JP2009517019A - Δ９エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用 - Google Patents

Δ９エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、リノール酸［１８：２、ＬＡ］をエイコサジエン酸［２０：２、ＥＤＡ］に転換する能力を有するΔ９エロンガーゼに関する。Δ９エロンガーゼをコードする単離された核酸断片およびこのような断片を含んでなる組み換えコンストラクトと共に、植物および油性酵母中でこれらのΔ９エロンガーゼを使用して長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を製造する方法が開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によって全体を本明細書に援用する２００５年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／７３９，９８９号明細書の利益を主張する。
本発明は、生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、Δ９脂肪酸エロンガーゼ酵素をコードする核酸断片の同定、および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造におけるこれらのエロンガーゼの使用に関する。
ＰＵＦＡの重要性には議論の余地がない。例えば特定のＰＵＦＡは健康な細胞の重要な生物学的構成要素であり、哺乳類では新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できず、その代わりに食餌中で得なくてはならず、またはリノール酸（ＬＡ、１８：２ ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ ω−３）のさらなる不飽和化および延長によって送達されなくてはならない「必須」脂肪酸として、リン脂質またはトリアシルグリセロールなどの形態であってもよい細胞の原形質膜の構成物として、（特に発達中の幼児の脳における）適切な発達、組織形成および修復のために必要なものとして、哺乳類における重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイド前駆物質（例えばプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン）として認識される。さらに長鎖ω−３ＰＵＦＡの大量摂取は、心臓血管保護効果を有する（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。その他の多数の研究が、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの投与によって得られる、多様な症状および疾患（例えば喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対する多岐にわたる健康上の利点を実証している。
今日、植物、藻類、菌・カビ、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が、商業的ＰＵＦＡ生産の手段として調査されている。宿主生物の天然のＰＵＦＡ産生能力は所定の技法に特異的な場合もあるが、遺伝子操作もまた、いくつかの宿主の天然の能力（天然にはＬＡおよびＡＬＡ脂肪酸産生に限定されるものでさえ）を実質的に増強でき、高レベルの様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡを生成させることが証明されている。この効果が天然の能力の結果、または組み換え技術の結果であるかにかかわらず、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０、４ω−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ω−３）の生成は全てΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（ユーグレナ種などのいくつかの生物中で作動して、エイコサジエン酸［ＥＤＡ；２０：２ ω−６］および／またはエイコサトリエン酸［ＥＴｒＡ；２０：３ ω−３］の生成によって特徴づけられる）、またはΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路（主に藻類、コケ、菌・カビ、線形動物、およびヒトに見られ、γ−リノール酸［ＧＬＡ；１８：３ ω−６］および／またはステアリドン酸［ＳＴＡ；１８：４ ω−３］の生成によって特徴づけられる）のどちらかの発現を必要とする（図１）。
ここでの目的では、本出願は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の使用、より具体的にはΔ９エロンガーゼ酵素の使用に着目する。これまでに同定されたほとんどのΔ９エロンガーゼ酵素は、ＬＡをＥＤＡにそしてＡＬＡをＥＴｒＡに転換する能力の双方を有する（Δ８デサチュラーゼによる反応に続いて、ＤＧＬＡおよびＥＴＡが引き続いてそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡから合成され、Δ５デサチュラーゼによる反応に続いて、ＡＲＡおよびＥＰＡが引き続いてそれぞれＤＧＬＡおよびＥＴＡから合成される。ＤＨＡ合成は、引き続く追加的なＣ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼの発現を必要とする）。
ＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡの生成のための新しい方法に対する必要にもかかわらず、わずかなΔ９エロンガーゼ酵素しか同定されていない。例えば出願人らの本発明に先だって、唯一のΔ９エロンガーゼが現在知られている。具体的には特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４が、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）からのΔ９エロンガーゼおよびその使用について述べる（ジェンバンク登録番号ＡＡＬ３７６２６もまた参照されたい）。したがってω−３／ω−６脂肪酸の生成で使用するための多様な宿主生物における異種性発現に適した、Δ９エロンガーゼをコードする追加的遺伝子の同定および単離に対する必要性がある。
過去に同定されているエロンガーゼは、それらが作用する基質に関して異なる。それらは動物および植物の双方に存在する。哺乳類に見られるものは、飽和、一不飽和、および多価不飽和脂肪酸に作用できる。しかし植物に見られるものは、飽和および一不飽和脂肪酸に特異的である。したがって植物中でＰＵＦＡを生成するためのＰＵＦＡ特異的エロンガーゼに対する必要がある。
植物中の鎖長延長過程は、二酸化炭素分子の放出を伴うマロン酸と脂肪酸の縮合の重要な段階に始まる４段階過程を伴う。脂肪酸延長における基質はＣｏＡ−チオエステルである。縮合段階は３−ケトアシルシンターゼによって媒介され、これは一般に４つの反応サイクル全体の律速段階であり、いくつかの基質特異性が提供される。１つの延長サイクルの生成物は、炭素原子２個分延長された脂肪酸を再生する（非特許文献５、非特許文献６）。
Δ８デサチュラーゼと併せてΔ９エロンガーゼを発現することの有用性に基づいて、様々な供給源からΔ８デサチュラーゼを同定して特性決定するためのかなりの努力がなされている。これまでのほとんどの努力は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ８デサチュラーゼの単離と特性決定に着目しており、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼのいくつかの配列変異が報告されている（例えば非特許文献７、特許文献５、特許文献６、特許文献４；２００５年６月２４日に出願された特許文献７（２００６年２月２日公開の特許文献８および特許文献９）を参照されたい）。より最近では、２００５年４月２２日公開の特許文献１０が、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）からのΔ８デサチュラーゼ酵素のアミノ酸および核酸配列を開示する。非特許文献８は、自由生活土壌アメーバであるアカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）からのｃＤＮＡの単離と特性決定について述べ、これはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中で発現させるとＣ２０Δ８デサチュラーゼをコードする。また２００６年４月２８日に出願された同一所有者の同時係属出願である特許文献１１が、パブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）（ＣＣＭＰ４５９）からのΔ８デサチュラーゼ酵素のアミノ酸および核酸配列を開示する一方、２００６年１０月２３に出願された同一所有者の同時係属出願である特許文献１２は、ユーグレナ属のテトルエトレプチア・ポムクテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９、およびユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からのΔ８デサチュラーゼを開示する。
次の同一所有者の特許出願は油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中でのＰＵＦＡの生成に関する。どちらも２００４年１１月２５日に公開された特許文献１３および特許文献１４、２００５年１１月２日に出願され特許文献１５に対応する特許文献１６、２００５年１１月１日に出願され特許文献１７に対応する特許文献１８、および２００５年１１月１日に出願され特許文献１９に対応する特許文献２０。
さらにどちらも同一所有者の同時係属出願である、２００４年８月２６日に公開された特許文献２１が、植物中でのＰＵＦＡの生成に関する一方、２００４年８月２６日に公開された特許文献２２は、アネキシンプロモーターおよび植物中での導入遺伝子発現におけるそれらの使用に関する。
国際公開第２００２／０７７２１３号パンフレット 国際公開第２００５／０８３０９３号パンフレット 国際公開第２００５／０１２３１６号パンフレット 国際公開第２００４／０５７００１号パンフレット 国際公開第２０００／３４４３９号パンフレット 米国特許第６，８２５，０１７号明細書 米国特許出願第１１／１６６，００３号明細書 国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレット 国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット 国際公開第２００５／１０３２５３号パンフレット 米国仮特許出願第６０／７９５８１０号明細書 米国仮特許出願第６０／８５３５６３号明細書 国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット 国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット 国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット 米国特許出願第１１／２６５，７６１号明細書 国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット 米国特許出願第１１／２６４，７８４号明細書 国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット 米国特許出願第１１／２６４，７３７号明細書 国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット 国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレット ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６頁（１９７５年） ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ２（８０８１）：１１７〜１１９頁（１９７８年７月１５日） シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ），Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８頁（２００１年） フォンシャッキー（ｖｏｎ Ｓｃｈａｃｋｙ），Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９頁（２００１年） ブラウズ（Ｂｒｏｗｓｅ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２７（９）：４６７〜４７３頁（２００２年９月） ネピア（Ｎａｐｉｅｒ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７（２）：５１〜５４頁（２００２年２月） ウォーリス（Ｗａｌｌｉｓ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３６５（２）：３０７〜３１６頁（１９９９年５月） サヤノバ（Ｓａｙａｎｏｖａ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、５８０：１９４６〜１９５２頁（２００６年）
出願人らは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からΔ９エロンガーゼをコードする遺伝子を単離することで、既述の問題を解決した。
本発明は、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子コンストラクト、およびＰＵＦＡの生成のための植物、藻類，細菌、酵母および菌・カビ中でのそれらの使用に関する。
したがって本発明は、
（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチド配列と比べると少なくとも７０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなりそれと１００％相補的である、前記ヌクレオチド配列の相補体
よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらに発明は、本発明の単離された核酸配列によってコードされるポリペプチドを提供する。具体的には、本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、
（ａ）配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列、および
（ｂ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換によって（ａ）のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列
よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼポリペプチドを提供する。
別の実施態様では、本発明は本発明の単離された核酸配列で形質転換された宿主細胞を提供し、好ましい宿主細胞は、例えば藻類、細菌、酵母、卵菌類および菌・カビなどの微生物種である。
別の実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）（１）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（２）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチドとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）リノール酸源
を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母宿主細胞をΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてリノール酸がエイコサジエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサジエン酸を回収する
ことを含んでなる、エイコサジエン酸の製造方法を提供する。
代案の実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）（１）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（２）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）α−リノレン酸源
を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞をΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてα−リノレン酸がエイコサトリエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサトリエン酸を回収する
ことを含んでなるエイコサトリエン酸の製造方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、本発明の形質転換宿主によって産生された微生物油を提供する。
別の実施態様では、本発明は、本発明の微生物油を含んでなる食品を提供する。
別の実施態様では、本発明は、本発明の油を含んでなる動物飼料を提供する。
生物学的寄託
以下のプラスミドが１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、以下の称号、登録番号、および寄託日を有する（表１）。
配列一覧
本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の図面と配列表によって、発明をより完全に理解できるであろう。
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
配列一覧説明
配列番号１〜１７、２１、２２、４５〜４８、５１〜６１、６８〜７１、７６〜７９、８１〜９３、９６〜１０２、および１１８〜１２９は、表２で同定されるような遺伝子またはタンパク質をコードするＯＲＦ（またはその一部）、またはプラスミドである。
配列番号１８は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃを配列決定するために使用されるＭ１３Ｆユニバーサルプライマーである。
配列番号１９および２０は、クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからのＥｇＤ９ｅを増幅するために使用されるプライマーｏＥｕｇＥＬ１−１およびｏＥｕｇＥＬ１−２にそれぞれ対応する。
配列番号２３〜３８は、ＩｇＤ９ｅＳの増幅のために使用されるプライマーＩＬ３−１Ａ、ＩＬ３−１Ｂ、ＩＬ３−２Ａ、ＩＬ３−２Ｂ、ＩＬ３−３Ａ、ＩＬ３−３Ｂ、ＩＬ３−４Ａ、ＩＬ３−４Ｂ、ＩＬ３−５Ａ、ＩＬ３−５Ｂ、ＩＬ３−６Ａ、ＩＬ３−６Ｂ、ＩＬ３−７Ａ、ＩＬ３−７Ｂ、ＩＬ３−８Ａ、およびＩＬ３−８Ｂにそれぞれ対応する。
配列番号３９〜４２は、ＩｇＤ９ｅＳ増幅のために使用されるプライマーＩＬ３−１Ｆ、ＩＬ３−４Ｒ、ＩＬ３−５Ｆ、およびＩＬ３−８Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号４３は、ｐＴ９（１−４）からの４１７ｂｐのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ断片である。
配列番号４４は、ｐＴ９（５−８）からの３７７ｂｐのＰｓｔＩ／Ｎｏｔ１断片である。
配列番号４９および５０は、ベクターｐＹ１１５からのＩｇＤ９ｅＳを増幅するために使用されるプライマーｉｇ−ｓおよびｉｇ−ａｓにそれぞれ対応する。
配列番号６２および６３は、ｃＤＮＡからのＥｇＤ８を増幅するために使用されるプライマーＥｇ５−１およびＥｇ３−３にそれぞれ対応する。
配列番号６４〜６７は、ＥｇＤ８を配列決定するために使用される、プライマーＴ７、Ｍ１３−２８Ｒｅｖ、Ｅｇ３−２、およびＥｇ５−２にそれぞれ対応する。
配列番号７２は、ｐＫＲ４５７のためのＫＴｉカセット５’末端多重クローニング部位（ＭＣＳ）の配列である。
配列番号７３は、ダイズアルブミン転写３’ターミネーターを含む、ｐＫＲ４５７のためのＫＴｉカセット３’末端多重クローニング部位（ＭＣＳ）の配列である。
配列番号７４および７５は、ダイズゲノムＤＮＡからのダイズアルブミン転写ターミネーターを増幅するために使用されるプライマーｏＳａｌｂ−１２およびｏＳａｌｂ−１３にそれぞれ対応する。
配列番号８０は、ｐＫＲ７６７を生成するためにｐＫＲ２８７に付加される制限部位に対応する。
配列番号９４および９５は、ｐＫＲ１６０生成中に制限部位を作り出すために使用されるプライマーｏＳＡｌｂ−９およびｏＳＡｌｂ−２にそれぞれ対応する。
配列番号１０３〜１０５は、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ ｃＤＮＡ合成のために使用されるスマート（ＳＭＡＲＴ）（商標）ＩＶオリゴヌクレオチドプライマー、ＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマーおよび５’−ＰＣＲプライマーにそれぞれ対応する。
配列番号１０６は、配列番号１０７で記載されるペプチドをコードする縮重プライマーＥｕＥＦ３のヌクレオチド配列である。同様に配列番号１０８は、配列番号１０９で記載されるペプチドをコードする縮重プライマーＥｕＥＲ３のヌクレオチド配列である。
配列番号１１０〜１１３は、Ｅ３８９Ｄ９ｅをコードするｃＤＮＡの５’末端のＰＣＲ増幅のために使用されるプライマー３８９Ｅｌｏ−５−１、３８９Ｅｌｏ−５−２、ＤＮＲＣＤＳ５’−２、および３８９Ｅｌｏ−５−４に、それぞれ対応する。
配列番号１１４および１１５は、Ｅ３８９Ｄ９ｅをコードするｃＤＮＡの３’末端のＰＣＲ増幅のために使用されるプライマー３８９Ｅｌｏ−３−１および３８９Ｅｌｏ−３−２にそれぞれ対応する。
配列番号１１６および１１７は、Ｅ３８９Ｄ９ｅをコードする全長ｃＤＮＡの増幅のために使用されるプライマー３８９ＥＬＯ−Ｆおよび３８９ＥＬＯ−Ｒ１にそれぞれ対応する。
本明細書に引用する全ての特許、特許出願、および公報は、参照によってその全体を本明細書に援用する。これは具体的には、次の同一所有者の同時係属出願を含む。米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書、および米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書（以上２００４年５月６日出願）、米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書（２００４年６月１６日出願）、米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書（２００４年７月１日出願）、米国特許出願第１０／９８５１０９号明細書および米国特許出願第１０／９８５６９１号明細書（以上２００４年１１月１０日出願）、米国特許出願第１０／９８７５４８号明細書（２００４年１１月１２日出願）、米国特許出願第１１／０２４５４５号明細書および米国特許出願第１１／０２４５４４号明細書（以上２００４年１２月２９日出願）、米国特許出願第１１／１６６９９３号明細書（２００５年６月２４日出願）、米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日出願）、米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書（２００５年７月２０日出願）、米国特許出願第１１／１９０７５０号明細書（２００５年７月２７日出願）、米国特許出願第１１／１９８９７５号明細書（２００５年８月８日出願）、米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書（２００５年９月１３日出願）、米国特許出願第１１／２５１４６６号明細書（２００５年１０月１４日出願）、米国特許出願第１１／２５４１７３号明細書および米国特許出願第１１／２５３８８２号明細書（以上２００５年１０月１９日出願）、米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（以上２００５年１１月１日出願）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（２００５年１１月２日出願）、米国仮特許出願第６０／７３９９８９号明細書（２００５年１１月２３日出願）、米国仮特許出願第６０／７９５８１０号明細書（２００６年４月２８日出願）、米国仮特許出願第６０／７９３５７５号明細書（２００６年４月２０日出願）、米国仮特許出願第６０／７９６６３７号明細書（２００６年５月２日出願）、米国仮特許出願第６０／８０１１７２号明細書（２００６年５月１７日出願）、米国仮特許出願第６０／８０１１１９号明細書（２００６年５月１７日出願）、米国仮特許出願第６０／８５３５６３号明細書（２００６年１０月２３日出願）、米国仮特許出願第６０／８５５１７７号明細書（２００６年１０月３０日出願）。これはさらに次の同一所有者の同時係属出願を含む。植物中のＰＵＦＡ生成に関する米国特許出願第１０／７７６３１１号明細書、およびアネキシンプロモーターおよび植物中の導入遺伝子発現におけるそれらの使用に関する米国特許出願第１０／７７６８８９号明細書。
本発明は、新しいミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼ酵素、および同酵素をコードする遺伝子を提供し、それは健康的なＰＵＦＡ生成のための生化学的経路を操作するために使用されてもよい。
ここで開示される方法によって作られるＰＵＦＡまたはその誘導体は、食餌代用物、または栄養補給剤および乳児用調製粉乳として、そして静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては正常な使用において受容者が所望量の栄養補助を受け入れるように調合された調理油、脂肪またはマーガリン中に精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物を薬学的用途（ヒトまたは獣医学）のために使用してもよい。
定義
本開示の文脈では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
「発明」または「本発明」という用語は、ここでの用法では本発明の特定実施態様のいずれかに限定することは意図されず、一般に、特許請求の範囲および明細書で述べられる全てのあらゆる本発明の実施態様に適用される。
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）」対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の違いについてさらに詳しくは、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで規定される。
ここで脂肪酸は単純な表記体系「Ｘ：Ｙ」によって表され、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子の数であり、Ｙは二重結合の数である。脂肪酸名に続く数は脂肪酸のカルボキシル末端からの二重結合の位置を示し、接尾辞「ｃ」は二重結合のｃｉｓ−配置を示す［例えばパルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１、９ｃ）、ペトロセリン酸（１８：１、６ｃ）、ＬＡ（１８：２、９ｃ，１２ｃ）、ＧＬＡ（１８：３、６ｃ，９ｃ，１２ｃ）、およびＡＬＡ（１８：３、９ｃ，１２ｃ，１５ｃ）］。特に断りのない限り１８：１、１８：２、および１８：３は、オレイン酸、ＬＡ、およびＡＬＡ脂肪酸を指す。特に断りのない限り、二重結合はｃｉｓ配置にあると想定される。例えば１８：２（９，１２）の二重結合はｃｉｓ配置にあると想定される。
本開示においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表３に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本明細書の残り全体で使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
「必須脂肪酸」という用語は、生物が特定の必須脂肪酸を新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できず、生存のために経口摂取しなくてはならならない特定のＰＵＦＡを指す。例えば哺乳類は、必須脂肪酸ＬＡを合成できない。その他の必須脂肪酸としては、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
「脂肪」という用語は、２５℃で固形で、通常飽和である脂質物質を指す。
「油」という用語は、２５℃で液体で、通常多価不飽和である脂質物質を指す。ＰＵＦＡは、ある種の藻類、油性酵母菌、および糸状菌の油中に見られる。「微生物油」または「単細胞油」とは、微生物がそれらの生涯において天然に産生する油である。
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子にエステル化される３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞中でのＴＡＧ合成を指す。
「総脂質および油画分中のパーセント（％）ＰＵＦＡ」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質（すなわち中性および極性）の合計を指すので、ホスファチジルコリン（ＰＣ）画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本明細書全体で同義的に使用される。
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って評価される。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００。式中、「生成物」には、直接生成物およびそれに由来する経路中の全生成物が含まれる。
代謝経路または生合成経路は、生化学的意味において、細胞内で起きて酵素によって触媒され、細胞によって使用されまたは保存される代謝産物の形成、または別の代謝経路の開始（流束発生ステップと称される）のどちらかを達成する一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑であり、開始物質を所望の正確な化学構造を有する生成物に成形する段階を追った改変を伴う。
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡに転換する代謝過程を指す。この過程は、文献で詳しく述べられる（例えば国際公開第２００５／００３３２２号パンフレット、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。簡単に述べると、この過程は、小胞体膜中に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素（すなわち「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」）による、炭素原子の添加を通じた炭素鎖延長、および二重結合付加を通じた分子不飽和化を伴う。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼをはじめとする、ＰＵＦＡ生合成に関与するいずれかの酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が、共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。
「機能性」という用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、全てのＰＵＦＡ生合成経路酵素遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、長鎖ＰＵＦＡ生成のための生合成経路を指す。この経路は少なくともΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼを含んでなり、それによってそれぞれＬＡおよびＡＬＡからのＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの生合成を可能にする。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ発現に伴って、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されてもよい。この経路は、ＧＬＡおよび／またはＳＴＡの生合成が排除されることから、実施態様によっては有利かもしれない。
「中間体脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路中で生成されて、その他の代謝経路酵素の作用によって、この経路中で意図される脂肪酸生成物にさらに転換できるあらゆる脂肪酸を指す。例えばΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用してＥＰＡを生成する場合、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、およびＡＲＡが生成でき、これらの脂肪酸はその他の代謝経路酵素の作用によってＥＰＡにさらに転換できることから、「中間体脂肪酸」と見なされる。
「副産物脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路中で生成する、経路の意図される脂肪酸生成物または経路の「中間体脂肪酸」でないあらゆる脂肪酸を指す。例えばΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用してＥＰＡを生成する場合、それぞれＥＤＡまたはＥＴｒＡのどちらかに対するΔ５デサチュラーゼの作用によって、シアドン酸（ＳＣＩ）およびジュニペロン酸（ｊｕｎｉｐｅｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＪＵＰ）もまた生成できる。これらはいずれもその他の代謝経路酵素の作用によってＥＰＡにさらに転換されないことから「副産物脂肪酸」と見なされる。
「デサチュラーゼ」とは、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドである。特定の脂肪酸を指すために、本明細書全体を通じたω参照システムの使用にもかかわらず、デルタ・システムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。対象とするデサチュラーゼとしては、（１）分子のカルボキシル末端から数えて８および９番めの炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、例えばＥＤＡからＤＧＬＡへのおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒できるΔ８デサチュラーゼ、（２）ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、（３）ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、（４）ＤＰＡからＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、（５）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、（６）ＬＡからＡＬＡへのおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、（７）ＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、および（８）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）へのおよび／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野でΔ１５およびΔ１７デサチュラーゼは、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に転換する（例えばＬＡをＡＬＡに、ＡＲＡをＥＰＡにそれぞれ変換する）それらの能力に基づいて、「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称されることもある。いくつかの実施態様では、適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定し、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましい。
ここでの目的では、「ＥｇＤ８」という用語は、ここで配列番号６０によってコードされるミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるΔ８デサチュラーゼ酵素（配列番号６１）を指す。ＥｇＤ８は、国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット［米国特許出願公開第２００５−０２８７６５２−Ａ１号明細書の配列番号２］で述べられるように、「Ｅｇ５」と１００％同一であり機能的に等しい。
同様に「ＥｇＤ８Ｓ」という用語は、ここでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されたミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の合成Δ８デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号６８および６９）。ＥｇＤ８Ｓは、国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレットで述べられるように、「Ｄ８ＳＦ」と１００％同一であり機能的に等しい。
「エロンガーゼ系」と言う用語は、エロンガーゼ系が作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い脂肪酸を生成する、脂肪酸炭素鎖の伸長に関与する４つの酵素の一揃いを指す。より具体的にはこの延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と共同して起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１〜２９２頁（１９９６年））。基質特異性であり、また律速でもあることが分かった第１のステップでは、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、二酸化炭素（ＣＯ２）およびβ−ケトアシル−ＣｏＡを生じる（アシル部分が炭素原子２個分伸長される）。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへの、ＳＴＡからＥＴＡへの、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
ここでの目的では、第１の縮合反応（すなわちマロニル−ＣｏＡのβ−ケトアシル−ＣｏＡへの変換）を触媒する酵素を総称的に「エロンガーゼ」と称する。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん幅広いが、鎖長および不飽和の程度の双方によって区別する。したがってエロンガーゼは異なる特異性を有することができる。例えばＣ１４／１６エロンガーゼは、Ｃ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ１８／２０エロンガーゼ（用語が同義的に使用できるようにΔ６エロンガーゼとしても知られている）はＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質（例えばＥＰＡ）を利用する。同様にここで特に興味深い「Δ９エロンガーゼ」は、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換をそれぞれ触媒できる。いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有するため、単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれないことに留意することが重要である。したがって例えばΔ９エロンガーゼはまた、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼとして作用してもよく、好ましくはないが、それぞれＥＰＡおよび／またはＧＬＡなどのΔ５およびΔ６脂肪酸に対する代案の特異性を有してもよい。好ましい実施態様では、適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼの遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定し、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが望ましい。
