JP2020537509A - Tigit抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、2019年9月29日に出願された出願番号cn201710908565.3に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 - Google Patents
Tigit抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、2019年9月29日に出願された出願番号cn201710908565.3に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(i)該重鎖可変領域は、配列番号15、16及び17のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号15、16及び17に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号18、19及び20のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号18、19及び20に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(ii)該重鎖可変領域は、配列番号21〜23のアミノ酸配列で示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3、またはそれぞれ配列番号21〜23に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号24〜26のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号24〜26に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(iii)該重鎖可変領域は、配列番号27〜29のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号27〜29に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号30〜32のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号30〜32に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(iv)該重鎖可変領域は、配列番号33〜35のアミノ酸配列に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3、またはそれぞれ配列番号33〜35に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号36〜38のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号36〜38に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(v)該重鎖可変領域は、配列番号39〜41のアミノ酸配列に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3、またはそれぞれ配列番号39〜41に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号42〜44のアミノ酸配列に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号42〜44に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む。
(vi)該重鎖可変領域は、配列番号15〜17に示されたようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号18〜20に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含む;または
(vii)該重鎖可変領域は、配列番号21〜23に示されたようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号24〜26に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含む;または
(viii)該重鎖可変領域は、配列番号27〜29に示されたようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号30〜32に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含む;または
(ix)該重鎖可変領域は、配列番号33〜35に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号36〜38に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含む;または
(x)該重鎖可変領域は、配列番号39〜41に示されるようなHCDR1、HCDR2及びHCDR3領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号42〜44に示されるようなLCDR1、LCDR2及びLCDR3領域を含む。
配列番号45に示されるような重鎖可変領域上のN84S、S85R及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号51に示されるような重鎖可変領域上のM48I、R72V、V79A及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号56に示されるような重鎖可変領域上のY27F、M48I、R72V、V79A、S84N及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号64に示されるような重鎖可変領域上のR38K、R67K、R72V、T74K、M48I、V68A、M70L、V79A及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号71に示されるような重鎖可変領域上のG27Y、M48I、L83F、A97T及びそれらの任意の組み合わせ。
(vi)配列番号45または50に示されるような重鎖可変領域;
(vii)配列番号51及び54から55のいずれか1つに示されるような重鎖可変領域;
(viii)配列番号56、61、62及び63のいずれか1つに示されるような重鎖可変領域;
(ix)配列番号64、67、68、69及び70のいずれか1つに示されるような重鎖可変領域;そして
(x)配列番号71、75、76及び77のいずれか1つに示されるような重鎖可変領域。
配列番号46の軽鎖可変領域上のS60D、T85D、A43S、S63T及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号52の軽鎖可変領域上のA43Sのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号57の軽鎖可変領域上のQ3V、A43S、S60D、Y87F及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号65の軽鎖可変領域上のA43S、I48V及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号72の軽鎖可変領域上のN22S、P49S及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異。
xi)配列番号46、47、48及び49のいずれか1つに示されるような軽鎖可変領域;または
xii)配列番号52または53に示されるような軽鎖可変領域;
xiii)配列番号57、58、59及び60のいずれか1つに示されるような軽鎖可変領域;
xiv)配列番号65または66に示されるような軽鎖可変領域;そして
xv)配列番号72、73及び74のいずれか1つに示されるような軽鎖可変領域。
xvi)配列番号45または50の重鎖可変領域及び配列番号46、47、48及び49のいずれか1つの軽鎖可変領域;
