JP2005506054A - Novel antibodies that bind to antigenic therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding antigens, and methods of use - Google Patents

Abstract

Disclosed herein are nucleic acid sequences encoding polypeptides. Also disclosed are antibodies, polynucleotides or antibodies that immunospecifically bind to polypeptides and derivatives, variants, sudden variants or fragments of said polypeptides. The invention further discloses therapeutic, diagnostic and investigation methods for the diagnosis, treatment or prevention of disorders associated with any of these novel human nucleic acids, polypeptides or antibodies, or fragments thereof.

Description

【表２】

【００２６】
表１はＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとのホモロジーを示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表１の第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００２７】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００２８】
表１の第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーにホモロジーを示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
【００２９】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表１に掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
【００３０】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがんの検出、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００３１】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００３２】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００３３】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００３４】
一つの特定の実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００３５】
もう一つの特別な実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００３６】
なおもう一つの特別な実施態様では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群から選択したヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００３８】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体型、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、また限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはたんぱく質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の修飾の工程から生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００３９】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６，０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００４０】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施態様において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、または０.１ｋｂ以下、のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、または培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４１】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの前記ヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００４２】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００４３】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基であって、オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ反応で使用されるべきヌクレオチド塩基の十分数を有するものを指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列のｐ一部を含む。本発明の一つの実施態様では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００４４】
もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００４５】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００４６】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００４７】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
【００４８】
誘導体および類似体は、もし誘導体または類似体が、以下に記載のような修飾された核酸またはアミノ酸を含むならば、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当分野において公知のコンピューターホモロジープログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施態様において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が前記タンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００４９】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでのホモロジーを特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００５０】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００５１】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００５２】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施態様において、プローブはそれに付着された標識基をさらに含み、例えば、基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００５３】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００５４】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５５】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００５６】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかとは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００５７】
従って、もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施態様では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６０％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００５８】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００５９】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００６０】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかの配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００６１】
第２の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardt'溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００６２】
第３の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００６３】
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当分野内で周知である。
【００６４】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかとアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施態様では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００６５】
配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００６６】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかの中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを当分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施態様では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかの突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００６７】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００６８】
一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００６９】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【００７０】
一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【００７１】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【００７２】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【００７３】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【００７４】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【００７５】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【００７６】
一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１のいずれか（ｎは１〜４６の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【００７７】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【００７８】
種々の実施態様において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個のヌクレオチド塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【００７９】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ_１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【００８０】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【００８１】
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等に複合し得る。
【００８２】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎのいずれか（ｎは１〜４６の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎのいずれか（ｎは１〜４６の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【００８３】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【００８４】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施態様では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【００８５】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施態様では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【００８６】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施態様では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【００８７】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【００８８】
一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【００８９】
２個またはそれ以上の配列間の相同性を測定すること
２個のアミノ酸配列または２個の核酸のホモロジーの割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【００９０】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【００９１】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９２】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【００９３】
一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【００９４】
もう一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【００９５】
なおもう一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【００９６】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【００９７】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施態様では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【００９８】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【００９９】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施態様では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ_１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１００】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１０１】
ＮＯＶＸ抗体
本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_{ａｂ '} およびＦ_{( ａｂ ')2}フラグメントならびにＦ_ａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１０２】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１０３】
本発明の特定の実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１０４】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数Ｋ_Ｄが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＯＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１０５】
当分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１０６】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１０７】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１０８】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１０９】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１１０】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１１１】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１１２】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１１３】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１１４】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１１５】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１１６】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１１７】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１１８】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１１９】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１２０】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１２１】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１２２】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１２３】
Ｆ_ａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆ_ａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦ_ａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ_{( ａｂ ') ２}フラグメント；(ii)Ｆ_{( ａｂ ') ２}フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦ_ａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦ_ａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆ_ｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１２５】
二重特異性抗体の作成方法は当分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１２６】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１２７】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１２８】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')_２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')_２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１２９】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')_２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１３０】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(Ｖ_Ｌ)に連結したＨ鎖可変領域(Ｖ_Ｈ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１３１】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１３２】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１３３】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１３４】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１３５】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙおよび^１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１３６】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１３７】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１３８】
イムノリポソームリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１３９】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１４０】
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
本発明のタンパク質に対して指向した抗体を、タンパク質の局在および／または定量(例えば、適切な生理的試料中のタンパク質レベルの測定における使用、診断法における使用、タンパク質のイメージングにおける使用等)に関する当分野内において公知の方法で使用し得る。ある一定の実施態様では、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に対する抗原結合ドメインを含有する抗体を、薬理学的に活性な化合物として利用する(下記を参照)。
【０１４１】
本発明のタンパク質に対して特異的な抗体を、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、タンパク質を単離するために使用し得る。そのような抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産した抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗体を使用して、抗原タンパク質の存在量またはパターンを評価するために抗原タンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。タンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈを挙げ得る。
【０１４２】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１４３】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１４４】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１４５】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０１４６】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１４７】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１４８】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１４９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、Ｆ_ａｂまたはＦ_{( ａｂ ) ２})を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１５０】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１５１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１５２】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１５３】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１５４】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１５５】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１５６】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１５７】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１５８】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１５９】
なおもう一つの実施態様では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０１６０】
もう一つの実施態様では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０１６１】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１６２】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０１６３】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１６４】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１６５】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０１６６】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０１６７】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１６８】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１のいずれかの(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０１６９】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１のいずれか(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０１７０】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０１７１】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０１７２】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０１７３】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ_０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０１７４】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０１７５】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０１７６】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０１７７】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１７８】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０１７９】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０１８０】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０１８１】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０１８２】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０１８３】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０１８４】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０１８５】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０１８６】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０１８７】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０１８８】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１８９】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
【０１９０】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０１９１】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０１９２】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸあるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸあるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸあるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０１９３】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸあるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０１９４】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０１９５】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０１９６】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０１９７】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)_ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０１９８】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０１９９】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２００】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２０１】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する。
【０２０２】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２０３】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２０４】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２０５】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２０６】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２０７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２０８】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１,０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、そしてさらに好ましくは２,０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２０９】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２１０】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２１１】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２１２】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２１３】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２１４】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２１５】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１,０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２,０００である。
【０２１６】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２１７】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２１８】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２１９】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２２０】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')_２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２２１】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２２２】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２２３】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２２４】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２２５】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２２６】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再編成、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２２７】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２２８】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２２９】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２３０】
他の実施態様では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２３１】
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２３２】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得た潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ_１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２３３】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２３４】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得た変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２３５】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２３６】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２３７】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２３８】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２３９】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２４０】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害(障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、慢性疾患および種々のがんに関連した代謝性シンドロームＸならびに消耗性疾患を挙げ得る)を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２４１】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２４２】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認した。
【０２４３】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２４４】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２４５】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２４６】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２４７】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。疾患としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症(ＡＳＤ)、房室(Ａ−Ｖ)管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症(ＶＳＤ)、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺がん、新生物、腺がん、リンパ腫、子宮がん、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、移植片対宿主病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、アルブライト遺伝性骨ジストロフィーの処置ならびに類似の他の疾患、障害および異常を挙げ得る。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２４８】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２４９】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２５０】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２５１】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２５２】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２５３】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有する状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２５４】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施態様において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２５５】
種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２５６】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は：代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を限定することなく、含み、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０２５７】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、代謝性疾患、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪血症：に罹患した患者の処置に効果を有するであろう。
【０２５８】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
【０２５９】
実施例
実施例１
ＮＯＶ１クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表１Ａに示す。
【表３】

【０２６０】
ＮＯＶ１ａタンパク質のさらなる分析は、表１ＢＣに示す以下の特性をもたらした。
【表４】

【０２６１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１ａタンパク質のサーチは、表１Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表５】

【０２６２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１ａタンパク質は、表１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表６】

【０２６３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１ａタンパク質が表１Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表７】

【０２６４】
実施例２
ＮＯＶ２クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２Ａに示す。
【表８】

【０２６５】
【表９】

【０２６６】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１０】

【０２６７】
ＮＯＶ２ａタンパク質のさらなる分析は、表２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１】

【０２６８】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２ａタンパク質のサーチは、表２Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１２】

【０２６９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２ａタンパク質は、表２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１３】

【０２７０】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２ａタンパク質が表２Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１４】

【０２７１】
実施例３
ＮＯＶ３クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表３Ａに示す。
【表１５】

【０２７２】
ＮＯＶ３ａタンパク質のさらなる分析は、表３Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１６】

【０２７３】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ３ａタンパク質のサーチは、表３Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１７】

【０２７４】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ３ａタンパク質は、表３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１８】

【０２７５】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ３ａタンパク質が表３Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１９】

【０２７６】
実施例４
ＮＯＶ４クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表４Ａに示す。
【表２０】

【０２７７】
【表２１】

【０２７８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表４Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表２２】

【０２７９】
ＮＯＶ４ａタンパク質のさらなる分析は、表４Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表２３】

【０２８０】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２ａタンパク質のサーチは、表４Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表２４】

【０２８１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ４ａタンパク質は、表４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表２５】

【０２８２】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ４ａタンパク質が表４Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表２６】

【０２８３】
実施例５
ＮＯＶ５クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表５Ａに示す。
【表２７】

【０２８４】
ＮＯＶ５ａタンパク質のさらなる分析は、表５Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表２８】

【０２８５】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ５ａタンパク質のサーチは、表５Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表２９】

【０２８６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ５ａタンパク質は、表５ＤＳのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表３０】

【０２８７】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ５ａタンパク質が表５Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表３１】

【０２８８】
実施例６
ＮＯＶ６クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表６Ａに示す。
【表３２】

【０２８９】
【表３３】

【０２９０】
【表３４】

【０２９１】
【表３５】

【０２９２】
【表３６】

【０２９３】
【表３７】

【０２９４】
前記タンパク質配列の配列比較は、表６Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表３８】

【０２９５】
ＮＯＶ６ａタンパク質のさらなる分析は、表６Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表３９】

【０２９６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ６ａタンパク質のサーチは、表６Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表４０】

【０２９７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ６ａタンパク質は、表６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表４１】

【０２９８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ６ａタンパク質が表６Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表４２】

【０２９９】
実施例７
ＮＯＶ７クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表７Ａに示す。
【表４３】

【０３００】
【表４４】

【０３０１】
ＮＯＶ７ａタンパク質のさらなる分析は、表７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表４５】

【０３０２】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ７ａタンパク質のサーチは、表７Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表４６】

【０３０３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ７ａタンパク質は、表７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表４７】

【０３０４】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ７ａタンパク質が表７Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表４８】

【０３０５】
実施例８
ＮＯＶ８クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表８Ａに示す。
【表４９】

【０３０６】
【表５０】

【０３０７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表８Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表５１】

【０３０８】
ＮＯＶ８ａタンパク質のさらなる分析は、表８Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表５２】

【０３０９】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ８ａタンパク質のサーチは、表８Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表５３】

【０３１０】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ８ａタンパク質は、表８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表５４】

【０３１１】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ８ａタンパク質が表８Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表５５】

【０３１２】
実施例９
ＮＯＶ９クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表９Ａに示す。
【表５６】

【０３１３】
ＮＯＶ９ａタンパク質のさらなる分析は、表９Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表５７】

【０３１４】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ９ａタンパク質のサーチは、表９Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表５８】

【０３１５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ９ａタンパク質は、表９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表５９】

【０３１６】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ９ａタンパク質が表９Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表６０】

【０３１７】
実施例１０
ＮＯＶ１０クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１０Ａに示す。
【表６１】

【０３１８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１０Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表６２】

【０３１９】
ＮＯＶ１０ａタンパク質のさらなる分析は、表１０Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表６３】

【０３２０】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１０ａタンパク質のサーチは、表１０Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表６４】

【０３２１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１０ａタンパク質は、表１０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表６５】

【０３２２】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１０ａタンパク質が表１０Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表６６】

【０３２３】
実施例１１
ＮＯＶ１１クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１１Ａに示す。
【表６７】

【０３２４】
ＮＯＶ１１ａタンパク質のさらなる分析は、表１１Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表６８】

【０３２５】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１１ａタンパク質のサーチは、表１１Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表６９】

【０３２６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１１ａタンパク質は、表１１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表７０】

【０３２７】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１１ａタンパク質が表１１Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表７１】

【０３２８】
実施例１２
ＮＯＶ１２クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１２Ａに示す。
【表７２】

【０３２９】
【表７３】

【０３３０】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表７４】

【０３３１】
ＮＯＶ１２ａタンパク質のさらなる分析は、表１２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表７５】

【０３３２】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１２ａタンパク質のサーチは、表１２Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表７６】

【０３３３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１２ａタンパク質は、表１２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表７７】

【０３３４】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１２ａタンパク質が表１２Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表７８】

【０３３５】
実施例１３
ＮＯＶ１３クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１３Ａに示す。
【表７９】

【０３３６】
【表８０】

【０３３７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１３Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表８１】

【０３３８】
ＮＯＶ１３ａタンパク質のさらなる分析は、表１３Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表８２】

【０３３９】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１３ａタンパク質のサーチは、表１３Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表８３】

【０３４０】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１３ａタンパク質は、表１３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表８４】

【０３４１】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１３ａタンパク質が表１３Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表８５】

【０３４２】
実施例１４
ＮＯＶ１４クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１４Ａに示す。
【表８６】

【０３４３】
【表８７】

【０３４４】
ＮＯＶ１４ａタンパク質のさらなる分析は、表１４Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表８８】

【０３４５】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１４ａタンパク質のサーチは、表１４Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表８９】

【０３４６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１４ａタンパク質は、表１４ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表９０】

【０３４７】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１４ａタンパク質が表１４Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表９１】

【０３４８】
実施例１５
ＮＯＶ１５クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１５Ａに示す。
【表９２】

【０３４９】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１５Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表９３】

【０３５０】
ＮＯＶ１５ａタンパク質のさらなる分析は、表１５Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表９４】

【０３５１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１５ａタンパク質のサーチは、表１５Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表９５】

【０３５２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１５ａタンパク質は、表１５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表９６】

【０３５３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１５ａタンパク質が表１５Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表９７】

【０３５４】
実施例１６
ＮＯＶ１６クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１６Ａに示す。
【表９８】

【０３５５】
ＮＯＶ１６ａタンパク質のさらなる分析は、表１６ＢＣに示す以下の特性をもたらした。
【表９９】

【０３５６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１６ａタンパク質のサーチは、表１６Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１００】

【０３５７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１６ａタンパク質は、表１６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１０１】

【０３５８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１６ａタンパク質が表１６Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１０２】

【０３５９】
実施例１７
ＮＯＶ１７クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１７Ａに示す。
【表１０３】

【０３６０】
ＮＯＶ１７ａタンパク質のさらなる分析は、表１７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１０４】

【０３６１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１７ａタンパク質のサーチは、表１７Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１０５】

【０３６２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１７ａタンパク質は、表１７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１０６】

【０３６３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１７ａタンパク質が表１７Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１０７】

【０３６４】
実施例１８
ＮＯＶ１８クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１８Ａに示す。
【表１０８】

【０３６５】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１８Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１０９】

【０３６６】
ＮＯＶ１８ａタンパク質のさらなる分析は、表１８Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１０】

【０３６７】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１８ａタンパク質のサーチは、表１８Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１１１】

【０３６８】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１８ａタンパク質は、表１８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１１２】

【０３６９】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１８ａタンパク質が表８１Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１１３】

【０３７０】
実施例１９
ＮＯＶ１９クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１９Ａに示す。
【表１１４】

【０３７１】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１９Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１１５】

【０３７２】
ＮＯＶ１９ａタンパク質のさらなる分析は、表１９Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１６】

【０３７３】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１９ａタンパク質のサーチは、表１９Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１１７】

【０３７４】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１９ａタンパク質は、表１９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１１８】

【０３７５】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１９ａタンパク質が表１９Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１１９】

【０３７６】
実施例２０
ＮＯＶ２０クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２０Ａに示す。
【表１２０】

【０３７７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２０Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１２１】

【０３７８】
ＮＯＶ２０ａタンパク質のさらなる分析は、表２０Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１２２】

【０３７９】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２０ａタンパク質のサーチは、表２０Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１２３】

【０３８０】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２０ａタンパク質は、表２０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１２４】

【０３８１】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２０ａタンパク質が表２０Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１２５】

【０３８２】
実施例２１
ＮＯＶ２１クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１９Ａに示す。
【表１２６】

【０３８３】
ＮＯＶ２１ａタンパク質のさらなる分析は、表２１Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１２７】

【０３８４】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２１ａタンパク質のサーチは、表２１Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１２８】

【０３８５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２１ａタンパク質は、表２１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１２９】

【０３８６】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２１ａタンパク質が表２１Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１３０】

【０３８７】
実施例２２
ＮＯＶ２２クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２２Ａに示す。
【表１３１】

【０３８８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１３２】

【０３８９】
ＮＯＶ２２ａタンパク質のさらなる分析は、表２２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１３３】

【０３９０】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２２ａタンパク質のサーチは、表２２Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１３４】

【０３９１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２２ａタンパク質は、表２２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１３５】

【０３９２】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２２ａタンパク質が表２２Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１３６】

【０３９３】
実施例２３
ＮＯＶ２３クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２３Ａに示す。
【表１３７】

【０３９４】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２３Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１３８】

【０３９５】
ＮＯＶ２３ａタンパク質のさらなる分析は、表２３Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１３９】

【０３９６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２３ａタンパク質のサーチは、表２３Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１４０】

【０３９７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２３ａタンパク質は、表２３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１４１】

【０３９８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２３ａタンパク質が表２３Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１４２】

【０３９９】
実施例２４
ＮＯＶ２４クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２４Ａに示す。
【表１４３】

【０４００】
ＮＯＶ２４ａタンパク質のさらなる分析は、表２４Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１４４】

【０４０１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２４ａタンパク質のサーチは、表２４Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１４５】

【０４０２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２４ａタンパク質は、表２４ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１４６】

【０４０３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２４ａタンパク質が表２４Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１４７】

【０４０４】
実施例２５
ＮＯＶ２５クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２５Ａに示す。
【表１４８】

【０４０５】
ＮＯＶ２５ａタンパク質のさらなる分析は、表２５Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１４９】

【０４０６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２５ａタンパク質のサーチは、表２５Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１５０】

【０４０７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２５ａタンパク質は、表２５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１５１】

【０４０８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２５ａタンパク質が表２５Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１５２】

【０４０９】
実施例２６
ＮＯＶ２６クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２６Ａに示す。
【表１５３】

【０４１０】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２６Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１５４】

【０４１１】
ＮＯＶ２６ａタンパク質のさらなる分析は、表２６Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１５５】

【０４１２】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２６ａタンパク質のサーチは、表２６Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１５６】

【０４１３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２６ａタンパク質は、表２６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１５７】

【０４１４】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２６ａタンパク質が表２６Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１５８】

【０４１５】
実施例２７
ＮＯＶ２７クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２７Ａに示す。
【表１５９】

【０４１６】
ＮＯＶ２７ａタンパク質のさらなる分析は、表２７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１６０】

【０４１７】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２７ａタンパク質のサーチは、表２７Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１６１】

【０４１８】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２７ａタンパク質は、表２７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１６２】

【０４１９】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２７ａタンパク質が表２７Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１６３】

【０４２０】
実施例Ｂ：配列決定方法論およびＮＯＶＸクローンの同定
１．GeneCalling [商標登録]技法：これは、CuraGenで開発した２個またはそれ以上の試料間の差次的遺伝子発現プロフィール化を実施する専売方法であり、Shimkets, et al.，"Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query" Nature Biotechnology 17:198-803 (1999)に記載されている。ｃＤＮＡを、多重組織型、正常および病的状態、生理学的状態ならびに異なるドナーからの発達状態を表す種々のヒト試料から誘導した。試料を、組織全体、一次細胞または組織培養一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学的薬剤、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイド、で処置されていてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、１２０対もの多数の制限酵素で消化し、それぞれ対の制限酵素に特異的なリンカー−アダプターの対を適切な末端に連結した。制限消化は、独特のｃＤＮＡ遺伝子フラグメントの混合物を生成する。限定ＰＣＲ増幅を、一つのプライマーがビオチン化されかつ他方が蛍光的に標識されているリンカーアダプター配列に相同的なプライマーにより実施する。二重標識した物質を単離し、蛍光的に標識した一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動により分割した。コンピューターアルゴリズムは、それぞれの制限消化に対する実験および対照群からの電気泳動を比較する。このおよびさらに別な配列由来の情報を用いて、種々のゲノムデータベースを用いてそれぞれの差次的発現遺伝子フラグメントの同一性を予測する。遺伝子フラグメントの同一性を、追加的、遺伝子−特異的競合的ＰＣＲによりまたは遺伝子フラグメントの単離およびシークエンシングにより確認した。
【０４２１】
２．SeqCalling[登録商標]技術：ｃＤＮＡを、多重組織型、正常および病的状態、生理学的状態ならびに異なるドナーからの発達状態を表す種々のヒト試料から誘導した。試料を、組織全体、一次細胞または組織培養一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学的薬剤、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイド、で処置されていてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、CuraGenの専売SeqCalling技術を用いてシークエンスした。配列トレースを手動で評価し、妥当であれば訂正のために編集した。すべての試料からのｃＤＮＡ配列を、公的なヒト配列を時には含むバイオインフォマチックプログラムを用いて、一緒に集め、それぞれのアセンブリに対する共通配列を生産した。それぞれのアセンブリは、Curagen Corporationのデータベースに含まれる。他の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたり少なくとも９５％であったときには、配列はアセンブリの成分として含めた。それぞれのアセンブリは、遺伝子またはその一部分を表し、そしてスプライス形態の単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)、挿入、欠失および他の配列変異のような変異体についての情報を含む。
【０４２２】
３．PathCalling[登録商標]技術：
ＮＯＶＸ核酸配列を、２ハイブリッドアプローチによるｃＤＮＡライブラリーの実験室スクリーニングによって誘導する。ＤＮＡ配列の全長またはその配列の部分のいずれか一方または両方をカバーするｃＤＮＡフラグメントをシークエンスした。インシリコ予測は、Curagen Corporationの専売配列データベースまたは公的ヒト配列データベース中で利用できる配列に基づいており、全長ＤＮＡ配列またはその或る部分のどちらかを提供した。
【０４２３】
実験室スクリーニングを、以下に要約した方法を用いて実施した：
ｃＤＮＡライブラリーを、多重組織型、正常および病的状態、生理的状態ならびに異なるドナーからの発達状態を表す種々のヒト試料から誘導した。試料を、組織全体、一次細胞または組織培養一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物的薬剤または化学的薬剤、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイド、で処置されていてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、適当な２ハイブリッドベクター(Ｇａｌ４−活性化ドメイン(Ｇａｌ４−ＡＤ)融合体)の中へ指向的にクローン化した。そのようなｃＤＮＡライブラリーならびにClontech(Palo Alto, CA)から商業的に入手可能なｃＤＮＡライブラリーを、次いで、E. coliからCuragen Corporationの専売酵母株(米国特許６,０５７,１０１および６,０８３,６９３(全体的な出典明示により本明細書の一部とする)に開示した)へ移入した。
【０４２４】
Curagen Corporationの専売ヒト配列ライブラリーのＧａｌ４−結合ドメイン(Ｇａｌ４−ＢＤ)融合体を用いて、多重のＧａｌ４−ＡＤ融合体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、それぞれにおいてＧａｌ４−ＡＤ融合体が個別のｃＤＮＡを含む酵母ハイブリッド二倍体の選択をもたらした。それぞれの試料を、ｃＤＮＡ挿入境界域において非特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて増幅した。そのようなＰＣＲ生成物をシークエンスした；配列トレースを手動で評価し、妥当であれば訂正のため編集した。公的ヒト配列を時には含むバイオインフォマチックプログラムを用いて、すべての試料からのｃＤＮＡ配列を一緒に集め、それぞれのアセンブリに対する共通配列を生産した。それぞれのアセンブリを、Curagen Corporationのデータベースに含める。他の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたり少なくとも９５％であったときには、配列をアセンブリの成分として含んだ。それぞれのアセンブリは、遺伝子またはその一部分を表し、そしてスプライス形態の単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)、挿入、欠失および他の配列変異のような変異体についての情報を含む。
【０４２５】
物理的クローン：全オープンリーディングフレームをカバーするスクリーニング手順により誘導したｃＤＮＡフラグメントを、組換えＤＮＡとして用いたｐＡＣＴ２プラスミド(Clontech)の中へクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その組換えプラスミドを宿主に挿入して、Curagen Corporationの専売酵母株Ｎ１０６´およびＹＵＬＨ(米国特許６,０５７,１０１および６,０８３,６９３)両方の掛け合わせによるスクリーニング手順の間に生成した酵母二倍体により選択した。
【０４２６】
４．ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ＲＡＣＥ)のようなポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を用いて、本発明のｃＤＮＡの予測した配列を単離または完結した。通常は、多重クローンを一つまたはそれ以上のヒト試料からシークエンスし、フラグメントのための配列を誘導した。異なるドナーからの種々のヒト組織試料を、ＲＡＣＥ反応に用いた。これらの手順から誘導した配列を、先章で記載したSeqCalling Assembly方法に含めた。
【０４２７】
５．エクソン連結：本発明で同定したＮＯＶＸ標的配列をエクソン連結方法に供し、配列を確認した。ＰＣＲプライマーは、順方向プライマーについては利用可能な最上流の配列から、そして逆方向プライマーについては利用可能な最下流の配列から出発することでデザインした。それぞれの場合において、特有なまたは高選択的などちらかである適当な配列に出会うまで、または逆方向プライマーの場合には停止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコーディング配列に向かって内側にウォーキングして配列を検討した。そのようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、標的配列のＤＮＡまたはタンパク質配列の部分(一つまたはそれ以上のエクソン)に対するインシリコの予測に基づいて、または他の種からの緊密に関連したヒト配列に対する予測エクソンの翻訳した相同性によりデザインした。次いで、これらのプライマーを以下のヒトｃＤＮＡプールに基づいたＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全縁、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺臓、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高度重複性に至るまでシークエンスした。エクソン結合から誘導したＰＣＲ産物を、InvitrogenのｐＣＲ２.１ベクターの中にクローン化した。得た細菌性クローンは、ｐＣＲ２.１ベクター中へクローン化された完全オープンリーディングフレームをカバーする挿入断片を有する。すべてのクローンから得た配列を、それ自体と、CuraGen Corporationデータベース中の他のフラグメントと、および公的ＥＳＴと共に集合させた。フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリの他の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であったとき、集合体の成分として含んだ。加えて、配列トレースを手動で評価し、妥当であれば訂正のため編集した。これらの手順が本明細書において報告する配列を提供する。
【０４２８】
６．物理的クローン：エクソンを相同性により予測し、そして標準的遺伝法則を用いてイントロン／エクソン境界域を決定した。エクソンをさらに選択し、そして多重ＢＬＡＳＴ(例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよびＢｌａｓｔＮ)をおよび、或る場合には、GeneScanおよびGrailを用いる類似性測定手段により精錬した。利用できるときには、公的および専売データベース両方からの発現配列をまた追加して、遺伝子配列をさらに定義し、完成した。次いで手動で、ＤＮＡ配列を、明白な矛盾について訂正し、それによって全長タンパク質をコード化する配列を得た。
全オープンリーディングフレームをカバーするエクソン結合により誘導したＰＣＲ産物を、InvitrogenのｐＣＲ２.１ベクターにクローン化して、発現およびスクリーニングの目的に用いるクローンを提供した。
【０４２９】
実施例Ｃ：種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現分析
種々の正常および病変由来の細胞、細胞株、および組織からのＲＮＡ試料を含むマイクロタイタープレートを用い、リアルタイム定量的ＰＣＲ(ＲＴＱ ＰＣＲ)を用いて、種々のクローンの定量的な発現を評価した。ＲＴＱ ＰＣＲは、Applied Biosystems ABI PRISM [登録商標] 7700 またはABI PRISM [登録商標] 7900 HT Sequence Detection System上で実施された。種々の収集試料をプレート上で集め、パネル１(正常組織およびがん細胞株を含有する)、パネル２(正常およびがん起源の組織由来の試料を含有する)、パネル３(がん細胞株を含有する)、パネル４(正常組織からの細胞および細胞株ならびに炎症異常に関連する細胞を含有する)、パネル５Ｄ／５Ｉ(代謝性疾患を強調するヒト組織および細胞株を含有する)、ＡＩ_包括的_パネル(正常組織および自己免疫疾患からの試料を含有する)、パネルＣＮＳＤ.０１(正常および疾患脳からの中枢神経系試料を含有する)、ならびにＣＮＳ_神経変性_パネル(正常およびアルツハイマー病の脳からの試料を含有する)と示す。
【０４３０】
２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡ染色強度比を指針(２：１〜２.５：１ ２８ｓ：１８ｓ)として用いるアガロースゲル電気泳動図および分解生成物を示唆するであろう低分子量ＲＮＡの不在の目視査定によって、すべての試料からのＲＮＡの完全性を品質制御する。単一エクソンの区間に渡って増幅するようにデザインされたプローブおよびプライマーのセットを用い、逆転写酵素の不在下で行われるＲＴＱ ＰＣＲ反応によりゲノムＤＮＡ汚染に対して、試料を制御する。
【０４３１】
最初に、ＲＮＡ試料を、構成的に発現される遺伝子(例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ)のような参照核酸へ規格化した。規格化されたＲＮＡ(５μｌ)をｃＤＮＡに変換して、製造元の指示にしたがって、One Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems; Catalog No. 4309169)および遺伝子−特異的プライマーを用いるＲＴＱ ＰＣＲにより分析した。
【０４３２】
他の場合では、規格化されていないＲＮＡ試料を、製造元の指示にしたがって、Superscript II (Invitrogen Corporation; Catalog No. 18064-147)および無秩序な６量体を用いて、単鎖ｃＤＮＡ(ｓｓｃＤＮＡ)に変換した。１０μｇまでの全ＲＮＡを含む反応を２０μｌの容積で実施し、４２℃で６０分間インキュベートした。この反応は、１００μｌの最終容積で５０μｇの全ＲＮＡにまでスケールを拡大し得る。次いで、ｓｓｃＤＮＡ試料を、製造元の指示にしたがって、1X TaqMan [登録商標] Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020)を用いて、先に記載したように参照核酸へ規格化する。
【０４３３】
プローブおよびプライマーを、Applied Biosystems Primer Express Software package (Apple Computer's Macintosh Power PC用１版)または標的配列を入力として用いる類似のアルゴリズムにしたがって、それぞれのアッセイに対してデザインした。反応条件に対してデフォルト設定を使用し、以下のパラメーターを設定し、プライマーを選択した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマー融解温度(Ｔｍ)範囲＝５８°〜６０℃、プライマー最適Ｔｍ＝５９℃、最大プライマー差＝２℃、プローブは５´Ｇを持たない、プローブＴｍはプライマーＴｍよりも１０℃大きくなければならない、アンプリコン(増幅産物)のサイズは７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されたプローブおよびプライマー(下を参照)は、Synthegen (Houston, TX, USA)により合成された。プローブをＨＰＬＣで二回精製して未カップリングの染料を除去し、質量分析法により評価して、レポーターおよび消光剤の染料がプローブのそれぞれ５'および３'末端にカップリングしていることを立証した。それらの最終濃度は、順方向および逆方向プライマーでそれぞれ９００ｎＭ、ならびにプローブで２００ｎＭであった。
【０４３４】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡ試料で作業するとき、それぞれの組織およびそれぞれの細胞株からの規格化されたＲＮＡを、９６穴または３８４穴のＰＣＲプレート(Applied Biosystems)のいずれか一方のそれぞれの穴の中にスポットした。ＰＣＲカクテルには、単一の遺伝子特異的プローブとプライマーのセットまたは二つの多重プローブとプライマーのセット(標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブによって多重化されているもう一つの遺伝子特異的なセット)のどちらかが含まれる。製造元の指示にしたがい、TaqMan [登録商標] One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems; Catalog No. 4313803)を用いて、ＰＣＲ反応をセットアップした。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、引き続いて以下のように増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクル。結果をｌｏｇ尺度を用いてＣＴ値(与えられた試料が蛍光の閾値をクロスするサイクル)として記録し、与えられた試料と２のデルタＣＴ乗として表わされる最低ＣＴ値を有する試料との間のＲＮＡ濃度の差とした。次いで、百分率相対発現は、このＲＮＡ差の逆数を取り１００倍することによって得られる。
【０４３５】
ｓｓｃＤＮＡ試料で作業するときは、先にＲＮＡ試料について記載したように、規格化したｓｓｃＤＮＡを用いた。製造元の指示にしたがって、1X TaqMan [登録商標] Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020)を用いて、一つまたは二つのセットのプローブとプライマーを含むＰＣＲ反応をセットアップした。ＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクル。結果を分析し、先に説明したように処理した。
【０４３６】
パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄ
パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄのためのプレートは、２個の対照穴(ゲノムＤＮＡ対照および化学対照)ならびに種々の試料からのｃＤＮＡを含有する９４穴を含む。これらのパネルにおける試料は、二つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料、に区分される。細胞株は、以下のタイプのがんに由来する：肺がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、前立腺がん、ＣＮＳがん、扁平上皮細胞がん腫、卵巣がん、肝臓がん、腎臓がん、胃がんおよび膵臓がん。これらのパネルで用いられる細胞株は、培養細胞株のための保管所の、the American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)を通じて広く入手でき、そしてＡＴＣＣにより推奨された条件を用いて培養された。これらのパネルで見られる正常組織は、単一の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料から成っている。これらの試料は以下の器官に由来する：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺臓、胎児肺臓、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０４３７】
パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄについての結果では、以下の略語を用いる。
ｃａ．：がん腫
^＊：転移から確立される
ｍｅｔ：転移
ｓ ｃｅｌｌ ｖａｒ：小細胞変異体
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ：小さくない
ｓｑｕａｍ：扁平
pl.eff＝pl effusion：胸膜浸出液
ｇｌｉｏ：神経膠腫
ａｓｔｒｏ：星細胞腫
ｎｅｕｒｏ：神経芽細胞腫
【０４３８】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１.４
パネル１.４のためのプレートは、２個の対照穴(ゲノムＤＮＡ対照および化学対照)ならびに種々の試料からのｃＤＮＡを含有する９４穴を含む。パネル１.４における試料は、二つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料、に分けられる。細胞株は、以下の型のがんに由来する：肺がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、前立腺がん、ＣＮＳがん、扁平上皮細胞がん腫、卵巣がん、肝臓がん、腎臓がん、胃がんおよび膵臓がん。パネル１.４で用いられる細胞株は、培養細胞株のための保管所の、the American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)を通じて広く入手でき、ＡＴＣＣにより推奨された条件を用いて培養した。パネル１.４で見られる正常組織は、２〜５人の種々の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料プールから成っている。これらの試料は以下の器官に由来する：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺臓、胎児肺臓、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略語は、パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄについて記載された通りである。
【０４３９】
パネル２Ｄおよび２.２
パネル２Ｄおよび２.２のためのプレートは、一般的に２個の対照穴およびthe National Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network (ＣＨＴＮ)またはthe National Disease Research Initiative (ＮＤＲＩ)と密接に協力して働く外科医によって調達されたヒト組織から単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡから成る９４個の試験試料を含む。組織はヒト悪性腫瘍に由来し、指示された場合には、多くの悪性腫瘍組織は、腫瘍の直ぐ横に隣接した非がん性組織から得られる「対応辺縁」を有する。これらを正常隣接組織と呼称し、以下の結果では「ＮＡＴ」と表す。腫瘍組織および「対応辺縁」は、二人の独立した病理学者(外科病理学者さらにＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者)により評価される。この分析は、腫瘍分化のグレードの組織病理学的評価を提供する。さらに、大部分の試料は、患者の臨床段階に関する情報を提供するところの外科病理学的報告原本を含む。これらのマッチド周縁は、手術領域を取り囲む組織(即ち、直接隣接部)から取られる(表ＲＲでは、正常隣接組織の場合「ＮＡＴ」と表記される)。加えて、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ試料は、高齢者または突然死犠牲者(事故、など)で実施された剖検由来の種々のヒト組織から得られた。これらの組織は無疾患であることが確認されており、Clontech (Palo Alto, CA)、Research GeneticsおよびInvitrogenのような種々の商業的供給者から購入された。
【０４４０】
パネル３Ｄ
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡ試料および２個の対照試料から成る。特に、これらの試料のうち９２個は培養ヒトがん細胞株由来であり、２個のヒト一次小脳組織の試料、および２個の対照である。ヒト細胞株は、一般的にＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)、ＮＣＩまたはドイツがん細胞バンクから得られ、以下の組織群に入る：舌の扁平上皮細胞がん腫、乳がん、前立腺がん、黒色腫、類表皮がん腫、肉腫、膀胱がん腫、膵臓がん、腎臓がん、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚部、胃、結腸、肺およびＣＮＳがん細胞株。加えて、２個の独立した小脳の試料がある。これらの細胞をすべて標準的な推奨された条件下で培養し、ＲＮＡを標準的な手法を用いて抽出する。パネル３Ｄおよび１.３Ｄにおける細胞株は、科学的な文献で用いられる最も普通の細胞株である。
【０４４１】
パネル４Ｄ、４Ｒ、および４.１Ｄ
パネル４は、炎症疾患に関連する種々のヒト細胞株または組織から単離されたＲＮＡ(パネル４Ｒ)またはｃＤＮＡ(パネル４Ｄ／４.１Ｄ)から成る、９６穴プレート(２個の対照穴、９４個の試験試料)上の試料を含む。結腸および肺(Stratagene, La Jolla, CA)ならびに胸腺および腎臓(Clonetech)のような対照正常組織からの全体のＲＮＡを使用した。肝硬変患者の肝臓組織およびエリトマトーデス患者の腎臓からの全体のＲＮＡは、BioChain (Biochain Institute, Inc., Hayward, CA)から入手された。クローン病および潰瘍性大腸炎を持つと診断された患者からのＲＮＡ標本用の腸組織は、the National Disease Research Interchange (ＮＤＲＩ) (Philadelphia, PA)から入手された。
【０４４２】
星状膠細胞、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞は、すべてClonetics (Walkersville, MD)から購入され、これらの細胞タイプのためにCloneticsから供給された培地中で発育させた。これらの一次細胞タイプを、指示されたとおり、６時間および／または１２〜１４時間、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せで活性化した。以下のサイトカインが用いられた：凡そ１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ、凡そ２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮガンマ、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。時には内皮細胞を、０.１％血清を有するCloneticsからの基本培地中での培養により種々の時間飢餓状態においた。
【０４４３】
単核細胞を、CuraGen Corporationの従業員の血液からFicollを用いて調製した。これらの細胞から、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco/Life Technologies, Rockville, MD)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびインターロイキン２中で４〜６日間での培養によってＬＡＫ細胞を調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮガンマならびに５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで６時間活性化した。或る場合には、単核細胞を４〜５日間、凡そ５μｇ／ｍｌのＰＨＡ(フィトヘマグルチニン)またはＰＷＭ(アメリカヤマゴボウマイトジェン)と共に、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中で培養した。試料をＲＮＡ調製のために２４、４８および７２時間で採取した。ＭＬＲ(混合リンパ球反応)試料は、二人のドナーから血液を採取し、Ficollを用いて単核細胞を単離し、そして単離された単核細胞を１：１で、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール(５.５×１０^−５Ｍ)(Gibco)、および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中で凡そ２×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度で混合することによって、得られた。ＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡ調製のために試料を１〜７日の範囲にわたる種々の時点で採取した。
【０４４４】
単核細胞から、製造元の指示にしたがってＣＤ１４Miltenyi Beads、正ｖｅＶＳ選択カラムおよびVario Magnetを用いて、単球を単離した。単球を、ＤＭＥＭ５％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)(Hyclone, Logen, UT)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４中で５〜７日間での培養によって樹状細胞に分化させた。単球をＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)および１０％ＡＢヒト血清または凡そ５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間での培養によって、マクロファージを調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖(ＬＰＳ)で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０モノクローナル抗体で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０４４５】
単核細胞から、製造元の指示にしたがってＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６ Miltenyi Beads、正ＶＳ選択カラムならびにVario Magnetを用いて、ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた単離した。ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９Miltenyi Beadsならびに正の選択を用いて、単核細胞からＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９細胞を除去することによって、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ ＣＤ４リンパ球を単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを用いてＣＤ４５ＲＯ ＣＤ４リンパ球を単離すると、残存する細胞はＣＤ４５ＲＡ ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)の中に入れて、１０^６細胞／ｍｌで、ＰＢＳ中の０.５μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ２８ (Pharmingen)および３μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ３(ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ)で終夜コーティングされたFalcon ６穴組織培養プレート上へ平板培養した。６および２４時間後に、ＲＮＡ調製のため細胞を集めた。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、我々は単離されたＣＤ８リンパ球を抗−ＣＤ２８および抗−ＣＤ３でコーティングされたプレート上で４日間活性化し、次いで細胞を集め、それらをＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２中で増殖させた。次いで、増殖したＣＤ８細胞を、プレートに結合された抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で４日間再び活性化し、前記のように増殖した。第二の活性化後６および２４時間ならびに第二の拡大培養４日後にＲＮＡを単離した。単離されたＮＫ細胞を、ＲＮＡの調製前の４〜６日間に、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２中で培養した。
【０４４６】
Ｂ細胞を得るために、扁桃腺をＮＤＲＩから取得した。扁桃腺を無菌解剖ハサミで切り裂き、次いで篩いに通過させた。次いで、扁桃腺細胞を遠心沈殿し、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中に、１０^６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化させるために、我々は５μｇ／ｍｌのＰＷＭまたは凡そ１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０(Pharmingen)および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を用いた。ＲＮＡ調製のために、細胞を２４、４８および７２時間にて収穫した。
【０４４７】
一次および二次のＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を調製するために、６−穴Falconプレートを１０μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ２８(Pharmingen)および２μｇ／ｍｌ ＯＫＴ３(ＡＴＣＣ)で終夜コーティングして、次いでＰＢＳで二回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球(Poietic Systems, German Town, MD)を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２(４ｎｇ／ｍｌ)中に、１０^５〜１０^６細胞／ｍｌで培養した。Ｔｈ１に対してはＩＬ−１２(５ｎｇ／ｍｌ)および抗−ＩＬ４(１μｇ／ｍｌ)を用いた一方で、Ｔｈ２に対してはＩＬ−４(５ｎｇ／ｍｌ)および抗−ＩＦＮガンマ(１μｇ／ｍｌ)を用い、そしてＴｒ１に対しては５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を用いた。４〜５日後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球をＤＭＥＭ中で一回洗浄し、そしてＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２(１ｎｇ／ｍｌ)中で４〜７日間培養した。これに続いて、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球を、抗−ＣＤ２８／ＯＫＴ３および上記のようなサイトカインで、ただしアポトーシスを阻止するために抗−ＣＤ９５Ｌ(１μｇ／ｍｌ)を加えて、５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球を洗浄し、次いでＩＬ−２で４〜７日間再び培養した。活性化Ｔｈ１およびＴｈ２のリンパ球を、最大３サイクルの間このように維持した。一次および二次のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から、プレートに結合された抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂによる第二および第三活性化の後６および２４時間後、ならびにインターロイキン２中での第二および第三の拡大培養開始から４日後に、ＲＮＡを調製した。
【０４４８】
ＡＴＣＣから以下の白血球細胞株を入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、０.１ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ中に５×１０^５細胞／ｍｌで三日毎に培地を交換し、かつ細胞濃度を５×１０^５細胞／ｍｌに調整しながら、８日間での培養によって、さらに分化させた。これらの細胞を培養するために、我々は、５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)を添加して、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ(ＡＴＣＣによって推奨されたように)を用いた。ＲＮＡを、休眠細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６および１４時間活性化した細胞のいずれかから、調製した。角化細胞株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまた、ＡＴＣＣから取得した。両方を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０^−５Ｍ(Gibco)、および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を凡そ５ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファおよび１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１ベータで６および１４時間活性化する一方で、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を以下のサイトカインで６および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１３および２７ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮガンマ。
【０４４９】
これらの細胞株および血液細胞については、Trizol (Gibco BRL)を用い凡そ１０^７細胞／ｍｌを溶解してＲＮＡを調製した。手短に言えば、１／１０容量のブロモクロロプロパン(Molecular Research Corporation)をＲＮＡ試料に加え、ボルテックスし、室温にて１０分後に管をSorvall SS34回転器中で１４,０００ｒｐｍで遠心した。水相を除去し、１５ｍｌのFalcon Tubeの中に入れた。等容積のイソプロパノールを加えて、−２０℃で終夜放置した。沈殿したＲＮＡをSorvall SS34回転器中、９,０００ｒｐｍで、１５分間、遠心沈殿し、７０％エタノール中で洗浄した。ペレットをＲＮアーゼの無い水３００μｌに再溶解させ、緩衝液(Promega) ３５μｌ、ＤＴＴ５μｌ、ＲＮＡｓｉｎ７μｌおよびＤＮアーゼ８μｌを加えた。管を３７℃で３０分間インキュベートし、汚染しているゲノムＤＮＡを除去し、フェノール／クロロホルムで一回抽出し、１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積の１００％エタノールで再沈殿した。ＲＮＡを遠心沈殿し、ＲＮアーゼの無い水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０４５０】
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１.０
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１.０のためのプレートは、Backus HospitalおよびClinomics (Frederick, MD)から取得した手術および検死ヒト組織から単離されたｃＤＮＡから成る２個の対照穴および８９個の試験試料を含む。Backus Hospitalからの組織試料から、全ＲＮＡをCuraGenの施設で抽出した。他の組織からの全ＲＮＡは、Clinomicsから取得した。
【０４５１】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織を、Backus Hospitalで全膝または臀部置換手術を行った患者から取得した。直ぐ後で、組織試料を液体窒素中で素早く凍結し、単離されたＲＮＡが最適な品質であり分解していないことを保証した。変形性関節炎および慢性関節リウマチの関節組織のさらに別の試料を、Clinomicsから取得した。正常な対照組織はClinomicsから供給され、そして外傷犠牲者の剖検の間に取得された。
【０４５２】
乾癬組織および隣接のマッチド組織の手術標本は、全ＲＮＡとしてClinomicsから取得した。二人の男性および二人の女性患者を年齢２５歳から４７歳から選択した。いずれの患者も、試料が単離されたときには、処方薬剤を服用していなかった。
【０４５３】
潰瘍性大腸炎およびクローン病を持つ患者からの疾患結腸ならびに隣接のマッチド組織の手術標本は、Clinomicsから取得した。年齢４１〜６９歳の間の三人の女性および三人の男性のクローン病患者からの腸組織を用いた。二人の患者は処方医薬品を受けていなかった一方で、他はデキサメタゾン、フェノバルビタールまたはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は、三人の男性および四人の女性患者からのものであった。患者のうち四人はレブビドを服用し、二人はフェノバルビタールを受けていた。
【０４５４】
無疾患または肺気腫、喘息またはＣＯＰＤを持つ外傷被害者の検死肺組織からの全ＲＮＡを、Clinomicsから購入した。年齢４０〜７０歳の範囲にわたる肺気腫患者は、すべて喫煙者であって、この年齢範囲は、タバコ関連の肺気腫を持つ患者に焦点を当てかつアルファ−１抗−トリプシン欠乏症を持つそれらの患者を除外するために、選択された。喘息患者は、年齢３６〜７５歳の範囲にわたり、そしてＣＯＰＤを持つ可能性のあるそれらの患者を阻止するために喫煙者を除外した。ＣＯＰＤ患者は、年齢３５〜８０歳の範囲にわたり、喫煙者および非喫煙者の両方を含んでいた。大部分の患者は、コルチコステロイドおよび気管支拡張剤を服用していた。
【０４５５】
ＡＩ_包括的_パネル_V１.０パネルの中の組織を同定するために使用するラベルの中で、以下の略語を用いる。
ＡＩ： 自己免疫
Ｓｙｎ： 滑液
Normal： 明白な疾患なし
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０：個別の患者
ＲＡ： 慢性関節リウマチ
Backus： Backus Hospitalから
ＯＡ： 変形性関節炎
(ＳＳ)(ＢＡ)(ＭＦ)：個別の患者
Ａｄｊ：隣接組織
Match control：隣接組織
−Ｍ： 男性
−Ｆ： 女性
ＣＯＰＤ： 慢性閉塞性肺疾患
【０４５６】
パネル５Ｄおよび５Ｉ
パネル５Ｄおよび５Ｉのためのプレートは、２個の対照穴および代謝性疾患を強調するヒト組織および細胞株から単離された種々のｃＤＮＡを含む。代謝組織を、Gestational Diabetes(妊娠性糖尿病)研究に登録された患者から取得した。ヒト間葉幹細胞からの脂肪細胞の分化の種々の段階中で、細胞を取得した。また、ヒト膵臓島細胞も取得した。
【０４５７】
Gestational Diabetes(妊娠性糖尿病)研究では対象は、若くて(１８〜４０歳)、日常的な(選択的)帝王切開術を行う妊娠性糖尿病の有無以外は健康な婦人である。幼児出産後、外科的切開が修復／縫合されているとき、産科医がそれぞれの外科的レベルの縫合中に露出された代謝組織の小量の試料(＜１ｃｃ)を摘出した。生検物質は、無菌生理食塩液ですすぎ洗いされ、水分を吸取り、摘出時から５分以内に迅速凍結された。次いで、組織は液体窒素中で急速冷凍され、個別に無菌のねじ蓋管に入れられて保存され、CuraGenへの輸送のためにまたは採取されるまでドライアイス上に置かれた。興味のある代謝組織としては、子宮壁(平滑筋)、内臓脂肪、骨格筋(直筋)および皮下脂肪が挙げられる。患者の説明は以下の通りである。
患者２ 糖尿病ラテンアメリカ系、過体重、インスリン非服用
患者７〜９ 非糖尿病白人系で肥満(ＢＭＩ＞３０)
患者１０ 糖尿病ラテンアメリカ系、過体重、インスリン服用
患者１１ 非糖尿病アフリカ系米国人で過体重
患者１２ インスリン服用の糖尿病ラテンアメリカ系
【０４５８】
脂肪細胞の分化を、二つの複製のみを有するところのドナー３Ｕを除き、Osirus(Clonetics/Bio Whittakerの一部門)から３部で得られたドナー前駆細胞中で誘導した。Cloneticsの科学者は、CuraGenのためにヒト間葉幹細胞(ＨｕＭＳＣ)を、Mark F. Pittenger, et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999: 143-147に見られる公開されたプロトコルに基づいて単離し、成長させ、分化させた。Cloneticsから、ｍＲＮＡの単離およびｄｓ ｃＤＮＡの生産に適するTrizol溶解物または凍結ペレットを得た。それぞれのドナーの一般的説明は、以下の通りである。
ドナー２および３Ｕ： 間葉幹細胞、未分化脂肪
ドナー２および３ＡＭ： 脂肪、中途分化脂肪
ドナー２および３ＡＤ： 脂肪、分化脂肪
【０４５９】
ヒト細胞株は、一般的にＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)、ＮＣＩまたはドイツがん細胞バンクから得られ、以下の組織群に入る：近位曲尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２がん細胞、心臓一次間質細胞および副腎皮質腺腫細胞。これらの細胞をすべて標準的な推奨された条件下で培養し、ＲＮＡを標準的な手順を用いて抽出した。すべての試料をCuraGenで加工して、単鎖ｃＤＮＡを生産した。
【０４６０】
パネル５Ｉは、先に記載したすべての試料にDiabetic Research Institute at the University of Miami School of Medicineから取得した、５８歳女性患者からの膵島の追加を含む。膵島組織は外部業者で全ＲＮＡに加工されて、パネル５Ｉに加えるためにCuraGenに運ばれた。
【０４６１】
５Ｄおよび５Ｉパネル中の組織を確認するために使用されるラベルでは、以下の略語を用いる：
ＧＯ Adipose： 大網膜脂肪
ＳＫ： 骨格筋
ＵＴ： 子宮
ＰＬ： 胎盤
ＡＤ： 分化脂肪
ＡＭ： 中途分化脂肪
Ｕ： 未分化幹細胞
【０４６２】
パネルＣＮＳＤ.０１
パネルＣＮＳＤ.０１のためのプレートは、２個の対照穴とthe Harvard Brain Tissue Resource Centerから取得した検死ヒト脳組織から単離されたｃＤＮＡから成る９４個の試験試料を含む。脳を、死後４〜２４時間の間のドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者が切片にし、液体窒素蒸気中−８０℃で凍結した。神経病理学者がすべての脳を切片にし、検査して、明確な関連する神経病理学で診断を確認する。
【０４６３】
疾患診断は患者記録からを取られる。パネルは以下の診断のそれぞれからの二つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン病、進行性核上性麻痺、抑鬱、および「正常対照」。これらのそれぞれの脳内で、以下の領域が提示される：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、Brodman４野(一次運動野)、Brodman７野(頭頂皮質)、Brodman９野(前前頭皮質)およびBrodman１７野(後頭皮質)。すべての場合において、脳領域のすべては提示されていない；例えば、ハンティントン病は、部分的に淡蒼球における神経変性を特徴とし、かくしてこの領域は確認されたハンティントン病の症例から取得することは不可能である。同じくパーキンソン病は、黒質の変性を特徴とし、この領域を取得するのをさらに困難にしている。正常対照脳の神経病理学検査を行い、神経変性と一致するいかなる病理もないことを見い出した。
【０４６４】
ＣＮＳパネル中の組織を確認するために使用するラベルでは、以下の略語を用いる。
ＰＳＰ： 進行性核上麻痺
Sub Nigra： 黒質
Glob Palladus： 淡蒼球
Temp Pole： 側頭極
Cing Gyr： 帯状回
ＢＡ４： Brodman４野
【０４６５】
パネルＣＮＳ_神経変性_Ｖ１.０
パネルＣＮＳ_神経変性_Ｖ１.０のためのプレートは、２個の対照穴とthe Harvard Brain Tissue Resource Center (McLean Hospital)およびthe Human Brain and Spinal Fluid Resource Center (VA Greater Los Angeles Healthcare System)から取得した検死ヒト脳組織から単離したｃＤＮＡから成る４７個の試験試料を含む。脳を、死後４〜２４時間の間のドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者が切片にし、液体窒素蒸気中−８０℃で凍結した。神経病理学者がすべての脳を切片にし、検査して明確な関連する神経病理学で診断を確認する。
【０４６６】
疾患診断は患者記録からを取られる。パネルは、アルツハイマー病(ＡＤ)疾患からの６個の脳および死亡前に痴呆の形跡を示さなかったところの「正常対照」からの８個の脳を含む。８個の正常対照脳は、二種の範疇に区分される：痴呆およびアルツハイマー様病理(対照)を持たない対照ならびに痴呆を持たないが重症アルツハイマー様病理、(特に０〜３の尺度でレベル３として評価される老人斑負荷；０＝斑形跡なし、３＝重症ＡＤ老人斑負荷)、の証拠を持つ対照。これらのそれぞれの脳内で、以下の領域が提示される：海馬、側頭皮質(Brodman２１野)、頭頂皮質(Brodman７野)および後頭皮質(Brodman１７野)。これらの領域は、ＡＤにおける全てのレベルを包含するために選択された。海馬はＡＤにおける初期および重症神経損失の領域であり；側頭皮質は海馬の後でＡＤにおいて神経変性を呈すと知られており；頭頂皮質は病気の後期段階で中程度の神経死を呈し；後頭皮質はＡＤにおいて生き長らえ、それ故にＡＤ患者内で「対照」領域として働く。すべての場合において、脳領域のすべては提示されていない。
【０４６７】
ＣＮＳ_神経変性_Ｖ１.０パネル中の組織を確認するために使用するラベルでは、以下の略語を用いる。
ＡＤ： アルツハイマー病脳；患者は痴呆になり、剖検でＡＤ様病理を呈した。
Control： 対照脳；痴呆でない患者、神経病理を呈さない
Control(Path)： 対照脳；痴呆ではないが重症ＡＤ様病理を呈する患者
Sup Temporal Ctx：上側頭皮質
Inf Temporal Ctx：下側頭皮質
【０４６８】
Ａ．ＧＧ１００１００４０４−０１：フィブロネクチン−マレエートデヒドロゲナーゼ
遺伝子ＣＧ１００１０４−０１の発現は、表ＡＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ４１６２を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果は、表ＡＢおよびＡＣに示す。
【０４６９】
【表１６４】

