JP2017101015A - Human heart-like structure and method for producing same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト心臓スフェロイドからヒト心臓様構造体を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a human heart-like structure from human heart spheroids.
脊椎動物において、心臓は循環系の血管を通じて血液を循環させるポンプとして働く。心血管疾患による世界の死亡率は、2008年時点で全死亡率の30%を占める。心血管疾患の中で、心筋梗塞と虚血性心疾患は心筋壊死を引き起こし、心臓線維芽細胞の増殖とリモデリングを生じる。この結果、左室駆出力低下により血液ポンプとしての機能を低下し、最終的に心不全による死を引き起こす。重症心不全における治療法は根本的には心臓移植であるが、心臓移植はドナーが圧倒的に不足しており現実的な手段ではない。
従来、心臓移植までの待機期間の代替措置として補助人工心臓が開発・実用化されている。しかしながら、補助人工心臓はサイズが大きく、患者の日常生活が制限される。また、再生医療等製品としては、テルモの「ハートシート[ヒト（自己）骨格筋由来細胞シート]」が2015年9月18日に期限付き承認された。ハートシートはパラクライン効果により心機能の改善が期待できるが、減少した心筋細胞を直接的に補充することはできず、ポンプ機能を再生するには不十分であった。従って、心筋細胞を直接補充することで、心臓の機能を再生する細胞治療製品が求められていた。
心筋細胞を補充する方法として２つの考え方がある。一つは、間葉系幹細胞（MSC）等の未分化細胞を移植し体内で心筋細胞に分化させるやり方で、もう一つは、ヒトiPS細胞を心筋に分化させてから移植する方法である。ヒトiPS由来心筋細胞の移植はiPS細胞の実用化として期待されているが、ヒトへの臨床応用例はまだない。更に、300μm以上の厚みを持った心臓様組織を一度に作製する手段はなく、ポンプ機能を再建し得る大量の心筋細胞を組織として効率よく移植し生着させる技術の開発が待たれていた。
他方、細胞の立体構造体の製造方法として、針状体又は糸状体にスフェロイドを積層する技術が知られており（特許文献１：WO2008/123614）、この技術を利用して心臓又は血管の構築が試みられている(特許文献２：WO 2014/141528)。
In vertebrates, the heart acts as a pump that circulates blood through blood vessels in the circulatory system. Global mortality from cardiovascular disease accounts for 30% of all mortality in 2008. Among cardiovascular diseases, myocardial infarction and ischemic heart disease cause myocardial necrosis, resulting in proliferation and remodeling of cardiac fibroblasts. As a result, the function of the blood pump is reduced due to a decrease in left ventricular drive output, and eventually death due to heart failure is caused. The treatment for severe heart failure is basically heart transplantation, but heart transplantation is overwhelmingly lacking by donors and is not a practical means.
Conventionally, an auxiliary artificial heart has been developed and put into practical use as an alternative to the waiting period until heart transplantation. However, auxiliary artificial hearts are large in size and limit the daily life of the patient. Terumo's “Heart sheet [human (self) skeletal muscle-derived cell sheet]” was approved as a regenerative medicine product on September 18, 2015. Although the heart sheet can be expected to improve cardiac function due to the paracrine effect, it cannot directly replenish the reduced cardiomyocytes and is insufficient to regenerate the pump function. Therefore, there has been a demand for a cell therapy product that regenerates the function of the heart by directly replenishing cardiomyocytes.
There are two ways to replenish cardiomyocytes. One is a method in which undifferentiated cells such as mesenchymal stem cells (MSC) are transplanted and differentiated into cardiomyocytes in the body, and the other is a method in which human iPS cells are differentiated into cardiac muscle and transplanted. Although transplantation of human iPS-derived cardiomyocytes is expected as a practical application of iPS cells, there are no clinical applications to humans yet. Furthermore, there is no means for producing a heart-like tissue having a thickness of 300 μm or more at a time, and development of a technique for efficiently transplanting and engrafting a large amount of cardiomyocytes capable of reconstructing the pump function as a tissue has been awaited.
On the other hand, as a method for producing a three-dimensional structure of cells, a technique of laminating spheroids on needle-like bodies or filamentous bodies is known (Patent Document 1: WO2008 / 123614). By using this technique, a heart or blood vessel is constructed. Has been attempted (Patent Document 2: WO 2014/141528).
前記細胞の立体構造体の製造技術を利用して心臓構造体を構築するに際し、実際の心臓の機能を模倣できるよう、さらなる改良が望まれている。そこで本発明は、ヒト心臓由来細胞を用いて、細胞同士の積極的な心臓組織化により、心筋細胞による拍動の伝搬や血管内皮細胞の血管網形成などを引き起こし、一度に300μm以上の厚みある構造体を構築する為の方法を提供することを目的とする。 When constructing a cardiac structure using the manufacturing technique of the three-dimensional structure of cells, further improvement is desired so that the function of the actual heart can be imitated. Therefore, the present invention uses human heart-derived cells to cause pulsatile propagation by cardiomyocytes, formation of vascular network of vascular endothelial cells, and the like, with a thickness of 300 μm or more at a time. An object is to provide a method for constructing a structure.
上記課題を解決する為、本発明者は、心臓組織として機能する細胞組成を検討するとともに、「細胞の立体構造体の製造方法（特許文献１：WO2008/123614A）」に基づく細胞凝集体の積層方法をバイオ３Dプリンターを使用して鋭意研究した。その結果、ヒトiPS由来心筋細胞、ヒト心臓線維芽細胞及びヒト血管内皮細胞の混合物を用いることにより、生体内でのヒト心臓に類似した機能を持つ構造体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
（１）ヒト心筋細胞とヒト心臓線維芽細胞とヒト血管内皮細胞とを混合し凝集させたヒト心臓型スフェロイド。
（２）ヒト心筋細胞とヒト心臓線維芽細胞とヒト血管内皮細胞との混合比が12000〜15000：15000〜18000：3000〜4500である（１）に記載のスフェロイド。
（３）ヒト心筋細胞がiPS細胞由来のものである（１）又は（２）に記載のスフェロイド。
（４）ヒト心臓線維芽細胞がヒトiPS細胞由来の心臓線維芽細胞である（１）〜（３）のいずれか１項に記載のスフェロイド。
（５）ヒト血管内皮細胞がヒト動脈血管内皮細胞である（１）〜（４）のいずれか１項に記載のスフェロイド。
（６）前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のスフェロイドに、さらにヒト羊膜由来間葉系幹細胞を融合させたヒト心臓型融合体。
（７）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載のスフェロイド又は（７）に記載の融合体を積層することを特徴とする心臓様三次元構造体の製造方法。
（８）スフェロイド又は融合体の積層は、スフェロイド又は融合体を針状体に突き刺すことにより行われるものである（７）に記載の方法。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor examined a cell composition that functions as a heart tissue, and laminated cell aggregates based on “a method for producing a three-dimensional structure of a cell (Patent Document 1: WO2008 / 123614A)”. The method was intensively studied using a bio 3D printer. As a result, by using a mixture of human iPS-derived cardiomyocytes, human cardiac fibroblasts and human vascular endothelial cells, we succeeded in producing a structure having a function similar to that of the human heart in vivo and completed the present invention. It came to do. That is, the present invention is as follows.
(1) A human heart spheroid obtained by mixing and aggregating human cardiomyocytes, human cardiac fibroblasts and human vascular endothelial cells.
(2) The spheroid according to (1), wherein the mixing ratio of human cardiomyocytes, human cardiac fibroblasts, and human vascular endothelial cells is 12000-15000: 15000-18000: 3000-4500.
(3) The spheroid according to (1) or (2), wherein the human cardiomyocytes are derived from iPS cells.
(4) The spheroid according to any one of (1) to (3), wherein the human cardiac fibroblast is a human iPS cell-derived cardiac fibroblast.
(5) The spheroid according to any one of (1) to (4), wherein the human vascular endothelial cells are human arterial vascular endothelial cells.
(6) A human heart-type fusion obtained by further fusing human amnion-derived mesenchymal stem cells to the spheroid according to any one of (1) to (5).
(7) A method for producing a heart-like three-dimensional structure, comprising stacking the spheroid according to any one of (1) to (6) or the fusion according to (7).
(8) The method according to (7), wherein the layering of the spheroid or fusion is performed by piercing the spheroid or fusion into the needle-like body.
本発明により、ヒト心臓型スフェロイド及びヒト心臓構造体並びにその製造方法が提供される。本発明の方法により製造された組織及び構造体は、生体内の心機能に類似した拍動能および構造を有しており、心臓の機能を補い得る生物由来の人工心臓組織として使用することができる。用途として、直接心臓に移植する方法のほか、心臓から拍出される血液の流れを補う補助ポンプとして、血管周囲に構造体を留置し、その血流を促進させることもできる。従って、本発明は、再生医療の多様な用途に利用できる点で極めて有用である。又、生体内の心機能に似た構造体として医薬品開発の評価系（有効性評価の探索、或いは心臓毒性の安全性評価）として利用できる点でも心筋細胞単独での評価系による技術以上に有用である。
The present invention provides a human heart spheroid, a human heart structure, and a method for producing the same. The tissue and structure produced by the method of the present invention have pulsation ability and structure similar to the cardiac function in the living body, and can be used as an artificial heart tissue derived from a living body that can supplement the function of the heart. . As an application, in addition to a method of transplanting directly into the heart, a structure can be placed around the blood vessel as an auxiliary pump to supplement the flow of blood pumped out of the heart, and the blood flow can be promoted. Therefore, the present invention is extremely useful in that it can be used for various applications of regenerative medicine. In addition, it can be used as an evaluation system for drug development (a search for efficacy evaluation or a safety evaluation of cardiotoxicity) as a structure similar to the cardiac function in the living body, and is more useful than the technique based on the evaluation system using cardiomyocytes alone. It is.
