JP2004321100A

JP2004321100A - VARIANT OF PROTEIN COMPRISING Fc REGION OF IgG

Info

Publication number: JP2004321100A
Application number: JP2003121598A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Akaike; 敏宏赤池; Masato Nagaoka; 正人長岡
Original assignee: Rikogaku Shinkokai
Current assignee: Rikogaku Shinkokai
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2004-11-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a polypeptide variant containing a Fc region of a mouse IgG and improved in affinity for a protein A. <P>SOLUTION: The variant of the protein comprises a Fc region of IgG, and in the variant, one or more amino acid residues of Fc region of natural IgG are substituted with other amino acid residues and affinity for protein A is improved in comparison with the protein containing Fc region of the natural IgG. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテインＡに対して親和性の向上した、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生化学や生物医工学の分野において、モノクローナル抗体の作成及び応用は一般的で有用な方法として普及している。
また、例えば生理活性ペプチドを大量に得るために、目的とするペプチドをコードするＤＮＡ（遺伝子）をＤＮＡ組換え技術を用いて発現させる試みが多く行われている。しかし、ペプチドが発現細胞内のプロテアーゼの作用によって分解を受けやすく、目的とするペプチドが得られないこともあり、そのため、融合タンパク質の形で発現させることがしばしば行われている。
【０００３】
研究対象となるタンパク質を簡単に効率よく入手することは、分子生物学、生化学をはじめ、薬学及び医学等の分野において非常に重要なことであるばかりでなく、生化学産業や製薬産業といった様々な産業において重要なことである。マウスＩｇＧのＦｃ領域と他の機能性タンパク質との融合タンパク質の作成も、多くの生化学的現象の解明に利用されている（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉｅｔａｌ．，１９９８；Ｈｕｙｎｈ−Ｄｏｅｔａｌ．，２００２；Ａｄａｃｈｉｅｔａｌ．，２００２）。
【０００４】
しかし、上記抗体や融合タンパク質の精製には問題があり、最も主要な問題点として、マウスのＩｇＧ、特にＩｇＧ１のプロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来：ＩｇＧのＦｃ領域と親和性がある）に対する親和性が低いことである。ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の多くがＩｇＧ１であり、この問題を解決するため、塩濃度を増加させたり、ｐＨをアルカリ性に調整することが行われている。しかし、このような条件下ではプロテインＡと血清タンパク質等との非特異的な相互作用が問題になる。マウスＩｇＧ１とプロテインＡとの親和性が低いため、融合タンパク質作成にはヒトや他の種のＦｃ領域が用いられることが多い。しかし、生体への薬物等としての応用実験を考えた場合、免疫拒絶や炎症反応などを誘起する可能性が大きい。
従って、マウスＩｇＧ１とプロテインＡとの親和性を向上させることができれば上記問題を解決することができる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉｅｔａｌ．，１９９８；Ｈｕｙｎｈ−Ｄｏｅｔａｌ．，２００２；Ａｄａｃｈｉｅｔａｌ．，２００２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、プロテインＡとの親和性の向上した、マウスＩｇＧのＦｃ領域を含むポリペプチド変異体、及びその製造方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、マウスＩｇＧ１のＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、プロテインＡに対する親和性を向上できるという知見を得た。
【０００８】
すなわち、本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質であって、天然のＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上していることを特徴とする、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体を提供するものである。
【０００９】
ＩｇＧのＦｃ領域はマウス由来のＩｇＧ１であるものが好ましく用いられる。
本発明のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体としては、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の第１５残基から第２２残基、第７５残基から第８３残基、又は第１９５残基から第２０４残基に相当する領域において１又はそれ以上アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているものが挙げられる。
また、本発明のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体としては、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換されているものが挙げられる。本明細書において、ＩｇＧ１のＦｃ領域中のアミノ酸残基の位置を示す番号は、ＣＨ２ドメインから開始するものとして定義する。
また、本発明は、上記タンパク質の変異体をコードする遺伝子を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記遺伝子、又は組換えベクターを保持する形質転換体を培養し、該形質転換体又はその培養上清から、発現させたタンパク質の変異体を回収する工程を含む、上記タンパク質の変異体の製造方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について説明する。
本発明のタンパク質の変異体は、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質であって、天然のＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり、天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上していることを特徴とする。本明細書において、親和性が向上するとは、中性で生理的な塩濃度の緩衝液中におけるＩｇＧ１とプロテインＡとの親和性が向上することを意味する。
【００１２】
本発明の好ましいタンパク質の変異体は、ＩｇＧのＦｃ領域がマウス由来のＩｇＧ１であるものである。本発明の好ましいタンパク質の変異体は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列よりなるタンパク質と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の第１５残基から第２２残基、第７５残基から第８３残基、又は第１９５残基から第２０４残基に相当する領域において、１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。
【００１３】
本発明のタンパク質の変異体の具体例としては、例えば、第１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸、好ましくはメチオニンで置換されているものが挙げられる。
また、他の具体例としては、第２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸、好ましくはセリンで置換されているものが挙げられる。
マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ１及びウサギＩｇＧの第２３１残基から第４４６残基に相当する領域のアミノ酸配列を図１に示す。なお、図１においては、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を基準としており、図１に示すアミノ酸配列における２３４番目のアミノ酸が、本明細書におけるＦｃ領域の開始部である。図１中、四角で囲った部分はＩｇＧ分子とプロテインＡとの相互作用に関与する部分である（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５９：９７５−９８５（１９７８）、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０：２３６１−２３７０（１９８１）、Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ａ．Ｅｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３：２６５−２７８（１９９５）、Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：９−１６（１９９８））。ＩｇＧのアミノ酸配列は動物種やサブタイプによって若干相違するが、プロテインＡとの相互作用領域付近のアミノ酸配列はよく保存されていることがわかる。本発明においては、マウスＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列のプロテインＡとの相互作用領域を、プロテインＡとの親和性の高いヒトＩｇＧ１のアミノ酸残基で置換した。