【０４７０】
【表１６５】

【０４７１】
表ＡＢの続き
【表１６６】

【０４７２】
【表１６７】

【０４７３】
表ＡＣの続き
【表１６８】

【０４７４】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１６２
ＣＧ１００１０４−０１遺伝子の非常に高い発現性は、排他的に精巣から検出される(ＣＴ＝２８.５)。したがって、この遺伝子の発現は、精巣試料をこのパネルで使用されている他の試料と区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、精巣関連疾患、例えば生殖能力および性機能低下症の処置において有用であり得る。
【０４７５】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた、卵巣癌ＯＶＣＡＲ−８−セルラインで検出される(ＣＴ＝３３.４)。したがって、このタンパク質生成物の治療的モジュレーションは、卵巣癌の処置において有用であり得る。
【０４７６】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１６２
ＣＧ１００１０４−０１遺伝子の非常に高い発現性は、腎臓で検出される(ＣＴ＝２９.９)。この遺伝子の発現は、正常な肺、胸腺および腎臓で排他的に見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの組織試料をこのパネルにおける他の試料と区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、肺および腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患の処置に有益であり得る。
【０４７７】
Ｂ．ＣＧ５６７８５−０１：ミトコンドリアＧＴＰ：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ
表ＢＡに記載した通り、プライマー‐プローブセットＡｇ３０３６を用いて遺伝子ＣＧ５６７８５−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＢＢ、ＢＣおよびＢＤに示す。
【０４７８】
【表１６９】

【０４７９】
【表１７０】

【０４８０】
【表１７１】

【０４８１】
表ＢＣの続き
【表１７２】

【０４８２】
【表１７３】

【０４８３】
表ＢＤの続き
【表１７４】

【０４８４】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３０３６
このパネルは、アルツハイマー病ではＣＧ５６７８５−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を示している。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０４８５】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３０３６
ＣＧ５６７８５−０１遺伝子の発現は、骨髄で排他的に検出される(ＣＴ＝３４.６)。この遺伝子は、様々な血液疾患でダウンレギュレーションされることが示された(Waller HD、Klin Wochenschr １９７８年５月１５日、５６(１０)：４８３−９１)、アデニル酸キナーゼファミリーの推定構成員をコードする。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料とこのパネルにおける他の試料とを区別し、骨髄および赤血球のマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、血液疾患および白血病の処置に有用であり得る。
【０４８６】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３０３６
ＣＧ５６７８５−０１遺伝子の発現は、休止単核細胞で排他的に見られる(ＣＴ＝３３.３)。この発現は、パネル１.３Ｄでの発現と一致する。この系統の休止細胞におけるこの遺伝子の発現は、この転写物によりコードされるタンパク質が免疫ホメオスタシスに伴う正常な免疫学的プロセスに関与し得ることを示唆している。
【０４８７】
Ｃ．ＣＧ５６９１４−０１：トロンボスポンジン
表ＣＡおよびＣＢに記載された、プライマープローブセットＡｇ３１０８およびＡｇ３８９９を用いて、遺伝子ＣＧ５６９１４−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨおよびＣＩに示す。
【０４８８】
【表１７５】

【０４８９】
【表１７６】

【０４９０】
【表１７７】

【０４９１】
表ＣＣの続き
【表１７８】

【０４９２】
【表１７９】

【０４９３】
表ＣＤの続き
【表１８０】

【０４９４】
【表１８１】

【０４９５】
表ＣＥの続き
【表１８２】

【０４９６】
【表１８３】

【０４９７】
表ＣＦの続き
【表１８４】

【０４９８】
【表１８５】

【０４９９】
表ＣＧの続き
【表１８６】

【０５００】
【表１８７】

【０５０１】
表ＣＨの続き
【表１８８】

【０５０２】
【表１８９】

【０５０３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３８９９／Ａｇ３９６０／Ａｇ４３３８
２種の異なるプライマーおよびプローブセットによる３実験の結果は極めて一致しており、ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現はＣＮＳ癌(アストロ)ＳＮＢ−７５セルラインで見られる(ＣＴ＝２３〜２６)。さらに、この遺伝子の非常に高度の発現は、ＣＮＳ癌セルライン、結腸癌組織、腎臓癌セルラインＵＯ−３１、乳癌および黒色腫セルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの試料をパネルにおける他の試料と区別し、またこれらの癌の検出用マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置において有益なものであり得る。
【０５０４】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において低〜中度レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０５０５】
興味深いことに、この遺伝子は、対応する成人組織(ＣＴ＝３３〜３５)と比べた場合、胎児肝臓(ＣＴ＝３１〜３２)および肺(ＣＴ＝２８)においてかなり高いレベルで発現される。この観察結果は、この遺伝子の発現がこれらの胎児組織を対応する成人組織と区別するのに使用され得ることを示唆している。
【０５０６】
ＨＡＳＳパネルｖ１.０要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子は、このパネルにおけるＭＣＦ−７細胞および神経膠腫試料により発現される。この遺伝子の発現は、ＭＣＦ−７細胞では血清依存的である。このため、発現は、血清から見出されるサイトカインおよび細胞外分子により調節され得る。この遺伝子のモジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗生物質の使用を通して、神経膠腫の処置に有益なものであり得る。
【０５０７】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで検出される(ＣＴ＝２７)。さらに、この遺伝子の発現はまた、黒色腫、乳癌、肺癌、星状細胞腫セルラインおよび結腸癌の十分〜中程度分化(ＯＤＯ３８６６)組織で見られる。この遺伝子の記載についてはパネル１.４参照。
【０５０８】
パネル２.１要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫転移試料で検出される(ＣＴ＝２９)。さらに、この遺伝子の発現は、隣接癌腫組織と比べ正常肝臓において、および乳癌(ＯＤ０４５９０−０１)(ＣＴ＝３６.７)と比べて転移乳癌(ＯＤ０４５９０−０３)(ＣＴ＝３３)において高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、潜在的に癌転移マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、肺癌、乳癌および黒色腫の処置において有用であり得る。
【０５０９】
パネル４.１Ｄ要約Ａｇ３８９９
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、肺で見られる(ＣＴ＝３０.３)。さらに、この遺伝子の中〜低レベルの発現は、ＨＵＶＥＣ細胞、肺および皮膚線維芽細胞で見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質で設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５１０】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は肺で見られる(ＣＴ＝２８.６)。一般的に、このパネルにおける発現は、パネル４.１Ｄでの発現と正当に一致している。この遺伝子の顕著な発現はまた、ＨＰＡＥＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、肺線維芽細胞、ＴＮＦアルファ＋ＩＬ１ベータ処置気管支上皮および皮膚線維芽細胞でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５１１】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた、腎臓および結腸でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患、例えば狼瘡および糸球体腎炎、並びに炎症性腸疾患、例えばクローン病の処置で重要であり得る。
【０５１２】
興味深いことに、この遺伝子の発現は、休止好塩基性細胞と比べると(ＣＴ＝３６)ＰＭＡ／イオノマイシン処置好塩基性細胞において刺激される(ＣＴ＝３０)。好塩基性細胞は、アレルゲンに応答してヒスタミンおよび他の生物学的修飾因子を放出し、喘息および過敏性反応の病理において重要な役割を演じる。したがって、この遺伝子によりコードされる推定タンパク質に対して設計された治療薬は、これらの病気における好塩基性細胞の機能を遮断することにより、炎症を低減化または阻害し得る。さらに、これらの細胞は、様々な炎症性肺および腸疾患、例えば喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に関与する炎症性細胞についての論理的モデルである。したがって、この遺伝子産物の機能を調節する治療薬は、喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に罹った患者の徴候を低減化または排除し得る。
【０５１３】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３１０８／Ａｇ３９６０
異なるプローブおよびプライマーセットによる２実験は、極めて一致した結果をもたらす。ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、転移性黒色腫(ＣＴ＝３０〜３１)で見られる。この結果はパネル２Ｄと一致している。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織と比べた場合、腎臓および肺癌で高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネルにおける他の試料からこれらの試料を識別するのに、そしてこれらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０５１４】
Ｄ．ＣＧ５６９１４−０２：ＴＳＰ、ＩＧ ＥＧＦドメイン含有タンパク質
表ＤＡ、ＤＢ、ＤＣ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＩ、ＤＪおよびＤＫに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ１３１５ｂ、Ａｇ１３１６ｂ、Ａｇ１９２４、Ａｇ３１０８、Ａｇ７７１、Ａｇ７７２、Ａｇ９００、Ａｇ３８９９、Ａｇ３９６０、Ａｇ４３３８およびＡｇ３４３を用いて遺伝子ＣＧ５６９１４−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行結果を表ＤＬ、ＤＭ、ＤＮ、ＤＯ、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ、ＤＳおよびＤＴに示す。
【０５１５】
【表１９０】

【０５１６】
【表１９１】

【０５１７】
【表１９２】

【０５１８】
【表１９３】

【０５１９】
【表１９４】

【０５２０】
【表１９５】

【０５２１】
【表１９６】

【０５２２】
【表１９７】

【０５２３】
【表１９８】

【０５２４】
【表１９９】

【０５２５】
【表２００】

【０５２６】
【表２０１】

【０５２７】
表ＤＬの続き
【表２０２】

【０５２８】
表ＤＬの続き
【表２０３】

【０５２９】
【表２０４】

【０５３０】
表ＤＭの続き
【表２０５】

【０５３１】
【表２０６】

【０５３２】
表ＤＮの続き
【表２０７】

【０５３３】
【表２０８】

【０５３４】
表ＤＯの続き
【表２０９】

【０５３５】
【表２１０】

【０５３６】
表ＤＰの続き
【表２１１】

【０５３７】
【表２１２】

【０５３８】
表ＤＱの続き
【表２１３】

【０５３９】
【表２１４】

【０５４０】
表ＤＲの続き
【表２１５】

【０５４１】
表ＤＲの続き
【表２１６】

【０５４２】
【表２１７】

【０５４３】
表ＤＳの続き
【表２１８】

【０５４４】
【表２１９】

【０５４５】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３８９９／Ａｇ３９６０／Ａｇ４３３８
２種の異なるプライマーおよびプローブセットによる３実験の結果は極めて一致しており、ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、ＣＮＳ癌(アストロ)ＳＮＢ−７５セルラインで見られる(ＣＴ＝２３〜２６)。さらに、この遺伝子の非常に高度の発現は、ＣＮＳ癌セルライン、結腸癌組織、腎癌セルラインＵＯ−３１、乳癌および黒色腫セルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの試料をパネルにおける他の試料と区別し、またこれらの癌の検出用マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置において有益なものであり得る。
【０５４６】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において低〜中度レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０５４７】
興味深いことに、この遺伝子は、対応する成人組織(ＣＴ＝３３〜３５)と比べた場合、胎児肝臓(ＣＴ＝３１〜３２)および肺(ＣＴ＝２８)においてかなり高いレベルで発現される。この観察結果は、この遺伝子の発現がこれらの胎児組織を対応する成人組織と区別するのに使用され得ることを示唆している。
【０５４８】
ＨＡＳＳパネルｖ１.０要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０２遺伝子は、このパネルにおけるＭＣＦ−７細胞および神経膠腫試料により発現される。この遺伝子の発現は、ＭＣＦ−７細胞では血清依存的である。このため、発現は、血清から見出されるサイトカインおよび細胞外分子により調節され得る。この遺伝子のモジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗生物質の使用を通して、神経膠腫の処置に有益なものであり得る。
【０５４９】
パネル１要約：Ａｇ３４３
ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、乳癌ＭＤＡ−Ｎセルラインで検出される(ＣＴ＝２６)。さらに、この遺伝子の非常に高度の発現はまた、黒色腫、星状細胞腫、および肺癌セルラインで観察される。この遺伝子の記載についてはパネル１.４参照。
【０５５０】
パネル１.２要約：Ａｇ７７１／Ａｇ７７２
２実験は非常に一致した結果をもたらし、ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで見られる(ＣＴ＝２５)。高レベルの発現はまた、黒色腫、胸部および脳の癌セルラインからの試料のクラスターで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、黒色腫試料およびこのパネルにおける他の試料を区別するため、そしてこれらの癌の存在を検出するマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、黒色腫、胸部および脳の癌の処置において有効であり得る。
【０５５１】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで検出される(ＣＴ＝２７)。さらに、この遺伝子の発現はまた、黒色腫、乳癌、肺癌、星状細胞腫セルラインおよび結腸癌の十分〜中程度分化(ＯＤＯ３８６６)組織で見られる。この遺伝子の記載についてはパネル１.４参照。
【０５５２】
パネル２.１要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫転移試料で検出される(ＣＴ＝２９)。さらに、この遺伝子の発現は、隣接癌腫組織と比べ正常肝臓において、および乳癌(ＯＤ０４５９０−０１)(ＣＴ＝３６.７)と比べて転移乳癌(ＯＤ０４５９０−０３)(ＣＴ＝３３)において高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、潜在的に癌転移マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、肺癌、乳癌および黒色腫の処置において有用であり得る。
【０５５３】
パネル４.１Ｄ要約Ａｇ３８９９／Ａｇ３９６０／Ａｇ４３３８
２種の異なるプライマーおよびプローブセットによる３実験の結果は極めて一致しており、ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は肺で見られる(ＣＴ＝３０〜３１)。さらに、この遺伝子の顕著な発現は、ＨＵＶＥＣ細胞、肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞で見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質で設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５５４】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた腎臓でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、腎機能を調節し、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患、例えば狼瘡および糸球体腎炎の処置で重要であり得る。
【０５５５】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は肺で見られる(ＣＴ＝２８.６)。一般的に、このパネルにおける発現は、パネル４.１Ｄでの発現と相応に一致している。この遺伝子の顕著な発現はまた、ＨＰＡＥＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、肺線維芽細胞、ＴＮＦアルファ＋ＩＬ１ベータ処置気管支上皮および皮膚線維芽細胞でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５５６】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた、腎臓および結腸でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患、例えば狼瘡および糸球体腎炎、並びに炎症性腸疾患、例えばクローン病の処置で重要であり得る。
【０５５７】
興味深いことに、この遺伝子の発現は、休止好塩基性細胞と比べると(ＣＴ＝３６)ＰＭＡ／イオノマイシン処置好塩基性細胞において刺激されている(ＣＴ＝３０)。好塩基性細胞は、アレルゲンに応答してヒスタミンおよび他の生物学的修飾因子を放出し、喘息および過敏性反応の病理において重要な役割を演じる。したがって、この遺伝子によりコードされる推定タンパク質に対して設計された治療薬は、これらの病気における好塩基性細胞の機能を遮断することにより、炎症を低減化または阻害し得る。さらに、これらの細胞は、様々な炎症性肺および腸疾患、例えば喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に関与する炎症性細胞についての論理的モデルである。したがって、この遺伝子産物の機能を調節する治療薬は、喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に罹った患者の徴候を低減化または排除し得る。
【０５５８】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３１０８／Ａｇ３９６０
異なるプローブおよびプライマーセットによる２実験は、極めて一致した結果をもたらす。ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、転移性黒色腫(ＣＴ＝３０〜３１)で見られる。この結果はパネル２Ｄと一致している。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織と比べた場合、腎臓および肺癌で高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネルにおける他の試料からこれらの試料を識別するのに、そしてこれらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０５５９】
Ｅ．ＣＧ５７２４２−０１：ＫＩＡ００９０
表ＥＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ３１４６を用いて遺伝子ＣＧ５７２４２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＥＢ、ＥＣおよびＥＤに示す。
【０５６０】
【表２２０】

【０５６１】
【表２２１】

【０５６２】
【表２２２】

【０５６３】
表ＥＣの続き
【表２２３】

【０５６４】
【表２２４】

【０５６５】
表ＥＤの続き
【表２２５】

【０５６６】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３１４６
このパネルは、アルツハイマー病ではＣＧ５７２４２−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を確認している。この遺伝子の記載についてはパネル１.３Ｄ参照。
【０５６７】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３１４６
ＣＧ５７２４２−０１の非常に高度の発現は、脳の癌セルラインで見られる(ＣＴ＝２９)。この遺伝子はこのパネルで遍在的に発現され、顕著なレベルの発現はまた、卵巣、肺、肝臓および脳の癌由来のセルラインのクラスターで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、肺、肝臓、卵巣および脳の癌の処置において有用であり得る。
【０５６８】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺および成人および胎児骨格筋、心臓および肝臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範囲に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０５６９】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０５７０】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３１４６
ＣＧ５７２４２−０１の非常に高度の発現は、イオノマイシンで処理したＢセルラインＲａｍｏｓで見られる(ＣＴ＝２６.５)。この遺伝子はこのパネルで遍在的に発現され、休止Ｔ細胞と比べた場合活性化Ｔ細胞で僅かに高いレベルの発現が見られる。さらに、顕著なレベルの発現は、ＰＷＭ処理ＰＢＭＣおよびＢリンパ球で見られる。顕著なレベルの発現はまた、健康な状態および病気における免疫応答で重要な細胞型の範囲、例えばｄ内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織で見られる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程にかかわり得ることを示唆している。このパターンはパネル１.３における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０５７１】
Ｆ．ＣＧ５７２７９−０２およびＣＧ５７２７９−０４およびＣＧ５７２７９−０５：補体崩壊促進因子
表ＦＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０６０を用いて、遺伝子ＣＧ５７２７９−０２、変異体ＣＧ５７２７９−０４および完全長物理的クローンＣＧ５７２７９−０５の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行結果を表ＦＢおよびＦＣに示す。
【０５７２】
【表２２６】

【０５７３】
【表２２７】

【０５７４】
表ＦＢの続き
【表２２８】

【０５７５】
【表２２９】

【０５７６】
表ＦＣの続き
【表２３０】

【０５７７】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０６０
ＣＧ５７２７９−０１遺伝子の発現は、肺癌セルラインで非常に高い(ＣＴ＝１９.４)。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネル上の他の試料からこの試料を識別するのに、そして肺癌マーカーとして使用され得る。発現はまた、成人肺における発現と比べた場合(ＣＴ＝２５)、胎児肺および前立腺癌セルラインで顕著に高い(ＣＴ＝２０.８)。すなわち、この遺伝子の発現は、成人および胎児肺組織間の識別に使用され得る。セルラインおよび胎児組織は正常成人組織より増殖性が高いため、この発現プロファイルは、この遺伝子が細胞増殖に掛かり合い得ることを示唆している。さらに、この遺伝子は、ヒト肺癌で過剰発現されることが示されており、癌が免疫監視機構を回避するのを助けると考えられている(Varsano S, Am J Respir Cell Mol Biol １９８８年９月、１９(３)：５２２−９)、崩壊促進因子と相同性を有する。したがって、この遺伝子の発現または機能のモジュレーションは、肺および前立腺癌の処置に有用であり得る。
【０５７８】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において高レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範囲に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。さらに、この遺伝子は、成人対応組織(ＣＴ＝２８.９)における発現と比較した場合、胎児肝臓組織(ＣＴ＝２５)においてかなり高レベルで発現される。すなわち、この遺伝子の発現は、この組織の胎児および成人供給源間の識別に使用され得る。
【０５７９】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜高レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０５８０】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０６０
ＣＧ５７２７９−０１遺伝子はこのパネルで遍在的に発現され、顕著に高い発現レベルはＴＮＦ−アルファ／ＩＬ−１ベータ刺激好中球で見られる(ＣＴ＝２３.６)。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネル上の他の試料からこの試料を識別するのに、そして活性化好中球マーカーとして使用され得る。この遺伝子は、崩壊促進因子と相同的な分子、補体調節タンパク質をコードする。ヒト多型核白血球(ＰＭＮ)は、相同性補体による損傷からそれらを保護するタンパク質を発現する。ＴＮＦ−ａおよびＬＰＳで処理した好中球におけるＣＧ５７２７９−０１遺伝子産物のアップレギュレーションは、炎症組織における防御機構の指標であり得る。したがって、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、炎症の分解、創傷治癒の促進および免疫複合体仲介疾患の処置において有効であり得る。さらに、この遺伝子産物の発現プロファイルおよび相同性に基くと、この遺伝子および／または遺伝子産物の治療的モジュレーションはまた、臓器移植の免疫抑制剤として作用し得る。
【０５８１】
Ｇ．ＣＧ９４６３０−０１：ＭＨＣクラスＩ抗原
表ＧＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ３９３１を用いて遺伝子ＣＧ９４６３０−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＧＢ、ＧＣ、ＧＤおよびＧＥに示す。
【０５８２】
【表２３１】

【０５８３】
【表２３２】

【０５８４】
【表２３３】

【０５８５】
表ＧＣの続き
【表２３４】

【０５８６】
【表２３５】

【０５８７】
表ＧＤの続き
【表２３６】

【０５８８】
【表２３７】

【０５８９】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３９３１
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９４６３０−０１遺伝子の発現を確認している。しかしながら、この遺伝子の差次的発現は、この実験においてアルツハイマー罹患剖検脳および非痴呆対照の剖検脳間からは検出されなかった。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０５９０】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３９３１
ＣＧ９４６３０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、乳癌Ｔ４７Ｄセルラインで検出される(ＣＴ＝２２.７)。一般に、この遺伝子の高い発現は、胸部、卵巣、胃、腸、膵臓およびＣＮＳ癌セルラインのクラスターで検出される。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌についての診断マーカーとして使用され得る。また、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０５９１】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０５９２】
興味深いことに、この遺伝子の発現は、対応する成人または胎児組織(ＣＴ＝３１)と比べた場合、胎児肺および成人骨格筋(ＣＴ＝２７)において高いレベルで発現される。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの胎児および成人組織間の区別に使用され得る。
【０５９３】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む被験中枢神経系の全領域において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子は、中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病においてある一定の役割を演じ得る。
【０５９４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ３９３１
ＣＧ９４６３０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、休止ＬＡＫ細胞において検出される(ＣＴ＝２５)。この遺伝子は、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において高〜中レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織の構成員が含まれる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０５９５】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３９３１
この遺伝子はこのパネルの組織の大部分において中レベルで発現され、最高レベルは腎臓癌試料で見られる(Ｃｔ＝２６.４８)。この遺伝子は、正常隣接組織と比べると、腸、肺および腎臓癌で高いレベルで発現される。この遺伝子の発現は、腫瘍を正常組織と区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通して、腎臓、肺または腸癌の処置に有益であり得る。
【０５９６】
Ｈ．ＣＧ９４８３１−０１およびＣＧ９４８３１−０２：テトラスパン
表ＨＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ３９５７を用いて、遺伝子ＣＧ９４８３１−０１および完全長物理的クローンＣＧ９４８３１−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＨＢおよびＨＣに示す。ＣＧ９４８３１−０２は、ＣＧ９４８３１−０１遺伝子の完全長物理的クローンを表すものとし、遺伝子配列の予測を確認している。
【０５９７】
【表２３８】

【０５９８】
【表２３９】

【０５９９】
表ＨＢの続き
【表２４０】

【０６００】
【表２４１】

【０６０１】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３９５７
ＣＧ９４８３１−０１遺伝子の非常に高度の発現は、卵巣癌セルラインで見られる(ＣＴ＝２７.２)。中レベルの発現はまた、腸癌セルラインで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの試料をこのパネル上の他の試料と区別するのに、そして腸および卵巣癌のマーカーとして使用され得る。この遺伝子は、テトラスパニンと相同的である分子をコードし、それは、恐らく膜生物学において重要な役割を演じ、細胞活性化および増殖、接着および運動性、分化、および癌を含む多くの多様な過程で掛かり合うと思われる。テトラスパニンファミリーの構成員は、腫瘍血管新生に関係しており(Longo N,Blood ２００１年１２月１５日、９８(１３)：３７１７−２６)、癌によってはアップレギュレーションされる場合もあることが示された(Kanetaka K,J Hepatol ２００１年１１月、３５(５)：６３７−４２)。すなわち、この遺伝子の発現およびテトラスパニンとのその相同性に基くと、この遺伝子の発現または機能のモジュレーションは、卵巣および腸癌の処置に有用であり得る。
【０６０２】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範囲に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６０３】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６０４】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３９５７
この遺伝子の発現は、正常腸試料では非常に高いと思われる(ＣＴ＝２８.１７)。さらに、正常隣接組織および黒色腫試料と比べると、肺、膀胱および前立腺癌試料での発現は実質的に増加していると思われる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの組織において正常細胞と腫瘍を区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子の治療的モジュレーションは、小分子薬剤または抗体の使用を通して、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０６０５】
Ｉ．ＣＧ９４８９２−０１:Ｃｕｂドメイン含有膜タンパク質
表ＩＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０６１を用いて遺伝子ＣＧ９４８９２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＩＢおよびＩＣに示す。
【０６０６】
【表２４２】

【０６０７】
【表２４３】

【０６０８】
表ＩＢの続き
【表２４４】

【０６０９】
【表２４５】

【０６１０】
表ＩＣの続き
【表２４６】

【０６１１】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０６１
ＣＧ９４８９２−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで見られる(ＣＴ＝２５.２)。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料をこのパネル上の他の試料と区別するのに、そして黒色腫マーカーとして使用され得る。中レベルの発現はまた、腎臓、卵巣、前立腺および肺癌に由来するセルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌および黒色腫の処置に有用であり得る。
【０６１２】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６１３】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０６１
ＣＧ９４８９２−０１遺伝子の非常に高度の発現は、腎臓で見られる(ＣＴ＝３１.６)。低いが顕著なレベルの発現はまた、活性化および未処理皮膚線維芽細胞およびケラチノサイト、ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−４活性化Ｂリンパ球および正常胸腺で検出される。すなわち、この遺伝子の発現は、腎臓をこのパネル上の他の試料と識別するのに、そして腎臓組織のマーカーとして使用され得る。さらに、この臓器におけるこの遺伝子の顕著な発現は、この遺伝子産物が腎臓の正常なホメオスタシスに関与し得ることを示唆している。したがって、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、狼瘡、糸球体腎炎および他の疾患による炎症中にこの臓器に対して機能を維持または回復させるのに有用であり得る。
【０６１４】
Ｊ．ＣＧ９５２２７−０１：コラーゲンアルファ２(VIII)鎖
表ＪＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０６２を用いて遺伝子ＣＧ９５２２７−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＪＢ、ＪＣおよびＩＤに示す。
【０６１５】
【表２４７】

【０６１６】
【表２４８】

【０６１７】
【表２４９】

【０６１８】
表ＪＣの続き
【表２５０】

【０６１９】
【表２５１】

【０６２０】
表ＪＤの続き
【表２５２】

【０６２１】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４０６２
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９５２２７−０１遺伝子の発現を確認している。しかしながら、この遺伝子の差次的発現は、この実験においてアルツハイマー罹患剖検脳および非痴呆対照の剖検脳間からは検出されなかった。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０６２２】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０６２
ＣＧ９５２２７−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで検出される(ＣＴ＝２４.５)。この遺伝子の中〜高度発現は、黒色腫、扁平上皮癌、胸部、卵巣、肺、腎臓、腸およびＣＮＳ癌セルラインで見られる。したがって、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０６２３】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０６２４】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む被験中枢神経系の全領域において高レベルで発現される。したがって、この遺伝子は、中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病においてある一定の役割を演じ得る。
【０６２５】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０６２
ＣＧ９５２２７−０１遺伝子の非常に高度の発現は、休止マクロファージで検出される(ＣＴ＝２７.３)。興味深いことに、この遺伝子の発現は、休止細胞(ＣＴ＝２７〜３０)と比べて、ＬＰＳ処理マクロファージ(ＣＴ＝３０.３)およびサイトカイン処理ＬＡＫ細胞(ＣＴ＞３７)でダウンレギュレーションされている。さらに、この遺伝子の中〜低度発現は、活性化ＣＤ４５ＲＡ ＣＤ４リンパ球、ＰＭＡ／イオノマイシン処理ＬＡＫ細胞、ツーウェイＭＬＲ、樹状細胞、ＨＰＡＥＣ、肺および皮膚線維芽細胞並びに腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織で検出される。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０６２６】
Ｋ．ＣＧ９６３８４−０１およびＣＧ９６３８４−０２：新規原形質膜タンパク質
表ＫＡおよびＫＢに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０９３およびＡｇ４０９２を用いて、遺伝子ＣＧ９６３８４−０１および完全長物理的クローンＣＧ９６３８４−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＫＣ、ＫＤおよびＫＥに示す。ＣＧ９６３８４−０２は、ＣＧ９６３８４−０１遺伝子の完全長物理的クローンを表すものとし、遺伝子配列の予測を確認している。
【０６２７】
【表２５３】

【０６２８】
【表２５４】

【０６２９】
【表２５５】

【０６３０】
【表２５６】

【０６３１】
表ＫＤの続き
【表２５７】

【０６３２】
【表２５８】

【０６３３】
表ＫＥの続き
【表２５９】

【０６３４】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４０９３
このパネルは、アルツハイマー病におけるＣＧ９６３８４−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を確認しており、非常に高度の発現は対照患者の頭頂皮質で見られる(ＣＴ＝３２.３)。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０６３５】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０９２
ＣＧ９６３８４−０１遺伝子はこのパネルにおいて広範に発現され、非常に高い発現は腎臓で見られる(ＣＴ＝２９.４)。
【０６３６】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６３７】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６３８】
この遺伝子の発現は、正常脳組織におけるよりも脳癌セルラインのクラスターにおける方が高いと思われる。すなわち、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、脳の癌の処置に有効であり得る。
【０６３９】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０９２
ＣＧ９６３８４−０１遺伝子はこのパネルで広範に発現され、非常に高度の発現は一次活性化Ｔｈ２細胞において検出される(ＣＴ＝３２.７)。この遺伝子はまた、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において高〜中レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに皮膚線維芽細胞および胸腺および腎臓から表される正常組織の構成員が含まれる。この発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０６４０】
Ｌ．ＣＧ９６４３２−０１：ナトリウム／プロトン交換体
表ＬＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０５６を用いて、遺伝子ＣＧ９６４３２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＬＢに示す。
【０６４１】
【表２６０】

【０６４２】
【表２６１】

【０６４３】
表ＬＢの続き
【表２６２】

【０６４４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０５６
ＣＧ９６４３２−０１遺伝子の発現は、休止単球およびＬＰＳ処理マクロファージに限られている(ＣＴ＝３４.２〜３４.８)。これらの細胞の機能は、膿瘍および腫瘍により生成された酸性微小環境にある間それらの要求される細胞質ｐＨを維持するナトリウム／プロトン交換体の活性に依存的である(Grinstein S,Clin Biochem １９９１年６月、２４(３)：２４１−７)。この特異的発現パターンは、このタンパク質の活性または機能の治療的モジュレーションが自己免疫疾患および癌の処置に有効であり得ることを示唆している。
【０６４５】
Ｍ．ＣＧ９７１０１−０１：関連するベンゾジアゼピン受容体
表ＭＡおよびＭＢに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４３４４およびＡｇ４３４３を用いて、遺伝子ＣＧ９７１０１−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＭＣに示す。
【０６４６】
【表２６３】

【０６４７】
【表２６４】

【０６４８】
【表２６５】

【０６４９】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４３４４
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９７１０１−０１遺伝子の発現を確認している。この遺伝子の発現は、正常対照よりもアルツハイマー病脳の側頭皮質における方が高い(統計的信頼度レベル＞０.０６)。ＣＧ９７１０１−０１遺伝子は、ベンゾジアゼピン受容体関連タンパク質と類似したタンパク質をコードする。ベンゾジアゼピンは、脳シナプスに位置するタイプＡ ＧＡＢＡ(ガンマ‐アミノ酪酸)受容体でシグナル伝達を調節する。アルツハイマー病患者の側頭皮質におけるＧＡＢＡの既知喪失を仮定すると(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol ２００１年２月、３６３(２)：１３９−４５)、ＣＧ９７１０１−０１遺伝子発現の改変は代償的(compensitory)であり得る。したがって、医薬によるＣＧ９７１０１−０１モジュレーションは、アルツハイマー病の処置において治療的価値を有し得る。
【０６５０】
Ｎ．ＣＧ９７１６８−０１：ＡＴＰ−結合カセット輸送体Ａ様
表ＮＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０９４を用いて、遺伝子ＣＧ９７１６８−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＮＢに示す。
【０６５１】
【表２６６】

【０６５２】
【表２６７】

【０６５３】
表ＮＢの続き
【表２６８】

【０６５４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０９４
ＣＧ９７１６８−０１遺伝子の発現は、ＩＬ−４処置皮膚線維芽細胞で排他的に見られる(ＣＴ＝３２)。したがって、この遺伝子の発現は、この試料をこのパネルにおける他の試料と区別するのに使用され得る。したがって、この遺伝子の治療的モジュレーションは、炎症性皮膚病、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、潰瘍性皮膚炎、潰瘍性大腸炎の処置に有益であり得る。
【０６５５】
ＣＧ９７１６８−０１遺伝子は、ＡＴＰ結合性カセット(ＡＢＣ)輸送体をコードする。ＡＢＣ輸送体遺伝子は、細菌からヒトまでほとんどの生物体で遍在的に存在する。それらは、ＡＴＰを加水分解し、分子の広いアレイを輸送するかまたは他の輸送機構を刺激することにより分子の輸送を誘導する「トラフィックアデノシントリホスファターゼ」である。多くのＡＢＣ輸送体は、ヒト遺伝または散発性疾患、例えば嚢胞性線維症、副腎脳白質ジストロフィー、シュタルガルト病、薬剤耐性腫瘍、デュービン‐ジョンソン症候群、バイラー病、進行性家族性肝臓内胆汁うっ滞、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血および運動失調、幼児の持続性高インシュリン(hyperinsulimenic)低血糖症などに関与している(Efferth T.,２００１年、Curr Mol Med １(１)：４５−６５、PMID:１１８９９２４２)。
【０６５６】
線維芽細胞は、皮膚での炎症プロセス中におけるサイトカインの重要な供給源を構成する。インターロイキン−１は、活性化ヒト皮膚線維芽細胞で誘導される強力な多面発現性サイトカインである。さらにインターロイキン−１は、ケモカインのインターロイキン−８を含む多くの炎症メディエーターを誘導する。インターロイキン−１アルファおよびインターロイキン−１ベータは、シグナルペプチドを欠き、ＡＢＣ輸送体タンパク質を含む第二分泌経路を用いて原形質膜で輸送される。ＡＢＣ輸送体阻害剤グリベンクラミドは、ヒト皮膚線維芽細胞においてインターロイキン−１の外面化およびそれに続くインターロイキン−８のオートクリン誘導を阻止することが最近立証された(Lottaz et al.,２００１、J Invest Dermatol １１７(４)：８７１−６、PMID：１１６７６８２５)。すなわち、この遺伝子によりコードされるＡＢＣ輸送体の機能に拮抗する抗体および小分子は、皮膚の炎症性疾患に罹った患者における徴候を低減化または排除し得る。
【０６５７】
Ｏ．ＣＧ９７４２０−０１およびＣＧ９７４２０−０２：ＭＡＧＥ−ドメイン含有タンパク質
表ＯＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１２６を用いて、遺伝子ＣＧ９７４２０−０１および完全長物理的クローンＧ９７４２０−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＯＢ、ＯＣおよびＯＤに示す。ＣＧ９７４２０−０２は、ＣＧ９７４２０−０１遺伝子の完全長物理的クローンを表すものとし、遺伝子配列の予測を確認している。
【０６５８】
【表２６９】

【０６５９】
【表２７０】

【０６６０】
【表２７１】

【０６６１】
表ＯＣの続き
【表２７２】

【０６６２】
【表２７３】

【０６６３】
表ＯＤの続き
【表２７４】

【０６６４】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４１２６
このパネルは、アルツハイマー病においてＣＧ９７４２０３−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を確認している。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０６６５】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１２６
ＣＧ９７４２０３−０１遺伝子の非常に高度の発現は、肺癌セルラインで見られる(ＣＴ＝３１.３)。高いレベルの発現はまた、正常組織試料での発現と比べた場合このパネル上の全セルラインでも見られる。この分布は、推定ＭＡＧＥドメインタンパク質としてのこのタンパク質の同定結果と一致している。ＭＡＧＥファミリー黒色腫抗原コード化遺伝子の構成員は、広く多様な腫瘍で発現されることが報告されている(Kirkin、Cancer Invest ２００２、２０(２)：２２２−３６)。すなわち、この遺伝子の発現は、癌のマーカーとして使用され得る。さらに、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、癌の処置において有用であり得る。
【０６６６】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において低いが顕著なレベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６６７】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１２６
ＣＧ９７４２０３−０１遺伝子の非常に高度の発現は慢性活性化Ｔｈ２細胞において検出される(ＣＴ＝３０.６)。さらに、この遺伝子はまた、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において中〜低レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織の構成員が含まれる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。さらに、ＭＡＧＥファミリーの構成員は、自己免疫疾患に関与し得る(McCurdy DK、Mol Genet Metab １９９８年１月、６３(１)：３−１３)。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０６６８】
Ｐ．ＣＧ９７４３０−０１：コラーゲンおよびスカベンジャー受容体ドメイン
表ＰＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１０８を用いて、遺伝子ＣＧ９７４３０−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＰＢおよびＰＣに示す。
【０６６９】
【表２７５】

【０６７０】
【表２７６】

【０６７１】
表ＰＢの続き
【表２７７】

【０６７２】
【表２７８】

【０６７３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１０８
ＣＧ９７４３０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、肺癌セルラインＮＣＩ−Ｈ４６０で検出される(ＣＴ＝２７.７)。さらに、この遺伝子の高い発現はまた、乳癌、黒色腫、前立腺癌、２種の肺癌およびＣＮＳ癌セルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌についての診断マーカーとして使用され得、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、小分子または抗体の使用を通し、これらの癌の処置において有用であり得る。
【０６７４】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０６７５】
ＣＧ９７４３０−０１遺伝子は、ウシマクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびIIと類似したスカベンジャー受容体タンパク質をコードする。遺伝子操作が加えられたマウス系統を用いた最近の試験は、ＳＲ−ＢＩ、すなわちスカベンジャー受容体群の一員が、ＨＤＬ代謝、ステロイド合成組織へのコレステロール輸送および胆汁コレステロール分泌の調節において重要な役割を演じることを示している。さらに、ＳＲ−ＢＩは、アテローム性動脈硬化症の発現に対して防御し、正常な雌性生殖能力に必要とされる(Trigatti BおよびRigotti A.、２０００、Int J Tissue React ２２(２−３)：２９−３７、PMID：１０９３７３５２)。したがって、この試験と相関させると、この遺伝子によりコードされるスカベンジャー受容体タンパク質は、ＨＤＬ代謝においてある一定の役割を演じ得、すなわち、アテローム性動脈硬化心血管疾患の阻止および／または処置用の新規標的を表し得る。
【０６７６】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ４１０８
ＣＧ９７４３０−０１遺伝子は、このパネルにおける試料では低レベルで発現され、非常に高度の発現は正常腸試料で見られる(ＣＴ＝３２.１９)。それはまた、黒色腫試料およびこのパネル上の腎臓癌の単一試料で発現されている(ＣＴ＝３２〜３３)。すなわち、この遺伝子の発現は、黒色腫細胞についての診断マーカーとして、そして正常な腸または腎臓と腸または腎臓癌を区別するのに使用され得る。小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体を用いることによるこの遺伝子の治療的モジュレーションは、黒色腫、腎臓または腸癌の処置に有益なものであり得る。
【０６７７】
Ｑ．ＣＧ９７４４０−０１:ＣＵＢドメイン含有
表ＱＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１０９を用いて遺伝子ＣＧ９７４４０−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＱＢおよびＱＣに示す。
【０６７８】
【表２７９】