ここでの目的では、「ＥｇＤ９ｅ」という用語は、配列番号１によってコードされる、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されたΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号２）を指す。対照的に「ＥｇＤ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の合成Δ９エロンガーゼを指す（すなわち配列番号３および２）。
「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」という用語は、配列番号４によってコードされる、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９から単離されたΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号５）を指す。対照的に「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９由来の合成Δ９エロンガーゼを指す（すなわち配列番号６および５）。
「ＩｇＤ９ｅ」という用語は、配列番号７によってコードされる、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）から単離されたΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号８；ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６［ＧＩ １７２２６１２３］、遺伝子座ＡＡＬ３７６２６、ＣＤＳ ＡＦ３９０１７４；ジェンバンク登録番号ＡＦ３９０１７４）を指す。対照的に「ＩｇＤ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）由来の合成Δ９エロンガーゼを指す（すなわち配列番号９および８）。ＩｇＤ９ｅＳの合成および機能解析については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで述べられる（ＩｇＤ９ｅＳはその中の配列番号５１および５０に等しい）。
「アミノ酸」と言う用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。アミノ酸は、参照によってここに援用するＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３：３０２１〜３０３０頁（１９８５年）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２１９（２）：３４５〜３７３頁（１９８４年）で述べられるＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に準拠して定義されるように、アミノ酸のための１文字コードまたは３文字コードのどちらかによって同定される。
「保存的アミノ酸置換」という用語はタンパク質の化学または機能的性質を変更しない、特定タンパク質中のアミノ酸残基の別のアミノ酸による置換を指す。例えば特定部位に化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす（が、コードされる折りたたまれたタンパクの構造的および機能的特性に影響しない）遺伝子の変更が一般的であることは、当該技術分野でよく知られている。本発明の目的で、「保存的アミノ酸置換」は、次の５群の１つの中の交換と定義される。
１．小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（Ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）、
２．極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］、
３．極性、正に帯電した残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］、
４．大型脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）、および、
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］。
保存的アミノ酸置換は、一般に次を維持する。１．）置換領域内のポリペプチド主鎖の構造、２．）標的部位の分子電荷または疎水性、または３．）側鎖の嵩。さらに多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更は、タンパク質活性を変更することが予期されない。
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、一般にタンパク質特性における最大変化を生じることが予期されるアミノ酸置換を指す。したがって例えば非保存的アミノ酸置換は、１．）親水性残基が／で疎水性残基で／が置換される（例えばＳｅｒまたはＴｈｒが／でＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌで／が置換される）、２．）ＣｙｓまたはＰｒｏが／であらゆるその他の残基で／が置換される、３．）陽性電荷側鎖を有する残基が／で陰性電荷を有する残基で／が置換される（例えばＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓが／でＡｓｐまたはＧｌｕで／が置換される）、または４．）嵩高い側鎖を有する残基が／で嵩高い側鎖を有さないもので／が置換される（例えばＰｈｅが／でＧｌｙで／が置換される）ものである。時に５群の２つの間の非保存的アミノ酸置換は、コードされたタンパク質の活性に影響しない。
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離された核酸断片」という用語は、ここで区別なく使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を場合により含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１個もしくはそれ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸塩形態で存在する）は、次のような一文字記号によって言及される。アデニレートまたはデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）を示す「Ａ」、シチジレートまたはデオキシシチジレートを示す「Ｃ」、グアニレートまたはデオキシグアニレートを示す「Ｇ」、ウリジレートを示す「Ｕ」、デオキシチミジレートを示す「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）を示す「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）を示す「Ｙ」、ＧまたはＴを示す「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴを示す「Ｈ」、イノシンの「Ｉ」、およびあらゆるヌクレオチドを示す「Ｎ」。
「機能的同等物である細断片」および「機能的同等物細断片」という用語は、ここで区別なく使用される。これらの用語は、その中で断片または細断片が活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変更するまたは特定の表現型を生成する能力が保持される、単離された核酸断片の部分またはサブ配列を指す。例えば断片または細断片をキメラ遺伝子のデザインで使用して、形質転換された植物において所望の表現型を生成できる。それが活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物プロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向で核酸断片またはその細断片を結合することにより、キメラ遺伝子を抑制において使用するためにデザインできる。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置において保存されたアミノ酸の組を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同的なタンパク質間で異なることができるのに対し、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列におけるそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新たに判定された配列のタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判別するための識別子、または「シグネチャ」として使用できる。ここでの目的のために、次の表でΔ９エロンガーゼ活性を有するタンパク質の指標となる本発明のモチーフについて述べる。
「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」、および「実質的に相当する」という用語は、ここで区別なく使用される。これらは、その中において１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の変更も指す。したがって当業者によって理解されるように、本発明は具体的な例示的配列を超えるものを包含する。
さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した核酸配列が、中程度にストリンジェントな条件下（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）において、ここで例示される配列と、またはここで開示される核酸配列のいずれかの機能的同等物であるここで開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によってもまた定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件を調節して、遠縁の生物体からの相同的配列などの中程度に類似した断片から、近縁の生物体からの機能性酵素を複製する遺伝子などの高度に類似した断片までをスクリーンすることができる。ハイブリダイズ後洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、その非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に大きい（例えば少なくとも背景の２倍）規定の核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的排除を指す。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的に互いに少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％までの配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その下でプローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することで、プローブに１００％相補的な標的配列を同定できる（相同的プロービング）。代案としては、より低い類似性が検出されるように、ストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくつかのミスマッチを許すことができる（異種性プロービング）。一般にプローブは、約１０００ヌクレオチド未満の長さであり、場合により５００ヌクレオチド未満の長さである。典型的にストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．５ＭのＮａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（またはその他の塩）濃度のものであり、温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）で少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液溶液でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。例示的な中度のストリンジェンシー条件としては、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。その他の例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
特異性は、典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔｍは、メインコス（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：２６７〜２８４頁（１９８４年）の式、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似でき、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下における）温度である。Ｔｍは、１％のミスマッチあたり約１℃低下するので、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節して、所望の同一性がある配列にハイブリダイズさせることができる。例えば≧９０％同一の配列を求める場合、Ｔｍを１０℃低下できる。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかし厳しくストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、中度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、低ストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。数式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が、固有に述べられることを理解するであろう。所望のミスマッチ程度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、チジュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、「生化学および分子生物学における実験室技法−核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」、第１部、第２章、「ハイブリダイゼーション原理および核酸プローブアッセイストラテジーの概説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ）」、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９３年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２章、グリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版、ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９５年）にある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用できる。
核酸またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ間で最大一致のために整列させると同じになる、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
したがって「配列同一性百分率」は、比較ウィンドウ間で最適に整列させた２つの配列を比較して判定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２配列の最適アラインメントのために、（付加または欠失を含まない）基準配列と比べて付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列内で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定して計算し、一致位置数を得て、一致する位置数を比較ウィンドウ内の総位置数で除して、結果に１００を乗じて同一性百分率を得る。有用な％配列同一性の例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの同一性は、ここで述べられるプログラムのいずれかを使用して判定できる。
アラインメントおよび％同一性または類似性計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲインコーポレーテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＤＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）プログラムをはじめとするが、これに限定されるものではない、相同的な配列を検出するようにデザインされた多様な比較法を使用して判定してもよい。本出願の文脈で、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、特に断りのない限り分析結果は言及プログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法で「デフォルト値」とは、開始時にソフトウェアにロードされるあらゆる値またはパラメーターの一揃いを意味する。
「クラスタルＶ法のアラインメント」は、クラスタルＶとラベルされるアラインメント法に対応し（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ），Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年）で述べられる）、レーザージーン（ＬＡＤＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）プログラム（前出）にある。多重整列化では、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。クラスタル法を使用した、ペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性計算のためのデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。クラスタルＶプログラムを使用したアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
「ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメント」は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するアルゴリズムである。
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者はよく理解している。有用な％同一性の例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。確かに本発明について述べるのに、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数のアミノ酸同一性が有用かもしれない。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的相補体も興味深い。
「ゲノム」という用語はそれが、植物細胞に対して適用される場合、核内に見られる染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えばミトコンドリア、色素体）中に見られる細胞小器官ＤＮＡを包含する。
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびコード配列に続く制御配列（３’非コード配列）を含む。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる方法で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「外来性」遺伝子とは、宿主生物に状態では見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
「対立遺伝子」とは、染色体上の特定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代案の形態の１つである。染色体上の特定の遺伝子座に存在する全ての対立遺伝子が同じである場合、その植物はその遺伝子座で同型接合性である。染色体上の特定遺伝子座に存在する対立遺伝子が異なる場合、その植物はその遺伝子座で異型接合性である。
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は次を含んでも良いが、これに限定されるものではない。プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造。
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流要素からなり、後者の要素はエンハンサーとして言及されることが多い。したがって「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターに固有の要素、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を向上させるために挿入される異種の要素であってもよい。プロモーターは全体が天然遺伝子に由来しても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、いくつかの変形例があるＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有するかもしれないこともさらに認識される。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプ中で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。植物細胞で有用な様々なタイプの新しいプロモーターが、絶えず発見されている。多数の例がオカムロ（Ｏｋａｍｕｒｏ），Ｊ．Ｋ．およびゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ），Ｒ．Ｂ．による編纂、「植物生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）」１５：１〜８２頁（１９８９年）にある。
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、転写一次産物のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響するかもしれない。翻訳リーダー配列の例については、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ），Ｒ．およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ），Ｇ．Ｄ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５〜２３６頁（１９９５年）で述べられている。
「３’非翻訳配列」、「転写ターミネーター」または「終結配列」と言う用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指し、これはｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。異なる３’非コード配列の使用は、インゲルブレヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ），Ｉ．Ｌ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１：６７１〜６８０頁（１９８９年）で例示される。
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称される。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列である場合、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成され、それに相補的なＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して二本鎖形態に転換できる。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞内または生体外でタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列にあってもよい。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されなくてもよいがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。「相補体」および「逆相補体」という用語は、ｍＲＮＡ転写物に関してここで同義的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを画定することを意図する。
「作動的に結合した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって制御されるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現を制御できる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはそのコード配列と作動的に結合する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡに５’で、または標的ｍＲＮＡに３’で、または標的ｍＲＮＡ内で、直接または間接的のどちらかで作動的に結合でき、または標的ｍＲＮＡに対して第１の相補的領域は５’でその相補体は３’である。
ここで使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野でよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）で述べられている。形質転換法は当業者によく知られており、下述する。
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は大量の特定ＤＮＡセグメント合成のための技術であり、一連の反復サイクルからなる（コネチカット州ノーウォークのパーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）））。典型的に二本鎖ＤＮＡは加熱変性され、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーが低温でアニールされ、次に中温で延長される。これらの３つの連続したステップの一組が「サイクル」と称される。
「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝的工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作による、２つのさもなければ分離した配列のセグメントの人工的組み合わせを指す。
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に結合または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「転換カセット」とは外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す（すなわちその中に核酸配列または断片を転移できる離散した核酸断片）。
「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組み換えＤＮＡコンストラクト」という用語は、ここで区別なく使用される。組み換えコンストラクトは、例えば自然には一緒に存在しない制御およびコード配列などの核酸断片の人工的組み合わせを含んでなる。例えばキメラコンストラクトは、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列、または同一源に由来するが自然に存在するのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。このようなコンストラクトはそれ自体で使用してもよく、またはベクターとの組み合わせで使用してもよい。ベクターが使用される場合、当業者によく知られているように、ベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターが使用できる。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質転換して選択し増殖させるために、ベクター上に存在すべき遺伝的要素を十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なる発現レベルおよびパターンをもたらし（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：２４１１〜２４１８頁（１９８５年）；デアルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１８：７８〜８６頁（１９８９年））、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す系列を得るために、複数事象がスクリーンされれば好ましいことも認識する。このようなスクリーニングは、例えばＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロット法分析、または表現型分析によって達成されてもよい。
「発現」という用語は、ここでの用法では、機能性最終生成物（例えば［前駆または成熟いずれかの］ｍＲＮＡまたはタンパク質）の生成を指す。
「導入する」という用語は、細胞内に核酸（例えば発現コンストラクト）またはタンパク質を提供することを意味する。導入するとは、核酸が細胞のゲノム中に組み込まれてもよい真核生物または原核生物細胞内への核酸の組み込みへの言及を含み、核酸またはタンパク質の細胞への一時的提供への言及を含む。導入するとは、安定したまたは一時的形質転換法、ならびに有性交配への言及を含む。したがって「導入する」とは、細胞内への核酸断片挿入（例えば組み換えＤＮＡコンストラクト／発現コンストラクト）の文脈において、「形質移入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核生物または原核生物細胞中への核酸断片組み込みへの言及を含み、そこでは核酸断片が細胞ゲノム（例えば染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）中に組み込まれて、自律性レプリコンに転換され、または一時的に発現されてもよい（例えば形質移入ｍＲＮＡ）。
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチドを指す（すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドがそれから除去されたもの）。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物を指す（すなわちプレまたはプロペプチドがなおも存在するもの）。プレまたはプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよいが、これに限定されるものではない。
「安定な形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、核およびオルガネラゲノムの双方を含む宿主生物体ゲノム中への核酸断片の転移を指す。対照的に「一過性形質転換」は、組み込みまたは安定な遺伝なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物体の核、またはＤＮＡ含有オルガネラ中への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物体は、「遺伝子導入」生物体と称される。
ここでの用法では「遺伝子導入」とは、そのゲノム中に異種のポリヌクレオチドを含んでなる植物または細胞を指す。好ましくは、異種のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが続く世代に受け継がれるように、ゲノム中に安定して組み込まれる。異種のポリヌクレオチドは、単独で、または発現コンストラクトの一部としてゲノム内に組み込まれてもよい。遺伝子導入はここで、最初にそのように改変された遺伝子導入、ならびに最初の遺伝子導入から有性交配または無性繁殖で作り出されたものを含め、その遺伝子型が異種の核酸の存在によって改変されている、あらゆる細胞、細胞系、カルス、組織、植物部分または植物を含めて使用される。「遺伝子導入」という用語は、ここでの用法では、従来の植物育種法による、またはランダム他家受精、非組み換えウイルス感染、非組み換え細菌性形質転換、非組み換え遺伝子転移、または突然変異などの天然事象によるゲノム改変（染色体または染色体外の）を包含しない。
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を指す。「コサプレッション」とは、同一のまたは実質的に類似の外来性または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。植物中のコサプレッションコンストラクトは、センス方向で、内在性ｍＲＮＡに対する相同性を有する核酸配列の過剰発現に注目することにより、以前にデザインされており、それは過剰発現される配列に対して相同性を有する全てのＲＮＡの減少をもたらす（ヴォーシェール（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６：６５１〜６５９頁（１９９８年）；およびグーラ（Ｇｕｒａ）、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：８０４〜８０８頁（２０００年））。この現象の全体的効率は低く、ＲＮＡ減少の程度は大きく異なる。より最近の研究は、発現されるＲＮＡのための潜在的な「ステム−ループ」構造をもたらす、相補的方向で配列をコードするｍＲＮＡの全部または一部を組み込んだ「ヘアピン」構造の使用について述べている（国際公開第９９／５３０５０号パンフレット；国際公開第０２／００９０４号パンフレット）。これは回収される遺伝子導入植物中のコサプレッションの頻度を増大させる。別の変形例は、配列をコードする近位ｍＲＮＡの抑制または「サイレンシング」を制御するための植物ウィルス配列の使用について述べる（国際公開第９８／３６０８３号パンフレット）。これらのコサプレッション現象のどちらも機構的には解明されていないが、遺伝的証拠がこの複雑な状況を解き明かし始めた（エルマヤン（Ｅｌｍａｙａｎ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７４７〜１７５７頁（１９９８年））。
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）、「菌・カビ脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ（１９８０年））。油性として同定される植物クラスは、一般に「油料種子」植物と称される。油料種子植物の例としては、ダイズ（グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）およびソヤ（Ｓｏｊａ）種）、亜麻（リーナス（Ｌｉｎｕｍ）種）、アブラナ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種）、トウモロコシ、綿、ベニバナ（カルタマス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）種）およびヒマワリ（ヘリアンタス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）種）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
これらの油性微生物細胞内で、細胞油またはＴＡＧ含量は一般にＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。
「油性酵母菌」と言う用語は、油を生成する酵母菌として分類される微生物を指す。油性微生物が、約２５％を超えるその乾燥細胞重量を油として蓄積するのは珍しくない。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
「ミドリムシ綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）」という用語は、淡水、海水、土壌および寄生性環境に生息する、一群の単細胞で無色または光合成鞭毛虫（「ユーグレナ属」）を指す。本綱は単生の単細胞によって特徴づけられ、大多数は自由遊泳性であり、レザバーとして知られている前側陥入から生える２本の鞭毛（その１本は出現していなくてもよい）を有する。光合成ユーグレナ属は１個から多数の葉緑体を含有し、それはミニディスクから幅広いプレートまたはリボンまで様々である。無色ユーグレナ属は栄養素同化作用のために、浸透栄養または摂食栄養に依存する。約１０００種について既述され、約４０の属および６の目に分類されている。ミドリムシ綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）の例としては、次の属が挙げられるが、これに限定されるものではない。ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、およびテトルエトレプチア（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ）。
「植物」という用語は、植物全体、植物器管、植物組織、種子、植物細胞、種子とその子孫を指す。植物細胞としては、種子からの細胞、懸濁液培養、胚芽、成長点領域、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「子孫」は、植物のあらゆる引き続く世代を含んでなる。
概説：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成をもたらすこのプロセスについては、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで詳細に述べられる。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）アシルトランスフェラーゼによる１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２．）アシルトランスフェラーゼによる第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じ、３．）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じ、４．）アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。
オメガ脂肪酸の生合成
オレイン酸が長鎖ω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下で述べられるように、特定ω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
具体的には、全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによる、オレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるＬＡへの最初の変換を必要とする。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」を使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のようにして形成される。（１）Δ９エロンガーゼによってＬＡがＥＤＡに転換され、（２）Δ８デサチュラーゼによってＥＤＡがＤＧＬＡに転換され、３）Δ５デサチュラーゼによってＤＧＬＡがＡＲＡに転換される。代案としては次のようにして、長鎖ω−３脂肪酸形成のために「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」を利用することができる。（１）Δ１５デサチュラーゼによってＬＡが第１のω−３脂肪酸であるＡＬＡに転換され、（２）Δ９エロンガーゼによってＡＬＡがＥＴｒＡに転換され、（３）Δ８デサチュラーゼによってＥＴｒＡがＥＴＡに転換され、（４）Δ５デサチュラーゼによってＥＴＡがＥＰＡに転換され、（５）Ｃ２０／２２エロンガーゼによってＥＰＡがＤＰＡに転換され、（６）Δ４デサチュラーゼによってＤＰＡがＤＨＡに転換される。場合により、ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に転換されてもよい。例えばΔ１７デサチュラーゼ活性によって、ＥＴＡおよびＥＰＡがそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
