JP2019092481A - Hetero protein cage - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヘテロタンパク質籠（ケージ）に関する。より詳細には、本発明は、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（以下、「ヘテロタンパク質ケージ」という場合がある。）の製造方法、結晶の製造方法、結晶、標的タンパク質の立体構造解析方法、及び、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キットに関する。 The present invention relates to heteroprotein cages. More specifically, the present invention relates to a method for producing a protein cage containing a target protein (hereinafter sometimes referred to as "heteroprotein cage"), a method for producing a crystal, a crystal, a method for analyzing the three-dimensional structure of the target protein, The present invention relates to a kit for producing a protein cage containing a target protein.
タンパク質分子の表面には、様々な機能性官能基をもつアミノ酸側鎖が存在し、特異な化学的特性を有している。そして、複数のタンパク質分子が規則正しく配列することにより、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）を形成する場合がある。 On the surface of a protein molecule, amino acid side chains having various functional functional groups are present and have unique chemical properties. And, by arranging a plurality of protein molecules regularly, a cage-like three-dimensional structure (protein cage) may be formed.
例えば、多角体病ウイルスは、カイコ等の昆虫の細胞に感染するウイルスである。多角体病ウイルスは、感染後期に感染細胞内に多角体と呼ばれる封入体を全細胞タンパクの約半分に達するほど大量に作り、その中に多数のウイルス粒子を封入する。多角体タンパク質であるポリヘドリンタンパク質は、上述したタンパク質ケージを形成するタンパク質の例である。 For example, the polyhedrosis virus is a virus that infects cells of insects such as silkworm. The polyhedrosis virus forms inclusion bodies called polyhedra in infected cells at a later stage of infection in a large amount to reach about half of all cellular proteins, and encloses a large number of virus particles therein. Polyhedrin protein, which is a polyhedron protein, is an example of a protein that forms the protein cage described above.
近年、タンパク質ケージを、機能性分子を固定する固体材料として利用する研究が行われている。例えば、非特許文献１には、多角体タンパク質であるポリヘドリンタンパク質のＮ末端に存在するＨ１α−へリックスとの融合タンパク質をコードする遺伝子を、ポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子と共に細胞内で共発現させることにより、細胞質多角体病ウイルスの多角体の結晶に融合タンパク質が封入された多角体を調製できることが記載されている。 In recent years, studies have been conducted to use protein cages as solid materials for immobilizing functional molecules. For example, Non-Patent Document 1 discloses a gene encoding a fusion protein with a H1α-helix present at the N-terminus of a polyhedron protein polyhedrin protein in a cell together with a gene encoding a polyhedrin protein. It is described that, by coexpression, it is possible to prepare a polyhedron in which a fusion protein is enclosed in a crystal of a polyhedron of cytoplasmic polyhedrosis virus.
しかしながら、非特許文献１の方法により標的タンパク質をタンパク質ケージに封入するためには、宿主として昆虫細胞を用いる必要がある。また、昆虫細胞にウイルスを感染させた後、約１週間インキュベーションさせる必要があり、比較的長時間を必要とするため改良の余地がある。そこで、本発明は、タンパク質分子から形成された、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）に標的タンパク質を取り込ませる技術を提供することを目的とする。 However, in order to enclose a target protein in a protein cage by the method of Non-Patent Document 1, it is necessary to use an insect cell as a host. In addition, it is necessary to incubate for about one week after insect cells are infected with the virus, and there is room for improvement because it requires a relatively long time. Therefore, the object of the present invention is to provide a technology for incorporating a target protein into a cage-like three-dimensional structure (protein cage) formed from protein molecules.
本発明は以下の態様を含む。
［１］標的タンパク質を含むタンパク質ケージの製造方法であって、タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含み、前記融合タンパク質はタグを有しており、前記タグは前記タンパク質ケージの表面に露出する、製造方法。
［２］前記タンパク質ケージモノマーがフェリチンである、［１］に記載の製造方法。
［３］結晶の製造方法であって、［１］又は［２］に記載の製造方法により製造された、標的タンパク質を含むタンパク質ケージを結晶化させ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程を含む、製造方法。
［４］前記結晶化工程を細胞外で行う、［３］に記載の製造方法。
［５］前記形成工程の後且つ前記結晶化工程の前に、前記タグを有する前記タンパク質ケージを精製する精製工程を更に含む、［３］又は［４］に記載の製造方法。
［６］実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成された結晶。
［７］［６］に記載の結晶の結晶構造解析を行う工程を含む、前記標的タンパク質の立体構造解析方法。
［８］タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターと、を備え、前記融合タンパク質がタグを有している、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キット。
［９］前記タンパク質ケージモノマーがフェリチンである、［８］に記載のキット。
The present invention includes the following aspects.
[1] A method for producing a protein cage containing a target protein, comprising the step of contacting a protein cage monomer with a fusion protein of the protein cage monomer and a target protein to form a protein cage, the fusion protein Has a tag, and the tag is exposed on the surface of the protein cage.
[2] The production method according to [1], wherein the protein cage monomer is ferritin.
[3] A method for producing a crystal, comprising: crystallizing a protein cage containing a target protein produced by the production method according to [1] or [2] to obtain a crystal of a protein cage containing a target protein Manufacturing method including the
[4] The production method according to [3], wherein the crystallization step is performed extracellularly.
[5] The production method according to [3] or [4], further comprising a purification step of purifying the protein cage having the tag after the formation step and before the crystallization step.
[6] A crystal formed substantially only from a protein cage containing a target protein.
[7] The method for analyzing the three-dimensional structure of the target protein, comprising the step of performing crystal structure analysis of the crystal described in [6].
[8] A protein cage monomer expression vector, an expression vector of a fusion protein of the protein cage monomer and a target protein, or a vector for producing an expression vector of the fusion protein, the fusion protein having a tag There is a kit for producing a protein cage containing a target protein.
[9] The kit according to [8], wherein the protein cage monomer is ferritin.
本発明によれば、タンパク質ケージに標的タンパク質を取り込ませる技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a technology for incorporating a target protein into a protein cage.