【００１４】
上述した、「実質的に同一」とは、タンパク質の活性が実質的に同一であることを意味し、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加された場合、その欠失、置換または付加がなされたポリペプチドは、欠失、置換または付加がなされていないものと活性が同一であれば、実質的に同一である。一般的に、相同性の程度が、全体の９０％、好ましくは９５％であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。一般には、アミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるタンパク質は実質的に同一である。すなわち、本発明のタンパク質の変異体は、天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上する限り、更に他のアミノ酸残基の一部が欠失又は置換されていてもよく、他のアミノ酸が付加されていてもよい。
本発明のタンパク質の変異体は、抗体であってもよく、ＩｇＧのＦｃ領域と、他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
ＩｇＧのＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質は、当該技術分野において公知の方法によって製造することができる。
【００１５】
本発明のタンパク質の変異体をコードする遺伝子は、天然のＩｇＧのＦｃ領域をコードする遺伝子において、配列番号１で表わされるアミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号２）を、変異すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することによって構築することができる。
このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、遺伝子に変異を導入する方法としては、例えばＫｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、変異の導入を行うことができる。
このようにして得られた変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主に形質転換する。外来性タンパク質を発現させるための多くのベクター・宿主系は当該技術分野において知られている。
【００１６】
本発明のタンパク質の変異体をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、適当なベクターに、本発明のタンパク質の変異体をコードする遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ１３又はＹＣｐ５０等）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルス等の動物ウイルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が好ましい。
【００１７】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
【００１８】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。
【００１９】
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２０】
大腸菌等の細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００２１】
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２３】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
【００２４】
本発明のタンパク質の変異体は、前記形質転換体を培養し、本発明のタンパク質の変異体を生成、蓄積し、該変態を採取することにより製造することができる。本発明のタンパク質の変異体が蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。
【００２５】
例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鐵、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約１５〜４３℃の温度で約１２〜４８時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約３０〜４０℃の温度で約１２〜１００時間行う。宿主が酵母の場合は、約２０〜３５℃の温度で約２４〜１００時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。ｐＨの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
【００２６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して培養を行う。例えば、Ｔ７プロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＰＴＧ等を培地に添加して培養を行ってもよい。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＡＡ等を培地に添加してもよい。
【００２７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常、５％程度の二酸化炭素の存在下で約３７℃の温度で１〜３０日間行う。
【００２８】
培養後、タンパク質の変異体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質の変異体を生成することができる。
【００２９】
本発明のタンパク質の変異体存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００３０】
本発明のタンパク質の変異体を製造するためには、本発明のタンパク質の変異体を恒常的に発現するトランスジェニック動物を作製し、タンパク質の変異体を製造してもよい。本発明のタンパク質の変異体を恒常的に発現するトランスジェニック動物を作製するためには、適宜の非ヒト哺乳動物を用いることができるが、マウスを用いることが好ましい。トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのマウスとしては、種々のものが利用できるが、例えばＣ５７ＢＬ／６、ＤＡ／２等が挙げられる。本発明のタンパク質の変異体をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを、例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１受精卵に導入することにより、トランスジェニックマウスを作製することができる。
トランスジェニックマウスを作製することにより、トランスジェニックマウスにより作製されたモノクローナル抗体、又は融合タンパク質を製造し、この抗体又は融合タンパク質はプロテインＡによる精製や免疫沈降法など生化学実験の高効率化が期待できる。
【００３１】
本発明のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体は、プロテインＡとの親和性が向上しているため、モノクローナル抗体やマウスＩｇＧのＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質を、より効果的にかつ能率的に精製することが可能となる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等の一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ｅｔａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。
【００３３】
実施例１
ｍｏｕｓｅＩｇＧ１を発現するハイブリドーマｋｕ−ＨＤ−２Ａ（慶応義塾大学理工学部教授星元紀先生より譲渡）を用いた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを調製し、Ｍ−ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写を行ってハイブリドーマのｃＤＮＡを作成した。得られたｃＤＮＡをもとに、配列番号３及び配列番号４で表わされるプライマーを用いて、ＰｗｏＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ法によりマウスＩｇＧ１Ｆｃ領域のｃＤＮＡ（７０８ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲ産物を１％アガロース電気泳動によって分離した後、プレップＡジーンＤＮＡ精製キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ）によってクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、Ｆｃ領域を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｆｃを作成した。作成したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、ＱＩＡＧＥＮカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。シークエンスの確認には、ＬＩ−ＣＯＲｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＧｅｎｅＲａｐｉｄ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
【００３４】
上述のようにして得られたｐＧＥＭ−Ｆｃを鋳型として、ＰＣＲにより変異を導入した。用いたプライマーは以下の通りである（図２、配列番号５〜７）。
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換された変異体（以下、Ｔ２５２Ｍという）を作成するためには、下記プライマーを用いた（配列番号５）。