ω−３／ω−６脂肪酸生合成のための代案の経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼを利用する（すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」）。より具体的には、Δ６デサチュラーゼによってＬＡおよびＡＬＡをそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡに転換し、次にＣ１８／２０エロンガーゼによってＧＬＡをＤＧＬＡに、および／またはＳＴＡをＥＴＡに転換してもよい。
ω−３／ω−６脂肪酸の生成のために特定の宿主生物中に導入することが必要とされる特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。例えばΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路によって生成されるＰＵＦＡはＧＬＡを欠いているので、いくつかの実施態様では、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現とは反対に、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現が好ましいかもしれない。
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、菌・カビ、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、および／または４．）ポリペプチドが必要とする補助因子。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する（より詳しくは国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットを参照されたい）。
追加的実施態様では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって所望の脂肪酸生合成を最適化するのに際し、各酵素の変換効率の考慮もまた有益であり、生成物の最終所望脂質プロフィールの観点から考慮しなくてはならない。
上のそれぞれの考慮を念頭に、公的に入手可能な文献（例えばジェンバンク）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは増強するのに適する。
新しいΔ９エロンガーゼの配列同定
本発明では、Δ９エロンガーゼをコードするヌクレオチド配列が、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ここで「ＥｇＤ９ｅ」と称する）、およびユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９（ここで「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」と称する）から単離されている。
ＥｇＤ９ｅヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公共データベースとの比較からは、最も類似した既知の配列（すなわちＩｇＤ９ｅ）が、ここで報告されるクラスタルＶ分析を使用した２５８のアミノ酸長にわたるＥｇＤ９ｅのアミノ酸配列と、約３１．８％同一であることが明らかにされる。
Ｅ３８９Ｄ９ｅヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公共データベースとの比較からは、最も類似した既知の配列（すなわちＩｇＤ９ｅ）が、ここで報告されるクラスタルＶ分析を使用した２６３のアミノ酸長にわたるＥ３８９Ｄ９ｅのアミノ酸配列と、約３３．１％同一であることが明らかにされる。
参考までに、クラスタルＶ分析を使用したここで配列番号２および配列番号５で記載される新しいＥｇＤ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅタンパク質配列の比較は、６５．１％の同一性を示す。
本発明の文脈で、好ましいアミノ酸断片は、ここでＥｇＤ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅ配列と少なくとも約７０％〜８５％同一であり、少なくとも約８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。本ＯＲＦに対応する好ましいＥｇＤ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅをコードする核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、それぞれここで報告されるＥｇＤ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅ核酸配列と少なくとも約７０％〜８５％同一であり、少なくとも８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。
代案の実施態様では、本ＥｇＤ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅ配列は、特定の宿主生物中での発現のためにコドン最適化できる。当該技術分野でよく知られているように、宿主が好むコドンの使用はポリペプチドをコードする異質遺伝子の発現を実質的に増強できるので、これは代案の宿主中の酵素発現をさらに最適化する有用な手段であることができる。一般に宿主が好むコドンは、タンパク質（好ましくは最大量で発現するもの）中でのコドン使用を調べ、どのコドンが最高頻度で使用されるかを判定することにより、対象とする特定の宿主種内で判定できる。次に宿主種で好まれるコドンを使用して、エロンガーゼ作用を有する対象とするポリペプチドのコード配列を全部または部分的に合成できる。ＤＮＡの全部（または一部）はまた、転写ｍＲＮＡ中に存在するあらゆる不安定化配列または二次構造領域を除去するように合成できる。ＤＮＡの全部（または一部）はまた、塩基組成を所望の宿主細胞中でより好まれるものに改変されるように合成できる。
好ましい本発明の一実施態様では、ＥｇＤ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された。これは、最初にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロフィールを判定し（国際公開第０４／１０１７５７号パンフレット参照）、好まれるコドンを同定することで可能であった。さらに「ＡＴＧ」開始コドン周辺の共通配列を判定して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での遺伝子発現の最適化を達成した。
ＥｇＤ９ｅの最適化は、７７７ｂｐのコード領域の１１７ｂｐ（１５．１％）の改変、および１０６コドンの最適化をもたらした。コドン最適化された遺伝子（「ＥｇＤ９ｅＳ」、配列番号３）のいずれの改変もタンパク質をコードするアミノ酸配列（配列番号２）を変化させなかった。実施例８で述べられるように、コドン最適化された遺伝子をＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現すると、ＬＡのＥＤＡへの延長において、野生型ＥｇＤ９ｅ遺伝子よりも約１６．２％効率的であった。
同様にＥ３８９Ｄ９ｅの最適化は、７９２ｂｐコード領域の１２８ｂｐの改変（１６．２％）および１１３コドンの最適化をもたらした。コドン最適化された遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」、配列番号６）のいずれの改変もタンパク質をコードするアミノ酸配列（配列番号５）を変化させなかった。実施例２４で述べられるように、コドン最適化された遺伝子をＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現すると、野生型遺伝子と同様の効率でＬＡをＥＤＡに延長した。
したがって本発明は、
（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２（ＥｇＤ９ｅ）または配列番号５（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて配列番号１（ＥｇＤ９ｅ）、配列番号３（ＥｇＤ９ｅＳ）、配列番号４（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）または配列番号６（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）で記載されるヌクレオチド配列と比べると少なくとも７０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１（ＥｇＤ９ｅ）、配列番号３（ＥｇＤ９ｅＳ）、配列番号４（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）または配列番号６（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなりそれと１００％相補的である、前記ヌクレオチド配列の相補体
よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列に関する。
当業者はここでの教示を使用して、野生型ＥｇＤ９ｅおよび／またはＥ３８９Ｄ９ｅ配列に基づいて、代案の宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）以外の）中での最適発現に適した、様々なその他のコドン最適化Δ９エロンガーゼタンパク質を作り出すことができる。この代案の宿主生物としては、植物または植物部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。したがって本発明は、野生型ＥｇＤ９ｅ（すなわち配列番号２によってコードされる）または野生型Ｅ３８９Ｄ９ｅ（すなわち配列番号５によってコードされる）のどちらかに由来する、あらゆるコドン最適化Δ９エロンガーゼタンパク質に関する。これとしては、どちらもヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、配列番号３で記載されるヌクレオチド配列（合成Δ９エロンガーゼタンパク質をコードする（すなわちＥｇＤ９ｅＳ））および配列番号６で記載されるヌクレオチド配列（合成Δ９エロンガーゼタンパク質をコードする（すなわちＥ３８９Ｄ９ｅＳ））が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の態様では、本発明は、配列番号８（すなわち「ＩｇＤ９ｅ」、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）からのΔ９エロンガーゼ（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ １７２２６１２３））を除く、Δ９エロンガーゼをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸断片に関し、前記Δ９エロンガーゼを含んでなるアミノ酸配列は、次よりなる群から選択される、アミノ酸配列モチーフの少なくとも１つを含有する。
ａ）Ｙ Ｎ Ｘ（ＬまたはＦ）Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｓ Ｘ Ｘ Ｓ Ｆ（配列番号１２３）、
ｂ）Ｆ Ｙ Ｘ Ｓ Ｋ Ｘ Ｘ（ＥまたはＤ）Ｙ Ｘ Ｄ（ＴまたはＳ）Ｘ Ｘ Ｌ（配列番号１２４）、
ｃ）Ｌ（ＱまたはＨ）Ｘ Ｆ Ｈ Ｈ Ｘ Ｇ Ａ（配列番号１２５）、
ｄ）Ｍ Ｙ Ｘ Ｙ Ｙ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ（ＫまたはＲまたはＮ）Ｆ（配列番号１２６）、
ｅ）Ｋ Ｘ Ｌ（ＩまたはＬまたはＭ）Ｔ Ｘ Ｘ Ｑ（配列番号１２７）、
ｆ）Ｗ Ｘ Ｆ Ｎ Ｙ Ｘ Ｙ（配列番号１２８）、および
ｇ）Ｙ Ｘ Ｇ Ｘ Ｖ Ｘ Ｘ Ｌ Ｆ（配列番号１２９）。
ここでＸは、いかなるアミノ酸でもあることができる。
下線付きアミノ酸はΔ９エロンガーゼに特有かもしれない。図２は、クラスタルＶアラインメント（デフォルトパラメーターによる）を使用した、本発明のΔ９エロンガーゼとイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）からのΔ９エロンガーゼとの比較を記載する。具体的には配列番号２（ＥｇＤ９ｅ）、配列番号５（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）、および配列番号８（ＩｇＤ９ｅ）を比較した。本発明のモチーフを含んでなる領域はボックス中に示す。
相同体の同定および単離
配列分析ソフトウェアを使用して、本エロンガーゼ配列（すなわちＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）またはその部分のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、菌・カビ、ユーグレナ属または植物種中で、Δ９エロンガーゼ相同体を検索してよい。一般には、このようなコンピューターソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の改変に相同性の程度を割り当てて同様の配列をマッチする。
代案としてはΔ９エロンガーゼ相同体の同定のために、本エロンガーゼ配列またはその部分のいずれかをハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象とする遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよいが、典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
ハイブリダイゼーション法については、良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい（塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウム）。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加できる。
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）核酸ＤＮＡ断片、および場合により約０．５〜２％重量／体積のグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えば硫酸デキストランなどの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
さらに別の実施態様では、ここで述べられるΔ９エロンガーゼ核酸断片（または同定されたそのあらゆる相同体）のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、菌・カビ、ユーグレナ属または植物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書のポリメラーゼ連鎖反）（ＰＣＲ）；タボール（Ｔａｂｏｒ），Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、１０７４頁（１９８５年）のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；または（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、３９２頁（１９９２年）の連鎖置換増幅（ＳＤＡ）］、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
例えば本明細書で述べるΔ９エロンガーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、例えばあらゆる所望の酵母菌または菌・カビからライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（ＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを産生する生物が好ましい）。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は当該技術分野で一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、「ヒトにおける遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」よりテイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「遺伝的障害診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」（１９８６年）３３〜５０頁、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりライクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ），Ｗ．、「ＰＣＲプロトコール：最近の方法と応用（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１９９３年）第１５巻、３１〜３９頁、ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）：ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
一般に本配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。またクローンされた核酸断片ライブラリーに対して、１つのプライマーの配列が本核酸断片に由来し、別のプライマーの配列が真核生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する、ＰＣＲを実施してもよい。
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８頁（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、本配列からデザインできる。メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））から市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステムを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３頁（１９８９年）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７頁（１９８９年））。
別の実施態様では、新しい改善された脂肪酸エロンガーゼを作り出すために、ここで述べられるいずれのΔ９エロンガーゼ核酸断片（または同定されるそのいずれの相同体）を使用してもよい。当該技術分野でよく知られているように、生体外変異誘発および選択、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を使用して、天然のエロンガーゼ遺伝子の突然変異を得ることができる（このような突然変異は、欠失、挿入、および点突然変異またはそれらの組み合わせを含んでもよい）。これはそれぞれ、生体内において、所望のＰＵＦＡのより長い半減期またはより高い生成速度などの宿主細胞中での機能により望ましい物理的および動力学的パラメーターがある、エロンガーゼ活性を有するポリペプチドの生成を可能にする。または必要に応じて、酵素的活性に重要な対象とするポリペプチドの領域（すなわちΔ９エロンガーゼ）は、日常的変異誘発、得られた突然変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の判定を通じて判定できる。これらの技術の概要については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられる。ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ、およびＥ３８９Ｄ９ｅＳ由来のこのような全ての突然変異タンパク質、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
代案としては改善された脂肪酸がドメイン交換によって合成されてもよく、そこではここで述べられるΔ９エロンガーゼ核酸断片のいずれかからの機能性ドメインが代案のエロンガーゼ遺伝子中の機能性ドメインと交換され、それによって新しいタンパク質がもたらされる。
様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成のための方法
適切なプロモーターの制御下における、ここで述べられるΔ９エロンガーゼをコードするキメラ遺伝子（すなわちＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳまたはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）の導入は、それぞれ形質転換された宿主生物中でのＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡ生成の増大をもたらすことが予期される。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡ）に転換されるように、脂肪酸基質（すなわちＬＡおよび／またはＡＬＡ）をここで述べられるエロンガーゼ酵素（例えばＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）に曝露することを含んでなる、ＰＵＦＡ生成に向けた方法を包含する。
より具体的には、本発明の目的は、
ａ）（１）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２（ＥｇＤ９ｅ）または配列番号５（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（２）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１（ＥｇＤ９ｅ）、配列番号３（ＥｇＤ９ｅＳ）、配列番号４（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）または配列番号６（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
ｂ）ＬＡ源
を含んでなる、宿主細胞（例えば油性酵母、ダイズ）中でのＥＤＡの生成方法を提供することであり、
宿主細胞はΔ９エロンガーゼが発現され、ＬＡがＥＤＡに転換されるような条件下で生育され、ＥＤＡは場合により回収される。
本発明の代案の実施態様では、Δ９エロンガーゼは、ＡＬＡのＥＴｒＡへの変換のために使用されてもよい。したがって本発明は、ＥＴｒＡの生成方法を提供し、宿主細胞は、
ａ）（１）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２（ＥｇＤ９ｅ）または配列番号５（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
（２）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列が配列番号１（ＥｇＤ９ｅ）、配列番号３（ＥｇＤ９ｅＳ）、配列番号４（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）または配列番号６（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
ｂ）ＡＬＡ源
を含んでなり、
宿主細胞はΔ９エロンガーゼが発現され、ＡＬＡがＥＴｒＡに転換されるような条件下で生育され、ＥＴｒＡは場合により回収される。
代案としては、ここで述べられる各Δ９エロンガーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物は、間接的に例えばＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡをはじめとする様々なω−６およびω−３ＰＵＦＡの生成のために使用できる（図１、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット参照）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生成は、中間体ステップまたは経路中間体の手段を通じて、脂肪酸基質が間接的に所望の脂肪酸生成物に転換されて起きる。したがってここで述べられるΔ９エロンガーゼ（例えばＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳまたはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはそれらの相同体）をＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と併せて発現して、より高いレベルのより鎖長の長いω−３／ω−６脂肪酸（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）の生成をもたらしてもよいことが考察された。
好ましい実施態様では、本発明のΔ９エロンガーゼは、最低限Δ８デサチュラーゼ（例えば配列番号６１で記載されるΔ８デサチュラーゼ［ＥｇＤ８］または配列番号６９で記載されるコドン最適化Δ８デサチュラーゼ［ＥｇＤ８Ｓ］）と併せて発現される。しかし特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望の最終産物に左右される。
代案の実施態様では、ここで述べられる完全な配列、これらの完全な配列の相補体、これらの配列のかなりの部分、それに由来するコドン最適化エロンガーゼ、およびそれらと実質的に相同的な配列に基づいて、宿主生物の天然Δ９エロンガーゼを中断することが有用かもしれない。
植物発現系、カセットとベクター、および形質転換
一実施態様では、本発明は、植物中での発現に適した少なくとも１つの制御配列と作動的に結合した、本発明のΔ９エロンガーゼポリヌクレオチドのいずれか１つを含んでなる組み換えコンストラクトに関する。
プロモーターは、プロモーター下流（３’）の近接するコード配列からＲＮＡを生成するように植物細胞機構に指示するＤＮＡ配列である。プロモーター領域は、その中で遺伝子のＲＮＡ転写物が作られる速度、発達段階、および細胞タイプに影響する。ＲＮＡ転写物は処理されてｍＲＮＡを生成し、それはコードされたポリペプチドのアミノ酸配列にＲＮＡ配列を翻訳するテンプレートの役割を果たす。５’非翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの開始および翻訳で役割を果たしてもよい、タンパク質コード領域上流のｍＲＮＡの領域である。３’転写終結／ポリアデニル化シグナルは、植物細胞中で機能してＲＮＡ転写物およびＲＮＡ３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチド付加の終結を引き起こす、タンパク質コード領域下流の非翻訳領域である。
適切な時点で所望の宿主組織において所望の核酸断片をコードする翻訳可能ｍＲＮＡを発現することで、本発明を達成するのに十分な転写活性を有しさえすれば、Δ９エロンガーゼコード配列の発現を進めるために選択されるプロモーターの起源は重要でない。異種のまたは非異種の（すなわち内在性）プロモーターのいずれかが本発明を実施するのに使用できる。例えば適切なプロモーターとしては、β−コングリシニンプロモーターのα−プライムサブユニット、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）トリプシン阻害剤３プロモーター、アネキシンプロモーター、Ｇｌｙ１プロモーター、β−コングリシニンプロモーターのβ−サブユニット、Ｐ３４／ＧｌｙＢｄ ｍ ３０Ｋプロモーター、アルブミンプロモーター、Ｌｅｇ Ａ１プロモーターおよびＬｅｇ Ａ２プロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。
アネキシンまたはＰ３４プロモーターについては、国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレット（２００４年８月２６日公開）で述べられる。アネキシンプロモーターの活性レベルは、次のようなの多くの既知の強力なプロモーターに匹敵する。（１）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（アタナソバ（Ａｔａｎａｓｓｏｖａ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：２７５〜２８５頁（１９９８年）；バトロー（Ｂａｔｔｒａｗ）およびホール（Ｈａｌｌ）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５２７〜５３８頁（１９９０年）；ホルトロフ（Ｈｏｌｔｏｒｆ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７〜６４６頁（１９９５年）；ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１〜３９０７頁（１９８７年）；ウィルミンク（Ｗｉｌｍｉｎｋ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：９４９〜９５５頁（１９９５年）、（２）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）オレオシンプロモーター（プラント（Ｐｌａｎｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３〜２０５頁（１９９４年）；リ（Ｌｉ）、テキサスＡ ＆ Ｍ大学博士論文、１０７〜１２８頁（１９９７年））、（３）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン延長タンパク質プロモーター（カリス（Ｃａｌｌｉｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５（２１）：１２４８６〜９３頁（１９９０年）、（４）トマトユビキチン遺伝子プロモーター（ロールフィンケ（Ｒｏｌｌｆｉｎｋｅ）ら、Ｇｅｎｅ、２１１（２）：２６７〜７６頁（１９９８年）、（５）ダイズ熱ショックタンパク質プロモーター（ショフル（Ｓｃｈｏｆｆｌ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１７（２−３）：２４６〜５３頁（１９８９年））、および（６）トウモロコシＨ３ヒストン遺伝子プロモーター（アタナソバ（Ａｔａｎａｓｓｏｖａ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７（２）：２７５〜８５頁（１９９８年））。
アネキシンプロモーターの別の有用な特色は、発達中の種子におけるその発現プロフィールである。本発明のアネキシンプロモーターは、初期段階（受粉の１０日後以前）の発達中の種子において最も活性であり、後期にはほとんど静止する。アネキシンプロモーターの発現プロフィールは、例えば発達後期に最高活性を提供することが多い種子貯蔵タンパク質プロモーターなどの多くの種子特異的プロモーターのそれとは異なる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２〜１２２頁（１９８９年）；エルマーソン（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０１９〜１０２７頁（１９９６年）；ケディ（Ｋｅｄｄｉｅ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３２７〜３４０頁（１９９４年）；プラント（Ｐｌａｎｔ）ら、前出）；リ（Ｌｉ）、前出）。アネキシンプロモーターはより従来型の発現プロフィールを有するが、その他の知られている種子特異的プロモーターとは、なおも相異なる。したがってアネキシンプロモーターは、初期発達段階において胚芽中の遺伝子の過剰発現または抑制が所望される場合、非常に魅力的な候補であろう。例えば初期胚芽発達を制御する遺伝子、または種子成熟に先だって代謝に関与する遺伝子を過剰発現することが望ましいかもしれない。
特定のΔ９エロンガーゼコード配列の発現に適した適切なプロモーターの同定に続いて、次にプロモーターは当業者によく知られている従来の手段を使用して、センス方向で作動的に結合される。
実施例で使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で良く知られておりサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」；第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９８９年）（以下「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９年）」）；またはオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．、ブレント（Ｂｒｅｎｔ），Ｒ．、キングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ），Ｒ．Ｅ．、ムーア（Ｍｏｏｒｅ），Ｄ．Ｄ．、シードマン（Ｓｅｉｄｍａｎ），Ｊ．Ｇ．、スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｊ．Ａ．、およびスツール（Ｓｔｒｕｈｌ），Ｋ．編、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」；ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）：ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９０年）（以下「オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、（１９９０年）」）でより詳しく述べられている。
ひとたび組み換えコンストラクトが生成すると、次にそれを当業者によく知られている方法（例えば形質移入、形質転換、および電気穿孔）によって、選択された植物細胞に導入してもよい。油料種子植物細胞が好ましい植物細胞である。次に形質転換された植物細胞を長鎖ＰＵＦＡの発現を可能にする適切な条件下で培養して再生し、次にそれを場合により回収して精製する。
本発明の組み換えコンストラクトを１個の植物細胞中に導入してもよく、または代案としては各コンストラクトを別々の植物細胞に導入してもよい。
植物細胞中における発現は、上述のように一過性または安定な様式で達成してもよい。
所望の長鎖ＰＵＦＡは種子内で発現できる。またこのような形質転換された植物から得られる種子または植物部分も本発明の範囲内である。
植物部分は、次をはじめとするが、これに限定されるものではない分化および未分化組織を含む。根、茎、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（単細胞、プロトプラスト、胚芽、および、カルス組織など）。植物組織は、植物中、または植物器官、組織または細胞培養物中にあってもよい。
「植物器官」という用語は、形態学的および機能的に特徴的な部分を構成する、植物組織または一群の組織を指す。「ゲノム」という用語は、次を指す。１．）生物の各細胞、またはウイルスまたは細胞小器官中に存在する遺伝物質の相補体全体（遺伝子および非コード配列）、および／または２．）一方の親の（半数体）単位として遺伝する染色体の完全な組。
したがって本発明はまた、細胞を本発明の組み換えコンストラクトで形質転換し、前記組み換えコンストラクトで形質転換細胞を選択することを含んでなる、細胞を形質転換する方法に関する。
また植物細胞を本発明のΔ９エロンガーゼポリヌクレオチドで形質転換し、そして形質転換された植物細細胞から植物を再生させることを含んでなる、形質転換された植物を作成する方法も興味深い。
（主としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用によって）双子葉植物を形質転換して遺伝子導入植物を得る方法は、例えば綿（米国特許第５，００４，８６３号明細書、米国特許第５，１５９，１３５号明細書）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号明細書、米国特許第５，４１６，０１１号明細書）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（米国特許第５，４６３，１７４号明細書）、ピーナッツ（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３〜６５７頁（１９９６年）；マッケントリー（ＭｃＫｅｎｔｌｙ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９〜７０３頁（１９９５年））、パパイア（リング（Ｌｉｎｇ），Ｋ．ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：７５２〜７５８頁（１９９１年））、およびエンドウマメ（グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４〜２５８頁（１９９５年））について公開されている。その他の一般に使用される植物形質転換法のレビューについては、ニューウェル（Ｎｅｗｅｌｌ），Ｃ．Ａ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５３〜６５頁（２０００年）を参照されたい。これらの形質転換法の１つは、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（テフラー（Ｔｅｐｆｌｅｒ），Ｍ．およびケース−デルバート（Ｃａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ），Ｆ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：２４〜２８頁（１９８７年））を使用する。ＰＥＧ融合（国際公開第９２／１７５９８号パンフレット）、電気穿孔（チョウリラ（Ｃｈｏｗｒｉｒａ），Ｇ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１７〜２３頁（１９９５年）；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ），Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：３９６２〜３９６６頁（１９８７年））、微量注入、または粒子衝撃（マッカーブ（ＭｃＣａｂｅ），Ｄ．Ｅ．ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：９２３頁（１９８８年）；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１〜６７４頁（１９８８年））を使用した、ＤＮＡの直接デリバリを使用したダイズの形質転換が公開されている。
植物組織からの植物再生のための多様な方法がある。特定の再生方法は、開始植物組織および再生する特定の植物種に左右される。単一植物プロトプラスト形質転換体から、または様々な形質転換外植片からの植物の再生、発達、および培養については当該技術分野でよく知られている（ワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）編、「植物分子生物学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１９８８年））。この再生および生育過程は、典型的に形質転換細胞を選択し、そして根付いた小植物段階を経る通常の胚芽発達段階を通じてそれらの個別化細胞を培養するステップを含む。遺伝子導入胚芽および種子も同様に再生させる。得られた遺伝子導入根付き芽をその後、土壌などの適切な植物成長培地に定植する。好ましくは再生した植物は自己受粉して、同型接合性遺伝子導入植物を提供する。さもなければ、再生植物から得られる花粉を農業経済学的に重要な系統の種子から成長させた植物に交配する。反対にこれらの重要な系統の植物からの花粉を使用して、再生植物を受粉させる。所望のポリペプチドを含有する本発明の遺伝子導入植物は、当業者によく知られている方法を使用して栽培される。
上で考察した手順に加えて、当業者は、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離のための特異的条件および手順、組み換えＤＮＡ断片および組み換え発現コンストラクトの産生、およびクローンのスクリーニングおよび単離について述べる標準的リソース材料を熟知している。例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ）（１９８９年）；マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、「植物分子生物学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ）（１９９５年）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、「ゲノム分析：遺伝子検出（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ）」、第１巻、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ）（１９９８年）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、「ゲノム分析：ＤＮＡ分析（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）」、第２巻、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ）（１９９８年）；クラーク（Ｃｌａｒｋ）編、「植物分子生物学：実験室マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）：ニューヨーク州（ＮＹ）（１９９７年）、を参照されたい。