［タンパク質ケージの製造方法］
１実施形態において、本発明は、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）の製造方法であって、タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含み、前記融合タンパク質はタグを有しており、前記タグは前記タンパク質ケージの表面に露出する、製造方法を提供する。
[Method of producing protein cage]
In one embodiment, the present invention is a method for producing a protein cage (heteroprotein cage) containing a target protein, which comprises contacting a protein cage monomer with a fusion protein of the protein cage monomer and the target protein, And the fusion protein has a tag, and the tag is exposed to the surface of the protein cage.
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、１〜２日で標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）を製造することができる。 As described later in the Examples, according to the production method of the present embodiment, a protein cage (heteroprotein cage) containing a target protein can be produced in 1 to 2 days.
本明細書において、タンパク質ケージとは、タンパク質で形成された籠（ケージ）状構造体を意味する。タンパク質ケージとしては、例えば、ウイルスのカプシド、生体内鉄貯蔵を担っているフェリチン２４量体、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｓｍａｌｌ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）等が挙げられる。 As used herein, a protein cage means a cage-like structure formed of a protein. Examples of protein cages include capsids of viruses, ferritin 24mer responsible for iron storage in vivo, DNA-binding proteins from starved cells (DPS), Pyruvate dehydrogenase multienzyme complex, Small heat-shock protein (HSP), etc. It can be mentioned.
また、本明細書において、タンパク質ケージモノマーとは、タンパク質ケージを構成するモノマータンパク質を意味する。例えば、タンパク質ケージがフェリチン２４量体であり、タンパク質ケージモノマーがフェリチンであってもよいが、これに限定されない。 Also, as used herein, protein cage monomer means a monomeric protein that constitutes a protein cage. For example, but not limited to, the protein cage may be a ferritin 24mer and the protein cage monomer may be ferritin.
フェリチンは、藻類、細菌、植物、ヒト、非ヒト動物を含むほぼ全ての生物が合成するタンパク質である。本実施形態の製造方法において、フェリチンとしては、これらフェリチンのいずれも用いることができる。 Ferritin is a protein synthesized by almost all organisms, including algae, bacteria, plants, humans and non-human animals. In the manufacturing method of the present embodiment, any of these ferritins can be used as the ferritin.
タンパク質ケージモノマーは、互いに接触することにより、自己組織化してタンパク質ケージを形成するものであることが好ましい。 Preferably, the protein cage monomers are self-assembled to form protein cages by contacting each other.
本実施形態の製造方法において、標的タンパク質は、タンパク質ケージに取り込ませる対象である。ここで、標的タンパク質をタンパク質ケージに取り込ませるとは、標的タンパク質をタンパク質ケージの内部に完全に収容することであってもよいし、標的タンパク質をタンパク質ケージの内部に一部収容し、一部が露出した状態とすることであってもよい。 In the production method of the present embodiment, the target protein is a target to be incorporated into a protein cage. Here, to incorporate the target protein into the protein cage may be to completely accommodate the target protein inside the protein cage, or partially accommodate the target protein inside the protein cage, and It may be in an exposed state.
タンパク質ケージに標的タンパク質を取り込ませることにより、例えばタンパク質を安定化させることができる。あるいは、標的タンパク質として生理活性を有するタンパク質を使用した場合、標的タンパク質を含むタンパク質ケージを、薬物送達システムとして用いることができる。 By incorporating the target protein into the protein cage, for example, the protein can be stabilized. Alternatively, when a protein having physiological activity is used as a target protein, a protein cage containing the target protein can be used as a drug delivery system.
標的タンパク質としては、タンパク質ケージモノマーと融合タンパク質を形成することができるものであれば特に形成されず、あらゆるタンパク質を利用することができる。また、融合タンパク質において、タンパク質ケージモノマーと標的タンパク質との間にはリンカー配列が配置されていてもよい。 As the target protein, any protein that can form a fusion protein with a protein cage monomer is not particularly formed, and any protein can be used. In addition, in the fusion protein, a linker sequence may be disposed between the protein cage monomer and the target protein.
また、実施例において後述するように、タンパク質ケージとして結晶化が容易なものを使用することにより、種々の標的タンパク質を取り込ませたタンパク質ケージを容易に結晶化させることができる。 In addition, as described later in Examples, by using a protein cage that is easy to crystallize, it is possible to easily crystallize a protein cage in which various target proteins are incorporated.
本実施形態の製造方法によれば、昆虫細胞に限られない様々な宿主を用いてタンパク質ケージを製造することができる。宿主としては、大腸菌、酵母等の細菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。 According to the production method of the present embodiment, a protein cage can be produced using various hosts that are not limited to insect cells. As a host, bacteria such as Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, plant cells and the like can be used.
また、宿主を使用せず、無細胞翻訳系を用いてタンパク質ケージを製造することもできる。無細胞翻訳系としては、特に限定されず、例えば、ウサギ網状赤血球を用いた翻訳系、コムギ胚芽を用いた翻訳系、大腸菌を用いた再構成翻訳系等が挙げられる。 Alternatively, cell-free translation systems can be used to produce protein cages without the use of a host. The cell-free translation system is not particularly limited, and examples thereof include a translation system using rabbit reticulocytes, a translation system using wheat germ, and a reconstituted translation system using E. coli.
また、実施例において後述するように、融合タンパク質がタグを有していることから、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）のみを分離精製することができる。 Also, as described later in the Examples, since the fusion protein has a tag, only the protein cage (heteroprotein cage) containing the target protein can be separated and purified.
タグとしては、タグを有するタンパク質ケージの精製が可能なアフィニティータグが好ましく用いられる。具体的なタグとしては、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質タグ等が挙げられるがこれらに限定されない。 As a tag, an affinity tag capable of purifying a protein cage having a tag is preferably used. Specific tags include, but are not limited to, for example, histidine tag (His tag), HA tag, myc tag, FLAG tag, Glutathione S-transferase (GST) tag, maltose binding protein tag and the like.
本実施形態の製造方法において、形成工程は、細胞内で実施してもよいし、細胞外で実施してもよい。 In the production method of the present embodiment, the forming step may be carried out intracellularly or extracellularly.
