JP2006081481A - Method and kit for measuring asymmetric dimethylarginine - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非対称ジメチルアルギニン測定法及び非対称ジメチルアルギニン測定キットに関する。 The present invention relates to an asymmetric dimethylarginine measurement method and an asymmetric dimethylarginine measurement kit.
非対称ジメチルアルギニン（以下、ADMAと略称する。）は、ヒト生体内において、NO合成酵素の内因性阻害剤として知られており、生体内でのNOの生成量をコントロールするもののひとつである可能性が示唆されている（非特許文献１参照）。NOの役割としては、現在、血管収縮弛緩コントロール、マクロファージより産生されたNOによる生体防御、神経伝達物質としての利用等が知られている。 Asymmetric dimethylarginine (hereinafter abbreviated as ADMA) is known as an endogenous inhibitor of NO synthase in the human body, and may be one of the controls for the amount of NO produced in the body. Has been suggested (see Non-Patent Document 1). The role of NO is currently known for vasoconstriction / relaxation control, biological defense by NO produced from macrophages, utilization as a neurotransmitter, and the like.
近年、NOと関連する疾患についての研究が進み、動脈硬化、高血圧、妊娠中毒症等においてADMAとの関連性が知られるようになった（非特許文献２及び非特許文献３参照）。すなわち、ADMA量を測定することにより、上記動脈硬化等の疾患の診断が可能であることが示唆されている。 In recent years, research on diseases related to NO has progressed, and the relationship with ADMA has been known in arteriosclerosis, hypertension, pregnancy toxemia, and the like (see Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). That is, it has been suggested that the above-mentioned diseases such as arteriosclerosis can be diagnosed by measuring the amount of ADMA.
現在ADMAは、HPLCを用いる方法（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８及び非特許文献９参照）あるいはELISA（特許文献１参照）により測定されている。更にジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（以下、DDAHと略称する。）を用いた酵素的測定法も開示されている（特許文献２参照）。 Currently, ADMA is measured by HPLC (see Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6, Non-Patent Document 7, Non-Patent Document 8, and Non-Patent Document 9) or ELISA (see Patent Document 1). Has been. Furthermore, an enzymatic measurement method using dimethylarginine dimethylaminohydrolase (hereinafter abbreviated as DDAH) is also disclosed (see Patent Document 2).
この酵素的測定法は、生体中のADMAをDDAHによりシトルリンに変換し、シトルリン量を測定する方法である。しかしながら、この方法は、食物由来シトルリン及び尿素骨格を有する化合物（尿素等）は同様に発色すること、除タンパク質のため検体のクリーンアップが必要なこと、検体の濃縮過程が必要であること等から、測定に2時間以上かかった。また、使用する試薬の臭気が強いこと、50%硫酸で85℃、40分間の加熱処理及び危険な操作があること等から、キット化し、検査室等で使用するには不充分であり、実用的ではなかった。 This enzymatic measurement method is a method in which ADMA in a living body is converted to citrulline by DDAH and the amount of citrulline is measured. However, in this method, food-derived citrulline and a compound having a urea skeleton (such as urea) are similarly colored, the sample needs to be cleaned up for deproteinization, and the sample concentration process is necessary. The measurement took more than 2 hours. In addition, because of the strong odor of the reagent used, heat treatment with 85% sulfuric acid at 85 ° C for 40 minutes, and dangerous operations, etc., it is not enough to be used as a kit and used in laboratories. It was not right.
本発明が解決しようとする課題は、ジメチルアミノヒドロラーゼ及び他の酵素を組み合わせることにより、簡便で実用的な非対称ジメチルアルギニン測定法及び非対称ジメチルアルギニン測定キットを提供することにある。 The problem to be solved by the present invention is to provide a simple and practical method for measuring asymmetric dimethylarginine and a kit for measuring asymmetric dimethylarginine by combining dimethylaminohydrolase and other enzymes.
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、ジメチルアミノヒドロラーゼ及び他の酵素を組み合わせて用いることにより、極めて短時間のうちに非対称ジメチルアルギニン濃度に依存した測定値が得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
(１)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びジメチルアミンに作用する酵素又はシトルリンに作用する酵素を用いることを特徴とする非対称ジメチルアルギニン測定法。
(２)以下の酵素の２種以上を用いることを特徴とする非対称ジメチルアルギニン測定法。
酵素；ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ
(３)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及び以下の酵素の１種以上を用いることを特徴とする非対称ジメチルアルギニン測定法。
酵素；ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ
(４)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びジメチルアミンデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする非対称ジメチルアルギニン測定法。
(５)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びジメチルアミンモノオキシゲナーゼを用いることを特徴とする非対称ジメチルアルギニン測定法。
(６)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びジメチルアミンに作用する酵素又はシトルリンに作用する酵素からなる非対称ジメチルアルギニン測定キット。
(７)以下の酵素の２種以上からなる非対称ジメチルアルギニン測定キット。
酵素；ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ
(８)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及び以下の酵素の１種以上からなる非対称ジメチルアルギニン測定キット。
酵素；ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ
(９)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びジメチルアミンデヒドロゲナーゼからなる非対称ジメチルアルギニン測定キット。
(１０)ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びジメチルアミンモノオキシゲナーゼからなる非対称ジメチルアルギニン測定キット。
Therefore, as a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used a combination of dimethylaminohydrolase and other enzymes, so that a measurement value dependent on the asymmetric dimethylarginine concentration can be obtained in a very short time. As a result, the present invention was completed.
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) Dimethylarginine A method for measuring asymmetric dimethylarginine, characterized by using dimethylaminohydrolase and an enzyme acting on dimethylamine or an enzyme acting on citrulline.
(2) A method for measuring asymmetric dimethylarginine, wherein two or more of the following enzymes are used.
Enzymes; dimethylarginine dimethylaminohydrolase, dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
(3) A method for measuring asymmetric dimethylarginine, comprising using dimethylarginine dimethylaminohydrolase and one or more of the following enzymes:
Enzymes; dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
(4) A method for measuring asymmetric dimethylarginine, characterized by using dimethylarginine dimethylaminohydrolase and dimethylamine dehydrogenase.
(5) A method for measuring asymmetric dimethylarginine, characterized by using dimethylarginine dimethylaminohydrolase and dimethylamine monooxygenase.
(6) Asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising dimethylarginine dimethylaminohydrolase and an enzyme acting on dimethylamine or an enzyme acting on citrulline.
(7) An asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising two or more of the following enzymes.
Enzymes; dimethylarginine dimethylaminohydrolase, dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
(8) Asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising dimethylarginine dimethylaminohydrolase and one or more of the following enzymes.
Enzymes; dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
(9) Asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising dimethylarginine dimethylaminohydrolase and dimethylamine dehydrogenase.
(10) Asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising dimethylarginine dimethylaminohydrolase and dimethylamine monooxygenase.
本発明によれば、非対称ジメチルアルギニン測定法及び非対称ジメチルアルギニン測定キットが提供された。 According to the present invention, an asymmetric dimethylarginine measurement method and an asymmetric dimethylarginine measurement kit are provided.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、非対称ジメチルアルギニンに２種以上の酵素を作用させ、測定値を得る測定法であり、以下に示す酵素に限定するものではない。
本発明測定法に用いられる酵素としては、例えば、DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
The present invention is a measurement method for obtaining a measurement value by causing two or more enzymes to act on asymmetric dimethylarginine, and is not limited to the following enzymes.