xvii)配列番号51、54及び55のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号52または53の軽鎖可変領域;
xviii)配列番号56、61、62及び63のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号57、58、59及び60のいずれか1つの軽鎖可変領域;
xix)配列番号64、67、68、69及び70のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号65または66の軽鎖可変領域;または、
xx)配列番号71、75、76及び77のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号72、73及び74のいずれか1つの軽鎖可変領域。
本開示をより容易に理解するために、特定の技術用語及び科学用語が以下で具体的に定義される。本明細書で明示的に定義されていない限り、本明細書で使用される他の全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
実施例及び試験例
実施例1 TIGIT抗原及び抗体の調製
本開示のTIGITの鋳型としてヒトTIGITタンパク質(Uniprot No.: Q495A1)を用い、本開示の検出に用いた抗原及びタンパク質のアミノ酸配列を設計した。または、異なるタグをTIGITタンパク質に融合させ、それぞれpHrベクター(自社製)またはpXC-17.4ベクター(LONZA)にクローン化し、293細胞で一過性に発現させるか、精製のためにCHO細胞で安定発現させ、抗原と本開示において検出に使用されるタンパク質が得られた。以下のTIGIT抗原は、特に明記しない限り、全てヒトTIGITを指す。
TIGIT細胞外ドメインとマウスIgG2aFcフラグメントからなる融合タンパク質:免疫と検出のためのTIGIT-mFc
注:下線付き部分はシグナルペプチドを示し、斜体部分はmFcを示す。
TIGIT細胞外ドメインとヒトIgG1 Fcフラグメントからなる融合タンパク質:検出用TIGIT-Fc
注:下線付き部分はシグナルペプチドを示し、斜体部分はFcを示す。
全長TIGIT:TIGITを過剰発現する細胞株の構築(検出用)
シグナルペプチド(単一の下線付き部分)+細胞外ドメイン+膜貫通ドメイン(二重下線付き部分)+細胞内ドメイン(斜体部分)
cynoTIGIT細胞外ドメインとマウスIgG2aFcフラグメントからなる融合タンパク質:cynoTIGIT-mFc(検出用)
注:下線付き部分はシグナルペプチドを示し、斜体部分はmFcを示す。
(1)融合細胞上清の分離、精製/プロテインG親和性クロマトグラフィー:
プロテインG親和性クロマトグラフィーは、マウス融合細胞上清の精製のために選択した。培養した融合細胞を遠心分離し、上清を得、1M Tris-HCl(pH8.0〜8.5)10〜15%(上清量)を加えてpHを調整した。プロテインGカラムを3〜5カラム容量の6M塩酸グアニジンで洗浄し、次に3〜5カラム容量の純水で洗浄した。カラムを、3〜5カラム容量の平衡化緩衝液、例えば、1×PBS(pH7.4)緩衝液システムで平衡化した。細胞上清をロードし、流速を制御することにより約1分以上の保持時間で低流速で結合した。UV吸収がベースラインに戻るまで、3〜5カラム容量の1×PBS(pH7.4)でカラムを洗浄した。0.1 M酢酸/酢酸ナトリウム(pH3.0)緩衝液でサンプルを溶出し、UV検出に従って溶出ピークを収集した。一時的な保管のため、溶出生成物のpHを1 M Tris-HCl(pH8.0)でpH5〜6にすばやく調整した。溶出生成物については、当業者に周知の方法によって溶液の交換を行うことができる。例えば、限外濾過チューブで限外濾過を行い、溶液が所望の緩衝液系と交換した。またはSuperdex 200などの高分解能分子排除カラムを用いて、溶出産物から凝集体を除去することによりサンプルの純度を向上させた。
(2)プロテインA親和性クロマトグラフィーによるFcタグ融合タンパク質または抗体の抽出:
Fc融合タンパク質または抗体を発現する細胞培養上清を最初に高速で遠心分離して上清を収集した。プロテインAカラムを3〜5カラム容量の6M塩酸グアニジンで洗浄し、次に3〜5カラム容量の純水で洗浄した。3〜5カラム容量の平衡化緩衝液、例えば、1×PBS(pH7.4)緩衝液システムでカラムを平衡化した。細胞上清をロードし、流速を制御することにより約1分以上の保持時間で低流速で結合した。UV吸収がベースラインに戻るまで、3〜5カラム容量の1×PBS(pH7.4)でカラムを洗浄した。サンプルは0.1 M酢酸/酢酸ナトリウム(pH3.0〜3.5)緩衝液で溶出され、UV検出に従って溶出ピークを収集した。一時的な保管のために、溶出生成物のpHを1 M Tris-HCl(pH8.0)でpH5〜6にすばやく調整した。溶出生成物については、当業者に周知の方法によって溶液の交換を行うことができる。例えば、限外濾過チューブで限外濾過を行い、溶液が所望の緩衝液系と交換した。または、Superdex 200などの高分解能分子排除カラムで溶出産物から凝集体を除去することにより、サンプルの純度が向上させた。
実施例2 抗ヒトTIGIT融合細胞モノクローナル抗体の調製
実験用SJLホワイトマウス(メス、6-8週齢、Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.、動物生産許可番号:SCXK (Beijing) 2012-0001)を免疫し、抗ヒトTIGITモノクローナル抗体を作製した。摂食環境:SPFレベル。マウスは、購入後1週間、12/12時間の明/暗サイクル、温度20〜25℃、湿度40〜60%で実験室環境に保管した。環境に順応したマウスを以下のプロトコルに従って免疫した。免疫用の抗原は、mFc(配列番号1)を含むヒトTIGIT細胞外ドメインであった。
免疫プロトコル:免疫は、TiterMax(登録商標)ゴールドアジュバント(Sigma カタログ番号T2684)とThermoImject(登録商標)Alum(Thermo カタログ番号77161)アジュバントを交互に使用して行った。抗原とアジュバントの比率(TiterMax(登録商標)Goldアジュバント)は1:1で、抗原とアジュバントの比率(ThermoImject(登録商標)Alum)は3:1、50μg/マウス/時間(初回免疫)、25μg/マウス/回(追加免疫)。抗原を乳化し、0、14、28、42及び56日目に接種した。0日目に、50μg/マウスの乳化抗原を腹腔内(IP)注射した。14日目に、25μg/マウスをいくつかの部位(一般的には背中の6〜8部位)に皮下(皮下)注射した。28日目と42日目に、背中と腹部の腫れ具合に応じて、抗原を背中に注射するか、腹腔内に注射した。21、35、49及び63日目に採血し、マウスの血清抗体価をELISAで測定した。4回目または5回目の免疫後、プラトーに達する傾向のある血清抗体価が高いマウスを脾細胞融合のために選択した。脾細胞融合の3日前に追加免疫を行い、生理食塩水中に調製した50μg/マウスの抗原を腹腔内注射した(IP)。
融合細胞は、脾臓リンパ球と骨髄腫Sp2/0細胞(ATCC(登録商標)CRL-8287TM)を最適化されたPEG媒介融合手順で融合することにより得られた。融合した融合細胞を0.5〜1×10^6/mlの密度で完全培地(20%FBS、1×HAT、1×OPIを含むDMEM培地)に再懸濁し、100μl/ウェルでの96ウェルプレートに播種した。37℃、5%CO2で3〜4日間インキュベートした後、HAT完全培地に100μl/ウェルを補充し、針状クローンが形成されるまでさらに3〜4日間培養した。上澄みを除去し、200μl/ウェルのHT完全培地(20%FBS、1x HT及び1x OPIを含むRPMI-1640培地)を加え、37℃、5%CO2で3日間培養し、次にELISAにより検出を行った。
融合細胞の培養上清を、融合細胞の増殖密度に従って結合ELISAで検出した。結合ELISAによって細胞が陽性であると検出された上清を、細胞結合アッセイ及び細胞ブロッキングアッセイに供した。細胞が結合アッセイとブロッキングアッセイの両方で陽性であることが検出されたウェルを適時に拡大し、凍結保存し、単一の細胞クローンが得られるまでサブクローンを2〜3回処理した。