以下、本発明について詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2015-229348号(2015年11月25日出願)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
本発明は、ヒト心筋細胞とヒト線維芽細胞とヒト血管内皮細胞とを混合し凝集させたヒト心臓型スフェロイドである。また本発明は、このスフェロイドを積層することを特徴とする心臓様三次元構造体の製造方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The scope of the present invention is not limited to these explanations, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention. It should be noted that all documents and publications described in this specification are incorporated herein by reference in their entirety regardless of their purposes. In addition, this specification is a disclosure of the claims, description, and drawings of Japanese Patent Application No. 2015-229348 (filed on November 25, 2015), which is a Japanese patent application that is the basis of the priority claim of the present application. Includes content.
The present invention is a human heart spheroid obtained by mixing and aggregating human cardiomyocytes, human fibroblasts, and human vascular endothelial cells. Moreover, this invention is a manufacturing method of the heart-like three-dimensional structure characterized by laminating | stacking this spheroid.
１．ヒト心臓型スフェロイド
本発明においては、ヒト由来の心筋細胞と、ヒト由来の線維芽細胞と、ヒト由来の血管内皮細胞とを共培養することにより、これらの細胞が凝集したスフェロイドを作製する。作製されたスフェロイドには心筋細胞種が含まれているため、このスフェロイドを「ヒト心臓型スフェロイド」という。但し、本明細書では単に「心臓スフェロイド」又は「スフェロイド」ともいう。
本発明において使用する心筋細胞は、ヒト由来の細胞であり、生検された細胞、市販の凍結細胞、ES細胞、iPS細胞などを用いることができる。また、生体由来細胞から試薬、遺伝子、mRNA、microRNA等を用いて分化誘導させた心筋細胞などを用いることもできる。本発明においては、ヒトiPS細胞由来の心筋細胞であることが好ましい。
本発明において用いられる線維芽細胞は、ヒト由来の細胞であり、特に限定されるものではないが、ヒト由来の線維芽細胞であることが好ましい。例えば、ヒト由来の心臓線維芽細胞、ヒトiPS細胞由来心臓線維芽細胞などが挙げられる。
本発明において用いられる血管内皮細胞は、ヒト由来の血管内皮細胞であり、特に限定されるものではないが、ヒト由来の臍帯静脈内皮細胞、動脈血管内皮細胞（例えば冠状動脈血管内皮細胞）、心臓由来血管内皮細胞であることが好ましい。
1. Human heart-type spheroids In the present invention, human-derived cardiomyocytes, human-derived fibroblasts, and human-derived vascular endothelial cells are co-cultured to produce spheroids in which these cells are aggregated. Since the produced spheroid contains cardiomyocyte types, this spheroid is referred to as “human heart spheroid”. However, in this specification, it is also simply referred to as “cardiac spheroid” or “spheroid”.
The cardiomyocytes used in the present invention are human-derived cells, and biopsyed cells, commercially available frozen cells, ES cells, iPS cells and the like can be used. In addition, cardiomyocytes induced to differentiate from living cells using reagents, genes, mRNA, microRNA and the like can also be used. In the present invention, human iPS cell-derived cardiomyocytes are preferred.
The fibroblast used in the present invention is a human-derived cell and is not particularly limited, but is preferably a human-derived fibroblast. Examples thereof include human-derived cardiac fibroblasts and human iPS cell-derived cardiac fibroblasts.
The vascular endothelial cells used in the present invention are human-derived vascular endothelial cells, and are not particularly limited. However, human-derived umbilical vein endothelial cells, arterial vascular endothelial cells (for example, coronary vascular endothelial cells), heart It is preferably a derived vascular endothelial cell.
本発明において、心臓スフェロイドを作製するための細胞の混合比は、ヒト心筋細胞：ヒト線維芽細胞：ヒト血管内皮細胞が12000〜15000：15000〜18000：3000〜4500、好ましくは15000：15000：3000である。すなわち、ヒト心筋細胞：ヒト線維芽細胞：ヒト血管内皮細胞＝８〜１０：１０〜1２：２〜３であり、5：5：1の細胞比とすることが好ましい。ここで、心筋細胞の培地中の濃度は、1×106個/ml〜2×105個/ml、好ましくは7.5×104個/mlとすることができ、この細胞数に対して、上記比率となるように線維芽細胞及び血管内皮細胞を調整し、混合する。 In the present invention, the mixing ratio of cells for producing cardiac spheroids is 12000-15000: 15000-18000: 3000-4500, preferably 15000: 15000: 3000 for human cardiomyocytes: human fibroblasts: human vascular endothelial cells. It is. That is, human cardiomyocytes: human fibroblasts: human vascular endothelial cells = 8-10: 10-12: 2-3, and a cell ratio of 5: 5: 1 is preferable. Here, the concentration of cardiomyocytes in the medium can be 1 × 10 6 cells / ml to 2 × 10 5 cells / ml, preferably 7.5 × 10 4 cells / ml. Fibroblasts and vascular endothelial cells are adjusted to the above ratio and mixed.
ここで「混合」とは、心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞が接触してスフェロイドを形成し得る状況になれば特に限定されるものではなく、例えば、(i)それぞれの細胞の細胞懸濁液を他の１つの容器に入れて混合する態様、(ii)心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞のいずれかの培養培地中に他の細胞の細胞懸濁液を添加する態様などがある。本発明の方法では、心筋細胞様培養液と線維芽細胞培養液と血管内皮細胞との混合培養液を用いる場合や、一の細胞を培養容器に接着又は沈殿させておいて培地の全部又は一部を取り除き、他の細胞の細胞懸濁液をその培養液に添加する態様が含まれる。 Here, “mixing” is not particularly limited as long as cardiomyocytes, fibroblasts and vascular endothelial cells come into contact with each other to form spheroids. For example, (i) cell suspension of each cell A mode in which a suspension is put in another container and mixed, (ii) a mode in which a cell suspension of other cells is added to any culture medium of cardiomyocytes, fibroblasts and vascular endothelial cells, etc. is there. In the method of the present invention, a mixed culture solution of cardiomyocyte-like culture solution, fibroblast culture solution and vascular endothelial cells is used, or one cell is adhered or precipitated to a culture container and all or one of the medium is used. The mode which removes a part and adds the cell suspension of another cell to the culture solution is contained.
本発明において、線維芽細胞の培養培地は、一般に動物細胞の培養に使用される培地を採用することができる。そのような培地としては、例えば、DMEM、RPMI-1640、DMEM/F12などが挙げられる。また、市販の線維芽細胞培養培地（LONZA社製、DSファーマバイオメディカル等）を使用することも可能であり、特に限定されるものではない。培地には、必要に応じて各種抗生物質、組み換えタンパク質およびウシ胎児血清などを添加することができる。 In the present invention, a culture medium generally used for culturing animal cells can be adopted as the culture medium for fibroblasts. Examples of such a medium include DMEM, RPMI-1640, DMEM / F12, and the like. A commercially available fibroblast culture medium (manufactured by LONZA, DS Pharma Biomedical, etc.) can also be used, and is not particularly limited. Various antibiotics, recombinant proteins, fetal bovine serum, and the like can be added to the medium as necessary.
本発明において、心筋細胞の培養培地は、一般に心筋細胞の培養に使用される培地を採用することができる。そのような培地としては、例えばDMEM、RPMI-1640、DMEM/F12、Williams’ Medium Eなどが挙げられる。また、市販の心筋細胞培養培地（リプロセル社）などを用いることもできる。
本発明において、血管内皮細胞の培養培地は、コラーゲンコートされた培養容器及びある種の組み換えタンパク質添加と組み合わせることで一般に血管内皮細胞の培養に使用される培地を採用することができる。そのような培地としては、例えばDMEM、RPMI-1640などが挙げられる。
また、市販の血管内皮細胞培養培地（Lonza社）などを用いることもできる。
In the present invention, a culture medium generally used for cardiomyocyte culture can be adopted as the culture medium for cardiomyocytes. Examples of such a medium include DMEM, RPMI-1640, DMEM / F12, and Williams' Medium E. Moreover, a commercially available cardiomyocyte culture medium (Reprocell) etc. can also be used.
In the present invention, a culture medium generally used for culturing vascular endothelial cells can be adopted as a culture medium for vascular endothelial cells in combination with a collagen-coated culture vessel and addition of a certain kind of recombinant protein. Examples of such a medium include DMEM and RPMI-1640.
Commercially available vascular endothelial cell culture medium (Lonza) can also be used.
非吸着のU底型マイクロウェルプレート内で上記の細胞を混合すると、細胞同士が集合して凝集する。この凝集体をスフェロイドという。スフェロイドを形成するまでの培養時間は、2日以上であり、2〜7日、好ましくは2〜4日である。培養は、4％〜6％CO2、33℃〜41℃の条件、例えば５％CO2、37℃の条件で行う。
作製されたスフェロイドが心臓型であることの確認は、スフェロイドの拍動、拍動率を指標とすることができる。拍動は、60秒あたり40回〜120回、好ましくは60回〜100回である。５％CO2、37℃の培養条件を指標とするときは、40〜120回/60秒、好ましくは60〜100回/60秒である。
血管内皮細胞を冠状動脈血管内皮細胞にすると、実際のヒト心臓組織の組成により近付けることができる。
本発明においては、このようにして形成されたスフェロイドに、さらに羊膜由来間葉系幹細胞を配合することができる。両者を配合すると、スフェロイドと羊膜由来間葉系幹細胞とが融合し、融合体を形成する。
スフェロイドと羊膜由来間葉系幹細胞との混合比は、33：40から33 : 200、好ましくは33：40から33：120である。羊膜由来間葉系幹細胞を用いることにより、前記スフェロイドの形態及び機能よりもさらにヒトの実際の心臓の形態及び機能に近づけることが可能である。
When the above cells are mixed in a non-adsorbed U-bottom microwell plate, the cells gather and aggregate. This aggregate is called spheroid. The culture time until spheroids are formed is 2 days or longer, 2 to 7 days, preferably 2 to 4 days. The culture is performed under conditions of 4% to 6% CO 2 and 33 ° C. to 41 ° C., for example, 5% CO 2 and 37 ° C.