例えば、宿主細胞に、タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクターとを、それぞれ導入し、細胞内で、タンパク質ケージモノマーと融合タンパク質とを発現させてもよい。この結果、タンパク質ケージモノマーと融合タンパク質とが、細胞内で、又は、細胞外に分泌された後に接触し、細胞内で、又は細胞外でタンパク質ケージが形成される。 For example, an expression vector of a protein cage monomer and an expression vector of a fusion protein of a protein cage monomer and a target protein may be introduced into a host cell, and the protein cage monomer and the fusion protein may be expressed in cells. . As a result, the protein cage monomer and the fusion protein are in contact in the cell or after being secreted extracellularly, and then the protein cage is formed in the cell or extracellularly.
同一細胞内でタンパク質ケージモノマーと融合タンパク質とを発現させる場合、タンパク質ケージモノマーの発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）、及び、融合タンパク質の発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）を適切に選択することにより、各発現ベクターの細胞内におけるコピー数比、ひいては各タンパク質の発現量比を調節することができる。これにより、タンパク質ケージに取り込まれる標的タンパク質の数を調整することが容易になる。 When expressing a protein cage monomer and a fusion protein in the same cell, appropriately selecting the replication origin (ori) of the protein cage monomer expression vector and the replication origin (ori) of the fusion protein expression vector, The copy number ratio of each expression vector in cells, and hence the expression ratio of each protein can be adjusted. This facilitates adjusting the number of target proteins incorporated into the protein cage.
あるいは、タンパク質ケージモノマーと、タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを、別々の宿主細胞を用いて別々に調製した後、両者を接触させてタンパク質ケージを形成させてもよい。 Alternatively, the protein cage monomer and the fusion protein of the protein cage monomer and the target protein may be separately prepared using separate host cells, and then the two may be contacted to form the protein cage.
この場合、タンパク質ケージモノマーがタンパク質ケージを形成している場合がある。また、融合タンパク質が会合体を形成している場合がある。このような場合、これらのタンパク質ケージ及び融合タンパク質の会合体を一度モノマーにまで解離させた後に適切な割合に調整して接触させ、タンパク質ケージを形成させることが好ましい。 In this case, protein cage monomers may form a protein cage. In addition, the fusion protein may form an association. In such a case, it is preferable that the protein cage and the fusion protein assembly be once dissociated into monomers and then adjusted and brought into contact in an appropriate ratio to form a protein cage.
［結晶の製造方法］
１実施形態において、本発明は、結晶の製造方法であって、上述した製造方法により製造された、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）を結晶化させ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程を含む、製造方法を提供する。
[Method of producing crystals]
In one embodiment, the present invention relates to a method for producing a crystal, comprising crystallizing a protein cage (heteroprotein cage) containing a target protein produced by the above-mentioned production method, and crystallizing a protein cage containing a target protein The present invention provides a production method comprising a crystallization step to obtain
現在解明されているタンパク質の立体構造座標の約９割がＸ線結晶構造解析法により決定されたものである。しかしながら、タンパク質が結晶化する条件は個々のタンパク質によって異なっている。 About 90% of the three-dimensional structural coordinates of proteins currently being elucidated are determined by X-ray crystallography. However, the conditions under which the proteins crystallize are different for each individual protein.
このため、新たなタンパク質の結晶を得るためには、大量の精製タンパク質を調製すること、タンパク質を結晶化するために数百から数千の結晶化条件の検討を行うこと等が必要になる。これらの作業には多大な労力と長期間を要し、タンパク質のＸ線結晶構造解析を行う際のボトルネックとなっている。 For this reason, in order to obtain new protein crystals, it is necessary to prepare a large amount of purified protein and to study hundreds to thousands of crystallization conditions in order to crystallize the protein. These operations require a great deal of labor and a long period of time, which is a bottleneck in performing X-ray crystallography of proteins.
これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、様々な標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を容易に製造することができる。また、製造した、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を用いてＸ線結晶構造解析を行うことにより、標的タンパク質の立体構造座標を決定することができる。 On the other hand, as described later in the examples, according to the production method of the present embodiment, it is possible to easily produce crystals of protein cages containing various target proteins. In addition, X-ray crystal structure analysis can be performed using the produced crystals of the protein cage containing the target protein to determine the conformational coordinates of the target protein.
本実施形態の製造方法によれば、タンパク質ケージとして、結晶化しやすいもの、結晶化条件が確立されているもの等を用いることにより、含有する標的タンパク質が異なるタンパク質ケージを、同一の条件で、あるいは、わずかな結晶化条件の検討により、容易に結晶化させることができる。この結果、従来、多大な労力と長期間を要していたタンパク質の結晶を容易に製造することが可能となる。 According to the manufacturing method of the present embodiment, protein cages that contain different target proteins can be used under the same conditions, or by using a protein cage that is easily crystallized, that has established crystallization conditions, or the like. Crystallization can be easily achieved by examination of slight crystallization conditions. As a result, it is possible to easily produce protein crystals that conventionally required a great deal of labor and long time.
本実施形態の製造方法では、従来の多角体ウイルスを用いた結晶の製造方法と異なり、結晶化工程を細胞外で行うことができる。この結果、例えば、タンパク質ケージを形成させる形成工程の後、且つ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程の前に、タグを有するタンパク質ケージのみを精製する精製工程を行うことができる。更に、実施例において後述するように、タンパク質ケージ１個あたりの標的タンパク質の分子数が均一なタンパク質ケージを精製して結晶化させることもできる。 In the manufacturing method of the present embodiment, unlike the conventional crystal manufacturing method using a polyhedrosis virus, the crystallization step can be performed extracellularly. As a result, for example, a purification step of purifying only the protein cage having a tag can be performed after the formation step of forming the protein cage and before the crystallization step of obtaining crystals of the protein cage containing the target protein. . Furthermore, as described later in the Examples, protein cages having a uniform number of target protein molecules per protein cage can also be purified and crystallized.
この結果、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成された結晶、更には、標的タンパク質を特定の割合で含むタンパク質ケージのみから形成された結晶を製造することができる。このようにして、均一な結晶を得ることにより、標的タンパク質の立体構造座標を決定することが容易になる。 As a result, it is possible to produce crystals formed only from the protein cage containing the target protein, and further crystals formed only from the protein cage containing the target protein in a specific ratio. In this way, obtaining uniform crystals facilitates determining the conformational coordinates of the target protein.