サブクローニングされた各細胞をまたTIGIT結合ELISA、HTRFブロッキングアッセイ、細胞結合アッセイ及び細胞ブロッキングアッセイに供した。融合細胞クローンは上記の実験により得えた。さらに無血清細胞培養により抗体を調製し、試験例で使用するために精製例に従って精製した。
陽性融合細胞クローンを以下のように配列決定した。対数増殖期の融合細胞を回収し、製造元の指示に従ってTrizol(Invitrogen、カタログ番号15596-018)でRNAを抽出し、PrimeScriptTM逆転写酵素キット(Takara、カタログ番号2680A)で逆転写を行った。逆転写により得られたcDNAを、マウスIg-プライマーセット(Novagen、TB326 Rev. B 0503)を用いたPCRにより増幅し、配列決定した。得られたDNA配列から、陽性クローンm17に対応する抗体の可変領域のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
各抗体の軽鎖及び重鎖におけるCDR配列を表1に示した。
(表1)各重鎖及び軽鎖のCDR配列
実施例3:マウス抗ヒトTIGIT抗体のヒト化
(1)m1707のヒト化のためのフレームの選択
マウス抗体m1707の場合、ヒト化軽鎖テンプレートはIGKV1-39 * 02及びhjk2.1で、ヒト化重鎖テンプレートはIGHV3-7*01及びhjh2であった。ヒト化後、ヒト化抗体h1707が得られた。ヒト化可変領域の配列は以下のとおりであった:
注:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に、斜体部分はFR配列を示し、下線付き部分はCDR配列を示す。
(2)h1707の逆突然変異は次のように設計された。
注:例えば、S60Dは、アミノ酸配列の自然な配列番号付けに従って、60番のSがDに逆変異したことを示す。「移植された」とは、マウス抗体CDRがヒト生殖系列FR領域配列に移植されたことを意味する。
(3)ヒト化h1707配列の組み合わせは次のとおりであった。
注:この表は、様々な変異体を組み合わせて取得した配列を示している。例えば、h1707-04は、ヒト化抗体h1707-04が4つの復帰変異、即ち、軽鎖L2と重鎖H2を含むことを示す。他は同様なルールに従う。
(4)ヒト化h1707の特定の配列は次のとおりであった。
(1)m1708のヒト化のためのフレームの選択
マウス抗体m1708の場合、ヒト化軽鎖テンプレートはIGKV1-39*01及びhjk4.1で、ヒト化重鎖テンプレートはIGHV1-46*01及びhjh4.1であった。ヒト化後、ヒト化抗体h1708が得られた。ヒト化可変領域の配列は以下のとおりであった:
h1708VH-CDRグラフト
注:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に、斜体部分はFR配列を示し、下線付き部分はCDR配列を示す。
(2)h1708の逆突然変異は次のように設計された。
注:例えば、A43Sは、アミノ酸配列の自然な配列番号に従って、43番のAがSに逆変異されたことを示す。「移植された」とは、マウス抗体のCDRがヒト生殖系列FR領域配列に移植されたことを意味する。
(3)ヒト化h1708配列の組み合わせは次のとおりであった。
(4)ヒト化h1708の特定の配列は次のとおりである。
(1)m1709のヒト化のためのフレームの選択
マウス抗体m1709の場合、ヒト化軽鎖テンプレートはIGKV1-39*01及びhjk4.1で、ヒト化重鎖テンプレートはIGHV1-46*01及びhjh4.1であった。ヒト化後、ヒト化抗体h1709が得られた。ヒト化可変領域の配列は以下のとおりであった:
注:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に、斜体部分はFR配列を示し、下線付き部分はCDR配列を示す。
(2)h1709の逆突然変異は次のように設計された。
注:例えば、S60Dは、アミノ酸配列の自然な配列番号付けに従って、60番のSがDに逆変異したことを示す。「移植された」とは、マウス抗体のCDRがヒト生殖系列FR領域配列に移植されたことを意味する。
(3)ヒト化h1709配列の組み合わせは次のとおりであった。
注:この表は、様々なバリアントを組み合わせて取得した配列を示している。例えば、h1709-06は、ヒト化抗体h1709-06が3つの復帰変異、即ち、軽鎖L2と重鎖H2を含むことを示す。他は同様なルールに従う。
(4)ヒト化h1709の特定の配列は以下のとおりであった。
(1)m1710のヒト化のためのフレームの選択
マウス抗体m1710の場合、ヒト化軽鎖テンプレートはIGKV1-39*01及びhjk4.1で、ヒト化重鎖テンプレートはIGHV1-46*01及びhjh4.1であった。ヒト化後、ヒト化抗体h1710が得られた。ヒト化可変領域の配列は以下のとおりであった:
注:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に、斜体部分はFR配列を示し、下線付き部分はCDR配列を示す。
(2)h1710の逆突然変異は次のように設計された。
注:例えば、A43Sは、アミノ酸配列の自然な配列番号に従って、43番のAがSに逆変異されたことを示す。「移植された」とは、マウス抗体のCDRがヒト生殖系列FR領域配列に移植されたことを意味する。
(3)ヒト化h1710配列の組み合わせは次のとおりであった。
注:この表は、様々な変異体を組み合わせて取得した配列を示している。例えば、h1710-07は、ヒト化抗体h1710-07が4つの復帰変異、即ち、軽鎖L2と重鎖H2を含むことを示している。他は同様なルールに従う。
(4)ヒト化h1710の特定の配列は次のとおりであった。
(1)m1711のヒト化のためのフレームの選択
マウス抗体m1711の場合、ヒト化軽鎖テンプレートはIGKV4-1*01及びhjk4.1で、ヒト化重鎖テンプレートはIGHV1-69*02及びhjh4.1であった。ヒト化後、ヒト化抗体h1711が得られた。ヒト化可変領域の配列は以下のとおりであった:
注:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順に、斜体部分はFR配列を示し、下線付き部分はCDR配列を示す。
(2)h1711の逆突然変異は次のように設計された。
注:例えば、P49Sは、アミノ酸配列の自然な配列番号に従って、49番のPがSに逆変異したことを示す。「移植された」とは、マウス抗体のCDRがヒト生殖系列FR領域配列に移植されたことを意味する。
(3)ヒト化h1711配列の組み合わせは次のとおりである。
注:この表は、様々な変異体トを組み合わせて取得した配列を示している。例えば、h1711-06は、ヒト化抗体h1711-06が軽鎖L2と重鎖H2からなる復帰変異を含むことを示す。他は同様なルールに従う。
(4)ヒト化h1711の特定の配列は以下のとおりであった。
全長重鎖配列は、上記の重鎖可変領域のそれぞれを、配列番号78に示す重鎖定常領域配列(IgG4、S228P変異を有する)で組換え発現させることにより得られた。上記の軽鎖可変領域のそれぞれは、配列番号79に記載の軽鎖定常領域配列(kappa鎖)で組換え発現され、最終的な完全長軽鎖配列を形成する。上記の重鎖及び軽鎖可変領域はまた、当技術分野で周知の他のIgGファミリー重鎖及び軽鎖定常領域または変異IgGファミリー定常領域と組み換えて、無傷の抗体重鎖及び軽鎖配列を形成することができる。例示的な定常領域配列を以下に示す:
S228P変異のあるIgG4重鎖定常領域:
上記の軽鎖及び重鎖は、当技術分野における従来の技術によって、本開示の代替のヒト化定常領域または機能的に修飾されたヒト化定常領域とともに組換え発現された。
22G2-H3Qは陽性対照抗体として使用され、そのVH及びVL配列はUS20160176963A1(それぞれUS20160176963A1の配列番号8及び9)に由来し、それぞれ、配列番号78および配列番号79の重鎖および軽鎖定常領域に連結されて、無傷の完全長抗体を形成した。22G2-H3QのVHとVLの特定の配列を以下に示す。
本開示の結合活性は、以下の生化学的試験で実証された。
試験例1:ELISAアッセイによるヒトTIGITタンパク質へのTIGIT抗体の結合