Confirmation that the produced spheroid is a heart type can be based on the spheroid pulsation and the pulsation rate. The pulsation is 40 to 120 times, preferably 60 to 100 times per 60 seconds. When the culture condition of 5% CO 2 and 37 ° C. is used as an index, it is 40 to 120 times / 60 seconds, preferably 60 to 100 times / 60 seconds.
When vascular endothelial cells are coronary vascular endothelial cells, they can be brought closer to the actual composition of human heart tissue.
In the present invention, amnion-derived mesenchymal stem cells can be further blended with the spheroids thus formed. When both are blended, spheroids and amnion-derived mesenchymal stem cells fuse to form a fusion.
The mixing ratio of spheroids to amnion-derived mesenchymal stem cells is 33:40 to 33: 200, preferably 33:40 to 33: 120. By using amnion-derived mesenchymal stem cells, it is possible to bring the shape and function of a human heart closer to that of the spheroid.
２．心臓構造体の製造
前述の通り、細胞を任意の３次元空間に配置することにより、細胞の立体構造体を作製する方法が知られている（WO2008/123614号）。この方法は、基板に針状体を剣山状に配置させて、その針状体に細胞塊を突き刺すことにより配置させるというものである。
2. Production of Heart Structure As described above, a method for producing a three-dimensional structure of cells by arranging cells in an arbitrary three-dimensional space is known (WO2008 / 123614). In this method, a needle-like body is arranged in a sword mountain shape on a substrate, and the needle-like body is placed by piercing a cell mass.
本発明においては、上記方法を利用してスフェロイド、又はスフェロイドと羊膜由来間葉系幹細胞との融合体を積層させて立体構造体を作製する。既に上記方法を実現するための自動積層ロボットが知られているので（バイオ3Dプリンター「レジェノバ」（登録商標）、株式会社サイフューズ）、立体構造体は、このロボットなどを用いて作製することが好ましい。
ここで、心臓構造体を作製する方法の例を、図７を用いて簡単に説明する。心臓構造体は、例えば、図７に示すように4つの工程、すなわち、工程I〜工程IVにより作製することができる。工程Iでは、前述のスフェロイド又は融合体を提供する。次に、工程IIは、剣山方式のBioprintingで構造体を作成するアプローチであり、スフェロイド又は融合体を所定ピッチの剣山を用いて積層する。工程IIIは、剣山にスフェロイド又は融合体を刺した状態での灌流培養プロセスであり、これにより賽子状やパッチ状などのBioprinting構造を形成する。工程IVでは、前記潅流培養後にスフェロイド同士又は融合体同士が融合していることを確認してから剣山からBioprinting構造の構造体を引き抜き、引き抜いた構造体を静置培養する。これらの工程を経て、心臓構造体を作製することができる。
スフェロイド及び融合体の配置数及び配置形状は特に限定するものではなく、任意である。ここで、「積層」とは、スフェロイド又は融合体を一層以上の層により構造体を形成することを意味する。
スフェロイド又は融合体を所定形状及び所定数で配置させた後、針状体を抜去して所定期間培養すると、スフェロイド又は融合体同士がさらに融合して心臓様の構造体を形成する。
In the present invention, a three-dimensional structure is prepared by laminating a spheroid or a fusion of a spheroid and an amnion-derived mesenchymal stem cell using the above method. Since an automatic stacking robot for realizing the above method is already known (Bio 3D printer “Regenova” (registered trademark), Cyfuse Co., Ltd.), it is preferable that the three-dimensional structure is produced using this robot or the like. .
Here, an example of a method for producing a heart structure will be briefly described with reference to FIG. The cardiac structure can be produced by, for example, four steps, that is, step I to step IV as shown in FIG. In step I, the aforementioned spheroid or fusion is provided. Next, Step II is an approach for creating a structure by Kenzan-type Bioprinting, in which spheroids or fusions are laminated using a Kenzan with a predetermined pitch. Step III is a perfusion culture process in which spheroids or fusions are stabbed in Kenzan, thereby forming a bioprinting structure such as an insulator or patch. In Step IV, after confirming that spheroids or fusions are fused after the perfusion culture, the structure of Bioprinting structure is extracted from Kenzan, and the extracted structure is statically cultured. Through these steps, a cardiac structure can be produced.
The number of arrangement | positioning and arrangement | positioning shape of a spheroid and a fusion body are not specifically limited, It is arbitrary. Here, “lamination” means forming a structure of one or more layers of spheroids or fusions.
After the spheroids or fusion bodies are arranged in a predetermined shape and a predetermined number, when the needle-like bodies are removed and cultured for a predetermined period, the spheroids or fusion bodies are further fused to form a heart-like structure.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
ヒト心臓様スフェロイドの作製
リプロセル社より作製・販売されているヒトiPS由来心筋細胞（ReproCardio 2TM）、ヒト心臓線維芽細胞（NHCF、DSファーマバイオメディカル）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC、Lonza）を用いて、表1のように細胞組成を振り（Group 1〜Group 10）、スフェロイドを作製した（表１、図１）。
スフェロイド培養培地は、20%FBSを補った心筋細胞専用培地200μL/wellの割合で培養した（5％CO2、37℃）。NHCFはDSファーマバイオメディカル社から購入し、HUVECはLonza社より購入した。それぞれ推奨された専用培地で培養し、passage 2〜8の割合まで拡大培養し、増殖・継代し、バンバンカー（日本ジェネティクス）で-80℃もしくは液体窒素に凍結保存した。スフェロイド作製時に、全ての細胞は37℃温浴にて融解し、 20%FBS心筋細胞専用培地で混濁してスフェロイド作製に使用した。 The spheroid culture medium was cultured at a rate of 200 μL / well dedicated to cardiomyocytes supplemented with 20% FBS (5% CO 2 , 37 ° C.). NHCF was purchased from DS Pharma Biomedical, and HUVEC was purchased from Lonza. Each of the cells was cultured in the recommended dedicated medium, expanded to a ratio of 2 to 8 passages, grown and passaged, and stored frozen at -80 ° C or liquid nitrogen in a bunker (Nippon Genetics). At the time of spheroid preparation, all cells were thawed in a 37 ° C. warm bath, turbid in a 20% FBS cardiomyocyte-dedicated medium, and used for spheroid preparation.
マイクロウェルプレートはSUMILON社より販売されているPrimeSurfaceTM 96U plate（U底）を用いた。ReproCardio 2TMは、Day 6以降には全て拍動を開始する事を確認した。 As the microwell plate, PrimeSurface ™ 96U plate (U bottom) sold by SUMILON was used. It was confirmed that ReproCardio 2 TM started to beat after Day 6.
又、Day 3におけるスフェロイドをバイオ3Dプリンター RegenovaTM（株式会社サイフューズ）で積層することを前提としてスフェロイド直径を倒立顕微鏡で観察した。Day 3において 約400μm直径のスフェロイドを形成し、かつDay 13（2週間以内）までに拍動する条件としてGroup 2の条件を見出した。
同様の実験を再度繰り返して確認したところ、ReproCardio 2TM： NHCF : HUVEC= 15000: 18750: 3750の細胞組成比で単一スフェロイドを作り、かつ細胞を撒いて少なくともDay 14以降に拍動する条件を見出した（図１）。
Further, the spheroids diameter assuming laminating spheroids in Day 3 bio 3D printer Regenova TM (Saifuyuzu Ltd.) were observed with an inverted microscope. On Day 3, the condition of Group 2 was found as a condition for forming a spheroid having a diameter of about 400 μm and pulsating by Day 13 (within 2 weeks).
When the same experiment was repeated again, it was confirmed that a single spheroid was formed with a cell composition ratio of ReproCardio 2 TM : NHCF: HUVEC = 15000: 18750: 3750, and the cells were beaten and pulsated at least after Day 14 (FIG. 1).
心臓スフェロイド融合体の作製
実施例１において心臓スフェロイドを作製した実験条件を元に、よりヒト心臓組織の組成に近づける為に、HUVECをHCAECに切り替えてスフェロイドを作製した（図２）。ヒト iPS由来心筋細胞（リプロセル社）、ヒト心臓線維芽細胞（NHCF）、ヒト冠状動脈血管内皮細胞（HCAEC）より心臓構造体スフェロイドを作製（15000 cells/15000 cells/3000 cells)した。この細胞混合比は、作製されたスフェロイド全体のうち、少なくとも半数のスフェロイドが拍動する条件である。次に、Day 3 以降、先太チップを用いて、2 ⇒ 4 ⇒ 8スフェロイドと、1つのwellにスフェロイドを集めて融合させた。その結果、Day 10の時点で、28スフェロイド融合体（3セットのうち1セット）の中で、融合体構造が全体に拍動するグループを確認した。
Preparation of cardiac spheroid fusion Based on the experimental conditions in which cardiac spheroids were prepared in Example 1, HUVEC was switched to HCAEC to produce spheroids in order to more closely approximate the composition of human heart tissue (FIG. 2). Heart structure spheroids (15000 cells / 15000 cells / 3000 cells) were prepared from human iPS-derived cardiomyocytes (Reprocell), human cardiac fibroblasts (NHCF), and human coronary artery endothelial cells (HCAEC). This cell mixing ratio is a condition under which at least half of the produced spheroids beat. Next, from Day 3 onwards, spheroids were collected and fused in one well, using a thick tip, 2 ⇒ 4 ⇒ 8 spheroids. As a result, as of Day 10, a group in which the fusion structure beats as a whole in 28 spheroid fusions (1 set out of 3 sets) was confirmed.
