JP2020518253A - トランスジェニックマーカー配列を使用せず細胞を単離する方法 - Google Patents

トランスジェニックマーカー配列を使用せず細胞を単離する方法 Download PDF

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Abstract

表現型選択形質の平行導入と組み合わされる、植物、植物細胞、または植物物質において標的化編集する方法。本方法は、トランスジェニック選択マーカー配列を導入するステップを含まない。

Description

本発明は、表現型選択形質の平行導入と組み合わされる、植物、植物の細胞または物質における標的化編集の方法に関する。さらに、トランスジェニック選択マーカー配列を導入するステップを含まない方法を提供する。方法は、第１のゲノム標的部位に標的化修飾を導入して選択表現型を得ることを含み、外来性ポリヌクレオチド鋳型の提供には頼らず、標的部位の二本鎖切断の導入にも頼らない。最後に、本発明は、異なるゲノム標的部位におけるトランスジェニックマーカーを用いない選択と標的化編集とを平行化する、特定の方法ステップの組み合わせに関し、その結果として選択可能なまたはほかの表現型を付与して、選択マーカーカセットを用いない植物物質の単離を可能にし、それによって関心対象の遺伝子型を特定する選択の手間が大幅に縮小された精密育種を可能にする。
発明の背景
真核細胞の遺伝情報の精密な改変は、農業、薬学、および医学用途にとって高い価値があるが、基礎研究にとっても重要である。ゲノム工学またはゲノム編集とは、そのような定められた遺伝子変化を高精度で標的中に作成する能力のことである。たとえば、標的化部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）またはリコンビナーゼにより、真核細胞中に二本鎖切断を生じさせることができる。
植物では、精密二本鎖切断が起きることで、相同組換え（ＨＲ）事象の頻度が１００〜１０００倍増加する（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （米） １９９６， ９３： ５０５５−５０６０）。しかし、改変細胞および改変植物の下流での特定が、植物改良用の育種ツールとしての遺伝子編集のルーチンな実施を制限している。
植物の育種、および農薬などの農業技術の開発は、１００年以上かけて目覚ましい進歩を遂げ、作物の収量を増加させてきた。しかし植物育種家たちは、常に多くの変化に応えていかねばならない。農業の慣行も変わるため、特定の農学的特徴を担持する遺伝子型をもつ植物を開発する必要が生じる。さらに、標的環境とそこに生息する生物たちも変化し続けている。たとえば、真菌や害虫が絶えず発生しては、関心対象の植物の抵抗性に打ち勝ってしまう。新しい土地が次々に農業に使用され、植物は異なる生育条件にさらされる。そして、消費者の好みや要求も変わる。したがって、植物育種家たちは、絶えず作物の新品種を開発するという終わりのない課題に直面している（Ｃｏｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｍａｃｋｉｌｌ， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ｂ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ２００８年２月１２日； ３６３（１４９１）： ５５７−５７２）。
したがって、育種ストラテジーを支援するために、関心対象の遺伝子型を確実に決定できる診断能力のある選択マーカー配列またはマーカー支援選択（ＭＡＳ）ストラテジーが必要とされている。欧州特許登録第２ ３４２ ３３７号Ｂ１で開示されているように、診断マーカーの開発は、関心対象の形質の根底である遺伝子の遺伝学的位置のマッピングから始まり、両側のマーカーの特定、密接に結合したマーカーの特定による細密な遺伝子マッピング、最多結合マーカーのＤＮＡマーカー配列の決定、標的遺伝子の位置特定に用いられる親系統間のマーカー座位での配列多様性の決定、簡単なＰＣＲアッセイの開発、植物物質の遺伝的背景（生殖質）の予測値の試験における選抜または育種中に診断特性をもつマーカーを試験する、といったプロセスを辿る。関心対象のマーカーが関心対象のゲノム内で好適な位置に存在するか挿入されなくてはならないので、前述のストラテジーは本質的に労力を要し、したがってコスト集約型となる。
ＤＮＡマーカー技術は、表現型形質を決定するかわりに、検定しやすいマーカーに基づいた選択を可能にすることで、植物育種の効率を劇的に高めることができる。しかし、そのような診断または選抜特性をもつマーカーの開発、およびそうしたマーカーを用いる有効性は、上記で詳述したように、労力と時間のかかるプロセスであることが多い。現在、点変異、たとえばＳＮＰを検出する方法では、そのような点変異をほんの少数しか特定できず、レパートリーも少ししか検出できない（Ｓｌａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３， ７５−８１）。
とはいえ、選択マーカー遺伝子は、トランスジェニックおよびトランスプラストミック植物の研究、または作物開発で、植物において重要な役割を果たす。選択マーカー遺伝子は、レポーター遺伝子と組み合わせて使用されることが多く、該レポーター遺伝子は細胞に選択性の利点を与えないが、トランスジェニック事象を観察すること、またはトランスジェニック物質を非形質転換物質から手動で分離することに用いることができる。
急進しているのが、選択マーカー遺伝子を排除して、マーカーを含まない植物を作るストラテジーの開発分野である。マーカーを含まない植物を作ることの合理性については、いくつかの論評で詳しく論じられている（Ｙｏｄｅｒ ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈ， １９９４； Ｏｗ， ２００１； Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｃｈｕａ， ２００２）。トランスジェニックおよび非トランスジェニック植物の製品化に関しては、最終植物品種において何の目的も果たさない遺伝子配列を除去することで、法的プロセスが簡単になり、消費者にも受け入れられやすくなる。最終植物からマーカー遺伝子を排除することで、膨大なバイオセイフティー審査を受けていない、あるいは植物に負の多面的効果を生じ得る実験的マーカー遺伝子の使用が可能になる。さらに、有用なマーカー遺伝子が次ラウンドの形質転換の前に排除されるならば、それを再利用して、トランスジェニック植物の反復的な形質転換が可能になる。
このように、トランスジェニック選択マーカー遺伝子は、処理細胞から再生する植物の回収効率を高めることができるが、植物ゲノムにトランスジェニックシーケンシングを導入することが必ずしも望ましいとは限らない。さらに、選択を終えてからトランスジェニックマーカー遺伝子を排除することは、たいてい非常に複雑である。
精密遺伝子編集またはゲノム工学は、この数年間で遺伝子工学の最重要分野の一つとして発展し、関心対象のゲノムの標的化された部位指定的な操作を可能にしている。部位指定的ゲノム工学に必要不可欠なのがプログラム可能なヌクレアーゼであり、これらは関心対象の核酸を決められた位置で切断して、二本鎖切断（ＤＳＢ）または１つもしくは複数の一本鎖切断を引き起こすのに用いることができる。かわりに、これらのヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能は失っているが別の酵素と組み合わされて認識分子として機能する、キメラまたは変異バリアントの場合もある。したがって、こうしたヌクレアーゼまたはそれらのバリアントはすべての遺伝子編集またはゲノム工学アプローチの基幹である。近年、多くの好適なヌクレアーゼ、特に、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、たとえばナトロノバクテリウム・グレゴリ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）由来のアルゴノートヌクレアーゼ、およびクラスター化反復短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系の一部としてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、たとえばＣａｓ、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、またはＣａｓＹヌクレアーゼなど、目的に合わせたエンドヌクレアーゼが開発されている。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化反復短回文配列リピート）は、自然環境ではもともと細菌内で発達したものであり、ＣＲＩＳＰＲ系はウイルス攻撃に対し防御する適応免疫系の役割を果たす。ウイルスに曝露すると、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ座位に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座位の一部分からウイルス配列を含むＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに対する相補配列を含有するこのＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がウイルスゲノムの標的配列を標的化するのを媒介する。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がウイルス標的を切断し、そうすることで複製に干渉する。過去数年で、ＣＲＩＳＰＲ系は、真核細胞の遺伝子編集やゲノム工学にも成功裏に用いられている。現在重点的に研究されているのは、動物細胞の編集、およびヒトへの治療用途である。複雑な動物ゲノム、そして植物ゲノムでも、標的化修飾は依然として骨の折れるタスクである。
自然環境でのＣＲＩＳＰＲ系とは、少なくとも１つの小さい単体の非コードＲＮＡと、Ｃａｓヌクレアーゼまたは別のＣｐｆ１ヌクレアーゼのようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの組み合わせを含む分子複合体のことであり（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｓ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ”， Ｃｅｌｌ， ２０１５年１０月， １６３， ｐ．１−１３）、特異的ＤＮＡ二本鎖切断を生じさせることができる。今のところ、ＣＲＩＳＰＲ系は２つのクラスに分類されており、これらのクラスには、たとえばＣａｓ９をエフェクターとするＩＩ型系やＣｐｆ１をエフェクター分子とするＶ型系など５つの型のＣＲＩＳＰＲ系が含まれる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．， ２０１５）。人工のＣＲＩＳＰＲ系では、合成非コードＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／または任意選択によりニッカーゼとして作用するように改変されているかまったくヌクレアーゼ機能をもたない修飾ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの機能を組み合わせた少なくとも１つの合成または人工ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと組み合わせて用いることができる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， 前掲）。天然の系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに媒介される免疫応答にはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が必要であり、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特異的活性化を制御するこのガイドＲＮＡの成熟は、これまでに特徴付けられているさまざまなＣＲＩＳＰＲ系の間で大きく異なる。まず、スペーサーとしても知られる侵入ＤＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ座位の近位末端の２つの隣接するリピート領域の間に組み込まれる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、干渉ステップの主要酵素としてのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードし、これらの系はｃｒＲＮＡとトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方をガイドモチーフとして含んでいる。これらがハイブリダイズして二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成し、これがＲＮＡｓｅ ｌｌＩにより認識されて切断され、成熟ｃｒＲＮＡを形成することができる。これらは次にＣａｓ分子と結合することで、このヌクレアーゼを特異的に標的核酸領域に向ける。組換えｇＲＮＡ分子は、可変ＤＮＡ認識領域とＣａｓ相互作用領域の両方を含むことができ、特定の標的核酸および所望のＣａｓヌクレアーゼとは関係なく、特殊設計とすることができる。さらなるセーフティ機構として、標的核酸領域にはＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）が存在する必要がある。これらは、Ｃａｓ９／ＲＮＡ複合体に認識されるＤＮＡに直接後続しているＤＮＡ配列である。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対するＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」または「ＮＡＧ」（標準ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）として記述されている（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２， ３３７： ８１６−８２１）。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９に対するＰＡＭ配列は、「ＮＮＧＲＲＴ」または「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」である。さらなるバリアントＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が知られている。したがって、ナイセリア・メニンギタイディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴのところを切断する。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷのところを切断する。最近、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）のＣＲＩＳＰＲ系に関し、さらなるＰＡＭモチーフＮＮＮＮＲＹＡＣが記述されている（国際公開第２０１６／０２１９７３号Ａ１）。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについては、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が、一般にＣａｓ９系により認識されるＧリッチＰＡＭではなく、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率よく切断することが記述されている（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， 前掲）。さらに、修飾ＣＲＩＳＰＲポリペプチドを用いることによって、特異的一本鎖切断を得ることができる。Ｃａｓニッカーゼをさまざまな組換えｇＲＮＡと組み合わせて使用して、二本鎖ＤＮＡニッキングにより、非常に特異的なＤＮＡ二本鎖切断を引き起こすこともできる。さらには、２つのｇＲＮＡを使用することで、ＤＮＡ結合の特異性ひいては該ＤＮＡの切断を最適化することができる。
現在、たとえば、エンドヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９をはじめとするＩＩ型系またはそのバリアントもしくは何らかのキメラ体が、ゲノム工学用に改変されている。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの２つの構成要素からなる合成ＣＲＩＳＰＲ系は、標的化すべき遺伝子に特異的でありエンドヌクレアーゼＣａｓ９と結合できるｇＲＮＡの同時発現により、ノックアウト細胞またはノックアウト動物を作製するのに用いることができる。なお、ｇＲＮＡは人工分子であり、Ｃａｓまたは任意のほかのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはそのバリアントもしくは触媒活性フラグメントと相互作用する１つのドメインと、関心対象の標的核酸と相互作用するもう１つのドメインとを含み、したがってｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物である（「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）または単に「ｇＲＮＡ」； Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， 前掲）。ゲノム標的は、ＰＡＭのすぐ上流に存在するかぎり、およそ２０ヌクレオチドのどのようなＤＮＡ配列でもよい。ＰＡＭ配列は標的結合にとって非常に重要であり、実際の配列はＣａｓ９の種に左右される。たとえば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９の場合は、５’ＮＧＧ３’または５’ＮＡＧ３’である（標準ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， 前掲）。修飾Ｃａｓヌクレアーゼを用いて、関心対象の標的配列に標的化一本鎖切断を導入することができる。このようなＣａｓニッカーゼを種々の組換えｇＲＮＡと組み合わせて用いることで、ダブルニッキング系により、高部位特異性ＤＮＡ二本鎖切断を導入することができる。１つまたは複数のｇＲＮＡを用いることで、全体的な特異性をさらに高めることができ、オフターゲットの効果を減じることができる。
Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡは、発現すると、ｇＲＮＡの「足場」ドメインとＣａｓ９の表面に露出しプラスに帯電した溝との相互作用により、リボヌクレオタンパク質複合体を形成する。重要なのは、ｇＲＮＡの「スペーサー」配列は、なおも標的ＤＮＡと相互作用できることである。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体はＰＡＭを有するどのようなゲノム配列にでも結合するが、ｇＲＮＡスペーサーが標的ＤＮＡと適合する度合いによって、Ｃａｓ９が切断するかどうかが決まる。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が推定ＤＮＡ標的に結合すると、ｇＲＮＡ標的化配列の３’末端にある「シード」配列が標的ＤＮＡにアニールし始める。シードと標的ＤＮＡ配列が適合すれば、ｇＲＮＡは引き続き、（ｇＲＮＡの極性に対し相対的に）３’から５’の方向に標的ＤＮＡにアニールする。
最近、標的化ゲノム工学では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に加えて、工学ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系がますます重要になっている（前掲のＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．および欧州特許出願公開第３ ００９ ５１１号Ａ２明細書を参照）。このＶ型系は、ＩＩ型系と同じくクラス２のＣＲＩＳＰＲ系に属する（Ｍａｋａｒｏｖａ ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０１５， １３１１： ４７−７５３）。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は巨大タンパク質（約１３００個のアミノ酸）であり、対応するＣａｓ９のドメインと相同のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、およびＣａｓ９の特徴であるアルギニンリッチクラスターのカウンターパートを含む。しかし、Ｃｐｆ１にはすべてのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインがなく、ＲｕｖＣ様ドメインはＣｐｆ１配列のなかで一続きになっており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入部が含まれるＣａｓ９と異なっている（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ， ２０１４； Ｍａｋａｒｏｖａ， ２０１５）。Ｃａｓ９エフェクターに対しＣｐｆ１エフェクターが有するいくつかの明白な違いとしては、ＣＲＩＳＰＲアレイのプロセシングに追加のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が不要であること、短いＴリッチＰＡＭ（一方のＣａｓ９ではＰＡＭにＧリッチ配列が後続）による効率のよい標的ＤＮＡ切断、およびＣｐｆ１による片方が突出したＤＮＡ二本鎖切断の導入がある。ごく最近、ＣａｓＸおよびＣａｓＹに基づいたさらなる新規のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が同定されたが、これらはエフェクタータンパク質のサイズが比較的小さいため、遺伝子編集またはゲノム工学の多くのアプローチにとって特に興味深いものである（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｎｅｗ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅｓ”， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１６年１２月）。
それでも、ＣＲＩＳＰＲ系自体には、標的細胞において関心対象のゲノムの所望位置で点変異を生成する固有の能力はない。
二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するＣＲＩＳＰＲ系のようなゲノム工学ツールは、ＤＳＢ修復機構を必要とする。この機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と相同組換え（ＨＲ）の２つの主要な基本タイプに分けられる。ふつう、相同性に基づいた修復機構は概して相同性指定修復（ＨＯＲ）と呼ばれている。
ＮＨＥＪは、動物および植物において主流の核応答であり、相同配列を必要としないが、エラーが起きやすいので潜在的に変異原性である（Ｗｙｍａｎ Ｃ．， Ｋａｎａａｒ Ｒ． “ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ： ａｌｌ’ｓ ｗｅｌｌ ｔｈａｔ ｅｎｄｓ ｗｅｌｌ”， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２００６； ４０， ３６３−８３）。ＨＯＲによる修復は相同性を必要とするが、切断された染色体の修復にインタクトな染色体を使うＨＯＲ経路、すなわち二本鎖切断修復および合成依存型鎖アニーリングは、非常に正確である。古典的ＤＳＢ修復経路では、３’末端がインタクトな相同鋳型に侵入して、ＤＮＡ修復合成のプライマーの役割を果たし、最終的にダブルホリデイジャンクション（ｄＨＪ）を形成させる。ｄＨＪは、４本鎖の分枝構造体であり、侵入鎖が伸長して第２のＤＳＢ末端のＤＮＡを「捕捉」し、そこからＤＮＡを合成して形成する。個々のＨＪは２つの方法のいずれかの切断により分解される。合成依存型鎖アニーリングは保存的であり、非乗換え事象しか生じない。このことは、新たに合成される配列がすべて、同一分子上に存在することを意味する。ＮＨＥＪ修復経路と異なり、鎖侵入および合成依存型鎖アニーリングのＤループ形成に続いて、侵入鎖の新たに合成された部分が鋳型からずらされ、他方のＤＳＢ末端の非侵入鎖の加工末端に戻される。非侵入鎖の３’末端が伸長し連結して、ギャップが埋まる。切断誘導型修復経路と呼ばれる、まだ完全には特徴付けられていない別のＨＯＲ経路もある。この経路の主な特色は、修復に使用できる侵入末端がＤＳＢに１つしかないことである。
したがって現時点では、植物ゲノムに標的化点変異を導入し、この変異を活用することは、難しいタスクである。さらに、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を用いるゲノム工学の潜在能力が今も直面しているのが、特に関心対象のゲノムが植物ゲノムのように複雑な真核生物のゲノムであって、育種の選択ラウンドをまたいで標的化修飾を追跡する必要がある場合に、これらＳＳＮにより導入された修飾を選択する問題である。
今日ゲノム工学（ＧＥ）は可能性に満ちているが、そうしたＧＥのアプローチの大半は、１種類のＳＳＮを含む複合体により関心対象の標的化修飾を導入することを目的としている。したがって、このような標的化修飾を後の植物育種のために植物の生殖質に導入することが可能であるが、該標的化修飾を後から追跡するのが厄介である。選択マーカーまたは選択マーカーカセットを用いて選択および関心対象となり得る細胞の単離を支援する場合でも、関心対象の遺伝子型／表現型の組み合わせを得るために育種中何ラウンドも連続して交配させた後で、植物のゲノムからこのようなマーカーカセットを除去するハードルはやはり相当高い。
同時に、育種中、たとえば関心対象の修飾に基づいた関心対象の形質、エリート事象、または交配させるべき栽培品種の好ましい特性を決定でき、作成でき、または交配できるような、好適な新しい植物育種法の提供に対する需要が大いにある。育種の種々の工程の際に、そうした関心対象の形質の伝搬と存在について選抜することは、時に難しく、または非常に時間がかかる。
したがって、細胞および植物を単離するより良い方法、好ましくは後続の選択ラウンド用にトランスジェニックマーカー配列のゲノム組込みを必要としない方法が必要とされている。さらに、選択および選抜手段の目的で、高精度で部位指定的に、かつ外来性トランスジェニック配列を導入することなく作製できる選択マーカー配列に対する高い需要もある。最後に、育種中何ラウンドも連続する交配および選択の間、関心対象の形質をまとめて生殖質にスタックしておく、高速育種を支援する新ストラテジーを定義する需要も極めて高い。
したがって、本願の根底にある目的は、遺伝子編集試薬で処理し編集した細胞を、選抜しやすい表現型選択形質を用いて単離する方法を提供することであった。このために、第１の遺伝子に標的化修飾を作成してその細胞およびその子孫に選択可能なまたはほかの表現型を付与し、トランスジェニック選択マーカー配列は導入しない。平行して、細胞に表現型を付与する場合もあるがふつうは付与しない標的化修飾を、第２の関心対象の遺伝子に作成する。該細胞およびその子孫細胞または植物を、選択因子を加えることにより、または第１の遺伝子の修飾により付与された表現型を用いてこの第１の遺伝子修飾を受けた細胞を特定するほかの方法により、無処理細胞のバックグラウンドから単離するか再生させることができる。この集団から、第２の関心対象の遺伝子に標的化修飾（実際の達成目的である第２の修飾）を有する細胞または植物を特定して、関心対象のゲノム中にトランスジェニック選択マーカー配列が存在することまたはそれを導入することを必要とせずに、より速い、したがってより廉価な選択を提供する。
発明の概要
上記で特定した目的は、本明細書で詳述するように、非トランスジェニックの表現型選択修飾の部位特定導入と、関心対象の第２の部位指定修飾の標的化導入とを平行化するストラテジーを定義することにより、達成されている。ふつう、この第２の修飾は選択には使われない。それは、第２の修飾が付与する表現型は、植物を作製するプロセスでは発現しないか関連がないためである。したがって、本発明の方法の根底にある目的は、第１の修飾を、選択を可能にするツールとして用いることである。従来のストラテジーと比べて本発明の方法は、トランスジェニックマーカー遺伝子を組み入れない利点を有する。対応する選択因子を用いて選択できる選択表現型を用いない場合と比べると、植物生産細胞の大部分を占めることになる無処理細胞のすべてまたは大半が排除されることで、効率が上がる利点を有する。第１の植物ゲノム標的部位に表現型選択形質の発現をもたらす標的化修飾をされていない無処理細胞を排除することで、生産しなければならない植物の数が大幅に減り、そして第２の標的化修飾について分子選抜しなければならない植物の数も大幅に減る。したがって本発明の方法は、育種効率を大幅に高め、かつ労働集約的ステップを回避する。
具体的には、上記の目的は、第１の態様では、少なくとも１つの改変植物細胞、または該少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法を提供することにより達成されており、該方法は、（ａ）改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾を導入することであって、該少なくとも１つの標的化塩基修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；（ｂ）該改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第２の標的化修飾を該第２の植物ゲノム標的部位に作成する少なくとも１つの部位特異的エフェクターを用いて導入され、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および（ｃ）（ｉ）該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾により該第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた該少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに（ｉｉ）該第２の植物ゲノム標的部位の該少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、を含む。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、方法が提供され、ここでステップ（ｂ）が、該少なくとも第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型を導入することをさらに含む。
さらなる実施形態では、第１の態様の方法は、少なくとも１つの第１の標的化修飾および少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得るステップであって、任意選択により、該関心対象の遺伝子型は、該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、さらなるステップ（ｄ）を含む。
一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、少なくとも１つの塩基編集複合体に一時的または恒久的に結合しており、該塩基編集複合体は、ステップ（ａ）の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾を媒介する。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターは、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントを含む制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、または塩基エディター、あるいは前述のエフェクターのあらゆるバリアントまたは触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターは、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼであり、該ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、少なくとも１つの塩基編集複合体を導く部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列は、（ａ）ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９、ＶＱＲ−Ｃａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９、（ｂ）ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１を含む、Ｃｐｆ１、（ｃ）ＣａｓＸ、および（ｄ）ＣａｓＹ、ならびに前述のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意のバリアントおよび誘導体を含む群より選択され、好ましくは該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、それぞれの野生型配列と比べて変異を含み、したがって得られたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮＡニッカーゼに、または全ＤＮＡ切断能力を失ったＤＮＡ結合エフェクターに変換されている。
一実施形態では、第１の態様の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、少なくとも１つの塩基エディターを構成要素として含む少なくとも１つの塩基編集複合体により作成される。
一実施形態では、塩基編集複合体は、少なくとも１つのシチジンデアミナーゼ、またはその触媒活性フラグメントを含む。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、ヌクレオチドＣ、Ａ、Ｔ、またはＧのいずれかの、任意のほかのヌクレオチドへの変換である。
本発明の方法の一実施形態では、塩基編集複合体は、ＡＰＯＢＥＣ１構成要素、ＵＧＩ構成要素、ＸＴＥＮ構成要素、またはＰｍＣＤＡ１構成要素を少なくとも１つ含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの塩基編集複合体は２つ以上の構成要素を含み、該少なくとも２つの構成要素は物理的に結合している。
本発明の方法の一実施形態では、少なくとも１つの塩基編集複合体は２つ以上の構成要素を含み、該少なくとも２つの構成要素は単体の構成要素として与えられている。
本発明の方法のさらなる実施形態では、少なくとも１つの塩基編集複合体の少なくとも１つの構成要素が、該少なくとも１つの塩基編集複合体を細胞内小器官に向けるために少なくとも１つの小器官局在化シグナルを含む。一実施形態では、少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり、さらなる実施形態では、少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、葉緑体輸送ペプチドである。さらなる実施形態では、少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、ミトコンドリア輸送ペプチドである。
本発明の方法の一態様では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、少なくとも１つの表現型選択形質をコードするゲノム標的部位であり、少なくとも１つの表現型選択形質は、抵抗性／耐性形質または成長優位性形質であり、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、もしくは植物、またはその子孫に、加えられる化合物またはトリガに対する抵抗性／耐性または成長優位性を付与する。
一実施形態では、関心対象の少なくとも１つの表現型選択形質は、少なくとも１つの内在性遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、あるいは関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、少なくとも１つの導入遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、少なくとも１つの内在性遺伝子または少なくとも１つの導入遺伝子は、関心対象の少なくとも１つの表現型形質に少なくとも１つの修飾がない細胞を阻害する、損傷する、または殺す植物毒、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは少なくとも１つの表現型形質は、細胞分裂、成長速度、胚発生のブースターからなる群より、または非改変細胞、組織、器官、もしくは植物と比べて改変細胞、組織、器官、もしくは植物に優位性を与える別の表現型選択特性から選択される。
一実施形態では、少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位は、除草剤抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型選択形質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子または導入遺伝子であり、ここで除草剤抵抗性／耐性は、グリホサートを含むＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルホシネートを含むグルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、イミダゾリンまたはスルホニルウレアを含むＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）を含むＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、フィトエンデサチュラーゼステップでのカロテノイド生合成阻害剤、４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、またはほかのカロテノイド生合成標的の阻害剤を含むカロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子ダイバーターに対する抵抗性／耐性、カルバメート、トリアジン、およびトリアジノンを含む光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ジカンバ（２，４−Ｄ、すなわち２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含む合成オーキシンに対する抵抗性／耐性からなる群より選択される。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は、植物毒抵抗性／耐性形質、好ましくは除草剤抵抗性／耐性形質であり、改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、植物毒化合物、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性を付与し、該化合物は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体、またはその子孫に加えられる外来性化合物である。