油料種子植物の例としては、次が挙げられるが、これに限定されるものではない。ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、亜麻、およびベニバナ。
少なくとも２０個の炭素原子および５個以上の炭素−炭素二重結合を有するＰＵＦＡの例としては、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような植物から得られる種子、ならびにこのような植物から得られる油もまた、本発明の範囲内である。
したがって一実施態様では、本発明は、
ａ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、油料種子植物に関する。
このような追加的デサチュラーゼは、例えば米国特許第６，０７５，１８３号明細書、米国特許第５，９６８，８０９号明細書、米国特許第６，１３６，５７４号明細書、米国特許第５，９７２，６６４号明細書、米国特許第６，０５１，７５４号明細書、米国特許第６，４１０，２８８号明細書、および国際公開第９８／４６７６３号パンフレット、国際公開第９８／４６７６４、号パンフレット国際公開第００／１２７２０号パンフレット、および国際公開第００／４０７０５号パンフレットで開示されている。
使用するカセットの組み合わせの選択は、形質転換される油料種子植物細胞のＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール、および発現される長鎖ＰＵＦＡにある程度左右される。
別の態様では、本発明は、
（ａ）細胞を本発明の組み換えコンストラクトで形質転換し、そして
（ｂ）長鎖ＰＵＦＡを作る形質転換細胞を選択する
ことを含んでなる、植物細胞中で長鎖ＰＵＦＡを作る方法に関する。
なおも別の態様では、本発明は、
（ａ）ダイズ細胞を
（ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
（ｉｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクト
で形質転換し、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換細胞からダイズ植物を再生させ、そして
（ｃ）非形質転換ダイズ植物から得られた種子中のレベルと比べて、改変されたレベルのＰＵＦＡを有する、ステップ（ｂ）の植物から得られた種子を選択する
ことを含んでなる、ダイズ細胞中で少なくとも１つのＰＵＦＡを生成する方法に関する。
特に好ましい実施態様では、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクトは、例えばミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されたおよび／またはそれに由来する配列番号６１および６９で記載されるΔ８デサチュラーゼなどのΔ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
微生物発現系、カセットとベクター、および形質転換
ここで述べられるΔ９エロンガーゼ遺伝子および遺伝子産物（すなわちＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ、またはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはそれらの相同体）はまた、異種の微生物宿主細胞中、特に油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））細胞中で産生されてもよい。組み換え微生物宿主中の発現は、今までに宿主を使用して可能でなかった新しい生成物合成のために、様々なＰＵＦＡ経路中間体を生成し、または宿主中に既在のＰＵＦＡ経路を調節するのに有用かもしれない。
外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する、微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当該技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域（例えばプロモーター）、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域（すなわちターミネーター）を含んでなる。双方の制御領域が形質転換された微生物宿主細胞の遺伝子由来であることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
所望の微生物宿主細胞中で、本Δ９エロンガーゼＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者には周知である。選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。微生物宿主細胞中での発現は、一時的または安定様式で達成できる。一時的発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された構成的プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される。（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するための好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット［米国特許出願公開第２００５−０１３６５１９−Ａ１号明細書］および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］を参照されたい）。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列が、酵母菌細胞中での発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドの酵母菌中での発現が不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を改変して効率的な酵母菌翻訳開始配列を含めさせ、最適の遺伝子発現を得ることができる。酵母菌中での発現のために、これは非効率的に発現する遺伝子を内在性酵母菌遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子にインフレームで融合させることによる、部位特異的変異誘発によって実施できる。代案としては宿主中の共通翻訳開始配列を判定して、対象とする宿主中でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に組み換えできる。
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域に、または異なる遺伝子に由来することができる。多数の終結領域が知られており、（それらが由来するのと同一および異なる属および種の双方で使用した際に）多様な宿主において満足に機能する。終結領域は、通常特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。好ましくは微生物宿主が酵母細胞である場合、終結領域は、酵母菌遺伝子（特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ））に由来する。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類遺伝子の３’領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。制限は意図しないが、ここでの開示で有用な終結領域としては以下が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外プロテアーゼ（ＸＰＲ、ジェンバンク登録番号Ｍ１７７４１）の約１００ｂｐの３’領域と、アシル−ｃｏＡオキシダーゼ（Ａｃｏ３、ジェンバンク登録番号ＡＪ００１３０１およびＣＡＡ０４６６１；Ｐｏｘ３：ジェンバンク登録番号ＸＰ＿５０３２４４）ターミネーターと、Ｐｅｘ２０（ジェンバンク登録番号ＡＦ０５４６１３）ターミネーターと、Ｐｅｘ１６（ジェンバンク登録番号Ｕ７５４３３）ターミネーター；Ｌｉｐ１（ジェンバンク登録番号Ｚ５００２０）ターミネーターと、Ｌｉｐ２（ジェンバンク登録番号ＡＪ０１２６３２）ターミネーターと、３−オキソアシル−ｃｏＡチオラーゼ（ＯＣＴ、ジェンバンク登録番号Ｘ６９９８８）ターミネーター。
当業者は認識しているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および微生物宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされる遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム内に組み込まれるかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終的細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率およびタンパク質の正しい折りたたみ、５．）宿主細胞内のｍＲＮＡおよびクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの改変は、ここで述べられるΔ９エロンガーゼの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
適切な微生物宿主細胞（例えば油性酵母）中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えばプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子）がひとたび得られたら、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、またはそれを宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内における遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
本発明では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノム中への直鎖ＤＮＡ組み込みによるものである。そしてゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であることができる。このような目的に向けて、複数コピー中に存在するゲノム内の配列を同定することが望ましい。
シュミット−ベルガー（Ｓｃｈｍｉｄ−Ｂｅｒｇｅｒ）らは、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７６（９）：２４７７〜２４８２頁（１９９４年）で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に第１のレトロトランスポゾン様要素Ｙｌｔ１を発見した。このレトロトランスポゾンは、ゼータ領域と称される長い末端反復（ＬＴＲ、それぞれおよそ７００ｂｐの長さ）の存在によって特徴づけられる。Ｙｌｔ１および単独ゼータ要素は、それぞれ少なくとも３５コピー／ゲノムおよび５０〜６０コピー／ゲノムで、ゲノム内に分散様式で存在し、どちらの要素も相同的組換え部位として機能すると判定された。さらにユーレットツェック（Ｊｕｒｅｔｚｅｋ）らは、Ｙｅａｓｔ、１８：９７〜１１３頁（２００１年）の研究で、（両端にＬＴＲゼータ領域がある直鎖ＤＮＡを使用して）酵母ゲノムの反復領域をプラスミドの標的にすることで、低コピープラスミド形質転換体を使用して得られた発現と比べて、遺伝子発現が劇的に増大できることを実証した。したがってゼータ誘導組み込みは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）へのプラスミドＤＮＡの複数組み込みを確実にする手段として理想的であることができ、それによって高レベル遺伝子発現を可能にする。しかし残念なことに、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の全株がゼータ領域を有するわけではない（例えばＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２として同定された株）。株がこのような領域を欠く場合、発現カセットを含んでなるプラスミドＤＮＡを代案の遺伝子座に組み込んで、発現カセットの所望コピー数に達するようにすることもまた可能である。例えば好ましい代案の遺伝子座としては、Ｕｒａ３遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子（ジェンバンク登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ジェンバンク登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ジェンバンク登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（国際公開第２００４／１０４１６７号パンフレット）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号Ｚ５００２０）および／またはＬｉｐ２遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＪ０１２６３２）が挙げられる。
有利なことに、Ｕｒａ３遺伝子は、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物、「５−ＦＯＡ」）選択（前出）と組み合わせて繰り返し使うことができ、遺伝子改変をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムにたやすく組み込むめる。
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
対象とする遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって微生物宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に対象とする遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。油性酵母（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書、米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチェン（Ｃｈｅｎ），Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）が挙げられる。
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組み換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。
形質転換宿主細胞は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット［米国特許出願公開第２００５−０１３６５１９−Ａ１号明細書］および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］で述べられるようにして、様々な選択技術によって同定できる。ここで使用するための好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。代案の実施態様では、５−ＦＯＡが、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択のために使用される。化合物は、オロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ），Ｐ．Ｌ．およびフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），Ｓ．、「酵母２−ハイブリッド・システム（Ｙｅａｓｔ ２−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）」、オックスフォード大学（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）：ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、第７巻、１０９〜１４７頁（１９９７年）。より具体的には最初に天然Ｕｒａ３遺伝子をノックアウトして、Ｕｒａ−表現型を有する株を生成でき、そこで選択は５−ＦＯＡ抵抗性に基づいて生じる。次に複数のキメラ遺伝子クラスターおよび新しいＵｒａ３遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムの異なる遺伝子座に組み込み、それによってＵｒａ＋表現型を有する新しい株を生成することができる。引き続く組み込みは、導入されたＵｒａ３遺伝子がノックアウトされると、新しいＵｒａ３−株（これも５−ＦＯＡ選択を使用して同定される）を生成する。したがってＵｒａ３遺伝子（５−ＦＯＡ選択と組み合わさった）は、形質転換の複数サイクル中で選択マーカーとして使用できる。
形質転換に続いて、本Δ９エロンガーゼ（そして場合により、宿主細胞内で同時発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
本遺伝子および核酸断片の発現のための微生物宿主細胞としては、広範な温度およびｐＨで、単純または複合炭水化物、脂肪酸，有機酸、油、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する宿主が挙げられる。本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌における（および特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における）発現のために単離されている。しかし転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌、藻類および／または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な微生物宿主になることが考察される。
しかし好ましい微生物宿主は油性生物体である。これらの生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には例示的な油合成酵母菌として、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された）が挙げられる。
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらに別の実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭ Ｓ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
歴史的に、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株が、イソシトレートリアーゼ、リパーゼ、ポリヒドロキシアルカノエート、クエン酸、エリトリトール、２−オキソグルタル酸、γ−デカラクトン、γ−ドデカラトン、およびピルビン酸の製造と生成のために使用されている。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ生成を設計するために応用できる特定教示は、それぞれ米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書（国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）、および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット）で提供される。
その他の好ましい微生物宿主としては、油性の細菌、藻類、およびその他の菌・カビが挙げられ、この幅広い微生物宿主郡中で特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物（またはこの目的のために遺伝子改変できるもの［例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのその他の酵母］）である。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーター制御下にある本Δ９エロンガーゼ遺伝子のいずれかによる、（商業的にＡＲＡの生成のために使用される）モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）の形質転換は、さらに多量のＥＤＡを合成できる形質転換生物を生じることができ、これはΔ８デサチュラーゼ遺伝子が同時発現されれば、さらに多量のＤＧＬＡに転換できる。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）の形質転換法は、マッケンジー（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５頁（２０００年）で述べられる。同様に、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物の形質転換法が米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示される。
上述の教示に基づいて、一実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
（ｉｉ）それぞれＬＡまたはＡＬＡのどちらかからなるエロンガーゼ基質源
を含んでなる、油性酵母を提供し、
ｂ）ステップ（ａ）の酵母を適切な発酵性炭素源の存在下で発育させ、Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現され、ＬＡがＥＤＡにまたはＡＬＡがＥＴｒＡにそれぞれ転換され、そして
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のＥＤＡまたはＥＴｒＡをそれぞれ回収する
ことを含んでなる、ＥＤＡまたはＥＴｒＡのどちらかをそれぞれ生成する方法に向けたものである。基質供給が必要とされるかもしれない。
いくつかの好ましい実施態様では、Δ９エロンガーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号４よりなる群から選択される。代案の好ましい実施態様では、Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３で記載される（配列番号１と比べて少なくとも１０６コドンが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のために最適化されている）。そして別の好ましい実施態様では、Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６で記載される（配列番号４と比べて少なくとも１１３コドンが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のために最適化されている）。
もちろん油性酵母中で天然に産生されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）、そしてもっと稀には１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限定されるので、本発明のより好ましい実施態様では、油性酵母は遺伝子改変され、ここで述べられるΔ９エロンガーゼに加えて長鎖ＰＵＦＡ生合成に必要な多重酵素を発現する（それによって例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの生成を可能にする）。
具体的には一実施態様で、本発明は、
ａ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に結合してΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる油性酵母に関する。
特に好ましい実施態様では、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクトは、例えばミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されおよび／またはそれに由来して配列番号６１および６９で記載されるΔ８デサチュラーゼなどの、Δ８デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
微生物ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
生化学的経路の操作法は当業者によく知られており、油性酵母、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化するのに、多数の操作が可能であることが予期される。これはＰＵＦＡ生合成経路内の直接的代謝エンジニアリング、または様々なその他の代謝経路の追加的協調操作を必要とするかもしれない。
ＰＵＦＡ生合成経路内の操作の場合、ＬＡの生成を増大させて、ω−６および／またはω−３脂肪酸の生成増大を可能にすることが望ましいかもしれない。Δ９デサチュラーゼおよび／またはΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子の導入および／または増幅が、これを達成するかもしれない。ω−６不飽和脂肪酸の生成を最大化するために、実質的にＡＬＡを含まない宿主微生物中で生成が優先されることが当業者によく知られている。したがって好ましくは宿主は、選択され、またはＬＡからＡＬＡへの変換を可能にするΔ１５またはω−３タイプデサチュラーゼ活性を除去または阻害して得られる。例えば（１）Δ１５デサチュラーゼ転写生成物へのアンチセンス配列の転写のためのカセットを提供して、（２）標的遺伝子の全部または一部の挿入、置換および／または欠失を通じてΔ１５デサチュラーゼ遺伝子を中断して、または（３）自然に低いまたは皆無のΔ１５デサチュラーゼ活性を有する［または有するように変異導入されている］宿主細胞を使用して、内在性デサチュラーゼ活性を低下または排除できる。望まれないデサチュラーゼ経路の阻害はまた、米国特許第４，７７８，６３０号明細書で述べられるものなどの特定デサチュラーゼ阻害剤の使用を通じて達成できる。
代案としては、ω−３脂肪酸生成を最大化する（そしてω−６脂肪酸合成を最小化する）ことが望ましいかもしれない。この例ではオレイン酸のＬＡへの変換を可能にするΔ１２デサチュラーゼ活性が除去または阻害されている宿主微生物が利用でき、引き続いてＡＬＡのω−３脂肪酸誘導体（例えばＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）への変換のために適切な基質（例えばＡＬＡ）と共に、適切な発現カセットを宿主中に導入する。
代案の実施態様では、エネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子中断によって排除し、またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によってダウンレギュレートしてもよい。
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内の操作の詳細な考察（およびその関連技術）は、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］でそれぞれ示され、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路中の望ましい操作（およびその関連技術）についても同様である。
本発明の文脈で、上述の戦略のいずれか１つによって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用であるかもしれない。例えば本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生成のために、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ生合成経路中の鍵酵素をコードする遺伝子を油性酵母内に導入する方法を提供する。ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を自然に有さない油性酵母中で本Δ９エロンガーゼ遺伝子を発現し、宿主生物の代謝エンジニアリングのための様々な手段を使用して、これらの遺伝子の発現を協調させ、好ましいＰＵＦＡ生成物の生成を最大化することが特に有用であろう。
ＰＵＦＡ合成のための微生物の発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の発現を最適化する条件下で生育させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に、最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。油性酵母などの対象とする微生物（例えば，ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））で、または生育に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース）上で生育させる。
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトース、スクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質と、植物油（例えばダイズ油）および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源とが挙げられる。炭素源としては、重要な生化学的中間体への代謝変換が実証されている一炭素源（例えば二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、および炭素含有アミン）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は、多種多様な炭素含有源を包含することが考察され、宿主生物の選択によってのみ制限される。好ましい炭素源は糖、グリセロール、および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素を含有するグルコースおよび／または脂肪酸である。
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性宿主の生育と、ＰＵＦＡ生成に必須の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌ）」より、ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、６１〜９７頁（１９９２年）。
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、形質転換宿主細胞の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母（例えば，ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるＰＵＦＡ生成には、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられ、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成育中の考察事項についても同様に述べられる。
ＰＵＦＡ油の精製および加工
ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で、宿主微生物および植物中に見いだすことができ、当該技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準についての１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年）である。下流プロセスに関する簡潔なレビューはまた、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：２７１〜３１２頁（１９９７年）にもある。
一般にＰＵＦＡの精製手段は、有機溶剤、超音波処理、（例えば二酸化炭素を使用した）超臨界流体抽出による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせを含んでもよい。追加的詳細については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットの教示を参照されたい。
種子油を単離する方法は当該技術分野でよく知られている（ガンストーン（Ｇｕｎｓｔｏｎｅ）ら編、「脂質ハンドブック（Ｔｈｅ Ｌｉｐｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」から（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、「脂肪および油の加工（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｏｉｌ）」、第５章、２５３〜２５７；チャップマン＆ホール（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ）：ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９９４年））。例えばダイズ油は、油含有種子からの食用油製品の抽出および精製を伴う一連のステップを使用して製造される。ダイズ油およびダイズ副産物は、下の表に示す全般的ステップを使用して生産される。
より具体的には、ダイズ種子を清潔にし、テンパー、脱皮して、薄片にすることで油抽出効率を高める。油抽出は、通常溶剤（例えばヘキサン）抽出によって達成されるが、物理的圧力、および／または溶剤抽出の組み合わせによっても達成される。得られる油は粗製油と称される。リン脂質およびその他の極性および中性脂質複合体を水和させて、非水和トリグリセリド画分（ダイズ油）からの分離を容易にすることで、粗製油を脱ガムしてもよい。得られるレシチンガムをさらに加工して、乳化および剥離（抗粘着）剤として多様な食物および工業製品で使用される、商業的に重要なレシチン製品を製造してもよい。不純物（主に遊離脂肪酸、顔料、および残留ガムなど）除去のために、脱ガム油をさらに精製してもよい。精製は、遊離脂肪酸と反応して、粗製油中に石鹸およびホスファチド水和物およびタンパク質を形成する苛性剤の添加によって達成される。水を使用して、精製中に形成された微量の石鹸を洗い流す。石鹸ストック副産物を動物飼料中で直接に使用してもよく、または酸性にして遊離脂肪酸を回収してもよい。色は、クロロフィルおよびカロテノイド化合物のほとんどを除去する漂白土による吸着を通じて除去される。精製油は水素化でき、それによって様々な融解特性およびテクスチャの脂肪が得られる。脱ろう（分画）を使用して、注意深く制御される冷却条件下での結晶化を通じて、水素化された油からステアリンを除去してもよい。脱臭（主に真空下の蒸気蒸留を通じた）は最終ステップであり、油に臭いまたは風味を与える化合物を除去するようにデザインされている。脱臭プロセス中に、トコフェロールおよびステロールなどのその他の価値ある副産物を除去してもよい。これらの副産物を含有する脱臭された蒸留物は、天然ビタミンＥおよびその他の高価値医薬品製品生産のために販売されてもよい。精製され、漂白され（水素化され、分画され）、脱臭された油および脂肪を包装して直接販売してもよく、またはより特殊な製品にさらに加工してもよい。ダイズ種子加工、ダイズ油生成および副産物利用に関するより詳細な参考文献はエリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）、「ダイズ加工および利用の実用的ハンドブック（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、米国油化学会および米国大豆協議会（１９９５年）にある。ダイズ油は、ココナツ、ヤシ、パーム核、およびココアバターなどの油と比較すると飽和脂肪酸が比較的少ないので、室温で液体である。
精製および／または純化されたＰＵＦＡ含有植物および微生物油に水素化して、それによって様々な融解特性およびテクスチャがある脂肪をもたらすことができる。（スプレッド、製菓用脂肪、硬質バター、マーガリン、ベーキングショートニングなどをはじめとする）多くの加工脂肪は、室温で様々な程度の硬さを必要とし、原料油の物理特性の改変を通じてのみ製造できる。これは最も一般的に、接触水素化を通じて達成される。
水素化は、ニッケルなどの触媒を用いて不飽和脂肪酸二重結合に水素が付加される化学反応である。例えば不飽和オレイン酸、ＬＡ、およびリノレン酸脂肪酸、そしてこれらのそれぞれを含有する高オレイン酸ダイズ油が水素化できる。水素化は２つの主な効果を有する。第１に不飽和脂肪酸含量減少の結果として、油の酸化安定性が増大する。第２に脂肪酸変化が融点を上昇させるため、油の物理特性が変化して室温で半液体または固形の脂肪が得られる。
水素化反応に影響する多くの変数があり、それは次に最終生成物の組成を改変する。圧力、温度、触媒タイプおよび濃度、撹拌および反応器デザインをはじめとする操作条件は、制御できるより重要なパラメーターである。選択的水素化条件を使用して、不飽和性がより低いものに優先して、より不飽和性が高い脂肪酸に水素化できる。非常に軽いまたはブラシ水素化（ｂｒｕｓｈ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）がしばしば用いられて、液体油の安定性を増大させる。さらに水素化は、液体油を物理的に固形の脂肪に転換する。水素化の程度は、特定の最終製品のためにデザインされた所望の性能および融解特性に左右される。液体ショートニング（ベーキング製品、固形脂肪、および商業的揚げ物と焙焼操作のために使用されるショートニングの製造で使用される）およびマーガリン製造のためのベースストックが、水素化を通じて得られる無数の可能な油および脂肪製品の例である。水素化および水素化された製品のより詳細な説明は、パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ），Ｈ．Ｂ．Ｗ．、「脂肪および油の水素化：理論と実践（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、米国油化学会（１９９４年）にある。
水素化された油はまた、水素化プロセスから帰結するトランス脂肪酸異性体の存在のためにいくぶんかの物議を醸している。トランス異性体の大量摂取は、血漿中の低密度−対−高密度リポタンパク質の比率の増大、および冠動脈心疾患リスク増大をはじめとする健康に対する悪影響と関連づけられている。
食料品中で使用するためのＰＵＦＡ含有油
現在、市場は、ω−３および／またはω−６脂肪酸（特にＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ）を組み込んだ、多岐にわたる食物および食品をサポートする。ＰＵＦＡを含んでなる本発明の植物／種子油、改変種子および微生物油は、食物および食品中で機能して現行の調合物に健康上の利点を与えることが考察される。その他の植物油と比較して、本発明の油は物理的観点から、食物用途においてその他の油と同様に機能すると考えられる（例えばダイズ油などの部分的に水素化された油は、ソフトスプレッド、マーガリン、およびベーキングおよび揚げ物のためのショートニングの成分として広く使用される）。
ここで述べられるω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する植物／種子油、改変種子および微生物油は、次をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な食物および飼料製品で使用するのに適している。食物類似物、肉製品、穀物製品、スナック食品、ベーカリー食品、および乳製品。さらに本植物／種子油、改変種子および微生物油を調合物中で使用して、医学的栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳をはじめとするメディカルフード、ならびに医薬品に健康上の利点を与えてもよい。食品加工および食品配合の当業者は、特定量と組成の植物および微生物油をどのように食品または飼料製品に添加してもよいかを理解する。このような量はここで「有効」量と称され、食品または飼料製品、製品が栄養補給を意図する食餌、またはメディカルフードまたは医学的栄養物が矯正または処置を意図する疾患に左右される。
食物類似物は、当業者によく知られているプロセスを使用して作り出すことができる。肉類似物、チーズ類似物、ミルク類似物などが挙げられる。ダイズからできた肉類似物は、共に混合されて様々な種類の肉をシミュレートするダイズタンパク質または豆腐およびその他の成分を含有する。これらの肉代用品は、冷凍、缶詰または乾燥食品として販売される。通常、それらはそれらが置き換える食品と同じように使用できる。ダイズから作られる肉代替物は、優れたタンパク質、鉄、およびＢビタミン供給源である。肉類似物の例としては、ハム類似物、ソーセージ類似物、ベーコン類似物などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