【０６７９】
【表２８０】

【０６８０】
表ＱＢの続き
【表２８１】

【０６８１】
【表２８２】

【０６８２】
表ＱＣの続き
【表２８３】

【０６８３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１０９
ＣＧ９７４４０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、脳癌セルラインで見られる(ＣＴ＝２５.９)。高いレベルの発現はまた、腸、胃、肺、肝臓、胸部、卵巣癌および黒色腫に由来する試料を含むこのパネルにおけるセルラインの多くで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、癌マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の発現または機能の治療的モジュレーションは、癌の処置において有用であり得る。
【０６８４】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人および胎児骨格筋、心臓、および肝臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６８５】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６８６】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１０９
ＣＧ９７４４０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、未処理肺微小血管内皮細胞で見られる(ＣＴ＝２９.１)。さらに、顕著なレベルの発現は、肺および皮膚由来の内皮および線維芽細胞から誘導された処理および未処理試料のクラスターで見られる。すなわち、この遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、喘息、気腫、アレルギーおよび乾癬を含む、肺および皮膚の炎症および病的状態に苦しむ患者における徴候を低減化または排除し得る。
【０６８７】
Ｒ．ＣＧ９７４５１−０１：グリシン−濃厚膜タンパク質
表ＲＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１１０を用いて、遺伝子ＣＧ９７４５１−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＲＢおよびＲＣに示す。
【０６８８】
【表２８４】

【０６８９】
【表２８５】

【０６９０】
表ＲＢの続き
【表２８６】

【０６９１】
【表２８７】

【０６９２】
表ＲＣの続き
【表２８８】

【０６９３】
一般的スクリーニングパネル１.４要約：Ａｇ４１１０
ＣＧ９７４５１−０１遺伝子の発現は、脳癌セルライン由来の試料に制限されている(ＣＴ＝３１.１)。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料およびこのパネル上の他の試料間の区別に、および脳癌存在検出用マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、脳癌の処置において有効であり得る。
【０６９４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１１０
ＣＧ９７４５１−０１遺伝子は、腎臓において検出可能レベルで発現されるだけである(ＣＴ＝３２.５)。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料およびこのパネル上の他の試料間の識別に、および腎臓組織マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の治療的モジュレーションは、腎臓機能を調節し、狼瘡および糸球体腎炎を含む、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患の処置において重要であり得る。
【０６９５】
Ｓ．ＣＧ９７８５２−０１：ガレクチン−９様１
表ＳＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１８３を用いて、遺伝子ＣＧ９７８５２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＳＢ、ＳＣ、ＳＤおよびＳＥに示す。
【０６９６】
【表２８９】

【０６９７】
【表２９０】

【０６９８】
表ＳＢの続き
【表２９１】

【０６９９】
【表２９２】

【０７００】
【表２９３】

【０７０１】
表ＳＤの続き
【表２９４】

【０７０２】
【表２９５】

【０７０３】
表ＳＥの続き
【表２９６】

【０７０４】
ＡＩ包括的パネルｖ１.０要約：Ａｇ４１８３
ＣＧ９７８５２−０１遺伝子の非常に高度の発現は、潰瘍性大腸炎患者から誘導された試料で見られる(ＣＴ＝３１.３)。低いが顕著なレベルの発現はまた、気腫、クローン病および慢性関節リウマチ患者から誘導された試料でも見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、潰瘍性大腸炎のマーカーとして使用され得る。この遺伝子は、ガレクチン９に相同的であるタンパク質をコードする。ガレクチンは、免疫応答においてある一定の役割を演じ得る炭水化物結合タンパク質である。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、気腫、クローン病、慢性関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎に苦しむ患者における徴候を低減化または排除し得る。。
【０７０５】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４１２６
このパネルは、アルツハイマー病においてＣＧ９７８５２−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳における低いが顕著なレベルでのこの遺伝子の発現を立証している。この遺伝子は、推定ガレクチンをコード化する。レクチンファミリーの構成員は、軸策成長、神経移動、シナプス形成および髄鞘形成を含む、脳での細胞接着および細胞認識機構並びに細胞シグナル伝達において機能することが示されている。神経膠ガレクチンイソ型、ガレクチン３は、細胞マトリックス相互作用および新規形成軸策の安定化に関与する(Mahoney,SA.Neuroscience２０００、１０１(１)：１４１−５５)。脳におけるこのガレクチン相同体の発現は、それが神経機能にも寄与し得ることを示唆している。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置において有用であり得る。
【０７０６】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１８３
ＣＧ９７８５２−０１遺伝子、ガレクチン相同体は、腸癌セルラインで非常に非常に高度のに発現される(ＣＴ＝２８.５)。さらに、膵臓、胃、胸部および卵巣癌からの癌セルラインは、この遺伝子の顕著な発現を示す。ガレクチン−９の発現は、腸癌セルラインに随伴している(Lahm H. J Cancer Res Clin Oncol ２００１、１２７(６)：３７５−８６)。すなわち、この遺伝子の発現は、腸、膵臓、胃、胸部および卵巣癌のマーカーとして使用され得る。ガレクチンファミリーの構成員は、細胞成長調節および接着監視に関与する。したがって、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、癌の処置において有効であり得る。
【０７０７】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１８３
同じプローブおよびプライマーを用いた２実験は、極めて一致した結果をもたらし、ＣＧ９７８５２−０１遺伝子の非常に高度の発現は休止ＮＫ細胞において検出される(ＣＴ＝２９)。これらの細胞におけるこの顕著な発現は、この遺伝子が、これらの細胞の免疫調節機能および自己免疫疾患の阻止に関わり得ることを示唆している。この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、多発性硬化症、狼瘡およびＮＫ細胞機能と関連した他の疾患の処置に有用であり得る(Baxter AG、Autoimmuity ２００２年２月、３５(１)：１−１４)。さらに、この遺伝子産物の調節は、異種移植に対する応答で見られるＮＫ仲介応答の縮小において有用であり得る。
【０７０８】
中〜定レベルの発現はまた、このパネルにおける他の試料でも見られ、処理および未処理ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、ＬＡＫ細胞、慢性活性化Ｔｈ２細胞、ＴＨＦ−アルファおよびＩＬ−１ベータ活性化小気道および気管支上皮および正常腎臓、胸腺および腸のクラスターが含まれる。すなわち、この遺伝子産物は、肺炎症疾患、例えばＴｈ２細胞が仲介する喘息および慢性閉塞性肺疾患を含むこれらの細胞型を伴う炎症プロセスに関与し得る。したがって、この遺伝子によりコードされたタンパク質に対して設計された治療薬は、肺炎症性疾患の処置に有用であり得る。
【０７０９】
この遺伝子は、ガレクチン９との相同性を伴うタンパク質、強力な好酸球化学誘引物質をコードする。したがって、この遺伝子産物の調節は、喘息の処置に有用であり得る。
【０７１０】
Ｔ．ＣＧ９９５７５−０１およびＣＧ９９５７５−０２：Ｔ細胞表面糖蛋白質ＣＤ１
表ＴＡおよびＴＢに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１７６およびＡｇ４８０４を用いて、完全長物理的クローンＣＧ９９５７５−０１および変異体ＣＧ９９５７５−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＴＣに示す。プローブおよびプライマーセットＡｇ４８０４は変異体ＣＧ９９５７５−０２にのみ対応するものとする。
【０７１１】
【表２９７】

【０７１２】
【表２９８】

【０７１３】
【表２９９】

【０７１４】
表ＴＣの続き
【表３００】

【０７１５】
表ＴＣの続き
【表３０１】

【０７１６】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１７６
同じプローブおよびプライマーを用いた２実験は、極めて一致した結果をもたらし、ＣＧ９９５７５−０１遺伝子の非常に高度の発現は抗ＣＤ４０処理樹状細胞において検出される(ＣＴ＝２８〜３２)。この遺伝子の中〜低発現は、活性化一次および二次Ｔｈ１細胞、ＣＤ４リンパ球、ＬＡＫ細胞、休止ＰＢＭＣ細胞、好酸球、樹状細胞、ＩＬII処理ＨＵＶＥＣ細胞、休止単球、胸腺、腸、肺および腎臓で見られる。したがって、この遺伝子の治療的モジュレーションは、これらの細胞型を伴う自己免疫および炎症性疾患、例えばエリテマトーデス、喘息、気腫、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症および乾癬の処置において有益であり得る。Ａｇ４８０４：異なるプローブおよびプライマーセットによるこの実験は、上記結果と完全に一致している。このプローブおよびプライマーセットは、ＣＧ９９５７５−０２遺伝子に特有であるものとする。
【０７１７】
Ｕ．ＣＧ９９６０８−１：糖輸送体
表ＵＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１５０を用いて、遺伝子ＣＧ９９６０８−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＵＢ、ＵＣ、ＵＤおよびＵＥに示す。
【０７１８】
【表３０２】

【０７１９】
【表３０３】

【０７２０】
【表３０４】

【０７２１】
表ＵＣの続き
【表３０５】

【０７２２】
【表３０６】

【０７２３】
表ＵＤの続き
【表３０７】

【０７２４】
【表３０８】

【０７２５】
Ａｇ４１５０
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３９３１
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９９６０８−０１遺伝子の発現を確認している。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質において僅かにアップレギュレーションされていることが見出された。この受容体の遮断は、この病気の処置に有用であり、神経細胞死を減少させ得る。
【０７２６】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１５０
ＣＧ９９６０８−０１遺伝子の非常に高度の発現は、腸癌ＣａＣｏ−２セルラインで検出される(ＣＴ＝２４.５)。この遺伝子は、黒色腫、卵巣、胸部、前立腺、扁平上皮癌、肺、腎臓、腸、ＣＮＳおよび膵臓癌セルラインのクラスターにおいて顕著なレベルで検出される。すなわち、小分子または抗体を通したこの遺伝子の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０７２７】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０７２８】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む被験中枢神経系の全領域において高レベルで発現される。したがって、この遺伝子は、中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病においてある一定の役割を演じ得る。
【０７２９】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１５０
ＣＧ９９６０８−０１遺伝子の非常に高度の発現は、ＩＬ−９処理ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において検出される(ＣＴ＝２８)。この遺伝子は、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において高〜中レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織の構成員が含まれる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。興味深いことに、この遺伝子の発現は、活性化一次および二次Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１細胞で刺激される。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０７３０】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ４１５０
ＣＧ９９６０８−０１遺伝子の非常に高度の発現は腎臓癌試料で検出される(ＣＴ＝２８)、顕著な発現はまた黒色腫、肺、扁平上皮癌、膀胱、前立腺および腸癌で見られる。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織におけるより癌において高くなっている。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するマーカーであり得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有効であり得る。
【０７３１】
Ｖ．ＣＧ９９７３２−０２：マクロファージレクチン２
表ＶＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１９８を用いて、完全長物理的クローンＣＧ９９７３２−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＶＢおよびＶＣに示す。
【０７３２】
【表３０９】

【０７３３】
【表３１０】

【０７３４】
表ＶＢの続き
【表３１１】

【０７３５】
【表３１２】

【０７３６】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１９８
ＣＧ９９７３２−０２遺伝子の非常に高度の発現は、腸プールで検出される(ＣＴ＝３１)。さらに、この遺伝子の顕著な発現は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管を含む、代謝または内分泌機能をもつ組織で見られる。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置において有用であることが判る。
【０７３７】
興味深いことに、この遺伝子の中度発現はまた、腸癌組織で検出される(ＣＴ＝３２)。したがって、この遺伝子の治療的モジュレーションは、腸癌の処置に有用であり得る。
【０７３８】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ４１９８
ＣＧ９９７３２−０２遺伝子の非常に高度の発現は、転移性黒色腫試料で検出される(ＣＴ＝３１.４)。さらに、この遺伝子の低〜中度発現はまた、腸、肺、前立腺および腎臓を含む全癌試料で見られる。したがって、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０７３９】
Ｗ．ＣＧ９９７６７−０１:Ｉ型膜タンパク質
表ＷＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４２４８を用いて遺伝子ＣＧ９９７６７−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＷＢに示す。
【０７４０】
【表３１３】

【０７４１】
【表３１４】

【０７４２】
表ＷＢの続き
【表３１５】

【０７４３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４２４８
ＣＧ９９７６７−０１遺伝子の発現は、骨格筋試料で排他的に検出される(ＣＴ＝３３.５)。したがって、この遺伝子の発現は、この試料をこのパネルにおける他の試料と区別するのに使用され得る。さらに、小分子標的または抗体を通したこの遺伝子の治療的モジュレーションは、筋骨格疾患および／または障害の処置において有益であり得る。
【０７４４】
実施例D:NOVX核酸配列での単一ヌクレオチド多型性の同定
変異体配列がまた、この応用にふくまれる。変異体配列は、単一ヌクレオチド多型性(SNP)を含むことができる。SNPは、幾つかの例で、「cSNP」として言及され、SNPを含むヌクレオチド配列がcDNAとして起源することをいう。SNPは、いくつかのやり方で生じ得る。例えば、SNPは、多型性部位の1ヌクレオチドの、他との置換のためであり得る。そのような置換は、トランジションまたはトランスバージョンであることができる。SNPはまた、参照アリルからのヌクレオチドの欠失または挿入から生じることができる。この場合には、多型性部位は、１のアリルが他のアリルの特定のヌクレオチドについてギャップを有する１部位である。遺伝子ないに存在するSNPは、SNPの位置での遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化という結果となり得る。遺伝子内SNPはまた、サイレントであり得、このときSNPを含むコドンは、遺伝的コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする。遺伝子の領域外にまたは遺伝子内のイントロンに存在するSNPは、タンパク質の任意のアミノ酸配列に変化を生じないが、発現パターンの調節は変化し得る。例は、一時的発現、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、および転写伝令の安定性を含む。
【０７４５】
エキソンリンキングプロセスによって生産されるSeqCallingアセンブリは、選択され、以下の基準を使用して、伸長させた。すべてまたは一部の当初または伸長配列への９８％同一性を有する領域を有するゲノムクローンは、クエリーヒトゲノムデータベースへの関連配列を使用して、ＢＬＡＳＴＮサーチによって同定した。得られるゲノムクローンは、さらなる分析のために選択され、というのは、この同一性は、これらのクローンがSeqCallngアセンブリについてのゲノム遺伝子座を含むことを指摘するからである。これらの配列を推定コード領域について並びに既知DNAおよびタンパク質配列への類似性について分析した。これらの分析のために使用されたプログラムは、Grail、Genscan,BLAST,HMMER,FASTA,Hybridおよび他の関連プログラムを含む。
【０７４６】
いくつかの追加的ゲノム領域はまた、同定され、というのはそれらの領域ヘのSeqCallingアセンブリマップを選択したからである。そのようなSeqCalling配列は、相同性またはエキソン予測によって定義された領域とオーバーラップした。これらがまた含まれ得、というのは、フラグメントの位置は、本来予測配列中に含まれた、類似性またはエキソン予測によって同定された、ゲノム領域の近傍であったからである。そのように同定された配列は手動でアセンブリし、それからCuraGenコーポレーションのヒトSeqCallingデータベースから取られる１または２以上の追加的配列を使用して伸長され得た。包含に好適なSeqCallingフラグメントを、CuraTools（登録商標）プログラムSeqExtendによって、または分析したゲノムクローンの適当な領域へのSeqCallingフラグメントマッピングを同定することによって同定した。
【０７４７】
前記手法によって定義した領域を次いで、手動で統合し、そして例えば本来のフラグメント中のミスコール性塩基から、または予測エキソン結合、EST位置および配列類似性の領域間の食い違いから生じられ得る明白な矛盾について更正し、ここに開示の最終配列を誘導した。必要なときに、SwqCallingアセンブリおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスは反復し、完全長配列を誘導した(Alderborn et al.,Determination of Single nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing.Genome Research.10(8)1249-1265,2000)。
【０７４８】
変異体は、個別に報告するが、すべてのまたは選択サブセットの変異体の任意の組み合わせはまた、本発明の企図NOVX実施態様として包含される。
【０７４９】
ＮＯＶ１ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１の２多型性変異体を同定し、表２８Ａに示す。
【表３１６】

【０７５０】
ＮＯＶ１の１多型性変異体を同定し、表２８Ｂに示す。
【表３１７】

【０７５１】
ＮＯＶ３ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ３の２多型性変異体を同定し、表２８Ｃに示す。
【表３１８】

【０７５２】
ＮＯＶ４ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ４の２多型性変異体を同定し、表２８Ｄに示す。
【表３１９】

【０７５３】
ＮＯＶ６ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ６の６多型性変異体を同定し、表２８Ｅに示す。
【表３２０】

【０７５４】
ＮＯＶ７ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ７の２多型性変異体を同定し、表２８Ｆに示す。
【表３２１】

【０７５５】
ＮＯＶ８ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ８の３多型性変異体を同定し、表２８Ｇに示す。
【表３２２】

【０７５６】
ＮＯＶ１０ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１０の１多型性変異体を同定し、表２８Ｈに示す。
【表３２３】

【０７５７】
ＮＯＶ１１ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１１の４多型性変異体を同定し、表２８Ｉに示す。
【表３２４】

【０７５８】
ＮＯＶ１２ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１２の５多型性変異体を同定し、表２８Ｊに示す。
【表３２５】

【０７５９】
ＮＯＶ１５ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１５の２多型性変異体を同定し、表２８Ｋに示す。
【表３２６】

【０７６０】
ＮＯＶ１９ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１９の１０多型性変異体を同定し、表２８Ｌに示す。
【表３２７】

【０７６１】
ＮＯＶ２３ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２３の１多型性変異体を同定し、表２８Ｍに示す。
【表３２８】

【０７６２】
ＮＯＶ２５ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２５の１多型性変異体を同定し、表２８Ｎに示す。
【表３２９】

【０７６３】
ＮＯＶ２６ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２６の９多型性変異体を同定し、表２８Ｏに示す。
【表３３０】

【０７６４】
ＮＯＶ２７ ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２７の１多型性変異体を同定し、表２８Ｐに示す。
【表３３１】

【０７６５】
（他の実施態様）
特定の実施態様は、詳細にここに開示されるが、これは例示のみの目的のためになされ、そして続く添付クレームの範囲について限定を意図しない。特に、発明者によって種々の置換、変更および修飾が本発明に、クレームによって定義の本発明の精神および範囲から離れることなくなしうることが企図される。核酸出発材料、所望のクローン、またはライブラリー型の選択は、ここに記載の実施態様の知識を有する当業者の日常的事項であると信じられる。提示クレームは、ここに開示の発明の代表である。その他、非クレーム発明はまた企図される。出願人は、以下のクレームのそのような発明を追及する権利を保存する。[0001]
(Technical field)
The present invention relates to novel antibodies that immunospecifically bind to an antigenic polypeptide where the polypeptide has characteristic properties relating to biochemical or physiological responses in cells, tissues, organs or organisms. A novel polypeptide is the gene product of a novel gene or a specific biologically active fragment or derivative thereof. Methods of using antibodies include approaches for polypeptide diagnostic or prognostic assays, as well as methods of treating various pathological conditions.
[0002]
(Background technology)
Eukaryotic cells feature biochemical and physiological methods that are delicately balanced to achieve cell maintenance and proliferation under normal conditions. When such cells are components of multicellular organisms such as vertebrates, or more particularly organisms such as mammals, the regulation of biochemical and physiological methods involves sophisticated signaling pathways. . Often, such signaling pathways involve extracellular signaling proteins, cellular receptors that bind to signaling proteins, and signaling components that are localized within the cell.
[0003]
Signal transduction proteins can be classified as endocrine effectors, paracrine effectors or autocrine effectors. Endocrine effectors are signaling molecules that are secreted into the circulatory system by a particular organ, which is then transported to a remote target organ or tissue. Target cells contain receptors for endocrine effectors, and when the endocrine effectors bind, a signaling cascade is induced. Paracrine effectors involve secretory cells and recipient cells in close proximity to each other, for example, two different classes of cells within the same tissue or organ. The first class of cells secretes the paracrine effector, which then reaches the second class of cells, for example by diffusion through the extracellular fluid. The second class of cells contains receptors for paracrine effectors, and effector binding induces a signaling cascade that results in a corresponding biochemical or physiological effect. Autocrine effectors have a high degree of similarity to paracrine effectors, except that the same type of cells that secrete autocrine effectors also contain receptors. Thus, an autocrine effector binds to a receptor on the same cell or on the same adjacent cell. The binding process then causes a characteristic biochemical or physiological effect.
[0004]
Signal transduction processes for cells and tissues include, but are not limited to, induction of cell or tissue proliferation, inhibition of growth or proliferation, induction of cell or tissue differentiation or maturation, and cell or tissue differentiation or maturation. Can cause a variety of effects including inhibition.
[0005]
Many pathologies involve dysregulation of the expression of important effector proteins. In certain classes of conditions, dysregulation manifests as increased or excessive protein effector synthesis and secretion. In the clinical setting, a subject may be suspected of suffering from an abnormality caused by increased or excessive levels of protein effector of interest.
[0006]
An antibody is a multi-chain protein that specifically binds to a specific antigen and binds weakly or not at all to substances that are not considered cognate antigens. Antibodies consist of two short chains, referred to as L chains, and two long chains, referred to as H chains. These chains are composed of immunoglobulin regions, which are generally divided into two classes: one variable region per chain, one constant region in the L chain, and one constant region in the H chain. Has three or more stationary regions. The antigen-specific portion of the immunoglobulin molecule is present in the variable region, and one L chain and one H chain variable region associate with each other to form an antigen-binding portion. Antibodies that immunospecifically bind to a cognate or target antigen bind with high affinity. They are therefore useful for specifically assaying for the presence of an antigen in a sample. In addition, they have the potential to inactivate antigen activity.
[0007]
Therefore, there is a need to assay the level of protein effector of interest in a biological sample from such a subject and compare that level to that characteristic of a non-pathological condition. There is a particular need for such assays based on the use of antibodies that immunospecifically bind to an antigen. Furthermore, there is a need to inhibit the activity of protein effectors in cases where the pathology is caused by increased or excessive levels of effectors based on the use of antibodies that immunospecifically bind to the effectors. Thus, there is a need for antibodies as production products. There is a further need for methods of treatment of pathologies caused by increased or excessive levels of protein effectors of interest based on administering antibodies to a subject.
[0008]
(Summary of the Invention)
The present invention is based in part on the discovery of nucleic acid sequences that encode novel polypeptides. The novel nucleic acids and polypeptides are referred to herein as NOVX or NOV1, NOV1, NOV2, NOV3, etc., nucleic acids and polypeptides. These nucleic acids and polypeptides, and derivatives, homologues, analogs and fragments thereof are hereinafter collectively referred to as “NOVX” nucleic acid or polypeptide sequences.
[0009]
In one aspect, the invention provides an isolated peptide comprising a mature form of NOVX amino acid. A polypeptide is, for example, a NOVX amino acid sequence, or any amino acid specified in a selected sequence, NOVX that has been changed to a different amino acid, provided that less than 15% of the amino acid residues are changed in the sequence. It may be a variant of the amino acid sequence. The invention also includes fragments of any NOVX polypeptide. In another aspect, the invention also includes an isolated nucleic acid encoding a NOVX polypeptide, or a fragment, homolog, analog or derivative thereof.
[0010]
The invention also includes NOVX polypeptides that are naturally occurring variants of the NOVX sequence. In one embodiment, the variant comprises an amino acid sequence that is a translation of a nucleic acid sequence that differs from the NOVX nucleic acid sequence by one nucleotide. In another embodiment, the NOVX polypeptide is a variant polypeptide described therein, wherein any amino acid specified in the selected sequence has been altered to produce a conservative substitution.
[0011]
In another aspect, the invention provides a sample; introducing the sample into an antibody that immunospecifically binds to the polypeptide; and measuring the presence or amount of antibody bound to the NOVX polypeptide; Measuring the presence or amount of NOVX polypeptide in a sample by: providing a method for measuring the presence or amount of NOVX polypeptide in a sample.
[0012]
In yet another aspect, the invention includes a method of determining the presence or predisposition of a disease associated with an altered level of NOVX polypeptide in a mammalian subject, which is derived from the first mammalian subject. Measuring the expression level of the polypeptide in the sample; and determining the amount of the polypeptide in the first step sample in a control sample from a second mammalian subject known not to have the disease or predisposition Compare with the amount of polypeptide present. A change in the expression level of the polypeptide in the first subject relative to a control sample indicates the presence or predisposition of the disease.
[0013]
In another embodiment, the invention includes a pharmaceutical composition comprising a therapeutically or prophylactically effective amount of a pharmaceutical composition and a pharmaceutically acceptable carrier. The therapeutic agent may be, for example, a NOVA nucleic acid, a NOVA polypeptide, or an antibody specific for a NOVA polypeptide. In a further aspect, the present invention comprises a therapeutically or prophylactically effective amount of the pharmaceutical composition in one or more containers.
[0014]
In yet another aspect, the invention provides the use of a therapeutic agent in the manufacture of a medicament for treating a syndrome associated with a human disease associated with a NOVX polypeptide.
[0015]
In a further aspect, the invention provides for the activity of a NOVX polypeptide by contacting a cell sample expressing the NOVX polypeptide with an antibody that binds to the NOVX polypeptide in an amount sufficient to modulate the activity of the polypeptide. Provide a way to adjust.
[0016]
The invention also includes an isolated nucleic acid encoding a NOVX polypeptide, or a fragment, homologue, analog or derivative thereof. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of a naturally occurring allelic nucleic acid variant. In another embodiment, the nucleic acid encodes a variant polypeptide, wherein the variant polypeptide has a polypeptide sequence of a naturally occurring polypeptide variant. In another embodiment, the nucleic acid molecule differs from the NOVX nucleic acid sequence by one nucleotide. In one embodiment, the NOVX nucleic acid molecule is exactly the complement of a nucleotide sequence or nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46). Hybridizes under stringent conditions. In one embodiment, the invention provides a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of an allelic nucleic acid variant in which the nucleic acid occurs in nature.
[0017]
The invention also includes vectors containing one or more nucleic acids described herein, and cells containing the vectors or nucleic acids described herein. The present invention is also directed to host cells transformed with a vector comprising any of the nucleic acid molecules described above.
[0018]
In yet another embodiment, the present invention measures the presence or amount of nucleic acid molecules in a sample by contacting the sample with a probe that binds to NOVX nucleic acid and measuring the amount of probe that binds to NOVX nucleic acid. Provide a method. For example, a NOVX nucleic acid can be a marker for a cell or tissue type, such as a cancerous cell or tissue type.
[0019]
In a further aspect, the present invention provides a method for determining the presence or predisposition to a disease associated with an altered level of a nucleic acid molecule in a first mammalian subject, wherein the first compared to a control sample. Changes in the level of nucleic acid in the subject indicate the presence or predisposition to the disease.
[0020]
The invention further provides an antibody that immunospecifically binds to a NOVX polypeptide. The NOVX antibody may be a monoclonal, humanized, or fully human antibody. Preferably, the antibody is 1 × 10 against the antibody of NOVX polypeptide.^-9Has a dissociation constant of less than M. More preferably, the NOVX antibody neutralizes the activity of the NOVX polypeptide.
[0021]
In a further aspect, the present invention provides the use of a therapeutic agent in the manufacture of a medicament for treating a syndrome associated with a human disease associated with a NOVX polypeptide. Preferably, the therapeutic agent is a NOVX antibody.
[0022]
In yet a further aspect, the invention provides a method of treating or preventing a NOVX-related disease, a method of treating a condition in a mammal, by administering a NOVX antibody to a subject in an amount sufficient to treat or prevent the disease, And methods for treating or preventing lesions associated with polypeptides.
[0023]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative and not intended to be limiting.
Other features and advantages of the invention will be apparent from the following invention disclosure and claims.
[0024]
(Disclosure of the Invention)
The present invention provides novel nucleotides and polypeptides encoded thereby. The present invention includes novel nucleic acid sequences, their encoded polypeptides, antibodies, and other related compounds. As used herein, sequences are collectively referred to as “NOVX nucleic acids” or “NOVX polynucleotides” and the corresponding encoded polypeptides are referred to as “NOVX polypeptides” or “NOVX proteins”. Unless otherwise stated, “NOVX” is meant to refer to any novel sequence disclosed herein. Table 1 summarizes the NOVX nucleic acids and their encoded polypeptides.
[0025]
Table 1: NOVX polynucleotide and polypeptide sequences and corresponding SEQ ID NO
[Table 1]

[Table 2]