Examples of the enzyme used in the measurement method of the present invention include DDAH, dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase, and luciferase.
DDAHは、以下に示す反応を触媒し、非対称ジメチルアルギニンへの特異性が高いものが好ましい。
ジメチルアルギニン + H2O → ジメチルアミン＋シトルリン
DDAHの作用により、ジメチルアルギニンから生成されるジメチルアミンに作用する酵素としては、例えば、以下の反応を触媒するジメチルアミンデヒドロゲナーゼが挙げられる。
ジメチルアミン + H2O + ｍPMS → メチルアミン + ホルムアルデヒド + 還元型ｍPMS
還元型ｍPMSは、NTBあるいはWST-8等のホルマザン試薬と反応させることにより発色させることができ、吸光度計を用いて測定することが可能である。
また、ジメチルアミンに作用する酵素としては、例えば、以下の反応を触媒するジメチルアミンモノオキシゲナーゼが挙げられる。
ジメチルアミン + O2 + NADPH → メチルアミン + ホルムアルデヒド + NADP＋
NADPHは、340nmの吸収を有しているので、減少量が吸光度計を用いて測定することが可能である。
すなわち、DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼもしくはジメチルアミンモノオキシゲナーゼ等の2種の酵素を組み合わせてADMAを測定することができる。
DDAHの反応産物であるシトルリンに作用する酵素としては、例えば、以下の反応を触媒するアルギノコハク酸合成酵素が挙げられる。
シトルリン + アスパラギン酸 + ATP → アルギノコハク酸 + AMP + ピロりん酸
DDAH catalyzes the following reaction and preferably has high specificity for asymmetric dimethylarginine.
Dimethylarginine + H 2 O → Dimethylamine + citrulline
Examples of the enzyme that acts on dimethylamine produced from dimethylarginine by the action of DDAH include dimethylamine dehydrogenase that catalyzes the following reaction.
Dimethylamine + H 2 O + mPMS → Methylamine + Formaldehyde + Reduced mPMS
Reduced mPMS can be colored by reacting with a formazan reagent such as NTB or WST-8, and can be measured using an absorptiometer.
Examples of the enzyme that acts on dimethylamine include dimethylamine monooxygenase that catalyzes the following reaction.
Dimethylamine + O 2 + NADPH → Methylamine + Formaldehyde + NADP +
Since NADPH has an absorption of 340 nm, the amount of decrease can be measured using an absorptiometer.
That is, ADMA can be measured by combining two kinds of enzymes such as DDAH, dimethylamine dehydrogenase or dimethylamine monooxygenase.
Examples of the enzyme that acts on citrulline, which is a DDAH reaction product, include arginosuccinic acid synthase that catalyzes the following reaction.
Citrulline + aspartic acid + ATP → arginosuccinic acid + AMP + pyrophosphoric acid
ATP量は、ルシフェラーゼ等により定量可能である。ルシフェラーゼは、以下の反応を触媒し、ATP量を発光量として測定することができる。
ルシフェリン + ATP + O2 → オキシルシフェリン + AMP + ピロりん酸 + CO2 + 光
すなわち、DDAH、アルギノコハク酸合成酵素、ルシフェラーゼの３種の酵素を組み合わせることにより、ADMAを測定することができる。
また、AMP をピルビン酸オルソりん酸ジキナーゼを用いた以下の反応によりピルビン酸に変換し、生じたピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等により定量することもできる。
ホスホエノールピルビン酸 + AMP + ピロりん酸 → ピルビン酸 + ATP + りん酸
The amount of ATP can be quantified by luciferase or the like. Luciferase catalyzes the following reaction and can measure the amount of ATP as the amount of luminescence.
Luciferin + ATP + O 2 → Oxyluciferin + AMP + Pyrophosphate + CO 2 + Light
That is, ADMA can be measured by combining three enzymes, DDAH, arginosuccinate synthase, and luciferase.
Alternatively, AMP can be converted to pyruvate by the following reaction using pyruvate orthophosphate dikinase, and the resulting pyruvate can be quantified with pyruvate oxidase or the like.
Phosphoenolpyruvate + AMP + pyrophosphate → pyruvate + ATP + phosphate
使用する酵素としては、市販されている酵素を用いてもよい。また、以下に具体例を挙げるが、これに限定されるものではない。
ジメチルアミンデヒドロゲナーゼとしては、例えば、Hyphomicrobium由来酵素（Journal of General Microbiology 115, 49-58, 1979）が知られている。
ジメチルアミンモノオキシゲナーゼとしては、例えば、Paracoccus aminovorans由来酵素（Arch. Microbiol. 176, 271-277, 2001）が知られている。
メチルアミンデヒドロゲナーゼとしては、例えば、Methylophilus methylotrophus由来酵素（J. Bacteriol. 176, 4073-4080, 1994）、Paracoccus denitrificans（Protein Engineering 14, 675-681, 2001）あるいはMethylobacterium extorquens（J. Biol. Chem. 273, 25703-25712, 1998）等が知られている。
メチルアミンオキシダーゼとしては、例えば、バチルス由来酵素（特開昭58-71886号公報あるいは特開昭58-71896号公報記載のもの等）が知られている。
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、例えば、シュードモナス由来酵素（J.Bacteriol 176、2483-2491、1994）が知られている。
DDAHについては、例えば、ヒト由来（Eur. J. Biochem. 258, 863-868, 1998）、ラット由来（J. Biol. Chem. 264, 10205-10209, 1989）あるいはPseudomonas aeruginosa由来（Molecular Microbiology 33, 1278-1279, 1999）等が知られており、例えば、Sinorhizobium meliloti ATCC51124由来のＤＤＡＨ（特願2004-079347号明細書記載のもの等）が挙げられる。
As the enzyme to be used, a commercially available enzyme may be used. Moreover, although a specific example is given below, it is not limited to this.
As dimethylamine dehydrogenase, for example, an enzyme derived from Hyphomicrobium (Journal of General Microbiology 115, 49-58, 1979) is known.
As dimethylamine monooxygenase, for example, an enzyme derived from Paracoccus aminovorans (Arch. Microbiol. 176, 271-277, 2001) is known.
Examples of methylamine dehydrogenase include enzymes derived from Methylophilus methylotrophus (J. Bacteriol. 176, 4073-4080, 1994), Paracoccus denitrificans (Protein Engineering 14, 675-681, 2001) or Methylobacterium extorquens (J. Biol. Chem. 273). , 25703-25712, 1998).
As methylamine oxidase, for example, an enzyme derived from Bacillus (such as those described in JP-A-58-71886 or JP-A-58-71896) is known.
As formaldehyde dehydrogenase, for example, Pseudomonas-derived enzyme (J. Bacteriol 176, 2483-2491, 1994) is known.
As for DDAH, for example, derived from human (Eur. J. Biochem. 258, 863-868, 1998), derived from rat (J. Biol. Chem. 264, 10205-10209, 1989) or derived from Pseudomonas aeruginosa (Molecular Microbiology 33, 1278-1279, 1999) is known, and examples thereof include DDAH derived from Sinorhizobium meliloti ATCC 51124 (such as those described in Japanese Patent Application No. 2004-079347).
