JP2004508036A - 抗体および／またはケモカイン構築物および免疫障害におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染している細胞の除去のため医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用に関連する。さらに、本発明は、炎症性腎疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症、皮膚疾患、糖尿病または移植拒絶反応の処置、予防および／または緩和のための医薬組成物を調製するための、カモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用を提供する。さらに、本発明は、抗体構築物および／またはケモカイン構築物に関連し、ここで前記抗体構築物はケモカインレセプター５の結合部位およびＣＤ３への結合部位を含み、ここで前記ケモカイン構築物はＲＡＮＴＥＳおよびトキシンを含むものである。本発明は、また前記抗体またはケモカイン構築物をエンコードするポリヌクレオチド、並びに前記核酸分子を含むベクターおよび宿主を記載するものである。さらに、本発明は、前記抗体構築物、ケモカイン構築物、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主を含む組成物に関連する。好ましくは、前記組成物は医薬組成物である。医薬組成物の調製のための抗体構築物、ケモカイン構築物、ポリヌクレオチド、宿主および／またはベクターの使用、並びに、免疫障害を処置、予防および／または緩和する方法または、潜伏して感染している細胞を除去する方法も記載されており、ここで前記細胞はＨＩＶ−１のような霊長類の免疫不全ウイルスに感染したものである。さらに、本発明は、本発明の化合物を含むキットを提供する。

