JP2006145519A - 糖鎖構造解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法を提供する。
【解決手段】（ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線と、構造既知の参照糖鎖から得られた、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線とを比較する糖鎖構造解析方法が提供される。
【選択図】図１

Description

本発明は、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法に関する。さらに本発明は、構造既知の複数の参照糖鎖をＣＩＤ−ＭＳⁿ測定することにより得られる複数の特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線からなるＣＩＤエネルギー依存曲線ライブラリーに関する。

糖鎖は主に細胞表面に糖タンパク質や糖脂質の一部として存在し、発生、分化誘導、受精、免疫、癌化、感染症等、様々な生命現象に深く関与している。このように多彩な機能を有する糖鎖の研究は近年盛んになっている。また、糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾の重要な部分を占め、今後の大きな研究対象である。糖タンパク質や糖脂質の機能は糖鎖により制御される場合があり、糖鎖の構造解析を極微量において達成する技術が必要である。しかし、糖鎖は生物工学的手法により増幅ができない分子種であるため、微量の物質のみで構造解析を達成することを可能とする新たな構造解析技術の開発が必要である。タンパク質の配列はゲノム配列が判明している場合、対応するタンパク質のアミノ酸配列も取得できるため、目的のタンパク質のアミノ酸配列は質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ法）により解析することができる。しかし、被修飾タンパク質の配列解析技術については今後の課題として残されている。特に、糖鎖によるタンパク質の修飾は極めて大きな分子の多様性を生み出している。したがって、糖鎖の構造解析技術の開発は必要不可欠である。

糖鎖は、核酸やタンパク質とは異なり配列以外の要因による構造異性体群を形成している。この理由の基本は、糖鎖を形成する単糖には反応点となる水酸基が複数存在するため結合位置異性体を形成する性質を有し、かつ、単糖間の結合の際にはアノメリック位の立体異性によるアノマー異性体を形成する性質を有しているためである。単糖間の結合は、生物体内においては糖鎖の合成に関わる酵素群の連続反応により行われるため、必ずしも組み合わせの原理に基づく糖鎖群を形成しているわけではない。しかし、酵素反応は副反応を伴うことが知られており、このような現象の生物における意味は解明されておらず、このような場合には遺伝情報によることのない全く新しい概念に基づく構造解析法が必要である。もちろん、遺伝情報が解明されていない、また、糖鎖の生合成経路が解明されていない生物種における糖鎖構造の解析についても新しい構造解析法が必要である。

現在用いられている糖鎖の構造解析技術としては、（１）核磁気共鳴分光法、（２）質量分析法、（３）多次元クロマトグラフィーによるマッピング法（非特許文献１を参照）、（４）加水分解酵素による特異的部分加水分解法（非特許文献２を参照）、（５）レクチンによるマッピング法（非特許文献２を参照）、及び（６）メチル化−加水分解-ガスクロマトグラフィーによる組成分析法（非特許文献２を参照）をあげることができ、通常はこれらを組み合わせて糖鎖の解析が行われている。

上記の中でも特に有効な糖鎖の解析手段としては、核磁気共鳴分光法及び質量分析法をあげることができるが、前者の問題点は解析に必要な量がμｇ以上であることであり、後者の問題点は立体異性体の解析が不可能なことである。これらの方法を含めいずれの解析法を用いるにせよ、糖鎖の構造解析は、得られた天然糖鎖構造の構造解析を直接行わなければならない(非特許文献３を参照)。

一方、異なる糖鎖を質量分析することにより、その結果が異なることが示されている。例えば、ステロイドの水酸基の立体異性体のＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定によるフラグメント化を行うと、各フラグメント強度が異なること（非特許文献４を参照）や、合成された硫酸化糖鎖の構造異性体のＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定をＦＡＢ−q−Ｍａｓｓで行って、特定イオンの強度を測定すると、その値に差があること（非特許文献５を参照）が示されている。しかし、これらはいずれも具体的に糖鎖の構造解析方法を示すものではなかった。

質量分析装置を用いる糖鎖の構造解析技術において一般的な構造解析法としては、ｍ／ｚとそのピーク強度をパラメータとし、構造既知の糖鎖のそれと比較することで同一構造か否かの判定をする方法がある（非特許文献６及び７を参照）。この方法は、特定の一点の電圧におけるフラグメントのピーク強度を指標とし、各々のフラグメントの強度が総合的に一致するか否かをスコア化して判定する方法であり、参照とする化合物群の網羅的なデータセット、あるいは、網羅的なデータベースが必要である。また、この方法の限界は、合否の判定をするだけで否の場合の構造予測が不可能な点であった。

構造的に類似性のある化合物群に対しては、多変量解析が、質量分析により得られたデータから構造的特徴を抽出するのに新たな可能性を与えることを示唆している報告があるが、２糖の構造予測に応用できることを報告しているにすぎず、長い糖鎖の構造予測の可能性については具体的には何も触れていない（非特許文献８を参照）。

さらに、質量分析法は極微量分析であり、検出される質量数（Ｈ、Ｎａ付加等）から物質の分子量が分かると共に、フラグメントイオンの解裂様式から、分子構造に関して重要な情報を得ることができるものの、サンプルに異性体（構造異性体、光学異性体）が混入して存在する場合、質量分析計のみではその混入物の存在すら識別できなかった。

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本発明の目的は、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法を提供することである。具体的には、本発明の目的は、構造解析の目的糖鎖に関する特定のｍ／ｚのフラグメントイオンついてＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られたＣＩＤエネルギー依存曲線を、同一のｍ／ｚの親イオンから同一のｍ／ｚの娘イオンを得た参照データであるＣＩＤエネルギー依存曲線と比較して、同一か否かを特定することにより該糖鎖の構造決定を行う方法を提供することである。本発明の別の目的は、上記の目的糖鎖および参照糖鎖のＣＩＤエネルギー依存曲線について、これらの曲線を特徴付ける数値で表した解裂イオンパラメータをそれぞれ作成し、これらのパラメータを統計的に解析することにより、目的糖鎖の構造決定又は構造推定を行う方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、質量分析計のみを用いた糖鎖の構造異性体混合物を識別するための分析方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、構造が異なる糖鎖および立体異性の糖鎖を合成し、特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成したところ、同一の構造を有する糖鎖は複数回これを測定しても同一のＣＩＤエネルギー依存曲線が得られ、逆に構造が異なる糖鎖はＣＩＤエネルギー依存曲線も異なることを見出した。また、立体異性体もＣＩＤエネルギー依存曲線が異なることを見出した。さらに、糖鎖の部分構造、そこから得られるＣＩＤエネルギー依存曲線またはＣＩＤエネルギー依存曲線のパラメータが一致しなくても、パラメータの統計的解析に基づき部分構造を推定できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。

すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） （ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線と、構造既知の参照糖鎖から得られた、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線とを比較することを特徴とする糖鎖構造解析方法。

（２） 構造既知の複数の参照糖鎖をＣＩＤ−ＭＳⁿ測定することにより得られる複数の特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線からなるＣＩＤエネルギー依存曲線ライブラリー。
（３） 参照糖鎖が３糖からなることを特徴とする（２）に記載のライブラリー。

（４） （２）に記載のＣＩＤエネルギー依存曲線から作成された、構造既知の複数の参照糖鎖の解裂イオンパラメータからなる解裂イオンパラメータライブラリー。
（５） 構造既知の複数の参照糖鎖の解裂イオンパラメータが、特定のｍ／ｚの娘イオンのイオン強度の最大値を該娘イオンの総イオンカウント数の相対数としてあらわした相対値、前記相対値が５０％となるＣＩＤエネルギー値、ＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き、から選ばれる少なくとも１つのパラメータであることを特徴とする、（４）に記載のライブラリー。
（６） 参照糖鎖が３糖からなることを特徴とする（４）または（５）に記載のライブラリー。

（７） （ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線と、（２）または（３）に記載のライブラリーに含まれる、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線とを比較することを特徴とする糖鎖構造解析方法。

（８） （１）または（７）に記載の（ｃ）の工程において、目的糖鎖の特定のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線の解裂イオンパラメータを作成し、該解裂イオンパラメータと、構造既知の参照糖鎖の上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線の解裂イオンパラメータとを比較することを特徴とする、（１）または（７）に記載の方法。