［結晶］
１実施形態において、本発明は、実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）のみから形成された結晶を提供する。本実施形態の結晶は、上述した結晶の製造方法により製造することができる。
[crystal]
In one embodiment, the present invention provides a crystal substantially formed only of a protein cage (heteroprotein cage) containing a target protein. The crystal of the present embodiment can be manufactured by the above-described crystal manufacturing method.
本実施形態の結晶は、実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成されている。このため、例えばＸ線結晶構造解析等を実施するのに適している。ここで、標的タンパク質としては特に限定されず、上述したものと同様である。また、タンパク質ケージは、例えばフェリチン２４量体であってもよいし、フェリチン２４量体以外の、上述したものと同様のタンパク質ケージであってもよい。 The crystals of the present embodiment are substantially formed only of the protein cage containing the target protein. For this reason, it is suitable for performing, for example, X-ray crystal structure analysis and the like. Here, the target protein is not particularly limited, and is the same as described above. Also, the protein cage may be, for example, a ferritin 24-mer, or may be a protein cage other than the ferritin 24-mer similar to that described above.
本実施形態において、実質的にとは、結晶中に、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージがごくわずかに混入することを許容する意味である。あるいは、結晶中に、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージが、検出限界以下混入することを許容する意味である。本実施形態の結晶中に含まれる、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージの割合は、５モル％以下であることが好ましく、１モル％以下であることがより好ましく、０．３モル％以下であることが更に好ましく、０モル％であること、すなわち、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージを全く含まないことが特に好ましい。 In the present embodiment, substantially means that the protein cage containing no target protein is allowed to contaminate slightly in the crystal. Alternatively, it is meant to allow the protein cage containing no target protein to contaminate the detection limit or less in the crystal. The proportion of the protein cage not containing the target protein contained in the crystal of the present embodiment is preferably 5 mol% or less, more preferably 1 mol% or less, and 0.3 mol% or less More preferably, it is 0 mol%, that is to say it is particularly preferred not to include any protein cage which does not contain the target protein.
［標的タンパク質の立体構造解析方法］
１実施形態において、本発明は、上述した結晶の結晶構造解析を行う工程を含む、前記標的タンパク質の立体構造解析方法を提供する。
[Method for three-dimensional structure analysis of target protein]
In one embodiment, the present invention provides a method for three-dimensional structure analysis of the target protein, comprising the step of performing crystal structure analysis of the above-mentioned crystal.
本実施形態の方法により、様々な標的タンパク質について立体構造解析を容易に行うことができる。結晶構造解析の手法は特に限定されず、例えば、Ｘ線結晶構造解析、電子顕微鏡像再構成法、電子線結晶構造解析等により行うことができる。 By the method of this embodiment, three-dimensional structural analysis can be easily performed on various target proteins. The method of crystal structure analysis is not particularly limited, and can be performed by, for example, X-ray crystal structure analysis, electron microscope image reconstruction, electron beam crystal structure analysis, or the like.
［キット］
１実施形態において、本発明は、タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターと、を備え、前記融合タンパク質がタグを有している、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キットを提供する。
[kit]
In one embodiment, the present invention comprises an expression vector of a protein cage monomer, an expression vector of a fusion protein of the protein cage monomer and a target protein, or a vector for producing an expression vector of the fusion protein, the fusion protein The present invention provides a kit for producing a protein cage containing a target protein, which has a tag.
本実施形態のキットにより、上述した、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）、及び、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶（ヘテロタンパク質ケージの結晶）を容易に製造することができる。 The kit of this embodiment can easily produce the protein cage containing the target protein (heteroprotein cage) and the protein cage crystal containing the target protein (crystal of heteroprotein cage) described above.
本実施形態のキットにおいて、タンパク質ケージモノマーは、例えば、フェリチンであってもよい。また、タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクターとしては、例えば、フェリチン及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター等が挙げられる。 In the kit of the present embodiment, the protein cage monomer may be, for example, ferritin. Moreover, as an expression vector of a fusion protein of a protein cage monomer and a target protein, for example, an expression vector of a fusion protein of ferritin and a target protein, and the like can be mentioned.
ここで、標的タンパク質としては特に限定されず、上述したものと同様である。また、融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターとは、例えば、フェリチン及び標的タンパク質の融合タンパク質を製造するためのベクターであって、標的タンパク質をコードする遺伝子が連結されていない発現ベクター等が挙げられる。 Here, the target protein is not particularly limited, and is the same as described above. Further, a vector for producing an expression vector of a fusion protein is, for example, a vector for producing a fusion protein of ferritin and a target protein, and includes an expression vector to which a gene encoding a target protein is not linked.
より具体的には、例えば、プロモーターの下流に、Ｈｉｓタグ、フェリチン遺伝子、マルチクローニングサイトをこの順に有しており、マルチクローニングサイトに標的タンパク質をコードする遺伝子断片を導入することにより、融合タンパク質の発現ベクターを作製することができるベクターが挙げられる。ここで、マルチクローニングサイトとは、１つ以上のユニークな制限酵素認識配列を有し、ベクターへの遺伝子断片の導入を容易にする領域を意味する。 More specifically, for example, a fusion protein is prepared by introducing a gene fragment encoding a target protein in the downstream of a promoter, having a His tag, a ferritin gene, and a multiple cloning site in this order, and Included are vectors capable of producing expression vectors. Here, the multicloning site means a region having one or more unique restriction enzyme recognition sequences and facilitating introduction of a gene fragment into a vector.