Description

【０００１】
本発明は、霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染している細胞の除去のための医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用に関連する。さらに、本発明は、炎症性腎疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症、皮膚疾患、糖尿病または移植拒絶反応の処置、予防および／または緩和のための医薬組成物を調製するための、カモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用を提供する。さらに、本発明は、抗体構築物および／またはケモカイン構築物に関連し、特にここで前記抗体構築物がケモカインレセプター５への結合部位およびＣＤ３への結合部位を含み、ここで前記ケモカイン構築物がＲＡＮＴＥＳおよびトキシンを含む、構築物である。本発明は、また前記抗体またはケモカイン構築物をエンコードするポリヌクレオチド、並びに前記核酸分子を含むベクターおよび宿主を記載するものである。さらに、本発明は、前記抗体構築物、ケモカイン構築物、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主を含む組成物に関連する。好ましくは、前記組成物は医薬組成物である。免疫障害を処置、予防および／または緩和する医薬組成物、または、潜伏して感染している細胞を除去する医薬組成物の調製のための抗体構築物、ケモカイン構築物、ポリヌクレオチド、宿主および／またはベクターの使用についても記載されており、ここで前記細胞はＨＩＶ−１のような霊長類の免疫不全ウイルスに感染したものである。本発明はまた、免疫障害を処置、予防および／または緩和する方法、または、霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染している細胞を除去する方法に関連する。さらに、本発明は、本発明の化合物を含むキットを提供する。
【０００２】
いくつかの文書がこの明細書の本文全体にわたり引用されている。ここで引用される各々の文書は（いずれの製品分析表、取扱説明書等も含む）、引用することにより本明細書に取り込まれる。
【０００３】
自己免疫疾患、炎症障害、または感染性疾患のような免疫疾患／障害は、増加しているのみならず、世界的な健康問題として実質的な脅威となっている。
【０００４】
例えばドイツでは、人口の約１％が自己免疫疾患性のリューマチ性関節炎を患っている。さらに、関節炎を引き起こす多数の他のリューマチ性疾患もある。現在、非ステロイド系抗リューマチ薬、コルチゾン製剤および第２次剤の３種類の薬剤と、ＴＮＦα遮蔽剤が、炎症性関節疾患の処置に用いられている。現在まで、治療としては、抗炎症薬や第２次剤の全身投与との組み合わせで、コルチゾン製剤の局所注射に焦点があてられてきた。
【０００５】
非ステロイド系抗リューマチ薬は、穏やかな鎮痛性と抗炎症作用を有するが、頻繁に投与された場合には多くの副作用がある（例えば、胃潰瘍、ネフローゼ）。多量の投与では、コルチゾン製剤は、強力な鬱血除去と鎮痛作用があるが、治療の中断後直ぐに再発をもたらす。さらに、コルチゾン製剤は、関節疾患の破壊工程を止めることはできない。コルチゾンによる長期の治療は、通常重篤な副作用を伴う（感染、クッシング現象、骨粗鬆症、羊皮紙様皮膚、代謝およびホルモン障害）。コルチゾンの局所注射は、移動した白血球細胞の活性が減少するだけであるという基本的な不利益がある。浸潤した細胞が破壊されないので、治療の中断の後直ぐに再発が起こる。上述したように、同様のことが全身投与でも起こる。まれに、コルチゾン結晶の刺激作用のために、コルチゾンの注射後炎症が悪化することがある。コルチゾン注射の作用の持続時間は、大きく変化し、最初の無作用から数週間の作用の持続までの範囲にわたる。
【０００６】
リューマチ学において、第２次剤を用いて炎症の長期の抑制とコルチゾン製剤の削減を行っている。かなりの毒性のため（アレルギー、感染、悪性疾患、腎不全、血圧分利、肺疾患）、患者のそばにいる医療専門家が必要である。処置の開始後、最初の３ヶ月間は治療効果が現れないであろう。現在、４、５個のこのような第２次剤が使用可能であり、これらは最初は個々に使用され、または治療が効果的でない場合は組み合わせて使用される。たいていは、第２次剤の作用形態についてはほとんど何も知られていない。第２次剤の投与が関節の破壊を消失されるかどうかは、完全には明らかになっていない。近年、新しい一群の物質がリューマチ性関節炎の処置に導入され、これはモノクローナル抗体や溶解性レセプター構築物による細胞シグナル物質（特にＴＮＦα）を遮断することに基づいている。
【０００７】
さらに、現在利用可能な治療には反応しない患者もいる。他の場合では、許容できない副作用のために従来の治療を中止しなければならないこともある。
【０００８】
同様の状況が、炎症性腎疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症および移植拒絶反応のような他の多くの炎症性および自己免疫疾患でも存在し、これらは現在の処置では多くの限界がある。例えば、炎症性および自己免疫疾患に用いられる薬剤には、アザチオプリン、シクロホスファミド、（プレドニゾンやコルチコステロイドのような）グルココルチコイド、のような抗炎症剤および免疫抑制剤；シクロスポリンＡ、タクロリマス（ＦＫ５０６）、シロリマス（ラパマイシン）のような免疫抑制剤；およびカルシニューリン、ベータ−インターフェロン、抗ＴＮＦアルファモノクローナル抗体（レミケード）のようなタンパク質薬が含まれる。これらの薬剤は、一般的な免疫調整作用を示し、それゆえ効能と副作用プロフィールが処置の選択肢の厳しい制限の原因となりうる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｅｄｓ． Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．， １４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）。
【０００９】
炎症性腸疾患（例としては、クローン病、潰瘍性大腸炎がある）は、抗炎症剤であるサルファザラジン（アズルフィジン）およびプレドニゾンのようなグルココルチコイドにより処置され、選択された場合にはＴＮＦ−α遮蔽剤により処置される。潰瘍性大腸炎では、アザチオプリンのような薬による免疫抑制治療がよく確立しており、重症患者では、強い免疫抑制剤であるシクロスポリンが用いられる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｅｄｓ． Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．， １４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）。
【００１０】
多くの場合で、現在の薬では充分な疾患活性の減少がなされず、外科的介入が時々必要となることさえある。
【００１１】
炎症性腎疾患（ネフローゼ）は、例えばグルココルチコイド、アルキル化剤および／またはプラスマフェレーシスにより処置される。同様の処置の選択肢を有するさらなる疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合結合組織疾患、抗リン脂質抗体症候群が含まれる。
【００１２】
いくつかのこれらの疾患には、現在ほとんど治療の選択肢がない。これらの疾患のすべてにおいて、１つの炎症性成分が共通する。しかし、この炎症性成分は現在利用可能な薬では充分に抑制できない。例えばアルキル化剤などのいくつかの薬では、患者１人当たりの最大生存投与量を超えることができない。
【００１３】
移植拒絶反応は、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェティル、グルココルチコイド、シクロスポリン、タクロリマス（ＦＫ５０６）、シロリマス（ラパマイシン）等の免疫抑制剤を用いて処置される。ステロイドと、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合するマウスのモノクローナル抗体ＯＫＴ３の少量の投与との組み合わせを用いて、Ｔ細胞をアネルギー化し、涸渇させ、シクロスポリンのような免疫抑制剤を用いて治療が続けられる。ヒト抗−マウス抗体Ｉ（ＨＡＭＡ）は、一般的な副作用を有し、ＯＫＴ３の使用が制限される（Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ． ｓｉｃ． ２３７４−２３８１）。
【００１４】
多発性硬化症を処置する方法には、アザチオプリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、カルシニューリン、ラパマイシン、ベータ−インターフェロン等の抗炎症剤のような全体の免疫系に作用する処置が含まれる（Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ． ｓｉｃ． ２４１５−２４１９； Ｗａｎｇ （２０００） ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５，５４８−５７）。さらに、身体的治療および精神的薬理学剤等のクオリティオブライフを改善しうる多数の非特異的処置が行われている。上述した処置の選択肢は、いずれも治癒させる作用はない。最も有望な化合物であるβ−インターフェロンでさえ、相当な副作用を示す一方、わずかに疾患の進行を遅らせるにすぎない。
【００１５】
さらに、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）は、エイズの最も一般的な原因であるが、（死亡した人を含めて）５０００万人以上に感染しており、また新たに感染する割合は、年間６百万人近いと推定される（ＡＩＤＳ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｕｐｄａｔｅ： Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９９ （ＵＮＡＩＳ， Ｇｅｎｅｖａ， １９９９）， ｗｗｗ． ｕｎａｉｄｓ． ｏｒｇ）。同様に困ったことは、その流行が不確定なことにある。アフリカのサハラ付近が世界的な中心であるが、感染の割合は近時は前ソビエト連邦や、インドと中国等の南および東南アジアの一部で増加しており、これらの場所では文字通り数億人が潜在的な危険にある。米国では、感染の新たな波が、女性、少数民族、および同性愛の男性の若い世代で認められてきた。抗レトロウイルス剤の組み合わせの治療により、多くの人々が臨床的に救われているが、その費用と処置の毒性は相当であり、ＨＩＶ−１感染は依然致命的な疾患のままである。さらに、感染した人々の世界的に大多数の者は、これらの薬剤を入手できない。従って、エイズの人口統計（およびその自然な生長のいくつかの例）が変化しているが、流行は終焉から遙か遠く、その代わりに、これは進化し、拡大し、さらに大きな解決すべき課題としてとどまっている。
【００１６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、細胞表面上の２つの鍵となる分子、ＣＤ４とコレセプターに最初に結合しない限りヒト細胞に進入できない。最初に認識されるコレセプターはＣＣＲ５であり、ウイルスのライフサイクルの後期では、もう一つのケモカインレセプターＣＸＣＲ４がＨＩＶ−１のコレセプターになる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１２９３ （１９９６）； Ｐｒｅｍａｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１１７４； Ｆａｕｃｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，５２９ （１９９６））。性的接触によるウイルスのほとんどの伝染原因となるＨＩＶ−１株は、Ｍ−指向性ウイルスと呼ばれる。これらのＨＩＶ−１株は（ＮＳＩ１次ウイルスとしても知られているが）、１次ＣＤ４＋Ｔ細胞およびマクロファージ中で複製し、ケモカインレセプターＣＣＲ５（および、頻度は低いもののＣＣＲ３）をそれらのコレセプターとして利用する。Ｔ−指向性イルス（時にＳＩ１次と呼ばれる）も１次ＣＤ４＋Ｔ細胞内で複製するが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは確立されたＣＤ４＋Ｔ細胞系にさらに感染し、これはケモカインレセプターＣＸＣＲ４（フュージン）を介して行われる。これらのＴ−指向性株の多くが、ＣＸＣＲ４に加えてＣＣＲ５を利用でき、いくつかは、少なくともあるｉｎ　ｖｉｔｒｏの条件下で、ＣＣＲ５を介してマクロファージに進入できる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１２９３ （１９９６）； Ｐｒｅｍａｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１１７４； Ｆａｕｃｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，５２９ （１９９６））。他のコレセプターがＨＩＶ−１の病因に寄与するかどうかは解明されていないが、いくつかのＴ−指向性株のための他のコレセプターの存在がｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験から推察される。Ｍ−指向性ＨＩＶ−１株がＨＩＶの性的伝染の約９０％に関係しているので、ＣＣＲ５は患者内のウイルスに対する優勢なコレセプターであり；ＣＸＣＲ４を用いる（Ｔ−指向性の）株の伝染（または全身での確立）は、まれである（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１２９３ （１９９６）； Ｐｒｅｍａｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１１７４； Ｆａｕｃｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４， ５２９ （１９９６）， Ｐａｘｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，４１２ （１９９６）； Ｌｉｕ， Ｃｅｌｌ ８６，３６７ （１９９６）； Ｓａｍｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３８２，７２２ （１９９６）； Ｄｅａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，１８５６ （１９９６）； Ｈｕａｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１２４０ （１９９６））。しかし、ＳＩウイルスがｉｎ　ｖｉｖｏで一旦進化すると（またはそれらが伝染すると）、それらは特に毒性となり、疾患の進行を早める原因となる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２， １２９３ （１９９６）； Ｐｒｅｍａｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１１７４； Ｆａｕｃｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，５２９ （１９９６）， Ｓｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６，１３５４ （１９９２）； Ｃｏｎｎｏｒ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７，１７７２ （１９９３）； Ｒｉｃｈｍａｎ， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６９，９６８ （１９９４）； Ｒ． Ｉ． Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５，６２１ （１９９７）； Ｔｒｋｏｌａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，１８４ （１９９６））。
【００１７】
標的細胞上のコレセプター分子の数と同一性、および異なるコレセプターを介して細胞に進入しそうなＨＩＶ−１株の能力は、疾患の進行の重要な決定因子であるように思える。これらの因子は、ＨＩＶ−１感染の宿主−およびウイルス−依存の両方の見地に重大な影響を与える。例えば、ＣＣＲ５のホモ接合欠損（デルタ３２）は、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶ−１感染の抵抗性に強く相関する。欠損したＣＣＲ５対立遺伝に対してヘテロ接合の個体は、感染に対して単に弱い保護しかなく、疾患の進行をわずかに遅くするだけである（Ｐａｘｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，４１２ （１９９６）； Ｌｉｕ， Ｃｅｌｌ ８６，３６７ （１９９６）； Ｓａｍｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３８２，７２２ （１９９６）； Ｄｅａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，１８５６ （１９９６）； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１２４０ （１９９６））。しかし、他の因子が活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＣＲ５発現のレベルに影響し、それによりｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶ−１感染の効率に影響する（Ｔｒｋｏｌａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４， １８４ （１９９６）； Ｂｌｅｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９４，１９２５ （１９９７））。理由はまだ明確になっていないが、細胞表面のＣＣＲ５発現量（ＭＩＰ−１結合により測定）は、２つの野生型ＣＣＲ５対立遺伝子を有する個体からのＣＤ４＋Ｔ細胞上で２０倍変化する（Ｔｒｋｏｌａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，１８４ （１９９６））（図面を参照）。ＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体による染色により、同様の大きな変化が示された（Ｗｕ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １３７３−８１ （１９９７））。このような変化は、ＣＣＲ５の１つの欠損した対立遺伝子のどの効果よりもはるかに影響があるであろう。これらは疾患に対する抵抗性を増加させる制御可能な因子を示すので、この変化の原因は徹底した研究の主題になるべきである。
【００１８】
最も主要なものとして、霊長類の免疫不全ウイルスの臨床的単離には、進入のためのケモカインレセプターＣＣＲ５が用いられる（Ｆｅｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，８７２ （１９９６）； Ｃｈｏｅ， Ｃｅｌｌ ８５，１１３５ （１９９６）； Ｄｅｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３８１，６６１ （１９９６）； Ｄｒａｇｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８１， ｐ． ６６７； Ｄｏｒａｎｚ， Ｃｅｌｌ ８５，１１４９ （１９９６）； Ａｌｋｈａｔｉｂ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，１９５５ （１９９６））。伝染して感染当初の数年間優勢である多くのＨＩＶ−１の単離では、ＣＣＲ５は絶対のコレセプターであり、遺伝的にＣＣＲ５発現が欠損しているまれな個体では、ＨＩＶ−１感染に対し相対的に耐性がある（Ｃｏｎｎｏｒ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５，６２１ （１９９７）； Ｚｈａｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３８３，７６８ （１９９６）； Ｂｊｏｒｎｄａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１，７４７８ （１９９７）； Ｄｅａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，１８５６ （１９９６）； Ｌｉｕ， Ｃｅｌｌ ８６，３６７ （１９９６）； Ｐａｘｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，４１２ （１９９６）； Ｓａｍｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３８２，７２２ （１９９６））。感染経過の後期に起こるＨＩＶ−１の単離にはしばしば他のケモカインレセプターが用いられ、たびたびＣＸＣＲ４がＣＣＲ５に加えて用いられる。キメラのエンベロープ糖タンパク質の研究により、ｇｐ１２０の第３の可変（Ｖ３）ループがどのケモカインレセプターが使われるかの主要な決定因子であることが示された（上記の文献およびＣｏｃｃｈｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２，１２４４ （１９９６）； Ｂｉｅｎｉａｓｚ， ＥＭＢＯ Ｊ． １６，２５９９ （１９９７）； Ｓｐｅｃｋ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１，７１３６ （１９９７）を参照のこと）。たとえＣＤ４の結合が野生型のレベルで起こるとしても、Ｖ３が削除されたｇｐ１２０ではＣＣＲ５に結合しない。Ｖ３ループに対する抗体は、ｇｐ１２０−ＣＣＲ５の結合を妨害する（Ｔｒｋｏｌａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，１８４ （１９９６）； Ｗｕ， Ｎａｔｕｒｅ ３８４，１７９ （１９９６）； Ｌａｐｈａｍ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ６０２ （１９９６）； Ｂａｎｄｒｅｓ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２，２５００ （１９９８）； Ｈｉｌｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ７１，６２９６ （１９９７））。これらの結果は、ケモカインレセプターの結合にＶ３ループが関与していることを支持するものである。
【００１９】
Ｍ−指向性株が優勢の場合は、ＨＩＶの潜伏は感染のごく初期の段階で確立する。Ｍ−指向性株は、感染する標的細胞上のＣＣＲ５の存在に依存する。Ｍ−指向性ＨＩＶ−１の基本的なコレセプターとしてのＣＣＲ５の重要性は、ホモ接合３２塩基対の欠失（デルタ３２）によるＣＣＲ５が欠損した個体がＨＩＶ−１感染に非常に耐性があるという事実により強調される。ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ４５ＲＯのような他のマーカーとは対照的に、ＣＣＲ５は、ＨＩＶ−１感染しやすいリンパ球や他の細胞のサブセット上にだけ存在する（Ｒｏｔｔｍａｎｎ （１９９７） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５１，１３４１−１３５１； Ｎａｉｆ （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，８３０−８３６； Ｌｅｅ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６， ５３１５−５２２０）。
【００２０】
潜伏して感染した細胞を除去するために、いくつかの方法が仮定された。一つの方策は、潜伏して感染しているものをウイルス産生に誘導し、それによって細胞死に誘導するものである。この文脈において、１つの方法は、ウイルスの貯蔵が涸渇するまでＨＡＡＲＴの存在下でＩＬ−２（ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６）を投与することである（Ｃｈｕｎ （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８，８３−９１； Ｃｈｕｎ （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５，６５１−６５５； Ｓｔｅｌｌｂｒｉｎｋ （１９９９） Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ６ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ （Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ， Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ， ＶＡ）， ａｂｓｔｒ． ３５６． ｐ． １３５ ； Ｉｍａｍｉｃｈｉ （１９９９） Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ６ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ （Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ， Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ， ＶＡ）， ａｂｓｔｒ． ３５８， ｐ． １３５）。これらの細胞は、活性化の後死亡すると信じられている。潜伏して感染した細胞のすべての貯蔵を涸渇させられるのかどうかは、疑問がある。
【００２１】
試みられた他の方策は、細胞表面のｇｐ−１２０発現に基づいて潜伏して感染した細胞を特異的に殺すものである。ｇｐ−１２０を認識する抗毒素が提案されたが、２つの理由により失敗した。ヒトにおいて試験された１つの構築物は、シュードモナスエーロギノサ（緑膿菌）のエクソトキシンＡ（ＰＥ）に結合した溶解性ＣＤ４から成るタンパク質であった。臨床的結果は、肝毒性の投与量制限のために失望するものであり、効果の徴候を示すことなく、その計画は終了した（Ａｓｈｏｒｎ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ８７，８８８９−８８９３； Ｂｅｒｇｅｒ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５，１１５１１−１１５１３）。失敗の第２の理由は、潜伏して感染した細胞は、ｇｐ−１２０やｇｐ−４１等のウイルス表面糖タンパク質を発現しないことであった。従って、潜伏して感染した細胞の除去のためにｇｐ−１２０やｇｐ−４１を標的とするという方法は、使えない。
【００２２】
潜伏して感染した細胞を除去するための他の方法としては、すべてのＣＤ４＋Ｔ細胞画分 （Ｂｅｒｇｅｒ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５，１１５１１−１１５１３） や、ＣＤ２５−陽性画分（Ｂｅｌｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０，１４１１−１４１５）、ＣＤ４５ＲＯ記憶細胞画分（ＭｃＣｏｉｇ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ９６，１１４８２１１４８５）を除去することに基づくものがある。しかし、これらのマーカーは、すべての潜在的感染細胞に充分に含まれているものではない。このような細胞には、ＣＤ４−陽性細胞や記憶細胞またマクロファージに加え、非造血細胞も含まれる。
【００２３】
ＷＯ９８／１８８２６には、哺乳動物（例えばヒト）のケモカインレセプター５に対して誘導された抗体が記載されており、前記抗体はＣＣＲ５を有する細胞とＨＩＶのような潜在的リガンドとの相互作用を阻害する方法において提案されている。前記方法はＨＩＶ感染を阻害するものとして提案される。さらに、炎症性疾患、自己免疫疾患および移植拒絶反応に対する処置の選択肢として提案されている。しかし、これらの処置の選択肢はすべて、免疫グロブリン分子のような特異的抗体そのもの、またはそれらの機能的部分がレセプター−リガンド相互作用を妨害するとの仮定に基づいている。しかし、これらの抗体が関連性のある細胞を涸渇させる能力を有するかどうかは、疑問がある。さらに、ＷＯ９８／１８８２６は、ＨＩＶとＣＣＲ５レセプターとの相互作用を防ぎ、これによりＨＩＶ感染を防ぐことを単に考えているにすぎない。
【００２４】
白血球、特にＴ細胞は、感染性の物質に対する免疫反応の鍵となる調整因子と信じられており、炎症性腸疾患、炎症性腎疾患、炎症性関節疾患、多発性硬化症や関節炎のような自己免疫障害、乾癬性損傷のような皮膚疾患、糖尿病および移植拒絶反応などの、炎症工程の開始および維持のための決定的な成分である。
【００２５】
従って、本発明が解決すべき技術的課題は、自己免疫疾患、炎症性の工程および／または免疫細胞のウイルス感染のような免疫病理学に関連する活性化した白血球の抑制を導くことのできる新規の手段と方法を提供することである。
【００２６】
よって、本発明は、霊長類の免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス、最も好ましくはＨＩＶ−１に潜伏して感染した細胞の除去のための医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用に関連する。
【００２７】
本発明の文脈において、ケモカインレセプターに結合する前記抗体および／またはケモカイン構築物の結合は、標的細胞、主に前記霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染した細胞を涸渇させるおよび／または破壊する結果をもたらす。
【００２８】
驚くべきことにこの発明において、ケモカインレセプターに対して誘導された高度に特異的な抗体が、前記ケモカインレセプターを発現している細胞を破壊し、分解し、および／または涸渇させることができないことが示された。しかし、本発明において記載され開示されたように、抗体構築物またはケモカイン構築物は、前記ケモカイン−レセプター陽性細胞と特異的に相互作用でき、前記細胞を涸渇させることができる。前記涸渇／破壊は、例えば単球、マクロファージ、Ｔ細胞（特に好ましくは細胞毒性Ｔ細胞）または樹状細胞のような、特異的なエフェクター細胞の誘引によりなされるであろう。たとえモノクローナル抗体が悪性細胞の破壊／涸渇において成功を示したとしても（例えば Ｍａｌｏｎｅｙ （１９９９）， Ｓｅｍ Ｏｎｃｏｌ． ２６，７６−７８を参照）、本明細書や添付の実施例に記載されているように、白血球の特定の特殊型、（リンパ球、多核白血球および単球を含む）特にＣＣＲ５＋単球、Ｔ細胞および樹状細胞に対しては効果的でないように思われる。
【００２９】
本発明において、「抗体および／またはケモカイン構築物」（即ち抗体構築物および／またはケモカイン構築物）の用語は、ここに記載される分子、多機能構築物および化合物を含むのみならず、それらの機能的フラグメントをも含む。前記構築物の機能的フラグメントとは、標的細胞上のケモカインレセプターに結合／と相互作用でき、前記標的細胞を涸渇させ、分解しおよび／または破壊する手段を提供する、フラグメントを意味する。
【００３０】
本発明において、特異的ケモカインレセプターは、これらに限定されないが、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＸＣＲ１、ＣＣＲ１０およびＣＸ３ＣＲ１を含む。前記ケモカインレセプターに結合するケモカインおよび／またはケモカインリガンドは、この分野においてよく知られており、特に表４に記載されるものがある。さらに、ケモカインおよび対応するレセプターはＭｕｒｐｈｙ （２０００）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｖｉｅｗｓ ５２，１４５−１７６に開示されている。ケモカイン、ケモカインリガンドおよび／またはレセプターは、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトケモカイン／リガンド／レセプターである。
【００３１】
本発明は、炎症性腎疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症、皮膚疾患、アレルギー性反応、糖尿病または移植拒絶反応の処置、予防および／または緩和のための医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用にも関連する。
【００３２】
前記皮膚疾患は、特に、乾癬の障害、アトピー性皮膚炎または慢性炎症性皮膚を含む。ＣＣＲ６の発現は、乾癬患者由来のＰＢＭＣ中でアップレギュレートされる。さらに、ＣＣＲ６リガンド（ＣＣＬ２０＝ＭＩＰ３アルファ）およびＣＣＲ６は、乾癬皮膚においてアップレギュレートされる。さらに、ＣＣＬ２０を発現しているケラチノサイトは、Ｔ細胞が浸潤した皮膚にともに局在化する（Ｈｏｍｅｙ （２０００） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４，６６２１−６６３２）。さらに、ＣＣＲ１０は、メラノサイト、皮膚繊維芽細胞、皮膚内皮細胞、Ｔ細胞および皮膚由来ランゲルハンス細胞で検出され、ケラチノサイトでは検出されない。ＣＣＲ１０リガンド（ＣＣＬ２７）は、皮膚関連発現パターンを有する（Ｈｏｍｅｙ （２０００） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４，３４６５−３４７０； Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒ （１９９９） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １９０，１７５５−１７６８）。さらに、ＣＣＲ４およびそのリガンド（ＴＡＲＣ、ＭＤＣ）は、慢性炎症性皮膚においてアップレギュレートされる。さらにＣＣＲ４は、皮膚に侵入したＴ細胞のホーミングレセプターである。ＣＣＲ４＋Ｔ細胞は、全Ｔ細胞のほんの小さい部分集合であり、それゆえＣＣＲ４＋Ｔ細胞の涸渇は種々の炎症性皮膚疾患においてその徴候を示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ４００，７７６−７８０）。ＣＣＲ３およびエキソトキシンの発現は、アトピー性皮膚炎で増強され、炎症の開始および維持に寄与するであろう（Ｙａｗａｌｋａｒ （１９９９） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１３，４３−４８）。
【００３３】
事実上、リューマチ性関節炎、滑液、並びに、潰瘍性大腸炎、慢性膣炎およびサルコイドーシスのような種々の炎症性組織のすべてのＴ細胞は、ＣＸＣＲ３を発現する。一方で正常リンパ節のほとんどＴ細胞は、ＣＸＣＲ３陽性ではない。
【００３４】
多発性硬化症については、ミエリンを破壊された脳の損傷に浸潤するＴ細胞上で、影響された患者の末梢血液中と同様に、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３が優勢に発現することが示された。対応するリガンドＭＩＰ−１αおよびＩＰ−１０はプラーク中でも検出される（Ｂａｌａｓｈｏｖ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６，６８７３−６８７８）。Ｔ細胞の除去は、この自己免疫疾患のＴ細胞アームを遮蔽するであろう。
【００３５】
多発性硬化症患者の死後のＣＮＳ組織のベータケモカインレセプターの発現の免疫化学的分析により、慢性的活性ＭＳの損傷におけるＣＣＲ２、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５の発現が泡沫状マクロファージに関係し、ミクログリアにより活性化されるが、対照ＣＮＳ組織ではこれらのケモカインレセプターはミクログリアル細胞では低いレベルでしか発現しないことが示された。ＣＣＲ２およびＣＣＲ５は、多数の浸潤するリンパ球上にも存在し、ＭＳの５／１４の場合でＣＣＲ３およびＣＣＲ５は、星状細胞上にも発現した。ＭＳにおけるＣＮＳでのＣＣＲ２、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５の増加した発現は、これらのベータケモカインレセプターおよびそれらのリガンドがＭＳにおいて病因の役割を果たしていることを示唆している（Ｓｉｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０００，１０８，１９２−２００）。
【００３６】
ＣＣＲ３およびＣＣＲ５の高い発現は、ホジキン病患者由来のリンパ節のＴ細胞およびＢ細胞においても観察された。ＣＣＲ３がＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に同等に分散している一方、ＣＣＲ５はおもにＣＤ４＋細胞に関係した。これらのデータは、ケモカインがホジキン病の非腫瘍性リンパ球の浸潤の形成に関係することを示唆するものである（Ｂｕｒｉ， Ｂｌｏｏｄ， ２００１，９７，１５４３−８）。
【００３７】
歯周病は、グラム陰性菌の種に関連する末梢感染である。中程度から進行した歯周病患者では、ＣＣＲ５ケモカインレセプターを発現している細胞が炎症性浸潤において見出された（Ｇａｍｏｎａｌ， Ｊ． Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ． Ｒｅｓ．， ２００１，３６，１９４−２０３およびＴａｕｂｍａｎ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｒａｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２００１，１２， １２５−３５）。
【００３８】
Ｉ型糖尿病は、Ｔ細胞媒介の自己免疫疾患であると見なされている。脾臓におけるＣＣＲ５レセプターの発現は、関連する動物モデルにおけるＩ型糖尿病の進行と関係した（Ｃａｍｅｒｏｎ （２０００） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５，１１０２−１１１０）。特に、ＣＣＲ５の発現は、インスリン炎症の発展や自発性Ｉ型糖尿病と関係した。
【００３９】
特定のケモカインが、関連する動物モデルのＩ型糖尿病のＴ細胞転移に関係した：ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＩＰ１０。これらのケモカインは、ｔｈ１免疫反応をもたらす（Ｂｒａｄｌｅｙ （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２： ２５１１−２５２０）。
【００４０】
上述した炎症性腸疾患は、クローン病および大腸炎潰瘍を含みうる。
【００４１】
ＣＣＲ９は腸に対してホーミングするＴ細胞上で発現し、クローン病および大腸炎潰瘍において誘導される。すべての腸の粘膜固有層と上皮内リンパ球は、ＣＣＲ９を発現する（Ｚａｂｅｌ （１９９９） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０，１２４１−１２５６）。
【００４２】
さらに、本発明の文中で記載したように、抗体および／またはケモカイン構築物は、移植の間および／またはその後の合併症を避けるため、即ち移植拒絶反応および対宿主性移植片疾患を避けるためにも有用である。
【００４３】
ＣＣＲ７は、ナイーブＴ細胞および樹状細胞上で発現し、リンパ組織への細胞の移動を媒介する。従って、ＣＣＲ７＋細胞の除去は、例えば移植後の新しい抗原に対する免疫反応を防ぐであろう。このような処置は、全般的な免疫抑制ではなく、新しい抗原に対して選択的なものであり、ＣＣＲ７＋細胞を涸渇させる本発明の薬剤の投与期間に限定される（Ｆｏｒｓｔｅｒ （１９９９） Ｃｅｌｌ ９９，２３−３３）。ＣＸＣＲ５は、末梢血液と扁桃腺のナイーブＢ細胞上、および記憶Ｔ細胞上で発現する。ＣＸＣＲ５＋Ｂ細胞の除去は、体液性反応の確立を防ぐであろう。さらに、記憶Ｔ細胞の除去は、免疫反応の細胞成分を減少させるであろう（Ｍｕｒｐｈｙ （２０００） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５２，１４５−１７６）。
【００４４】
アレルギーおよび／またはアレルギー反応の処置のための医薬組成物を提供するために、ここに記載されたような抗体および／またはケモカイン構築物が用いられる。エクソトキシンおよびＲＡＮＴＥＳに結合するＣＣＲ３が、アレルギー反応に関係する、好酸球、Ｔｈ２細胞、マスト細胞、好塩基球上で発現することが示された（Ｒｏｍａｎｇｎａｎｉ （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５５，１１９５−１２０４）。
【００４５】
上述した腎または腎臓疾患に関する限り、ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞が繊維症を導く間質性の工程に役割を果たすであろうことが示された。ＣＣＲ５陽性細胞は、移植拒絶反応と同様に、種々の糸球体および間質性疾患の間質性浸潤において同定された。前記疾患は、急性および慢性の腎炎、ＩｇＡ腎症、およびその他を含む（Ｓｅｇｅｒｅｒ （１９９９）， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５６，５２−６４）。
一時的免疫複合体糸球体腎炎（ＩＣ−ＧＮ）のモデルにおいて、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、およびＣＲ５は早期に発現し、尿蛋白および白血球浸潤の最大時においてはすでにダウンレギュレートされていた。ＣＣＲ５の発現は、単離された糸球体の原位置ハイブリダイゼーションおよび定量的逆転写ＰＣＲにより、糸球体に位置していた（Ａｎｄｅｒｓ， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．， ２００１，１２，９１９−３１）。いくつかの腎疾患の３８人の患者の腎臓において、ＣＣＲ１−およびＣＣＲ５−陽性マクロファージとＴ細胞が、免疫組織化学により示されるように、糸球体および間質の両方において検出された。腎性ＣＣＲ５−陽性細胞は、グルココルチコイドにより誘導される回復期の間に顕著に減少した（Ｆｕｒｕｉｃｈｉ， Ａｍ． Ｊ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．， ２０００，２０，２９１−９）。
【００４６】
本発明の好ましい態様において、本発明は、上述したように医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用を提供し、ここで前記ケモカインレセプターは、ケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）である。前記ＣＣＲ５は、好ましくはヒトＣＣＲ５である。
【００４７】
ケモカインレセプターＣＣＲ５は、前炎症性ケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−βおよびＭＣＰ−２に結合するＧタンパク質共役型７回膜貫通ドメインレセプターの大きなファミリーの構成員である。ケモカインは、接着分子と共同して作用して白血球の管外流失を誘発し、組織損傷部位へのそれらの移動を誘導する。
【００４８】
ＣＣＲ５は、少数のＴ細胞上および単球上で発現し、ＨＩＶ感染の早期の段階で優勢であるＭ−指向性ＨＩＶ−１株のさらに主要なコレセプターである。
従って、上述した医薬組成物は、特にＣＣＲ５＋白血球の涸渇に有用であり、ＨＩＶ−１に潜伏して感染している細胞の除去に有用であろう。従って、ＣＣＲ５＋細胞の涸渇は、ＨＩＶに潜伏して感染している細胞の数を減少させ、有効な抗ウイルス剤、好ましくは抗レトロウイルス治療との組み合わせにおいて特に有用であろう。
特に好ましい態様において、前記抗体構築物は、第１の抗原としてケモカインレセプター、好ましくはＣＣＲ５に結合し、第２の抗原としてエフェクター細胞のＣＤ３抗原に結合する二重特異性抗体である。好ましくは、前記ＣＤ３抗原はＴ細胞、好ましくは細胞毒性Ｔ細胞の表面にある。従って前記ＣＤ３は、上述した細胞上に発現している抗原を表し、多重分子（Ｔ）細胞レセプター複合体の一部であろう。
【００４９】
二重特異性抗体は、共有結合により特異的な抗体に結合することや、ダイアボディ法のような他の方法により、ハイブリッド−ハイブリドーマ技術を用いて構築されうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｗ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７７ （１９９８）， ７６３−７７３）。
【００５０】
前記二重特異性抗体が単鎖抗体構築物であることが好ましい。
【００５１】
よく知られたように、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体フラグメントＦｖは、１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）が非共有結合的に結合したダイマーから成る。天然抗体に見出されるものに対応するこの立体配置において、各々の可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマー表面の抗原結合部位を決定するように相互作用する。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。ＣＤＲの側面に位置するフレームワーク（ＦＲ）は、ヒトおよびマウスのような多様な種の天然の免疫グロブリン中で本質的に保存された３次構築物を有する。これらのＦＲは、それらの適切な配向によりＣＤＲを保持するように働く。
【００５２】
不変ドメインは、結合機能を要求されず、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ相互作用を安定化させる手助けをするであろう。通常全結合部位よりも低い親和性ではあるが、単鎖可変ドメイン（または抗原に対して特異的なわずか３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有する（Ｐａｉｎｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１ （１９７２）， １３２７−１３３７）。よって、本発明で定義され記載された抗体構築物の結合部位の前記ドメインは、異なる免疫グロブリンのＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｈ、またはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｌドメインの対でもよい。ポリペプチド鎖内のＶ_ＨとＶ_Ｌドメインの順番は本発明に対して決定的なものではなく、上述したドメインの順番は機能を失うことなく通常逆にしうる。しかしながら、抗原結合部位が適切に折りたたまれるようにＶ_ＨとＶ_Ｌドメインが配列することは、重要である。
【００５３】
抗体／免疫グロブリンの異なる部分は、通常の方法により結合され、または、組み換えＤＮＡ技術により近接タンパク質として構築され、例えば、キメラやヒト化抗体鎖をコードする核酸分子を近接タンパク質を構築するために発現させる方法などによる（例えば、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ９２， ｐｐ． ７０２１−７０２５を参照）。
【００５４】
以下のＦｖフラグメントを有する単鎖抗体が好ましい：ケモカインレセプターに対する、好ましくはＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体のｓｃ−Ｆｖフラグメント、およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体のｓｃ−Ｆｖフラグメント。この場合、ケモカインレセプターに対して誘導されたＦｖフラグメントおよびＣＤ３に対するＦｖフラグメントの両方は、Ｎ末端位に位置するであろう。ＣＣＲ５に対するＦｖフラグメントは、Ｎ末端位にあることが好ましい。Ｖ_ＬとＶ_Ｈ抗体ドメインの順番は、両方の構築物で換えることができ、好ましくはＣＣＲ５に対するＦｖフラグメントの順番は、Ｖ_Ｌ−Ｖ_Ｈであり、ＣＤ３に対するＦｖフラグメントの１つは、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌである。可変ドメイン間、また同様に２つのＦｖフラグメント間のリンカーは、ペプチドリンカーから成り、好ましくは１から２５のアミノ酸の親水性で柔軟なグリシン−およびセリン−含有リンカーから成っていてもよい。
【００５５】
例えば、６×Ｈｉｓの、Ｃ−またはＮ−末端位にある付加的ヒスチジン鎖は、精製および検出を簡単にするために用いられる。
【００５６】
通常の二重特異性抗体と比較して、二重特異性単鎖抗体は、たった１つのタンパク質鎖から構成され、それ故それらの組成が正確に定義できるという長所がある。それらは、通常＜６０ｋＤの低い分子量を有しており、組み換え技術を用いて、例えばＣＨＯ細胞等の適当な細胞系において容易かつ大きなスケールで産生することができる。しかし、最も本質的な長所は、不変抗体ドメインを有さず、それ故これらがその標的細胞、即ちケモカインレセプター発現細胞に結合する時に、Ｔリンパ球を溶解するように活性化するのみであるということである。従って、単鎖抗体は重篤な副作用が少ないかほとんどない臨床への使用において、通常の二重特異性抗体にしばしば勝るものとなる。
【００５７】
ＭＣ−１は、ヒトＣＣＲ５の第２の細胞外ループの第１の部分に特異的に結合し、添付の実施例に示されるようにアカゲザル由来のＣＣＲ５と交差反応をしないことが示された。従って、単鎖抗体構築物が、ケモカインレセプター、好ましくはヒトＣＣＲ５に対して特異的な抗体のＶ_ＬとＶ_Ｈドメイン、および、ＣＤ３抗原に対して特異的な抗体のＶ_ＨとＶ_Ｌドメイン、を含むことが好ましい。ヒトＣＣＲ５に特異的な前記抗体は、ネズミ抗ヒトＣＣＲ５抗体ＭＣ−１であり、特にＭａｃｋ （１９９８）， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７， １２１５−１２２４および添付に実施例に記載されている。また、（添付の実施例で特徴づけられ、またＳｅｇｅｒｅｒ （１９９９）， ｌｏｃ． ｃｉｔ．に記載されているように）ＭＣ−５のような他のα−ＣＣＲ５抗体が本発明の文脈に含まれていることを認識できるであろう。ＣＤ３抗原に特異的な抗体は、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ鎖を認識する抗体、特に好ましくはイプシロン鎖とＣＤ３ゼータ鎖を認識する抗体から成る群より選ばれうる（Ｊａｋｏｂｓ （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４４，２５７−２６４； Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ （１９９１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１，５７１６−５７２１）。抗イプシロン鎖抗体の例としては、ＯＫＴ３（ＷＯ ９１／０９９６８， Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０６，３４７−３４９ （１９７９）； Ｖａｎ Ｗａｕｗｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２４，２７０８−２７１３ （１９８０）； Ｔｒａｎｓｙ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９，９４７−９５０ （１９８９）； Ｗｏｏｄｌｅ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８，２７５６−２７６３ （１９９２）； Ａｄａ， Ｈｕｍａｎ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， ４１−４７ （１９９４））および ＴＲ６６ （Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ （１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０， ３６５５−３６５９）がある。ＣＤ３ゼータ鎖に対するモノクローナル抗体の例としては、Ｈ２Ｄ９、ＴＩＡ２（ともにベクトンディッキンソン）、Ｇ３（セロテック（株））がある。
本発明の使用の特に好ましい態様として、上述した単鎖抗体のＶ_ＬとＶ_Ｈドメインは、Ｖ_Ｌ（ＭＣ−１）−Ｖ_Ｈ（ＭＣ−１）−Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）−Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）の順に配列しており、ここでＶ_Ｌ（ＭＣ−１）が配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、前記Ｖ_Ｈ（ＭＣ−１）が配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、前記Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、および／または前記Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）が配列番号２８を含むことが特に好ましい。ＭＣ−１抗体の特異的ＣＤＲ部分は、配列番号２９から３４に示されており、ここで配列番号２９はＶ_ＬＭＣ−１のＣＤＲ１を示し、配列番号３０はＶ_ＬＭＣ−１のＣＤＲ２を示し、配列番号３１はＶ_ＬＭＣ−１のＣＤＲ３を示し、配列番号３２はＶ_ＨＭＣ−１のＣＤＲ１を示し、配列番号３３はＶ_ＨＭＣ−１のＣＤＲ２を示し、そして配列番号３４はＶ_ＨＭＣ−１のＣＤＲ３を表す。前記二重特異性抗体は、特に配列番号１７で表される核酸配列によりエンコードされるアミノ酸配列を含み、または配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５８】
本発明の使用の他の態様として、抗体構築物は第１の抗原として前記ケモカインレセプターに、第２の抗原としてトキシンに結合する二重特異性抗体である。抗体は前記トキシンに共有結合し、前記抗体―トキシン構築物は化学的カップリングにより構築され、前記抗体および修飾された若しくは修飾されていない原核生物若しくは真核生物のトキシンから融合タンパク質またはモザイクタンパク質を産生しうる。さらに、前記抗体は、さらなる多量化ドメインを介して前記トキシンに結合してもよい。
【００５９】
本発明の使用のさらなる態様として、前記抗体構築物は、多量化ドメインを介して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｖｏでＣＤ３抗原および／またはトキシンに結合する第２の抗体構築物に結合できる。前記多量化は、特にヘテロ（二）量化を介して得られるであろう。例えば、不変免疫グロブリンドメインのヘテロ（二）量化領域が用いられうる。他の多量および／またはヘテロ二量化ドメインはこの分野で知られており、ロイシンジッパー，Ｔ細胞レセプターのα−およびβ−鎖またはＭＨＣクラスＩＩ分子に基づいている。さらに、ｊｕｎ−およびｆｏｓ−に基づくドメインが用いられうる（ｄｅ Ｋｕｉｆ （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１，７６３０−７６３４； Ｋｏｓｔｅｌｎｙ （１９９２）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８，１５４７−１５５３）。多量化ドメインのさらなる例としては、Ｓａｋａｍｏｔｏ （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１，８９７４−８９７８； Ｌｅｅ （１９９４） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １，８７７−８９０； Ｊｅｆｆｒｅｙ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，１４９８−５１０２ ｏｒ Ｎｏｏｒｅｎ （１９９９） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６，７５５−７５９）に記載されているような、ｐ５３−およびＭＮＴ−ドメインがある。
【００６０】
本発明の他の態様として、上述したケモカイン構築物は、修飾された若しくは修飾されていないケモカインと修飾された若しくは修飾されていないトキシンとの融合構築物である。前記構築物は、特に多量化ドメインを介してｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｖｏでＣＤ３抗原および／またはトキシンに結合する抗体構築物に結合する。適切な多量化ドメインは、先行文献に記載されており、上述した。ケモカイン−トキシン構築物は、特に化学的カップリングの結果であり、（添付の実施例に示したように）組み換えにより産生され、またはケモカインと修飾された若しくは修飾されていない原核生物若しくは真核生物のトキシンとの融合タンパク質として産生されうる。前記ケモカインがヒトケモカインレセプターＣＣＲ５に結合し、特にＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３または前記レセプターに結合できるそれらのフラグメントを含むことが、特に好ましい。好ましいトキシンは、ＰＥ３８、ＰＥ４０またはＰＥ３７のようなシュードモナスのエクソトキシンの切断されたものでもよい。この発明の文脈において、最も好ましくはＰＥ３８である。