心臓スフェロイドと羊膜由来間葉系幹細胞（AMSC）とを混合した融合体の作製（図３）
ヒト iPS由来心筋細胞（リプロセル社）、ヒト心臓線維芽細胞（NHCF）、ヒト冠状動脈血管内皮細胞（HCAEC）より心臓構造体スフェロイドを作製（15000 cells/ 15000 cells/3000 cells)し、PrimeSurfaceTM96Uプレートで3日間培養した（5％CO2、37℃）。培地を
100μl/wellの割合で除去し、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞（AMSC、コスモバイオ）を4×104 cells/100μlの割合で添加した（Day 3）。更に培養し、AMSCも含めて単一スフェロイドが形成されたことを確認し、スミロンセルタイトプレート24F（以後、24 well plateと表記）にスフェロイドを移動した（n=4）。その後、更にAMSCを加えない群、8×104個、1.6×105個又は3.2×105個を添加した群に分けて24 well plateで培養した（Day 7）。その後、
Day 31まで培養・維持し続けた。Day 31において、AMSCを加えない群と8×104個添加群は、全例1秒/回以上の割合で拍動した。 1.6×105個添加群は一部のwellで拍動せず、3.2×105個添加群は4wellともに拍動していなかった（表２）。
Production of a fusion of cardiac spheroids and amnion-derived mesenchymal stem cells (AMSC) (Fig. 3)
Prepared cardiac structure spheroids (15000 cells / 15000 cells / 3000 cells) from human iPS-derived cardiomyocytes (Reprocell), human cardiac fibroblasts (NHCF), and human coronary artery endothelial cells (HCAEC), PrimeSurface TM 96U The plate was cultured for 3 days (5% CO 2 , 37 ° C.). Medium
The cells were removed at a rate of 100 μl / well, and human amnion-derived mesenchymal stem cells (AMSC, Cosmo Bio) were added at a rate of 4 × 10 4 cells / 100 μl (Day 3). After further culturing, it was confirmed that a single spheroid including AMSC was formed, and the spheroid was moved to Sumilon Celtite Plate 24F (hereinafter referred to as 24 well plate) (n = 4). Thereafter, the cells were further divided into a group to which AMSC was not added, a group to which 8 × 10 4 cells, 1.6 × 10 5 cells or 3.2 × 10 5 cells were added, and cultured in a 24-well plate (Day 7). after that,
Cultivation and maintenance continued until Day 31. On Day 31, the group in which AMSC was not added and the group in which 8 × 10 4 were added all beat at a rate of 1 second / time or more in all cases. The 1.6 × 10 5 addition group did not beat in some wells, and the 3.2 × 10 5 addition group did not beat in all 4 wells (Table 2).
心臓構造体の作製
心臓スフェロイドを28個融合しても拍動する事を確認した為、これらのスフェロイドを300μｍピッチの剣山を用いて8×7×1のシート状に積層し、心臓構造体シートを作製した（図４Ａ）。細胞を撒いて3日後にバイオ3Dプリンター RegenovaTM（以下、RegenovaTMと表記）でスフェロイドを積層し、循環培養容器内に20%FBS心筋専用培地 100mlを用いて灌流培養を7日間実施した。7日後に、剣山上でスフェロイド同士が融合していることを目視し、グリットプレートと併せて構造体を抜去した。抜去した心臓構造体は、直径10cmシャーレ（底面を組織培養処理していない）に20%FBS心筋専用培地 10mlとともに培養・維持した。静置培養から4日後に心臓構造体は全体が同調して拍動していることを確認した（図4Ａ上パネル）。
Preparation of heart structure Since it was confirmed that the heart beats even after 28 heart spheroids were fused, these spheroids were laminated into an 8x7x1 sheet using a 300mm pitch sword mountain, and the heart structure sheet Was prepared (FIG. 4A). Three days after seeding the cells, spheroids were layered with a Bio 3D printer Regenova ™ (hereinafter referred to as Regenova ™ ), and perfusion culture was performed for 7 days using 100 ml of 20% FBS myocardial medium in a circulating culture vessel. Seven days later, it was visually observed that spheroids were fused on Mount Ken, and the structure was removed together with the grit plate. The removed heart structure was cultured and maintained in a 10 cm diameter petri dish (the bottom surface was not subjected to tissue culture treatment) with 10 ml of 20% FBS myocardial medium. Four days after stationary culture, it was confirmed that the heart structure was pulsating in synchrony as a whole (FIG. 4A upper panel).
Day 12に構造体直径を観察し、培地から4%パラフォルムアルデヒド（PFA）含有PBS溶液（ナカライテスク）に交換した。組織を固定後、免疫染色処理を実施した。
又、同様の心臓スフェロイド組成で図４Ａ下パネルに示すようなリング状の３層構造体を作製した。リング状に積層した構造体をDay 8で抜去後、Day 9において内孔側でも規則的な収縮を示した（図４Ａ下パネル）。血管周囲に留置し、血流を向上させる用途に応用できる。
The structure diameter was observed on Day 12, and the medium was replaced with a 4% paraformaldehyde (PFA) -containing PBS solution (Nacalai Tesque). After the tissue was fixed, immunostaining was performed.
Further, a ring-shaped three-layer structure having the same cardiac spheroid composition as shown in the lower panel of FIG. 4A was produced. After the structure laminated in the ring shape was removed on Day 8, regular shrinkage was also observed on the inner hole side on Day 9 (lower panel in FIG. 4A). It can be placed around blood vessels and applied to improve blood flow.
心臓構造体の免疫組織染色
実施例４で作製したシート状の心臓構造体（図4）と同様の方法で、1層48スフェロイドでほぼ3層からなる構造体を作製した。リング状に積層した構造体の穴は、Day 52の時点では塞がっており、Day 52の時点で次のように切片を作り免疫染色を行った。
具体的には、心臓の3次元構造体は、4%パラフォルムアルデヒド（PFA）含有PBS溶液（ナカライテスク）で処理し、PBS溶液に交換後4℃で維持した。その後、Xyleneに比べ低毒性有機溶媒のG-Nox（Genostaff Co., Ltd.）を使用してCT-Pro20 (Genostaff Co., Ltd.)で包埋し、5μm間隔で切片化した。
免疫染色を実施する為に、これらの切片はxyleneで脱パラフィン化し、エタノールとPBSを通じて水飽和処理した。抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（pH6.0）で20分間マイクロ波熱処理によって実施した。内在性のperoxidaseは、0.3% H2O2含有メタノール溶液で30分間ブロックし、 Protein Block (Genostaff) とavidin/biotin blocking kit (Vector)でインキュベーションした。
Immunohistochemical staining of heart structure By the same method as the sheet-like heart structure prepared in Example 4 (FIG. 4), a structure consisting of approximately 3 layers of 48 spheroids per layer was prepared. The holes of the structure laminated in a ring shape were closed at the time of Day 52, and at the time of Day 52, sections were prepared as follows and immunostaining was performed.
Specifically, the three-dimensional structure of the heart was treated with a PBS solution (Nacalai Tesque) containing 4% paraformaldehyde (PFA) and maintained at 4 ° C. after exchanging with the PBS solution. Then, it was embedded in CT-Pro20 (Genostaff Co., Ltd.) using G-Nox (Genostaff Co., Ltd.), which is a less toxic organic solvent than Xylene, and sectioned at intervals of 5 μm.
To perform immunostaining, these sections were deparaffinized with xylene and water-saturated with ethanol and PBS. Antigen activation was performed by microwave heat treatment with citrate buffer (pH 6.0) for 20 minutes. Endogenous peroxidase was blocked with a methanol solution containing 0.3% H 2 O 2 for 30 minutes and incubated with Protein Block (Genostaff) and avidin / biotin blocking kit (Vector).