ヤギ抗ヒトFc抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-005-008)またはヤギ抗マウスFc抗体(Sigma、カタログ番号M3534-1ML)をPBS、pH7.4(Shanghai BasalMedia、カタログ番号B320)で希釈し、2μg/mlの濃度にし、96ウェルマイクロタイタープレート(Corning、カタログ番号CLS3590-100EA)に50μl/ウェルの容量で加え、37℃のインキュベーターに2時間放置した。液体を廃棄した後、PBSで希釈した5%スキムミルク(BDスキムミルク、カタログ番号232100)ブロッキング溶液を200μl/ウェルで添加し、ブロッキングのため37℃で3時間または4℃で終夜(16〜18時間)した。ブロッキングが終了した後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液(0.05%tween-20を含むPBS、pH7.4)、TIGIT-Fc融合タンパク質(自社製)またはTIGIT-mFc融合タンパク質(自社製)で5回洗浄した。サンプル希釈液(1%BSAを含むPBS、pH7.4)で0.5μg/mlの濃度に希釈し、50μl/ウェルで加え、37℃のインキュベーターに1時間または4℃で終夜放置した。インキュベーション後、反応液をプレートから取り除き、プレートをPBSTで5回洗浄し、サンプル希釈液で様々な濃度に希釈した試験対象の抗体(融合細胞の精製抗体またはヒト化抗体)を50μl/ウェルで入れ、37℃で1時間インキュベーターに放置した。インキュベーション後、プレートをPBST、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)サンプル希釈液で希釈し、50μl/ウェルで加え、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄し、TMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を50μl/ウェルで加え、室温で5〜10分間インキュベートし、50μl/ウェルの1M H2SO4を添加して反応を停止させた。波長450 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific Multiskan、MK3)で読み取った。データをGraphPad Prism 5で分析し、EC50値はヒトTIGITタンパク質へのTIGIT抗体の結合として算出した。その結果を図1に示す。
試験例2:ELISAアッセイによるカニクイザルTIGITタンパク質へのTIGIT抗体の結合
ヤギ抗ヒトFc抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-005-008)またはヤギ抗マウスFc抗体(Sigma、カタログ番号M3534-1ML)をPBS、pH7.4(Shanghai BasalMedia、カタログ番号B320)を2μg/mlの濃度に調整し、96ウェルマイクロタイタープレート(Corning、カタログ番号CLS3590-100EA)に50μl/ウェルの容量で加え、プレートを37℃のインキュベーターに2時間放置した。液体を廃棄した後、PBSで希釈した5%スキムミルク(BDスキムミルク、カタログ番号232100)ブロッキング溶液を200μl/ウェルで添加し、ブロッキングのため37℃で3時間または4℃で終夜(16〜18時間)インキュベートした。ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液(0.05%tween-20、pH7.4を含むPBS)、カニクイザルTIGIT-Fc融合タンパク質(自社製)またはカニクイザルTIGIT-mFcで5回洗浄した。サンプル希釈液(1%BSAを含むPBS、pH7.4)で0.5μg/mlの濃度に希釈された融合タンパク質(自社製)を50μl/ウェルで添加し、プレートを37℃のインキュベーターに1時間、または4℃で終夜放置した。インキュベーション後、反応液をプレートから取り除き、プレートをPBSTで5回洗浄し、サンプル希釈液で様々な濃度に希釈した試験対象の抗体(融合細胞の精製抗体またはヒト化抗体)を50μl/ウェル、そしてプレートを37℃のインキュベーターに1時間置いた。インキュベーション後、プレートをPBST、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)サンプル希釈液で希釈し、50μl/ウェルで加え、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄し、TMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を50μl/ウェル加え、室温で5〜10分間インキュベートし、50μl/ウェルの1M H2SO4を添加して反応を停止させた。波長450 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific Multiskan、MK3)で読み取った。データをGraphPad Prism 5で分析し、EC50値をカニクイザルTIGITタンパク質へのTIGIT抗体の結合として算出した。その結果を図2に示す。
試験例3:結合アッセイによるヒトTIGITを過剰発現するCHO細胞へのTIGIT抗体の結合
細胞を5x10^5/mlの密度で播種し、100μl/ウェルを96ウェルプレートで終夜培養した。上清を捨て、プレートをPBSで3回洗浄した後、細胞免疫固定液(Beyotime、カタログ番号P0098)100μl/ウェルを加え、室温で30分固定した。プレートをPBSで4回洗浄した。液体を捨てた後、PBSで希釈した5%スキムミルク(BDスキムミルク、カタログ番号232100)のブロッキング溶液を200μl/ウェルで加え、37℃で3時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液(0.05%tween-20を含むPBS、pH7.4)で5回洗浄し、試験対象の抗体(融合細胞の精製抗体またはヒト化抗体)をサンプル希釈液で希釈した。様々な濃度の溶液を50μl/ウェルで加え、37℃のインキュベーターに1時間放置した。インキュベーション後、プレートをPBST、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号 109-035-003)をサンプル希釈液で希釈し、50μl/ウェルで加え、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄し、TMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)50μl/ウェルを加え、室温で5〜15分間インキュベートし、1 Mウェルを50μl/ウェルH2SO4を添加して反応を停止させた。波長450 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific Multiskan、MK3)で読み取った。データをGraphPad Prism 5で分析し、EC50値は、TIGITタンパク質を過剰発現するCHO細胞へのTIGIT抗体の結合として算出した。その結果を図3と次の表に示す。
試験例4:結合アッセイによるTIGIT抗体のヒトPBMCへの結合
PBMCは、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離(Stem Cell Technologies)により新鮮な血液から得られ、10%(v/v)FBS及び500 ng/mlスーパー抗原黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)が補充されたRPMI 1640培養培地で37℃、5%CO2で4日間培養された。