【００６１】
さらに、本発明に従って、前記ケモカイン構築物は、ＣＤ３抗原に結合できる抗体構築物に結合する、および／またはトキシンに共有結合した、抗体構築物に共有結合したケモカインを含みうる。
【００６２】
本発明の使用の特に好ましい態様として、抗体および／またはケモカイン構築物は、ケモカインレセプター、好ましくはＣＣＲ５レセプター、最も好ましくはヒトＣＣＲ５レセプターに結合する抗体および／またはケモカインを少なくとも１つ含むヘテロミニボディ構築物である。前記ヘテロミニボディ構築物は少なくとも１つのトキシンを含み、前記ヘテロミニボディ構築物が上記に定義したケモカインレセプターおよび／またはエフェクター細胞のＣＤ３抗原に結合することが特に好ましい。好ましいケモカインは上述したケモカインであり、好ましいトキシンは上述したトキシンであり、これらは修飾されていても修飾されていなくてもよい。ケモカインは、この分野でよく知られており、特にＭｕｒｐｈｙ （１９９９）， ｌｏｃ． ｃｉｔに記載されている。従って、ケモカインがＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３またはそれらの機能的フラグメントから成る群より選ばれることが好ましい。この発明の内容において、最も好ましいケモカインはＲＡＮＴＥＳである。前記ケモカインの機能的フラグメントは、前記ケモカインレセプター、好ましくはヒトＣＣＲ５に結合またはこれと相互作用できるフラグメントである。ヘテロミニボディは、この分野で知られており、その製造については、特にＷＯ００／０６６０５に記載されている。前記ヘテロミニボディは、ケモカインレセプター、好ましくはヒトＣＣＲ５に結合またはこれと相互作用する少なくとも１つの抗体および／またはケモカインを含む多機能化合物であり、（さらに）以下に定義されるトキシンおよび／またはＣＤ３抗原に対する結合部位を含みうる。
【００６３】
好ましい態様として、本発明で用いられる抗体構築物またはケモカイン構築物は、融合（ポリ）ペプチドまたはモザイク（ポリ）ペプチドである。前記融合（ポリ）ペプチドは、上述したように単に構築物のドメインおよびそれらの機能的フラグメントのみを含んでいてもよい。しかし、前記融合（ポリ）ペプチドがさらにドメインおよび／または機能的伸長を含むことも企図される。従って、前記融合（ポリ）ペプチドは、少なくとも１つのさらなるドメインを含むことができ、前記ドメインは共有結合または非共有結合により結合している。このような構築物の構築と同様にその結合は、この分野で知られた方法に従った遺伝子融合に基づくことができ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｌｏｃ． ｃｉｔ．， Ａｕｓｕｂｅｌ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ． Ｙ． （１９８９））、または例えばＷＯ９４／０４６８８に記載されたような化学的架橋等により行うことができる。構築物に存在するさらなるドメインは、好ましくは柔軟なリンカー、より都合よくは（ポリ）ペプチドリンカーにより結合され、ここで前記（ポリ）ペプチドリンカーは好ましくは、前記さらなるドメインＣ末端から、ペプチド、（ポリ）ペプチドまたは抗体のＮ末端の、若しくはその逆の間の距離にわたり充分な長さの複数で親水性のペプチド結合したアミノ酸を含む。前記リンカーは、特にグリシン、セリン、および／または、グリシン／セリンリンカーでもよい。さらなるリンカーは、オリゴマー化ドメインを含む。オリゴマー化ドメインは、１つの機能的分子で２つまたはいくつかの自己抗原またはそれらのフラグメントの組み合わせを容易にする。オリゴマー化ドメインの非限定の例としては、（ｊｕｎ−ｆｏｓ、ＧＣＮ４、Ｅ／ＥＢＰのような）ロイシンジッパー（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８ （１９９２）， １５４７−１５５３； Ｚｅｎｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４ （１９９７）， ３６７３−３６７８， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５ （１９９１）， １５５３−１５６３； Ｓｕｔｅｒ，”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｃｈａｐｔｅｒ １１， （１９９６）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、不変ドメインＣＨ１およびＣＬのような抗体由来オリゴマー化ドメイン （Ｍｕｅｌｌｅｒ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４２２ （１９９８）， ２５９−２６４） 、および／またはＧＣＮ４−ＬＩのような四量化ドメインがある（Ｚｅｒａｎｇｕｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７ （２０００）， ３５９１−３５９５）。
【００６４】
さらに、本発明に用いられ、または以下に記載される抗体構築物またはケモカイン構築物は、少なくとも１つのさらなるドメイン、特に例えばヒスチジン伸長のような精製手段を提供するドメインを含んでいてもよい。前記さらなるドメインは、共有結合または非共有結合により結合しうる。
【００６５】
結合は、この分野で知られたまたはここに記載された方法による遺伝子融合に基づくことができ、または例えばＷＯ９４／０４６８６に記載されたような化学的架橋等により行うことができる。この発明で記載され、開示された構築物に存在するさらなるドメインは、好ましくは柔軟なリンカー、より都合よくはポリペプチドリンカーにより、結合部位ドメインの１つに結合し、ここで前記ポリペプチドリンカーは、水溶液に置かれたときに前記ポリペプチドが結合に適したコンフォメーションとなる、前記ドメインの１つのＣ末端から前記ドメインの他のＮ末端の距離にわたり充分な長さの複数で親水性のペプチド結合したアミノ酸を含む。好ましくは、前記ポリペプチドリンカーは、前述した態様に記載したようなポリペプチドリンカーである。本発明のポリペプチドは、エンテロキナーゼのようなプロテイナーゼの切断リンカーまたは切断部位をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
本発明の使用、組成物および方法として開示した前記構築物が免疫調整因子として機能しうるさらなるドメインを含むことも、企図される。前記免疫調整因子には、限定されないが、サイトカイン、リンフォカイン、Ｔ細胞補助刺激リガンド等が含まれる。
【００６７】
ナイーブＴ細胞のプライミングをもたらす充分な活性化は、１次免疫反応に重要であり、樹状細胞のような専用のＡＰＣ（抗原提示細胞）由来の２つのシグナルに依存する。第１のシグナルは、抗原特異的であり、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で提示されるプロセッシングされた抗原により誘導されるクローン型Ｔ細胞抗原レセプターの刺激により通常媒介される。しかし、この第１の刺激はナイーブＴ細胞のプライミング反応を誘導するには不充分であり、抗原提示細胞の補助刺激リガンド分子に結合する特異的Ｔ細胞表面分子の相互作用により提供される第２のシグナルが必要であり、これはプライミングされたＴ細胞の増殖をさらに支援する。従って、「Ｔ細胞補助刺激リガンド」の用語は、本発明の分子に照らして、第１の刺激との組み合わせでナイーブＴ細胞のプライミングを支援することができ、限定されないがＢ７−１（ＣＤ８０）および１３７−２（ＣＤ８６）等のタンパク質のＢ７ファミリーの構成員を含むものを意味する。
【００６８】
上記に定義若しくは以下に記載される抗体および／またはケモカイン構築物は、さらなるレセプターまたはリガンド機能を含み、また免疫調整エフェクター分子またはそれらのフラグメントを含みうる。免疫調整エフェクター分子は、体液性および／または細胞性免疫系、特にその細胞性および／または非細胞性成分、その機能、および／またはその他の生理系との相互作用に、正および／または負に影響を与える。前記免疫調整エフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、マクロファージ移動阻害因子（ＭＩＦ；特にＢｅｒｎｈａｇｅｎ （１９９８）， Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６ （３−４）； １５１−６１ ｏｒ Ｍｅｔｚ （１９９７）， Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６６，１９７−２２３に記載されている）、Ｔ細胞レセプターおよび溶解性ＭＨＣ分子から成る群より選ばれうる。このような免疫調整エフェクター分子は、この分野でよく知られており、特にＰａｕｌ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）に記載されている。特に、知られたサイトカインおよびケモカインは、Ｍｅａｇｅｒ，”Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ” （１９９８）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ， Ｅｎｇｌａｎｄ； （Ｂａｃｏｎ （１９９８）． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ９ （２）： １６７−７３； Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ （１９９７）． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２，２６８２−６； Ｔａｕｂ， （１９９４） Ｔｈｅｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ （４）， ２２９−４６ ｏｒ Ｍｉｃｈｉｅｌ， （１９９２）． Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ ３ （１）， ３−１５）、に記載されている。
【００６９】
本発明で開示され記載され、およびさらなる機能ドメインを含む抗体および／またはケモカイン構築物は、特に以下に記載されるようなヘテロミニボディのような多機能化合物でもよい。
【００７０】
本発明で使用され、またはここに記載された構築物は、１つの種から、好ましくは哺乳動物から、より好ましくはヒトから由来するドメインを含む構築物でもよい。しかし、キメラおよび／またはヒト化構築物も予期されるものであり、本発明の範囲内に含まれるものである。
【００７１】
特に好ましい態様として、本発明で使用され、またはここに記載された構築物を含む本発明の組成物は、架橋（ポリ）ペプチド構築物である。ここで言及するように、前記架橋は、生化学的方法や組み換えを含むこの分野で知られた方法に基づくであろう。
【００７２】
本発明の使用のまたさらなる態様として、使用される抗体構築物またはケモカイン構築物は、少なくとも１つのトキシンを含む。前記トキシンは、シュードモナスのエクソトキシンＡ、ジフテリアトキシンおよび同種のトキシンでもよい。添付の実施例に記載したシュードモナスのトキシンのＰＥ３８やＰＥ４０のような、切断されたトキシンも用いられると企図される。
【００７３】
前記トキシンは、上述したような方法により前記抗体またはケモカインに結合しうる。前記トキシンが短いペプチドリンカーにより抗体／ケモカインに結合することも企図される。そのリンカーは、好ましくは柔軟で親水性のアミノ酸配列からなり、特にグリシンおよびセリンである。好ましくは前記リンカーは、１から２０のアミノ酸長を有する。
【００７４】
シュードモナスのエクソトキシンＡの切断したものを有するいくつかの融合タンパク質が、これまで設計されてきた。それらのほとんどは、悪性細胞を標的とし破壊するために使用されてきた。このトキシンは、タンパク質分解による切断により活性化される。完全長タンパク質がその第１のドメインで遍在するα２−マクログロブリンレセプターに結合し、従ってほとんどの真核細胞に毒性であるので、トキシンの切断されたもの（ＰＥ３８）は本発明の構築物として使用されうる。しかし、この問題は、シュードモナスのエクソトキシンＡの第１のドメインを、トキシンの結合特異性を変化させるための特異的配列に置き換えることにより解決しうる。
【００７５】
さらに、本発明は、霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染している細胞の除去のための医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合するケモカイン構築物の使用に関連し、ここで前記ケモカイン構築物は、配列番号２４で表され、または配列番号２３で表されるヌクレオチド配列によりエンコードされるアミノ酸配列を含む。
【００７６】
上述したように、また好ましい態様にあるように、本発明の範囲内で使用される抗体および／またはケモカイン構築物は、ＣＤ３抗原に結合またはこれと相互作用する。好ましくは前記ＣＤ３抗原は、エフェクター細胞、主としてＴ細胞、好ましくは細胞毒性Ｔ細胞の表面にある。
【００７７】
抗体構築物がＣＣＲ５に対する結合部位およびＣＤ３に対する結合部位を含む構築物を使用し、前記ケモカイン構築物がＲＡＮＴＥＳを含み、前記トキシンが切断されたシュードモナスのエクソトキシンＡ（ＰＥ３８）であるケモカイン構築物を使用することが特に好ましい。
【００７８】
従って、本発明は、ＣＣＲ５に対する結合部位とＣＤ３に対する結合部位を含む抗体構築物、ＲＡＮＴＥＳおよび切断されたシュードモナスのエクソトキシンＡ（ＰＥ３８）を含むケモカイン構築物、にも関連する。
【００７９】
本発明はまた、上記で定義した抗体構築物をエンコードするポリヌクレオチド、またはここで定義するケモカイン構築物をエンコードするポリヌクレオチドにも関連し、ここで前記ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１８若しくは配列番号２４で表されるポリペプチドを特にエンコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１７若しくは配列番号２３で表される核酸分子を含むポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、である。
【００８０】
上記（ｃ）で特徴づけられるポリヌクレオチド／ヌクレオチド配列に関して、この文脈における「ハイブリダイズする」の用語は、通常のハイブリダイズの条件、好ましくは５０％ホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡでハイブリダイズさせ、ここでハイブリダイズの温度が３７℃以上で、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する温度が５５℃以上のような条件を指す。最も好ましくは、「ハイブリダイズする」の用語は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９に記載されているような、ストリンジェントなハイブリダイズ条件を指す。上記（ｃ）で特徴づけられるポリヌクレオチドが（ａ）および／または（ｂ）で定義されるポリヌクレオチドと高い相同性を有し、（ａ）および／または（ｂ）で定義されるポリヌクレオチドに対して、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは９９％の相同性を有していることが企図される。（ｃ）により定義され特徴づけられるポリヌクレオチドは、それ故（ａ）および（ｂ）で定義されるポリヌクレオチドと高い相同性を有するポリヌクレオチドをエンコードしうる。当業者は、ケモカインレセプター、特にヒトＣＣＲ５レセプターに結合する、および／またはＨＩＶ−１のような霊長類の免疫不全ウイルスに感染した細胞等の細胞を除去し、涸渇させおよび／または破壊する、または免疫障害に関係する若しくはここに開示された標的細胞を除去し、涸渇させおよび／または破壊する、このような相同性ポリペプチドの能力を容易に試すことができる。当業者は、添付の実施例のｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｅｘ　ｖｉｖｏ試験を容易に適用して、このような構築物の結合および／または涸渇の性質を確認することができる。
【００８１】
さらに、前記ポリヌクレオチド／核酸分子は、例えばチオエステル結合および／またはヌクレオチドアナログを含有しうる。前記修飾は、細胞中のエンド−および／またはエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用であろう。前記核酸分子は、細胞中で前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含んだ適当なベクターにより転写されうる。本発明の組成物のポリヌクレオチド／核酸分子は、前述したいずれの核酸分子単独または組み合わせのいずれかを含む組み換えにより産生されたキメラ核酸分子でもよい。
【００８２】
前記ポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成により産生されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、または単独または組み合わせでいずれかのこれらのポリヌクレオチドを含む組み換えにより産生されたキメラ核酸分子でもよい。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはベクターの一部である。このようなベクターは、適当な宿主細胞中および適当な条件下で前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核または真核細胞で発現可能な発現制御配列に作用的に結合する。前記ポリヌクレオチドの発現には、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写が含まれる。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞での発現を確実にする調整因子は、当業者によく知られている。これらは通常転写の開始を確実にする調整配列、および任意に転写の終了と転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。さらなる調整因子には、転写および翻訳エンハンサー、および／または天然に組織化された若しくは異種のプロモーター領域が含まれうる。原核宿主細胞で発現が許される可能性のある調整因子には、例えばＥ．ｃｏｌｉのＰＬ，ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが含まれ、真核宿主細胞で発現が許される調整因子の例としては、酵母のＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーター、哺乳動物や他の動物細胞のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーまたはグロブリンイントロンがある。転写開始の原因となる因子に加えて、これらの調整因子は、ＳＶ４０−ポリＡ部位やｔｋ−ポリＡ部位のような転写終止シグナル、ポリヌクレオチドの下流を含んでいてもよい。さらに、用いる発現系に依存してポリペプチドを細胞区画に誘導したり、媒質中に分泌したりできるリーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に加えることができる。これはこの分野でもよく知られており、また例えば添付の実施例を参照のこと。リーダー配列は、適切な相中で、翻訳、開始および終止配列、好ましくは翻訳されたタンパク質やそれらの部分の、ペリプラズム空間や細胞外媒質への分泌を誘導できるリーダー配列、とともに集合する。任意に、異種配列は、例えば発現した組み換え産物の安定化や簡潔化した精製など、望む特徴を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をエンコードできる（前掲参照）。この文脈において、適当な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア），　ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、またはｐＳＰＯＲＴ１（ギブコＢＲＬ）のような、この分野で知られたものである。
【００８３】
好ましくは、発現制御配列は、ベクター中のトランスフェクションする真核宿主細胞の形質転換を可能にする真核細胞プロモーター系でありうるが、原核細胞の宿主の制御配列を用いてもよい。ベクターが適切な宿主に取り込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベルの発現に適した条件下に維持され、所望により本発明のポリペプチドの採取および精製が続いて行われる。例えば、添付の実施例を参照のこと。
【００８４】
上述したように、本発明のポリヌクレオチドは、単独またはベクターの一部として用いて、例えば免疫障害の処置や抗ウイルス治療のための本発明や細胞において使用される抗体および／またはケモカイン構築物を発現できる。上記のポリペプチドのいずれか１つをエンコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドやベクターは細胞中に導入され、次にこれは目的のポリペプチドを産生する。従って、前記ポリヌクレオチドおよびベクターは、遺伝子治療に用いてもよい。遺伝子治療は、ｅｘ　ｖｉｖｏやｉｎ　ｖｉｖｏ技術により治療遺伝子を細胞中に導入することに基づいているが、これは遺伝子転移の最も重要な応用の１つである。ｉｎ　ｖｉｔｒｏやｉｎ　ｖｉｖｏの遺伝子治療のための適したベクター、方法または遺伝子輸送系は、文献に記載され、当業者に知られている。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ５３４−５３９； Ｓｃｈａｐｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７９ （１９９６）， ９１１−９１９； Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６ （１９９２）， ８０８−８１３； Ｖｅｒｍａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８９ （１９９４）， ２３９； Ｉｓｎｅｒ， Ｌａｎｃｅｔ ３４８ （１９９６）， ３７０−３７４； Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７ （１９９５）， １０７７−１０８６； Ｏｎｏｄｅｒａ， Ｂｌｏｏｄ ９１ （１９９８）， ３０−３６； Ｖｅｒｍａ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５ （１９９８）， ６９２−６９９； Ｎａｂｅｌ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１１ （１９９７）， ２８９−２９２； Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９ （１９９８）， ２２４３−５１； Ｗａｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ７１４−７１６； ＷＯ９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７，ＵＳ５，５８０，８５９；ＵＳ５，５８９，４６６；または Ｓｃｈａｐｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７ （１９９６）， ６３５−６４０，およびそれらの引用文献を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞への直接導入または、リポソームやウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のために設計されうる。好ましくは、前記細胞は、微生物系細胞、胚細胞、卵細胞、またはこれら由来のものであり、最も好ましくは前記細胞は幹細胞である。胚性幹細胞の例としては、特にＮａｇｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０ （１９９３）， ８４２４−８４２８に記載された幹細胞が挙げられる。
上記に従って、本発明は、本発明のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含む、遺伝子工学に通常使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関連する。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子転移若しくは標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターは、標的細胞集団に本発明のポリヌクレオチドやベクターを輸送するために用いることができる。当業者によく知られた方法は、組み換えベクターを構築するために用いることができ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９） Ｎ． Ｙ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）に記載された技術を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、標的細胞に輸送するためのリポソーム中に再構築することができる。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、よく知られた方法により宿主細胞に転移させることができ、その方法は細胞宿主の型に依存し変化するものである。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に通常利用され、一方リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に用いられる（前掲Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）。一旦発現すると、本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等の、この分野の標準的工程により精製できる。Ｓｃｏｐｅｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ． Ｙ． （１９８２）を参照のこと。医薬用途には、実質的に少なくとも約９０から９５％の均質性の純粋なポリペプチドが好ましく、９８から９９％もしくはそれ以上の均質性が最も好ましい。部分的に、または所望の均質性まで一旦精製されると、ポリペプチドは、（体外を含めた）治療のためまたは分析工程の発展および実行のために用いれうる。
【００８５】
またさらなる態様として、本発明は、上述したポリヌクレオチド若しくはベクターを含んだ細胞、または本発明のベクターにより形質転換した宿主に関連する。好ましくは、前記宿主／細胞は、真核生物のものであり、ポリペプチドの治療への使用を企図するのであれば、最も好ましくは動物細胞である。もちろん、酵母や微生物細胞のようにあまり好ましくない原核生物のものでも、特に産生したポリペプチドが診断手段として使用される場合には、同様に働くであろう。
【００８６】
宿主細胞に存在する本発明のポリヌクレオチドやベクターは、いずれも宿主細胞のゲノムに統合され、または染色体外に維持されてもよい。
【００８７】
「原核生物」の用語は、本発明のポリペプチドの発現のためのＤＮＡやＲＮＡ分子により形質転換またはトランスフェクションされうるすべての微生物を含む意味である。原核生物の宿主には、例えばグラム陰性菌と同様、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、霊菌、枯草菌のようなグラム陽性菌が含まれうる。「真核生物」の用語は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは動物細胞を含む意味である。組み換え体産生工程に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化していても、グリコシル化していなくてもよい。本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、当業者に一般的に知られたいずれの技術を用いる宿主の形質転換またはトランスフェクションもすることができる。特に好まれるのは、本発明のポリペプチドのコード配列を含み、Ｎ末端フラッグ−タグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓ−タグがこれらに遺伝子的に融合したプラスミドやウイルスの使用である。好ましくは、前記フラッグ−タグの長さは約４から８アミノ酸であり、最も好ましくは８アミノ酸である。例えば哺乳動物細胞や微生物中での、融合し操作可能な結合した遺伝子の調製およびその発現の方法は、この分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．， １９８９）。ここに記載された遺伝子構築物および方法は、真核生物または原核生物の宿主中での本発明のポリペプチドの発現に利用できる。一般的に、挿入されたポリヌクレオチドの充分な転写を容易にするプロモーター配列を含んだ発現ベクターは、宿主との関連で使用される。発現ベクターは、一般的には複製起点、プロモーター、ターミネーター、および形質転換した細胞の表現型による選択を提供できる特異的遺伝子を含む。さらに、本発明の細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明の抗体および／またはケモカイン構築物の大スケールでの産生に使用されうる。最も好ましくは、前記トランスジェニック動物は本発明の抗体構築物を産生する。
【００８８】
さらなる態様として、従って本発明は、抗体および／またはケモカイン構築物の発現および細胞や培地からポリペプチドを単離するのに適した条件下での本発明の（宿主）細胞の培養を含む、上述したポリペプチドの調製工程と関連する。形質転換した宿主は、最適な細胞成長を行うためのこの分野で知られた技術に従い、発酵層で成長させ、培養することができる。そして、本発明の産生された構築物は、成長培地、細胞溶解産物、または細胞膜画分から単離されうる。例えば微生物により発現した本発明のポリペプチドの単離および精製は、例えば本発明のポリペプチドのタグに対して誘導されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を伴うような、または添付の実施例に示したような、予備的クロマトグラフによる分離および免疫的分離のようないずれの通常の方法によってもよい。
【００８９】
宿主細胞に依存して、適切なコンフォメーションを獲得するために、復元技術が必要な場合がある。必要な場合は、最適な結合を探すための点置換が、通常のカセット式変異誘発やここに記載されたような他のタンパク質工学手法をもちいたＤＮＡにおいて行われうる。本発明のポリペプチドの調製は、酵素、毒素、成長因子、細胞分化因子、レセプター、代謝拮抗物質、ホルモン、種々のサイトカインまたはリンフォカインのような生物活性のあるタンパク質のアミノ酸配列（または対応するＤＮＡやＲＮＡ配列）の知識にも依存してもよい。このような配列は、文献やコンピュータによるデータバンクを通じて入手可能である。
【００９０】
本発明は、さらに上述したまたは上述した方法により産生されたポリヌクレオチドによりエンコードされた抗体構築物またはケモカイン構築物に関係する。
【００９１】
さらに、本発明の構築物は、添付の実施例に記載されたように免疫障害、特に自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患およびエイズ（ＨＩＶ感染）の管理、に用いることができる。
【００９２】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主、抗体構築物および／またはケモカイン構築物を含む組成物を提供する。
【００９３】
この発明の内容において「組成物」の用語は、ここに記載された少なくとも１つのポリヌクレオチド、ベクター、宿主、抗体構築物および／またはケモカイン構築物を含む。
【００９４】
前記組成物は、任意に、さらに例えば免疫系を調整および／または妨害することができる分子のような他の分子を単独または組み合わせで含む。組成物は固体、液体または気体の形態でもよく、特に粉末、錠剤、溶液またはエアロゾルの形態でもよい。好ましい態様として、前記組成物は少なくとも２つの、好ましくは３つの、より好ましくは４つの、本発明で記載された最も好ましい化合物を含む。
好ましくは、前記組成物は、任意に医薬的に許容可能なキャリアー、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む医薬組成物である。
【００９５】
適した医薬のキャリアーの例としては、この分野でよく知られており、リン酸バーファー塩溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、種々の型の湿潤剤、無菌溶液等が含まれる。このようなキャリアーを含む組成物は、よく知られた通常の方法により処方できる。これらの医薬組成物は、適切な投与量で被験者に投与できる。適した組成物の投与は、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与等の異なる方法により実施できる。静脈内投与が特に好ましい。投与計画は、医師の立ち会いの下、臨床的要因により決定されうる。医療分野でよく知られているように、いずれかの１人の患者への投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬剤を含む、多くの要因に依存する。一般的には、医薬組成物の標準の投与の計画は、１日当たり１μｇから１０ｍｇ単位の範囲であろう。投与計画が連続的注入の場合は、体重１キログラム、１分当たり１μｇから１０ｍｇ単位の範囲であろう。しかし、連続注入のより好ましい投与量は、体重１キログラム、１時間当たり０．０１μｇから１０ｍｇ単位の範囲であろう。特に好ましい投与量としては、以下に述べられている。進行状況は、周期的な評価により観察することができる。投与量は変化するが、ＤＮＡの静脈投与の好ましい投与量は、ＤＮＡ分子の約１０^６から１０^１２コピーである。本発明の組成物は、局所的または全身的に投与してもよい。投与は、通常静脈内などの非経口によるが、外用投与も企図している。ＤＮＡは、例えば内側または外側の標的部位にバイオリスティックな輸送により、または動脈へのカテーテル挿入によるなど、標的部位に直接投与してもよい。非経口投与の調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁物およびエマルジョンが含まれる。非水溶性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルがある。水溶性キャリアーには、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、懸濁物、塩水およびバッファー溶媒等が含まれる。非経口の賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、リンガー液、または固定油が含まれる。静脈内投与の賦形剤には、液体および栄養補給剤、（リンガーブドウ糖液に基づいたもののような）電解質補給剤等が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等の防腐剤や他の添加剤もある。さらに、本発明の医薬組成物は、例えば血清アルブミンや免疫グロブリン、好ましくはヒト由来のもの等のタンパク質様キャリアーを含みうる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図する使用に依存して、さらに生物学的に活性な物質を含むことを企図している。このような物質は、免疫系に作用する薬剤、抗ウイルス処置に用いる薬剤、特にＨＩＶの処置（例えばＨＡＡＲＴ）およびエイズ管理および／または抗炎症薬でありうる。例えば、ウイルス容量が数週間から数ヶ月間検出濃度以下となるまで、できるだけ早期に患者がＨＡＡＲＴ処置を受けることを企図する。感染した患者のＨＡＡＲＴによる早期の処置は、ＣＣＲ５からＣＸＣＲ４等の他のケモカインレセプターの使用へのウイルス株転移を防ぐ（Ｃｏｎｎｏｒ （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５，６２１−６２８）。例えば、ＣＣＲ５×ＣＤ３構築物等の本発明で開示された構築物は、ＨＡＡＲＴに加えて投与され、ＨＩＶ−１により再感染しやすい細胞とともに潜伏して感染している細胞を除去する。ＣＣＲ５^＋細胞の涸渇は、１から１０回繰り返される。ＣＣＲ５×ＣＤ３の投与量は、０．５μｇ／ｍ２から１０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｍ２から１００μｇ／ｍ２である。薬剤は、静脈内、皮下および／または大脳脊椎液中に投与できる。二重特異性抗体による数回の処置サイクルの後、ＨＡＡＲＴを中断し、ウイルス容量を詳しく観察する。ウイルス容量が検出濃度以上に増加した場合は、ＨＡＡＲＴおよび二重特異性抗体の新たなサイクルを上述したように開始する。
【００９６】
本発明の種々のポリヌクレオチドおよびベクターが標準的なベクターおよび／または遺伝子輸送系を用い、また任意に医薬的に許容可能なキャリアーまたは賦形剤とともに、単独またはいずれかの組み合わせのいずれかで投与されることが、本発明により企図されている。投与の後、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは、被験者のゲノム中に安定して統合されうる。好ましくは、前記被験者はヒトである。
【００９７】
一方、特定の細胞や組織に特異的であり、前記細胞に執着するようなウイルスベクターを用いてもよい。適した医薬的キャリアーおよび賦形剤は、この分野でよく知られている。本発明に従って調製される医薬組成物は、異なる種類の免疫疾患の予防、処置または遅延に用いられ、これらの免疫疾患は、炎症、特に炎症性腸疾患、炎症性腎疾患、（慢性）関節炎のような炎症性関節疾患等の、炎症に関係しうる。さらに、本発明の医薬組成物は、ウイルス、好ましくは霊長類の免疫不全ウイルス、より好ましくはＨＩＶ（−１）に潜伏して感染した細胞を除去するために用いてもよい。
【００９８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む本発明の医薬組成物を遺伝子治療に用いることも可能である。適した遺伝子輸送系には、リポソーム、レセプター媒介輸送系、裸のＤＮＡ、並びにヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスのようなウイルスベクターが含まれうる。遺伝子治療のための身体の特定部位への核酸の輸送は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１）， ２７２６−２７２９）に記載されたようなバイオリスティックな輸送系を用いて達成してもよい。核酸輸送のさらなる方法には、例えばＶｅｒｍａ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １５ （１９９８）， ６９２−６９９に記載されたような粒子媒介遺伝子転移を含む。
【００９９】
導入されたポリヌクレオチドおよびベクターが前記細胞に導入された後、好ましくは前記細胞の寿命の間その状態を維持して、遺伝子産物を産生することが理解される。例えば、適切な調整配列の制御の下でポリヌクレオチドを安定的に産生する細胞系は、当業者によく知られた方法に従って遺伝子操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞はプラスミドと同一か別個のいずれかの、本発明のポリヌクレオチドおよび選択マーカーにより形質転換されうる。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作された細胞は、富養化された培地で１−２日間成長させ、そして選択培地に移される。組み換えプラスミドの選択マーカーは、選択耐性を付与し、そのクロモソーム中に安定して統合されたプラスミドを有する細胞の選択を可能にし、細胞系で順次複製し拡張するフォーカスを形成するように成長する。
【０１００】
多数の選択系が使用され、例えば限定するものではないが、ｔｋ⁻、ｈｇｐｒｔ⁻、ａｐｒｔ⁻細胞における、それぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｃｅｌｌ １１ （１９７７）， ２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８ （１９６２）， ２０２６）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ， Ｃｅｌｌ ２２ （１９８０）， ８１７）などがある。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７ （１９８０）， ３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８ （１９８１）， １５２７）、ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８ （１９８１）， ２０７２）、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０ （１９８１）， １）、ハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ， Ｇｅｎｅ ３０ （１９８４）， １４７）、ピューロマイシン（ｐａｔ、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）、による選択の基礎として使用できる。例えば細胞にトリプトファンの代わりにインドールの利用を可能にするｔｒｐＢ、細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールの利用を可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ （１９８８）， ８０４７）、オルニチンデカルボシキラーゼ阻害因子である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボシキラーゼ）（ＭｃＣｏｌｏｇｕｅ， １９８７， Ｉｎ ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．） 等、さらなる選択可能な遺伝子が記載されている。
【０１０１】
さらなる態様として、本発明は、組成物、上述したように好ましくは医薬組成物に関連し、これらはさらに免疫障害の処置のための薬剤または抗ＨＩＶ処置のための薬剤を含む。
【０１０２】
前記抗ＨＩＶ処置には、ＨＡＡＲＴが含まれうる。ＨＡＡＲＴ治療は、３分類の抗ウイルス薬のカクテルから成る。これらの分類は、ヌクレオシドの逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシドの逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）である。優先的に１以上の分類からの２から４つの薬剤を通常組み合わせて、ウイルス容量をほとんど非検出濃度まで減少させる。製品、投与スケジュールおよび一般的な副作用については、添付の表Ｉ〜ＩＩＩに示す。
【０１０３】
免疫障害の前記処置には、抗炎症剤および免疫抑制剤を含みうる。抗炎症剤は、アザチオプリン、シクロホスファミド、プレドニゾンおよびコルチコステロイドのようなグルココルチコイドから成る群より選ばれうる。免疫抑制剤には、シクロスポリンＡ、タクロリマス（ＦＫ５０６）、シロリマス（ラパマイシン）が含まれうる。タンパク質薬には、カルシニューリン、ベータ−インターフェロン、抗ＴＮＦアルファモノクローナル抗体（レミケード）が含まれうる。抗炎症剤および免疫抑制剤の投与および使用は、特にＦａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｉｃに記載されている。さらなる処置の選択肢は、当業者に知られており、特に上記に記載されている。
【０１０４】
特に好ましい態様として、本発明は、免疫障害を処置、予防および／または緩和するための、または霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染した細胞を除去するための、このような処置、予防および／または緩和を必要とする被験者に、本発明の化合物および／または組成物、好ましくは医薬組成物を有効量投与することを含む、方法に関連する。
【０１０５】
ここで記載された構築物は、ケモカインレセプター陽性細胞を特異的に破壊するのに特に有用である。例えば、標的細胞上のＣＣＲ５とＴ細胞上のＣＤ３に同時に結合する二重特異性抗体は、細胞毒性Ｔ細胞をＣＣＲ５陽性標的細胞に再誘導する。添付に実施例に示したように、抗体構築物は、ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞および単球を特異的に涸渇させるが、ＣＣＲ５欠損Δ３２／Δ３２ＰＢＭＣのようなＣＣＲ５を発現しない細胞に対しては不活性である。さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ／ｅｘ　ｖｉｖｏ試験において、二重特異性抗体構築物は、関節炎患者の滑液からのＣＣＲ５陽性単球およびＴ細胞の９５％以上を除去した。ケモカイン構築物のような他の構築物では、例えば、ケモカインＲＡＮＴＥＳとシュードモナスのエクソトキシンＡの切断されたもの（ＰＥ３８）との融合タンパク質は、添付の実施例に例証されたように、ＣＣＲ５に結合でき、細胞表面からレセプターを下降調整することができる。４８時間以内に、ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８は、２ｎＭの濃度においてＣＣＲ５陽性ＣＨＯ細胞を完全に破壊した。ＣＣＲ５陰性ＣＨＯ細胞に対しては、細胞毒性効果は検出されなかった。
【０１０６】
慢性的に炎症を起こしている組織の浸潤のＣＣＲ５陽性Ｔ細胞および単球の優位性に基づいた、ＣＣＲ５陽性細胞の特異的涸渇は、免疫障害の処置における新しい概念である。
【０１０７】
上述したように、特異的ケモカインレセプターがＨＩＶ感染細胞上に、主としてＣＣＲ５が存在するという事実によって、本発明の化合物および組成物は、霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染した細胞の涸渇／除去に特に有用である。
【０１０８】
本発明は、免疫障害の処置、予防および／または緩和のための医薬組成物の調製または、潜伏して感染した細胞の除去のための医薬組成物の調製のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主、抗体構築物および／またはケモカイン構築物にも関連し、そして前記細胞は霊長類の免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、特にＨＩＶ−１に潜伏して感染している細胞である。
【０１０９】
前記免疫障害は、自己免疫疾患、皮膚疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、糖尿病および移植拒絶反応であり、前記自己免疫疾患は多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、リューマチ性関節炎から成る群より選ばれる。前記皮膚疾患は、乾癬性病巣、乾癬、萎縮性皮膚炎等を含みうる。上述の炎症性疾患は、炎症性関節疾患、炎症性腎疾患、炎症性腸疾患から成る群より選ばれる。特に、前記炎症性腸疾患には、クローン病、サルコイドーシス、全身性硬化症、膠原病、筋炎、神経炎が含まれうる。炎症性腎疾患には、腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎、またはＩｇＡ腎症が含まれうる。
【０１１０】
種々の慢性炎症性疾患において、ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞およびマクロファージの顕著な蓄積が、炎症部位に見出される。ＣＣＲ５^＋細胞の蓄積は、関節炎、炎症性腎疾患、移植拒絶反応、多発性硬化症や炎症性腸疾患のような自己免疫疾患、等の炎症性疾患のいくつかの型で示された。対照的に、これらの患者の末梢血液では、ごく少数のＴ細胞および単球がＣＣＲ５を発現する。従って、ＣＣＲ５は、慢性炎症に関与する白血球を同定するための優秀なマーカーと思われる。ＣＣＲ５の発現を防ぐＣＣＲ５遺伝子の３２ｂｐの欠損の発生は、慢性炎症性疾患におけるＣＣＲ５の病態生理学的役割の研究を可能にする。リューマチ性関節炎患者において、ＣＣＲ５欠損（Δ３２／Δ３２）個体の頻度は、顕著に減少する。さらに、腎臓移植での平均生存率は、ＣＣＲ５−Δ３２／Δ３２患者で顕著に長い。これらの結果から、ＣＣＲ５を治療の介入のための標的とできることがわかる。さらに、末梢血液の白血球上のＣＣＲ５のわずかな発現と対照的な疾患組織におけるＣＣＲ５陽性白血球の遍在は、ＣＣＲ５陽性白血球が、末梢血液白血球を顕著に涸渇させることなく、多発性硬化症のような、慢性炎症、移植拒絶反応および自己免疫疾患の浸潤細胞の数の削減によって治療に有用であり得ることを意味する。炎症性浸潤からのＣＣＲ５陽性白血球の除去は、これらがすでに組織に浸潤しているので、これらの細胞のケモカインレセプターを単に遮蔽することに比べて治療として大いに有益であろう。
【０１１１】
添付の実施例で立証されているように、抗体および／またはケモカイン構築物は、特に炎症性関節疾患を処置、予防および／または緩和するのに有用である。従って、本発明の組成物は、関節炎、特に慢性関節炎のような炎症性関節疾患の処置に特に有用である。
【０１１２】
本発明はさらに、医療方法および使用を提供し、ここで組成物は好ましくは医薬組成物であり、抗ウイルス剤との組み合わせおよび／またはエイズ管理に利用される薬剤との組み合わせにより投与される。
【０１１３】
上述したように、エイズ管理における主要な問題は、潜伏してＨＩＶ感染した細胞の発生にある。現在の処置の選択肢は、ＨＩＶ−１ウイルスの２つの酵素、プロテアーゼと逆転写酵素を妨害する抗ウイルス剤に基づいている。プロテアーゼは、不活性なウイルスのプレタンパク質を活性産物の形態に切断するために不可欠なものであり、一方逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡゲノムのＤＮＡ中間体を産生するのに必要なものである。そしてＤＮＡ中間体は、宿主ゲノムに統合され、沈黙して潜伏した形態でそこにとどまる。最も効果的な処置の選択肢は、高活性抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）からなり、−処置計画は少なくとも３つの抗レトロウイルス薬からなり、プロテアーゼ阻害剤の分類の薬剤を通常少なくとも１つ含む。高活性抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の出現は、ＨＩＶ−１感染個体に重要な影響を与え、循環するウイルスを検出不可能な濃度にまで低下させた（Ｏｘｅｎｉｕｓ （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７，３３８３３３８７； Ｐｅｒｅｌｓｏｎ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３８７，１８８−１９１； Ｈａｍｍｅｒ （１９９７） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３７，７２５−７３３； Ｇｕｌｉｃｋ （１９９７） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３７，７３４−７３９）。これにもかかわらず、潜伏して感染した細胞は、かなりの期間これらの個体にとどまることができ（Ｃｈｕｎ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３８７，１８３−１８８； Ｃｈｕｎ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５，８８６９−８８７３； Ｚｈａｎｇ （１９９９） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４０，１６０５−１６１３）、もしＨＡＡＲＴを中止すると、これらの細胞はウイルスを産生できることとなる（Ｈａｒｒｉｇａｎ （１９９９） ＡＩＤＳ １３， Ｆ５９−Ｆ６２）。潜伏して感染した細胞のプールは、霊長類のＨＩＶ−１感染の早期に作成された（Ｃｈｕｎ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ９５， ８８６９−８８７３）。潜伏したウイルスレザバーの仮定した長い半減期（Ｚｈａｎｇ （１９９９） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４０，１６０５−１６１３， Ｆｉｎｚｉ （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ ５，５１２−５１７）、副作用、および長期のＨＡＡＲＴの費用（Ｆｌｅｘｎｅｒ （１９９８） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３８，１２８１１２９２； Ｃａｒｒ （１９９８） Ｌａｎｃｅｔ ３５１，１８８１−１８８３）を考慮すると、潜伏したレザバーを除去する新しい方策を開発することが重要である。ＨＡＡＲＴ処置がＨＩＶ感染個体の血漿ウイルス血症を抑制するのに非常に有効である一方、脳、リンパ系組織に関連した腸および生殖管において潜伏して感染したＣＤ４＋Ｔ細胞および他の細胞中に含まれるＨＩＶの永続性のレザバーがなお存在する（Ｃｈｕｎ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６， １０９５８−１０９６１）。ＨＡＡＲＴ中断後の血漿ウイルス血症の再出現は、それらの前から存在するウイルスレザバーによるものであり、ＨＡＡＲＴではそれらのレザバーを除去することができない（Ｃｈｕｎ （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ６，７５７−７６１）。従って、ＨＡＡＲＴでも単にウイルス複製を抑制し、ウイルス容量を削減するにすぎず、潜伏して感染した細胞の出現を防いだり、そのような細胞を除去することはない。ＣＣＲ５対立遺伝子のホモ接合Δ３２が欠損した個体がＨＩＶ−１感染に対して高い耐性を有するので、ＨＩＶ−１の伝染はＣＣＲ５の存在に依存している。非常に活性な抗レトロウイルス治療はＨＩＶ−１の複製を効果的に抑制できるが、ＨＩＶの完全な根絶は、今日までなされていない。主要な障害は、潜伏して感染した細胞に対して抗レトロウイルス治療が不活性であるためと思われ、これらの細胞は数年にわたって生存でき、ＨＩＶ−１の内因性の供給源として機能する。これらの細胞の多くがウイルスタンパク質を発現せずに、免疫反応を巧みに避けることができる。しかし、ＣＣＲ５がその最初の感染に必要であるので、潜伏して感染した細胞の大多数はなおＣＣＲ５を発現しているであろう。本発明の化合物は、ＣＣＲ５^＋細胞の涸渇に特に有用であり、潜伏して感染したＨＩＶ^＋細胞の数を顕著に削減しうる。表面に発現したｇｐ１２０等のウイルスタンパク質の特異的認識に依存するＨＩＶ−１感染細胞を除去するための他の方策は、これらの細胞中でウイルスが休眠中あるため、潜伏して感染した細胞に対しては、効果がないであろう。
【０１１４】
従って、本発明の組成物は、補助治療方法において特に有用であり、これはＨＩＶ感染細胞、好ましくはＣＣＲ５陽性細胞の涸渇を導くものである。本発明の組成物はＨＡＡＲＴとの組み合わせで用いることが好ましい。従って、本発明の構築物は、添付の実施例に示したようにＨＡＡＲＴとの組み合わせでＨＩＶ治療に用いられうる。ＨＡＡＲＴの製品、投薬スケジュールおよび一般的な副作用は知られており、特に表Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに例証する。
【０１１５】
前記組み合わせは、他の抗ウイルス剤、好ましくは抗レトロウイルス剤、最も好ましくは抗ＨＩＶ剤による処置の前または後の投与等の補助投与を含んでもよい。
【０１１６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主、抗体構築物および／またはケモカイン構築物を含むキットを提供する。
【０１１７】
さらに好ましくは、本発明のキットは、任意に保存溶液および／または維持試薬または科学的若しくは治療的方法を実施するのに必要な物質をさらに含む。前記キットは、特に、ここに定義した免疫障害の処置および／またはエイズ管理に用いられる薬剤および／または薬物を含んでもよい。さらに、本発明のキットの部品は、バイアル、瓶、容器の組み合わせ、または多重容器ユニットに、個々に充填できる。
【０１１８】
本発明は、以下の生化学的実施例を参照することによりここで記載されるが、これらは単に例示にすぎず、本発明の範囲を限定して解釈するためのものではない。
【０１１９】
【実施例】
実施例１：細胞系、ＰＢＭＣ調製、滑液
１．１　ヒトＣＣＲ５を発現するＣＨＯ細胞系の産生
ＣＣＲ５のｃＤＮＡ配列を、ヒトＰＢＭＣのゲノムＤＮＡからＰｆｕ−ポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いたＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーは：
【０１２０】
【化１】