[0026]
Table 1 shows the homology of NOVX polypeptides with known protein families. Thus, nucleic acids, polynucleotides, antibodies and related compounds according to the present invention corresponding to NOVX identified in the first column of Table 1 are, for example, lesions associated with known protein families identified in the fifth column of Table 1. And useful in therapeutic and diagnostic applications related to disease.
[0027]
NOVX nucleic acids and their encoded polypeptides are useful in a variety of applications and situations. Various NOVX nucleic acids and polypeptides according to the present invention are useful as novel members of a protein family according to the existence of domains and sequence relationships with said proteins. In addition, NOVX nucleic acids and polypeptides can be used to identify proteins that are members of the family to which the NOVX polypeptide belongs.
[0028]
Consistent with other known members of the protein family identified in column 5 of Table 1, the NOVX polypeptides of the invention exhibit homology to and characterize other members of such protein families. Contains a domain that Details of sequence relatedness analysis and domain analysis for each NOVX are shown in Example A.
[0029]
NOVX nucleic acids and polypeptides can be used to screen for molecules that inhibit or promote NOVX activity or function. In particular, the nucleic acids and polypeptides according to the invention can be used as targets for the identification of small molecules that modulate or inhibit diseases associated with the protein families listed in Table 1.
[0030]
NOVX nucleic acids and polypeptides are also useful for detecting specific cell types. Details of expression analysis for each NOVX are shown in Example C. Accordingly, NOVX nucleic acids, polypeptides, antibodies and related compounds according to the present invention can be used in diagnostic and therapeutic applications in the detection of various diseases having different expression in normal tissue versus diseased tissue, eg, detection of various cancers. Have
Additional uses for NOVX nucleic acids and polypeptides according to the present invention are disclosed herein.
[0031]
NOVX clone
NOVX nucleic acids and their encoded polypeptides are useful in a variety of applications and situations. Various NOVX nucleic acids and polypeptides according to the present invention are useful as novel members of the protein family according to the presence of domains and sequences associated with the protein. In addition, NOVX nucleic acids and polypeptides can be used to identify proteins that are members of the family to which the NOVX polypeptide belongs.
[0032]
The NOVX genes and their corresponding encoded proteins are useful for preventing, treating or alleviating medical conditions, eg, by protein therapy or gene therapy. The pathology can be diagnosed by measuring the amount of the new protein in the sample or measuring the presence of the mutation in the new gene. Based on the tissues in which the NOVX gene is most highly expressed, the specific use for each NOVX gene will be described. Use includes developing products for diagnosing or treating various diseases and disorders.
[0033]
The NOVX nucleic acids and proteins of the present invention are useful as potential diagnostic and therapeutic applications and research tools. These include serving as specific or selective nucleic acids, or proteins, diagnostic markers and / or prognostic markers. Here, the presence or amount of nucleic acids or proteins, as well as potential therapeutic applications such as: (i) protein therapeutics, (ii) small molecule targets, (iii) antibody targets (therapeutic, Diagnostic, drug targeting / cytotoxic antibodies), (iv) nucleic acids useful for gene therapy (gene delivery / gene surgery), and (v) compositions that promote tissue regeneration in vitro and in vivo, (vi) Biological defense weapon.
[0034]
In one particular embodiment, the invention provides a mature form having an amino acid sequence selected from the group consisting of: (a) SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46); (b) SEQ ID NO: 2n ( n is an integer from 1 to 46), and a mature variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of 15% of amino acid residues in the mature sequence (C) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46); (d) SEQ ID NO: 2n ( a variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of n is an integer of 1 to 46, provided that any amino acid identified by the selected sequence comprises 15% or less of the amino acid residues in the sequence Change to a different amino acid on condition that it is subject to change Is; to and e) a) not comprising an isolated polypeptide comprising any of the fragments, the amino acid sequence selected from the group consisting of d).
[0035]
In another particular embodiment, the present invention provides a mature form having an amino acid sequence given (a) SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46); (b) SEQ ID NO: 2n (n is A mature variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of 1 to 46, wherein any amino acid in the mature form of the selected sequence is an amino acid residue in the mature sequence (C) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46); d) a variant of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46), wherein the amino acid identified in the selected sequence is an amino acid residue in the sequence Different nets on condition that 15% or less is subject to change A variant that has been changed to an acid; and (e) at least a portion of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46), or a selected sequence A fragment of a nucleic acid encoding any variant of a polypeptide, wherein any amino acid of is altered to a different amino acid provided that less than 10% of the amino acid residues in the sequence are altered; and (f) a nucleic acid molecule An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
[0036]
In yet another particular embodiment, the present invention includes an isolated nucleic acid molecule. Wherein the nucleic acid molecule is (a) a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer of 1 to 46); (b) SEQ ID NO: 2n-1 (n is 1 to 46) A condition wherein one or more nucleotides in a nucleotide sequence selected from the group consisting of: is selected from the group consisting of selected sequences, and no more than 15% of the nucleotides are altered (C) a nucleic acid fragment having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46); and (d) SEQ ID NO: 2n Whether one or more nucleotides are selected from the group consisting of selected sequences in a nucleotide sequence selected from the group consisting of -1 (n is an integer from 1 to 46) Comprises a nucleotide sequence selected nucleic acid fragment that is changed to a different nucleotide in the condition that more than 15% of the nucleotides undergo changes, from the group consisting of.
[0037]
NOVX nucleic acids and polypeptides
One aspect of the invention pertains to isolated nucleic acid molecules that encode NOVX polypeptides or biologically active portions thereof. The invention also includes nucleic acid fragments sufficient for use as hybridization probes to identify nucleic acids encoding NOVX (eg, of NOVX mRNA), and PCR for amplification and / or mutation of NOVX nucleic acid molecules. Includes fragments for use as primers. As used herein, the term “nucleic acid molecule” refers to a DNA molecule (eg, cDNA or genomic DNA), an RNA molecule (eg, mRNA), a DNA analog or RNA analog produced using nucleotide analogs, And their derivatives, fragments and homologues. The nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but preferably is double-stranded DNA.
[0038]
The NOVX nucleic acid can encode a mature NOVX polypeptide. As used herein, a “mature” form of a polypeptide or protein disclosed in the present invention is a naturally occurring polypeptide, or precursor form, or the product of a proprotein. Naturally occurring polypeptides, precursors or proproteins include, by way of non-limiting example, full-length gene products encoded by the corresponding genes. Alternatively, it may be defined as a polypeptide, precursor or proprotein encoded by the ORFs described herein. A “mature” form of a product also occurs, as a non-limiting example, as a result of one or more naturally occurring processing steps that can occur in a cell (host cell) that produces a gene product. Examples of such processing steps that lead to a “mature” form of a polypeptide or protein include cleavage of the N-terminal methionine residue encoded by the initiation codon of the ORF, or proteolytic cleavage of the signal peptide or leader sequence. Thus, a mature form resulting from a precursor polypeptide or protein having residues 1-N where residue 1 is the N-terminal methionine has residues 2-N remaining after removal of the N-terminal methionine. Alternatively, the mature form resulting from a precursor polypeptide or protein having residues 1-N that cleaves the N-terminal signal sequence from residues 1-residue M is derived from the remaining residues M + 1-residue N. Has a residue. Further, as used herein, a “mature” form of a polypeptide or protein may result from a post-translational modification step other than a proteolytic cleavage event. Such further methods include, but are not limited to glycosylation, myristoylation, or phosphorylation. In general, a mature polypeptide or protein can be produced by manipulation of only one of these methods, or any combination thereof.
[0039]
As used herein, the term “probe” preferably refers to a variable length nucleic acid sequence that is at least about 10 nucleotides (nt) to 100 nt in length, or depending on the particular use, for example, as long as 6,000 nt. Point to. Probes can be used for the detection of identical, similar or complementary nucleic acid sequences. Longer probes are generally obtained from natural or recombinant sources. Longer probes are slower to hybridize than oligomer probes with higher specificity and shorter lengths. Probes can be single-stranded or double-stranded and can be designed to have specificity in PCR, membrane-based hybridization techniques, or ELISA-like techniques.
[0040]
As used herein, the term “isolated” nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid. Preferably, an “isolated” nucleic acid does not have sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (ie, sequences located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid). For example, in various embodiments, an isolated NOVX nucleic acid molecule is about 5 kb, 4 kb naturally adjacent to the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell / tissue from which the nucleic acid is derived (eg, brain, heart, liver, spleen, etc.). It may contain no more than 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0.1 kb nucleotide sequence. Furthermore, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, may be substantially free of other cellular material, or media, or chemical precursors or other chemicals.
[0041]
A nucleic acid molecule of the present invention, eg, a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46), or the complement of said nucleotide sequence, can be obtained using standard molecular biology techniques and Isolation may be accomplished using the sequence information provided herein. All or part of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46) is used as a hybridization probe, using standard hybridization and cloning techniques (eg, Sambrook, et al., ( eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons , New York, NY, 1993) can be used to isolate NOVX molecules.
[0042]
The nucleic acids of the invention can be amplified with appropriate oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques using cDNA, mRNA, or alternatively genomic DNA as a template. The nucleic acid so amplified can be cloned into an appropriate vector and characterized by DNA sequence analysis. In addition, oligonucleotides corresponding to NOVX nucleotide sequences can be prepared by standard synthetic techniques, such as the use of automated DNA synthesizers.
[0043]
The term “oligonucleotide” as used herein refers to a series of linking nucleotide residues where the oligonucleotide has a sufficient number of nucleotide bases to be used in a PCR reaction. Short oligonucleotide sequences can be based on or designed from genomic or cDNA sequences. Short oligonucleotide sequences are then used to amplify, confirm, or reveal the presence of identical, similar, or complementary DNA or RNA in a particular cell or tissue. The oligonucleotide comprises a p portion of a nucleic acid sequence that is about 10 nt, 50 nt, or 100 nt in length, preferably about 15 nt to 30 nt in length. In one embodiment of the invention, the oligonucleotide comprising a nucleic acid molecule of less than 100 nt in length is at least 6 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), or It further includes a complement. Oligonucleotides can be chemically synthesized and used as probes.
[0044]
In another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention comprises a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), or a portion of this nucleotide sequence (eg, NOVX polypeptide A nucleic acid molecule that is the complement of a fragment that can be used as a probe, primer, or fragment encoding a biologically active portion of A nucleic acid molecule that is complementary to a nucleotide sequence that represents SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) is a nucleotide sequence that represents SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). It is sufficiently complementary and can hydrogen bond with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46) with little or no mismatch. Thus, the nucleic acid molecule forms a stable duplex.
[0045]
As used herein, the term “complementary” refers to Watson-Crick or Hoogsteen base pairing between nucleotide units of a nucleic acid molecule, and the term “binding” refers to two polypeptides or compounds, or related polypeptides. Or means a physical or chemical interaction between compounds or combinations thereof. Binding includes ionic, non-ionic, van der Waals, hydrophobic interactions, and the like. The physical interaction can be direct or indirect. Indirect interactions may be through or due to the action of other polypeptides or compounds. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the action of another polypeptide or compound but instead takes place without other substantial chemical mediators.
[0046]
As provided herein, “fragments” are at least 6 fragments that are long enough to allow specific hybridization in the case of nucleic acids, and long enough for specific recognition of epitopes in the case of amino acids. Defined as a sequence of (contiguous) nucleic acids or a sequence of at least 4 (contiguous) amino acids, and some part of most shorter than the full length. Fragments can be derived from any contiguous portion of the selected nucleic acid or amino acid sequence. Derivatives are nucleic acid or amino acid sequences generated either directly from the original compound, either by modification or by partial substitution. Analogs are nucleic acid or amino acid sequences that have a structure that is similar but not identical to the original compound, eg, they differ from a natural compound with respect to a particular component or side chain. Analogs can be synthetic, can be derived from different evolutionary origins, and can have similar or opposite metabolic activities compared to wild-type. A homologue is the nucleic acid or amino acid sequence of a particular gene derived from a different species.
[0047]
A full-length NOVX clone is identified as containing an ATG translation start codon and an in-frame stop codon. Any disclosed NOVX nucleotide sequence lacking the ATG initiation codon therefore encodes a truncated C-terminal fragment of each NOVX polypeptide and extends in the 5 'direction of the sequence disclosed by the corresponding full length cDNA. Require to do. Any disclosed NOVX nucleotide sequence lacking an in-frame stop codon similarly encodes a truncated N-terminal fragment of the respective NOVX polypeptide, such that the corresponding full-length cDNA extends in the 3 'direction of the disclosed sequence. Request.
[0048]
Derivatives and analogs can be full length or other than full length if the derivative or analog contains a modified nucleic acid or amino acid as described below. The nucleic acid or protein derivatives or analogs of the present invention, in various embodiments, at least in comparison to alignment sequences aligned over nucleic acid or amino acid sequences of the same size or aligned by computer homology programs known in the art. Molecules comprising regions that are substantially homologous to the nucleic acids or proteins of the invention with about 70%, 80%, or 95% identity (preferably 80-95% identity), or nucleic acids encoding them Include, but are not limited to, molecules that are capable of hybridizing under stringent, moderately stringent, or low stringency conditions to the complement of the sequence encoding the protein. See, for example, Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993 and the following.
[0049]
"Homologous nucleic acid sequence" or "homologous amino acid sequence" or variants thereof refer to sequences characterized by homology at the nucleotide or amino acid level as described above. Homologous nucleotide sequences include those sequences that encode isoforms of the NOVX polypeptide. Isoforms can be expressed in different tissues of the same organism as a result of, for example, alternative splicing of RNA. Alternatively, isoforms can be encoded by different genes. In the present invention, a homologous nucleotide sequence includes a nucleotide sequence encoding a non-human species NOVX polypeptide, including but not limited to vertebrates. Thus, for example, include frogs, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, and other organisms. Homologous nucleotide sequences also include, but are not limited to, naturally occurring allelic variants and mutants of the nucleotide sequences set forth herein. However, homologous nucleotide sequences do not include the exact nucleotide sequence encoding human NOVX protein. Homologous nucleic acid sequences include nucleic acid sequences that encode conservative amino acid substitutions (see below) of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46) as well as polypeptides having NOVX biological activity. Various biological activities of the NOVX protein are described below.
[0050]
NOVX polypeptides are encoded by the open reading frame (“ORF”) of NOVX nucleic acids. The ORF corresponds to a nucleotide that can potentially be translated into a polypeptide. A series of nucleic acids containing the ORF is not interrupted by a stop codon. The ORF representing the sequence encoding the full-length protein begins with an ATG “start” codon and ends with one of the three “stop” codons, TAA, TAG or TGA. For the purposes of the present invention, the ORF can be any portion of the coding sequence that may or may not have a start codon, a stop codon, or both. In order to consider the ORF as a good candidate for encoding a genuine cellular protein, minimal requirements are often defined, for example a series of DNAs encoding 50 amino acids or more.
[0051]
Nucleotide sequences determined from cloning of the human NOVX gene are for use in identifying and / or cloning NOVX homologues from other cell types, eg, other tissues, and NOVX homologues from other vertebrates Allows creation of probes and primers to be designed. The probe / primer typically comprises a substantially purified oligonucleotide. The oligonucleotide is at least about 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive sense strand nucleotides of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) An antisense strand nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46); or a naturally occurring variant of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) Typically includes regions of nucleotide sequences that hybridize under stringent conditions.
[0052]
Probes based on human NOVX nucleotide sequences can be used to detect transcripts or genomic sequences encoding the same or homologous proteins. In various embodiments, the probe further comprises a label group attached thereto, eg, the group can be a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or a cofactor of the enzyme. Such probes are part of a diagnostic test kit for identifying cells or tissues that misexpress a NOVX protein, such as by measuring the level of a NOVX-encoding nucleic acid in a cell sample from a subject. For example, NOVX mRNA is detected or whether the genomic NOVX gene has been mutated or deleted.
[0053]
A “polypeptide having a biologically active portion of a NOVX polypeptide” includes mature forms as measured in a particular biological analysis and is similar, but not necessarily identical, to the activity of a polypeptide of the invention. It refers to a polypeptide that exerts no activity with or without dose dependency. A nucleic acid fragment encoding a “biologically active portion of NOVX” is represented by SEQ ID NO: 2n-1 (where n is a polypeptide encoding a polypeptide having a certain NOVX biological activity (the biological activity of the NOVX protein is described below)). Can be prepared by isolating a portion of (which is an integer from 1 to 46), expressing the NOVX protein coding portion (eg, by in vitro recombinant expression) and assessing the activity of the NOVX coding portion. .
[0054]
NOVX nucleic acid and polypeptide variants
The present invention further differs from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) due to the degeneracy of the genetic code, and therefore, SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). Nucleic acid molecules encoding the same NOVX protein as encoded by the nucleotide sequence shown in FIG. In another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the invention has a nucleotide sequence that encodes a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46).
[0055]
In addition to the human NOVX nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46), a DNA sequence polymorphism that results in a change in the amino acid sequence of the NOVX polypeptide is present in a population (eg, a human population). Those skilled in the art will understand that Such genetic polymorphisms in the NOVX gene may exist among individuals in the population due to natural allelic variation. The terms “gene” and “recombinant gene” as used herein refer to a nucleic acid molecule comprising an open reading frame (ORF) encoding a NOVX protein, preferably a vertebrate NOVX protein. Such natural allelic variations typically result in 1-5% variation in the nucleotide sequence of the NOVX gene. Any and all such nucleotide variations that are the result of natural allelic variation and do not alter the functional activity of the NOVX polypeptide and the amino acid polymorphisms in the NOVX polypeptide obtained therefrom are intended to be within the scope of the invention. .
[0056]
In addition, nucleic acid molecules encoding NOVX proteins from other species, and thus nucleic acid molecules having a nucleotide sequence different from any of human SEQ ID NOs: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) are of the invention Be within range. Nucleic acid molecules corresponding to natural allelic variants and homologues of the NOVX cDNA of the present invention are obtained using human cDNA or a portion thereof as a hybridization probe according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions. It can be isolated based on homology with the human NOVX nucleic acids disclosed herein.
[0057]
Thus, in another embodiment, an isolated nucleic acid molecule of the present invention is at least 6 nucleotides in length and is exact to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). Hybridizes under conditions. In another embodiment, the nucleic acid is at least 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, or 2000 or more nucleotides in length. In yet another embodiment, the isolated nucleic acid molecule of the invention hybridizes to the coding region. As used herein, the term “hybridizes under stringent conditions” describes hybridization and washing conditions in which nucleotide sequences that are at least about 60% homologous to each other typically remain hybridized to each other. Intended.
[0058]
Homologues (i.e., nucleic acids encoding NOVX proteins from non-human species) or other related sequences (e.g., paralogs) can be converted to specific human sequences using methods well known in the art of nucleic acid hybridization and cloning. All or part of the probe is used as a probe, and can be obtained by low, medium, or highly stringent hybridization.
[0059]
As used herein, the term “stringent hybridization conditions” refers to conditions under which a probe, primer or oligonucleotide hybridizes to a target sequence but not to other sequences. The exact conditions are sequence dependent and there are differences in different environments. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures than shorter sequences. In general, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the melting temperature (Tm) for the specific sequence at a constant ionic strength and pH. Tm is the temperature (under a defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe complementary to the target sequence hybridizes to the target sequence at equilibrium. Since the target sequence is generally present in excess at Tm, it accounts for 50% of the probe at equilibrium. Typically, the strict conditions are pH 7.0-8.3 and a salt concentration of less than about 1.0M sodium ion, typically about 0.01-1.0M sodium ion (or other salt), The temperature is at least about 30 ° C. for short probes, primers or oligonucleotides (eg, 10 nt to 50 nt) and at least about 60 ° C. for longer probes, primers and oligonucleotides. Stringent conditions can also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.
[0060]
The exact conditions are known to those skilled in the art and can be found in Ausubel, et al., (Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. it can. Preferably, the conditions are such that sequences that are at least 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homologous to each other typically remain hybridized to each other. is there. Non-limiting examples of stringent hybridization include 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA and 500 mg / ml denaturation. Hybridization is performed at 65 ° C. in a high salt buffer containing salmon sperm DNA, and then washed once or more at 50 ° C. in 0.2 × SSC, 0.01% BSA. An isolated nucleic acid molecule of the invention that hybridizes under stringent conditions to any sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule. As used herein, the term “naturally-occurring” nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule having a nucleic acid sequence that occurs in nature (eg, encodes a natural protein).
[0061]
In a second embodiment, the nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), or a fragment, analog or derivative thereof, hybridizes under moderately stringent conditions. Nucleic acid sequences for soy are provided. Non-limiting examples of moderately stringent hybridization conditions include hybridization at 55 ° C. in 6 × SSC, 5 × Reinhardt 'solution, 0.5% SDS and 100 mg / ml denatured salmon sperm DNA, followed by 1 X Washing once or more at 37 ° C in SSC, 0.1% SDS. Other moderately stringent conditions that can be used are well known in the art. See, for example, Ausubel, et al. (Eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY. .
[0062]
In a third embodiment, the nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), or a fragment, analog or derivative thereof, hybridizes under less stringent conditions. Nucleic acid sequences for soy are provided. Non-limiting examples of low stringency hybridization conditions include 35% formamide, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.0%. Hybridization in 2% BSA, 100 mg / ml denatured salmon sperm DNA, 10% (wt / vol) dextran sulfate at 40 ° C., followed by 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, And washing once or more at 50 ° C. in 0.1% SDS. Other less stringent conditions that can be used (eg, used for interspecies hybridization) are well known in the art. For example, Ausubel, et al. (Eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY .; Shilo and Weinberg 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792.
[0063]
Conservative mutation
In addition to naturally occurring allelic variations of the NOVX sequence that may be present in the population, mutations can be introduced into the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). Those of skill in the art will further understand that changes in the amino acid sequence of the encoding NOVX protein can thereby be induced without altering the functional activity of the NOVX protein. For example, nucleotide substitutions leading to amino acid substitutions at “non-essential” amino acid residues can be made in the sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). “Non-essential” amino acid residues are those residues that can change the wild-type sequence of the NOVX protein without altering their biological activity, while “essential” amino acid residues are such biological activity. Need to. For example, amino acid residues that are conserved in the NOVX protein of the present invention are not expected to be particularly resistant to conversion. Amino acids for which conservative substitutions can be made are well known in the art.
[0064]
Another aspect of the invention pertains to nucleic acid molecules encoding NOVX proteins that contain changes in amino acid residues that are not essential for activity. Such NOVX proteins differ in amino acid sequence from any of SEQ ID NOs: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), but still retain biological activity. In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence that encodes a protein, wherein the protein is at least about 45% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). Contains amino acid sequence. Preferably, the protein encoded by the nucleic acid molecule is at least about 70% homologous to SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46); more preferably, SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). Even more preferably, at least about 90% homologous to SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46); most preferably SEQ ID NO: 2n (n Is an integer from 1 to 46).
[0065]
An isolated nucleic acid molecule encoding a NOVX protein homologous to the protein of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46) within the protein encoding one or more amino acid substitutions, additions or deletions Can be created by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46).
[0066]
Mutations can be introduced into any of SEQ ID NOs: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. . Preferably, conservative amino acid substitutions are made at one or more predicted non-essential amino acid residues. A “conservative amino acid substitution” is one of the amino acid residues that is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. A family of amino acid residues having similar side chains has been defined within the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged side chains (e.g., glycine, Asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), amino acids with beta side chains (e.g., Threonine, valine, isoleucine), as well as amino acids with aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Thus, a predicted nonessential amino acid residue in a NOVX protein is replaced with another amino acid residue from the same side chain family. Alternatively, in another embodiment, mutations can be introduced randomly along all or part of a NOVX coding sequence, such as saturation mutagenesis, and the resulting mutations The body can be screened for NOVX biological activity to identify mutants that retain activity. Subsequent to mutagenesis of any of SEQ ID NOs: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46), the encoded protein is expressed by any recombinant technique known in the art to increase the activity of the protein. Can be measured.
[0067]
Amino acid family relationships can also be determined based on side chain interactions. Substituted amino acids can be fully conserved “strong” residues or fully conserved “weak” residues. The “strong” group of conserved amino acid residues can be any one of the following groups: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW, where the one letter code for amino acids Are grouped with amino acids that can be substituted for each other. Similarly, the “weak” group of conserved residues can be any one of the following: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEKK, NDEQHK, NEQHRK, HFY, where each Group letters represent the single letter code for amino acids.
[0068]
In one embodiment, the mutant NOVX protein is: (i) another NOVX protein, other cell surface protein or protein that interacts with their biological active site: protein forming activity, (ii) mutant NOVX protein May be assayed for complex formation between certain NOVX ligands, or (iii) the activity of mutant NOVX proteins that bind to intracellular target proteins or their biologically active sites; (eg, avidin protein).
In yet another embodiment, mutant NOVX proteins can be assayed for activity that modulates a specific biological function (eg, modulation of insulin secretion).
[0069]
Antisense nucleic acid
Another aspect of the invention is hybridizable or complementary to a nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), or a fragment, homologue or derivative thereof. Related to isolated antisense nucleic acid molecules. An “antisense” nucleic acid comprises a nucleotide sequence that is complementary to a “sense” nucleic acid encoding a protein (eg, complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or complementary to an mRNA sequence). In particular embodiments, antisense nucleic acid molecules comprising at least about 10, 25, 50, 100, 250, or 500 nucleotides or a sequence complementary to the entire NOVX coding strand, or only a portion thereof, are provided. A nucleic acid molecule encoding a fragment, homologue, derivative and analogue of NOVX protein with SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46), or SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46) ) And an antisense nucleic acid complementary to the NOVX nucleic acid sequence provided.
[0070]
In one embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a “coding region” of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a NOVX protein. The term “coding region” refers to a region of a nucleotide sequence that includes codons translated into amino acid residues. In another embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a “non-coding region” of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a NOVX protein. The term “noncoding region” refers to 5 ′ and 3 ′ sequences that flank the coding region that are not translated into amino acids (ie, also referred to as 5 ′ untranslated region and 3 ′ untranslated region).
[0071]
Given the sequence of the coding strand encoding the NOVX protein disclosed herein, antisense nucleic acids of the invention can be designed according to the rules of Watson and Crick or Hoogsteen base pairing. The antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of NOVX mRNA, but more preferably is an oligonucleotide that is antisense to only a portion of the coding or non-coding region of NOVX mRNA. . For example, the antisense oligonucleotide can be complementary to the region surrounding the translation start site of NOVX mRNA. Antisense oligonucleotides can be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 nucleotides in length. An antisense nucleic acid of the invention can be constructed using chemical synthesis or enzymatic ligation reactions using procedures known in the art. For example, an antisense nucleic acid (e.g., an antisense oligonucleotide) increases the biological stability of a naturally occurring nucleotide or molecule, or a double-stranded physical stability that forms between an antisense nucleic acid and a sense nucleic acid. Various modified nucleotides designed to increase can be chemically synthesized (eg, phosphorothioate derivatives and nucleotides substituted with acridine can be used).
[0072]
Examples of modified nucleotides that can be used to make antisense nucleic acids include the following: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5 -(Carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosilk enosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5 -Methoxy Minomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosilk eosin, 5′-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wivetoxosin, pseudouracil , Queosin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-methyl 2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w, and 2,6-diaminopurine. Alternatively, the antisense nucleic acid is subcloned in the antisense orientation of the nucleic acid (ie, RNA transcribed from the inserted nucleic acid is the antisense orientation for the target nucleic acid of interest and is further described in the subsection below). Can be produced biologically using the expression vector.
[0073]
Protein expression by hybridizing or binding the antisense nucleic acid molecules of the present invention to cellular mRNA and / or genomic DNA that encodes certain NOVX proteins thereby (eg, inhibiting transcription and / or translation) Is typically administered to a subject so as to inhibit or made in tissue. Hybridization can also be due to the complementarity of conventional nucleotides to form stable duplexes. Or, for example, in the case of an antisense nucleic acid that binds to a DNA double strand, it can be through a specific interaction in the double-stranded major groove. An example of a route of administration of antisense nucleic acid molecules of the invention is direct injection into a tissue site. Alternatively, antisense nucleic acid molecules can be modified to selected cellular targets where they can be administered systemically. For example, for systemic administration, antisense molecules are specifically bound to receptors or antigens expressed on selected cell surfaces (e.g., linking antisense nucleic acid molecules to peptides or cell surfaces). May be modified (by antibodies that bind to receptors or antigens). Antisense nucleic acid molecules can also be delivered to cells using the vectors described herein. In order to deliver sufficient nucleic acid molecules, vector structures that place antisense nucleic acid molecules under the control of a strong pol II or pol III promoter are preferred.
[0074]
In yet another embodiment, the antisense nucleic acid molecule of the invention is an α-anomeric nucleic acid molecule. α-anomeric nucleic acid molecules form specific double-stranded hybrids with complementary RNAs, which are opposite to normal β units and run parallel to each other. See, for example, Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641. Antisense nucleic acid molecules can also be 2′-o-methyl ribonucleotides (see, eg, Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) or chimeric RNA-DNA analogs (eg, Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330).
[0075]
Ribozyme and PNA moiety
Non-limiting examples of nucleic acid modifications include modified bases and nucleic acids that have been modified or derived from a sugar phosphate backbone. These modifications are made at least in part to enhance the chemical stability of the modified nucleic acid so that it can be used, for example, as an antisense that binds to the nucleic acid in therapeutic applications to a subject.
[0076]
In one embodiment, the antisense nucleic acid of the invention is a ribozyme. Ribozymes are catalytically active RNA molecules with ribonuclease activity that are capable of cleaving single-stranded nucleic acids such as mRNA having a complementary region. Thus, ribozymes (eg, hammerhead ribozymes as described in Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591) are used to catalytically cleave the NOVX mRNA transcript, thereby resulting in the NOVX mRNA. Translation may be inhibited. A ribosome having specificity for a nucleic acid encoding NOVX is based on the nucleotide sequence of one NOVX cDNA disclosed herein (ie, any one of SEQ ID NOs: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46)). Can design. For example, a derivative of Tetrahymena L-19IVS RNA can be constructed in which the nucleotide sequence of the active site is complementary to a nucleotide sequence that can be cleaved in mRNA encoding NOVX. See, for example, Cech, et al., US Pat. No. 4,987,071, and Cech, et al., US Pat. No. 5,116,742. NOVX mRNA can also be used to select catalytic RNAs with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules. See, for example, Bartel et al., (1993) Science 261: 1411-1418.
[0077]
On the other hand, NOVX gene expression is inhibited by targeting a nucleotide sequence complementary to a regulatory region of NOVX nucleic acid (eg, NOVX promoter and / or enhancer), and triple helical that blocks transcription of NOVX gene in the target cell. A structure can be formed. See, for example, Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. NY Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15. .
[0078]
In various embodiments, NOVX nucleic acids can be modified at the base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone moiety to improve, for example, molecular stability, hybridization, or solubility. For example, the nucleic acid deoxyribose phosphate backbone can be modified to produce peptide nucleic acids. See, for example, Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23. As used herein, the term “peptide nucleic acid” or “PNA” refers to a nucleic acid mimetic (eg, a DNA mimetic) that replaces the deoxyribose phosphate backbone with a pseudopeptide backbone and retains only four nucleotide bases. . The neutral backbone of PNA is shown to allow specific hybridization to DNA and RNA under conditions of low ionic strength. The synthesis of PNA oligomers is described in Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675 It can be performed using a standard solid phase peptide synthesis protocol.
[0079]
NOVX PNA may be used for therapeutic and diagnostic applications. For example, PNA can be used as an antisense or antigenic agent for sequence specific modulation of gene expression, eg, by inducing transcription or translational arrest or inhibiting replication. NOVX PNAs can also be used, for example, for analysis of single base pair mutations in genes (eg, PNAs that direct PCR fixation; other enzymes such as S₁As an artificial restriction enzyme that can be used in combination with a nuclease (see Hyrup, et al., 1996. supra); or as a DNA sequence and hybridization probe or primer (Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supra))).
[0080]
In another embodiment, the NOVX PNA is modified, eg, by attaching a lipophilic or other auxiliary group to the PNA, by generation of a PNA-DNA chimera, or by liposomes or the art Can be used to enhance their stability or cellular uptake by use of other drug delivery techniques known in the art. For example, a PNA-DNA chimera of NOVX can be generated that can combine the beneficial properties of PNA and DNA. Such chimeras allow DNA recognition enzymes (eg, RNase H and DNA polymerase) to interact with the DNA moiety, while the PNA moiety provides binding high affinity and binding specificity. PNA-DNA chimeras can be joined using linkers of appropriate lengths selected for base linkage, number of linkages between nucleotide bases and orientation (see Hyrup, et al., 1996. supra). Synthesis of PNA-DNA chimeras can be performed as described in Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363. For example, a DNA strand can be synthesized on a solid support using standard phosphoramidite coupling chemistry. Modified nucleoside analogs, such as 5 ′-(4-methoxytrityl) amino-5′-deoxythymidine phosphoramidites, can then be used between the PNA and the 5 ′ end of the DNA. See, for example, Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988. The PNA monomer is then coupled stepwise to produce a chimeric molecule having a 5 ′ PNA segment and a 3 ′ DNA segment. See, for example, Finn, et al., 1996. supra. Alternatively, the chimeric molecule can be synthesized with a 5 ′ DNA segment and a 3 ′ PNA segment. See, for example, Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124.
[0081]
In other embodiments, the oligonucleotides are attached to groups such as peptides (e.g., to target host cell receptors in vivo), or cell membranes (e.g., Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; see PCT publication number WO 88/09810) or blood brain barrier (eg, PCT publication number). Agents that facilitate transport across (see WO89 / 10134) may be included. In addition, oligonucleotides can be combined with hybridization-inducing cleavage agents (see, eg, Krol, et al., 1988. BioTechniques 6: 958-976) or intercalating agents (eg, Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539 -549). For this purpose, oligonucleotides can be conjugated to, for example, peptides, hybridization-inducing cross-linking agents, transport agents, hybridization-inducing cleavage agents, and the like.
[0082]
NOVX polypeptide
Polypeptides according to the present invention include polypeptides containing the amino acid sequence of the NOVX polypeptide whose sequence is provided in any of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). The present invention also preserves its NOVX activity and physiology while any residue thereof can be converted from the corresponding residue shown in any of SEQ ID NO: 2n (where n is an integer from 1 to 46). Or mutant proteins that still encode functional fragments thereof.
[0083]
In general, one NOVX variant that retains a NOVX-like function includes any variant that substitutes a residue at a particular site in the sequence with another amino acid, with another residue between the two residues of the parent protein. Or further including the possibility of inserting multiple residues as well as the possibility of deleting one or more residues from the parent sequence. Any amino acid substitution, insertion or deletion is encompassed by the present invention. In preferred circumstances, the substitution is a conservative substitution as defined above.
[0084]
One aspect of the present invention relates to isolated NOVX proteins and biologically active portions thereof, or derivatives, fragments, analogs or homologues thereof. Polypeptide fragments suitable for use as an immunogen for the production of anti-NOVX antibodies can also be provided. In one embodiment, native NOVX protein can be isolated from a cell or tissue source by a suitable purification scheme using standard protein purification techniques. In another embodiment, NOVX protein is produced by recombinant DNA technology. As an alternative to recombinant expression, certain NOVX proteins or polypeptides can be chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques.
[0085]
An “isolated” or “purified” polypeptide or protein or biologically active portion thereof is substantially free of cellular or tissue source cellular material or other contaminating protein from which the NOVX protein is derived, or chemically When synthesized, it is substantially free of chemical precursors or other chemicals. The term “substantially free of cellular material” includes a sample of NOVX protein that has separated the protein from the cellular components of the original cell from which the protein was isolated or recombinantly produced. In one embodiment, the term “substantially free of cell source” means less than about 30% (dry weight ratio) of non-NOVX protein (also referred to herein as “contaminating protein”), more preferably about Samples of NOVX protein having less than 20% non-NOVX protein, even more preferably less than about 10% non-NOVX protein, and most preferably less than about 5% non-NOVX protein are included. In recombinantly producing NOVX proteins or biologically active portions thereof, it is also preferably substantially free of medium, ie, the medium is less than about 20% of the volume of the NOVX protein specimen, more preferably It represents less than about 10%, and most preferably less than 5%.
[0086]
The term “substantially free of chemical precursors or other chemicals” includes a sample of NOVX protein where proteins are separated from chemical precursors or other chemicals involved in protein synthesis. To do. In one embodiment, the term “substantially free of chemical precursors or other chemicals” refers to less than about 30% (dry weight ratio) chemical precursors or non-NOVX chemicals, more preferably Less than about 20% chemical precursor or non-NOVX chemical, even more preferably less than about 10% chemical precursor or non-NOVX chemical, and most preferably less than about 5% chemical precursor or non-NOVX Includes specimens of NOVX protein with chemicals.
[0087]
The biologically active portion of the NOVX protein includes the amino acid sequence of the NOVX protein that contains fewer amino acids than the full-length NOVX protein and exhibits at least one activity of the NOVX protein (eg, SEQ ID NO: 2n, where n is 1 to 46 The amino acid sequence derived from the amino acid sequence sufficiently homologous to (the amino acid sequence shown in the amino acid sequence of the NOVX protein). Typically, the biologically active portion includes a domain or motif having at least one activity of the NOVX protein. A biologically active portion of a NOVX protein can be a polypeptide, eg, 10, 25, 50, 100 or more amino acid residues long.
In addition, other biologically active portions lacking other regions of the protein can be prepared by recombinant techniques and evaluated for one or more of the functional activities of the native NOVX protein.
[0088]
In one embodiment, the NOVX protein has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2n (where n is an integer from 1 to 46). In another embodiment, the NOVX protein is substantially homologous to SEQ ID NO: 2n (where n is an integer from 1 to 46) and SEQ ID NO: 2n (where n is an integer from 1 to 46). Retains the functional activity of certain proteins, but still differs in amino acid sequence due to natural allelic variants or mutations as detailed below. Thus, in another embodiment, the NOVX protein comprises an amino acid sequence that is at least about 45% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2n (where n is an integer from 1 to 46), Wherein n is an integer of 1 to 46).
[0089]
Measuring homology between two or more sequences
To determine the percentage of homology between two amino acid sequences or two nucleic acids, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg, gaps are optimally aligned with the second amino acid or nucleic acid sequence). In the first amino acid sequence or nucleic acid sequence). The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid or nucleic acid sites are then compared. When a site in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding site in the second sequence, both molecules are homologous at that site (ie, as used herein, amino acids or Nucleic acid “homology” is equivalent to amino acid or nucleic acid “identity”).
[0090]
Nucleic acid sequence homology can be measured as the degree of identity between two sequences. Homology can be measured using computer programs known in the art, such as GAP software provided in the GCG program package. See Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453. Using the GCG GAP software with the following settings: GAP generation penalty 5.0 or GAP extension penalty 0.3, the coding region of the above similar nucleic acid sequence is SEQ ID NO: 2n-1 (where n is Preferably at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% identity with the CDS (encoding) portion of the DNA sequence shown in FIG. Indicates the degree.
[0091]
The term “sequence identity” refers to the extent to which two polynucleotide or polypeptide sequences are identical from residue to residue over a particular region of comparison. The term “percent of sequence identity” is used to compare two sequences that are optimally aligned over the region of comparison and to determine the number of matching sites (for example, A, in the case of nucleic acids, A, The number of sites where T, C, G, U, or I) is present in both sequences is determined, the number of matching sites is divided by the total number of sites in the comparison region (ie, window size), and the quotient is 100. Can be calculated by multiplying to obtain a percentage of sequence identity. As used herein, the term “substantial identity” means a property of a polynucleotide sequence. Here, the polynucleotide comprises at least 80% sequence identity, preferably at least 85% sequence identity, and often 90-95% sequence identity, more usually compared to the standard sequence over the comparison region. Includes sequences with at least 99% sequence identity.
[0092]
Chimeric or fusion protein
The present invention also provides NOVX chimeric proteins or fusion proteins. As used herein, a NOVX “chimeric protein” or “fusion protein” includes a NOVX polypeptide operably linked to a non-NOVX polypeptide. “NOVX polypeptide” refers to a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to the NOVX protein of SEQ ID NO: 2n, where n is an integer from 1 to 46, while “non-NOVX polypeptide” A polypeptide having an amino acid sequence corresponding to a protein that is not substantially homologous to the NOVX protein, for example, a protein that is the same or different from the NOVX protein. Within a NOVX fusion protein, a NOVX polypeptide may correspond to all or part of a NOVX protein. In one embodiment, a NOVX fusion protein includes at least one biologically active portion of a NOVX protein. In another embodiment, a NOVX fusion protein comprises at least two biologically active portions of a NOVX protein. In yet another embodiment, a NOVX fusion protein comprises at least three biologically active portions of a NOVX protein. Within the fusion protein, the term “operably linked” shall indicate that the NOVX polypeptide and the non-NOVX polypeptide are fused in-frame to each other. The non-NOVX polypeptide can be fused to the N-terminus or C-terminus of the NOVX polypeptide.
[0093]
In one embodiment, the fusion protein is a GST-NOVX fusion protein. Here, the NOVX sequence is fused to the C-terminus of GST (glutathione S transferase). Such fusion proteins can facilitate the purification of recombinant NOVX polypeptides.
[0094]
In another embodiment, the fusion protein is a NOVX protein containing a heterologous signal sequence at its N-terminus. In certain host cells (eg, mammalian host cells), NOVX expression and / or secretion may be enhanced through the use of heterologous signal sequences.
[0095]
In yet another embodiment, the fusion protein is a NOVX-immunoglobulin fusion protein. Here, the NOVX sequence is fused to a sequence derived from a member of the immunoglobulin protein family. A NOVX-immunoglobulin fusion protein of the invention is incorporated into a pharmaceutical composition and administered to a subject to inhibit the interaction of a NOVX ligand with a NOVX protein on the cell, thereby inhibiting NOVX-mediated in vivo. Information transmission can be suppressed. NOVX-immunoglobulin fusion proteins can be used to affect the bioavailability of certain NOVX-like ligands. Inhibition of the NOVX ligand / NOVX interaction may be therapeutically useful for the treatment of proliferation and differentiation disorders and for modulating (eg, enhancing or inhibiting) cell survival. In addition, the NOVX-immunoglobulin fusion proteins of the present invention are used to produce anti-NOVX antibodies in a subject, purify NOVX ligand, and inhibit the interaction of NOVX with a NOVX ligand in screening assays Can be identified.
[0096]
The NOVX chimeric or fusion proteins of the invention can be produced by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA fragments encoding different polypeptide sequences can be used, for example, using blunted or staggered ends for ligation, cleavage with restriction enzymes to provide appropriate ends, appropriately filling sticky ends, desirably Ligated together in-frame according to conventional methods such as alkaline phosphatase treatment to prevent unbound and enzymatic coupling. In another embodiment, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques including automated DNA synthesizers. Alternatively, PCR amplification of gene fragments is performed using anchor primers that produce complementary overhangs between two consecutive gene fragments, which are subsequently annealed and reamplified to produce a chimeric gene sequence. (See, eg, Ausubel, et al. (Eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Moreover, many expression vectors (eg, GST polypeptides) that already encode a fusion moiety are commercially available. A nucleic acid encoding NOVX can be cloned into such an expression vector such that the fusion moiety binds in-frame to the NOVX protein.
[0097]
NOVX agonists and antagonists
The invention also includes variants of the NOVX protein that function as either NOVX agonists (ie, mimetics) or NOVX antagonists. NOVX protein variants may be generated by mutation (eg, point mutation or truncation of the NOVX protein). NOVX protein agonists retain substantially the same biological activity or subset thereof as the naturally occurring form of NOVX protein. NOVX protein agonists inhibit the activity of one or more naturally occurring forms of NOVX protein by, for example, antagonistic binding to downstream or upstream members of the cellular signaling cascade, including NOVX protein Can do. Thus, specific biological effects can be exerted by treatment with variants having limited functions. In one embodiment, treatment of a subject with a variant having a subset of the biological activity of a naturally occurring form of the protein has fewer side effects in the subject than treatment with a naturally occurring form of NOVX protein.
[0098]
Variants of NOVX proteins that function as either NOVX agonists (ie, mimetics) or NOVX antagonists screen recombinant libraries of NOVX protein mutants (eg, truncation mutants) for NOVX protein agonist or antagonist activity Can be identified. In one embodiment, the NOVX variant-rich library is generated by recombinant (combinatorial) mutagenesis at the nucleic acid level and is encoded by a gene library that is rich in change. A library enriched in NOVX variants can be used, for example, to enzymatically link a mixture of synthetic oligonucleotides to a gene sequence so that a degenerate set of potential NOVX sequences can be expressed as individual polypeptides. Or alternatively as a set of larger fusion proteins (eg, for phage display) containing a set of NOVX sequences therein. There are a variety of methods that can be generated from a degenerate oligonucleotide sequence using a library of potential NOVX variants. Chemical synthesis of degenerate gene sequences can be performed with an automated DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into an appropriate expression vector. The use of a degenerate set of genes allows the provision of a single mixture of all of the sequences that encode the desired set of potential NOVX sequences. Methods for synthesizing degenerate oligonucleotides are well known in the art. For example, Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. See Nucl. Acids Res. 11: 477.
[0099]
Polypeptide library
In addition, a fragment library of NOVX protein-encoding sequences can be used to generate populations rich in changes in NOVX fragments for screening and subsequent selection of NOVX protein variants. In one embodiment, a library of coding sequence fragments is subjected to nuclease treatment of a double stranded PCR fragment of a NOVX coding sequence under conditions that cause nicking only about once per molecule to denature the double stranded DNA. Forming a double stranded DNA that may contain sense / antisense pairs from different nicking products, S₁It can be generated by removing the single-stranded portion from the double helix regenerated by nuclease treatment and ligating the resulting fragment library to an expression vector. By this method, an expression library can be derived which encodes NV-terminal or internal fragments of various sizes of NOVX protein.
[0100]
Various techniques for screening gene products of recombinant (combinatorial) libraries generated by point mutations or truncations, and screening cDNA libraries for gene products having selected properties are known in the art. . Such techniques are applicable to rapid screening of gene libraries generated by recombinant (combinatorial) mutagenesis of NOVX proteins. The most widely used technique applicable to high-throughput analysis to screen large gene libraries is to clone the gene library into a replicable expression vector and transform the appropriate cells with the resulting vector library, And the detection of the desired activity typically involves expressing the recombinant (combinatorial) gene under conditions that facilitate the isolation of a vector encoding the gene that detects the product. A new technique that increases the frequency of functional mutations in the library, repetitive ensemble mutagenesis (REM), can be used in combination with screening assays to identify NOVX mutants. See, for example, Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6: 327-331.
[0101]
NOVX antibody
As used herein, the term “antibody” refers to an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule and an immunoglobulin (Ig) molecule, ie, an antigen that specifically binds (and reacts immunologically) with an antigen. Refers to a molecule containing a binding site. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, F_ab, F_{ab '} And F_{( ab ') 2}Fragment and F_abExamples include but are not limited to expression libraries. In general, antibody molecules obtained from humans relate to any of the classes IgG, IgM, IgA, IgE and IgD, which differ from each other due to the nature of the heavy chain present in the molecule. A specific class is IgG₁, IgG₂And so on, with subclasses as well. Furthermore, in humans, the L chain can be a k chain or a lambda chain. Reference herein to antibodies includes a reference to all such classes, subclasses and types of human antibody species.
[0102]
Generate isolated antibodies immunospecifically using standard techniques for polyclonal and monoclonal antibody preparation using the isolated protein of the present invention, or a portion or fragment thereof, intended for use as an antigen, as an immunogen Can do. The full-length protein may be used, or alternatively, the present invention provides an antigenic peptide fragment of an antigen for use as an immunogen. The antigenic peptide fragment comprises at least 6 amino acid residues of the amino acid sequence of the full length protein, such as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2n, where n is an integer from 1 to 46, and for the peptide The raised antibody includes the epitope to form a specific immune complex with the full-length protein or any fragment containing the epitope. Preferably, the antigenic peptide comprises at least 10 amino acid residues, or at least 15 amino acid residues, or at least 20 amino acid residues, or at least 30 amino acid residues. Preferred epitopes encompassed by the antigenic peptides are protein regions located on the surface; these are usually hydrophilic regions.
[0103]
In certain embodiments of the invention, at least one epitope encompassed by the antigenic peptide is a NOVX region, eg, a hydrophilic region, localized on the surface of the protein. Hydrophobic analysis of the human NOVX protein sequence indicates which regions of the NOVX polypeptide are particularly hydrophilic and therefore likely to encode useful surface residues for targeting antibody production. As a means to target antibody production, hydropathy plots showing hydrophilic and hydrophobic regions are well known in the art, including, for example, the Kyte Doolittle or Hopp Woods methods, both with or without Fourier transforms. It can be generated by any method. For example, Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142 (both are hereby incorporated by reference in their entirety) As a part of the book). Antibodies that are specific for one or more domains within an antigenic protein or derivative, fragment, analog or homologue thereof are also provided herein.
[0104]
The term “epitope” includes all protein determinants (sites) that can specifically bind to an immunoglobulin or T cell receptor. Epitope-like determinants (sites) usually contain chemically active molecules (eg, amino acids or sugar side chains) surface groups and usually exhibit specific charge characteristics in addition to specific three-dimensional structural characteristics . Certain NOVX polypeptides or fragments thereof have at least one antigenic epitope. The equilibrium binding constant K as measured by an assay (eg, a radioligand binding assay or similar assay known to those skilled in the art)._DBut,<1 μM, preferably<100 nM, more preferably<10 nM, most preferably<When it is 100 pM to about 1 pM, the anti-NOVOX antibody of the present invention specifically binds to the antigen NOVX.
The proteins of the invention, or derivatives, fragments, analogs, homologues, or orthologs thereof can be utilized as an immunogen in the production of antibodies that immunospecifically bind to these protein components.
[0105]
Various methods known in the art can be used for the production of polyclonal or monoclonal antibodies against a protein of the invention, or derivatives, fragments, analogs, homologues, or orthologs thereof (eg, Antibodies: A Laboratory Manual). Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, which is incorporated herein by reference). Some of these antibodies are discussed below.
[0106]
Polyclonal antibody
For the production of polyclonal antibodies, various suitable host animals (e.g., rabbits, goats, mice, or other mammals) are injected once or more with the natural protein, synthetic variants thereof, or the aforementioned derivatives. Immunization can be performed. Suitable immunogenic formulations may include, for example, naturally occurring immunogenic proteins, chemically synthesized polypeptides that are representative of immunogenic proteins, or recombinantly expressed immunogenic proteins. Furthermore, the protein may be complexed with a second protein that is known to be immunogenic in the mammal to be immunized. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. The formulation may further contain an adjuvant. Various adjuvants used to increase the immune response include Freund's (complete and incomplete) adjuvants, mineral gels (e.g. aluminum hydroxide), surfactants (e.g. lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions) , Dinitrophenol, and the like), adjuvants that can be used in humans, such as, but not limited to, Bacillus Calmette-Guerin and Corynebacterium parvum. Yet another example of an adjuvant that may be used may include MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic dicorynomycolic acid trehalose).
[0107]
Polyclonal antibodies against immunogenic proteins are isolated from mammals (eg, from blood) and known techniques, such as affinity chromatography using protein A or protein G, which provides mainly the IgG fraction in immune serum Can be used for further purification. Subsequently, or alternatively, a specific antigen that is the target of the desired immunoglobulin, or an epitope thereof, can be immobilized on a column and the immunospecific antibody can be purified by immunoaffinity chromatography. The purification of immunoglobulins is discussed, for example, by D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28).
[0108]
Monoclonal antibody
As used herein, the term “monoclonal antibody” (MAb) or “monoclonal antibody composition” contains only one molecular species of antibody molecule consisting of a characteristic L chain gene product and a characteristic H chain gene product. Refers to a population of antibody molecules. In particular, the complementarity determining regions (CDRs) of a monoclonal antibody are identical in all molecules of the population. Thus, MAbs contain an antigen binding site capable of immunoreacting with a particular epitope of an antigen characterized by a characteristic binding activity thereto.
[0109]
Monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma methods, as described by Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In the hybridoma method, lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that specifically bind to an immunizing agent are typically immunized by immunizing a mouse, hamster, or other suitable host animal with the immunizing agent. To trigger. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro.
[0110]
The immunizing agent typically includes protein antigens, fragments thereof or fusion proteins thereof. In general, either peripheral blood lymphocytes are used if cells derived from humans are desired, or spleen cells or lymph node cells are used if non-human mammalian sources are desired. . The lymphocytes are then fused with an immortal cell line using a suitable fusing agent such as polyethylene glycol to produce hybridoma cells (Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Immortal cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells from rodents, cattle or humans. Usually, rat or mouse myeloma cell lines may be used. The hybridoma cells may be cultured in a suitable medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused, immortalized cells. For example, if the parent cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the culture medium for hybridomas typically contains hypoxanthine, a substance that prevents the growth of HGPRT-deficient cells, Contains aminopterin and thymidine (“HAT medium”).
[0111]
Preferred immortal cell lines are those that fuse efficiently, support high level expression of antibodies by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. Further preferred immortal cell lines are mouse myeloma cell lines available from, for example, the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines are also described for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
[0112]
The medium in which the hybridoma is cultured can then be assayed for the presence of monoclonal antibodies directed against the antigen. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is measured by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Such techniques or assays are known in the art. The binding affinity of a monoclonal antibody can be measured, for example, by Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980). Identifying antibodies with a high degree of specificity and high binding affinity for the target antigen is a particularly important objective in the therapeutic application of monoclonal antibodies.
[0113]
After identifying the desired hybridoma cells, the clones can be subcloned by limiting dilution and grown by standard methods (Goding, 1986). Suitable media for this purpose may include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium media and RPMI-1640 media. Alternatively, the hybridoma cells can be grown in vivo as ascites in a mammal.
[0114]
Monoclonal antibodies secreted by subclones are isolated or isolated from medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification procedures such as, for example, protein-A sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography. It can be purified.
[0115]
Monoclonal antibodies can also be made by recombinant DNA methods as described in US Pat. No. 4,816,567. Using an oligonucleotide probe capable of specifically binding DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention to a gene encoding the heavy and light chains of the murine antibody using conventional procedures (eg. Can be easily isolated and sequenced. The hybridoma cells of the invention serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA is placed in an expression vector, which is then host cells such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that would otherwise not produce immunoglobulin proteins. It can be transfected into to obtain monoclonal antibody synthesis in recombinant host cells. DNA can also be replaced, for example, by replacing coding sequences for the normal domains of human heavy and light chains in place of homologous murine sequences (US Pat. No. 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812- 13 (1994)), or all or part of the coding sequence for a non-immunoglobulin peptide can be modified by covalent attachment to the coding sequence of the immunoglobulin. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the normal domain of the antibody of the invention, or can be substituted for the variable domain of one antigen binding site of the antibody of the invention to produce chimeric 2 A titer antibody can be created.
[0116]
Humanized antibody
The antibody against the protein antigen of the present invention further includes a humanized antibody or a human antibody. These antibodies are suitable for administration to humans without causing human immune responses to the administered immunoglobulins. Humanized forms of antibodies consist of chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains, or fragments thereof (Fv, Fab, Fab ′) that consist primarily of human immunoglobulin sequences and contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. , F (ab ')₂Or other antigen-binding subsequence of the antibody). Humanization is performed by Winter or co-workers (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239 : 1534-1536 (1988)) by replacing the rodent CDR or CDR sequence with the corresponding sequence of a human antibody. (See also US Pat. No. 5,225,539). In some cases, the Fv frame residues of the human immunoglobulin can be replaced by corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also comprise residues that are not found in the recipient antibody or in the CDR or frame sequence. In general, a humanized antibody will contain at least one, and typically substantially all of the two variable domains. Here, all or substantially all of the CDR regions correspond to the CDR regions of a non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the frame region is of a human immunoglobulin consensus sequence. A humanized antibody optimally also comprises at least a portion of an immunoglobulin normal region (Fc), typically that of a human immunoglobulin (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta , Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)).
[0117]
Human antibody
A fully human antibody relates essentially to an antibody molecule in which the entire L and H chain sequences, including the CDRs, originate from a human gene. Such antibodies are referred to herein as “human antibodies” or “fully human antibodies”. Human monoclonal antibodies can be prepared by trioma technology; human B cell hybridoma technology (see Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72) and EBV hybridoma technology to produce human monoclonal antibodies (Cole, et al. , 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Humanized monoclonal antibodies can be utilized in the practice of the invention and human hybridomas can be used (see Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) or human B cells can be Can be produced by transformation with Epstein Barr virus (see Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
[0118]
In addition, human antibodies can also be obtained from phage display libraries (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). Can be produced using further techniques including: Similarly, human antibodies can be made by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, eg, mice. Here, the endogenous immunoglobulin genes are partially or completely inactivated. The challenge observes human antibody production very similar to that seen in humans in all aspects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. This approach is described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016. Marks et al. (Bio / Technology 10, 779-783 (1992)), Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994)), Morrison (Nature 368, 812-13 (1994)), Fishwild et al, (Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)), Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)), Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)). .
[0119]
Human antibodies can additionally be produced using transgenic non-human animals that have been modified to produce fully human antibodies rather than the animal's endogenous antibodies in response to challenge with antigen (PCT Publication No. WO94 / 02602). The endogenous genes encoding immunoglobulin heavy and light chains in the non-human host are disabled, and active loci encoding human immunoglobulin heavy and light chains are inserted into the genome of the host. Human genes can be incorporated, for example, using yeast artificial chromosomes containing the necessary human DNA segments. Animals that provide all the desired modifications are then obtained as offspring by crossbreeding intermediate transgenic animals that contain less than the full complement of modifications. A preferred embodiment of such a non-human animal is the mouse, designated as Xenomouse® as disclosed in PCT Publication Nos. WO96 / 33735 and WO96 / 34096. This animal produces B cells that secrete fully human immunoglobulins. The antibody can be obtained directly from the animal after immunization with the immunogen of interest, eg, as a polyclonal antibody specimen, or alternatively, an immortalized B derived from an animal, such as a hybridoma producing a monoclonal antibody. It can also be obtained from cells. In addition, genes encoding immunoglobulins with human variable regions can be recovered and expressed to obtain antibodies directly, or further modified, eg, for antibodies such as single chain Fv molecules. Analogues can be obtained.
[0120]
An example of a method of producing a non-human host, exemplified as a mouse, that lacks endogenous immunoglobulin heavy chain expression is disclosed in US Pat. No. 5,939,598. It is known from at least one endogenous heavy chain locus in embryonic stem cells to prevent loci rearrangement and to prevent transcript production of rearranged immunoglobulin heavy chain loci. A segment is deleted, this deletion being brought about by a targeting vector containing a gene encoding a selectable marker, and somatic cells or embryonic cells are transformed from embryonic stem cells containing a gene encoding the selectable marker. It is obtained by a method that includes producing.
[0121]
Methods for producing antibodies of interest, such as human antibodies, are disclosed in US Pat. No. 5,916,771. It introduces an expression vector containing a nucleotide sequence encoding an H chain into one cultured mammalian host cell, and introduces an expression vector containing a nucleotide sequence encoding an L chain into yet another mammalian host cell. And fusing two cells to produce a hybrid cell. Hybrid cells express antibodies that contain heavy and light chains.
[0122]
In a further refinement of this procedure, a method for identifying clinically relevant epitopes on an immunogen and a correlated method for selecting antibodies that immunospecifically bind to the relevant epitope with high affinity are disclosed in PCT publication. No. WO99 / 53049.
[0123]
F_abFragments and single chain antibodies
In accordance with the present invention, the technique can be adapted to the production of single chain antibodies specific for the antigenic proteins of the present invention (see, eg, US Pat. No. 4,946,778). In addition, the method is F_abCompatible with the construction of expression libraries (see, eg, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) and have the desired specificity for a protein or derivative, fragment, analog or homologue thereof Monoclonal F_abIt may allow rapid and effective identification of fragments. Antibody fragments containing idiotypes against protein antigens can be produced by techniques known in the art, which include (i) F produced by pepsin digestion of antibody molecules._{( ab ') 2}Fragment; (ii) F_{( ab ') 2}F obtained by reducing the disulfide bridge of the fragment_abFragments; (iii) F generated by treating antibody molecules with papain and a reducing agent_abFragments; and (iv) F_vIncluding but not limited to fragments.
[0124]
Bispecific antibody
Bispecific antibodies are monoclonal antibodies, preferably human or humanized, that have binding specificities for at least two different antigens. As used herein, one of the binding specificities is for the antigenic protein of the present invention. The second binding target is any other antigen, preferably a cell surface protein or receptor or receptor subunit.
[0125]
Methods for making bispecific antibodies are known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs in which the two heavy chains have different specificities (Milstein and Cuello, Nature, 305 : 537-539 (1983)). Due to the random combination of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually performed by affinity chromatography. Similar methods are disclosed in WO 93/08829 published in May 1993 and Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
[0126]
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin normal domain sequences. The fusion is preferably with the normal domain of an immunoglobulin heavy chain comprising at least part of the hinge, CH2 and CH3 regions. It is preferred to have a first heavy chain normal region (CH1) containing at least the site necessary for light chain binding present in one of the fusions. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain are inserted into separate expression vectors and transfected into a suitable host organism. For further details of bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
[0127]
According to another approach described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be modified to maximize the percentage of heterodimer recovered from the recombinant cell medium. A preferred interface includes at least a portion of the CH3 region of the normal domain of an antibody. In this method, one or more small amino acid side chains at the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg tyrosine or tryptophan). The interface of the second antibody molecule by replacing a compensatory “void” of the same or similar size as the large side chain (s) by replacing the large amino acid side chain with a smaller one (eg alanine or threonine). To generate. This provides a mechanism to increase the yield of heterodimers over other undesirable end products such as homodimers.
[0128]
Bispecific antibodies can be expressed as full-length antibodies or antibody fragments (eg, F (ab ′)₂Bispecific antibodies). Techniques for generating bispecific antibodies from antibody fragments have been described in the literature. For example, bispecific antibody fragments can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) cleaves intact antibodies with proteolytic enzymes to produce F (ab ′)₂A procedure for generating fragments is described. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The resulting Fab ′ fragment is then converted to a thionitrobenzoic acid (TNB) derivative. One of the Fab′-TNBs is then reconverted to Fab′-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equal amount of other Fab′-TNB derivatives to produce bispecific antibodies. The resulting bispecific antibody can be used as an enzyme selective immobilization agent.
[0129]
In addition, Fab ′ fragments can be recovered directly from E. coli and chemically coupled to produce bispecific antibodies. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) is a fully humanized bispecific antibody F (ab ').₂Describes the production of molecules. Each Fab ′ fragment was secreted separately from E. coli and subjected to directed chemical coupling in vitro to form bispecific antibodies. Thus, the formed bispecific antibody can bind to cells that overexpress the ErbB2 receptor and normal human T cells and induce lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. did it.
[0130]
Various techniques for making and isolating bispecific antibodies directly from recombinant cell media are also described. For example, bispecific antibodies are produced using leucine zippers. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zippers from Fos protein and Jun protein were linked to the Fab ′ portions of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers were reduced at the hinge region to form monomers and then reoxidized to form antibody heterodimers. This method can also be utilized for the production of antibody homodimers. The “diabody” technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) provides yet another mechanism for bispecific antibody fragment production. The fragment is linked to the light chain variable region (V_LH chain variable region (V) linked to_H), But the short linker does not allow pairing between two domains on the same chain. Thus, one fragment's V_HAnd V_LThe domain is forced to be the complementary V of another fragment_LAnd V_HPair with the domain, thereby forming two antigen binding sites. Another strategy for making bispecific antibody fragments by the use of single chain Fv (sFv) dimers has also been reported. See Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
[0131]
An antibody having a valence of 3 or more can also be considered. For example, trispecific antibodies can be prepared. For example, Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
A typical bispecific antibody can bind to two different epitopes, at least one of which is derived from a protein antigen of the invention. Alternatively, the anti-antigen arm of an immunoglobulin molecule is linked to a T cell receptor molecule (e.g., CD2, CD3, CD28 or B7) or FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16) on leukocytes. In combination with an arm that binds to an inducible molecule such as the Fc receptor for IgG (Fcγ), a cellular defense mechanism against cells expressing a particular antigen may be focused. Bispecific antibodies can also be used to direct cytotoxic agents to cells expressing a particular antigen. These antibodies possess an antigen binding arm and an arm that binds a cytotoxic agent or a radionuclide chelator such as EOTUBE, DPTA, DOTA or TETA. Another bispecific antibody of interest binds to the protein antigen described herein and further binds tissue factor (TF).
[0132]
Heteroconjugate antibody
Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. A heteroconjugate antibody consists of two antibodies linked by a covalent bond. Such antibodies are for example for targeting cells of the immune system to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980) and for the treatment of HIV infection (WO 91/00360; WO 92/003733; EP03089). ). It is believed that these antibodies can be prepared in vitro using known methods of protein synthesis chemistry, including those involving crosslinkers. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose may include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate and those disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.
[0133]
Effector functional engineering
For example, it may be desirable to modify the antibodies of the present invention with respect to effector function in order to enhance the effectiveness of the antibody in treating cancer. For example, cysteine residue (s) may be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. The homodimeric antibodies thus produced may have improved internalization ability and / or enhanced complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity can also be prepared using heterobifunctional cross-linking agents as described in Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, an antibody having a dual Fc region, thereby having enhanced complement-dependent cell lysis and ADCC ability, can be engineered. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
[0134]
Immune complex
The invention also includes cells such as chemotherapeutic agents, toxins (e.g., enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof) or radioisotopes (i.e., radioconjugates). The present invention relates to an immune complex including an antibody conjugated with a toxic substance.
[0135]
Chemotherapeutic agents useful for the generation of such immune complexes are described above. Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, endotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, avirin A chain, modesin A chain, Alphasarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII and PAP-S), momoridica charantia inhibitor, crucine, crotin, sapaonaria officinalisc inhibitor, gelonin, mitogerin, Listristine, phenomycin, enomycin and trichothecene. Various radionuclides are available for the production of radioconjugated antibodies. As an example,²¹²Bi,¹³¹I,¹³¹In,⁹⁰Y and¹⁸⁶Re may be mentioned.
[0136]
A complex of an antibody and a cytotoxic agent is converted to a bifunctional derivative of N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), an imide ester (such as dimethyl adipimidate HCL Active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bisazide derivatives (such as bis- (p-azidobenzoyl) -hexanediamine), bisdiazonium derivatives (such as bis -(Such as p-diazonium benzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro 2,4-dinitrobenzene) A variety of bifunctional protein coupling agents are used. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Carbon-14 labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is a typical chelating agent for conjugating radionucleotides to antibodies. See WO94 / 11026.
[0137]
In another embodiment, the antibody can be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) for pretargeting the tumor, wherein the antibody-receptor complex is administered to the patient. The unbound complex is then removed from the blood circulation using a scavenger and then a “ligand” (eg, avidin) conjugated to the cytotoxic agent is then administered.
[0138]
Immunoliposome liposome
The antibodies disclosed herein can also be formulated as immunoliposome liposomes. Liposome liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980). And U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545, as known in the art. Liposome liposomes with increased circulation time are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
[0139]
Particularly useful liposomal liposomes can be generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposome liposomes are extruded through a filter with a defined pore size to obtain liposome liposomes of the desired diameter. Fab ′ fragments of the antibodies of the present invention can be bound to liposome liposomes via a disulfide exchange reaction as described in Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982). A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. See Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81 (19): 1484 (1989).
[0140]
Diagnostic application of antibodies directed against the protein of the present invention
Antibodies directed against the proteins of the invention relate to protein localization and / or quantification (eg, use in measuring protein levels in an appropriate physiological sample, use in diagnostic methods, use in protein imaging, etc.) It can be used in a manner known in the art. In certain embodiments, an antibody containing an antigen binding domain for a protein or derivative, fragment, analog, or homologue thereof is utilized as a pharmacologically active compound (see below).
[0141]
Antibodies specific for the protein of the invention can be used to isolate the protein by standard techniques such as immunoaffinity chromatography or immunoprecipitation. Such antibodies can facilitate the purification of naturally derived proteins from cells and recombinantly produced antigens expressed in host cells. Furthermore, such antibodies can be used to detect antigenic proteins (eg, in cell lysates or cell supernatants) to assess the abundance or pattern of the antigenic protein. Antibodies directed against proteins can be used diagnostically to monitor protein levels in tissues as part of a clinical laboratory procedure, for example, to determine the effectiveness of a given treatment. Detection can be facilitated by coupling (ie, physically linking) the antibody to a detectable substance. Examples of detectable substances include various enzymes, combination groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials and radioactive materials. Examples of suitable enzymes may include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase and acetylcholinesterase; examples of suitable formulations may include streptavidin / biotin and avidin / biotin; suitable fluorescent materials Examples of umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; examples of luminescent materials include luminol Examples of bioluminescent materials include luciferase, luciferin and aequorin, examples of suitable radioactive materials include¹²⁵I,¹³¹I,³⁵S or³H may be mentioned.
[0142]
Antibody therapy
The antibodies of the invention, including polyclonal, monoclonal, humanized and fully human antibodies, can be used as therapeutic agents. Such agents are generally used for the treatment or prevention of the disease or lesion of interest. An antibody formulation, preferably one having high specificity and high affinity for its target antigen, is administered to a subject and generally has an effect due to binding to the target. Such an effect is one of two types depending on the specific nature of the interaction between a given antibody molecule and the target antigen in question. In the first case, administration of the antibody may prevent or inhibit binding of the target to the endogenous ligand to which it is bound. In this case, the antibody binds to the target and masks the naturally occurring ligand binding site where the ligand acts as an effector molecule. Thus, the receptor mediates the signaling pathway in which the ligand plays a role.
[0143]
Alternatively, the effect may be that the antibody elicits a physiological result by binding to an effector binding site on the target molecule. In this case, a target that is a receptor having an endogenous ligand that may not be present or defective in the disease or pathology is combined with an antibody as an alternative effector ligand to produce a receptor-based signaling event. Initiated by the receptor.
[0144]
A therapeutically effective amount of an antibody of the invention generally relates to the amount required to achieve a therapeutic purpose. As mentioned above, this may be a binding interaction between an antibody and its target antigen that in certain cases inhibits the function of the target and in other cases promotes a physiological response. The amount required for administration will further depend on the binding affinity of the antibody for the particular antigen and also on the rate at which the administered antibody can be removed from the free volume of the administered subject. The usual range of therapeutically effective doses of an antibody or antibody fragment of the invention can be, by way of non-limiting example, from about 0.1 mg / kg body weight to about 50 mg / kg body weight. The usual number of administrations can range, for example, from twice a day to once a week.
[0145]
Antibody pharmaceutical composition
Antibodies that specifically bind to the proteins of the invention, as well as other molecules identified by the screening assays disclosed herein, can be administered in the form of pharmaceutical compositions for the treatment of various disorders. The principles and considerations involved in the preparation of such compositions, as well as guidelines for component selection, are described, for example, in The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., Editors) Mack Pub. Co. ., Easton, Pa .: 1995, Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994, and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), Provided in 1991, M. Dekker, New York.
[0146]