更に、微生物、動物、植物等起源の酵素を探索して、自然界より取得することもできる。
例えば、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を探索する場合、ジメチルアミン等の酵素生産誘導物質を添加した培地で微生物を培養し、得られた微生物菌体を破砕し、ジメチルアミンを基質として用い、デヒドロゲナーゼ活性を検出することにより本発明ＤＤＡＨ生産能を有する微生物を取得できる。
ここで用いる微生物は、土壌から新たに分離してもよく、更には、微生物保存機関等より入手した微生物を用いることもできる。更に、現在までに知られているジメチルアミンデヒドロゲナーゼ遺伝子配列により相同性検索を行ない、機能未知の遺伝子配列情報を入手し、クローニングしてもよい。
更に、本発明ＤＤＡＨとして、遺伝子工学的技術あるいは変異処理等の方法により、天然型酵素を改変して得られる酵素も挙げられる。
Furthermore, enzymes derived from microorganisms, animals, plants, etc. can be searched and acquired from the natural world.
For example, when searching for a microorganism having the ability to produce dimethylamine dehydrogenase, the microorganism is cultured in a medium to which an enzyme production inducer such as dimethylamine is added, the resulting microbial cell is disrupted, and dimethylamine is used as a substrate. By using and detecting the dehydrogenase activity, a microorganism having the ability to produce the DDAH of the present invention can be obtained.
The microorganism used here may be newly separated from the soil, and further, a microorganism obtained from a microorganism storage organization or the like may be used. Furthermore, homology search may be performed using a dimethylamine dehydrogenase gene sequence known so far, and gene sequence information with unknown function may be obtained and cloned.
Furthermore, the DDAH of the present invention also includes an enzyme obtained by modifying a natural enzyme by a genetic engineering technique or a mutation treatment method.
改変する方法としては、例えば、必要な酵素を生産する生物に、紫外線、Ｘ線、放射線等を照射するかあるいはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の変異誘発剤を接触させることにより、改変された変異型酵素を生産する微生物を得、得られた微生物から変異型酵素を得る方法等が挙げられる。一般的には、遺伝子工学的な手法を用い、性質を異にする必要な酵素をコードする遺伝子を改変することにより、更に、優れた性質の変異型酵素を得ることもできる。
本発明測定法に用いる他の酵素についても同様の方法で取得することができる。
Examples of the modification method include, for example, irradiating an organism producing a necessary enzyme with ultraviolet rays, X-rays, radiation, etc., or ethyl methanesulfonate, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, Examples include a method of obtaining a microorganism that produces a modified mutant enzyme by contacting a mutagen such as nitric acid, and obtaining the mutant enzyme from the obtained microorganism. In general, by using a genetic engineering technique and modifying a gene that encodes a necessary enzyme having different properties, a mutant enzyme having superior properties can be obtained.
Other enzymes used in the measurement method of the present invention can also be obtained by the same method.
本発明測定法は、２種以上の酵素を組み合わせて用いる非対称ジメチルアルギニン測定法であり、特にDDAH及び他の酵素を組み合わせて用いる非対称ジメチルアルギニン測定法を挙げることができる。
他の酵素の例として、例えば、ジメチルアミンに作用する酵素、シトルリンに作用する酵素のいずれかを組み合わせて用いることができる。更に詳しくは、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、ルシフェラーゼ等の１種以上の酵素を選択し、DDAHと組み合わせて用いることができる。更に、２種以上の酵素を組み合わせて用いる非対称ジメチルアルギニン測定用キットであれば、本発明に含まれる。
The measurement method of the present invention is an asymmetric dimethylarginine measurement method using a combination of two or more enzymes, and particularly includes an asymmetric dimethylarginine measurement method using a combination of DDAH and another enzyme.
As examples of other enzymes, for example, an enzyme that acts on dimethylamine or an enzyme that acts on citrulline can be used in combination. More specifically, one or more enzymes such as dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase, and luciferase can be selected and used in combination with DDAH. Furthermore, any kit for measuring asymmetric dimethylarginine using a combination of two or more enzymes is included in the present invention.
組み合わせの例を以下に示すが、これに限定されるものではない。また、還元型ｍPMSとは、酵素反応の電子受容体の例として示したものであり、電子受容体として使用できるものであれば代用することができる。感度が不足した場合は、メチルアミンデヒドロゲナーゼ、メチルアミンオキシダーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを適時組み合わせることにより更に高感度に測定することができる。
DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼにより生じる還元型ｍPMSをホルマザン試薬により発色させる方法。（２）DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、メチルアミンデヒドロゲナーゼを組み合わせて生じる還元型ｍPMSをホルマザン試薬で発色させる方法。（３）DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを組み合わせて生じる還元型ｍPMSをホルマザン試薬で発色させる方法。（４）DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、メチルアミンデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを組み合わせて生じる還元型ｍPMSをホルマザン試薬で発色させる方法。（５）DDAH、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼを組み合わせて消費されるNADPH量を340nmの吸収で測定する方法。（６）（５）について、反応前と反応後の2回ホルマザン試薬によりNADPH量を定量し、減少量を算出する方法。（７）DDAH、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼもしくはジメチルアミンモノオキシゲナーゼにより生じるメチルアミンをメチルアミンオキシダーゼにより反応させ、生じる過酸化水素をパーオキシダーゼにより測定する方法。（８）DDAH、アルギノコハク酸合成酵素を組み合わせることにより消費されるATP量をルシフェラーゼにより測定する方法。（９）（１）から（４）について、反応の結果生じる還元型ｍPMSと酸素から発生する過酸化水素をルシゲニンのような化学発光基質と反応させ、発光により測定する方法。（１０）DDAH、アルギノコハク酸合成酵素、ピルビン酸オルソりん酸ジキナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを組合わせることにより生じる過酸化水素を発色あるいは発光により測定する方法。
Although the example of a combination is shown below, it is not limited to this. The reduced mPMS is shown as an example of an electron acceptor for enzyme reaction, and can be substituted if it can be used as an electron acceptor. When sensitivity is insufficient, it can be measured with higher sensitivity by combining methylamine dehydrogenase, methylamine oxidase, and formaldehyde dehydrogenase in a timely manner.
A method in which reduced mPMS produced by DDAH and dimethylamine dehydrogenase is colored with a formazan reagent. (2) A method in which a reduced mPMS produced by combining DDAH, dimethylamine dehydrogenase, and methylamine dehydrogenase is colored with a formazan reagent. (3) A method for coloring a reduced mPMS produced by combining DDAH, dimethylamine dehydrogenase, and formaldehyde dehydrogenase with a formazan reagent. (4) A method in which a reduced mPMS produced by combining DDAH, dimethylamine dehydrogenase, methylamine dehydrogenase, and formaldehyde dehydrogenase is colored with a formazan reagent. (5) A method of measuring the amount of NADPH consumed in combination with DDAH and dimethylamine monooxygenase by absorption at 340 nm. (6) A method for calculating the decrease by quantifying the NADPH amount with the formazan reagent twice before and after the reaction for (5). (7) A method in which methylamine produced by DDAH, dimethylamine dehydrogenase or dimethylamine monooxygenase is reacted with methylamine oxidase, and the resulting hydrogen peroxide is measured with peroxidase. (8) A method of measuring the amount of ATP consumed by combining DDAH and arginosuccinate synthase with luciferase. (9) A method for measuring (1) to (4) by reacting reduced mPMS resulting from the reaction with hydrogen peroxide generated from oxygen with a chemiluminescent substrate such as lucigenin, and measuring by luminescence. (10) A method for measuring hydrogen peroxide generated by combining DDAH, arginosuccinic acid synthase, pyruvate orthophosphate dikinase, and pyruvate oxidase by color development or luminescence.