増幅したフラグメントをゲル精製し、ＰＣＲ−スクリプトＡｍｐ　Ｓｋ（＋）スクリプトベクター（ストラタジーン）に結紮し、配列決定した。ＰＥＦ−ＤＨＦＲベクターにサブクローニングした後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、ヌクレオシドフリーのＭＥＭ培地で記載したように１０％透析ＦＣＳで安定発現を選択した。ＣＨＯ／ＣＣＲ５トランスフェクトした細胞はＦＡＣＳ分析により均質であることが示された。
【０１２１】
１．２　ＰＢＭＣ精製
ＰＢＭＣを、健康なドナーのバフィコートまたは完全血液からフィコール密度勾配遠心分離により単離した。そのように示されている場合には、ＣＣＲ５対立遺伝子（Δ３２／Δ３２）にホモ接合３２塩基対の欠失のあるドナーからのＰＢＭＣを用いて、ＣＣＲ５の表面発現を防いだ。詳しくは、バフィコートを０．９％ＮａＣｌで１：２に希釈し、３５ｍｌを１５ｍｌのフィコールパーク上に層化し、４００ｇで２５分間遠心分離した。白色の中間相を採取し、連続した３回の洗浄により血小板を除去し、ＲＰＭＩで１０％ＦＣＳとともに１００ｇで６分間の遠心分離工程を行った。新たに単離した単球は非常に低いレベルのＣＣＲ５を発現したが、ＲＰＭＩで１０％ＦＣＳとともに３７℃で２４から４８時間のＰＢＭＣの培養後に、発現が強く誘発された。ＦＣＳの量は、この誘発には影響しなかった。リンパ球上のＣＣＲ５の発現は、培養の間変化しなかった。
【０１２２】
１．３　滑液
関節炎患者の滑液を診断若しくは治療としての関節穿刺により得、さらなる調製をすることなく実験に用いた。すべの患者からインフォームドコンセントを得た。滑液および血液サンプルを、膝関節炎の２３人の患者から診断若しくは治療としての関節穿刺により同時に得た。診断内容としては、ここで適用可能なＡＣＲ基準に従って、リューマチ性関節炎（７）、反応性関節炎（３）、未分化膝関節炎（４）、乾癬性関節炎（３）、変形性関節症（２）、強直性脊椎炎（１）および痛風（３）が含まれた。すべての患者から書面のインフォームドコンセントを得た。滑液を光学顕微鏡により分析した。結晶を偏光顕微鏡により同定した。スチューデントｔ検定およびペアードｔ検定を統計分析として適用した。
【０１２３】
１．４　全血液サンプルおよび滑液におけるケモカインレセプター発現の分析
関節穿刺の直後、ＳＦ（滑液）白血球をＮａＣｌ０．９％中の５％ＰＢＳにて２回の洗浄工程により単離した。滑液細胞および全血液（１ｍＭＥＤＴＡを含む）をケモカインレセプターに対するモノクローナル抗体および適当なアイソタイプ対照とともに１０μｇ／ｍｌの濃度で氷上でインキュベートした。抗体としては、ＣＣＲ５に対しＭＣ−１（Ｍａｃｋ （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７，１２１５−１２２４）、ＣＣＲ２に対してはＤＯＣ−３で、これはＣＣＲ２（９）に特異的に結合し、ＣＣＲ１に対してはＣｌｏｎｅ５３５０４（Ｒ＆Ｄ　システムズ）、ＣＸＣＲ１に対しては５Ａ１２（ファーミゲン）、ＣＸＣＲ２に対しては６Ｃ６（ファーミゲン）、ＣＸＣＲ４に対しては１２Ｇ５（ファーミゲン）、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２ａ−、およびＩｇＧ２ｂ−アイソタイプ対照（シグマ）を用いた。２回の洗浄工程の後、細胞をＰＥ−コンジュゲートウサギ抗マウスＦ（ａｂ）２フラグメント（Ｒ４３９、ダコ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＣＤ４−ＦＩＣＴ、ＣＤ８−ＰＥＣｙ５およびＣＤ１４−ＡＰＣ（イムノテック）との組み合わせの後、１０％マウス血清とともにインキュベートした。赤血球の分解の後、直ぐに細胞をフローサイトメトリー（ベクトン−ディッキンソン）により分析した。セルクエスト分析ソフトウエアにより計算を行った。ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、単球および好中球を光散乱特性およびＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４の発現若しくは不存在により同定した。ケモカインレセプターの発現をアイソタイプ対照に従って境界線を定義した後、計算した。
【０１２４】
急性および慢性の関節滲出の両方において、末梢血液に比較して、ケモカインレセプターＣＣＲ５を発現したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が一貫して増加したことを見出した。これらのデータは以前の報告とよく一致する（Ｍａｃｋ （１９９９） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４２，９８１−９８８； Ｑｉｎ （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１，７４６−７５４）。
【０１２５】
非結晶誘発関節炎におけるＴ細胞上のケモカインレセプターの発現：滑液からの約８８％のＣＤ４＋Ｔ細胞および９３％のＣＤ８＋Ｔ細胞が、ケモカインレセプターＣＣＲ５に対して陽性に染色された。同様に、ＳＦ中のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の多くの割合でＣＣＲ２を発現した（６６％および４８％）（図１）。対照的に、末梢血液では少数のＴ細胞しかケモカインレセプターＣＣＲ５またはＣＣＲ２を発現しなかった。滑液においてＣＣＲ５＋ヘルパーＴ細胞が最も突出して豊富であった（血液：ＳＦ比＝１：４）。Ｔリンパ球の大多数は両方の画分でＣＸＣＲ４に対して陽性に染色された。ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＣＲ１は、Ｔ細胞の少数にのみその割合が変化して発現した（図１）。１人の患者の典型的な例を図２に示し、末梢血液および滑液における白血球上のＣＣＲ５、ＣＣＲ２およびＣＸＣＲ４の発現を示す。
【０１２６】
非結晶誘発関節炎における単球上のケモカインレセプターの発現：以前のデータと一致して、ＳＦ中の大多数の単球はＣＣＲ５を発現した。さらに、末梢血液と比較して滑液中の単球においてＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ１の減少した発現がここで報告される（図１、２）。レセプター陽性細胞の低い頻度のみならず、細胞表面上のケモカインレセプターの低い密度が見出された（データは示していない）。基礎となる診断、関節滲出の期間または前処理との関係において違いは検出されなかった。ＣＣＲ２は、両方の画分ですべての単球において同等に発現した（図１、２）。
【０１２７】
非結晶誘発関節炎における好中球上のケモカインレセプターの発現：急性関節炎は、炎症を起こした関節への好中球の急激な流入により特徴づけられる。従って、炎症を起こした関節滲出からの好中球上のケモカインレセプターの発現を分析した。最初は、ＣＸＣＲ４の高い発現が急性および慢性関節炎患者の滑液からの好中球の大きな分画（６０％）において示されるが、末梢血液ではもっと低い発現が見出された（２４％）（図１、２）。痛風以外の関節炎では、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２が、末梢血液と比べて約５０％まで滑液からの好中球において減少した。ＣＣＲ１は、両方の画分においてほんの少数の好中球しか発現しなかった。
【０１２８】
１．５　ＣＣＲ５遺伝子型の決定
ゲノムＤＮＡをアフィニティークロマトグラフィー（ロシュダイアグノスティクス）により冷凍血液サンプルから調製した。続いて潜在的３２塩基対欠失を含むＣＣＲ５遺伝子のフラグメントを、Ｔａｑポリメラーゼを用いた４０サイクルのＰＣＲにて増幅した。プライマーは以下の通りである。
【０１２９】
【化２】