（９） 解裂イオンパラメータが、特定のｍ／ｚの娘イオンのイオン強度の最大値を該娘イオンの総イオンカウント数の相対数としてあらわした相対値、前記相対値が５０％となるＣＩＤエネルギー値、ＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き、から選ばれる少なくとも１つのパラメータであることを特徴とする、（８）に記載の方法。

（１０） （ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線の解裂イオンパラメータを作成し、（ｄ）該解裂イオンパラメータと、（４）〜（６）のいずれかに記載のライブラリーに含まれる、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線から作成された解裂イオンパラメータを比較することを特徴とする糖鎖構造解析方法。

（１１） ＣＩＤエネルギー依存曲線の特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数が、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数と、該娘イオンの総イオンカウント数と親イオンの総イオンカウント数の和の比であることを特徴とする（１）または（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。

（１２） 目的糖鎖に含まれる異なる特定のｍ／ｚのフラグメントイオンについて（１）もしくは（７）に記載の（ａ）〜（ｃ）の工程または（１０）に記載の（ａ）〜（ｄ）の工程を繰り返し、それらの結果を組み合わせることを特徴とする糖鎖構造解析方法。

（１３） 少なくともＣＩＤ−ＭＳⁿ測定装置、（２）〜（６）のいずれかに記載のライブラリーをコンピューター読み取り可能なように記録した記録媒体、および目的糖鎖に含まれる異なる特定のフラグメントイオンについて（１）もしくは（７）に記載の（ｂ）および（ｃ）の工程または（１０）に記載の（ｂ）〜（ｄ）の工程を行なうためのプログラムを記録した記録媒体を含む糖鎖構造解析システム。

（１４） （ａ）糖鎖検体について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが消失しないような任意の電圧でＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）残存する該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、（ｃ）前記２工程で得られたマススペクトル、ＣＩＤエネルギー依存曲線または該曲線の解裂イオンパラメータを比較することを特徴とする、糖鎖構造異性体の混入検定方法。

本発明の糖鎖解析方法は、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行ない、得られたＣＩＤエネルギー依存曲線を構造既知の糖鎖から得られた参照データと比較することにより構造決定を行う方法である。該方法は、天然に存在する構造未知の糖鎖を、置換基が異なるものや立体異性体等も含めその構造、またはその一部を決定又は推定することができ、また極微量の解析が行える点で非常に有用である。また該方法は、糖鎖の構造解析という次世代生命科学研究の基盤技術となるのみならず、糖鎖の異常を伴う疾病や感染症を引き起こすきっかけとなる糖鎖レセプターの特定等、診断医療に貢献する技術となるものである。さらに、本発明の純度検定方法により、検体の詳細なデータ解析をおこなう以前にその必要性を簡便に判定することが可能となる。

以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。
以下の説明において、「ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定」とは、ＣＩＤ（Collision induced dissociation:衝突誘起解離）による多段マススペクトロメトリーの取得を行うことを示し、「フラグメントイオン」とは、上記ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定や物理化学的分解等により得られる各ｍ／ｚを有するイオンを示し、「ｍ／ｚ」とは、質量数（ｍ）と電荷（ｚ）の比を示し、「娘イオン」とは、フラグメントイオンを上記ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定することにより得られる各ｍ／ｚを有するフラグメントイオンを示し、「総イオンカウント数」とは、各ｍ／ｚを有するすべてのフラグメントイオンのイオン強度の総和を示し、また、「ＣＩＤエネルギー」とは、ＣＩＤを起こすときに加えるエネルギーを一般的に示し、実際にはイオンを振動させるためのある周波数の電場の電圧を示す。さらに、「構造解析方法」とは、構造決定方法および／または構造推定方法を意味する。

本発明の方法を図１〜５に示し、この図に従って以下に本発明を説明する。
（１）構造解析方法の概略（図１）
本発明は、構造未知の糖鎖（本明細書中では、これを「目的糖鎖」と称することがある）を特定のｍ／ｚのフラグメントイオン（以下、これを「親イオン」又は「親フラグメントイオン」と称することがある）が得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い（フローＡ１）、得られた親フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行う（フローＢ１）。ここで、得られた特定のｍ／ｚを有する娘イオンについて総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、必要に応じて該曲線の各特長をパラメータ化した解裂イオンパラメータを作成する（フローＢ１）。一方、参照データとして、構造既知の糖鎖（本明細書中では、これを「参照糖鎖」と称することがある）またはそのライブラリーについて、特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い（フローＡ２）、得られたフラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行う（フローＢ２）。ここで、得られた特定の娘イオンについて総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、必要に応じて該曲線の各特長をパラメータ化した解裂イオンパラメータを作成する（フローＢ２）。本明細書中では、これら参照糖鎖のＣＩＤエネルギー依存曲線および解裂イオンパラメータをあわせて「参照データ」と称することがある。なお、フローＡ１に先立って、目的糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定による糖鎖構造異性体の混入検定を行ってもよい（フローＤ）。

かくして得られた目的糖鎖の特定のｍ／ｚのフラグメントイオンから得られた特定のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線、または解裂イオンパラメータを、参照データと比較し（フローＣ）、目的糖鎖のデータと一致する参照データがあった場合に、その参照データが得られた参照糖鎖と目的糖鎖の一部の構造が一致すると判断することができる。

また、目的糖鎖のデータと参照データが一致しない場合でも、目的糖鎖のパラメータが参照糖鎖のパラメータの統計的解析結果の範囲内であれば、部分構造を推定することができる。本発明には、このような構造の推定を行う方法も含まれる。

このようにして目的糖鎖の一部の構造が決定または推定された場合、これらを目的糖鎖の生合成経路を参照する等して全体の構造を決定または推定していく（フローＡ１）ことができる。

（２）目的親フラグメントイオンの調製（図１・図２／フローＡ１）
本発明に用いられる目的糖鎖は、以下に説明する方法により分解するなどしてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い得るものであればいかなるものであってもよい。また、構造解析を目的として本発明の方法に供するものであるので、その全部または一部の構造が未知のものが好ましい。目的糖鎖は、生体組織又は細胞等から得られたものでもよいし、合成されたタンパク質に結合したものから得られたものでもよく、またそれを酸加水分解又は酵素分解したり、さらにＨＰＬＣ等で分離精製したもの等を用いることができる。また、化学合成された糖鎖を用いることもできる。

本発明では、目的糖鎖と参照糖鎖から得られる同一のｍ／ｚを有する親イオンについて、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定して得られる娘イオン強度を比較するので、参照データを誘導する親イオン（以下、これを「参照親フラグメントイオン」と称することがある）と同一のｍ／ｚを有するフラグメントイオン（以下、これを「目的親フラグメントイオン」と称することがある）が得られるまで何らかの方法で分解する必要がある。分解の方法は、それ自体公知の常法を用いることができるが、例えば、酸加水分解、酵素分解等により得られる糖鎖を液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動等により分離精製して用いることもでき、あるいは後述するＣＩＤ−ＭＳⁿ測定等により得られる任意のフラグメントイオンをｍ／ｚにより分離して用いることができる。フローＡ１では、参照糖鎖として３糖ライブラリーを用いた場合を示しているので、目的糖鎖を１〜３糖に分解することが望ましい。また、目的糖鎖が置換基を有する場合、これを除去しても、また参照データに置換基を含むものがあれば付いたままでも用いることができる。最終的に得られた目的糖鎖分解物は、それぞれ質量分析することによりｍ／ｚを確認し、この質量とその他の情報、例えば生合成経路などの情報から配列を決定することもできるが、本発明の方法は、ここで決定することのできなかったフラグメントイオンについて用いることができる。

（３）目的親フラグメントイオンのＣＩＤ−ＭＳⁿ測定（図１、図３／フローＢ１）
上記で得られた目的親フラグメントイオンは、これをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定する（ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定により得られた目的親フラグメントの場合は、これをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定する）。

イオン化法としては、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＣＩ（化学イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化法）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）等が用いられるが、本発明においてはサンプル調製が容易で、かつ、マトリックス由来の夾雑イオンの影響がないＥＳＩ法を用いることが好ましい。しかし、上記ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定が可能であればイオン化法はこれらに限定されるものではない。また、ＥＳＩ法にはマイクロスプレー法とナノスプレー法があるが、サンプル使用量の面から本発明においてはナノスプレー法が好ましく用いられる。