DDAHの作用によりADMAは、シトルリン及びジメチルアミンに変換される。DDAHとしては、前述のとおり、ヒト由来、ラット由来、微生物由来等のDDAHが使用でき、特にSinorhizobium meliloti ATCC51124由来DDAH （特願2004-079347号明細書記載のもの等）は、至適ｐH範囲がｐＨ7.0〜10.0と広く、本測定法の使用に適している。
先ず、ADMA を含むサンプルに、DDAH を添加し反応させる。具体的には、１測定あたりDDAH を0.01〜5Uの範囲で使用でき、0.1U前後で使用することが望ましい。
反応ｐＨは、ｐH7.0〜10であればよく、他の酵素を共存させる場合は、共存させる酵素の至適に合わせて選択することができる。
他の酵素がジメチルアミンモノオキシゲナーゼあるいはジメチルアミンデヒドロゲナーゼであれば、ｐＨ8.0前後で反応するのが適当である。使用するバッファーは、目的のｐＨを調整できるバッファーであれば使用でき、リン酸バッファーであれば充分反応可能である。反応温度は、30〜40℃であれば反応できる。
ADMA is converted to citrulline and dimethylamine by the action of DDAH. As described above, DDAH derived from humans, rats, and microorganisms can be used as DDAH. Particularly, DDAH derived from Sinorhizobium meliloti ATCC51124 (such as those described in Japanese Patent Application No. 2004-079347) has an optimum pH range. It has a wide pH range of 7.0 to 10.0 and is suitable for use in this measurement method.
First, DDAH is added to a sample containing ADMA and allowed to react. Specifically, DDAH can be used in the range of 0.01 to 5 U per measurement, and is preferably used at around 0.1 U.
The reaction pH may be pH 7.0 to 0, and when other enzymes are allowed to coexist, they can be selected according to the optimum enzyme to be coexisted.
If the other enzyme is dimethylamine monooxygenase or dimethylamine dehydrogenase, it is appropriate to react at about pH 8.0. As the buffer to be used, any buffer that can adjust the target pH can be used, and any phosphate buffer can sufficiently react. The reaction can be conducted at a reaction temperature of 30 to 40 ° C.
DDAHの作用により生じたシトルリン及びジメチルアミンに作用する酵素を添加する場合、DDAH と共存させる場合あるいは、2段階反応をさせる場合が考えられる。
共存させる場合には、DDAH 反応液に更に、0.01〜5Uの酵素を添加することができる。その際、添加する酵素の反応に必要な試薬を必要量添加する必要がある。ジメチルアミンモノオキシゲナーゼを使用する場合、ＮＡＤＰＨを測定機器の検出感度に合わせて0.01〜0.5ｍＭ程度添加する。添加後、340ｎｍの吸光度を測定すれば、ADMA 量にしたがって吸光度の減少が見られる。二段階反応をさせる場合には、DDAH による反応終了後に、他の酵素と反応に必要な試薬を上記共存させる場合に準じて添加し、30〜40℃で反応させればよい。
When enzymes that act on citrulline and dimethylamine produced by the action of DDAH are added, they may coexist with DDAH, or may be a two-step reaction.
When coexisting, 0.01 to 5 U of enzyme can be further added to the DDAH reaction solution. At that time, it is necessary to add a necessary amount of a reagent necessary for the reaction of the enzyme to be added. When dimethylamine monooxygenase is used, NADPH is added in an amount of about 0.01 to 0.5 mM in accordance with the detection sensitivity of the measuring instrument. When the absorbance at 340 nm is measured after addition, the absorbance decreases according to the amount of ADMA. In the case of carrying out a two-step reaction, after completion of the reaction with DDAH, a reagent necessary for the reaction with another enzyme may be added according to the above-described case and reacted at 30 to 40 ° C.
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
ジメチルアミンデヒドロゲナーゼの取得
NCIMBよりHyphomicrobium denitrificans NCIMB 11706を購入し、NCIMB指定の方法で復元した後、復元物を、0.2Lの培地［1Lあたり（NH4）2 SO4 １ｇ、MgSO4 0.2ｇ、NaH2PO4 0.5ｇ、K2HPO4 1.55ｇ、ｐH7.2、オートクレーブ後フィルターろ過、10％塩酸ジメチルアミンを0.1％となるように添加］に接種し、30℃、１２０ｒ.ｐ.ｍ.で１日間、回転振とう培養した。これをシードとして0.2Lの上記培地に２ｍｌ接種し、30℃で一日振とう培養した。この培養液より、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離することで菌体を回収した。
得られた菌体を、50ｍMりん酸バッファー（ｐH7.5）2ｍｌで懸濁し、氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて６０秒間、４回処理した。破砕液を１２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で、１０分間遠心し、上清を予め50ｍMりん酸バッファー（ｐH7.5）で平衡化したDEAEセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（1.0ｃｍ×4ｃｍ）にかけた。8ｍｌの50ｍMりん酸バッファー（ｐH7.5）で洗浄後、4ｍｌの0.２M NaClを含む50ｍMりん酸バッファー（ｐH7.5）で溶出した。更に、4ｍｌの0.4M NaClを含むりん酸バッファーで洗浄した。活性画分を、約０．２Ｍ NaClで溶出した。
Acquisition of dimethylamine dehydrogenase
After purchasing Hyphomicrobium denitrificans NCIMB 11706 from NCIMB and reconstitution with the method specified by NCIMB, the reconstituted product is 0.2 g of medium [1 g of (NH 4 ) 2 SO 4 per liter, 0.2 g of MgSO 4 , 0.5 g of NaH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 1.55 g, pH 7.2, filter filtration after autoclaving, 10% dimethylamine hydrochloride added to 0.1%] and inoculate at 30 ° C., 120 rpm for 1 day. Cultured at last. 2 ml of 0.2 L of the above medium was inoculated as a seed and cultured at 30 ° C. with shaking for one day. From this culture, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes.
The obtained microbial cells were suspended in 2 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and were treated 4 times for 60 seconds using an ultrasonic crusher (Ultrasonicgenerator, manufactured by Nissei) under cooling on ice. The disrupted solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) in a DEAE Sepharose FF (Amersham Biotech) column (1.0 cm × 4 cm). ) After washing with 8 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), elution was performed with 4 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.2 M NaCl. Furthermore, it was washed with a phosphate buffer containing 4 ml of 0.4 M NaCl. The active fraction was eluted with approximately 0.2M NaCl.
ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ活性測定法
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：5 ｍM ＰＭＳ
15.3ｍｇのフェナジンメトスルファートを水に溶解し、10mlに定溶する。
（２）試薬２：1 ｍＭ DCIP
2.9ｍｇのジクロロインドフェノールナトリウムを水に溶解し、10ｍｌに定溶する。
（３）試薬３：基質溶液（30mM ジメチルアミン）
24.5ｍｇのジメチルアミン塩酸塩を水に溶解し、10mlに定溶する。
（４）試薬４：1M りん酸バッファー（pH7.7）
Ｂ．測定法
1mlの水を試験管にとり、200μｌの試薬１、200μｌの試薬２、200μｌの試薬４、200μｌのサンプルを混和し、30℃のインキュベーターで5分間保温する。200μｌの試薬３を添加し、600nmの吸光度のタイムコースを30℃、5分間で測定する。なお、対照液は、200μｌの試薬３の代わりに200μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。ジクロロインドフェノールナトリウムのモル吸光係数（21.69×103 Ｍ-1cm-1）より酵素活性単位を計算することができる。
Method for measuring dimethylamine dehydrogenase activity Preparation of reagents (1) Reagent 1: 5 mM PMS
Dissolve 15.3 mg phenazine methosulfate in water and dissolve to 10 ml.