活性化されたPBMC細胞を5×10^6/ml、100μl/ウェルの密度で96ウェル丸底プレート(Corning、カタログ番号32915001)に播種し、遠心分離機(ベックマンコールター、Allegra X-15R遠心分離機)で1500 rpmで5分間遠心分離した。その上清を廃棄した。細胞を200μlのPBSで再懸濁し、遠心分離し、上清を再び廃棄した。勾配サンプル希釈溶液(1%BSAを含むPBS、pH7.4)で希釈した試験対象の抗体を100μl/ウェルで加えて細胞を再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを1500 rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をサンプル希釈液で2回洗浄し、PEヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch、109-115-098)を100μl加えて再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを1500 rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をサンプル希釈液で2回洗浄し、最後に200μl/ウェルのサンプル希釈液で再懸濁した。蛍光シグナルの強度をフローサイトメーター(BD FACS Canto II)で測定した。データをGraphPad Prism 5で分析した。EC50値をヒトPBMCへのTIGIT抗体の結合として算出した。その結果を図4に示す。
試験例5:Biacoreアッセイ
プロテインAバイオセンサーチップ(カタログ番号29127556、GE)を用いた親和性キャプチャーにより、または、Human Anti-Capture Kit(カタログ番号28-9538-28、GE)の取扱説明書に従って、ヒト抗捕捉抗体をバイオセンサーチップ(カタログ番号28-9538-28、GE)に共有結合させた。それにより、試験される抗体のある量が親和性で捕捉された。次に、ヒトとサルのTIGIT抗原の一連の濃度勾配をチップの表面に流した。ヒトTIGITはSinobiological Co., Ltd.(カタログ番号10917-H08-H、Sino.Biol)から入手可能であり、サルTIGITは実施例1及び実施例2に記載されている発現及び精製から得られた。反応シグナルが検出された。Biacore装置(Biacore T200、GE)を用いてリアルタイムで結合及び解離曲線を得た。サイクルの解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、Human anti-Capture Kitで提供される再生溶液またはグリシン塩酸再生溶液、pH1.5(カタログ番号BR-1003-54、GE)で再生した。実験に用いたアミノカップリングキットはGE(カタログ番号BR-1000-50、GE)から購入し、緩衝液はHBS-EP+10×緩衝液(カタログ番号BR-1006-69、GE)であり、D.I.水で1×(pH7.4)に希釈した。
BIAevaluationバージョン4.1、GEソフトウェアを用いてデータを(1:1)Langmuirモデルに適合させ、表2〜4に示すように親和性値を得た。
(表2)huTIGITタンパク質に対する試験される分子の反応親和性
(表3)cynoTIGITタンパク質に対する試験される分子の反応親和性
(表4)ch1711とTIGITタンパク質に対するそのヒト化抗体の反応親和性
試験例6:TIGIT抗体はTIGIT抗原のCD155タンパク質への結合をブロックアッセイにより遮断する
希釈溶液(1%BSAを含むPBS、pH7.4)で希釈した様々な濃度の試験抗体(融合細胞精製抗体またはヒト化抗体)を、384ウェルの実験用プレート(Corning、カタログ番号3706)に10μl/ウェルで添加し、1000 rpmで1分間遠心分離し、サンプル希釈液で濃度2μg/mlに希釈したTIGIT-FcまたはTIGIT-mFcを2.5μl/ウェルで添加し、1000 rpmで1分間遠心分離した後、ビオチン-CD155 4μg/ mlに希釈したものを2.5μl/ウェルで加えた。プレートを1000 rpmで1分間遠心分離した後、室温で10分間プレインキュベートした。その後、Pab Anti-Human IgG-Tb(Cisbio、カタログ番号61HFCTAA)をサンプル希釈液で3.2μg/ mlに希釈し、0.08μg/ml Streptavidin-XL665(Cisbio、カタログ番号610SAXLA)を2.5μl/ウェルで加え、またはサンプル希釈液で3.2μg/mlおよび0.08μg/mlストレプトアビジン-Tb(Cisbio、カタログ番号610SATLA)に希釈されたPab Anti-mouse-IgG-XL665(Cisbio、カタログ番号61 PAMXLA)を2.5μl/ウェルで添加した。プレートを室温で1時間放置し、PHEARstar FSプレートリーダー(BMG LABTECH)を用いて665 nm及び620 nmで発光値を検出した。データをGraphPad Prism 5で分析した。CD155タンパク質へのヒトTIGITの結合に対するTIGIT抗体の阻害活性を算出した。その結果を図5A及び5Bに示す。
試験例7:TIGIT抗体は、ブロッキングアッセイによりCD155を過剰発現するCHO細胞へのTIGIT抗原の結合を遮断する
CD155-CHO細胞を5x10^5/mlの密度で播種し、100μl/ウェルを96ウェルプレートで終夜培養した。上清を廃棄し、プレートをPBSで3回洗浄した後、細胞免疫固定液(Beyotime、カタログ番号P0098)を100μl/ウェルで加え、室温で30分固定した。プレートをPBSで4回洗浄した。液体を廃棄した後、PBSで希釈した5%スキムミルク(BDスキムミルク、カタログ番号. 232100)のブロッキング溶液を200μl/ウェルで加え、37℃で3時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液(0.05%tween-20、pH7.4を含むPBS)で5回洗浄した後、抗原抗体の事前混合溶液を50μl/ウェルで添加した。37℃のインキュベーターで1時間インキュベートした。ここで、ヒトTIGIT-hFc(自社製)またはヒトTIGIT-mFc(自社製)をサンプル希釈液(1%BSAを含むPBS、pH7.4)で希釈した。0.2μg/mlの最終濃度まで、試験される抗体の勾配濃度と混合し、1時間プレインキュベートした。インキュベーション後、反応液をプレートから取り除き、PBST、HRP標識ヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)またはヤギ抗 サンプル希釈液で希釈したマウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)を50μl/ウェルで加え、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄し、TMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を50μl/ウェルで加え、室温で5〜15分間インキュベートし、1M H2SO4を50で加え、50 μl/ウェルで反応を停止させる。波長450 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Thermo Scientific Multiskan、MK3)で読み取った。データをGraphPad Prism 5で分析した。CD155を過剰発現するCHO細胞への抗原の結合を遮断することに対するTIGIT抗体の効果を算出した。その結果を図6に示す。
試験例8:TIGIT抗体は、ブロッキングアッセイにより、TIGITを過剰発現しているCHO細胞へのCD155タンパク質の結合を遮断する
まず、CD155-Fc(Sino Biological、カタログ番号10109-H02H)をCFTM633蛍光色素(Sigma Aldrich、カタログ番号MX633S100)で標識した。CD155-FcをPBSに0.5〜1 mg/mlの濃度で溶解し、9倍のサンプル量の10×Mix-n-Stain反応緩衝液を添加して、完全に混合した。CFTM633蛍光色素を加え、暗所、室温で30分間インキュベートした。蛍光標識の手順は完了した。