上記目的糖鎖またはその分解物をイオン化する場合、微液滴を真空下溶媒を蒸発させることでイオン化するため水／メタノールあるいは水／アセトニトリル（１：１）を溶媒として用いることができるが、物質の性質に従い選択が可能でありこれに限られることはない。目的糖鎖またはその分解物は、この溶媒に対して０．０１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５ｎｍｏｌ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度に溶解することが好ましい。

また、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行なう装置は、これが可能であれば、機種を問うものではないが、本発明においては、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定が可能な四重極イオントラップ型質量分析計を用いることが好ましい。このような装置としては、具体的には例えば、ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカーダルトニクス社製）、ＬＣＱ ＤＥＣＡ（サーモフィニガン社製）、ＡＸＩＭＡ ＱＩＴ（島津社製）、ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津社製）等が挙げられる。測定方法としては、各親フラグメントイオンから解離する娘イオンのイオン強度が測定できる方法であればいかなるものでもよいが、具体的には、例えば、熱キャピラリー温度２０〜３６５℃、キャピラリー電圧０〜６．０ｋＶ、ＣＩＤエネルギーが０〜２５Ｖ、ポジティブモードまたはネガティブモードのいずれか等で測定することができる。ポジティブモードを用いる場合には、プロトン、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム等の陽イオンを選択して用いることができる。

上述のＣＩＤ−ＭＳⁿ測定（またはＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定）により得られたプロットから、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成する（式１）。このうち、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数を、該娘イオンの総イオンカウント数と、該娘イオンの総イオンカウント数と上記親イオンの総イオンカウント数の和との比で表すことが好ましい（式２）。なお、式１及び式２は、親イオンＡから娘イオンａ，ｂ，ｃ，ｄ，…，（ｉ），…ｎが生成する場合の関係式を示す。この比で娘イオン強度を表すことにより、微弱なその他のイオンカウント数に影響を受けず、正確なＣＩＤエネルギー依存曲線を作成することができる。特定のｍ／ｚの娘イオンとは、目的親フラグメントイオンから解離する何れの娘イオンでもよいし、その全てでもよい。

式１

式２

さらに、上記ＣＩＤエネルギー依存曲線をそれ自体公知の方法で、特徴付ける数値で表すことにより、解裂イオンパラメータを作成することもできる。

解裂イオンパラメータとしては、例えば、特定のｍ／ｚの娘イオンのイオン強度の最大値を該娘イオンの総イオンカウント数の相対数としてあらわした相対値、前記相対値が５０％となるＣＩＤエネルギー値、及びＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き、から選ばれる少なくとも１つのパラメータを用いることができる。また、ＣＩＤエネルギー依存曲線をイオンカウント数の相対数としての基底値（Ｂｏｔｔｏｍ＝０）と最大値（Ｔｏｐ＝１００）、その５０％にあたるＣＩＤエネルギー（Ｖ₅₀）、およびＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き（Ｓｌｏｐｅ）を指標として以下の式３により計算し、解裂イオンパラメータとすることもできる。式３のｘは、ＣＩＤエネルギーを示す。

式３

上記のＣＩＤエネルギー依存曲線あるいは解裂イオンパラメータを作成するためのＣＩＤ−ＭＳⁿ測定において、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定器の機種、あるいは個体間においてデータのばらつきがあると、後述する参照データとの正確な比較が困難となる。そこで、必要に応じてスタンダードとなり得る物質についても同様にＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行ない、このデータを用いて補正して比較することが好ましい。

（４）参照親フラグメントイオンの調製（図１、図２／フローＡ２）
参照データを取得する目的で、参照糖鎖について上記（２）と同様に親フラグメントイオンを調製する。参照糖鎖は、目的糖鎖の全部または一部の構造を本発明の方法を用いて決定し得るものであればいかなるものであってもよい。具体的には、目的糖鎖またはその一部と構造が一致する可能性があり、構造が明らかであるものが用いられる。このような参照糖鎖は、天然のものでも合成されたものでもよく、また置換基がついていてもよい。糖鎖の長さは、１〜１３個の糖が連結したものが用いられる。

この参照糖鎖として、ある特定の集団であるライブラリーを用いることによれば、より網羅的、組織的に目的糖鎖の構造決定を行なうことができる。このようなライブラリーとしては、例えば、２〜２５個の糖が連結した構造を有しており、ライブラリーを構成する各糖鎖は、天然糖鎖を構成する全ての種類の単糖の順列組み合わせの配列を有するもので、かつ立体異性も含むもの等が好ましく用いられる。また、非天然の単糖を含んでいてもよい。

また、糖鎖構造を一般化すれば、非還元末端糖、還元末端糖、およびそれらの中間に存在する糖からなるポリマー性糖化合物ということができ、このポリマーの最小単位は３糖が連結した糖鎖である。このような３糖からなる天然糖鎖を構成する全ての種類の単糖の順列組み合わせの配列を有するもので、かつ立体異性も含む３糖ライブラリーは、生体に存在するあらゆる直鎖構造を有する糖鎖の部分構造を含んでいるため、本発明の参照糖鎖のライブラリーとしてより好ましい。

上記の天然糖鎖を構成する単糖とは、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、N-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミン、キシロース、シアル酸、グルクロン酸、フコース等が挙げられる。また、これらは修飾基を有していても良い。

参照糖鎖および参照糖鎖ライブラリーは、これを化学合成することが好ましい。合成の方法としては、通常用いられるそれ自体公知の方法を用いることができる。化学合成には、上述のような単糖各々を適当に保護した合成ユニットが必要である。さらに、立体異性体から成る糖鎖ライブラリーを効率良く合成するためには、立体選択的な合成ではα−グリコシドを得るためには隣接基関与のない保護基、例えばベンジル基（Ｂｎ）を、β−グリコシドを得るためには、隣接基関与のある保護基、例えばアセチル基等を用いる必要がある。これらの立体制御のための保護基の他に通して用いる保護基を用いる必要性から、単糖合成ユニット数は多くなり、合成経路の複雑化につながる。従って、２位の保護基は隣接基関与のない保護基とし、合成経路の簡略化を、例えばＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９５２３号明細書に記載の方法等に従って行なうことが好ましい。

かくして得られた参照糖鎖または参照糖鎖ライブラリーは、これを目的糖鎖と同様に特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行なう。特定のｍ／ｚのフラグメントイオンとは、目的糖鎖の親フラグメントイオンが有するｍ／ｚと同一のものであればいかなるものでもよい。また、参照糖鎖がライブラリーの場合には、該ライブラリーの各構成要素から得られる何れの解裂しえるフラグメントイオンでもよく、全ての解裂し得るフラグメントイオンでもよい。

（５）参照親フラグメントイオンのＣＩＤ−ＭＳⁿ測定（図１、図３／フローＢ２）
上記（４）で取得された参照親フラグメントイオンは、これを目的親フラグメントイオンと同様にＣＩＤ−ＭＳⁿ測定する（ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定により取得された参照親フラグメントの場合は、これをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定する）。イオン化法、溶媒、糖鎖の調製、測定装置などは全て目的糖鎖および親フラグメントイオンと同様のものを用いることができる。該測定により得られたプロットから、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成する（前述の式１）。このうち、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数を、該娘イオンの総イオンカウント数と、該娘イオンの総イオンカウント数と上記親イオンの総イオンカウント数の和との比で表すことも好ましい（前述の式２）。この比で娘イオン強度を表すことにより、微弱なその他のイオンカウント数に影響を受けず、正確なＣＩＤエネルギー依存曲線を作成することができる。特定のｍ／ｚの娘イオンとは、参照親フラグメントイオンから解離する何れの娘イオンでもよいし、その全てでもよい。さらに、参照糖鎖が、ライブラリーであった場合、該ライブラリーの全ての構成要素から得られる参照親フラグメントイオンについて得られる全ての娘イオンであることが網羅的、組織的解析を行なう上で好ましい。