(2) Reagent 2: 1 mM DCIP
Dissolve 2.9 mg sodium dichloroindophenol in water and dissolve to 10 ml.
(3) Reagent 3: Substrate solution (30 mM dimethylamine)
Dissolve 24.5 mg dimethylamine hydrochloride in water and dissolve to 10 ml.
(4) Reagent 4: 1M phosphate buffer (pH 7.7)
B. Measurement method
Take 1 ml of water into a test tube, mix 200 μl of reagent 1, 200 μl of reagent 2, 200 μl of reagent 4, and 200 μl of sample, and incubate for 5 minutes in a 30 ° C. incubator. 200 μl of reagent 3 is added, and the time course of absorbance at 600 nm is measured at 30 ° C. for 5 minutes. The control solution was the same as described above except that 200 μl of ion-exchanged water was added instead of 200 μl of reagent 3. The unit of enzyme activity can be calculated from the molar extinction coefficient of dichloroindophenol sodium (21.69 × 10 3 M −1 cm −1 ).
ジメチルアミンモノオキシゲナーゼの取得
NBRCよりParacoccus aminovorans ＮＢＲＣ１６７１１を購入し、NBRC指定の方法で復元した後、復元物を、0.002Ｌの培地（1LあたりK2HPO4 １ｇ、KH2PO4 ２．５ｇ、MgSO4・７H2O １．４ｇ、NH4Cｌ ０．２ｇ、KCｌ ０．２５ｇ、イーストエキス ０．２ｇ、ｐH７．２、 オートクレーブ後フィルターろ過、１０％塩酸ジメチルアミンを０．１％となるように添加）に接種し、30℃、１２０ｒ.ｐ.ｍ.で１日間回転振とう培養した。これをシードとして0.2Ｌの上記培地に２ｍｌ接種し、30℃で一日振とう培養した。この培養液より、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離することにより菌体を回収した。
得られた菌体を、５０ｍMりん酸バッファー（ｐH７．５）２ｍｌで懸濁し、氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて６０秒間、４回処理した。破砕液を１２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で、１０分間遠心し、上清を予め５０ｍMりん酸バッファー（ｐH７．５）で平衡化したDEAEセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（１．０ｃｍ×４ｃｍ）にかけた。８ｍｌの０．２Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭりん酸バッファー（ｐH７．５）で洗浄後、４ｍｌの０．３M ＮａＣｌを含む５０ｍMりん酸バッファー（ｐH７．５）で溶出した。更に、４ｍｌの０．４Ｍ ＮａＣｌを含むりん酸バッファーで洗浄した。活性画分を、約０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
Acquisition of dimethylamine monooxygenase
After purchasing Paracoccus aminovorans NBRC16711 from NBRC and restoring it by the method specified by NBRC, 0.002L of medium (1 g of K 2 HPO 4 , 2.5 g of KH 2 PO 4 , MgSO 4 · 7H 2 O 1 per liter) .4 g, NH 4 Cl 0.2 g, KCl 0.25 g, yeast extract 0.2 g, pH 7.2, filter filtration after autoclaving, and 10% dimethylamine hydrochloride added to 0.1%) The cells were cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 1 day. This was used as a seed to inoculate 2 ml of 0.2 L of the above medium and cultured with shaking at 30 ° C for one day. The cells were collected from this culture by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes.
The obtained bacterial cells were suspended in 2 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and were treated 4 times for 60 seconds using an ultrasonic crusher (Ultrasonicgenerator, manufactured by Nissei) under cooling on ice. The disrupted solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) in a DEAE Sepharose FF (Amersham Biotech) column (1.0 cm × 4 cm). After washing with 8 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.2 M NaCl, elution was performed with 4 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.3 M NaCl. Further, it was washed with a phosphate buffer containing 4 ml of 0.4 M NaCl. The active fraction was eluted with approximately 0.3 M NaCl.
ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ活性測定法
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ
４．５ｍｇのニコチンアミドアデニンヌクレオチドりん酸還元型を水に溶解し、１０ｍｌに定溶する。
（２）試薬２：基質溶液（３０ｍＭ ジメチルアミン）
２４．５ｍｇのジメチルアミン塩酸塩を水に溶解し、１０ｍｌに定溶する。
（３）試薬３：２００ｍＭ りん酸バッファー（ｐＨ７．５）
Ｂ．測定法
1mlの試薬３を試験管にとり、200μｌの試薬１、400μｌの水、200μｌのサンプルを混和し、30℃のインキュベーターで5分間保温する。200μｌの試薬２を添加し、340nmの吸光度のタイムコースを30℃、5分間で測定する。なお、対照液は、200μｌの試薬２の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。NADPHのモル吸光係数を元にして活性単位を算出することができる。
Method for measuring dimethylamine monooxygenase activity Preparation of reagents (1) Reagent 1: 0.5 mM NADPH
4.5 mg nicotinamide adenine nucleotide phosphate reduced form is dissolved in water and dissolved in 10 ml.
(2) Reagent 2: Substrate solution (30 mM dimethylamine)
24.5 mg of dimethylamine hydrochloride is dissolved in water and dissolved in 10 ml.
(3) Reagent 3: 200 mM phosphate buffer (pH 7.5)
B. Measurement method
Take 1 ml of reagent 3 in a test tube, mix 200 μl of reagent 1, 400 μl of water, and 200 μl of sample, and incubate for 5 minutes in a 30 ° C. incubator. Add 200 μl of Reagent 2 and measure the time course of absorbance at 340 nm at 30 ° C. for 5 minutes. The control solution was the same as described above except that 100 μl of ion exchange water was added instead of 200 μl of reagent 2. The activity unit can be calculated based on the molar extinction coefficient of NADPH.
DDAHの取得
特願2004-079347号明細書記載の方法でSinorhizobium由来DDAHを得た。
Acquisition of DDAH Sinorhizobium-derived DDAH was obtained by the method described in Japanese Patent Application No. 2004-079347.
DDAH活性測定法
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：発色液Ａ
５００ｍｇのアンチピリン、２７８ｍｇの硫酸鉄を５０％硫酸に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（２）試薬２：発色液Ｂ
８００ｍｇのジアセチルモノオキシムを５％酢酸に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１０ｍＭ ＡＤＭＡ）
非対称ジメチルアルギニン２５ｍｇをイオン交換水に溶解して９．１ｍｌに定容する。対称ジメチルアルギニン又はＬ−アルギニンを基質として用いるときは夫々、２５ｍｇ、１６ｍｇをイオン交換水に溶解して、９．１ｍｌに定容した溶液を用いる。
（４）試薬４：２００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）
（５）試薬５：混合発色液
使用直前に試薬１及び試薬２を等量混合する。
DDAH activity measurement method Preparation of reagents (1) Reagent 1: Color developing solution A
500 mg of antipyrine, 278 mg of iron sulfate are dissolved in 50% sulfuric acid and made up to a volume of 100 ml.