If the antigenic protein is intracellular and an intact antibody is used as an inhibitor, an internalizing antibody is preferred. However, liposomes can be used to deliver antibodies or antibody fragments into cells. When using antibody fragments, the smallest inhibitory fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, peptide molecules can be designed that retain the ability to bind to the sequence of the target protein based on the sequence of the variable region of the antibody. Such peptides can be synthesized by chemical and / or recombinant DNA techniques. See, for example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). The formulation herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively or in addition, the composition may contain an agent that enhances its function, eg, a cytotoxic agent, cytokine, chemotherapeutic agent, or growth inhibitory agent. Such molecules are conveniently present in combination in amounts that are effective for the intended purpose.
[0147]
The active ingredients are colloidal drug delivery systems, for example in microcapsules prepared by coacervation technology or interfacial polymerization, for example in hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microcapsules, respectively. It can be encapsulated in (eg, liposomes, albumin globules, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions.
[0148]
The formulation to be used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through a sterile filtration membrane.
Sustained release formulations can be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include solid-phase hydrophobic polymer semipermeable matrices containing antibodies, which are in the form of shaped articles such as films or microcapsules, for example. Yes. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol), polylactide (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and Degradable lactic acid such as γ-ethyl-L-glutamate copolymer, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT® (injectable microspheres comprising lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) Glycolic acid copolymers include polymers such as ethylene vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid, which can release molecules over 100 days, while certain hydrogels release proteins in a shorter period of time.
[0149]
ELISA assay
The agent that detects the analyte protein is an antibody capable of binding to the analyte protein, preferably an antibody with a detectable label. The antibody may be polyclonal or more preferably monoclonal. Complete antibodies or fragments thereof (eg F_abOr F_{( ab ) 2}) Can be used. The term “label” refers to a direct labeling of a probe or antibody by coupling (ie, physically linking) a detectable substance to the probe or antibody with respect to the probe or antibody, as well as another It is intended to include indirect labeling of probes or antibodies by reactivity with drugs. Examples of indirect labeling include detection of the first antibody using a fluorescently labeled second antibody and end labeling of the DNA probe with biotin so that it can be detected with fluorescently labeled streptavidin. The term “biological sample” is intended to include tissues, cells and biological fluids isolated from a subject, as well as tissues, cells and fluids present within a subject. Thus, the term “biological sample” can include blood fractions or components including blood and serum, plasma, or lymph. That is, the detection methods of the present invention can be used to detect analyte mRNA, protein or genomic DNA in a biological sample in vitro as well as in vivo. For example, in vitro techniques for the detection of analyte mRNA may include Northern hybridization and in situ hybridization. Analytical protein in vitro detection techniques may include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot, immunoprecipitation and immunofluorescence. A technique for in vitro detection of analyte DNA may include Southern hybridization. The procedure for performing an immunoassay is described, for example, in `` ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology '', Vol. 42, JR Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995, `` Immunoassay '', E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996, and “Practice and Thory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. In addition, techniques for in vivo detection of analyte proteins include introducing labeled anti-analyte protein antibodies into a subject. For example, the antibody can be labeled with a radioactive marker whose presence or localization in a subject can be detected by standard imaging techniques.
[0150]
NOVX recombinant expression vector and host cell
Another aspect of the invention relates to a vector, preferably an expression vector, containing a nucleic acid encoding a NOVX protein or derivative, fragment, analog or homologue thereof. As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid bound thereto. One type of vector is a “plasmid”, which refers to a circular double stranded DNA loop with additional DNA segments attached to it. Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome. Certain vectors can be autonomously amplified in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and mammalian episomal vectors). Other vectors (eg, mammalian non-episomal vectors) can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, thereby replicating along with the host genome. In addition, certain vectors are capable of directing the expression of genes that are operably linked to them. Such vectors are referred to herein as “expression vectors”. In general, expression vectors useful in recombinant DNA technology are often in the form of plasmids. In the present specification, “plasmid” and “vector” may be used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the present invention is intended to include other forms of expression vectors such as viral vectors with equivalent functions (eg, retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses lacking replication ability).
[0151]
A recombinant expression vector of the invention comprises a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell, which expresses a recombinant expression virus selected based on the host cell used for expression. It is meant to include one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence of interest. Within a recombinant expression vector, “operably linked” means that the nucleic acid sequence of interest is capable of expressing the nucleic acid sequence (eg, in an in vitro transcription / translation system or by introducing the vector into a host cell). In this case, it is meant to be bound to a regulatory sequence (in the host cell).
[0152]
The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). Such regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulatory sequences include those that direct constitutive expression of nucleotide sequences in many types of host cells and those that direct expression of nucleotide sequences only in specific host cells (e.g., tissue-specific regulatory sequences). obtain. Those skilled in the art will appreciate that the design of the expression vector may depend on factors such as the choice of host cells to transform, the expression level of the desired protein, and the like. A protein or peptide comprising a fusion protein or peptide encoded by a nucleic acid as described herein (e.g., NOVX protein, mutant form of NOVX protein, fusion) by introducing an expression vector of the invention into a host cell Protein and the like).
[0153]
The recombinant expression vectors of the invention can be designed for NOVX protein expression in prokaryotic or eukaryotic cells. For example, NOVX protein can be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast cells or mammalian cells. Suitable host cells are further discussed in Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternatively, the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
[0154]
Protein expression in eukaryotic cells is most often performed using vectors containing constitutive or inducible promoters that direct the expression of either fusion or non-fusion proteins in Escherichia coli. Fusion vectors add a number of amino acids to the protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. Such fusion vectors typically serve three purposes: (i) to increase expression of the recombinant protein; (ii) to increase the solubility of the recombinant protein; and (iii) in affinity chromatography. To help purify recombinant protein by acting as a ligand. Often, in fusion expression vectors, proteolytic cleavage sites are introduced at the junction of the fusion moiety and the recombinant protein to allow purification of the fusion protein following separation of the recombinant protein from the fusion moiety. Such enzymes, and their homologous recognition sequences, may include Factor Xa, thrombin and enterokinase. Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31) in which glutathione S-transferase (GST), maltose E-binding protein, or protein A is fused to a target recombinant protein, respectively. -40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) And pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ).
[0155]
Examples of suitable inducible non-fused E. coli expression vectors include pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).
[0156]
One strategy to maximize protein expression in E. coli is to express the protein in a host cell that has impaired the ability to proteolytically cleave the recombinant protein. See Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Another strategy is to alter the nucleic acid sequence of the nucleic acid inserted into the expression vector so that individual codons for each amino acid are preferentially used in E. coli (eg, Wada, et al. al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118). Such alteration of the nucleic acid sequences of the present invention can be made by standard DNA synthesis techniques.
[0157]
In another embodiment, the NOVX expression vector is a yeast expression vector. Examples of expression vectors in yeast Saccharomyces cerivisae include pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), And picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
[0158]
Alternatively, NOVX can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors. Examples of baculovirus vectors that can be used for protein expression in cultured insect cells (eg, SF9 cells) include the pAc series (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series. (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).
[0159]
In yet another embodiment, the nucleic acids of the invention can be expressed in mammalian cells using mammalian expression vectors. Examples of mammalian expression vectors may include pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). When used in mammalian cells, the expression vector's control functions are often provided by viral regulatory elements. For example, commonly used promoters are derived from polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus and simian virus 40. For other expression systems suitable for both prokaryotic and eukaryotic cells, see, for example, Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor See Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
[0160]
In another embodiment, the recombinant mammalian expression vector is capable of preferentially directing the expression of a nucleic acid in a particular cell type (e.g., using tissue-specific regulatory elements to express the nucleic acid). ). Tissue specific regulatory elements are known in the art. Non-limiting examples of suitable tissue specific promoters include albumin promoters (liver specific; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid specific promoters (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), especially T cell receptors (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) and immunoglobulins (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729) -740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), neuron-specific promoters (eg, neurofilament promoters; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477 ), Pancreas-specific promoters (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), and mammary gland-specific promoters (eg, whey; US Pat. No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264, 166). For example, the developmentally regulated promoters of the mouse hox promoter (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) and the α-fetoprotein promoter (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546) Include.
[0161]
The present invention further provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule of the present invention cloned in an antisense orientation into the expression vector. That is, the DNA molecule is operably linked to regulatory sequences in a manner that allows expression of an RNA molecule that is antisense to NOVX mRNA (by transcription of the DNA molecule). Selecting regulatory sequences, such as viral promoters and / or enhancers, operably linked to the nucleic acid cloned into the antisense orientation that directs the sequential expression of the antisense RNA molecule in various cell types A regulatory sequence can be selected that directs tissue-specific or cell-type-specific constitutive expression of the antisense RNA. Antisense expression vectors can be in the form of recombinant plasmids, phagemids or attenuated viruses that produce antisense nucleic acids under the control of a highly efficient regulatory region whose activity is determined by the cell type into which the vector has been introduced. See, for example, Weintraub, et al., “Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis” Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986, for a discussion of the regulation of gene expression using antisense genes. I want.
[0162]
Another aspect of the invention pertains to host cells into which a recombinant expression vector of the invention has been introduced. The terms “host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably herein. It is understood that such terms refer not only to the particular subject cell, but also to the progeny or potential progeny of such a cell. Such progeny may not actually be identical to the parent cell, as the mutations or environmental effects may cause certain modifications in later generations, but the scope of the terms used herein Still included.
[0163]
The host cell can be any prokaryotic or eukaryotic cell. For example, NOVX protein can be expressed in bacterial cells such as E. coli, insect cells, yeast or mammalian cells (Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells). Other suitable host cells are well known to those skilled in the art.
[0164]
Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques. As used herein, the terms “transformation” and “transfection” refer to foreign nucleic acids (eg, DNA) including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran mediated transfection, lipofection, or electroporation. It shall refer to various techniques recognized in the art for introduction into a host cell. Suitable methods for transforming or transfecting host cells include MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and others. Can be found in the laboratory manual.
[0165]
For stable transfection of mammalian cells, depending on the expression vector used and the transfection technique, a small fraction of the cell can incorporate foreign DNA into its genome. In order to identify and select these integrants, a selectable marker (eg, resistance to antibiotics) is generally introduced into the host cells along with the gene of interest. Various selectable markers include those that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate. Nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding NOVX or can be introduced on a separate vector. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (eg, cells that incorporate a selectable marker survive while other cells die).
[0166]
A host cell of the invention, such as a prokaryotic or eukaryotic cell in culture, can be used to produce (ie, express) NOVX protein. Therefore, the present invention further provides a method for producing NOVX protein using the host cell of the present invention. In one embodiment, the method comprises culturing a host cell of the invention (into which a recombinant expression vector encoding NOVX protein is introduced) in a suitable medium that produces NOVX protein. Including. In another embodiment, the method further comprises isolating NOVX protein from the medium or the host cell.
[0167]
Transgenic NOVX animals
The host cells of the invention can also be used to produce non-human transgenic animals. For example, in one embodiment, the host cell of the invention is a fertilized oocyte or embryonic stem cell into which a NOVX protein coding sequence is introduced. A non-human transgenic animal that uses such a host cell to introduce an exogenous NOVX sequence into the genome, or a homologous recombinant animal that alters an endogenous NOVX sequence therein Can be created. Such animals are useful for studying NOVX protein function and / or activity, and for identifying and / or evaluating modulators of NOVX protein activity. As used herein, a “transgenic animal” is a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a rat or mouse, in which one or more cells of the animal contain the transgene. It is a tooth. Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, amphibians, and the like. The transgene is incorporated into the genome of the cell from which the transgenic animal develops and remains in the genome of the mature animal, thereby coding in one or more cell types or tissues of the transgenic animal. This is an exogenous DNA that directs the expression of a modified gene product. As used herein, “homologous recombinant animal” refers to an endogenous NOVX gene introduced into the endogenous gene and animal cells, eg, animal embryo cells, prior to animal development. A non-human animal, preferably a mammal, more preferably a mouse, which has been altered by homologous recombination with an exogenous DNA molecule.
[0168]
The transgenic animal of the present invention introduces a nucleic acid encoding NOVX into the male pronucleus of a fertilized oocyte (eg, by microinjection, retroviral infection), and the oocyte is injected into a pseudopregnant female foster animal. It can be created by allowing it to occur in the body. The human NOVX cDNA sequence of any of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46) can be introduced as a transgene into the genome of a non-human animal. Alternatively, a non-human homologue of the human NOVX gene, such as the mouse NOVX gene, can be isolated based on hybridization with human NOVX cDNA (detailed further above) and used as a transgene. Intron sequences and polyadenylation signals can also be included in the transgene to increase the expression efficiency of the transgene. Tissue specific regulatory sequences can be operably linked to the NOVX transgene to direct expression of the NOVX protein to specific cells. Methods for producing transgenic animals, particularly animals such as mice, by embryo manipulation and microinjection have become conventional in the art, for example, US Pat. No. 4,736,866; 4,870,009. And 4,873,191; and Hogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Similar methods can be used to produce other transgenic animals. Primary transgenic animals can be identified based on the presence of NOVX transgenes in the genome and / or expression of NOVX mRNA in animal tissues or cells. The primary transgenic animals can then be used to breed additional animals carrying the transgene. In addition, a transgenic animal carrying a transgene encoding a NOVX protein can be used to breed additional transgenic animals carrying other transgenes.
[0169]
A vector containing at least part of a NOVX gene into which deletions, additions or substitutions have been introduced into it in order to create homologous recombinant animals, thereby altering the NOVX gene, for example functionally disrupting To prepare. The NOVX gene can be a human gene (for example, the cDNA of any of SEQ ID NOs: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46)), more preferably a non-human homologue of the human NOVX gene. is there. For example, a homologous set suitable for altering the endogenous NOVX gene in the mouse genome using the mouse homologue of the human NOVX gene of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46) Replacement vectors can be constructed. In one embodiment, the vector is designed to functionally disrupt an endogenous gene (ie, no longer encodes a functional protein; also referred to as a “knockout” vector) by homologous recombination.
[0170]
Alternatively, the vector mutates or otherwise alters the endogenous NOVX gene by homologous recombination, but still encodes a functional protein (e.g., alters the upstream regulatory region thereby changing the endogenous To alter the expression of sex NOVX protein). In a homologous recombination vector, the altered protein of the NOVX gene is bound to the endogenous NOVX gene and embryonic stem cells carried by the vector adjacent to the 5 'end or 3' end by additional nucleic acids of the NOVX gene. Allows homologous recombination to occur between NOVX genes. Yet another flanking NOVX nucleic acid is of sufficient length to allow successful homologous recombination with the endogenous gene. Typically, a few kilobases of contiguous DNA (both 5 'and 3' ends) can be included in the vector. For a description of homologous recombination vectors, see, for example, Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503. The vector is then introduced into an embryonic stem cell line (eg, by electroporation) and cells in which the introduced NOVX gene is homologously recombined with the endogenous NOVX gene are selected. See, for example, Li, et al., 1992. Cell 69: 915.
[0171]
The selected cells are then injected into an animal (eg, mouse) blastocyst to form an aggregated chimera. See, for example, Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152. The chimeric embryo is then implanted into a suitable pseudopregnant female foster animal, and the embryo is delivered at term. Using progeny holding DNA homologously recombined in germ cells, all cells of the animal will breed animals containing homologous recombinant DNA by germline transmission of the transgene be able to. Methods for constructing homologous recombination vectors and homologous recombination animals are described in Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; PCT International Publication No .: WO 90/11354; WO 91/01140; WO 92/0968. And further described in WO 93/04169.
[0172]
In another embodiment, non-human transgenic animals can be produced that contain selected systems that allow for regulated expression of the transgene. One example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. For a description of the cre / loxP recombinase system, see for example Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236. Another example of a recombinase system is the Saccharomyces cerevisiae FLP recombinase system. See O'Gorman, et al., 1991. Science 251: 1351-1355. If a cre / loxP recombinase system is used to regulate transgene expression, an animal containing a transgene encoding both the Cre recombinase and the selected protein is required. Such animals are, for example, “double” transgenic animals by mating two transgenic animals, one containing a transgene encoding the selected protein and the other containing a transgene encoding a recombinase. It can be provided by constructing.
[0173]
Non-human transgenic animal clones described herein can also be produced according to the method described in Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813. Briefly, cells (eg, somatic cells) are isolated and induced from a transgenic animal, exiting the growth cycle, and₀You can enter the period. The quiescent cells can then be fused with enucleated oocytes from the same type of animal from which the quiescent cells were isolated, for example, by use of electric pulses. The reconstituted oocyte is then cultured such that it develops into a morula or blastocyst and then introduced into a pseudopregnant female foster animal. The offspring born from this female foster animal is an animal clone that isolates cells (eg, somatic cells).
[0174]
Pharmaceutical composition
Incorporating the NOVX nucleic acid molecules, NOVX proteins, anti-NOVX antibodies (also referred to herein as “active compounds”), and their derivatives, fragments, analogs and homologues of the present invention into pharmaceutical compositions suitable for administration obtain. Typically, such compositions comprise a nucleic acid molecule, protein or antibody and a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like that are compatible with pharmaceutical administration. Intended to include. Suitable carriers are described in the latest edition of Remington's pharmacology, a standard reference text in this field, which is hereby incorporated by reference. Preferred examples of such carriers or excipients include, but are not limited to, water, saline, finger solutions, glucose solutions and 5% human serum albumin. Water-insoluble vehicles such as liposomes and fatty oils are also used. Such media and agents for pharmaceutically active substances are well known in the art. Unless any conventional media or agents are compatible with the active compounds, their use in the compositions is contemplated. Supplementary active compounds can also be incorporated into the compositions.
[0175]
A pharmaceutical composition of the invention is formulated to be compatible with its intended route of administration. Examples of routes of administration may include parenteral, e.g., intravenous, intradermal, subcutaneous, oral (e.g. inhalation), transdermal (i.e. topical), transmucosal and rectal administration. . Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal or subcutaneous applications may include the following components: sterile excipients such as water for injections, saline solutions, fatty oils, polyethylene glycols, Glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); Buffers such as acid salts or phosphates, and agents that adjust isotonicity such as sodium chloride or glucose. The pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. The parenteral preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple use vials made of glass or plastic.
[0176]
Pharmaceutical compositions suitable for injection may include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile powders for preparations prepared as necessary in sterile injectable solutions or dispersions. For intravenous administration, suitable carriers may include physiological saline, bacteriostatic water, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J.) or phosphate buffered saline (PBS). In all cases, the composition must be sterile and should be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Protection of microbial action is achieved by various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[0177]
By incorporating the active compound (eg, a NOVX protein or anti-NOVX antibody) in the required amount, together with one or a combination of the above-listed ingredients, in a suitable solvent, and then sterile sterilizing, followed by filter sterilization Can be prepared. Generally, dispersions can be prepared by incorporating the active compound into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the method of preparation involves vacuum drying and freezing to produce a powder of the active ingredient plus any further desired ingredient powder from the pre-sterile filtered solution. It is dry.
[0178]
Oral compositions generally include an inert excipient or edible carrier. They can be enclosed in gelatin capsules or compressed into tablets. For the purpose of oral therapeutic administration, the active compound can be incorporated with additives and used in the form of tablets, troches, or capsules. Oral compositions can also be prepared using a liquid carrier for use as a mouthwash, where the compound in the liquid carrier is applied orally, quickly removed, and exhaled or swallowed. Pharmaceutically compatible binding agents, and / or adjuvant materials can be included as part of the composition. Tablets, pills, capsules, troches and the like may contain any of the following ingredients or compounds with similar properties: binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth or gelatin; additives such as starch or lactose, alginic acid Disintegrants such as primogel or corn starch; lubricants such as magnesium stearate or sterote; slip agents such as colloidal silicon dioxide; sweeteners such as sucrose or saccharin; or mint, methyl salicylate, orange A fragrance like perfume.
[0179]
For administration by inhalation, the compounds can be delivered in the form of an aerosol spray from a pressurized container or dispenser which contains a suitable propellant, eg, a gas such as carbon dioxide, or a nebulizer.
[0180]
Systemic administration can also be obtained by transmucosal or transdermal means. For transmucosal or transdermal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are generally known in the art and may include detergents, bile salts, fusidic acid derivatives, for example, for transmucosal administration. Transmucosal administration can be accomplished through the use of nasal sprays or suppositories. For transdermal administration, the active compounds are formulated into ointments, ointments, gels, or creams as generally known in the art.
[0181]
The compounds can also be prepared in the form of suppositories (eg, with conventional suppository bases such as cocoa butter and other glycerides) or retention enemas for rectal delivery.
[0182]
In one embodiment, the active compounds are prepared with carriers that will prevent the compound from rapid elimination from the body, such as a controlled release formulation, including implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable and biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polyacetic acid. It will be clear to those skilled in the art how to prepare such formulations. Materials are also commercially available from Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomal suspensions (including liposomes targeted from infected cells with monoclonal antibodies to viral antibodies) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These can be prepared according to methods known to those skilled in the art, for example, as described in US Pat. No. 4,522,811.
[0183]
It is especially advantageous to formulate oral or parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, unit dosage form refers to a physically discrete unit suitable as a single dosage for the subject being treated; each unit together with the required pharmaceutical carrier. Contains a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect. The unit dosage form specifications of the present invention are dictated by the unique features of the active compound and the particular therapeutic effect to be achieved, as well as limitations inherent in the art to formulate such active compounds for the treatment of individuals. And depends directly.
[0184]
The nucleic acid molecule of the present invention can be inserted into a vector and used as a gene therapy vector. Gene therapy vectors can be obtained, for example, by intravenous injection, by local administration (see, eg, US Pat. No. 5,328,470) or by tactile injection (see, for example, Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). A pharmaceutical formulation of a gene therapy vector can include a gene therapy vector in an acceptable excipient, or can include a sustained matrix having the gene therapy vector embedded therein. Alternatively, where a complete gene therapy vector can be produced intact from a recombinant cell, such as a retrovirus vector, the pharmaceutical formulation can include one or more cells producing a gene delivery system.
The pharmaceutical formulation may be included in a container, pack or dispenser along with instructions for administration.
[0185]
Screening and detection methods
As detailed below, the isolated nucleic acid molecules of the invention are used to express NOVX protein (eg, via a recombinant expression vector in a host cell in gene therapy applications) and NOVX mRNA (eg, an organism Genetic deficiencies in) or NOVX genes can be detected and NOVX activity can be modulated. In addition, NOVX protein is used to screen for drugs or compounds that modulate NOVX protein activity or expression, as well as poor or excessive production of NOVX protein, or reduced or abnormal compared to NOVX wild-type protein Diseases characterized by the production of NOVX protein types with various activities (eg; diabetes (modulate insulin release); obesity (lipid binding and transport); obesity-related metabolic disorders, metabolic syndrome X and chronic disorders And anorexia and debilitating disorders associated with various cancers, as well as infectious diseases (with antimicrobial activity) and various dyslipidemias.In addition, the anti-NOVX antibodies of the present invention may be used. NOVX protein can be detected and isolated, and NOVX activity can be modulated. Can be used in methods to affect appetite, nutrient absorption and disposal of metabolic substrates in both positive and negative ways.
The invention further relates to novel agents identified in the screening assays described herein and their use for the treatments described above.
[0186]
Screening assay
The present invention relates to modulators, ie candidates or test compounds or agents (eg peptides, peptidomimetics) that bind to the NOVX protein or have a promoting or inhibitory effect on, for example, the expression of NOVX protein or the activity of NOVX protein. , Small molecules or other drugs) (also referred to herein as “screening assays”). The present invention also includes compounds identified in the screening assays described herein.
[0187]
In one embodiment, the invention provides an assay for screening candidate or test compounds that bind to or modulate the activity of a membrane-bound NOVX protein or polypeptide or biologically active portion thereof. To do. Test compounds of the present invention can be obtained from biological libraries; spatially addressable parallel solid or liquid phase libraries; synthetic library methods that require deconvolution; “one bead one compound” library Can be obtained using any of a number of approaches in combinatorial libraries well known in the art, including: methods; and synthetic library methods using affinity chromatography selection. The biological library approach is limited to peptide libraries, while the other four approaches are applicable to peptide, non-peptide oligomer or small molecule libraries of compounds. See, for example, Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145.
[0188]
As used herein, “small molecule” refers to a composition having a molecular weight of less than about 5 kD, most preferably less than about 4 kD. Small molecules can be, for example, nucleic acids, peptides, polypeptides, peptidomimetics, carbohydrates, lipids or other organic or inorganic molecules. Biological mixtures, such as chemical and / or fungal, bacterial, or algae extracts are known in the art and can be screened using any assay of the present invention.
[0189]
Examples of molecular library synthesis methods are described in, for example, DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909, Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. : 11422, Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678, Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059, Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, and Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233 Get a headline.
[0190]
A library of compounds can be obtained in solution (eg, Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421) or on beads (Lam, 1991. Nature 354: 82-84) on a chip (Fodor, 1993. Nature 364: 555-556), bacteria (Ladner, US Pat. No. 5,223,409), spores (Ladner, US Pat. No. 5,233,409), plasmids (Cull, et al., 1992. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) or on phage (Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406, Cwirla, et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310, Ladner, US Pat. No. 5,233,409).
[0191]
In some embodiments, the assay is a cell-based assay, wherein a cell expressing a membrane-bound NOVX protein or biologically active portion thereof on the cell surface is contacted with the test compound and the test compound is present The ability to bind to NOVX protein is measured. The cells can be, for example, mammalian or yeast cells. Measuring the ability of a test compound to bind to the NOVX protein can be accomplished, for example, by coupling the test compound with a radioisotope or enzyme label to bind the test compound to the NOVX protein or biologically active portion thereof. The measurement is made possible by detecting the labeled compound in the complex. For example, the test compound¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C or³Label directly or indirectly with H and detect the radioisotope by direct counting of radiation or scintillation counting. Alternatively, the test compound is enzymatically labeled, for example, with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, or luciferase, and the enzyme label is detected by measuring conversion of the appropriate substrate to product. In one embodiment, the assay comprises contacting a cell expressing a membrane-bound NOVX protein or biologically active portion thereof on the cell surface with a known compound that binds to NOVX to form an assay mixture. Contacting the assay mixture with the test compound and measuring the ability of the test compound to interact with the NOVX protein, wherein measuring the ability of the test compound to interact with the NOVX protein is determined by the test Measuring the ability of a compound to bind preferentially to a NOVX protein or biologically active portion thereof compared to a known compound.
[0192]
In another embodiment, the assay is a cell-based assay, contacting a cell that expresses a membrane-bound NOVX protein or biologically active portion thereof on the cell surface with a test compound, and the test compound is NOVX Measuring the ability to modulate (eg, promote or inhibit) the activity of a protein or biologically active portion thereof. Measuring the activity of a test compound that modulates the activity of NOVX or a biologically active portion thereof is, for example, by measuring the ability of a NOVX protein to bind to or interact with a NOVX target molecule. Can be achieved. As used herein, a “target molecule” is a molecule that binds or interacts with a NOVX protein that is naturally occurring, such as a cell surface molecule that expresses a protein that interacts with a NOVX or NOVX, A cell surface molecule, a molecule in the extracellular environment, a molecule associated with the inner surface of the cell membrane or a cytoplasmic molecule. The target molecule of NOVX can be a non-NOVX molecule or a NOVX that is a NOVX protein or polypeptide of the invention. In one embodiment, a NOVX target molecule of NOVX is a signal transduction that facilitates the transmission of extracellular signals (eg, signals generated by compound binding to membrane-bound NOVX molecules) through and into the cell membrane. It is a component of the pathway. The target can be, for example, a second intracellular protein with catalytic activity or a protein that promotes the association of a downstream signal molecule with NOVX.
[0193]
Measuring the ability of a NOVX protein to bind to or interact with a NOVX target molecule can be accomplished by one of the methods described above that measure direct binding. In one embodiment, measuring the ability of a NOVX protein to bind or interact with a target molecule of NOVX or NOVX can be accomplished by measuring the activity of the target molecule. For example, the activity of the target molecule can be determined by modulating the target cellular second messenger (ie, intracellular Ca²⁺, Diacylglycerol, IP₃NOVX operably linked to a nucleic acid encoding a receptor gene (a detectable marker, eg, luciferase), detecting the induction of the target, against the appropriate substrate, etc. Can be measured by detecting the induction of (including responsive regulatory elements) or by detecting a cellular response, eg, cell survival, cell differentiation, or cell proliferation.
[0194]
In yet another embodiment, the assay of the present invention is a cell-free assay, wherein a NOVX protein or biologically active portion thereof is contacted with a test compound, and the test compound is NOVX protein or biological thereof Measuring the ability to bind to an active moiety. Binding of the test compound to the NOVX protein can be measured either directly or indirectly as described above. In one such embodiment, the assay comprises contacting the NOVX protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds NOVX to form an assay mixture, contacting the assay mixture with the test compound. And measuring the ability of a test compound to interact with a NOVX protein, wherein measuring the ability of a test compound to interact with a NOVX protein includes determining that the test compound is a NOVX protein or organism thereof. Measuring the ability to bind preferentially to a chemically active moiety compared to a known compound.
[0195]
In yet another embodiment, the assay contacts a NOVX protein or biologically active protein thereof with a test compound, and the test compound modulates the activity of the NOVX protein or biologically active protein thereof ( A cell-free assay that involves measuring the ability to (eg promote or inhibit). Measuring the ability of a test compound to modulate the activity of NOVX can be achieved, for example, by one of the methods described above for measuring direct binding to the NOVX protein binding activity to a target molecule of NOVX. it can. In yet another embodiment, measuring the ability of a test compound to modulate the activity of a NOVX protein can be accomplished by measuring the ability of the NOVX protein to modulate an additional NOVX target molecule. For example, the catalytic / enzymatic activity of the target molecule against the appropriate substrate can be measured as described above.
[0196]
In yet another embodiment, the cell-free assay comprises contacting the NOVX protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds to the NOVX protein to form an assay mixture, wherein the assay mixture is a test compound. And measuring the ability of the test compound to interact with the NOVX protein, wherein measuring the ability of the test compound to interact with the NOVX protein is a target of NOVX with the NOVX protein. Measuring the ability to bind preferentially to a molecule or modulate its activity.
[0197]
The cell-free assay of the present invention can be used for both soluble or membrane-bound NOVX proteins. In the case of cell-free assays involving membrane-bound NOVX protein, it is desirable to utilize a solubilizing agent so that the membrane-bound NOVX protein is maintained in solution. Examples of such solubilizers include n-octyl glucoside, n-dodecyl glucoside, n-dodecyl maltoside, octanoyl-N-methylglucamide, decanoyl-N-methylglucamide, Triton® X- 100, Triton (registered trademark) X-114, Thesit (registered trademark), isotridecipoly (ethylene glycol ether)_nNonionic surfactants such as N-dodecyl-N, N-dimethyl-ammonio-1-propanesulfonate, 3- (3-chloroamidopropyl) dimethylaminol-1-propanesulfonate (CHAPS), or 3 Mention may be made of-(3-chloroamidopropyl) dimethylaminol-2hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO).
[0198]
In two or more embodiments of the above assay methods of the invention, the NOVX protein or target molecule thereof may be immobilized to facilitate separation of the complex form from the uncomplexed form of one or both proteins, as well as the assay. Can adapt to automation. Binding of the test compound to the NOVX protein or the interaction of the NOVX protein with the target molecule in the presence and absence of the candidate compound can be achieved in any container suitable for containing the reactants. Examples of such containers may include microtiter plates, test tubes, and microcentrifuge tubes. In one embodiment, a fusion protein can be provided that adds a domain that allows one or both proteins to be bound to a matrix. For example, GST-NOVX fusion protein or GST-target fusion protein is adsorbed onto a microtiter plate derivatized with glutathione Sepharose beads (Sigma Chemical, St. Louis, MO) or glutathione, which is then tested or tested The compound and either non-adsorbed target protein or NOVX protein are bound and the mixture is incubated under conditions that promote complex formation (eg, physiological conditions with respect to salt and pH). After incubation, the beads or microtiter plate holes are washed to remove any unbound components, in the case of beads, the matrix is immobilized, and the complex is measured directly or indirectly, eg as described above. . Alternatively, the complex can be dissociated from the matrix and the level of NOVX protein binding or activity measured using standard techniques.
[0199]
Other techniques for immobilizing proteins on a matrix can also be used in the screening assays of the invention. For example, either the NOVX protein or its target molecule can be immobilized utilizing the binding of biotin and streptavidin. A biotinylated NOVX protein or target molecule is prepared from biotin-NHS (N-hydroxy-succinimide) using techniques well known in the art (eg, biotinylated kit, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) To prepare streptavidin Can be immobilized in holes in a 96-well plate coated with (Pierce Chemical). Alternatively, an antibody that is reactive with the NOVX protein or target molecule but does not interfere with the binding of the NOVX protein to the target protein is derivatized into a hole in the plate to bind the unbound target or NOVX protein to the antibody. Can be captured in the hole. Methods for detecting such complexes include, in addition to those described above for GST-immobilized complexes, immunodetection of complexes using antibodies that react with NOVX proteins or target molecules, and NOVX proteins or target molecules. Mention may be made of enzyme binding assays that rely on detecting the relevant enzyme activity.
[0200]
In another embodiment, a modulator of NOVX protein expression is identified by a method of contacting a cell with a candidate compound and measuring expression of NOVX mRNA or protein in the cell. The expression level of NOVX mRNA or protein in the presence of the candidate compound is compared to the expression level of NOVX mRNA or protein in the absence of the candidate compound. Candidate compounds can then be identified as NOVX mRNA or protein modulators based on this comparison. For example, a candidate compound is identified as a promoter of NOVX mRNA or protein expression when the expression of NOVX mRNA or protein is greater in the presence of the candidate compound (ie, statistically significantly higher) than in the absence . Alternatively, if the expression of NOVX mRNA or protein is less in the presence of the candidate compound (ie, statistically significantly less) in the presence of the candidate compound, the candidate compound may be an inhibitor of NOVX mRNA or protein expression. Identify as The level of expression of NOVX mRNA or protein in the cell can be measured by the methods described herein for detecting NOVX mRNA or protein.
[0201]
In yet another embodiment of the invention, the NOVX protein is a two-hybrid assay or a three-hybrid assay (eg, US Pat. No. 5,283,317, Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232, Madura, et al., 1993). J. Biol. Chem. 268: 12046-12054, Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924, Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696, and Brent WO 94/10300. Can be used to identify other proteins that bind or interact with NOVX to modulate NOVX activity (“NOVX binding protein” or “NOVX-bp”). Such NOVX binding proteins are also involved, for example, in signal amplification by NOVX proteins as elements upstream or downstream of the NOVX pathway.
[0202]
The two-hybrid system is based on the modular nature of most transcription factors consisting of separable DNA binding and activation domains. Briefly, the assay utilizes two different DNA constructs. In one construct, the gene encoding NOVX is fused to a gene encoding the DNA binding domain of a known transcription factor (eg, GAL-4). In other constructs, DNA from a DNA sequence library encoding an unidentified protein ("prey" or "sample") is fused to a gene encoding the activation domain of a known transcription factor. If the “bait” and “prey” proteins can interact in vivo to form a NOVX-dependent complex, the DNA binding and activation domains of transcription factors can be drawn closer together. This proximity allows transcription of a reporter gene (eg, LacZ) operably linked to a transcriptional regulatory site responsive to the transcription factor. Reporter gene expression can be detected, cell colonies containing functional transcription factors can be isolated and used to obtain cloned genes that encode proteins that interact with NOVX.
The invention further relates to novel agents identified by the aforementioned screening assays and their use in the treatments described herein.
[0203]
Detection assay
A portion or fragment of a cDNA identified herein (and the corresponding complete gene sequence) can be used in various ways as a polynucleotide reagent. By way of example, and without limitation, these sequences: (i) map each gene on the chromosome; thus locate the gene region associated with the genetic disease; (ii) from a trace biological sample It can be used to help identify forensic identification of individuals (tissue typing); and (iii) biological samples. Some of these applications are described in the following subsections.
[0204]
Chromosome mapping
Once a gene sequence (or part of a sequence) is isolated, this sequence can be used to map the position of the gene on the chromosome. This method is called chromosome mapping. Accordingly, a portion or fragment of the NOVX sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46), or a fragment or derivative thereof, is used to position the NOVX gene on the chromosome, respectively. Can be mapped. Mapping NOVX sequences to the chromosome is an important first step in correlating these sequences with genes associated with disease.
[0205]
Briefly, the NOVX gene can be mapped to a chromosome by preparing PCR primers (preferably 15-25 bp long) from the NOVX sequence. Computer analysis of NOVX sequences can be used to quickly select primers that span no more than two exons in genomic DNA, thus complicating the amplification process. These primers can then be used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Those hybrids containing the human gene corresponding to the NOVX sequence produce an amplified fragment.
[0206]
Somatic cell hybrids are prepared by fusing somatic cells from different mammals (eg, human and mouse cells). As hybrids of human and mouse cells grow and divide, they gradually delete human chromosomes in a random order, but retain mouse chromosomes. Mouse cells cannot grow because they lack specific enzymes, but human cells retain one human chromosome containing the gene encoding the required enzyme by using a medium that can grow. A panel of hybrid cell lines can be established by using various media. Each cell line in the panel contains a single human chromosome or a small number of human chromosomes, and a complete set of mouse chromosomes, allowing individual genes to be easily mapped to specific human chromosomes. See, for example, D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924. Somatic cell hybrids containing only fragments of human chromosomes can also be produced by using human chromosomes with translocations and deletions.
[0207]
PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure that maps a specific sequence to a specific chromosome. Using a single thermal cycler, it is possible to associate three or more sequences per day. By designing oligonucleotide primers with NOVX sequences, a detailed localization site specification can be achieved using a panel of fragments from specific chromosomes.
[0208]
Fluorescence in situ hybridization (FISH) of DNA sequences to metaphase chromosome spreads can further be used to provide precise chromosomal locations in one step. Chromosome spreads can be generated using cells that are blocked at metaphase by chemicals that disrupt the spindle, such as colcemid. Chromosomes can be briefly treated with trypsin and then Giemsa stained. A pattern of light and dark bands appears on each chromosome so that the chromosomes can be individually identified. FISH technology can be used with DNA sequences as short as 500 or 600 bases. However, clones larger than 1,000 bases are more likely to bind to specific chromosomal locations with signal intensity sufficient for simple detection. Preferably 1,000 bases and more preferably 2,000 bases are sufficient to obtain good results in a reasonable time. For a review of this technology, see Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988).
[0209]
Use individual chromosome mapping reagents to label a single chromosome or a single site on that chromosome, or use a panel of reagents to label multiple sites and / or multiple chromosomes Can do. Reagents corresponding to non-coding regions of the gene are actually preferred for mapping purposes. The coding region is more likely to be conserved within the gene family, thus increasing the chance of cross-hybridization during chromosomal mapping.
[0210]
Once a sequence is mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data is found, for example, in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (available online through Hopkins University Welch Medical Library). The relationship between the genes mapped to the same chromosomal site and the disease can then be determined using the association analysis described in, for example, Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787 (for physically adjacent genes). Can be identified by co-inheritance).
[0211]
In addition, DNA sequence differences between individuals suffering from and not affected by diseases associated with the NOVX gene can be measured. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in any of the unaffected individuals, the mutation is likely a causative agent for a particular disease. Comparison of affected and unaffected individuals is generally first detected by using visible structural changes in the chromosome, such as deletions or translocations visible from the chromosome spread, or using PCR based on its DNA sequence With the search for possible structural changes. Finally, complete sequencing of genes from several individuals can be performed to confirm the presence of the mutation and to distinguish the mutation from the polymorphism.
[0212]
Organization typing
The NOVX sequences of the present invention can also be used to identify individuals from trace biological samples. In this technique, an individual's genomic DNA is digested with one or more restriction enzymes and probed on a Southern blot to produce a unique band for identification. The sequences of the present invention are useful as yet another DNA marker for RFLP (restriction fragment length polymorphism, described in US Pat. No. 5,272,057).
[0213]
Furthermore, the sequences of the present invention may be used to provide yet another technique for measuring the actual base-by-base DNA sequence of a selected portion of an individual's genome. Thus, using the NOVX sequence described herein, two PCR primers can be prepared from the 5 'and 3' ends of the sequence. These primers can then be used to amplify the individual's DNA and subsequently sequence it.
[0214]
Since each individual has a characteristic set of such DNA due to allelic differences, a panel of corresponding DNA sequences from individuals prepared in this manner can provide identification of characteristic individuals. The sequences of the present invention can be used to obtain such identification sequences from individuals and tissues. The NOVX sequences of the present invention characteristically represent portions of the human genome. Allelic variation occurs to some extent in the coding regions of these sequences and to a greater extent in the non-coding regions. It is believed that allelic variation between individual humans occurs at a frequency of about 1 in 500 bases. Many of the allelic variations are due to single nucleotide polymorphisms (SNPs), including restriction fragment length polymorphisms (RFLP).
[0215]
Each of the sequences described herein can be used to some extent as a standard by which DNA from individuals can be compared for identification purposes. Since more genetic polymorphisms occur in non-coding regions, fewer sequences are required to identify individuals. Non-coding sequences can reasonably provide unambiguous identification of an individual with a panel of perhaps 10 to 1,000 primers, each resulting in a 100 base non-coding amplified sequence. If a predicted coding sequence such as the sequence of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46) is used, the number of more suitable primers for unambiguous individual identification is 500 to 2,000.
[0216]
Predictive medicine
The present invention also relates to the field of predictive medicine, using diagnostic assays, prognostic assays, pharmacogenomics, and clinical trial monitoring for prognostic (predictive) purposes, thereby prophylactically treating an individual. Accordingly, one aspect of the present invention is to measure NOVX protein and / or nucleic acid expression and NOVX activity in the context of a biological sample (eg, blood, serum, cells, tissue), thereby causing an individual to become abnormal Relates to a diagnostic assay for determining whether or not one is suffering from or at risk of developing a disorder associated with the expression or activity of NOVX. Disorders include metabolic disorders, diabetes, obesity, infectious diseases, anorexia, cancer-related cachexia, cancer, neurodegenerative disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, and hematopoietic disorders, and various different fats May include metabolic disorders associated with blood pressure, obesity, metabolic syndrome X and debilitating diseases associated with chronic diseases and various cancers. The invention also provides a prognostic (predictive) assay to determine whether an individual is at risk for developing a disorder associated with NOVX protein, nucleic acid expression or activity. For example, certain NOVX gene mutations can be assayed in a biological sample. Such assays are used for prognostic or predictive purposes, thereby prophylacticizing individuals prior to the development of a disorder characterized or associated with NOVX protein, nucleic acid expression or biological activity. Can be treated.
[0217]
Another aspect of the present invention is a method for measuring NOVX protein, nucleic acid expression or activity in an individual, thereby selecting an appropriate therapeutic or prophylactic agent for that individual (referred to herein as “pharmacogenomics”). Provided). Pharmacogenomics allows the selection of an agent (e.g., a drug) for therapeutic or prophylactic treatment of an individual based on the individual's genotype (e.g., examining an individual's genotype to identify an individual's specific drug) Measure ability to respond to).
[0218]
Yet another aspect of the invention relates to monitoring the effect of a drug (eg, drug, compound) on NOVX expression or activity in clinical trials.
These and other agents are described in detail in the following sections.
[0219]
Diagnostic assays
An exemplary method for detecting the presence or absence of NOVX in a biological sample is to obtain a biological sample from a subject and to convert the biological sample to NOVX protein or a nucleic acid encoding NOVX protein (e.g., associated with a compound or agent capable of detecting mRNA, genomic DNA) to allow the presence of NOVX to be detected in a biological sample. An agent for detection of NOVX mRNA or genomic DNA is a labeled nucleic acid probe capable of hybridizing to NOVX mRNA or genomic DNA. The nucleic acid probe is, for example, a full length NOVX nucleic acid such as the nucleic acid of SEQ ID NO: 2n-1 (where n is an integer from 1 to 46), or at least 15, 30, 50, 100, 250 or 500 nucleotides in length And it is part of an oligonucleotide sufficient to specifically hybridize to NOVX mRNA or genomic DNA under stringent conditions. Other suitable probes for use in the diagnostic assays of the invention are described herein.
[0220]
The agent for detecting NOVX protein is an antibody capable of binding to NOVX protein, preferably an antibody with a detectable label. The antibody may be polyclonal, or more preferably monoclonal. Intact antibody, or fragment thereof (eg, Fab or F (ab ′)₂) Can be used. The term “label” for a probe or antibody refers to directly labeling a probe or antibody by coupling (ie, physically linking) a detectable substance to the probe or antibody, as well as another directly labeled Indirect labeling of the probe or antibody by reactivity with one reagent. Examples of indirect labeling may include detection of the first antibody using a fluorescently labeled second antibody and end-labeling the DNA probe with biotin so that it can be detected with fluorescently labeled streptavidin. . The term “biological sample” includes tissues, cells and biological fluids isolated from a subject, as well as tissues, cells and fluids present within a subject. That is, the detection methods of the invention can be used to detect NOVX mRNA, protein, or genomic DNA in a biological sample in vitro and in vivo. For example, in vitro techniques for detection of NOVX mRNA may include Northern hybridization and in situ hybridization. In vitro techniques for detecting NOVX protein may include enzyme linked immunoassay (ELISA), Western blot, immunoprecipitation, and immunofluorescence. In vitro techniques for detecting NOVX genomic DNA may include Southern hybridization. Further, in vivo techniques for detecting NOVX protein include introducing labeled anti-NOVX antibodies into the subject. For example, the antibody can be labeled with a radioactive marker whose presence and location in a subject can be detected with standard imaging techniques.
[0221]
In one embodiment, the biological sample contains protein molecules from the test subject. Alternatively, the biological sample can contain mRNA molecules from the test subject or genomic DNA molecules from the test subject. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means.
[0222]
In another embodiment, the method comprises obtaining a control biological sample from a control subject, using the control sample as a compound or agent capable of detecting NOVX protein, mRNA or genomic DNA, and NOVX protein, mRNA or genome. Further contacting to detect the presence of DNA in the biological sample and comparing the presence of NOVX protein, mRNA or genomic DNA in the control sample to NOVX protein, mRNA or genomic DNA in the test sample Accompany.
[0223]
The invention also includes a kit for detecting the presence of NOVX in a biological sample. For example, the kit: a labeled compound or agent capable of detecting NOVX protein or mRNA in a biological sample; means for measuring the amount of NOVX in the sample; and means for comparing the amount of NOVX in the sample with a standard Can be included. The compound and drug can be packaged in a suitable container. The kit may further comprise instructions for use of the kit for detecting NOVX protein or nucleic acid.
[0224]
Prognostic assay
In addition, the diagnostic methods described herein can be used to identify subjects who have or are at risk of developing a disease or disorder associated with abnormal NOVX expression or activity. For example, using the assays described herein, such as previous diagnostic assays and the following assays, to identify subjects who have or are at risk of developing a disorder related to NOVX protein, nucleic acid expression or activity Can do. Alternatively, prognostic assays can be utilized to identify subjects having or at risk for developing a disease or disorder. Thus, the present invention provides a method of identifying a disease or disorder associated with aberrant NOVX expression or activity that obtains a test sample from a subject and detects aberrant NOVX protein or nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA). Wherein the presence of NOVX protein or nucleic acid is a diagnosis for a subject having or at risk of developing a disease or disorder associated with abnormal NOVX expression or activity. As used herein, “test sample” refers to a biological sample obtained from a subject of interest. For example, the test sample can be a biological fluid (eg, serum), a cell sample, or a tissue.
[0225]
In addition, the prognostic assays described herein can be used to treat agents (eg, agonists, antagonists, peptidomimetics, proteins, peptides) to treat diseases or disorders associated with abnormal NOVX expression or activity. , Nucleic acids, small molecules, or other pharmaceutical candidates) can be determined. For example, such methods can be used to determine whether a subject's disease is effectively treated with a drug. Thus, the present invention provides a method for obtaining a test sample and determining whether an agent can effectively treat a disorder associated with abnormal NOVX expression or activity that detects NOVX protein or nucleic acid. (For example, where the presence of NOVX protein or nucleic acid becomes a diagnosis for a subject who can be administered an agent to treat a disorder associated with abnormal NOVX expression or activity).
[0226]
The method of the invention may also be used to detect genetic damage in certain NOVX genes, such that the subject with the damaged gene is at risk for a disorder characterized by abnormal cell growth and / or differentiation Can decide. In various embodiments, these methods are genetically characterized in at least one alteration that affects the integrity of a gene encoding a NOVX protein, or misexpression of a NOVX gene, in a cell sample from a subject. Includes detection of the presence or absence of damage. For example, such genetic damage may include (i) deletion of one or more nucleotides from a NOVX gene; (ii) addition of one or more nucleotides to a NOVX gene; (iii) Substitution of one or more nucleotides of a NOVX gene, (iv) chromosomal rearrangement of a NOVX gene, (v) changes in mRNA transcript level of a NOVX gene, (vi) methylation pattern of genomic DNA, etc. (Vii) presence of a non-wild type splicing pattern of an mRNA transcript of a NOVX gene, (viii) a non-wild type level of a NOVX protein, (ix) an allelic deletion of a NOVX gene And (x) can be detected by confirmation of the presence of at least one inappropriate post-translational modification of a NOVX protein. There are a number of assay techniques known in the art that can be used to detect damage to certain NOVX genes described herein. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means. However, any biological sample containing nucleated cells including, for example, buccal mucosa cells can be used.
[0227]
In certain embodiments, damage detection is in a polymerase chain reaction (PCR) such as anchor PCR or RACE PCR (see, eg, US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202) or Alternatively, Ligation Chain Reaction (LCR) (eg, Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080, and Nakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360 With the use of probes / primers in (see -364), but the latter may be particularly useful for the detection of point mutations in the NOVX gene (Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682). See). This method involves collecting a cell sample from a patient, isolating nucleic acid (eg, genome, mRNA or both) from the sample cells, and under conditions such that hybridization and amplification of the NOVX gene (if present) occurs. Contacting the nucleic acid sample with one or more primers that specifically hybridize to a NOVX gene, and detecting the presence or absence of the amplification product, or detecting the size of the amplification product, and length with the control sample A step of comparing the lengths. PCR and / or LCR are desirably used as a preliminary amplification step in conjunction with any technique used to detect mutations described herein.
[0228]
Further amplification methods include: self-retaining sequence replication (see Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), transcription amplification system (Kwoh, et al., 1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177); Qβ replicase (see Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197), or any other nucleic acid amplification method followed by one skilled in the art May include detection of amplified molecules using well-known techniques. These detection schemes are particularly useful for the detection of such molecules if only a small number of nucleic acid molecules are present.
[0229]
In yet another embodiment, mutations in certain NOVX genes from sample cells can be identified by changes in restriction enzyme cleavage patterns. For example, sample and control DNA is isolated, amplified (optionally), treated with one or more restriction endonucleases, and fragment sizes are measured and compared by gel electrophoresis. Differences in fragment size between sample and control DNA indicate mutations in the sample DNA. In addition, sequence specific ribozymes (see, eg, US Pat. No. 5,493,531) can be used to assess the presence of specific mutations by the generation or disappearance of ribozyme cleavage sites.
[0230]
In other embodiments, genetic mutations in NOVX are identified by hybridizing sample and control nucleic acids, eg, DNA or RNA, to a high density array containing hundreds or thousands of oligonucleotide probes. can do. See, for example, Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255, Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759. For example, genetic variations in NOVX can be identified in a two-dimensional array containing DNA probes that generate light as described in Cronin, et al., Supra. Briefly, the first hybridization array of probes is used to scan a long stretch of DNA in a sample and a control to create a series of overlapping probe linear arrays to determine base changes between sequences. Can be identified. This step allows the identification of point mutations. This is followed by a second hybridization that allows the characterization of a particular mutation by using a smaller special probe array that is complementary to all the mutants or mutations detected. Each mutation array consists of a set of parallel probes, one complementary to the wild type gene and the other complementary to the mutant gene.
[0231]
In yet another embodiment, the NOVX gene is directly sequenced using any of a variety of sequencing reactions known in the art, and the NOVX sequence of the sample is compared with the corresponding wild type (control) sequence. Mutations can be detected by comparison. Examples of sequencing reactions are based on the technique developed by Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 or Sanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 You can list things. Sequencing by mass spectrometry (eg, PCT International Publication No. WO 94/16101; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162 and Griffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: It can also be envisaged that any of a variety of automated sequencing methods can be utilized in performing a diagnostic assay (see, eg, Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448).
[0232]
Other methods for detecting mutations in the NOVX gene may include methods for detecting mismatched bases in RNA / RNA or RNA / DNA heteroduplexes using protection from cleaving agents. See, for example, Myers, et al., 1985. Science 230: 1242. In general, the art of “mismatch cleavage” is formed by hybridizing (labeled) RNA or DNA containing a wild-type NOVX sequence with RNA or DNA of a potential mutant obtained from a tissue sample. Starting with providing a heteroduplex. The duplex is treated with an agent that cleaves the single-stranded region of the duplex present due to base mismatches between the control and sample strands. For example, RNA / DNA duplex is treated with RNase and DNA / DNA hybrid is S₁It can be treated with nucleases and the mismatch regions can be treated enzymatically. In other embodiments, either DNA / DNA or RNA / DNA duplexes can be treated with hydroxylamine or osmium tetroxide and piperidine to digest mismatched regions. After processing the mismatch region, the resulting material is then separated by size on a denaturing polyacrylamide gel to determine the site of mutation. See, for example, Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397, Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295. In one embodiment, the control DNA or RNA can be labeled for detection.
[0233]
In yet another embodiment, the mismatch cleavage reaction recognizes mismatched base pairs in double stranded DNA in a defined system to detect and map point mutations in NOVX cDNA obtained from a sample of cells. One or more proteins (so-called “DNA mismatch repair” enzymes) are used. For example, E. coli mutY enzyme cleaves G / A mismatch A and thymidine DNA glycosidase from HeLa cells cleaves G / T mismatch T. See, for example, Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662. According to an exemplary embodiment, a probe based on a NOVX sequence, eg, a wild type NOVX sequence, is hybridized with cDNA or other DNA product from the test cell (s). This duplex is treated with a DNA mismatch repair enzyme, and if a cleavage product is present, it can be detected from an electrophoresis protocol or the like. See, for example, US Pat. No. 5,459,039.
[0234]
In other embodiments, changes in electrophoretic mobility are used to identify mutations in the NOVX gene. For example, single strand conformation polymorphism (SSCP) can be used to detect electrophoretic mobility differences between mutant and wild type nucleic acids. For example, Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766, Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144, Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: See 73-79. Allows single-stranded DNA fragments of sample and control NOVX nucleic acids to be denatured and renatured. The secondary structure of single-stranded nucleic acids varies from sequence to sequence, and the resulting change in electrophoretic mobility makes it possible to detect even single base changes. DNA fragments can be labeled or detected with a labeled probe. The sensitivity of the assay can be increased by using RNA (rather than DNA) whose secondary structure is more sensitive to sequence changes. In one embodiment, the subject method utilizes heteroduplex analysis to separate duplex helical duplex molecules based on changes in electrophoretic mobility. See, for example, Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5.
[0235]
In yet another embodiment, the migration of mutant or wild type fragments in a polyacrylamide gel containing a gradient of denaturing agent is assayed using denaturing concentration gradient gel electrophoresis (DGGE). See, for example, Myers, et al., 1985. Nature 313: 495. When using DGGE as an analytical method, DNA is modified, eg, by adding a GC clamp of high melting point GC-enriched DNA of approximately 40 bp to ensure that it is not completely denatured. In a further embodiment, temperature gradients are used in place of denaturing gradients to identify differences in the mobility of control and sample DNA. See, for example, Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753.
[0236]
Examples of other techniques for detecting point mutations may include, but are not limited to, selective oligonucleotide hybridization, selective amplification, or selective primer extension. For example, an oligonucleotide primer centered on a known mutation is prepared and then hybridized with the target DNA under conditions that allow hybridization only when a perfect match is found. See, for example, Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163, Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230. When the oligonucleotide is attached to the hybridizing membrane and hybridized with the labeled target DNA, such allele-specific oligonucleotide hybridizes with the PCR amplified target DNA or a number of different mutants. .
[0237]
Alternatively, allele specific amplification techniques based on selective PCR amplification may be used in conjunction with the present invention. Oligonucleotides used as primers for specific amplification allow the mutation of interest to be centered in the molecule (as amplification depends on differential hybridization; see, eg, Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448) or, under appropriate conditions, mismatches can prevent or reduce polymerase extension (see, eg, Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238) held at the 3 ′ extreme end of one primer. It may be. In addition, it is desirable to introduce new restriction sites in the region of the mutation in order to create detection based on cleavage. See, for example, Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1. In certain embodiments, it is anticipated that amplification can also be performed using Taq ligase for amplification. See, for example, Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189. In such cases, ligation occurs only when there is a perfect match at the 3 'end of the 5' end sequence, and the presence of a known mutation at a particular site is detected by examining the presence or absence of amplification. Enable.
[0238]
The methods described herein can be performed, for example, by utilizing a prepacked diagnostic kit that includes at least one probe nucleic acid or antibody reagent described herein. This can be conveniently used, for example, in the clinical setting to diagnose a patient who exhibits symptoms or symptoms of a disease or disorder involving the NOVX gene or has a family history.
[0239]
In addition, any cell type or tissue that expresses NOVX, preferably peripheral blood leukocytes, may be utilized in the prognostic assays described herein. However, any biological sample containing, for example, nucleated cells of buccal mucosa cells may be used.
[0240]
Pharmacogenomics
An agent or modulator having a stimulatory or inhibitory effect on NOVX activity (eg, NOVX gene expression) as identified by the screening assays described herein is administered to the individual to treat disorders (including metabolic disorders, diabetes Obesity, infectious diseases, anorexia, cancer-related cachexia, cancer, neurodegenerative disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, and hematopoietic disorders, and various dyslipidemias, metabolic disorders associated with obesity Can be treated (prophylactically or therapeutically), which may include metabolic syndrome X and debilitating diseases associated with chronic diseases and various cancers. Along with such treatment, an individual's pharmacogenomics (ie, a study of the relationship between an individual's genotype and the individual's response to a foreign compound or drug) may be considered. Differences in therapeutic drug metabolism can result in severe toxicity or treatment failure by altering the relationship between pharmacologically active drug dose and blood concentration. Thus, the pharmacogenomics of an individual allows for the selection of an effective agent (eg, drug) for prophylactic or therapeutic treatment based on consideration of the individual's genotype. Such pharmacogenomics can further be used to determine the appropriate dose and method of treatment. Thus, the activity (s) of NOVX protein, the expression of NOVX nucleic acids, or the content of NOVX gene mutations in an individual can be measured, thereby selecting the appropriate agent (s) for therapeutic or prophylactic treatment of the individual.
[0241]
Pharmacogenomics deals with clinically significant genetic variation in response to drugs due to altered drug distribution and abnormal effects in affected individuals. See, for example, Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266. In general, two types of pharmacogenetic abnormalities can be distinguished. Genetic abnormalities that transmit as a single factor that changes the way the drug acts on the body (altered drug action) or genetic abnormalities that transmit as a single factor that changes the way the body acts on the drug (altered drug metabolism) There is. These pharmacogenetic abnormalities can occur as either rare defects or polymorphisms. For example, glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is a common hereditary enzyme disorder, in which the main clinical complications are oxidant drugs (antimalarials, sulfonamides) , Analgesics, nitrofurans) hemolysis after ingestion or after eating broad beans.
[0242]
In an exemplary embodiment, the activity of a drug's metabolic enzyme is a major determinant of both the intensity and duration of the drug's action. The discovery of genetic polymorphisms in drug metabolizing enzymes (eg, N-acetyltransferase 2 (NAT2) and cytochrome pregnancy band precursor protein enzymes CYP2D6 and CYP2C19) Provide an explanation of whether the expected effect of the drug is not achieved or if it shows excessive drug response and severe toxicity. These polymorphisms are expressed in the population population in two phenotypes: a high metabolic group (EM) and a low metabolic group (PM). The abundance of PM varies between different populations. For example, the gene encoding CYP2D6 is highly polymorphic and several mutations identify PMs that result in the absence of functional CYP2D6. The hypometabolic group of CYP2D6 and CYP2C19 very frequently experience excessive drug response and side effects when receiving standard doses. If the metabolite is an active therapeutic component, PM does not show a therapeutic response, as demonstrated by the analgesic action of codeine mediated by the metabolite morphine produced by CYP2D6. The exact opposite is the so-called ultrafast metabolic group that does not respond to standard doses. Recently, the molecular basis of the ultrafast metabolic group was confirmed to be due to CYP2D6 gene amplification.
[0243]
Thus, an individual's NOVX protein activity, NOVX nucleic acid expression, or mutation content of the NOVX gene can be measured, thereby selecting an appropriate drug (s) for therapeutic or prophylactic treatment of the individual . In addition, pharmacogenetic studies can be used to apply genotyping of polymorphic alleles encoding drug metabolizing enzymes to the identification of individual drug responsiveness phenotypes. In applying this knowledge to dosage and drug selection, adverse effects or treatment failures may be observed when treating a subject with a NOVX modulator, such as a modulator identified by one of the exemplary screening assays described herein. Avoiding and thus enhancing therapeutic or prophylactic efficiency.
[0244]
Action monitoring in clinical trials
Monitoring the effect of a drug (eg, drug, compound) on NOVX expression or activity (eg, activity that modulates abnormal cell growth and / or differentiation) can be applied to basic drug screening, It can also be applied to clinical trials. For example, screening assays as described herein may reduce the efficacy of agents determined to increase NOVX gene expression, protein levels, or upregulate NOVX activity, to reduce NOVX gene expression, protein levels, or lower It can be monitored in clinical trials of subjects exhibiting controlled NOVX activity. Alternatively, the efficacy of an agent that has been determined to decrease NOVX gene expression, protein levels, or down-regulate NOVX activity is compared to the clinical efficacy of a subject exhibiting increased NOVX gene expression, protein levels, or up-regulated NOVX activity. Can be monitored in the test. In such clinical trials, expression or activity of NOVX, and preferably other genes associated with, for example, cell proliferation or immune disorders, may be used as a “readout” or marker of immune responsiveness of specific cells. .
[0245]
By way of non-limiting example, a gene comprising NOVX that is modulated in a cell by treatment with an agent (eg, a compound, drug or small molecule) that modulates NOVX activity (eg, identified in a screening assay described herein) Can be identified. Thus, to examine the effects of drugs on cell proliferation disorders, for example, in clinical trials, cells can be isolated and RNA prepared and the expression levels of NOVX and other genes thought to be associated with the disorder can be analyzed. The amount of protein produced by gene expression levels (ie gene expression patterns) by Northern blot analysis or RT-PCR as described herein, or alternatively by one of the methods described herein. Or by measuring the activity level of NOVX or other genes. In this manner, gene expression patterns serve as markers that indicate the cellular physiological response to the drug. Thus, this response state can be measured before and during treatment of an individual with a drug at various times.
[0246]
In one embodiment, the invention is an agent (e.g., agonist, antagonist, protein, peptide, peptidomimetic, nucleic acid, small molecule, or other drug candidate identified in the screening assays described herein). A method of monitoring the effectiveness of treating a subject is provided, the method comprising: (i) obtaining a pre-dose sample from the subject prior to drug administration; and (ii) NOVX protein, mRNA, or in a pre-dose sample Detecting the expression level of genomic DNA; (iii) obtaining one or more post-administration samples from the subject; and (iv) the level of expression or activity of NOVX protein, mRNA, or genomic DNA in the post-administration sample And (v) one or more samples after administration of NOVX protein, mRNA, or genomic DNA expression or activity levels in the sample prior to administration The comparison with NOVX protein, mRNA or genomic DNA,, and comprising the step of changing the administration of the agent to a subject according to (vi) it. For example, to increase NOVX expression or activity to a higher level than detected, ie, to increase the effectiveness of the drug, increased administration of the drug is desirable. Alternatively, in order to reduce NOVX expression or activity to a lower level than detected, ie, reduce the effectiveness of the drug, reduced administration of the drug is desirable.
[0247]
Treatment method
The present invention provides both prophylactic and therapeutic methods for treating subjects at risk (susceptibility) or having a disease associated with abnormal NOVX expression or activity. Diseases include cardiomyopathy, atherosclerosis, hypertension, congenital heart disease, aortic stenosis, atrial septal defect (ASD), atrioventricular (AV) duct defect, arterial duct, pulmonary valve stenosis, Aortic lower stenosis, ventricular septal defect (VSD), valve disease, tuberous sclerosis, scleroderma, obesity, transplantation, adrenoleukodystrophy, congenital adrenal hyperplasia, prostate cancer, neoplasm, adenocarcinoma , Lymphoma, uterine cancer, fertility, hemophilia, hypercoagulability, idiopathic thrombocytopenic purpura, immunodeficiency, graft-versus-host disease, AIDS, bronchial asthma, Crohn's disease; multiple sclerosis, al Mention of the treatment of Bright hereditary bone dystrophy and other similar diseases, disorders and abnormalities may be mentioned.
These treatments are discussed in further detail below.
[0248]
Diseases and disorders
Treat diseases and disorders characterized by increased levels (as compared to subjects not afflicted with the disease or disorder) or biological activity with therapeutic agents that antagonize (i.e. reduce or inhibit) activity. obtain. A therapeutic that antagonizes activity may be administered in a therapeutic or prophylactic manner. The therapeutic agents that can be used include: (i) the aforementioned peptides, or analogs, derivatives, fragments or homologues thereof; (ii) antibodies to the aforementioned peptides; (iii) nucleic acids encoding the aforementioned peptides; (iv) Antisense nucleic acids and nucleic acids that are “dysfunctional” used to “knock out” the endogenous function of the aforementioned peptides by homologous recombination (ie, heterologous into the coding sequence of the coding sequence for the aforementioned peptide) (See, eg, Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292); or (v) a modulator that alters the interaction of the aforementioned peptide and its binding partner (ie, further of the invention Inhibitors, agonists, antagonists) including, but not limited to, mimetics of other peptides or antibodies specific for the peptides of the present invention.
[0249]
Diseases and disorders characterized by decreased levels (as compared to subjects not afflicted with the disease or disorder) or biological activity can be treated with therapeutic agents that increase activity (ie, are agonists). A therapeutic agent that upregulates activity may be administered in a therapeutic or prophylactic manner. The therapeutic agents that can be utilized can include, but are not limited to, the aforementioned peptides, or analogs, derivatives, fragments, or homologues thereof; or agonists that increase bioavailability.
[0250]
Increased or decreased levels are obtained from patient tissue samples (e.g., from biopsy tissue) and assayed in vitro for RNA or peptide levels, expressed peptide (or mRNA for the aforementioned peptides) structure and / or activity By doing so, it can be easily detected by quantifying the peptide and / or RNA. Methods well known in the art include to detect immunoassays (eg Western blot analysis, immunoprecipitation followed by sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, immunocytochemistry, etc.) and / or mRNA expression. Hybridization assays such as, but not limited to, Northern assays, dot blots, in situ hybridization, and the like.
[0251]
Preventive measures
In one aspect, by administering to a subject an agent that modulates abnormal NOVX expression or at least some NOVX activity, the present invention provides a method for preventing a disease or abnormality associated with abnormal NOVX expression or activity in a subject. I will provide a. Identifying a subject at risk for a disease caused or contributed to by aberrant NOVX expression or activity, eg, by any of diagnostic or prognostic assays or combinations thereof as described herein Can do. A prophylactic agent may be administered prior to the appearance of symptoms characteristic of NOVX abnormalities so as to prevent or alternatively delay the progression of the disease or disorder. Depending on the type of NOVX abnormality, for example, an agent that is a certain NOVX agonist or NOVX antagonist may be used to treat the subject. Appropriate agents can be determined based on the screening methods described herein. The prophylactic methods of the present invention are further discussed in the following subsections.
[0252]
Therapeutic method
Another aspect of the invention relates to a method of modulating NOVX expression or activity for therapeutic purposes. The modulating method of the present invention comprises contacting a cell with an agent that modulates one or more activities of NOVX protein activity associated with the cell. The agent that modulates NOVX protein activity can be an agent described herein, such as a nucleic acid or protein, a naturally occurring congener ligand of a NOVX protein, a peptide, a NOVX peptide mimetic, or a small molecule. In one embodiment, the agent promotes one or more NOVX protein activities. Examples of such facilitating agents may include active NOVX proteins and nucleic acid molecules encoding NOVX introduced into cells. In another embodiment, the agent inhibits one or more NOVX protein activities. Examples of such inhibitory agents may include antisense NOVX nucleic acid molecules and anti-NOVX antibodies. These adjustment methods can be performed in vitro (eg, by culturing cells with the agent) or alternatively, in vivo (eg, by administering the agent to the subject). Thus, the present invention provides a method of treating an individual suffering from a disease or disorder characterized by abnormal expression or activity of certain NOVX proteins or nucleic acid molecules. In one embodiment, the method comprises a combination of agents (e.g., agents identified in the screening assays described herein) or agents that modulate (e.g., upregulate or downregulate) NOVX expression or activity. With administration. In another embodiment, the method involves administering a NOVX protein or nucleic acid molecule as a treatment to compensate for decreased or abnormal NOVX expression or activity.
[0253]
In situations where NOVX is abnormally downregulated and / or increased NOVX activity has a beneficial effect, it is desirable to promote NOVX activity. One example of such a situation is when the subject has a disorder characterized by abnormal cell proliferation and / or differentiation (eg, cancer or an immune related disease). Another example of such a situation is when the subject has a gestational disorder (eg, preeclampsia).
[0254]
Measuring the biological effects of therapeutic agents
In various embodiments of the invention, appropriate in vitro or in vivo assays are performed to determine the efficacy of a particular therapeutic agent and whether it is indicated for the treatment of tissues affected by its administration.
[0255]
In various specific embodiments, an in vitro assay is performed on a representative type (s) of cells involved in the patient's disorder to determine whether the administered therapeutic agent has the desired effect on the cell type. Can be measured. The compounds used for treatment can be tested in a suitable animal model system including, without limitation, rats, mice, chickens, cows, monkeys, rabbits, etc. prior to testing in human subjects. Similarly, for in vivo studies, any animal model system known in the art can be used prior to administration to a human subject.
[0256]
Prophylactic and therapeutic uses of the compositions of the invention
The NOVX nucleic acids and proteins of the present invention are: metabolic disorders, diabetes, obesity, infectious diseases, anorexia, cancer-related, neurodegenerative disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immune disorders, hematopoietic disorders, and various dyslipidemias For potential prophylactic and therapeutic applications associated with various disorders, including, without limitation, metabolic disorders associated with obesity, metabolic syndrome X and debilitating diseases associated with chronic diseases and various cancers Useful.
[0257]
By way of example, a cDNA encoding a NOVX protein of the invention can be useful for gene therapy, and the protein can be useful when administered to a subject in need thereof. By way of non-limiting example, the composition of the present invention may be used in metabolic diseases, diabetes, obesity, infectious diseases, anorexia, cancer-related cachexia, cancer, neurodegenerative disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, immunity It will have an effect on the treatment of patients suffering from disorders, hematopoietic disorders, and various dyslipidemias.
[0258]
Both novel nucleic acids encoding NOVX proteins and NOVX proteins of the invention, or fragments thereof, may also be useful in diagnostic applications to assess the presence or amount of nucleic acids or proteins. A further use may be as an antibacterial molecule (ie, certain peptides have been found to have antibacterial properties). These substances are further useful for the production of antibodies that immunospecifically bind to the novel substances of the invention for use in therapeutic or diagnostic methods.
[0259]
Example
Example 1
NOV1 clones were analyzed and the nucleotide and encoded polypeptide sequences are shown in Table 1A.
[Table 3]