組織切片は、抗CD31ウサギポリクローナル抗体（abcam）、抗CD34マウスモノクローナル抗体（abcam）、抗Connexin43ウサギポリクローナル抗体（abcam）、抗αSMAウサギポリクローナル抗体、抗Cardiac troponin Tマウスモノクローナル抗体（abcam）及び抗MYOM1（ミオメシン）ウサギポリクローナル抗体（abcam）とともに、4℃で一晩それぞれインキュベーションした。抗体処理した切片は、ビオチン結合型ヤギ抗ウサギIg（Dako）又はビオチン結合型ウサギ抗マウスIg(Dako)で30分間、室温処理した。処理された切片を、ペルオキシダーゼ結合型ストレプトアビジンを添加して5分間反応させ、更にジアミノベンジンによって発色処理した。組織切片は、Mayer’s Hematoxylin (MUTO)、マッソントリクロームおよびエラスチカマッソンでそれぞれ染色し、malinol（MUTO）でマウントした（図４Ｂ [解像度50倍]、図４Ｃ [解像度100倍]） 。
図４Ｂ及び図４Ｃにおいて観察されるとおり、心臓構造体には血管が自己組織化しており（IHC:CD31及びCD34）、本来の拍動するヒト心臓の形態を有していることが示された(IHC: Connexin 43、αSMA、Cardiac TroponinT及びMYOM1)。また、血管が管腔構造を形成しており、構造体の中心部まで培地が供給されていることが示された。これは、任意の大きな厚みのある細胞構造体を壊死することなく作製できることを示しており、本発明の有利な点である。
図４Ｂ及び図４Ｃの血管内皮構造細胞の内部構造がどのように連続しているかを確認した（図４Ｄ）。5μm間隔で連続した8枚の組織切片（Slide No.45からSlide No.52の合計8枚）に対して、抗CD34マウスモノクローナル抗体（abcam）で免疫染色している。心臓構造体内部にCD34で染色される細胞（血管内皮細胞）は局在する領域を確認した。CD34抗体に結合する染色領域は切片ごとに少しずつ形状を変化しており、構造体内部に管状の血管構造が形成しつつある事が推察された。
心臓構造体（解像度 ×100）の中にヒト心臓本来の構造が形成されているかを確認する為に、HE染色した構造体切片を光学顕微鏡で400倍の解像度で観察した。その結果、横縞模様の構造が散在して存在していることがわかった（図4Ｅ、輪で囲った部分）。横紋筋構造が断片的に形成されていることが推察された。
Tissue sections consist of anti-CD31 rabbit polyclonal antibody (abcam), anti-CD34 mouse monoclonal antibody (abcam), anti-Connexin43 rabbit polyclonal antibody (abcam), anti-αSMA rabbit polyclonal antibody, anti-Cardiac troponin T mouse monoclonal antibody (abcam) and anti-MYOM1. Incubated with (myomesin) rabbit polyclonal antibody (abcam) at 4 ° C. overnight. The antibody-treated sections were treated with biotin-conjugated goat anti-rabbit Ig (Dako) or biotin-conjugated rabbit anti-mouse Ig (Dako) for 30 minutes at room temperature. The treated sections were added with peroxidase-conjugated streptavidin, reacted for 5 minutes, and further developed with diaminobenzine. Tissue sections were stained with Mayer's Hematoxylin (MUTO), Masson Trichrome and Elastica Masson, respectively, and mounted with malinol (MUTO) (FIG. 4B [resolution 50 times], FIG. 4C [resolution 100 times]).
As observed in FIGS. 4B and 4C, the heart structure was shown to have self-organized blood vessels (IHC: CD31 and CD34) and to have the shape of an original beating human heart. (IHC: Connexin 43, αSMA, Cardiac TroponinT and MYOM1). It was also shown that the blood vessels formed a luminal structure, and the medium was supplied to the center of the structure. This shows that an arbitrarily large cell structure can be produced without necrosis, which is an advantage of the present invention.
It was confirmed how the internal structures of the vascular endothelial structure cells in FIGS. 4B and 4C are continuous (FIG. 4D). Immunostaining was carried out with anti-CD34 mouse monoclonal antibody (abcam) on 8 tissue sections (Slide No. 45 to Slide No. 52 in total) that were continuous at 5 μm intervals. The region where cells (vascular endothelial cells) stained with CD34 were localized in the heart structure was confirmed. The stained region that binds to the CD34 antibody slightly changed in shape from section to section, and it was speculated that a tubular vascular structure was being formed inside the structure.
In order to confirm whether the original structure of the human heart was formed in the heart structure (resolution x100), the HE-stained structure section was observed with an optical microscope at 400 times the resolution. As a result, it was found that horizontal striped structures were scattered (FIG. 4E, a portion surrounded by a ring). It was inferred that the striated muscle structure was formed in pieces.
心臓スフェロイドに羊膜由来間葉系幹細胞（AMSC）を混合した構造体の作製
ヒトiPS由来心筋細胞（リプロセル社）、心臓線維芽細胞（NHCF）、冠状動脈血管内皮細胞（HCAEC）をPrimeSurfaceTM 96Uプレートに撒き、37℃5%CO2インキュベーターで3日間静置培養した。心臓構造体の凝集（15000 cells/15000 cells/3000 cells) を確認後、羊膜由来間葉系幹細胞（Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cells、AMSCと略記、Cellula社）を40000 cells/wellの割合で追加添加し、更に3日間静置培養した（図5Aの図5-1もしくは上パネル）。
心臓スフェロイド凝集体にAMSCが更に単一の球状に凝集されたことを確認した。この凝集体スフェロイドを400μｍピッチの剣山を用いて6×6×2のシート状にバイオ3Dプリンター RegenovaTMでスフェロイドを積層した（表３）。
Preparation of a structure in which amnion-derived mesenchymal stem cells (AMSC) are mixed with cardiac spheroids Human iPS-derived cardiomyocytes (Reprocell), cardiac fibroblasts (NHCF), coronary artery vascular endothelial cells (HCAEC) in PrimeSurface TM 96U plate Then, the cells were statically cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 3 days. After confirming the aggregation of the cardiac structure (15000 cells / 15000 cells / 3000 cells), add amnion-derived mesenchymal stem cells (Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cells, abbreviated as AMSC, Cellula) at a rate of 40,000 cells / well. The culture was further statically cultured for 3 days (FIG. 5A in FIG. 5A or the upper panel).
It was confirmed that AMSC was further aggregated into a single spherical shape on cardiac spheroid aggregates. The aggregate spheroids were laminated on a 6 × 6 × 2 sheet using a bio 3D printer Regenova ™ using a 400 μm pitch sword mountain (Table 3).
循環培養容器内に20%FBS心筋専用培地 100mlを用いて灌流培養を4日間実施した。4日後に、剣山上でスフェロイド同士が融合していることを目視し、グリットプレートを併せて一辺が2mmのシート状構造体を抜去した。抜去した心臓構造体は、10cmシャーレ（底面を組織培養処理していない）に20%FBS心筋専用培地 10mlとともに培養・維持した。 Perfusion culture was performed for 4 days using 100 ml of 20% FBS myocardial medium in a circulating culture vessel. Four days later, it was visually observed that spheroids were fused on the sword mountain, and the sheet-like structure with a side of 2 mm was removed together with the grit plate. The extracted heart structure was cultured and maintained in a 10 cm petri dish (the bottom surface was not subjected to tissue culture treatment) with 10 ml of 20% FBS myocardial medium.
静置培養から3日後（Day 13）に心臓構造体が拍動していることを確認した。Day 14、
Day 15にも構造体表面が継続的に拍動することを動画観察し（図５Ａ上パネルの右写真）、培地から4%PFA入りPBS溶液に交換した。
又、ヒト iPS由来心筋細胞、NHCF、HCAEC、AMSCをPrimeSurfaceTM 96Uプレートに1 well当たり7500 cells/7500 cells/3000 cells/40000 cellsの組成で撒いて、37℃ 5% CO2インキュベーターで4日間静置培養し、Day 5で8×8×1のシート構造で400μｍピッチ剣山に積層して構造体を作製した（表３のGroup 17、図5Aの図5-2もしくは図5A下パネル）。
構造体の形状は脆く、Day 10で一部塊が崩れたものの、Day 17に拍動を確認した。図５Ａ右下パネルはDay 19における心臓構造体の写真である。
AMSCがiPS由来心筋細胞の2.7倍もしくは5.3倍含まれていても、移植用の心臓様構造体として、利用できる可能性を示した。
Three days after stationary culture (Day 13), it was confirmed that the heart structure was beating. Day 14,
A moving image was observed on Day 15 that the surface of the structure pulsated continuously (right photo in the upper panel of FIG. 5A), and the medium was replaced with a PBS solution containing 4% PFA.
In addition, human iPS-derived cardiomyocytes, NHCF, HCAEC, and AMSC were plated on a PrimeSurface ™ 96U plate at a composition of 7500 cells / 7500 cells / 3000 cells / 40000 cells per well and allowed to stand still for 4 days in a 37 ° C 5% CO 2 incubator. After incubation, the structure was prepared by laminating on a 400 μm pitch sword mountain with an 8 × 8 × 1 sheet structure on Day 5 (Group 17 in Table 3, FIG. 5-2 in FIG. 5A or lower panel in FIG. 5A).
The shape of the structure was fragile, and some lumps collapsed on Day 10, but pulsation was confirmed on Day 17. The lower right panel of FIG. 5A is a photograph of the heart structure on Day 19.
Even if AMSC is contained 2.7 times or 5.3 times that of iPS-derived cardiomyocytes, it has been shown that it can be used as a heart-like structure for transplantation.
心臓スフェロイドに羊膜由来間葉系幹細胞（AMSC）を混合した構造体の免疫組織染色
実施例６で作製した組織を固定後、免疫染色処理を実施した（図5Ｂ、図５Ｃ）。3次元構造体は、4%パラフォルムアルデヒド（PFA）含有PBS溶液（ナカライテスク）で処理し、PBS溶液に交換後4℃で維持した。その後、Xyleneに比べ低毒性有機溶媒のG-Nox（Genostaff Co., Ltd.）を使用してCT-Pro20 (Genostaff Co., Ltd.)で包埋し、5μm間隔で切片化した。
免疫染色を実施する為に、これらの切片をxyleneで脱パラフィン化し、エタノールとPBSを通じて水飽和処理した。抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（pH6.0）で20分間マイクロ波熱処理によって実施した。内在性のperoxidaseは、0.3% H2O2含有メタノール溶液で30分間ブロックし、 Protein Block (Genostaff) とavidin/biotin blocking kit (Vector)でインキュベーションした。
Immunohistochemical staining of structures in which amnion-derived mesenchymal stem cells (AMSC) are mixed with cardiac spheroids
After the tissue prepared in Example 6 was fixed, immunostaining was performed (FIGS. 5B and 5C). The three-dimensional structure was treated with a 4% paraformaldehyde (PFA) -containing PBS solution (Nacalai Tesque), exchanged with a PBS solution, and maintained at 4 ° C. Then, it was embedded in CT-Pro20 (Genostaff Co., Ltd.) using G-Nox (Genostaff Co., Ltd.), which is a less toxic organic solvent than Xylene, and sectioned at intervals of 5 μm.