ＰＣＲフラグメントの長さの違いにより（２７４または２４２ｂｐ）、ＣＣＲ５−野生型およびＣＣＲ５−Δ３２対立遺伝子を同定できた。
【０１３０】
実施例２：　二重特異性抗体の構築
２．１　ヒトＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体の産生
ヒトＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体を産生するために、５匹のＢＬＡＢ／ｃマウスを４週間の間隔で腹腔内（ｉ．ｐ．）で免疫し、最初にＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）中で１０日間１×１０^７ＰＢＭＣとともに培養し、ＣＣＲ５が高レベルで発現している１×１０^７のＣＨＯ細胞を６回続けてｉ．ｐ．注射した。この目的のために、ＣＣＲ５をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を２０ｎＭメトトレキサートの存在下で成長させ、ＣＣＲ５の発現を増幅し、ＣＣＲ５を高レベルで発現している１つのクローンを選択した。ＣＨＯ／ＣＣＲ５細胞の最後のｉ．ｐ．注射の４日後に、脾臓を切除し、細胞をＰ３×６３−Ａｇ８細胞系と融合した。約６０００のハイブリドーマからの上清を安定ＣＨＯ／ＣＣＲ５細胞上でフローサイトメトリーにより融合の度にスクリーニングし、ＣＣＲ５（ＭＣ−１、ＭＣ−４、ＭＣ−５）に対するモノクローナル抗体を３回目の融合の後に検出した。ＭＣ−１（ＩｇＧ１）、ＭＣ−４、ＭＣ−５の特異性を、ＣＣＲ１−３およびＣＸＣＲ４により安定してトランスフェクトしたＣＨＯ細胞上で試験した。すべての場合で、結合が検出されなかった。さらに、抗体は、ＣＣＲ５遺伝子のΔ３２欠失ホモ接合のドナーからの新たに単離したＰＢＭＣや培養したＰＢＭＣとは反応しなかった。
【０１３１】
２．２　ＣＣＲ５に対するＭＡｂ　ＭＣ−１の可変ドメインのクローニング
αＣＣＲ５ハイブリドーマＭＣ−１からの軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）可変ドメインをＰＣＲ増幅を用いてクローニングした（Ｏｒｌａｎｄｉ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６，３８３３）。逆転写を、任意の６量体ヌクレオチドおよびスーバースクリプト逆転写酵素（ギブコ）を用いて行った。可変ドメインをＰｆｕ−ポリメラーゼを用いたＰＣＲで増幅し、ベクターＰＣＲスクリプトＡｍｐＳＫ＋（ストラタジーン）にサブクローニングし、配列決定した。
【０１３２】
ＶＬ（１）のＰＣＲ増幅のために以下のプライマーを用いた。
【化３】