また、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンで置換されている変異体（以下、Ｔ２５４Ｓという）を作成するためには、下記プライマーを用いた（配列番号６）。

また、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換され、２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンで置換されている変異体（以下、Ｔ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓという）を作成するためには、下記プライマーを用いた（配列番号７）。

【００３５】
部位特異的変異は以下の通りに行った。ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲにより行い、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩにより処理して鋳型ＤＮＡを切断した。反応液で直接形質転換し、ＧｅｎｅＲａｐｉｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（登録商標）により変異を導入した遺伝子配列を確認した。発現ベクターを作成するために、変異を導入したプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断したものに組み込み、それぞれの変異導入プラスミド（Ｔ２５２Ｍ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓ）を作成した。
【００３６】
実施例２
ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に１０％の牛胎児血清を添加して培養した。上述のようにして得られたプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（登録商標）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した培地で２日間培養し、培養後に培地を回収し、遠心により細胞及び残査を除去し、培養上清を回収した。
【００３７】
実施例３
実施例２で回収した培養上清を、ＰＢＳで５ｍｌに希釈し、０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した後、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡｃｏｌｕｍｎを用いて精製した。洗浄には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、溶出には０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．７）を用い、溶出液を１／５量の１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。カラムに吸着しなかった画分、洗浄画分、溶出画分の容量を５ｍｌに合わせ、ウェスタンブロット法により含まれる融合タンパク質を検出した。ウェスタンブロット法は以下のように実施した。
【００３８】
サンプルと等量の２×Ｌａｅｍｍｌｉｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，１．２％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）と混合し、９５℃で５分間加熱してタンパク質を変性させた後、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後のゲルを、ＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にセミドライ法により２０Ｖの定電圧で９０分間転写した。変性されたタンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｂ）中に４℃で２４時間ブロッキングを行った。Ｆｃ部位を確認するためにはｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１／１０，０００希釈液を室温で１．５時間反応させた。検出にはＥＣＬ試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発光させＸ線フィルムに露光した。
【００３９】
ウェスタンブロットの結果を図３に示す。図３において、ｉｎｔａｃｔはカラムに吸着させる前のサンプル、ｔｈｒｏｕｇｈはカラムに吸着しなかった画分、ｗａｓｈは洗浄画分、ｅｌｕａｔｅは溶出画分を意味する。また、ＷＴは、変異させていない融合タンパク質である。
【００４０】
図３に示すように、変異させていない融合タンパク質は、カラムに吸着しなかった画分、及び洗浄画分に存在が確認されたが、溶出画分には全く存在が確認されなかった。すなわち、変異させていない融合タンパク質はプロテインＡとの親和性は低いものである。
Ｔ２５４Ｓにおいては、カラムに吸着しなかった画分には、融合タンパク質は存在がほとんど確認されず、洗浄画分においては存在が確認されたが、溶出画分においても存在が確認された。
【００４１】
Ｔ２５２Ｍ、及びＴ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓにおいては、カラムに吸着しなかった画分、及び洗浄画分には融合タンパク質は存在がほとんど確認されず、溶出画分に存在が確認された。
上記結果より、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５２Ｍ、及びＴ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓは、プロテインＡに対する親和性が、変異させていないものに対して親和性が向上していることがわかる。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明によれば、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質のプロテインＡに対する親和性を向上させることができるので、抗体、融合タンパク質の精製を容易に行うことが可能となる。モノクローナル抗体の多くはＩｇＧ１であり、従来はプロテインＡ等による精製は困難であったが、本発明により、プロテインＡに対する親和性を向上させることができ、プロテインＡによって、容易に精製することができる。
【００４３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】各種のＩｇＧのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】融合タンパク質に変異を導入するために用いたプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】ウェスタンブロットの結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a variant of a protein containing an IgG Fc region, which has improved affinity for protein A.
[0002]
[Prior art]
In recent years, in the fields of biochemistry and biomedical engineering, preparation and application of monoclonal antibodies have become widespread as a general and useful method.
Also, for example, in order to obtain a large amount of a physiologically active peptide, many attempts have been made to express a DNA (gene) encoding a target peptide using a DNA recombination technique. However, peptides are susceptible to degradation by the action of proteases in the expressing cells, and the desired peptide may not be obtained. Therefore, expression is often performed in the form of a fusion protein.
[0003]
It is very important in the fields of molecular biology, biochemistry, pharmacology and medicine, etc., to obtain a protein to be studied easily and efficiently, as well as in various fields such as biochemical industry and pharmaceutical industry. It is important in various industries. The creation of fusion proteins between the Fc region of mouse IgG and other functional proteins has also been used to elucidate many biochemical phenomena (eg, Monfardini et al., 1998; Huynh-Do et al., 2002). Adachi et al., 2002).
[0004]
However, there is a problem in the purification of the above-mentioned antibodies and fusion proteins, and the most significant problem is the affinity for mouse IgG, particularly IgG1 protein A (derived from Staphylococcus aureus: having an affinity for the IgG Fc region). It is low. Most of the monoclonal antibodies produced by hybridomas are IgG1, and in order to solve this problem, the salt concentration is increased or the pH is adjusted to alkaline. However, under such conditions, non-specific interaction between protein A and serum proteins becomes a problem. Due to the low affinity between mouse IgG1 and protein A, fusion proteins are often prepared using human or other species of Fc regions. However, when an application experiment as a drug or the like to a living body is considered, there is a great possibility that an immune rejection or an inflammatory reaction is induced.
Therefore, if the affinity between mouse IgG1 and protein A can be improved, the above problem can be solved.
[0005]
[Non-patent document 1]
Monfardini et al. Huynh-Do et al., 1998; Adachi et al., 2002; , 2002
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a polypeptide variant containing an Fc region of mouse IgG, which has improved affinity for protein A, and a method for producing the same.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, improved the affinity for protein A by substituting one or more amino acid residues in the Fc region of mouse IgG1 with another amino acid residue. I learned that I can do it.
[0008]
That is, the present invention has been made based on the above findings, and is a protein containing an IgG Fc region, wherein one or more amino acid residues of the natural IgG Fc region are substituted with other amino acid residues. A variant of a protein containing an IgG Fc region, wherein the variant has improved affinity for protein A as compared to the protein containing the native IgG Fc region. Things.