融合タンパク質において、フェリチン遺伝子と標的タンパク質との間にはリンカー配列が配置されていてもよい。また、タンパク質ケージモノマーはフェリチンに限られず、上述したものと同様のタンパク質ケージモノマーを適宜使用することができる。 In the fusion protein, a linker sequence may be disposed between the ferritin gene and the target protein. Also, the protein cage monomer is not limited to ferritin, and protein cage monomers similar to those described above can be used as appropriate.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described by way of examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［実験例１］
（Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターの作成）
タンパク質ケージモノマーとして、フェリチンを使用した。フェリチンとしては、ウマ脾臓由来フェリチンＬ鎖を使用した。フェリチンは２４量体の籠（フェリチン２４量体籠）からなるタンパク質ケージを形成することが知られている。また、標的タンパク質として、Ｓｕｐｅｒ ｆｏｌｄｅｒ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用した。
[Experimental Example 1]
(Preparation of His6-ferritin-GFP expression vector)
Ferritin was used as a protein cage monomer. As the ferritin, equine spleen derived ferritin L chain was used. Ferritin is known to form a protein cage consisting of 24 mer (ferritin 24 mer). In addition, Super folder green fluorescent protein (GFP) was used as a target protein.
まず、フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクターを鋳型に用いて、ＰＣＲ法によりフェリチン遺伝子断片を増幅した。また、ＧＦＰ遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ発現ベクターを鋳型に用いて、ＰＣＲ法によりＧＦＰ遺伝子断片を増幅した。 First, a ferritin gene fragment was amplified by PCR using the pETDuet1 expression vector into which the ferritin gene was introduced as a template. Moreover, the GFP gene fragment was amplified by PCR using the pET22b expression vector into which the GFP gene was introduced as a template.
続いて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ１発現ベクターにフェリチン遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を導入し、フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の発現ベクターである、Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターを作製した。フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質のＮ末端には６×Ｈｉｓタグを導入した。 Then, the ferritin gene and GFP gene were introduce | transduced into pACYCDuet1 expression vector, and the His6-ferritin-GFP expression vector which is a ferritin-GFP fusion protein expression vector was produced. A 6xHis tag was introduced at the N-terminus of the ferritin-GFP fusion protein.
フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）は、ベクターが１細胞あたり数１０コピー維持されることが知られているｐＢＲ３２２ｏｒｉであった。また、Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）は、ベクターが１細胞あたり数コピー維持されることが知られているｐ１５ｏｒｉであった。また、フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が組み込まれており、Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターにはクロラムフェニコール耐性遺伝子が組み込まれていた。 The replication origin (ori) of the pETDuet1 expression vector into which the ferritin gene was introduced was pBR322 ori, which is known to maintain several tens of copies of the vector per cell. In addition, the origin of replication (ori) of the His6-ferritin-GFP expression vector was p15ori, which is known to maintain several copies of the vector per cell. Moreover, the ampicillin resistance gene was integrated into the pETDuet1 expression vector into which the ferritin gene was introduced, and the chloramphenicol resistance gene was integrated into the His6-ferritin-GFP expression vector.
［実験例２］
（フェリチン及びＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の共発現）
フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクター、及び、実験例１で作製したＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターを用いて大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布しコロニーを形成させた。
[Experimental Example 2]
(Co-expression of ferritin and His6-ferritin-GFP fusion protein)
E. coli strain BL21 (DE3) is transformed with the pETDuet1 expression vector into which the ferritin gene has been introduced, and the His6-ferritin-GFP expression vector prepared in Experimental Example 1, and LB agar medium containing ampicillin and chloramphenicol Applied to form colonies.
続いて、形成されたコロニーを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で６００ｎｍの吸光度が０．６程度となるまで培養した。 Subsequently, the formed colonies were inoculated into LB liquid medium containing ampicillin and chloramphenicol, and cultured at 37 ° C. until the absorbance at 600 nm reached about 0.6.
続いて、３０℃に温度を下げた後、ＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導し、引き続き３０℃で６時間培養した。続いて、培養液を遠心分離して大腸菌体を沈殿させた。得られた菌体は−８０℃で保存した。 Subsequently, the temperature was lowered to 30 ° C., IPTG was added to induce protein expression, and the cells were cultured at 30 ° C. for 6 hours. Subsequently, the culture solution was centrifuged to precipitate E. coli. The obtained cells were stored at -80 ° C.
［実験例３］
（ＧＦＰを含むタンパク質ケージの精製）
実験例２で凍結した菌体を０．３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波破砕機を用いて菌体を溶菌させた。
[Experimental Example 3]
(Purification of protein cage containing GFP)
The cells frozen in Experimental Example 2 were suspended in 50 mM Tris buffer pH 7.5 containing 0.3 M NaCl, and the cells were lysed using an ultrasonic crusher.
《Ｎｉ−アフィニティカラムによる精製》
続いて、溶菌液を遠心分離して可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＮｉ−アフィニティＨｉｓＴｒａｐＦＦ Ｃｒｕｄｅカラム（５ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加した。続いて、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で未吸着タンパク質を溶出した。
Purification by Ni-Affinity Column
Subsequently, the lysate is centrifuged to separate soluble and insoluble fractions and the soluble fraction is equilibrated with 20 mM Tris buffer pH 8.0 Ni-Affinity HisTrapFF Crude column (5 mL, GE Healthcare Biosciences) Company). Subsequently, unadsorbed proteins were eluted with 20 mM Tris buffer pH 8.0 containing 20 mM imidazole.
カラムに吸着したタンパク質は、まず、４５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で溶出した。これにより、弱く結合したタンパク質を溶出した。 The proteins adsorbed to the column were first eluted with 20 mM Tris buffer pH 8.0 containing 45 mM imidazole. This eluted the weakly bound protein.
続いて、４５〜５００ｍＭイミダゾールの直線グラジエントにより、強く結合したタンパク質を溶出した。 Subsequently, the strongly bound protein was eluted with a linear gradient of 45 to 500 mM imidazole.
続いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各溶出画分に含まれるタンパク質を確認した。 Subsequently, proteins contained in each eluted fraction were confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
図１（ａ）は、Ｎｉ−アフィニティＨｉｓＴｒａｐＦＦ Ｃｒｕｄｅカラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムであり、図１（ｂ）は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。図１（ｂ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。 FIG. 1 (a) is a chromatogram showing the result of chromatography with Ni-affinity HisTrapFF Crude column, and FIG. 1 (b) is a photograph showing the result of SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) . In FIG. 1 (b), the upper arrow indicates the fusion protein and the lower arrow indicates ferritin.