(2) Reagent 2: Color developing solution B
Dissolve 800 mg of diacetyl monooxime in 5% acetic acid and make up to 100 ml.
(3) Reagent 3: Substrate solution (10 mM ADMA)
Dissolve 25 mg of asymmetric dimethylarginine in ion-exchanged water to a constant volume of 9.1 ml. When symmetric dimethylarginine or L-arginine is used as a substrate, 25 mg and 16 mg are dissolved in ion-exchanged water and a solution having a constant volume of 9.1 ml is used.
(4) Reagent 4: 200 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0)
(5) Reagent 5: Mixed color developer Reagents 1 and 2 are mixed in equal amounts immediately before use.
Ｂ．測定法
０．２５ｍｌの試薬４及び０．２ｍｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後０．０５ｍｌの試薬３を加えて充分混合した後、３７℃で２０分間インキュベートする。 ０．２５ｍｌの試薬５を添加し、充分攪拌した後、８５℃で４０分間反応させる。放冷後、分光光度計で４６６ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これを予め作製しておいたシトルリンを試薬３の代わりに、又、酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃、１分間当たりに生成されるシトルリンのマイクロモルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。
B. Measurement method Mix 0.25 ml of reagent 4 and 0.2 ml of enzyme solution, and preheat at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 0.05 ml of Reagent 3 is added and mixed well, and then incubated at 37 ° C. for 20 minutes. Add 0.25 ml of Reagent 5 and stir well, then react at 85 ° C. for 40 minutes. After cooling, the absorbance at 466 nm is measured with a spectrophotometer. The control solution was the same as described above except that 100 μl of ion exchange water was added instead of 100 μl of reagent 3. A graph is prepared in which the citrulline prepared in advance is used in place of the reagent 3 and ion-exchanged water is used in place of the enzyme solution, and the relationship with the amount of the produced dye is examined. Using this graph, the micromolar amount of citrulline produced per minute at 37 ° C. is calculated, and this value is used as the activity unit in the enzyme solution.
（１）アルギノコハク酸合成酵素の取得
Ｇｅｎｅ−Ｂａｎｋより大腸菌K-12由来アルギノコハク酸合成酵素遺伝子情報を入手し、構造遺伝子を増幅できるＤＮＡプライマーをシグマジェネシス社の受託合成により作製した。大腸菌Ｋ−１２ ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を、０．２ＬのＴＹ培地に接種し、３７℃、１２０ｒ.ｐ.ｍ.で１日間回転振とう培養した。この培養液より、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離することで菌体を回収した。得られた菌体は、５ｍｌのＴＥバッファーで懸濁し、等量のＴＥ飽和フェノールを添加した後、緩やかに振とうすることにより溶菌させた。１２０００ｒ.ｐ.ｍ.で２分間遠心後、上清を取りだし、更に、ＴＥ飽和フェノールで除タンパク質処理を行なった。最後に、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収し、１．２０ｍｇのＤＮＡを得た。
(1) Acquisition of arginosuccinic acid synthase Gene information of Escherichia coli K-12-derived arginosuccinic acid synthase gene was obtained from Gene-Bank, and a DNA primer capable of amplifying the structural gene was prepared by contract synthesis of Sigma Genesis. Escherichia coli K-12 JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.) was inoculated into 0.2 L of TY medium and cultured with shaking at 37 ° C. and 120 rpm for 1 day. From this culture, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The obtained cells were suspended in 5 ml of TE buffer, added with an equal amount of TE saturated phenol, and then lysed by gentle shaking. After centrifugation at 12000 rpm for 2 minutes, the supernatant was taken out and further subjected to protein removal treatment with TE saturated phenol. Finally, DNA was recovered by ethanol precipitation to obtain 1.20 mg of DNA.
（２）ＰＣＲ
反応液を以下の組成で調製し、変性を９４℃、３０秒間、アニールを６２℃、３０秒間、伸長反応を７２℃、２分間で３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行なった。
（反応液組成）
１０μＭプライマー（配列番号１） ０．６μｌ
１０μＭプライマー（配列番号２） ０．６μｌ
10×ＰＣＲバッファー ２μｌ
ｄＮＴＰ ２μｌ
１ｍＭ塩化マグネシウム ０．８μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．４Ｕ
Ｈ２Ｏ 最終容量２０μｌになるよう加える。
ＰＣＲ終了後、NdeIに消化した後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１．３ｋｂの位置に目的の断片と思われるバンドが確認されたので、そのバンドをＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出した。
(2) PCR
A reaction solution was prepared with the following composition, and PCR was performed under the conditions of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 62 ° C. for 30 seconds, extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes and 30 cycles.
(Reaction solution composition)
0.6 μl of 10 μM primer (SEQ ID NO: 1)
0.6 μl of 10 μM primer (SEQ ID NO: 2)
2x 10x PCR buffer
dNTP 2 μl
1 mM magnesium chloride 0.8 μl
Taq polymerase 0.4U
Add to a final volume of 20 μl of H 2 O.
After completion of PCR, after digesting with NdeI, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, a band considered to be the target fragment was confirmed at a position of about 1.3 kb. The band was identified as RecoChip (Takara Shuzo). And purified and extracted.
（３）精製ＤＮＡ断片の解析
精製したＤＮＡ断片をＣＥＱ２０００ＸＬ（ベックマンコールター社製）を用いて塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列は、データベースのＤＮＡ配列と同じであった。一方プラスミドｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩで消化後、上記精製抽出したＤＮＡ断片とライゲーション反応を行ない、大腸菌Ｋ−１２ ＪＭ１０９を形質転換した。得られたプラスミドｐＥＴ１６−ＡＳＳは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０１１０として寄託されている。ｐＥＴ１６−ＡＳＳで大腸菌ＢＬ２１（ノバジェン社製）を形質転換し、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ生産株［大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴ１６−ＡＳＳ）］とした。
(3) Analysis of purified DNA fragment When the base sequence of the purified DNA fragment was determined and analyzed using CEQ2000XL (manufactured by Beckman Coulter, Inc.), the determined base sequence was the same as the DNA sequence of the database. On the other hand, plasmid pET16b (manufactured by Novagen) was digested with restriction enzyme NdeI, ligated with the purified and extracted DNA fragment, and transformed into E. coli K-12 JM109. The obtained plasmid pET16-ASS is deposited as FERM BP-10110 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST). Escherichia coli BL21 (manufactured by Novagen) was transformed with pET16-ASS to obtain a dimethylamine dehydrogenase producing strain [E. coli BL21 (pET16-ASS)].
（４）活性の確認
大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴ１６−ＡＳＳ）菌体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ バクトイースト・エクストラクト、０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌにて３７℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、更に、３時間培養した。この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理した。これをエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、後述する酵素活性測定法によりアルギノコハク酸合成酵素活性を測定したところ、ＢＬ２１（ｐＥＴ１６−ＡＳＳ）は、０．０１５Ｕ／ｍｌとアルギノコハク酸合成酵素活性を有していた。
(4) Confirmation of activity Escherichia coli BL21 (pET16-ASS) was treated with TY medium (1% bactotryptone, 0.5% bactoeast extract, 0.5% NaCl, pH 7) containing 50 μg / ml ampicillin. 0.0) After 10 ml of shaking culture at 37 ° C. to Klett 100, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and further cultured for 3 hours. This culture solution was treated 4 times for 20 seconds under cooling on ice using an ultrasonic crusher (Ultrasonicgenerator, manufactured by Nissei). Place this in an Eppendorf tube, centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes using a microcentrifuge, separate the supernatant fraction and the precipitate fraction, and transfer the supernatant to another Eppendorf tube. When arginosuccinic acid synthase activity was measured by the enzyme activity measuring method described later, BL21 (pET16-ASS) had an arginosuccinic acid synthase activity of 0.015 U / ml.