[0009]
As the IgG Fc region, one that is mouse-derived IgG1 is preferably used.
Variants of the protein containing the IgG Fc region of the present invention include residues 15 to 22; residues 75 to 83; and residues 195 of the Fc region of mouse-derived IgG1. In the region corresponding to residue 204, one or more amino acid residues are substituted with another amino acid residue.
In addition, examples of mutants of the protein containing the IgG Fc region of the present invention include those in which the amino acid residue corresponding to threonine at position 19 in the Fc region of mouse-derived IgG1 is substituted with methionine. In the present specification, the numbers indicating the positions of amino acid residues in the Fc region of IgG1 are defined as starting from the CH2 domain.
The present invention also provides a gene encoding a mutant of the above protein.
[0010]
The present invention also provides a recombinant vector containing the above gene.
The present invention also provides a transformant transformed with the above recombinant vector.
The present invention also provides a method for culturing a transformant carrying the gene or the recombinant vector, and recovering the expressed protein mutant from the transformant or a culture supernatant thereof. A method for producing a mutant of
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described.
A variant of the protein of the present invention is a protein comprising an IgG Fc region, wherein one or more amino acid residues of the native IgG Fc region are substituted with other amino acid residues, Characterized in that its affinity for protein A is improved as compared to a protein containing an IgG Fc region. As used herein, improving affinity means improving the affinity between IgG1 and protein A in a buffer having a neutral physiological salt concentration.
[0012]
A preferred variant of the protein of the present invention is one in which the IgG Fc region is mouse-derived IgG1. A preferred variant of the protein of the present invention is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 from residues 15 to 22 and residues 75 to In the region corresponding to the 83rd residue or the 195th to the 204th residues, one or more amino acid residues are substituted with other amino acid residues.
[0013]
Specific examples of mutants of the protein of the present invention include, for example, those in which the amino acid residue corresponding to the thirteenth threonine is replaced with another amino acid, preferably methionine.
Another specific example is one in which the amino acid residue corresponding to the thirteenth threonine is substituted with another amino acid, preferably serine.
FIG. 1 shows the amino acid sequence of a region corresponding to residues 231 to 446 of mouse IgG1, mouse IgG2a, mouse IgG2b, human IgG1, and rabbit IgG. In FIG. 1, the amino acid sequence of human IgG1 is used as a reference, and the 234th amino acid in the amino acid sequence shown in FIG. 1 is the start of the Fc region in the present specification. In FIG. 1, a portion surrounded by a square is a portion involved in the interaction between an IgG molecule and protein A (Deisenhofer, J. et al. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359: 975-985 ( 1978), Deisenhofer, J. Biochemistry 20: 2361-2370 (1981), Sauer-Eriksson, AE et al. Structure 3: 265-278 (1995), Brown, N.L. (1998)). Although the amino acid sequence of IgG slightly differs depending on the animal species and subtype, it is understood that the amino acid sequence near the interaction region with protein A is well conserved. In the present invention, the interaction region with protein A in the amino acid sequence of the Fc region of mouse IgG1 was replaced with an amino acid residue of human IgG1 having high affinity for protein A.
[0014]
As described above, the term “substantially the same” means that the activities of the proteins are substantially the same, and when some amino acids are deleted, substituted or added, the deletion, substitution or addition is performed. The polypeptides made are substantially identical if they have the same activity as those without deletion, substitution or addition. Generally, proteins having an amino acid sequence with a degree of homology of 90%, preferably 95% of the total are taken to be substantially identical. In general, a protein consisting of an amino acid in which a part (preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and most preferably several) of amino acids in the amino acid sequence is deleted, substituted or added is substantially Identical. That is, the mutant of the protein of the present invention may further have a part of another amino acid residue deleted or substituted as long as the affinity for protein A is improved as compared with the protein containing the Fc region of natural IgG. Or another amino acid may be added.
The mutant of the protein of the present invention may be an antibody or a fusion protein of the Fc region of IgG and another protein.
A fusion protein of the IgG Fc region and another protein can be produced by a method known in the art.
[0015]
The gene encoding the mutant of the protein of the present invention is a gene encoding the Fc region of natural IgG, the amino acid to be mutated from the nucleotide sequence encoding the amino acid residue represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2). It can be constructed by substituting the residue with a nucleotide sequence encoding the same.
Various methods for such site-specific nucleotide sequence substitution are known in the art. For example, as a method for introducing a mutation into a gene, a known method such as the Kunkel method or the Gapped double method or a method similar thereto can be employed. For example, the mutation can be introduced using a mutagenesis kit (Mutant-K (manufactured by TAKARA) or Mutant-G (manufactured by TAKARA)) utilizing site-directed mutagenesis.