[0260]
Further analysis of the NOV1a protein resulted in the following properties shown in Table 1BC.
[Table 4]

[0261]
A search for the NOV1a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing sequences published in patents and patent publications, resulted in several homologous proteins shown in Table 1C.
[Table 5]

[0262]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV1a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 1D.
[Table 6]

[0263]
PHam analysis predicts that the NOV1a protein contains the domains shown in Table 1E.
[Table 7]

[0264]
Example 2
NOV2 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 2A.
[Table 8]

[0265]
[Table 9]

[0266]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 2B.
[Table 10]

[0267]
Further analysis of the NOV2a protein resulted in the following properties shown in Table 2C.
[Table 11]

[0268]
A search for the NOV2a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing sequences published in patents and patent publications, resulted in several homologous proteins shown in Table 2D.
[Table 12]

[0269]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV2a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 2E.
[Table 13]

[0270]
PHam analysis predicts that the NOV2a protein contains the domains shown in Table 2F.
[Table 14]

[0271]
Example 3
NOV3 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 3A.
[Table 15]

[0272]
Further analysis of the NOV3a protein resulted in the following properties shown in Table 3B.
[Table 16]

[0273]
Searching the NOV3a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published sequences in the patent publication, resulted in several homologous proteins shown in Table 3C.
[Table 17]

[0274]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV3a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 3D.
[Table 18]

[0275]
PHam analysis predicts that the NOV3a protein contains the domains shown in Table 3E.
[Table 19]

[0276]
Example 4
NOV4 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 4A.
[Table 20]

[0277]
[Table 21]

[0278]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 4B.
[Table 22]

[0279]
Further analysis of the NOV4a protein resulted in the following properties shown in Table 4C.
[Table 23]

[0280]
A search for NOV2a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 4D.
[Table 24]

[0281]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV4a protein was found to have homology to the proteins shown in the BLASTP data in Table 4E.
[Table 25]

[0282]
PHam analysis predicts that the NOV4a protein contains the domains shown in Table 4F.
[Table 26]

[0283]
Example 5
NOV5 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 5A.
[Table 27]

[0284]
Further analysis of the NOV5a protein resulted in the following properties shown in Table 5B.
[Table 28]

[0285]
A search for NOV5a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 5C.
[Table 29]

[0286]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV5a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 5DS.
[Table 30]

[0287]
PHam analysis predicts that the NOV5a protein contains the domains shown in Table 5E.
[Table 31]

[0288]
Example 6
NOV6 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 6A.
[Table 32]

[0289]
[Table 33]

[0290]
[Table 34]

[0291]
[Table 35]

[0292]
[Table 36]

[0293]
[Table 37]

[0294]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 6B.
[Table 38]

[0295]
Further analysis of the NOV6a protein resulted in the following properties shown in Table 6C.
[Table 39]

[0296]
Searching the NOV6a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 6D.
[Table 40]

[0297]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV6a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 6E.
[Table 41]

[0298]
PHam analysis predicts that the NOV6a protein contains the domains shown in Table 6F.
[Table 42]

[0299]
Example 7
NOV7 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 7A.
[Table 43]

[0300]
[Table 44]

[0301]
Further analysis of the NOV7a protein resulted in the following properties shown in Table 7B.
[Table 45]

[0302]
Searching the NOV7a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 7C.
[Table 46]

[0303]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV7a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 7D.
[Table 47]

[0304]
PHam analysis predicts that the NOV7a protein contains the domains shown in Table 7E.
[Table 48]

[0305]
Example 8
NOV8 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 8A.
[Table 49]

[0306]
[Table 50]

[0307]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 8B.
[Table 51]

[0308]
Further analysis of the NOV8a protein resulted in the following properties shown in Table 8C.
[Table 52]

[0309]
A search for the NOV8a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 8D.
[Table 53]

[0310]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV8a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 8E.
[Table 54]

[0311]
PHam analysis predicts that the NOV8a protein contains the domains shown in Table 8F.
[Table 55]

[0312]
Example 9
NOV9 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 9A.
[Table 56]

[0313]
Further analysis of the NOV9a protein resulted in the following properties shown in Table 9B.
[Table 57]

[0314]
A search for NOV9a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 9C.
[Table 58]

[0315]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV9a protein was found to have homology to the proteins shown in the BLASTP data in Table 9D.
[Table 59]

[0316]
PHam analysis predicts that the NOV9a protein contains the domains shown in Table 9E.
[Table 60]

[0317]
Example 10
NOV10 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 10A.
[Table 61]

[0318]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 10B.
[Table 62]

[0319]
Further analysis of the NOV10a protein resulted in the following properties shown in Table 10C.
[Table 63]

[0320]
Searching the NOV10a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 10D.
[Table 64]

[0321]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV10a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 10E.
[Table 65]

[0322]
PHam analysis predicts that the NOV10a protein contains the domains shown in Table 10F.
[Table 66]

[0323]
Example 11
NOV11 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 11A.
[Table 67]

[0324]
Further analysis of the NOV11a protein resulted in the following properties shown in Table 11B.
[Table 68]

[0325]
A search for NOV11a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 11C.
[Table 69]

[0326]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV11a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 11D.
[Table 70]

[0327]
PHam analysis predicts that the NOV11a protein contains the domains shown in Table 11E.
[Table 71]

[0328]
Example 12
NOV12 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 12A.
[Table 72]

[0329]
[Table 73]

[0330]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 12B.
[Table 74]

[0331]
Further analysis of the NOV12a protein resulted in the following properties shown in Table 12C.
[Table 75]

[0332]
A search for NOV12a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 12D.
[Table 76]

[0333]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV12a protein was found to have homology to the proteins shown in the BLASTP data in Table 12E.
[Table 77]

[0334]
PHam analysis predicts that the NOV12a protein contains the domains shown in Table 12F.
[Table 78]

[0335]
Example 13
NOV13 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 13A.
[Table 79]

[0336]
[Table 80]

[0337]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 13B.
[Table 81]

[0338]
Further analysis of the NOV13a protein resulted in the following properties shown in Table 13C.
[Table 82]

[0339]
A search for NOV13a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing sequences published in patents and patent publications, resulted in several homologous proteins shown in Table 13D.
[Table 83]

[0340]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV13a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 13E.
[Table 84]

[0341]
PHam analysis predicts that the NOV13a protein contains the domains shown in Table 13F.
[Table 85]

[0342]
Example 14
NOV14 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 14A.
[Table 86]

[0343]
[Table 87]

[0344]
Further analysis of the NOV14a protein resulted in the following properties shown in Table 14B.
[Table 88]

[0345]
A search for the NOV14a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 14C.
[Table 89]

[0346]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV14a protein was found to have homology to the proteins shown in the BLASTP data in Table 14D.
[Table 90]

[0347]
PHam analysis predicts that the NOV14a protein contains the domains shown in Table 14E.
[Table 91]

[0348]
Example 15
NOV15 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 15A.
[Table 92]

[0349]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 15B.
[Table 93]

[0350]
Further analysis of the NOV15a protein resulted in the following properties shown in Table 15C.
[Table 94]

[0351]
A search for the NOV15a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 15D.
[Table 95]

[0352]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV15a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 15E.
[Table 96]

[0353]
PHam analysis predicts that the NOV15a protein contains the domains shown in Table 15F.
[Table 97]

[0354]
Example 16
NOV16 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 16A.
[Table 98]

[0355]
Further analysis of the NOV16a protein resulted in the following properties shown in Table 16BC.
[Table 99]

[0356]
Searching the NOV16a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 16C.
[Table 100]

[0357]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV16a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 16D.
[Table 101]

[0358]
PHam analysis predicts that the NOV16a protein contains the domains shown in Table 16E.
[Table 102]

[0359]
Example 17
NOV17 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 17A.
[Table 103]

[0360]
Further analysis of the NOV17a protein resulted in the following properties shown in Table 17B.
[Table 104]

[0361]
A search for the NOV17a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 17C.
[Table 105]

[0362]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV17a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 17D.
[Table 106]

[0363]
PHam analysis predicts that the NOV17a protein contains the domains shown in Table 17E.
[Table 107]

[0364]
Example 18
NOV18 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 18A.
[Table 108]

[0365]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 18B.
[Table 109]

[0366]
Further analysis of the NOV18a protein resulted in the following properties shown in Table 18C.
[Table 110]

[0367]
A search for NOV18a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 18D.
[Table 111]

[0368]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV18a protein was found to have homology to the proteins shown in the BLASTP data in Table 18E.
[Table 112]

[0369]
PHam analysis predicts that the NOV18a protein contains the domains shown in Table 81F.
[Table 113]

[0370]
Example 19
NOV19 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 19A.
[Table 114]

[0371]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 19B.
[Table 115]

[0372]
Further analysis of the NOV19a protein resulted in the following properties shown in Table 19C.
[Table 116]

[0373]
Searching the NOV19a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 19D.
[Table 117]

[0374]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV19a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 19E.
[Table 118]

[0375]
PHam analysis predicts that the NOV19a protein contains the domains shown in Table 19F.
[Table 119]

[0376]
Example 20
NOV20 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 20A.
[Table 120]

[0377]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 20B.
[Table 121]

[0378]
Further analysis of the NOV20a protein resulted in the following properties shown in Table 20C.
[Table 122]

[0379]
Searching the NOV20a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 20D.
[Table 123]

[0380]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV20a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 20E.
[Table 124]

[0381]
PHam analysis predicts that the NOV20a protein contains the domains shown in Table 20F.
[Table 125]

[0382]
Example 21
NOV21 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 19A.
[Table 126]

[0383]
Further analysis of the NOV21a protein resulted in the following properties shown in Table 21B.
[Table 127]

[0384]
Searching the NOV21a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 21C.
[Table 128]

[0385]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV21a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 21D.
[Table 129]

[0386]
PHam analysis predicts that the NOV21a protein contains the domains shown in Table 21E.
[Table 130]

[0387]
Example 22
NOV22 clones were analyzed and nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 22A.
[Table 131]

[0388]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 22B.
[Table 132]

[0389]
Further analysis of the NOV22a protein resulted in the following properties shown in Table 22C.
[Table 133]

[0390]
A search of the NOV22a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 22D.
[Table 134]

[0390]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV22a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 22E.
[Table 135]

[0392]
PHam analysis predicts that the NOV22a protein contains the domains shown in Table 22F.
[Table 136]

[0393]
Example 23
NOV23 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 23A.
[Table 137]

[0394]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 23B.
[Table 138]

[0395]
Further analysis of the NOV23a protein resulted in the following properties shown in Table 23C.
[Table 139]

[0396]
Searching the NOV23a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published sequences in the patent publication, resulted in several homologous proteins shown in Table 23D.
[Table 140]

[0397]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV23a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 23E.
[Table 141]

[0398]
PHam analysis predicts that the NOV23a protein contains the domains shown in Table 23F.
[Table 142]

[0399]
Example 24
NOV24 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 24A.
[Table 143]

[0400]
Further analysis of the NOV24a protein resulted in the following properties shown in Table 24B.
[Table 144]

[0401]
Searching the NOV24a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published sequences in the patent publication, resulted in several homologous proteins shown in Table 24C.
[Table 145]

[0402]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV24a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 24D.
[Table 146]

[0403]
PHam analysis predicts that the NOV24a protein contains the domains shown in Table 24E.
[Table 147]

[0404]
Example 25
NOV25 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 25A.
[Table 148]

[0405]
Further analysis of the NOV25a protein resulted in the following properties shown in Table 25B.
[Table 149]

[0406]
A search for the NOV25a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 25C.
[Table 150]

[0407]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV25a protein was found to be homologous to the proteins shown in the BLASTP data in Table 25D.
[Table 151]

[0408]
PHam analysis predicts that the NOV25a protein contains the domains shown in Table 25E.
[Table 152]

[0409]
Example 26
NOV26 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 26A.
[Table 153]

[0410]
Sequence comparison of the protein sequences results in the following sequence relationships shown in Table 26B.
[Table 154]

[0411]
Further analysis of the NOV26a protein resulted in the following properties shown in Table 26C.
[Table 155]

[0412]
Searching the NOV26a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published sequences in the patent publication, resulted in several homologous proteins shown in Table 26D.
[Table 156]

[0413]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV26a protein was found to have homology to the proteins shown in the BLASTP data in Table 26E.
[Table 157]

[0414]
PHam analysis predicts that the NOV26a protein contains the domains shown in Table 26F.
[Table 158]

[0415]
Example 27
NOV27 clones were analyzed and the nucleotide and coding polypeptide sequences are shown in Table 27A.
[Table 159]

[0416]
Further analysis of the NOV27a protein resulted in the following properties shown in Table 27B.
[Table 160]

[0417]
Searching the NOV27a protein against the Geneseq database, a proprietary database containing patents and published patent sequences, resulted in several homologous proteins shown in Table 27C.
[Table 161]

[0418]
In a BLAST search of the public sequence database, the NOV27a protein was found to be homologous to the protein shown in the BLASTP data in Table 27D.
[Table 162]

[0419]
PHam analysis predicts that the NOV27a protein contains the domains shown in Table 27E.
[Table 163]

