JP2014502731A - タンパク質検出方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に記載されるのは、サンプル中の標的分析物をリンカーおよび上記リンカーに結合させられた抗体を含む電極で検出するための、および上記抗体への上記サンプル中の分析物の結合によって生成される電気触媒シグナル変化を測定するためのシステムおよび方法である。タンパク質分析物の電気化学的検出のためのキットもまた、本明細書で開示される。上記リンカーは、直接的にもしくは間接的に上記抗体もしくはそのフラグメントに連結し得る官能基を含む。

Description

（相互参照）
本出願は、２０１１年１月１１日に出願された米国仮出願第６１／４３１，７８６号の利益を主張し、上記米国仮出願第６１／４３１，７８６号は、その全容が参考として本明細書に援用される。

（発明の背景）
臨床サンプル中のタンパク質レベルの高感度かつ簡単な測定のためのプラットフォームの開発は、疾患診断におけるタンパク質バイオマーカーのより広い使用を促進する重要なゴールである。有用な情報を提供するために、検出スキームは、高レベルの特異性、低い検出限界、ならびに血液および血清のような生物学的液体中での堅調な性能を示さねばならない。がんおよび他の疾患に関して、複数のタンパク質の特性の発生を考慮すると、多重化はまた、価値ある特徴である。内部コントロールおよび外部コントロール、ならびに標準物質（正確な診断アッセイの開発に重要である）を含めることはまた、多重化を必要とする。

種々の高性能タンパク質検出プラットフォームが開発中であり、最も特異的かつ高感度のもののうちの多くは、それらの感知スキームにおいてマイクロおよびナノ材料を使用する。電気化学的読み取りとともに使用されるバーコード処理されたナノ粒子、ナノワイヤトランジスタ、酵素標識ビーズ、および微小流体イムノアレイは全て、バイオマーカー分析器の開発が有望であることを示す。しかし、コスト効率的で十分堅調（臨床使用に関して）である単純な分析システムの開発に関する難題は未だに残っている。

（発明の要旨）
タンパク質分析物を電気化学的に検出するための検出システムが、本明細書において提供される。一局面において、上記検出システムは、リンカーを表面に含む電極（ここで上記リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている）；およびレドックスレポーターを含む。

本明細書に提供されるシステムのいくつかの実施形態において、上記リンカーは、直接的にもしくは間接的に上記抗体もしくはそのフラグメントに連結し得る官能基を含む。他の実施形態において、上記リンカーは、官能性アミン基を含む。さらに他の実施形態において、上記リンカーは、官能性カルボン酸基を含む。さらなる実施形態において、上記リンカーは、シスタミン、システアミン、メルカプトプロピオン酸もしくは４−アミノチオフェノールである。なおさらなる実施形態において、上記リンカーは、第２のリンカーを介して上記抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている。いくつかの場合において、上記第２のリンカーは、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドである。さらなる実施形態において、上記リンカーは、抗体もしくはそのフラグメントの複数コピーに結合させられている。

本明細書に提供されるシステムのいくつかの実施形態において、上記抗体もしくはそのフラグメントは、ポリクローナル抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＣＤＲペプチドおよびダイアボディーからなる群より選択される。

本明細書におけるシステムのいくつかの実施形態において、上記レドックスレポーターは、電位が印加される場合に、上記電極で電気化学的シグナルを生成し得る。他の実施形態において、上記レドックスレポーターは、ファラデー電流を生成する。さらに他の実施形態において、上記レドックスレポーターは、界面電子移動する能力がある。さらなる実施形態において、上記レドックスレポーターは、フェリシアニド／フェロシアニドもしくはフェロセンである。なおさらなる実施形態において、上記レドックスレポーターは、ヘキサクロロイリデート（ＩＶ）／ヘキサクロロイリデート（ＩＩＩ）である。

本明細書に提供されるシステムのいくつかの実施形態において、上記電極は、貴金属である。他の実施形態において、上記電極は、炭素である。さらに他の実施形態において、上記電極は、酸化インジウムスズである。さらなる実施形態において、上記電極は、金、パラジウムもしくは白金である。

本明細書に提供されるシステムのいくつかの実施形態において、上記電極は、微小電極である。本明細書に提供されるシステムの特定の実施形態において、上記電極は、ナノ構造の微小電極である。いくつかの実施形態において、上記電極は、約５００ミクロン未満である。他の実施形態において、上記電極は、約２５０ミクロン未満である。さらに他の実施形態において、上記電極は、約１００ミクロン未満である。さらに他の実施形態において、上記電極は、約５〜約５０ミクロンである。さらなる実施形態において、上記電極は、約１０ミクロン未満である。さらなる実施形態において、上記電極は、微小作製チップ（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｃｈｉｐ）上にある。さらなる実施形態において、基材上に配列された複数の電極が存在する。

本明細書に提供されるシステムのいくつかの実施形態において、上記タンパク質分析物は、疾患、障害もしくは状態のバイオマーカーである。いくつかの場合において、上記バイオマーカーは、がんバイオマーカーである。特定の場合において、上記バイオマーカーは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、α−フェトプロテイン、β−２ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、がん抗原７２−４、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、カルシトニン、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、神経特異的エノラーゼ、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはこれらの一部、バリエーションもしくはフラグメントからなる群より選択される。さらなる場合において、上記バイオマーカーは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌感染のバイオマーカーである。

タンパク質分析物を電気化学的に検出するための方法もまた、本明細書において提供される。一局面において、上記方法は、リンカーを表面に含む電極と、サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで上記リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、工程；電位が印加される場合に、上記抗体標識された電極および上記レドックスレポーターによって生成される電気化学的シグナルを測定する工程；上記電気化学的シグナルと、タンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルとを比較する工程；を包含し、ここでタンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルと比較して検出された上記シグナルの変化は、上記サンプル中の上記タンパク質分析物の存在を示す。

本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、上記リンカーは、直接的にもしくは間接的に上記抗体もしくはそのフラグメントに連結し得る官能基を含む。他の実施形態において、上記リンカーは、官能性アミン基を含む。さらに他の実施形態において、上記リンカーは、官能性カルボン酸基を含む。さらなる実施形態において、上記リンカーは、シスタミン、システアミン、メルカプトプロピオン酸もしくは４−アミノチオフェノールである。なおさらなる実施形態において、上記リンカーは、第２のリンカーを介して、上記抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている。いくつかの場合において、上記第２のリンカーは、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドである。さらなる実施形態において、上記リンカーは、抗体もしくはそのフラグメントの複数コピーと結合させられている。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、上記抗体もしくはそのフラグメントは、ポリクローナル抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＣＤＲペプチドおよびダイアボディーからなる群より選択される。

本明細書中のシステムのいくつかの実施形態において、上記レドックスレポーターは、ファラデー電流を生成する。他の実施形態において、上記レドックスレポーターは、界面電子移動する能力がある。さらなる実施形態において、上記レドックスレポーターは、フェリシアニド／フェロシアニドもしくはフェロセンである。なおさらなる実施形態において、上記レドックスレポーターは、ヘキサクロロイリデート（ＩＶ）／ヘキサクロロイリデート（ＩＩＩ）である。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、上記電極は、貴金属である。他の実施形態において、上記電極は、炭素である。さらに他の実施形態において、上記電極は、酸化インジウムスズである。さらなる実施形態において、上記電極は、金、パラジウムもしくは白金である。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態において、上記電極は、ナノ構造の微小電極である。他の実施形態において、上記電極は、約１００ミクロン未満である。さらに他の実施形態において、上記電極は、約５〜約５０ミクロンである。さらなる実施形態において、上記電極は、約１０ミクロン未満である。さらなる実施形態において、上記電極は、微小作製チップ上にある。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、上記タンパク質分析物は、疾患、障害もしくは状態のバイオマーカーである。いくつかの場合において、上記バイオマーカーは、がんバイオマーカーである。特定の場合において、上記バイオマーカーは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、α−フェトプロテイン、β−２ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、がん抗原７２−４、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、カルシトニン、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、神経特異的エノラーゼ、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはこれらの一部、バリエーションもしくはフラグメントからなる群より選択される。さらなる場合において、上記バイオマーカーは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌感染のバイオマーカーである。