さらに、上記ＣＩＤエネルギー依存曲線をそれ自体公知の方法で、特徴付ける数値で表すことにより、解裂イオンパラメータを作成することもできる。

解裂イオンパラメータとしては、例えば、特定のｍ／ｚの娘イオンのイオン強度の最大値を該娘イオンの総イオンカウント数の相対数としてあらわした相対値、前記相対値が５０％となるＣＩＤエネルギー値、及びＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き、から選ばれる少なくとも１つのパラメータを用いることができる。また、ＣＩＤエネルギー依存曲線をイオンカウント数の相対数としての基底値（Ｂｏｔｔｏｍ＝０）と最大値（Ｔｏｐ＝１００）、その５０％にあたるＣＩＤエネルギー（Ｖ₅₀）、およびＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き（Ｓｌｏｐｅ）を指標として前述の式３により計算し、解裂イオンパラメータとすること等が挙げられる。このとき、他の式によるＣＩＤエネルギー依存曲線のカーブフィッティングを行なうこともでき、そのような場合には対応するパラメータを用いることができる。

上記した方法により得られる、構造既知の複数の参照糖鎖をＣＩＤ−ＭＳⁿ測定することにより得られる複数の特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線からなるＣＩＤエネルギー依存曲線ライブラリー、並びに上記ＣＩＤエネルギー依存曲線から作成された、構造既知の複数の参照糖鎖の解裂イオンパラメータからなる解裂イオンパラメータライブラリーも本発明に含まれる。

さらに、参照糖鎖または参照糖鎖ライブラリーをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定することにより得られるＣＩＤエネルギー依存曲線、解裂イオンパラメータ等の参照データを、コンピュータにより読み取り可能な記憶装置に格納したデータセットも本発明に含まれる。

さらに、ＣＩＤエネルギー依存曲線、または解裂イオンパラメータは深度を持つ新しい種類のバーコードとして扱うこともでき、分子の構造を記述するために用いることもできる。参照データとともに参照糖鎖名、起源、測定方法や条件等も同時にコード化することができ、サンプル瓶等に貼ることができる。従って、これを読み取るバーコードリーダー等と解析ソフトウェアについても当業者によれば作成することは可能であり本発明の範囲に含まれる。

（６）目的糖鎖の構造決定（図１、図４／フローＣ）
本発明においては、上記（３）で得られた目的糖鎖の特定のｍ／ｚの親フラグメントイオンから得られた特定のｍ／ｚの娘イオン（以下、これを「目的娘イオン」と称することがある）のＣＩＤエネルギー依存曲線について、目的親フラグメントイオンと同一のｍ／ｚを有する参照親フラグメントイオンから得られた、目的娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオン（以下、これを「参照娘イオン」と称することがある）のＣＩＤエネルギー依存曲線を選択し、これを比較する。また、これらのＣＩＤエネルギー依存曲線から得られた解裂イオンパラメータを比較してもよい。

また、参照糖鎖がライブラリーである場合には、まず、参照データから目的親フラグメントイオンと同一のｍ／ｚを有する親イオンのデータを選択し、さらにその中から、比較しようとする目的娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線または解裂イオンパラメータを選択してこれを比較する。

目的親フラグメントイオンから得られたＣＩＤエネルギー依存曲線または解裂イオンパラメータと、これに対応する参照データが一致した場合、参照データが誘導されたもとの参照親フラグメントイオンの構造と目的親フラグメントイオンの構造が同じであると決定することができる。ここで、それぞれのデータが一致するとは、ＣＩＤエネルギー依存曲線の場合、各々の曲線が９５％以上の一致度を示すこといい、また、解裂イオンパラメータの場合にはその値の差が±２％以内であることを示す。また、目的親フラグメントイオンに置換基が結合していた場合には、置換基が結合した参照親フラグメントイオンから得られた参照データと比較して、一致した場合には、同一の置換基を有していると判断することができる。このとき、Ｚ検定を判断基準とすることもできる。

ここで、１つの特定のｍ／ｚを有する娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線または解裂イオンパラメータが一致しても、さらに他のｍ／ｚを有する娘イオンのデータを比較すると異なる場合もあるので、複数の娘イオンのデータを比較することが好ましい。

かくして本発明の方法により目的糖鎖の一部が決定された場合、これらの全配列を決定するために、例えば、生合成経路に当てはまるものを参照してつなぎ合わせたり、初めに目的親フラグメントイオンを産生するために分解した場合には、その分解の方法から再構築する等の方法が用いられる。

（７）目的糖鎖の構造推定（図１、図４／フローＣ）
上記（６）で比較したＣＩＤエネルギー依存曲線または解裂イオンパラメータが一致しなかった場合は、解裂イオンパラメータを比較し、目的糖鎖の構造を推定することができる。具体的には、目的娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線から解裂イオンパラメータを作成し、参照娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線から作成した解裂イオンパラメータと比較することにより、目的糖鎖の構造を推定すればよい。統計的解析により比較するのが好ましく、また参照糖鎖として、前述の糖鎖ライブラリーを用いるのが好ましい。また、解裂イオンパラメータとして、例えば、ＣＩＤエネルギー依存曲線をイオンカウント数の相対数としての基底値（Ｂｏｔｔｏｍ＝０）と最大値（Ｔｏｐ＝１００）、その５０％にあたるＣＩＤエネルギー（Ｖ₅₀）、およびＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き（Ｓｌｏｐｅ）を指標として前述の式３により計算した値を、挙げることができる。

（８）糖鎖の構造異性体の純度検定（図１、図５／フローＤ）
前述のように、糖鎖の構造異性体毎にＣＩＤ−ＭＳⁿ測定結果は相違する(図１０)。すなわち、同一質量数であっても構造が異なる糖鎖異性体はこれを形成する結合の解裂反応の様子が異なる。この理由は構造異性を形成する化学結合エネルギーに差異が存在し、このため、異なる結合が各々ＣＩＤ条件下で解裂することによるためである。これを利用し、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定で親イオンが消失しない程度に衝突誘起解離を行い、この残存する親イオンをｎ＋１段目で再度衝突誘起解離を行うこと（ＣＩＤ−ＭＳⁿ⁺¹測定）により、糖鎖の構造異性体の純度検定を行うことができる。検体が純品ならばＣＩＤ−ＭＳⁿとＣＩＤ−ＭＳⁿ⁺¹の段数で得られるマススペクトル、あるいは、エネルギー依存曲線は一致する。検体が同一質量数の物質からなる混合物である（構造異性体混合物）ならば、ＣＩＤ−ＭＳⁿとＣＩＤ−ＭＳⁿ⁺¹の各段の親イオンの組成比が異なることとなるので、得られる質量分析結果、特に、各シグナル強度、あるいは、エネルギー依存曲線が異なる。上記の純度検定の概略を図５に示す。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ ＣＩＤ−ＭＳ ⁿ 測定の定量性の確認
（１）ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定値の定量性
立体異性体や結合位置異性体からなる糖鎖のＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られたＣＩＤ−エネルギー依存曲線を比較して上記糖鎖の化学構造を決定するためには、取得したデータの定量性が問題となるためこれを確認した。Ｆｕｃα（１−３）Ｇａｌβ−Ｏｃｔｙｌ（ＷＯ２００５／０００８６１号明細書に記載の方法で合成した）をＨ₂Ｏ／メタノール（１：１）溶液に最終濃度１０ｎｇ／μｌとなるように溶解し、これをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定装置（ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ：ブルカーダルトニクス社製）のニードルにシリンジポンプを用いたインフュージョン法（流速を２μｌ／分）で注入し、熱キャピラリー温度２５０℃、キャピラリー電圧４．０ｋＶ、ＣＩＤエネルギーが０．５〜１．５Ｖ、ポジティブモードで測定を行った。

上記の測定で得られる実際のイオングラフの１例として、ｍ／ｚ＝３１５のフラグメントイオンのイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を図６Ａに示す。図中、階段状のカーブが電圧変化を示し、縦軸が総イオンカウント数、横軸が測定時間である。

上記の測定におけるｍ／ｚ＝３１５およびその親イオンである４１６について、ＣＩＤエネルギー（電圧）と総イオンカウント数の関係を示したグラフ（ＣＩＤエネルギー依存曲線）を図６Ｂに示す。図中丸で示したグラフがｍ／ｚ＝３１５のもので、四角で示したグラフはｍ／ｚ＝４１６のもので、いずれも１６プロットから電圧変化の直前直後の各々２プロットを除いた平均値をプロットした。

図６Ｂの縦軸は、ｍ／ｚ＝３１５の総イオンカウント数と、ｍ／ｚ＝３１５の総イオンカウント数と親イオン（ｍ／ｚ＝４１６）の総イオンカウント数の和の比である。この値を用いることにより、微弱な他のｍ／ｚのイオンカウント数の影響を受けない値で参照データと比較することができる。