（５）大腸菌K-12由来アルギノコハク酸合成酵素の製造
ＢＬ２１（ｐＥＴ１６−ＡＳＳ）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ バクトイースト・エクストラクト、０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌに接種し、37℃で１日間振とう培養した。これを種培養として、0.5Ｌ三角フラスコに入れた上記培地0.1Ｌに１ｍｌずつ接種し、37℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、更に、４時間培養した。この培養液より、遠心分離（１２０００ｒ.ｐ.ｍ.、１０分間）により菌体を回収した。得られた菌体を−８０℃で凍結保存した。
(5) Production of Escherichia coli K-12-Derived Arginosuccinic Acid Synthase BL21 (pET16-ASS) in TY medium (1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5 containing ampicillin at 50 μg / ml) % NaCl, pH 7.0) was inoculated into 10 ml, and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 day. As a seed culture, 1 ml of the medium was inoculated into 0.1 L of the above medium in a 0.5 L Erlenmeyer flask, cultured at 37 ° C. with shaking to Klett 100, and then IPTG was added to a final concentration of 1 mM. Incubate for hours. From this culture solution, the cells were collected by centrifugation (12000 rpm) for 10 minutes. The obtained microbial cells were stored frozen at -80 ° C.
凍結菌体（２５０ｍｌ分）をバッファーＴＥＣＡ（１０ｍＭトリス ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、1ｍＭシトルリン、１ｍＭアスパラギン酸、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）１５ｍｌに懸濁し、氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理した。破砕液を１２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で、１０分間遠心し、上清を予めバッファーTECAで平衡化したＱセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。１５０ｍｌのバッファーＴＥＣＡで洗浄後、バッファーＴＥＣＡから０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含むＴＥＣＡのリニアグラジェントで溶出させた。活性画分を、約０．０７Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。活性フラクションをまとめてアルギノコハク酸合成酵素溶液とした。 Frozen cells (250 ml) were suspended in 15 ml of buffer TECA (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM citrulline, 1 mM aspartic acid, 0.1 mM PMSF), cooled on ice, and subjected to an ultrasonic crusher (Ultrasonicgenerator, Nissei). For 4 seconds for 20 seconds. The disrupted solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was applied to a Q Sepharose FF (Amersham Biotech) column (2.5 cm × 15 cm) previously equilibrated with buffer TECA. After washing with 150 ml of buffer TECA, the buffer TECA was eluted with a TECA linear gradient containing 0.1 M sodium chloride. The active fraction was eluted with approximately 0.07M sodium chloride. The active fractions were combined into an arginosuccinic acid synthase solution.
アルギノコハク酸合成酵素活性測定法
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：４０ｍＭアスパラギン酸
５３．２ｍｇのL-アスパラギン酸を水に溶解し、１０ｍｌに定溶する。
試薬２：１０ｍＭ ATP
５５．１ｍｇのアデノシン三リン酸二ナトリウムを水に溶解し、１NのＮａＯＨでｐH８に調製し、１０ｍｌに定溶する。
試薬３：６０ｍＭ塩化マグネシウム
１２３．０ｍｇの塩化マグネシウム6水和物を溶解し１０ｍｌに定溶する。
試薬４：200ｍM塩化カリウム
１４９．１ｍｇの塩化カリウムを溶解し１０ｍｌに定溶する。
試薬５：２００Ｕ/ｍｌピロホスファターゼ
１００Ｕのピロホスファターゼを１ｍｌの２Ｍ硫安で溶解する。
試薬６：１Ｍ トリスバッファー（ｐＨ７．６）
試薬７：基質溶液（１０ｍＭシトルリン）
１７．５ｍｇのシトルリンを溶解し１０ｍｌに定溶する。
試薬８：発色液Ａ
５００ｍｇのアンチピリン、２７８ｍｇの硫酸鉄を５０％硫酸に溶解し、１００ｍｌに定容する。
試薬９：発色液Ｂ
８００ｍｇのジアセチルモノオキシムを５％酢酸に溶解し、１００ｍｌに定容する。
試薬１０：混合発色液
使用直前に試薬８及び試薬９を等量混合する。
Ｂ．測定法
以下のように反応測定混合液をマイクロチューブに調製し、37℃で5分間インキュベートする。
試薬１ 1.5μｌ
試薬２ 4.5μｌ
試薬３ 15μｌ
試薬４ 15μｌ
試薬５ 1.0μｌ
試薬６ 1.5μｌ
試薬７ 15μｌ
水 56.5μｌ
４０μｌのサンプルを添加し、３７℃で６０分間反応させる。反応後、２０μｌの反応液を４８０μｌの水と混和し、希釈する。反応希釈液に０．２５ｍｌの試薬１０を添加し、充分攪拌した後、８５℃で４０分間反応させる。放冷後、分光光度計で４６６ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、これを予め希釈しておいたシトルリンを反応希釈液の代わりに用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃、１分間当たりに消費されるシトルリンのマイクロモルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。
Arginosuccinic acid synthase activity measurement method Preparation of Reagent (1) Reagent 1: 40 mM aspartic acid 53.2 mg of L-aspartic acid is dissolved in water and dissolved in 10 ml.
Reagent 2: 10 mM ATP
55.1 mg of adenosine triphosphate disodium is dissolved in water, adjusted to pH 8 with 1N NaOH, and dissolved in 10 ml.
Reagent 3: 60 mM magnesium chloride 123.0 mg of magnesium chloride hexahydrate is dissolved and dissolved in 10 ml.
Reagent 4: 200 mM potassium chloride 149.1 mg of potassium chloride is dissolved and dissolved in 10 ml.
Reagent 5: 200 U / ml pyrophosphatase Dissolve 100 U pyrophosphatase in 1 ml 2M ammonium sulfate.
Reagent 6: 1M Tris buffer (pH 7.6)
Reagent 7: Substrate solution (10 mM citrulline)
Dissolve 17.5 mg citrulline and dissolve to 10 ml.
Reagent 8: Coloring solution A
500 mg of antipyrine, 278 mg of iron sulfate are dissolved in 50% sulfuric acid and made up to a volume of 100 ml.
Reagent 9: Color developing solution B
Dissolve 800 mg of diacetyl monooxime in 5% acetic acid and make up to 100 ml.
Reagent 10: Mixed color developing solution Equal amounts of Reagent 8 and Reagent 9 are mixed immediately before use.
B. Measurement method Prepare the reaction mixture in a microtube as follows and incubate at 37 ° C for 5 minutes.
Reagent 1 1.5 μl
Reagent 2 4.5 μl
Reagent 3 15 μl
Reagent 4 15 μl
Reagent 5 1.0 μl
Reagent 6 1.5 μl
Reagent 7 15 μl
56.5 μl of water
Add 40 μl of sample and react at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, 20 μl of the reaction solution is mixed with 480 μl of water and diluted. 0.25 ml of reagent 10 is added to the reaction dilution, and after stirring sufficiently, the reaction is carried out at 85 ° C. for 40 minutes. After cooling, the absorbance at 466 nm is measured with a spectrophotometer. In addition, the citrulline which diluted this beforehand is used instead of the reaction dilution liquid, and the graph which investigated the relationship with the amount of produced | generated pigment | dyes is prepared. Using this graph, the micromole of citrulline consumed per minute at 37 ° C. is calculated, and this value is used as the activity unit in the enzyme solution.