複数のタンパク質分析物の多重化電気化学的検出のための方法もまた、本明細書で提供される。一局面において、上記方法は、リンカーを表面に含む第１の電極と、サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで上記リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る第１の抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、工程；電位が印加される場合に、上記第１の抗体標識された電極および上記レドックスレポーターによって生成される第１の電気化学的シグナルを測定する工程；表面にリンカーを含む第２の電極と、サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで上記リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る第２の抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、工程；電位が印加される場合に、上記第２の抗体標識された電極および上記レドックスレポーターによって生成される第２の電気化学的シグナルを測定する工程；ならびに上記第１および第２の電気化学的シグナルと、タンパク質分析物を含まないコントロールサンプルにおいて上記第１および第２の抗体標識された電極によって生成されるそれぞれのシグナルとを比較する工程；を包含し、ここでタンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのそれぞれのシグナルと比較して検出された上記第１および第２の電気化学的シグナルの変化は、上記サンプル中の上記タンパク質分析物の存在を示す。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、上記第１および第２の電極はともに、微小作製チップ上にある。他の実施形態において、上記第１および第２の電極は、異なる微小作製チップ上にある。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、上記第２の抗体標識された電極は、上記第１の抗体標識された電極に対する参照コントロールである。他の実施形態において、上記第２の抗体標識された電極は、豊富な血清タンパク質を検出する。

がんを有する被験体における進行もしくは応答をモニターするための方法もまた、本明細書において提供される。一局面において、上記方法は、上記被験体から生物学的サンプルを得る工程；リンカーを表面に含む電極と、上記サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで上記リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられており、上記抗体もしくはそのフラグメントは、タンパク質分析物に結合する、工程；電位が印加される場合に、上記抗体標識された電極および上記レドックスレポーターによって生成される電気化学的シグナルを測定する工程；ならびに上記電気化学的シグナルと、タンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルとを比較する工程；を包含し、ここでタンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルと比較して検出された上記シグナルの変化は、上記サンプル中の上記タンパク質分析物の存在を示す。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、上記タンパク質分析物は、疾患、障害もしくは状態のバイオマーカーである。いくつかの場合において、上記バイオマーカーは、がんバイオマーカーである。特定の場合において、上記バイオマーカーは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、α−フェトプロテイン、β−２ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、がん抗原７２−４、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、カルシトニン、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、神経特異的エノラーゼ、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはこれらの一部、バリエーションもしくはフラグメントからなる群より選択される。さらなる場合において、上記バイオマーカーは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 細菌感染のバイオマーカーである。

タンパク質分析物の電気化学的検出のためのキットもまた、本明細書で提供される。一局面において、上記キットは、リンカーを表面に含む電極であって、ここで上記リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、電極；および電位が印加される場合に、上記電極で電気化学的シグナルを生成し得るレドックスレポーターを含む。

（参考としての援用）
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、もしくは特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得られる。
図１ａは、電極の電気化学的堆積のための５μｍの開き口を特徴とする微小作製チップを示す多重化センサーチップの写真（左）および開口部の図示（中央）である。金（Ａｕ）パターンは、従来のフォトリソグラフィーを使用してシリコンウェハ上に堆積され、次いで、ＳｉＯ_２の層で覆われる；５μｍの開き口は、次いで、この最上部層を貫通してエッチングされて、Ａｕの丸い部分を露出する。Ａｕ電着によるＡｕ電極の生成の模式図（右）。図１ｂは、電極官能化の模式図である；（左）シスタミンのリンカーが、Ａｕ構造上に形成される；（中央）センサー表面でのアルデヒド基を導入するための二官能性リンカーグルタルアルデヒドとの反応；（右）抗体改変された電極センサーを調製するための抗ＣＡ−１２５抗体もしくは抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体の付加。図１ｃは、ＣＡ−１２５抗原のための電気化学的検出の模式図である。上記抗原−抗体結合は、［Ｆｅ（ＣＮ）_６］_{３−／４−}の界面電子移動反応を妨げる。図１ｄは、上記ＣＡ−１２５（血清中１０Ｕ／ｍｌ）の４０分間にわたるインキュベーション後に観察されたシグナル減少を示す微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）である。 図２は、３種の異なるサイズのＡＵ電極センサーのＳＥＭ画像および特徴的なサイクリックボルタモグラムである。（ａ）１００ミクロンセンサーのＳＥＭ画像。この構造を、２００ｓにわたって０ｍＶの印加電位においてＤＣ電位アンペロメトリーを使用して製作した。（ｃ）３０ミクロンセンサー。この構造を、２００ｓにわたって１５０ｍＶの印加電位において、ＤＣ電位アンペロメトリーを使用して製作した。および（ｅ）８ミクロンセンサー。この構造を、５０ｓにわたって３０ｎＡの印加電流において、クロノポテンシオメトリーを使用して製作した。上記３種のセンサーの特徴的なサイクリックボルタモグラムを、サイズ（ｂ）１００ミクロン、（ｄ）３０ミクロン、および（ｆ）８ミクロンセンサーを有するセンサーにおいて、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度で、２．５ｍＭ ［Ｆｅ（ＣＮ）_６］_{３−／４−}および０．１Ｍ ＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝溶液において得た。図２（ｆ）の挿入図は、上記サイクリックボルタモグラムの拡大図を示す。（ｇ）各センサーサイズの表面積を反映する３つのセンサーの容量性電流。サイクリックボルタモグラムを、サイズ（外側の曲線）１００ミクロン、（中央の曲線）３０ミクロン、および（内側の曲線）８ミクロンを有するセンサーにおいて、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度で、０．１Ｍ ＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝溶液において得た。 図３は、３種の異なるサイズのＡｕ構造において生成されたイムノセンサーの感度および検出限界の比較である。ＰＢＳ中のＣＡ−１２５の濃度でのΔΔ（Ｉ％）を、（ａ）１００ミクロンセンサー、（ｂ）３０ミクロンセンサー、および（ｃ）８ミクロンセンサーで得た。 図４は、ＰＢＳ中のＣＡ−１２５の異なる濃度でのインキュベーション前（灰色棒）およびその後（黒棒）の、サイズ（ａ）１００ミクロンおよび（ｂ）８ミクロンを有するセンサーの電流変化である。 図５は、血清および全血中でのＣＡ−１２５の検出である。（ａ）添加した血清サンプル中でのＣＡ−１２５およびＨＳＡの同時検出。サンプルは、未希釈血清を含んだ。データを、血清のみおよび異なる濃度のＣＡ−１２５を添加した血清で得た。灰色棒は、抗ＣＡ−１２５抗体改変イムノセンサーで得たデータを示し、黒棒は、抗ＨＳＡ抗体改変イムノセンサーのものを表す。センサーサイズは、８ミクロンであった。（ｂ）全血中でのＣＡ−１２５の検出。サンプルは、未希釈の、未処理血液、および示された濃度のＣＡ−１２５を含んだ。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．電気化学的検出システムおよび方法）
サンプル中の標的分析物を電気化学的に検出するためのシステムおよび方法が、本明細書で提供される。分析物の存在は、電気触媒的シグナルの変化によって検出される。このような電気的読み取りの使用は、安価で、極めて高感度で、小型化しやすく、自動化しやすい方法を提供する。

本明細書に記載される検出システムおよび方法の一局面において、電極が提供され、ここで上記電極はリンカーを含み、上記リンカーは、抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている。上記抗体もしくはそのフラグメントは、標的分析物（例えば、タンパク質）に結合し得る。上記電極は、レドックスレポーターの存在下にある。

本明細書に記載されるシステムおよび方法における使用に適したレドックスレポーターは、電位が印加される場合に、上記電極で電気的シグナル（例えば、ファラデー電流）を生成し得る。ファラデー電流を生成するか、または上記電極で界面電子移動する能力のある任意のレドックスレポーターが、使用され得る。非限定的なレドックスレポーターとしては、フェリシアニド／フェロシアニド、フェロセンおよびヘキサクロロイリデート（ＩＶ）／ヘキサクロロイリデート（ＩＩＩ）のような低分子のレドックス活性基が挙げられるが、これらに限定されない。上記検出システムは、レドックスレポーターを利用して、上記電極でベースラインの電気的シグナルを生成する。上記抗体もしくはそのフラグメントに結合する標的分析物が存在する場合、上記電気的シグナルは、減衰する。上記シグナルの減衰は、上記レドックスレポーターが上記電極の表面に効率的に接近することをブロックする上記標的分析物に起因すると考えられる。言い換えると、上記抗体−分析物結合は、界面電子移動を妨げる。例示に過ぎないが、図１ｃおよび図１ｄを参照のこと。