TIGIT-CHO細胞を5×10^6/ml、100μl/ウェルの密度で96ウェル丸底プレート(Corning、カタログ番号32915001)に播種し、遠心分離機で1500 rpmで5分間遠心分離した(ベックマンコールター、アレグラX-15R遠心分離機)、上清を廃棄した。細胞を200μlのPBSに再懸濁し、再び遠心分離し、上清を廃棄した。細胞は、サンプル希釈溶液(1%BSAを含むPBS、pH7.4)で段階希釈された100μl/ウェルのテスト対象の抗体溶液を加えて再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1500rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をサンプル希釈液で2回洗浄した。次に、2μg/ml CFTM633蛍光標識CD155-Fc溶液100μlを加えて細胞を再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1500 rpmで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をサンプル希釈液で2回洗浄し、最後に細胞を200μl/ウェルのサンプル希釈液で再懸濁した。蛍光シグナルの強度をフローサイトメーター(BD FACS Canto II)で測定した。データをGraphPad Prism 5で分析した。CD155のTIGIT-CHO細胞への結合を遮断する際のTIGIT抗体の能力を算出した。その結果を図7と次の表に示す。
本試験例では、h1707-02、h1708-04、h1709-10、h1710-01及びh1711-04抗体は全て、TIGITを過剰発現しているCHO細胞へのCD155の結合を遮断できた。
試験例9:TIGIT抗体は、ブロッキングアッセイにより、CD112を過剰発現しているCHO細胞へのTIGIT抗原の結合を遮断する
ヒト化抗体サンプルを1%BSAで希釈し、20μg/mLの濃度から9つの濃度ポイントを開始した。一方、TIGIT-mFcは2μg/mLに希釈した。抗原を様々な濃度の抗体と1:1(体積比)の比率で混合し、37℃で30分間プレインキュベートした。CD112-CHO細胞を収集し、PBSで1回洗浄し、0.5*10^6/testで分注した。細胞を抗原抗体混合物150μlで再懸濁し、4℃で60分間インキュベートし、1%BSAで3回洗浄した。細胞を100μlのPE-ヤギ抗マウスIgG(Biolegend、405307)希釈溶液に再懸濁し、4℃で40分間インキュベートし、1%BSAで3回洗浄し、200μlの1%BSAで再懸濁した。各サンプルの平均蛍光強度(MFI)をフローサイトメトリーBD FACSCanto IIで読み取った。データをGraphPad Prism 5で分析した。CD112-CHO細胞への抗原の結合の遮断に対するTIGIT抗体の効果を算出した。その結果を図8に示す。
試験例10:TIGITを過剰発現するCHO細胞でのTIGIT抗体の結合内在化アッセイ
TIGIT-CHO細胞を2x10^6/ml、100μl/ウェルの密度で96ウェル丸底プレート(Corning、カタログ番号32915001)に播種し、遠心分離機(ベックマンコールター、Allegra X-15R遠心分離機)で1500 rpmで5分間遠心分離した。上清を廃棄した。細胞を200μlの1%BSAに再懸濁し、遠心分離し、再び上清を廃棄した。ヒト化抗体サンプルを1%BSAで4μg/mLの濃度に希釈し、100μl/ウェルで細胞に添加して細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞を氷上で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1500 rpmで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を1%BSAで3回洗浄し、10%FBS-DMEM/F-12培養液で再懸濁し、2つの部分に分けた。1つはインキュベーター内で37℃で1時間インキュベートし(内在化グループ)、もう1つは氷上で1時間インキュベートした(結合親和性グループ)。インキュベーション後、細胞を1%BSAで1回洗浄した後、氷上で1%BSAで希釈したPE-抗Fc抗体(Jackson、109-115-098)と1時間インキュベートした。細胞を1%BSAで3回洗浄し、%BSAに再懸濁した。各サンプルのMFIをフローサイトメーターBD FACSCanto IIで読み取った。抗体の内在化率は次式により算出した。注:「ブランク」とは、1%BSAで希釈したPE-抗Fc抗体のみで、抗TIGIT抗体なしで、氷上で1時間インキュベートし、3回洗浄して再懸濁した後、MFIが読み取られたことを意味する。その結果を図9に示す。
内在化率%=(結合親和性グループ-内在化グループ)* 100/(結合親和性グループ-空白グループ)
試験例11:ナチュラルキラー細胞(NK)の細胞殺傷アッセイ
ヒト結腸直腸癌細胞株WiDrは、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を添加したMEM培地で37℃、5%CO2下で培養した。PBMCは、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離(Stem Cell Technologies)により新鮮な血液から得た。ヒト初代NK細胞は、新しく分離されたPBMC(Miltenyi、カタログ番号130-092-657)から抽出し、37℃、5%CO2下で、10%(v/v)FBSを添加したRPMI 1640培地の中で培養した。
ヒト初代NK細胞を6ウェル細胞培養プレートに約2x10^6/mlの細胞密度で播種し、100 U/mLのヒトIL-2を添加して終夜インキュベートした。細胞をフェノールレッドを含まないRPMI 1640培地で洗浄し、再懸濁し、細胞密度約3x10^5/ウェルで96ウェルU底プレートに播種した。一方、連続希釈抗体サンプル(PBSで希釈)または同量のホモIgG(ブランクコントロールとして)を追加した。37℃、5%CO2で1時間インキュベートした後、標的細胞WiDrをヒト初代NK細胞と1:1の比率で、37℃、5%CO2で4時間共培養した。胞培養上清を回収した。細胞培養上清に分泌されたLDHのレベルは、製造元の指示に従ってCytoTox96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega、カタログ番号G1780)を用いて測定した。特定の細胞溶解の割合は、次の式:溶解率= 100×(ER-SR1-SR2)/(MR-SR1)で測定した。ここで、ER、SR(1&2)及びMRは実験的な自然発生(「1」)標的細胞については「2」、ヒト初代NK細胞については「2」)及び最大LDH放出を示す。自然放出は、培地のみで培養された標的細胞またはヒト初代NK細胞によるLDHの放出で、最大放出は、全ての標的細胞が溶解緩衝液によって溶解されたときに測定されたLDHであった。結果を図10Aまたは図10Bと次の表に示す。ヒト化TIGIT候補抗体h1707-02、h1708-04、h1710-01及びその他の抗体は、ヒト初代NK細胞による標的細胞の殺傷を様々な程度に高め、薬物濃度依存的な効果を示す。
試験例12:PBMC-Tリンパ球活性化の実験
Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離(Stem Cell Technologies)により新鮮な血液からPBMCを得て、10%(v/v)FBSが補充されたRPMI 1640培地で37℃、5%CO2で培養した。
新たに精製されたPBMCの密度は、RPMI 1640培地で2x10^6/mlに調整した。25μlのツベルクリンを20 mLの細胞懸濁液に加え、37℃、5%CO2で5日間培養した。5日目に、CD155(組換えCD155/PVRタンパク質、R&D、2530-CD-050/CF)を96ウェル細胞培養プレートに0.25μg/ウェルで加え、4℃で終夜コーティングした。6日目に、上記の培養細胞を収集し、遠心分離し、PBSで1回洗浄し、新鮮なRPMI 1640培地に再懸濁して密度を1×10^6/mlに調整した。細胞を、CD155コーティングした96ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり90μlで播種した。連続希釈抗体サンプル(PBSで希釈)または等量のアイソタイプIgG(ブランクコントロールとして)をウェルあたり10μl添加した。細胞培養プレートをインキュベーター内で37℃、5%CO2で3日間インキュベートした。胞培養プレートを取り出し、4000rpmで10分間遠心分離した。細胞培養上清を回収し、IFN-γのレベルをELISA法(ヒトIFN-γ検出キット、NEOBioscience、EHC 102g.96)で製造元の指示に従って測定した。その結果を図11に示す。TIGITヒト化候補抗体h1708-04、h1710-01及びその他の抗体は、活性化された初代Tリンパ球から分泌されるサイトカインIFN-γのレベルを様々な程度に増加させ、薬物濃度依存的な効果を示した。