食物類似物は、それらの機能性および組成特性次第で模造品または代用品として分類できる。例えば模造チーズは、それが置き換えるようデザインされたチーズに似てさえいればよい。しかし製品は一般に、それが置き換えるチーズと栄養的に同等であり、そのチーズに対する最小組成要求量を満たす場合にのみ代用チーズと称することができる。したがって代用チーズは模造チーズよりも高いタンパク質レベルを有することが多く、ビタミンおよびミネラルで強化される。
ミルク類似物または非乳製品食品としては、模造ミルクおよび非乳製品冷菓（例えばダイズおよび／またはダイズタンパク質製品からできたもの）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
肉製品は、幅広い製品を包含する。米国では「肉」は、牛、豚、および羊から産する「赤身肉」を含む。赤身肉に加えて、鶏、七面鳥、ガチョウ、ホロホロチョウ、カモを含む家禽品目、および魚および貝類がある。生、塩蔵、および揚げ物、および塩蔵され調理された幅広い種類の調味および加工肉製品がある。ソーセージおよびホットドッグは、加工肉製品の例である。したがって「肉製品」という用語は、ここでの用法では加工肉製品を含むが、これに限定されるものではない。
シリアル食品は、シリアル穀物の加工に由来する食品である。シリアル穀物としては、可食穀物（種子）を産するイネ科のあらゆる植物が挙げられる。最も普及している穀物は、大麦、コーン、雑穀、オート麦、キノア、米、ライ麦、モロコシ、ライ小麦、小麦、およびワイルドライスである。シリアル食品の例としては、全粒、破砕粒、挽き割り、穀粉、ふすま、胚芽、朝食用シリアル、押し出し食品、パスタなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ベーカリー製品は、ベーキングに匹敵する様式で天火焼または加工された、すなわち熱に曝すことで乾燥または硬化された、上述のあらゆるシリアル食品を含んでなる。ベーカリー製品の例としては、パン、ケーキ、ドーナツ、バー、パスタ、パン粉、ベークドスナック、ミニビスケット、ミニクラッカー、ミニクッキー、およびミニ−プレッツェルが挙げられるが、これに限定されるものではない。上述されるように、成分として本発明の油を使用できる。
スナック食品は、上または下で述べられる食品のいずれかを含んでなる。
揚げ物食品は、油で揚げた上または下で述べられる食品のいずれかを含んでなる。
健康食品は、健康上の利点を与えるあらゆる食品である。多くの油料種子由来食品は、健康食物と見なしてももよい。
飲料は、液体または乾燥粉末形態であることができる。
例えば非炭酸飲料と、生、冷凍、缶詰または濃縮果汁と、フレーバーミルクまたはプレーンミルク飲料などが挙げられる。成人および幼児栄養フォーミュラについては当該技術分野でよく知られ、市販されている（例えばアボット・ラボラトリーズのロス製品部門（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのシミラック（Ｓｉｍｉｌａｃ）（登録商標）、エンシュア（Ｅｎｓｕｒｅ）（登録商標）、ジュビディ（Ｊｅｖｉｔｙ）（登録商標）、およびアリメンタム（Ａｌｉｍｅｎｔｕｍ）（登録商標））。
乳児用調製粉乳は、幼児および小児に与えられる液体または戻した粉末である。「乳児用調製粉乳」とは、ここで幼児の哺乳において人乳に置き換えることができ、典型的に水溶液中で所望の百分率の炭水化物およびタンパク質と混合された、所望の百分率の脂肪から構成される経腸栄養製品と定義される（例えば米国特許第４，６７０，２８５号明細書を参照されたい）。世界的組成研究ならびに専門家グループによって規定されるレベルに基づいて、平均的人乳は典型的に約０．２０％〜０．４０％の全脂肪酸（脂肪からの熱量が約５０％と仮定すれば）を含有し、一般にＤＨＡとＡＲＡの比率は約１：１〜１：２の範囲である（例えばミード・ジョンソン・アンド・カンパニー（Ｍｅａｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）からのエンファミル（Ｅｎｆａｍｉｌ）ＬＩＰＩＬ（商標）およびアボット・ラボラトリーズのロス製品部門（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのシミラック・アドバンス（Ｓｉｍｉｌａｃ Ａｄｖａｎｃｅ）（商標）の配合を参照されたい）。乳児用調製粉乳は幼児にとって唯一の栄養源であることが多いので、幼児の食餌において特別な役割を有し、母乳が幼児にとってなおも最良の栄養であるが、乳児用調製粉乳は、乳児が生育するだけでなく生長できる十分近い次善の策である。
乳製品はミルク由来製品である。ミルク類似物または非乳製品は、例えば上述した豆乳のようなミルク以外の供給源に由来する。これらの製品としては、全乳、スキムミルク、ヨーグルトまたはサワーミルクなどの発酵ミルク製品、クリーム、バター、練乳、粉ミルク、コーヒーホワイトナー、コーヒークリーマー、アイスクリーム、チーズなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中に本発明のＰＵＦＡ含有油を含めることができる追加的食品としては、例えばチューインガム、糖菓およびフロスティング、ゼラチンおよびプディング、ハードおよびソフトキャンディ、ジャムおよびゼリー、白色グラニュー糖、糖代用品、甘みソース、トッピングおよびシロップ、および乾燥ブレンド粉末ミックスが挙げられる。
健康食品および医薬品で使用するためのＰＵＦＡ含有油
健康食品は健康上の利点を与えるあらゆる食品であり、機能性食品、メディカルフード、医学的栄養剤、乳児用調製粉乳、および栄養補助食品が含まれる。さらに本発明の植物／種子油、改変種子および微生物油を標準医薬組成物で使用してもよい。例えば本発明の油を上述のあらゆる食品中に容易に組み込んで、それによって例えば機能性食品またはメディカルフードを生成できる。ＰＵＦＡを含んでなるより濃縮された調合物としては、ヒトまたはヒト以外の動物において栄養補助食品として使用できる、カプセル、粉末、錠剤、ソフトジェル、ジェルキャップ、濃縮液、およびエマルジョンが挙げられる。
動物飼料で使用するためのＰＵＦＡ含有油
動物飼料は、ここで総称的にヒト以外の動物飼料としての使用または飼料への混合が意図される製品と定義される。本発明の植物／種子油、改変種子および微生物油は、様々な動物飼料中の成分として使用できる。
より具体的には、これに限定されるものではないが、本発明の油は、ペットフード、反芻動物および家禽飼料製品、および水産養殖飼料製品で使用できる。ペットフードはペット［例えば犬、猫、鳥、爬虫類、齧歯類］に食べさせることが意図される製品であり、これらの製品は上のシリアルおよび健康食品、ならびに肉および肉副産物、ダイズタンパク質製品、および牧草および干し草産物（例えばアルファルファ、チモシー、カラスムギまたはスズメノチャヒキ、野菜）を含むことができる。反芻動物および家禽食品は、例えば七面鳥、鶏、牛、および豚に食べさせることが意図される製品である。上のペットフードと同様に、これらの製品は、上に列挙したシリアルおよび健康食品、ダイズタンパク質製品、肉および肉副産物、および牧草および干し草製品を含むことができる。水産養殖飼料（または「アクアフィード」）は、淡水または海水中での水生生物、動物、および／または植物の繁殖、養殖または飼育に関わる養殖で使用されることが意図される製品である。
特に断りのない限り部および百分率が重量を基準とし、温度が摂氏である以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、発明の好ましい実施態様を示しながら、あくまで例示のために提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その趣旨と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。したがってここで示され述べられたものに加えて、本発明の様々な改変は前述の説明から当業者には明らかである。このような改変はまた、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版（１９８７年）で述べられる。
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、当該技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、米国微生物学会、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４年）、またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、「バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、シナウアー・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
一般分子クローニングは、標準法に従って実施した（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出）。ＤＮＡ配列は、ベクターとインサート特異的プライマーとの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。ミシガン州アンアーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）中で配列編集を実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを表す。遺伝的配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２を有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、典型的にＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で２８℃で生育させた。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りチェン（Ｃｈｅｎ），Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、０．１２５ｍＬの２Ｍ ＤＴＴ、および５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
形質転換体の選択のためには、一般に最少培地（「ＭＭ」）を使用した。ＭＭの組成は以下のとおり。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１。適切ならばウラシルのサプリメントを最終濃度０．０１％に添加した（それによって２０ｇ／Ｌの寒天で調製される「ＭＭＵ」選択培地を生成した）。
代案としては、次を含んでなる５−フルオロオロチン酸（「ＦＯＡ」、また５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも）選択培地上で、形質転換体を選択した。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌのウラシル、７５ｍｇ／Ｌのウリジン、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの９００ｍｇ／Ｌ ＦＯＡ、および２０ｇ／Ｌの寒天。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、ブライ（Ｂｌｉｇｈ），Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ），Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７頁（１９５９年）で述べられるように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ），Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ），Ｉ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続きヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）からの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
実施例１
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）の生育条件、脂質プロフィール、およびｍＲＮＡ単離
本実施例は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）の生育、培養脂質分析、およびｍＲＮＡ単離について述べる。
生育および脂質分析
ミシガン州イーストランシングのミシガン州立大学のリチャード・トリーマー（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔｒｉｅｍｅｒ）博士の研究室からミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）を得た。１０ｍＬの活発に生育する培養から、１ｍＬのアリコートを５００ｍＬガラスびん中の２５０ｍＬのミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｅｇ）培地に移した。９７０ｍＬの水中で１ｇの酢酸ナトリウム、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの１ｇの牛肉エキス（カタログ番号Ｕ１２６−０１）、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの２ｇのＢａｃｔｏ（登録商標）トリプトン（カタログ番号０１２３−１７−３）、およびディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの２ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）（登録商標）酵母抽出物（カタログ番号０１２７−１７−９）を合わせてＥｇ培地を作製した。フィルター滅菌後、ノースカロライナ州バーリントンのカロライナ・バイオロジカル・サプライ・カンパニー（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））からの３０ｍＬの土壌上清（Ｓｏｉｌ−Ｗａｔｅｒ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）（カタログ番号１５−３７９０）を無菌的に添加して最終的なＥｇ培地を生成した。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）培養物を２３℃で１６時間の照明、８時間の暗黒サイクルで撹拌せずに２週間生育させた。
２週間後、脂質分析のために１０ｍＬの培養を取り除いて１，８００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを水で１度洗浄し、再遠心分離した。得られたペレットを真空下で５分間乾燥させ、１００μＬの水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）に再懸濁し、振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。その後、０．５ｍＬのヘキサンを添加して、バイアルを振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。脂肪酸メチルエステル（ヘキサン層から注入された５μＬ）を分離して、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．）からのオメガワックス（Ｏｍｅｇａｗａｘ）３２０融解石英キャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２）を装着した（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ガスクロマトグラフを使用して定量化した。オーブン温度をプログラムして２２０℃に２．７分間保ち、２０℃／分で２４０℃に上昇させて、次にさらに２．３分間保った。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）水素発生器によってキャリアガスを供給した。ヌチェック・プレップ・インコーポレーテッド（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）から市販される標準メチルエステル（カタログ番号Ｕ−９９−Ａ）と滞留時間を比較して、得られたクロマトグラムを図３に示す。
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのｍＲＮＡ調製
残った２週間培養物（２４０ｍＬ）を１，８００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、水で１度洗浄して再遠心分離した。テキサス州フレンズウッドのテル−テスト（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ））からのＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（商標）試薬を使用して、提供された製造業者のプロトコルに従って（５ｍＬの試薬を使用してＲＮＡを０．５ｍＬの水に溶解）、得られたペレットから全ＲＮＡを抽出した。このようにしてペレットから１ｍｇの全ＲＮＡ（２ｍｇ／ｍＬ）を得た。ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャム・バイオサイエンス（アマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））からのｍＲＮＡ精製キットを使用して、提供された製造業者のプロトコルに従って、１ｍｇの全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。このようにして８５μｇのｍＲＮＡを得た。
実施例２
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のｃＤＮＡ合成、ライブラリー構築、および配列決定
（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのクロンマイナー（Ｃｌｏｎｅｍｉｎｅｒ）（商標）ｃＤＮＡライブラリー構築キット（カタログ番号１８２４９−０２９）を使用して、提供された製造業者のプロトコルに従って（バージョンＢ、２５−０６０８）、ｃＤＮＡライブラリーを生成した。非放射標識法を使用し、Ｂｉｏｔｉｎ−ａｔｔＢ２−オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ｃＤＮＡを３．２μｇのｍＲＮＡ（実施例１）から合成した。第１および第２のストランド合成後、ａｔｔＢ１アダプターを添加してライゲートし、カラムクロマトグラフィーを使用してｃＤＮＡをサイズ分画した。画分７および８からのＤＮＡ（約８００〜１５００ｂｐのサイズ範囲）を濃縮し、ｐＤＯＮＲ（商標）２２２に遺伝子組み換えして、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エレクトロマックス（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ）（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１ファージ抵抗性細胞に形質転換した。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ライブラリーを「ｅｅｇ１ｃ」と命名した。
配列決定のために、クローンを最初に、３８４ウェル凍結培地プレート内で生育／凍結した保存グリセロール培養から回収し、ＬＢ＋７５μｇ／ｍＬカナマイシン（複製されたプレート）を含有する３８４ウェルマイクロタイタープレート内の（マサチューセッツ州ボストンのジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））からの無菌３８４ピンレプリケーターで複製した。次に製造業者のプロトコルに従って、アマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのテンプリフィ（テンプリフィ（Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ）ＤＮＡ配列決定テンプレート増幅キット法を使用して、プラスミドを単離した。簡単に述べると、テンプリフィ（Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ）法は、等温ローリングサークル増幅（ディーン（Ｄｅａｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１１：１０９５〜１０９９頁（２００１年）；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：Ｓ４４〜Ｓ４７頁（２００２年））により、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して、環状一本鎖または二本鎖ＤＮＡを増幅する。３７℃で２０時間生育後、複製されたプレートからの細胞を５μＬの希釈緩衝液に添加して、９５℃で３分間変性させて部分的に細胞を溶解して変性テンプレートを放出する。次にテンプリフィ（Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ）プレミックス（５μＬ）を各サンプルに添加して、得られた反応混合物を３０℃で１６時間、次に６５℃で１０分間インキュベートして、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ活性を不活性化した。増幅されたサンプルを蒸留水で１：３に希釈した後に、ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量化試薬（分子プローブ）によるＤＮＡ定量化を実施した
次にＭ１３Ｆユニバーサルプライマー（配列番号１８）およびＡＢＩビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）バージョン３．１プリズム（Ｐｒｉｓｍ）配列決定キットを使用して、増幅産物を３８４ウェルプレート内で９５℃で１０分間変性して末端配列決定した。配列決定反応では、１００〜２００ｎｇのテンプレートおよび６．４ｐｍｏｌのプライマーを使用して、次の反応条件を２５回反復した。９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、および６０℃で４分間。エタノールベースのクリーンアップ後、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＡＢＩ ３７３０ｘｌ自動配列決定装置上でサイクル配列決定反応生成物を分解し、検出した。
実施例３
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃからのΔ９エロンガーゼ酵素相同体の同定
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性のジェンバンク番号ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク由来配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新主要公開、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）中に含まれる配列との類似性に対する、ＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍａｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））検索を行って、長鎖多価不飽和脂肪酸延長酵素相同体（すなわちＬＣ−ＰＵＦＡ ＥＬＯ相同体またはΔ９エロンガーゼ）をコードするｃＤＮＡクローンを同定した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、実施例２で得られたｃＤＮＡ配列を「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性について分析した。ＤＮＡ配列を全ての読み枠に翻訳し、ＮＣＢＩが提供するＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ）およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３：２６６〜２７２頁（１９９３年）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について比較した。便宜上、ＢＬＡＳＴによる計算で、単なる偶然により検索するデータベース中に含まれる配列とｃＤＮＡ配列との一致を観察することのＰ値（確率）は、報告されたＰ値の対数の負の値を表す「ｐＬｏｇ」値としてここで報告され、したがってｐＬｏｇ値が大きいほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの「ヒット」が、相同的なタンパク質を表す可能性は大きくなる。
クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからのヌクレオチド配列を使用したＢＬＡＳＴＸ検索は、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質とＩｇＤ９との類似性を明らかにした（すなわちここで配列番号８として記載されるイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）からの長鎖ＰＵＦＡ延長酵素；ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ １７２２６１２３）、遺伝子座ＡＡＬ３７６２６、ＣＤＳ ＡＦ３９０１７４；キ（Ｑｉ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１０（３）：１５９〜１６５頁（２００２年））。クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからのｃＤＮＡ挿入断片の一部の配列を配列番号１０で示す（ｃＤＮＡ挿入断片の５’末端）。
上述のようにして、しかしｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ−プライムウォブル（Ｗｏｂｂｌｅ）Ｔオリゴヌクレオチドを使用して、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．１のｃＤＮＡ挿入断片の３’末端から追加的配列を得た。簡単に述べると、ウォブル（Ｗｏｂｂｌｅ）Ｔプライマーは、ｃＤＮＡクローンの３’末端を配列決定するのに使用される、２１塩基長のｐｏｌｙ（Ｔ）Ａ、ｐｏｌｙ（Ｔ）Ｃ、およびｐｏｌｙ（Ｔ）Ｇの等モル混合物である。３’末端配列を配列番号１１で示す。
５’および３’配列の双方をミシガン州アンアーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（商標）（バージョン４．２）を使用してアラインメントし、ｃＤＮＡから得られた配列を配列番号１２で示す。ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆ中のｃＤＮＡからのコード配列の配列決定、および対応する推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２で示す。上で報告された相同性に基づいて、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．１のｃＤＮＡ挿入断片のミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）遺伝子産物がΔ９エロンガーゼをコードすると仮定し、したがって「ＥｇＤ９ｅ」と命名した。
配列番号２（すなわちＥｇＤ９ｅ）で記載されるアミノ酸配列をＢＬＡＳＴＰによって評価し、ＩｇＤ９ｅ（配列番号８）に対するｐＬｏｇ値３８．７０（２ｅ−３９のＥ値）を得た。ヨトゥン・ハイン（Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ）法を使用して、ＥｇＤ９ｅはＩｇＤ９ｅと３９．４％同一である。ヨトゥン・ハイン（Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ）法（ハイン（Ｈｅｉｎ）、Ｊ．Ｊ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８３：６２６〜６４５頁（１９９０年））によって実施された配列％同一性計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲインコーポレーテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＤＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）ｖ６．１プログラムを使用して、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝２）で実施した。クラスタルＶ法（図４）を使用して、ＥｇＤ９ｅ（配列番号２）はＩｇＤ９ｅ（配列番号８）と３１．８％同一である。クラスタルＶ法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ），Ｄ．Ｇ．およびシャープ（Ｓｈａｒｐ），Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年）によって実施された配列％同一性計算は、レーザージーン（ＬＡＤＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）ｖ６．１プログラムを使用して、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５、およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で実施した。
ＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、本核酸断片（配列番号１２）が、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ全体をコードすることを示唆した。
実施例４
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でのミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ）の機能解析
本実施例は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＥｇＤ９ｅの機能解析について述べる。これには、（１）ｐＹ１１９を生成するためのＥｇＤ９ｅの酵母発現ベクターｐＹ−７５中へのクローニング、（２）基質供給後のｐＹ−７５およびｐＹ１１９を含んでなる形質転換生物中の脂質プロフィールの比較、および（３）基質非供給後のｐＹ−７５およびｐＹ１１９を含んでなる形質転換生物中の脂質プロフィールの比較が必要であった。
プラスミドｐＹ−７５（対照）とＥｇＤ９ｅを含んでなるｐＹ１１９との構築
酵母エピソームのプラスミド（ＹＥｐ）−タイプベクターｐＲＳ４２５（クリスチャンソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ、１１０：１１９〜１２２頁（１９９２年））はサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２μ内在性プラスミドからの配列、ＬＥＵ２選択可能マーカー、および多機能性ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の主鎖に基づく配列を含有する。ジア（Ｊｉａ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３：８３〜９２頁（２０００年）で述べられるのと同様にして、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）強力構成的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターをｐＲＳ４２５のＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩ部位間でクローンして、ｐＧＰＤ−４２５生成した。ＮｏｔＩ部位をｐＧＰＤ−４２５のＢａｍＨＩ部位中に導入し、このようにしてＢａｍＨＩ部位で挟まれたＮｏｔＩ部位を生成して、このプラスミドをｐＹ−７５と称した。
マサチューセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））からのベント（Ｖｅｎｔ）Ｒ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、オリゴヌクレオチドプライマーｏＥｕｇＥＬ１−１（配列番号１９）およびｏＥｕｇＥＬ１−２（配列番号２０）で、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからＥｇＤ９ｅを増殖した。インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのゼロ（Ｚｅｒｏ） Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲクローニングキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクター中にクローンして、ｐＫＲ９０６を生成した。ＮｏｔＩでの消化によってＥｇＤ９ｅをｐＫＲ９０６から放出し、ｐＹ−７５のＮｏｔＩ部位にクローンして、ｐＹ１１９（配列番号２１、図５）を生成した。ＥｇＤ９ｅを図５で「ｅｕｇ ｅｌ１」と標識する。
基質供給によるＥｇＤ９ｅエロンガーゼ活性の機能解析
標準酢酸リチウム形質転換手順を使用して、プラスミドｐＹ１１９およびｐＹ−７５をインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＮＶＳＣ１に形質転換した。形質転換体をカリフォルニア州カールズバッドのキュビオジーン（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＣＳＭ−ｌｅｕを添加したＤＯＢＡ培地上で選択した。各プレートからの形質転換体をＣＳＭ−ｌｅｕ（キュビオジーン（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ））と０．２％タージトールを添加した２ｍＬのＤＯＢ培地に接種した。細胞を３０℃で１日間生育させた後、ＬＡ［１８：２（９，１２）］、ＡＬＡ［１８：３（９，１２，１５）］、ＧＬＡ［１８：３（６，９，１２）］、ＳＴＡ［１８：４（６，９，１２，１５）］、ＡＲＡ［２０：４（５，８，１１，１４）］またはＥＰＡ［２０：５（５，８，１１，１４，１７）］のいずれかを０．１７５ｍＭに添加した３ｍＬの同じ培地に、０．１ｍＬを移した。これらを３０℃、２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートして、次に遠心分離によってペレットを得た。細胞を水で一度洗浄し、遠心分離によってペレット化して風乾した。ペレットを５０℃で３０分間５００μＬの１％ナトリウムメトキシドでエステル交換し（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ），Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ），Ｉ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、その後５００μＬの１Ｍ塩化ナトリウムおよび１００μＬのヘプタンを添加した。完全な混合と遠心分離後、実施例１で述べられるように脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をＧＣで分析した。
ｐＹ７５（ベクター対照）またはｐＹ１１９を含有する細胞（ｐＹ１１９−５、ｐＹ１１９−６、およびｐＹ１１９−８と命名される３つの独立した形質転換体）に基質供給した結果を図６に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（９）（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（９）（オレイン酸）、ＬＡ、ＧＬＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、２２：２（１３，１６）（ドコサジエン酸）、２２：４（７，１０，１３，１６）（アドレン酸）、ＤＰＡおよび２４：１（ネルボン酸）と同定された。供給した各脂肪酸（「ＦＡ」）について延長効率（「％Ｅｌｏ」）を次のように計算した。［％ＦＡ生成物／（％ＦＡ生成物＋％ＦＡ基質）＊１００］
図６のデータは、クローンされたＥｇＤ９ｅが、ＬＡおよびＡＬＡをそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡに効率的に延長したことを実証した。
基質供給なしのＥｇＤ９ｅエロンガーゼ活性の機能解析
さらにオレイン酸［ＯＡ−１８：１（９）］と、パルミトレイン酸［ＰＡ−１６：１（９）］延長生成物であるバクセン酸［ＶＡ−１８：１（１１）］との分離を達成するために、わずかに異なる温度プロフィールを使用して、脂肪酸が供給されない細胞からのＦＡＭＥをＧＣによって分析した。スペルコ・インコーポレーテッド（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．）からのオメガワックス（Ｏｍｅｇａｗａｘ）３２０溶融石英キャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２）を装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ガスクロマトグラフを使用して、脂肪酸メチルエステル（ヘキサン層から注入された３μＬ）を分離して定量化した。オーブン温度は２００℃を２．７分間保ち、２０℃／分で２４０℃に上昇させて、次にさらに２．３分間保つようにプログラムした。結果を表６に示す。
上に示す結果に基づいて、ＥｇＤ９ｅは、ＬＡおよびＡＬＡからそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡへの延長を触媒できるΔ９エロンガーゼとしてのその主な役割に加えて、Ｃ１６／１８エロンガーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼの双方として作用するかもしれない。
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された（ＩｇＤ９ｅＳ）合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）由来）を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１１５の構築
本実施例は、キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＩｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１１５の構築について述べ、ここでＩｇＤ９ｅＳはイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）由来の合成Δ９エロンガーゼであり、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されている。プラスミドｐＹ１１５は、下記の実施例６および７で述べられるように、ＥｇＤ９ｅのΔ９エロンガーゼ活性と比べるために、間接的にＩｇＤ９ｅＳのΔ９エロンガーゼ活性を可能にする。
プラスミドｐＹ１１５（配列番号４５、図８）の構築は、（１）ｐＤＭＷ２６３の構築、（２）ＩｇＤ９ｅＳの合成およびプラスミドｐＤＭＷ２３７の創出、および（３）プラスミドｐＤＭＷ２６３およびｐＤＭＷ２３７からの断片のライゲーションを必要とした。
ｐＤＭＷ２６３の構築
プラスミドｐＹ５−３０（図７Ａ、その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０５／００３３１０号パンフレットで以前述べられている）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のどちらの中でも複製できるシャトルプラスミドである。プラスミドｐＹ５−３０は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８）、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、およびキメラのＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲ遺伝子を含有する。
当業者によく知られている技術を使用してＴＥＦプロモーターをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（国際公開第０５／０４９８０５号パンフレット）で置換して、プラスミドｐＤＭＷ２６３（配列番号２２、図７Ｂ）をｐＹ５−３０から作り出した。簡単に述べると、このプロモーターは、ｆｂａ１遺伝子によってコードされて発現に必要なフルクトース−二リン酸アルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドン前の５’上流非翻訳領域中に位置する変性プロモーターに加えて、イントロンを有する５’コード領域の一部を指し、その中でＦＢＡＩＮｍは、ＡＴＧ翻訳開始コドンとＦＢＡＩＮプロモーターのイントロンの間の５２ｂｐの欠失を有し（それによってＮ末端の２２個のアミノ酸のみを含む）、およびイントロンの後の新しい翻訳コンセンサスモチーフを有する。表７はｐＤＭＷ２６３の構成要素を要約する。