一局面において、上記抗体への標的分析物結合に対応するシグナル変化は、ファラデー電流における％変化として計算される：
ΔＩ％＝｛（平均Ｉ_０）−（平均Ｉ_ｃ）｝／平均Ｉ_０×１００
ここで平均Ｉ_０＝０標的濃度における平均電流、平均Ｉ_ｃ＝任意の標的の濃度における平均電流である。特定の実施形態において、上記シグナル変化は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６５％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％超、約２倍、約１０倍、約５０倍以上である。特定の場合において、上記シグナルの変化は、上記分析物が上記抗体に結合させられていることを示す。上記ファラデー電流における変化を伴って、本明細書に記載される検出システムおよび方法は、一局面において、標的分析物の存在を決定するために使用される。

別の局面において、本明細書に記載される検出システムおよび方法は、サンプル中の標的分析物の濃度を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、これは、上記標的分析物の既知の濃度標準での上記検出システムの較正を介して達成される。例えば、多くの陽性コントロールサンプル（各々、特定の濃度の分析物を有する）は、試験サンプル中の分析物の未知の量の決定のために、ファラデー電流における％変化を決定するために使用される。上記検出システムおよび方法の検出範囲は、上記抗体、分析物、および結合能力ならびに上記使用されるレドックスレポーターに依存する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される検出システムおよび方法は、約５００フェムトモル濃度（ｆＭ）もしくは約１００ｐｇ／ｍＬ以下において、分析物の濃度を検出する。

別の局面において、本明細書に記載される検出システムおよび方法は、複数の標的分析物の濃度を検出および／もしくは決定するために多重化される。いくつかの実施形態において、多重化システムおよび方法は、少なくとも２個の電極（各々は、リンカーを含み、異なる抗体が、各リンカーに結合させられている）を含む。特定の場合において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の電極（各々は、リンカーを含み、異なる抗体が各リンカーに結合させられている）が、多重化システムにおいて使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、もしくは少なくとも５０個以上の電極が、多重化システムにおいて使用される（各々は、リンカーを含み、異なる抗体が、各電極において各リンカーに結合させられている）。あるいは、１個より多くの電極が、同じ抗体もしくは抗体クラスを含み得る；例えば、４個の電極の複製物（各群は、３種の別個の抗体のうちの１つを含む）は、１２電極の多重化システムにおいて使用され得る。さらに、電極は、１種より多くの抗体もしくは抗体クラスを含み得る；例えば、個々の電極上に、１種より多くの抗体（各々は、タンパク質もしくは分析物の特定の領域を認識する）が合わされ得る。いくつかの場合において、検出は、タンパク質もしくは分析物が、上記電極に結合した全ての抗体に結合する場合にのみ起こる。いくつかの場合において、検出は、タンパク質もしくは分析物が、上記電極に結合した上記抗体群のうちの少なくとも１種に結合する場合に起こる。

多重化は、非常に多くの分析物が同時に検出されることを可能にするので、「分析物パネル」が作られる。例示的な分析物パネルは、障害、疾患もしくは状態に関連する分析物（例えば、特定のがんの関連バイオマーカー）を含み得る。多重化はまた、同じかもしくは異なるエピトープを介して同じ標的分析物に結合する異なる抗体等、分析物についてのより高い感度を可能にする。異なる抗体の使用（例えば、同じ分析物を標的とするポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の使用）は、上記検出システムが、１タイプのみの抗体を使用して分析物を検出する一重システムよりも、堅調で高感度のものであることを可能にする。多重化は、偽陽性および偽陰性を低下させるための上記システムの内部較正をさらに可能にする。例えば、標的分析物の分析は、安定であることが公知の分析物（例えば、豊富な血清タンパク質）と並行して行われ得る。

別の局面において、本明細書に記載される検出システムおよび方法は、障害、疾患もしくは状態を検出もしくは診断するために、または障害、疾患もしくは状態の進行もしくは応答をモニターするために、使用される。いくつかの実施形態において、サンプルは、患者もしくは被験体から得られ、上記検出システムおよび方法は、上記障害、疾患もしくは状態と関連した標的分析物の存在および／もしくは濃度を検出するために使用される。例示的な障害、疾患もしくは状態としては、がん（例えば、乳房、卵巣、前立腺、膵臓、結腸直腸、膀胱など）、感染性疾患（例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 細菌感染、ＭＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ウイルス感染、真菌感染など）、自己免疫疾患（例えば、グレーブス病、狼瘡、関節炎、グッドパスチャー症候群など）、代謝性疾患および障害（例えば、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、クローン病、過敏性腸症候群など）、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、遺伝病、ならびに治療薬もしくは毒性物質と関連した状態が挙げられる。障害、疾患もしくは状態の重篤度もしくはステージは、いくつかの実施形態においては、標的分析物の濃度（異なる濃度が重篤度もしくはステージを示す）を検出することによって決定される。同様に、他の実施形態において、障害、疾患もしくは状態の進行もしくは応答は、種々の時点にわたって上記標的分析物の濃度を検出することによって決定される。薬理学的処置、治療もしくはレジメンの治療効率はまた、いくつかの実施形態において、種々の時点にわたって上記標的分析物の濃度を検出することによって決定され得る。

（ＩＩ．電極）
本明細書に記載される検出システムおよび方法のための電極は、上記電極の表面にリンカーを許容する特性を有する任意の導電性材料である。電極は、電子をレドックスレポーターへもしくはそれから移動する能力を有し、一般に、電子制御および検出デバイスに接続される。一般に、貴金属、例えば、Ａｇ、Ａｕ、Ｉｒ、Ｏｓ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｕおよびそれらのファミリーの中の他のものは、電極に適した材料である。貴金属は、安定性および酸化への耐性を含めて、都合のよい特性を有し、種々の方法（例えば、電着）において操作され得、チオールおよびジスルフィド含有分子に結合し、それによって、上記分子の結合を可能にする。他の材料もまた、使用され得る（例えば、窒素含有伝導性化合物（例えば、ＷＮ、ＴｉＮ、ＴａＮ）もしくはケイ素／シリカベースの材料（例えば、シランもしくはシロキサン））。特定の実施形態において、上記電極は、金、パラジウムもしくは白金である。他の実施形態において、上記電極は、炭素である。さらなる実施形態において、上記電極は、酸化インジウムスズである。

いくつかの実施形態において、上記電極は、微小電極である。他の実施形態において、上記微小電極は、ナノ構造の微小電極（「ＮＭＥ」）である。ＮＭＥは、ナノ構造表面を特徴とする微小電極である。表面のナノテクスチャリングもしくはナノ構造は、上記電極に増大した表面積を提供し、より高い感度（特に、バイオセンシング適用において）を可能にする。ＮＭＥの製造は、電着を介して行われ得る。パラメーター（例えば、堆積時間、堆積電位、支持電解質タイプおよび金属イオン源）を変化させることによって、種々のサイズ、形態および組成のＮＭＥが、生成され得る。特定の場合において、ＮＭＥは、樹状構造を有する。上記樹状構造の複雑さは、前述の電着パラメーターを変化させることによって達成される。本明細書に記載されるシステムおよび方法における使用のための例示的ＮＭＥは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１２１２（ＷＯ／２０１０／０２５５４７として公開）（これは、その全体において参考として援用される）において記載される。

他の電極構造もまた、本明細書に記載される検出システムおよび方法において使用され得る（平らな表面、ワイヤ、チューブ、円錐および粒子が挙げられる）。市販のマクロ電極および微小電極はまた、本明細書に記載される実施形態に適している。

電極は、例えば、長さもしくは直径が約０．０００１〜約５０００ミクロン；長さもしくは直径が約０．０００１〜約２０００ミクロン；約０．００１〜約２５０ミクロン；約０．０１〜約２００ミクロン；約０．１〜約１００ミクロン；約１〜約５０ミクロン；長さが約１０〜約３０ミクロン、または長さもしくは直径が約１０ミクロン未満のサイズにされる。特定の実施形態において、電極は、長さもしくは直径が約１００ミクロン、約３０ミクロン、約１０ミクロンもしくは約５ミクロンのサイズにされる。さらなる実施形態において、電極は、約８ミクロンのサイズにされる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される検出システムおよび方法は、検出のために１個の電極を含む。他の実施形態において、複数の電極が使用される。複数の電極の使用は、いくつかの実施形態においては、各電極に結合した１種の抗体タイプを介して標的分析物を検出するために、並列において使用され得る。あるいは、他の実施形態において、複数の電極は、以前に記載されるように、多重化のために使用される。複数の電極は、高密度アレイもしくは低密度アレイに構成され得る。多重化使用のための微小作製チップ上の例示的な８電極のアレイは、図１ａに図示される。