The mutant gene thus obtained is inserted into a vector for gene expression (for example, a plasmid) and transformed into a suitable host. Many vector-host systems for expressing foreign proteins are known in the art.
[0016]
The recombinant vector containing the DNA encoding the mutant of the protein of the present invention can be prepared according to a method known in the art. For example, it can be obtained by ligating (inserting) a gene encoding a mutant of the protein of the present invention into an appropriate vector. The vector is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and includes, for example, plasmid DNA, phage DNA and the like.
This is carried out by cutting out a DNA fragment containing the DNA encoding the protein of the present invention, and ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC118 or pBluescript), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5 or pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15, Bacteriophages such as YEp13 or YCp50), λ phage and the like, and animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus and baculovirus can be used. As the promoter used in the present invention, any promoter may be used as long as it is an appropriate promoter corresponding to a host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, T3 promoter, araBAD promoter, etc., and when the host is Bacillus sp. Promoter, XYL promoter, HWP promoter, CWP promoter, etc., when the host is Bacillus subtilis, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc., and when the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH Promoters and the like are preferred. When animal cells are used as hosts, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. When an insect cell is used as a host, a polyhedrin promoter, an Op1E2 promoter and the like are preferable.
[0017]
In addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like known in the art may be added to the expression vector, if desired. be able to. Further, if necessary, the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein (eg, glutathione S-transferase and protein A). Such a fusion protein can be cleaved using a site-specific protease and separated into respective proteins.
[0018]
Examples of the host cell include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like. Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 30). 1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), DH5α, and JM109. Examples of Bacillus bacteria include Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)], and Bacillus brevis. Used. Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombiCiSpiC20PiCiNsPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiCiPiCiPiCiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiCiPiBiCiPiCiPiBiCiPiBiCiPi)) Polymorpha (Hansenula polymorpha) or the like is used. Examples of animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell), mouse L Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, HEK293 cells and the like are used.
[0019]
Transformation of the host cells described above can be performed according to methods known in the art. For example, the following literature describes a method for transforming a host cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978); Cell Engineering Annex 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha); and Virology, 52, 456 (1973).
[0020]
The method for introducing a recombinant vector into a bacterium such as Escherichia coli is not particularly limited as long as it can introduce DNA into the bacterium. For example, a method using calcium ions (Cohen, SN et al.) Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110 (1972), electroporation method and the like.
When yeast is used as a host, the method of introducing the recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it can introduce DNA into yeast. For example, electroporation, spheroplast, lithium acetate And the like.
[0021]
When an animal cell is used as a host, the method for introducing the recombinant vector into the animal cell is not particularly limited as long as the method can introduce DNA into the animal cell, and examples thereof include an electroporation method, a calcium phosphate method, and lipofection. And the like.
[0022]
When an insect cell is used as a host, the method for introducing the recombinant vector into the insect cell is not particularly limited as long as the method can introduce DNA into the insect cell. For example, the calcium phosphate method, lipofection method, electroporation And the like.
[0023]
As a method for confirming whether or not the gene has been integrated into the host, for example, a PCR method, a Southern hybridization method, a Northern hybridization method, or the like can be used. For example, DNA is prepared from the transformant, DNA-specific primers are designed, and PCR is performed. PCR is performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid. Next, the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or capillary electrophoresis, stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and then the amplification product is detected as a single band and transformed. You can confirm that. PCR may be performed using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect amplification products. Furthermore, a method of binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and then confirming the amplification product using fluorescence or an enzyme reaction can also be used.
[0024]
The mutant of the protein of the present invention can be produced by culturing the transformant, producing and accumulating the mutant of the protein of the present invention, and collecting the metamorphosis. The accumulation of the protein mutant of the present invention means not only the culture supernatant but also any of cultured cells or cultured cells, or crushed cells or cells. In the present invention, the method for culturing the transformant is not particularly limited, and may be a usual method used in culturing a host.
[0025]