[0420]
Example B: Sequencing methodology and identification of NOVX clones
1. GeneCalling [Trademark] technique: This is a proprietary method for performing differential gene expression profiling between two or more samples developed at CuraGen, Shimkets, et al., “Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query "Nature Biotechnology 17: 198-803 (1999). cDNA was derived from various human samples representing multiple tissue types, normal and pathological conditions, physiological conditions and developmental conditions from different donors. Samples were obtained as whole tissue, primary cells or tissue culture primary cells or cell lines. Cells and cell lines may be treated with biological or chemical agents that modulate gene expression, such as growth factors, chemokines or steroids. The cDNA thus derived was then digested with as many as 120 pairs of restriction enzymes, and linker-adapter pairs specific for each pair of restriction enzymes were ligated to the appropriate ends. Restriction digests produce a mixture of unique cDNA gene fragments. Limited PCR amplification is performed with primers that are homologous to a linker adapter sequence in which one primer is biotinylated and the other is fluorescently labeled. The doubly labeled material was isolated and the fluorescently labeled single strand was resolved by capillary gel electrophoresis. A computer algorithm compares the experiments from each restriction digest and electrophoresis from the control group. Information from this and further sequences is used to predict the identity of each differentially expressed gene fragment using various genomic databases. The identity of the gene fragment was confirmed by additional, gene-specific competitive PCR or by gene fragment isolation and sequencing.
[0421]
2. SeqCalling® technology: cDNA was derived from various human samples representing multiple tissue types, normal and pathological conditions, physiological conditions and developmental conditions from different donors. Samples were obtained as whole tissue, primary cells or tissue culture primary cells or cell lines. Cells and cell lines may be treated with biological or chemical agents that modulate gene expression, such as growth factors, chemokines or steroids. The cDNA thus derived was then sequenced using CuraGen's proprietary SeqCalling technology. Sequence traces were manually evaluated and edited for correction if appropriate. The cDNA sequences from all samples were collected together using a bioinformatic program, sometimes containing public human sequences, to produce a common sequence for each assembly. Each assembly is included in the Curagen Corporation database. A sequence was included as a component of an assembly when the degree of identity with other components was at least 95% over 50 bp. Each assembly represents a gene or portion thereof and includes information about variants such as splice forms of single nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions, deletions and other sequence variations.
[0422]
3. PathCalling technology:
NOVX nucleic acid sequences are derived by laboratory screening of cDNA libraries by a two-hybrid approach. A cDNA fragment that covers either the full length of the DNA sequence or part of the sequence or both was sequenced. In silico predictions were based on sequences available in Curagen Corporation's proprietary sequence database or public human sequence database and provided either the full-length DNA sequence or some portion thereof.
[0423]
Laboratory screening was performed using the method summarized below:
The cDNA library was derived from various human samples representing multiple tissue types, normal and pathological conditions, physiological conditions and developmental conditions from different donors. Samples were obtained as whole tissue, primary cells or tissue culture primary cells or cell lines. Cells and cell lines may be treated with biological or chemical agents that modulate gene expression, such as growth factors, chemokines or steroids. The cDNA thus derived was then directionally cloned into an appropriate two hybrid vector (Gal4-activation domain (Gal4-AD) fusion). Such cDNA libraries as well as commercially available cDNA libraries from Clontech (Palo Alto, Calif.), And then the proprietary yeast strains of Curagen Corporation from E. coli (US Pat. Nos. 6,057,101 and 6,083). , 693 (disclosed in the entire specification as a part of this specification).
[0424]
Multiple Gal4-AD fusion cDNA libraries were screened using Gal4-binding domain (Gal4-BD) fusions from Curagen Corporation's proprietary human sequence library, with each Gal4-AD fusion containing a separate cDNA. This resulted in selection of yeast hybrid diploid containing. Each sample was amplified using polymerase chain reaction (PCR) with non-specific primers in the cDNA insertion boundary. Such PCR products were sequenced; sequence traces were manually evaluated and edited for correction if appropriate. Using bioinformatic programs, sometimes including public human sequences, cDNA sequences from all samples were collected together to produce a common sequence for each assembly. Each assembly is included in the Curagen Corporation database. A sequence was included as a component of the assembly when the degree of identity with other components was at least 95% over 50 bp. Each assembly represents a gene or portion thereof and includes information about variants such as splice forms of single nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions, deletions and other sequence variations.
[0425]
Physical clone: A cDNA fragment derived by a screening procedure covering all open reading frames was cloned into the pACT2 plasmid (Clontech) used as recombinant DNA to create a cDNA library. The recombinant plasmid was inserted into the host and produced during the screening procedure by crossing both Curagen Corporation's proprietary yeast strains N106 ′ and YULH (US Pat. Nos. 6,057,101 and 6,083,693). Selected by diploid.
[0426]
4). RACE: Polymerase chain reaction based techniques such as rapid amplification of cDNA ends (RACE) were used to isolate or complete the predicted sequence of the cDNA of the present invention. Usually, multiple clones were sequenced from one or more human samples to derive the sequence for the fragment. Various human tissue samples from different donors were used for the RACE reaction. Sequences derived from these procedures were included in the SeqCalling Assembly method described in the previous chapter.
[0427]
5). Exon ligation: The NOVX target sequence identified in the present invention was subjected to the exon ligation method to confirm the sequence. PCR primers were designed starting from the most upstream sequence available for the forward primer and from the most downstream sequence available for the reverse primer. In each case, walk inward from each end to the coding sequence until an appropriate sequence that is either unique or highly selective is encountered, or in the case of a reverse primer, a stop codon is reached. And examined the sequence. Such primers are based on in silico predictions for full-length cDNA, target sequence DNA or protein sequence portions (one or more exons), or predicted exons for closely related human sequences from other species. Designed with the translated homology of These primers were then used in PCR amplification based on the following human cDNA pools: adrenal gland, bone marrow, brain-tonsillar, brain-cerebellum, brain-hippocampus, brain-substantia nigra, brain-thalamus, brain-full margin, Fetal brain, fetal kidney, fetal liver, fetal lung, heart, kidney, lymphoma-large, mammary gland, pancreas, pituitary gland, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thyroid, trachea The womb. Usually, the resulting amplicons were gel purified, cloned, and sequenced to high redundancy. PCR products derived from exon binding were cloned into Invitrogen's pCR2.1 vector. The resulting bacterial clone has an insert that covers the complete open reading frame cloned into the pCR2.1 vector. Sequences from all clones were assembled together with themselves, other fragments in the CuraGen Corporation database, and public ESTs. Fragments and ESTs were included as components of the assembly when their degree of identity with other components of the assembly was at least 95% over 50 bp. In addition, sequence traces were manually evaluated and edited for correction if appropriate. These procedures provide the sequences reported herein.
[0428]
6). Physical clones: Exons were predicted by homology, and intron / exon boundaries were determined using standard genetic rules. Exons were further selected and refined by multiple BLAST (eg, tBlastN, BlastX and BlastN) and, in some cases, similarity measures using GeneScan and Grail. When available, expression sequences from both public and proprietary databases were also added to further define and complete the gene sequences. The DNA sequence was then manually corrected for obvious discrepancies, thereby obtaining the sequence encoding the full-length protein.
PCR products derived by exon binding covering all open reading frames were cloned into Invitrogen's pCR2.1 vector to provide clones for expression and screening purposes.
[0429]
Example C: Quantitative expression analysis of clones in various cells and tissues
Quantitative expression of various clones was evaluated using real time quantitative PCR (RTQ PCR) using microtiter plates containing RNA samples from various normal and lesion derived cells, cell lines, and tissues. RTQ PCR was performed on an Applied Biosystems ABI PRISM® 7700 or ABI PRISM® 7900 HT Sequence Detection System. Various collected samples are collected on the plate, panel 1 (containing normal tissues and cancer cell lines), panel 2 (containing samples from tissues of normal and cancer origin), panel 3 (cancer cell lines). Panel 4 (contains cells and cell lines from normal tissues and cells associated with inflammatory abnormalities), panel 5D / 5I (contains human tissues and cell lines highlighting metabolic disease), AI _Comprehensive_panel (containing samples from normal tissue and autoimmune disease), panel CNSD.01 (containing central nervous system samples from normal and diseased brain), and CNS_neurodegeneration_panel (normal and Containing samples from Alzheimer's disease brain).
[0430]
By agarose gel electropherogram using 28S and 18S ribosomal RNA staining intensity ratio as a guide (2: 1-2.5: 1 28s: 18s) and by visual assessment of the absence of low molecular weight RNA that would indicate degradation products Quality control the integrity of RNA from all samples. Samples are controlled against genomic DNA contamination by RTQ PCR reactions performed in the absence of reverse transcriptase using a set of probes and primers designed to amplify over a single exon interval.
[0431]
Initially, RNA samples were normalized to reference nucleic acids such as constitutively expressed genes (eg, β-actin and GAPDH). Normalized RNA (5 μl) is converted to cDNA and analyzed by RTQ PCR using One Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems; Catalog No. 4309169) and gene-specific primers according to manufacturer's instructions did.
[0432]
In other cases, non-standardized RNA samples are converted to single-stranded cDNA (sscDNA) using Superscript II (Invitrogen Corporation; Catalog No. 18064-147) and disordered hexamers according to the manufacturer's instructions. Converted. Reactions containing up to 10 μg total RNA were performed in a 20 μl volume and incubated at 42 ° C. for 60 minutes. This reaction can be scaled up to 50 μg total RNA in a final volume of 100 μl. The sscDNA sample is then normalized to the reference nucleic acid as described above using 1X TaqMan® Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020) according to the manufacturer's instructions.
[0433]
Probes and primers were designed for each assay according to the Applied Biosystems Primer Express Software package (version 1 for Apple Computer's Macintosh Power PC) or a similar algorithm using the target sequence as input. The default settings were used for the reaction conditions, the following parameters were set, and primers were selected: primer concentration = 250 nM, primer melting temperature (Tm) range = 58 ° -60 ° C., primer optimal Tm = 59 ° C., maximum Primer difference = 2 ° C., probe does not have 5′G, probe Tm must be 10 ° C. larger than primer Tm, amplicon (amplification product) size is 75 bp to 100 bp. Selected probes and primers (see below) were synthesized by Synthegen (Houston, TX, USA). The probe was purified twice by HPLC to remove uncoupled dye and evaluated by mass spectrometry to confirm that the reporter and quencher dyes were coupled to the 5 'and 3' ends of the probe, respectively. Proven. Their final concentrations were 900 nM for the forward and reverse primers, respectively, and 200 nM for the probe.
[0434]
PCR conditions: When working with RNA samples, normalized RNA from each tissue and each cell line is placed in each well of either 96 or 384 well PCR plates (Applied Biosystems). Spotted. PCR cocktails include a single gene-specific probe and primer set or two multiplex probe and primer sets (a set specific to the target clone and another gene-specific set multiplexed by the target probe). ) Is included. The PCR reaction was set up using TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems; Catalog No. 4313803) according to the manufacturer's instructions. Reverse transcription was performed at 48 ° C. for 30 minutes followed by an amplification / PCR cycle as follows: 95 ° C. for 10 minutes, then 95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 1 minute, 40 cycles. The result is recorded as a CT value (cycle where a given sample crosses the fluorescence threshold) using the log scale, and between the given sample and the sample with the lowest CT value expressed as 2 to the Delta CT power The difference was the RNA concentration. Percent relative expression is then obtained by taking the reciprocal of this RNA difference and multiplying by 100.
[0435]
When working with sscDNA samples, standardized sscDNA was used as previously described for RNA samples. A PCR reaction containing one or two sets of probes and primers was set up using 1X TaqMan® Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020) according to the manufacturer's instructions. PCR amplification was performed as follows: 40 cycles of 95 ° C. for 10 minutes, then 95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 1 minute. Results were analyzed and processed as described above.
[0436]
Panel 1, 1.1, 1.2, and 1.3D
Plates for panels 1, 1.1, 1.2, and 1.3D include two control holes (genomic DNA control and chemical control) and 94 holes containing cDNA from various samples. The samples in these panels are divided into two classes: samples from cultured cell lines and samples from primary normal tissues. Cell lines are derived from the following types of cancer: lung cancer, breast cancer, melanoma, colon cancer, prostate cancer, CNS cancer, squamous cell carcinoma, ovarian cancer, liver cancer, kidney Cancer, stomach cancer and pancreatic cancer. The cell lines used in these panels were widely available through the American Type Culture Collection (ATCC), a repository for cultured cell lines, and were cultured using conditions recommended by the ATCC. The normal tissue found in these panels consists of samples from all major organ systems of a single adult individual or fetus. These samples are derived from the following organs: adult skeletal muscle, fetal skeletal muscle, adult heart, fetal heart, adult kidney, fetal kidney, adult liver, fetal liver, adult lung, fetal lung, various regions of the brain, spleen , Bone marrow, lymph node, pancreas, salivary gland, pituitary gland, adrenal gland, spinal cord, thymus, stomach, small intestine, colon, bladder, trachea, breast, ovary, uterus, placenta, prostate, testis and fat.
[0437]
In the results for panels 1, 1.1, 1.2, and 1.3D, the following abbreviations are used.
ca. : Cancer
^*: Established from metastasis
met: metastasis
s cell var: small cell mutant
non-s = non-sm: not small
squam: flat
pl.eff = pl effusion: pleural effusion
glio: glioma
astro: Astrocytoma
neuro: neuroblastoma
[0438]
General_Screening_Panel_v1.4
The plate for panel 1.4 contains two control holes (genomic DNA control and chemical control) and 94 holes containing cDNA from various samples. The samples in panel 1.4 are divided into two classes: samples from cultured cell lines and samples from primary normal tissues. Cell lines are derived from the following types of cancer: lung cancer, breast cancer, melanoma, colon cancer, prostate cancer, CNS cancer, squamous cell carcinoma, ovarian cancer, liver cancer, kidney Cancer, stomach cancer and pancreatic cancer. The cell lines used in panel 1.4 were widely obtained through the American Type Culture Collection (ATCC), a repository for cultured cell lines, and were cultured using conditions recommended by the ATCC. The normal tissue seen in panel 1.4 consists of sample pools derived from all major organ systems of 2 to 5 different adult individuals or fetuses. These samples are derived from the following organs: adult skeletal muscle, fetal skeletal muscle, adult heart, fetal heart, adult kidney, fetal kidney, adult liver, fetal liver, adult lung, fetal lung, various regions of the brain, spleen , Bone marrow, lymph node, pancreas, salivary gland, pituitary gland, adrenal gland, spinal cord, thymus, stomach, small intestine, colon, bladder, trachea, breast, ovary, uterus, placenta, prostate, testis and fat. Abbreviations are as described for panels 1, 1.1, 1.2, and 1.3D.
[0439]
Panel 2D and 2.2
Plates for panels 2D and 2.2 are typically created by surgeons working closely with two control holes and the National Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network (CHTN) or the National Disease Research Initiative (NDRI) Includes 94 test samples consisting of RNA or cDNA isolated from procured human tissue. Tissues are derived from human malignancies, and when indicated, many malignant tumor tissues have “corresponding margins” obtained from non-cancerous tissue immediately adjacent to the tumor. These are referred to as normal adjacent tissues and are represented as “NAT” in the following results. Tumor tissue and “corresponding margins” are evaluated by two independent pathologists (surgical pathologists plus NDRI or CHTN pathologists). This analysis provides a histopathological assessment of the grade of tumor differentiation. In addition, most samples contain original surgical pathology reports that provide information about the clinical stage of the patient. These matched perimeters are taken from the tissue surrounding the surgical area (ie, directly adjacent) (in Table RR, labeled “NAT” for normal adjacent tissue). In addition, RNA and cDNA samples were obtained from various human tissues derived from autopsy performed in elderly or sudden death victims (accidents, etc.). These tissues were confirmed to be disease free and were purchased from various commercial suppliers such as Clontech (Palo Alto, CA), Research Genetics and Invitrogen.
[0440]
Panel 3D
Panel 3D plate consists of 94 cDNA samples and 2 control samples. In particular, 92 of these samples are derived from cultured human cancer cell lines, 2 human primary cerebellar tissue samples, and 2 controls. Human cell lines are generally obtained from the American Type Culture Collection (ATCC), NCI or the German Cancer Cell Bank and fall into the following tissue groups: squamous cell carcinoma of the tongue, breast cancer, prostate cancer, black Carcinoma, epidermoid carcinoma, sarcoma, bladder carcinoma, pancreatic cancer, kidney cancer, leukemia / lymphoma, ovary / uterus / cervix, stomach, colon, lung and CNS cancer cell lines. In addition, there are two independent cerebellar samples. All these cells are cultured under standard recommended conditions and RNA is extracted using standard techniques. The cell lines in panels 3D and 1.3D are the most common cell lines used in the scientific literature.
[0441]
Panels 4D, 4R, and 4.1D
Panel 4 is a 96-well plate (2 control wells, 94) consisting of RNA (panel 4R) or cDNA (panel 4D / 4.1D) isolated from various human cell lines or tissues associated with inflammatory diseases. Samples on a single test sample). Total RNA from control normal tissues such as colon and lung (Stratagene, La Jolla, CA) and thymus and kidney (Clonetech) were used. Total RNA from liver tissue of cirrhotic patients and kidney of erythematosus patients was obtained from BioChain (Biochain Institute, Inc., Hayward, CA). Intestinal tissue for RNA specimens from patients diagnosed with Crohn's disease and ulcerative colitis was obtained from the National Disease Research Interchange (NDRI) (Philadelphia, PA).
[0442]
Astrocytes, lung fibroblasts, skin fibroblasts, coronary artery smooth muscle cells, small airway epithelium, bronchial epithelium, microvascular skin endothelial cells, microvascular lung endothelial cells, human pulmonary artery endothelial cells, human umbilical vein endothelial cells All were purchased from Clonetics (Walkersville, MD) and grown in culture medium supplied by Clonetics for these cell types. These primary cell types were activated with various cytokines or combinations of cytokines for 6 hours and / or 12-14 hours as indicated. The following cytokines were used: approximately 1-5 ng / ml IL-1 beta, approximately 5-10 ng / ml TNF alpha, approximately 20-50 ng / ml IFN gamma, approximately 5-10 ng / ml IL-4. Approximately 5-10 ng / ml IL-9, approximately 5-10 ng / ml IL-13. Sometimes endothelial cells were starved for various times by culturing in basal medium from Clonetics with 0.1% serum.
[0443]
Mononuclear cells were prepared from the blood of CuraGen Corporation employees using Ficoll. From these cells, DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco / Life Technologies, Rockville, MD), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10^-5LAK cells were prepared by culturing for 4-6 days in M (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco) and interleukin-2. Cells were then treated with 10-20 ng / ml PMA and 1-2 μg / ml ionomycin, 5-10 ng / ml IL-12, 20-50 ng / ml IFN-gamma and 5-10 ng / ml IL-18. Either was activated for 6 hours. In some cases, mononuclear cells are allowed to remain in DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM with approximately 5 μg / ml PHA (phytohemagglutinin) or PWM (American pokeweed mitogen) for 4-5 days. Sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10^-5Cultured in M (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco). Samples were taken at 24, 48 and 72 hours for RNA preparation. MLR (mixed lymphocyte reaction) samples were collected from two donors, mononuclear cells were isolated using Ficoll, and the isolated mononuclear cells were 1: 1 with DMEM 5% FCS (Hyclone). ), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol (5.5 × 10^-5M) (Gibco), and approximately 2 × 10 in 10 mM Hepes (Gibco)⁶Obtained by mixing at a final concentration of cells / ml. MLRs were cultured and samples were taken at various time points ranging from 1-7 days for RNA preparation.
[0444]
Monocytes were isolated from mononuclear cells using CD14 Miltenyi Beads, positive veVS selection column and Vario Magnet according to the manufacturer's instructions. Monocytes were isolated from DMEM 5% fetal calf serum (FCS) (Hyclone, Logen, UT), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10.^-5Differentiated into dendritic cells by culturing for 5-7 days in M (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco), 50 ng / ml GMCSF and 5 ng / ml IL-4. Monocytes were treated with DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10.^-5Macrophages were prepared by culturing for 5-7 days in M (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco) and 10% AB human serum or approximately 50 ng / ml MCSF. Monocytes, macrophages and dendritic cells were stimulated with 100 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) for 6 hours and 12-14 hours. Dendritic cells were also stimulated with 10 μg / ml anti-CD40 monoclonal antibody for 6 hours and 12-14 hours.
[0445]
CD4 lymphocytes, CD8 lymphocytes and NK cells were also isolated from mononuclear cells using CD4, CD8 and CD56 Miltenyi Beads, positive VS selection column and Vario Magnet according to the manufacturer's instructions. CD45RA and CD45RO CD4 lymphocytes were isolated by removing CD8, CD56, CD14 and CD19 cells from mononuclear cells using CD8, CD56, CD14 and CD19 Miltenyi Beads and positive selection. Subsequently, when CD45RO CD4 lymphocytes were isolated using CD45RO beads, the remaining cells were CD45RA CD4 lymphocytes. CD45RA CD4, CD45RO CD4 and CD8 lymphocytes were purified from DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10.^-5In M (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco)⁶Cells / ml were plated onto Falcon 6-well tissue culture plates coated overnight with 0.5 μg / ml anti-CD28 (Pharmingen) and 3 μg / ml anti-CD3 (OKT3, ATCC) in PBS. Cells were collected for RNA preparation after 6 and 24 hours. To prepare chronically activated CD8 lymphocytes, we activated isolated CD8 lymphocytes on anti-CD28 and anti-CD3 coated plates for 4 days, then collected the cells, DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10^-5Grown in M (Gibco), and 10 mM Hepes (Gibco) and IL-2. Proliferated CD8 cells were then reactivated for 4 days with anti-CD3 and anti-CD28 bound to the plates and expanded as described above. RNA was isolated 6 and 24 hours after the second activation and 4 days after the second expansion culture. The isolated NK cells were treated with DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10 4 days before RNA preparation.^-5Cultured in M (Gibco), and 10 mM Hepes (Gibco) and IL-2.
[0446]
To obtain B cells, tonsils were obtained from NDRI. The tonsils were cut with sterile dissected scissors and then passed through a sieve. The tonsil cells were then spun down and DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10.^-510 in M (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco)⁶Resuspended at cells / ml. In order to activate the cells we used 5 μg / ml PWM or approximately 10 μg / ml anti-CD40 (Pharmingen) and 5-10 ng / ml IL-4. Cells were harvested at 24, 48 and 72 hours for RNA preparation.
[0447]
To prepare primary and secondary Th1 / Th2 and Tr1 cells, 6-well Falcon plates were coated overnight with 10 μg / ml anti-CD28 (Pharmingen) and 2 μg / ml OKT3 (ATCC) and then with PBS. Washed twice. Umbilical cord blood CD4 lymphocytes (Poietic Systems, German Town, MD), DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10^-5In M (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco) and IL-2 (4 ng / ml), 10⁵-10⁶Cultured at cells / ml. IL-12 (5 ng / ml) and anti-IL4 (1 μg / ml) were used for Th1, while IL-4 (5 ng / ml) and anti-IFN gamma (1 μg / ml) were used for Th2. ) And 5 ng / ml IL-10 for Tr1. After 4-5 days, activated Th1, Th2 and Tr1 lymphocytes were washed once in DMEM and DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acid (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercapto Ethanol 5.5 × 10^-5The cells were cultured in M (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco) and IL-2 (1 ng / ml) for 4 to 7 days. Following this, activated Th1, Th2 and Tr1 lymphocytes were added with anti-CD28 / OKT3 and cytokines as described above, but with anti-CD95L (1 μg / ml) to prevent apoptosis, Restimulated for 5 days. After 4-5 days, Th1, Th2 and Tr1 lymphocytes were washed and then re-cultured with IL-2 for 4-7 days. Activated Th1 and Th2 lymphocytes were maintained in this way for up to 3 cycles. From primary and secondary Th1, Th2 and Tr1, 6 and 24 hours after the second and third activation by anti-CD3 and anti-CD28 mAb bound to the plate, and second and second in interleukin-2. RNA was prepared 4 days after the start of the third expansion culture.
[0448]
The following white blood cell lines were obtained from ATCC: Ramos, EOL-1, KU-812. EOL cells were 5 × 10 5 in 0.1 mM dbcAMP.⁵Change medium every 3 days at cells / ml and cell concentration 5 × 10⁵Further differentiation was achieved by culturing for 8 days while adjusting to cells / ml. To cultivate these cells, we have 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10.^-5M (Gibco), 10 mM Hepes (Gibco) was added and DMEM or RPMI (as recommended by ATCC) was used. RNA was prepared from either dormant cells or cells activated with 10 ng / ml PMA and 1 μg / ml ionomycin for 6 and 14 hours. The keratinocyte cell line CCD106 and airway epithelial tumor line NCI-H292 were also obtained from ATCC. Both were DMEM 5% FCS (Hyclone), 100 μM non-essential amino acids (Gibco), 1 mM sodium pyruvate (Gibco), mercaptoethanol 5.5 × 10^-5Cultured in M (Gibco) and 10 mM Hepes (Gibco). CCD1106 cells were activated with approximately 5 ng / ml TNF alpha and 1 ng / ml IL-1 beta for 6 and 14 hours, while NCI-H292 cells were activated with the following cytokines for 6 and 14 hours: 5 ng / ml IL- 4, 5 ng / ml IL-9, 5 ng / ml IL-13 and 27 ng / ml IFN gamma.
[0449]
About these cell lines and blood cells, about 10 using Trizol (Gibco BRL).⁷Cells / ml were lysed to prepare RNA. Briefly, 1/10 volume of bromochloropropane (Molecular Research Corporation) was added to the RNA sample, vortexed, and after 10 minutes at room temperature, the tube was centrifuged at 14,000 rpm in a Sorvall SS34 rotator. The aqueous phase was removed and placed in a 15 ml Falcon Tube. An equal volume of isopropanol was added and left at −20 ° C. overnight. The precipitated RNA was spun down in a Sorvall SS34 rotator at 9,000 rpm for 15 minutes and washed in 70% ethanol. The pellet was redissolved in 300 μl RNase-free water and 35 μl buffer (Promega), 5 μl DTT, 7 μl RNAsin and 8 μl DNase were added. Tubes were incubated at 37 ° C. for 30 minutes to remove contaminating genomic DNA, extracted once with phenol / chloroform, and reprecipitated with 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of 100% ethanol. RNA was spun down and placed in RNase free water. RNA was stored at -80 ° C.
[0450]
AI_Comprehensive_Panel_v1.0
The plate for AI_Comprehensive_Panel_v1.0 consists of two control wells and 89 copies of cDNA isolated from surgical and autopsy human tissues obtained from Backus Hospital and Clinomics (Frederick, MD) Includes test sample. Total RNA was extracted from tissue samples from Backus Hospital at the CuraGen facility. Total RNA from other tissues was obtained from Clinomics.
[0451]
Joint tissue, including synovial fluid, synovium, bone and cartilage, was obtained from a patient who had a total knee or hip replacement operation at Backus Hospital. Immediately thereafter, tissue samples were quickly frozen in liquid nitrogen to ensure that the isolated RNA was of optimal quality and not degraded. Yet another sample of joint tissue from osteoarthritis and rheumatoid arthritis was obtained from Clinomics. Normal control tissues were sourced from Clinomics and were obtained during autopsy of trauma victims.
[0452]
Surgical specimens of psoriatic tissue and adjacent matched tissue were obtained from Clinomics as total RNA. Two male and two female patients were selected from age 25 to 47 years. None of the patients were taking prescription drugs when the samples were isolated.
[0453]
Surgical specimens of diseased colon and adjacent matched tissue from patients with ulcerative colitis and Crohn's disease were obtained from Clinomics. Intestinal tissue from three women between the ages of 41 and 69 and three male Crohn's disease patients was used. Two patients were not taking prescription drugs, while others were taking dexamethasone, phenobarbital or tylenol. Ulcerative colitis tissue was from 3 male and 4 female patients. Four of the patients took levbid and two received phenobarbital.
[0454]
Total RNA from autopsy lung tissue of trauma victims with no disease or emphysema, asthma or COPD was purchased from Clinomics. All emphysema patients ranging from 40 to 70 years old are smokers, and this age range focuses on patients with tobacco-related emphysema and excludes those with alpha-1 anti-trypsin deficiency Selected to do. Asthmatic patients ranged from 36 to 75 years of age and excluded smokers to prevent those patients who could have COPD. COPD patients ranged from 35 to 80 years of age and included both smokers and non-smokers. Most patients were taking corticosteroids and bronchodilators.
[0455]
AI_Comprehensive_Panel_V1.0 The following abbreviations are used in the labels used to identify tissues in the panel.
AI: Autoimmunity
Syn: Synovial fluid
Normal: No obvious disease
Rep22 / Rep20: Individual patient
RA: rheumatoid arthritis
Backus: From Backus Hospital
OA: osteoarthritis
(SS) (BA) (MF): Individual patient
Adj: Adjacent organization
Match control: Adjacent tissue
-M: Male
-F: Female
COPD: Chronic obstructive pulmonary disease
[0456]
Panels 5D and 5I
Plates for panels 5D and 5I contain two control wells and various cDNAs isolated from human tissues and cell lines highlighting metabolic disease. Metabolic tissue was obtained from patients enrolled in the Gestational Diabetes study. Cells were obtained during various stages of adipocyte differentiation from human mesenchymal stem cells. Human pancreatic islet cells were also obtained.
[0457]
In the Gestational Diabetes study, the subjects are young (18-40 years) healthy women except for the presence or absence of gestational diabetes with routine (selective) cesarean section. After infant delivery, when the surgical incision is being repaired / sutured, the obstetrician removed a small sample (<1 cc) of metabolic tissue exposed during each surgical level of suturing. The biopsy material was rinsed with sterile saline, blotted and quickly frozen within 5 minutes of extraction. The tissue was then snap frozen in liquid nitrogen, stored individually in sterile screw-cap tubes and placed on dry ice for transport to CuraGen or until harvested. Metabolic tissues of interest include uterine wall (smooth muscle), visceral fat, skeletal muscle (straight muscle) and subcutaneous fat. The patient's explanation is as follows.
Patient 2 Diabetes Latin American, overweight, not taking insulin
Patients 7-9 Non-diabetic Caucasian and obese (BMI> 30)
Patient 10 Diabetes Latin American, overweight, taking insulin
Patient 11 Non-diabetic African American overweight
Patient 12 Diabetes Latin American taking insulin
[0458]
Adipocyte differentiation was induced in donor progenitor cells obtained in 3 parts from Osirus (a division of Clonetics / Bio Whittaker), with the exception of donor 3U, which had only two replicates. Clonetics scientists have published human mesenchymal stem cells (HuMSC) for CuraGen, as seen in Mark F. Pittenger, et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999: 143-147 Isolated, grown and differentiated based on protocol. From Clonetics, Trizol lysates or frozen pellets suitable for mRNA isolation and ds cDNA production were obtained. A general description of each donor is as follows.
Donors 2 and 3U: Mesenchymal stem cells, undifferentiated fat
Donor 2 and 3AM: fat, prematurely differentiated fat
Donor 2 and 3AD: fat, differentiated fat
[0459]
Human cell lines are generally obtained from ATCC (American Type Culture Collection), NCI or German cancer cell banks and fall into the following tissue groups: proximal convoluted tubules, uterine smooth muscle cells, small intestine, liver HepG2 Cancer cells, cardiac primary stromal cells and adrenocortical adenoma cells. All of these cells were cultured under standard recommended conditions and RNA was extracted using standard procedures. All samples were processed with CuraGen to produce single stranded cDNA.
[0460]
Panel 51 includes the addition of islets from a 58 year old female patient obtained from the Diabetic Research Institute at the University of Miami School of Medicine for all the samples described above. Islet tissue was processed into total RNA by an external vendor and transferred to CuraGen for addition to panel 51.
[0461]
The following abbreviations are used in labels used to identify tissue in 5D and 5I panels:
GO Adipose: Large retinal fat
SK: Skeletal muscle
UT: Uterus
PL: Placenta
AD: Differentiated fat
AM: Midway differentiated fat
U: Undifferentiated stem cell
[0462]
Panel CNSD.01
The plate for panel CNSD.01 contains 94 test samples consisting of 2 control wells and cDNA isolated from autopsy human brain tissue obtained from the Harvard Brain Tissue Resource Center. The brain was removed from the donor calvaria between 4 and 24 hours post-mortem, sectioned by a neuroanatomist and frozen at −80 ° C. in liquid nitrogen vapor. A neuropathologist slices and examines all brains to confirm the diagnosis with a clear associated neuropathology.
[0463]
Disease diagnosis is taken from patient records. The panel includes two brains from each of the following diagnoses: Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, progressive supranuclear palsy, depression, and “normal controls”. Within each of these brains, the following areas are presented: zonal gyrus, temporal pole, pallidum, substantia nigra, Brodman 4 area (primary motor area), Brodman 7 area (parietal cortex), Brodman 9 area (frontal frontal) Cortex) and Brodman 17 area (occipital cortex). In all cases, not all of the brain area is presented; for example, Huntington's disease is partly characterized by neurodegeneration in the pallidal sphere, and thus this area cannot be obtained from a confirmed case of Huntington's disease Impossible. Parkinson's disease is also characterized by substantia nigra degeneration, making it more difficult to obtain this area. A neuropathological examination of the normal control brain was performed and found no pathology consistent with neurodegeneration.
[0464]
The following abbreviations are used in the labels used to identify the tissue in the CNS panel.
PSP: Progressive supranuclear palsy
Sub Nigra: Black quality
Glob Palladus
Temp Pole: Temporal pole
Cing Gyr: zonal gyrus
BA4: Brodman 4 field
[0465]
Panel CNS_Neurodegeneration_V1.0
Plate for panel CNS_Neurodegenesis_V1.0 is obtained from two control wells and the Harvard Brain Tissue Resource Center (McLean Hospital) and the Human Brain and Spinal Fluid Resource Center (VA Greater Los Angeles Healthcare System) 47 test samples consisting of cDNA isolated from autopsy human brain tissue. The brain was removed from the donor calvaria between 4 and 24 hours post-mortem, sectioned by a neuroanatomist and frozen at −80 ° C. in liquid nitrogen vapor. A neuropathologist slices all brains and examines them to confirm the diagnosis with a clear associated neuropathology.
[0466]
Disease diagnosis is taken from patient records. The panel includes 6 brains from Alzheimer's disease (AD) disease and 8 brains from “normal controls” that showed no evidence of dementia before death. The eight normal control brains are divided into two categories: controls with no dementia and Alzheimer-like pathology (control) and those with no dementia but severe Alzheimer-like pathology (especially level 3 on a scale of 0-3) Control with evidence of senile plaque burden, 0 = no plaque marks, 3 = severe AD senile plaque burden). Within each of these brains, the following areas are presented: hippocampus, temporal cortex (Brodman 21), parietal cortex (Brodman 7) and occipital cortex (Brodman 17). These regions were selected to encompass all levels in AD. The hippocampus is an area of early and severe nerve loss in AD; the temporal cortex is known to exhibit neurodegeneration in AD after the hippocampus; the parietal cortex exhibits moderate neuronal death at a late stage of the disease; The occipital cortex survives in AD and therefore serves as the “control” area within AD patients. In all cases, not all of the brain area is presented.
[0467]
The following abbreviations are used in labels used to identify tissue in the CNS_Neurodegenerative_V1.0 panel.
AD: Alzheimer's disease brain; patient became demented and presented with AD-like pathology at necropsy.
Control: Control brain; non-demented patient, no neuropathology
Control (Path): Control brain; patients with severe AD-like pathology but not dementia
Sup Temporal Ctx: superior temporal cortex
Inf Temporal Ctx: Inferior temporal cortex
[0468]
A. GG100100404-01: Fibronectin-maleate dehydrogenase
The expression of gene CG100104-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4162 described in Table AA. The results of the RTQ-PCR run are shown in Tables AB and AC.
[0469]
[Table 164]

[0470]
[Table 165]

[0471]
Continuation of Table AB
[Table 166]

[0472]
[Table 167]

[0473]
Continuation of Table AC
[Table 168]

[0474]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4162
The very high expression of the CG100104-01 gene is exclusively detected from the testis (CT = 28.5). Thus, the expression of this gene can be used to distinguish testis samples from other samples used in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene product may be useful in the treatment of testis related diseases such as fertility and hypogonadism.
[0475]
Furthermore, low expression of this gene is also detected in the ovarian cancer OVCAR-8-cell line (CT = 33.4). Thus, therapeutic modulation of this protein product may be useful in the treatment of ovarian cancer.
[0476]
Panel 4.1D Summary: Ag4162
Very high expression of the CG100104-01 gene is detected in the kidney (CT = 29.9). Expression of this gene is found exclusively in normal lung, thymus and kidney. That is, the expression of this gene can be used to distinguish these tissue samples from other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene product may be beneficial in the treatment of inflammatory or autoimmune diseases that affect the lungs and kidneys.
[0477]
B. CG56785-01: Mitochondrial GTP: AMP phosphotransferase
The expression of gene CG56785-01 was evaluated using primer-probe set Ag3036 as described in Table BA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables BB, BC and BD.
[0478]
[Table 169]

[0479]
[Table 170]

[0480]
[Table 171]

[0481]
Continuation of Table BC
[Table 172]

[0482]
[Table 173]

[0483]
Continuation of Table BD
[Table 174]

[0484]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag3036
This panel does not show differential expression of the CG56785-01 gene in Alzheimer's disease. However, this expression profile indicates the presence of this gene in the brain. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0485]
Panel 1.3D Summary: Ag3036
The expression of the CG56785-01 gene is exclusively detected in the bone marrow (CT = 34.6). This gene has been shown to be down-regulated in various blood diseases (Waller HD, Klin Wochenschr, May 15, 1978, 56 (10): 483-91), a putative member of the adenylate kinase family. Code. That is, the expression of this gene distinguishes this sample from other samples in this panel and can be used as a marker for bone marrow and erythrocytes. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of hematological disorders and leukemias.
[0486]
Panel 4D Summary: Ag3036
Expression of the CG56785-01 gene is seen exclusively in resting mononuclear cells (CT = 33.3). This expression is consistent with that in panel 1.3D. Expression of this gene in resting cells of this line suggests that the protein encoded by this transcript may be involved in normal immunological processes associated with immune homeostasis.
[0487]
C. CG56914-01: Thrombospondin
The expression of the gene CG56914-01 was evaluated using the primer probe sets Ag3108 and Ag3899 described in Tables CA and CB. The results of RTQ-PCR run are shown in Tables CC, CD, CE, CF, CG, CH and CI.
[0488]
[Table 175]

[0489]
[Table 176]

[0490]
[Table 177]

[0491]
Continuation of Table CC
[Table 178]

[0492]
[Table 179]

[0493]
Continuation of Table CD
[Table 180]

[0494]
[Table 181]

[0495]
Continuation of Table CE
[Table 182]

[0496]
[Table 183]

[0497]
Continuation of table CF
[Table 184]

[0498]
[Table 185]

[0499]
Continuation of Table CG
[Table 186]

[0500]
[Table 187]

[0501]
Continuation of Table CH
[Table 188]

[0502]
[Table 189]

[0503]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag3899 / Ag3960 / Ag4338
The results of three experiments with two different primer and probe sets are in great agreement, with very high expression of the CG56914-01 gene seen in the CNS cancer (astro) SNB-75 cell line (CT = 23-26 ). Furthermore, very high expression of this gene is found in CNS cancer cell lines, colon cancer tissues, kidney cancer cell line UO-31, breast cancer and melanoma cell lines. Thus, the expression of this gene distinguishes these samples from other samples in the panel and can be used as a marker for detection of these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the activity of this gene or its protein product may be beneficial in the treatment of these cancers through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies.
[0504]
Among tissues with metabolic or endocrine function, this gene is expressed at low to moderate levels in the pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, pituitary, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene may prove useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0505]
Interestingly, this gene is expressed at fairly high levels in fetal liver (CT = 31-32) and lung (CT = 28) when compared to the corresponding adult tissue (CT = 33-35). This observation suggests that expression of this gene can be used to distinguish these fetal tissues from the corresponding adult tissues.
[0506]
HASS Panel v1.0 Summary: Ag3108
The CG56914-01 gene is expressed by MCF-7 cells and glioma samples in this panel. The expression of this gene is serum dependent in MCF-7 cells. Thus, expression can be regulated by cytokines and extracellular molecules found in serum. This gene modulation may be beneficial in the treatment of glioma through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibiotics.
[0507]
Panel 1.3D Summary: Ag3108
A very high expression of the CG56914-01 gene is detected in the melanoma cell line (CT = 27). Furthermore, expression of this gene is also found in melanoma, breast cancer, lung cancer, astrocytoma cell lines, and well-to-moderately differentiated (ODO3866) tissues of colon cancer. See panel 1.4 for a description of this gene.
[0508]
Panel 2.1 Summary: Ag3108
A very high expression of the CG56914-01 gene is detected in melanoma metastasis samples (CT = 29). Furthermore, the expression of this gene is higher in normal liver compared to adjacent carcinoma tissue and in metastatic breast cancer (OD04590-03) (CT = 33) compared to breast cancer (OD04590-01) (CT = 36.7). Yes. That is, the expression of this gene can potentially be used as a cancer metastasis marker. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of lung cancer, breast cancer and melanoma.
[0509]
Panel 4.1D Summary Ag3899
A very high expression of the CG56914-01 gene is found in the lung (CT = 30.3). In addition, medium to low level expression of this gene is found in HUVEC cells, lung and dermal fibroblasts. Therefore, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene are important in the treatment of inflammatory lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, allergies and emphysema and skin diseases including psoriasis obtain.
[0510]
Panel 4D Summary: Ag3108
A very high expression of the CG56914-01 gene is found in the lung (CT = 28.6). In general, the expression in this panel is in good agreement with the expression in panel 4.1D. Significant expression of this gene is also found in HPAEC cells, HUVEC cells, lung fibroblasts, TNF alpha + IL1 beta treated bronchial epithelium and dermal fibroblasts. Thus, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene are important in the treatment of inflammatory lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, allergies and emphysema and skin diseases including psoriasis obtain.
[0511]
In addition, low expression of this gene is also found in the kidney and colon. Thus, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene are useful in the treatment of inflammatory or autoimmune diseases that affect the kidneys, such as lupus and glomerulonephritis, and inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease. Can be important.
[0512]
Interestingly, the expression of this gene is stimulated in PMA / ionomycin-treated basophilic cells (CT = 30) compared to resting basophilic cells (CT = 36). Basophilic cells release histamine and other biological modifiers in response to allergens and play an important role in the pathology of asthma and hypersensitivity reactions. Thus, therapeutic agents designed for the putative protein encoded by this gene can reduce or inhibit inflammation by blocking the function of basophil cells in these diseases. Furthermore, these cells are a logical model for inflammatory cells involved in various inflammatory lung and bowel diseases such as asthma, Crohn's disease and ulcerative colitis. Thus, therapeutic agents that modulate the function of this gene product may reduce or eliminate symptoms in patients with asthma, Crohn's disease and ulcerative colitis.
[0513]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag3108 / Ag3960
Two experiments with different probe and primer sets give very consistent results. A very high expression of the CG56914-02 gene is seen in metastatic melanoma (CT = 30-31). This result is consistent with panel 2D. Furthermore, the expression of this gene is higher in kidney and lung cancer when compared to normal adjacent tissues. That is, the expression of this gene can be used to distinguish these samples from other samples in this panel and as a marker for these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene or gene product may be useful in the treatment of these cancers.
[0514]
D. CG56914-02: TSP, IG EGF domain-containing protein
Primer-probe sets Ag1315b, Ag1316b, Ag1924, Ag3108, Ag771, Ag772, Ag900, Ag3899, Ag3960, as described in Tables DA, DB, DC, DD, DE, DF, DG, DH, DI, DJ and DK The expression of gene CG56914-02 was evaluated using Ag4338 and Ag343. The RTQ-PCR execution results are shown in Tables DL, DM, DN, DO, DP, DQ, DR, DS, and DT.
[0515]
[Table 190]

[0516]
[Table 191]

[0517]
[Table 192]

[0518]
[Table 193]

[0519]
[Table 194]

[0520]
[Table 195]

[0521]
[Table 196]

[0522]
[Table 197]

[0523]
[Table 198]

[0524]
[Table 199]

[0525]
[Table 200]

[0526]
[Table 201]

[0527]
Table DL continued
[Table 202]

[0528]
Table DL continued
[Table 203]

[0529]
[Table 204]

[0530]
Continuation of Table DM
[Table 205]

[0531]
[Table 206]

[0532]
Continuation of Table DN
[Table 207]

[0533]
[Table 208]

[0534]
Continuation of table DO
[Table 209]

[0535]
[Table 210]

[0536]
Continuation of Table DP
[Table 211]

[0537]
[Table 212]

[0538]
Continuation of Table DQ
[Table 213]

[0539]
[Table 214]

[0540]
Table DR continued
[Table 215]

[0541]
Table DR continued
[Table 216]

[0542]
[Table 217]

[0543]
Continuation of Table DS
[Table 218]

[0544]
[Table 219]

[0545]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag3899 / Ag3960 / Ag4338
The results of three experiments with two different primer and probe sets are in very good agreement, and a very high expression of the CG56914-01 gene is seen in the CNS cancer (astro) SNB-75 cell line (CT = 23- 26). Furthermore, very high expression of this gene is found in CNS cancer cell lines, colon cancer tissue, renal cancer cell line UO-31, breast cancer and melanoma cell lines. Thus, the expression of this gene distinguishes these samples from other samples in the panel and can be used as a marker for detection of these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the activity of this gene or its protein product may be beneficial in the treatment of these cancers through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies.
[0546]
Among tissues with metabolic or endocrine function, this gene is expressed at low to moderate levels in the pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, pituitary, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene may prove useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0547]
Interestingly, this gene is expressed at fairly high levels in fetal liver (CT = 31-32) and lung (CT = 28) when compared to the corresponding adult tissue (CT = 33-35). This observation suggests that expression of this gene can be used to distinguish these fetal tissues from the corresponding adult tissues.
[0548]
HASS Panel v1.0 Summary: Ag3108
The CG56914-02 gene is expressed by MCF-7 cells and glioma samples in this panel. The expression of this gene is serum dependent in MCF-7 cells. Thus, expression can be regulated by cytokines and extracellular molecules found in serum. This gene modulation may be beneficial for the treatment of glioma through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibiotics.
[0549]
Panel 1 Summary: Ag343
A very high expression of the CG56914-02 gene is detected in the breast cancer MDA-N cell line (CT = 26). Furthermore, very high expression of this gene is also observed in melanoma, astrocytoma, and lung cancer cell lines. See panel 1.4 for a description of this gene.
[0550]
Panel 1.2 Summary: Ag771 / Ag772
The two experiments gave very consistent results, and a very high expression of the CG56914-02 gene is seen in the melanoma cell line (CT = 25). High levels of expression are also seen in clusters of samples from melanoma, breast and brain cancer cell lines. That is, the expression of this gene can be used to distinguish melanoma samples from other samples in this panel and as a marker to detect the presence of these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be effective in the treatment of melanoma, breast and brain cancer.
[0551]
Panel 1.3D Summary: Ag3108
A very high expression of the CG56914-01 gene is detected in the melanoma cell line (CT = 27). Furthermore, expression of this gene is also found in melanoma, breast cancer, lung cancer, astrocytoma cell lines, and well-to-moderately differentiated (ODO3866) tissues of colon cancer. See panel 1.4 for a description of this gene.
[0552]
Panel 2.1 Summary: Ag3108
A very high expression of the CG56914-01 gene is detected in melanoma metastasis samples (CT = 29). Furthermore, the expression of this gene is higher in normal liver compared to adjacent carcinoma tissue and in metastatic breast cancer (OD04590-03) (CT = 33) compared to breast cancer (OD04590-01) (CT = 36.7). Yes. That is, the expression of this gene can potentially be used as a cancer metastasis marker. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of lung cancer, breast cancer and melanoma.
[0553]
Panel 4.1D Summary Ag3899 / Ag3960 / Ag4338
The results of three experiments with two different primer and probe sets are very consistent, with very high expression of the CG56914-02 gene found in the lung (CT = 30-31). Furthermore, significant expression of this gene is found in HUVEC cells, lung fibroblasts and dermal fibroblasts. Therefore, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene are important in the treatment of inflammatory lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, allergies and emphysema and skin diseases including psoriasis obtain.
[0554]
Furthermore, low expression of this gene is also seen in the kidney. Thus, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene may be important in the treatment of inflammatory or autoimmune diseases such as lupus and glomerulonephritis that regulate kidney function and affect the kidney .
[0555]
Panel 4D Summary: Ag3108
A very high expression of the CG56914-01 gene is found in the lung (CT = 28.6). In general, the expression in this panel is correspondingly consistent with that in panel 4.1D. Significant expression of this gene is also found in HPAEC cells, HUVEC cells, lung fibroblasts, TNF alpha + IL1 beta treated bronchial epithelium and dermal fibroblasts. Therefore, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene are important in the treatment of inflammatory lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma, allergies and emphysema and skin diseases including psoriasis obtain.
[0556]
In addition, low expression of this gene is also found in the kidney and colon. Thus, antibodies or small molecule therapeutics designed with the protein encoded by this gene are useful in the treatment of inflammatory or autoimmune diseases that affect the kidneys, such as lupus and glomerulonephritis, and inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease. Can be important.
[0557]
Interestingly, the expression of this gene is stimulated in CTA / ionomycin-treated basophilic cells (CT = 30) compared to resting basophilic cells (CT = 36). Basophilic cells release histamine and other biological modifiers in response to allergens and play an important role in the pathology of asthma and hypersensitivity reactions. Thus, therapeutic agents designed for the putative protein encoded by this gene can reduce or inhibit inflammation by blocking the function of basophil cells in these diseases. Furthermore, these cells are a logical model for inflammatory cells involved in various inflammatory lung and bowel diseases such as asthma, Crohn's disease and ulcerative colitis. Thus, therapeutic agents that modulate the function of this gene product may reduce or eliminate symptoms in patients with asthma, Crohn's disease and ulcerative colitis.
[0558]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag3108 / Ag3960
Two experiments with different probe and primer sets give very consistent results. A very high expression of the CG56914-02 gene is seen in metastatic melanoma (CT = 30-31). This result is consistent with panel 2D. Furthermore, the expression of this gene is higher in kidney and lung cancer when compared to normal adjacent tissues. That is, the expression of this gene can be used to distinguish these samples from other samples in this panel and as a marker for these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene or gene product may be useful in the treatment of these cancers.
[0559]
E. CG57242-01: KIA0090
The expression of the gene CG57242-01 was evaluated using the primer-probe set Ag3146 described in Table EA. The results of RTQ-PCR runs are shown in Tables EB, EC and ED.
[0560]
[Table 220]

[0561]
[Table 221]

[0562]
[Table 222]

[0563]
Continuation of Table EC
[Table 223]

[0564]
[Table 224]

[0565]
Continuation of Table ED
[Table 225]

[0566]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag3146
This panel does not show differential expression of the CG57242-01 gene in Alzheimer's disease. However, this expression profile confirms the presence of this gene in the brain. See panel 1.3D for a description of this gene.
[0567]
Panel 1.3D Summary: Ag3146
A very high expression of CG57242-01 is found in the brain cancer cell line (CT = 29). This gene is ubiquitously expressed in this panel, and significant levels of expression are also found in cell line clusters from ovarian, lung, liver and brain cancers. That is, the expression of this gene can be used as a marker for these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene product may be useful in the treatment of lung, liver, ovary and brain cancer.
[0568]
Among tissues with metabolic functions, this gene is expressed at moderate to low levels in the pituitary gland, fat, adrenal gland, pancreas, thyroid and adult and fetal skeletal muscle, heart and liver. This widespread expression between these tissues indicates that the gene product can play a role in normal neuroendocrine and metabolic functions, and that the regulation of expression of the gene is disrupted, resulting in neuroendocrine or metabolic disease. Suggests that, for example, obesity and diabetes can be induced.
[0569]
This gene is also expressed at low levels in the CNS, including the hippocampus, thalamus, substantia nigra, tonsils, cerebellum and cerebral cortex. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0570]
Panel 4D Summary: Ag3146
A very high expression of CG57242-01 is seen in the B cell line Ramos treated with ionomycin (CT = 26.5). This gene is ubiquitously expressed in this panel, with slightly higher levels of expression seen in activated T cells when compared to resting T cells. Furthermore, a significant level of expression is seen in PWM treated PBMC and B lymphocytes. A significant level of expression is also a range of cell types important in the immune response in healthy conditions and diseases such as the d endothelial cells, macrophages / monocytes, and peripheral blood mononuclear cell families, and epithelium and from the lungs and skin It is found in fibroblast types and normal tissues represented by the intestines, lungs, thymus and kidneys. This ubiquitous expression pattern suggests that this gene product may be involved in the homeostasis process for these and other cell types and tissues. This pattern is consistent with the expression profile in panel 1.3 and suggests a role for gene products in cell survival and proliferation. Thus, modulation of gene products by functional therapeutics induces functional alterations associated with these cell types and results in autoimmune and inflammatory diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, psoriasis, rheumatoid arthritis And improvement of symptoms in patients suffering from osteoarthritis can be induced.
[0571]
F. CG57279-02 and CG57279-04 and CG57279-05: complement decay promoting factors
The expression of gene CG57279-02, mutant CG57279-04 and full-length physical clone CG57279-05 was evaluated using the primer-probe set Ag4060 described in Table FA. The RTQ-PCR execution results are shown in Tables FB and FC.
[0572]
[Table 226]

[0573]
[Table 227]

[0574]
Continuation of Table FB
[Table 228]

[0575]
[Table 229]

[0576]
Continuation of Table FC
[Table 230]