ＩｇＤ９ｅＳの生体外合成
ここでそれぞれその全体を参照によって援用する、国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット（米国特許出願公開第２００４−０２５３６２１−Ａ１号明細書）で述べられるのと類似した様式で、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット（米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書）で述べられるように、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）のΔ９エロンガーゼ遺伝子（ＩｇＤ９ｅ、配列番号７および８）のコドン使用頻度をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン、ＡＴＧ翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般方法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ ２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年））に従って、ＩｇＤ９ｅ（配列番号７）のコード配列に基づいて、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「ＩｇＤ９ｅＳ」と称する、配列番号９）をデザインした。翻訳開始部位の改変に加えて７９２ｂｐのコード領域の１２７ｂｐを改変し（１６．０％）、１２２コドンを最適化した。コドン最適化遺伝子中のいずれの改変も、コードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）を変化させなかった。
より具体的には、ＩｇＤ９ｅＳの全長を延長するように、８組のオリゴヌクレオチド（例えばＩＬ３−１Ａ、ＩＬ３−１Ｂ、ＩＬ３−２Ａ、ＩＬ３−２Ｂ、ＩＬ３−３Ａ、ＩＬ３−３Ｂ、ＩＬ３−４Ａ、ＩＬ３−４Ｂ、ＩＬ３−５Ａ、ＩＬ３−５Ｂ、ＩＬ３−６Ａ、ＩＬ３−６Ｂ、ＩＬ３−７Ａ、ＩＬ３−７Ｂ、ＩＬ３−８Ａ、およびＩＬ３−８Ｂ、配列番号２３〜３８に対応する）をデザインした。各５’−末端の４ｂｐのオーバーハングを除いて、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各対は相補的であった。さらに引き続くサブクローニングのために、プライマーＩＬ３−１Ｆ、ＩＬ３−４Ｒ、ＩＬ３−５Ｆ、およびＩＬ３−８Ｒ（配列番号３９〜４２）には、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、およびＮｏｔ１制限部位もまた導入した。
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのスペルミジン、０．５ｍＭのＡＴＰ、および１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの体積中で、各オリゴヌクレオチド（１００ｎｇ）を３７℃で１時間リン酸化した。以下のパラメーターを使用して、サーモサイクラー内でセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの各対を混合しアニールした。９５℃（２分間）、８５℃（２分間）、６５℃（１５分間）、３７℃（１５分間）、２４℃（１５分間）、および４℃（１５分間）。このようにＩＬ３−１Ａ（配列番号２３）をＩＬ３−１Ｂ（配列番号２４）にアニールし、二本鎖生成物「ＩＬ３−１ＡＢ」を生成した。同様にＩＬ３−２Ａ（配列番号２５）をＩＬ３−２Ｂ（配列番号２６）にアニールして、二本鎖生成物「ＩＬ３−２ＡＢ」などを生成した。
次に下に示すように、アニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの別々のプールを共にライゲートした。プール１（ＩＬ３−１ＡＢ、ＩＬ３−２ＡＢ、ＩＬ３−３ＡＢ、およびＩＬ３−４ＡＢを含んでなる）、およびプール２（ＩＬ３−５ＡＢ、ＩＬ３−６ＡＢ、ＩＬ３−７ＡＢ、およびＩＬ３−８ＡＢを含んでなる）。アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを２０μＬの体積中で、１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に混合し、ライゲーション反応を１６℃で一晩インキュベートした。
次に各ライゲーション反応の生成物をテンプレートとして使用し、デザインされたＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。具体的には、ライゲートした「プール１」混合物（すなわちＩＬ３−１ＡＢ、ＩＬ３−２ＡＢ、ＩＬ３−３ＡＢ、およびＩＬ３−４ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＩＬ３−１ＦおよびＩＬ３−４Ｒ（配列番号３９および４０）をプライマーとして使用し、ＩｇＤ９ｅＳの第１の部分をＰＣＲによって増幅した。４１７ｂｐのＰＣＲ断片をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ）中にサブクローンして、ｐＴ９（１−４）（配列番号４３）を発生させた。
ライゲートした「プール２」混合物（例えばＩＬ３−５ＡＢ、ＩＬ３−６ＡＢ、ＩＬ３−７ＡＢ、およびＩＬ３−８ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＩＬ３−５ＦおよびＩＬ３−８Ｒ（配列番号４１および４２）をプライマーとして使用して、ＩｇＤ９ｅＳの第２の部分を同様にＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ）中にクローンして、ｐＴ９（５−８）（配列番号４４）を発生させた。
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）をｐＴ９（１−４）（配列番号４３）およびｐＴ９（５−８）（配列番号４４）で別々に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン抵抗性形質転換体から単離した。プラスミドＤＮＡを精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化して、ｐＴ９（１−４）の４１７ｂｐのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ断片、およびｐＴ９（５−８）の３７７ｂｐのＰｓｔＩ／Ｎｏｔ１断片を遊離した。次にこれらの２つの断片を組み合わせて、Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ１で消化したｐＺＵＦ１７（配列番号１２１、図７Ｃ）と共に一方向性にライゲートして、ｐＤＭＷ２３７（配列番号４６）を発生させた。したがって合成的に生成されたＩｇＤ９ｅＳ遺伝子は、発現ベクターｐＤＭＷ２３７中でＦＢＡＩＮプロモーターおよびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０ターミネーターに挟まれていた。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１１５の最終構築
ｐＤＭＷ２６３（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含有する）からのＮｃｏＩ／ＳａｌＩＤＮＡ断片をｐＤＭＷ２３７（ＩｇＤ９ｅＳを含有する）のＮｃｏＩ／ＳａｌＩＤＮＡ断片中にクローンして、キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＩｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるｐＹ１１５（配列番号４５、図８）を生成した。図８でＦＢＡＩＮｍを「Ｆｂａ１＋イントロン」と標識し、ＩｇＤ９ｅＳを「Ｉ ｇａｌｂａｎａ ｓｙｎｔｈ Ｄ９ ｅｌｏｎｇａｓ」と標識する。
実施例６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＢＹ２（ＥｇＤ９ｅを含んでなる）およびｐＢＹ１−ＦＡＥ（ＩｇＤ９ｅＳを含んでなる）の構築
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＢＹ２（キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）およびｐＢＹ１−ＦＡＥ（キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＩｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）の合成について述べる。実施例７（下記）で述べられるように、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現した際のＩｇＤ９ｅＳのΔ９エロンガーゼ活性をＥｇＤ９ｅのそれと比較した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＢＹ２の構築
プラスミドｐＹ１１５（配列番号４５、実施例５）をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化して、得られたＤＮＡ末端をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）を使用して充填した。充填して平滑末端を形成した後、ＤＮＡ断片を仔ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理し、アガロースゲル電気泳動法を使用して分離した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含有する６９８９ｂｐの断片をアガロースゲルから切除して、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン・インコーポレーテッド（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）（登録商標）ゲル抽出キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）ベクター変換システム（カタログ番号１１８２３−０２９）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、精製した６９８９ｂｐの断片をカセットｒｆＡとライゲートし、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）目的ベクターｐＢＹ１（配列番号４７、図９Ａ）を形成した。
カリフォルニア州バレンシアのキアゲン・インコーポレーテッド（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）（登録商標）スピン・ミニプレップ（Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを使用して製造業者のプロトコルに従って、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆ（実施例２および３）からプラスミドを精製した。インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）ＬＲクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）（商標）ＩＩ酵素ミックス（カタログ番号１１７９１−０２０）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからのｃＤＮＡをｐＢＹ１に転移してｐＢＹ２（配列番号４８、図９Ｂ）を形成した。ウォブル（Ｗｏｂｂｌｅ）Ｔプライマーで配列決定を実施したため、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆ（すなわちｐｏｌｙＡ ｔａｉｌを含有する）の３’末端の全配列は未知であった。制限酵素消化およびアガロースゲル分析に基づいて、ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌは１００ｂｐ未満の長さであるように見えた。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＢＹ１−ＦＡＥの構築
インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのアキュプライム（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ）（商標）Ｔａｑポリメラーゼハイフィデリティ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（カタログ番号１２３４６−０８６）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、オリゴヌクレオチドプライマーｉｇ−ｓ（配列番号４９）およびｉｇ−ａｓ（配列番号５０）で、ＩｇＤ９ｅＳをｐＹ１１５（配列番号４５、実施例５）から増殖した。インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのｐＥＮＴＲ（商標）ディレクショナル（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、得られたＤＮＡ断片をｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）中にクローンしてｐＥＮＴＲ−ＦＡＥを生成した。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン・インコーポレーテッド（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）（登録商標）スピンミニプレップ（Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを使用して、上記のように製造業者のプロトコルに従って、プラスミドｐＥＮＴＲ−ＦＡＥを精製した。インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）ＬＲクロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）（商標）ＩＩ酵素ミックス（カタログ番号１１７９１−０２０）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＩｇＤ９ｅＳのためのＣＤＳをｐＢＹ１に転移してｐＢＹ１−ＦＡＥを形成した（配列番号５１、図９Ｃ）。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）へのベクター形質転換
ｐＢＹ２およびｐＢＹ１−ＦＡＥの創出に続いて、各ベクターをインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞に形質転換した。形質転換細胞を生育させ、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン・インコーポレーテッド（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）（登録商標）スピンミニプレップ（Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを使用して、ｐＢＹ２およびｐＢＹ１−ＦＡＥを単離した。
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株中のＥｇＤ９ｅの機能解析
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株中のＥｇＤ９ｅの機能解析について述べる。これは、（１）Ｙ２２２４株（すなわち野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自立的突然変異からのＦＯＡ抵抗性突然変異体）の構築、および（２）ｐＢＹ２（ＥｇＤ９ｅを発現する）またはｐＢＹ１−ＦＡＥ（ＩｇＤ９ｅＳを発現する）のどちらかを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株の形質転換生物中の脂質プロフィールの比較を必要とした。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株の発生
Ｙ２２２４株を次のようにして単離した。ＹＰＤ寒天プレートからのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２細胞をザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からの２５０ｍｇ／Ｌの５−ＦＯＡを含有する最少培地プレート（各７５ｍｇ／Ｌのウラシルおよびウリジン、硫酸アンモニウム含有の６．７ｇ／ＬのＹＮＢ、アミノ酸なし、２０ｇ／Ｌのグルコース）上に画線培養した。プレートを２８℃でインキュベートし、得られたコロニーの内４つを２００ｍｇ／ｍＬの５−ＦＯＡを含有する最少培地プレート上、およびウラシルおよびウリジンを欠く最少培地プレート上に別々にパッチしてウラシルＵｒａ３栄養要求性を確認した。引き続いてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株をＹＰＤ寒天上で２８℃で生育させた。
ｐＢＹ１−ＦＡＥおよびｐＢＹ２を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
ｐＢＹ１−ＦＡＥ（キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＩｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）およびｐＢＹ２（キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）を一般方法で述べられるようにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株に形質転換した。細胞をウラシルを欠く最少培地プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
次に形質転換体の単一コロニーをウラシルを欠く３ｍＬの最少培地中で３０℃で約１．０のＯＤ６００に生育させた。対照として、Ｙ２２２４をウラシルを添加した最少培地上でもまた同様に生育させた。細胞を引き続いて水で洗浄し、遠心分離によって収集して、脂質を前出のようにしてエステル交換した。実施例４で述べられる方法（すなわちｐＹ１１９含有Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞のための）を使用して、ｐＢＹ１−ＦＡＥ、ｐＢＹ２、または皆無の発現ベクターを含有する細胞からのＦＡＭＥをＧＣによって分析した。それぞれ３つの複製の平均の結果を表８に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（９）（パルミトレイン酸）、１７：１（９）、１８：０、１８：１（９）（オレイン酸）、ＬＡ、およびＥＤＡと同定された。実施例４で述べられるようにして、延長効率（「％Ｅｌｏ ＬＡ」）を計算した。
表８に示すように、結果は、ＬＡをＥＤＡに転換する際に、ＥｇＤ９ｅがＩｇＤ９ｅＳよりも大きい基質変換効率で機能することを実証した。
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された（ＥｇＤ９ｅＳ）合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来）を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳの構築および機能解析
本実施例は、キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ＥＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ベクターｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳの発現について述べ、ここでＥｇＤ９ｅＳは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の合成Δ９エロンガーゼであり、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化されている。したがってこの分析は、（１）ＥｇＤ９ｅＳの合成、（２）ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳの構築およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株への形質転換、および（３）ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（ＥｇＤ９ｅＳを発現する）を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株の形質転換生物中の脂質プロフィール分析を必要とした。
ＥｇＤ９ｅＳの合成
実施例５および国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットで述べられるのと類似した様式で、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子（ＥｇＤ９ｅ、配列番号１および２）のコドン使用頻度をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般方法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ ２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年）に従って、ＥｇＤ９ｅ（すなわちクローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆから）のコード配列に基づき、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「ＥｇＤ９ｅＳ」と称する、配列番号３）をデザインした。翻訳開始部位の改変に加えて７７７ｂｐのコード領域の１１７ｂｐ（１５．１％）を改変し、１０６コドンを最適化した。図１０はＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ９ｅＳのヌクレオチド配列の比較を示す。コドン最適化遺伝子中のいずれの改変も、コードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を変化させなかった。デザインされたＥｇＤ９ｅＳ遺伝子は、ニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって合成され、ｐＵＣ５７（ジェンバンク登録番号Ｙ１４８３７）中にクローンされて、ｐＥｇＤ９Ｓを生成した。
コンストラクトｐＺｕＦｍＥｇＤ９Ｅ（ＥｇＤ９Ｅを含んでなる）およびｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（ＥｇＤ９ＥＳを含んでなる）の発生
ｐＺＵＦ１７（図７Ｃ、配列番号１２１）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片をＥｇＤ９ｅＳを含んでなるｐＥｇＤ９ＳからのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片で置換して、キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ＥＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（配列番号５３）を構築した。このライゲーション生成物は、自己複製する発現ベクターｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳであり、したがってそれは次の構成要素を含有した。
キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９Ｅ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺｕＦｍＥｇＤ９Ｅ（配列番号５２）は、ｐＺＵＦ１７プラスミド主鎖を使用して、同様にして合成した。
ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥおよびｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
一般方法で述べるようにして、プラスミドｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥおよびｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（それぞれキメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｐｅｘ２０遺伝子およびＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）をＹ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自立的突然変異からのＦＯＡ抵抗性突然変異体、実施例７）に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で２日間の生育後、ＭＭプレート上に生育した３つの形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび生育すると、これらの株を３０℃の３ｍＬの液体ＭＭ中に個々に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離して収集して脂質を抽出し、エステル交換反応によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９Ｅがある７つの全形質転換体中で約３．２％のＥＤＡ（Ｃ２０：２）の総脂質が生成されたことを示し、これらの７株中でのＬＡ（Ｃ１８：２）からＥＤＡへの平均変換効率は約１８．３％と判定された（平均、実施例４で述べられるように計算された）。
対照的にＧＣ分析は、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳがある７つの全形質転換体中で、約３．６％のＥＤＡ（Ｃ２０：２）の総脂質が生成されたことを示し、これらの７株中でのＬＡ（Ｃ１８：２）からＥＤＡへの平均変換効率は約２０．１％と判定された。したがって実験的データは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（すなわちＥｇＤ９ｅＳ、配列番号３）が、ＬＡをＥＤＡに延長するにあたり野生型ＥｇＤ９ｅ遺伝子（すなわち配列番号１）よりも約１６．２％より効率的であることを実証した。
実施例９
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ）発現のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１２０の構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅ発現のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ベクターｐＹ１２０の構築について述べる。具体的には、ｐＫＲ９０６からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＤＮＡ断片（ＥｇＤ９ｅを含んでなる、実施例４から）をｐＹ１１５からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＤＮＡ断片（図８、実施例５、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含んでなる）中にクローンして、ｐＹ１２０（配列番号５４、図１１Ａ）を生成した。この図では、ＥｇＤ９ｅを「ｅｕｇ ｅｌ１」と標識する。
実施例１０
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ）発現のためのダイズ発現ベクターｐＫＲ９１２の構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅ発現のためのダイズベクターｐＫＲ９１２の構築について述べる。
その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０２／００８２６９号パンフレットで以前述べられたｐＫＳ１２３の誘導体である開始プラスミドｐＫＲ７２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０１９、配列番号５５）は、Ｔ７プロモーターおよび転写ターミネーター（Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット）で挟まれたハイグロマイシンＢリン酸転移酵素遺伝子（ＨＰＴ）（グリッツ（Ｇｒｉｔｚ），Ｌ．およびデービーズ（Ｄａｖｉｅｓ），Ｊ．、Ｇｅｎｅ、２５：１７９〜１８８頁（１９８３年））と、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中での選択および複製のための細菌複製起点（ｏｒｉ）を含有する。さらにｐＫＲ７２はまた、ダイズなどの植物中での選択のために、３５Ｓプロモーター（オーデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０〜８１２頁（１９８５年））およびＮＯＳ３’転写ターミネーター（デピッカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：５６１〜５７０頁（１９８２年））で挟まれたＨＰＴ遺伝子（３５Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳ３’カセット）も含有する。ｐＫＲ７２はまた、β−コングリシニンα’サブユニットのためのプロモーター（「ＢＣＯＮ Ｐｒｏ」；ビーチィ（Ｂｅａｃｈｙ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：３０４７〜３０５３頁（１９８５年））およびファゾリン遺伝子の３’転写終結領域（ドイル（Ｄｏｙｌｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：９２２８〜９２３８頁（１９８６年））で挟まれたＮｏｔＩ制限部位も含有し、したがってダイズ種子中でのＮｏｔＩ部位にクローンした遺伝子の強力な組織特異的発現を可能にする。
ＮｏｔＩでの消化によってＥｇＤ９ｅをｐＫＲ９０６（実施例４）から放出し、ｐＫＲ７２のＮｏｔＩ部位にクローンして、ｐＫＲ９１２（配列番号５６）を生成した。ｐＫＲ９１２の概略図を図１１Ｂに示し、その中でＥｇＤ９ｅを「ｅｕｇ ｅｌ１」と標識する。
実施例１１
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ）発現のためのダイズ中間体クローニングベクターｐＫＲ９１１の構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅの発現のためのダイズベクターｐＫＲ９１１の構築について述べる。
その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０２／００９０５号パンフレットで以前述べられたベクターｐＫＳ１０２（配列番号５７）は、Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット（実施例１０で述べられる）、および細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中での選択および複製のための細菌複製起点（ｏｒｉ）を含有する。
その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで以前述べられたベクターｐＫＲ１９７（配列番号５８）は、Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセットおよび細菌ｏｒｉを含有するプラスミドｐＫＳ１０２（配列番号５７）からのＡｓｃＩ断片と、βｃｏｎ／ＮｏｔＩ／Ｐｈａｓカセットを含有するプラスミドｐＫＲ７２（実施例１０で述べられる）のＡｓｃＩ断片とを組み合わせて構築された。
ＮｏｔＩでの消化によってＥｇＤ９ｅをｐＫＲ９０６（実施例４）から放出し、ｐＫＲ１９７のＮｏｔＩ部位にクローンして、中間体クローニングベクターｐＫＲ９１１（配列番号５９）を生成した。ｐＫＲ９１１の概略図を図１２Ａに示し、その中でＥｇＤ９ｅを「ｅｕｇ ｅｌ１」と標識する。
実施例１２
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ（ＥｇＤ８）のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ
本実施例は、米国特許出願第１１／１６６００３号明細書および米国特許出願第１１／１６６９９３号明細書（その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第０６／０１２３２６号パンフレットに対応する）で開示されるようなミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ８デサチュラーゼ（「ＥｇＤ８」と命名される）の単離について述べる。この遺伝子の単離は、ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８の同時発現を可能にし、それによってΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を可能して、ＬＡおよび／またはＡＬＡからのＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの蓄積を可能にするのに望ましい。
カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（商標）選択システムを使用して、製造業者のプロトコルに従って、提供されるオリゴ（ｄＴ）プライマーによって、７６５ｎｇのｍＲＮＡ（実施例１）からミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを２０μＬの水に溶解した。
下で述べられる条件を使用して、ｃＤＮＡからミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼを増幅した。具体的には、ｃＤＮＡ（１μＬ）を５０ピコモルのＥｇ５−１（配列番号６２）、５０ピコモルのＥｇ３−３（配列番号６３）、ウイスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からの１μＬのＰＣＲヌクレオチドミックス（１０ｍＭ）、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの１．５μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの０．５μＬのＴａｑポリメラーゼと合わせ、水で５０μＬにした。反応条件は９４℃で３分間、続いて９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で１分間を３５サイクルであった。ＰＣＲを７２℃で７分間で終了し、次に４℃に保った。５μＬに対するアガロースゲル電気泳動法によってＰＣＲ反応を分析し、分子量１．３ｋＢ前後のＤＮＡバンドが観察された。残る４５μＬの生成物をアガロースゲル電気泳動法によって分離して、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からのザイモクリーン（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ）（商標）ゲルＤＮＡ回収キットを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡバンドを精製した。得られたＤＮＡを製造業者のプロトコルに従って、プロメガプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージーベクター（Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）中にクローンした。Ｔ７（配列番号６４）、Ｍ１３−２８Ｒｅｖ（配列番号６５）、Ｅｇ３−２（配列番号６６）、およびＥｇ５−２（配列番号６７）を使用して複数クローンを配列決定した。
このようにしてミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ（すなわちＥｇ５）のＤＮＡ配列（配列番号６０）を得た。Ｅｇ５の翻訳は、配列番号６１で記載されるタンパク質配列を生じさせた。ここでの目的では、「Ｅｇ５」はこの明細書残部全体を通じて「ＥｇＤ８」と称される。
ここでは詳述しないが、前出の実施例５で述べられる方法を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ＥｇＤ８の合成バージョン（米国特許出願第１１／１６６００３号明細書および米国特許出願第１１／１６６９９３号明細書（国際公開第０６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第０６／０１２３２６号パンフレットに対応する）で開示されるような）もまた作り出された。ＥｇＤ８Ｓと命名されたこの遺伝子は、ここで配列番号６８および６９として述べられる。
実施例１３
ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８の同時発現のためのダイズ発現ベクターｐＫＲ９１３の構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８の同時発現のためのダイズベクターｐＫＲ９１３の構築について述べる。
その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０２／００９０４号パンフレットで以前述べられたベクターｐＫＳ１２１（配列番号７０）は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ダイズトリプシン阻害剤（ＫＴｉ）プロモーター（ジョフク（Ｊｏｆｕｋｕ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１：１０７９〜１０９３頁（１９８９年））と、その単離について米国特許第６，３７２，９６５号明細書で述べられるＫＴｉ３’終結領域とで挟まれたＮｏｔＩ部位を含有する（ＫＴｉ／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセット）。
その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０５／０４７４７９号パンフレットで以前述べられたベクターｐＫＲ４５７（配列番号７１）はｐＫＳ１２１の誘導体であり、ＫＴｉ／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセット上流および下流の制限部位が、いくつかのサブクローニングステップを通じて改変されている。ベクターｐＫＲ４５７はまた、その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで以前述べられたダイズアルブミン転写ターミネーター（ＧＭ−ＡＬＢ ＴＥＲＭ）をＫＴｉターミネーター下流に含有して、転写終結を伸ばして強化する。ｐＫＲ４５７では、ＫＴｉ／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセット中のＫＴｉプロモーター上流のＢａｍＨＩ部位を除去して、ＢｓｉＷＩ、ＳａｌＩ、ＳｂｆＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する新しい配列（配列番号７２）が付加し、ＢｓｉＷＩ部位がＫＴｉプロモーター５’末端に最も近かった。
さらにｐＫＳ１２１からのＫＴｉ／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセット中のＫＴｉターミネーター下流のＳａｌＩ部位を除去して、ＸｂａＩ（ＫＴｉターミネーター３’末端に最も近い）、ＢａｍＨＩ部位、ダイズアルブミン転写ターミネーター配列、ＢｓｉＷＩ部位、および別のＢａｍＨＩ部位を含有する新しい配列（配列番号７３）を付加した。アルブミン転写ターミネーターは、ＢｓｉＷＩ部位をターミネーター３’末端に導入するようにデザインされたプライマーｏＳａｌｂ−１２（配列番号７４）と、ＢａｍＨＩ部位をターミネーター５’末端に導入するようにデザインされたプライマーｏＳａｌｂ−１３（配列番号７５）とを使用して、ダイズゲノムＤＮＡから以前増幅されている。