試験例13:ラットにおけるヒト化TIGIT抗体の薬物動態学的評価
静脈内注射の場合、血液サンプルは、投与後5分、8時間、1日、2日、4日、7日、10日、14日、21日及び28日の時点で採取した。皮下注射の場合、血液サンプルは、投与後1時間、4時間、8時間、1日、2日、4日、8日、11日、14日、21日、及び28日の前の時点で採取した。各動物について、抗凝固剤の非存在下で全血0.2 mlを採取した。血液サンプルを4℃で30分間放置し、1000 gで15分間遠心分離し、上澄みをEPチューブに取り出し、-80℃で保存した。
抗体の血清濃度をELISA法(実施例3及び試験例1を参照)により測定し、試験薬物の薬物動態パラメーターをWinnolinソフトウェアで計算した。主な薬物動態の結果を図12に示す。
該検出から、ラットにおける抗TIGIT抗体h1707-02、h1708-04、h1710-01、h1709-10及びh1711-04の暴露量は、SDラットに上記の抗体3 mg/kgを静脈内投与した後も同様であったことが分かった。皮下投与後の生物学的利用率は高く、ほぼ100%であった。各抗体の消失半減期は22G2-H3Q抗体のそれよりも長かった。
試験例14:UNITテストによるヒト化TIGIT抗体の熱安定性の検出
(表5)抗体の熱安定性
試験例15:SEC-HPLCでサンプル純度のモニタリングによる特定濃度でのサイクル安定性の調査
試験例16:抗体の化学的安定性
試験する抗体500μgを500μlのPBS pH7.4に溶解し、40℃の水浴でインキュベートした。酵素消化実験のために、サンプルをそれぞれ0日目、14日目、28日目に採取した。様々な時点で採取した100μgのサンプルを100μlの0.2 M His-HCl、8 M Gua-HCl pH6.0に溶解し、3μlの0.1g/mL DTTを添加し、50℃の水浴で1分間インキュベートした後、0.02 M His-HCl pH6.0で2回限外濾過した。3μlの0.25 mg/mLトリプシンを加え、酵素消化のために37℃の水浴で終夜インキュベートした。LC-MS分析は、Agilent 6530 Q-TOFを用いて行った。その結果、40℃で1か月加速した後、h1707-02、h1708-04、h1709-10、h1710-01及びh1711-04は、水の損失、酸化、脱アミドなどの不安定な変化を示さなかった。分子が良好な化学的安定性を有することが示唆された。
Claims (23)
- モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、該モノクローナル抗体または抗原結合断片は、ヒトTIGITに特異的に結合し、該モノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、
(i)該重鎖可変領域は、配列番号15、16及び17のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、または、それぞれ配列番号15、16及び17に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号18、19及び20のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号18、19及び20に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つまたは1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(ii)該重鎖可変領域は、配列番号21、22及び23のアミノ酸配列で示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3、またはそれぞれ配列番号21、22及び23に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号24、25及び26のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号24、25及び26に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(iii)該重鎖可変領域は、配列番号27、28及び29のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号27、28及び29に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号30、31及び32のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号30、31及び32に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(iv)該重鎖可変領域は、配列番号33、34及び35のアミノ酸配列に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3、またはそれぞれ配列番号33、34及び35に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号36、37及び38のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号36、37及び38に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む;または、
(v)該重鎖可変領域は、配列番号39、40及び41のアミノ酸配列に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3、またはそれぞれ配列番号39、40及び41に示されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるHCDR変異体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号42、43及び44のアミノ酸配列に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3、またはそれぞれ配列番号42、43及び44に示されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3と3つ、2つ、または1つのアミノ酸の差があるLCDR変異体を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - 該モノクローナル抗体が、組換え抗体、好ましくは、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体からなる群から選択される組換え抗体である、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域上の軽鎖及び重鎖FR領域配列は、それぞれ、ヒト生殖系列の軽鎖及び重鎖またはそれらの変異配列に由来する、請求項2に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- ヒト化抗体は、配列番号45、51、56、64または71に示される重鎖可変領域、またはそれらの変異体を含み、該変異体が、配列番号45、51、56、64または71に示される重鎖可変領域に1〜10のアミノ酸変異を有する、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 変異体は、配列番号45、51、56、64または71に示される重鎖可変領域のFR領域に1〜10のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、該逆突然変異が、
配列番号45に示される重鎖可変領域上のN84S、S85R及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号51に示される重鎖可変領域上のM48I、R72V、V79A及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号56に示される重鎖可変領域上のY27F、M48I、R72V、V79A、S84N及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号64の重鎖可変領域上のR38K、R67K、R72V、T74K、M48I、V68A、M70L、V79A及びそれらの任意の組み合わせ;または、