このグラフの定量性を検証するためにｍ／ｚ＝３１５のＣＩＤエネルギー依存曲線の立ち上がり点（０．９４Ｖ）、減衰する親イオン（ｍ／ｚ＝４１６）のＣＩＤエネルギー依存曲線との交点（１．１２Ｖ）、およびプラトーに達する点（１．３８Ｖ）の３点におけるイオンカウント数について上記１６プロットから上限２プロットを除いた１２プロットで、ＣＶ値（変動係数）を算出した結果を図６Ｃに示す。算出式は、標準偏差／平均値×１００である。結果、それぞれの電圧における値のＣＶ値（変動係数）がＣＩＤエネルギー依存曲線の立ち上がり点で２４．２％、親イオンＣＩＤエネルギー依存曲線との交点で３．５％、およびプラトー到達点で７．３％であり、特に親イオンＣＩＤエネルギー依存曲線との交点以降のデータは信頼性が高く、上記の方法により定量的解析が可能であることを示した。

（２）ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定により得られるＣＩＤエネルギー依存曲線の同一性
本発明においては、同一のフラグメントイオンについて、ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳとＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定またはそれ以上の各ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定で得られたＣＩＤエネルギー依存曲線が同一でないと、参照データとの比較ができないので、これを確認した。

マルトヘキサオース（６糖）のピリジルアミノ化物（図７Ａ）をＨ₂Ｏ／メタノール（１：１）溶液に最終濃度１０ｎｇ／μｌとなるように溶解し、これをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定装置（ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ：ブルカーダルトニクス社製）のニードルにシリンジポンプを用いたインフュージョン法（流速を２μｌ／分）で注入し、熱キャピラリー温度２５０℃、キャピラリー電圧４．０ｋＶ、ＣＩＤエネルギーが０．９〜１Ｖ、ポジティブモードで測定を行った。上記ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定で得られたｍ／ｚ＝４４３（２糖）のＣＩＤエネルギー依存曲線を図７Ａ−１に示した。ここで、縦軸は、ｍ／ｚ＝４４３の総イオンカウント数と、ｍ／ｚ＝４４３の総イオンカウント数と親イオン（ｍ／ｚ＝１０９１）の総イオンカウント数の和の比である。

次にマルトヘプタオース（７糖）のピリジルアミノ化物（図７Ｂ）を上記と同様にＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られたｍ／ｚ＝１０９１のフラグメントイオンについて、さらに１．１〜１．９ＶのＣＩＤエネルギーでＣＩＤ−ＭＳ（この時点ではＭＳ／ＭＳ／ＭＳ）測定を行って得られたｍ／ｚ＝４４３（２糖）のＣＩＤエネルギー依存曲線を図７Ｂ−１に示した。さらに上記２つのＣＩＤエネルギー依存曲線を重ね合わせたものを図７Ｃに示した。図から明らかなように、同一のフラグメントイオンのＣＩＤエネルギー依存曲線は、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定の異なる段数で得られたものでも同一でありＣＩＤ−ＭＳⁿ測定の定量性が確認された。

実施例２ ＣＩＤエネルギー依存曲線比較による構造決定
（１）天然糖鎖と合成オリゴ糖鎖におけるＣＩＤエネルギー依存曲線の同一性
本発明は、参照糖鎖（ライブラリー）のＣＩＤエネルギー依存曲線と構造未知の天然の糖鎖のＣＩＤエネルギー依存曲線を比較することにより目的糖鎖の構造解析を行う方法である。ここで、構造は同じであるが異なる置換基を有している合成糖鎖と天然糖鎖について、ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定で同一のｍ／ｚを有する親イオンを取得し、これをさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定した場合、得られた娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線が同一であることを確認した。

Ｆｕｃα（１−６）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌ（合成品／図８Ｂ）と、Ｆｕｃα（１−２）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃを含むＨ₂Ｏ−メタノール（１：１）(Ｄｅｘｔｒａ Ｌａｎｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．製／図８Ａ)について、例１（１）と同様にして、ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られたｍ／ｚ＝３０５．０８のフラグメントイオン(グルコース環が解裂したもの（Ａ⁰、2イオン）)について、さらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。この測定のｍ／ｚ＝２４５の時のＣＩＤエネルギー依存曲線を図８に示す。図中、Ａ−１で示されるグラフが天然の糖鎖から得られたもの、Ｂ−１がオクチル基が付いた合成オリゴ糖から得られたものである。また、これらを重ね合わせたものをＣで示した。図から明らかなように、合成オリゴ糖と天然糖鎖では、同一のｍ／ｚを有するフラグメントイオンでは、その前段数のＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定の親イオンが異なる置換基を有していても、また、天然糖鎖と合成糖鎖でも同一のＣＩＤエネルギー依存曲線が得られることが確認された。

また、上記ＣＩＤエネルギー依存曲線をイオンカウント数の相対数としての基底値（Ｂｏｔｔｏｍ＝０）と最大値（Ｔｏｐ＝１００）、その５０％にあたるＣＩＤエネルギー（Ｖ₅₀）、およびＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き（Ｓｌｏｐｅ）を指標として式１によりパラメータ化（Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いた）し、比較したところ、ほぼ同一の値を示した。従って、上記パラメータの比較によっても、構造未知の天然糖鎖の部分構造を明らかにすることができることが確認された。

（２）異なる構造を有する糖鎖から得られる同一のフラグメントイオンにおけるＣＩＤエネルギー依存曲線の同一性
本発明の方法は、目的糖鎖（参照データの親フラグメントイオンとは異なる構造を有する）を参照データの親イオンと同一の構造を有するフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、これをさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られたＣＩＤエネルギー依存曲線を参照データと比較することにより糖鎖の構造解析を行う方法である。そこで、異なる構造を有する２種の糖鎖について同一のフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、得られたフラグメントイオンをさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定し、得られた娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線が同一であることを確認した。

ＰＡ化ＬｅＸ５糖（図９Ａ）および還元末端遊離のＬｅＸ５糖（Ｂ）のナトリウム付加イオンを実施例１と同様にＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、ＬｅＸ−ｏｓｙｌ残基（ＬｅＸ構造を含み、Ｎ−アセチルグルコサミン１位の酸素原子を含む）由来のフラグメントイオン（ｍ／ｚ＝５５２．１９）が共通に観察された。

そこで、このフラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ（この時点での段数は３段目となる）測定を行った。得られたプロットからｍ／ｚ＝４０６（Ｃ）および３８８（Ｄ）のフラグメントイオンについてＣＩＤエネルギー依存曲線を作成した結果を図９ＣおよびＤに示す。図中丸で示したグラフは、ＰＡ化ＬｅＸ５糖由来のもの、四角が還元末端遊離のＬｅＸ５糖由来のものを示す。図から明らかなように、異なる構造を有する糖鎖から得られたものであっても、同一の構造を有するフラグメントイオンから得られる同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線は一致することが確認された。

（３）アノマーの識別
同一の構造を有するが立体異性のフラグメントイオンについて、これを本発明の方法で識別することができることを確認した。Ｆｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−６）Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌ（図１０Ａ）の３つのグリコシド結合がそれぞれ異なる８種のアノマーを化学合成し、ＨＰＬＣで分離精製を行なった後、これらを実施例１と同様にＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。このときのＦｕｃα（１−６）Ｇａｌα（１−６）Ｇｌｃβ−ＯｃｔｙｌのＭＳ／ＭＳを異なるＣＩＤエネルギー（Ｂ：０．８２Ｖ、Ｃ：０．９６Ｖ）で測定したスペクトルの１例を図１０Ｂ、Ｃに示した。図から明らかなように、ｍ／ｚ＝６２３．３の親イオンは、ＣＩＤエネルギーが０．８２Ｖではｍ／ｚ＝４７７．２のフラグメントイオンを生じ、さらに０．９６Ｖでは、該親イオンはｍ／ｚ＝４７７．２と３３１．１の２つのフラグメントイオンを生じた。

本解析に用いた糖鎖が構造未知であったとすると、上記の結果からは、該糖鎖がデオキシヘキソースとヘキソースを含むことが判るが、上記８種のアノマーのいずれのグリコシド結合を有しているかは判らない。