DDAH+ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ
上記のようにして得られたDDAH及びジメチルアミンモノオキシゲナーゼを組み合わせてADMAを測定した。
試薬１：１０U/ｍｌＤＤＡＨ
試薬２：ＡＤＭＡ希釈液（０〜０．０３ｍＭ）
試薬３：１ｍＭ ＮＡＤＰＨ
試薬４：10U/ml ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ
試薬５：１Mりん酸バッファー（pH８．０）
５０μｌの試薬５、５０μｌの試薬１、１．４ｍｌの試薬２をマイクロチューブ内で混和し、３７℃で5分間保温した。これに、２００μｌの試薬５、１００μｌの試薬３、１００μｌの試薬４を順次添加し、分光光度計により３４０ｎｍでタイムコースをとった。一定時間で減少した吸光度及び添加したADMA濃度の関係は次のようになった（図１）。
DDAH + dimethylamine monooxygenase ADMA was measured by combining DDAH and dimethylamine monooxygenase obtained as described above.
Reagent 1: 10 U / ml DDAH
Reagent 2: ADMA dilution (0 to 0.03 mM)
Reagent 3: 1 mM NADPH
Reagent 4: 10 U / ml Dimethylamine monooxygenase reagent 5: 1 M phosphate buffer (pH 8.0)
50 μl of reagent 5, 50 μl of reagent 1, and 1.4 ml of reagent 2 were mixed in a microtube and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 200 μl of reagent 5, 100 μl of reagent 3, and 100 μl of reagent 4 were sequentially added thereto, and the time course was taken at 340 nm with a spectrophotometer. The relationship between the absorbance decreased over time and the concentration of added ADMA was as follows (FIG. 1).
DDAH+アルギノコハク酸合成酵素+ルシフェラーゼの測定法
上記のようにして得られたDDAH及びアルギノコハク酸合成酵素を組み合わせてADMAを測定した。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：40ｍMアスパラギン酸
53.2ｍｇのL-アスパラギン酸を水に溶解し、10mlに定溶する。
（２）試薬２：0.1ｎＭ ATP
55.1ｍｇのアデノシン三リン酸二ナトリウムを水に溶解し、１NのNaOHでｐH8に調製し、10mlに定溶する。これを1/1000000希釈する。
（３）試薬３：60ｍM塩化マグネシウム
123.0ｍｇの塩化マグネシウム6水和物を溶かし10mlに定溶する。
（４）試薬４：200ｍM塩化カリウム
149.1ｍｇの塩化カリウムを溶かし10mlに定溶する。
（５）試薬５：200U/ｍｌピロホスファターゼ
100Uのピロホスファターゼを1mlの2M硫安で溶解する。
（６）試薬６：1M トリスバッファー（pH7.６）
試薬７：1U/mlアルギノコハク酸合成酵素
試薬８：10U/ml DDAH
試薬９：ADMA希釈液（0〜0.03mM）
試薬１０：アルギノコハク酸反応液
以下の組成で混合した。
試薬１ 1.5μｌ
試薬２ 4.5μｌ
試薬３ 15μｌ
試薬４ 15μｌ
試薬５ 1.0μｌ
試薬６ 1.5μｌ
試薬７ 5μｌ
水 66.6μｌ
試薬１１：0.5 ｍMルシフェリン
試薬１２：0.5 mg/ml ルシフェラーゼ
Ｂ．10μｌの試薬６、10μｌの試薬８、100μｌの試薬９をマイクロチューブ内で混和し、37℃で5分間保温した。これに、60μｌの試薬１０を添加し、37℃で10分間保温した後、10μｌの試薬１１及び10μｌの試薬１２を添加し、直ちにルミノメーター（アロカ社製、ＢＬＲ−２０１）で発光量を測定した。発光量は、ADMA濃度が増えるにしたがって減少した（図２）。
Method for Measuring DDAH + Arginosuccinate Synthase + Luciferase ADMA was measured by combining DDAH and arginosuccinate synthase obtained as described above.
A. Preparation of reagents (1) Reagent 1: 40 mM aspartic acid
Dissolve 53.2 mg of L-aspartic acid in water and dissolve to 10 ml.
(2) Reagent 2: 0.1 nM ATP
Dissolve 55.1 mg of adenosine triphosphate disodium in water, adjust to pH 8 with 1N NaOH, and dissolve in 10 ml. Dilute this to 1/1000000.
(3) Reagent 3: 60 mM magnesium chloride
Dissolve 123.0 mg of magnesium chloride hexahydrate and dissolve to 10 ml.
(4) Reagent 4: 200 mM potassium chloride
Dissolve 149.1 mg of potassium chloride and dissolve to 10 ml.
(5) Reagent 5: 200 U / ml pyrophosphatase
Dissolve 100 U pyrophosphatase with 1 ml 2M ammonium sulfate.
(6) Reagent 6: 1M Tris buffer (pH 7.6)
Reagent 7: 1 U / ml arginosuccinic acid synthase reagent 8: 10 U / ml DDAH
Reagent 9: ADMA diluent (0 to 0.03 mM)
Reagent 10: Arginosuccinic acid reaction solution Mixed with the following composition.
Reagent 1 1.5 μl
Reagent 2 4.5 μl
Reagent 3 15 μl
Reagent 4 15 μl
Reagent 5 1.0 μl
Reagent 6 1.5 μl
Reagent 7 5 μl
Water 66.6μl
Reagent 11: 0.5 mM Luciferin reagent 12: 0.5 mg / ml Luciferase 10 μl of Reagent 6, 10 μl of Reagent 8, and 100 μl of Reagent 9 were mixed in a microtube and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. To this, 60 μl of reagent 10 was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Then, 10 μl of reagent 11 and 10 μl of reagent 12 were added, and the amount of luminescence was immediately measured with a luminometer (ALRICA, BLR-201). did. The amount of luminescence decreased as the ADMA concentration increased (FIG. 2).
Claims (10)
酵素；ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ A method for measuring asymmetric dimethylarginine, wherein two or more of the following enzymes are used.
Enzymes; dimethylarginine dimethylaminohydrolase, dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
酵素；ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ A method for measuring asymmetric dimethylarginine, comprising using dimethylarginine dimethylaminohydrolase and one or more of the following enzymes:
Enzymes; dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
酵素；ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ An asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising two or more of the following enzymes.
Enzymes; dimethylarginine dimethylaminohydrolase, dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
酵素；ジメチルアミンデヒドロゲナーゼ、ジメチルアミンモノオキシゲナーゼ、ジメチルアミンオキシダーゼ、アルギノコハク酸合成酵素及びルシフェラーゼ Asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising dimethylarginine dimethylaminohydrolase and one or more of the following enzymes.
Enzymes; dimethylamine dehydrogenase, dimethylamine monooxygenase, dimethylamine oxidase, arginosuccinate synthase and luciferase
An asymmetric dimethylarginine measurement kit comprising dimethylarginine dimethylaminohydrolase and dimethylamine monooxygenase.
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