さらなる実施形態において、電極は、基材上に位置づけられる。上記基材は、広い範囲の材料（生物学的、非生物学的、有機的、無機的、もしくはこれらのうちのいずれかの組み合わせのどれか）を含み得る。例えば、上記基材は、重合化ラングミュア・ブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ_２、ＳｉＮ_４、改変ケイ素、または広く種々のゲルもしくはポリマーのうちのいずれか１種（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコリド）、ポリ無水物、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリシロキサン、ポリマー状シリカ、ラテックス、デキストランポリマー、エポキシ、ポリカーボネート、もしくはこれらの組み合わせ）であり得る。

基材は、平らな結晶性基材、例えば、シリカベースの基材（例えば、ガラス、石英など）、または例えば、半導体およびマイクロプロセッサ産業において使用される結晶性基材（例えば、ケイ素、ガリウムヒ素、インジウムドープＧａＮなど）であり得る。シリカエアロゲルはまた、基材として使用され得、任意の公知の方法によって調製され得る。エアロゲル基材は、独立の基材として、もしくは別の基材材料のための表面コーティングとして、使用され得る。

上記基材は、任意の形態をとり得、代表的には、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、粒子、微粒子、ナノ粒子、ストランド（ｓｔｒａｎｄ）、沈殿物、必要に応じて、多孔性ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、チップ、マルチウェルプレートもしくはディッシュ、光ファイバーなどである。上記基材は、剛性もしくは半剛性である任意の形態であり得る。上記基材は、隆起した領域もしくは凹んだ領域を含み得、その上にアッセイ成分が位置づけられる。上記基材の表面は、所望の表面特徴（例えば、溝、ｖ字型の溝、メサ構造（ｍｅｓａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）など）を提供するために、周知の技術を使用してエッチングされ得る。上記基材は、フォトダイオード、光電子センサー（例えば、光電子半導体チップもしくは光電子薄膜半導体）、またはバイオチップの形態をとり得る。上記基材上の電極の位置は、アドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）であり得、これは、高密度フォーマットにおいて行われ得、上記位置は、マイクロアドレスアドレス可能（ｍｉｃｒｏａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）であってもよいし、ナノアドレス可能（ｎａｎｏａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）であってもよい。いくつかの実施形態において、上記電極は、微小作製チップ上にある。

上記基材の表面は、上記基材と同じ材料から構成され得るか、または異なる材料から作製され得、化学的手段もしくは物理的手段によって、上記基材に連結され得る。このような連結された表面は、広く種々の材料（例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、ポリサッカリド、シリカもしくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、もしくは上記に列挙した基材材料のうちのいずれか）のうちのいずれかから構成され得る。

上記基材および／もしくはその表面は、使用中に曝される条件に概して耐性であるかもしくは耐性であるように処理され、必要に応じて、このような条件への曝露後に、任意の耐性材料を除去するように処理され得る。

（ＩＩＩ．リンカー）
一局面において、上記電極は、上記電極の表面にリンカーを含む。リンカーは、いくつかの実施形態において、リンカー分子が表面の分子層に吸着し（ａｂｓｏｒｂ）、表面の分子層へと組織化される場合に形成され得る。本明細書で開示される電極とともに使用するのに適したリンカーは、金属と強く化学吸着する「ヘッド基」（例えば、チオールおよびジスルフィド）および官能基（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ、−ＯＣＨ_３、−ＮＨＮＨ_２、−ビオチン、−ＮＨＳ（アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド））を有するテールを有する。リンカーの例としては、官能基を有する一本鎖もしくは分枝鎖のアルキルチオールが挙げられる。他のリンカー分子としては、芳香族チオール（例えば、官能基を有するチオフェノール）が挙げられる。適切なリンカー分子は、直接的にもしくは間接的に抗体に連結し得る官能基を有する任意の分子を含む。例示的なリンカー分子としては、シスタミン、システアミン、メルカプトプロピオン酸もしくは４−アミノチオフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、シスタミンである。

リンカーは、上記電極が上記リンカー分子の溶液に浸漬される場合に、上記電極表面に形成される。代表的濃度は、水性溶液もしくはエタノール溶液中に約０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭもしくは約５０ｍＭ以上の上記リンカー分子を含む。上記浸漬は、数時間から数日の範囲におよぶ期間にわたる。いくつかの実施形態において、上記浸漬は、約４時間、約８時間、約１６時間、約２４時間、約２日間、約５日間もしくは約７日間である。いくつかの実施形態において、上記浸漬は、室温である。他の実施形態において、上記浸漬は、室温より高い。さらなる実施形態において、上記浸漬は、室温より低い。

リンカーは、任意の公知の方法によって、直接的にもしくは間接的に抗体に結合させられ得る。直接的結合は、いくつかの実施形態において、抗体と反応し、結合し得る上記リンカー分子の官能基（例えば、−ＣＯ官能基）を介して達成され得る。あるいは、他の実施形態においては、第２のリンカーもしくはスペーサーが、官能基に結合体化され得、それによって、上記第２のリンカーもしくはスペーサーは、上記抗体に結合し得る。例えば、−ＮＨ官能基を有するリンカー分子は、リンカー（例えば、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒド）と反応し得、これは続いて、抗体に結合し得る。さらなる実施形態において、上記抗体は、官能基と相互作用するように誘導体化され得る。例えば、アビジン標識抗体は、リンカーのビオチン官能基に結合し得る。これらおよび他の例の直接的もしくは間接的な連結は、本明細書に記載される実施形態の範囲内にある。

（ＩＶ．抗体）
一局面において、抗体は、標的分析物の量および／もしくは濃度を決定するために使用される。抗体は、免疫グロブリンといわれる血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本的構成ブロック、免疫グロブリンの折りたたみもしくはドメインは、上記免疫系および他の生物学的認識システムの多くの分子において種々の形態で使用される。代表的な免疫グロブリンは、可変領域として公知の抗原結合領域および定常領域として公知の非可変領域を含む４つのポリペプチド鎖を有する。本明細書に記載される本実施形態における使用に適した抗体は、種々の形態（血清、全免疫グロブリン、抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および類似のフラグメント、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体、ならびに類似の形態が挙げられ、これらのうちの全ては、本明細書で使用される場合、広い用語「抗体」の中に入る）のうちのいずれかにあり得る。本明細書に記載される本実施形態は、抗体、ポリクローナルもしくはモノクローナルの任意の特異性の使用を意図し、特定の抗原を認識しかつ免疫反応する抗体に限定されない。本明細書中のいくつかの実施形態において、治療法およびスクリーニング法両方の状況において、抗体もしくはそのフラグメントが使用され、これは、標的分析物に対して免疫特異的である。

用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、上記集団を構成する個々の抗体は、考えられる天然に存在する変異（微量で存在し得る）を除いて、同一である）から得られる抗体に言及する。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。さらに、代表的には、異なる決定基（エピトープ）に向けられる異なる抗体を含む従来のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、上記抗原の単一の決定基に対して向けられる。本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／もしくは軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同である一方で、上記鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一かもしくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにこのような抗体のフラグメント（それらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて）を含む。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ８１， ６８５１ ６８５５ （１９８４）を参照のこと。

用語「抗体フラグメント」とは、全長抗体の一部（一般には、抗原結合領域もしくは可変領域）に言及する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化は、２つの同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントといわれ、各々、単一の抗原結合部位を有する）および残りのいわゆる、「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化するその能力が理由で）を生じる。ペプシン処理は、抗原を架橋し得る２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）_２フラグメント、および残りの他のフラグメント（これは、ｐＦｃ’といわれる）を生じる。さらなるフラグメントとしては、ダイアボディー、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成されるマルチ特異的抗体が挙げられ得る。本明細書で使用される場合、抗体に関して「機能的フラグメント」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントに言及する。

抗体フラグメントは、その抗原もしくはレセプターと選択的に結合するいくらかの能力を保持し、以下のように定義される：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、完全抗体を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖および一方の重鎖の一部を生じることによって生成され得る。

（２）Ｆａｂ’は、完全抗体をペプシンで処理して、続いて、還元して、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じることによって得られ得る抗体分子のフラグメントである。２個のＦａｂ’フラグメントが、１抗体分子につき得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域に由来する１個以上のシステインを含む、上記重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数残基の付加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。

（３）Ｆ（ａｂ’）_２は、完全抗体を、酵素ペプシンで消化して、その後の還元なしで得られ得る抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）_２は、２個のジスルフィド結合によって一緒に保持された２個のＦａｂ’フラグメントのダイマーである。

（４）Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密に非共有結合的に会合した一本の重鎖可変ドメインおよび一本の軽鎖可変ドメインのダイマー（Ｖ_ＨＶ_Ｌダイマー）からなる。この構成において、各可変ドメインの３個のＣＤＲは、上記Ｖ_ＨＶ_Ｌダイマーの表面にある抗原結合部位を定義するように相互作用する。まとめると、上記６個のＣＤＲは、上記抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（もしくは抗原に対して特異的な３個のみのＣＤＲを含む、Ｆｖの半分）すら、抗原を認識し、結合する能力を有するが、全結合部位より親和性は低い。

（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）とは、上記軽鎖の可変領域、上記重鎖の可変領域を含み、適切なポリペプチドリンカーによって、遺伝的に融合された単一鎖分子として連結される、遺伝的に操作された分子として定義される。このような一本鎖抗体はまた、「一本鎖Ｆｖ」もしくは「ｓＦｖ」抗体フラグメントといわれる。一般に、上記Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このことは、上記ｓＦｖが、抗原結合に関して所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ． ２６９ ３１５ （１９９４）を参照のこと。

用語「ダイアボディー」とは、２個の抗原結合部位を有する低分子抗体フラグメントであって、これらフラグメントは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に同じポリペプチド鎖において接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むもの（ＶＨ ＶＬ）に言及する。同じ鎖上の上記２個のドメイン間で対形成することを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、上記ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成して、２個の抗原結合部位を作らされる。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４ ６４４８ （１９９３）により十分に記載される。

抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小の認識ユニット」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって、調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ： ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， ページ １０６ （１９９１）を参照のこと。

抗体の生成および調製は、任意の公知の方法を介する。例えば、Ｇｒｅｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，： Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍａｎｓｏｎ， ｅｄ．）， ページ １ ５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）； Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ， Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ，： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， セクション ２．４．１ （１９９２）（これらは、ポリクローナル抗体の生成および調製に関して参考として援用される）； Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）； Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， セクション ２．５．１ ２．６．７； および Ｈａｒｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．，： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ページ ７２６ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ． （１９８８））（これらは、モノクローナル抗体の生成および調製について参考として援用される）を参照のこと。抗体フラグメントを生成するための方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８８）に記載されるプロトコルに類似のプロトコルによって、生成され得る。

上記抗体は、任意の公知の方法によって、上記リンカーに結合させられている。上記抗体は、いくつかの実施形態において、上記リンカー上の選択された官能基に直接結合させられ得る。あるいは、上記抗体は、他の実施形態においては、第２のリンカーもしくはスペーサーを介して、上記リンカーに間接的に連結され得る。

（Ｖ．検出可能な分析物／バイオマーカーおよび疾患状態／使用）
一局面において、上記標的分析物は、タンパク質である。多数の考えられるタンパク質性標的分析物が存在し、それらは、本明細書中の本実施形態を使用して、検出され得る。「タンパク質」もしくは本明細書中の文法的等価物は、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチド、誘導体およびアナログ、例えば、天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸アナログ含むタンパク質、およびペプチド摸倣構造を意味する。上記側鎖は、（Ｒ）配置もしくは（Ｓ）配置のいずれかにおいて存在し得る。いくつかの実施形態において、上記アミノ酸は、（Ｓ）配置もしくはＬ配置にある。

適切なタンパク質分析物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）免疫グロブリン（特に、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、および特に治療上もしくは診断上関連する抗体。以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ヒトアルブミン、アポリポプロテイン（アポリポプロテインＥが挙げられる）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、α−フェトプロテイン、サイロキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、アンチトロンビンに対する抗体、医薬（抗てんかん薬（フェニトイン、プリミドン、カルバマゼピン（ｃａｒｂａｒｉｅｚｅｐｉｎ）、エトスクシミド、バルプロ酸、およびフェノバルビタール（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔｏｌ）が挙げられる）、心臓作用薬（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド）、気管支拡張薬（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド）、抗鬱剤、免疫抑制剤、濫用薬物（アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカインおよびオピエート））に対する抗体、ならびに任意の数のウイルス（オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス（ｍ ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ））、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニア・ウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ、ＢおよびＣを含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩが挙げられる）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルスなどが挙げられる）、および細菌（広く種々の病原性および非病原性の目的の原核生物が挙げられ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ（例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ Ｙ． ｐｅｓｔｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ（例えば、Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍ）；などが挙げられる）に対する抗体；（２）酵素（および他のタンパク質）、以下が挙げられるが、これらに限定されない：心疾患のインジケーターもしくはその処置のインジケーターとして使用される酵素（クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブリノゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）が挙げられる）；膵臓疾患インジケーター（アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシンおよびトリプシンが挙げられる）；肝機能酵素およびタンパク質（コリンエステラーゼ、ビリルビン、およびアルカリホスファターゼが挙げられる）；アルドラーゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ならびに細菌およびウイルスの酵素（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ）；（３）ホルモンおよびサイトカイン（そのうちの多くは、細胞レセプターのリガンドとして働く）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１７が挙げられる）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１および−２が挙げられる）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βが挙げられる）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、低密度リポプロテイン、高密度リポプロテイン、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、毛様体神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール（ｃｏｔｒｉｓｏｌ）、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロン、テストステロン；ならびに（４）他のタンパク質（α−フェトプロテイン、がん胎児性抗原ＣＥＡが挙げられる）。

いくつかの実施形態において、タンパク質分析物は、疾患、障害もしくは状態のバイオマーカーである。例示的なバイオマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ＰＳＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、Ｂ２Ｍ（β−２ミクログロブリン）、ＢＴＡ（膀胱腫瘍抗原）、ＣＡ１５−３（がん抗原１５−３）、ＣＡ１９−９（がん抗原１９−９）、ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、ＣＡ７２−４（がん抗原７２−４）、ＣＡ−１２５（がん抗原１２５）、カルシトニン、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ−１）、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、ＮＳＥ（神経特異的エノラーゼ）、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、モノクローナル免疫グロブリン、ＮＳＥ（神経特異的エノラーゼ）、プロゲステロンレセプターＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、総前立腺特異的膜抗原および遊離型前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはこれらの一部もしくはバリエーションもしくはフラグメント。特定の場合において、上記バイオマーカーは、がんのバイオマーカーである。他の場合において、上記バイオマーカーは、細菌感染のバイオマーカーである。さらなる場合において、上記バイオマーカーは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌感染のバイオマーカーである。

（ＶＩ．サンプル）
本明細書に記載される検出システムおよび方法についてのサンプルは、分析物を含むと疑われる任意の材料であり得る。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、生きている生物から直接的にもしくは間接的に得られ得るタンパク質を含む生物学的材料の任意の供給源（細胞、組織もしくは体液が挙げられる）、およびその生物が残した堆積物（ｄｅｐｏｓｉｔ）（ウイルス、マイコプラズマおよび化石が挙げられる）であり得る。代表的には、上記サンプルは、主に水性の媒体において得られるかもしくは分散している。上記サンプルの非限定的な例としては、以下が挙げられる：血液、尿、精液、乳汁、痰、粘液、口内スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、吸引物、針生検、例えば、外科手術もしくは剖検によって得られる組織の切片、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管および尿生殖路の外分泌物、涙液、唾液、腫瘍、器官、インビトロ細胞培養構成要素のサンプル（細胞培養培地中の細胞の増殖から生じる馴化培地、ウイルス感染したと思われる細胞、組換え細胞、および細胞成分が挙げられるが、これに限定されない）、ならびにタンパク質、ペプチドなどを含む組換えライブラリー。

上記サンプルは、標的分析物を含むことが公知である陽性コントロールサンプルであり得る。陰性コントロールサンプルもまた、使用され得る。これは、上記分析物を含むとは予測されないが、上記分析物を含む（試薬のうちの１種以上の汚染を介して）か、もしくは偽陽性を生じ得る別の成分を含むと疑われ、所定のアッセイにおいて使用される試薬の標的分析物による汚染がないことを確認するために、ならびにアッセイ条件の所定の設定が偽陽性（上記サンプル中の標的分析物の非存在下ですら陽性シグナル）を生じるか否かを決定するために、試験される。

上記サンプルは、希釈、溶解、懸濁、抽出され得、あるいは存在する任意の標的分析物を可溶化および／もしくは精製するように、または増幅スキームにおいて使用される試薬にもしくは検出試薬に接近できるように別の方法で処理され得る。上記サンプルが細胞を含む場合、上記細胞は、上記細胞内のポリヌクレオチドを放出するように溶解もしくは透過処理され得る。１工程の透過処理緩衝液が、細胞を溶解するために使用され得、このことは、さらなる工程が溶解後に直接行われることを可能にする（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）。

（ＶＩＩ．使用のためのデバイス、３電極システム、スキャン法）
電子移動は、一般に、電子的に開始され、少なくとも第１の電位の印加が、上記電極およびレドックスレポーターを含む上記システムに適用される。上記印加された電位における正確な制御およびバリエーションが、ポテンシオスタットおよび３電極システム（１つは参照、１つはサンプル（もしくは作用）および１つはカウンター電極）もしくは２電極システム（１つはサンプル、および１つはカウンター電極）のいずれかを介して行われ得る。いくつかの実施形態において、３電極システムを有するポテンシオスタットが、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極および白金ワイヤ補助電極とともに使用される。電気的シグナルは、サイクリックボルタンメトリーもしくは微分パルスボルタンメトリーのいずれかによって測定され得る。特定の場合において、電気的シグナルは、約５０ｍ／ｖ、約８０ｍ／ｖ、約１００ｍ／ｖ、約１２０ｍ／ｖ、もしくは約１５０ｍ／ｖのスキャン速度において、サイクリックボルタンメトリーによって測定される。他の場合において、電気的シグナルは、微分パルスボルタンメトリーによって、約１〜５ｍＶもしくは約２〜１０ｍＶの電位ステップ、約２５〜５０ｍＶもしくは約４０〜７５ｍＶのパルス振幅、パルス約２５〜５０ｍｓもしくは約４０〜７５ｍｓ、および約１０〜１００ｍｓもしくは約２５〜１５０ｍｓもしくは約５０〜２００ｍｓのパルス周期で測定される。

他の場合において、電気化学的電位を検出する他の手段（電位差測定式、アンペロメトリー、パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー、ブロードバンド周波数応答、インピーダンス、もしくは他の電気化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない）は、本明細書に記載されるシステムおよび方法の電気化学的に改変された電極からの出力シグナルを変換するために使用され得る。

（ＶＩＩＩ．キット）
上記記載されるシステムのための、および上記記載される方法を行うための構成要素を含むキットもまた、提供される。いくつかの実施形態において、キットは、以下の構成要素（電極、上記電極の表面にリンカーを形成するための試薬、１種以上の抗体およびレドックスレポーターが挙げられる）のうちの１種以上を含む。上記キットの構成要素は、収納箱によって保持され得る。記載される方法を行うために上記キットを使用するための指示書は、上記収納箱とともに提供され得、任意の固定媒体において提供され得る。上記指示書は、上記収納箱の中に位置してもよいし、上記収納箱の外に位置してもよく、上記収納箱を形成する任意の表面の内部もしくは外部に印刷され得、このことは、上記指示書を読みやすくする。キットは、１種以上の異なる標的分析物の検出のために多重形態にあり得る。

（実施例１：電極およびリンカーの調製）
チップを、アセトン中、５分間にわたる超音波処理によって清浄にし、イソプロピルアルコールおよびＤＩ水で３０ｓにわたってすすぎ、空気流で乾燥させた。電着を室温で行い；製作した電極の５μｍ開口部を、作用電極として使用し、露出したボンドパッドを使用して接触させる。金（Ａｕ）センサーを、ＨＡｕＣｌ_４の２０ｍＭ 溶液および０．５Ｍ ＨＣｌを含む堆積溶液を使用して作製する。上記Ａｕセンサーを、約０〜２５０ｍＶにおいて約１００〜３００ｓにわたってＤＣ電位アンペロメトリーを使用して形成する。あるいは、Ａｕ構造はまた、例えば、約１５〜４０ｎＡにおいて約２５〜６０ｓにわたって、クロノポテンシオメトリーを使用して形成し得る。

（実施例２：リンカーへの抗体の連結）
１〜５０ｍＭの４−アミノチオフェノールもしくはメルカプトプロピオン酸を含む水性溶液を、１０〜２０時間にわたって室温においてＡＵセンサーに適用する。次いで、上記センサーを、ＤＩ水で２〜３回、２〜４分間にわたって洗浄する。上記処理したセンサーを、室温において、水中の１．５〜３．０％ グルタルアルデヒドで１時間にわたって反応させ、続いて、ＤＩ水で２〜３回、２〜４分間にわたって洗浄した。次いで、上記官能化したセンサーを、５〜２５μｇ／ｍｌ 抗体を含むＰＢＳと室温において１〜２時間反応させる。上記センサーを、ＰＢＳで２〜３回、３〜６分間にわたって洗浄する。未反応のアルデヒド基を、１％ （Ｗ／Ｖ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで、１〜２時間にわたって室温でブロックする。次いで、上記センサーを、３〜４回、ＰＢＳで４〜７分間にわたって洗浄する。

（実施例３：がんバイオマーカー、ＣＡ−１２５の検出）
臨床サンプル中のタンパク質レベルの高感度かつ簡単な測定のためのプラットフォームの開発は、疾患診断におけるタンパク質バイオマーカーのより広い使用を促進する重要なゴールである。有用な情報を提供するために、検出スキームは、高レベルの特異性、低い検出限界、ならびに血液および血清のような生物学的液体中での堅調な性能を示さねばならない。がんおよび他の疾患に関して、複数のタンパク質の特性の発生を考慮すると、多重化はまた、価値ある特徴である。内部コントロールおよび外部コントロール、ならびに標準物質を含めることはまた、多重化を必要とする。

ＣＡ−１２５は、卵巣がんの検出のためのマーカーとして使用されてきた上皮抗原である。いくつかのアッセイが、ＣＡ−１２５を検出するために開発されたが、大部分は、その検出手順が感度を欠いていることおよび複雑さにのいずれかに起因して、理想的ではない。市販のＣＡ−１２５イムノアッセイは、１５Ｕ／ｍｌという検出限界を有し、これは、疾患の存在と相関するレベルのＣＡ−１２５（３５Ｕ／ｍｌ）を検出するには十分であるが、有意に低いレベルの関連を正確に研究されることを可能にしない。

本明細書で開示されるタンパク質検出システムは、卵巣がんにおいて一般に存在するＣＡ−１２５がんバイオマーカーを、微小電極センサーオンチップ設計（ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｄｅｓｉｇｎ）を介して、電気化学的に検出するために適合させた。上記センサーチップは、異なるサイズの電極センサーの比較、ならびび０．１Ｕ／ｍｌに至るまで示された検出限界を決定することを可能にする。その読み取りを、非共有結合レドックスレポーター基の導入を包含する単一の工程において行った。上記報告された検出システムは、ヒト血清中のＣＡ−１２５の分析において、特異的であることを示した。上記システムの多重化は、上記バイオマーカーの分析が、豊富な血清タンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（内部較正のため）とともに並行して行われることを可能にした。

材料。 ＣＡ−１２５抗原およびＡＢドナーからのヒト血清、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体、ＨＡｕＣｌ_４溶液、フェリシアン化カリウム（Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］）、フェロシアン化カリウム三水和物（Ｋ_２［Ｆｅ（ＣＮ）_６３Ｈ_２Ｏ）、５０％（ｗ／ｗ） グルタルアルデヒド、およびシスタミンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。抗ＣＡ−１２５抗体を、ＫａｌＧｅｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｃａｎａｄａから得た。ＡＣＳグレードのアセトンおよびイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を、ＥＭＤ（ＵＳＡ）から得た；６Ｎ 塩酸を、ＶＷＲ（ＵＳＡ）から得た。リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４，１×）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ヒト全血を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から得た。

チップおよび電極製作： チップを、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒにおいて製作した。簡潔には、３インチのシリコンウェハを、熱成長させた二酸化ケイ素の厚い層を使用して不動態化した。３５０ｎｍの金層を、電子ビーム補助金蒸着を使用して、上記チップ上に堆積させた。上記金フィルムを、標準のフォトリソグラフィーおよびリフトオフプロセスを使用してパターン形成した。絶縁二酸化ケイ素の５００ｎｍ層を、化学蒸着を使用して堆積させ；５μｍ開口部を、標準のフォトリソグラフィーを使用して、上記電極上に刻み込み、２ｍｍ×２ｍｍ ボンドパッドを、標準のフォトリソグラフィーを使用して露出させた。図１ａは、例示的なセンサーチップ（左）および代表的な層（右）の写真を示す。

チップを、アセトン中で、５分間にわたって超音波処理することによって清浄にし、イソプロピルアルコールおよびＤＩ水で３０ｓ間にわたってすすぎ、空気流で乾燥させた。電着を室温において行った；上記製作した電極センサーの５μｍ開口部を、作用電極として使用し、上記露出したボンドパッドを使用して接触させた。３個の異なる金電極センサーを、ＨＡｕＣｌ_４の２０ｍＭ溶液および０．５Ｍ ＨＣｌを含む堆積溶液を使用して、国際出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１２１２（ＷＯ ２０１０／０２５５４７として公開）に記載される手順に類似のプロセスを使用して、作製した。１００ミクロンおよび３０ミクロンの金。

電極構造を、それぞれ、０ｍＶにおいて２００ｓにわたって、および１５０ｍＶにおいて２００ｓにわたってＤＣ電位アンペロメトリーを使用して形成した；そして８ミクロン金電極構造を、３０ｎＡにおいて５０ｓにわたってクロノポテンシオメトリーを使用して形成した。図２ａ、図２ｃおよび図２ｅは、それぞれ、１００ミクロン、３０ミクロンおよび８ミクロンの金電極構造のＳＥＭ画像を示す。

センサーの表面積の決定。 Ａｕセンサーの表面積を、５０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４中でサイクリックボルタモグラムから得たＡｕ酸化物還元ピーク面積を積分することによって計算した。順方向スキャンにおいて、化学吸着酸素の単層を形成し、次いで、逆方向スキャンにおいて還元する。顕微鏡の単位面積あたりの還元電荷は、５００μＣ／幾何ｃｍ^２として実験的に決定した。上記表面積を、還元ピーク（Ａｇ／ＡｇＣｌに対して約０．８１２Ｖ）を積分して、還元電荷を得、これを、５００μＣ／幾何ｃｍ^２で除算することによって計算した。

電極の抗体改変： １０ｍＭ シスタミンを含む水性溶液を、上記電極の表面に均一なリンカーを形成するために、１６時間にわたって室温において金電極センサーに適用した。次いで、上記電極を、ＤＩ水で２回、２分間にわたって洗浄した。上記リンカーを、室温において水中の２．５％ グルタルアルデヒドと１時間にわたって反応させ、続いて、ＤＩ水で２回、２分間にわたって洗浄した。次いで、上記官能化電極を、１０μｇ／ｍｌ 抗ＣＡ−１２５抗体もしくは抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体を含むＰＢＳと、室温において１時間にわたって反応させた。上記電極を、ＰＢＳで２回、５分間にわたって洗浄した。未反応のアルデヒド基を、１％ （Ｗ／Ｖ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックした。次いで、上記電極を、３回、ＰＢＳで５分間にわたって洗浄した。ＰＢＳ中の異なる濃度のＣＡ−１２５もしくは血清を含む溶液を、上記抗体改変電極に、４０分間にわたって３７℃において適用した。上記電極を、電気化学的読み取りの前に、ＰＢＳで洗浄した。

電気化学的分析および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）： 電気化学的実験を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極および白金ワイヤ補助電極を特徴とする３電極システムを備えるＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｐｓｉｌｏｎポテンシオスタットを使用して行った。電気化学的シグナルを、２．５ｍＭ Ｋ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］、２．５ｍＭ Ｋ_２［Ｆｅ（ＣＮ）_６］、および０．１Ｍ ＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７）中で測定した。サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度で得、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）シグナルを、５ｍＶの電位ステップ、パルス振幅５０ｍＶ、５０ｍｓでのパルス、およびパルス周期１００ｍｓで得た。上記抗体への標的タンパク質の結合に対応するシグナル変化を、以下のとおりに計算した： ΔＩ％＝｛（平均Ｉ_０）−（平均Ｉ_ｃ）｝／平均Ｉ_０×１００（ここで平均Ｉ_０＝ゼロ標的濃度での平均電流、平均Ｉ_ｃ＝任意の標的濃度における平均電流）。上記ＳＥＭ画像を、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ−３４００ ＳＥＭを使用して得た。

３種の異なる構造を、異なる電気化学的方法および条件を使用して、チップ上に製作した。１００ミクロン（図２ａ）、３０ミクロン（図２ｃ）、および８ミクロン（図２ｅ）のセンサーを、上記電着条件を変化させることによって作製した。上記センサーの表面積を、硫酸中でスキャンし、上記表面から形成され剥がれた酸化物の量を測定することによって測定し、約４×１０^−６ｃｍ^２（８ミクロンセンサー）、３×１０^−５ｃｍ^２（３０ミクロンセンサー）、および１×１０^−４ｃｍ^２（１００ミクロンセンサー）という面積を得た。緩衝溶液中で測定した容量性電流（図２ｇ）は、これら値と一致していた。上記タンパク質検出のためのセンサーを試験する前に、サイクリックボルタモグラムを、フェロシアニドおよびフェリシアニドを含む溶液中の各構造について得た（図２ｂ、図２ｄ、および図２ｆ）。上記１００ミクロンセンサーは、拡散限界電流を示し、上記８ミクロンおよび３０ミクロンのセンサーは、微小電極に関して予期されたものと一致したプラトー電流を示した。

上記３種の異なるサイズにしたセンサー上に形成されるイムノセンサーの検出限界は、ＣＡ−１２５と４０分間にわたってインキュベーションする前後に、［Ｆｅ（ＣＮ）６］_{３−／４−}溶液の微分パルスボルタモグラム（ＤＰＶ）を測定することによって評価した。最も大きなセンサー（図３ａ）を用いたところ、濃度１０Ｕ／ｍｌが、測定できるシグナル変化に必要とされた。中間の３０ミクロンセンサーを用いたところ、検出限界は、１Ｕ／ｍｌに近づいた（図３ｂ）。最も小さな８ミクロンセンサーを用いたところ、０．１Ｕ／ｍｌのＣＡ−１２５が検出可能であった（図３ｃ）。０．１Ｕ／ｍｌのＣＡ−１２５抗原は、約５００ｆＭのＣＡ−１２５もしくは１００ｐｇ／ｍｌに匹敵する。

上記例示的な検出システムを生物学的液体で評価するために、ヒト血清中のＣＡ−１２５サンプルの検出を行った。血清は、大量のタンパク質および他の分子を含む非常に複雑な生物学的液体である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、ヒト血清中のＨＳＡの一定かつ高濃度に起因して、内部標準として選択した。多重センサーチップ上に、ＣＡ−１２５およびＨＳＡのイムノセンサーを、抗ＣＡ−１２５抗体および抗ＨＳＡ抗体の層をそれぞれ形成することによって開発した（図１ａ）。異なる濃度のＣＡ−１２５を添加したヒト血清を、上記多重化イムノセンサーに適用し、ＤＰＶを、フェロシアニドおよびフェリシアニドの混合溶液中で記録した。図５ａは、異なる濃度のＣＡ−１２５を添加したヒト血清について得られたΔＩ％（０Ｕ／ｍｌ ＣＡ−１２５を有する血清に関して）値を示す。抗ＣＡ−１２５抗体で改変したセンサーについてのΔＩ％は、ＣＡ−１２５の濃度が増えるとともに増大したのに対して、ＨＳＡのΔＩ％は、抗ＨＳＡ抗体で改変したイムノセンサーに関して本質的に一定であった。血清タンパク質と並行したＣＡ−１２５の検出は、上記がんバイオマーカーの絶対測定値を提供する有用な手段である。

この感知システムの性能をまた、未処理の全血において調査した。血液サンプルに、ＣＡ−１２５を添加し、その分析を、血清および緩衝液研究と同じ様式において行った。興味深いことに、同じ検出限界が得られ、図５ｂにおいて示されるように、バックグラウンドレベルを超えて、０．１Ｕ／ｍｌが明らかに分離された。未処理の血液サンプルで達成されたこのレベルの感度は、この単純で、簡単な電気化学的タンパク質検出アッセイがまた、顕著に堅調であることを示す。

以下の表は、種々の電極サイズに関するＣＡ−１２５のおよその検出限界を示す：

本発明の好ましい実施形態が、本明細書で示され、記載されてきたが、このような実施形態が例示のためにのみ提供されることは、当業者に明らかである。多くのバリエーション、変更、および置換は、本発明から逸脱することなく、いまや当業者に想起される。本明細書に記載される発明の実施形態の種々の代替が、本発明を実施するにあたって使用され得ることは、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これら特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物は、特許請求の範囲によって網羅されると解釈される。