そこで、上記で得られたｍ／ｚ＝４７７．２のフラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った（この時点での段数は３段目となる）。条件は、実施例１と同じで、ＣＩＤエネルギーは０．５〜１．７５Ｖで行った。ｍ／ｚ＝４７７．２３のフラグメントイオンは還元末端の単糖（フコース）を失った２糖の４種のアノマーのものである。

得られたプロットからｍ／ｚ＝３１５のフラグメントイオンについてＣＩＤエネルギー依存曲線を作成した結果を図１０Ｄに示す。図中丸で示したグラフは、グリコシド結合α／αのもの、四角がβ／αのもの、三角がα／βのもの、ひし形がβ／βのものを示す。また、黒で示したグラフは１段目のＣＩＤで遊離したフコースとのグリコシド結合がαであったもの、白で示したグラフがβであったものを示す。

図から明らかなように、アノマー間では、ＣＩＤエネルギー依存曲線が明らかに異なり、本解析によりアノマーを識別できることが判った。また、親イオンのアノマーの違いは娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線には影響しないことが判った。

さらに、上記のＣＩＤエネルギー依存曲線をイオンカウント数の相対数としての基底値（Ｂｏｔｔｏｍ＝０）と最大値（Ｔｏｐ＝１００）、その５０％にあたるＣＩＤエネルギー（Ｖ₅₀）、およびＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き（Ｓｌｏｐｅ）を指標として上記式１によりＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて算出、比較したところ、アノマー間では異なる値となり、また、親イオンのアノマーの違いは娘イオンの値には影響せず、上記計算式によってもアノマーを識別できることが判った。

従って、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、得られるＣＩＤエネルギー依存曲線を参照データと比較し、同一のものがあった場合には、目的糖鎖は、該ＣＩＤエネルギー依存曲線を与えた糖鎖と同一の構造であり、アノマーの違いも特定できることがわかった。

逆に、構造が同一の糖鎖の参照データと、目的糖鎖をＣＩＤ−ＭＳⁿ測定して得られたＣＩＤエネルギー依存曲線が一致しなかった場合、参照データのもととなる糖鎖は目的糖鎖のアノマーである可能性がある。

（４）ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定の異なる段数におけるＣＩＤエネルギー依存曲線の比較
本発明において、目的糖鎖の特定のｍ／ｚのフラグメントイオンの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線が、参照データと一致した場合、この段数では一致していても、構造が異なることが考えられる。そこで、該ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定で得られるその他の娘イオンについても参照データの同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線と比較すると、さらに正確な構造解析を行うことができる。この場合の例を以下に示す。

非還元末端にＯ型血液型抗原エピトープ（Ｆｕｃα（１−２）Ｇａｌ）を有する天然型糖鎖２種を比較対象として選択した。これらの糖鎖はエピトープ（Ｆｕｃα（１−２）Ｇａｌ）を共有するものの、フコースが結合しているガラクトースを含む２糖構造がラクト系列（図１１Ａ）とネオラクト系列（図１１Ｂ）であり、結合位置異性体である。さらに、Ａは３糖、Ｂは５糖であり、親イオンとしての質量数も明らかに異なるが、糖鎖Ａ、ＢをそれぞれＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行うことによりグルコサミニル結合部分で解裂したと考えられる共通のｍ／ｚを有するフラグメントイオン（ｍ／ｚ＝５３４．１８）がナトリウム付加物として得られる（図１１Ａ、およびＢの線の左側部分）。

そこで、さらにこのフラグメントイオンについてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、これらの娘イオン（ｍ／ｚ＝３８８）のＣＩＤエネルギー依存曲線を作成したところ、これらは一致した（図１１Ｃ）。しかし、その他の娘イオンについても同様にＣＩＤエネルギー依存曲線を作成したところ、ｍ／ｚ＝３４９の娘イオンでは図１１Ｄとなり、ｍ／ｚ＝３３１の娘イオンでは図１１Ｅとなり、明らかにＣＩＤエネルギー依存曲線は異なることがわかった。このことから、上記２種の糖鎖の構造は異なると判断することができた。

実施例３ パラメータ解析による構造異性の判別の可能性の確認
最初にアノマー異性体、および、結合位置異性体の判定をおこなうことの可能性に関して、単一の単糖の特定の結合のみからなるオリゴ糖を用いて検討した。マルトオリゴ糖はグルコースのみがα（１−４）、セロオリゴ糖はβ（１−４）結合それぞれした構造体でありであり、アノマー異性体の比較に適している。また、イソマルトオリゴ糖はα（１−６）の結合から成っており、マルトオリゴ糖との比較において結合位置異性の判別に重要な位置を占める。

（１）アノマー異性の判別
実施例１（２）においてマルトオリゴ糖のＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳとＭＳ／ＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤ−ＭＳⁿとＣＩＤ−ＭＳⁿ⁺¹）測定のＣＩＤエネルギー依存曲線が良い一致を示すことを示した。ここで得られたエネルギー依存曲線をシグモイドカーブフィットし、得られたパラメータ（Ｔｏｐ、Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）について３Ｄ散布図を作成、この２Ｄ展開図を作成した。同時に結合位置はマルトオリゴ糖と同じでアノマー立体配置のみが異なるセロオリゴ糖に関して同様にプロットした（図１２）。この結果、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定の２段目と３段目においてプレカーサーイオンが同一であればパラメータが良い一致を示し、特に、Ｖ₅₀が１．４０〜１．４５Ｖの範囲に集中することが分かった。一方、セロオリゴ糖においてはＶ₅₀値が１．５Ｖ付近にあり、これは、アノマー立体配置の相違による結合の解裂状況をパラメータで判別できることを示す結果である。

（２）結合位置異性の判別
実施例３（１）のマルトースの結果に対しα（１−６）の結合から成っているイソマルトオリゴ糖の衝突エネルギーマップから各パラメータを取得し、マルトースのそれらと共にグラフとした（図１３）。この結果、Ｖ₅₀値が結合位置異性の指標として使用できることが示された。

実施例４ 構造推定方法に利用可能な３糖ライブラリーの参照データの同定
（１）３糖ライブラリーの合成およびそのＣＩＤ−ＭＳⁿ測定
３糖ライブラリーの一部であるフコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、および、グルコース（Ｇｌｃ）で構成される３糖Ｆｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−２／３／４／６）Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌをアノマー混合物として合成しＨＰＬＣを用いて単離した各々の３糖についてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、得られたライブラリー化合物からの構造情報を用いて構造未定化合物の構造予測をおこなった。情報源となる化合物は本来計３２種（２³×４）であるが、単離可能であった計２３化合物についてライブラリー構造データとしてあつかった。全てのサンプルにおいてＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定はｍ／ｚ＝６２３［Ｍ＋Ｎａ］⁺、ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定はｍ／ｚ＝４７７［Ｍ−Ｆｕｃ＋Ｎａ］⁺に関しておこなった。

（２）ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定時の３糖ライブラリーのフコース残基解離データ
実施例１に記載の方法でＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定をそれぞれのサンプルに関して行ってデータを取得した(図１４)。その後カーブフィット（ボルツマンのシグモイド式）をおこない、各パラメータ（Ｔｏｐ、Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）を算出した(図１５)。３糖ライブラリーの２３化合物のうち、Ｆｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−６）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌの例を図１４および１５に示す。

算出されたパラメータの散布図を作成するとプロットが二分していることが明らかであり、アノマー異性体(Ｆｕｃα：黒丸、Ｆｕｃβ：白丸)に着目すると、プロットがＣＩＤプロセス下のフラグメント化においてグリコシド結合の立体（アノマー異性）を反映することが明らかである(図１６)。この場合、Ｖ₅₀とＳｌｏｐｅの両パラメータがアノマー異性の判別の指標となることが分かる。β体において１点のみＳｌｏｐｅが小さな値を示したが、これはデータのばらつきによるエラーであり統計的にもはずれ値として認識される。

（３）ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定時の３糖ライブラリーのガラクトース残基解離データ
ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定においてもＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定時のＦｕｃの脱離に関するプロットと同様にＧａｌが脱離したｍ／ｚ＝３１５に関するデータは、２極化の傾向がある (図１７)。この結果はＶ₅₀のみがアノマー異性体を反映する結果である。