その結果、弱く結合したタンパク質はフェリチンに対しＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の含量が少ない画分（ｌｏｗＧＦＰ画分）であり、強く結合したタンパク質はフェリチンに対しＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の含量が多い画分（ｈｉｇｈＧＦＰ画分）であることが確認された。そこで、以降の操作では、ｌｏｗＧＦＰ画分及びｈｉｇｈＧＦＰ画分を別々に精製した。 As a result, the weakly bound protein is a fraction having a low content of His6-ferritin-GFP fusion protein relative to ferritin (low GFP fraction), and the strongly bound protein has a content of His6-ferritin-GFP fusion protein relative to ferritin It was confirmed that the fraction was high (high GFP fraction). Therefore, in the subsequent operation, the lowGFP fraction and the highGFP fraction were separately purified.
《陰イオン交換カラムによる精製》
続いて、Ｎｉ−アフィニティカラム溶出試料を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化した陰イオン交換ＨｉＴｒａｐＱＨＰカラム（５ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加した。続いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で未吸着タンパク質を溶出した。続いて、吸着したタンパク質を、０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントにより溶出した。
Purification by anion exchange column
Subsequently, the Ni-affinity column elution sample was applied to an anion exchange HiTrap QHP column (5 mL, GE Healthcare Biosciences) equilibrated with 20 mM Tris buffer pH 8.0. Subsequently, unadsorbed protein was eluted with 20 mM Tris buffer pH 8.0. Subsequently, the adsorbed protein was eluted with a linear gradient of 0 to 1 M NaCl.
図２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、陰イオン交換ＨｉＴｒａｐＱＨＰカラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分を精製した結果であり、図２（ｂ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を精製した結果である。図２（ａ）及び（ｂ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。 Fig.2 (a) and (b) are a chromatogram which shows the result of the chromatography by anion exchange HiTrapQHP column, respectively, and a photograph which shows the result of SDS-PAGE, respectively. FIG. 2 (a) shows the result of purifying the lowGFP fraction, and FIG. 2 (b) shows the result of purifying the highGFP fraction. In FIG. 2 (a) and (b), the upper arrow shows a fusion protein and the lower arrow shows a ferritin.
続いて、フェリチンとＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質をともに含む画分を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濃縮デバイスを用いて濃縮した。 Subsequently, fractions containing both ferritin and His6-ferritin-GFP fusion protein were concentrated using an Amicon Ultra centrifugal concentration device.
《ゲル濾過カラムによる精製》
続いて、上記の濃縮した試料を、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム（２４ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０を移動相として分離した。
Purification by gel filtration column
Subsequently, the above concentrated sample is added to a gel filtration Superdex 200 GL column (24 mL, GE Healthcare Biosciences) equilibrated with 20 mM Tris buffer pH 8.0 containing 0.2 M NaCl, and 0.2 M NaCl is added. The 20 mM Tris buffer pH 8.0 containing was separated as a mobile phase.
図２（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラムによるクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２（ｃ）はｌｏｗＧＦＰ画分を精製した結果であり、図２（ｄ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を精製した結果である。図２（ｃ）及び（ｄ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。 FIG.2 (c) and (d) are the photography which respectively shows the result of the chromatogram and SDS-PAGE by gel filtration Superdex200GL column. FIG. 2 (c) shows the result of purifying the lowGFP fraction, and FIG. 2 (d) shows the result of purifying the highGFP fraction. In FIG. 2 (c) and (d), the upper arrow shows a fusion protein and the lower arrow shows a ferritin.
また、溶出した各試料の電子顕微鏡観察も行った。図３（ａ）〜（ｅ）は、代表的な電子顕微鏡写真である。倍率は５万倍である。図３（ａ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分から精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体画分の電子顕微鏡写真であり、図３（ｂ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分から精製した会合体画分の電子顕微鏡写真である。また、図３（ｃ）はｌｏｗＧＦＰ画分から精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体画分の電子顕微鏡写真であり、図３（ｄ）はｌｏｗＧＦＰ画分から精製した会合体画分の電子顕微鏡写真である。また、図３（ｅ）は野生型のフェリチン２４量体籠の電子顕微鏡写真である。 In addition, electron microscopic observation of each eluted sample was also performed. Fig.3 (a)-(e) is a representative electron micrograph. The magnification is 50,000 times. FIG. 3 (a) is an electron micrograph of the monomer fraction of the GFP-containing protein cage (ferritin 24 mer) purified from the high GFP fraction, and FIG. 3 (b) is the aggregate purified from the high GFP fraction It is an electron micrograph of a fraction. Also, FIG. 3 (c) is an electron micrograph of the monomer fraction of the protein cage containing GFP (ferritin 24 mer) purified from the low GFP fraction, and FIG. 3 (d) is purified from the low GFP fraction It is an electron micrograph of an aggregate fraction. FIG. 3 (e) is an electron micrograph of wild-type ferritin 24mer.
その結果、クロマトグラムのピーク形状と電子顕微鏡観察の結果から、ＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）が複数会合した分子種（会合体）が混在していることが明らかとなった。また、会合体には、オリゴマー及び凝集体が存在すると考えられた。そこで、分離したピーク画分を再度濃縮し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（２４ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し会合体を除去した。 As a result, from the peak shape of the chromatogram and the result of the electron microscopic observation, it has become clear that there is a mixture of molecular species (aggregates) in which a plurality of GFP-containing protein cages (ferritin 24 mer) are associated. Also, it was considered that oligomers and aggregates were present in the aggregate. Therefore, the separated peak fraction is concentrated again and added to a gel filtration Superdex 200 Increase column (24 mL, GE Healthcare Biosciences) equilibrated with 20 mM Tris buffer pH 8.0 containing 0.2 M NaCl to remove the aggregate. did.
［実験例４］
（精製したタンパク質ケージの解析）
実験例３で精製した各タンパク質ケージを、超遠心速度法及びゲル濾過により解析した。
[Experimental Example 4]
(Analysis of purified protein cages)
Each protein cage purified in Experimental Example 3 was analyzed by ultracentrifugation and gel filtration.