For example, when the host is a microorganism such as Escherichia coli or yeast, the culture medium for culturing the transformant contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be utilized by the microorganism, and efficiently cultivates the transformant. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used. Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch; organic acids such as acetic acid and propionic acid; and alcohols such as ethanol and propanol. Examples of the nitrogen source include ammonium, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, and the like. Can be Examples of the inorganic substance include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. The cultivation is usually performed under aerobic conditions such as infiltration culture or aeration and stirring culture. When the host is Escherichia coli, the culture is performed at a temperature of about 15 to 43 ° C. for about 12 to 48 hours. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the reaction is carried out at a temperature of about 30 to 40 ° C. for about 12 to 100 hours. When the host is yeast, the reaction is performed at a temperature of about 20 to 35 ° C. for about 24 to 100 hours. In addition, ventilation or stirring can be added as necessary. When the pH needs to be adjusted, the adjustment is performed using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
[0026]
When culturing a transformant transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, culturing is performed by adding an inducer to the medium as necessary. For example, in the case of an expression vector using a T7 promoter, culturing may be performed by adding IPTG or the like to a medium. In the case of an expression vector using a trp promoter inducible with indoleacetic acid (IAA), IAA or the like may be added to the medium.
[0027]
When culturing a transformant obtained using animal cells as a host, examples of the medium to be used include commonly used RPMI1640 medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums. The cultivation is usually performed in the presence of about 5% carbon dioxide at a temperature of about 37 ° C. for 1 to 30 days.
[0028]
When the mutant protein is produced in the cells or cells after the culture, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freezing. After disrupting cells or cells by thawing or the like, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration may be used. The buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark). When the protein is secreted into the culture solution, after the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected. The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. That is, for example, by using ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like alone or in an appropriate combination, a mutant of the target protein can be produced.
[0029]
The presence of the mutant of the protein of the present invention can be measured by various binding assays, enzyme immunoassays using specific antibodies, and the like.
[0030]
In order to produce a mutant of the protein of the present invention, a transgenic animal that constantly expresses the mutant of the protein of the present invention may be prepared to produce a mutant of the protein. In order to produce a transgenic animal that constantly expresses the mutant of the protein of the present invention, an appropriate non-human mammal can be used, but a mouse is preferably used. Various mice can be used as a mouse for producing a transgenic non-human mammal, and examples thereof include C57BL / 6 and DA / 2. A transgenic mouse can be produced by introducing an expression vector into which a gene encoding a mutant of the protein of the present invention has been introduced into, for example, a (C57BL / 6 × DBA / 2) F1 fertilized egg.
By producing transgenic mice, monoclonal antibodies or fusion proteins produced by the transgenic mice are produced, and this antibody or fusion protein is expected to improve the efficiency of biochemical experiments such as protein A purification and immunoprecipitation. it can.
[0031]
Since the variant of the protein containing the Fc region of IgG of the present invention has improved affinity for protein A, it is possible to use a monoclonal antibody or a fusion protein of the Fc region of mouse IgG with another protein more effectively. And it becomes possible to purify efficiently.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It goes without saying that the scope of the present invention is not limited to such examples. In addition, methods necessary for general gene recombination such as DNA cutting, ligation, transformation of E. coli, determination of base sequence of a gene, hybridization, etc. are attached to commercially available reagents, mechanical devices, etc. used for each operation. Basic instructions were followed in accordance with the instruction manual and the experimental manual (for example, "Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)").
[0033]
Example 1
Hybridoma ku-HD-2A expressing mouse IgG1 (transferred from Professor Nori Hoshimoto, Professor, Faculty of Science and Technology, Keio University) was used. MRNA was prepared using TRIzol reagent (Invitrogen), and reverse-transcribed using M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen) to prepare a hybridoma cDNA. Based on the obtained cDNA, a cDNA (708 bp) of mouse IgG1 Fc region was amplified by PCR using primers represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and Pwo DNA polymerase. After separating the PCR product by 1% agarose electrophoresis, the product was purified using Prep A Gene DNA Purification Kit (Bio-Rad), and DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa) was incorporated into the cloning vector pGEM-T easy (Promega) to prepare a plasmid pGEM-Fc containing an Fc region. Escherichia coli was transformed with the prepared plasmid vector, and the plasmid was purified using a QIAGEN column (QIAGEN). The LI-COR sequencer and Gene Rapid (Amersham Biosciences) were used to confirm the sequence.
[0034]
Mutations were introduced by PCR using pGEM-Fc obtained as described above as a template. The primers used are as follows (FIG. 2, SEQ ID NOS: 5-7).
The following primer was used to prepare a mutant (hereinafter referred to as T252M) in which the amino acid residue corresponding to threonine at position 19 in the Fc region of mouse-derived IgG1 was replaced with methionine (SEQ ID NO: 5).