To perform immunostaining, these sections were deparaffinized with xylene and water-saturated with ethanol and PBS. Antigen activation was performed by microwave heat treatment with citrate buffer (pH 6.0) for 20 minutes. Endogenous peroxidase was blocked with a methanol solution containing 0.3% H 2 O 2 for 30 minutes and incubated with Protein Block (Genostaff) and avidin / biotin blocking kit (Vector).
組織切片は、抗CD31ウサギポリクローナル抗体（abcam）、抗CD34マウスモノクローナル抗体（abcam）、抗Connexin43ウサギポリクローナル抗体（abcam）、抗αSMAウサギポリクローナル抗体、抗Cardiac troponin Tマウスモノクローナル抗体（abcam）及び抗MYOM1（ミオメシン）ウサギポリクローナル抗体（abcam）とともに、4℃で一晩それぞれインキュベーションした。抗体処理した切片は、ビオチン結合型ヤギ抗ウサギIg (Dako)、又はビオチン結合型ウサギ抗マウスIg (Dako)で30分間、室温処理した。処理された切片を、ペルオキシダーゼ結合型ストレプトアビジンを添加して5分間反応させ、更にジアミノベンジンによって発色処理した。組織切片は、Mayer’s Hematoxylin (MUTO)、マッソントリクロームおよびエラスチカマッソンでそれぞれ染色し、malinol（MUTO）でマウントした（図５Ｂ [解像度50倍]、図5Ｃ [解像度100倍]） 。 Tissue sections consist of anti-CD31 rabbit polyclonal antibody (abcam), anti-CD34 mouse monoclonal antibody (abcam), anti-Connexin43 rabbit polyclonal antibody (abcam), anti-αSMA rabbit polyclonal antibody, anti-Cardiac troponin T mouse monoclonal antibody (abcam) and anti-MYOM1. Incubated with (myomesin) rabbit polyclonal antibody (abcam) at 4 ° C. overnight. The antibody-treated sections were treated with biotin-conjugated goat anti-rabbit Ig (Dako) or biotin-conjugated rabbit anti-mouse Ig (Dako) for 30 minutes at room temperature. The treated sections were added with peroxidase-conjugated streptavidin, reacted for 5 minutes, and further developed with diaminobenzine. Tissue sections were stained with Mayer ’s Hematoxylin (MUTO), Masson Trichrome and Elastica Masson, respectively, and mounted with malinol (MUTO) (FIG. 5B [resolution 50 ×], FIG. 5C [resolution 100 ×]).
図５Ｂ及び図５Ｃに観察されるとおり、抗Cardiac troponin Tマウスモノクローナル抗体（abcam）及び抗MYOM1（ミオメシン）ウサギポリクローナル抗体（abcam）は一部の領域に発現し、膜タンパク質のconnexin43はαSMAを発現する細胞以外のほぼ全ての領域で発現していた。これは構造体の一部のヒト心筋細胞で引き起こされる自立拍動の電気的シグナルを、8/3倍〜5倍以上含まれるAMSC（40/7.5倍含有する）も含めて構造体全体に伝えている事を示している（パネル図5A）。iPS由来心筋細胞に対して数倍量のAMSCを含む構造体は、図４の構造体とは細胞分布が異なっていた。Troponin T及びMYOM1の発現は構造体内部に散在し、血管内皮細胞のマーカーであるCD31とCD34の発現は構造体表面から内部に連続的な線状に分布した。一方、電気シグナルを伝える膜タンパク質のConnexin43は構造体のほぼ全域で発現していた。従って、図5Aの構造体がレシピエントに移植された場合、物理的な位置関係から血管内皮細胞は速やかに心臓の血管と相互作用し連結する事が期待される。又、Connexin43を発現する構造体は、レシピエントの心臓の拍動と効率よく速やかに同調して拍動することが期待される。これは、AMSC単体で心臓に移植するよりも「生着」と「同調」の面で有利である。
As observed in FIG. 5B and FIG. 5C, the anti-Cardiac troponin T mouse monoclonal antibody (abcam) and anti-MYOM1 (myomesin) rabbit polyclonal antibody (abcam) are expressed in some regions, and the membrane protein connexin43 expresses αSMA. It was expressed in almost all areas except for cells. This conveys the electrical signal of self-sustained pulsation caused by some human cardiomyocytes of the structure to the entire structure, including AMSC (contained 40 / 7.5 times), which is contained in 3/8 to 5 times. (Panel Figure 5A). The structure containing AMSC several times the amount of iPS-derived cardiomyocytes had a different cell distribution from the structure of FIG. The expression of Troponin T and MYOM1 was scattered inside the structure, and the expression of vascular endothelial cell markers CD31 and CD34 was distributed linearly from the structure surface to the inside. On the other hand, Connexin43, a membrane protein that transmits electrical signals, was expressed almost throughout the structure. Therefore, when the structure of FIG. 5A is transplanted to the recipient, it is expected that the vascular endothelial cells rapidly interact and connect with the blood vessels of the heart because of the physical positional relationship. In addition, the structure expressing Connexin 43 is expected to beat in synchrony efficiently and quickly with the heart beat of the recipient. This is more advantageous in terms of “engraftment” and “synchronization” than transplanting to the heart with AMSC alone.
心臓の拍動率の経過観察
実施例４で作製したシート状の心臓構造体（図4）と同様の方法で、1層48スフェロイドでほぼ3層からなる構造体を作製した。この構造体は、ヒトiPS由来心筋細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト冠状動脈血管内皮細胞をそれぞれ15：15：3の組成比として作成された。スフェロイド作製を開始してから、Day 11以降に拍動を確認した。以後、20%FBS心筋細胞培地で維持し、Day 30以降の拍動率を測定した。それぞれ15回/15秒 (Day 31)、21回/18秒 (Day 38)、13回/15秒 (Day 43)、18回/14秒 (Day 46)および16回/15秒 (Day 52)であった（図６）。1回/秒を基本に、それよりも早い時期と遅い時期が周期的に出現した。この拍動率は構造体作製に使用したReproCardio 2TMで保障されている拍動数と同程度であり、心臓線維芽細胞と動脈系内皮細胞を含んだ構造体においても同等の速度での拍動率を示していた。
Follow-up observation of heart pulsation rate By a method similar to that of the sheet-like heart structure prepared in Example 4 (FIG. 4), a structure consisting of approximately 3 layers of 48 spheroids per layer was prepared. This structure was prepared using human iPS-derived cardiomyocytes, human cardiac fibroblasts, and human coronary vascular endothelial cells at a composition ratio of 15: 15: 3, respectively. After starting spheroid production, pulsation was confirmed after Day 11. Thereafter, it was maintained in 20% FBS cardiomyocyte medium, and the pulsation rate after Day 30 was measured. 15 times / 15 seconds (Day 31), 21 times / 18 seconds (Day 38), 13 times / 15 seconds (Day 43), 18 times / 14 seconds (Day 46) and 16 times / 15 seconds (Day 52) (FIG. 6). On the basis of 1 time / second, earlier and later periods appeared periodically. This rate of pulsation is comparable to the number of pulsations guaranteed by ReproCardio 2 TM used for constructing the structure, and even in structures containing cardiac fibroblasts and arterial endothelial cells, The rate of movement was shown.
心臓様三次元構造体の動きのビデオ追跡（図８）
賽子状心臓様構造体を次のように作製した。心臓様スフェロイドを300μｍピッチもしくは400μｍピッチ、9×9の剣山を用いて、2（縦）×2（横）×2（高さ）の構造を同じ2層に８個作るデザインで積層した。表4で示すように各種細胞を撒き、3日後にバイオ3Dプリンター RegenovaTM（以下、RegenovaTMと表記）でスフェロイドを積層した。循環培養容器内に20%FBS心筋専用培地 100mlを用いて灌流培養を4日間実施した。4日後に、剣山上でスフェロイド同士が融合していることを目視し、グリットプレートと併せて構造体を抜去した。抜去した心臓構造体は、非吸着のスミロンセルタイトプレート24F（MS-9024X、住友ベークライト）に賽子構造体1個当たり1 wellの割合で移し、培養を継続した。培地量は20%FBS心筋専用培地を0.9ml/well入れて、構造体分取時に100〜200μLを同時に培地分取して培養・維持した。抜去後、次の日より賽子状構造体は自立拍動する事を確認した。培地交換は、3日に一度0.5mLを除去して20%FBS（Group 21ではHyclone社の血清、Group 25ではGibco社の血清を使用）心筋専用培地0.5mLを添加して培養した。拍動解析は、抜去後7日以降14日以内に解析した。
Video tracking of the motion of a heart-like 3D structure (Figure 8)
An insulator-like heart-like structure was produced as follows. The heart-like spheroids were stacked with a design of 8 (2) (vertical) x 2 (horizontal) x 2 (height) structures in the same two layers using a 300mm pitch or 400mm pitch, 9x9 Kenzan. As shown in Table 4, various cells were seeded, and after 3 days, spheroids were laminated with a bio 3D printer Regenova ™ (hereinafter referred to as Regenova ™ ). Perfusion culture was performed for 4 days using 100 ml of 20% FBS myocardial medium in a circulating culture vessel. Four days later, it was visually observed that spheroids were fused on Mount Ken, and the structure was removed together with the grit plate. The extracted heart structure was transferred to a non-adsorbed Sumilon Celtite Plate 24F (MS-9024X, Sumitomo Bakelite) at a rate of 1 well per insulator structure, and the culture was continued. The amount of the medium was 0.9% / well of 20% FBS myocardial medium, and 100 to 200 μL of the medium was collected and cultured and maintained at the same time as the structure was collected. After removal, it was confirmed that the insulator-like structure pulsated from the next day. The medium was exchanged by removing 0.5 mL once every 3 days and adding 20 mL of 20% FBS (Hyclone serum for Group 21 and Gibco serum for Group 25) and adding 0.5 mL of myocardial medium. The pulsation analysis was performed within 14 days after 7 days after removal.
心臓様構造体の動きを評価する非侵襲的なアプローチとして、セルモーションイメージングシステム SI-8000（ソニー）が使用された。高速デジタルCMOSカメラ（KP-FM400WCL、日立国際電気エンジニアリング）が倒立顕微鏡（Eclipse Ti ニコン）に装着された。1秒当たり150フレームの速度で2048×2048ピクセルの解像度および8ビットの深さ、対物レンズで10倍に拡大した画像を連続した位相差コントラストとして、賽子状心臓様構造体の動画イメージが記録された。拍動している心臓様構造体の動きベクトルは、ブロックマッチングアルゴリズムを使って得られた。賽子状心臓様構造体は8例実施され、そのうち代表的なサンプルの動きの波形を示した（図８Ａ、図８Ｂ）。縦軸は動きの速度（μm/sec）で、横軸は時間（秒）を示している。8例トータルの収縮速度ピークの平均値は46.2±0.135 (μm/sec)、弛緩速度ピークの平均は38.1±0.157 (μm/sec)だった。作成された構造体の動きは図８Ｃで示されるようなRegion of Interest(ROI、関心領域)を設定し、分析された。 Cell motion imaging system SI-8000 (Sony) was used as a non-invasive approach to assess the motion of heart-like structures. A high-speed digital CMOS camera (KP-FM400WCL, Hitachi Kokusai Electric Engineering) was attached to an inverted microscope (Eclipse Ti Nikon). A video image of a cocoon-like heart-like structure is recorded as a continuous phase difference contrast with a resolution of 2048 x 2048 pixels at a rate of 150 frames per second, a depth of 8 bits, and an image magnified 10 times with an objective lens. It was. The motion vector of the beating heart-like structure was obtained using a block matching algorithm. Eight cocoon-like heart-like structures were implemented, of which representative sample motion waveforms were shown (FIGS. 8A and 8B). The vertical axis represents the speed of movement (μm / sec), and the horizontal axis represents time (seconds). The average of the contraction speed peaks in all 8 cases was 46.2 ± 0.135 (μm / sec), and the average relaxation speed peak was 38.1 ± 0.157 (μm / sec). The motion of the created structure was analyzed by setting a Region of Interest (ROI) as shown in FIG. 8C.
8個の構造体を33℃から2℃ずつ温度を上げて設定した時の拍動率を評価した（図８Ｄ）。図８Ｄに示すように、拍動率は温度依存的に増加した。この時、それぞれの温度における収縮速度と弛緩速度を測定し平均化したところ（図８Ｅ）、温度の上昇に対して収縮速度と弛緩速度ともに増加する傾向が認められた。更に、8例を2群に分けて、0.1% DMSO添加群とDMSOで溶解した(-)-blebbistatin (SIGMA)を終濃度10μMになるように添加したサンプルの拍動率を10分おきに測定した。測定温度は37℃で実施した。その結果、横紋筋を阻害するblebbistatin添加群では拍動率の減少が認められた（図８Ｆ）。又、この拍動率の減少は化合物を含まない培地に交換する事によって解消されることを確認している。心臓様構造体は、断片的ではあるものの横紋筋が形成され、ポンプとしての機能を有する可能性が示唆された。
The pulsation rate when the eight structures were set by raising the temperature by 2 ° C. from 33 ° C. was evaluated (FIG. 8D). As shown in FIG. 8D, the pulsation rate increased in a temperature-dependent manner. At this time, when the contraction rate and the relaxation rate at each temperature were measured and averaged (FIG. 8E), a tendency was observed that both the contraction rate and the relaxation rate increased with increasing temperature. Furthermore, 8 cases were divided into 2 groups, and the pulsation rate of samples added with 0.1% DMSO added group and (-)-blebbistatin (SIGMA) dissolved in DMSO to a final concentration of 10 μM was measured every 10 minutes. did. The measurement temperature was 37 ° C. As a result, a decrease in pulsation rate was observed in the blebbistatin addition group that inhibits striated muscle (FIG. 8F). In addition, it has been confirmed that this decrease in pulsation rate can be eliminated by replacing the medium with no compound. Although the heart-like structure was fragmented, striated muscle was formed, suggesting the possibility of having a function as a pump.
心臓様三次元構造体の動きの測定（図９）
賽子状心臓様構造体と心臓様スフェロイドを次のように作製した。心臓様スフェロイドを400μｍピッチ、9×9の剣山を用いて、2（縦）×2（横）×2（高さ）の近接構造を同じ2層に８個作るデザインで積層した。表5に示すように細胞を撒き、3日後にバイオ3Dプリンター RegenovaTM（以下、RegenovaTMと表記）でスフェロイドを積層し、循環培養容器内に20%FBS心筋専用培地 100mlを用いて灌流培養を4日間実施した。4日後に、剣山上でスフェロイド同士が融合していることを目視し、グリットプレートと併せて構造体を抜去した。抜去した心臓構造体は、非吸着のスミロンセルタイトプレート24F（MS-9024X、住友ベークライト）に賽子構造体1個当たり1 wellの割合で移し、培養を継続した。培地量は20%FBS心筋専用培地を0.9ml/well入れて、構造体分取時に100〜200μLを同時に培地分取して培養・維持した。抜去後、次の日より賽子状構造体は自立拍動する事を確認した。培地交換は、3日に一度0.5mLを除去して20%FBS（Gibco社血清）心筋専用培地0.5mLを添加して培養した。拍動解析は、抜去後2週間以内に解析した。
Measurement of motion of heart-like 3D structure (Fig. 9)
An insulator-like heart-like structure and a heart-like spheroid were prepared as follows. The heart-like spheroids were stacked with a design of making 8 adjacent structures of 2 (vertical) x 2 (horizontal) x 2 (height) in the same two layers using a 400mm pitch, 9x9 Kenzan. Cells are seeded as shown in Table 5, and after 3 days, spheroids are layered with a bio 3D printer Regenova ™ (hereinafter referred to as Regenova ™ ), and perfusion culture is performed using 100 ml of 20% FBS myocardial medium in a circulating culture vessel. Conducted for 4 days. Four days later, it was visually observed that spheroids were fused on Mount Ken, and the structure was removed together with the grit plate. The extracted heart structure was transferred to a non-adsorbed Sumilon Celtite Plate 24F (MS-9024X, Sumitomo Bakelite) at a rate of 1 well per insulator structure, and the culture was continued. The amount of the medium was 0.9% / well of 20% FBS myocardial medium, and 100 to 200 μL of the medium was collected and cultured and maintained at the same time as the structure was collected. After removal, it was confirmed that the insulator-like structure pulsated from the next day. The medium was replaced by removing 0.5 mL once every 3 days and adding 0.5 mL of 20% FBS (Gibco serum) myocardial medium. The pulsation analysis was performed within 2 weeks after removal.
賽子状心臓様構造体（図９Ａ、絵で表記）と心臓様スフェロイド（図９Ａ、絵で表記）がスミロンセルタイトプレート24F(住友ベークライト)で1個/wellの割合で培養され、それぞれの拍動率を測定した（図9Ａ）。賽子状構造体と心臓様スフェロイドは、20% FBS-1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むReprocCardio 2TM culture mediumで37℃ 5%CO2培養された。研究で使用されたGMsは機械で引っ張り作成された標準的なキャピラリー電極で、この中を3M KCl溶液で満たした。これらの微小電極は銀-塩化銀のワイヤーと共役し、高いインピーダンス比と可変容量を中和する機能を持った増幅器に連結された。30kHz (low pass)のフィルターをセットした、gain設定10の増幅器(CEZ-1250，NIHON KOHDEN)で、シグナル値は増強された。ハードウェア（PowerLab 4/30, AD INSTRUMENTS）とソフトウェア（Lab Chart, AD INSTRUMENTS）を使用して10kHzのサンプリング周波数で、２つのシグナルは獲得された。サンプルを浸した培地を37℃で循環させながら維持し、それぞれのサンプルにキャピラリー電極を刺して活動電位を測定した。90%の耐久時間（APD90）が測定された（図９Ｂ）。賽子状構造体の活動電位チャートが図9Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅで示され、又、スフェロイドの活動電位チャートが図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈで示された。活動電位のチャートから心臓様構造体とスフェロイドは共に周期的な電気シグナルを発生している事が確認された。又、拍動率（図９Ａ）とAPD90（図９Ｂ）は逆相関する傾向があった。これは、一回の拍動に伴い構造体およびスフェロイドの内部で一ピークの活動電位が引き起こされている事を示唆している。
Eggplant-like heart-like structures (Fig. 9A, indicated by pictures) and heart-like spheroids (Fig. 9A, indicated by pictures) were cultured on Sumilon Celtite Plate 24F (Sumitomo Bakelite) at a rate of 1 / well, and each beat The activity rate was measured (FIG. 9A). Insulator-like structures and heart-like spheroids were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 in ReprocCardio 2 ™ culture medium containing 20% FBS-1% penicillin-streptomycin. The GMs used in the study were standard capillary electrodes created by mechanical pulling and filled with 3M KCl solution. These microelectrodes were conjugated to silver-silver chloride wires and connected to an amplifier with a high impedance ratio and the ability to neutralize variable capacitance. The signal value was enhanced with an amplifier (CEZ-1250, NIHON KOHDEN) with a gain setting of 10 with a 30kHz (low pass) filter set. Two signals were acquired with a sampling frequency of 10 kHz using hardware (PowerLab 4/30, AD INSTRUMENTS) and software (Lab Chart, AD INSTRUMENTS). The medium in which the sample was immersed was maintained while circulating at 37 ° C., and the action potential was measured by inserting a capillary electrode into each sample. A 90% endurance time (APD90) was measured (FIG. 9B). The action potential chart of the insulator structure is shown in FIGS. 9C, 9D, and 9E, and the action potential chart of the spheroid is shown in FIGS. 9F, 9G, and 9H. It was confirmed from the action potential chart that both the heart-like structure and spheroids generate periodic electrical signals. Also, the pulsation rate (FIG. 9A) and APD90 (FIG. 9B) tended to be inversely correlated. This suggests that one peak of action potential is caused inside the structure and spheroid with one pulsation.
スフェロイド及び心臓様構造体における血管内皮細胞の分布(図１０〜１２)
非生理的な組成で複数の細胞を共培養してスフェロイドを作成し、81個のスフェロイドで構成されるパッチ状構造体およびスフェロイド融合体の血管内皮細胞がどのように分布するかを調べた。不死化心筋細胞：心臓線維芽細胞：ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(GFP-hUVEC)を、1.5×104: 1.5×104: 3×103の割合で、それぞれの専用培地を1:1:1の割合で混合した培地でPrimeSurfaceTM 96Uプレートに撒いた。ここで、不死化心筋細胞（Immortalized Human Cardiomyocytes-SV40）、心臓線維芽細胞、及びヒト臍帯静脈血管内皮細胞(GFP-hUVECs)は、それぞれabm社、DSファーマバイオメディカル社、Angio-Proteomie社（フナコシ取り扱い）より入手した。細胞を撒いて3日後に、光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡でスフェロイドを観察し写真撮影した（図１０Ａ、スフェロイド数 1）。又、形成されたスフェロイドを先太チップで培地と共に吸引し、別のスフェロイドが存在するwellに2、4、8、16個の割合で混合した。4個以上のスフェロイドは2+2=4、4+4=8、8+8=16のように多段階のピペッティングでスフェロイドを混合している。次の日（Day 4）に、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡で写真撮影した（図１０Ａ）。蛍光顕微鏡の写真から、スフェロイド同士が融合すると、GFP-hUVECはその融合面に集まる傾向があった。
Distribution of vascular endothelial cells in spheroids and heart-like structures (FIGS. 10-12)
A spheroid was prepared by co-culturing a plurality of cells with a non-physiological composition, and the distribution of vascular endothelial cells of a patch-like structure composed of 81 spheroids and a spheroid fusion was examined. Immortalized cardiomyocytes: cardiac fibroblasts: human umbilical vein vascular endothelial cells (GFP-hUVEC) at a ratio of 1.5 × 10 4 : 1.5 × 10 4 : 3 × 10 3 , each dedicated medium 1: 1 The medium mixed at a ratio of 1 was plated on a PrimeSurface ™ 96U plate. Here, immortalized cardiomyocytes (Immortalized Human Cardiomyocytes-SV40), cardiac fibroblasts, and human umbilical vein endothelial cells (GFP-hUVECs) are respectively abm, DS Pharma Biomedical, Angio-Proteomie (Funakoshi) Handling). Three days after seeding the cells, the spheroids were observed and photographed with an optical microscope and a fluorescence microscope (FIG. 10A, number of spheroids 1). In addition, the formed spheroids were sucked together with the medium with a tip-tip and mixed at a ratio of 2, 4, 8, 16 in wells containing other spheroids. Four or more spheroids are mixed by multistage pipetting such as 2 + 2 = 4, 4 + 4 = 8, 8 + 8 = 16. On the next day (Day 4), photographs were taken with an optical microscope and a fluorescence microscope (FIG. 10A). Fluorescence microscope photographs showed that when spheroids fused together, GFP-hUVEC tended to gather on the fusion surface.
次に、バイオ3Dプリンター・RegenovaTMを用いて構造体を作成した（図１０Ｂ）。不死化心筋細胞：心臓線維芽細胞（NHCF）：ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(GFP-hUVEC)を、1.5×104: 1.5×104: 3×103の割合で、それぞれの専用培地を1:1:1の割合で混合した培地でPrimeSurfaceTM 96Uプレートに撒いた。3日後、形成されたスフェロイドを用いてバイオ3Dプリンター・RegenovaTMで9×9剣山を使用し、9（縦）×9（横）×1層のシート状に整列・積層した。それぞれの専用培地を1:1:1の割合で混合した培地150mlを灌流培養容器に添加し、スフェロイドを積層した剣山を置いた。ペリスタポンプにPharMedTMBPTチューブをセットし、流速3.4ml/minの割合で1週間循環培養した。
循環培養後、スフェロイド同士が融合した事を目視して確認し、クリーンベンチ内で融合した構造体をクリーンベンチから抜去した。抜去した構造体は、非吸着の10cmシャーレで1日、静置培養された。
Next, a structure was created using a bio-3D printer Regenova ™ (FIG. 10B). Immortalized cardiomyocytes: cardiac fibroblasts (NHCF): human umbilical vein endothelial cells (GFP-hUVEC) at a ratio of 1.5 x 10 4 : 1.5 x 10 4 : 3 x 10 3 Plated in PrimeSurface ™ 96U plates with medium mixed at a 1: 1 ratio. Three days later, using the formed spheroids, the bio 3D printer Regenova ™ was used 9 × 9 Kenzan and aligned and laminated into a sheet of 9 (vertical) × 9 (horizontal) × 1 layer. 150 ml of a medium prepared by mixing each dedicated medium at a ratio of 1: 1: 1 was added to the perfusion culture container, and a sword mountain on which spheroids were stacked was placed. A PharMed ™ BPT tube was set in the peristaltic pump, and cultured for 1 week at a flow rate of 3.4 ml / min.
After circulating culture, it was visually confirmed that the spheroids were fused, and the fused structure in the clean bench was removed from the clean bench. The extracted structure was statically cultured in a non-adsorbed 10 cm petri dish for 1 day.
構造体内部の蛍光画像を得る為に、Focus ClearTMkitで透明化処理された（図１０Ｂ）。透明化処理2時間後と6時間後の光学顕微鏡および蛍光顕微鏡画像を示す。蛍光発現したhUVECは構造体の中で格子状に偏在しており、スフェロイド同士が融合した境界面に多く分布している事が示された。 In order to obtain a fluorescent image inside the structure, it was made transparent with a Focus Clear ™ kit (FIG. 10B). The optical microscope image and fluorescence microscope image after 2 hours and 6 hours after the clearing treatment are shown. Fluorescently expressed hUVECs were unevenly distributed in a lattice pattern in the structure, indicating that many spheroids were distributed on the interface where they were fused.
より明瞭なGFP発現hUVECの蛍光顕微鏡画像を得る為に、4%パラフォルムアルデヒド入りPBS溶液（ナカライテスク）で構造体を固定化した後に、Focus ClearTM kitで透明化処理をした。図11に示すように、作成されたシート状構造体を２つに分割し、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡でGFP-hUVECの構造体内部での分布を確認した（図11）。次に、この分割した構造体の片方を共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 880 [好感度GaAsP検出器付]、電動倒立顕微鏡 Axio Observer Z.1）で立体構造を観察した。血管内皮細胞は太い細胞の帯となって、網目状に構造体の内外に分布している事が確認された（図1２Ａ）。血管内皮細胞の網目状構造は、3次元画像を再構成する事でも確認している（図１２Ｂ）。 In order to obtain a clearer fluorescence microscope image of GFP-expressing hUVEC, the structure was immobilized with a PBS solution containing 4% paraformaldehyde (Nacalai Tesque) and then clarified with a Focus Clear ™ kit. As shown in FIG. 11, the prepared sheet-like structure was divided into two, and the distribution of GFP-hUVEC inside the structure was confirmed with an optical microscope and a fluorescence microscope (FIG. 11). Next, the three-dimensional structure of one of the divided structures was observed with a confocal laser scanning microscope (LSM 880 [with high-sensitivity GaAsP detector], electric inverted microscope Axio Observer Z.1). It was confirmed that the vascular endothelial cells became thick cell bands and distributed in a mesh shape inside and outside the structure (FIG. 12A). The network structure of vascular endothelial cells has also been confirmed by reconstructing a three-dimensional image (FIG. 12B).
図１２での血管内皮細胞の分布は、図４Ｂおよび図４Ｃで示した生理的な組成（iPS心筋由来細胞、心臓線維芽細胞、冠状動脈血管内皮細胞[HCAEC]）での心臓構造体中の血管内皮細胞の分布（構造体内部にのみ、未成熟な管腔状構造が見られる）とは異なっていた。相違点は、不死化心筋細胞は拍動していないこと、血管内皮細胞は臍帯由来のHUVECだったこと、及び培地組成が異なることである。 The distribution of vascular endothelial cells in FIG. 12 is shown in the cardiac structure in the physiological composition (iPS myocardium-derived cells, cardiac fibroblasts, coronary vascular endothelial cells [HCAEC]) shown in FIGS. 4B and 4C. It was different from the distribution of vascular endothelial cells (an immature luminal structure is seen only inside the structure). The differences are that immortalized cardiomyocytes are not beating, vascular endothelial cells were umbilical cord-derived HUVECs, and the medium composition was different.
Claims (8)
The method according to claim 7, wherein the lamination of the spheroid or fusion is performed by piercing the spheroid or fusion into the needle-like body.
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