【０１３３】
ＶＨ（１）のＰＣＲ増幅のために以下のプライマーを用いた。
【化４】

【０１３４】
ＲＴ　ＰＣＲにより得られたＶＬ（１）のヌクレオチド配列は、配列番号９である。
【化５】

【０１３５】
ＶＬ（１）に対応する翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１０である。
【化６】

【０１３６】
増幅に用いたプライマー配列を除くＶＬ（１）のヌクレオチド配列は配列番号１１である。
【化７】

【０１３７】
ＶＬ（１）の配列番号１１に対応する翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１２である。
【化８】

【０１３８】
ＲＴ　ＰＣＲにより得られたリーダー配列を含むＶＨ（１）の配列は、配列番号１３である。
【化９】

【０１３９】
ＶＨ（１）に対応する翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１４である。
【化１０】

【０１４０】
増幅に用いたリーダー配列とプライマー配列を除いたＶＨ（１）のヌクレオチド配列は、配列番号１５である。
【化１１】

【０１４１】
ＶＨ（１）の配列番号１５に対応する翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１６である。
【化１２】

【０１４２】
２．３　二重特異性単鎖抗体ＣＣＲ５×ＣＤ３の構築および発現
ＣＣＲ５×ＣＤ３二重特異性単鎖抗体の構造および作用の様式の模式図を、図３に示す。以前に記載したように、軽および重可変ドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３リンカーを用いて単鎖フラグメントに結合し、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間で発現させ、組み換えタンパク質のＣＣＲ５への結合を試験した。
【０１４３】
その後、αＣＣＲ５単鎖フラグメントのＤＮＡ配列を、ＢｓｒＧ１およびＢｓｐＥ１を用いて真核生物発現ベクター（ｐＥＦ−ＤＨＦＲ）にサブクローニングし、このベクターは６ヒスチジン残基のＣ末端結合テールを有するＣＤ３に対して誘導された単鎖フラグメントをすでに含んでいる（Ｍａｃｋ （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２，７０２１）。αＣＣＲ５およびαＣＤ３単鎖フラグメントを、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１をコードするリンカーにより結合した（図３を参照）。
【０１４４】
次のドメインの順序のものが選ばれた：ＶＬ（１）−ＶＨ（１）−ＶＨ（２）−ＶＬ（２）で、（１）はＣＣＲ５に対して特異的であり、（２）はＣＤ３に対して特異的である。
【０１４５】
二重特異性ＣＣＲ５×ＣＤ３抗体は、配列番号１７の次のヌクレオチド配列を有する。
【０１４６】
【化１３】

二重特異性ＣＣＲ５×ＣＤ３抗体は、配列番号１８の次のタンパク質配列を有する。
【０１４７】
【化１４】

二重特異性抗体を、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞で発現させ、固定化Ｎｉ２＋イオンのアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製した（Ｈｏｃｈｕｌｉ （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１３２１−１３２５； Ｎｉ−ＮＴＡ， Ｑｉａｇｅｎ）。
要約として、二重特異性抗体の構築のためには、例えば単鎖技術を使用できる（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ， ９２： ７０２１−７０２５； Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８： ３９６５−３９７０）。この場合、図３（上）に模式的に示したように、２つの異なる抗体の軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）免疫グロブリン鎖の可変ドメインは、特定の順序で融合し、任意に６×Ｈｉｓのヒスチジン鎖がさらに結合する。融合は、ＤＮＡ基盤に影響し、４つの異なる可変ドメインを有するタンパク質鎖が発現後に形成されることとなる（図３（上）を参照）。結合したヒスチジン鎖は、固定化Ｎｉイオンを介して１工程で簡単かつ効果的に精製できる。図３（上）に、エフェクター細胞表面のＣＤ３抗原および標的細胞としての白血球表面のヒトＣＣＲ５に結合する二重特異性抗体の好ましい態様を示す。
【０１４８】
その後、特異性を有する単鎖抗体を、２つの可変抗体ドメインの間に（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ_１）_３のリンカーを挿入することにより融合ＰＣＲにより産生する。さらなる融合ＰＣＲにおいて、ＣＣＲ５に対する抗体フラグメントを、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ_１から成るリンカーを挿入することにより、ＣＤ３に対するすでに公表された抗体フラグメントと融合する（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． 前掲、を参照）。
【０１４９】
二重特異性抗体を発現させるため、対応するＤＮＡ配列を真核生物発現ベクター（例えばＰＥＦ−ＤＨＦＲ、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＮＡＳ，前掲）中でサブクローニングし、エレクトロポレーションによりＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。二重特異性抗体を、Ｎｉ−ＮＴＡのアフィニティークロマトグラフィーにより、ｐＨ値を下げることによる溶出を起こさせて安定してトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清から精製する。その後、ｐＨを調整し、タンパク質を適切な濃度に調整する。全精製得量は約９００μｇ／ｌ培地上清であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、いずれの検出可能な酵素によるタンパク質分解またはタンパク質の分解を示すことなく、還元および非還元条件下で約６０ｋＤの単一のバンドが示された（図４）。
【０１５０】
実施例３：　ケモカイン−トキシン融合タンパク質の発現および精製
ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８　ケモカイン−トキシン融合タンパク質の構造と作用の様式の模式図を、図５に示す。プライマーＰ１およびＰ２により産生したＲＡＮＴＥＳのＰＣＲフラグメントを、ＳｔｕｌおよびＳａｌｌを用いてＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現のためにベクター中にサブクローニングした（Ｍａｃｋ （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２，７０２１）。制限部位ＳｔｕｌをＯｍｐＡシグナル配列の３’末端にあらかじめ導入しておいた。シュードモナスのエクソトキシンＡの切断されたもの（ＰＥ３８； Ｔｈｅｕｅｒ （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３，３４０）のＤＮＡを、プライマーＰ３およびＰ４を用いたＰｆｕ−ポリメラーゼでＰＣＲにより増幅し、ＢｓｐＥ１およびＨｉｎｄＩＩＩを用いてＲＡＮＴＥＳのｃＤＮＡをすでに含むベクター中にサブクローニングした。プライマーＰ４により、ＰＥ３８の３’末端に６ヒスチジン残基のテールも付加した。ペリプラズムでの発現の間、組み換えタンパク質がＲＡＮＴＥＳの最初のアミノ酸から開始できるように、ＯｍｐＡシグナル配列を切断した。６ヒスチジン残基のテールが結合したＣ末端により、Ｎｉ−ＮＴＡのアフィニティークロマトグラフィー（キアゲン）による精製が可能であった。
【０１５１】
プライマーの一覧：
【化１５】