一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＡＬＳである。別の実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＰＰＯである。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＥＰＳＰＳ、ＡＬＳ、またはＰＰＯであり、ＥＰＳＰＳ、ＡＬＳ、またはＰＰＯは、少なくとも１つの対応するアミノ酸変換をもたらす少なくとも１つの核酸変換を含み、少なくとも１つの核酸変換は、少なくとも１つの塩基エディターにより作成される。
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に標的化修飾を導入することを含み、該第１の植物ゲノム標的部位はＡＬＳであり、標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＡ１２２をコードする配列に生じ、または配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＰ１９７をコードする配列に生じ、または配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＡ２０５をコードする配列に生じ、または配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＤ３７６をコードする配列に生じ、または配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＲ３７７をコードする配列に生じる。さらに別の実施形態では、標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＷ５７４をコードする配列に生じる。一実施形態では、標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＳ６５３をコードする配列に生じる。一実施形態では、標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＧ６５４をコードする配列に生じる。
本発明の方法の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位はＰＰＯであり、標的化修飾は配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＣ２１５をコードする配列に生じる。別の実施形態では、標的化修飾は配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＡ２２０をコードする配列に生じる。さらなる実施形態では、標的化修飾は配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＧ２２１をコードする配列に生じる。さらなる実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位はＰＰＯであり、標的化修飾は配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＮ４２５をコードする配列に、またはＹ４２６をコードする配列に、または配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＩ４７５をコードする配列に生じる。
本発明の方法の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位はＥＰＳＰＳであり、標的化修飾は、いずれも配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べて、Ｇ１０１およびＧ１４４をコードする配列に、Ｇ１０１およびＡ１９２をコードする配列に、またはＴ１０２およびＰ１０６をコードする配列に生じる。
第１のゲノム標的部位の標的化修飾のさらなる組み合わせまたは追加の修飾は、本発明の範囲内である。
本発明の方法の一実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、または植物体の特定または単離に便利な可視表現型である。少なくとも１つの表現型選択形質は、光沢表現型、ゴールデン表現型、成長優位性表現型、もしくは着色表現型、または任意のほかの目視で選抜可能な表現型であってもよい。
本発明の第２の態様では、少なくとも１つの改変植物細胞、または該少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法を提供し、該方法は、（ａ）改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、またはＤＮＡ修飾試薬を含む少なくとも１つの第１の部位特異的エフェクターを用いて、少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾を導入することであって、該少なくとも１つの標的化コドン欠失修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；（ｂ）該改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第２の標的化修飾を該第２の植物ゲノム標的部位に作成する少なくとも１つの第２の部位特異的エフェクターを用いて導入され、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および（ｃ）（ｉ）該少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾により該第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた該少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに（ｉｉ）該第２の植物ゲノム標的部位の該少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、（ｄ）任意選択により、該少なくとも１つの第１の標的化修飾および該少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得ることであって、任意選択により、該関心対象の遺伝子型は、該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、交配させること、を含む。
本発明のさらなる態様では、少なくとも１つの改変植物細胞、または該少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法を提供し、該方法は、（ａ）改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第１の部位特異的エフェクターを用いて、少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾を導入することであって、該少なくとも１つの標的化フレームシフトまたは欠失修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；（ｂ）該改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第２の標的化修飾を該第２の植物ゲノム標的部位に作成するヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、またはＤＮＡ修飾試薬を含む少なくとも１つの第２の部位特異的エフェクターを用いて導入され、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物体に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および（ｃ）（ｉ）該少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾により該第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた該少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに（ｉｉ）該第２の植物ゲノム標的部位の該少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、（ｄ）任意選択により、該少なくとも１つの第１の標的化修飾および該少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得ることであって、任意選択により、該関心対象の遺伝子型は、該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、交配させること、を含む。
上記態様の一実施形態では、好ましくはステップ（ｂ）が、少なくとも１つの第１のおよび／または第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型を導入することをさらに含む。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターは、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントを含む制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、あるいは前述のエフェクターのあらゆるバリアントまたは触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターは、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼであり、該ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列は、（ａ）ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９、ＶＱＲ−Ｃａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９、（ｂ）ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１を含む、Ｃｐｆ１、（ｃ）ＣａｓＸ、および（ｄ）ＣａｓＹ、ならびに前述のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意のバリアントおよび誘導体を含む群より選択され、任意選択により該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、それぞれの野生型配列と比べて変異を含み、したがって得られたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮＡニッカーゼに、または全ＤＮＡ切断能力を失ったＤＮＡ結合エフェクターに変換されている。
本発明の態様のさらなる実施形態では、少なくとも部位特異的エフェクター、または該少なくとも１つの部位特異的エフェクターを含む複合体の少なくとも１つの構成要素が、該少なくとも１つの塩基編集複合体を細胞内小器官に向けるために少なくとも１つの小器官局在化シグナルを含み、該少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、葉緑体輸送ペプチド、またはミトコンドリア輸送ペプチドから選択され得る。
上記態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、少なくとも１つの表現型選択形質をコードするゲノム標的部位であり、少なくとも１つの表現型選択形質は、抵抗性／耐性形質または成長優位性形質であり、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、もしくは植物、またはその子孫に、加えられる化合物またはトリガに対する抵抗性／耐性または成長優位性を付与する。
上記態様のさらなる実施形態では、関心対象の少なくとも１つの表現型選択形質は、少なくとも１つの内在性遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、あるいは関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、少なくとも１つの導入遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、少なくとも１つの内在性遺伝子または少なくとも１つの導入遺伝子は、関心対象の少なくとも１つの表現型形質に少なくとも１つの修飾がない細胞を阻害する、損傷する、または殺す植物毒、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは少なくとも１つの表現型形質は、細胞分裂、成長速度、胚発生のブースターからなる群より、または非改変細胞、組織、器官、もしくは植物と比べて改変細胞、組織、器官、もしくは植物に優位性を与える別の表現型選択特性から選択される。
上記態様のさらなる実施形態では、少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位は、除草剤抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型選択形質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子または導入遺伝子であり、ここで除草剤抵抗性／耐性は、グリホサートを含むＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルホシネートを含むグルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、イミダゾリンまたはスルホニルウレアを含むＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）を含むＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、フィトエンデサチュラーゼステップでのカロテノイド生合成阻害剤、４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、またはほかのカロテノイド生合成標的の阻害剤を含むカロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子ダイバーターに対する抵抗性／耐性、カルバメート、トリアジン、およびトリアジノンを含む光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ジカンバ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含む合成オーキシンに対する抵抗性／耐性からなる群より選択される。
上記態様の一実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は、植物毒抵抗性／耐性形質、好ましくは除草剤抵抗性／耐性形質であり、改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失またはフレームシフトもしくは欠失修飾により、植物毒化合物、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性が付与され、該化合物は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体、またはその子孫に加えられる外来性化合物である。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、選択の目的で、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、アマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＸ２Ｌ遺伝子産物のホモログである。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾、標的化コドン欠失、または標的化フレームシフトもしくは欠失修飾は、配列番号２８のアマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＸ２Ｌ遺伝子産物のＧ２１０残基に相当する位置に生じる。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、または植物体の特定または単離に便利な可視表現型である。本発明のさまざまな態様の少なくとも１つの表現型選択形質は、光沢表現型、ゴールデン表現型、成長優位性表現型、もしくは着色表現型、または任意のほかの目視で選抜可能な表現型であり得る。
本発明の全態様の方法の一実施形態では、改変すべき少なくとも１つの植物細胞は、好ましくは、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より選択される植物または前述の植物の１つに属するあらゆる変種もしくは亜種に由来する。
図１（図１Ａ〜１Ｃ）は、たとえば植物育種および標的化選択ストラテジー用の選択の間、関心対象の細胞を単離するために、本発明の方法をどのように実施するかを例示している。図１Ａでは、塩基エディター（ＢＥ）またはＢＥ複合体と、編集試薬すなわち部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を含む部位特異的エフェクターとを用いて、２つの異なるゲノム位置で平行して細胞を処理している。矢印は標的部位を示し、塩基エディター（複合体）と部位特異的エフェクターとが２つの標的化部位特異的修飾を導入することになる。図１Ｂは、図１Ａに例示した先行ステップの結果を示しており、すなわちＢＥ（複合体）が修飾された表現型を関心対象の遺伝子に導入し（白でハイライト）、部位特異的エフェクターが標的化編集を形質遺伝子に導入する（黒でハイライト）。したがって、２つの異なるゲノム標的部位でのこれら２つの別個の修飾は、植物細胞または植物を処理細胞から単離することを可能にする。次に、関心対象の遺伝子の編集について植物を選抜することができるが、それはふつう、選抜目的で使用される修飾表現型とは異なっている。そして図１Ｃは、所望の遺伝子型を得るために植物を分離した後の結果を示す。この関心対象の所望の遺伝子型は、部位特異的エフェクターにより導入された標的化修飾（黒）を含んでいるが、修飾された表現型修飾はもう含んでいない。後者は選択目的で導入されていたが、この例で得られた植物細胞、組織、器官、または植物体のゲノムに含まれるゲノム形質として導入されたわけではない。 ＴａＡＬＳ Ｓ１部位の同時編集により向上した選抜効率を例示する図である。 ＴａＡＬＳ−Ｐ１７３の編集による除草剤抵抗性コムギの作製を例示する図である。 ＺｍＡＬＳ−Ｐ１６５の編集による除草剤抵抗性トウモロコシの作製を例示する図である。 トウモロコシにおいて編集すべき配列構造および除草剤抵抗性部位を例示する図である。 ＺｍＡＬＳ−Ｐ１９７およびＺｍＡＬＳ−Ｇ６５４の高効率の編集を例示する図である。 ＺｍＡＬＳ−Ｐ１９７およびＺｍＡＬＳ−Ｇ６５４を望ましい除草剤抵抗性を付与する残基に変換する効率を例示する図である。
配列：
配列番号１は、ＡＰＯＢＥＣ１（ラットシチジンデアミナーゼ）−ＸＴＥＮリンカー（たとえば Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｍａｎｎｅｒ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００９） ２７， ｐ． １１８６−１１９０を参照）−ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤）−ＮＬＳをコードするコンストラクトのヌクレオチド配列であり、コドン最適化されなかった。この配列は、３’終止コドンＴＡＡを含む。
配列番号２は、ＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮリンカー−ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＵＧＩ−ＮＬＳをコードするコンストラクトのヌクレオチド配列であり、穀類植物で使用されるようにコドン最適化された。この配列は、３’終止コドンＴＡＧを含む。
配列番号３は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＡＬＳ１＆２＿Ｐ１９７Ｓ／Ｌ／Ｆの例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳｐＣａｓ９由来（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９由来）ベースのエディターに適用する。
配列番号４は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＡＬＳ１＆２＿Ｐ１９７Ｓ／Ｌ／Ｆの例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳａＫＫＨ−ＢＥ３由来のベースのエディター（ＰＡＭ特異性が緩い、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）由来変異体のＳａＣａｓ９）に適用する。
配列番号５は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＡＬＳ１＆２＿Ｐ１９７Ｓ／Ｌ／Ｆの例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＶＱＲ−ＢＥ３由来のベースのエディター（ＰＡＭ特異性が異なる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）由来変異体のＳａＣａｓ９）に適用する。
配列番号６は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＡＬＳ１＆２＿Ｓ６５３Ｎの例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳｐＣａｓ９由来のベースのエディターに適用する。
配列番号７は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ａ２２０＿＆＿Ｇ２２１の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳｐＣａｓ９由来のベースのエディターに適用する。
配列番号８は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ａ２２０＿＆＿Ｇ２２１の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳａＫＫＨ−ＢＥ３由来のベースのエディターに適用する。
配列番号９は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ａ２２０＿＆＿Ｇ２２１の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＶＱＲ−ＢＥ３由来のベースのエディターに適用する。
配列番号１０は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ｃ２１５の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳｐＣａｓ９由来のベースのエディターに適用する。
配列番号１１は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ｃ２１５の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳａＫＫＨ−ＢＥ３由来のベースのエディターに適用する。
配列番号１２は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ｃ２１５の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＳａＫＫＨ−ＢＥ３由来のベースのエディターに適用する。
配列番号１３は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ｃ２１５の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＶＱＲ−ＢＥ３由来のベースのエディターに適用する。
配列番号１４は、ＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮリンカー−ＣａｓＸ１−ＵＧＩ−ＮＬＳをコードするコンストラクトのヌクレオチド配列であり、コドン最適化された。この配列は３’終止コドンＴＡＧを含む。
配列番号１５は、ＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮリンカー−ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）（Ｒ１２２６Ａ変異を有するアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ． Ｃｐｆ１）−ＵＧＩ−ＮＬＳをコードするコンストラクトのヌクレオチド配列であり、コドン最適化された。この配列は３’終止コドンＴＡＧを含む。
配列番号１６は、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−リンカー−ＰｍＣＤＡ１（ウミヤツメウナギの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）オルソログＰｍＣＤＡ１、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６， ｖｏｌ． ３５３， ｉｓｓｕｅ ６３０５， ａａｆ８７２９）を参照）−ＵＧＩをコードするコンストラクトのヌクレオチド配列である。この配列は３’終止コドンＴＡＧを含む。
配列番号１７は、例示的Ｃａｓ９ニッカーゼｎ（ｉ）Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、例示的ＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、例示的ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、例示的ＡＰＯＢＥＣ１をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、例示的ＵＧＩをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、例示的ＰｍＣＤＡ１をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、Ｂ７３基準遺伝子型の塩基編集用Ｚｍ＿ＰＰＯ＿Ｎ４２５＿＆Ｙ４２６の例示的プロトスペーサー配列である。位置は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＰＯホモログの残基の座標に基づく。この配列は、ＶＱＲ−ＢＥ３由来のベースのエディターに適用する。
配列番号２４は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）の配列である。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ識別子：Ｕ２ＵＭＱ６．１。
配列番号２５は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）（葉緑体）の配列である。ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＷ７０３８６。
配列番号２６は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）の配列である。
配列番号２７は、葉緑体輸送ペプチド除去後の成熟タンパク質、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の配列である。ＮＣＢＩ受託ＡＡＹ２５４３８。
配列番号２８は、アマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のミトコンドリアプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＸ２Ｌ）の配列である。ＮＣＢＩ受託ＤＱ３８６１１４を参照。
定義：
本明細書では、文脈により別途明示されないかぎり、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が複数形も包含することに注意されたい。たとえば、１つの構成要素への言及は、複数の構成要素の組成物も含むものとする。「ａ（１つの）」構成成分を含む組成物への言及は、該構成成分に加えてほかの複数の構成成分を含むものとする。換言すると、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は数を限定する意味ではなく、言及するものが「少なくとも１つ」存在することを意味する。各用語は、当業者が理解する最も広い意味を想定しており、同じ目的を実現するために同様に機能するあらゆる技術的均等物を含むものとする。
本明細書では、範囲は、「約」もしくは「およそ」もしくは「実質的に」１つの特定の値から、および／または「約」もしくは「およそ」もしくは「実質的に」別の特定の値まで、と表現される場合がある。そのような範囲が表現されている場合、ほかの例示的実施形態も、この１つの特定の値から、および／またはこの別の特定の値までを含む。さらに、「約」という用語は、当業者により決定される特定値の許容可能な誤差範囲内を意味するが、これはその値がどのように測定され、または決定されるか、すなわち測定システムの限界に左右される部分もある。たとえば、「約」は当技術分野の慣行にしたがい許容される標準偏差内を意味する場合がある。かわりに、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大５〜±１０％、より好ましくは最大±５％、さらに好ましくは最大±１％の範囲を意味する場合がある。かわりに、特に生物学的系またはプロセスに関して、この用語はある値の１０倍以内、好ましくは２倍以内を意味する場合がある。本願および特許請求の範囲で特定の値が記載されている場合、特に断らないかぎり、「約」という用語が言外に含まれており、そしてこの文脈で、特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味する。
「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、組成物または物品または方法に、少なくとも言及された化合物、元素、粒子、または方法ステップが存在することを意味するが、たとえ該言及されたものと同じ機能を持つ場合でもほかの化合物、物質、粒子、方法ステップの存在を排除するものではない。
本明細書では、アミノ酸配列に関する「触媒活性フラグメント」という用語は、所与の鋳型アミノ酸配列またはそれをコードする核酸配列に由来する、該鋳型配列の活性部位を全部または一部含むコア配列を意味し、ただし得られた触媒活性フラグメントは、該鋳型配列を特徴付けるネイティブ酵素またはそのバリアントの活性部位に基づく活性をなおも有している。このような改変は、鋳型配列と同じ活性をもちながらサイズがより小さいアミノ酸配列を生産するのに好適であり、触媒活性フラグメントがより汎用的な、または立体的により扱いやすいより安定したツールとなる。
本明細書では、「相補（的）」または「相補性」とは、２つのＤＮＡ間の、２つのＲＮＡ間の、または本発明のハイブリッド配列に関していえばＲＮＡとＤＮＡ核酸領域間の関係のことである。ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸塩基により定められる２つの核酸領域は、鍵と鍵穴モデルにしたがい互いにハイブリダイズすることができる。これには、塩基アデニンとチミン／ウラシル、そしてグアニンとシトシンのそれぞれを相補塩基とするワトソン−クリックの塩基対形成理論が適用される。さらに、ワトソン−クリックの塩基対形成以外の、逆ワトソン−クリック、フーグスティーン、逆フーグスティーン、およびウォッブルの塩基対形成も、それぞれの塩基対が互いに水素結合を形成できるかぎり、すなわちこの相補性に基づき２つの異なる核酸鎖が互いにハイブリダイズすることができるかぎり、本明細書では「相補」という用語に包含される。
本明細書では、「コンストラクト」という用語、特に「遺伝子コンストラクト」または「組換えコンストラクト」または「発現コンストラクト」という用語は、本開示の標的細胞または植物、植物細胞、組織、器官、もしくは植物物質への導入または形質転換、形質移入または形質導入のためのコンストラクトを指し、とりわけプラスミドまたはプラスミドベクター、コスミド、人工酵母染色体（ＹＡＣ）または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ファージミド、細菌ファージベースのベクター、発現カセット、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列またはアミノ酸配列を含む単離された一本鎖または二本鎖核酸配列、改造ウイルスなどのウイルスベクター、およびそれらの組み合わせまたは混合物を包含する。本発明の組換えコンストラクトは、核酸またはアミノ酸配列の形態のエフェクタードメインを含む場合があり、ここでエフェクタードメインは、標的細胞内で作用することができる分子であり、導入遺伝子、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ分子、たとえばガイドＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、シングルもしくはデュプレックスＣＲＩＳＰＲｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、あるいはアミノ酸配列、たとえば、とりわけ酵素もしくはその触媒活性フラグメント、結合タンパク質、抗体、転写因子、ヌクレアーゼ、好ましくは部位特異性ヌクレアーゼ等を包含する。さらに、組換えコンストラクトは、制御配列および／または局在化配列を含む場合がある。組換えコンストラクトは、プラスミドベクターなどのベクターに組み込まれる場合があり、かつ／またはベクター構造から単離されて、たとえばポリペプチド配列の形態で、またはベクターと結合していない一本鎖もしくは二本鎖核酸として存在する場合もある。遺伝子コンストラクトは、たとえば形質転換による導入後、たとえば二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡの形態で、またはアミノ酸配列として、染色体外に留まること、すなわち標的細胞のゲノムに組み込まれないこともある。かわりに、本開示の遺伝子コンストラクトまたはその一部は、標的細胞のゲノム、たとえば標的細胞の核ゲノムまたはさらなる遺伝要素、たとえばミトコンドリアまたは葉緑体のようなプラスチドのゲノムに、安定して組み込まれる場合もある。これに関して使用される「プラスミドベクター」という用語は、もとはプラスミドから得られた遺伝子コンストラクトを指す。
本明細書では「送達コンストラクト」または「送達ベクター」という用語は、標的細胞、好ましくは真核細胞に、核酸、たとえばＲＮＡおよびＤＮＡを含むハイブリッド核酸、および／または関心対象のアミノ酸配列を輸送するためのカーゴとして用いられる、あらゆる生物学的または化学的手段を指す。したがって、本明細書では送達コンストラクトまたはベクターという用語は、本開示の遺伝子コンストラクトまたは組換えコンストラクトを標的細胞、組織、器官、または生物に送達するための輸送手段を指す。したがって、ベクターは、関心対象の標的細胞に、または植物の所望の細胞コンパートメントの植物標的構造に、直接的または間接的に送達される、任意選択により制御配列または局在化配列のような配列を含む核酸配列を含む場合がある。ベクターはまた、アミノ酸配列またはリボ核−分子複合体を標的細胞または標的構造に導入するのに用いられる場合もある。本明細書ではふつう、ベクターはプラスミドベクターの場合がある。さらに、本発明の特定の好ましい実施形態では、関心対象のコンストラクトまたは配列または複合体の直接導入を実施する。直接導入という用語は、本開示にしたがい修飾すべきＤＮＡ標的配列を含む所望の標的細胞または標的構造が、関心対象の特定の標的細胞へ直接的に形質転換または形質導入または形質移入され、送達ベクターにより送達された物質がそこで作用することを意味する。間接的導入という用語は、それ自体は形質転換の実際の関心対象の標的細胞または構造ではない構造体、たとえば葉の細胞または器官もしくは組織の細胞に導入することを意味するが、そうした構造体は、好ましくは本開示の遺伝子コンストラクトを含むベクターを、実際の標的構造、たとえば分裂組織の細胞もしくは組織、または幹細胞もしくは組織の全体に拡散し移入する拠点の役割を果たす。ベクターという用語をアミノ酸配列および／または核酸配列、たとえばハイブリッド核酸配列を標的細胞に形質移入する文脈で使用する場合、ベクターという用語は、たとえばイオン性脂質混合物、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）、または微粒子銃のような、ペプチドまたはタンパク質形質移入に好適な因子を意味する。核酸物質の導入という文脈では、ベクターという用語は、プラスミドベクターだけでなく、関心対象の標的細胞に、たとえば微粒子銃により核酸および／またはアミノ酸配列の送達を導入する拠点となる好適な担体物質を意味する場合もある。このような担体物質としては、とりわけ金またはタングステンの粒子が挙げられる。最後に、ベクターという用語はまた、本開示の少なくとも１つの遺伝子コンストラクトを導入するための、たとえば以下のウイルス株由来のたとえば改造ウイルスのような、ウイルスベクターの使用を意味する：アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、ワクシニアウイルス、センダイウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林アルファウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、トウモロコシ条斑ウイルス（ＭＳＶ）、オオムギ斑葉ウイルス（ＢＳＭＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ、受託番号：ＲＮＡ１：Ｘ５８４５６；ＲＮＡ２：Ｘ５８４５７；ＲＮＡ３：Ｘ５８４５８）、トウモロコシ条斑ウイルス（ＭＳｐＶ）、トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス（ＭＹＤＶ）、トウモロコシ黄萎ウイルス（ＭＹＤＶ）、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）、
ベニウイルス科（Ｂｅｎｙｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばビートえそ性葉脈黄化ウイルスのウイルス種（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３５１４；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３５１５；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３５１６；ＲＮＡ４：ＮＣ＿００３５１７）、またはブロモウイルス科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばアルファルファ・モザイクウイルス属（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００１４９５；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００２０２４；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００２０２５）またはブロモウイルス属（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ）のウイルス種、たとえばＢＭＶ（前掲）、またはククモウイルス属（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）のウイルス種、たとえばキュウリモザイクウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００２０３４；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００２０３５；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００１４４０）、またはオレアウイルス属（Ｏｌｅａｖｉｒｕｓ）のウイルス種の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、