《超遠心速度法による解析》
続いて、精製したｌｏｗＧＦＰ画分及びｈｉｇｈＧＦＰ画分のＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）、及び野生型のタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）をそれぞれ超遠心速度法により解析し、分子量、沈降係数、分子の形状（ｆ／ｆ０）を測定した。下記表１に、超遠心速度法による解析結果を示す。なお、アミノ酸配列から推定したフェリチンの分子量は４７９ｋＤａであり、ＧＦＰの分子量は２９ｋＤａであった。
<< Analysis by ultracentrifuge velocity method >>
Subsequently, the protein cage (ferritin 24mer high) containing GFP in the purified lowGFP fraction and highGFP fraction and the wild type protein cage (ferritin 24mer 籠) are respectively analyzed by ultracentrifugation, and the molecular weight , Sedimentation coefficient, shape of molecule (f / f 0 ) were measured. Table 1 below shows the results of analysis by the ultracentrifuge velocity method. The molecular weight of ferritin estimated from the amino acid sequence was 479 kDa, and the molecular weight of GFP was 29 kDa.
その結果、各タンパク質ケージは分子量、沈降係数が異なっているにもかかわらず、ｆ／ｆ０がほぼ同じであることが明らかとなった。この結果から、ＧＦＰはフェリチン２４量体籠に内包されており、タンパク質ケージの外側の形状はいずれのタンパク質ケージにおいても同様であると考えられた。 As a result, it was revealed that f / f 0 was almost the same although each protein cage had different molecular weight and different sedimentation coefficient. From this result, it was considered that GFP was contained in the ferritin 24mer 籠, and the shape of the outside of the protein cage was similar in any of the protein cages.
《ゲル濾過による解析》
実験例３で精製したｌｏｗＧＦＰ画分のＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体、及び、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体を、それぞれ、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム（２４ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０を移動相として分離し、波長２８０ｎｍにおける吸光度、及び波長４８８ｎｍにおける吸光度を解析した。なお、波長２８０ｎｍにおける吸光はタンパク質全般（主にトリプトファン残基）による吸収を検出するものであり、波長４８８ｎｍにおける吸光はＧＦＰによる吸収を検出するものである。
<< Analysis by gel filtration >>
The monomer of the protein cage (ferritin 24mer 籠) containing GFP of the lowGFP fraction purified in Experimental Example 3 and the monomer of the protein cage (ferritin 24mer 籠) containing GFP of the highGFP fraction Each was applied to a gel filtration Superdex 200 GL column (24 mL, GE Healthcare Biosciences) equilibrated with 20 mM Tris buffer pH 8.0 containing 0.2 M NaCl, and 20 mM Tris buffer pH 8. 0 was separated as a mobile phase, and the absorbance at a wavelength of 280 nm and the absorbance at a wavelength of 488 nm were analyzed. In addition, the light absorption in wavelength 280nm detects the absorption by protein whole (mainly a tryptophan residue), and the light absorption in wavelength 488nm detects the absorption by GFP.
図４（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラムによるクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図４（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分を解析した結果を示すクロマトグラムであり、図４（ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。また、図４（ｃ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を解析した結果を示すクロマトグラムであり、図４（ｄ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図４（ｂ）及び（ｄ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。 FIG. 4 (a) to (d) are photographs showing the results of chromatogram and SDS-PAGE by gel filtration Superdex 200 GL column, respectively. FIG. 4 (a) is a chromatogram showing the result of analyzing the low GFP fraction, and FIG. 4 (b) is a photograph showing the result of SDS-PAGE. Moreover, FIG.4 (c) is a chromatogram which shows the result of having analyzed the high GFP fraction, FIG.4 (d) is a photograph which shows the result of SDS-PAGE. In FIG. 4 (b) and (d), the upper arrow shows a fusion protein and the lower arrow shows ferritin.
その結果、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、波長２８０ｎｍの吸光と波長４８８ｎｍの吸光の比が約６：１であった。一方、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、波長２８０ｎｍの吸光と波長４８８ｎｍの吸光の比が約３：１であった。 As a result, the protein cage of the low GFP fraction had a ratio of absorbance at a wavelength of 280 nm to absorbance at a wavelength of 488 nm of about 6: 1. On the other hand, the protein cage of the high GFP fraction had a ratio of absorbance at a wavelength of 280 nm to absorbance at a wavelength of 488 nm of about 3: 1.
この結果から、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージと比較して、約２倍のＧＦＰを含むことが明らかとなった。ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージ１個は１分子のＧＦＰを含み、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージ１個は２分子のＧＦＰを含むと考えられた。 From this result, it was revealed that the protein cage of the highGFP fraction contains about twice as much GFP as the protein cage of the lowGFP fraction. One protein cage in the lowGFP fraction contained one molecule of GFP, and one protein cage in the highGFP fraction was considered to contain two molecules of GFP.
［実験例５］
（ＧＦＰを含むタンパク質ケージの結晶化）
実験例３で精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージの結晶化を行った。まず、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濃縮デバイスを用いて、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージを約２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。また、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージを約１６ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
[Experimental Example 5]
(Crystallization of protein cage containing GFP)
The crystallization of the GFP-containing protein cage purified in Experimental Example 3 was performed. First, the protein cage of the lowGFP fraction was concentrated to about 20 mg / mL using an Amicon Ultra centrifugal concentration device. In addition, the protein cage of the high GFP fraction was concentrated to about 16 mg / mL.
続いて、フェリチンの既知の結晶化条件により各タンパク質ケージを結晶化させた。具体的には、１２．５〜２０ｍＭの塩化カドミウムを含む０．５〜１．０Ｍの硫酸アンモニウム溶液０．５ｍｌを母液に用いて、タンパク質ケージ試料１μＬと母液１μＬを混合し、ハンギングドロップ法により結晶化させた。 Subsequently, each protein cage was crystallized under known crystallization conditions of ferritin. Specifically, 0.5 ml of a 0.5 to 1.0 M ammonium sulfate solution containing 12.5 to 20 mM cadmium chloride is used as a mother liquor, 1 μl of a protein cage sample and 1 μl of a mother liquor are mixed, and crystals are obtained by the hanging drop method It turned
図５（ａ）〜（ｄ）は、結晶化を開始してから３日後の各結晶を、それぞれ、可視光及び紫外線（波長４３０ｎｍ以下）の存在下で光学顕微鏡観察した結果を示す写真である。倍率は７０倍である。 FIGS. 5 (a) to 5 (d) are photographs showing the results of optical microscope observation of each crystal three days after the start of crystallization in the presence of visible light and ultraviolet light (wavelength of 430 nm or less), respectively. . The magnification is 70 times.