The following primers were used to prepare a mutant in which the amino acid residue corresponding to threonine at position 21 in the Fc region of mouse-derived IgG1 was substituted with serine (hereinafter, referred to as T254S) (SEQ ID NO: 2). 6).

In addition, a mutant in which the amino acid residue corresponding to the 19th threonine in the Fc region of mouse-derived IgG1 has been substituted with methionine, and the amino acid residue corresponding to the 21st threonine has been substituted with serine (hereinafter referred to as T252M- T254S), the following primers were used (SEQ ID NO: 7).

[0035]
The site-specific mutation was performed as follows. PCR was performed using Pfu Turbo® DNA polymerase, and the PCR product was treated with DpnI to cleave the template DNA. Transformation was performed directly with the reaction solution, and the gene sequence into which the mutation was introduced was confirmed by Gene Rapid DNA sequencer (registered trademark). In order to prepare an expression vector, the plasmid into which the mutation was introduced was digested with Hind III and Not I, and the resulting fragment was incorporated into each of the plasmids (T252M, T254S, T252M-T254S).
[0036]
Example 2
CHO-K1 cells were cultured by adding 10% fetal bovine serum to Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM). The plasmid obtained as described above was introduced into CHO-K1 cells using lipofectamine reagent (registered trademark), and cultured in a medium supplemented with 400 μg / ml G418 for 2 days. After the culture, the medium was collected and centrifuged. To remove the cells and residue, and collect the culture supernatant.
[0037]
Example 3
The culture supernatant collected in Example 2 was diluted to 5 ml with PBS, passed through a 0.22 μm syringe filter (Millipore), and then purified using rProtein A column. A 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) was used for washing, a 0.1 M sodium citrate solution (pH 2.7) was used for elution, and the eluate was diluted with 1/5 volume of 1 M Tris-HCl (pH 9.5). Neutralized with 0). The volume of the fraction not adsorbed to the column, the washed fraction, and the eluted fraction were adjusted to 5 ml, and the contained fusion protein was detected by Western blotting. Western blotting was performed as follows.
[0038]
The sample was mixed with an equal volume of 2 × Laemmli sample buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 1.2% β-mercaptoethanol, 20% glycerol), and heated at 95 ° C. for 5 minutes to mix protein. Was denatured and then separated by 7.5% SDS-PAGE. The gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane (Immobilon P: Millipore) at a constant voltage of 20 V for 90 minutes by a semi-dry method. The PVDF membrane onto which the denatured protein was transferred was washed with PBS (PBS-T) containing 0.1% Tween-20 (registered trademark), and PBS-T (PBS-T) containing 5% (W / V) BSA dissolved therein. Blocking was performed during 24 hours at 4 ° C in B). To confirm the Fc site, a 1 / 10,000 dilution of peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody (Jackson Immunoresearch Laboratories) was reacted at room temperature for 1.5 hours. For detection, light was emitted using an ECL reagent (Amersham Biosciences) and the film was exposed to an X-ray film.
[0039]
The results of the Western blot are shown in FIG. In FIG. 3, intact means a sample before adsorbing to the column, through means a fraction not adsorbed to the column, wash means a washed fraction, and elute means an eluted fraction. WT is an unmutated fusion protein.
[0040]
As shown in FIG. 3, the presence of the unmutated fusion protein was confirmed in the fraction not adsorbed to the column and in the washed fraction, but was not confirmed in the eluted fraction at all. That is, the unmutated fusion protein has low affinity for protein A.
In T254S, the presence of the fusion protein was hardly confirmed in the fraction not adsorbed to the column, and the presence was confirmed in the washed fraction, but also in the eluted fraction.
[0041]
In T252M and T252M-T254S, almost no fusion protein was found in the fraction not adsorbed to the column and in the washed fraction, and the presence of the fusion protein was confirmed in the eluted fraction.
From the above results, it can be seen that T254S, T252M, and T252M-T254S have improved affinity for protein A with respect to unmutated ones.
[0042]
【The invention's effect】
As described in detail above, according to the present invention, the affinity of a protein containing the Fc region of IgG for protein A can be improved, so that antibodies and fusion proteins can be easily purified. Most of the monoclonal antibodies are IgG1, which has been conventionally difficult to purify using protein A or the like. However, according to the present invention, the affinity for protein A can be improved, and purification can be easily performed using protein A. .
[0043]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequences of various IgGs.
FIG. 2 is a view showing a base sequence of a primer used for introducing a mutation into a fusion protein.
FIG. 3 shows the results of Western blot.