カリモウイルス科（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、特にバドナウイルス科（Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）またはカリモウイルス科（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）、たとえば種々のバナナ条斑ウイルス（たとえば、受託番号：ＮＣ＿００７００２、ＮＣ＿０１５５０７、ＮＣ＿００６９５５またはＮＣ＿００３３８１）またはカリフラワーモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１４９７）、またはカベモウイルス属（Ｃａｖｅｍｏｖｉｒｕｓ）、ペチュウイルス属（Ｐｅｔｕｖｉｒｕｓ）、ロザドナウイルス属（Ｒｏｓａｄｎａｖｉｒｕｓ）、ソレンドウイルス属（Ｓｏｌｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、ソイモウイルス属（Ｓｏｙｍｏｖｉｒｕｓ）またはツングロウイルス属（Ｔｕｎｇｒｏｖｉｒｕｓ）のウイルス種の、ｄｓＤＮＡウイルス、
クロステロウイルス科（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばアンペロウイルス属（Ａｍｐｅｌｏｖｉｒｕｓ）、クリニウイルス属（Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ）、たとえばレタス伝染性黄色ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３６１７；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３６１８）またはトマトクロロシスウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００７３４０；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００７３４１）、クロステロウイルス属（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、たとえばビート萎黄ウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１５９８）、またはベラリウイルス属（Ｖｅｌａｒｉｖｉｒｕｓ）の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、
ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばベクルトウイルス科（Ｂｅｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）、ベゴモウイルス科（Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）のウイルス種、たとえばインゲンマメゴールデンイエローモザイクウイルス、タバコ巻茎（Ｔｏｂａｃｃｏ ｃｕｒｌｙ ｓｈｏｏｔ）ウイルス、タバコ斑巻葉（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｔｔｌｅ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ）ウイルス、トマト退緑斑紋（Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス、トマト葉萎縮ウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、トマト巻葉ウイルス、トマト斑紋ウイルスもしくはトマト黄点ウイルス、またはクルトウイルス属（Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ）のジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばビートカーリートップウイルス、またはトポクウイルス属（Ｔｏｐｏｃｕｖｉｒｕｓ）、ツルンクルトウイルス属（Ｔｕｒｎｃｕｒｔｖｉｒｕｓ）もしくはマストレウイルス属（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）のジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばトウモロコシ条斑ウイルス（前掲）、タバコ黄萎ウイルス、コムギ萎縮ウイルスの、一本鎖ＤＮＡ（＋／−）ウイルス、
ルテオウイルス科（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばルテオウイルス属（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）、たとえばオオムギ黄萎ウイルス−ＰＡＶ（受託番号：ＮＣ＿００４７５０）、またはポレロウイルス属（Ｐｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓ）、たとえばジャガイモ葉巻ウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１７４７）の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、
ナノウイルス属（Ｎａｎｏｖｉｒｕｓ）またはバブウイルス属（Ｂａｂｕｖｉｒｕｓ）を含むナノウイルス科（Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ）の一本鎖ＤＮＡウイルス、
とりわけアルファパルチチウイルス（Ａｌｐｈａｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）、ベータパルチチウイルス（Ｂｅｔａｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）デルタパルチチウイルス（Ｄｅｌｔａｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）などの科を含む、パルチウイルス科（Ｐａｒｔｉｖｉｒｉｄａｅ）の、二本鎖ＲＮＡウイルス、
ポスピウイロイド科（Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅ）のウイロイド、
たとえばブランビウイルス属（Ｂｒａｍｂｙｖｉｒｕｓ）、バイモウイルス属（Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ）、イポモウイルス属（ｌｐｏｍｏｖｉｒｕｓ）、マクルラウイルス属（Ｍａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓ）、ポエースウイルス属（Ｐｏａｃｅｖｉｒｕｓ）を含むポティウイルス科（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばトリチカムモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿０１２７９９）、またはポティウイルス属（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）のポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばビートモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００５３０４）、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００３３７７）、ジャガイモウイルスＹ（受託番号：ＮＣ＿００１６１６）、もしくはゼアモザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿０１８８３３）、またはトリチモウイルス属（Ｔｒｉｔｉｍｏｖｉｒｕｓ）のポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばブロム条斑モザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００３５０１）もしくはコムギ条斑モザイクウイルス（受託番号：ＮＣ＿００１８８６）の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、
シュードウイルス科（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばシュードウイルス属（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ）またはシレウイルス属（Ｓｉｒｅｖｉｒｕｓ）の一本鎖ＲＮＡウイルス、
レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえば、イネ萎縮ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３７７３；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３７７４；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３７７２；ＲＮＡ４：ＮＣ＿００３７６１；ＲＮＡＳ：ＮＣ＿００３７６２；ＲＮＡ６：ＮＣ＿００３７６３；ＲＮＡ７：ＮＣ＿００３７６０；ＲＮＡＢ：ＮＣ＿００３７６４；ＲＮＡ９：ＮＣ＿００３７６５；ＲＮＡ１０：ＮＣ＿００３７６６；ＲＮＡ１１：ＮＣ＿００３７６７；ＲＮＡ１２：ＮＣ＿００３７６８）の、二本鎖ＲＮＡウイルス、
たとえばアルファネクロウイルス属（Ａｌｐｈａｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ）、アウレウスウイルス属（Ａｕｒｅｕｓｖｉｒｕｓ）、ベータネクロウイルス属（Ｂｅｔａｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ）、カーモウイルス属（Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ）、ダイアンソウイルス属（Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ）、ガランチウイルス属（Ｇａｌｌａｎｔｉｖｉｒｕｓ）、マカナウイルス属（Ｍａｃａｎａｖｉｒｕｓ）、マクロモウイルス属（Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ）、パニコウイルス属（Ｐａｎｉｃｏｖｉｒｕｓ）、トムブスウイルス属（Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ）、アンブラウイルス属（Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ）、またはゼアウイルス属（Ｚｅａｖｉｒｕｓ）たとえばトウモロコシえそ性条斑ウイルス（受託番号：ＮＣ＿００７７２９）を含む、トムブスウイルス科（Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ）の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、または
ビルガウイルス科（Ｖｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばフロウイルス属（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）、ホルデイウイルス属（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）のウイルス種、たとえばオオムギ斑葉ウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３４６９；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３４８１；ＲＮＡ３：ＮＣ＿００３４７８）、またはペクルウイルス属（Ｐｅｃｌｕｖｉｒｕｓ）、ポモウイルス属（Ｐｏｍｏｖｉｒｕｓ）、トバモウイルス属（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）もしくはトブラウイルス属（Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）のウイルス種、たとえばタバコ茎えそウイルス（受託番号：ＲＮＡ１：ＮＣ＿００３８０５；ＲＮＡ２：ＮＣ＿００３８１１）の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびに
モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）、特にラプドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばオオムギ黄色条線モザイクウイルス（受託番号：ＫＭ２１３８６５）またはレタスえそ性黄色ウイルス（受託番号／標本：ＮＣ＿００７６４２／ＡＪ８６７５８４）の、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、
ピコルナウイルス目（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌｅｓ）、特にセコウイルス科（Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばコモウイルス属（Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ファバウイルス属（Ｆａｂａｖｉｒｕｓ）、ネポウイルス属（Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ）、ケラウイルス属（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、サドワウイルス属（Ｓａｄｗａｖｉｒｕｓ）、セクイウイルス属（Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ）、トラドウイルス属（Ｔｏｒｒａｄｏｖｉｒｕｓ）、またはワイカウイルス属（Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ）の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、
ティモウイルス目（Ｔｙｍｏｖｉｒａｌｅｓ）、特にアルファフレキシウイルス科（Ａｌｐｈａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばアレキシウイルス属（Ａｌｌｅｘｉｖｉｒｕｓ）、ロラウイルス属（Ｌｏｌａｖｉｒｕｓ）、マンダリウイルス属（Ｍａｎｄａｒｉｖｉｒｕｓ）、またはポテックスウイルス属（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）のウイルス種、ティモウイルス目（Ｔｙｍｏｖｉｒａｌｅｓ）、特にベータフレキシウイルス科（Ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばカピロウイルス属（Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）、カルラウイルス属（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）、シトリウイルス属（Ｃｉｔｒｉｖｉｒｕｓ）、フォベアウイルス属（Ｆｏｖｅａｖｉｒｕｓ）、テポウイルス属（Ｔｅｐｏｖｉｒｕｓ）、もしくはビチウイルス属（Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ）のウイルス種の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、
ティモウイルス目（Ｔｙｍｏｖｉｒａｌｅｓ）、特にティモウイルス科（Ｔｙｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、たとえばマクラウイルス目（Ｍａｃｕｌａｖｉｒｕｓ）、マラフィウイルス目（Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ）、もしくはティモウイルス目（Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ）のウイルス種の、プラス鎖ＲＮＡウイルス、および
細菌ベクター、たとえばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．のような、たとえばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等。最後に、ベクターという用語はまた、ポリマーまたは脂質を用いる送達コンストラクトなどの物理的導入方法と組み合わされて、標的細胞に線状核酸配列（一本鎖または二本鎖）またはアミノ配列またはそれらの組み合わせを導入するための、好適な化学的輸送因子を意味する。
したがって、好適な送達コンストラクトまたはベクターは、ウイルスベクター、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．などのヌクレオチド配列を標的細胞内に送達する生物学的手段、あるいはたとえばメソ孔シリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）などのナノ粒子、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）ポリマー系アプローチもしくはＤＥＡＥ−デキストランのようなポリマーなどのカチオン性ポリマー、または非共有結合表面へのＰＥＩ付加によるカチオン性表面形成、脂質もしくは高分子ベシクルなどの化学的送達コンストラクト、またはそれらの組み合わせを含む。脂質または高分子ベシクルは、たとえば脂質、リポソーム、脂質封入系、ナノ粒子、小核酸脂質粒子配合物、ポリマー、およびポリマーソームから選択することができる。
本明細書では、原核または真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは本開示の植物または植物細胞または植物物質の文脈で使用される「誘導体」または「後代」または「子孫」という用語は、そのような細胞または物質の有性生殖および無性生殖を含む自然の繁殖から生じる後代に関する。当業者には周知であるが、そのような繁殖により自然現象から生じる生物のゲノムに変異が導入される場合があり、その結果親生物または親細胞とゲノムが異なる後代または子孫が生じるが、それでもこれら後代または子孫は親組換え宿主細胞と同じ属／種に属し、同じ特徴の大半を有している。したがって、生殖または再生の際に自然現象から生じるような誘導体または後代または子孫は、本開示のこの用語に包含される。さらに、「誘導体」という用語は、細胞または生物を指すのではない物質または分子の文脈では、直接的にまたは改変により間接的に別のものから得られることを意味する場合がある。これは、細胞または物質から得られた細胞または植物代謝物に由来する核酸配列を意味する場合がある。したがって、これらの用語は、どの誘導体、後代、または子孫でも指すわけではなく、親細胞または親ウイルスまたは親分子と系統的に関連のある、すなわちそれらに基づいた誘導体または後代または前駆体を指すものであるが、この誘導体、後代、または子孫とその「親」との関係は、当業者であれば明白に推断できる。
さらに、本明細書では、生物学的配列（核酸またはアミノ酸）または分子または複合体の文脈で使用される「由来（の）」「〜に由来する」、または「誘導体」という用語は、それぞれの配列がたとえば配列表の、またはデータベース受託番号の、またはその足場構造の基準配列に基づくこと、すなわち該配列に起源をもつことを意味するが、該基準配列はさらに配列を含んでいる場合があり、たとえばウイルスの全ゲノムまたは全ポリタンパク質コード配列を含んでいる場合があるが、ネイティブ配列「に由来する」配列は、その単離されたフラグメント１つだけ、またはそのコヒーレントなフラグメント１つだけを含む場合がある。この文脈では、ｃＤＮＡ分子またはＲＮＡは、分子鋳型となるＤＮＡ配列「に由来する」といえる。したがって当業者は、基準配列「に由来する」配列を容易に画定することができ、ＤＮＡまたはアミノ酸のレベルについて配列アラインメントを行うと、該由来配列はそれぞれの基準配列と高い同一性を有し、それぞれの基準配列と共通のＤＮＡ／アミノ酸コヒーレント区分を有している（配列アラインメントで、由来配列をクエリとし、基準配列を相手配列としてアラインメントした所与の長さの分子について、クエリ同一性が７５％よりも高い）。こうして当業者は、本明細書に記載の開示に基づき、それぞれの配列をポリメラーゼ連鎖反応等により関心対象の好適なベクター系にクローン化するか、または配列をベクター足場として用いることができる。したがって、「〜に由来する」という用語は、任意の配列ではなく、それが由来する基準配列に対応する配列であるが、何らかの違い、たとえば宿主細胞内で組換えコンストラクトの複製中に自然に生じる何らかの変異は排除できないため、「〜に由来する」という用語に包含される。さらに、親配列のいくつかの配列区分が、親由来の配列中で連結することがある。こうした異なる区分は、親配列に対して高い、時には１００％の相同性を有することになる。当業者であれば周知であるが、本発明の人工分子複合体の配列が核酸配列として提供されると、または部分的にでも提供されると、生体内で転写され、場合によっては翻訳され、そして宿主細胞内でおそらくさらに消化され、かつ／または加工される（シグナルペプチドの切断、内因的ビオチン化その他）ので、「〜に由来する」という用語は、本発明の開示で最初に用いられた配列との関連を示すものである。
本明細書では、「融合物」は、タンパク質および／または１つまたは複数の非ネイティブ配列（たとえば諸部分）を含む核酸を指す場合がある。融合物は、修飾タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端または両末端に、あるいは別ドメインとして分子内に存在することができる。核酸分子では、融合物分子は５’末端または３’末端、あるいはその間の任意の好適な位置に結合することができる。融合物は、転写および／または翻訳融合物の場合がある。融合物は、同じ非ネイティブ配列を１つまたは複数含む場合がある。融合物は、異なる非ネイティブ配列を１つまたは複数含む場合がある。融合物は、キメラの場合がある。融合物は、核酸親和性タグを含む場合がある。融合物は、バーコードを含む場合がある。融合物は、ペプチド親和性タグを含む場合がある。融合物は、部位特異的エフェクターまたは塩基エディターの細胞内局在化を提供することができる（たとえば、核標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体標的化のための葉緑体局在化シグナル、１５小胞体（ＥＲ）保留シグナル等）。融合物は、追跡または精製に利用することができる非ネイティブ配列（たとえば、親和性タグ）を提供することができる。融合物は、ビオチンまたはａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素、シアニン３色素、シアニン５色素といった色素などの小分子であり得る。融合物は、より高いまたはより低い安定性を提供することができる。いくつかの実施形態では、融合物は、検出可能なシグナルを提供することができる部分などの検出可能標識を含む場合がある。検出可能なシグナルを提供することができる好適な検出可能標識および／または部分としては、限定ではないが、酵素、放射性同位体、特異的結合ペアのメンバー；フルオロフォア；蛍光レポーターまたは蛍光タンパク質；量子ドット等を挙げることができる。融合物は、ＦＲＥＴペア、またはフルオロフォア／量子ドットドナー／アクセプターペアのメンバーを含むことができる。融合物は、酵素を含む場合がある。好適な酵素としては、限定ではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ２５ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。融合物は、蛍光タンパク質を含む場合がある。好適な蛍光タンパク質としては、限定ではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（たとえば、アエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰ、アンギラ・ジャポニカ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の由来蛍光タンパク質、またはそれらの変異体もしくは誘導体）、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、黄緑色蛍光タンパク質（たとえば、頭索動物ブランキオストマ・ランケロラクタム（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）のテトラマー蛍光タンパク質由来のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、さまざまな蛍光および着色タンパク質を挙げることができる。融合物はナノ粒子を含む場合がある。好適なナノ粒子としては、蛍光もしくは発光ナノ粒子および磁気ナノ粒子、または任意選択によりナノ粒子に結合させたナノダイアモンドを挙げることができる。ナノ粒子の任意の光または磁気特性または特徴を検出することができる。融合物としては、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋｌ）、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ（たとえば５’エキソヌクレアーゼおよび／または３’エキソヌクレアーゼ）、リガーゼ、ニッカーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（たとえばＣａｓ３）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（たとえばＤａｍ）、またはＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ（たとえば限定ではなく、ヒストンアセチラーゼなど）、デアセチラーゼ（たとえば限定ではなく、ヒストンデアセチラーゼなど）、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（補助）アクチベーター、転写（補助）因子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構成タンパク質、長鎖非コードＲＮＡ、ＤＮＡ修復タンパク質（たとえば、一本鎖および／もしくは二本鎖切断の修復に関わるタンパク質、たとえば塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、ＮＨＥＪ、ＨＲ、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、および／または代替非相同末端結合（ＡＮＨＥＪ）に関わるタンパク質、たとえば限定ではなく、ＨＲレギュレーターおよびＨＲ複合体アセンブリシグナル）、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質（たとえばｍＣｈｅｒｒｙまたは重金属結合タンパク質）、シグナルペプチド（たとえばＴａｔ−シグナル配列）、標的化タンパク質もしくはペプチド、細胞内局在化配列（たとえば、核局在化配列、葉緑体局在化配列）、および／または抗体エピトープ、あるいはそれらの組み合わせを挙げることができる。
「遺伝子改変（された）」または「遺伝子操作」または「遺伝子（的に）操作された」という用語は、本明細書では広義に使われ、直接的であれ間接的であれ人的に介入することで実現する核酸配列またはアミノ酸配列、標的細胞、組織、器官、または生物の任意の修飾によって、標的細胞、組織、器官、または生物の内在性遺伝物質またはトランスクリプトームまたはプロテイノーム（ｐｒｏｔｅｉｎｏｍｅ）に影響を与えて、人的介入なしでの状態とは異なるよう合目的的に改変することを意味する。人的介入は、試験管内でも生体／植物内でも、または両方でも、実施することができる。さらなる修飾としては、たとえば、たとえば標的化タンパク質工学またはコドン最適化のための１つまたは複数の点変異、欠失、および少なくとも１つの核酸またはアミノ酸分子の１つまたは複数の挿入または欠失（相同組換えも含む）、核酸またはアミノ酸配列の修飾、あるいはそれらの組み合わせを挙げることができる。これらの用語はまた、自然界で生じる同等の配列、生物、または物質と似ているが少なくとも１つの合目的的操作ステップにより構築されている、核酸分子またはアミノ酸分子または宿主細胞または生物、たとえば植物またはその植物物質を含む。したがって本明細書では「標的化遺伝子操作」または「標的化（塩基）修飾」は、標的化してもたらされる、すなわち操作されるべき少なくとも１つの細胞、好ましくは植物細胞において所望の効果を実現するために標的細胞内の特定の位置に特定の好適な状況下でもたらされる「遺伝子操作」の結果であり、この用語は、標的化すべき配列およびそれに対応する修飾は先行配列の検討事項に基づくので、得られる修飾を、たとえば細胞のゲノムの標的部位について得られる配列情報に基づいて、かつ／または関心対象の分子ツールの標的特異性（核酸またはアミノ酸配列の認識または結合特性、相補塩基対形成等）の情報に基づいて、事前に計画できることを意味する。
「ゲノム」という用語は、生物の各細胞、またはウイルスもしくは小器官に存在する全遺伝物質（遺伝子および非コード配列）、および／または片方の親から（一倍体）ユニットとして遺伝する染色体の完全な組を指す。本明細書で用いる「微粒子銃」という用語は、「微粒子銃形質移入」または「マイクロ粒子媒介遺伝子移入」とも呼ばれ、関心対象の核酸または遺伝子コンストラクトを含むコーティングされたマイクロ粒子またはナノ粒子を標的細胞または組織内に移入する物理的送達方法を指す。マイクロ粒子またはナノ粒子は発射物として機能し、しばしば遺伝子銃と呼ばれる好適なデバイスにより、関心対象の標的構造へ高圧で発射される。微粒子銃による形質転換では、関心対象の遺伝子で被覆された金属のマイクロ発射物を用い、この発射物を「遺伝子銃」（Ｓａｎｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． １９８７）として知られる装置によって、標的組織の細胞壁を貫通するには十分であるが細胞死させるほどではない高速（約１５００ｋｍ／ｈ）で、標的細胞へ発射する。細胞壁が完全に除去されたプロトプラストでは、条件は論理的に異なる。少なくとも１つのマイクロ発射物表面に付着した核酸または遺伝子コンストラクトは、撃込み後に細胞内に放出され、ゲノムに組み込まれる。マイクロ発射物の加速は、高圧放電または圧縮ガス（ヘリウム）により実現される。使用する金属粒子については、毒性も反応性もなく、かつ標的細胞よりも粒径が小さいものでなくてはならない。もっとも一般的に用いられるのは金またはタングステンである。遺伝子銃および関連システムの一般的な使用法については、メーカーや業者が多くの情報を一般公開している。
本明細書では「ゲノム編集」と「ゲノム工学」という用語は交換可能に使用され、生命体の任意の遺伝情報またはゲノムの標的化された特異的修飾のためのストラテジーおよび技法を指す。したがって、これらの用語は、遺伝子編集だけでなく、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も包含する。さらに、（存在する場合は）核ならびに細胞のほかの遺伝情報の編集または工学も包含する。さらに、「ゲノム編集」および「ゲノム工学」という用語は、エピジェネティックな編集または工学、すなわち遺伝子発現における遺伝性の変化をもたらし得る非コードＲＮＡの標的化修飾、たとえばメチル化、ヒストン修飾も包含する。
本明細書では「生殖質」は、遺伝資源、またはより精密には生物のＤＮＡ、およびその物質の集合を説明する用語である。育種テクノロジーでは、生殖質という用語は、新しい植物または植物品種を作るもとになり得る遺伝物質の集まりを指すのに用いられる。
本明細書では「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、または「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という用語は交換可能に使用され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との合成融合物を指し、あるいはこの用語はｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡのみからなる一本鎖ＲＮＡ分子を指し、あるいはこの用語はｃｒＲＮＡ部分またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分を個別に含むｇＲＮＡを指す。したがって、ｃｒＲＮＡ部分およびｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、１つの共有結合したＲＮＡ分子上に必ずしも存在しなくてもよく、また２つの単体ＲＮＡ分子に含まれていてもよく、それらが非共有結合的または共有結合的な相互作用により結合するかまたは結合されて、本開示のｇＲＮＡを提供することができる。本明細書では「ｇＤＮＡ」または「ｓｇＤＮＡ」または「ガイドＤＮＡ」という用語は交換可能に使用され、アルゴノートヌクレアーゼと相互作用する核酸分子を指す。本明細書で開示するｇＲＮＡもｇＤＮＡも、部位特異的ヌクレアーゼと相互作用し、そして該部位特異的ヌクレアーゼをゲノム標的部位に向けるのを支援する能力により「ガイドする核酸」または「ガイド核酸」と呼ばれる。
本明細書では、「変異」と「修飾（改変）」という用語は交換可能に使用されて、生体内または試験管内の核酸操作の文脈で、欠失、挿入、付加、置換、編集、鎖切断、および／またはアダクトの導入を指す。欠失は、１つまたは複数のヌクレオチドが欠けた核酸配列の変化と定義される。挿入または付加は、１つまたは複数のヌクレオチドの追加をもたらした核酸配列の変化である。「置換」または編集は、ある分子で１つまたは複数のヌクレオチドを置き換えることで生じ、この分子は、置き換えられた１つまたは複数のヌクレオチドとは異なる分子である。たとえば、チミンをシトシン、アデニン、グアニン、またはウリジンで置換する例示のように、ある核酸を別の核酸で置き換えてもよい。ピリミジンからピリミジン（たとえば、ＣからＴまたはＴからＣのヌクレオチド置換）またはプリンからプリン（たとえば、ＧからＡまたはＡからＧのヌクレオチド置換）は転位と呼ばれるが、ピリミジンからプリンまたはプリンからピリミジン（たとえば、ＧからＴ、またはＧからＣ、またはＡからＴ、またはＡからＣ）は転換と呼ばれる。かわりに、チミンをチミングリコールで置換する例示のように、核酸を修飾核酸で置換する場合もある。変異の結果、ミスマッチが生じ得る。ミスマッチという用語は、２つの核酸間の非共有結合的相互作用を指し、各核酸は、塩基対形成ルールに従わない異なるヌクレオチド配列または核酸分子に存在する。たとえば、部分相補配列５’−ＡＧＴ−３’と５’−ＡＡＴ−３’には、Ｇ−Ａミスマッチ（転位）が存在する。
配列または分子に関する「ヌクレオチド」と「核酸」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、天然または合成の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。したがって、ヌクレオチド配列という用語は、長さに関係なくあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ配列に用いられるので、この用語は少なくとも１つのヌクレオチドを含むあらゆるヌクレオチド配列を包含するが、あらゆる種類のもっと大きいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも包含する。したがって、この用語は、天然および／または合成デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列を指し、任意選択により合成核酸アナログ（ａｎａｌｏｇａ）を含むことができる。本開示の核酸は、任意選択によりコドン最適化されていてもよい。「コドン最適化」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのコドンの使用を、関心対象の細胞または生物のものに合わせて、関心対象の細胞または生物における該組換え核酸の転写率を高めることを意味する。当業者には周知のように、コドン縮重により標的核酸の１つの位置を修飾することができるが、この修飾は翻訳後もその位置に同じアミノ酸配列を生じさせることになり、このことは、標的細胞または生物の種特異的コドンの使用を考慮したコドン最適化により実現される。本願の核酸配列は、以下に挙げる非限定的な生物について、特定のコドン最適化を担持することができる：ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、セタリア・イタリク（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザａ／ｔａ（Ｏｒｙｚａ ａ／ｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、ホルデウム・バルボサム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｏｓｕｍ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、Ｍａ／ｕｓドメスチカ（Ｍａ／ｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・／イコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ／ｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・フレクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｆｌｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カペセラ・ブルサーパストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルスタ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔａ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、エルカ・ウェシカリア・サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｓｐ．、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラタス・ノルウェギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）またはホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）。