[0577]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag 4060
The expression of CG57279-01 gene is very high in the lung cancer cell line (CT = 19.4). That is, the expression of this gene can be used to distinguish this sample from other samples on this panel and as a lung cancer marker. Expression is also significantly higher in the fetal lung and prostate cancer cell lines (CT = 20.8) when compared to expression in adult lung (CT = 25). That is, the expression of this gene can be used to distinguish between adult and fetal lung tissue. Since cell lines and fetal tissues are more proliferative than normal adult tissues, this expression profile suggests that this gene may be involved in cell proliferation. In addition, this gene has been shown to be overexpressed in human lung cancer and is thought to help cancers circumvent immune surveillance (Varsano S, Am J Respir Cell Mol Biol September 1988). 19 (3): 522-9), homologous to decay accelerating factors. Thus, modulation of the expression or function of this gene may be useful for the treatment of lung and prostate cancer.
[0578]
Among tissues with metabolic functions, this gene is expressed at high levels in the pituitary gland, fat, adrenal gland, pancreas, thyroid, fetal liver and adult and fetal skeletal muscle and heart. This widespread expression between these tissues indicates that the gene product can play a role in normal neuroendocrine and metabolic functions, and that the regulation of expression of the gene is disrupted, resulting in neuroendocrine or metabolic disease. Suggests that, for example, obesity and diabetes can be induced. Furthermore, this gene is expressed at a fairly high level in fetal liver tissue (CT = 25) when compared to expression in adult counterpart tissue (CT = 28.9). That is, the expression of this gene can be used to distinguish between fetal and adult sources of this tissue.
[0579]
This gene is also expressed at moderate to high levels in the CNS, including the hippocampus, thalamus, substantia nigra, tonsils, cerebellum and cerebral cortex. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0580]
Panel 4.1D Summary: Ag 4060
The CG57279-01 gene is ubiquitously expressed in this panel, with significantly higher expression levels seen in TNF-alpha / IL-1beta stimulated neutrophils (CT = 23.6). That is, the expression of this gene can be used to distinguish this sample from other samples on this panel and as an activated neutrophil marker. This gene encodes a complement regulatory protein, a molecule homologous to decay accelerating factors. Human polymorphonuclear leukocytes (PMN) express proteins that protect them from damage by homologous complement. Upregulation of the CG57279-01 gene product in neutrophils treated with TNF-a and LPS may be an indicator of a defense mechanism in inflammatory tissue. Thus, therapeutic modulation of this gene product may be effective in the degradation of inflammation, the promotion of wound healing and the treatment of immune complex mediated diseases. Furthermore, based on the expression profile and homology of the gene product, therapeutic modulation of the gene and / or gene product can also act as an immunosuppressant for organ transplantation.
[0581]
G. CG94630-01: MHC class I antigen
The expression of the gene CG94630-01 was evaluated using the primer-probe set Ag3931 described in Table GA. The results of RTQ-PCR run are shown in Tables GB, GC, GD and GE.
[0582]
[Table 231]

[0583]
[Table 232]

[0584]
[Table 233]

[0585]
Continuation of Table GC
[Table 234]

[0586]
[Table 235]

[0587]
Continuation of Table GD
[Table 236]

[0588]
[Table 237]

[0589]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag3931
This panel confirms the expression of the CG94630-01 gene at a low level in the brain of an independent population. However, differential expression of this gene was not detected in this experiment between Alzheimer's autopsy brain and non-demented control autopsy brain. See panel 1.4 for a description of this gene.
[0590]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag3931
A very high expression of the CG94630-01 gene is detected in the breast cancer T47D cell line (CT = 22.7). In general, high expression of this gene is detected in clusters of breast, ovary, stomach, intestine, pancreas and CNS cancer cell lines. Thus, the expression of this gene can be used as a diagnostic marker for these cancers. Also, therapeutic modulation of the activity of this gene or its protein product may be beneficial in the treatment of these cancers through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies.
[0591]
Among tissues with metabolic or endocrine function, this gene is expressed at high to medium levels in the pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, pituitary, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene may prove useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0592]
Interestingly, the expression of this gene is expressed at higher levels in fetal lung and adult skeletal muscle (CT = 27) when compared to the corresponding adult or fetal tissue (CT = 31). That is, the expression of this gene can be used to distinguish between these fetal and adult tissues.
[0593]
In addition, this gene is expressed at high to medium levels in all areas of the central nervous system tested, including tonsils, hippocampus, substantia nigra, thalamus, cerebellum, cerebral cortex and spinal cord. Thus, this gene may play a role in central nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, multiple sclerosis, schizophrenia and depression.
[0594]
Panel 4.1D Summary: Ag3931
A very high expression of the CG94630-01 gene is detected in resting LAK cells (CT = 25). This gene is expressed at high to medium levels in a wide range of cell types that are important in immune responses in healthy conditions and diseases. These cells include T cells, B cells, endothelial cells, macrophages / monocytes, and peripheral blood mononuclear cell families, as well as epithelial and fibroblast types from the lung and skin, and by the intestine, lung, thymus and kidney Includes members of the normal organization represented. This ubiquitous expression pattern suggests that this gene product can engage in homeostasis processes for these and other cell types and tissues. This pattern is consistent with the expression profile in the general screening panel v1.4 and suggests a role for gene products in cell survival and proliferation. Thus, modulation of gene products by functional therapeutics induces functional alterations associated with these cell types and results in autoimmune and inflammatory diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, psoriasis, rheumatoid arthritis And improvement of symptoms in patients suffering from osteoarthritis can be induced.
[0595]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag3931
This gene is expressed at moderate levels in most of the tissues in this panel, with the highest level found in kidney cancer samples (Ct = 26.48). This gene is expressed at higher levels in intestine, lung and kidney cancer compared to normal adjacent tissues. The expression of this gene can be used to distinguish tumors from normal tissues. Furthermore, therapeutic modulation of this gene may be beneficial for the treatment of kidney, lung or intestinal cancer through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies.
[0596]
H. CG94831-01 and CG94883-02: Tetraspan
Primer-probe set Ag3957, described in Table HA, was used to evaluate the expression of gene CG94883-01 and full-length physical clone CG94883-02. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables HB and HC. CG94831-02 represents a full-length physical clone of the CG94883-01 gene, confirming the prediction of the gene sequence.
[0597]
[Table 238]

[0598]
[Table 239]

[0599]
Continuation of Table HB
[Table 240]

[0600]
[Table 241]

[0601]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag3957
Very high expression of the CG94883-01 gene is found in the ovarian cancer cell line (CT = 27.2). Medium levels of expression are also found in intestinal cancer cell lines. That is, the expression of this gene can be used to distinguish these samples from other samples on this panel and as a marker for intestinal and ovarian cancer. This gene encodes a molecule that is homologous to tetraspanin, which probably plays an important role in membrane biology and many diverse processes including cell activation and proliferation, adhesion and motility, differentiation, and cancer It seems to get involved in. Members of the tetraspanin family are involved in tumor angiogenesis (Longo N, Blood December 15, 2001, 98 (13): 3717-26) and may be upregulated in some cancers (Kanetaka K, J Hepatol November 2001, 35 (5): 637-42). That is, based on the expression of this gene and its homology with tetraspanin, modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of ovarian and intestinal cancer.
[0602]
Among tissues with metabolic functions, this gene is expressed at moderate to low levels in the pituitary gland, fat, pancreas, thyroid, fetal liver and adult and fetal skeletal muscle and heart. This widespread expression between these tissues indicates that the gene product can play a role in normal neuroendocrine and metabolic function, and that the regulation of expression of the gene is disrupted, resulting in neuroendocrine or metabolic disease. For example, suggesting that obesity and diabetes can be induced.
[0603]
This gene is also expressed at moderate to low levels in the CNS, including the hippocampus, thalamus, substantia nigra, tonsils, cerebellum and cerebral cortex. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0604]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag3957
The expression of this gene appears to be very high in normal intestinal samples (CT = 28.17). Furthermore, expression in lung, bladder and prostate cancer samples appears to be substantially increased compared to normal adjacent tissue and melanoma samples. That is, the expression of this gene can be used to distinguish between normal cells and tumors in these tissues. Furthermore, therapeutic modulation of this gene may be beneficial in the treatment of these cancers through the use of small molecule drugs or antibodies.
[0605]
I. CG94892-01: Cub domain-containing membrane protein
The expression of the gene CG94892-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4061 described in Table IA. The results of RTQ-PCR runs are shown in Tables IB and IC.
[0606]
[Table 242]

[0607]
[Table 243]

[0608]
Continuation of Table IB
[Table 244]

[0609]
[Table 245]

[0610]
Continuation of Table IC
[Table 246]

[0611]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4061
A very high expression of the CG94892-01 gene is found in the melanoma cell line (CT = 25.2). That is, the expression of this gene can be used to distinguish this sample from other samples on this panel and as a melanoma marker. Medium levels of expression are also found in cell lines derived from kidney, ovary, prostate and lung cancer. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful for the treatment of kidney cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer and melanoma.
[0612]
This gene is also expressed at moderate to low levels in the CNS, including the hippocampus, thalamus, substantia nigra, tonsils, cerebellum and cerebral cortex. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0613]
Panel 4.1D Summary: Ag4061
A very high expression of the CG94892-01 gene is found in the kidney (CT = 31.6). Low but significant levels of expression are also detected in activated and untreated dermal fibroblasts and keratinocytes, CD40L / IL-4 activated B lymphocytes and normal thymus. That is, the expression of this gene can be used to distinguish the kidney from other samples on this panel and as a marker for kidney tissue. Furthermore, the marked expression of this gene in this organ suggests that this gene product may be involved in the normal homeostasis of the kidney. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this protein may be useful to maintain or restore function to this organ during inflammation due to lupus, glomerulonephritis and other diseases.
[0614]
J. et al. CG95227-01: Collagen alpha 2 (VIII) chain
The expression of the gene CG95227-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4062 described in Table JA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables JB, JC and ID.
[0615]
[Table 247]

[0616]
[Table 248]

[0617]
[Table 249]

[0618]
Continuation of Table JC
[Table 250]

[0619]
[Table 251]

[0620]
Continuation of Table JD
[Table 252]

[0621]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag4062
This panel confirms the expression of the CG95227-01 gene at a low level in the brain of an independent population. However, differential expression of this gene was not detected in this experiment between Alzheimer's autopsy brain and non-demented control autopsy brain. See panel 1.4 for a description of this gene.
[0622]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4062
A very high expression of the CG95227-01 gene is detected in the melanoma cell line (CT = 24.5). Medium to high expression of this gene is found in melanoma, squamous cell carcinoma, breast, ovary, lung, kidney, intestine and CNS cancer cell lines. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene or its protein product may be beneficial in the treatment of these cancers through the use of small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies.
[0623]
In tissues with metabolic or endocrine function, this gene is expressed at high to medium levels in the pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, pituitary, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene may prove useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0624]
In addition, this gene is expressed at high levels in all areas of the central nervous system tested, including tonsils, hippocampus, substantia nigra, thalamus, cerebellum, cerebral cortex and spinal cord. Thus, this gene may play a role in central nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, multiple sclerosis, schizophrenia and depression.
[0625]
Panel 4.1D Summary: Ag4062
A very high expression of the CG95227-01 gene is detected in resting macrophages (CT = 27.3). Interestingly, the expression of this gene is down-regulated in LPS-treated macrophages (CT = 30.3) and cytokine-treated LAK cells (CT> 37) compared to resting cells (CT = 27-30). In addition, medium to low expression of this gene is expressed by activated CD45RA CD4 lymphocytes, PMA / ionomycin-treated LAK cells, two-way MLR, dendritic cells, HPAEC, lung and skin fibroblasts and intestine, lung, thymus and kidney. Detected in normal tissue represented. Thus, modulation of gene products by functional therapeutics induces functional alterations associated with these cell types and results in autoimmune and inflammatory diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, psoriasis, rheumatoid arthritis And improvement of symptoms in patients suffering from osteoarthritis can be induced.
[0626]
K. CG96384-01 and CG96384-02: novel plasma membrane proteins
Primer-probe sets Ag4093 and Ag4092 described in Tables KA and KB were used to evaluate the expression of gene CG96384-01 and full-length physical clone CG96384-02. The results of RTQ-PCR runs are shown in Tables KC, KD and KE. CG96384-02 represents a full-length physical clone of the CG96384-01 gene, confirming the prediction of the gene sequence.
[0627]
[Table 253]

[0628]
[Table 254]

[0629]
[Table 255]

[0630]
[Table 256]

[0631]
Continuation of Table KD
[Table 257]

[0632]
[Table 258]

[0633]
Continuation of Table KE
[Table 259]

[0634]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag4093
This panel does not show differential expression of the CG96384-01 gene in Alzheimer's disease. However, this expression profile confirms the presence of this gene in the brain and very high expression is seen in the parietal cortex of control patients (CT = 32.3). See panel 1.4 for a description of this gene.
[0635]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4092
The CG96384-01 gene is widely expressed in this panel, with very high expression seen in the kidney (CT = 29.4).
[0636]
Among tissues with metabolic functions, this gene is expressed at moderate to low levels in the pituitary gland, fat, adrenal gland, pancreas, thyroid, fetal liver and adult and fetal skeletal muscle and heart. This widespread expression between these tissues indicates that the gene product can play a role in normal neuroendocrine and metabolic function, and that the regulation of the expression of this gene is disrupted, resulting in neuroendocrine or metabolic disease. Suggests that, for example, obesity and diabetes can be induced.
[0637]
This gene is also expressed at moderate to low levels in the CNS, including the hippocampus, thalamus, substantia nigra, tonsils, cerebellum and cerebral cortex. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0638]
The expression of this gene appears to be higher in clusters of brain cancer cell lines than in normal brain tissue. That is, therapeutic modulation of the expression or function of this protein may be effective in the treatment of brain cancer.
[0639]
Panel 4.1D Summary: Ag4092
The CG96384-01 gene is extensively expressed in this panel and very high expression is detected in primary activated Th2 cells (CT = 32.7). This gene is also expressed at high to medium levels in a wide range of cell types that are important in immune responses in healthy conditions and diseases. These cells include T cells, B cells, endothelial cells, monocytes, and peripheral blood mononuclear cell families, as well as members of normal tissues represented by dermal fibroblasts and thymus and kidney. This expression pattern suggests that this gene product can participate in the homeostasis process for these and other cell types and tissues. This pattern is consistent with the expression profile in the general screening panel v1.4 and suggests a role for gene products in cell survival and proliferation. Thus, modulation of gene products by functional therapeutics induces functional alterations associated with these cell types and results in autoimmune and inflammatory diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, psoriasis, rheumatoid arthritis And improvement of symptoms in patients suffering from osteoarthritis can be induced.
[0640]
L. CG96432-01: sodium / proton exchanger
The expression of the gene CG96432-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4056 described in Table LA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Table LB.
[0641]
[Table 260]

[0642]
[Table 261]

[0643]
Continuation of Table LB
[Table 262]

[0644]
Panel 4.1D Summary: Ag4056
Expression of the CG96432-01 gene is limited to resting monocytes and LPS-treated macrophages (CT = 34.2-34.8). The function of these cells is dependent on the activity of sodium / proton exchangers that maintain their required cytoplasmic pH while in the acidic microenvironment created by abscesses and tumors (Grinstein S, Clin Biochem 1991). June, 24 (3): 241-7). This specific expression pattern suggests that therapeutic modulation of the activity or function of this protein may be effective in the treatment of autoimmune diseases and cancer.
[0645]
M.M. CG97101-01: Related benzodiazepine receptors
The expression of the gene CG97101-01 was evaluated using the primer-probe sets Ag4344 and Ag4343 described in Tables MA and MB. The results of RTQ-PCR execution are shown in Table MC.
[0646]
[Table 263]

[0647]
[Table 264]

[0648]
[Table 265]

[0649]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag4344
This panel confirms the expression of the CG97101-01 gene at a low level in the brain of an independent population. The expression of this gene is higher in the temporal cortex of Alzheimer's disease brain than in the normal control (statistical confidence level> 0.06). The CG97101-01 gene encodes a protein similar to the benzodiazepine receptor related protein. Benzodiazepines regulate signaling at type A GABA (gamma-aminobutyric acid) receptors located at brain synapses. Assuming a known loss of GABA in the temporal cortex of Alzheimer's disease patients (Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol February 2001, 363 (2): 139-45), alterations in CG97101-01 gene expression are compensatory obtain. Thus, pharmaceutical CG97101-01 modulation may have therapeutic value in the treatment of Alzheimer's disease.
[0650]
N. CG97168-01: ATP-binding cassette transporter A-like
The expression of the gene CG97168-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4094 described in Table NA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Table NB.
[0651]
[Table 266]

[0652]
[Table 267]

[0653]
Continuation of Table NB
[Table 268]

[0654]
Panel 4.1D Summary: Ag4094
Expression of the CG97168-01 gene is seen exclusively in IL-4 treated dermal fibroblasts (CT = 32). Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this sample from other samples in this panel. Thus, therapeutic modulation of this gene may be beneficial in the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis, atopic dermatitis, ulcerative dermatitis, ulcerative colitis.
[0655]
The CG97168-01 gene encodes an ATP binding cassette (ABC) transporter. ABC transporter genes are ubiquitous in most organisms from bacteria to humans. They are “traffic adenosine triphosphatases” that induce the transport of molecules by hydrolyzing ATP and transporting a wide array of molecules or stimulating other transport mechanisms. Many ABC transporters are associated with human inherited or sporadic diseases such as cystic fibrosis, adrenal brain white matter dystrophy, Stargardt disease, drug resistant tumors, Dubin-Johnson syndrome, Bayer's disease, progressive familial intrahepatic cholestasis, Involved in X-linked ironblastic anemia and ataxia, persistent hyperinsulimenic hypoglycemia in infants, etc. (Efferth T., 2001, Curr Mol Med 1 (1): 45-65, PMID : 11899242).
[0656]
Fibroblasts constitute an important source of cytokines during the inflammatory process in the skin. Interleukin-1 is a potent pleiotropic cytokine induced in activated human skin fibroblasts. Furthermore, interleukin-1 induces a number of inflammatory mediators, including the chemokine interleukin-8. Interleukin-1 alpha and interleukin-1 beta are transported across the plasma membrane using a second secretory pathway that lacks a signal peptide and contains an ABC transporter protein. The ABC transporter inhibitor glibenclamide has recently been demonstrated to block externalization of interleukin-1 and subsequent autocrine induction of interleukin-8 in human dermal fibroblasts (Lottaz et al., 2001, J Invest Dermatol 117 (4): 871-6, PMID: 11676825). That is, antibodies and small molecules that antagonize the function of the ABC transporter encoded by this gene can reduce or eliminate symptoms in patients with inflammatory diseases of the skin.
[0657]
O. CG97420-01 and CG97420-02: MAGE-domain containing proteins
The expression of gene CG97420-01 and full-length physical clone G97420-02 was evaluated using the primer-probe set Ag4126 described in Table OA. The results of RTQ-PCR run are shown in Tables OB, OC and OD. CG97420-02 represents a full-length physical clone of the CG97420-01 gene, confirming the prediction of the gene sequence.
[0658]
[Table 269]

[0659]
[Table 270]

[0660]
[Table 271]

[0661]
Continuation of Table OC
[Table 272]

[0662]
[Table 273]

[0663]
Continuation of table OD
[Table 274]

[0664]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag4126
This panel shows no differential expression of the CG974203-01 gene in Alzheimer's disease. However, this expression profile confirms the presence of this gene in the brain. See panel 1.4 for a description of this gene.
[0665]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4126
A very high level of expression of the CG974203-01 gene is found in lung cancer cell lines (CT = 31.3). High levels of expression are also seen in all cell lines on this panel when compared to expression in normal tissue samples. This distribution is consistent with the identification of this protein as a putative MAGE domain protein. Members of the MAGE family melanoma antigen-encoding gene have been reported to be expressed in a wide variety of tumors (Kirkin, Cancer Invest 2002, 20 (2): 222-36). That is, the expression of this gene can be used as a marker for cancer. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this protein may be useful in the treatment of cancer.
[0666]
Among tissues with metabolic functions, this gene is expressed at low but significant levels in the pituitary gland, adrenal gland, pancreas, thyroid, fetal liver and adult and fetal skeletal muscle and heart. This widespread expression between these tissues indicates that the gene product can play a role in normal neuroendocrine and metabolic function, and that the regulation of expression of this gene is disrupted, resulting in neuroendocrine or metabolic disease. For example, suggesting that obesity and diabetes can be induced.
[0667]
Panel 4.1D Summary: Ag4126
A very high expression of the CG974203-03-01 gene is detected in chronically activated Th2 cells (CT = 30.6). In addition, this gene is also expressed at moderate to low levels in a wide range of cell types that are important in immune responses in healthy conditions and diseases. These cells include T cells, B cells, endothelial cells, macrophages / monocytes, and peripheral blood mononuclear cell families, as well as epithelial and fibroblast types from the lung and skin, and by the intestine, lung, thymus and kidney The members of the representative normal tissue are included. This ubiquitous expression pattern suggests that this gene product can engage in homeostasis processes for these and other cell types and tissues. This pattern is consistent with the expression profile in the general screening panel v1.4 and suggests a role for gene products in cell survival and proliferation. In addition, members of the MAGE family may be involved in autoimmune diseases (McCurdy DK, Mol Genet Metab January 1998, 63 (1): 3-13). Thus, modulation of gene products by functional therapeutics induces functional alterations associated with these cell types and results in autoimmune and inflammatory diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, psoriasis, rheumatoid arthritis And improvement of symptoms in patients suffering from osteoarthritis can be induced.
[0668]
P. CG97430-01: Collagen and scavenger receptor domain
The expression of the gene CG97430-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4108 described in Table PA. The results of the RTQ-PCR run are shown in Tables PB and PC.
[0669]
[Table 275]

[0670]
[Table 276]

[0671]
Continuation of Table PB
[Table 277]

[0672]
[Table 278]

[0673]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4108
A very high expression of the CG97430-01 gene is detected in the lung cancer cell line NCI-H460 (CT = 27.7). Furthermore, high expression of this gene is also found in breast cancer, melanoma, prostate cancer, two lung cancer and CNS cancer cell lines. Thus, expression of this gene can be used as a diagnostic marker for these cancers, and therapeutic modulation of this gene product can be useful in the treatment of these cancers through the use of small molecules or antibodies.
[0674]
In tissues with metabolic or endocrine function, this gene is expressed at high to medium levels in the pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene may prove useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0675]
The CG97430-01 gene encodes a scavenger receptor protein similar to bovine macrophage acetylated LDL receptors I and II. Recent studies using genetically engineered mouse strains have shown that SR-BI, a member of the scavenger receptor group, plays an important role in the regulation of HDL metabolism, cholesterol transport to steroid-synthesizing tissues, and biliary cholesterol secretion. It shows that it plays. Furthermore, SR-BI protects against the development of atherosclerosis and is required for normal female fertility (Trigatti B and Rigotti A., 2000, Int J Tissue React 22 (2-3) : 29-37, PMID: 10937352). Thus, when correlated with this study, the scavenger receptor protein encoded by this gene may play a role in HDL metabolism, ie a novel for the prevention and / or treatment of atherosclerotic cardiovascular disease Can represent a target.
[0676]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag4108
The CG97430-01 gene is expressed at low levels in the samples in this panel, with very high expression seen in normal intestinal samples (CT = 32.19). It is also expressed in melanoma samples and a single sample of kidney cancer on this panel (CT = 32-33). That is, the expression of this gene can be used as a diagnostic marker for melanoma cells and to distinguish between normal intestine or kidney and intestine or kidney cancer. The therapeutic modulation of this gene by using small molecule drugs, protein therapeutics or antibodies may be beneficial for the treatment of melanoma, kidney or intestinal cancer.
[0677]
Q. CG97440-01: Contains CUB domain
The expression of the gene CG97440-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4109 described in Table QA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables QB and QC.
[0678]
[Table 279]

[0679]
[Table 280]

[0680]
Continuation of Table QB
[Table 281]

[0681]
[Table 282]

[0682]
Continuation of Table QC
[Table 283]

[0683]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4109
A very high expression of the CG97440-01 gene is found in the brain cancer cell line (CT = 25.9). High levels of expression are also found in many of the cell lines in this panel, including samples from the intestine, stomach, lung, liver, breast, ovarian cancer and melanoma. That is, the expression of this gene can be used as a cancer marker. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene or its protein product may be useful in the treatment of cancer.
[0684]
Among tissues with metabolic functions, this gene is expressed at moderate to low levels in the pituitary gland, fat, adrenal gland, pancreas, thyroid, and adult and fetal skeletal muscle, heart, and liver. This widespread expression between these tissues indicates that the gene product can play a role in normal neuroendocrine and metabolic function, and that the regulation of the expression of this gene is disrupted, resulting in neuroendocrine or metabolic disease. Suggests that, for example, obesity and diabetes can be induced.
[0685]
This gene is also expressed at moderate to low levels in the CNS, including the hippocampus, thalamus, substantia nigra, tonsils, cerebellum and cerebral cortex. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0686]
Panel 4.1D Summary: Ag4109
A very high expression of the CG97440-01 gene is found in untreated lung microvascular endothelial cells (CT = 29.1). Furthermore, a significant level of expression is seen in clusters of treated and untreated samples derived from lung and skin-derived endothelium and fibroblasts. That is, therapeutic modulation of the expression or function of this gene product may reduce or eliminate symptoms in patients suffering from lung and skin inflammation and pathological conditions, including asthma, emphysema, allergies and psoriasis.
[0687]
R. CG97451-01: Glycine-rich membrane protein
The expression of the gene CG97451-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4110 described in Table RA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables RB and RC.
[0688]
[Table 284]

[0689]
[Table 285]

[0690]
Continuation of Table RB
[Table 286]

[0691]
[Table 287]

[0692]
Continuation of Table RC
[Table 288]

[0693]
General Screening Panel 1.4 Summary: Ag4110
Expression of the CG97451-01 gene is restricted to samples derived from brain cancer cell lines (CT = 31.1). That is, the expression of this gene can be used to distinguish between this sample and other samples on this panel and as a marker for detecting the presence of brain cancer. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be effective in the treatment of brain cancer.
[0694]
Panel 4.1D Summary: Ag4110
The CG97451-01 gene is only expressed at detectable levels in the kidney (CT = 32.5). That is, the expression of this gene can be used to distinguish between this sample and other samples on this panel and as a kidney tissue marker. Furthermore, therapeutic modulation of this gene or gene product regulates kidney function and may be important in the treatment of inflammatory or autoimmune diseases that affect the kidney, including lupus and glomerulonephritis.
[0695]
S. CG97852-01: Galectin-9 like 1
The expression of the gene CG97852-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4183 described in Table SA. The results of the RTQ-PCR run are shown in Tables SB, SC, SD and SE.
[0696]
Table 289

[0697]
[Table 290]

[0698]
Continuation of Table SB
[Table 291]

[0699]
[Table 292]

[0700]
[Table 293]

[0701]
Continuation of Table SD
[Table 294]

[0702]
[Table 295]

[0703]
Continuation of table SE
[Table 296]

[0704]
AI Comprehensive Panel v1.0 Summary: Ag4183
A very high expression of the CG97852-01 gene is seen in samples derived from patients with ulcerative colitis (CT = 31.3). Low but significant levels of expression are also seen in samples derived from patients with emphysema, Crohn's disease and rheumatoid arthritis. That is, the expression of this gene can be used as a marker for ulcerative colitis. This gene encodes a protein that is homologous to galectin-9. Galectins are carbohydrate binding proteins that can play a role in the immune response. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene or gene product may reduce or eliminate symptoms in patients suffering from emphysema, Crohn's disease, rheumatoid arthritis and ulcerative colitis. .
[0705]
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag4126
This panel does not show differential expression of the CG97852-01 gene in Alzheimer's disease. However, this expression profile demonstrates the expression of this gene at low but significant levels in the brain. This gene encodes a putative galectin. Members of the lectin family have been shown to function in cell adhesion and cell recognition mechanisms and cell signaling in the brain, including axon growth, nerve migration, synaptogenesis and myelination. The glial galectin isoform, galectin 3, is involved in the stabilization of cell matrix interactions and newly formed axons (Mahoney, SA. Neuroscience 2000, 101 (1): 141-55). The expression of this galectin homologue in the brain suggests that it may also contribute to neural function. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be useful in the treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, schizophrenia, multiple sclerosis, stroke and epilepsy.
[0706]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4183
The CG97852-01 gene, a galectin homologue, is very highly expressed in intestinal cancer cell lines (CT = 28.5). Furthermore, cancer cell lines from pancreatic, stomach, breast and ovarian cancers show significant expression of this gene. Galectin-9 expression is associated with intestinal cancer cell lines (Lahm H. J Cancer Res Clin Oncol 2001, 127 (6): 375-86). That is, the expression of this gene can be used as a marker for intestine, pancreas, stomach, breast and ovarian cancer. Members of the galectin family are involved in cell growth regulation and adhesion monitoring. Thus, therapeutic modulation of the expression or function of this protein may be effective in the treatment of cancer.
[0707]
Panel 4.1D Summary: Ag4183
Two experiments with the same probes and primers yielded very consistent results, with very high expression of the CG97852-01 gene detected in resting NK cells (CT = 29). This marked expression in these cells suggests that this gene may be involved in the immunoregulatory function of these cells and the prevention of autoimmune diseases. Therapeutic modulation of expression or function of this gene may be useful in the treatment of multiple sclerosis, lupus and other diseases associated with NK cell function (Baxter AG, Autoimmuity February 2002, 35 (1): 1-14). Furthermore, the regulation of this gene product may be useful in reducing the NK-mediated response seen in response to xenotransplantation.
[0708]
Medium to constant levels of expression are also seen in other samples in this panel, treated and untreated NCI-H292 cells, LAK cells, chronically activated Th2 cells, THF-alpha and IL-1beta activated small airways and Includes bronchial epithelium and normal kidney, thymus and intestinal clusters. That is, the gene product may be involved in inflammatory processes involving these cell types, including pulmonary inflammatory diseases such as Th2 cell mediated asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Thus, therapeutic agents designed for the protein encoded by this gene may be useful for the treatment of pulmonary inflammatory diseases.
[0709]
This gene encodes a protein with homology to galectin 9, a strong eosinophil chemoattractant. Thus, regulation of this gene product may be useful for the treatment of asthma.
[0710]
T.A. CG99575-01 and CG99575-02: T cell surface glycoprotein CD1
Primer-probe sets Ag4176 and Ag4804 described in Tables TA and TB were used to evaluate the expression of full-length physical clones CG99575-01 and mutant CG99575-02. The results of RTQ-PCR execution are shown in Table TC. Probe and primer set Ag4804 shall correspond only to mutant CG99575-02.
[0711]
[Table 297]

[0712]
[Table 298]

[0713]
[Table 299]

[0714]
Continuation of Table TC
[Table 300]

[0715]
Continuation of Table TC
[Table 301]

[0716]
Panel 4.1D Summary: Ag4176
Two experiments with the same probe and primer yielded very consistent results, with very high expression of the CG99575-01 gene detected in anti-CD40 treated dendritic cells (CT = 28-32). Medium to low expression of this gene is associated with activated primary and secondary Th1 cells, CD4 lymphocytes, LAK cells, resting PBMC cells, eosinophils, dendritic cells, ILII-treated HUVEC cells, resting monocytes, thymus, intestine, Found in the lungs and kidneys. Therefore, therapeutic modulation of this gene is associated with autoimmune and inflammatory diseases associated with these cell types such as lupus erythematosus, asthma, emphysema, Crohn's disease, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis and psoriasis May be beneficial in treatment. Ag4804: This experiment with different probe and primer sets is in complete agreement with the above results. This probe and primer set shall be unique to the CG99575-02 gene.
[0717]
U. CG99608-1: Sugar transporter
The expression of the gene CG99608-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4150 described in Table UA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Tables UB, UC, UD and UE.
[0718]
[Table 302]

[0719]
Table 303

[0720]
[Table 304]

[0721]
Continuation of Table UC
[Table 305]

[0722]
[Table 306]

[0723]
Continuation of Table UD
[Table 307]

[0724]
[Table 308]

[0725]
Ag4150
CNS neurodegeneration v1.0 Summary: Ag3931
This panel confirms the expression of the CG99608-01 gene at a low level in the brain of an independent population. This gene was found to be slightly up-regulated in the temporal cortex of Alzheimer's disease patients. This receptor blockade is useful in the treatment of this disease and can reduce neuronal cell death.
[0726]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4150
A very high expression of the CG99608-01 gene is detected in the intestinal cancer CaCo-2 cell line (CT = 24.5). This gene is detected at significant levels in clusters of melanoma, ovary, breast, prostate, squamous cell carcinoma, lung, kidney, intestine, CNS and pancreatic cancer cell lines. That is, therapeutic modulation of this gene through small molecules or antibodies may be useful in the treatment of these cancers.
[0727]
In tissues with metabolic or endocrine function, this gene is expressed at high to medium levels in the pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, pituitary, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene may prove useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0728]
In addition, this gene is expressed at high levels in all areas of the central nervous system tested, including tonsils, hippocampus, substantia nigra, thalamus, cerebellum, cerebral cortex and spinal cord. Thus, this gene may play a role in central nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, multiple sclerosis, schizophrenia and depression.
[0729]
Panel 4.1D Summary: Ag4150
A very high expression of the CG99608-01 gene is detected in IL-9 treated NCI-H292 cells (CT = 28). This gene is expressed at high to medium levels in a wide range of cell types that are important in immune responses in healthy conditions and diseases. These cells include T cells, B cells, endothelial cells, macrophages / monocytes, and peripheral blood mononuclear cell families, as well as epithelial and fibroblast types from the lung and skin, and by the intestine, lung, thymus and kidney Includes members of the normal organization represented. This ubiquitous expression pattern suggests that this gene product can engage in homeostasis processes for these and other cell types and tissues. This pattern is consistent with the expression profile in the general screening panel v1.4 and suggests a role for gene products in cell survival and proliferation. Interestingly, the expression of this gene is stimulated in activated primary and secondary Th1, Th2 and Tr1 cells. Thus, modulation of gene products by functional therapeutics induces functional alterations associated with these cell types and results in autoimmune and inflammatory diseases such as asthma, allergies, inflammatory bowel disease, lupus erythematosus, psoriasis, rheumatoid arthritis And improvement of symptoms in patients suffering from osteoarthritis can be induced.
[0730]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag4150
A very high expression of the CG99608-01 gene is detected in kidney cancer samples (CT = 28), with significant expression also seen in melanoma, lung, squamous cell carcinoma, bladder, prostate and intestinal cancer. Furthermore, the expression of this gene is higher in cancer than in normal adjacent tissues. Thus, the expression of this gene can be a marker for detecting the presence of these cancers. Furthermore, therapeutic modulation of the expression or function of this gene may be effective in the treatment of these cancers.
[0731]
V. CG99732-02: Macrophage lectin 2
The expression of the full-length physical clone CG99732-02 was evaluated using the primer-probe set Ag4198 described in Table VA. The results of RTQ-PCR runs are shown in Tables VB and VC.
[0732]
[Table 309]

[0733]
[Table 310]

[0734]
Continuation of Table VB
[Table 311]

[0735]
[Table 312]

[0736]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4198
A very high expression of the CG99732-02 gene is detected in the intestinal pool (CT = 31). In addition, significant expression of this gene is found in tissues with metabolic or endocrine functions, including pancreas, fat, adrenal gland, thyroid, pituitary, skeletal muscle, heart, liver and gastrointestinal tract. Thus, therapeutic modulation of the activity of this gene proves useful in the treatment of endocrine / metabolism related diseases such as obesity and diabetes.
[0737]
Interestingly, moderate expression of this gene is also detected in intestinal cancer tissue (CT = 32). Thus, therapeutic modulation of this gene may be useful for the treatment of intestinal cancer.
[0738]
General Oncology Screening Panel v2.4 Summary: Ag4198
A very high expression of the CG99732-02 gene is detected in metastatic melanoma samples (CT = 31.4). Moreover, low to moderate expression of this gene is also found in all cancer samples including intestine, lung, prostate and kidney. Thus, therapeutic modulation of this gene product may be useful in the treatment of these cancers.
[0739]
W. CG99767-01: type I membrane protein
The expression of the gene CG99767-01 was evaluated using the primer-probe set Ag4248 described in Table WA. The results of RTQ-PCR execution are shown in Table WB.
[0740]
[Table 313]

[0741]
[Table 314]

[0741]
Continuation of Table WB
[Table 315]

[0743]
General Screening Panel v1.4 Summary: Ag4248
The expression of the CG99767-01 gene is exclusively detected in skeletal muscle samples (CT = 33.5). Thus, the expression of this gene can be used to distinguish this sample from other samples in this panel. Furthermore, therapeutic modulation of this gene through small molecule targets or antibodies can be beneficial in the treatment of musculoskeletal diseases and / or disorders.
[0744]
Example D: Identification of a single nucleotide polymorphism in a NOVX nucleic acid sequence
Variant sequences are also included in this application. Variant sequences can include single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNP is referred to in some examples as “cSNP” and refers to the nucleotide sequence containing the SNP originated as cDNA. SNPs can occur in several ways. For example, the SNP can be for replacement of one nucleotide of a polymorphic site with another. Such substitutions can be transitions or transversions. SNPs can also result from the deletion or insertion of nucleotides from the reference allele. In this case, the polymorphic site is a site where one allele has a gap for a particular nucleotide of another allele. A SNP present in the absence of a gene can result in a change in the amino acid encoded by the gene at the position of the SNP. Intragenic SNPs can also be silent, with codons containing SNPs encoding the same amino acid as a result of the degeneracy of the genetic code. SNPs present outside the gene region or in introns within the gene do not change any amino acid sequence of the protein, but the regulation of the expression pattern can be altered. Examples include transient expression, physiological response regulation, cell type expression regulation, intensity of expression, and transcriptional messenger stability.
[0745]
The SeqCalling assembly produced by the exon linking process was selected and stretched using the following criteria. Genomic clones with regions with 98% identity to all or part of the original or extended sequences were identified by BLASTN search using related sequences to the query human genome database. The resulting genomic clones were selected for further analysis, since this identity points out that these clones contain the genomic locus for the SeqCallng assembly. These sequences were analyzed for putative coding regions and for similarity to known DNA and protein sequences. Programs used for these analyzes include Grail, Genscan, BLAST, HMMER, FASTA, Hybrid, and other related programs.
[0746]
Some additional genomic regions were also identified because we selected SeqCalling assembly maps to those regions. Such SeqCalling sequences overlapped with regions defined by homology or exon prediction. These can also be included because the position of the fragment was in the vicinity of the genomic region identified by similarity or exon prediction originally included in the predicted sequence. The sequences so identified could be assembled manually and then extended using one or more additional sequences taken from the CuraGen Corporation human SeqCalling database. SeqCalling fragments suitable for inclusion were identified by the CuraTools® program SeqExtend or by identifying SeqCalling fragment mapping to the appropriate regions of the analyzed genomic clone.
[0747]
The regions defined by the above technique are then manually integrated and for obvious discrepancies that can arise, for example, from miscored bases in the original fragment or from discrepancies between regions of predicted exon binding, EST position and sequence similarity Corrected and derived the final sequence disclosed herein. When necessary, the process for identifying and analyzing SwqCalling assemblies and genomic clones was repeated to derive full-length sequences (Alderborn et al., Determination of Single nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing.Genome Research. 10 (8) 1249-1265, 2000).
[0748]
Variants are reported individually, but any combination of all or a selected subset of variants is also encompassed as a contemplated NOVX embodiment of the invention.
[0749]
NOV1 SNP data
Two polymorphic variants of NOV1 were identified and shown in Table 28A.
[Table 316]

[0750]
One polymorphic variant of NOV1 was identified and shown in Table 28B.
[Table 317]

[0751]
NOV3 SNP data
Two polymorphic variants of NOV3 were identified and shown in Table 28C.
[Table 318]

[0752]
NOV4 SNP data
Two polymorphic variants of NOV4 were identified and shown in Table 28D.
[Table 319]

[0753]
NOV6 SNP data
Six polymorphic variants of NOV6 were identified and shown in Table 28E.
[Table 320]

[0754]
NOV7 SNP data
Two polymorphic variants of NOV7 were identified and shown in Table 28F.
[Table 321]

[0755]
NOV8 SNP data
Three polymorphic variants of NOV8 were identified and shown in Table 28G.
[Table 322]

[0756]
NOV10 SNP data
One polymorphic variant of NOV10 was identified and shown in Table 28H.
[Table 323]

[0757]
NOV11 SNP data
Four polymorphic variants of NOV11 were identified and shown in Table 28I.
[Table 324]

[0758]
NOV12 SNP data
Five polymorphic variants of NOV12 were identified and shown in Table 28J.
[Table 325]

[0759]
NOV15 SNP data
Two polymorphic variants of NOV15 were identified and shown in Table 28K.
[Table 326]

[0760]
NOV19 SNP data
Ten polymorphic variants of NOV19 were identified and shown in Table 28L.
[Table 327]

[0761]
NOV23 SNP data
One polymorphic variant of NOV23 was identified and shown in Table 28M.
[Table 328]

[0762]
NOV25 SNP data
One polymorphic variant of NOV25 was identified and shown in Table 28N.
[Table 329]

[0763]
NOV26 SNP data
Nine polymorphic variants of NOV26 were identified and shown in Table 28O.
[Table 330]

[0764]
NOV27 SNP data
One polymorphic variant of NOV27 was identified and shown in Table 28P.
[Table 331]

[0765]
(Other embodiments)
Although particular embodiments are disclosed herein in detail, this is done for illustrative purposes only and is not intended to limit the scope of the appended claims. In particular, it is contemplated by the inventor that various substitutions, changes and modifications may be made to the invention without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the claims. The selection of nucleic acid starting material, desired clone, or library type is believed to be a routine matter of ordinary skill in the art having knowledge of the embodiments described herein. The claims presented are representative of the invention disclosed herein. In addition, non-claimed inventions are also contemplated. Applicant retains the right to pursue such inventions in the following claims.

Claims (50)

An isolated polypeptide comprising a mature form of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 95% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). An isolated polypeptide, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence comprising one or more conservative substitutions in an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). 2. The polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is naturally occurring. A composition comprising the polypeptide of claim 1 and a carrier. A kit comprising the composition of claim 6 in one or more containers. Use of a therapeutic agent in the manufacture of a medicament for treating a syndrome associated with a human disease, wherein the disease is selected from the pathology associated with the polypeptide of claim 1, wherein the therapeutic agent is claimed. Use, comprising 1 polypeptide. A method for determining the presence or amount of a polypeptide of claim 1 in a sample, the method comprising:
(a) providing the sample;
(b) introducing the sample into an antibody that immunospecifically binds to the polypeptide; and
(c) measuring the presence or amount of an antibody bound to the polypeptide, thereby measuring the presence or amount of the polypeptide in the sample. A method for determining the presence or predisposition of a disease associated with an altered expression level of the polypeptide of claim 1 in a first mammalian subject comprising:
a) measuring the expression level of the polypeptide in the sample from the first mammalian subject; and b) not expressing the polypeptide in the sample of step (a) with the disease or predisposition The expression level of the polypeptide in the first subject when compared to the control sample, wherein the expression level is compared to the expression of the polypeptide in the control sample from a second mammalian subject A method that indicates the presence or predisposition of a disease. A method of identifying an agent that binds to the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) introducing the polypeptide into the agent, and (b) determining whether the agent binds to the polypeptide. 12. The method of claim 11, wherein the agent is a cellular receptor or a downstream effector. A method of identifying a potential therapeutic agent for use in the treatment of a pathology, wherein the pathology is associated with aberrant expression or abnormal physiological interaction of the polypeptide of claim 1, wherein the method comprises:
(A) providing a cell that expresses the polypeptide of claim 1 and has properties or functions attributable to the polypeptide;
(B) contacting the cell with a composition comprising a candidate substance, and (c) determining whether the substance alters a property or function to be attributed to the polypeptide, wherein the presence of the substance If the change observed below is not observed if cells are contacted with the composition in the absence of the agent, then the agent is identified as a potential therapeutic. A method of screening for modulators of pathological activity or potential or predisposition associated with the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) administering a test compound to a test animal at increased risk of pathology associated with the polypeptide of claim 1;
(B) measuring the activity of the polypeptide in the test animal after administering the compound of step (a), and (c) determining the activity of the polypeptide in the test animal not being administered the polypeptide Comparing the activity of the polypeptide in a control animal, wherein a change in the activity of the polypeptide in the test animal relative to the control animal is associated with the polypeptide of claim 1. A method indicating that it is a modulator of pathological activity or potential or predisposition. 15. The method of claim 14, wherein the test animal is a recombinant test animal that expresses the test protein transgene or expresses the transgene under increased levels of promoter control relative to a wild type test animal. And wherein the promoter is not the native gene promoter of the transgene. A method of modulating the activity of a polypeptide according to claim 1, wherein the method comprises a cell sample expressing the polypeptide of claim 1 in an amount sufficient to modulate the activity of the polypeptide. Contacting with a compound that binds to the polypeptide. A method of treating or preventing a pathology associated with the polypeptide of claim 1, wherein the method comprises subjecting the polypeptide of claim 1 to a subject for which such treatment or prevention is desired. Administering in an amount sufficient to treat or prevent the pathology of. The method of claim 17, wherein the subject is a human. A method of treating a pathological condition in a mammal comprising administering to said mammal an amount of a polypeptide sufficient to alleviate said pathological condition, wherein said polypeptide A polypeptide having an amino acid sequence, or a biologically active fragment thereof, at least 95% identical to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46) There is a way. An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). 21. The nucleic acid molecule of claim 20, wherein the nucleic acid molecule is naturally occurring. A nucleic acid molecule that differs from a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer of 1 to 46) by a single nucleotide. An isolated nucleic acid molecule encoding a mature form of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n (n is an integer from 1 to 46). An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46). The nucleic acid molecule hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2n-1 (n is an integer from 1 to 46), or a complement of the nucleotide sequence. The nucleic acid molecule according to 20. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 20. 27. The vector of claim 26, further comprising a promoter operably linked to the nucleic acid molecule. A cell comprising the vector of claim 26. An antibody that immunospecifically binds to the polypeptide of claim 1. 30. The antibody of claim 29, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 30. The antibody of claim 29, wherein the antibody is a humanized antibody. 30. The antibody of claim 29, wherein the antibody is a fully human antibody. 該解away constants binding to an antibody polypeptide, 1x10 ^-9 M less than the antibody of claim 29. 30. The antibody of claim 29, wherein the antibody neutralizes the activity of the polypeptide. 30. A method of treating or preventing a disorder associated with NOVX, said method comprising, in a subject in which such treatment or prevention is desired, an amount sufficient to treat or prevent the pathology of the subject. Administering the antibody. 36. The method of claim 35, wherein the subject is a human. A method for determining the presence or amount of a nucleic acid molecule of claim 20 in a sample comprising:
(A) providing the sample;
(B) introducing the sample into a probe that binds to the nucleic acid molecule; and (c) determining the presence or amount of the probe bound to the nucleic acid molecule;
Thereby determining the presence or amount of a nucleic acid molecule in the sample. 38. The method of claim 37, wherein the presence or amount of a nucleic acid molecule is used as a marker for a cell or cell type. 40. The method of claim 38, wherein the cell or cell type is cancerous. A method for determining the presence or predisposition of a disease associated with an altered level of expression of a nucleic acid molecule of claim 20 in a first mammalian subject comprising:
(A) measuring the level of expression of the nucleic acid in a sample from the first mammalian subject, and (b) determining the level of expression of the nucleic acid in the sample of step (a) to have no or predisposition to the disease Comparing to the level of expression of nucleic acid present in a subject sample from a second mammalian subject that is not known;
Wherein the change in the level of expression of the nucleic acid in the first subject as compared to the subject sample indicates the presence or predisposition of the disease. 2. A method for producing the polypeptide of claim 1, comprising culturing the cell under conditions that lead to expression of the polypeptide, wherein the cell is SEQ ID NO: 2n-1 (n is 1 46. A method comprising a vector comprising an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of: 42. The method of claim 41, wherein the cell is a bacterial cell. 42. The method of claim 41, wherein the cell is an insect cell. 42. The method of claim 41, wherein the cell is a yeast cell. 42. The method of claim 41, wherein the cell is a mammalian cell. A method for producing the polypeptide of claim 2, comprising culturing the cell under conditions that lead to expression of the polypeptide, wherein the cell comprises SEQ ID NO: 2n-1 (n is 46. A method comprising a vector comprising an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of: an integer from 1 to 46. 48. The method of claim 46, wherein the cell is a bacterial cell. 48. The method of claim 46, wherein the cell is an insect cell. 48. The method of claim 46, wherein the cell is a yeast cell. 48. The method of claim 46, wherein the cell is a mammalian cell.