ＮｏｔＩでの消化によって、実施例１２で述べられるｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージーベクター（Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）からＥｇＤ８（配列番号６０）を放出し、ｐＫＲ４５７のＮｏｔＩ部位にクローンしてｐＫＲ６８０（配列番号７６）を生成した。次にプラスミドｐＫＲ６８０をＢｓｉＷＩで消化し、ＥｇＤ８を含有する断片をｐＫＲ９１１（配列番号５９、実施例１１）のＢｓｉＷＩ部位中にクローンしてｐＫＲ９１３（配列番号７７）を生成した。ｐＫＲ９１３の概略図を図１２Ｂに示す。ここでＥｇＤ９ｅを「ｅｕｇ ｅｌ１」と標識し、ＥｇＤ８を「ｅｕｇ ｄ８−ｓｑ５」と標識する。
実施例１４
ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８の同時発現のためのダイズ発現ベクターの構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８の同時発現のためのダイズベクターの構築について述べる。具体的には、プラスミドｐＫＲ６８０（配列番号７６、実施例１３）をＢｓｉＷＩで消化して、ＥｇＤ８（配列番号６０）を含有する断片をｐＫＲ９１２（配列番号５６、実施例１０）のＢｓｉＷＩ部位にクローンした。このようにして強力な種子特異的プロモーターの後ろで、ＥｇＤ８をＥｇＤ９ｅと同時発現する。
実施例１５
ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８と、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（Ｍａｄ５）との同時発現のためのベクター構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ８と、さらにその他のＰＵＦＡ遺伝子（すなわちΔ５デサチュラーゼ）との同時発現のためのダイズベクターの構築について述べる。
その内容を参照によって本明細書に援用する米国特許第６，０７５，１８３号明細書および国際公開第号パンフレット国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第０５／０４７９４７９号パンフレットで述べられ、全て強力種子特異的プロモーターの制御下にある、ＥｇＤ８（配列番号６０）、ＥｇＤ９ｅ（配列番号１）、およびモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（配列番号７８、「Ｍａｄ５」）を含有するダイズ発現ベクターを次のようにして構築する。
いくつかのサブクローニングステップを通じて、（その内容を参照によって本明細書に援用する国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）ベクターｐＫＲ２８７のＳｍａＩ部位に、ＤＮＡ配列（配列番号８０）を効果的に付加して、ｐＫＲ７６７（配列番号８１）を生成する。このようにして国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第０５／０４７９４７９号パンフレットで述べられるＧｙ１／Ｍａｄ５／ｌｅｇＡ２カセットのｌｅｇ１Ａ転写ターミネーター３’末端に、ＳｂｆＩ制限部位を付加する。
ＳｂｆＩので消化によってＧｙ１／Ｍａｄ５／ｌｅｇＡ２カセットをｐＫＲ７６７から放出し、得られた断片を実施例１４で述べられるベクターのＳｂｆＩ部位中にクローンして、強力種子特異的プロモーターの制御下に全３遺伝子（すなわちＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５）を同時発現する新しいベクターを生成した。
実施例１６
ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を含んでなるダイズ発現ベクターと、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）との同時発現
本実施例は、実施例１５で述べられるダイズ発現ベクター（ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を発現する）と、複数の異なる種子特異的プロモーター／長鎖ＰＵＦＡ−生合成遺伝子の組み合わせを発現する（例えばΔ１７デサチュラーゼを発現する）その他のベクターとを同時形質転換する手段について述べる。プラスミド全体、または適切な遺伝子の組み合わせを含有するプラスミドから精製されたＡｓｃＩ断片を使用する（いずれのプラスミド断片のあらゆる組み合わせも使用できる）。
例えば実施例１５で述べられるベクターと、アネキシンプロモーター制御下にあって植物中での選択ためのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有するサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）を含有するｐＫＲ３２８（配列番号８２、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）とを同時形質転換できる。
同様に実施例１５で述べられるベクターと、ｐＫＲ３２８に類似するが植物中での選択ためのＳＡＭＳ／ＡＬＳ／ＡＬＳ３’カセット（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）を有する２つのベクターｐＫＲ８８６またはｐＫＲ８８６ｒ（それぞれ図１３Ａおよび図１３Ｂ）とを同時形質転換できる。具体的には、ｐＫＲ２７１（配列番号８５、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）からのＡｎｎ／Ｓｄｄ１７／ＢＤ３０カセットを含有するＰｓｔＩ断片をｐＫＲ２２６（配列番号８６、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）のＳｂｆＩ部位にクローンして、ベクターｐＫＲ８８６（配列番号８３）およびｐＫＲ８８６ｒ（配列番号８４）を作成する。
実施例１７
ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ、およびＭａｄ５を含んでなるダイズ発現ベクターと、ＳｄＤ１７およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｆａｄ３との同時発現
本実施例は実施例１５で述べられるダイズ発現ベクター（ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を発現する）と、複数の異なる種子特異的プロモーター／長鎖ＰＵＦＡ−生合成遺伝子の組み合わせを発現する（例えばΔ１７デサチュラーゼおよびＦａｄ３を発現する）その他のベクターとを同時形質転換する手段について述べる。
実施例１５で述べられるベクターと、ｐＫＲ２７５（配列番号８７、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９８９を有する）またはｐＫＲ３２９（配列番号８８、国際公開第０４／０７１４６号パンフレットで述べられる）のどちらかとをダイズに同時形質転換できる。プラスミドｐＫＲ２７５およびｐＫＲ３２９は、それぞれＡＬＳまたはハイグロマイシン選択を有し、Ａｎｎ／Ｓｄｄ１７／ＢＤ３０カセットに加えてＫＴｉ／Ｆａｄ３／ＫＴｉ３’遺伝子カセット（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）を含有する。このようにしてアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｆａｄ３遺伝子と、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）とを強力種子特異的プロモーターの後ろで同時発現できる。
実施例１８
ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を含んでなるダイズ発現ベクターと、ＳｄＤ１７およびフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５）との同時発現
本実施例は、実施例１５で述べられるダイズ発現ベクター（ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を発現する）と、複数の異なる種子特異的プロモーター／長鎖ＰＵＦＡ−生合成遺伝子の組み合わせ発現する（例えばΔ１７デサチュラーゼおよびΔ１５デサチュラーゼを発現する）その他のベクターとを同時形質転換する手段について述べる。
実施例１５で述べられるベクターと、ハイグロマイシン選択を有してＫＴｉプロモーター制御下のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５）を含有するｐＫＲ５８５（配列番号８９、国際公開第０５／０４７９４７９号パンフレットで述べられ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０１９を有する）とをダイズに同時形質転換できる。
実施例１５で述べられるベクターはまた、ＡＬＳ選択を有して、Ａｎｎ／Ｓｄｄ１７／ＢＤ３０カセットに加えてＫＴｉプロモーター制御下のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを含有するｐＫＲ６６９ともダイズに同時形質転換できる。プラスミドｐＫＲ６６９を次のようにして生成する。ＢｓｉＷＩでの消化によって、プラスミドｐＫＲ５７８（配列番号９０、国際公開第０５／０４７９４７９号パンフレットで述べられ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６２８０を有する）からＫＴｉプロモーター：ＦｍＤ１５：ＫＴｉターミネーターカセットを放出し、選択のためのＡＬＳ遺伝子、Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット、および細菌ｏｒｉ領域を含有するプラスミドｐＫＲ２２６（配列番号８６、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）のＢｓｉＷＩ部位にクローンして、ｐＫＲ６６７（配列番号９１）を生成する。プラスミドｐＫＲ２７１（配列番号８５、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）をＰｓｔＩで消化して、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼを含有する断片をｐＫＲ６６７のＳｂｆＩ部位にクローンして、ｐＫＲ６６９を生成する。このようにして、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼとサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼとを強力種子特異的プロモーターの後ろで同時発現できる。ｐＫＲ６６９の概略図を図１４Ａに示す。
実施例１５で述べられるベクターはまた、ＡＬＳ選択を有してＡｎｎ／Ｓｄｄ１７／ＢＤ３０カセットに加えてダイズアルブミンプロモーター（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）制御下のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５）を含有するｐＫＲ８７３（配列番号９２）ともダイズに同時形質転換できる。具体的には、プラスミドｐＫＲ８７３を次のようにして生成する。ＰＣＲを使用して、プラスミドｐＫＲ１３２（配列番号９３、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）からＳＡ／ＮｏｔＩ／ＳＡ３’カセットを増幅する。プライマーｏＳＡｌｂ−９（配列番号９４）は、プロモーター５’末端にＸｂａＩおよびＢｓｉＷＩ部位を導入するようにデザインされ、プライマーｏＳＡｌｂ−２（配列番号９５）は、ターミネーター３’末端にＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩ部位を導入するようにデザインされる。得られたＰＣＲ断片を引き続いて、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からのｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＡＭＰ ＳＫ（＋）中にクローンして、ｐＫＲ１６０（配列番号９６）を生成する。次にプラスミドｐＫＲ１６０をＢｓｉＷＩで消化して、ＳＡ／ＮｏｔＩ／ＳＡ３’カセットをｐＫＲ１２４（配列番号９７、国際公開第０５／０４７９４７９号パンフレットで述べられる）のＢｓｉＷＩ部位にライゲートして、ｐＫＲ１６３（配列番号９８）を生成する。フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを含有するｐＹ３４（配列番号９９、国際公開第０５／０４７９４７９号パンフレットで述べられる）からのＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１６３（配列番号９８）のＮｏｔＩ部位にクローンして、ｐＫＲ８６３（配列番号１００）を生成する。ＢｓｉＷＩでの消化によってプラスミドｐＫＲ８６３からＳＡ／ＦｍＤ１５／ＳＡ３’カセットを放出し、選択のためのＡＬＳ遺伝子、Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット、および細菌ｏｒｉ領域を含有するプラスミドｐＫＲ２２６（配列番号８６、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）のＢｓｉＷＩ部位にクローンして、ｐＫＲ８６９（配列番号１０１）を生成する。プラスミドｐＫＲ２７１（配列番号８５、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）をＰｓｔＩで消化し、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼを含有する断片をｐＫＲ８６９（配列番号１０１）のＳｂｆＩ部位にクローンして、それによってｐＫＲ８７３（配列番号９２）を生成する。このようにしてフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼとサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼとを強力種子特異的プロモーターの後ろで同時発現できる。ｐＫＲ８７３の概略図を図１４Ｂに示す。
実施例１９
ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を含んでなるダイズ発現ベクターと、ＳｄＤ１７およびモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（ＭａＥＬＯ）との同時発現
本実施例は、実施例１５で述べられるダイズ発現ベクター（ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５発現する）と、複数の異なる種子特異的プロモーター／長鎖ＰＵＦＡ−生合成遺伝子の組み合わせを発現する（例えばΔ１７デサチュラーゼおよびエロンガーゼを発現する）その他のベクターとを同時形質転換する手段について述べる。
実施例１５で述べられるベクターはまた、ＡＬＳ選択を有してＡｎｎ／Ｓｄｄ１７／ＢＤ３０カセットに加えて、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第００／１２７２０号パンフレットで述べられる）の制御下にダイズアルブミンプロモーター（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）を含有するベクターともダイズに同時形質転換できる。このプラスミドは、前述したのと同様にして生成できる。例えばモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼ（「Ｍａｅｌｏ」）を含有するｐＫＲ２７０（配列番号１０２、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）からのＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１６３（配列番号９８）のＮｏｔＩ部位にクローンして、ＳＡ／Ｍａｅｌｏ／ＳＡ３’カセットを有するベクターを生成できる。ＢｓｉＷＩでの消化によってプラスミドからＳＡ／Ｍａｅｌｏ／ＳＡ３’カセットを放出し、選択のためのＡＬＳ遺伝子、Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット、および細菌ｏｒｉ領域を含有するプラスミドｐＫＲ２２６（配列番号８６、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）のＢｓｉＷＩ部位にクローンして、新しいプラスミドを生成できる。次にプラスミドｐＫＲ２７１（配列番号８５、国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）をＰｓｔＩで消化して、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼを含有する断片をＳＡ／Ｍａｅｌｏ／ＳＡ３’カセットを含有する新しいプラスミドのＳｂｆＩ部位にクローンする。このようにしてモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）エロンガーゼと、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼとを強力種子特異的プロモーターの後ろで同時発現できる。
実施例２０
ＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５を含んでなるダイズ発現ベクターと、Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼとの同時発現
本実施例は、実施例１５で述べられるダイズ発現ベクター（発現するＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ８、およびＭａｄ５）と、複数の異なる種子特異的プロモーター／長鎖ＰＵＦＡ−生合成遺伝子の組み合わせを発現する（例えばＣ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼを発現する）その他のベクターとを同時形質転換する手段について述べる。
Ｃ２０／２２エロンガーゼ（Δ５エロンガーゼおよび／またはＥＰＡエロンガーゼとしても同定される）および／またはΔ４デサチュラーゼもまた、ここで述べられるのと類似したダイズ発現ベクター中で同時発現できる。例えばシゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）（国際公開第０２／０９０４９３号パンフレットで述べられる）からのΔ４デサチュラーゼ、またはパブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）（国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられる）からのΔ５エロンガーゼを国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットで述べられるものなどの適切なダイズ発現ベクター中にクローンできる。ＮｏｔＩ部位をΔ４デサチュラーゼまたはΔ５エロンガーゼの５’および３’末端に導入するようにデザインされたＰＣＲプライマーを使用して、遺伝子を増幅できる。次に得られたＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化して、強力種子特異的プロモーターおよび転写ターミネーターで挟まれたＮｏｔＩ部位を含有する、適切なダイズ発現ベクター中にクローンできる。さらにこれに限定されるものではないが、ここで述べられるもの、または国際公開第０４／０７１４６７号パンフレットまたは国際公開第０５／０４７４７９号パンフレットで述べられものなどのその他のベクター中へのサブクローニングからは、ダイズ中でのΔ４デサチュラーゼおよび／またはΔ５エロンガーゼの発現および同時発現に適したベクターが生じるはずである。
実施例２１
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡの調製
本実施例は、メイン州ウェストブースベイハーバーのビジェロー海洋科学研究所（Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｏｃｅａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ））のプロバゾリ−ギィヤール国立海洋植物プランクトン培養センター（Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ）（ＣＣＭＰ）から購入したユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡの調製について述べる。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの調製
カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬を使用して、製造業者のプロトコルに従って、１Ｌの培養から全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを単離した。具体的には細胞ペレットを０．７５ｍＬのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬に再懸濁し、０．５ｍＬの０．５ｍｍガラスビーズと混合してオクラホマ州バートルズビルのバイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ））からのミニビーズビーター中で最速高設定で３分間均質化した。混合物をエッペンドルフ遠心分離内で１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、残骸およびガラスビーズを除去した。上清をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの１５０μＬの２４：１クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。上部水相をＲＮＡ単離のために使用し、下部有機相をＤＮＡ単離のために使用した。
ＲＮＡ単離では、水相を０．３７５ｍＬのイソプロピルアルコールと混合し、室温で５分間インキュベートした。８，０００ｒｐｍおよび４℃で５分間の遠心分離によって、沈殿したＲＮＡを収集した。ペレットを０．７ｍＬの８０％エタノールで一度洗浄し、風乾した。このようにして３６０μｇの総ＲＮＡを得た。
ゲノムＤＮＡ単離では、下部有機相を７５μＬのエタノールと混合し、室温で５分間インキュベートした。次にエッペンドルフ遠心分離内で、サンプルを５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。ペレットを０．７５ｍＬの０．１Ｍクエン酸ナトリウム：１０％エタノールで２回洗浄した。毎回、サンプルを洗浄溶液中で室温で１５分間インキュベートし、５，０００ｒｐｍおよび４℃で５分間の遠心分離がそれに続いた。ペレットを風乾し、３００μＬの８ｍＭ ＮａＯＨに再溶解した。サンプルを１ＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７．５に調節した。次にカリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのＰＣＲ精製キットで、製造業者のプロトコルで述べられる通りにして、ゲノムＤＮＡをさらに精製した。このようにして４０μｇのゲノムＤＮＡを単離した。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのｃＤＮＡ調製
カリフォルニア州パロアルトのＢＤバイオサイエンス・クローンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣｌｏｎＴｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））からのクリエーター（Ｃｒｅａｔｏｒ）（商標）スマート（ＳＭＡＲＴ）（商標）ｃＤＮＡライブラリー構築キットを使用して、二本鎖ｃＤＮＡを発生させた。具体的には第１のｃＤＮＡストランド合成では、１μＬの総ＲＮＡサンプル（１．２μｇ）を１μＬのスマート（ＳＭＡＲＴ）（商標）ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号１０３）、１μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０４）、および２μＬの水と個々に混合した。混合物を７５℃で５分間加熱して、氷上で５分間冷却した。サンプルに、２μＬの５×第１ストランド緩衝液、１μＬの２０ｍＭ ＤＴＴ、１μＬのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、および１μＬのパワースクリプト（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素を添加した。サンプルを４２℃で１時間インキュベートした。
第１のｃＤＮＡストランド合成混合物を増幅ためのテンプレートとして使用した。具体的には、反応混合物は、２μＬの上記第１のｃＤＮＡストランドサンプル、８０μＬの水、１０μＬの１０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ ＰＣＲ緩衝液、２μＬの５０×ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、２μＬの５’−ＰＣＲプライマー（配列番号１０５）、２μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’−ＰＣＲプライマー（配列番号１０４）、および２μＬの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ポリメラーゼミックスを含有した。次の条件を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で１分間、続いて９５℃で１０秒間および６８℃で６分間を２０サイクル。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＰＣＲ精製キットで、製造業者のプロトコルで述べられる通りにして、増幅生成物を精製した。精製した生成物を５０μＬの水で溶出した。
実施例２２
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からの全長Δ９エロンガーゼの単離
本実施例は、ドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＥｇＤ９ｅ、実施例３）およびＩ．ガルバナ（ｇａｌｂａｎａ）（ＩｇＤ９ｅ）Δ９エロンガーゼ配列の保存領域由来のプライマーの使用による、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのΔ９エロンガーゼをコードする部分的ｃＤＮＡ断片の同定について述べる。次に部分的ｃＤＮＡ断片の配列に基づいて、遺伝子の５’および３’末端を単離した。これによって、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼ翻訳開始「ＡＴＧ」コドン上流に５１塩基、そしてΔ９エロンガーゼ終止コドンの向こう側に６６２ｂｐ伸びるコンティグ（配列番号１７）のアセンブリーを可能にした。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からの部分的Δ９エロンガーゼをコードするｃＤＮＡ断片の同定
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９をΔ９エロンガーゼの存在について分析した。ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼを単離するのに適した縮重プライマーのデザインは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）プログラムのクラスタルＷ法（緩慢、正確、ゴネット（Ｇｏｎｎｅｔ）オプション；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））を使用して、２つのエロンガーゼのアラインメントをした際に、ＥｇＤ９ｅ（配列番号２）およびＩｇＤ９ｅ（配列番号８）の双方に共通であるいくつかのひと続きの保存アミノ酸配列の同定に基づいた（クラスタルＷアラインメントはここで示さず、代わりにＥｇＤ９ｅおよびＩｇＤ９ｅのクラスタルＶアラインメントが図４として提供される）。
表１０に示すように、このアラインメントに基づいて、次の縮重オリゴヌクレオチドのセットをデザインして、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのΔ９エロンガーゼ遺伝子コード領域の一部を増幅した。
反応混合物は、１μＬの１：２０希釈ｃＤＮＡ、各５μＬの順方向および逆方向プライマー（２０μＭ）、１４μＬの水、およびカリフォルニア州マウンテン・ビューのタカラ・バイオ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）からの２５μＬのタカラ（ＴａＫａＲａ）ＥｘＴａｑ ２×プレミックスを含有した。次のパラメーターを使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。９４℃で１分間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間を３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終延長サイクル。
ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、約２００ｂｐの断片が得られたことを示した。断片をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットで精製し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして、配列決定した。得られた配列（配列番号１３）を翻訳すると、ＢＬＡＳＴプログラム分析（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍａｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年）；実施例３）に基づいて、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（ＩｇＤ９ｅ、配列番号８）からの既知のΔ９エロンガーゼとの相同性を有した。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼ５’末端配列の単離
２回の別個のＰＣＲ増幅において、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９（実施例２１）の二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。１回目のＰＣＲ増幅では、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＢＤクローンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）クリエーター（Ｃｒｅａｔｏｒ）（商標）スマート（ＳＭＡＲＴ）（商標）ｃＤＮＡライブラリーキットからの遺伝子特定オリゴヌクレオチド（すなわち３８９Ｅｌｏ−５−１［配列番号１１０］）と一般的オリゴヌクレオチド５’−ＰＣＲプライマー（配列番号１０５）からなった。次を含んでなる５０μＬの総体積中でＰＣＲ増幅を実施した。テンプレートとしての１μＬの１：１０希釈ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ ｃＤＮＡ、各１μＬのプライマー（２０μＭ）、２２μＬの水、および２５μＬのタカラ（ＴａＫａＲａ）ＥｘＴａｑ ２×プレミックス。増幅を９４℃で９０秒間、次に９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクル、続いて７２℃で７分間の最終延長サイクルで実施した。
２回目のＰＣＲ増幅は、１回目のＰＣＲ反応からの１μＬの希釈された生成物（１：５０）をテンプレートとして使用した。プライマーは、遺伝子特定オリゴヌクレオチド（すなわち３８９Ｅｌｏ−５−２（配列番号１１１））およびオリゴヌクレオチドＤＮＲ ＣＤＳ５’−２（配列番号１１２）からなった。増幅を上述のように行った。
２回目のＰＣＲ反応生成物は１％（ｗ／ｖ）アガロース中で電気泳動され、２００〜８００ｂｐのサイズ範囲に及ぶ拡散したバンドとして現れた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って４００ｂｐ〜６００ｂｐの間の生成物を単離し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天上で選択した。
推定上のΔ９エロンガーゼｃＤＮＡの５’領域を含んでなる１つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡの配列分析は、４０６ｂｐの断片（すなわち５’−ｃＤＮＡ断片１、配列番号１４）を明らかにした。この断片は遺伝子の「ＡＴＧ」翻訳開始コドン近くまで伸びていたが、開始コドンまたは最初の２０〜３０アミノ酸のいずれも配列番号１４に含まれてはいなかった。
次に５’−ｃＤＮＡ断片１（配列番号１４）の配列に基づいて追加的オリゴヌクレオチド（すなわち３８９Ｅｌｏ−５−４（配列番号１１３））をデザインし、ＰＣＲによって遺伝子の完全な５’末端を得た。プライマー３８９Ｅｌｏ−５−２を３８９Ｅｌｏ−５−４で置き換えたこと以外は、反応混合物および増幅条件は、上の２回目のＰＣＲで使用したのと同じであった。アガロースゲル電気泳動法によって分析すると、ＰＣＲ産物はここでも２００〜８００ｂｐの間の拡散したバンドとして現れ、サイズ２００〜５００ｂｐの断片を単離して上述のようにクローンおよび形質転換した。
推定上のΔ９エロンガーゼｃＤＮＡの５’領域を含んでなる１つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡの配列分析は、１９７ｂｐの断片（５’−ｃＤＮＡ断片２、配列番号１５）を明らかにした。これはｃＤＮＡの５’末端、および非翻訳領域上流の５１ｂｐを含んだ。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼの３’末端の単離
テンプレートとしてｃＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅によって推定上のΔ９エロンガーゼの３’末端もまた単離した。方法は５’末端単離について上述したようであったが、１回目および２回目双方のＰＣＲ増幅で使用したプライマーは、下の表１１に示すようであり、２０μＭでなく１０μＭであった。さらに７２℃での最終延長サイクルを７分間から５分間に短縮した。
２回目のＰＣＲ増幅から約１ｋＢのＤＮＡ断片が発生し、それをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットで精製して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして形質転換および配列決定した。いくつかのクローンの配列分析は約１ｋＢＤＮＡ断片が、ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌを含む推定上のΔ９エロンガーゼｃＤＮＡの３’領域を含有したことを示した。９２０ｂｐのアセンブルした３’領域のコンティグ配列は、配列番号１６として示される。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からの全長Δ９エロンガーゼ配列のアセンブリー
オリジナルの部分的ｃＤＮＡ断片（配列番号１３）、２つの５’ｃＤＮＡ断片（配列番号１４および１５）、および３’−ｃＤＮＡ断片（配列番号１６）のアセンブリーは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのΔ９エロンガーゼの完全な配列と、それに加えて５１ｂｐの５’非翻訳領域および６６２ｂｐの３’非翻訳領域（配列番号１７、１５０４ｂｐ）とをもたらした。コード領域は７９２ｂｐの長さであり、アミノ酸２６３個のタンパク質（配列番号５）をコードする。配列番号４は、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼのコード配列（ここでＥ３８９Ｄ９ｅと命名する）のヌクレオチド配列である。
ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９のΔ９エロンガーゼ配列（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）と既知のΔ９エロンガーゼとの比較
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（実施例３）中に含まれる配列との類似性についてＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号５（すなわちＥ３８９Ｄ９ｅ）のアイデンティティを判定した。配列番号５がそれに対して最も高い類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴ比較の結果を％同一性、％類似性、および期待値に従って報告する。「％同一性」とは、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される。「％類似性」とは、２つのタンパク質間で同一のまたは保存されたアミノ酸百分率と定義される。「期待値」は、全くの偶然によりこのサイズのデータベースの検索で予期される、所定スコアでの一致数を特定して、一致の統計的有意性を推定する。
したがってここで配列番号５として記載されるアミノ酸断片は、２Ｅ−４３の期待値で、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（配列番号８）のΔ９エロンガーゼであるＩｇＤ９ｅと、３８％の同一性および５６％の類似性を有する。同様に、Ｅ３８９Ｄ９ｅはクラスタルＶ法を使用してＩｇＤ９ｅと３３．１％同一であり、Ｅ３８９Ｄ９ｅはクラスタルＶ法を使用してＥｇＤ９ｅと６５．１％同一である（図２）。クラスタルＶ法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ），Ｄ．Ｇ．およびシャープ（Ｓｈａｒｐ），Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年））によって実施された配列％同一性計算は、レーザージーン（ＬＡＤＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）ｖ６．１プログラムを使用して、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５、およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で実施した。
実施例２３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株中でのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏ（ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼ（Ｅ３８９Ｄ９ｅ）を含んでなる）の構築および機能解析
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏ（キメラのＦＢＡＩＮｍ：：Ｅ３８９Ｄ９ｅ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）の合成について述べる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株中で発現させた場合のＥ３８９Ｄ９ｅのΔ９エロンガーゼ活性を引き続いて判定した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏの構築
オリゴヌクレオチド３８９Ｅｌｏ−Ｆおよび３８９Ｅｌｏ−Ｒ１（それぞれ配列番号１１６および１１７）をプライマーとして使用して、Ｅ３８９Ｄ９ｅ（配列番号４）の全長ｃＤＮＡを増幅した。ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ ｃＤＮＡ（実施例２１）をテンプレートとして、ＰＣＲ反応を次を含んでなる５０μＬの総体積中で個々に実施した。各１μＬの２０μＭ順方向および逆方向プライマー、１μＬのｃＤＮＡ、１０μＬの５×ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰミックス（各１０μＭ）、３５μＬの水、およびマサチューセッツ州イプスウィッチのニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））からの１μＬのフュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ポリメラーゼ。増幅を９８℃で１分間、次に９８℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル、続いて７２℃で５分間の最終延長サイクルで実施した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＥａｒＩで消化して、Δ９エロンガーゼｃＤＮＡの５’領域を含有する約２１０ｂｐの断片を発生させた。これをＥａｒＩおよびＮｏｔＩでも消化して、ｃＤＮＡの３’領域を含有する約６００ｂｐの断片を発生させた。ＮｃｏＩ／ＥａｒＩおよびＥａｒＩ／ＮｏｔＩ消化断片を１％（ｗ／ｖ）アガロース中でのゲル電気泳動法に続いて精製した。