したがって本明細書では、「ヌクレオチド」は、広く塩基−糖−リン酸の組み合わせを指すことができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを包含することができる。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを包含することができる。ヌクレオチドは、モノマー単位の核酸配列の場合がある（たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、たとえばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体を包含することができる。そのような誘導体としては、たとえば限定ではなく、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、ならびにそれが含まれる核酸分子にヌクレアーゼ抵抗性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書ではヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指す場合がある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、限定ではないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドは無標識であってもよいし、周知の技法により標識してもよい。標識化は量子ドットを用いて実施することもできる。検出可能な標識としては、たとえば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、バイオ発光標識、および酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識としては、限定ではないが、フルオセイン、５−カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）、２′７′−５ジメトキシ−４′５−ジクロロ−６−カルボキシフルオセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４′ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、および５−（２′−アミノエチル）アミノナフタレン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を挙げることができる。
本明細書では、「非ネイティブ」または「自然に生じない」または「人工」は、ネイティブ核酸またはタンパク質には見当たらない核酸もしくはポリペプチド配列、またはビオチンもしくはフルオセインのような任意のほかの生体分子を指す場合がある。非ネイティブは、親和性タグを指す場合がある。非ネイティブは、融合物を指す場合がある。非ネイティブは、変異、挿入および／または欠失を含む、自然に生じる核酸またはポリペプチド配列を指す場合がある。非ネイティブ配列は、それが融合している核酸および／またはポリペプチド配列も示すことのできる活性（たとえば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性、その他）を示しかつ／またはコードすることができる。非ネイティブ核酸またはポリペプチド配列を、自然に生じる核酸またはポリペプチド配列（またはそのバリアント）に遺伝子工学により結合させて、キメラ核酸、および／またはキメラ核酸をコードするポリペプチド配列、および／またはポリペプチドを作製することができる。「非ネイティブ配列」は、３’ハイブリダイズ伸長配列を指す場合がある。
本明細書では、植物の細胞、組織、器官、または植物の文脈で用いられる「植物毒」または「植物毒性」という用語は、一般に植物または任意の植物細胞に対する細胞毒作用または細胞毒性を指す。したがってこの用語は、植物の細胞、組織、器官、または植物体を阻害し、破壊し、ときには殺す、化合物またはトリガの対植物毒性作用を意味する。そのようなダメージの原因は、除草剤、駆除剤、微量金属、病原菌が誘導する毒性エフェクター、塩性植物毒、またはアレロケミカルといった多様な化合物であり得る。さらに、この用語はまた、植物フィトホルモン、たとえば、限定ではないが、植物の免疫応答を調節するエチレン、ジャスモン酸、およびサリチル酸のようなホルモン、または植物の発生および成長を調節するオーキシン、アブシジン酸（ＡＢＡ）、サイトカイニン、ジベレリン、およびブラシノステロイドなどの植物ホルモンを指す。
本明細書では、「植物」という用語は、植物体、植物器官、分化および未分化植物組織、植物細胞、種子、ならびにそれらの誘導体および子孫を指す。「植物細胞」としては、限定ではなく、たとえば、種子、成熟および未成熟胚、分裂組織、苗、異なる分化状態のカルス組織、葉、花、根、茎、配偶体、胞子体、花粉および小胞子、プロトプラスト、大型藻類および微細藻類などの細胞が挙げられる。種々の植物細胞は、一倍体、二倍体、またはマルチプロイドであり得る。「植物器官」という用語は、植物の形態的および機能的に明確な部分を構成する植物組織または植物組織群を指す。
本明細書では「植物物質」は、任意の発生ステージの植物から得ることができる任意の物質を指す。植物物質は、植物内でも、植物またはその植物組織または植物器官の試験管内培養でも得ることができる。したがってこの用語は、植物の細胞、組織、および器官、ならびに発生した植物構造、ならびに核酸のような細胞内構成要素、ポリペプチド、そして植物細胞もしくはコンパートメント内に存在し得る、および／または植物が産生し得る、またはあらゆる発生ステージのあらゆる植物細胞、組織、もしくは植物の抽出物から得ることができるあらゆる植物化学物質または代謝物を包含する。この用語はまた、植物物質に含まれる少なくとも１つの植物細胞に由来する植物物質誘導体、たとえばプロトプラストを包含する。したがってこの用語は、植物の分裂細胞または分裂組織も包含する。
「プラスミド」は、二本鎖核酸配列の形態の環状自己複製型染色体外エレメントを指す。遺伝子工学分野では、こうしたプラスミドは、抗菌剤または除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子、標的核酸配列や局在化配列、制御配列、タグ配列をコードする遺伝子、マーカー遺伝子、たとえば抗菌マーカーもしくは蛍光マーカー等を挿入することにより、日常的に標的化修飾に供されている。複製起点のようなプラスミド本来の構造構成要素は維持される。本発明の特定の実施形態では、局在化配列は、核局在化配列、プラスチド局在化配列、好ましくはミトコンドリア局在化配列または葉緑体局在化配列を含み得る。該局在化配列は、植物バイオテクノロジー分野の当業者であれば入手可能である。関心対象の種々の標的細胞に用いられるさまざまなプラスミドベクターが市販されており、その改造は各分野の当業者には公知である。
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、特定のＤＮＡセグメントを合成するための技法である。ＰＣＲは、一連の反復的な変性、アニーリング、および伸長サイクルで構成される。一般に、二本鎖ＤＮＡを熱変性させ、標的セグメントの３′境界に対し相補である２つのプライマーを低温でＤＮＡにアニールさせてから、中温で伸長させる。この３つの連続するステップの１セットを「サイクル」と呼ぶ。
「子孫」は、植物、植物細胞、または植物組織の任意の次の世代を包含する。
本明細書では「制御配列」という用語は、関心対象の核酸配列の転写および／または翻訳および／または修飾を指令することができる核酸またはアミノ酸配列を指す。
本明細書では「タンパク質」、「アミノ酸」、または「ポリペプチド」という用語は交換可能に使用され、触媒酵素機能または構造的または機能的効果を有するアミノ酸配列を指す。「アミノ酸」または「アミノ酸配列」または「アミノ酸分子」という用語は、あらゆる天然のまたは化学合成されたタンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび酵素、または修飾タンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび酵素を包含し、ここで「修飾（された）」という用語は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび酵素のあらゆる化学的または酵素的修飾を包含し、野生型配列をもっと短いが活性は保持している部分に切断することも包含する。
本発明では、従来の分子生物学、微生物学、および当技術分野の組換えＤＮＡ技法を使用する場合がある。そのような技法は、文献に詳しく説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８９） Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９」）； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＪ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４）； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （ＲＩ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）などを参照されたい。
本明細書では、「選択（可能な）表現型」または「表現型選択（可能）」または「表現型選抜（可能）」は、成長、代謝、植物毒（たとえば除草剤）またはほかの化合物に対する感応性、または栄養分の消費についての細胞または生物の性能または外観的特徴の改変を表す。「選択（可能な）表現型」はまた、肉眼でまたは特殊装置を用いて観察した場合の可視または不可視の外観を包含する。したがって、表現型選択形質は、少なくとも１つのゲノム領域によりコードされ、顕微鏡で目視して、または分子生物学もしくは分析生物学の任意の手段により選抜することができる表現型を生じる。
本開示が核酸またはアミノ酸配列の相同性または同一性の百分比に関する場合はいつでも、そのような値は、核酸はＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ヌクレオチド）プログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）、またはアミノ酸配列はＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（タンパク質）プログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／）により得られたものとする。欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）がローカル配列アラインメント用に提供しているこれらのツールは、修正Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／および Ｓｍｉｔｈ， Ｔ．Ｆ． ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ｍ．Ｓ． “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８１ １４７ （１）：１９５−１９７を参照）を用いる。アラインメントを実施する場合、ＥＭＢＬ−ＥＢＩが定めるデフォルトのパラメータを用いる。そのようなパラメータは、（ｉ）アミノ酸配列：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、または（ｉｉ）核酸配列：マトリックス＝ＤＮＡｆｕｌｌ、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。
「鎖切断」という用語は、二本鎖核酸配列、たとえばＤＮＡ標的配列としてのゲノム配列に関して使用する場合、一本鎖切断および／または二本鎖切断を包含する。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の２本の鎖のうち１本の切断に関する。これに対し二本鎖切断とは、二本鎖核酸配列の両方の鎖の切断を指す。本開示の鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼまたはそのバリアントなどの好適なエンドヌクレアーゼを用いて関心対象の核酸塩基位置を酵素切断することにより、二本鎖核酸配列に導入することができ、ここで該バリアントは、野生型タンパク質の酵素機能をなおも発揮できる、野生型タンパク質またはエンドヌクレアーゼの変異または短小バージョンであってもよい。
本明細書では「標的領域」、「標的部位」、「標的構造」、「標的コンストラクト」、「標的核酸」、または「標的細胞／組織／生物」、または「ＤＮＡ標的領域」という用語は、標的細胞の任意のコンパートメント内の任意のゲノム領域またはエピゲノム領域であり得る標的を指す。
本明細書では、「標的化（された）」または「部位特異的」または「部位指定」という用語は、修飾すべき関心対象のゲノム領域の配列情報を用いる分子生物学の作用を指し、この作用はさらに、分子ツール、たとえばヌクレアーゼ、たとえばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびそのバリアント、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、またはリコンビナーゼ、ＤＮＡ修飾酵素、たとえばシチジンデアミナーゼ酵素やヒストン修飾酵素などのような塩基修飾酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ等の作用機構の情報に依存し、それによって関心対象のゲノム標的領域でもたらすべき少なくとも１つの修飾のコンピューター予測が可能になる。したがって、関連の分子ツールを試験管内またはコンピューターで設計し構築することができる。
本明細書では、「導入遺伝子」または「トランスジェニック」という用語は、ある生物のゲノムから採取された、または合成により生産された少なくとも１つの核酸配列を指し、それが関心対象の宿主細胞または生物または組織に導入され、続いて「安定」形質転換または形質移入アプローチにより宿主のゲノムに組み込まれる。これに対し「一過性」形質転換または形質移入または導入という用語は、好適な化学物質または生物学的剤を任意選択により含む少なくとも１つの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、またはそれらの混合）および／または少なくとも１つのアミノ酸配列を含む分子ツールを導入して、関心対象の少なくとも１つの細胞コンパートメント、たとえば限定ではないが細胞質、小器官、たとえば核、ミトコンドリア、液胞、葉緑体、または膜内への移入を実現する方法に関し、導入された該少なくとも１つの分子の転写および／または翻訳および／または会合および／または活性が、安定組込みまたは組入れを実現することなく、したがって細胞のゲノムに導入されたそれぞれの該少なくとも１つの分子が遺伝することなく、得られる。
したがって、本明細書では「一過性導入」という用語は、好ましくは送達ベクターまたは組換えコンストラクトに組み入れられた、本開示の少なくとも１つの核酸配列を、送達ベクターに補助されてまたは補助なしで、標的構造たとえば植物細胞に一過的に導入することに関し、該少なくとも１つの核酸配列は、標的構造に内在する核酸物質つまり全ゲノムには組み込まれないような好適な反応条件で導入されるので、標的細胞の内在ＤＮＡには組み込まれない。したがって、一過性導入の場合、導入された遺伝子コンストラクトは、標的構造、たとえば原核細胞、動物細胞、または植物細胞の子孫には遺伝しない。該少なくとも１つの核酸配列またはその転写もしくは翻訳から生じる産物は、構造性または誘導性の形態で一時的に、すなわち一過的にしか存在しないので、標的細胞中で限られた時間だけ活性をもち効果を発揮することができる。したがって、一過性導入により導入された少なくとも１つの核酸配列は、細胞の子孫には遺伝しない。しかし、一過的に導入された核酸配列の効果は、標的細胞の子孫に遺伝する可能性がある。
本明細書で開示する任意の部位特異的エフェクターまたは塩基エディターの「バリアント」とは、自然に生じる野生型酵素の活性を変えるためにそれぞれの野生型酵素と比べて少なくとも１つの変異、欠失、または挿入を含む分子のことである。「バリアント」は、非現定例として、触媒活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）または部位特異的ヌクレアーゼの場合があり、これはニッカーゼとして機能するように改変されている。
発明の詳細な説明
本発明は、植物の細胞、組織、器官、または物質における標的化編集の方法を提供し、これらの方法は用途に合わせて組み合わされ、平行導入ストラテジーを用いる。したがって、本明細書で提供する方法は、表現型選択形質を第１のゲノム標的部位に平行導入することに依拠し、この表現型選択形質そのものが容易な選抜を可能にするので、トランスジェニックマーカー配列またはマーカーカセットの導入を含まない。また、標的化修飾を第１のゲノム標的部位に導入して選択表現型を得ることは、外来性ポリヌクレオチド鋳型の提供にも標的部位の二本鎖（ｄｓ）切断の導入にも頼らないが、これらのステップはふつう、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を用いてゲノム標的部位の二本鎖切断を導入するさまざまなゲノム編集アプローチで必要とされ、切断はたいてい相同修復（ＨＲ）の修復鋳型を外来性核酸物質として与えられて回復する。
したがって植物育種ストラテジーに特化した諸方法が提供されているが、農学的関心対象の諸形質を関心対象の植物内で組み合わせなくてはならず、それにはふつう、繰り返しの多い時間のかかる選択ステップを要する。さらに、本明細書で提供する具体的な方法ステップは、異なるゲノム標的部位におけるトランスジェニックマーカーを用いない選択と標的化編集とを平行化し、その結果として選択可能なまたはほかの表現型が植物または植物細胞に付与される。このことはさらに、そのような改変植物物質を選択マーカーカセットを用いず単離することを可能にするが、この表現型の選択は、ふつうはそれ自体が表現型選抜可能ではない関心対象の第２の標的化修飾の選抜コストを大幅に削減する。このように２つの標的化修飾の同時導入が相乗的に相互作用して、一方の修飾はトランスジェニックマーカーを用いない選択を保証し、第２の修飾により関心対象のゲノム標的部位に高部位特異的で予測可能な編集を導入できるので、本発明の方法は、関心対象の遺伝子型を特定する選択労力が大幅に軽減された精密育種ストラテジーを可能にし、ひいては関心対象の植物細胞または生殖質における関連の修飾の特定に必要な時間とコストの削減にも役立つ。
第１の態様では、少なくとも１つの改変植物細胞、または該少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法を提供し、該方法は、（ａ）改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾を導入することであって、該少なくとも１つの標的化塩基修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；（ｂ）該改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第２の標的化修飾を該第２の植物ゲノム標的部位に作成する少なくとも１つの部位特異的エフェクターを用いて導入され、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および（ｃ）（ｉ）該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾により該第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた該少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに（ｉｉ）該第２の植物ゲノム標的部位の該少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、を含む。
本発明の方法では、選択マーカーとして用いられるトランスジェニック外来性配列の安定組込みを必要としない。かわりに、第１の植物ゲノム標的部位に表現型選択形質または表現型を作成する。これには、選択時にマーカーとして用いられる外来性核酸コンストラクトの組込みに頼らない、選択編集を提供するという利点がある。
本明細書では「表現型選択形質」は、関連のゲノム形質の発現後に目視でまたは別途選択可能な表現型を生じさせる、少なくとも１つの遺伝子によりコードされる形質を指す。該形質の選択は、目視で、または植物細胞、組織、器官、物質、または植物体に与えられる選択因子、化合物、もしくはトリガを用いて、達成することができる。
第１の植物ゲノム標的部位と第２の植物ゲノム標的部位は、同じゲノム座位であっても異なるゲノム座位であってもよい。好ましくは、第１の植物ゲノム標的部位と第２の植物ゲノム標的部位は、異なるゲノム座位に存在し、これらのゲノム座位は同じ染色体上にあっても異なる染色体上にあってもよい。
本発明の方法では、第１の標的化修飾と第２の標的化修飾との平行導入ストラテジーをとり、第１の植物ゲノム標的部位と第２の植物ゲノム標的部位に異なる標的化修飾を導入するこの平行化により、後の選抜ステップが大きく改善される。ふつう、この第２の修飾は選択には使われない。それは、第２の修飾が付与する表現型は、植物を作製するプロセスでは発現しないか関連がないためである。したがって、本発明の方法の根底にある目的は、表現型選択表現型を生じさせる第１の修飾を、選択を可能にするツールとして用いることである。従来の方法と比べて、本明細書で開示する方法は、トランスジェニックマーカー遺伝子を組み入れない利点を有する。選択表現型を選択因子とともに用いない場合と比べると、植物生産細胞の大部分を占めることになる無処理細胞のすべてまたは大半が排除されることで、効率が上がる利点を有する。無処理細胞を排除することで、生産しなければならない植物の数が大幅に減り、そして第２の標的化修飾について分子選抜しなければならない植物の数も大幅に減り、したがって本開示の植物育種法の効率が上がることになる。
好ましくは、本発明のさまざまな態様の方法は、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾、コドン欠失、またはフレームシフトもしくは欠失修飾を、関心対象の第２の植物ゲノム標的部位に少なくとも１つの第２の標的化修飾も受ける同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、同時にまたは連続して導入することに依拠する。したがって、第１の標的部位および第２の標的部位の修飾は、好ましくは、同じ細胞に同じときに、すなわち同時に、すなわち平行して導入される。したがって、この意味で、連続導入は、少なくとも１つの塩基編集複合体および／または少なくとも１つの部位特異的エフェクターを含んで導入される異なるツールの一方が他方よりも少し早く作用し得ることを指す。とはいえ、この文脈での「連続して」という用語は、関心対象のツールを同じ細胞内に平行して同時に導入することを意味する。そしてこのことは、少なくとも１つの第１および第２の標的化修飾を媒介する分子ツールの導入プロセスが対になっていて、これらの修飾が互いに完全には独立していないことから、選抜の可能性を向上させる効果を有する。したがって、１つの修飾を有する改変すべき細胞は、第２の標的化修飾も有する可能性がかなり高い。処理済みと無処理の細胞の総合集団から細胞を無作為に、特にふつう明確な表現型をもたない第２の修飾について選択する場合と比べて、本発明の方法は選択の利点を提供する。ふつうはゲノム編集時のボトルネックとなるそれぞれのツールの機能的な送達が、同期して同時に実施されるため、選択は大幅に改良される。第１の修飾を標的化して選択することが可能なので、第２の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの標的化修飾の選抜回数は少なくて済むが、それは、本発明のどのツールまたは複合体も機能的に受けなかった細胞は、第１の植物ゲノム標的部位で表現型選択形質をもたらす修飾を受けていないからである。そのような植物細胞が、細胞に平行して加えられた本発明の第２の部位特異的エフェクター複合体を受けた可能性は低いので、第１の標的化修飾の選抜が陰性であった場合は、時間のかかる選抜を第２の標的化修飾について実施する必要がない。
したがって本発明の方法は、第１の標的化修飾により標的化された表現型選択形質を好適な試薬または目視選抜により選択することによって、少なくとも１つの第１の修飾を受けた、または受けなかった細胞を選択することを可能にする。したがって、この選抜により少なくとも１つの第１の修飾を含まない細胞が排除され、あるいはこの選抜により細胞を目視検査して第１の標的化修飾を受けた改変細胞と第１の標的化修飾を受けなかった細胞に分離することが可能になる。本発明の平行導入および送達アプローチにより、第１の標的化修飾を成功裏に受けた細胞のうち妥当な数が、少なくとも１つの第２の標的化修飾も受けたと考えられる。「妥当な」はこの文脈では、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾により生じた少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、少なくとも１つの第２の標的化修飾の存在について選抜すべき細胞数の何らかの改善、すなわち減少を意味する。少なくとも１つの第２の標的化修飾の存在の実際の頻度は、いくつかの要因により変わり得るので、ふつうは予測しにくい。そのせいで、ゲノム工学により導入される任意の修飾を、一般的な分子技法により、たとえばＰＣＲを利用して選抜することが煩雑になる。本発明の方法では、第１と第２の両方の標的化修飾を受けた細胞の頻度は、第１の修飾を有する植物細胞または植物と、第１および第２の標的化修飾を有する植物細胞または植物とを比べると、２：１から１０００：１の範囲であり得る。したがって、第２の修飾について選抜しなくてはならない細胞の総数が減るので、どの選抜または選択ステップにおいても本質的に有利である。特に、第１および第２の標的化修飾を導入する各ツールが送達されなかった細胞は、分子ツールをいっさい受けていないと考えられるので、第１の標的化修飾も第２の標的化修飾も存在し得ない。したがって第１の表現型選択形質は識別されず、すなわち選択できない。各ツールが平行導入されているため、第１の修飾が存在しない場合は第２の修飾が導入された可能性は低いので、選択圧の下、または目視で選択後、表現型選択形質が「陰性」である植物細胞、組織、器官、または植物体は、次の第２の標的化修飾の選抜に供する必要がない。
所望により、由来植物との交配により第１の修飾を除去し、第２の修飾から遺伝学的に分離してもよい。
したがって、本明細書で開示する方法は、関心対象の少なくとも１つの第１の標的化修飾について選抜して、編集試薬を受けなかったか標的化修飾されなかった細胞を排除または除去することにより、関心対象の第２の遺伝子に標的化修飾を有する植物の回収率を高めるのに用いることができる。
本発明のさまざまな実施形態の標的化塩基修飾は、ｄｓＤＮＡ主鎖切断またはドナー鋳型を必要とせず、プログラム可能な様式で１つの標的ＤＮＡ塩基を別の塩基に直接不可逆的に変換することを可能にするゲノム編集を指す（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１６， Ｖｏｌ． ５３３を参照）。
一実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、さらに、ステップ（ｂ）において、少なくとも第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型を導入することを含む。修復鋳型（ＲＴ）は一本鎖または二本鎖の核酸配列であり、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる任意のゲノム編集中に、相同性指定修復を支援する既知の配列の鋳型として与えられて、該ＤＮＡ切断の標的化修復を支援することができる。本発明の少なくとも１つの修復鋳型核酸配列の一部としてのサイズはさまざまであり得る。それは、部位指定的に修飾すべきＤＮＡ標的配列により、約２０ｂｐから約５０００ｂｐまたは８０００ｂｐの範囲であり得る。ＲＴは、単独の物理的要素として、または本発明の複合体の一部として与えることができる。特定の用途では、細胞のＮＨＥＪ修復機構による望ましくない挿入や欠失を回避するために、ＲＴの使用が好ましい場合がある。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、本明細書で提供する方法は、少なくとも１つの第１の標的化修飾および少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得るステップであって、任意選択により、該関心対象の遺伝子型は、該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、さらなるステップ（ｄ）を含む。
関心対象のさらなる植物または植物物質は、関心対象のゲノム物質を含むどのような植物物質であってもよく、たとえば関心対象のエリート事象または任意の形質を含むこの物質は、たとえば育種の後続ラウンドで関心対象の遺伝子型を作ること、したがって関心対象の植物を作ることが意図されている。したがって、関心対象の遺伝子型は、異なる関心対象の植物の形質を組み合わせた先行育種ステップの結果である。
本発明の全態様の一実施形態では、関心対象の最終遺伝子型は、少なくとも１つの第１の標的化修飾、すなわち少なくとも１つの表現型選択形質を含まない。図１に例示するように、本発明の方法は、特定の用途で所望される場合、由来植物との交配により、表現型選択形質を生じさせる第１の標的化修飾を除去し、第２の標的化修飾から遺伝学的に分離することに特に適している（図１Ｃ参照）。別の実施形態では、得られた関心対象の遺伝子型および対応する植物または植物物質にとって表現型選択形質そのものが価値ある場合は、関心対象の表現型選択形質をコードする第１の標的化修飾は、関心対象の遺伝子型内に維持される場合がある。
本発明の第１の態様の一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、少なくとも１つの塩基編集複合体に一時的または恒久的に結合しており、該塩基編集複合体は、ステップ（ａ）の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾を媒介する。したがって、少なくとも１つの部位特異的エフェクターを、非共有結合的（一時的）または共有結合的（恒久的）に、少なくとも１つの塩基編集複合体に連結させることができる。少なくとも１つの塩基編集複合体の任意の構成要素を、少なくとも１つの部位特異的エフェクターに一時的または恒久的に結合させることができる。したがって、「一時的（に）」または「恒久的（に）」という用語は、広義に解釈すべきであり、少なくとも１つの部位特異的エフェクターと少なくとも１つの塩基編集複合体との物理的近さを得るための共有結合的および／または非共有結合的な結合または連結を含む。少なくとも１つの塩基編集複合体の少なくとも１つの構成要素と、少なくとも１つの部位特異的エフェクターとの結合、または任意のほかの構成要素、たとえば少なくとも１つの部位特異的エフェクターと結合したｇＲＮＡまたはＲＴとの結合は、少なくとも１つの第１のゲノム標的部位と少なくとも１つの第２のゲノム標的部位とが、関心対象のゲノム内で至近である場合は、関心対象であり得る。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターは、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントを含む制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、または塩基エディター、あるいは前述のエフェクターのあらゆるバリアントまたは触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される。
したがって、本明細書では「部位特異的エフェクター」は、一本鎖または二本鎖切断をゲノム標的部位に導入する能力のある、あるいは点変異、挿入、または欠失などの標的化修飾を関心対象のゲノム標的部位に導入する能力のある、任意のヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、または塩基エディターと定義することができる。少なくとも１つの「部位特異的エフェクター」は単体で、または分子複合体の一部としてほかの分子と一緒に、作用することができる。「部位特異的エフェクター」は、融合分子として存在する場合もあるし、部位特異的エフェクター複合体の各構成要素が物理的に近づくように共有結合的もしくは非共有結合的相互作用の少なくとも１つにより結合したまたは結合された単体分子として存在する場合もある。
本明細書では「塩基エディター」は、タンパク質、または由来タンパク質と同じ触媒活性をもつフラグメントを指し、該タンパク質またはそのフラグメントは、単独で、または分子複合体として提供された場合に、本明細書では塩基編集複合体と呼ばれ、標的化塩基修飾を媒介する、すなわち関心対象の塩基を変換して関心対象の点変異をもたらす能力があり、この塩基変換が、サイレント変異ではなく、塩基エディターにより変換されるべき位置を含むコドンによりコードされるアミノ酸の変換をもたらす場合、標的化変異をもたらすことができる。好ましくは、本発明の少なくとも１つの塩基エディターは、一時的または恒久的に少なくとも１つの部位特異的エフェクターに結合するか、任意選択により少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体の構成要素に結合する。この結合は、共有結合的および／または非共有結合的であり得る。
本明細書で開示する塩基エディターもしくは部位特異的エフェクター、またはその触媒活性フラグメント、あるいは塩基エディター複合体のまたは部位特異的エフェクター複合体の構成要素はどれでも、核酸フラグメントとして細胞に導入することができ、該核酸フラグメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質エフェクターであるかそれをコードしており、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせとして導入することができる。
エンドヌクレアーゼ、ＤＳＢ、および修復鋳型を用いて選択修飾を作成する要件を排除する主要なツールセットは、塩基エディターまたは標的化変異誘発ドメインの使用である。複数の発表文献が、シチジンデアミナーゼドメイン、アポリポタンパクＢｍＲＮＡ−編集触媒ポリペプチド（ＡＰＯＢＥＣ１）、たとえばラット由来のＡＰＯＢＥＣと結合させたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非機能的ヌクレアーゼを用いた、主にシチジン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への標的化塩基変換を発表している。シトシン（Ｃ）は、シチジンデアミナーゼの触媒により脱アミノ化されて、チミン（Ｔ）の塩基対形成特性をもつウラシル（Ｕ）となる。公知のシチジンデアミナーゼの大半がＲＮＡで機能し、ＤＮＡを認容する数例は一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを要する。ｄＣａｓ９標的ＤＮＡ複合体の研究によると、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ「Ｒループ」複合体の形成後、置換ＤＮＡ鎖の少なくとも９ヌクレオチド（ｎｔ）が対形成していない（Ｊｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， （２０１１） １８， ５２９−５３６）。実際、Ｃａｓ９ Ｒループ複合体の構造において、置換ＤＮＡ鎖のプロトスペーサーの最初の１１ｎｔに乱れがあり、これらの移動が厳しく制限されてはいないことがわかる。また、非鋳型鎖のシトシンのＣａｓ９ニッカーゼ誘導変異は、それらが細胞のシトシンデアミナーゼ酵素によりアクセスされやすいため生じる可能性が考えられる。発明者らは、ＲループのこのｓｓＤＮＡ区分のサブセットは、ｄＣａｓ９とつながったシチジンデアミナーゼにとって、ＤＮＡにおいてＣからＵへのプログラム可能な直接の変換をもたらす効率のよい基質の役割を果たし得ると推論した（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．， 前掲）。
したがって、本発明のどの塩基編集複合体も、少なくとも１つのシチジンデアミナーゼ、またはその触媒活性フラグメントを含む場合がある。少なくとも１つの塩基編集複合体は、シチジンデアミナーゼ、または触媒活性フラグメントの形態でそのドメインを、塩基エディターとして含む場合がある。
別の実施形態では、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、ヌクレオチドＣ、Ａ、Ｔ、またはＧのいずれかの、任意のほかのヌクレオチドへの変換である。Ｃ、Ａ、Ｔ、またはＧヌクレオチドのいずれか１つを、塩基エディターまたはその触媒活性フラグメントの媒介により、部位指定的に別のヌクレオチドに交換することができる。したがって、少なくとも１つの塩基編集複合体は、任意の塩基エディター、または塩基エディタードメイン、またはその触媒活性フラグメントを含むことができ、関心対象のヌクレオチドを、任意のほかの関心対象のヌクレオチドに、標的化して変換することができる。
本発明は、塩基エディターツールそのものについての知識を組み合わせる方法を提供し、この技術を関心対象の表現型選択表現型を得るための併用法として用いて、トランスジェニックマーカーの必要性を回避するが、それは選択可能な表現型アウトプットを有する内在性マーカーを塩基編集により人工的に作成できるからである。そのために、塩基エディターは、ゲノム標的領域を認識し結合する能力を保持している改変された部位特異的エフェクターと組み合わされ、場合によってはＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼのｇＲＮＡにガイドされて、ＣからＵまたはＧからＡへの変換を媒介して、部位指定的変異誘発を導入する。そうして標的化変異を発生させることができ、関心対象の表現型が得られる。こうして標的化育種ストラテジーが可能になるが、特に、本明細書で開示する方法ではさらに、改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に標的化塩基修飾を導入するための少なくとも１つの塩基エディターまたは塩基編集複合体の使用と、少なくとも１つの部位特異的エフェクターが媒介する第２の修飾とを平行式に組み合わせる。このアプローチにより、マーカーを用いない選択と、関心対象の修飾または遺伝子型の選抜とが相乗効果的に可能になり、本発明のさまざまな態様の少なくとも１つの第１の修飾、すなわち標的化塩基修飾、標的化コドン欠失、または標的化フレームシフトもしくは欠失修飾のために、ＤＳＢまたはＲＴの導入を必要としない。
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＧＩ）ドメインを付加することで、塩基編集効率がさらに上がる。複合体が適切に標的化できるように、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または任意のほかの小器官標的化シグナルがさらに必要になる場合がある。
本発明の全態様の一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクターは、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼであり、該ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、少なくとも１つの塩基編集複合体を導く部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列は、（ａ）ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９、ＶＱＲ−Ｃａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９、（ｂ）ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１を含む、Ｃｐｆ１、（ｃ）ＣａｓＸ、および（ｄ）ＣａｓＹ、ならびに前述のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意のバリアントおよび誘導体を含む群より選択され、好ましくは該少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、それぞれの野生型配列と比べて変異を含み、したがって得られたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮＡニッカーゼに、または全ＤＮＡ切断能力を失ったＤＮＡ結合エフェクターに変換されている。