図５（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真であり、図５（ｂ）は、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。また、図５（ｃ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真であり、図５（ｄ）は、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。 FIG. 5 (a) is a photomicrograph of the low GFP fraction protein cage under visible light, and FIG. 5 (b) is a photomicrograph of the low GFP fraction protein cage in the presence of ultraviolet light. FIG. 5 (c) is a photomicrograph of the protein cage of the high GFP fraction under visible light, and FIG. 5 (d) is a photomicrograph of the protein cage of the high GFP fraction in the presence of ultraviolet light.
その結果、図５（ａ）に示すように、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージを結晶化させることができた。また、図５（ｂ）に示すように、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの結晶は紫外線の存在下で蛍光を発することから、ＧＦＰを含んでいることが確認された。 As a result, as shown in FIG. 5 (a), the protein cage of the low GFP fraction could be crystallized. In addition, as shown in FIG. 5 (b), it was confirmed that the protein cage crystals of the low GFP fraction contained GFP because they emitted fluorescence in the presence of ultraviolet light.
一方、図５（ｃ）に示すように、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、アモルファス状態又は相分離により、上記の条件下では結晶化させることができなかった。また、図５（ｄ）に示すように、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは紫外線の存在下で蛍光を発することから、ＧＦＰを含んでいることが確認された。 On the other hand, as shown in FIG. 5 (c), the protein cage of the high GFP fraction could not be crystallized under the above conditions due to the amorphous state or phase separation. In addition, as shown in FIG. 5 (d), it was confirmed that the protein cage of the high GFP fraction contained GFP because it emitted fluorescence in the presence of ultraviolet light.
［実験例６］
（ＧＦＰ以外のタンパク質を含むタンパク質ケージの結晶化）
ＧＦＰ以外のタンパク質を含むタンパク質ケージの結晶化を行った。標的タンパク質として、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を使用した。タンパク質ケージモノマーとして、フェリチンを使用した。フェリチンとしては、ウマ脾臓由来フェリチンＬ鎖を使用した。ＧＦＰの代わりにＹＦＰを使用した点以外は、実験例１〜３と同様にして、ＹＦＰを含むタンパク質ケージを精製した。
[Experimental Example 6]
(Crystallization of protein cages containing proteins other than GFP)
Crystallization of protein cages containing proteins other than GFP was performed. Yellow fluorescent protein (YFP) was used as a target protein. Ferritin was used as a protein cage monomer. As the ferritin, equine spleen derived ferritin L chain was used. A protein cage containing YFP was purified in the same manner as in Experimental Examples 1 to 3 except that YFP was used instead of GFP.
続いて、実験例５と同様にしてＹＦＰを含むタンパク質ケージの結晶化を行った。図６（ａ）及び（ｂ）は、結晶化を開始してから３日後の結晶を、可視光及び励起波長（波長５１０ｎｍ）の光の存在下で光学顕微鏡観察した結果を示す写真である。倍率は２５倍である。 Subsequently, crystallization of a protein cage containing YFP was performed in the same manner as in Experimental Example 5. FIGS. 6 (a) and 6 (b) are photographs showing the results of optical microscope observation of a crystal three days after the start of crystallization in the presence of visible light and light of an excitation wavelength (wavelength 510 nm). The magnification is 25 times.
図６（ａ）はタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真であり、図６（ｂ）は、タンパク質ケージの励起波長の光の存在下における顕微鏡写真である。 FIG. 6 (a) is a photomicrograph of the protein cage under visible light, and FIG. 6 (b) is a photomicrograph in the presence of light at the excitation wavelength of the protein cage.
その結果、図６（ａ）に示すように、ＹＦＰを含むタンパク質ケージを結晶化させることができた。また、図６（ｂ）に示すように、タンパク質ケージの結晶は励起波長の光の存在下で蛍光を発することから、ＹＦＰを含んでいることが確認された。 As a result, as shown in FIG. 6 (a), it was possible to crystallize the protein cage containing YFP. In addition, as shown in FIG. 6 (b), it was confirmed that the crystals of the protein cage contain YFP because they emit fluorescence in the presence of light of the excitation wavelength.
この結果は、ＧＦＰ以外のタンパク質を標的タンパク質とした場合においても、タンパク質ケージ、及びタンパク質ケージの結晶を作製することができることを示す。 This result shows that even when targeting proteins other than GFP, protein cages and crystals of protein cages can be produced.
本発明によれば、タンパク質ケージに標的タンパク質を取り込ませる技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a technology for incorporating a target protein into a protein cage.
Claims (9)
タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含み、
前記融合タンパク質はタグを有しており、前記タグは前記タンパク質ケージの表面に露出する、製造方法。 A method of producing a protein cage containing a target protein, comprising
Contacting the protein cage monomer with the fusion protein of the protein cage monomer and the target protein to form a protein cage,
The manufacturing method, wherein the fusion protein has a tag, and the tag is exposed on the surface of the protein cage.
請求項１又は２に記載の製造方法により製造された、標的タンパク質を含むタンパク質ケージを結晶化させ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程を含む、製造方法。 A method of producing crystals,
A manufacturing method comprising a crystallization step of crystallizing a protein cage containing a target protein, which is manufactured by the manufacturing method according to claim 1 or 2, and obtaining a crystal of a protein cage containing a target protein.
前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターと、を備え、
前記融合タンパク質がタグを有している、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キット。 A protein cage monomer expression vector,
An expression vector of a fusion protein of the protein cage monomer and a target protein, or a vector for producing an expression vector of the fusion protein,
A kit for producing a protein cage comprising a target protein, wherein the fusion protein has a tag.
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| JP2019534700A (en) * | 2016-10-07 | 2019-12-05 | ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール | Compositions and methods for protein expression and delivery |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 蚕糸・昆虫バイオテック, vol. 76, no. 3, JPN6021025732, 2007, pages 181 - 188, ISSN: 0004672170 * |
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