配列番号71に示される重鎖可変領域上のG27Y、M48I、L83F、A97T及びそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項4に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - 該ヒト化抗体は、
(vi)配列番号45または50に示される重鎖可変領域;
(vii)配列番号51及び54から55のいずれか1つに示される重鎖可変領域;
(viii)配列番号56、61、62及び63のいずれか1つに示される重鎖可変領域;
(ix)配列番号64、67、68、69及び70のいずれか1つに示される重鎖可変領域;そして
(x)配列番号71、75、76及び77のいずれか1つに示される重鎖可変領域
からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - 該ヒト化抗体は、配列番号46、52、57、65または72に示される軽鎖可変領域またはその変異体を含み、該変異体が、配列番号46、52、57、65または72に示される軽鎖可変領域に1〜10のアミノ酸変化を含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 該変異体は、配列番号46、52、57、65または72に示される軽鎖可変領域のFR領域に1〜10のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、該逆突然変異が、
配列番号46の軽鎖可変領域上のS60D、T85D、A43S、S63T及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号52の軽鎖可変領域上のA43Sのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号57の軽鎖可変領域上のQ3V、A43S、S60D、Y87F及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号65の軽鎖可変領域上のA43S、I48V及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異;または、
配列番号72の軽鎖可変領域上のN22S、P49S及びそれらの任意の組み合わせのアミノ酸逆突然変異
からなる群から選択される、請求項7に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - 該ヒト化抗体は、
xi)配列番号46、47、48及び49のいずれか1つに示される軽鎖可変領域;
xii)配列番号52または53に示される軽鎖可変領域;
xiii)配列番号57、58、59及び60のいずれか1つに示される軽鎖可変領域;
xiv)配列番号65または66に示される軽鎖可変領域;そして
xv)配列番号72、73及び74のいずれか1つに示される軽鎖可変領域
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - 該ヒト化抗体は、
xvi)配列番号45または50の重鎖可変領域及び配列番号46、47、48及び49のいずれか1つの軽鎖可変領域;
xvii)配列番号51、54及び55のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号52または53の軽鎖可変領域;
xviii)配列番号56、61、62及び63のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号57、58、59及び60のいずれか1つの軽鎖可変領域;
xix)配列番号64、67、68、69及び70のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号65または66の軽鎖可変領域;または、
xx)配列番号71、75、76及び77のいずれか1つの重鎖可変領域及び配列番号72、73及び74のいずれか1つの軽鎖可変領域
からなる群から選択されるいずれか1つを含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - 該抗体は全長抗体であり、ヒト抗体定常領域をさらに含み、好ましくは、配列番号78に示されるヒト抗体重鎖定常領域及び配列番号79に示されるヒト軽鎖定常領域を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 該抗原結合断片は、Fab、Fab'、F(ab’)2、単鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(二重特異性抗体)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)及びCDRを含むペプチドからなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトTIGITへの結合について請求項1〜12のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と競合することを特徴とする、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- 治療有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
- 請求項15に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
- 請求項16に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞であって、該宿主細胞が原核細胞及び真核細胞からなる群から選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である、宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法であって、請求項17に記載の宿主細胞を培養して培養し、請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を形成及び蓄積し、そして培養物から該モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む、方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用するステップを含む、ヒトTIGITを検出または測定するための方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、ヒトTIGITを検出または測定するための薬剤。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、請求項14に記載の医薬組成物、または請求項15に記載の核酸分子の、ヒトTIGIT関連疾患を治療するための薬剤の調製における使用であって、該疾患が好ましくは、T細胞機能不全疾患であり、より好ましくは腫瘍、癌、免疫疾患または感染症である、使用。
- ヒトTIGIT関連疾患を治療するための方法であって、該方法は、ヒトTIGIT関連疾患を治療するため、薬学的有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、または請求項14に記載の医薬組成物、または請求項15に記載の単離された核酸分子を被験者に投与することを含み、該疾患が、好ましくはT細胞機能不全疾患であり、より好ましくは腫瘍、癌または感染症であり、最も好ましくはCD155陽性またはPVR陽性の腫瘍、癌または感染症である、方法。
- 疾患を治療する方法であって、該方法は、薬学的有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、または請求項14に記載の医薬組成物、または請求項15に記載の単離された核酸分子を被験者に投与することを含み、該疾患が、好ましくはT細胞機能不全疾患であり、より好ましくは腫瘍、癌または感染症であり、最も好ましくはCD155陽性またはPVR陽性の腫瘍、癌または感染症である、方法。
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