本明細書では「ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ」は、自然に生じるＣＲＩＳＰＲ系において同定されている任意のヌクレアーゼであり、その後その自然のコンテキストから単離され、好ましくは標的化ゲノム工学の好適なツールになるように、改造されまたは組み合わされて関心対象の組換えコンストラクトにされている。オリジナルの野生型ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼがＤＮＡ認識性すなわち結合特性を提供するかぎり、どのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼを用いてもよく、任意選択により、本発明のさまざまな実施形態にとって好適であるようにリプログラムしたり、さらに変異させたりすることができる。該ＤＮＡ認識性は、ＰＡＭ依存的であり得る。特殊用途用に最適化され工学されたＰＡＭ認識パターンを有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用しかつ作製することができる。野生型ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼのオリジナルのＰＡＭ特異性とは関係なく、部位特異的エフェクター複合体を関心対象の標的部位に向けるために、ＰＡＭ認識コードの伸長が好適であり得る。Ｃｐｆ１バリアントは、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）のＡｓＣｐｆ１のＳ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、Ｎ５５２Ｒ、またはＫ６０７Ｒ変異のうちの少なくとも１つを含むことができ、好ましくは変異Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７ＲまたはＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒを含む（配列番号２４参照）。さらに、本発明の方法では塩基編集複合体の一部として、改変Ｃａｓバリアント、たとえばＣａｓ９バリアント、たとえばＢＥ３、ＶＱＲ−ＢＥ３、ＥＱＲ−ＢＥ３、ＶＲＥＲ−ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＫＫＨ−ＢＥ３を用いることができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２０１７， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８０３を参照）。したがって、本発明では、人工的に改変したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを想定し、これらは二本鎖切断酵素という意味においてはとくに「ヌクレアーゼ」ではないかもしれないが、なおも固有のＤＮＡ認識性を有し、したがって結合能力がある、ニッカーゼまたはヌクレアーゼデッドバリアントである。本発明の目的にとって好適な例示的ＣａｓベースまたはＣｐｆ１ベースのコンストラクトを、配列番号１７〜１９に開示する。ＡｓＣｐｆ１野生型配列を配列番号２４に開示する。本発明の方法で使用されるほかの好適なＣｐｆ１ベースのエフェクターは、ラクノスピラ科バクテリア（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来（ＬｂＣｐｆ１、たとえば、ＮＣＢＩ基準配列：ＷＰ＿０５１６６６１２８．１）、またはフランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）由来（ＦｎＣｐｆ１、たとえば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ａ０Ｑ７Ｑ２．１）である。Ｃｐｆ１のバリアントが公知である（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＲｘｉｖ， ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１を参照）。そこで、本発明の部位特異的エフェクターとして想定されるのは、試験管内および生体内で高い活性を有し、ＴＹＣＶ／ＣＣＣＣとＴＡＴＶのＰＡＭを有する標的部位をそれぞれ切断できる変異Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ、およびＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒを有するＡｓＣｐｆ１のバリアントである。ゲノム全体にわたるオフターゲット活性の評価によると、これらのバリアントは高レベルのＤＮＡ標的化特異性を保持しているが、非ＰＡＭ相互作用ドメインに変異を導入することで、該特異性をさらに高めることができる。これらのバリアントを合わせると、ＡｓＣｐｆ１の標的化範囲は、ヒトゲノムの非反復領域でおよそ８．７ｂｐごとに１つの切断部位にまで増大し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム工学のツールボックスにとっての便利な追加項目となる（前掲のＧａｏ ｅｔ ａｌ．を参照）。
本発明の第１の態様の一実施形態では、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、少なくとも１つの塩基エディターを構成要素として含む少なくとも１つの塩基編集複合体により作成される。本発明の塩基編集複合体は、塩基エディターのほかにもさらなる任意選択の構成要素を含む。
一実施形態では、塩基編集複合体は、ＡＰＯＢＥＣ１構成要素、好ましくはラットＡＰＯＢＥＣ１を含む。別の実施形態では、塩基編集複合体は、塩基エディターとして、任意のシチジン／シトシンデアミナーゼ酵素、たとえばヒトＡＩＤ、たとえばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ９ＧＺＸ７．１、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、たとえばＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＫ５４７５２．１、またはヤツメウナギＣＤＡ１、たとえばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＯ１５１５０．１を含む場合があるが、本発明の範囲ではあらゆる酵素またはその触媒活性フラグメントが想定される。本発明の方法での使用に適した例示的ＡＰＯＢＥＣ構成要素を、配列番号２０に示す。さらに、本発明の方法では、改変された塩基エディター、好ましくは６ｎｔ未満の、５ｎｔ未満の、４ｎｔ未満の、３ｎｔ未満の、または２ｎｔの、もしくは１ｎｔの狭い編集幅を有する塩基エディターを使用することができる。編集ウインドウが狭いほど、関心対象のゲノム標的部位により精密な編集を導入することができる。
一実施形態では、塩基編集複合体は、ＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤）構成要素を含む。特定の実施形態では、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＵＧＩを使用する場合があり、またはＵＤＧの活性を阻害して特定の細胞において活性のある内在性塩基除去修復（ＢＥＲ）の活性を抑制する任意のほかのドメインを使用する場合がある。本発明の方法での使用に適した例示的ＵＧＩ構成要素を、配列番号２１に示す。
さらなる実施形態では、塩基編集複合体は、ＸＴＥＮ構成要素、すなわち少なくとも１つの部位特異的エフェクターに結合した少なくとも１つの塩基エディターの最適な脱アミノ化活性を提供するための特殊なリンカーを含む。塩基エディターと部位特異的エフェクターの間に少なくとも２ヌクレオチド（ｎｔ）長のほかのリンカーを用いる場合もあるが、部位特異的エフェクターが付与する結合活性および／または塩基エディターの塩基編集活性に影響はない。好適なＸＴＥＮリンカー配列を、配列番号１（位置６８８〜７３５）、配列番号２（位置７０６〜７５３）、配列番号１４（位置７０６〜７５３）、または配列番号１５（位置７０６〜７５３）に示す。さまざまなさらなるリンカーが当業者には公知であり、リンカー設計の文献もある。したがって、リジッドなリンカーでもフレキシブルなリンカーでも本発明のさまざまな方法で用いることができる。
本発明の例示的融合コンストラクトを、配列番号１、２、１４、１５、または１６に示す。
一実施形態では、少なくとも１つの塩基編集複合体は２つ以上の構成要素を含み、少なくとも２つ構成要素は物理的に結合している。物理的な結合には、共有結合的な結合、たとえばＤＮＡフラグメントを互いに融合させて、発現後に融合タンパク質を生成させること、または本開示の複合体の異なる構成要素を互いに化学架橋することが含まれ得る。物理的な結合にはまた、非共有結合的相互作用が含まれ得る。したがって非共有結合的相互作用または連結には、静電相互作用、ファンデルワールス力、ＴＴ作用、および疎水性作用が含まれる。核酸分子の文脈で特に大切なのは、静電相互作用としての水素結合である。水素結合（Ｈ結合）は特殊なタイプの双極子間相互作用であり、部分的にプラスの水素原子と、この水素原子と共有結合するのではない、電気陰性度が高い、部分的にマイナスの酸素、窒素、硫黄、またはフッ素原子との相互作用が関与している。
さらなる実施形態では，塩基編集複合体は、ＰｍＣＤＡ１（ウミヤツメウナギの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）オルソログＰｍＣＤＡ１、Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６， ｖｏｌ． ３５３， ｉｓｓｕｅ ６３０５， ａａｆ８７２９）参照）構成要素を塩基エディターとして含む。本発明の方法で用いられる例示的ＰｍＣＤＡ１を、配列番号２２に示す。
ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、修飾すべき関心対象のゲノム標的領域に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識を通じて作用する。したがって、改変されたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼを用いた塩基編集の範囲および精度をさらに増大するために、異なるＰＡＭ特異性を導入して標的化できる部位の数を増やすことは、大きな関心事項である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２０１７， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８０８）。当業者には公知のように、各種野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼごとに異なる固有のＰＡＭ特異性を有する。本発明で想定するＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、改変されたＰＡＭ特異性を有するので、標的化範囲も改変されており、たとえば、ＮＧＡＰＡＭ配列を許容するＳｐＣａｓ９変異体（ＶＱＲ−Ｃａｓ９）、ＮＧＡＧＰＡＭ配列を許容するＳｐＣａｓ９変異体（ＥＱＲ−Ｃａｓ９）、またはＮＧＣＧＰＡＭ配列を許容するＳｐＣａｓ９変異体（ＶＲＥＲ−Ｃａｓ９）、ならびにバリアントのＰＡＭ要件をＮＮＮＲＲＴに緩める３種の変異を含む工学ＳａＣａｓ９バリアント（ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９）である（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５） ３３， １２９３−１２９８）。異なるＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼに適した本発明の例示的ＰＡＭ配列を配列番号３〜１３および２３に示す。
一実施形態では、少なくとも１つの塩基編集複合体は、２つ以上の構成要素を含み、少なくとも２つの構成要素は単体の構成要素として与えられる。このアプローチは、特定の形質転換または形質移入ストラテジーにとって好適であり得る。
本発明の方法の特定の実施形態では、細胞内で複合体が形成できるよう、または形質転換もしくは形質移入前に試験管内で複合体が形成できるよう、本発明の任意の複合体の少なくとも１つの構成要素が、関心対象の細胞内で同系の結合パートナーと特異的に相互作用または結合することができる部または部分を含む場合がある。結合ペアは、ドッキングドメイン、またはアソシエーションドメイン、またはそれをコードする核酸配列により結合することができ、ビオチン、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質色素、たとえばフルオロフォア、たとえばフルオセイン、もしくはそのバリアント、マレイミド、またはＴｅｔｒａｘｏｌｉｕｍ（ＸＴＴ）、少なくとも１つの修復鋳型核酸配列と相互作用するように特異的に構成されているガイド核酸配列、ストレプトアビジン、もしくはそのバリアント、好ましくはモノマーのストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、アビジン、もしくはそのバリアント、親和性タグ、好ましくはストレプトアビジンタグ、抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、所与の抗体もしくはｓｃＦｖに特異的な抗原、シングルドメイン抗体（ナノボディ）、アンチカリン、アグロバクテリウムＶｉｒＤ２タンパク質もしくはそのドメイン、ピコルナウイルスＶＰｇ、トポイソメラーゼもしくはそのドメイン、ＰｈｉＸ１７４ファージＡタンパク質、ＰｈｉＸ Ａ＊タンパク質、ＶｉｒＥ２タンパク質もしくはそのドメイン、またはジオキシゲニンの少なくとも１つから選択される。ほかの好適な結合ペアが当業者には公知である。もっとも好ましくは、同系結合パートナーは、生理学的条件下で、互いに高い親和性定数または結合親和性を有し、したがって低い解離定数（Ｋｄ）を有し、すなわちＫｄ値は低μＭであり、または好ましくはｎＭ範囲であり、好ましくはそれよりも低く、本発明の少なくとも１つの塩基編集複合体または少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体の複合体形成を支援する。
本発明の全態様の一実施形態の方法では、少なくとも１つの塩基編集複合体の少なくとも１つの構成要素、および／または少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体の少なくとも１つの構成要素は、該少なくとも１つの塩基編集複合体を細胞内小器官に向けるために少なくとも１つの小器官局在化シグナルを含む。一実施形態では、少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。さらなる実施形態では、少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、葉緑体輸送ペプチドである。さらなる実施形態では、少なくとも１つの小器官局在化シグナルは、ミトコンドリア輸送ペプチドである。１つまたは複数の局在化シグナルは、塩基編集複合体または部位特異的エフェクター複合体の少なくとも１つの構成要素と結合した状態で存在することができる。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、少なくとも１つの表現型選択形質をコードするゲノム標的部位であり、少なくとも１つの表現型選択形質は、抵抗性／耐性形質または成長優位性形質であり、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、もしくは植物、またはその子孫に、加えられる化合物またはトリガに対する抵抗性／耐性または成長優位性を付与する。
本明細書では「成長優位性」は、植物の発生および生殖の全ステージにおける任意の生理学的または代謝的に好ましい特性、たとえば生物的および非生物的ストレスに対する抵抗性が有利である、またはたとえば乾燥や塩度等のようなストレス条件下での植物の成長および発生に影響する特性を指す。
したがって本発明では「化合物」または「トリガ」は除草剤であり得、たとえば、細胞代謝阻害剤、たとえば：ＥＰＳＰＳ阻害（グリシン、たとえばグリホサート）；ＡＬＳ／ＡＨＡＳ（分枝鎖アミノ酸産生）阻害（たとえばイミダゾリン、スルホニルウレア）；脂質合成阻害／ＡＣＣａｓｅ（アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）、シクロヘキサンジオン（ＤＩＭ）、フェニルピラゾリン（ＤＥＮ）；グルタミンシンセターゼ阻害剤（グルホシネート／ホスフィノスリチン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ））、成長／細胞分裂阻害剤、たとえば植物細胞成長攪乱剤（フェノキシカルボン酸、たとえば２，４−Ｄ）、合成オーキシン（安息香酸たとえばジカンバ）、オーキシン輸送阻害（フタラマート）；および光合成干渉、たとえば：漂白剤／ＨＰＰＤ阻害剤（ピラゾールおよびイソキサゾール）；光化学系ＩＩ阻害剤（ＰＳＩＩ阻害剤）（トリアジン、トリアジノン、ピリダゾン、Ｃ３：アイオキシニルおよびブロモキシニルほか多数）；プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤（ＰＰＯ／ＰＰＸ）（たとえばジフェニルエーテルおよびＮ−フェニルフタルイミド）から選択される。
さらに、本発明では「化合物」または「トリガ」は、植物内部で生じるまたは外部から加えられる、植物の代謝に影響する植物成長因子または任意のほかの物質の場合もある。
本明細書で開示する方法の全実施形態で、化合物またはトリガは、外部から加えられて、関心対象の形質、少なくとも１つの植物細胞、組織、器官、物質、または植物体によりコードされる、そして本発明の全態様のさまざまな方法で標的化されて修飾されている表現型選択形質の選択を可能にする。したがって、表現型選択形質の修飾の形態の特異的相互作用ペアを提供すること、ならびに対応する化合物およびトリガを後続の選択および交配のステップで提供することで、あらゆる育種の取り組みを改善することができる。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、関心対象の少なくとも１つの表現型選択形質は、少なくとも１つの内在性遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、あるいは関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、少なくとも１つの導入遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、少なくとも１つの内在性遺伝子または少なくとも１つの導入遺伝子は、関心対象の少なくとも１つの表現型形質に少なくとも１つの修飾がない細胞を阻害する、損傷する、または殺す植物毒、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは少なくとも１つの表現型形質は、細胞分裂、成長速度、胚発生のブースターからなる群より、または非改変細胞、組織、器官、もしくは植物と比べて改変細胞、組織、器官、もしくは植物に優位性を与える別の表現型選択特性から選択される。
本発明のさまざまな態様のさらなる実施形態では、少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位は、除草剤抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型選択形質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子または導入遺伝子であり、ここで除草剤抵抗性／耐性は、グリホサートを含むＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルホシネートを含むグルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、イミダゾリンまたはスルホニルウレアを含むＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）を含むＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、フィトエンデサチュラーゼステップでのカロテノイド生合成阻害剤、４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、またはほかのカロテノイド生合成標的の阻害剤を含むカロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子ダイバーターに対する抵抗性／耐性、カルバメート、トリアジン、およびトリアジノンを含む光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ジカンバ（２，４−Ｄ、すなわち２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含む合成オーキシンに対する抵抗性／耐性からなる群より選択される。
本発明のさまざまな態様のさらなる実施形態では、少なくとも１つの内在性遺伝子または少なくとも１つの導入遺伝子は、ウイルス、細菌、真菌、もしくは動物の病原菌から選択される病原菌抵抗性／耐性などの生物的ストレスに対する抵抗性／耐性、非生物的ストレスに対する抵抗性／耐性、たとえば冷害抵抗性／耐性、乾燥ストレス抵抗性／耐性、浸透圧抵抗性／耐性、熱ストレス抵抗性／耐性、低温ストレス抵抗性／耐性、酸化ストレス抵抗性／耐性、重金属ストレス抵抗性／耐性、塩ストレスもしくは浸水抵抗性／耐性、倒伏抵抗性／耐性、脱粒抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、収量増、開花期改変、種子色改変、胚乳組成の改変、栄養分改変、または関心対象の経路の代謝工学などのさらなる関心対象の農学的形質の修飾からなる群より選択される。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は、植物毒抵抗性／耐性形質、好ましくは除草剤抵抗性／耐性形質であり、改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位の少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、植物毒化合物、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性を付与し、該化合物は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体、またはその子孫に加えられる外来性化合物である。
関心対象の植物細胞のゲノムによりコードされる任意のさらなる表現型選択形質を、本発明のさまざまな態様の少なくとも１つの第１の標的化修飾の標的とすることができるが、ただし、関心対象の表現型選択形質をコードする少なくとも１つの遺伝子が既知であること、および対応する相補性の化合物またはトリガが入手可能であるかまたは標的化修飾を選抜できるように設計可能であることが前提である。可視表現型の場合、選抜用の化合物またはトリガは不要であるが、かわりに目視で選抜可能な形質の観測に基づいた好適な読み取りおよび決定ストラテジーを準備する必要がある。
さまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、除草剤または植物毒化合物に対する抵抗性または耐性を付与する遺伝子であり、第１の植物ゲノム標的部位は、少なくとも１つの対応するアミノ酸変換を生じさせる少なくとも１つの核酸変換を含み、少なくとも１つの核酸変換は、少なくとも１つの塩基エディターにより作成されている。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＡＬＳである。本発明の目的には、どのＡＬＳ配列でも好適である。例示的ＡＬＳ配列を配列番号２５に示す。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＰＰＯである。本発明の目的には、どのＰＰＯ配列でも好適である。例示的ＰＰＯ配列を配列番号２６に示す。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＥＰＳＰＳである。本発明の目的には、どのＥＰＳＰＳ配列でも好適である。例示的ＥＰＳＰＳ配列を配列番号２７に示す。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、ＥＰＳＰＳ、ＡＬＳ、またはＰＰＯ、またはそれらの任意のアレルもしくは植物バリアントであり、ＥＰＳＰＳ、ＡＬＳ、またはＰＰＯは、少なくとも１つの対応するアミノ酸変換をもたらす少なくとも１つの核酸変換を含み、少なくとも１つの核酸変換は、少なくとも１つの塩基エディターにより作成されている。
本発明の表現型選択形質をコードするそのような一標的は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子である。いくつかの１または２アミノ酸置換により、該酵素のグリホサート敏感性が低下することがわかっている（Ｓａｍｍｏｎｓ， Ｒ． Ｄ． ａｎｄ Ｇａｉｎｅｓ， Ｔ． Ａ． （２０１４）， Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｓｔａｔｅ ｏｆ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ． Ｐｅｓｔ． Ｍａｎａｇ． Ｓｃｉ．， ７０： １３６７−１３７７）。
別の標的は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子であり、さまざまな１アミノ酸変異が、トリアゾロピリミジン、スルホニルウレア、ピリミジニルチオベンゾアート、イミダゾリノン、およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンといった分類に属する１つまたは複数の除草剤に対する耐性と関連付けられている。本発明の目的に適した残基置換としては、Ａ１２２、Ｐ１９７、Ａ２０５、Ｄ３７６、Ｗ５７４、およびＳ６５３が挙げられる。
さらに別の選択修飾は、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）およびアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子における。ここで、２１５番目のシステインのフェニルアラニンへ（Ａ２１５Ｆ）、ロイシンへ（Ａ２１５Ｌ）、またはリジンへ（Ａ２１５Ｋ）の修飾、ならびに２２０番目のアラニンのバリンへ（Ａ２２０Ｖ）、スレオニンへ（Ａ２２０Ｔ）、またはロイシンへ（Ａ２２０Ｌ）の修飾、ならびに２２１番目のグリシンのセリンへ（Ａ２２１Ｓ）またはロイシンへ（Ａ２２１Ｌ）の修飾は、ジフェニルエーテル、Ｎ−フェニルフタルイミド、オキサジアゾール、オキサゾリジンジオン、フェニルピラゾール、ピリミジニジオン、チアジアゾール、トリアゾリノン、その他などのＰＰＯ除草剤に対する抵抗性を指す（Ｌｉ， Ｘｉａｎｇｇａｎ ｅｔ ａｌ． “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ Ｏｘｉｄａｓｅ ａｓ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ．” Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３３．２ （２００３）： ７３６−７４７． ＰＭＣ． Ｗｅｂ． ２０１７年３月１５日）。上記の残基置換に加えて、Ｎ．タバカム（Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ）またはそのホモログの１７８番目のグリシンの１アミノ酸欠失は、ＰＰＯ阻害剤の結合を妨害し、上記阻害剤に対する抵抗性を与える（Ｐａｔｚｏｌｄｔ， Ｗ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００６）． “Ａ ｃｏｄｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ” ＰＮＡＳ １０３（３３）：１２３２９−１２３３４）ので、本発明のさまざまな態様で用いることができる。
さらに、本願に記載の技術は、精密なアミノ酸修飾および欠失のみならず、選択表現型を生じさせる遺伝子の配列を修飾または妨害するための終止コドンの導入を可能にする。アミノ酸をコードする６１のコドンのうち、どちらかの鎖の少なくとも１つのシトシン／シチジンからチミン／チミジンへの変換により、５つのアミノ酸を終止コドンに変換することができる。
これらの修飾を作成するツールは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼそのものである。１つまたは複数の塩基対欠失を提供することがわかっているＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、およびＣａｓＹが挙げられる。これらは現時点ではもっとも便利なオプションであるが、将来開発される部位指定ヌクレアーゼも、本文書に記載する手順に容易に適応できよう。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位はＡＬＳであり、標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＡ１２２をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＰ１９７をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＡ２０５をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＤ３７６をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＲ３７７をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＷ５７４をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＳ６５３をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＧ６５４をコードする配列に生じ、あるいは前述の変異の任意の組み合わせである。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位はＰＰＯであり、標的化修飾は配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＣ２１５、Ａ２２０、Ｇ２２１、Ｎ４２５、またはＹ４２６をコードする配列に生じ、あるいは前述の変異の任意の組み合わせである。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、選択の目的で、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位は、アマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＸ２Ｌ遺伝子産物である。本発明のさまざまな態様の一実施形態では、標的化塩基修飾、標的化コドン欠失、または標的化フレームシフトもしくは欠失修飾を含む第１の標的化修飾は、配列番号２８のアマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＸ２Ｌ遺伝子産物のＧ２１０残基に相当する位置に生じる。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位はＥＰＳＰＳであり、少なくとも１つの標的化修飾が、配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＧ１０１、Ｔ１０２、Ｐ１０６、Ｇ１４４、またはＡ１９２をコードする配列に生じる標的化修飾のいずれか１つであり、あるいは前述の変異の任意の組み合わせである。特定の好ましい実施形態では、標的化修飾は配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＧ１０１およびＧ１４４をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＧ１０１およびＡ１９２をコードする配列に生じ、または標的化修飾は配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＴ１０２およびＰ１０６をコードする配列に生じる。
当業者であれば、本明細書に記載の開示に基づいて、本発明の少なくとも１つの表現型選択形質を作るためのさらなる好適な植物毒抵抗性／耐性形質および対応する変異を定義することもできる。
本発明のさまざまな態様の特定の実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、または植物体を特定または単離するのに便利な可視表現型である。「可視」表現型は、肉眼であれ顕微鏡であれ、目で観測して検出できる任意の表現型なので、分子生物学的選抜が不要になる。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、少なくとも１つの表現型選択形質は光沢表現型、ゴールデン表現型、着色表現型、または成長優位性表現型である。いくつかのほかの可視表現型が当業者には公知である。これらの可視表現型は、関心対象の植物または植物細胞の遺伝的背景により異なる。
本発明の第２の態様では、少なくとも１つの改変植物細胞、または該少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法を提供し、該方法は、（ａ）改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、またはＤＮＡ修飾試薬を含む少なくとも１つの第１の部位特異的エフェクターを用いて、少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾を導入することであって、該少なくとも１つの標的化コドン欠失修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；（ｂ）該改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第２の標的化修飾を該第２の植物ゲノム標的部位に作成する少なくとも１つの第２の部位特異的エフェクターを用いて導入され、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および（ｃ）（ｉ）該少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾により該第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた該少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに（ｉｉ）該第２の植物ゲノム標的部位の該少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、（ｄ）任意選択により、該少なくとも１つの第１の標的化修飾および該少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得ることであって、任意選択により、該関心対象の遺伝子型は、該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、交配させること、を含む。
本発明のさらなる態様では、少なくとも１つの改変植物細胞、または該少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法を提供し、該方法は、（ａ）改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第１の部位特異的エフェクターを用いて、少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾を導入することであって、該少なくとも１つの標的化フレームシフトまたは欠失修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；（ｂ）該改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第２の標的化修飾を該第２の植物ゲノム標的部位に作成するヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、またはＤＮＡ修飾試薬を含む少なくとも１つの第２の部位特異的エフェクターを用いて導入され、該少なくとも１つの第２の標的化修飾は、該少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物体に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および（ｃ）（ｉ）該少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾により該第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた該少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに（ｉｉ）該第２の植物ゲノム標的部位の該少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、（ｄ）任意選択により、該少なくとも１つの第１の標的化修飾および該少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得ることであって、任意選択により、該関心対象の遺伝子型は、該少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、交配させること、を含む。
上記で詳述したように、本発明の方法は、２つの異なる分子複合体の新たな組み合わせ方を提供し、１つの複合体は、トランスジェニックマーカーを挿入することなく選択表現型を生じさせる少なくとも１つの第１の標的化修飾を導入するように構成されており、もう１つの複合体は、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入するように構成されており、ここで第１の修飾は選抜の目的に貢献し、第２の修飾は導入されるべきゲノム編集を表す。したがって、本発明の方法は、異なるゲノム標的部位でゲノム編集ストラテジーを相乗効果的に組み合わせて異なる標的化修飾を実現し、最終的には関心対象の遺伝子型を有する植物が得られる効率のよい育種法となる。
特定の実施形態では、本発明の方法のステップｂが、少なくとも１つの第１のおよび／または第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型（ＲＴ）を導入することをさらに含む。ＲＴによってゲノム編集アプローチの精度レベルがさらに上がるが、それは、好適なＲＴを単体でまたは本発明の少なくとも１つの複合体の一部として与えることで、ヌクレアーゼまたはニッカーゼにより生じた切断を、エラーが起きやすい内在性ＮＨＥＪ経路を修復機構とするのではなく、相同性指定修復を支援することにより所定のとおりに修復することができるからである。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼが、ｇＲＮＡと相互作用する部位特異的エフェクターとして用いられ、該ｇＲＮＡはＲＴに共有結合的に結合することができ、または該ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡは、ＲＴと非共有結合的に相互作用する。別の実施形態では、ＲＴは、関心対象のＲＴをコードするコンストラクトの追加などで単体として与えられ、該ＲＴは、該ＲＴの相同性アームに媒介される相補性塩基対形成により部位特異的エフェクター複合体と結合し、関心対象の少なくとも１つのゲノム標的部位にアニールする。
一実施形態では、融合タンパク質、または相互作用ドメインとして非共有結合的に結合した活性Ｃｐｆ１と不活性ｄＣａｓ９が、部位特異的エフェクターとして提供される場合がある。Ｃａｓ９のｇＲＮＡは、修復鋳型またはその伸長部を標的とすることができ、Ｃｐｆ１−ｄＣａｓ９−ＲＴ複合体を形成する。ｃｒＲＮＡ（Ｃｐｆ１）は、二本鎖切断の対象とされたゲノム座位を標的として、ＨＤＲを開始する。同様に、高活性のジンクフィンガータンパク質、ｍｅｇａＴＡＬ、または不活性メガヌクレアーゼを用いることができる。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、本明細書で開示する方法のいずれか１つにより得ることができる植物細胞、組織、器官、物質、もしくは植物体、またはその子孫を提供する。
本明細書で提供する方法は、農学的に好ましい形質を有するがトランスジェニックマーカー配列を含まない新種の植物の提供を支援するように特別設計されているので、本明細書で開示する方法は、多種多様な植物遺伝子型を速く確実に作るのに適している。
本発明のさまざまな態様の一実施形態では、改変すべき少なくとも１つの植物細胞は、好ましくは、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より選択される植物または前述の植物の１つに属するあらゆる変種または亜種に由来する。
遺伝子改変された、導入遺伝子を含まない植物を生産する方法：
さらなる態様では、本発明は、ゲノム編集により遺伝子改変植物を作製する方法を提供し、該方法は、
ａ）遺伝子改変すべき植物の細胞または組織を準備するステップ；
ｂ）第１のゲノム編集系および第２のゲノム編集系を準備するステップであって、該第１のゲノム編集系は、植物の選択マーカー遺伝子を標的化し修飾することができ、該第２のゲノム修飾系は、該植物の関心対象の遺伝子を標的化し修飾することができる、ステップ；
ｃ）該第１および該第２のゲノム編集系で該細胞または該組織を同時形質転換するステップ；
ｄ）好ましくは選択圧なしで、該形質転換細胞または組織から植物を再生させるステップ；
ｅ）ステップｄ）で再生させた植物のなかから、該選択マーカー遺伝子が修飾されている植物を選択するステップ；および
ｆ）ステップｅ）で選択した植物のなかから、その標的遺伝子が修飾されている植物を特定するステップ
を含む。
植物の細胞または組織としては、インタクトな植物として再生させることができる、プロトプラスト、カルス、外植体、未成熟胚等の任意の細胞または組織が挙げられる。
本明細書では、「遺伝子修飾（改変）」は、遺伝子の配列を変えること、および／または遺伝子の発現を変えることを包含する。
本明細書では、「関心対象の遺伝子」という用語は、構造遺伝子も非構造遺伝子も含め、植物の修飾すべき任意のヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、関心対象の遺伝子は、植物の形質、好ましくは農学的形質と関連がある。
本明細書では、「選択マーカー遺伝子」は、植物の内在性遺伝子であって、好適に修飾された後、選択することができる選択形質を該植物に付与する遺伝子を意味する。好ましくは、選択マーカー遺伝子は、好適に修飾されたとき、植物のほかの形質を実質的に変えることはない。
たとえば、選択マーカー遺伝子は、植物の内在性の除草剤抵抗性遺伝子であってもよく、好適に修飾されると該植物に除草剤抵抗性を付与する。植物内在性の除草剤抵抗性遺伝子としては、限定ではないが、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＰＰＯ、およびＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、およびＰ４５０が挙げられる。除草剤抵抗性を付与することができるＡＬＳ変異部位としては、限定ではないが、Ａ１２２、Ｐ１９７、Ａ２０５、およびＳ６５３が挙げられる（アミノ酸のナンバリングはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＬＳのアミノ酸配列を参照する）。除草剤抵抗性を付与することができるＥＰＳＰＳ変異部位としては、限定ではないが、Ｔ１０２、Ｐ１０６が挙げられる（アミノ酸のナンバリングはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＰＳＰＳアミノ酸配列を参照する）。除草剤抵抗性を付与することができるＡＣＣａｓｅ変異部位としては、限定ではないが、Ｉ１７８１、Ｗ２０２７、Ｉ２０４１、Ｄ２０７８、およびＧ２０９６が挙げられる（アミノ酸のナンバリングはアロペクルス・ミオスロイデス（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ）の葉緑体ＡＣＣａｓｅのアミノ酸配列を参照する）。除草剤抵抗性を付与することができるＨＰＰＤ変異部位としては、限定ではないが、Ｐ２７７、Ｌ３６５、Ｇ４１７、およびＧ４１９が挙げられる（アミノ酸のナンバリングはイネのＨＰＰＤ酵素のアミノ酸配列を参照する）。
本発明のいくつかの実施形態では、コムギにおいて除草剤抵抗性を付与することができるＡＬＳ変異部位として、ＴａＡＬＳ Ｐ１７３が挙げられる。いくつかの実施形態では、トウモロコシにおいて除草剤抵抗性を付与することができるＡＬＳ変異部位として、ＺｍＡＬＳ Ｐ１６５が挙げられる。いくつかの実施形態では、イネにおいて除草剤抵抗性を付与することができるＡＬＳ変異部位として、ＯｓＡＬＳ Ｐ１７１が挙げられる。
かわりに、選択マーカー遺伝子は、適切に修飾されると目視観測できる形質変化を植物に産生させる、葉舌、葉色、葉蝋を制御する遺伝子などであってもよく、限定ではないがＬＩＧ、ＰＤＳ、ｚｂ７、およびＧＬ２が挙げられる。
従来の植物改変法（トランスジェニック法）では、効率を上げるために、植物の再生時に特定の選択圧を加えることを要する（たとえば、使用される導入遺伝子ベクターに応じて異なる抗菌剤を用いた選抜）。しかし、それによって外来遺伝子、特に抗菌剤抵抗性遺伝子が植物ゲノムに組み込まれ、安全面の問題をはらむことになる。
本ゲノム編集技術を植物改変に用いることで、本ゲノム編集系は標的の遺伝子修飾を植物ゲノムに組み込むことなく実現することができる。したがって、本発明の方法では、ステップｄ）の再生は、好ましくは選択圧なしで実施される。こうして外来遺伝子の組込みを回避し、遺伝子改変された（遺伝子編集された）トランスジェニック植物が得られる。しかし、選択圧なしで植物を再生させると、選抜効率が大きく低下してしまう。
この問題は、本発明では、関心対象の遺伝子を標的とするゲノム編集系と、内在性選択マーカー遺伝子を標的とするゲノム編集系との同時形質転換により解決される。
何ら理論にとらわれるものではないが、本発明の方法では、関心対象の遺伝子を標的とするゲノム編集系と、内在性選択マーカー遺伝子を標的とするゲノム編集系とが植物（植物細胞または組織など）に同時形質転換されると、関心対象の遺伝子および内在性選択マーカー遺伝子の編集が一緒に生じる傾向がある。したがって、内在性選択マーカー遺伝子に基づいて選択された植物は、その関心対象の遺伝子も修飾されている可能性が高い。内在性選択マーカー遺伝子編集に関する１回目の選抜は、関心対象の遺伝子編集の選抜効率を大きく向上させることになる。そして、内在性選択マーカー遺伝子しか用いないので、導入遺伝子の懸念は回避される。本発明では、好ましくは、内在性選択マーカー遺伝子は修飾後も関心対象の形質に影響せず、たとえば収量減少などは起きない。さらに好ましくは、内在性選択マーカー遺伝子の修飾により、植物にさらなる関心対象の形質、たとえば除草剤抵抗性が付与される。つまり、好ましくは、本発明で植物の選択に利用できる形質は、除草剤抵抗性などの農学的にも有用な形質である。
ステップｅ）の選択を実施する方法は、選択マーカー遺伝子の性質による。たとえば、選択マーカー遺伝子が、植物に除草剤抵抗性を付与するように修飾される場合、再生された植物を、野生型選択マーカー遺伝子を有する植物が生存できないか発育不良になるような好適な濃度に置くことができる。そして、この除草剤濃度で生存するか良好に発育する植物が選択される。
ステップｆ）の特定は、たとえばＰＣＲ／ＲＥ、またはシーケンシング法により実施することができる。当業者であれば、遺伝子が変異したか否かをいかにして特定するか熟知している。
本発明の植物（細胞または組織）を形質転換する好適な方法としては、限定ではないが、微粒子銃、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換が挙げられる。
本発明は、植物ゲノムの正確な編集ができるのであれば、特に特異的ゲノム編集系に限定しない。たとえば、本発明での使用に適したゲノム編集系としては、限定ではないが、精密塩基エディター（ＰＢＥ）系、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆｌ系、ＣＲＩＳＰＲｉ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、およびＴＡＬＥＮ系が挙げられる。関心対象の遺伝子および内在性選択マーカー遺伝子を標的化する好適なゲノム編集系の選定および設計は、当業者の技術範囲内である。
ＣＲＩＳＰＲ系は、細菌が進化する過程で生産するようになった、外来遺伝子の侵入に対する防御系である。それが改変され、真核生物のゲノム編集で広く用いられている。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系とは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づいたゲノムＣＲＩＳＰＲ編集系を指す。「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」と「Ｃａｓ９」は本明細書では交換可能に使用され、Ｃａｓ９タンパク質またはそのフラグメント（たとえば、Ｃａｓ９の活性ＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含む、ＲＮＡに案内されるヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は原核生物免疫系ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの構成要素であり、ガイドＲＮＡに案内されてＤＮＡ標的配列を標的として切断してＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することができる。本発明での使用に適したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系としては、限定ではないが、Ｓｈａｎ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０１３） ３１， ６８６−６８８に記載のものが挙げられる。
「ガイドＲＮＡ」と「ｇＲＮＡ」は本明細書では交換可能に使用され、一般に、部分相補性により複合体を形成するｃｒＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子とで構成され、ここでｃｒＲＮＡは、標的配列とハイブリダイゼーションするのに十分相補性の配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）を導いて該標的配列に特異的に結合させる。しかし当技術分野では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ両方の特徴をもつシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も設計できることが公知である。
本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、以下のうちの１つを含む場合がある：
ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｉｖ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；または
ｖ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼに基づいたＣＲＩＳＰＲゲノム編集系である。Ｃｐｆ１とＣａｓ９の違いは、Ｃｐｆ１タンパク質のほうが分子量が小さく、またｃｒＲＮＡだけがガイドＲＮＡとして必要とされるほか、ＰＡＭ配列も異なっている。本発明での使用に適したＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系としては、限定ではないが、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１７に記載の系が挙げられる。
本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆｌ系は、以下のうちの１つを含む場合がある：
ｉ）Ｃｐｆ１タンパク質、およびガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
ｉｉ）Ｃｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉｉ）Ｃｐｆ１タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｉｖ）Ｃｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；または
ｖ）Ｃｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト。
ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質を用いるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系由来の遺伝子サイレンシング系である。この系は標的遺伝子の配列を変えることはないが、本明細書ではこの系もゲノム編集系として定義する。本発明での使用に適したＣＲＩＳＰＲｉ系としては、限定ではないが、Ｓｅｔｈ ａｎｄ Ｈａｒｉｓｈ， ２０１６に記載の系が挙げられる。
本発明のＣＲＩＳＰＲｉ系は、以下のうちの１つを含む場合がある：
ｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｉｖ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；または
ｖ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト。
精密塩基エディター系は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づいて最近開発された系であり、Ｃａｓ９タンパク質とシチジンデアミナーゼとのヌクレアーゼ不活性化融合タンパク質を用いて、正確にゲノムの１塩基編集ができる。（ＤＮＡ切断ドメインのＨＮＨサブドメインおよび／またはＲｕｖＣサブドメインの変異による）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合能力を保持しており、シチジンデアミナーゼがＤＮＡ上のシチジン（Ｃ）の脱アミノ化を触媒してウラシル（Ｕ）を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、シチジンデアミナーゼと融合される。ガイドＲＮＡに案内されて、該融合タンパク質は、植物ゲノムの標的配列を標的化することができる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性がないので、ＤＮＡ二本鎖は切断されない。融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の形成で生産された一本鎖ＤＮＡのシチジンをＵに変換し、ＣからＴの置換が塩基ミスマッチ修復により得られる。本発明での使用に適した精密塩基エディター系としては、限定ではないが、Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１７に記載の系が挙げられる。
本発明の精密塩基エディター系は、以下のうちの１つを含む場合がある：
ｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡ；
ｉｉｉ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｉｖ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；または
ｖ）ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質とシチジンデアミナーゼの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＳｐＣａｓ９）と比べてアミノ酸置換Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａを含む。シチジンデアミナーゼの例としては、限定ではないが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはＣＤＡ１（ＰｍＣＤＡ１）が挙げられる。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）」は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとを融合させて調製された人工制限酵素である。１つのＺＦＮのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは一般に３〜６の個別のジンクフィンガーリピートを含み、各ジンクフィンガーリピートがたとえば３ｂｐを認識する。本発明での使用に適したＺＦＮ系は、たとえばＳｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００９およびＴｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００９から得ることができる。
「トランスアクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）」は、特定のＤＮＡ配列を切断するように工学することができる制限酵素であり、ふつう転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメインと、ＤＮＡ切断ドメインとを融合させて調製される。ＴＡＬＥは、たいていの所望のＤＮＡ配列に結合するように工学することができる。本発明での使用に適したＴＡＬＥＮ系は、たとえばＬｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２から得ることができる。
当業者であれば、本発明の方法の第１のゲノム編集系と第２のゲノム編集系の組み合わせを、異なるゲノム編集系それぞれの特徴により、また実現すべき所望の特定のタイプのゲノム編集により、適切に決定することができ、たとえば、互いの干渉、たとえば同じｇＲＮＡを共有することができる異なる系同士の干渉を避けるための好適な組み合わせを選択することができる。
たとえば、選択形質を作成するのに、内在性選択マーカー遺伝子が精密変異のために１塩基編集系を必要とする場合、関心対象の遺伝子の標的化に通常はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いないが、それはこの２つの系が同じｇＲＮＡを共有することができるので、関心対象の遺伝子をノックアウトするＣａｓ９が内在性選択マーカー遺伝子もノックアウトする可能性があるからである（その逆もあり）。
本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態では、第１のゲノム編集系と第２のゲノム編集系は、どちらも精密塩基エディター系である。
本発明のいくつかの実施形態では、第１のゲノム編集系および第２のゲノム編集系の構成要素は、同じ発現コンストラクトにより発現させても異なる発現コンストラクトにより発現させてもよく、当業者が適宜選択することができる。たとえば、関心対象の遺伝子および選択マーカー遺伝子のガイドＲＮＡは、同じ発現コンストラクトを用いて転写されてもよい。好ましくは、第１のゲノム編集系および第２のゲノム編集系の構成要素を、同じ発現コンストラクトにより発現させる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、第１のゲノム編集系および第２のゲノム編集系はどちらも精密塩基エディター系であって、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質とシチジンデアミナーゼと関心対象の遺伝子および選択マーカー遺伝子のガイドＲＮＡとの融合タンパク質が、同じ発現コンストラクトにより発現させられる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、植物は単子葉または双子葉である。たとえば、植物は、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より、または前述の植物の１つに属するあらゆる変種もしくは亜種から選択される。いくつかの実施形態では、植物は作物植物である。
本発明のいくつかの実施形態では、方法は、さらに、遺伝子改変され導入遺伝子を含まない植物の子孫を得ることを含む。
別の態様では、本発明はまた、遺伝子改変植物またはその子孫もしくはその一部を提供し、該植物は本発明の上記の方法により得られる。
別の態様では、本発明はまた、本発明の上記の方法により得られた第１の遺伝子改変植物を、該遺伝子改変を含まない第２の植物と交配させ、そうすることで該遺伝子改変を該第２の植物に導入することを含む、植物育種法を提供する。
植物の修飾すべき関心対象の遺伝子と内在性選択マーカー遺伝子とを同時に標的化することにより、遺伝子改変され導入遺伝子を含まない植物の選抜効率が大きく向上し得る。本発明の方法により、導入遺伝子を含まない変異体の選抜効率は、１％未満の変異率を有する関心対象の遺伝子について約１０〜１００倍向上し得る。
送達方法：
遺伝物質を植物細胞に導入するさまざまな好適な送達技法が当業者には公知であり、たとえばプロトプラストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ． １９８５）から、電気穿孔（Ｄ´Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、微量注入（Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８７）、炭化ケイ素繊維ウィスカー技術（Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、ウイルスベクター媒介アプローチ（Ｇｅｌｖｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３， “Ｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｇｅｔｓ ａ ｂｏｏｓｔ”， ６８４−６８５ （２００５））、および微粒子銃（たとえば Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ， ５５， １−１５を参照）のような手順まで、直接的な送達技法を選択することにより導入される。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換またはウイルスベクターが媒介する植物形質転換のような生物学的アプローチに基づいた、および微粒子銃または微量注入のような物理的送達方法に基づいた形質転換方法が、関心対象の植物細胞または組織に遺伝物質を導入する屈指の技法として発展してきたが、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（“Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｉｎｔａｃｔ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＨｅｌｉｏｓＴＭ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ”， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ， ２０００， １８ （３）：２８７−２８８）は、植物細胞に物質を導入する物理的方法として微粒子銃を開示している。このように、現在、関心対象の植物細胞に遺伝子コンストラクトの形態で遺伝物質を導入するさまざまな植物形質転換法が存在しており、これには植物バイオテクノロジー分野で当業者に公知の生物学的および物理的手段が含まれ、少なくとも１つの塩基エディターおよび少なくとも１つの部位特異的エフェクターならびに少なくとも１つの塩基エディターと少なくとも１つの部位特異的エフェクターとを含む対応する複合体を導入するのに用いることができる。なお、このような形質転換および形質移入の送達方法は、本発明のツールを同時導入するのに用いることができる。一般的な生物学的手段は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．を用いた形質転換であり、多種多様な植物物質で何十年も使用されている。ウイルスベクターが媒介する植物の形質転換は、関心対象の細胞に遺伝物質を導入するさらなるストラテジーである。植物生物学で用いられ始めた物理的手段として、微粒子銃、別名微粒子銃形質移入またはマイクロ粒子媒介遺伝子移入があり、関心対象の核酸または遺伝子コンストラクトを含む被覆マイクロ粒子またはナノ粒子を標的細胞または組織に移入する物理的送達方法を指す。物理的導入手段は、核酸、すなわちＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、ならびにタンパク質の導入に適している。同様に、関心対象の核酸またはアミノ酸コンストラクトを植物細胞に特異的に導入する、電気穿孔、微量注入、ナノ粒子、および細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）などの、特異的形質転換または形質移入の方法が存在する。さらに、遺伝子コンストラクトおよび／または核酸および／またはタンパク質を導入するための化学物質ベースの形質移入方法が存在し、とりわけリン酸カルシウムを用いた形質移入、リポソーム、たとえばカチオン性リポソームを用いた形質移入、ＤＥＡＤ−デキストランまたはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを用いた形質移入、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。したがってこうした送達方法または送達ビヒクルまたはカーゴは、動物および哺乳類の細胞などのほかの真核細胞に使用される送達ツールとは本質的に異なり、どの送達方法も、ゲノム編集を媒介する関心対象のコンストラクトを完全に機能性および活性のある様式で関心対象の標的細胞の特定のコンパートメントに導入できるように、特化して微調整し最適化する必要がある。上述の送達技法を単独でまたは組み合わせて用いて、本発明の少なくとも１つの分子複合体、すなわち塩基エディター複合体および／もしくは部位特異的エフェクター複合体、または少なくとも１つのその下位構成要素、すなわち少なくとも１つのＳＳＮ、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも１つのＲＴ、もしくは少なくとも１つの塩基エディター、または本発明の前述の下位構成要素をコードする配列を、生体内または試験管内で標的細胞に挿入することができる。
本発明では物理的および化学的送達方法が特に好ましいが、それはこれらの方法が関心対象のさまざまなツールを少なくとも１つの植物細胞に同時送達すること、したがって平行導入することを可能にするからである。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、ステムループまたは最適化ステムループ構造または最適化二次構造を含む。別の実施形態では、成熟ｃｒＲＮＡが、ステムループまたは最適化ステムループ構造を直接反復配列に含み、ここでステムループまたは最適化ステムループ構造は切断活性にとって重要である。特定の実施形態では、成熟ｃｒＲＮＡは、好ましくはシングルステムループを含む。特定の実施形態では、直接反復配列は、好ましくはシングルステムループを含む。特定の実施形態では、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重構造に影響する変異の導入により修飾される。好ましい実施形態では、ステムループのＲＮＡ二重部を維持する変異が導入される場合があり、そうすることでエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。ほかの好ましい実施形態では、ステムループのＲＮＡ二重構造を破壊する変異が導入される場合があり、そうすることでエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に消失する。
なお、本発明の方法さまざまな態様の方法は、アミノ酸をコードするコード領域内の修飾としての第１および／または第２の標的化修飾に限定されない。制御配列の修飾も想定されている。エピジェネティック効果を有するあらゆる修飾もまた、本発明の方法により対処できる。
一実施形態では、修飾すべき少なくとも１つのゲノム標的配列は、プロモーターなどの制御配列の場合があり、該プロモーターの編集には、プロモーターまたはプロモーターフラグメントを別のプロモーター（置換プロモーターともいう）または別のプロモーターフラグメント（置換プロモーターフラグメントともいう）で置換することが含まれ、該プロモーター置換の結果として以下のいずれか１つ、または以下の任意の組み合わせの１つが得られる：プロモーター活性の上昇、プロモーター組織特異性の上昇、プロモーター活性の低下、プロモーター組織特異性の低下、新しいプロモーター活性、誘導可能プロモーター活性、遺伝子発現ウインドウの拡大、同じ細胞層またはほかの細胞層における遺伝子発現のタイミングまたは発生進行の改変、たとえば葯のタペータムにおける遺伝子発現のタイミングの延長、ＤＮＡ結合エレメントの変異および／またはＤＮＡ結合エレメントの欠失もしくは付加。修飾すべきプロモーター（またはプロモーターフラグメント）は、編集されている細胞に対し内在性の、人工の、既存の、またはトランスジェニックなプロモーター（またはプロモーターフラグメント）である。置換プロモーターまたはそのフラグメントは、編集されている細胞に対し内在性の、人工の、既存の、またはトランスジェニックなプロモーターまたはそのフラグメントの場合がある。
一実施形態では、少なくとも１つのゲノム標的配列は、プロモーターの場合があり、該プロモーターの編集には、ネイティブＥＰＳＰＳ１プロモーターを植物ユビキチンプロモーターで置換することが含まれる。別の実施形態では、修飾すべき少なくとも１つのゲノム標的配列はプロモーターの場合があり、編集すべき該プロモーターは、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）−ＰＥＰＣ１プロモーター（Ｋａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１ ４５： １−１５）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ユビキチンプロモーター（ＵＢＩ１ＺＭ ＰＲＯ， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９２ １８： ６７５−６８９）、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ ２， １６３−１７１， １９９０年２月）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）−ＧＯＳ２プロモーター（米国特許第６，５０４，０８３号明細書）、およびゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）オレオシンプロモーター（米国特許第８，４６６，３４１号明細書）を含む群より選択される。
一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体は、同時送達されるＲＴと組み合わせて用いることができ、それによって、導入遺伝子選択マーカーを組み入れることなく、プロモーターまたはプロモーターエレメントを関心対象のゲノムヌクレオチド配列に挿入することが可能になり、プロモーター挿入（またはプロモーターエレメント挿入）の結果として以下のいずれか１つ、または以下の任意の組み合わせの１つが得られる：プロモーター活性の上昇、すなわちプロモーター強度の上昇、プロモーター組織特異性の上昇、プロモーター活性の低下、プロモーター組織特異性の低下、新しいプロモーター活性、誘導可能プロモーター活性、遺伝子発現ウインドウの拡大、遺伝子発現のタイミングまたは発生進行の改変、ＤＮＡ結合エレメントの変異および／またはＤＮＡ結合エレメントの付加。挿入すべきプロモーターエレメントとしては、限定ではないが、プロモーターコアエレメント、たとえば限定ではないが、ＣＡＡＴボックス、ＣＣＡＡＴボックス、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス、および／またはＴＡＴＡボックス、誘導性発現のための翻訳調節配列および／またはリプレッサー系、たとえばＴＥＴオペレーターリプレッサー／オペレーター／インデューサーエレメント、またはスルホニルウレアリプレッサー／オペレーター／インデューサーエレメントがあり得る。脱水応答性エレメント（ＤＲＥ）は、乾燥応答性遺伝子ｒｄ２９Ａのプロモーターのシス作用性プロモーターエレメントとして最初に同定され、９ｂｐの保存コア配列ＴＡＣＣＧＡＣＡＴを含む（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ， Ｋ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６， ２５１−２６４）。ＤＲＥを内在性プロモーターに挿入すると、下流遺伝子の乾燥誘導性発現を付与することができる。別の例は、多くのＡＢＡおよび／またはストレス調節遺伝子に存在することがわかっている（Ｃ／Ｔ）ＡＣＧＴＧＧＣコンセンサス配列を含むＡＢＡ応答性エレメント（ＡＢＲＥ）である（Ｂｕｓｋ Ｐ． Ｋ．， Ｐａｇｅｓ Ｍ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７：４２５−４３５）。３５ＳエンハンサーまたはＭＭＶエンハンサーを内在性プロモーター領域に挿入すると、遺伝子発現が増加する（米国特許第５，１９６，５２５号明細書）。挿入すべきプロモーターまたはプロモーターエレメントは、編集されている細胞に対し内在性の、人工の、既存の、またはトランスジェニックなプロモーターまたはプロモーターエレメントの場合がある。
一実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体を用いて、限定ではないがカリフラワーモザイクウイルス３５ Ｓエンハンサーなどのエンハンサーエレメントを内在性ＦＭＴ１プロモーターの前に挿入してＦＴＭ１の発現を強化することができる。さらなる実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体を用いてＴＥＴオペレーターリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の構成要素またはスルホニルウレアリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の構成要素を植物ゲノムに挿入して、導入遺伝子選択マーカーを組み入れることなく、誘導可能な発現系を作成または制御することができる。
別の実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体を用いてプロモーターまたはプロモーターエレメントを欠失させることができ、ここでプロモーター欠失（またはプロモーターエレメント欠失）の結果として以下のいずれか１つ、または以下の任意の組み合わせの１つが得られる：恒久的に不活性化された遺伝子座位、プロモーター活性の上昇（プロモーター強度の上昇）、プロモーター組織特異性の上昇、プロモーター活性の低下、プロモーター組織特異性の低下、新しいプロモーター活性、誘導可能プロモーター活性、遺伝子発現ウインドウの拡大、遺伝子発現のタイミングまたは発生進行の改変、ＤＮＡ結合エレメントの変異および／またはＤＮＡ結合エレメントの付加。欠失させるべきプロモーターエレメントは、限定ではないが、プロモーターコアエレメント、プロモーターエンハンサーエレメント、または３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。欠失すべきプロモーターまたはプロモーターフラグメントは、編集されている細胞に対し内在性、人工、既存、またはトランスジェニックであり得る。
さらに別の実施形態では、修飾すべき関心対象の少なくとも１つのゲノム標的部位はターミネーターの場合があり、該ターミネーターの編集には、「ターミネーター交換」または「ターミネーター置換」とも呼ばれる、ターミネーターを置換ターミネーターとも呼ばれる異なるターミネーターで置換すること、またはターミネーターフラグメントを置換ターミネーターフラグメントとも呼ばれる異なるターミネーターフラグメントで置換することが含まれ、該ターミネーター置換の結果として以下のいずれか１つ、または以下の任意の組み合わせの１つが得られる：ターミネーター活性の上昇、ターミネーター組織特異性の上昇、ターミネーター活性の低下、ターミネーター組織特異性の低下、ＤＮＡ結合エレメントの変異および／またはＤＮＡ結合エレメントの欠失または付加。修飾すべきターミネーターまたはそのフラグメントは、編集されている細胞に対し内在性の、人工の、既存の、またはトランスジェニックなターミネーターであり得る。置換ターミネーターは、編集されている細胞に対し内在性の、人工の、既存の、またはトランスジェニックなターミネーターまたはそのフラグメントであり得る。
一実施形態では、修飾すべき関心対象の少なくとも１つのゲノム標的部位は、ターミネーターの場合があり、編集すべき該ターミネーターは、トウモロコシＡｒｇｏｓ ８およびＳＲＴＦ１８遺伝子のターミネーター、ならびにほかのターミネーター、たとえばジャガイモＰｉｎＩＩターミネーター、ソルガムアクチンターミネーター（国際公開第２０１３／１８４５３７号Ａ１）、イネＴ２８ターミネーター（国際公開第２０１３／０１２７２９号Ａ２）、ＡＴ−Ｔ９ ＴＥＲＭ（国際公開第２０１３／０１２７２９号Ａ２）、およびＧＺ−Ｗ６４Ａ ＴＥＲＭ（米国特許第７，０５３，２８２号明細書）を含む群より選択される。
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体は、同時送達されるＲＴ配列と組み合わせて用いることができ、それによってターミネーターまたはターミネーターエレメントを関心対象のゲノムヌクレオチド配列に挿入することが可能になり、このターミネーター（エレメント）挿入の結果として以下のいずれか１つ、または以下の任意の組み合わせの１つが得られる：ターミネーター活性の上昇、すなわちターミネーター強度の上昇、ターミネーター組織特異性の上昇、ターミネーター活性の低下、ターミネーター組織特異性の低下、ＤＮＡ結合エレメントの変異および／またはＤＮＡ結合エレメントの付加。
挿入すべきターミネーターまたはエレメントまたはそのフラグメントは、編集されている細胞に対し内在性の、人工の、既存の、またはトランスジェニックなターミネーター（またはターミネーターエレメント）であり得る。
さらに別の実施形態では、少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体を用いてターミネーターまたはターミネーターエレメントを欠失させることができ、ここでターミネーター欠失（またはターミネーターエレメント欠失）の結果として以下のいずれか１つ、または以下の任意の組み合わせの１つが得られる：ターミネーター活性の上昇（ターミネーター強度の上昇）、ターミネーター組織特異性の上昇、ターミネーター活性の低下、ターミネーター組織特異性の低下、ＤＮＡ結合エレメントの変異および／またはＤＮＡ結合エレメントの付加。欠失すべきターミネーターまたはターミネーターフラグメントは、編集されている細胞に対し内在性、人工、既存、またはトランスジェニックであり得る。
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの部位特異的エフェクター複合体を用いて、導入遺伝子選択マーカーを組み入れることなく、細胞のゲノムの制御配列を改変または置換することができる。制御配列は、生物内で特定の遺伝子の発現を増加または低下させることができる、かつ／または生物内で遺伝子の組織特異的発現を改変することができる、核酸分子のセグメントである。制御配列の例としては、限定ではないが、３’ＵＴＲ（非翻訳領域）領域、５’ＵＴＲ領域、転写アクチベーター、転写エンハンサー、転写リプレッサー、翻訳リプレッサー、スプライシング因子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ、プロモーターエレメント、ＣＡＭＶ ３５ Ｓエンハンサー、ＭＭＶエンハンサーエレメント、ＳＥＣＩＳエレメント、ポリアデニル化シグナル、およびポリユビキチン化部位が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１つの標的化修飾、または調節エレメントの置換の形態の編集の結果として、改変されたタンパク質翻訳、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシング、転写終了または翻訳後修飾が得られる。一実施形態では、調節エレメントをプロモーター内で特定することができ、そしてこれらの調節エレメントを編集または修飾して、プロモーターのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのために最適化することができる。
一実施形態では、修飾すべき関心対象の少なくとも１つのゲノム標的部位はポリユビキチン化部位であり、ポリユビキチン化部位の修飾の結果、タンパク質の分解速度が変わる。ユビキチンタグは、タンパク質をプロテアゾームまたは自食作用により分解させる。プロテアゾーム阻害剤がタンパク質過剰生産を招くことは公知である。関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に対する修飾の結果、関心対象のタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を修飾することができ、この修飾によりタンパク質のポリユビキチン化（翻訳後修飾）が可能になり、タンパク質分解の改変が得られる。
さらなる実施形態では、修飾すべき関心対象の少なくとも１つのゲノム標的部位は、トウモロコシＥＰＳＰＳ遺伝子のポリユビキチン化部位であり、ポリユビキチン化部位が修飾されると、ＥＰＳＰＳのタンパク質分解速度が遅くなるため、タンパク質含有率が高くなる。
さらなる実施形態では、修飾すべき関心対象の少なくとも１つのゲノム標的部位はイントロン部位であり、該修飾はイントロン増強モチーフをイントロンに挿入することからなり、その結果として該イントロンを含む遺伝子の転写活性が調節される。
次に、本発明を以下の実施例により説明するが、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
実施例
実施例１：次世代シーケンシングによる塩基編集の検証
前述の標的に対する、ニッカーゼと結合した塩基エディターの活性を試験するため、ＡＰＯＢＥＣ−ＸＴＥＮ−Ｃａｓ９（ニッカーゼ）−ＵＧＩ（配列番号１および配列番号２）をコードするプラスミドを標準的な方法で構築し、塩基エディターおよびｓｇＲＮＡをゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）組織由来の細胞内で一過的に発現させた。この複合体と併せて、実施例２〜６で設計したｇＲＮＡも試験した。さらに、関心対象の標的部位に関する特異的ＰＡＭモチーフ（配列番号３〜１３および２３を参照）を定めた。
また、特定の除草剤の標的遺伝子の関連アミノ酸の変換に利用できる標的部位の範囲を広げるために、ＳａＫＫＨ−ＢＥ３およびＶＱＲ−ＢＥ３タンパク質（Ｋｏｍｏｒ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９−ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． （２０１７））をトウモロコシでの発現用にコドン最適化し、合成し、適切なｓｇＲＮＡと一緒にプラスミド内にクローン化して、同じトウモロコシ細胞系で発現させた。
塩基エディター発現プラスミドでの処理から１２〜９６時間後、細胞集団から全ゲノムＤＮＡを抽出し、標的化ディープシーケンシングに供して、標的における塩基変換の頻度およびパターンを分析した。除草剤抵抗性アミノ酸置換をもたらす変換をＡＬＳ１（特にＰ１９７、Ｓ６５３）、ＡＬＳ２（特にＰ１９７、Ｓ６５３）、およびＰＰＯ（特にＣ２１５、Ａ２２０、Ｇ２２１、Ｎ４２５、Ｙ４２６）遺伝子において作成する能力を評価した。
実施例２：塩基編集構成要素の形質転換およびスルホニルウレアまたはイミダゾリノンに対する選択
この文書に記載の方法により除草剤抵抗性を付与する塩基編集の実現可能性を示すため、実施例１に記載の塩基エディター、および実施例１でＮＧＳにより検証したトウモロコシＡＬＳ１、ＡＬＳ２遺伝子を標的とするいくつかの特別設計のｇＲＮＡを、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の組織に形質転換させ、（Ｐ１９７またはＳ６５３置換は）スルホニルウレア、または（Ｓ６５３置換は）イミダゾリノンを含有する選択培地上で再生させた。除草剤抵抗性植物は、塩基エディターの作用により塩基変換されているはずであり、その結果、どの塩基エディターが送達されたかによって、１９７番目のプロリンまたは６５３番目のセリンが置換されたはずである。塩基変換事象を検証するため、除草剤抵抗性植物のＡＬＳ遺伝子を相補性除草剤を用いて選択し、分子的技法により分析した。
実施例３：塩基エディターの作用により除草剤抵抗性を同時選択して非結合座位の非選択修飾の頻度を高める
遺伝子編集事象により植物を単離する、導入遺伝子を用いない選択が、ゲノム工学において好適かつ端的なツールとなることを示すために、実施例２に記載の方法論を部位特異的ヌクレアーゼの同時送達と組み合わせて、同一細胞内で除草剤遺伝子の塩基変換と関心対象の遺伝子の標的化修飾とを同時に平行して発生させた。同じプラスミドまたは第２のプラスミドに、ｓｇＲＮＡおよび任意選択により修復鋳型と一緒にヌクレアーゼをコードさせて、塩基エディターの作用により塩基変換が生じている同じ細胞内に標的化修飾を作成する。後の段階で、実施例２に記載したように、植物を除草剤選択下で再生させることができ、そして分子的およびほかの適切な技法により関心対象の遺伝子の標的化修飾について選抜することができるが、除草剤選択により、少なくとも１つの第２の修飾、すなわち修飾すべき関心対象の遺伝子である第２のゲノム座位の少なくとも１つの標的化修飾について選抜すべき細胞の数を大幅に低下させることができる。
実施例４：機能性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１塩基エディターの設計および塩基編集ウインドウの定義
この例では、第２のＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃｐｆ１を用いて塩基エディター複合体をゲノム標的に送達した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１もそのＤＮＡ標的に結合するときＲループ様構造を形成し、一本鎖として塩基変換に使える非標的鎖を生成する。しかし、Ｃｐｆ１由来塩基エディターによる塩基変換ウインドウの正確な位置がわからないので、標的のＰＡＭ配列に対する塩基変換パターンを分析する必要がある。塩基変換ウインドウは、実施例１に記載のトウモロコシゲノムのＧＣリッチ配列を標的とするＣｐｆ１ベースのエディターの送達後、細胞集団におけるそれらの配列に対する標的化ＮＧＳにより定義することができる。ほかの標的植物については、このストラテジーを植物に応じて改造することができる。
実施例５：ＰＰＯ遺伝子の１ヌクレオチド欠失を用いて、修復鋳型または相同組換えなしに、選択修飾を生産する
アマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＯ遺伝子の２１０番目のグリシンの１アミノ酸欠失が、この雑草にＰＰＯ阻害除草剤に対する抵抗性を与えている（Ｐａｔｚｏｌｄｔ， Ｗ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００６）． “Ａ ｃｏｄｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ” ＰＮＡＳ １０３（３３）：１２３２９−１２３３４）。このアイソフォームはＰＰＸ２Ｌとも呼ばれる。これに相当するニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のアミノ酸はＰＰＯ２遺伝子の１７８番目のグリシンである。ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）では、相当するアミノ酸はアラニンであるが、周辺残基が高度に保存されているので、なおも機能性活性部位を構成し得、それがアラニン欠失により抵抗性となる。
この実施例では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などの部位指定ヌクレアーゼを適切なｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと併用して、このアミノ酸のコドンの近くに二本鎖切断を作成することができる。活性ＰＰＯ酵素を保存するが除草剤の結合を阻害する３塩基欠失の結果、除草剤抵抗性植物が得られる。このように、この選択修飾は、修復鋳型または相同組換えを用いることなく作成することができるので、トランスジェニックマーカーを用いないストラテジーを提供する。
実施例６：さらなる用途
上記実施例１〜３でＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９について説明した用途とともに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＣａｓＸ、ＣａｓＹ、およびＣｐｆ１を用いたさらなる例が考えられる。また、実施例１に記載のＣａｓ９と結合させた塩基エディターまたは実施例４に記載のＣｐｆ１と結合させた塩基エディターを用いて早期終止コドンを選択遺伝子標的または植物の選抜用表現型マーカーに導入する。具体例として、表現型遺伝子（たとえば、多くの光沢遺伝子、ゴールデンほか）の終止コドンを挙げることができる。
除草剤抵抗性に基づく選択のさらなる標的としては、前述したＰＰＯ、ＡＬＳ、およびＥＰＳＰＳ遺伝子におけるほかのアミノ酸欠失、早期終止コドンの導入、またはアミノ酸変換も挙げられる。ＰＰＯ遺伝子の塩基編集に好適なｇＲＮＡプロトスペーサー配列を提供する（配列番号７〜１３参照）。
さらに、ａＣａｓＸと結合させた塩基編集複合体の配列（配列番号１４）、ＡｓＣｐｆ１と結合させた塩基編集複合体の配列（配列番号１５）、およびシチジンデアミナーゼＰｍＣＤＡ１を、Ｃａｓ９と結合させた塩基編集複合体に組み入れる配列（配列番号１６）も提供する。
最適化については、そして特にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合させた塩基編集複合体の新規の設計については、以下の構成要素の任意の順および組み合わせを用いることができる：ｎｉＣａｓ９（Ｄ１０Ａ；配列番号１７）、ＣａｓＸ（配列番号１８）、ｎｉＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ；配列番号１９）、ＡＰＯＢＥＣ１（配列番号２０）、ＵＧＩ（配列番号２１）、ＰｍＣＤＡ１（配列番号２２）、ならびにリンカー、たとえばＸＴＥＮリンカー、および関心対象のゲノム部位に応じて核局在化シグナルまたはほかの小器官標的化シグナル、あるいは前述の構成要素の任意の組み合わせ。
実施例７：イネ変異植物の選抜
Ｙｕａｎ Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｚｏｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｃｉｓｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｒｉｃｅ， ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｗｉｔｈ ａ Ｃａｓ９−ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．３８１１）にしたがい、ＯｓＡＬＳ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＡＹ８８５６７４．１）の２つの異なる部位（Ｓ１およびＳ２）を同時に標的化するベクターｐＨ−ｎＣａｓ９−ＰＢＥ−ＯｓＡＬＳ−Ｓ１／Ｓ２を、ｐＨ−ｎＣａｓ９−ＰＢＥに基づいて構築した。ＯｓＡＬＳのＳ１部位を除草剤選択部位として用いた。Ｓ１座位が変異すると、植物はニコスルフロンなどの除草剤に対する抵抗性を得る（Ｔｒａｎｅｌ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， ２００２）。本実験のｓｇＲＮＡ標的配列を表１に示す。
表１．イネｓｇＲＮＡ標的配列
Figure 2020518253
 下線部はＰＡＭ。
ｐＨ−ｎＣａｓ９−ＰＢＥ−ＯｓＡＬＳ−Ｓ１／Ｓ２バイナリーベクターを電気穿孔によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１内へ形質転換させた。Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｈａｎ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１， ６８６−６８８ （２０１３））にしたがい、イネ品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、組織培養、および再生を実施した。組織培養のあいだ、ハイグロマイシン選択（５０μｇ／ｍｌ）を用いた。（本実験は概念を証明するものなので、まずはハイグロマイシンを用いて、次にニコスルフロンを用いて植物を選択した。目的は、まずはトランスジェニック植物を得ること、そして除草剤抵抗性について選抜することであった。）イネ植物の再生後、１０再生苗を、野生型植物ならば生存できない０．００６５ＰＰＭのニコスルフロンを含有する選択培地で栽培した。１４日後、４苗が生存していた。この４苗からＤＮＡを抽出した。ＡＬＳ遺伝子をＰＣＲで増幅し、変異体の遺伝子型の配列を決定した。結果によると、４苗のすべてがＳ２座位に塩基変異を有しており、これらの除草剤抵抗性植物のＳ２部位の変異率は１００％（４／４）であった。変異パターンを図２Ａに示す。
実施例８：コムギ変異植物の選抜
Ｙｕａｎ Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｚｏｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｃｉｓｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｒｉｃｅ， ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｗｉｔｈ ａ Ｃａｓ９−ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｂｔ．３８１１）にしたがい、ｐＴａＵ６に基づき以下のコンストラクトを調製した。
１）ＢゲノムのＴａＡＬＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＹ２１０４０６）のＳ２部位を標的とするｐＴａＵ６−ＴａＡＬＳ−Ｓ２、
２）ＢゲノムおよびＤゲノムのＴａＡＣＣａｓｅ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＥＵ６６０９０１およびＥＵ６６０９０２）の１つの部位を標的とするｐＴａＵ６−ＴａＡＣＣａｓｅ、
３）ＴａＡＬＳ遺伝子の２つの部位を平行して標的化するｐＴａＵ６−ＴａＡＬＳ−Ｓ１／Ｓ２、および
４）ＴａＡＬＳ遺伝子とＴａＡＣＣａｓｅ遺伝子とを平行して標的化するｐＴａＵ６−ＴａＡＬＳ−Ｓ１／ＴａＡＣＣａｓｅ。
ＴａＡＬＳ Ｓ１部位を除草剤選択部位として用いた。この部位が変異すれば、植物は除草剤（ニコスルフロンなど）抵抗性を得るが、ＴａＡＬＳ Ｓ２部位の変異だけでは抵抗性を付与しない（Ｔｒａｎｅｌ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ， ２００２）。本実験で用いたｓｇＲＮＡ標的配列を表２に示す。
表２．コムギｓｇＲＮＡ標的配列
Figure 2020518253
 下線部はＰＡＭ。
形質転換についての以前の記述（Ｚｈａｎｇ， Ｋ．， Ｌｉｕ， Ｊ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｙａｎｇ， Ｚ． ＆ Ｇａｏ， Ｃ． Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｅｌｉｔｅ ｗｈｅａｔ （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．） ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ４２， ３９−４２ （２０１５））にしたがい、プラスミドＤＮＡ（ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥおよびｐＴａＵ６ベクターシリーズの等量の混合）をＫｏｎｕｎ １９９の幼胚への撃込みに用いた。撃込み後、該文献にしたがい胚を処理し、また組織培養の際に選択因子は用いなかった。
ＢゲノムのＴａＡＬＳ遺伝子のＳ２部位の標的化のみで得たコムギ植物を３〜４植物ごとに１試料としてプールして、ＰＣＲ／ＲＥで変異を検出した。２５８試料（個々の植物の数としては、およそ１０００）をＰＣＲ／ＲＥで検出したが、変異は検出されなかった。
ＴａＡＣＣａｓｅ遺伝子の部位の標的化のみで得たコムギ植物を３〜４植物ごとに１試料としてプールして、サンガーシーケンシングに供した。６４試料（個々の植物の数としては、約２５６）の配列決定を行ったが、変異は検出されなかった。
ＴａＡＬＳ遺伝子Ｓ１およびＳ２部位を平行して標的化して得たコムギ植物（植物数はおよそ８００）を、まずは（野生型植物ならば生存できない）０．１３ＰＰＭのニコスルフロンを含有する選択培地で栽培した。３０日後、１２苗が生存しており、そのうち９苗がＴａＡＬＳ−Ｓ２部位に塩基変異を有していた。ニコスルフロン選択培地を用いたＡＬＳ−Ｓ２部位変異植物の選択効率は、７５％（９／１２）であった。５つの変異体の変異タイプを図２Ｂに示す。
ＴａＡＬＳおよびＴａＡＣＣａｓｅ遺伝子を平行して標的化して得たコムギ植物（植物数は約８００）を０．１３ＰＰＭのニコスルフロンを含有する選択培地で栽培した。３０日後、９苗が生存しており、２つの植物がＴａＡＣＣａｓｅ部位に塩基変異を有していた。ニコスルフロン選択培地を用いたＴａＡＣＣａｓｅ部位変異植物の選択効率は、２２％（２／９）であった。ＴａＡＣＣａｓｅ部位の変異パターンを図２Ｃに示す。
実験結果によると、変異率が非常に低い標的遺伝子（たとえば標的遺伝子の変異率が０．５％）について、本発明の方法は、標的変異を得る確率を１０〜１００倍高めることができる。
実施例９：ＴａＡＬＳ−Ｐ１７３に基づいたコムギの塩基同時編集系の開発
この試験では、コムギ形質転換の際にＴａＡＬＳ−Ｐ１７３に対応するｓｇＲＮＡ部位を用いて除草剤選択系を確立した。ＰｎＣａｓ９−ＰＢＥおよびＴａＡＬＳ−Ｐ１７３−ｓｇＲＮＡのコンストラクトを微粒子銃を用いて６４０個のパンコムギ品種Ｋｅｎｏｎｇ １９９の未成熟胚細胞に送達した。苗（高さ２〜３ｃｍ）の再生後、ＰＣＲ制限酵素消化アッセイ（ＰＣＲ−ＲＥアッセイ）を用いて変異頻度を分析した。同時に、同じ苗を０．２７ｐｐｍのニコスルフロンを含有する培地に移した（図３）。除草剤含有培地で３週間栽培した後、ＰＣＲ−ＲＥアッセイで特定した１４変異苗（２．１％）のうち１０苗（１．５６％）が抵抗性を示したが、３つのセンシティブ変異体には一切アミノ酸置換が含まれなかった（表３）。
表３
Figure 2020518253
 ＳＭ：サイレント変異、Ｓ：センシティブ、Ｒ：抵抗性、ホモ：ホモ接合性、ヘテロ：ヘテロ接合性。
これらの結果により、ＴａＡＬＳ−Ｐ１７３置換が除草剤含有培地から識別できることが確認された。発明者らは次に、この部位がほかのゲノム編集事象の選択にも使用可能かどうか試験した。そこで３つのほかの部位（ＴａＡＬＳ−Ａ９８、ＴａＡＬＳ−Ａ１８１、ならびにＴａＡＣＣａｓｅ−Ａ２００４）をそれぞれＴａＡＬＳ−Ｐ１７３と組み合わせた。選択効率を評価するために、ＴａＡＬＳ−Ｐ１７３部位標的化系を同時撃込みした再生苗をニコスルフロン含有培地に置き、生存苗を遺伝子型決定に供した。標的変異体は、３部位の全て（表４）で最大７８％の選択効率で検出された。部位ＴａＡＬＳ−Ａ１８１およびＴａＡＣＣａｓｅ−Ａ２００４では、選択効率は比較的低かった（約２５％）が、それはＧＣコンテキストではデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１の変換能力が低かったためと考えられる。
ＧＣコンテキストを有する部位での選択効率を高めるために、ＡＰＯＢＥＣ１とは異なる配列嗜好性をもつ別のデアミナーゼ、ＰｍＣＤＡ１で、ＡＰＯＢＥＣ１を置換した。新たに作製した塩基エディターｐＰｍＣＤＡ１−ＰＢＥ、ＴａＡＣＣａｓｅ−Ａ２００４−ｓｇＲＮＡ、およびＴａＡＬＳ−Ｐ１７３−ｓｇＲＮＡのコンストラクトを６４０個の未成熟胚細胞に微粒子銃を用いて送達した。２生存苗が両方とも（１００％）、標的部位ＴａＡＣＣａｓｅ−Ａ２００４に変異アレルを含んでいた（表４）。
表４
Figure 2020518253
実施例１０：ＺｍＡＬＳ−Ｐ１６５に基づいたトウモロコシの塩基同時編集系の開発
トウモロコシの同時編集系を確立するために、アセト乳酸シンターゼ部位に対応するＴａＡＬＳ−Ｐ１７３を標的化して除草剤抵抗性を試験した。ＺｍＡＬＳ２の１アレル編集により植物に除草剤抵抗性を付与できることが報告されている（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ， ２０１６）。そこでＺｍＡＬＳ−Ｐ１６５を標的とするバイナリーベクターを未成熟胚に形質転換させた（ＺｍＡＬＳ１でもＺｍＡＬＳ２でも、ＺｍＡＬＳ−Ｐ１６５部位は保存された）。再生植物から３つの独立した変異体が得られ、それらの遺伝子型は同じであった。ＣからＴへの置換を含む２つのＺｍＡＬＳ１アレルおよび１つのＺｍＡＬＳ２アレルが、１６５番目のプロリンからロイシンへの１アミノ酸残基の変更をもたらした。ＺｍＡＬＳ２にヘテロ接合Ｐ１６５Ｌ置換を有する１つの変異植物が、メソスルフロン−メチルというスルホニルウレア分類の除草剤に対し抵抗性を示した（図４）。
ＺｍＡＬＳ−Ｐ１６５部位が選択マーカーの役割を良好に果たし得ることを確認した後、ほかの２つの部位、ＺｍＡｃｃａｓｅ Ａ２００４およびＺｍＳｂｅ２ Ｓｔｏｐをそれぞれこの選択部位と組み合わせた。形質転換には微粒子銃とアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介送達の両方を用いた。ＺｍＡｃｃａｓｅ Ａ２００４部位はＧＣコンテキスト内だったので、ＡＰＯＢＥＣ１に替えてＰｍＣＤＡ１を用いた。
微粒子銃送達による選択効率を評価するため、撃ち込んだカルスならびにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で形質転換した未成熟胚をメソスルフロン−メチル含有培地に置いた。生存苗は標的部位変異を示した。
実施例１１：ＯｓＡＬＳ−Ｐ１７１に基づいたイネの塩基同時編集系の開発
イネの塩基同時編集系を構築するために、アセト乳酸シンターゼ部位に対応するＴａＡＬＳ−Ｐ１７３を標的化して除草剤抵抗性を試験した。１アレル編集により植物に除草剤抵抗性を付与できることが報告されている（Ｋａｗａｉ， Ｋ．， Ｋａｋｕ， Ｋ．， Ｉｚａｗａ， Ｎ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｍ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｈ．， ＆ Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｔ． （２００８）． Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３（２）， １２８−１３７）。そこでＯｓＡＬＳ−Ｐ１７１を標的とするバイナリーベクターを未成熟胚に形質転換させた。再生植物から変異体を得た。
ＯｓＡＬＳ−Ｐ１７１部位が選択マーカーの役割を良好に果たし得ることを確認した後、ほかの３つの部位、ＯｓＡｃｃａｓｅ Ｗ２１２５、ＯｓＢＤＡＨ２ ＳｔｏｐおよびＯｓＳｂｅ２ Ｓｔｏｐをそれぞれこの選択部位と組み合わせた。形質転換には微粒子銃とアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介送達の両方を用いた。生存苗は標的部位変異を示した。
実施例１２：ＺｍＡＬＳ−Ｐ１９７またはＺｍＡＬＳ−Ｇ６５４に基づいたトウモロコシの塩基同時編集系の開発
１．塩基エディターにより作成された除草剤抵抗性を付与するアミノ酸変換の発生
イミダゾリノンおよびスルホニルウレアのような除草剤群に抵抗性のある雑草に見られるアミノ酸に変換するため、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の標的アミノ酸を選定した。図５の緑色の矢印は、所望の変換を得るためのコード鎖または非コード鎖へのガイド配列である。注記：本実施例でナンバリングしたアミノ酸残基の座標は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の典型的なＡＬＳ遺伝子を基準としている。トウモロコシおよびコムギのペプチド配列では、これらの残基の位置は多少異なる。
２．トウモロコシＡＬＳの除草剤センシティブＰ１９７コドンを、塩基エディターにより効率よく編集することができる
全実験をトウモロコシのプロトプラスト系で実施した。ｓｇＲＮＡのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター：Ｐ１９７座位のＡＬＳ１遺伝子（図６の左上のグラフ）およびＧ６５４座位のＡＬＳ２遺伝子（図６の右上のグラフ）を修飾するためにガイドを作製した。塩基エディター系は、シングルベクター系であり、この場合はｐＵｂｉ１駆動塩基エディターおよびＺｍＵ３駆動ガイドＲＮＡを含む。上に示す結果は、ＡＬＳ１およびＡＬＳ２両方について、ガイドＲＮＡのＣごとに計算し、そして陰性対照のバックグラウンドを引いた、ＣからＴへの変換頻度（％）である。ここで示す頻度は、同一細胞内でＰ１９７コドンのＣが片方だけまたは両方とも変更されたかどうかは特定しない。Ｇ６５４座位でも変更は明白であったが、程度は前者ほどではなかった。
３．除草剤センシティブ残基は、処理細胞の最大６％の頻度で除草剤抵抗性に変換される（図７）。
図６に示すデータの別の分析法は、所望のアミノ酸コドンの変換を示すリード数の計測である。最終％データをプロトプラストの形質転換効率に関し正規化した。
上のパネル：ＡＬＳ１およびＡＬＳ２座位の両方でプロリン１９７がロイシンまたはセリンに変換されているリード％を示す。これはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを用いた実験のデータである。
真ん中のパネル：ＡＬＳ１およびＡＬＳ２座位の両方でプロリン１９７がロイシンまたはセリンに変換されているリード％を示す。これはＰｏｌ ＩＩプロモーターおよびｓｇＲＮＡのリボザイム送達ストラテジーを用いた実験のデータである。
下のパネル：ＡＬＳ１およびＡＬＳ２座位の両方でグリシン６５４がアスパラギン酸に変換されているリード％を示す。これはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターおよびｓｇＲＮＡのリボザイム送達ストラテジーを用いた実験のデータである。

Claims (93)

  1. 少なくとも１つの改変植物細胞、または前記少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法であって、
    ａ．改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾を導入することであって、前記少なくとも１つの標的化塩基修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；
    ｂ．前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾は、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を前記第２の植物ゲノム標的部位に作成する少なくとも１つの部位特異的エフェクターを用いて導入され、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾は、前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または前記少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および
    ｃ．
    ｉ．前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾により前記第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた前記少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに
    ｉｉ．前記第２の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、
    少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること
    を含む、方法。
  2. ステップｂが、前記少なくとも第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型を導入することをさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つの第１の標的化修飾および前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得るステップであって、任意選択により、前記関心対象の遺伝子型は、前記少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、さらなるステップｄ
    を含む、請求項１記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、少なくとも１つの塩基編集複合体に一時的または恒久的に結合しており、前記塩基編集複合体は、ステップａの前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾を媒介する、請求項１記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントを含む制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、または塩基エディター、あるいは前述のエフェクターのあらゆるバリアントまたは触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される、請求項１記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼであり、前記ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、前記少なくとも１つの塩基編集複合体を導く部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列は、
    ａ．ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９、ＶＱＲ−Ｃａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９、
    ｂ．ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１を含む、Ｃｐｆ１、
    ｃ．ＣａｓＸ、および
    ｄ．ＣａｓＹ、
    ならびに前述したＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意のバリアントおよび誘導体を含む群より選択され、好ましくは前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、それぞれの野生型配列と比べて変異を含み、したがって得られたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮＡニッカーゼに、または全ＤＮＡ切断能力を失ったＤＮＡ結合エフェクターに変換されている、請求項１記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾が、少なくとも１つの塩基エディターを構成要素として含む少なくとも１つの塩基編集複合体により作成される、請求項１記載の方法。
  8. 前記塩基編集複合体が、少なくとも１つのシチジンデアミナーゼ、またはその触媒活性フラグメントを含む、請求項７記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾が、ヌクレオチドＣ、Ａ、Ｔ、またはＧのいずれかの、任意のほかのヌクレオチドへの変換である、請求項７記載の方法。
  10. 前記塩基編集複合体がＡＰＯＢＥＣ１構成要素を含む、請求項７記載の方法。
  11. 前記塩基編集複合体がＵＧＩ構成要素を含み、かつ／または前記塩基編集複合体がＸＴＥＮ構成要素を含む、請求項７記載の方法。
  12. 前記塩基編集複合体がＰｍＣＤＡ１構成要素を含む、請求項７記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つの塩基編集複合体が２つ以上の構成要素を含み、前記少なくとも２つの構成要素は物理的に結合している、請求項７記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つの塩基編集複合体が２つ以上の構成要素を含み、前記少なくとも２つの構成要素は単体の構成要素として与えられる、請求項７記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの塩基編集複合体の少なくとも１つの構成要素が、前記少なくとも１つの塩基編集複合体を細胞内小器官に向けるために少なくとも１つの小器官局在化シグナルを含む、請求項７記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）である、請求項１５記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、葉緑体輸送ペプチドである、請求項１５記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、ミトコンドリア輸送ペプチドである、請求項１５記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位が、少なくとも１つの表現型選択形質をコードするゲノム標的部位であり、前記少なくとも１つの表現型選択形質は、抵抗性／耐性形質または成長優位性形質であり、前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、前記少なくとも１つの改変植物細胞、組織、もしくは植物、またはその子孫に、加えられる化合物またはトリガに対する抵抗性／耐性または成長優位性を付与する、請求項１記載の方法。
  20. 前記関心対象の少なくとも１つの表現型選択形質が、少なくとも１つの内在性遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、あるいは前記関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、少なくとも１つの導入遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、前記少なくとも１つの内在性遺伝子または前記少なくとも１つの導入遺伝子は、前記関心対象の少なくとも１つの表現型形質に前記少なくとも１つの修飾がない細胞を阻害する、損傷する、または殺す植物毒、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは前記少なくとも１つの表現型形質は、細胞分裂、成長速度、胚発生のブースターからなる群より、または非改変細胞、組織、器官、もしくは植物と比べて改変細胞、組織、器官、もしくは植物に優位性を与える別の表現型選択特性から選択される、請求項１９記載の方法。
  21. 前記少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位が、除草剤抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型選択形質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子または導入遺伝子であり、ここで除草剤抵抗性／耐性は、グリホサートを含むＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルホシネートを含むグルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、イミダゾリンまたはスルホニルウレアを含むＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）を含むＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、フィトエンデサチュラーゼステップでのカロテノイド生合成阻害剤、４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、またはほかのカロテノイド生合成標的の阻害剤を含むカロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子ダイバーターに対する抵抗性／耐性、カルバメート、トリアジン、およびトリアジノンを含む光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ジカンバ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含む合成オーキシンに対する抵抗性／耐性からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が、植物毒抵抗性／耐性形質、好ましくは除草剤抵抗性／耐性形質であり、前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、植物毒化合物、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性を付与し、前記化合物は、前記少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体、またはその子孫に加えられる外来性化合物である、請求項１９記載の方法。
  23. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位がＡＬＳである、請求項１９記載の方法。
  24. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位がＰＰＯである、請求項１９記載の方法。
  25. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位がＥＰＳＰＳ、ＡＬＳ、またはＰＰＯであり、前記ＥＰＳＰＳ、ＡＬＳ、またはＰＰＯは、少なくとも１つの対応するアミノ酸変換をもたらす少なくとも１つの核酸変換を含み、前記少なくとも１つの核酸変換は、少なくとも１つの塩基エディターにより作成される、請求項１９記載の方法。
  26. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＡ１２２をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  27. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＰ１９７をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  28. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＡ２０５をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  29. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＤ３７６をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  30. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＲ３７７をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  31. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＷ５７４をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  32. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＳ６５３をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  33. 標的化修飾が、配列番号２５のＡＬＳ基準配列と比べてＧ６５４をコードする配列に生じる、請求項２３記載の方法。
  34. 標的化修飾が、配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＣ２１５をコードする配列に生じる、請求項２４記載の方法。
  35. 標的化修飾が、配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＡ２２０をコードする配列に生じる、請求項２４記載の方法。
  36. 標的化修飾が、配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＧ２２１をコードする配列に生じる、請求項２４記載の方法。
  37. 標的化修飾が、配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＮ４２５をコードする配列に生じる、請求項２４記載の方法。
  38. 標的化修飾が、配列番号２６のＰＰＯ基準配列と比べてＹ４２６をコードする配列またはＩ４７５をコードする配列に生じる、請求項２４記載の方法。
  39. 標的化修飾が、配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＧ１０１およびＧ１４４をコードする配列に生じる、請求項２５記載の方法。
  40. 標的化修飾が、配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＧ１０１およびＡ１９２をコードする配列に生じる、請求項２５記載の方法。
  41. 標的化修飾が、配列番号２７のＥＰＳＰＳ基準配列と比べてＴ１０２およびＰ１０６をコードする配列に生じる、請求項２５記載の方法。
  42. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、または植物体の特定または単離に便利な可視表現型である、請求項１記載の方法。
  43. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が光沢表現型である、請求項４２記載の方法。
  44. 前記少なくとも１つの表現型選択形質がゴールデン表現型である、請求項４２記載の方法。
  45. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が着色表現型または成長優位性表現型である、請求項４２記載の方法。
  46. 前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞が、好ましくはホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より選択される植物または前述の植物の１つに属するあらゆる変種もしくは亜種に由来する、請求項１記載の方法。
  47. 少なくとも１つの改変植物細胞、または前記少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法であって、
    ａ．改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、またはＤＮＡ修飾試薬を含む少なくとも１つの第１の部位特異的エフェクターを用いて、少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾を導入することであって、前記少なくとも１つの標的化コドン欠失修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；
    ｂ．前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾は、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を前記第２の植物ゲノム標的部位に作成する少なくとも１つの第２の部位特異的エフェクターを用いて導入され、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾は、前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または前記少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および
    ｃ．
    ｉ．前記少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾により前記第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた前記少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに
    ｉｉ．前記第２の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、
    少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、
    ｄ．任意選択により、前記少なくとも１つの第１の標的化修飾および前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得ることであって、任意選択により、前記関心対象の遺伝子型は、前記少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、交配させること、
    を含む、方法。
  48. 好ましくはステップｂが、前記少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位および／または前記少なくとも第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型を導入することをさらに含む、請求項４７記載の方法。
  49. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントを含む制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、あるいは前述のエフェクターのあらゆるバリアントまたは触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される、請求項４７記載の方法。
  50. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼであり、前記ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列は、
    ａ．ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９、ＶＱＲ−Ｃａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９、
    ｂ．ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１を含む、Ｃｐｆ１、
    ｃ．ＣａｓＸ、および
    ｄ．ＣａｓＹ、
    ならびに前述したＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意のバリアントおよび誘導体を含む群より選択され、任意選択により前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、それぞれの野生型配列と比べて変異を含み、したがって得られたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮＡニッカーゼに、または全ＤＮＡ切断能力を失ったＤＮＡ結合エフェクターに変換されている、請求項４７記載の方法。
  51. 前記少なくとも部位特異的エフェクター、または前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターを含む複合体の少なくとも１つの構成要素が、前記少なくとも１つの塩基編集複合体を細胞内小器官に向けるために少なくとも１つの小器官局在化シグナルを含む、請求項４７記載の方法。
  52. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）である、請求項５１記載の方法。
  53. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、葉緑体輸送ペプチドである、請求項５１記載の方法。
  54. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、ミトコンドリア輸送ペプチドである、請求項５１記載の方法。
  55. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位が、少なくとも１つの表現型選択形質をコードするゲノム標的部位であり、前記少なくとも１つの表現型選択形質は、抵抗性／耐性形質または成長優位性形質であり、前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、前記少なくとも１つの改変植物細胞、組織、もしくは植物、またはその子孫に、加えられる化合物またはトリガに対する抵抗性／耐性または成長優位性を付与する、請求項４７記載の方法。
  56. 前記関心対象の少なくとも１つの表現型選択形質が、少なくとも１つの内在性遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、あるいは前記関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、少なくとも１つの導入遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、前記少なくとも１つの内在性遺伝子または前記少なくとも１つの導入遺伝子は、前記関心対象の少なくとも１つの表現型形質に前記少なくとも１つの修飾がない細胞を阻害する、損傷する、または殺す植物毒、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは前記少なくとも１つの表現型形質は、細胞分裂、成長速度、胚発生のブースターからなる群より、または非改変細胞、組織、器官、もしくは植物と比べて改変細胞、組織、器官、もしくは植物に優位性を与える別の表現型選択特性から選択される、請求項４７記載の方法。
  57. 前記少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位が、除草剤抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型選択形質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子または導入遺伝子であり、ここで除草剤抵抗性／耐性は、グリホサートを含むＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルホシネートを含むグルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、イミダゾリンまたはスルホニルウレアを含むＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）を含むＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、フィトエンデサチュラーゼステップでのカロテノイド生合成阻害剤、４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、またはほかのカロテノイド生合成標的の阻害剤を含むカロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子ダイバーターに対する抵抗性／耐性、カルバメート、トリアジン、およびトリアジノンを含む光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ジカンバ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含む合成オーキシンに対する抵抗性／耐性からなる群より選択される、請求項４７記載の方法。
  58. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が、植物毒抵抗性／耐性形質、好ましくは除草剤抵抗性／耐性形質であり、前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾は、植物毒化合物、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性を付与し、前記化合物は、前記少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体、またはその子孫に加えられる外来性化合物である、請求項４７記載の方法。
  59. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位が、選択の目的で、アマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＸ２Ｌ遺伝子産物のホモログである、請求項５８記載の方法。
  60. 前記少なくとも１つの第１の標的化コドン欠失修飾が、配列番号２８のアマランサス・ツベルクラタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）のＰＰＸ２Ｌ遺伝子産物のＧ２１０残基に相当する位置に生じる、請求項５９記載の方法。
  61. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、または植物体の特定または単離に便利な可視表現型である、請求項４７記載の方法。
  62. 前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞が、好ましくはホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より選択される植物または前述の植物の１つに属するあらゆる変種もしくは亜種に由来する、請求項４７記載の方法。
  63. 少なくとも１つの改変植物細胞、または前記少なくとも１つの改変植物細胞を含む少なくとも１つの改変植物組織、器官、もしくは植物体を、トランスジェニック選択マーカー配列を安定的に組み込むことなく単離する方法であって、
    ａ．改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第１の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第１の部位特異的エフェクターを用いて、少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾を導入することであって、前記少なくとも１つの標的化フレームシフトまたは欠失修飾により、少なくとも１つの表現型選択形質の発現がもたらされる、導入すること；
    ｂ．前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞の第２の植物ゲノム標的部位に、少なくとも１つの第２の標的化修飾を導入することであって、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾は、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を前記第２の植物ゲノム標的部位に作成するヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、またはＤＮＡ修飾試薬を含む少なくとも１つの第２の部位特異的エフェクターを用いて導入され、前記少なくとも１つの第２の標的化修飾は、前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾の導入と同時にまたは連続して、同じ改変すべき少なくとも１つの植物細胞に、または前記少なくとも１つの第１の標的化修飾を含む少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物体に導入されて、少なくとも１つの改変植物細胞を得る、導入すること；および
    ｃ．
    ｉ．前記少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾により前記第１の植物ゲノム標的部位にもたらされた前記少なくとも１つの表現型選択形質を選択することにより、そして任意選択によりさらに
    ｉｉ．前記第２の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を選択することにより、
    少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体を単離すること、または少なくとも１つのその子孫細胞、組織、器官、もしくは植物を単離すること、
    ｄ．任意選択により、前記少なくとも１つの第１の標的化修飾および前記少なくとも１つの第２の標的化修飾を含む少なくとも１つの改変植物または植物物質を、関心対象のさらなる植物または植物物質と交配させて、得られた子孫植物または植物物質を分離し、それによって関心対象の遺伝子型を得ることであって、任意選択により、前記関心対象の遺伝子型は、前記少なくとも１つの第１の標的化修飾を含んでいない、交配させること
    を含む、方法。
  64. 好ましくはステップｂが、前記少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位および／または前記少なくとも第２の植物ゲノム標的部位に標的化配列変換または置換を作成するために修復鋳型を導入することをさらに含む、請求項６３記載の方法。
  65. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、ＣａｓもしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントを含む制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼ、あるいは前述のエフェクターのあらゆるバリアントまたは触媒活性フラグメントの少なくとも１つから選択される、請求項６３記載の方法。
  66. 前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターが、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼであり、前記ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列は、
    ａ．ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＫＫＨ−Ｃａｓ９、ＶＱＲ−Ｃａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９、
    ｂ．ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１を含む、Ｃｐｆ１、
    ｃ．ＣａｓＸ、および
    ｄ．ＣａｓＹ、
    ならびに前述したＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼの任意のバリアントおよび誘導体を含む群より選択され、任意選択により前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、それぞれの野生型配列と比べて変異を含み、したがって得られたＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、一本鎖特異的ＤＮＡニッカーゼに、または全ＤＮＡ切断能力を失ったＤＮＡ結合エフェクターに変換されている、請求項６３記載の方法。
  67. 前記少なくとも部位特異的エフェクター、または前記少なくとも１つの部位特異的エフェクターを含む複合体の少なくとも１つの構成要素が、前記少なくとも１つの塩基編集複合体を細胞内小器官に向けるために少なくとも１つの小器官局在化シグナルを含む、請求項６３記載の方法。
  68. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）である、請求項６７記載の方法。
  69. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、葉緑体輸送ペプチドである、請求項６７記載の方法。
  70. 前記少なくとも１つの小器官局在化シグナルが、ミトコンドリア輸送ペプチドである、請求項６７記載の方法。
  71. 前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位が、少なくとも１つの表現型選択形質をコードするゲノム標的部位であり、前記少なくとも１つの表現型選択形質は、抵抗性／耐性形質または成長優位性形質であり、前記少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第１の標的化塩基修飾は、前記少なくとも１つの改変植物細胞、組織、もしくは植物、またはその子孫に、加えられる化合物またはトリガに対する抵抗性／耐性または成長優位性を付与する、請求項６３記載の方法。
  72. 前記関心対象の少なくとも１つの表現型選択形質が、少なくとも１つの内在性遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、あるいは前記関心対象の少なくとも１つの表現型形質は、少なくとも１つの導入遺伝子であるかまたはそれによりコードされ、前記少なくとも１つの内在性遺伝子または前記少なくとも１つの導入遺伝子は、前記関心対象の少なくとも１つの表現型形質に前記少なくとも１つの修飾がない細胞を阻害する、損傷する、または殺す植物毒、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型形質をコードし、あるいは前記少なくとも１つの表現型形質は、細胞分裂、成長速度、胚発生のブースターからなる群より、または非改変細胞、組織、器官、もしくは植物と比べて改変細胞、組織、器官、もしくは植物に優位性を与える別の表現型選択特性から選択される、請求項６３記載の方法。
  73. 前記少なくとも１つの第１の植物ゲノム標的部位が、除草剤抵抗性／耐性からなる群より選択される少なくとも１つの表現型選択形質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子または導入遺伝子であり、ここで除草剤抵抗性／耐性は、グリホサートを含むＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルホシネートを含むグルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、イミダゾリンまたはスルホニルウレアを含むＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＦＯＰ）を含むＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、フィトエンデサチュラーゼステップでのカロテノイド生合成阻害剤、４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、またはほかのカロテノイド生合成標的の阻害剤を含むカロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子ダイバーターに対する抵抗性／耐性、カルバメート、トリアジン、およびトリアジノンを含む光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ジカンバ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含む合成オーキシンに対する抵抗性／耐性からなる群より選択される、請求項６３記載の方法。
  74. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が、植物毒抵抗性／耐性形質、好ましくは除草剤抵抗性／耐性形質であり、前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞の前記第１の植物ゲノム標的部位の前記少なくとも１つの第１の標的化フレームシフトまたは欠失修飾は、植物毒化合物、好ましくは除草剤に対する抵抗性／耐性を付与し、前記化合物は、前記少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、もしくは植物体、またはその子孫に加えられる外来性化合物である、請求項６３記載の方法。
  75. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が、少なくとも１つの改変植物細胞、組織、器官、または植物体の特定または単離に便利な可視表現型である、請求項６３記載の方法。
  76. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が光沢表現型である、請求項７５記載の方法。
  77. 前記少なくとも１つの表現型選択形質がゴールデン表現型である、請求項７５記載の方法。
  78. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が着色表現型である、請求項７５記載の方法。
  79. 前記少なくとも１つの表現型選択形質が成長優位性表現型である、請求項７５記載の方法。
  80. 前記改変すべき少なくとも１つの植物細胞が、好ましくはホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より選択される植物または前述の植物の１つに属するあらゆる変種もしくは亜種に由来する、請求項６３記載の方法。
  81. 請求項１記載の方法により得ることができる、植物細胞、組織、器官、物質、もしくは植物体、またはその子孫。
  82. 請求項４７記載の方法により得ることができる、植物細胞、組織、器官、物質、もしくは植物体、またはその子孫。
  83. 請求項６３記載の方法により得ることができる、植物細胞、組織、器官、物質、もしくは植物体、またはその子孫。
  84. ゲノム編集により遺伝子改変植物を作製する方法であって、
    ａ）遺伝子改変すべき植物の細胞または組織を準備するステップ；
    ｂ）第１のゲノム編集系および第２のゲノム編集系を準備するステップであって、前記第１のゲノム編集系は、植物の選択マーカー遺伝子を標的化し修飾することができ、前記第２のゲノム修飾系は、前記植物の関心対象の遺伝子を標的化し修飾することができる、ステップ；
    ｃ）前記第１および前記第２のゲノム編集系で前記細胞または前記組織を同時形質転換するステップ；
    ｄ）好ましくは選択圧なしで、前記形質転換細胞または組織から植物を再生させるステップ；
    ｅ）ステップｄ）で再生させた植物のなかから、前記選択マーカー遺伝子が修飾されている植物を選択するステップ；および
    ｆ）ステップｅ）で選択した植物のなかから、その標的遺伝子が修飾されている植物を特定するステップ
    を含む、方法。
  85. 前記ゲノム編集系が、精密塩基エディター（ＰＢＥ）系、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆｌ系、ＣＲＩＳＰＲｉ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、およびＴＡＬＥＮ系から選択される、請求項８４記載の方法。
  86. 前記選択マーカー遺伝子の修飾により、前記植物に選択可能な形質が生じ、好ましくは前記選択マーカー遺伝子の前記修飾は、前記植物のほかの形質を変えることがない、請求項８４記載の方法。
  87. 前記選択形質が除草剤抵抗性である、請求項８６記載の方法。
  88. 前記選択マーカー遺伝子が、ｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、およびＰ４５０からなる群より選択される、請求項８７記載の方法。
  89. 前記選択形質が、葉舌、葉色、葉蝋などの目視観測できる形質である、請求項８６記載の方法。
  90. 前記選択マーカー遺伝子が、ＬＩＧ、ＰＤＳ、ｚｂ７、およびＧＬ２からなる群より選択される、請求項８７記載の方法。
  91. 前記第１のゲノム編集系および前記第２のゲノム編集系が、精密塩基エディター（ＰＢＥ）系である、請求項８４から９０までのいずれか１項記載の方法。
  92. 前記植物が、好ましくはホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホルデウム・バルバゾム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｂｕｌｂｕｓｏｍ）、ソルガム・ビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、サッカルム・オフィシナリウム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｉｕｍ）、ゼア・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）などのゼア（Ｚｅａ）ｓｐｐ．、セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、オリザ・ミヌタ（Ｏｒｙｚａ ｍｉｎｕｔａ）、オリザ・サチワ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・アウストラリエンシス（Ｏｒｙｚａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、オリザ・アルタ（Ｏｒｙｚａ ａｌｔａ）、トリチカム・アエスチウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリチカム・デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、トリチカレ（Ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ブラキポジウム・ジスタキオン（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、ホルデウム・マリナム（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、アエギロプス・タウスキイ（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ）、ダウカス・グロキジアタス（Ｄａｕｃｕｓ ｇｌｏｃｈｉｄｉａｔｕｓ）、ベタ・ウルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのベタ（Ｂｅｔａ）ｓｐｐ．、ダウカス・プシルス（Ｄａｕｃｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、ダウカス・ムリカタス（Ｄａｕｃｕｓ ｍｕｒｉｃａｔｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ユーカリプタス・グランジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、コフェア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ウィティス・ウィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、エリトランテ・グッタータ（Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｅ ｇｕｔｔａｔａ）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）、ククミス・サチウス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マルス・ノタビリス（Ｍａｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クルキヒマラヤ・ヒマライカ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｈｉｍａｌａｉｃａ）、クルキヒマラヤ・ワリキイ（Ｃｒｕｃｉｈｉｍａｌａｙａ ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、カルダミネ・ネクスオサ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｎｅｘｕｏｓａ）、レピジウム・ウイルギニカム（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｖｉｒｇｉｎｉｃｕｍ）、カプセラ・ブルサ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、オルマラビドプシス・プミラ（Ｏｌｍａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｍｉｌａ）、アラビス・ヒルステ（Ａｒａｂｉｓ ｈｉｒｓｕｔｅ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・オレラケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ラファヌス・サチウス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ブラシカ・ユンカケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃａｃｅａ）、ブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、エルカ・ウェシカリアｓｕｂｓｐ．サチワ（Ｅｒｕｃａ ｖｅｓｉｃａｒｉａ ｓｕｂｓｐ． ｓａｔｉｖａ）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）、ポプラス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、メジカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キケル・ヤマシタエ（Ｃｉｃｅｒ ｙａｍａｓｈｉｔａｅ）、キケル・ビユガム（Ｃｉｃｅｒ ｂｉｊｕｇｕｍ）、キケル・アリエチナム（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、キケル・レチクラタム（Ｃｉｃｅｒ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、キケル・ユダイカム（Ｃｉｃｅｒ ｊｕｄａｉｃｕｍ）、カヤナス・カヤニフォリウス（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎｉｆｏｌｉｕｓ）、カヤナス・スカラバエオイデス（Ｃａｊａｎｕｓ ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅｓ）、ファセオラス・ウルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、グリキネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）ｓｐ．、アストラガラス・シニカス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｉｎｉｃｕｓ）、ロータス・ヤポニカス（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａｓ）、トレニア・フォウルニエリ（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）、アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、アリウム・フィスツロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、アリウム・サチウム（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ヘリアンタス・ツベロサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、およびアリウム・ツベロサム（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からなる群より選択される植物または前述の植物の１つに属するあらゆる変種もしくは亜種である、請求項８４から９１までのいずれか１項記載の方法。
  93. 請求項８４の方法により得ることができる遺伝子改変植物であって、好ましくは導入遺伝子を含まない、遺伝子改変植物。
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