上述したように、ＲＡＮＴＥＳのＤＮＡ配列を、シュードモナスのエクソトキシンＡの切断されたもの（ＰＥ３８）（Ｔｈｅｕｅｒ （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３，３４０）の配列と融合した。構築物の最初のものにおいて、Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーをＲＡＮＴＥＳとＰＥ３８の間に置いた。しかし、これは、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現の間融合タンパク質の酵素によるかなりのタンパク質分解をもたらした（データは示していない）。構築物を安定化させる試みとして、リンカーとＰＥ３８の最初の３つのアミノ酸を除去した。新たな融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６左パネル）およびウエスタンブロット（図６右パネル）に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間での発現の間タンパク質分解を起こさなかった。対応する構築物を、配列番号２３および２４にそれぞれ表す。
【０１５２】
実施例４：二重特異性抗体の標的抗原ＣＣＲ５およびＣＤ３への結合
二重特異性単鎖抗体のＣＨＯ細胞またはＰＢＭＣへの結合を、ＦＡＣＳ分析により決定した（図７から９）。６×Ｈｉｓ（ディアノバ、ハンブルグ、ドイツ）に対する抗体およびＰＥ−コンジュゲートポリクローナルウサギ−抗マウスＦ（ａｂ）２フラグメント（Ｒ４３９、ダコ、ハンブルグ、ドイツ）につづき、細胞を、二重特異性抗体で氷上で６０分間インキュベートした。二重特異性抗体がＣＣＲ５にも結合しうるので、ＣＣＲ５対立遺伝子のホモ接合３２塩基対の欠失によるＣＣＲ５の発現を欠いたＰＢＭＣで分析を行った。抗体は、リンパ球の分集団への良好な結合を示した。ＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体による共染色により、この分集団がＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔリンパ球であることを同定した（図７）。さらに、二重特異性抗体は、Ｔ細胞に結合するためのモノクローナルＣＤ３抗体ＯＫＴ−３と競合した（データは示していない）。
【０１５３】
二重特異性抗体のＣＣＲ５への結合が、ＣＣＲ５過剰発現ＣＨＯ細胞およびヒト単球で示された（図８および９）。抗体は、ＣＣＲ５トランスフェクトＣＨＯ細胞（図８）および培養された単球（図９）に対しすばらしい結合を示したが、ＣＸＣＲ４によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞やホモ接合ＣＣＲ５−Δ３２／Δ３２欠失ドナーからの培養された単球では、結合は検出されなかった。単球の一晩の培養により、野生型単球上のＣＣＲ５の発現を誘発したが、ホモ接合ＣＣＲ５−Δ３２／Δ３２欠失ドナーからの単球では、ＣＣＲ５を発現しなかった。さらに、ＣＣＲ５の内在化を効果的に誘発してＣＣＲ５抗体（２５）の結合を減少させることが知られているＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳとともに３７℃で３０分間単球を予備インキュベーションすることにより、培養された単球上の二重特異性抗体による検出可能なＣＣＲ５シグナルは、１５％以下の値に減少し得た（データは示していない）。
【０１５４】
実施例５：　ケモカインレセプターの下降調整
５．１　ＣＣＲ５に対するｍＡｂ　ＭＣ−１によるＣＣＲ５の下降調整
ヒトＣＣＲ５の表面発現に対するＭＣ−１の効果を測定した。比較のために、ＣＣＲ５に対する異なるモノクローナル抗体ＭＣ−４を使用した。ＣＨＯ−ＣＣＲ５細胞を、種々の濃度の抗体ＭＣ−１およびＭＣ−４とともに３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を氷上に置き、ＭＣ−１およびＭＣ−４でそれぞれ１５μｇ／ｍｌの濃度で氷上で１時間染色し、その後第２抗体により検出した（ウサギ抗−マウスＦＩＴＣ、Ｆ３１３、ダコ）。ＦＡＣＳカリバーにより分析を行った。３７℃で３０分間のＭＣ−１とのインキュベーションは、１０μｇ／ｍｌの濃度で４０％までヒトＣＣＲ５の下降調整をもたらした（図１０）。
【０１５５】
５．２　ケモカイン−トキシンによるＣＣＲ５の下降調整
ＲＡＮＴＥＳのシュードモナスのエクソトキシンＡの切断したもののＮ末端への融合は、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３のようなＲＡＮＴＥＳレセプターを発現している細胞への構築物の特異的結合をもたらすと予想される。修飾されたトキシンの結合におけるケモカインレセプターの内在化は、細胞の取り込みおよび構築物の細胞毒活性を増強しうる（図５下パネル）。従って、ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８が、１次単球およびＴ細胞表面からのＣＣＲ５の内在化ができるかどうかを分析した（図１１、白抜き）。ＣＣＲ５の内在化は、構築物がＣＣＲ５に結合でき、ＰＥ３８との融合後もＲＡＮＴＥＳが機能的に活性のまま維持されていることを示しうる。図１１に示したように、構築物は単球およびリンパ球の表面からＣＣＲ５を内在化できる。非修飾のＲＡＮＴＥＳを陽性対照として用い、これはＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８よりも幾分効果的であった（図１１、黒塗り）。
【０１５６】
ＰＢＭＣを、１００μｌの体積で、１０％ＦＣＳのＲＰＭＩで希釈したＲＡＮＴＥＳまたはＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８を種々の濃度において３７℃で３０分間インキュベートした。溶媒単独のものを対照として用いた。そして、細胞を、ＰＥ−コンジュゲート抗−マウス抗体Ｒ４３９に続いて、モノクローナル抗体ＭＣ−１または陰性対照としての溶媒を用いて表面ＣＣＲ５発現について氷上で染色した。ＦＡＣＳ分析を、ＦＡＣＳカリバー（ベクトンディッキンソン）およびセルクエストソフトウエアにより行った。リンパ球と単球とを、その前方および側方光散乱特性並びにＣＤ１４、ＣＤ４およびＣＤ８の発現により区別した。相対的な表面ＣＣＲ５発現を、［平均チャネル蛍光（測定値）−平均チャネル蛍光（陰性対照）］／［平均チャネル蛍光（溶媒）−平均チャネル蛍光（陰性対照）］により計算した。
【０１５７】
実施例６：　ＣＣＲ５×ＣＤ３抗体およびＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８による細胞の涸渇
６．１　培養したＰＢＭＣからの単球のＣＣＲ５特異的涸渇
ＣＣＲ５−野生型（ＷＴ）またはＣＣＲ５欠損（Δ３２／Δ３２）ドナーからのＰＢＭＣを、一晩インキュベートし、単球上にＣＣＲ５の発現を誘導した。培養したＰＢＭＣを、異なる濃度の精製したαＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体または対照としての溶媒とともに２０時間インキュベートした。生き残った細胞を、ＦＡＣＳカリバーで分析し数を数えた。
【０１５８】
ＣＣＲ５陽性１次細胞を涸渇させるαＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性単鎖抗体の能力を試験するために、ヒトＰＢＭＣを抗体とともにインキュベートした（図１２）。インキュベーションの前に、ＰＢＭＣを一晩培養し、単球上のＣＣＲ５の発現をアップレギュレートした。細胞毒性Ｔ細胞を再誘導することにより、二重特異性抗体は、濃度に依存して（図１３）２０時間以内に大多数の単球を涸渇させ、１０ｎｇ／ｍｌの濃度に置いてＣＣＲ５陽性細胞をほとんど完全に涸渇させた。単球の涸渇が、誘導されたＣＣＲ５の発現によるものであると確認するために、ＣＣＲ５を表面発現しないＣＣＲ５対立遺伝子のホモ接合３２ｂｐ欠失を有するドナーからのＰＢＭＣを用いて同様の実験を行った。ＣＣＲ５欠損単球では２０時間後でも涸渇は検出されず、（図１２の）右下のパネルを右上のパネルと比較し、左のパネルが陰性対照であることより、二重特異性抗体による細胞の涸渇がＣＣＲ５を発現する単球に限定されることが示された。単球（Ｍｏ）およびリンパ球（Ｌｙ）を、前方および側方光散乱特性により同定した。単球は、左下象限に矢印で示したように現れる。
【０１５９】
６．２　関節炎患者の滑液からの単球およびＴリンパ球の涸渇
関節炎患者の新たに採取した滑液を、異なる濃度の精製したαＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体または対照としての溶媒とともに２０時間インキュベートした。生き残った細胞を、ＦＡＣＳカリバーで分析し数を数えた。
【０１６０】
二重特異性単鎖抗体は、関節炎患者の炎症を起こした関節からのＣＣＲ５陽性Ｔ細胞および単球を涸渇させるために適用できる可能性がある。従って、種々の型の関節炎患者の滑液からのＣＣＲ５陽性細胞の涸渇を測定した。炎症を起こした滑液の大多数のＴ細胞および単球がＣＣＲ５を発現していることは、以前に示されている（Ｍａｃｋ （１９９９） ｌｏｃ． ｃｉｔ．）。涸渇実験の前に得た滑液サンプルについて、大部分のリンパ球および単球がＣＣＲ５を発現しているが、顆粒球上にはＣＣＲ５の発現が検出されないことをＦＡＣＳ分析により確認した（データは示していない）。涸渇実験のために、滑液をｅｘ　ｖｉｖｏで異なる濃度の二重特異性抗体とともに２０時間インキュベートした（図１４）。滑液を、穿刺の直後に調製することなくインキュベートし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの条件が、抗体が炎症を起こした関節内に存在するｉｎ　ｖｉｖｏと極近い条件に確実に似せるようにした。図１４に示すように、二重特異性抗体は、大多数の滑液からのリンパ球および単球の涸渇を誘発したが、ＣＣＲ５を発現していない顆粒球は影響されないまま維持された。濃度０．５μｇ／ｍｌのＣＣＲ５×ＣＤ３の滑液の単球およびリンパ球の涸渇の代表的なＦＡＣＳ分析を図１５に示す。ＣＣＲ５陰性好中球（ＰＭＮ：多形核細胞）だけは、二重特異性抗体によって影響されない。
【０１６１】
抗体を、滑液とともに１日若しくは数日間インキュベートした。２４時間後、ＣＣＲ５陽性リンパ球および単球は、すでにほとんど消滅していた。長いインキュベーションの後溶媒を調整したとき、単球は培地フラスコの底で視認できるマクロファージに分化していた。二重特異性抗体との適当なインキュベーションの後、マクロファージは視認できなくなった。
【０１６２】
上述したように、培養したＰＢＭＣを二重特異性抗体とともにインキュベートすると、一致した結果が得られる。この場合、ＣＣＲ５陽性単球のほとんど完全な涸渇およびＣＣＲ５陽性Ｔリンパ球のほとんど完全な涸渇となる。ＣＣＲ５陽性Ｔリンパ球および単球の涸渇を示す。
【０１６３】
その結果は、本発明の構築物がＣＣＲ５陽性単球を破壊できることを示している。これは、マクロファージに分化しているときにＣＣＲ５を発現している関節吸引からの単球および血液単球の両方の単球に適用できる。単球／マクロファージの涸渇は、数時間以内に起こる（＜２４時間）。特に、関節の単球／マクロファージの涸渇は、これらの細胞が関節破壊の主要な原因であることから、治療において大きな利益を有する。さらに、Ｔリンパ球の活性化のためにはマクロファージとの相互作用も必要であり、同時にＴリンパ球の作用も抑制される。
【０１６４】
単球／マクロファージの涸渇に加え、ＣＣＲ５陽性Ｔリンパ球の数のかなりの減少が観察される。
【０１６５】
６．３　モノクローナル抗体に対する二重特異性抗体ＣＣＲ５×ＣＤ３の効力の比較
ＣＣＲ５陽性単球の涸渇におけるαＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性単鎖抗体の効力を、２つの非修飾モノクローナル抗体の効力と比較した。２人の異なるドナー（ＦおよびＮ）からのＰＢＭＣを一晩培養し、その後溶媒、二重特異性単鎖抗体（１２５ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣ−１（５μｇ／ｍｌ）およびＭＣ−５（５μｇ／ｍｌ）とともに２４時間インキュベートした。二重特異性単鎖抗体に対する親抗体であるモノクローナル抗体ＭＣ−１はアイソタイプマウスＩｇＧ−１を有し、抗体ＭＣ−５はアイソタイプＩｇＧ−２ａを有する。細胞を完全に回収してＦＡＣＳにより分析し、生き残った単球およびリンパ球を定量した。
【０１６６】
図１６は、驚くべきことに二重特異性抗体のみがＣＣＲ５陽性単球をかなり涸渇させることができる一方、非修飾モノクローナル抗体は二重特異性抗体ＣＣＲ５×ＣＤ３の４０倍以上過剰に用いた場合でもほとんど効果がないことを示す。リンパ球および単球の前方および側方光散乱特性を用いたＦＡＣＳ分析により、モノクローナル抗体ではなくＣＣＲ５×ＣＤ３二重特異性抗体のみが、培養した単球を涸渇させる能力があることが示された（図１７の右上のパネルと下のパネルを比較）。
【０１６７】
６．４　ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８によるケモカインレセプター発現細胞の涸渇
ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を発現しているＣＨＯ細胞を、２４ウェル培養プレート上にサブコンフルーエントに成長させ、異なる濃度の精製したＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８または対照としての溶媒とともにインキュベートした。４０時間後、付着および非付着細胞を回収してＦＡＣＳにより分析して、死亡した細胞の割合を測定した。すでに確立されたように、死亡した（プロピジウムアイオダイド陽性）ＣＨＯ細胞は、光散乱特性により同定できる。
【０１６８】
ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８の細胞毒活性をさらに分析した。この目的のため、ヒトＣＣＲ５、ネズミＣＣＲ５およびヒトＣＸＣＲ４を発現しているＣＨＯ細胞を種々の濃度のケモカイン−トキシンまたは溶媒とともにインキュベートした。１０ｎＭのように低いＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８で４０時間インキュベートした後では、生き残った（付着した）ヒトまたはネズミＣＣＲ５陽性ＣＨＯ細胞は光学顕微鏡によって検出されなかった。対照的に、ＣＣＲ５陽性細胞を溶媒とともにインキュベートした場合、またはＣＸＣＲ４陽性ＣＨＯ細胞を同一濃度のケモカイン−トキシンとともにインキュベートした場合に、規則的な成長と生存が観察された（データは示していない）。死亡した細胞の割合を定量するために、付着および非付着の細胞をＦＡＣＳにより分析した。以前に確立されたように、生存および死亡したＣＨＯ細胞は、光散乱特性により同定することができ、死亡または生存細胞の位置を矢印で示す（図１８）。図１８に示すように、ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８の細胞毒性作用は、ＣＸＣＲ４を発現しているＣＨＯ細胞上では見られないが、ヒトＣＣＲ５を発現しているＣＨＯ細胞では１０ｎＭのＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８により完全に死滅した。
【０１６９】
これらの実験により、ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８が細胞表面からＣＣＲ５を内在化でき、ＲＡＮＴＥＳレセプターｈＣＣＲ５またはｍＣＣＲ５を発現している細胞の涸渇を誘発することが示される。ＣＸＣＲ４陽性ＣＨＯ細胞に対する構築物の不活性は、構築物の細胞毒活性が特異的なケモカインレセプターを発現している細胞に限定されることを示す。
【０１７０】
実施例７：　安定にトランスフェクトした細胞によるウイルス感染アッセイ
ＧＨＯＳＴ３４ＣＣＲ５細胞は、安定してＣＣＲ５を発現しているＨＯＳ／ＣＤ４細胞由来のものを、ダンリットマン（スカボールインスティテュート、ニューヨーク）から提供された。４８ウェルトレー中の２．５×１０^４の細胞を、適切な希釈で３７℃で３０分間１００μｌのケモカインに暴露した。１００μｌのＮＳＩ、ＣＣＲ５−依存ＨＩＶ−１株、ＳＦ１６２を１０００フォーカス形成単位／ｍｌ（ＦＦＵ／ｍｌ）で添加し、細胞をさらに３時間インキュベートした。その後細胞を洗浄し、適当なケモカインを含む溶媒中で固定化前に４日間インキュベートし、前述したようにその場でｐ２４産生について染色して感染のフォーカスを算定した。
【０１７１】
実施例８：　ＣＣＲ５×ＣＤ３のＣＣＲ５発現ＣＨＯ細胞への濃度に依存した結合
ＣＣＲ５を安定してトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＣＲ５＋ＣＨＯ）を標的細胞として用い、（実施例２および図３に記載されたような）二重特異性ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の結合試験を行った。これらの細胞は、（実施例５および図１０に示したような）親抗体ＭＣ−１による結合アッセイによる評価により、ＣＤ３に対して陰性でＣＣＲ５に対して＞９５％で陽性であった。結合は、フローサイトメトリーに基づく結合アッセイにより評価した。
【０１７２】
４×１０^５のＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞を、２０μｌ／ｍｌから１９．５ｎｇ／ｍｌまでの範囲での異なる希釈のｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３を含む５０μｌのＦＡＣＳバッファー（１％胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）および０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中に再懸濁させた。細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートで４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ−タグモノクローナル抗体（ディアノバ）で４℃で４５分間インキュベートした。特異的に結合したｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３を、モノクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥコンジュゲート抗体（ディアノバ）により検出した。洗浄後、細胞を、セルクエストソフトウエア（ベクトンディッキンソン）を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳカリバー、ベクトンディッキンソン）により分析し、異なる濃度のサンプルの蛍光強度の中央値を計算した。非線形回帰分析を、グラフパッドプリズム（バージョン３．０２）により行った。ｓｃＦｖ ＣＣＲ５×ＣＤ３のＣＣＲ５発現ＣＨＯ細胞への濃度に依存した結合を、０．８６μｇ／ｍｌのＫ_Ｄ値により観察した（図２０）。
【０１７３】
実施例９：　エフェクター細胞として１次Ｔリンパ球によるＣＣＲ５×ＣＤ３の細胞毒活性
ＣＣＲ５陽性細胞に対する細胞毒性を媒介する（実施例２および図３に示したような）ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の能力を、標的細胞として安定してトランスフェクトしたＣＣＲ５＋ＣＨＯおよびエフェクター細胞として末梢血液由来のＣＤ３陽性Ｔリンパ球を用いて試験した。細胞毒性の検出には、ＦＡＣＳに基づく分析を行った。
【０１７４】
（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を含む）ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞富養カラム（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いたネガティブ選択により末梢血液から単離した。この目的のために、ＰＢＭＣを標準フィコール−ハイパーク密度勾配分離により調製し、カラムに適用した。Ｂ細胞および単球をカラムマトリックスに結合させる一方、Ｔ細胞を溶出させた。濃縮したＴ細胞を溶媒で洗浄し、エフェクター細胞として用いた。
【０１７５】
フローサイトメトリーによるエフェクター細胞からの標的細胞の区別のために、ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞を脂肪族膜染料ＰＫＨ２６（シグマ）により最終濃度１２μＭでラベル化した。０．５×１０^５のラベル化したＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞および２．５×１０^５のＣＤ３＋Ｔ細胞を、５：１のエフェクター：標的比で９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。３２０ｎｇ／ｍｌから０．３ｐｇ／ｍｌの範囲のｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の１００μｌの希釈物を、細胞とともに３７℃で１６時間、５％ＣＯ_２の加湿環境でインキュベートした。その後、細胞を６００×ｇで３分間遠心分離し、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。１μｇ／ｍｌのプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）による染色の後、細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳカリバー、ベクトンディッキンソン）で２回分析した。
【０１７６】
ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３媒介の分解の特異性を確認するために、安定してＣＸＣＲ４をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を陰性対照標的細胞として用いた。細胞毒性アッセイを、ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞に対するのと同一の条件下で行った。
【０１７７】
ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞の特異的分解を、セルクエストソフトウエア（ベクトンディッキンソン）を用いて計算し、非線形回帰分析をグラフパッドプリズムを用いて行った。Ｓ字状の用量−反応曲線が得られ（図２１）、９１２ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値が判明した。標的細胞としてＣＸＣＲ４＋ＣＨＯ細胞を用いて、ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３に細胞毒性作用がないことが観察された。
【０１７８】
実施例１０：　エフェクター細胞としてのＴ細胞クローンＣＢ１５によるＣＣＲ５×ＣＤ３の細胞毒活性
（実施例２および図３に記載されたような）ＣＣＲ５陽性細胞上のｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の細胞毒活性も、エフェクター細胞としてＣＤ３陽性Ｔ細胞系ＣＤ１５（ＣＤ４＋）を用いて試験した。細胞毒性の検出のために、ＦＡＣＳに基づく分析を標的細胞としてＣＣＲ５トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＣＲ５＋ＣＨＯ）を用いて行った。
【０１７９】
ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞を脂肪族膜染料ＰＫＨ２６（シグマ）により最終濃度１０μＭでラベル化した。エフェクターおよび標的細胞を、１０：１の比でマイクロタイタープレート中で、４０μｇ／ｍｌから０．１５ｎｇ／ｍｌの範囲で希釈したｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の１００μｌとともに、３７℃で６時間、５％ＣＯ_２の加湿環境でインキュベートした。細胞を６００×ｇで３分間遠心分離し、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。細胞を１μｇ／ｍｌのプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）で染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳカリバー、ベクトンディッキンソン）で２回分析した。
【０１８０】
ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞の特異的分解を、セルクエストソフトウエア（ベクトンディッキンソン）を用いて計算し、非線形回帰分析をグラフパッドプリズムを用いて行った。Ｓ字状の用量−反応曲線が得られ（図２２）、１２．８ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値が判明した。
【０１８１】
生物活性アッセイにおいてエフェクター細胞としてＴ細胞クローンＣＢ１５により得られた結果は、ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３により媒介される特異的分解がＣＤ８＋ＣＴＬの細胞毒活性に限定されるのではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞もこの工程に関与していることを示す。
【０１８２】
実施例１１：　ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の構築に用いる親ＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体ＭＣ−１のエピトープのマッピング
（実施例２および図３記載したような）ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の構築に用いる親ＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体ＭＣ−１のエピトープを、キメラおよび点突然変異レセプターを安定して発現している約７０のＣＨＯ−Ｋ１細胞のパネルを用いてフローサイトメトリーによりマッピングした（Ｓａｍｓｏｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７，２７２，２４９３４−２４９４１； Ｌｅｅ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９９，２７４，９６１７−９６２６； Ｂｌａｎｐａｉｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９９，２７４，３４７１９−３４７２７； Ｂｌａｎｐａｉｎ， Ｂｌｏｏｄ， ２０００，９６，１６３８−１６４５）。細胞を、ｍａｂ　ＭＣ−１とともに氷上で３０分間インキュベートし、洗浄してＰＥ−コンジュゲート抗−マウスＩｇ抗体（シグマ）により染色した。ＣＣＲ２ｂを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を、陰性対照として用いた。ＭＣ−１は、ＣＣＲ５分子の第２の細胞外ループ（ＥＣＬ２）の第１の部分を認識することが示された（データは示していない）。ＥＣＬ２は、ａａ１６８−１９９（ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＩＶ）の範囲にあり、Ｃｈｅｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９７，７１，２７０５−２７１４に記載されたようにＣＣＲ５の膜透過領域４および５の間に位置する。
【０１８３】
ヒトおよびアカゲザルのＣＣＲ５のアミノ酸配列は、８つのアミノ酸において異なり、ＥＣＬ２のａａ１７１（Ｋ→Ｒ）およびａａ１９８（Ｉ→Ｍ）の位置において２つのアミノ酸が変化している（Ｃｈｅｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９７，７１，２７０５−２７１４）。これらのアミノ酸の変化による、ＭＣ−１のアカゲザルＣＣＲ５のＥＬＣ２との交差反応の可能性を、ＦＡＣＳに基づくアッセイでヒトおよびアカゲザルのＰＢＭＣにより分析した。両方の種のＰＢＭＣを、標準フィコール勾配遠心分離により単離した。５×１０^５の細胞を、５０μｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、５０μｇ／ｍｌのＭＣ−１を添加した。４℃での３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、ヤギ抗−マウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥコンジュゲートモノクローナル抗体（ディアノバ）を用い４℃で暗所にて３０分間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳカリバー、ベクトンディッキンソン）により分析した。
【０１８４】
図２３に示すように、ＭＣ−１は排他的にヒトＣＣＲ５に結合するが、アカゲザル由来のＣＣＲ５には反応しなかった。これらのデータは、ＭＣ−１により認識されたエピトープがヒトＣＣＲ５に対して特異的であり、ヒトＣＣＲ５配列中のａａ１７１位におけるリジンおよびａａ１９８位におけるイソロイシンがこの特異性に本質的であることを示している。特に、ＥＣＬ２の第１の部分に位置しているａａ１７１位のリジンが、ｍａｂ　ＭＣ−１によるＣＣＲ５のヒトエピトープの特異的認識に寄与している。
【０１８５】
実施例１２：　ＨＩＶ−１感染単球におけるウイルス産生のｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３媒介による削減
ＰＢＭＣを健康なドナーの新鮮なバフィコートからフィコール密度遠心分離により調製し、単球を一晩の培地フラスコへの付着により単離した。残っているＰＢＬを除去し、５％ＣＯ_２下加湿環境で３７℃にて別個に培養した。
【０１８６】
単球を、５×１０^４細胞／ウェルの密度で４８ウェルマイクロタイタープレートに播種し、Ｍ−指向性ＨＩＶ−１株ＢａＬ（ｍｏｉ＝１）により５％ＣＯ_２下加湿環境で３７℃にて一晩感染させた。ウイルスを洗浄により除去し、単球を非刺激ＰＢＬ（ウェル当たり１５×１０^４）＋ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）＋ＡＺＴ（７５μＭ）、または陰性対照として非刺激ＰＢＬ単独（ウェル当たり１５×１０^４）とともにさらに培養した。感染後（ｐ．ｉ．）５日で単球を洗浄し、ＡＺＴまたは抗体の不存在下で培養した。上清をｐ．ｉ．１５日で採取し、ＨＩＶ−１複製をＥＬＩＳＡのｐ２４の測定により定量した。この実験方法により、ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３を含まない対照と比較して（３００ｎｇ／ｍｌ　ｐ２４）、ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３を含むサンプルでは７５％のウイルス複製の削減をもたらした（７５ｎｇ／ｍｌ　ｐ２４）。
【０１８７】
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】痛風を除く関節炎患者の末梢血液（白のカラム）および滑液（灰色のカラム）中のＴ細胞（第１および第２のパネル）、単球（第３のパネル）、好中球（第４のパネル）上の種々のケモカインレセプター（ｘ軸に示した）の発現。それぞれの点は、１人の患者を示し、平均値は棒グラフで示す。好中球上のＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の発現はｙ軸の蛍光強度として与えられ、他のすべてのものはレセプター陽性細胞の割合が示されている。
【図２】リューマチ性関節炎の１人の患者の末梢血液（左）および滑液（右）中の白血球上のＣＣＲ５、ＣＣＲ２およびＣＸＣＲ４の発現を示すＦＡＣＳ点プロット。境界線は、アイソタイプ対照に従って設定し、垂直線として示す。滑液中においてＴ細胞および単球の大多数は、高レベルのＣＣＲ５発現を示すが、末梢血液中においてこれらの細胞のほんの少数が、低いレベルのＣＣＲ５を発現する。
【図３】二重特異性単鎖抗体の模式図。ハイブリドーマＭＣ−１由来のαＣＣＲ５単鎖フラグメント（ＣＣＲ５　ＶＬ／ＣＣＲ５　ＶＨ）は、ＣＤ３に対して誘導された単鎖フラグメント（ＣＤ３　ＶＨ／ＣＤ３　ＶＬ）のＮ末端に融合する。二重特異性抗体のＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＣＲ５陽性標的細胞への結合は、ＣＤ３の架橋、エフェクターＴ細胞の活性化およびＣＣＲ５陽性標的細胞の分解をもたらす。
【図４】精製された二重特異性単鎖抗体αＣＣＲ５−αＣＤ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。約６０ｋＤの単一バンドが、還元（左）および非還元（右）条件下で観察される。二重特異性抗体の分解またはタンパク質分解は、検出されなかった。
【図５】ケモカイン−トキシン　ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８の模式図。ケモカインＲＡＮＴＥＳは、シュードモナスのエクソトキシンＡの切断されたもの（ＰＥ３８）のＮ末端に融合する。切断されたトキシンは真核細胞に結合できないが、融合タンパク質はＲＡＮＴＥＳ部位によりＣＣＲ５に結合し、細胞中に内在化する。これによりトキシンは、タンパク質合成を阻害し、細胞死を誘発する。
【図６】精製したタンパク質ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）およびウエスタンブロット（右）。約４６ｋＤの予期された大きさの明瞭なバンドが、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットで視認できる。
【図７】αＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体のＣＣＲ５欠損リンパ球上のＣＤ３への結合。ＣＤ４およびＣＤ８との共染色により、二重特異性抗体がＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞分集団に結合することが示された。多色分析により他の細胞集団への結合が起こらないことが示された。
【図８】αＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体のトランスフェクションしたＣＨＯ細胞上のＣＣＲ５への結合。ＣＣＲ５によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞は黒で示し、ＣＸＣＲ４陽性ＣＨＯ細胞は陰性対照として用い、白で示す。
【図９】αＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体の培養された単球上のＣＣＲ５への結合。ＣＣＲ５陽性ドナー由来の単球は黒で示し、ＣＣＲ５欠損（Δ３２／Δ３２）ドナー由来の単球は陰性対象として用い、白で示す。
【図１０】ＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体を、ＦＡＣＳ分析によりＣＣＲ５の下降調整を誘発する能力について比較した。ｍＡｂ　ＭＣ−１（四角）、αＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体の親抗体は顕著な内在化を示したが、ＭＣ−４（三角）はＣＣＲ５内在化の誘発を示さなかった。ＣＨＯ−ＣＣＲ５細胞は、３７℃で３０分間種々の濃度でインキュベートした。
【図１１】ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８（白抜き）およびＲＡＮＴＥＳ（黒塗り）によるＰＢＭＣ表面からのＣＣＲ５の下降調整。ＣＣＲ５の表面発現は、リンパ球（四角）および単球（まる）で測定され、溶媒対照の％として与えられる。融合タンパク質ＲＡＴＥＳ−ＰＥ３８は、非修飾のＲＡＮＴＥＳに比べ幾分低い効率で細胞表面からのＣＣＲ５を下降調整できる。
【図１２】二重特異性抗体によるＣＣＲ５陽性単球の涸渇。ＣＣＲ５欠損ＰＢＭＣ（Δ３２／Δ３２）または野生型ＰＢＭＣ（ＷＴ−ＰＢＭＣ）を一晩培養し、二重特異性抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）または対照としての溶媒とともに２０時間インキュベートした。残存している単球（Ｍｏ）およびリンパ球（Ｌｙ）をＦＡＣＳの光散乱特性により同定した。ＣＣＲ陽性野生型単球は二重特異性抗体により完全に涸渇したが、ＣＣＲ５欠損単球は生き残った。
【図１３】二重特異性抗体によるＣＣＲ５陽性単球の涸渇。用量−反応曲線は、αＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性抗体の種々の濃度で培養された単球の涸渇を示す。単球の９０％以上が３３ｎｇ／ｍｌの濃度で涸渇した。
【図１４】二重特異性αＣＣＲ５−αＣＤ３抗体は、慢性関節炎患者の滑液からのリンパ球および単球を涸渇させた。新たに採取した滑液を種々の濃度の二重特異性抗体または対照としての溶媒とともに２０時間インキュベートし、ＦＡＣＳで分析した。両方の細胞型の９５％以上が、３１ｎｇ／ｍｌの濃度で涸渇した。
【図１５】二重特異性αＣＣＲ５−αＣＤ３抗体は、慢性関節炎患者の滑液からのリンパ球および単球を涸渇させた。新たに採取した滑液を二重特異性抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）または対照としての溶媒とともに２０時間インキュベートし、ＦＡＣＳ（前方および側方光散乱分析）で分析した。二重特異性抗体はＣＣＲ５陽性単球およびリンパ球を完全に涸渇させたが、ＣＣＲ５陰性顆粒球（ＰＭＮ）は生き残った。我々の以前のデータと一致して、この滑液中のすべての単球およびリンパ球はＣＣＲ５を発現したが、顆粒球（ＰＭＮ）ではＣＣＲ５の発現は見られなかった。
【図１６】ＣＣＲ５陽性単球を涸渇させる場合のαＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性単鎖抗体の効率を、２つの非修飾モノクローナル抗体ＭＣ−１およびＭＣ−５の効率と比較した。２人の異なるドナー（ＦおよびＮ）からのＰＢＭＣを一晩培養し、抗体構築物および抗体の存在下または不存在下で溶媒とともに２４時間インキュベートした。濃度を示した。細胞を完全に回収し、ＦＡＣＳ分析により生存する単球およびリンパ球を定量した。ＰＢＭＣドナーそれぞれの２つの実験結果を示す。驚くべきことに、二重特異性抗体のみがＣＣＲ５陽性単球を相当涸渇できたが、一方非修飾のモノクローナル抗体はほとんど効果がなかった。
【図１７】図１６に示したような典型的な実験の前方および側方光散乱分析の例であり、αＣＣＲ５−αＣＤ３二重特異性単鎖抗体のみが左下象限の単球を涸渇させる能力を有することが示された。異なる細胞型の局在化の比較として、図１２左パネルを参照のこと。
【図１８】ケモカイン−トキシン　ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８によるＣＣＲ５陽性ＣＨＯ細胞の破壊。ＣＣＲ５陽性ＣＨＯ細胞およびＣＸＣＲ４陽性ＣＨＯ細胞を４０時間ケモカイン−トキシン（１０ｎＭ）でインキュベートし、ＦＡＣＳで分析した。死亡した細胞が、前方および側方光散乱プロットの左上領域に現れる。ＲＡＮＴＥＳ−ＰＥ３８は、ＣＣＤ５陽性ＣＨＯ細胞を完全に破壊したが、ＣＸＣＲ４陽性ＣＨＯ細胞には効果がなかった。
【図１９】ペプチド結合または多量化ドメインにより組み合わされるケモカインレセプター（ＣＣＲ）発現細胞に結合する抗体および／またはケモカイン構築物の例：（Ａ）は、エフェクター細胞表面抗原に結合することによりエフェクター細胞と相互作用する抗体およびケモカイン構築物の種々の例を示し、（Ｂ）は、トキシンに結合する抗体およびケモカイン構築物の例を示し、（Ｃ）は、トキシンに対する抗体結合部位を含む抗体およびケモカイン構築物の例を示す。
【図２０】４×１０^５のＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞を、１９．５ｎｇ／ｍｌのｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３とともに４℃で３０分間インキュベートし、洗浄後細胞を２０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ−タグモノクローナル抗体とともに４℃で４５分間インキュベートした。ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の結合をモノクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）_２−ＰＥコンジュゲート抗体で検出し、セルクエストソフトウエアを用いたフローサイトメーターにより分析した。グラフパッドプリズムによる非線形回帰分析を行った。
【図２１】ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の細胞毒活性を、ＣＣＲ５＋ＣＨＯを標的とし、ＣＤ３＋Ｔリンパ球をエフェクター細胞としたＦＡＣＳに基づく分析により検査した。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、末梢血液から単離した。ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞は、１２μＭのＰＫＨ２６によりラベル化した。エフェクター細胞：標的細胞を５：１の比率で、ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３を３２０ｎｇ／ｍｌから０．３ｐｇ／ｍｌの範囲で希釈したものとともに５％ＣＯ_２下３７℃で１６時間インキュベートした。１μｇ／ｍｌのプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）で染色した後、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。
ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３媒介の分解の特異性を確認するために、安定してＣＸＣＲ４でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を陰性対照標的細胞として用いた。細胞毒性アッセイをＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞について記載したのと同一の条件下で行った。
ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞の特異的分解をセルクエストソフトウエア（ベクトンディッキンソン）を用いて計算し、非線形回帰分析をグラフパッドプリズムにより行った。Ｓ字状の用量−反応曲線により、９１２ｐｇ／ｍｌのＥＣ５０値が明らかになった。標的細胞としてＣＸＣＲ４＋ＣＨＯ細胞では、ｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の細胞毒性作用は観察されなかった。
【図２２】ＣＣＲ５陽性細胞上のｓｃＦｖ　ＣＣＲ５×ＣＤ３の細胞毒活性も、エフェクター細胞としてＣＤ３陽性Ｔ細胞系ＣＢ１５を用いてＦＡＣＳに基づいたアッセイにより検査した。１０μＭのＰＫＨ２６によってラベル化されたＣＣＲ５＋ＣＨＯ標的細胞を、エフェクター：標的が１０：１の比率で用い、異なる希釈（４０μｇ／ｍｌから０．１５ｎｇ／ｍｌ）のｓｃＦｖ ＣＣＲ５×ＣＤ３を１００μｌとともに、５％ＣＯ_２下３７℃で６時間インキュベートした。細胞を１μｇ／ｍｌのプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）で染色した後、２回フローサイトメトリーにより分析した。
ＣＣＲ５＋ＣＨＯ細胞の特異的分解をセルクエストソフトウエア（ベクトンディッキンソン）を用いて計算し、非線形回帰分析をグラフパッドプリズムにより行った。Ｓ字状の用量−反応曲線により、１２．８ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値が明らかになった。
【図２３】ＭＣ−１の、Ａ）ヒトＰＢＭＣおよびＢ）アカゲザルＰＢＭＣとの反応性。ＰＢＭＣ（実線）、ＰＢＭＣおよびＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（点線）、ＰＢＭＣおよびＭＣ−１とＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（太線）。ＭＣ−１はヒトＰＢＭＣ（Ａ）と結合するが、アカゲザルＰＢＭＣ（Ｂ）とは結合しないことが、Ｍ１マーカー線により示される。