実施例５ ３糖ライブラリーのＣＩＤ−ＭＳ ⁿ 散布図を利用したアノマーの識別法
（１）各プロットと各平均との距離によるプロットの範囲
ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定により得られるシグモイドカーブのグラフから、α配置およびβ配置（本実施例においてはフコースとガラクトースの場合について説明）はそれぞれある範囲を持ち収束していることがわかる。未知糖鎖のアノマー解析を行う際、この範囲に入っているか否かによりアノマーの推定が可能である。

まずバラつきの範囲を認識するために、Ｆｕｃのα配位、β配位のＶ₅₀およびＳｌｏｐｅの平均をそれぞれもとめ、各プロットとの距離の値を範囲(Ｒ)とした。具体例を示すと、Ｆｕｃα（１−６）Ｇａｌα（１−３）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌでは、
Ｖ₅₀−α全体のＶ₅₀の平均 ＝ ０．００５９７、
Ｓｌｏｐｅ−α全体のＳｌｏｐｅの平均 ＝ ０．０００２２９
である。この値からの距離をもとめ、この距離を半径とする円をＦｕｃαの範囲とした(図１８)。Ｆｕｃαに関するライブラリーから得た数値を表１に示す。

（３）構造解析における分子量の影響の補正
実施例２で、糖鎖ライブラリーをなす化合物のＣＩＤ解析から得られる部分構造体のエネルギー依存曲線と未知物質の部分構造体のエネルギー依存カーブの比較から、カーブが完全一致すれば部分構造を推定できることを示した。これは異なった元の構造から得られた同一のフラグメントをライブラリーデータと参照することで可能としている。この場合トラップされたイオンは同一分子量であるため、部分構造の完全一致が可能となる。しかし質量分析において、親イオンの分子量(分子の大きさ)は結果に影響する重要な因子であり、本研究においても分子量の差異によりカーブおよびパラメータ(Ｖ₅₀、Ｓｌｏｐｅ等)が異なる結果が得られているため、分子量の影響を考慮した糖鎖構造解析が必要となる。以下、得られた結果の補正法を提供する（図２０）。

糖鎖ライブラリー（Ｆｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−２／３／４／６）Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌ） のｍ／ｚ＝４７７のフラグメントイオンのＣＩＤエネルギー依存曲線と、今回補正サンプルとして用いる未知糖鎖の目的娘イオンと同一のｍ／ｚを有するＬｅｗｉｓ ａの参照娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線からそれぞれ得られるＶ₅₀およびＳｌｏｐｅを同一グラフにプロットした(図２１)。ここからプロットは分子量の差異の影響を大きく受けていることが分かる。次にこの差異からＶ₅₀、Ｓｌｏｐｅの補正値を導いた。以下に式を示す。
Ｖ₅₀の補正値 ＝ 脱Ｆｕｃαライブラリー（ｍ／ｚ＝４７７）のＶ₅₀平均 ／ Ｌｅｗｉｓ ａのＶ₅₀
Ｓｌｏｐｅの補正値＝脱Ｆｕｃαライブラリー（ｍ／ｚ＝４７７）のＳｌｏｐｅ平均 ／ Ｌｅｗｉｓ ａ のＳｌｏｐｅ

この算出された各補正値を未知糖鎖の目的娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線から得られるＶ₅₀およびＳｌｏｐｅに掛け合わせた。一例を示すと未知糖鎖の補正前プロットは図２１に示すように、この未知糖鎖がＦｕｃβとは大きく差があるためＦｕｃαということが示唆された。この方法のみではデオキシヘキソースが何であるかの特定はできないが、ここで未知糖鎖として使用した糖鎖はヒトから単離された四糖構造であり、ヒトにおいて存在するデオキシヘキソースがフコースであるので未知検体はＦｕｃα構造を有すると推測できた。実際に未知糖鎖として用いた糖鎖はＬｅｗｉｓ ＸでありＦｕｃα構造を持っている。ライブラリーデータを充足することで、より精度の高い構造予測が可能である。

（４）機器間のデータ補正
質量分析計を用いた構造解析を行うにあたり問題視されるのは、機器間のデータの差異である。これを上記の方法を用いて補正を行った。まず、共通のサンプルとしてＦｕｃα(１−６)Ｇａｌα（１−６）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌを補正サンプルとして用いた。比較に用いた機器は同一会社ではあるがブルカーＱＩＴＭＳを用いることで「個体差」の補正をおこなった。エネルギー依存曲線データを比べるとＸ軸(ＡｍｐｌおよびＶ₅₀)に差異が見られる(図２２)。次に、このサンプルを補正サンプルとしてＦｕｃβ（１−６）Ｇａｌβ（１−６）Ｇｌｃα−Ｏｃｔｙｌの補正を段落番号００９８の補正と同様の方法で行ったところ、差異が少なくなり補正可能であることが示唆された。補正用検体数を増やすことにより補正の精度を改善できる。

実施例６ 糖鎖の構造異性体の混入検定
（１）検体の調製および質量分析
以下の４種類の検体を調製し、それぞれを実施例１の方法に従い測定した。すなわち、検体の質量分析計への注入はインフュージョン法で、流速１２０μｌ／ｈで行い、用いているイオン源（エレクトロスプレーイオン化法：ＥＳＩ）は1μｌ／ｍｉｎ〜１ｍｌ／ｍｉｎの範囲で使用した。また、ｏｎ ｌｉｎｅあるいはｏｆｆ ｌｉｎｅ ｎａｎｏＥＳＩを用いることにより、ｎｌ／ｍｉｎスケールでの分析が可能であった。検出機として質量分析計はブルカーダルトニクス ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ｐｌｕｓ（ＱＩＴ−ＭＳⁿ）を用いた。分析条件を以下に示す。１）熱キャピラリー温度：２０５℃、２）キャピラリー電圧：４．０ｋＶ、３）Ｄｒｙ Ｇａｓ：４．０ｌ／ｍｉｎ。ポジティブイオンモードで測定。ここで、ＣＩＤ−ＭＳⁿ測定の条件であるＩｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈは同位体を含まない０．８ ｍｓで行った。

純品Ａ Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌα−ＯＭｅ（７ ｎｍｏｌ）
純品Ｂ Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌβ−ＯＭｅ（７ ｎｍｏｌ）
混合物Ｃ 純品Ａ：純品Ｂ＝１：１
混合物Ｄ 純品Ａ：純品Ｂ＝１：９

（２）純品Ａおよび純品Ｂの分析結果
純品ＡのＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定及びＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定のＡｍｐｌ Ｖｏｌｔａｇｅ毎の各フラグメント強度と各々の差を図２３に示した。ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定及びＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定では結果に差異が見られなかった。純品Ｂも同様の結果であった（図２４）。

（３）混合物Ｃおよび混合物Ｄの分析結果
混合物Ｃおよび混合物ＤのＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定及びＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定のＡｍｐｌ Ｖｏｌｔａｇｅ毎の各フラグメント強度と各々の差を図２５および図２６にそれぞれ示した。それぞれの混合物に関して、純品に比べ大きな差異が見られた。この差異から混合物／非混合物の判定が可能であった。