Claims

A protein comprising the IgG Fc region, wherein one or more amino acid residues of the native IgG Fc region are substituted with other amino acid residues, and the protein comprises the native IgG Fc region. A variant of a protein containing an IgG Fc region, which has an improved affinity for protein A as compared with the protein.

The protein variant according to claim 1, wherein the IgG Fc region is a mouse-derived IgG1.

One or more amino acid residues in a region corresponding to residues 15 to 22; residues 75 to 83; or residues 195 to 204 of the Fc region of mouse-derived IgG1 3. The variant of the protein according to claim 2, wherein is substituted with another amino acid residue.

The variant of the protein according to claim 3, wherein an amino acid residue corresponding to threonine at position 19 in the Fc region of mouse-derived IgG1 has been substituted with another amino acid residue.

The mutant protein according to claim 3, wherein the amino acid residue corresponding to threonine at position 19 in the Fc region of mouse-derived IgG1 has been substituted with methionine.

The variant of the protein according to claim 3, wherein the amino acid residue corresponding to threonine at position 21 in the Fc region of mouse-derived IgG1 has been substituted with another amino acid residue.

The variant of the protein according to claim 3, wherein the amino acid residue corresponding to threonine at position 21 in the Fc region of mouse-derived IgG1 is substituted with serine.

The protein according to claim 3, wherein an amino acid residue corresponding to threonine at position 19 and an amino acid residue corresponding to threonine at position 21 in the Fc region of mouse-derived IgG1 have been substituted with another amino acid residue. Mutant.

The protein according to claim 3, wherein the amino acid residue corresponding to threonine at position 19 in the Fc region of mouse-derived IgG1 is substituted with methionine, and the amino acid residue corresponding to threonine at position 21 is substituted with serine. Mutant.

A gene encoding a mutant of the protein according to any one of claims 1 to 9.

A recombinant vector containing the gene according to claim 10.

A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 11.

A step of culturing a transformant carrying the gene according to claim 10 or the recombinant vector according to claim 11, and collecting a mutant of the expressed protein from the transformant or a culture supernatant thereof. The method for producing a mutant of the protein according to any one of claims 1 to 9, comprising: