JP2019132675A - Target material detection method and waveguide mode sensor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、導波モードセンサを用いて標的物質を検出する際、アビジン等により標的物質を捕捉するための処理を簡易化する標的物質検出方法及び前記標的物質検出方法の実施に好適な導波モードセンサに関する。 The present invention provides a target substance detection method that simplifies a process for capturing a target substance with avidin or the like when a target substance is detected using a waveguide mode sensor, and a waveguide suitable for implementing the target substance detection method. It relates to a mode sensor.
溶液中に存在する微小物質を標的物質とし、前記標的物質の検出を行うセンサとして、導波モードセンサが用いられている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
前記導波モードセンサにおいて前記標的物質の検出を担うセンサチップとしては、光透過性基板上に、金属材料、半導体材料及び第１の誘電体材料のいずれかで形成される第１の層と、第２の誘電体材料で形成される第２の層とをこの順で積層させたものが用いられる。
このようなセンサチップに対し、裏面側（前記光透過性基板側）から全反射条件を満たしつつ特定の入射角度で前記光を照射すると、特定波長の光が前記第１の層及び前記第２の層の中を伝搬する導波モード（光導波モード、導波路モード、光導波路モード、リーキーモードなどとも呼ばれる）と結合し、前記導波モードが励起される。
A waveguide mode sensor is used as a sensor for detecting a target substance using a minute substance present in a solution as a target substance (for example, see Non-Patent Documents 1 to 3).
As a sensor chip responsible for detection of the target substance in the waveguide mode sensor, a first layer formed of any one of a metal material, a semiconductor material, and a first dielectric material on a light-transmitting substrate; A layer obtained by laminating a second layer formed of the second dielectric material in this order is used.
When such a sensor chip is irradiated with the light at a specific incident angle while satisfying the total reflection condition from the back surface side (the light transmissive substrate side), light of a specific wavelength is emitted from the first layer and the second layer. The waveguide mode is excited by coupling with a waveguide mode (also referred to as an optical waveguide mode, a waveguide mode, an optical waveguide mode, a leaky mode, etc.) propagating through the layer.
前記導波モードセンサによるセンシングの実施方法として、前記センサチップに照射される前記光の反射光を検知する第１の方法がある。
この第１の方法では、特定波長の入射光を前記導波モードセンサに入射すると、前記導波モードが励起される特定の入射角度において前記反射光の強度が変化すること、或いは、特定の入射角度でスペクトル幅を持つ入射光を前記導波モードセンサに入射すると、前記導波モードが励起される特定の波長において前記反射光の強度が変化することを利用する。
また、前記第１の方法では、前記導波モードが励起される前記入射角度付近又は前記特定波長付近における反射光強度が前記センサチップの表面近傍の複素屈折率によって変化することを利用する。
即ち、前記センサチップの表面に前記標的物質が吸着したり接近したりして前記複素屈折率に変化が生じると、前記入射角度或いは前記特定波長の付近における反射光強度に変化をもたらすことから、前記標的物質を前記反射光の特性変化として検出することができる。
具体的には、前記標的物質の吸着等を、特定波長の光を入射したときの特定の入射角度における急激な反射光強度の減少を示すディップの位置や深さ、或いは、特定の入射角度でブロードな波長特性を持つ光を入射したときの特定波長における急激な反射光強度の減少を示すディップの位置や深さを検出器で捉えることで、前記センサチップ表面における前記標的物質の吸着等を検出することができる。
前記導波モードの励起条件は、前記センサチップ表面における前記複素屈折率の虚部の変化、つまり吸光度の変化に敏感であり、前記標的物質の吸着等によって吸光度に変化が生ずると、前記反射光の特性の大きな変動となって現れることから、前記導波モードセンサによる前記標的物質の高感度検出を期待できる。
As a method for performing sensing by the waveguide mode sensor, there is a first method for detecting reflected light of the light irradiated on the sensor chip.
In this first method, when incident light having a specific wavelength is incident on the guided mode sensor, the intensity of the reflected light changes at a specific incident angle at which the guided mode is excited, or a specific incident When incident light having a spectral width at an angle is incident on the waveguide mode sensor, the fact that the intensity of the reflected light changes at a specific wavelength at which the waveguide mode is excited is utilized.
The first method utilizes the fact that the reflected light intensity near the incident angle or near the specific wavelength at which the waveguide mode is excited varies depending on the complex refractive index near the surface of the sensor chip.
That is, when the target material is adsorbed or approached to the surface of the sensor chip and the complex refractive index changes, it causes a change in reflected light intensity near the incident angle or the specific wavelength, The target substance can be detected as a characteristic change of the reflected light.
Specifically, the adsorption or the like of the target substance is performed at the position or depth of a dip indicating a sharp decrease in reflected light intensity at a specific incident angle when light of a specific wavelength is incident, or at a specific incident angle. By capturing the position and depth of the dip that shows a sudden decrease in reflected light intensity at a specific wavelength when light having a broad wavelength characteristic is incident, the target substance is adsorbed on the surface of the sensor chip. Can be detected.
The waveguide mode excitation condition is sensitive to a change in the imaginary part of the complex refractive index on the surface of the sensor chip, that is, a change in absorbance. When the absorbance changes due to adsorption of the target substance, the reflected light Therefore, high sensitivity detection of the target substance by the waveguide mode sensor can be expected.
他の前記導波モードセンサによるセンシングの実施方法として、前記センサチップに照射される光に基づいて発せられる前記標的物質の存在に伴う蛍光又は散乱光を検知する第２の方法がある。
この第２の方法では、前記センサチップ裏面側から全反射条件を満たしつつ特定の入射角度で前記光を照射し、前記導波モードを励起させたときに前記センサチップ表面近傍に増強電場が形成されることを利用する。
即ち、前記増強電場が形成されると、前記センサチップ表面上に導入された前記標的物質自身又は前記標的物質を標識する標識物質から蛍光又は散乱光が発せられることから、前記蛍光等を検出器で捉えることで前記標的物質の存在を検出することが可能となる。
As another implementation method of the sensing by the waveguide mode sensor, there is a second method of detecting fluorescence or scattered light accompanying the presence of the target substance emitted based on light irradiated on the sensor chip.
In this second method, an enhanced electric field is formed in the vicinity of the sensor chip surface when the light is irradiated at a specific incident angle while satisfying the total reflection condition from the back side of the sensor chip and the waveguide mode is excited. Take advantage of what is being done.
That is, when the enhanced electric field is formed, fluorescence or scattered light is emitted from the target substance itself or a labeling substance that labels the target substance introduced on the surface of the sensor chip. It is possible to detect the presence of the target substance.
ところで、前記導波モードセンサにより、前記標的物質として特定の生体物質等を検出する場合、前記標的物質を特異的に捕捉する抗体を前記センサチップの表面上に固定化した上で、前記抗体で前記標的物質（抗原）を抗原抗体反応により捕捉することにより、前記標的物質を検出することが行われている。
この従来法では、先ず、前記センサチップを、ビオチン部位を有する化合物で表面修飾した後、前記センサチップの表面上にストレプトアビジン又はアビジンに前記抗体を結合させた試薬を導入し、前記ビオチン部位に前記ストレプトアビジン等を結合させることで、前記ビオチン部位を有する化合物及び前記ストレプトアビジン等を介して前記抗体を前記センサチップの表面上に固定化する前処理を実施する。
次いで、被検体液を前記センサチップの表面上に導入して、前記抗体に対し、前記標的物質（抗原）を前記抗原抗体反応により捕捉させる捕捉処理を実施する。
次いで、前記抗体が前記標的物質を捕捉している状態と捕捉していない状態とにおける前記導波モードセンサの各センシング状態の比較を通じて、前記被検体液中に含まれる前記標的物質を検出する検出処理を実施する。
By the way, when a specific biological substance or the like is detected as the target substance by the waveguide mode sensor, an antibody that specifically captures the target substance is immobilized on the surface of the sensor chip, and then the antibody is used. The target substance is detected by capturing the target substance (antigen) by an antigen-antibody reaction.
In this conventional method, first, the surface of the sensor chip is modified with a compound having a biotin moiety, and then streptavidin or a reagent in which the antibody is bound to avidin is introduced onto the surface of the sensor chip, and the biotin moiety is introduced. By binding the streptavidin or the like, a pretreatment for immobilizing the antibody on the surface of the sensor chip through the compound having the biotin moiety and the streptavidin or the like is performed.
Then, a sample liquid is introduced onto the surface of the sensor chip, and a capture process is performed on the antibody to capture the target substance (antigen) by the antigen-antibody reaction.
Next, detection for detecting the target substance contained in the analyte liquid is performed by comparing each sensing state of the waveguide mode sensor between the state where the antibody captures the target substance and the state where the antibody does not capture the target substance. Perform the process.
しかしながら、前記試薬と前記被検体液とを別々に取り扱うと、スペースが限られた前記センサチップの表面上で、前記抗原抗体反応のための前記試薬と前記被検体液との混合を行う必要があり、前記検出処理を行う前の作業が煩雑となる。加えて、前記抗原抗体反応のための前記捕捉処理とは別に、前記ビオチン部位を有する化合物と前記抗体付きのストレプトアビジン等とを結合させる前記前処理が必要であるため、前記検出処理を行う前の作業が段階的となり、より一層、前記検出処理を行う前の作業を煩雑化させる。
更に、前記ビオチン部位を有する化合物と未結合の前記抗体付きのストレプトアビジン等が前記捕捉処理において前記抗原と結合した結合体は、前記検出処理において夾雑物との区別が付かないため、前記前処理と前記捕捉処理との間に前記ビオチン部位を有する化合物と未結合の前記抗体付きのストレプトアビジン等を洗浄する洗浄工程が必要となる。
よって、従来法では、作業の煩雑さや検出に必要な工程数が嵩むとともに、前記標的物質の検出に多くの時間を要する問題がある。
However, when the reagent and the sample liquid are handled separately, it is necessary to mix the reagent for the antigen-antibody reaction and the sample liquid on the surface of the sensor chip with limited space. In addition, the work before performing the detection process becomes complicated. In addition to the capture treatment for the antigen-antibody reaction, the pretreatment for binding the compound having the biotin moiety to streptavidin or the like with the antibody is necessary. This step becomes stepwise, and the work before the detection process is further complicated.
Furthermore, since the conjugate in which the compound having the biotin moiety and streptavidin with the unbound antibody are bound to the antigen in the capture process cannot be distinguished from the contaminant in the detection process, the pretreatment And a step of washing the compound having the biotin moiety and the unbound streptavidin with the antibody, etc., are required.
Therefore, in the conventional method, there are problems that the work is complicated and the number of steps necessary for detection increases, and that it takes much time to detect the target substance.
本発明は、従来技術における前記諸問題を解決し、導波モードセンサを用いた標的物質の検出操作を簡素化可能な標的物質検出方法及び前記標的物質検出方法の実施に好適な前記導波モードセンサを提供することを課題とする。 The present invention solves the above-mentioned problems in the prior art and simplifies the target substance detection operation using the waveguide mode sensor, and the waveguide mode suitable for implementing the target substance detection method. It is an object to provide a sensor.
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 導波モードセンサのセンサチップの表面にビオチンを固定化するビオチン固定化工程と、検出対象となる標的物質の存在が検証される被検体と、少なくともストレプトアビジン及びアビジンのいずれかから選択されるビオチン結合体及び前記ビオチン結合体と結合されるとともに前記標的物質と結合して捕捉可能とされる第１の標的物質捕捉物質を含む試薬とが混合された混合液を調製する混合液調製工程と、前記ビオチンが固定化された前記センサチップの表面上に前記混合液を導入する混合液導入工程と、前記標的物質を含まない状態の前記混合液、前記被検体と混合されない状態の前記試薬及び前記標的物質の含有量がコントロールされた状態の前記混合液のいずれかである基準液を前記ビオチンが固定化された前記センサチップの表面に導入したときの前記導波モードセンサのセンシング状態を基準状態とし、前記混合液導入工程により前記混合液を導入したときの前記導波モードセンサの前記センシング状態を測定状態として、前記基準状態と前記測定状態とを比較することで前記標的物質を検出する標的物質検出工程と、を含むことを特徴とする標的物質検出方法。
＜２＞ 試薬が、導波モードセンサでセンシング可能な標識物質と、前記標識物質と結合されるとともに標的物質と結合して捕捉可能とされる第２の標的物質捕捉物質とを更に含む前記＜１＞に記載の標的物質検出方法。
＜３＞ 第１の標的物質捕捉物質及び第２の標的物質捕捉物質が、標的物質に対する抗体及びアプタマーのいずれかである前記＜２＞に記載の標的物質検出方法。
＜４＞ 標識物質が、可視光領域において光吸収性を有する色素及びナノ粒子、蛍光を発する色素及び微粒子、並びに、散乱光を発する微粒子のいずれかである前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
＜５＞ ビオチン固定化工程が、シラン化合物にビオチンが付加されたビオチニル化シランカップリング剤の溶液をセンサチップの表面に接触させた後、前記センサチップを乾燥させる工程である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
＜６＞ ビオチニル化シランカップリング剤が、下記一般式（１）に示す化合物である前記＜５＞に記載の標的物質検出方法。
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数が２〜１０のアルキレン基を示し、Ｒ２は、炭素数が２〜１５のアルキレン基を示す。
＜８＞ 標的物質検出工程が、基準状態と測定状態とでそれぞれ検知された反射光の反射光スペクトルにおけるディップ底部の深さを比較して実施される前記＜７＞に記載の標的物質検出方法。
＜９＞ 導波モードセンサによるセンシングが、センサチップに対し裏面側から全反射条件で光を照射することに基づいて発せられる標的物質の存在に伴う蛍光又は散乱光を検知して実施される前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
＜１０＞ シラン化合物にビオチンが付加されたビオチニル化シランカップリング剤により表面修飾されたセンサチップが配されることを特徴とする導波モードセンサ。
＜１１＞ ビオチニル化シランカップリング剤が、下記一般式（１）に示す化合物である前記＜１０＞に記載の導波モードセンサ。
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数が２〜１０のアルキレン基を示し、Ｒ２は、炭素数が２〜１５のアルキレン基を示す。
<1> Select from biotin immobilization process for immobilizing biotin on the surface of a sensor chip of a waveguide mode sensor, a test object to be verified for the presence of a target substance to be detected, and at least one of streptavidin and avidin Preparation of a mixed solution prepared by mixing a biotin conjugate and a reagent containing a first target substance capturing substance that is bound to the target substance and capable of being captured by binding to the biotin conjugate A liquid mixture introducing step of introducing the liquid mixture onto the surface of the sensor chip on which the biotin is immobilized, the liquid mixture not containing the target substance, and the liquid not being mixed with the analyte A reference solution that is one of the mixed solution in a state in which the content of the reagent and the target substance is controlled is added to the sensor chip on which the biotin is immobilized. The sensing state of the waveguide mode sensor when introduced to the surface of the substrate is set as a reference state, and the sensing state of the waveguide mode sensor when the mixed solution is introduced by the mixed solution introduction step is set as a measurement state. And a target substance detection step of detecting the target substance by comparing a reference state with the measurement state.
<2> The reagent further includes a labeling substance that can be sensed by a waveguide mode sensor, and a second target substance capturing substance that is bound to the labeling substance and that can be captured by binding to the target substance. The target substance detection method according to 1>.
<3> The target substance detection method according to <2>, wherein the first target substance-capturing substance and the second target substance-capturing substance are either antibodies or aptamers against the target substance.
<4> Any one of <2> to <3>, wherein the labeling substance is any one of a dye and a nanoparticle having light absorption in the visible light region, a dye and a fine particle that emits fluorescence, and a fine particle that emits scattered light A target substance detection method according to claim 1.
<5> The biotin immobilization step is a step in which a solution of a biotinylated silane coupling agent in which biotin is added to a silane compound is brought into contact with the surface of the sensor chip, and then the sensor chip is dried. <4> The target substance detection method according to any one of the above.
<6> The target substance detection method according to <5>, wherein the biotinylated silane coupling agent is a compound represented by the following general formula (1).
However, the general formula (1), R 1 is an alkylene group having a carbon number of 2 to 10, R 2 has a carbon number of an alkylene group of 2 to 15.
<8> The target substance detection method according to <7>, wherein the target substance detection step is performed by comparing the depths of the dip bottoms in the reflected light spectra of the reflected light detected in the reference state and the measurement state, respectively. .
<9> Sensing by the waveguide mode sensor is performed by detecting fluorescence or scattered light accompanying the presence of a target substance emitted based on irradiation of light from the back side to the sensor chip under total reflection conditions. The target substance detection method according to any one of <1> to <6>.
<10> A waveguide mode sensor comprising a sensor chip whose surface is modified with a biotinylated silane coupling agent in which biotin is added to a silane compound.
<11> The waveguide mode sensor according to <10>, wherein the biotinylated silane coupling agent is a compound represented by the following general formula (1).
However, the general formula (1), R 1 is an alkylene group having a carbon number of 2 to 10, R 2 has a carbon number of an alkylene group of 2 to 15.
本発明によれば、従来技術における前記諸問題を解決することができ、導波モードセンサを用いた標的物質の検出操作を簡素化可能な標的物質検出方法及び前記標的物質検出方法の実施に好適な前記導波モードセンサを提供することができる。 According to the present invention, the above-mentioned problems in the prior art can be solved, and the target substance detection method and the target substance detection method that can simplify the target substance detection operation using the waveguide mode sensor are suitable. Such a waveguide mode sensor can be provided.
（導波モードセンサの基本構成）
先ず、本発明の標的物質検出方法が適用される導波モードセンサの基本構成について説明し、次いで、前記導波モードセンサの基本構成に基づき、前記標的物質検出方法について説明する。
(Basic configuration of guided mode sensor)
First, the basic configuration of a waveguide mode sensor to which the target substance detection method of the present invention is applied will be described, and then the target substance detection method will be described based on the basic configuration of the waveguide mode sensor.
前記導波モードセンサは、センサチップと、液体保持部と、光照射部と、光検出部とを有して構成される。 The waveguide mode sensor includes a sensor chip, a liquid holding unit, a light irradiation unit, and a light detection unit.
＜センサチップ＞
前記センサチップは、光透過性基板と導波モード励起層とが配され、前記光透過性基板側から全反射条件で光が照射されたときに前記導波モード励起層に導波モードが励起されるように構成される。
<Sensor chip>
The sensor chip includes a light-transmitting substrate and a waveguide mode excitation layer. When light is irradiated from the light-transmitting substrate side under total reflection conditions, the waveguide mode is excited in the waveguide mode excitation layer. Configured to be.
−光透過性基板−
前記光透過性基板は、公知のガラス材料、プラスチック材料で形成される基板である。
なお、本明細書において、「光透過性」とは、可視光透過率が０．５％以上であることを示す。
-Light transmissive substrate-
The light transmissive substrate is a substrate formed of a known glass material or plastic material.
In the present specification, “light transmissivity” indicates that the visible light transmittance is 0.5% or more.
前記透過性基板の形成材料である前記ガラス材料としては、特に制限はないが、前記光透過性基板の製造コスト及び入手し易さの観点に加え、好適な屈折率を満足する前記光透過性基板が得られる観点から、シリカガラスが好ましい。前記シリカガラスとしては、二酸化珪素（ＳｉＯ２）を単一成分として形成されるシリカガラスそのもののほか、溶融石英ガラスのような不純物を含むシリカガラス、ホウ素シリカガラス、フッ素添加シリカガラス、ゲルマニウム添加シリカガラスなどのシリカガラスに添加剤を添加したガラスを含み、例えば、ＢＫ７ガラスやパイレックスガラス（登録商標）などを含む。
プラスチック材料としては、ポリスチレンや、ポリカーボネート、アクリル、ポリエステル、ＣＯＰ等の一般的な透明なプラスチック材料を用いることができる。
The glass material which is a material for forming the transmissive substrate is not particularly limited, but the light transmissive material satisfies a suitable refractive index in addition to the manufacturing cost and availability of the light transmissive substrate. From the viewpoint of obtaining a substrate, silica glass is preferred. Examples of the silica glass include silica glass formed with silicon dioxide (SiO 2 ) as a single component, silica glass containing impurities such as fused silica glass, boron silica glass, fluorine-added silica glass, and germanium-added silica. It includes a glass obtained by adding an additive to silica glass such as glass, and includes, for example, BK7 glass and Pyrex glass (registered trademark).
As the plastic material, a general transparent plastic material such as polystyrene, polycarbonate, acrylic, polyester, COP or the like can be used.
−導波モード励起層−
前記導波モード励起層は、前記光透過性基板上に第１の層と第２の層とがこの順で積層されて構成され、前記導波モードが励起可能とされる層である。
前記導波モードは、前記センサチップに対して前記光透過性基板側（裏面側）から全反射条件で光を照射することで励起される。
-Guided mode excitation layer-
The waveguide mode excitation layer is a layer in which a first layer and a second layer are laminated in this order on the light-transmitting substrate, and the waveguide mode can be excited.
The waveguide mode is excited by irradiating the sensor chip with light from the light transmissive substrate side (back surface side) under total reflection conditions.
−−第１の層−−
前記第１の層は、金属材料、半導体材料及び第１の誘電体材料のいずれかで形成される。
前記金属材料としては、特に制限はなく、例えば、金、銀、銅等の金属材料が挙げられる。
前記半導体材料としては、特に制限はなく、Ｓｉ、Ｇｅ、ＳｉＧｅ等の公知の半導体材料又は化合物半導体材料が挙げられるが、中でも、３．０以上の高い屈折率が得られ易いＳｉ、Ｇｅが好ましい。
前記第１の誘電体材料としては、特に制限はなく、例えば、ＴｉＯ２、Ｔａ２Ｏ５等の公知の光透過性の誘電体材料が挙げられるが、中でも、２．５以上の高い屈折率が得られ易く、消衰係数が低い（光透過性が高い）ＴｉＯ２が好ましい。
また、前記第１の層の厚みとしては、構成材料及び照射する光の波長によって最適値が決定されるとともに、この値は、フレネルの式を用いた計算から算出可能であることが知られている。一般に、近紫外から近赤外域の波長帯の光を使用する場合、前記第１の厚みは、数ｎｍ〜数百ｎｍとなる。
なお、前記第１の層の形成方法としては、特に制限はなく、形成材料に応じて適宜選択することができ、例えば、貼り合わせ法、スパッタリング法、蒸着法等の公知の方法が挙げることができる。
--First layer--
The first layer is formed of any one of a metal material, a semiconductor material, and a first dielectric material.
There is no restriction | limiting in particular as said metal material, For example, metal materials, such as gold | metal | money, silver, copper, are mentioned.
There is no restriction | limiting in particular as said semiconductor material, Although well-known semiconductor materials or compound semiconductor materials, such as Si, Ge, SiGe, are mentioned, Among these, Si and Ge which are easy to obtain a high refractive index of 3.0 or more are preferable. .
As the first dielectric material is not particularly limited, for example, although a known light transmissive dielectric material such as TiO 2, Ta 2 O 5 and the like, among others, 2.5 higher than the refractive index Is preferred, and TiO 2 having a low extinction coefficient (high light transmittance) is preferable.
The thickness of the first layer is determined to be an optimum value depending on the constituent material and the wavelength of light to be irradiated, and this value is known to be calculated from the calculation using the Fresnel equation. Yes. Generally, when using light in a wavelength band from the near ultraviolet to the near infrared region, the first thickness is several nm to several hundred nm.
In addition, there is no restriction | limiting in particular as a formation method of a said 1st layer, According to formation material, it can select suitably, For example, well-known methods, such as a bonding method, sputtering method, a vapor deposition method, can be mentioned. it can.
−−第２の層−−
前記第２の層は、第２の誘電体材料で形成される。
前記第２の誘電体材料としては、特に制限はなく、例えば、シリカガラス等のガラス材料、ＴｉＯ２等の酸化物、ＡｌＮ等の窒化物、ＭｇＦ２、ＣａＦ等のフッ化物が挙げられるが、中でも、消衰係数が低いシリカガラスが好ましい。前記シリカガラスとしては、二酸化珪素（ＳｉＯ２）を単一成分として形成されるシリカガラスそのもののほか、ホウ素シリカガラス、フッ素添加シリカガラス、ゲルマニウム添加シリカガラスなどのシリカガラスに添加剤を添加したガラスを含む。
また、前記第２の層の厚みとしては、前記第１の層と同様に構成材料及び照射する光の波長によって最適値が決定されるとともに、この値は、フレネルの式を用いた計算から算出可能であることが知られている。一般に前記第２の層の厚みは、数十ｎｍ〜数μｍとなる。
なお、前記第２の層の形成方法としては、特に制限はなく、形成材料に応じて適宜選択することができ、例えば、スパッタリング法、スピンコート法等の公知の方法が挙げることができる。また、前記第１の層が半導体で形成されている場合、前記第１の層の熱酸化により前記第２の層を形成することもできる。
--Second layer--
The second layer is formed of a second dielectric material.
The second dielectric material is not particularly limited, and examples thereof include glass materials such as silica glass, oxides such as TiO2, nitrides such as AlN, and fluorides such as MgF2 and CaF. Silica glass having a low extinction coefficient is preferred. As the silica glass, in addition to silica glass itself formed with silicon dioxide (SiO 2 ) as a single component, glass obtained by adding an additive to silica glass such as boron silica glass, fluorine-added silica glass, and germanium-added silica glass including.
In addition, the thickness of the second layer is determined by the constituent material and the wavelength of light to be irradiated in the same manner as the first layer, and this value is calculated from the calculation using the Fresnel equation. It is known to be possible. In general, the thickness of the second layer is several tens of nm to several μm.
In addition, there is no restriction | limiting in particular as a formation method of a said 2nd layer, According to a forming material, it can select suitably, For example, well-known methods, such as sputtering method and a spin coat method, can be mentioned. Further, when the first layer is formed of a semiconductor, the second layer can be formed by thermal oxidation of the first layer.
ここで、前記光透過性基板が表面と裏面とが平行な板である場合、裏面側から照射された光は、表面上に液体が存在すると全反射されない。よって、このような場合には、前記光透過性基板の裏面部分に回折格子を形成することにより、回折格子に特定の角度で光を照射したときに、光が回折格子で回折されてセンサチップ内に導入されるとともに、センサチップ内に導入された光が全反射条件で表面に照射されて前記導波モード励起層内に導波モードを励起するように、センサチップを構成してもよい。または、前記光透過性基板の表面と裏面とが平行にならないように形成してもよい。或いは、光源から照射される光を公知のプリズムを介して検出板の裏面に照射することとしてもよい。プリズムは、センサチップの裏面に屈折率調整オイル又は光学用接着剤等により光学的に貼り合せて用いることができる。プリズムの形成材料として、前記光透過性基板の形成材料と同じ形成材料が選択される場合には、前記光透過性基板とプリズムとが一体成型されたものを用いることもできる。 Here, when the light-transmitting substrate is a plate having a front surface and a back surface parallel to each other, the light irradiated from the back surface side is not totally reflected when a liquid exists on the surface. Therefore, in such a case, by forming a diffraction grating on the back surface portion of the light-transmitting substrate, when the diffraction grating is irradiated with light at a specific angle, the light is diffracted by the diffraction grating and the sensor chip The sensor chip may be configured such that light introduced into the sensor chip is irradiated on the surface under total reflection conditions to excite the waveguide mode in the waveguide mode excitation layer. . Or you may form so that the surface and back surface of the said transparent substrate may not become parallel. Or it is good also as irradiating the back surface of a detection plate with the light irradiated from a light source through a well-known prism. The prism can be used by being optically bonded to the back surface of the sensor chip with a refractive index adjusting oil or an optical adhesive. When the same material as the material for forming the light-transmitting substrate is selected as the material for forming the prism, a material in which the light-transmitting substrate and the prism are integrally molded may be used.
＜液体保持部＞
前記センサチップの前記導波モード励起層側の面、つまり、前記センサチップの表面には、液体試料（混合液）が導入される。前記液体試料を前記センサチップの表面上に保持させる方法としては、例えば、前記液体試料を前記センサチップの表面上に滴下した後、カバーガラス等で覆うことが挙げられる。
また、前記液体試料を確実に保持させるため、前記センサチップの表面上に液体試料槽を形成してもよい。前記液体試料槽としては、特に制限はないが、簡易な構成とする観点から、前記センサチップ表面領域の全体又は一部を囲むように前記センサチップの表面上に立設され、前記表面を底とした前記液体試料槽の構成部とされる側壁部が配されることで、構成されることが好ましい。
なお、前記側壁部の形成材料としては、特に制限はなく、公知のガラス材料、樹脂材料等を挙げることができ、前記側壁部の形成方法としても、材料に応じた公知の方法を挙げることができる。
<Liquid holding part>
A liquid sample (mixed liquid) is introduced into the surface of the sensor chip on the waveguide mode excitation layer side, that is, the surface of the sensor chip. As a method for holding the liquid sample on the surface of the sensor chip, for example, the liquid sample is dropped on the surface of the sensor chip and then covered with a cover glass or the like.
Moreover, in order to hold | maintain the said liquid sample reliably, you may form a liquid sample tank on the surface of the said sensor chip. The liquid sample tank is not particularly limited, but from the viewpoint of a simple configuration, the liquid sample tank is erected on the surface of the sensor chip so as to surround the whole or part of the surface area of the sensor chip, and the surface is bottomed. It is preferable to be configured by arranging a side wall portion which is a constituent portion of the liquid sample tank.
In addition, there is no restriction | limiting in particular as a formation material of the said side wall part, A well-known glass material, a resin material, etc. can be mentioned, As a formation method of the said side wall part, the well-known method according to material is mentioned. it can.
＜光照射部＞
前記光照射部は、前記光学プリズムを介して前記センサチップに対し前記光透過性基板側から全反射条件で光が照射可能とされる部である。
前記光照射部の光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のランプ、ＬＥＤ、レーザー等が挙げられる。
前記光学プリズムを介して前記センサチップに対し全反射条件で光を照射すると前記センサチップの第１の層及び第２の層内に導波モードが形成される。
したがって、この場合に前記光照射部に求められる役割としては、前記光学プリズムを介して前記センサチップに対し全反射条件で光を照射することのみであり、前記光学プリズムを用いる場合、光源の選択に制限がない。
<Light irradiation part>
The light irradiation unit is a unit that can irradiate the sensor chip with light from the light transmissive substrate side under the total reflection condition via the optical prism.
There is no restriction | limiting in particular as a light source of the said light irradiation part, According to the objective, it can select suitably, A well-known lamp | ramp, LED, a laser, etc. are mentioned.
When the sensor chip is irradiated with light through the optical prism under total reflection conditions, a waveguide mode is formed in the first layer and the second layer of the sensor chip.
Therefore, in this case, the role required of the light irradiation unit is only to irradiate light to the sensor chip through the optical prism under a total reflection condition. When the optical prism is used, the light source is selected. There is no limit.
ランプ、ＬＥＤ等の放射光源を用いる場合には、入射角度を一定にすることが好ましい。こうしたことから、放射光源を用いる場合には、照射光の照射方向を特定の方位に規制するコリメートレンズ等の案内部を用いることが好ましい。 When a radiation light source such as a lamp or LED is used, the incident angle is preferably constant. For this reason, when a radiation light source is used, it is preferable to use a guide unit such as a collimator lens that regulates the irradiation direction of the irradiation light to a specific direction.
＜光検出部＞
前記光検出部は、前記センサチップの裏面側から全反射条件で照射された光の反射光及び前記センサチップに対し裏面側から全反射条件で光を照射することに基づいて発せられる前記標的物質の存在に伴う蛍光又は散乱光のいずれかの光を検出する部である。
前記光検出部としては、特に制限はなく、フォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳイメージセンサなどの光検出器を用いることができる。また、反射光スペクトルを観測して、検出光強度の波長依存性を測定する場合には、光検出部に分光器を用いることが好ましい。
<Light detector>
The light detection unit is configured to emit reflected light from the back surface side of the sensor chip under the total reflection condition and the target substance that is emitted based on the light irradiation from the back surface side to the sensor chip under the total reflection condition. It is a part for detecting either fluorescence or scattered light associated with the presence of.
There is no restriction | limiting in particular as said light detection part, Photodetectors, such as a photodiode, a photomultiplier tube, CCD, a CMOS image sensor, can be used. In addition, when the reflected light spectrum is observed and the wavelength dependence of the detected light intensity is measured, it is preferable to use a spectroscope for the light detection unit.
また、前記光検出部の構成としては、前記導波モードセンサのセンシング態様に応じて設定される。
即ち、前記導波モードセンサによるセンシング態様としては、前記センサチップの裏面側から全反射条件で照射された光の反射光を検出するタイプと、前記センサチップに対し裏面側から全反射条件で光を照射することに基づいて発せられる前記標的物質の存在に伴う蛍光又は散乱光タイプとで、２つに大別される。
前記反射光を検出するタイプでは、前記反射光の経路上に前記光検出部を配し、前記蛍光又は前記散乱光を検出するタイプでは、前記蛍光又は前記散乱光が発せられる前記センサチップの表面上に前記光検出部を配することで、これら２つのタイプの前記導波モードセンサが構成される。
In addition, the configuration of the light detection unit is set according to the sensing mode of the waveguide mode sensor.
That is, the sensing mode by the waveguide mode sensor includes a type that detects the reflected light of the light irradiated from the back side of the sensor chip under the total reflection condition and the light from the back side of the sensor chip under the total reflection condition. Fluorescence or scattered light type accompanying the presence of the target substance that is emitted based on the irradiation of the target substance.
In the type of detecting the reflected light, the surface of the sensor chip from which the fluorescence or the scattered light is emitted in the type of detecting the fluorescence or the scattered light by arranging the light detection unit on the path of the reflected light. These two types of waveguide mode sensors are configured by disposing the light detection unit thereon.
（標的物質検出方法）
本発明の前記標的物質検出方法について、前記標的物質検出方法に好適に用いられる前記導波モードセンサについての説明を交えつつ、以下に説明する。
(Target substance detection method)
The target substance detection method of the present invention will be described below with an explanation of the waveguide mode sensor suitably used for the target substance detection method.
前記標的物質検出方法は、ビオチン固定化工程と、混合液調製工程と、混合液導入工程と、標的物質検出工程とを含む。 The target substance detection method includes a biotin immobilization step, a mixed solution preparation step, a mixed solution introduction step, and a target substance detection step.
−ビオチン固定化工程−
前記ビオチン固定化工程は、前記導波モードセンサの前記センサチップの表面にビオチンを固定化する工程である。
前記ビオチンは、比較的低分子で安定性が高く、また、前記センサチップの表面に固定化される前記ビオチンの量は、制御が容易であるので、製造が容易であり、安定供給及び長期保存が可能な前記センサチップを提供することができる。
前記センサチップの表面に前記ビオチンを固定化する方法としては、特に制限はなく、公知の固定化法の中から適宜選択することができる。
前記公知の固定化法の一例としては、次の通りである。
-Biotin immobilization process-
The biotin immobilization step is a step of immobilizing biotin on the surface of the sensor chip of the waveguide mode sensor.
The biotin is a relatively small molecule and has high stability, and the amount of biotin immobilized on the surface of the sensor chip is easy to control, so that it is easy to manufacture, stable supply and long-term storage. It is possible to provide the sensor chip capable of.
The method for immobilizing the biotin on the surface of the sensor chip is not particularly limited and can be appropriately selected from known immobilization methods.
An example of the known immobilization method is as follows.
先ず、センサチップをアセトンで超音波洗浄した後、エタノールにて超音波洗浄し、センサチップ表面の清浄な状態にする。
次いで、3-Aminopropyltriethoxysilane（APTES、信越化学工業社製、LS-3150）の０．１体積％エタノール溶液に前記センサチップを常温で２４時間浸漬することで、前記センサチップ表面に3-Aminopropyltriethoxysilaneを固定して前記センサチップ表面をアミノ化する表面修飾を行う。
次いで、溶液から取り出した前記センサチップに対し、アセトンによるリンス、エタノール中での３分間の超音波洗浄、１ｍＭのＮａＯＨ溶液中での３分間の超音波洗浄、１ｍＭのＨＣｌ溶液中での３分間の超音波洗浄、超純水中での３分間の超音波洗浄、及び窒素ブローによる乾燥の各処理をこの順で行う。
次いで、ビオチン部位を有する化合物であるBiotin-(AC5)2 Sulfo-Osu（同仁化学社製、Ｃ２６Ｈ４０Ｎ５ＮａＯ１０Ｓ２＝６６９．７５）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬工業社１０×ＰＢＳ（−）を１０倍希釈して使用）中に３５０μｇ／ｍＬの含有量で混合した溶液中にセンサチップを常温で２４時間浸漬させる。
次いで、溶液から取り出したセンサチップに対し、Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社、製品コードＴ０５４３）を０．０５質量％含む超純水によるリンス、超純水による３回のリンス、及び乾燥の各処理をこの順で行う。
以上の手順により、前記センサチップの表面に前記ビオチンが固定化される。
First, the sensor chip is ultrasonically cleaned with acetone and then ultrasonically cleaned with ethanol to make the sensor chip surface clean.
Next, 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., LS-3150) is immersed in a 0.1% by volume ethanol solution at room temperature for 24 hours to fix 3-Aminopropyltriethoxysilane on the surface of the sensor chip. Then, surface modification for aminating the surface of the sensor chip is performed.
Next, the sensor chip taken out from the solution is rinsed with acetone, ultrasonically washed in ethanol for 3 minutes, ultrasonically washed in 1 mM NaOH solution for 3 minutes, and in 1 mM HCl solution for 3 minutes. The ultrasonic cleaning, the ultrasonic cleaning in ultrapure water for 3 minutes, and the drying by nitrogen blowing are performed in this order.
Subsequently, Biotin- (AC 5 ) 2 Sulfo-Osu (manufactured by Dojindo, C 26 H 40 N 5 NaO 10 S 2 = 669.75), a compound having a biotin moiety, was added to phosphate buffered saline (PBS). The sensor chip is immersed in a solution mixed at a content of 350 μg / mL in Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (10 × PBS (−) diluted 10 times) for 24 hours at room temperature.
Next, the sensor chip taken out from the solution is rinsed with ultrapure water containing 0.05% by weight of Tween 20 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., product code T0543), rinsed three times with ultrapure water, and dried. Perform in this order.
By the above procedure, the biotin is immobilized on the surface of the sensor chip.
前記公知の固定化法では、概して、アミノ基を有する化合物を前記センサチップ表面に固定して前記センサチップ表面をアミノ化する第１の表面修飾ステップと、ビオチン部位を有する化合物を導入して前記アミノ基と結合させ、前記センサチップ表面を前記ビオチン化する第２の表面修飾ステップとのマルチステップにより実施される。
しかし、前記各表面修飾ステップの実施には、比較的複雑な操作が必要であり、前記ビオチンの固定化に対する再現性が低く、最適化が求められる。
また、表面に前記ビオチンが固定化された前記センサチップを量産する場合、工程数が増えることで製品間のバラツキを抑えるための管理項目が増えるため、製品の安定供給、歩留りの向上においても不利となる。
In the known immobilization method, generally, a first surface modification step in which a compound having an amino group is immobilized on the surface of the sensor chip to aminate the surface of the sensor chip, and a compound having a biotin moiety is introduced to This is performed by a multi-step with a second surface modification step for binding to an amino group and biotinylating the surface of the sensor chip.
However, each surface modification step requires a relatively complicated operation, has low reproducibility for immobilization of biotin, and requires optimization.
In addition, when mass-producing the sensor chip with the biotin immobilized on its surface, the number of processes increases, so the number of management items for suppressing variation between products increases, which is disadvantageous for stable supply of products and improvement of yield. It becomes.
そのため、１ステップで前記センサチップ表面を前記ビオチン化する１ステップ方法が好ましい。
前記１ステップ方法では、前記ビオチン固定化工程が、シラン化合物にビオチンが付加されたビオチニル化シランカップリング剤の溶液をセンサチップの表面に接触させた後、前記センサチップを乾燥させる工程として実施される。
即ち、前記センサチップの表面と結合するシラン部位とビオチン部位とを併せ持つ前記ビオチニル化シランカップリング剤を用いることで、これまでマルチステップにより実施されていた前記センサチップの表面に前記ビオチンを固定化する工程を１ステップで行う。
Therefore, a one-step method of biotinylating the sensor chip surface in one step is preferable.
In the one-step method, the biotin immobilization step is performed as a step of bringing the biotinylated silane coupling agent in which biotin is added to the silane compound into contact with the surface of the sensor chip and then drying the sensor chip. The
That is, by using the biotinylated silane coupling agent having both a silane moiety and a biotin moiety that bind to the surface of the sensor chip, the biotin is immobilized on the surface of the sensor chip, which has been performed by multi-steps so far. The process is performed in one step.
前記ビオチニル化シランカップリング剤としては、前記シラン部位と前記ビオチン部位とを併せ持つものであれば、特に制限はなく用いることができる。
例えば、下記一般式（Ａ）に示すビオチニル化シランカップリング剤を用いることができる。
ただし、前記一般式（Ａ）中、Ｘは、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ等のハロゲン原子を示し、Ｙは、エトキシ基等のアルコキシ基を示し、Ｒは、アルキル基、エチレングリコール鎖、アラルキル鎖、エーテル鎖、チオエーテル鎖等の二価の鎖状基を示し、ｎは、０〜３の整数を示す。
The biotinylated silane coupling agent is not particularly limited as long as it has both the silane moiety and the biotin moiety.
For example, a biotinylated silane coupling agent represented by the following general formula (A) can be used.
However, in the said general formula (A), X shows halogen atoms, such as F, Cl, Br, Y shows alkoxy groups, such as an ethoxy group, R shows an alkyl group, an ethylene glycol chain, an aralkyl chain, A divalent chain group such as an ether chain or thioether chain is shown, and n is an integer of 0 to 3.
中でも、本発明者らが新たに合成した、下記一般式（１）に示す化合物が好ましい。
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数が２〜１０のアルキレン基を示し、Ｒ２は、炭素数が２〜１５のアルキレン基を示す。
Among these, a compound newly synthesized by the present inventors and represented by the following general formula (1) is preferable.
However, the general formula (1), R 1 is an alkylene group having a carbon number of 2 to 10, R 2 has a carbon number of an alkylene group of 2 to 15.
以下では、前記一般式（１）で示すビオチニル化シランカップリング剤の代表例として、１１−ビオチニル化アミノウンデカン（トリエトキシシリルプロピル）チオエーテル（以下、１１−ビオチン化シランカップリング剤）の合成方法を説明するが、出発物質の炭素鎖長を選択することで、前記一般式（１）中のＲ１，Ｒ２に該当する任意の炭素鎖長のビオチニル化シランカップリング剤を前記合成方法に準じて合成することができる。 Hereinafter, as a representative example of the biotinylated silane coupling agent represented by the general formula (1), a method for synthesizing 11-biotinylated aminoundecane (triethoxysilylpropyl) thioether (hereinafter referred to as 11-biotinylated silane coupling agent). However, by selecting the carbon chain length of the starting material, a biotinylated silane coupling agent having an arbitrary carbon chain length corresponding to R 1 and R 2 in the general formula (1) is added to the synthesis method. It can be synthesized accordingly.
＜１１−ビオチニル化シランカップリング剤の合成＞
（１）先ず、下記スキーム（１）に従って、１１−アジ化ウンデセンを合成する。
<Synthesis of 11-biotinylated silane coupling agent>
(1) First, 11-azidundecene is synthesized according to the following scheme (1).
具体的には、先ず、三口フラスコ（１００ｍＬ）に１１−ブロモウンデセン２．３３ｇ（１０ｍｍｏｌ）とＤＭＦ８０ｍＬを入れ、室温で撹拌する。次いで、アジ化ナトリウム１．３０ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１２時間撹拌する。次いで、放冷後反応液を５質量％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出する。次いで、クロロホルム、ＤＭＦを留去し、減圧乾燥して粗１１−アジ化ウンデセンを合成する。
なお、この手法により実際に合成した前記粗１１−アジ化ウンデセンは、次のように得られた。
・無色液体
・粗収率１００％
・Ｃ１１Ｈ２１Ｎ３、Ｍ＝１９５．３１
Specifically, first, 2.33 g (10 mmol) of 11-bromoundecene and 80 mL of DMF are put into a three-necked flask (100 mL), and stirred at room temperature. Next, 1.30 g (20 mmol) of sodium azide is added and stirred at 80 ° C. for 12 hours. Subsequently, after cooling, the reaction solution is poured into 100 mL of 5% by mass hydrochloric acid and extracted with 100 mL of chloroform. Subsequently, chloroform and DMF are distilled off and dried under reduced pressure to synthesize crude 11-azide undecene.
The crude 11-azide undecene actually synthesized by this method was obtained as follows.
-Colorless liquid-100% crude yield
C 11 H 21 N 3 , M = 195.31
（２）次いで、下記スキーム（２）に従って、１１−アミノウンデセンを合成する。 (2) Next, 11-aminoundecene is synthesized according to the following scheme (2).
具体的には、先ず、三口フラスコ（３００ｍＬ）に前記粗１１−アジ化ウンデセン１．９５ｇ（１０ｍｍｏｌ）、水４ｍＬ、ＴＨＦ１００ｍＬを入れ、０℃で撹拌する。次いで、トリフェニルホスフィン３．９３ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２５ｍＬを滴下し、室温で１２時間撹拌する。次いで、ＴＨＦを留去し、シリカゲルカラム（濃度勾配；クロロホルム：メタノール＝１００：２→１００：１００）を用いて前記１１−アミノウンデセンを精製する。
なお、この手法により実際に合成した前記１１−アミノウンデセンは、次のように得られた。
・淡黄色液体
・収率８３％
・Ｃ１１Ｈ２３Ｎ、Ｍ＝１６９．３１
Specifically, first, 1.95 g (10 mmol) of the crude 11-azide undecene, 4 mL of water, and 100 mL of THF are placed in a three-necked flask (300 mL), and the mixture is stirred at 0 ° C. Next, 25 mL of a THF solution of 3.93 g (15 mmol) of triphenylphosphine is dropped, and the mixture is stirred at room temperature for 12 hours. Next, THF is distilled off, and the 11-aminoundecene is purified using a silica gel column (concentration gradient; chloroform: methanol = 100: 2 → 100: 100).
The 11-aminoundecene actually synthesized by this method was obtained as follows.
-Light yellow liquid-Yield 83%
C 11 H 23 N, M = 169.31
（３）次いで、下記スキーム（３）に従って、ビオチンアミドウンデセンを合成する。 (3) Next, biotinamide undecene is synthesized according to the following scheme (3).
具体的には、先ず、三口フラスコ（１００ｍＬ）に窒素雰囲気下ビオチン４８８ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、前記１１−アミノウンデセン３３９ｍｇ（２ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）３２４ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３１０ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）、脱水ＤＭＦ３０ｍＬのそれぞれを加え、氷冷する。次いで、ベンゾトリアゾールイルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）９３４ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液３０ｍＬを滴下し、窒素雰囲気下室温で１２時間撹拌する。ＤＭＦを留去し、得られた残渣を５質量％塩酸１００ｍＬに注ぎ、クロロホルム１００ｍＬで抽出し、クロロホルム層を５質量％塩酸１００ｍＬで三回洗浄する。クロロホルムを留去し、シリカゲルカラム（濃度勾配；クロロホルム：メタノール＝１００：２→１００：５）を用いて前記ビオチンアミドウンデセンを精製する。
なお、この手法により実際に合成した前記ビオチンアミドウンデセンは、次のように得られた。
・無色固体（ゲル状）
・収率７０％
・Ｃ２１Ｈ３７Ｎ３Ｏ２Ｓ、Ｍ＝３９５．６０
Specifically, first, in a three-necked flask (100 mL), 488 mg (2 mmol) of biotin, 339 mg (2 mmol) of 11-aminoundecene, 324 mg (2.4 mmol) of hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropylethylamine (DIEA) in a nitrogen atmosphere. ) Add 310 mg (2.4 mmol) and 30 mL of dehydrated DMF, and cool with ice. Subsequently, 30 mL of dehydrated DMF solution of 934 mg (2.2 mmol) of benzotriazolyltetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) is added dropwise and stirred at room temperature for 12 hours under a nitrogen atmosphere. DMF is distilled off, and the resulting residue is poured into 100 mL of 5% by mass hydrochloric acid, extracted with 100 mL of chloroform, and the chloroform layer is washed three times with 100 mL of 5% by mass hydrochloric acid. Chloroform was distilled off, and the biotinamide undecene was purified using a silica gel column (concentration gradient; chloroform: methanol = 100: 2 → 100: 5).
The biotinamide undecene actually synthesized by this method was obtained as follows.
・ Colorless solid (gel)
・ Yield 70%
· C 21 H 37 N 3 O 2 S, M = 395.60
（４）次いで、下記スキーム（４）に従って、前記１１−ビオチニル化シランカップリング剤を合成する。 (4) Next, the 11-biotinylated silane coupling agent is synthesized according to the following scheme (4).
具体的には、ナスフラスコ（５０ｍＬ）に前記ビオチンアミドウンデセン１９９ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、２，２’−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）５．１ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン２３８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、脱水ジクロロメタン３０ｍＬのそれぞれを加え、素早く撹拌しながらジクロロメタンを留去して減圧乾燥（０℃、５分）し、紫外光を３０分間まんべんなく照射する。次いで、シリカゲルカラム（濃度勾配；クロロホルム：エタノール＝１００：２→１００：１０）を用いて前記１１−ビオチニル化シランカップリング剤を精製する。
なお、この手法により実際に合成した前記１１−ビオチニル化シランカップリング剤は、次のように得られた。
・無色固体
・収率６６％
・Ｃ３０Ｈ５９Ｎ３Ｏ５Ｓ２Ｓｉ、Ｍ＝６３４．０２
Specifically, 199 mg (0.5 mmol) of biotinamide undecene, 5.1 mg (0.02 mmol) of 2,2′-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA), mercaptopropyltriethoxy were added to an eggplant flask (50 mL). Add each of 238 mg (1 mmol) of silane and 30 mL of dehydrated dichloromethane, distill off dichloromethane with rapid stirring, dry under reduced pressure (0 ° C., 5 minutes), and irradiate with UV light evenly for 30 minutes. Next, the 11-biotinylated silane coupling agent is purified using a silica gel column (concentration gradient; chloroform: ethanol = 100: 2 → 100: 10).
The 11-biotinylated silane coupling agent actually synthesized by this method was obtained as follows.
-Colorless solid-Yield 66%
· C 30 H 59 N 3 O 5 S 2 Si, M = 634.02
次に、前記１１−ビオチニル化シランカップリング剤による前記センサチップ表面のビオチン化の手順について説明する。
先ず、前記センサチップをアセトンで超音波洗浄した後、エタノールにて超音波洗浄し、センサチップ表面の清浄な状態にする。
次いで、前記１１−ビオチニル化シランカップリング剤を１ｍＭ含むトルエン溶液中に前記センサチップを浸漬して２０℃で２週間放置する。この放置期間は、浸漬時の温度を４０℃にすると２４時間にまで短縮が可能である。
次いで、浸漬後、前記センサチップを溶液から取り出し、トルエンでリンスして、アセトンでリンス後、窒素ブローにて乾燥させる。
以上のプロセスで、前記センサチップの表面に前記ビオチンを固定化することができる。前記１１−ビオチニル化シランカップリング剤を用いる方法では、前記トルエン溶液中に前記センサチップを所定の時間浸漬させ、その後リンスし乾燥するだけ（１ステップ）でビオチン化が行うことができ、前記公知の固定化法（マルチステップ）における不利な点を解消することができる。
即ち、前記１ステップによる方法では、前記公知の固定化法（マルチステップ）よりも工程が単純で、再現性が高く、量産時に製品のバラツキを抑えることができる。
Next, a procedure for biotinylation of the sensor chip surface with the 11-biotinylated silane coupling agent will be described.
First, the sensor chip is ultrasonically cleaned with acetone and then ultrasonically cleaned with ethanol to make the sensor chip surface clean.
Next, the sensor chip is immersed in a toluene solution containing 1 mM of the 11-biotinylated silane coupling agent and left at 20 ° C. for 2 weeks. This standing period can be shortened to 24 hours when the temperature during immersion is 40 ° C.
Next, after immersion, the sensor chip is taken out of the solution, rinsed with toluene, rinsed with acetone, and dried by nitrogen blowing.
Through the above process, the biotin can be immobilized on the surface of the sensor chip. In the method using the 11-biotinylated silane coupling agent, biotinylation can be performed only by immersing the sensor chip in the toluene solution for a predetermined time, and then rinsing and drying (one step). The disadvantages of the immobilization method (multi-step) can be solved.
In other words, the method according to the one step is simpler than the known immobilization method (multi-step), has high reproducibility, and can suppress product variations during mass production.
また、こうした観点から、前記導波モードセンサとしては、前記ビオチニル化シランカップリング剤により表面修飾された前記センサチップが配されたものを用いることが好ましく、中でも、前記ビオチニル化シランカップリング剤が、前記一般式（１）に示す化合物であることが特に好ましい。 From this point of view, it is preferable to use the waveguide mode sensor in which the sensor chip surface-modified with the biotinylated silane coupling agent is used. Among them, the biotinylated silane coupling agent is preferably used. The compound represented by the general formula (1) is particularly preferable.
＜混合液調製工程＞
前記混合液調製工程は、検出対象となる前記標的物質の存在が検証される被検体と、少なくともストレプトアビジン及びアビジンのいずれかから選択されるビオチン結合体及び前記ビオチン結合体と結合されるとともに前記標的物質と結合して捕捉可能とされる第１の標的物質捕捉物質を含む試薬とが混合された混合液を調製する工程である。
<Mixed liquid preparation process>
In the mixed solution preparation step, the target to be detected is verified, the biotin conjugate selected from at least one of streptavidin and avidin, and the biotin conjugate are combined with the analyte. This is a step of preparing a mixed solution in which a reagent containing a first target substance capturing substance that can be captured by binding to a target substance is mixed.
前記第１の標的物質捕捉物質としては、前記標的物質を特異的に捕捉する物質であれば、特に制限はなく、前記標的物質の設定や目的に応じて適宜選択することができ、前記標的物質に対する抗体やアプタマー等が挙げられる。
前記第１の標的物質捕捉物質に前記ビオチン結合体を付加する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のストレプトアビジン標識キット等を用いる方法が挙げられる。
The first target substance capturing substance is not particularly limited as long as it is a substance that specifically captures the target substance, and can be appropriately selected according to the setting and purpose of the target substance. For example, antibodies and aptamers.
The method for adding the biotin conjugate to the first target substance-capturing substance is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include a method using a commercially available streptavidin labeling kit or the like. It is done.
前記試薬としては、更に前記導波モードセンサでセンシング可能な標識物質と、前記標識物質と結合されるとともに前記標的物質と結合して捕捉可能とされる第２の標的物質捕捉物質とを含み得る。
前記標識物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、色素や、色付きのビーズ、金属ナノ粒子などが挙げられる。これらの中でも、可視光領域において光吸収性を有する色素及びナノ粒子、蛍光を発する色素及び微粒子、散乱光を発する微粒子が好ましく、金ナノ粒子が特に好ましい。なお、微粒子とは、最大径が１ｎｍ〜１μｍである粒子を指す。
前記金ナノ粒子の形状としては、特に制限はなく、球状、楕円球状、板状等のものを用いることができる。
前記金ナノ粒子の大きさとしては、形状に制限がないため体積換算とすると、６．５×１０−２０ｃｍ３〜１．１×１０−１６ｃｍ３が好ましい。この大きさは、前記金ナノ粒子の形状が球状である場合、直径５ｎｍ〜６０ｎｍに相当する。以下、球状である場合として好ましい大きさを説明する。
即ち、前記球状の金ナノ粒子の直径が５ｎｍ未満であると、信号が弱く検知が困難になり易く、また、粒径の揃ったものを入手することが困難となり易い。
また、前記球状の金ナノ粒子の直径が６０ｎｍを超えると、重力による沈降がブラウン運動に打ち勝ち自重により前記センサチップの表面まで沈むことがある。自重によって沈んだ粒子は、信号として検知されてしまうことから、誤検知の原因となる。こうした観点からは、前記球状の金ナノ粒子の直径が４０ｎｍ以下であることがより好ましい。ただし、前記球状の金ナノ粒子の直径が４０ｎｍを超える場合でも、６０ｎｍ以下であれば、沈降速度が遅いため、測定を数分以内に完了させる場合には用いることができる。なお、直径４０ｎｍの前記球状の金ナノ粒子を体積換算すると、３．４×１０−１７ｃｍ３となる。
The reagent may further include a labeling substance that can be sensed by the waveguide mode sensor, and a second target substance capturing substance that is bound to the labeling substance and can be captured by binding to the target substance. .
There is no restriction | limiting in particular as said label | marker substance, According to the objective, it can select suitably, A pigment | dye, a colored bead, a metal nanoparticle etc. are mentioned. Among these, dyes and nanoparticles that absorb light in the visible light region, dyes and fine particles that emit fluorescence, and fine particles that emit scattered light are preferable, and gold nanoparticles are particularly preferable. The fine particles refer to particles having a maximum diameter of 1 nm to 1 μm.
There is no restriction | limiting in particular as a shape of the said gold nanoparticle, A spherical shape, an ellipsoidal shape, plate shape, etc. can be used.
The size of the gold nanoparticles is preferably 6.5 × 10 −20 cm 3 to 1.1 × 10 −16 cm 3 in terms of volume since there is no limitation on the shape. This size corresponds to a diameter of 5 nm to 60 nm when the shape of the gold nanoparticles is spherical. Hereinafter, a preferable size as a spherical shape will be described.
That is, if the diameter of the spherical gold nanoparticle is less than 5 nm, the signal is weak and detection is difficult, and it is difficult to obtain a product having a uniform particle size.
In addition, when the diameter of the spherical gold nanoparticle exceeds 60 nm, the sedimentation due to gravity overcomes the Brownian motion and may sink to the surface of the sensor chip due to its own weight. Particles that have sunk due to their own weight are detected as a signal, causing false detection. From such a viewpoint, it is more preferable that the spherical gold nanoparticles have a diameter of 40 nm or less. However, even when the diameter of the spherical gold nanoparticle exceeds 40 nm, if it is 60 nm or less, the sedimentation rate is slow, so that it can be used when the measurement is completed within a few minutes. In addition, it becomes 3.4 * 10 <-17> cm < 3 > when the said spherical gold nanoparticle of diameter 40nm is converted into a volume.
前記標識物質は、前記標的物質自身が前記反射光の特性変化を付与するか、前記蛍光又は前記散乱光を発する場合には必要ないが、前記標的物質がこのような性質を持たない場合に、前記導波モードセンサでのセンシングのために用いられる。
例えば、前記標的物質がタンパク質等の透明物質である場合について図１を参照しつつ説明する。
図１は、特定の入射角度でブロードな波長特性を持つ光を入射した時の特定波長における急激な反射光強度の減少によって生じるディップの検出例を示す図である。
前記透明物質が前記センサチップの表面に吸着されると、ディップの位置は、横方向（長波長方向）に移動する。一方、このセンサチップ表面に、この波長帯で光吸収を持つ物質（前記標識物質）が吸着すると、ディップ底部の深さがより深くなる。
この場合、ディップの変化の仕方は、前記標的物質がない場合と、ある場合とで以下のような変化の仕方をする。
即ち、前記標的物質がないときは、前記ビオチン結合体（前記ストレプトアビジン等）付きの前記第１の標的捕捉物質（抗体など）が前記センサチップ表面に吸着するが、この時、前記ビオチン結合体も前記第１の標的捕捉物質も透明であると、ディップは横方向に動く。
一方、前記標的物質があるときは、前記ビオチン結合体付きの前記第１の標的捕捉物質−前記標的物質−前記標識物質の結合体が前記センサチップ表面に吸着するが、この時、前記ビオチン結合体、前記第１の標的捕捉物質及び前記標的物質が透明であることから、ディップが横方向に動くものの、前記標識物質は、光吸収を持つ物質を用いるため、ディップ底部の深さがより深くなる方向にシフトする。
以上から、ディップの横方向の動きに注目しても、前記標的物質があるかないかは判定できないが、ディップの深さをモニターすることによって、前記標的物質の存在を検知でき、また、ディップ深さの変化量から、前記標的物質の量を測定することができる。
更に、前記被検体に不純物が含まれる場合があるが、一般に不純物は透明な物質であることが多い。よって、ディップの深さを測定する手法を用いれば、不純物吸着の影響を受けにくいというメリットもある。
The labeling substance is not necessary when the target substance itself gives a change in the characteristics of the reflected light or emits the fluorescence or the scattered light, but when the target substance does not have such a property, Used for sensing by the waveguide mode sensor.
For example, the case where the target substance is a transparent substance such as protein will be described with reference to FIG.
FIG. 1 is a diagram illustrating an example of detecting a dip caused by a sudden decrease in reflected light intensity at a specific wavelength when light having a broad wavelength characteristic is incident at a specific incident angle.
When the transparent substance is adsorbed on the surface of the sensor chip, the position of the dip moves in the lateral direction (long wavelength direction). On the other hand, when a substance having light absorption in this wavelength band (the labeling substance) is adsorbed on the surface of the sensor chip, the depth of the dip bottom becomes deeper.
In this case, the dip changes depending on whether the target substance is not present or not.
That is, when there is no target substance, the first target capture substance (such as an antibody) with the biotin conjugate (such as the streptavidin) is adsorbed on the surface of the sensor chip. If the first target capture material is also transparent, the dip moves laterally.
On the other hand, when the target substance is present, the conjugate of the first target capture substance with the biotin conjugate, the target substance, and the labeling substance is adsorbed on the surface of the sensor chip. Since the body, the first target capture substance and the target substance are transparent, the dip moves in the lateral direction, but the labeling substance uses a substance having light absorption, so that the depth of the dip bottom is deeper. Shift in the direction.
From the above, it is not possible to determine whether or not the target substance is present even if attention is paid to the lateral movement of the dip, but the presence of the target substance can be detected by monitoring the dip depth, and the dip depth can be detected. The amount of the target substance can be measured from the amount of change in thickness.
Furthermore, the analyte may contain impurities, but in general, the impurities are often transparent substances. Therefore, if a technique for measuring the depth of the dip is used, there is an advantage that it is hardly affected by impurity adsorption.
前記標識物質としては、前記標識物質自身が前記標的物質に吸着する性質を有するものであれば、そのまま使用することが可能である。しかし、前記標識物質そのものが前記標的物質に吸着する性質を持たない場合には、前記標識物質と結合されるとともに前記標的物質と結合して捕捉可能とされる前記第２の標的物質捕捉物質を付加して使用する。
前記第２の標的物質捕捉物質としては、前記標識物質と結合し、前記標的物質を特異的に捕捉する物質であれば、特に制限はなく、前記標識物質、前記標的物質の設定や目的に応じて適宜選択することができ、前記標的物質に対する抗体やアプタマー等が挙げられる。
The labeling substance can be used as it is as long as the labeling substance itself has a property of adsorbing to the target substance. However, when the labeling substance itself does not have the property of adsorbing to the target substance, the second target substance capturing substance that is bound to the labeling substance and binds to the target substance and can be captured. Use with additional.
The second target substance capturing substance is not particularly limited as long as it is a substance that binds to the labeling substance and specifically captures the target substance, depending on the setting and purpose of the labeling substance and the target substance. And antibodies and aptamers against the target substance can be mentioned.
ところで、前記標識物質と、前記標識物質付きの前記第２の標的物質捕捉物質としては、前記混合液に含めず、後述の前記混合液導入工程により前記センサチップ表面に前記ビオチン−前記ビオチン結合体付きの前記第１の標的物質捕捉物質−前記標識物質の結合体が形成された状態で、改めてこれらを含む導入液を前記センサチップ表面上に導入することもできる。
しかしながら、従来技術における、前記センサチップの表面上にストレプトアビジン又はアビジンに前記抗体を結合させた前記試薬と前記被検体液とを別々に取り扱う場合と同様に、前記混合液と前記導入液とを別々に取り扱うと、スペースが限られた前記センサチップの表面上で、前記標的物質と前記第２の標的物質捕捉物質とを結合させるための前記混合液と前記導入液との混合を行う必要があり、検出処理を行う前の作業が煩雑となる。
よって、前記標識物質及び前記標識物質付きの前記第２の標的物質捕捉物質としては、前記試薬に含ませ、一つの前記混合液中で取り扱うことが好ましい。
By the way, the labeling substance and the second target substance-capturing substance with the labeling substance are not included in the mixed solution, and the biotin-biotin conjugate is formed on the surface of the sensor chip by the mixed solution introducing step described later. In the state where the first target substance-capturing substance-labeled substance combination is formed, an introduction liquid containing these can be introduced again onto the surface of the sensor chip.
However, in the prior art, as in the case where the reagent and the analyte liquid in which the antibody is bound to streptavidin or avidin on the surface of the sensor chip are handled separately, the mixed liquid and the introduction liquid are mixed. When handled separately, it is necessary to mix the mixed solution and the introduction solution for binding the target substance and the second target substance capturing substance on the surface of the sensor chip with limited space. In addition, the work before performing the detection process becomes complicated.
Therefore, the labeling substance and the second target substance-capturing substance with the labeling substance are preferably included in the reagent and handled in one mixed solution.
＜混合液導入工程＞
前記混合液導入工程は、前記ビオチンが固定化された前記センサチップの表面上に前記混合液を導入する工程である。
前記センサチップの表面上に前記混合液が導入されると、前記混合液の含有成分に応じて、前記ビオチン結合体付きの前記第１の標的捕捉物質−前記標的物質、前記ビオチン結合体付きの前記第１の標的捕捉物質−前記標的物質−前記標識物質の結合体及び前記ビオチン結合体付きの前記第１の標的捕捉物質−前記標的物質−前記標識物質付きの前記第２の標的物質捕捉物質のいずれかが、前記ビオチン結合体を介して前記センサチップ表面上に固定されることとなる。
したがって、前記導波モードセンサによるセンシング前の前処理を著しく簡素化させることができる。
<Mixed liquid introduction process>
The mixed solution introducing step is a step of introducing the mixed solution onto the surface of the sensor chip on which the biotin is immobilized.
When the mixed solution is introduced onto the surface of the sensor chip, the first target capturing substance with the biotin conjugate-the target substance, with the biotin conjugate is added according to the components contained in the mixed solution. The first target capture substance-the target substance-the conjugate of the label substance and the first target capture substance with the biotin conjugate-the target substance-the second target substance capture substance with the label substance Any one of the above is immobilized on the surface of the sensor chip via the biotin conjugate.
Therefore, pre-processing before sensing by the waveguide mode sensor can be remarkably simplified.
前記混合液の導入方法としては、特に制限はなく、前記センサチップの表面上に導入された前記混合液をカバーガラスで覆い、保持することや、前記センサチップに前記液体試料槽が形成される場合には、前記液体試料槽内に前記混合液を導入することが挙げられる。
また、前記混合液を前記センサチップの表面上に導入後、前記ビオチンと前記ビオチン結合体との結合等のために必要な時間分、前記混合液を静置してもよいし、必要に応じて前記センサチップの表面上に導入された状態の前記混合液を攪拌等してもよい。
The method for introducing the mixed liquid is not particularly limited, and the mixed liquid introduced onto the surface of the sensor chip is covered with a cover glass and held, or the liquid sample tank is formed on the sensor chip. In some cases, the liquid mixture may be introduced into the liquid sample tank.
In addition, after introducing the mixed solution onto the surface of the sensor chip, the mixed solution may be allowed to stand for a time required for binding of the biotin and the biotin conjugate, etc. The mixed solution in a state of being introduced onto the surface of the sensor chip may be stirred.
＜標的物質検出工程＞
前記標的物質検出工程は、前記標的物質を含まない状態の前記混合液、前記被検体と混合されない状態の前記試薬及び前記標的物質の含有量がコントロールされた状態の前記混合液のいずれかである基準液を前記ビオチンが固定化された前記センサチップの表面に導入したときの前記導波モードセンサのセンシング状態を基準状態とし、前記混合液導入工程により前記混合液を導入したときの前記導波モードセンサの前記センシング状態を測定状態として、前記基準状態と前記測定状態とを比較することで前記標的物質を検出する工程である。
<Target substance detection process>
The target substance detection step is any of the mixed liquid that does not contain the target substance, the reagent that is not mixed with the analyte, and the mixed liquid that has a controlled content of the target substance. The sensing state of the waveguide mode sensor when the reference liquid is introduced onto the surface of the sensor chip on which the biotin is immobilized is set as a reference state, and the waveguide when the mixed liquid is introduced by the mixed liquid introduction step. This is a step of detecting the target substance by comparing the reference state and the measurement state with the sensing state of the mode sensor as the measurement state.
前記基準液として、前記標的物質を含まない状態の前記混合液及び前記被検体と混合されない状態の前記試薬を選択すると、前記標的物質の有無、前記標的物質の存在量を検出でき、更に前記基準液として、前記標的物質の含有量がコントロールされた状態の前記混合液を選択すると、前記標的物質の存在量の定量化に役立つ。
なお、前記基準液としては、前記導波モードセンサを用いたセンシングにより、前記標的物質の有無、存在量の定量化のために用いるものであり、センシングに影響を与えない添加剤が加えられていてもよい。
As the reference solution, when the mixed solution not containing the target substance and the reagent not mixed with the analyte are selected, the presence / absence of the target substance and the abundance of the target substance can be detected, and the reference Selecting the mixed solution in which the content of the target substance is controlled as a liquid is useful for quantifying the abundance of the target substance.
The reference liquid is used for quantification of the presence / absence of the target substance and the abundance by sensing using the waveguide mode sensor, and an additive that does not affect the sensing is added. May be.
前記標的物質検出工程としては、前記導波モードセンサによるセンシング態様に応じて実施することができる。
即ち、前記導波モードセンサによるセンシングの実施方法に関する前記第１の方法に応じて、前記導波モードセンサによるセンシングが、センサチップの裏面側から全反射条件で照射された光の反射光を検知して実施されることが挙げられる。
この場合、図１を用いた説明の通り、不純物吸着の影響を抑える観点などから、前記標的物質検出工程としては、前記基準状態と前記測定状態とでそれぞれ検知された反射光の反射光スペクトルにおけるディップ底部の深さを比較して実施されることが好ましい。
また、前記導波モードセンサによるセンシングの実施方法に関する前記第２の方法に応じて、前記導波モードセンサによるセンシングが、前記センサチップに対し裏面側から全反射条件で光を照射することに基づいて発せられる前記標的物質の存在に伴う前記蛍光又は前記散乱光を検知して実施されることが挙げられる。
The target substance detection step can be performed according to the sensing mode by the waveguide mode sensor.
That is, according to the first method related to the sensing method by the waveguide mode sensor, the sensing by the waveguide mode sensor detects reflected light of light irradiated under the total reflection condition from the back surface side of the sensor chip. To be implemented.
In this case, as described with reference to FIG. 1, from the viewpoint of suppressing the influence of impurity adsorption, the target substance detection step includes a reflected light spectrum of reflected light detected in the reference state and the measurement state, respectively. It is preferable to carry out by comparing the depth of the bottom of the dip.
Further, in accordance with the second method related to the sensing method by the waveguide mode sensor, the sensing by the waveguide mode sensor irradiates the sensor chip with light from the back side under total reflection conditions. This is performed by detecting the fluorescence or the scattered light accompanying the presence of the target substance.
（第１実施形態）
次に、本発明の第１の実施形態を図２〜図５を参照しつつ、説明する。なお、図２は、第１実施形態を説明するための説明図であり、図３は、ビオチン固定化工程の概要を示す説明図であり、図４は、混合液調製工程の概要を示す説明図であり、図５は、混合液導入工程の概要を示す説明図である。
(First embodiment)
Next, a first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 2 is an explanatory diagram for explaining the first embodiment, FIG. 3 is an explanatory diagram showing an outline of the biotin immobilization process, and FIG. 4 is an explanation showing an outline of the mixed liquid preparation process. FIG. 5 is an explanatory diagram showing an outline of the mixed liquid introducing step.
図２に示すように、導波モードセンサ１００は、センサチップ１０１と光照射部１０４と光検出部１０５と光学プリズム１０６とを有する。
また、導波モードセンサ１００では、センサチップ１０１の表面上に導入された混合液１０２をカバーガラス１０３で覆うことで、混合液１０２がセンサチップ１０１の表面上に保持される。
この導波モードセンサ１００は、センサチップ１０１の裏面側（光学プリズム１０６と接する側）から全反射条件で照射された光の反射光を検出するタイプの導波モードセンサとなる。
As shown in FIG. 2, the waveguide mode sensor 100 includes a sensor chip 101, a light irradiation unit 104, a light detection unit 105, and an optical prism 106.
In the waveguide mode sensor 100, the mixed liquid 102 introduced onto the surface of the sensor chip 101 is covered with the cover glass 103, whereby the mixed liquid 102 is held on the surface of the sensor chip 101.
The waveguide mode sensor 100 is a type of waveguide mode sensor that detects reflected light of light irradiated under the total reflection condition from the back surface side (side in contact with the optical prism 106) of the sensor chip 101.
第１実施形態に係る標的物質検出方法では、図３に示すように、先ず、混合液１０２がセンサチップ１０１の表面上に導入される前に、センサチップ１０１の表面にビオチン３を固定化する（ビオチン固定化工程）。図３では、前記マルチステップにより、センサチップ１０１の表面にアミノ化表面修飾層２を一旦形成した上で、アミノ化表面修飾層２上にビオチン３を形成しているが、前記ビオチニル化シランカップリング剤を用いた前記１ステップにより、センサチップ１０１の表面に直接、ビオチン３を固定化することもできる。
次いで、図４に示すように、検出対象となる標的物質１３（例えば、抗原）の存在が検証される前記被検体と、前記ストレプトアビジン及び前記アビジンのいずれかから選択されるビオチン結合体１１と、ビオチン結合体１１と結合されるとともに標的物質１３と結合して捕捉可能とされる第１の標的物質捕捉物質１２（例えば、抗体）と、更に導波モードセンサ１００でセンシング可能な標識物質１５（例えば、金ナノ粒子）と、標識物質１５と結合されるとともに標的物質１３と結合して捕捉可能とされる第２の標的物質捕捉物質１４（例えば、抗体）とを含む試薬とが混合された混合液１０２を調製する（混合液調製工程）
次いで、図５に示すように、混合液１０２をセンサチップ１０１の表面上に導入する。
混合液１０２が導入されると、センサチップ１０１の表面上に固定化されたビオチン３と、ビオチン結合体１１、第１の標的物質捕捉物質１２、標的物質１３、第２の標的物質捕捉物質１４及び標識物質とがこの順で結合された結合体とが、ビオチン結合体１１を介して結合され、標的物質１３の存在を検出するための前処理が完了する。
即ち、第１実施形態に係る標的物質検出方法では、センサチップ１０１の表面上に混合液１０２を導入するだけで、標的物質１３の存在を検出するための前処理を完了させることができ、導波モードセンサ１００を用いた標的物質１３の検出操作を著しく簡素化させることができる。
In the target substance detection method according to the first embodiment, as shown in FIG. 3, first, biotin 3 is immobilized on the surface of the sensor chip 101 before the mixed liquid 102 is introduced onto the surface of the sensor chip 101. (Biotin immobilization step). In FIG. 3, after the amination surface modification layer 2 is once formed on the surface of the sensor chip 101 by the multi-step, biotin 3 is formed on the amination surface modification layer 2, but the biotinylated silane cup The biotin 3 can be directly immobilized on the surface of the sensor chip 101 by the one step using a ring agent.
Next, as shown in FIG. 4, the analyte to be verified for the presence of the target substance 13 (for example, antigen) to be detected, and the biotin conjugate 11 selected from one of the streptavidin and the avidin , A first target substance capturing substance 12 (for example, an antibody) that is bound to the biotin conjugate 11 and can be captured by binding to the target substance 13, and a labeling substance 15 that can be sensed by the waveguide mode sensor 100. (For example, gold nanoparticles) and a reagent containing a second target substance capturing substance 14 (for example, an antibody) that is bound to the labeling substance 15 and is capable of being captured by binding to the target substance 13 is mixed. Prepared mixed liquid 102 (mixed liquid preparation step)
Next, as shown in FIG. 5, the mixed liquid 102 is introduced onto the surface of the sensor chip 101.
When the mixed liquid 102 is introduced, biotin 3 immobilized on the surface of the sensor chip 101, biotin conjugate 11, first target substance capturing substance 12, target substance 13, and second target substance capturing substance 14. And the conjugate | bonded_body with which the labeling substance was couple | bonded in this order is couple | bonded via the biotin coupling body 11, and the pre-processing for detecting presence of the target substance 13 is completed.
That is, in the target substance detection method according to the first embodiment, the pretreatment for detecting the presence of the target substance 13 can be completed simply by introducing the mixed liquid 102 onto the surface of the sensor chip 101. The operation of detecting the target substance 13 using the wave mode sensor 100 can be remarkably simplified.
（第２実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態を図６を参照しつつ、説明する。なお、図６は、第２実施形態を説明するための説明図である。
図６に示すように、導波モードセンサ２００は、センサチップ２０１と光照射部２０４と光検出部２０５と光学プリズム２０６とを有する。
また、導波モードセンサ２００では、センサチップ２０１の表面上に導入された混合液２０２をカバーガラス２０３で覆うことで、混合液２０２がンサチップ２０１の表面上に保持される。
この導波モードセンサ２００は、センサチップ２０１に対し裏面側（光学プリズム２０６と接する側）から全反射条件で光を照射することに基づいて発せられる前記標的物質の存在に伴う前記蛍光又は前記散乱光を検出するタイプの導波モードセンサとなる。
即ち、導波モードセンサ２００は、前記反射光の検出のため前記反射光の経路上に光検出部１０５が配される導波モードセンサ１００と異なり、前記蛍光又は前記散乱光（図中「Ｌ」で表示される光）の検出のためセンサチップ２０１上に光検出部２０５が配される。
この他の事項は、導波モードセンサ１００と同様であるため、説明を省略する。
(Second Embodiment)
Next, a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. FIG. 6 is an explanatory diagram for explaining the second embodiment.
As shown in FIG. 6, the waveguide mode sensor 200 includes a sensor chip 201, a light irradiation unit 204, a light detection unit 205, and an optical prism 206.
In the waveguide mode sensor 200, the mixed liquid 202 introduced onto the surface of the sensor chip 201 is covered with the cover glass 203, so that the mixed liquid 202 is held on the surface of the sensor chip 201.
The waveguide mode sensor 200 is configured to emit the fluorescence or the scattering caused by the presence of the target substance emitted from the back surface side (side in contact with the optical prism 206) with respect to the sensor chip 201 under a total reflection condition. This is a waveguide mode sensor of a type that detects light.
That is, the waveguide mode sensor 200 differs from the waveguide mode sensor 100 in which the light detection unit 105 is arranged on the path of the reflected light for detection of the reflected light, and the fluorescence or the scattered light (“L” in the drawing). The light detection unit 205 is arranged on the sensor chip 201 for detection of “light”.
Since other matters are the same as those of the waveguide mode sensor 100, description thereof is omitted.
（実施例１）
実施例１として、本発明の標的物質検出方法を次のように実施した。
導波モードセンサとしては、シーアンドアイ社製の導波モードセンサ（Eva-M01）を使用した。また、センサチップとしては、シーアンドアイ社製の導波モードセンサチップ（M01-35-40-325-01）を使用した。
先ず、センサチップをアセトンで超音波洗浄した後、エタノールにて超音波洗浄し、センサチップ表面の清浄な状態にした。
次いで、3-Aminopropyltriethoxysilane（APTES、信越化学工業社製、LS-3150）の０．１体積％エタノール溶液にセンサチップを常温で２４時間浸漬することで、センサチップ表面に3-Aminopropyltriethoxysilaneを固定してセンサチップ表面をアミノ化する表面修飾を行った。
次いで、溶液から取り出したセンサチップに対し、アセトンによるリンス、エタノール中での３分間の超音波洗浄、１ｍＭのＮａＯＨ溶液中での３分間の超音波洗浄、１ｍＭのＨＣｌ溶液中での３分間の超音波洗浄、超純水中での３分間の超音波洗浄、及び窒素ブローによる乾燥の各処理をこの順で行った。
次いで、ビオチン部位を有する化合物であるBiotin-(AC5)2 Sulfo-Osu（同仁化学社製、Ｃ２６Ｈ４０Ｎ５ＮａＯ１０Ｓ２＝６６９．７５）の３５０μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液中にセンサチップを常温で２４時間浸漬させた。
次いで、溶液から取り出したセンサチップに対し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含む超純水によるリンス、超純水による３回のリンス、及び乾燥の各処理をこの順で行った。
以上の手順により、センサチップ表面にビオチンを固定化した。
Example 1
As Example 1, the target substance detection method of the present invention was performed as follows.
As the guided mode sensor, a guided mode sensor (Eva-M01) manufactured by Sea & Eye Co., Ltd. was used. Further, as a sensor chip, a waveguide mode sensor chip (M01-35-40-325-01) manufactured by Sea & Eye Co., Ltd. was used.
First, the sensor chip was ultrasonically cleaned with acetone and then ultrasonically cleaned with ethanol to make the sensor chip surface clean.
Next, the 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., LS-3150) was immersed in a 0.1% by volume ethanol solution at room temperature for 24 hours to fix 3-Aminopropyltriethoxysilane on the sensor chip surface. The surface modification which aminated the sensor chip surface was performed.
Next, the sensor chip removed from the solution was rinsed with acetone, ultrasonically washed in ethanol for 3 minutes, ultrasonically washed in 1 mM NaOH solution for 3 minutes, and in 1 mM HCl solution for 3 minutes. Each treatment of ultrasonic cleaning, ultrasonic cleaning for 3 minutes in ultra pure water, and drying by nitrogen blowing was performed in this order.
Then, a compound having a biotin moiety Biotin- (AC 5) 2 Sulfo- Osu ( Dojin Chemical Co., Ltd., C 26 H 40 N 5 NaO 10 S 2 = 669.75) a sensor chip to 350 [mu] g / ml PBS solution of It was immersed for 24 hours at room temperature.
Next, the sensor chip taken out from the solution was rinsed with ultrapure water containing 0.05% by mass of Tween 20, rinsed three times with ultrapure water, and dried in this order.
Through the above procedure, biotin was immobilized on the surface of the sensor chip.
検出対象とする標的物質としては、ＣＲＰ抗原（Ｃ反応性蛋白、Fitzgerald社製）を用いた。 As a target substance to be detected, CRP antigen (C-reactive protein, manufactured by Fitzgerald) was used.
第１の標的物質捕捉物質としてAnti-h CRP clone 6405 SPTN-5（code:100358、Medix社製、以下、「６４０５抗体」と呼ぶ）を用いた。また、ストレプトアビジン付き第１の標的物質捕捉物質（以下、「一次抗体」と呼ぶ）は、次のように準備した。
６４０５抗体にストレプトアビジンを付けるためのキットとして、ストレプトアビジン標識キット（FastLink Streptavidin Labeling Kit、Abnova社製）を用いた。６４０５抗体にストレプトアビジンを付ける手順としては、同キットに添付のプロトコールに従って行った。具体的には、以下の通りである。
先ず、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈した６４０５抗体の溶液１００μＬに１０μＬのModifier Reagentを加えて混合する。この混合液全量をFast Link Mix（ＮＨＳ活性化−ストレプトアビジン凍結乾燥粉末）入りのガラスバイアルに添加して十分混合し４℃で一晩反応させる。
次いで、反応液あたり１／１０容積のQuencher Reagentを添加して十分混合した後、室温下で３０分間静置し、反応を停止させる。
Anti-h CRP clone 6405 SPTN-5 (code: 100358, manufactured by Medix, hereinafter referred to as “6405 antibody”) was used as the first target substance capturing substance. A first target substance-capturing substance with streptavidin (hereinafter referred to as “primary antibody”) was prepared as follows.
As a kit for attaching streptavidin to the 6405 antibody, a streptavidin labeling kit (FastLink Streptavidin Labeling Kit, manufactured by Abnova) was used. The procedure for attaching streptavidin to the 6405 antibody was performed according to the protocol attached to the kit. Specifically, it is as follows.
First, 10 μL of Modifier Reagent is added to and mixed with 100 μL of 6405 antibody solution diluted to 1 mg / mL with PBS. The total amount of this mixed solution is added to a glass vial containing Fast Link Mix (NHS activated-streptavidin lyophilized powder), mixed well, and reacted overnight at 4 ° C.
Next, 1/10 volume of Quencher Reagent per reaction solution is added and mixed well, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes to stop the reaction.
標識物質としては、金ナノコロイドを選択した。
また、標識物質には、第２の標的物質捕捉物質としてAnti-h CRP clone 6404 SP-6（code:100061、Medix社製、以下、「６４０４抗体」と呼ぶ）を結合させた。ここで作製した金ナノコロイド付き６４０４抗体を二次抗体と呼ぶ。
二次抗体の作製には、金ナノコロイド標識キット（20nm NHS-Activated Gold Nanoparticle Conjugation Kit、CTD社製）を用いた。二次抗体の作製手順としては、同キットに添付のプロトコールに従って行った。具体的には、以下の通りである。
先ず、６４０４抗体溶液を透析し、Buffer A（２０ｍＭ ＮａＨＣＯ３，０．１Ｍ ＮａＣｌ）に置換する。
次いで、透析後の抗体溶液４８μＬとReaction Buffer ６０μＬとをよく混合して得られた１０８μｍのうち、９０μＬを凍結乾燥ＮＨＳ活性化金ナノコロイドのバイアルに加えて十分混合する。４℃で一晩反応させる。
次いで、Quencher solution １０μＬを添加して十分混合した後、７，５００ｒｐｍ、２０℃、６０分間の条件下で遠心分離を行い、上清を除去する。
次いで、残滓にBuffer B（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１質量％ＢＳＡ，０．０５質量％ＰＥＧ２００００，ｐＨ８．２）を加えた後、７，５００ｒｐｍ、２０℃、６０分間の条件下で遠心分離を行い、上清を除去する。
次いで、残滓に対し、同様の上清除去操作をさらに２回繰り返し、標識物質と未反応の６４０４抗体を除去する。
次いで、Buffer Bに再溶解する。
以上の手順により、二次抗体を作製した。
Gold nanocolloid was selected as the labeling substance.
Anti-h CRP clone 6404 SP-6 (code: 100061, manufactured by Medix, hereinafter referred to as “6404 antibody”) was bound to the labeling substance as a second target substance capturing substance. The 6404 antibody with gold nanocolloid prepared here is called a secondary antibody.
For the production of the secondary antibody, a gold nano colloid labeling kit (20 nm NHS-Activated Gold Nanoparticle Conjugation Kit, manufactured by CTD) was used. The secondary antibody was prepared according to the protocol attached to the kit. Specifically, it is as follows.
First, the 6404 antibody solution is dialyzed and replaced with Buffer A (20 mM NaHCO 3 , 0.1 M NaCl).
Next, of 108 μm obtained by thoroughly mixing 48 μL of the antibody solution after dialysis and 60 μL of Reaction Buffer, 90 μL is added to the vial of freeze-dried NHS-activated gold nanocolloid and mixed well. React overnight at 4 ° C.
Next, 10 μL of Quencher solution is added and mixed well, followed by centrifugation under conditions of 7,500 rpm, 20 ° C. and 60 minutes, and the supernatant is removed.
Next, Buffer B (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% by mass BSA, 0.05% by mass PEG 20000, pH 8.2) was added to the residue, followed by centrifugation under conditions of 7,500 rpm, 20 ° C. for 60 minutes. And remove the supernatant.
Next, the same supernatant removal operation is further repeated twice on the residue to remove the labeling substance and unreacted 6404 antibody.
Then redissolve in Buffer B.
A secondary antibody was prepared by the above procedure.
作製した一次抗体及び二次抗体を０．０１質量％のＴｗｅｅｎ ＰＢＳにて希釈し、それぞれ混合時の終濃度が２ｎＭ及び２００ｐＭになるように調整した。
また、ＣＲＰ抗原を０．０１質量％のＴｗｅｅｎ ＰＢＳにて希釈し、混合時の終濃度が１０ｐＭ，５０ｐＭ，１００ｐＭ，２００ｐＭの４種の濃度に調整した。
また、ネガティブコントロールには、ＣＲＰ抗原を含まない０．０１質量％のＴｗｅｅｎ ＰＢＳを用いた。
また、ポジティブコントロールには、金ナノコロイドに直接ストレプトアビジンを吸着させた結合体（ＳＡ−Ａｕ）を２００ｐＭ含む溶液を用いた。
導波モードセンサ（Eva-M01）によるセンシングとしては、これら希釈された、一次抗体、二次抗体及びＣＲＰ抗原を含む溶液をチューブにてミックスして得られた混合液を３０分間放置した後、導波モードセンサのセンサチップ上に４０μＬ滴下した状態で行った。
また、導波モードセンサ（Eva-M01）によるセンシングとしては、同センサに内蔵されている、導波モード励起によって生じる反射スペクトルにおけるディップ位置での反射率の変化をトレースする機能を用いて行った。
ＣＲＰ抗原と一次抗体と二次抗体との結合体が、ストレプトアビジンによってセンサチップ表面に固定化されたビオチンに結合すると、金ナノコロイドの効果によって、導波モード励起によって生じる反射スペクトルにおけるディップ位置での反射率が減少する。つまり、ＣＲＰ抗原と一次抗体と二次抗体との結合体が、ストレプトアビジンによってセンサチップ表面に固定化されたビオチンに結合していない状態に比べ、反射光スペクトルにおけるディップ底部の位置がより深い位置となる。
The prepared primary antibody and secondary antibody were diluted with 0.01% by weight Tween PBS, and adjusted so that the final concentrations at the time of mixing were 2 nM and 200 pM, respectively.
Further, the CRP antigen was diluted with 0.01% by weight Tween PBS, and the final concentrations at the time of mixing were adjusted to four concentrations of 10 pM, 50 pM, 100 pM, and 200 pM.
Moreover, 0.01 mass% Tween PBS which does not contain CRP antigen was used for negative control.
As a positive control, a solution containing 200 pM of a conjugate (SA-Au) in which streptavidin was directly adsorbed on gold nanocolloid was used.
As sensing by the waveguide mode sensor (Eva-M01), after the mixture obtained by mixing the diluted solution containing the primary antibody, the secondary antibody and the CRP antigen in a tube is allowed to stand for 30 minutes, It was performed in a state where 40 μL was dropped on the sensor chip of the waveguide mode sensor.
In addition, sensing using the guided mode sensor (Eva-M01) was performed using the built-in function to trace the change in reflectance at the dip position in the reflection spectrum caused by guided mode excitation. .
When the conjugate of CRP antigen, primary antibody, and secondary antibody binds to biotin immobilized on the surface of the sensor chip by streptavidin, the effect of gold nanocolloids causes a dip position in the reflection spectrum generated by guided mode excitation. The reflectance of is reduced. In other words, the position of the bottom of the dip in the reflected light spectrum is deeper than when the conjugate of CRP antigen, primary antibody and secondary antibody is not bound to biotin immobilized on the surface of the sensor chip by streptavidin. It becomes.
図７は、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール及びＣＲＰ抗原１００ｐＭ，２００ｐＭの試料に対する反射光スペクトルのディップ位置における測定結果を示す図である。
図７に示すように、濃度依存性のあるＣＲＰ抗原の検出ができていることが分かる。
FIG. 7 is a diagram showing the measurement results at the dip position of the reflected light spectrum for the negative control, positive control, and CRP antigen 100 pM and 200 pM samples.
As shown in FIG. 7, it can be seen that the concentration-dependent CRP antigen can be detected.
図８は、ネガティブコントロール及びＣＲＰ抗原１０ｐＭ，５０ｐＭの試料に対する反射光スペクトルのディップ位置における測定結果を示す図である。
図８に示すように、ＣＲＰ抗原が１０ｐＭと非常に低濃度な場合でも、ネガティブコントロールとは明確な差が得られており、検出に成功していることが分かる。また、ＣＲＰ抗原１０ｐＭの場合とＣＲＰ抗原５０ｐＭの場合とを比較すると、濃度に応じて信号強度が大きくなっていることも分かる。
FIG. 8 is a diagram showing the measurement results at the dip position of the reflected light spectrum for the negative control and CRP antigen samples of 10 pM and 50 pM.
As shown in FIG. 8, even when the concentration of CRP antigen was as low as 10 pM, a clear difference from the negative control was obtained, indicating that the detection was successful. Moreover, when the case of CRP antigen 10pM is compared with the case of CRP antigen 50pM, it can be seen that the signal intensity increases according to the concentration.
以上に示す実施例１の手法により、被検体と一次抗体、二次抗体を含んだ試薬とを混合して、センサチップの表面上に導入するだけで、標的物質の検出及び定量的な評価が可能であることが確認される。 According to the method of Example 1 described above, the target substance can be detected and quantitatively evaluated simply by mixing the analyte and the reagent containing the primary antibody and the secondary antibody and introducing the mixture onto the surface of the sensor chip. It is confirmed that it is possible.
（実施例２）
実施例２では、センサチップ表面にビオチンを固定化する方法を実施例１の方法に代えて、以下の通りとした。
先ず、センサチップをアセトンで超音波洗浄した後、エタノールにて超音波洗浄し、センサチップ表面の清浄な状態にした。
次いで、前述の１１−ビオチニル化シランカップリング剤を１ｍＭ含むトルエン溶液中にセンサチップを浸漬して２０℃で２週間放置した。
次いで、センサチップを溶液から取り出し、トルエンによるリンス、アセトンによるリンス、及び窒素ブローによる乾燥の各処理をこの順で行った。
以上の手順によってセンサチップ表面にビオチンを固定化した。この実施例２における手順では、センサチップ表面をアミノ化する表面修飾等の処理が不要であり、この処理を実施する実施例１の手順に比べて操作が簡便化される。
(Example 2)
In Example 2, the method of immobilizing biotin on the sensor chip surface was replaced with the method of Example 1 as follows.
First, the sensor chip was ultrasonically cleaned with acetone and then ultrasonically cleaned with ethanol to make the sensor chip surface clean.
Next, the sensor chip was immersed in a toluene solution containing 1 mM of the aforementioned 11-biotinylated silane coupling agent and left at 20 ° C. for 2 weeks.
Next, the sensor chip was taken out of the solution, and each of the rinse with toluene, the rinse with acetone, and the drying with nitrogen blowing were performed in this order.
Biotin was immobilized on the surface of the sensor chip by the above procedure. The procedure in Example 2 does not require treatment such as surface modification for aminating the sensor chip surface, and the operation is simplified compared to the procedure in Example 1 in which this treatment is performed.
ＣＲＰ抗原、一次抗体、二次抗体としては、実施例１で準備したものを使用した。
また、センサ及びセンサチップも実施例１で使用したものと同じ型番のものを使用し、同様のセンシングを行った。
また、一次抗体及び二次抗体を０．０１質量％ Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて希釈し、それぞれ混合時の終濃度が２ｎＭ及び６００ｐＭになるように調整した。
また、ＣＲＰ抗原を０．０１質量％のＴｗｅｅｎ ＰＢＳにて希釈し、混合時の終濃度が３００ｐＭになるように調整した。
また、ネガティブコントロールには、ＣＲＰ抗原を含まない０．０１質量％ Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを用いた。
また、ポジティブコントロールには、金ナノコロイドに直接ストレプトアビジンを吸着させた結合体（ＳＡ−Ａｕ）を６００ｐＭ含む溶液を用いた。
As the CRP antigen, primary antibody, and secondary antibody, those prepared in Example 1 were used.
The sensor and sensor chip also used the same model number as that used in Example 1, and the same sensing was performed.
Moreover, the primary antibody and the secondary antibody were diluted with 0.01% by mass Tween PBS, and adjusted so that the final concentrations upon mixing were 2 nM and 600 pM, respectively.
Further, the CRP antigen was diluted with 0.01% by mass of Tween PBS and adjusted so that the final concentration during mixing was 300 pM.
Moreover, 0.01 mass% Tween PBS which does not contain CRP antigen was used for negative control.
As a positive control, a solution containing 600 pM of a conjugate (SA-Au) in which streptavidin was directly adsorbed on a gold nanocolloid was used.
図９は、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール及びＣＲＰ抗原３００ｐＭの試料に対する反射光スペクトルのディップ位置における測定結果を示す図である。
図９に示すように、３００ｐＭのＣＲＰ抗原の検出ができていることが分かる。
FIG. 9 is a diagram showing the measurement results at the dip position of the reflected light spectrum for the negative control, positive control, and CRP antigen 300 pM samples.
As shown in FIG. 9, it can be seen that 300 pM CRP antigen can be detected.
１０１，２０１ センサチップ
２ アミノ化表面修飾層
３ ビオチン
１０２，２０２ 混合液
１１ ビオチン結合体
１２ 第１の標的物質捕捉物質
１３ 標的物質
１４ 第２の標的物質捕捉物質
１５ 標識物質
１００，２００ 導波モードセンサ
１０３，２０３ カバーガラス
１０４，２０４ 光照射部
１０５，２０５ 光検出部
１０６、２０６ 光学プリズム
DESCRIPTION OF SYMBOLS 101,201 Sensor chip 2 Amination surface modification layer 3 Biotin 102,202 Liquid mixture 11 Biotin conjugate 12 First target substance capture substance 13 Target substance 14 Second target substance capture substance 15 Label substance 100,200 Waveguide mode Sensor 103, 203 Cover glass 104, 204 Light irradiation unit 105, 205 Light detection unit 106, 206 Optical prism
Claims (11)
検出対象となる標的物質の存在が検証される被検体と、少なくともストレプトアビジン及びアビジンのいずれかから選択されるビオチン結合体及び前記ビオチン結合体と結合されるとともに前記標的物質と結合して捕捉可能とされる第１の標的物質捕捉物質を含む試薬とが混合された混合液を調製する混合液調製工程と、
前記ビオチンが固定化された前記センサチップの表面上に前記混合液を導入する混合液導入工程と、
前記標的物質を含まない状態の前記混合液、前記被検体と混合されない状態の前記試薬及び前記標的物質の含有量がコントロールされた状態の前記混合液のいずれかである基準液を前記ビオチンが固定化された前記センサチップの表面に導入したときの前記導波モードセンサのセンシング状態を基準状態とし、前記混合液導入工程により前記混合液を導入したときの前記導波モードセンサの前記センシング状態を測定状態として、前記基準状態と前記測定状態とを比較することで前記標的物質を検出する標的物質検出工程と、
を含むことを特徴とする標的物質検出方法。 A biotin immobilization step of immobilizing biotin on the surface of the sensor chip of the waveguide mode sensor;
Capable of binding to the target substance to be detected, the biotin conjugate selected from at least one of streptavidin and avidin, and the biotin conjugate and binding to the target substance A mixed liquid preparation step of preparing a mixed liquid in which a reagent containing the first target substance capturing substance is mixed; and
A liquid mixture introduction step for introducing the liquid mixture onto the surface of the sensor chip on which the biotin is immobilized;
The biotin is immobilized on a reference solution that is one of the mixed solution that does not contain the target substance, the reagent that is not mixed with the analyte, and the mixed solution that has a controlled content of the target substance. The sensing state of the waveguide mode sensor when introduced to the surface of the sensor chip formed as a reference state, the sensing state of the waveguide mode sensor when the mixture is introduced by the mixture introduction step As a measurement state, a target substance detection step of detecting the target substance by comparing the reference state and the measurement state,
A target substance detection method comprising:
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数が２〜１０のアルキレン基を示し、Ｒ２は、炭素数が２〜１５のアルキレン基を示す。
However, the general formula (1), R 1 is an alkylene group having a carbon number of 2 to 10, R 2 has a carbon number of an alkylene group of 2 to 15.
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数が２〜１０のアルキレン基を示し、Ｒ２は、炭素数が２〜１５のアルキレン基を示す。
The waveguide mode sensor according to claim 10, wherein the biotinylated silane coupling agent is a compound represented by the following general formula (1).
However, the general formula (1), R 1 is an alkylene group having a carbon number of 2 to 10, R 2 has a carbon number of an alkylene group of 2 to 15.
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