Claims (50)

1. 霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染している細胞の除去のための医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用。
2. 前記霊長類の免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項１に記載の使用。
3. 前記ヒト免疫不全ウイルスがＨＩＶ−１である、請求項２に記載の使用。
4. 炎症性腎疾患、アレルギー反応、炎症性腸疾患、多発性硬化症、皮膚疾患、糖尿病または移植拒絶反応の処置、予防および／または緩和のための医薬組成物を調製するための、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカイン構築物の使用。
5. 前記ケモカインレセプターがケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）である、請求項１ないし４のいずれかに記載の使用。
6. 前記ケモカインレセプター５がヒトＣＣＲ５である請求項５に記載の使用。
7. 前記抗体構築物が、第１の抗原としてケモカインレセプターに、第２の抗原としてエフェクター細胞のＣＤ３抗原に結合する二重特異性抗体である、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
8. 前記二重特異性抗体が単鎖抗体構築物である、請求項７に記載の使用。
9. 前記単鎖抗体構築物が、ケモカインレセプターに特異的な抗体のＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメイン、並びにＣＤ３抗原に特異的な抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む、請求項８に記載の使用。
10. 前記ケモカインレセプターに特異的な抗体がネズミ抗−ヒトＣＣＲ５抗体ＭＣ−１である、請求項９に記載の使用。
11. 前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインが、Ｖ_Ｌ（ＭＣ−１）−Ｖ_Ｈ（ＭＣ−１）−Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）−Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）の順に配列している、請求項９または１０に記載の使用。
12. 前記Ｖ_Ｌ（ＭＣ−１）が配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含み、前記Ｖ_Ｈ（ＭＣ−１）が配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、前記Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、および／または、前記Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）が配列番号２８を含む、請求項１１に記載の使用。
13. 前記二重特異性抗体が配列番号１７で表される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５ないし１２のいずれかに記載の使用。
14. 前記抗体構築物が、第１の抗原として前記ケモカインレセプターに、第２の抗原としてトキシンに結合する二重特異性抗体である、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
15. 前記抗体構築物がトキシンに共有結合する、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
16. 前記抗体構築物が、多量化ドメインを介して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｖｏでＣＤ３抗原および／またはトキシンに結合する第２の抗体構築物に結合できる、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
17. 前記ケモカイン構築物が修飾または非修飾ケモカインと修飾または非修飾トキシンとの融合構築物である、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
18. 前記ケモカイン構築物が、多量化ドメインを介して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ　ｖｉｖｏでＣＤ３抗原および／またはトキシンに結合する抗体構築物に結合できる、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
19. 前記ケモカイン構築物が、ＣＤ３抗原に結合する抗体構築物に結合する、および／またはトキシンに共有結合した、抗体構築物に共有結合したケモカインを含む、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
20. 前記抗体および／またはケモカイン構築物が、ケモカインレセプターに結合する抗体および／またはケモカインを少なくとも１つ含むヘテロミニボディ構築物である、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
21. 前記ヘテロミニボディ構築物が少なくとも１つのトキシンを含む、請求項２０に記載の使用。
22. 前記ヘテロミニボディ構築物が、ケモカインレセプターおよび／またはエフェクター細胞のＣＤ３抗原に結合する、請求項２０または２１に記載の使用。
23. 前記ケモカインが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３から成る群より選ばれる、請求項１７ないし２２のいずれかに記載の使用。
24. 前記トキシンが、切断されたシュードモナスのエクソトキシンＡである、請求項１５ないし１９、２１および２２のいずれかに記載の使用。
25. 前記ケモカイン構築物が、配列番号２４で表される、または配列番号２３で表されるヌクレオチド配列によりエンコードされる、アミノ酸配列を含む、請求項１７ないし２４のいずれかに記載の使用。
26. 前記ＣＤ３抗原がＴ細胞であるエフェクター細胞表面上にある、請求項７ないし１３、１６、１８、１９および２２のいずれかに記載の使用。
27. 前記構築物がＣＣＲ５に対する結合部位およびＣＤ３に対する結合部位を含む、請求項５ないし１６、２０、２１および２２のいずれかで定義される抗体構築物。
28. 前記ケモカイン構築物がＲＡＮＴＥＳを含み、前記トキシンが切断されたシュードモナスのエクソトキシンＡ（ＰＥ３８）である、請求項１７ないし２２のいずれかで定義されるケモカイン構築物。
29. 請求項５ないし１２のいずれかで定義される抗体構築物、または請求項１７ないし１９、２３および２４のいずれかで定義されるケモカイン構築物、をエンコードするポリヌクレオチドであって、
    （ａ）　配列番号１８または配列番号２４で表されるポリペプチドを特にエンコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド；
    （ｂ）　配列番号１７または配列番号２３で表される核酸分子を含むポリヌクレオチド；または、
    （ｃ）　（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
30. ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
31. 請求項２９または３０のポリヌクレオチドを含むベクター。
32. 発現ベクターまたは遺伝子移入ベクターである、請求項３１に記載のベクター。
33. 請求項３１または３２のベクターで形質転換された宿主。
34. 請求項３３の宿主を培養し、産生した抗体構築物またはケモカイン構築物を単離することを含む、請求項２９で定義される抗体構築物またはケモカイン構築物を産生する方法。
35. 請求項２９または３０のポリヌクレオチドによりエンコードされる、または請求項３４の方法により産生される、抗体構築物またはケモカイン構築物。
36. 請求項２９のポリヌクレオチド、請求項３１または３２のベクター、請求項３３の宿主、請求項２７または３５の抗体構築物、および／または、請求項２８または３５のケモカイン構築物、を含む組成物。
37. 任意に医薬的に許容されるキャリアー、希釈剤、および／または、賦形剤をさらに含む医薬組成物である、請求項３６に記載の組成物。
38. 免疫障害の処置のための薬剤または抗−ＨＩＶ処置のための薬剤をさらに含む、請求項３６または３７に記載の組成物。
39. 免疫障害を処置、予防および／または緩和するための方法、または霊長類の免疫不全ウイルスに潜伏して感染している細胞を除去するための方法であって、処置、緩和および／または予防を必要とする被験者に請求項３６ないし３８のいずれかに記載の組成物の有効量を投与することを含む方法。
40. 免疫障害を処置、予防および／または緩和するための医薬組成物を調製するための、請求項２９または３０のポリヌクレオチド、請求項３１または３２のベクター、請求項３３の宿主、請求項２７または３５の抗体構築物、および／または、請求項２８または３８のケモカイン構築物の使用。
41. 細胞が霊長類の免疫不全ウイルスに感染しており、潜伏して感染している前記細胞を除去するための医薬組成物を調製するための、請求項２９または３０のポリヌクレオチド、請求項３１または３２のベクター、請求項３３の宿主、請求項２７または３５の抗体構築物、および／または、請求項２８または３８のケモカイン構築物の使用。
42. 前記免疫障害が自己免疫疾患、アレルギー疾患、皮膚疾患、炎症性疾患、糖尿病、対宿主性移植片疾患および移植拒絶反応から成る群より選ばれる、請求項３９の方法または請求項４０の使用。
43. 自己免疫疾患が、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病およびリューマチ性関節炎から成る群より選ばれる、請求項４２の方法または使用。
44. 前記皮膚疾患が、皮膚炎症、アトピー性皮膚炎および乾癬から成る群より選ばれる、請求項４２に記載の方法または使用。
45. 前記炎症性疾患が、炎症関節疾患、炎症性腎疾患、炎症性腸疾患から成る群より選ばれる、請求項４２に記載の方法または使用。
46. 前記炎症性関節疾患が（慢性）関節炎である、請求項４５に記載の方法または使用。
47. 前記霊長類の免疫不全ウイルスによる感染がＨＩＶ−１感染である、請求項３９に記載の方法または請求項４１に記載の使用。
48. 前記組成物が抗ウイルス剤との組み合わせ、および／またはエイズ管理に使用される薬剤との組み合わせで投与される、請求項４７に記載の方法または使用。
49. 前記エイズ管理に使用される薬剤がＨＡＡＲＴに使用される薬剤を含む、請求項４７に記載の方法または使用。
50. 請求項２９または３０のポリヌクレオチド、請求項３１または３２のベクター、請求項３３の宿主、請求項２７または３５の抗体構築物、および／または、請求項２８または３８のケモカイン構築物を含むキット。

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