Claims (64)

1. タンパク質分析物を電気化学的に検出するための検出システムであって、該検出システムは、
   表面にリンカーを含む電極であって、ここで該リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、電極；および
   レドックスレポーター
   を含む、検出システム。
2. 前記リンカーは、前記抗体もしくはそのフラグメントに直接的にもしくは間接的に連結し得る官能基を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記リンカーは、官能性アミン基を含む、請求項１に記載のシステム。
4. 前記リンカーは、官能性カルボン酸基を含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記リンカーは、シスタミン、システアミン、メルカプトプロピオン酸もしくは４−アミノチオフェノールである、請求項１に記載のシステム。
6. 前記リンカーは、第２のリンカーを介して前記抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、請求項１に記載のシステム。
7. 前記第２のリンカーは、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドである、請求項６に記載のシステム。
8. 前記リンカーは、抗体もしくはそのフラグメントの複数のコピーと結合させられている、請求項１に記載のシステム。
9. 前記抗体もしくはそのフラグメントは、ポリクローナル抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＣＤＲペプチドおよびダイアボディーからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
10. 前記レドックスレポーターは、電位が印加される場合に、前記電極で電気化学的シグナルを生成し得る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
11. 前記レドックスレポーターは、ファラデー電流を生成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
12. 前記レドックスレポーターは、界面電子移動する能力がある、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
13. 前記レドックスレポーターは、フェリシアニド／フェロシアニドもしくはフェロセンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
14. 前記レドックスレポーターは、ヘキサクロロイリデート（ＩＶ）／ヘキサクロロイリデート（ＩＩＩ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
15. 前記電極は、貴金属である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
16. 前記電極は、炭素である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
17. 前記電極は、酸化インジウムスズである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
18. 前記電極は、金、パラジウムもしくは白金である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
19. 前記電極は、ナノ構造の微小電極である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
20. 前記電極は、約１５０ミクロン未満である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
21. 前記電極は、約５〜約５０ミクロンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
22. 前記電極は、約１０ミクロン未満である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
23. 前記電極は、微小作製チップ上にある、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
24. 前記タンパク質分析物は、疾患、障害もしくは状態のバイオマーカーである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のシステム。
25. 前記バイオマーカーは、がんバイオマーカーである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
26. 前記バイオマーカーは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、α−フェトプロテイン、β−２ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、がん抗原７２−４、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、カルシトニン、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、神経特異的エノラーゼ、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはこれらの一部、バリエーションもしくはフラグメントからなる群より選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
27. 前記バイオマーカーは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌感染のバイオマーカーである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
28. タンパク質分析物の電気化学的検出のための方法であって、該方法は、
    リンカーを表面に含む電極と、サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで該リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、工程；
    電位が印加される場合に、該抗体標識された電極および該レドックスレポーターによって生成される電気化学的シグナルを測定する工程；ならびに
    該電気化学的シグナルと、タンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルとを比較する工程；
    を包含し、ここでタンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルと比較して検出した該シグナルの変化は、該サンプル中の該タンパク質分析物の存在を示す、方法。
29. 前記リンカーは、前記抗体もしくはそのフラグメントに直接的にもしくは間接的に連結し得る官能基を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記リンカーは、官能性アミン基を含む、請求項２８に記載の方法。
31. 前記リンカーは、官能性カルボン酸基を含む、請求項２８に記載の方法。
32. 前記リンカーは、シスタミン、システアミン、メルカプトプロピオン酸もしくは４−アミノチオフェノールである、請求項２８に記載の方法。
33. 前記リンカーは、第２のリンカーを介して前記抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、請求項２８に記載の方法。
34. 前記第２のリンカーは、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記電極は、抗体もしくはそのフラグメントの複数のコピーで標識されている、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記抗体もしくはそのフラグメントは、ポリクローナル抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＣＤＲペプチドおよびダイアボディーからなる群より選択される、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記レドックスレポーターは、ファラデー電流を生成する、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記レドックスレポーターは、界面電子移動する能力がある、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記レドックスレポーターは、フェリシアニド／フェロシアニドもしくはフェロセンである、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記レドックスレポーターは、ヘキサクロロイリデート（ＩＶ）／ヘキサクロロイリデート（ＩＩＩ）である、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記電極は、貴金属である、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記電極は、炭素である、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記電極は、酸化インジウムスズである、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記電極は、金、パラジウムもしくは白金である、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記電極は、ナノ構造の微小電極である、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記電極は、約１００ミクロン未満である、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記電極は、約５〜約５０ミクロンである、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記電極は、約１０ミクロン未満である、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記電極は、微小作製チップ上にある、請求項２８〜４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 前記タンパク質分析物は、疾患、障害もしくは状態のバイオマーカーである、請求項２８〜４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記バイオマーカーは、がんバイオマーカーである、請求項２８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記バイオマーカーは、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、α−フェトプロテイン、β−２ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、がん抗原７２−４、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、カルシトニン、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、神経特異的エノラーゼ、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはこれらの一部、バリエーションもしくはフラグメントからなる群より選択される、請求項２８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記バイオマーカーは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌感染のバイオマーカーである、請求項２８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記測定する工程は、ボルタンメトリーを介する、請求項２８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. ボルタンメトリーは、サイクリックボルタンメトリーもしくは微分パルスボルタンメトリーである、請求項５４に記載の方法。
56. 複数のタンパク質分析物の多重化電気化学的検出のための方法であって、該方法は、
    リンカーを表面に含む第１の電極と、サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで該リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る第１の抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、工程；
    電位が印加される場合に、該第１の抗体標識された電極および該レドックスレポーターによって生成される第１の電気化学的シグナルを測定する工程；
    リンカーを表面に含む第２の電極と、サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで該リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る第２の抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、工程；
    電位が印加される場合に、該第２の抗体標識された電極および該レドックスレポーターによって生成される第２の電気化学的シグナルを測定する工程；ならびに
    該第１および該第２の電気化学的シグナルと、タンパク質分析物を含まないコントロールサンプルにおいて該第１のおよび該第２の抗体標識された電極によって生成されるそれぞれのシグナルとを比較する工程；
    を包含し、ここでタンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのそれぞれのシグナルと比較して検出された該第１および該第２の電気化学的シグナルの変化は、該サンプル中の該タンパク質分析物の存在を示す、方法。
57. 前記第１および前記第２の電極はともに、微小作製チップ上にある、請求項５６に記載の方法。
58. 前記第１および前記第２の電極は、異なる微小作製チップ上にある、請求項５６に記載の方法。
59. 前記第２の抗体標識された電極は、前記第１の抗体標識された電極に対する参照コントロールである、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
60. 前記第２の抗体標識された電極は、豊富な血清タンパク質を検出する、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
61. がんを有する被験体における進行もしくは応答をモニターするための方法であって、該方法は、
    該被験体から生物学的サンプルを得る工程；
    リンカーを表面に含む電極と、該サンプルおよびレドックスレポーターとを接触させる工程であって、ここで該リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられており、ここで該抗体もしくはそのフラグメントは、タンパク質分析物に結合する、工程；
    電位が印加される場合に、該抗体標識された電極および該レドックスレポーターによって生成される電気化学的シグナルを測定する工程；ならびに
    該電気化学的シグナルと、タンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルとを比較する工程；
    を包含し、ここでタンパク質分析物を含まないコントロールサンプルのシグナルと比較して検出される該シグナルの変化は、該サンプル中の該タンパク質分析物の存在を示す、方法。
62. 前記タンパク質分析物は、がんバイオマーカーである、請求項６１に記載の方法。
63. 前記タンパク質分析物は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、α−フェトプロテイン、β−２ミクログロブリン、膀胱腫瘍抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、がん抗原７２−４、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、カルシトニン、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、モノクローナル免疫グロブリン、神経特異的エノラーゼ、ＮＭＰ２２、サイログロブリン、プロゲステロンレセプター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｓ−１００、およびＴＡ−９０、またはその一部、バリエーションもしくはフラグメントからなる群より選択されるバイオマーカーである、請求項６１に記載の方法。
64. タンパク質分析物を電気化学的に検出するためのキットであって、該キットは、
    リンカーを表面に含む電極であって、ここで該リンカーは、タンパク質分析物を結合し得る抗体もしくはそのフラグメントに結合させられている、電極；および
    電位が印加される場合に、該電極で電気化学的シグナルを生成し得るレドックスレポーター
    を含む、キット。