図１は、本発明の方法の概略を示した図である。 図２は、本発明の方法の概略を示した図である。 図３は、本発明の方法の概略を示した図である。 図４は、本発明の方法の概略を示した図である。 図５は、本発明の方法の概略を示した図である。 図６は、Ｆｕｃα（１−３）Ｇａｌβ−ＯｃｔｙｌをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果を示すグラフである。 図７は、マルトヘキサオースとマルトヘプタオースの構造、およびそれらをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果、並びにそれらを比較した結果を示すグラフである。 図８は、Ｆｕｃβ（１−６）Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃの天然物および合成品の構造、およびそれらをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果、並びにそれらを比較した結果を示すグラフである。 図９は、ＰＡ化ＬｅＸ５糖と還元末端遊離のＬｅＸ５糖の構造、およびそれらをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果、並びにそれらを比較した結果を示すグラフである。 図１０は、Ｆｕｃα（１−６）Ｇａｌβ（１−６）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌのアノマーの構造、およびそれらをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果、並びにそれらを比較した結果を示すグラフである。 図１１は、非還元末端にＯ型血液型抗原エピトープ（Ｆｕｃα（１−２）Ｇａｌ）を有する天然型糖鎖２種の構造、およびそれらをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果、並びにそれらを比較した結果を示すグラフである。 図１２は、マルトヘキサオースとマルトヘプタオースのＣＩＤエネルギー依存曲線から得られた解裂イオンパラメータ（Ｔｏｐ、Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）をそれぞれ２Ｄ展開図にプロットした結果を示すグラフである。 図１３は、マルトヘキサオースとイソマルトヘキサオースのＣＩＤエネルギー依存曲線から得られた解裂イオンパラメータ（Ｔｏｐ、Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）をそれぞれ２Ｄ展開図にプロットした結果を示すグラフである。 図１４は、３糖ライブラリーを構成するＦｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−２／３／４／６）Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌのアノマーのうち、Ｆｕｃα（１−６）Ｇａｌα（１−６）Ｇｌｃβ−ＯｃｔｙｌをＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果を示すグラフである。 図１５は、Ｆｕｃα（１−６）Ｇａｌα（１−６）Ｇｌｃβ−ＯｃｔｙｌのＣＩＤエネルギー依存曲線をカーブフィットした結果を示すグラフと、そのグラフから得られた解裂イオンパラメータ（Ｔｏｐ、Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）の値である。 図１６は、３糖ライブラリーを構成するＦｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−２／３／４／６）Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌの各アノマーのフコース残基を解離させた解裂イオンパラメータ（Ｔｏｐ、Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）を２Ｄ展開図にプロットした結果を示すグラフである。各アノマーは結合位置異性で略して表記し、例えば１６３ＡＡＢはＦｕｃα（１−６）Ｇａｌα（１−３）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌを意味する。 図１７は、３糖ライブラリーを構成するＦｕｃα／β（１−６）Ｇａｌα／β（１−２／３／４／６）Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌの各アノマーのガラクトース残基をさらに解離させた解裂イオンパラメータ（Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）を２Ｄ展開図にプロットした結果を示すグラフである。 図１８は、３糖ライブラリーを構成するアノマーの解裂イオンパラメータの平均値の２Ｄ展開図において、未知糖鎖のアノマーの推定が可能な範囲を示すグラフである。 図１９は、３糖ライブラリーを構成するアノマーのフコースを解離させた解裂イオンパラメータ（Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）のα配置およびβ配置の各平均値ならびにそれらの標準偏差と、Ｆｕｃβ（１−６）Ｇａｌα（１−６）Ｇｌｃα−Ｏｃｔｙｌのフコースを解離させた解裂イオンパラメータを２Ｄ展開図にプロットした結果を示すグラフである。 図２０は、参照娘イオンと目的娘イオンの分子量が異なった場合の補正方法の概略を示した図である。 図２１は、参照娘イオンと目的娘イオンの分子量が異なった場合に得られる解裂イオンパラメータ（Ｓｌｏｐｅ、Ｖ₅₀）の２Ｄ展開図における、測定値と補正値の関係を示すグラフである。 図２２は、Ｆｕｃα（１−６）Ｇａｌα（１−６）Ｇｌｃβ−Ｏｃｔｙｌを異なる機種の質量分析計を用いてＣＩＤ−ＭＳⁿ測定した結果を示すグラフである。 図２３は、２糖の純品Ａ（Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌα−ＯＭｅ）を、親イオンと最も強度の高いフラグメントイオンの比が約１：３、１：１、３：１となるＡｍｐｌ ＶにてそれぞれＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定およびＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定した結果を示すグラフである。 図２４は、２糖の純品Ｂ（Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌβ−ＯＭｅ）を、親イオンと最も強度の高いフラグメントイオンの比が約１：３、１：１、３：１となるＡｍｐｌ ＶにてそれぞれＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定およびＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定した結果を示すグラフである。 図２５は、２糖の純品Ａ（Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌα−ＯＭｅ）および純品Ｂ（Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌβ−ＯＭｅ）を１：１の比で混合した混合物Ｃを、親イオンと最も強度の高いフラグメントイオンの比が約１：３、１：１、３：１となるＡｍｐｌ ＶにてそれぞれＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定およびＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定した結果を示すグラフである。 図２６は、２糖の純品Ａ（Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌα−ＯＭｅ）および純品Ｂ（Ｇａｌα（１−３）Ｇａｌβ−ＯＭｅ）を１：９の比で混合した混合物Ｃを、親イオンと最も強度の高いフラグメントイオンの比が約１：３、１：１、３：１となるＡｍｐｌ ＶにてそれぞれＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定およびＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定した結果を示すグラフである。

Claims (14)

1. （ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線と、構造既知の参照糖鎖から得られた、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線とを比較することを特徴とする糖鎖構造解析方法。
2. 構造既知の複数の参照糖鎖をＣＩＤ−ＭＳⁿ測定することにより得られる複数の特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線からなるＣＩＤエネルギー依存曲線ライブラリー。
3. 参照糖鎖が３糖からなることを特徴とする請求項２に記載のライブラリー。
4. 請求項２に記載のＣＩＤエネルギー依存曲線から作成された、構造既知の複数の参照糖鎖の解裂イオンパラメータからなる解裂イオンパラメータライブラリー。
5. 構造既知の複数の参照糖鎖の解裂イオンパラメータが、特定のｍ／ｚの娘イオンのイオン強度の最大値を該娘イオンの総イオンカウント数の相対数としてあらわした相対値、前記相対値が５０％となるＣＩＤエネルギー値、ＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き、から選ばれる少なくとも１つのパラメータであることを特徴とする、請求項４に記載のライブラリー。
6. 参照糖鎖が３糖からなることを特徴とする請求項４または５に記載のライブラリー。
7. （ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線と、請求項２または３に記載のライブラリーに含まれる、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線とを比較することを特徴とする糖鎖構造解析方法。
8. 請求項１または７に記載の（ｃ）の工程において、目的糖鎖の特定のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線の解裂イオンパラメータを作成し、該解裂イオンパラメータと、構造既知の参照糖鎖の上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線の解裂イオンパラメータとを比較することを特徴とする、請求項１または７に記載の方法。
9. 解裂イオンパラメータが、特定のｍ／ｚの娘イオンのイオン強度の最大値を該娘イオンの総イオンカウント数の相対数としてあらわした相対値、前記相対値が５０％となるＣＩＤエネルギー値、ＣＩＤエネルギー依存曲線の変曲点での傾き、から選ばれる少なくとも１つのパラメータであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. （ａ）目的糖鎖について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが得られるまでＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、得られた特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成し、（ｃ）該ＣＩＤエネルギー依存曲線の解裂イオンパラメータを作成し、（ｄ）該解裂イオンパラメータと、請求項４〜６のいずれかに記載のライブラリーに含まれる、上記フラグメントイオンと同一のｍ／ｚのフラグメントイオンをＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定することにより得られた、上記娘イオンと同一のｍ／ｚの娘イオンのＣＩＤエネルギー依存曲線から作成された解裂イオンパラメータを比較することを特徴とする糖鎖構造解析方法。
11. ＣＩＤエネルギー依存曲線の特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数が、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数と、該娘イオンの総イオンカウント数と親イオンの総イオンカウント数の和の比であることを特徴とする請求項１または７〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 目的糖鎖に含まれる異なる特定のｍ／ｚのフラグメントイオンについて請求項１もしくは７に記載の（ａ）〜（ｃ）の工程または請求項１０に記載の（ａ）〜（ｄ）の工程を繰り返し、それらの結果を組み合わせることを特徴とする糖鎖構造解析方法。
13. 少なくともＣＩＤ−ＭＳⁿ測定装置、請求項２〜６のいずれかに記載のライブラリーをコンピューター読み取り可能なように記録した記録媒体、および目的糖鎖に含まれる異なる特定のフラグメントイオンについて請求項１もしくは７に記載の（ｂ）および（ｃ）の工程または請求項１０に記載の（ｂ）〜（ｄ）の工程を行なうためのプログラムを記録した記録媒体を含む糖鎖構造解析システム。
14. （ａ）糖鎖検体について特定のｍ／ｚのフラグメントイオンが消失しないような任意の電圧でＣＩＤ−ＭＳⁿ測定を行い、（ｂ）残存する該フラグメントイオンについてさらにＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定を行い、（ｃ）前記２工程で得られたマススペクトル、ＣＩＤエネルギー依存曲線または該曲線の解裂イオンパラメータを比較することを特徴とする、糖鎖構造異性体の混入検定方法。

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