodD gene encodes a protein that acts in the formation of nodules, and nifH encodes a nitrogenase protein, which is an enzyme responsible for nitrogen fixation.
本実施例で単離したBradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96は、上記MLSA解析の結果と、低温条件下でダイズに根粒を形成する点で公知のBradyrhizobium sp. VAF1269（Microbes Environ. Vol. 34, No. 1, 43-58, 2019）とは異なる新規株である判定した。本実施例で単離したBradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NITE特許微生物寄託センター：〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2019年9月26日付けで受託番号NITE P-03029、NITE P-03030、NITE P-03031、NITE P-03032及びNITE P-03033でとしてそれぞれ寄託した。 Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 isolated in this example are known for the results of the above MLSA analysis and the formation of nodules in soybean under low temperature conditions. It was judged to be a new strain different from Vol. 34, No. 1, 43-58, 2019). Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 isolated in this example are the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NITE Patent Microorganisms Depositary Center: Kazusa Kama, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). Deposited on foot 2-5-8) with accession numbers NITE P-03029, NITE P-03030, NITE P-03031, NITE P-03032 and NITE P-03033 on September 26, 2019, respectively.
〔実施例２〕
本実施例では、実施例１で単離・同定したBradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96について、低温条件下におけるダイズポッド栽培での根粒菌接種試験を行った。なお、本実施例では、コントロールとして既知のモデル根粒菌であるBradyrhizobium USDA110株を使用した。
[Example 2]
In this example, Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 isolated and identified in Example 1 were subjected to a root nodule inoculation test in soybean pod cultivation under low temperature conditions. In this example, Bradyrhizobium USDA110 strain, which is a known model rhizobia, was used as a control.
本実施例では、先ず、ダイズ品種メルリンの種子を、実施例１の<<手順>>と同様に表面殺菌し、その後、発芽処理を行った。発芽種子は、実施例１と同様に滅菌したバーミキュライトを詰めて無窒素水耕液で締めさせた300mlガラスポッドに播種した。その際、2mlの根粒菌培養液（107の菌数を含む）を、播種した箇所にかけることにより接種した。ダイズは温度及び光を、16時間20℃明、8時間10℃暗の低温条件で約６週間栽培した。この低温条件は、ドイツ北部の5月の最高気温と最低気温にあたる。5月はダイズ初期成育の時期である。 In this example, first, the seeds of the soybean cultivar Merlin were surface sterilized in the same manner as in << Procedure >> of Example 1, and then germination treatment was performed. The germinated seeds were sown in 300 ml glass pods packed with sterilized vermiculite and tightened with a nitrogen-free hydroponic solution in the same manner as in Example 1. At that time, 2 ml of a rhizobial culture solution ( including a number of 10 7 bacteria) was applied to the seeded area for inoculation. Soybeans were cultivated at a low temperature of 20 ° C. for 16 hours and dark at 10 ° C. for 8 hours for about 6 weeks. This low temperature condition corresponds to the highest and lowest temperatures in May in northern Germany. May is the time for early soybean growth.
Bradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96を接種したダイスと、Bradyrhizobium USDA110株を接種したダイズの地上部を撮像した写真を図２に示し、ダイズ地上部の乾燥重量を測定した結果（n=3）を図３に示した。なお、図２及び３におけるコントロール（Control）はダイズ根粒菌非接種のダイズである。さらに、Bradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96を接種したダイズと、Bradyrhizobium USDA110株を接種したダイズについて、根粒の乾燥重量を測定した結果（n=3）を図４に示した。 Fig. 2 shows photographs of the above-ground parts of soybeans inoculated with Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 and Bradyrhizobium USDA110 strain, and the dry weight of the above-ground soybeans was measured (n). = 3) is shown in FIG. The control in FIGS. 2 and 3 is soybean not inoculated with soybean rhizobia. Furthermore, the results of measuring the dry weight of nodules (n = 3) of soybeans inoculated with Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 and soybeans inoculated with Bradyrhizobium USDA110 strain are shown in FIG.
これら図２〜４に示すように、実施例１で単離・同定したBradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96は、低温条件においてダイズに対して根粒を形成することができ、地上部バイオマスを増大させる効果を有することが明らかとなった。 As shown in FIGS. 2 to 4, Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 isolated and identified in Example 1 can form nodules for soybean under low temperature conditions, and the above-ground part. It was revealed that it has the effect of increasing biomass.
また、比較のためにBradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57、GMM71及びGEM96と系統が比較的近いBradyrhizobium sp. VAF1269（Microbes Environ. Vol. 34, No. 1, 43-58, 2019）についても、同様に低温条件下におけるダイズに対する接種試験を行った。Bradyrhizobium sp. GMF14、GMM36、GMF57及びGMM71を接種したダイスと、Bradyrhizobium USDA110株を接種したダイズと、Bradyrhizobium sp. VAF1269を接種したダイズの地上部を撮像した写真を図５に示し、葉の乾燥重量を測定した結果を図６に示し、根の乾燥重量を図７に示し、根粒の乾燥重量を図８に示し、根粒の数を図９に示した。その結果、Bradyrhizobium sp. VAF1269は、本実施例に使用したメルリン品種に対して根粒着生が悪く、根粒の乾燥重が低いことがわかった。なお、それにも関わらず、Bradyrhizobium sp. VAF1269を接種したところ葉と根の乾燥重が増加していた。この結果は、Bradyrhizobium sp. VAF1269の共生により窒素固定ではなく、その他の成長促進効果（ホルモンの分泌など）によるものと考えられた。この結果から、Bradyrhizobium sp. VAF1269は、低温条件下ではダイズに根粒を形成できす、窒素固定活性を上げるものではないと結論付けた。 The same applies to Bradyrhizobium sp. VAF1269 (Microbes Environ. Vol. 34, No. 1, 43-58, 2019), which is relatively close to Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57, GMM71 and GEM96 for comparison. An inoculation test was conducted on soybeans under low temperature conditions. Fig. 5 shows photographs of the above-ground parts of the dice inoculated with Bradyrhizobium sp. GMF14, GMM36, GMF57 and GMM71, the soybeans inoculated with the Bradyrhizobium USDA110 strain, and the soybeans inoculated with Bradyrhizobium sp. VAF1269. The dry weight of the roots is shown in FIG. 7, the dry weight of the nodules is shown in FIG. 8, and the number of nodules is shown in FIG. As a result, it was found that Bradyrhizobium sp. VAF1269 had poor nodule settling and a low dry weight of nodules as compared with the merlin variety used in this example. Nevertheless, when Bradyrhizobium sp. VAF1269 was inoculated, the dry weight of leaves and roots increased. This result was considered to be due to other growth-promoting effects (hormone secretion, etc.) rather than nitrogen fixation due to the symbiosis of Bradyrhizobium sp. VAF1269. From this result, it was concluded that Bradyrhizobium sp. VAF1269 can form nodules in soybean under low temperature conditions and does not increase nitrogen-fixing activity.
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| 北海道農研・北海道畑輪作研究チーム、中央農研・大豆生産安定研究チーム: "大豆の根粒菌接種では菌液の局所接種やスプレー接種の効果が高い", 北海道農業研究成果情報, JPN6023032233, 2007, ISSN: 0005123761 * |
| 臼木 一英, 土田 勝一: "大豆の根粒菌接種において接種資材が根粒着生に及ぼす影響", 日本作物学会講演会要旨集, vol. 223, JPN6023032234, 2007, pages 100, ISSN: 0005123760 * |
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