Ｅ３８９Ｄ９ｅ遺伝子が、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下にあるように、ＮｃｏＩ／ＥａｒＩおよびＥａｒＩ／ＮｏｔＩΔ９エロンガーゼ消化断片とＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１（配列番号１１８）とを一方向性にライゲートした。具体的にはライゲーション反応は、次を含有した。１０μＬの２×ライゲーション緩衝液、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ、各４μＬの約２１０ｂｐおよび約６００ｂｐの断片（各約３００ｎｇ）、および１μＬのｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１（約１５０ｎｇ）。反応混合物を室温で２時間インキュベートして使用し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トップ（Ｔｏｐ）１０コンピテント細胞に形質転換した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ミニプレップ）キットを使用して、形質転換体からのプラスミドＤＮＡを回収した。制限酵素マッピングによって正しいクローンを同定し、最終コンストラクトを「ｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏ」と命名した。
したがってｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏ（図１５Ａ、配列番号１１９）は、その結果次の構成要素を含有した。
ｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
一般方法で述べられるようにして、ｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏ（Ｅ３８９Ｄ９ｅを含んでなる）の５つの個々のクローン、および対照プラスミドｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（実施例７）に形質転換した。ウラシルを欠くＭＭプレート上に細胞を播種して、３０℃に２〜３日間保った。次に各プレートから細胞をこすり取り、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏを含んでなる５つの全形質転換体中でＥＤＡが生成された一方、対照株中ではＥＤＡが生成されなかったことを示した（表１３）。脂肪酸を１８：２（ＬＡ）および２０：２（ＥＤＡ）として同定し、それぞれの組成物を総脂肪酸の％で表す。次の式に従って変換効率を計算した。（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００。式中、「生成物」は、直接生成物と、それに由来する経路中の全生成物とを含む。
上に示す結果は、ここで配列番号４および５で記載されるユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９からのクローンされたｃＤＮＡが、ＬＡをＥＤＡに効率的に不飽和化し、したがってΔ９エロンガーゼとして機能することを確認する。
実施例２４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９に由来する）（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ）を含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＺＵＦＥ３８９Ｓの構築および機能解析
本実施例は、キメラのＦＢＡＩＮ：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ベクターｐＺＵＦＥ３８９Ｓの機能性発現について述べ、ここでＥ３８９Ｄ９ｅＳは、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９由来の合成Δ９エロンガーゼであり、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化されている。したがってこの分析は、次を必要とした。（１）Ｅ３８９Ｄ９ｅＳの合成、（２）ｐＺＵＦＥ３８９Ｓの構築およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株への形質転換、および（３）ｐＺＵＦＥ３８９Ｓを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳを発現する）の形質転換生物中の脂質プロフィール分析。
Ｅ３８９Ｄ９ｅＳの合成
実施例５、実施例８、および国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットで述べられるのと類似した様式で、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９（Ｅ３８９Ｄ９ｅ、配列番号４および５）のΔ９エロンガーゼ遺伝子のコドン使用頻度をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般方法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ ２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年）に従って、Ｅ３８９Ｄ９ｅ（配列番号４）のコード配列に基づき、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」と称する、配列番号６）をデザインした。翻訳開始部位の改変に加えて７９２ｂｐコード領域（停止コドンを含む）の１２８ｂｐ（１６．２％）を改変し、１１３コドンを最適化した。ＧＣ含量は、野生型遺伝子（すなわちＥ３８９Ｄ９ｅ）中の４５．７％から、合成遺伝子（すなわちＥ３８９Ｄ９ｅＳ）中の５０．１％に増大した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をそれぞれ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に組み込んだ。図１６は、Ｅ３８９Ｄ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅＳのヌクレオチド配列の比較を示す。コドン最適化遺伝子中のいずれの改変もコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）を変化させなかった。
デザインされたＥ３８９Ｄ９ｅＳ遺伝子（配列番号６）は、ニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって合成され、ｐＵＣ５７（ジェンバンク登録番号Ｙ１４８３７）中にクローンされて、ｐＥ３８９Ｓ（配列番号１２０）を生成した。
Ｅ３８９Ｄ９ｅＳを含んでなるコンストラクトｐＺＵＦＥ３８９Ｓの発生
ｐＺＵＦ１７（図７Ｃ、配列番号１２１）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片をＥ３８９Ｄ９ｅＳを含んでなるｐＥ３８９Ｓ（配列番号１２０）からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片で置換して、プラスミドｐＺＵＦＥ３８９Ｓ（図１５Ｂ、配列番号１２２）を構築した。このライゲーション生成物はｐＺＵＦＥ３８９Ｓであり、したがってそれは次の構成要素を含有した。
ｐＺＵＦＥ３８９Ｓを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体の機能解析
一般方法で述べるようにして、プラスミドｐＺＵＦＥ３８９ＳをＹ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自立的突然変異からのＦＯＡ抵抗性突然変異体、実施例７）に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で２日間の生育後、形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび生育すると、これらの株を３０℃の３ｍＬの液体ＭＭ中に個々に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離して収集して脂質を抽出し、エステル交換反応によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、１２つの全形質転換体中で約２．２％のＣ２０：２（ＥＤＡ）の総脂質が生成されたことを示し、これらの１２株中でのＣ１８：２からＣ２０：２への変換効率は約１２％と判定された（平均、実施例２３で述べられるように計算された）。
実施例２５
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＥｇＤ９ｅまたはＥｇＤ９ｅＳ）および／またはユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９（Ｅ３８９Ｄ９ｅまたはＥ３８９Ｄ９ｅＳ）Δ９エロンガーゼの発現のための代案のダイズ発現ベクターの構築
上の実施例は、例示的であるが限定を意図しないことが、当業者によって理解されるであろう。例えばここで述べられる方法に類似するがこれに限定されるものではない方法を使用して、ＥｇＤ９ｅの発現のために上の実施例１０、１１、および１３〜１５で作り出されたダイズ発現ベクターのいずれかを容易に改質して、代わりにＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅおよび／またはＥ３８９Ｄ９ｅＳの発現（または同時発現）を可能にできる。Δ９エロンガーゼの５’および３’末端にＮｏｔＩ部位を導入するようにデザインされたＰＣＲプライマーを使用して、遺伝子を増幅できる。次に得られたＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化して、強力種子特異的プロモーターと転写ターミネーターとで挟まれたＮｏｔＩ部位を含有する、適切なダイズ発現ベクター中にクローンできる。ここで述べられる、または国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレットまたは国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレットで述べられる（が、これらに限定されるものではない）その他のベクター中へのさらなるサブクローニングからは、ダイズ中のΔ９エロンガーゼの発現に適したベクターが生じるであろう。
さらにここで述べられる遺伝子、プロモーター、ターミネーター、および遺伝子カセットに加えて、当業者は、ここでＥｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅおよび／またはＥ３８９Ｄ９ｅＳの発現のために述べられる方法に類似するが、これに限定されるものではない方法で、その他のプロモーター／遺伝子／ターミネーターカセットの組み合わせが合成できることを理解できる。同様に、本発明のΔ９エロンガーゼのいずれかとの同時発現のために、その他のＰＵＦＡ遺伝子（下の表１７で述べるものなど）を発現することが望ましいかもしれない。
例えば国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレットは、ダイズ中における胚芽特異的発現で使用するためのいくつかのプロモーターおよび転写ターミネーター配列の単離について述べる。さらに国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット、および国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットは、個々のプロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを固有の組み合わせで共にライゲートすることによる、複数のプロモーター／遺伝子／ターミネーターカセットの組み合わせの合成について述べる。一般に適切なプロモーター（表１５に列挙されるが、これに限定されるものではない）および転写ターミネーター（表１６に列挙されるが、これに限定されるものではない）で挟まれたＮｏｔＩ部位を使用して所望の遺伝子をクローンする。遺伝子の５’および３’末端にＮｏｔＩ部位を導入するようにデザインされたオリゴヌクレオチドでのＰＣＲ増幅を使用して、ＮｏｔＩ部位を表１７に列挙されるが、これに限定されるものではない、対象とする遺伝子に付加できる。次に得られたＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化して、適切なプロモーター／ＮｏｔＩ／ターミネーターカセット中にクローンする。
さらに国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットは、所望の表現型の発現を得るために、（適切な選択可能なマーカーカセットに加えて）固有の組み合わせの個々の遺伝子カセットをさらに結合させることについて述べる。これは主に異なる制限酵素部位を使用して行われるが、いくつかの技術を利用して所望のプロモーター／遺伝子／転写ターミネーターの組み合わせを達成できることが、当業者には理解できる。そうすることで、胚芽特異的プロモーター／遺伝子／転写ターミネーターカセットのあらゆる組み合わせを達成できる。当業者はまた、これらのカセットが個々のＤＮＡ断片上または複数の断片上に位置でき、遺伝子の同時発現が複数のＤＮＡ断片の同時形質転換の結果であることも理解できる。
実施例２６
体細胞性ダイズ胚芽培養物の形質転換
培養条件
ダイズ胚芽形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）は、光度６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの冷白色蛍光灯による１６：８時間の昼／夜光周期で、１５０ｒｐｍ、２６℃の回転振盪器上の３５ｍＬの液体培地ＳＢ１９６（下の処方参照）中で維持できる。培養物は、およそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの新鮮な液体ＳＢ１９６中に接種して、７日〜２週間毎に継代培養される（好ましい継代培養間隔は７日毎である）。
ダイズ胚芽形成懸濁培養物は、粒子ガン衝撃法によって、以前述べられたプラスミドおよびＤＮＡ断片で形質転換できる（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３２７：７０〜７３頁（１９８７年）；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）。デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）（商標）ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム後付け）を全ての形質転換のために使用する。
ダイズ胚芽形成懸濁液培養の開始
各開始間を５〜７日間開けて、ダイズ培養を毎月２回開始する。定植後４５〜５５日の入手可能なダイズ植物から未熟種子入りサヤを摘み取って、種子を外皮から取り出して滅菌マゼンタ・ボックスに入れる。１滴のアイボリー（ｉｖｏｒｙ）石鹸添加５％クローラックス（Ｃｌｏｒｏｘ）溶液（すなわち９５ｍＬのオートクレーブ済み蒸留水に５ｍＬのクローラックス（Ｃｌｏｒｏｘ）および１滴の石鹸を添加して良く混合する）中で１５分間振盪して、ダイズ種子を滅菌する。２本の１Ｌ入り滅菌蒸留水を使用して種子をすすいで、４ｍｍ未満のものを個々の顕微鏡スライドに載せる。種子の小さな端を切断して、子葉を種子被膜から押し出す。子葉（プレート当たり２５〜３０個）をＳＢ１培地を含有するプレートに移す。子葉を含有するプレートをファイバーテープで覆って８週間保存する。その後、二次胚芽を切断してＳＢ１９６液体培地に７日間入れる。
衝撃のためのＤＮＡ調製
対象とする遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含有する、無傷のプラスミドまたはＤＮＡプラスミド断片のどちらかを衝撃のために使用できる。ｐＫＲ２７４（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−４９８８）、ｐＫＲ６８５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０４７）またはｐＫＲ６８１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０４６）などのプラスミドおよび／またはその他の発現プラスミドからの断片を消化されたプラスミドのゲル単離によって得ることができる。各場合において、下述する０．５ｍＬの特定酵素ミックス中で１００μｇのプラスミドＤＮＡを使用できる。プラスミドは、ＮＥ緩衝液４（２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、１ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．９）中のＡｓｃＩ（１００単位）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールにより、３７℃で１．５時間で消化できる。得られたＤＮＡ断片をバイオウィタカー・モレキュラー・アプリケーションズ（ＢｉｏＷ］ｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）からの１％のシープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）（登録商標）ＧＴＧアガロース上のゲル電気泳動法によって分離でき、ＰＵＦＡ生合成遺伝子を含有するＤＮＡ断片をアガロースゲルから切除できる。ＤＮＡは、ゲラーゼ（ＧＥＬａｓｅ）（登録商標）消化酵素を使用して、製造業者のプロトコルに従ってアガロースから精製できる。代案としてはプラスミド全体、またはプラスミド全体と断片との組み合わせが使用できる。
５μＬの１μｇ／μＬ ＤＮＡ溶液（無処置プラスミドまたは上述のように調製されたＤＮＡ断片のいずれか）、５０μＬの２．５ＭＣａＣｌ２、および２０μＬの０．１Ｍスペルミジンに、３ｍｇの金粒子（３ｍｇの金）を含有する滅菌蒸留水の５０μＬのアリコートを添加できる。ボルテックス振盪器のレベル３で混合物を３分間振盪し、卓上遠心分離器内で１０秒間遠沈する。４００μＬの１００％エタノールでの洗浄後、超音波処理によって４０μＬの１００％エタノール中にペレットを懸濁する。遺伝子銃ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置ディスクの各フライングディスクに、５μＬのＤＮＡ懸濁液を小分けして入れる。各５μＬのアリコートは衝撃あたり（例えばディスクあたり）およそ０．３７５ｍｇの金を含有した。
組織調製およびＤＮＡによる衝撃
およそ１５０〜２００ｍｇの７日齢の胚芽懸濁培養物を空の滅菌６０×１５ｍｍペトリ皿に入れ、皿をプラスチックメッシュで覆う。膜破裂圧力を１１００ＰＳＩに設定して、チャンバーを２７〜２８インチ水銀圧の真空に脱気して、組織をプレートあたり１または２回衝撃する。組織を保持／停止スクリーンからおよそ３．５インチに置く。
形質転換された胚芽の選択
ハイグロマイシン（ハイグロマイシンＢリン転移酵素（ＨＰＴ）遺伝子が選択可能な標識として使用された場合）またはクロルスルフロン（アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子が選択可能な標識として使用された場合）のいずれかを使用して、形質転換された胚芽を選択する。
ハイグロマイシン（ＨＰＴ）選択
衝撃に続いて、上述のように組織を新鮮なＳＢ１９６培地に入れて培養する。衝撃の６日後に、ＳＢ１９６を３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンの選択物質を含有する新鮮なＳＢ１９６で交換する。選択培地は毎週新しくする。選択の４〜６週後に、形質転換されていない壊死性胚芽形成クラスターから、緑色の形質転換された組織が生育しているのが観察されるかもしれない。単離された緑色組織を取り出して、マルチウェルプレートに接種し、新しいクローン増殖され形質転換された胚芽形成懸濁培養物を生成する。
クロルスルフロン（ＡＬＳ）選択
衝撃に続いて、組織を新鮮なＳＢ１９６培地を入れた２つのフラスコに分割し、上述のように培養する。衝撃の６〜７日後、ＳＢ１９６を１００ｎｇ／ｍＬクロルスルフロンの選択物質を含有する新鮮なＳＢ１９６と交換する。選択培地は毎週新しくする。選択の４〜６週後に、形質転換されていない壊死性胚芽形成クラスターから、緑色の形質転換された組織が生育しているのが観察されるかもしれない。単離された緑色組織を取り出して、ＳＢ１９６を含有するマルチウェルプレートに接種し、新しいクローン増殖され形質転換された胚芽形成懸濁培養物を生成する。
ダイズ体細胞性胚芽の植物への再生
胚芽形成懸濁培養物から植物全体を得るために、組織を再生する必要がある。
胚芽成熟
生産形質転換からの形質転換胚芽形成クラスターは、冷白色蛍光灯（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）冷白色エコノワット（Ｅｃｏｎｏｗａｔｔ）Ｆ４０／ＣＷ／ＲＳ／ＥＷ）およびアグロ（Ａｇｒｏ）（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）Ｆ４０アグロ（Ａｇｒｏ）電球（４０Ｗ））の下、光強度９０〜１２０μＥ／ｍ２／ｓの１６：８時間の光周期で、ＳＢ１９６中において２６℃で、上述のようにマルチウェルプレート中で４〜６週間（モデル系では１〜３週間）培養した。その後、胚芽クラスターを取り出して、ＳＢ１６６固体寒天培地に１〜２週間（モデル系では１週間）入れ、次にＳＢ１０３培地で３〜４週間継代培養して胚芽を成熟させた。ＳＢ１０３中のプレート上での成熟後、個々の胚芽をクラスターから取り出して乾燥させ、前述のようにそれらの脂肪酸組成の変更についてスクリーンした。必要に応じて、下で述べるようないくつかの事象から植物を得た。
代案としてはいくつかのモデル系実験で、胚芽をダイズ組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：３９３頁（２００５年））中で、修正手順を使用して成熟させた。簡単に述べると、上述のようにＳＢ１９中で４週間の選択後、胚芽クラスターを取り出して２５０ｍＬエルレンマイアーフラスコ内の３５ｍＬのＳＢ２２８（ＳＨａＭ液体培地）に入れた。胚芽が成熟する間、組織を光度６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの冷白色蛍光灯による１６：８時間の昼／夜光周期で、１３０ｒｐｍ、２６℃の回転振盪器上のＳＨａＭ液体培地中に２〜３週間保った。ＳＨａＭ液体培地中で２〜３週間生育させた胚芽は、ＳＢ１６６／ＳＢ１０３上で５〜８週間培養した胚芽と、サイズおよび脂肪酸含量が等しかった。
ＳＨａＭ液体培地中での成熟後、個々の胚芽をクラスターから取り出して乾燥させ、前述のようにそれらの脂肪酸組成の変更についてスクリーンした。必要に応じて、下で述べるようないくつかの事象から植物を得た。
胚芽乾燥および発芽
成熟した個々の胚芽は、空の小型ペトリ皿（３５×１０ｍｍ）におよそ４〜７日間入れて乾燥できる。プレートをファイバーテープで密封する（小型湿度室を作る）。乾燥させた胚芽をＳＢ７１−４培地に定植し、そこで上述したのと同一の培養条件で発芽させる。発芽した小植物を発芽培地から取り出して水ですすぎ、次に２４−セルパックトレー内のレディアース（Ｒｅｄｉ−Ｅａｒｔｈ）に定植し、透明なプラスチックドームで覆う。２週間後ドームを除去して、植物をさらに１週間、強化する。小植物が丈夫そうであれば、それらを鉢あたり３本までの小植物を１０インチの鉢内のレディアース（Ｒｅｄｉ−Ｅａｒｔｈ）に移植する。１０〜１６週後、成熟種子を採取し、細断して上述のように脂肪酸について分析できる。
培地処方
ＳＢ１固体培地（１Ｌあたり）
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬ Ｂ５ビタミン １０００×原液
３１．５ｇ スクロース
２ｍＬ ２，４−Ｄ（最終濃度２０ｍｇ／Ｌ）
ｐＨ５．７
８ｇ ＴＣ寒天
ＳＢ１６６固体培地（１Ｌあたり）
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬ Ｂ５ビタミン １０００×原液
６０ｇ マルトース
７５０ｍｇ ＭｇＣｌ２六水和物
５ｇ 活性炭
ｐＨ５．７
２ｇゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）
ＳＢ１０３固体培地（１Ｌあたり）
１袋のＭＳ塩（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬ Ｂ５ビタミン １０００×原液
６０ｇ マルトース
７５０ｍｇ ＭｇＣｌ２六水和物
ｐＨ５．７
２ｇ ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）
ＳＢ７１−４固体培地（１Ｌあたり）
１瓶のガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）のＢ５塩、スクロース添加（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）−カタログ番号２１１５３−０３６）
ｐＨ５．７
５ｇ ＴＣ寒天
２，４−Ｄ原液
ファイトテク（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ）からカタログ番号Ｄ２９５の既製品を得る−濃度は１ｍｇ／ｍＬ
Ｂ５ビタミン原液（１００ｍＬあたり）
１０ｇ ミオイノシトール
１００ｍｇ ニコチン酸
１００ｍｇ ピリドキシンＨＣｌ
１ｇ チアミン
アリコートを−２０℃に保存する、溶液が十分迅速に溶解しない場合、加熱撹拌プレートによって低レベルの熱を加える。
クロルスルフロン原液
０．０１Ｎ水酸化アンモニウム中１ｍｇ／ｍＬ
体細胞胚を誘導するために、表面滅菌したダイズ栽培品種Ａ２８７２の未成熟種子から切除した長さ３〜５ｍｍの子葉を２６℃で明または暗状態において、適切な寒天培地上で６〜１０週間培養できる。次に二次胚を生じた体細胞胚を切除して、適切な液体培地に入れる。初期球状段階胚として増殖する体細胞胚クラスターについて、繰り返し選択した後、懸濁液を下述のように維持する。
ダイズ胚芽形成懸濁培養物は、蛍光灯による１６：８時間の昼／夜光周期で、１５０ｒｐｍ、２６℃の回転振盪器上の３５ｍＬの液体培地中で維持できる。およそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地に接種して、培養を２週間毎に継代培養する。
次にダイズ胚芽形成懸濁培養物を粒子ガン衝撃法によって形質転換してもよい（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３２７：７０〜７３頁（１９８７年）；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）。デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）（商標）ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム後付け）をこれらの形質転換のために使用できる。
ダイズ形質転換を促進するのに使用できる選択可能なマーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オーデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０〜８１２頁（１９８５年））と、プラスミドｐＪＲ２２５からのハイグロマイシンＢリン酸転移酵素遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から；グリッツ（Ｇｒｉｔｚ）ら、Ｇｅｎｅ、２５：１７９〜１８８頁（１９８３年））と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域とから構成される組み換えＤＮＡコンストラクトである。ファゼオリン５’領域、本ポリペプチドをコードする断片、およびファゼオリン３’領域を含んでなる種発現カセットは、制限酵素断片として単離できる。次にこの断片をマーカー遺伝子を保有するベクターの固有の制限部位に挿入できる。
５０μＬの６０ｍｇ／ｍＬ １μｍ金粒子懸濁液に、次を記載順に添加する。５μＬのＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μＬのスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）。次に粒子調製品を３分間撹拌し、微量遠心管中で１０秒間遠沈して上清を除去する。次にＤＮＡ被覆された粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、４０μＬの無水エタノールに再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁液を１秒間ずつ３回超音波処理できる。次に５μＬのＤＮＡ被覆された金粒子を各マクロキャリアディスクに装填する。
およそ３００〜４００ｍｇの２週間経過懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍペトリ皿に入れ、組織からピペットで残留液体を除去する。各形質転換実験では、通常およそ５〜１０枚の組織プレートに衝撃を与える。膜破裂圧力を１１００ｐｓｉに設定し、チャンバーを２８インチ水銀圧の真空に排気する。組織を保持スクリーンからおよそ３．５インチ離して置き、３回衝撃を与える。衝撃に続いて組織を二分して液体中に戻し、上述のように培養できる。
衝撃の５〜７日後、液体培地を新鮮培地に交換し、衝撃の１１〜１２日後、５０ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する新鮮な培地で交換してもよい。この選択的培地は、毎週取り替えることができる。衝撃の７〜８週間後、緑色の形質転換組織が、未形質転換壊死胚芽形成クラスターから生育するのが観察されるかもしれない。単離された緑色組織を取り出して個々のフラスコに接種し、新しいクローン的に増殖させた形質転換胚芽形成懸濁培養物を発生させる。新しい各系列は、独立した形質転換事象として取り扱ってもよい。次にこれらの懸濁液を継代培養して、未成熟胚芽のクラスターとして維持でき、または個々の体細胞胚の成熟および発芽によって、全植物体に再生できる。
様々な中間体を通じてミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供するω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示する。 本発明のミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号２）、本発明のユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号５）、およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ １７２２６１２３））からの長鎖ＰＵＦＡ延長酵素のアミノ酸配列（配列番号８）のクラスタルＶアラインメントを示す（デフォルトパラメーターによる）。 ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）細胞抽出物（実施例１）の脂質プロフィールのクロマトグラムを示す。 本発明のミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号２）と、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ １７２２６１２３））からの長鎖ＰＵＦＡ延長酵素のアミノ酸配列（配列番号８）とのクラスタルＶアラインメントを示す（デフォルトパラメーターによる）。 ｐＹ１１９のプラスミドマップである。 サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でのミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅ）機能解析の結果である。 ｐＹ５−３０のプラスミドマップである。 ｐＤＭＷ２６３のプラスミドマップである。 ｐＺＵＦ１７のプラスミドマップである。 ｐＹ１１５のプラスミドマップである。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）目的ベクターｐＢＹ１のプラスミドマップである。 ｐＢＹ２のプラスミドマップである。 ｐＢＹ１−ＦＡＥのプラスミドマップである。 ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子（ＥｇＤ９ｅ、配列番号１）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（ＥｇＤ９ｅＳ、配列番号３）とのＤＮＡ配列の比較を示す。 ｐＹ１２０のプラスミドマップである。 ｐＫＲ９１２のプラスミドマップである。 ｐＫＲ９１１のプラスミドマップである。 ｐＫＲ９１３のプラスミドマップである。 ｐＫＲ８８６のプラスミドマップである。 ｐＫＲ８８６ｒのプラスミドマップである。 ｐＫＲ６６９のプラスミドマップである。 ｐＫＲ８７３のプラスミドマップである。 ｐＦＢＡＩＮ−３８９Ｅｌｏのプラスミドマップである。 ｐＺＵＦＥ３８９Ｓのプラスミドマップである。 ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）種ＣＣＭＰ３８９ Δ９エロンガーゼ遺伝子（Ｅ３８９Ｄ９ｅ、配列番号４）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ、配列番号６）とのＤＮＡ配列の比較を示す。

Claims (21)

  1. （ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
    （ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチド配列と比べると少なくとも７０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
    （ｃ）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
    または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなりそれと１００％相補的である、前記ヌクレオチド配列の相補体
    よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
  2. ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６を含んでなる請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６よりなる群から選択される請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. ポリペプチドのアミノ酸配列が、
    （ａ）配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列、および
    （ｂ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換によって（ａ）のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列
    よりなる群から選択されるΔ９エロンガーゼポリペプチド。
  5. 請求項１に記載の単離された核酸配列を含んでなる単離された形質転換宿主細胞。
  6. 宿主細胞が、藻類、細菌、酵母、卵菌類、および菌・カビよりなる群から選択される請求項５に記載の形質転換宿主細胞。
  7. 宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種よりなる群から選択される菌・カビである請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
  8. 酵母が油性酵母である請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
  9. 油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
  10. 酵母がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種である請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
  11. ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される請求項１０に記載の形質転換された酵母。
  12. ａ）ｉ）（１）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
    （２）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチドとハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
    よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
    （ｉｉ）リノール酸源
    を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
    ｂ）ステップ（ａ）の酵母宿主細胞をΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてリノール酸がエイコサジエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
    ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサジエン酸を回収する
    ことを含んでなるエイコサジエン酸の製造方法。
  13. ａ）ｉ）（１）Δ９エロンガーゼ活性を有し、クラスタルＶ法のアラインメントに基づいて配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列と比べると少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列、
    （２）Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号６で記載されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸配列
    よりなる群から選択される、Δ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、および
    （ｉｉ）α−リノレン酸源
    を含んでなる単離された形質転換酵母宿主細胞を提供し、
    ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞をΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする核酸配列が発現されてα−リノレン酸がエイコサトリエン酸に転換される条件下で生育させ、そして
    ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサトリエン酸を回収する
    ことを含んでなるエイコサトリエン酸の製造方法。
  14. Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列が、配列番号２または配列番号５で記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする請求項１２または１３に記載の方法。
  15. Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列が、
    ａ）少なくとも１１３コドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化される配列番号５、および
    ｂ）少なくとも１０６コドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化される配列番号２
    よりなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項６に記載の宿主細胞によって産生される微生物油。
  17. 請求項１６に記載の微生物油の有効量を含んでなる食品。
  18. 類似食品、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される請求項１７に記載の食品。
  19. 請求項１６に記載の微生物油の有効量を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
  20. 請求項に１６に記載の微生物油の有効量を含んでなる動物飼料。
  21. ペットフード、反芻動物飼料、家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される請求項２０に記載の動物飼料。
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