JP2003533177A - 新規ＰＲＯＳＴ−ＥｔｓポリペプチドをコードするＤＮＡ - Google Patents

新規ＰＲＯＳＴ−ＥｔｓポリペプチドをコードするＤＮＡ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと呼ばれる新規の転写因子ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドの製造方法、発現ベクターおよびポリペプチドの発現のための遺伝子工学処理細胞に関する。本発明はさらに、調査、診断および治療的用途におけるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの利用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 産業上の利用分野 本発明は、一部は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体および誘導体、ポリヌクレオチド
およびポリペプチドならびにそれらの変異体および誘導体の製造方法、ポリペプ
チドに対して向けられる抗体、それらの変異体および誘導体、ならびにポリヌク
レオチド、ポリペプチド、変異体、誘導体および抗体の使用に関する。特にこれ
らのおよびその他の点では、本発明は、新規のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド
、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリペプチド
に向けられる抗体およびＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現を遮断するアンチセンスポリヌ
クレオチドに関する。 発明の背景 前立腺癌は、男性にしばしば発生する疾患であって、45歳以上の男性の約3分
の1に見出される。遺伝的および環境的原因の両方に対する証拠が認められ、大
多数の症例が、恐らくは両因子の組合せの結果である。よく知られている癌の研
究は、遺伝的素質が全前立腺がんの約5〜10％において、そして55歳より若い男
性における症例の約45％において一役を演じすることを示唆した。
【０００２】 前立腺癌は多段階疾患として発症するという証拠があり、前駆体病変の１つは
前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）である。疾患の初期段階はアンドロゲン依存性であ
るが、一方後期段階はホルモンとは無関係である。良性前立腺過形成として既知
の前立腺の増殖性障害がしばしば臨床的に検出されるが、しかし恐らくは癌の発
症における段階ではない。しかしながらそれはしばしば前立腺癌に関連する。前
立腺における癌は、しばしば多病巣性であり、一般的に徐々に増殖し、不均質性
である。後期癌はしばしばリンパ節に、そして骨に転移する。
【０００３】 前立腺癌は通常は、身体検査により、ならびに血清レベルの前立腺特異的抗原
（ＰＳＡ）により診断される。根治的前立腺切除は、限局性疾患に対して選択さ
れる治療である。進行性転移性疾患は、精巣摘出またはＧｎＲＨ（ゴナドトロピ
ン放出ホルモン）による治療により、ならびに抗アンドロゲン療法により誘導さ
れるアンドロゲン除去により一般に処置される。しかしながら進行した疾患はほ
とんど変わらずにホルモン耐性になり、進行性疾患のための治癒法はない。さら
に根治的前立腺切除およびアンドロゲン除去療法の両方に伴う重篤な副作用が存
在する。これらの例としては、根治的前立腺切除に関連した失禁および不能、な
らびにアンドロゲン除去療法に関連した骨折および骨粗鬆症の高い危険性が挙げ
られる。
【０００４】 したがって初期および後期段階前立腺癌に対する新しい治療的アプローチが大
いに必要とされる。治療オプションに有意に影響を及ぼすので、新しい診断薬、
特に疾患の段階を識別し得る作用物質に対する有意の必要性も存在する。例えば
疾患が前立腺以外に進行し、リンパ節に転移していた場合には、根治的前立腺切
除は、進行に影響を及ぼさず、有意の望ましくない副作用を生じる恐れがあるの
で、行なわれない。転移をin vivoで検出し得る作用物質は、多大の有益性を有
する。
【０００５】 特定のタンパク質の発現における変化は前立腺癌において実証されており、そ
の例としては、後期前立腺癌における異常ｐ５３発現、ＴＧＦ−β受容体のレベ
ル低減、Ｅ−カドヘリン、Ｃ−ＣＡＭ（細胞付着分子）およびいくつかのインテ
グリンのレベル低減が挙げられる。癌遺伝子ｂｃｌ−２の発現は、後期アンドロ
ゲン非依存性腫瘍において顕著に増大され、高レベルのｂｃｌ−２を発現する患
者に関する予後は相対的に好ましくない。遺伝子発現における前記の変化は十分
に実証されているが、しかし疾患に対する原因として作用することが実証された
発現の変化は確認されていない。したがってその発現が前立腺腫瘍の存在または
発症に結び付けられる新規のタンパク質を同定することは有用であり、これは前
立腺癌の診断および治療のための分子標的として役立ち得る。
【０００６】 本発明は、Ｅｔｓファミリーのタンパク質と同族体である新規の転写因子を開
示する。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと呼ばれるこの同族体は他の組織と比較して前立腺
および乳房組織に示差的に発現され、そして前立腺癌、乳癌および卵巣癌におい
て過剰発現され得る。本発明は、腫瘍細胞中のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓのレベルを低
減し、それによりそれらの増殖を抑制する作用物質も開示する。したがってこの
ような作用物質は、前立腺、乳房、卵巣およびその他の癌に対する有益な治療薬
であり得る。
【０００７】 Ｅｔｓ遺伝子のファミリーは、高度保存ＤＮＡ結合ドメインであるＥｔｓドメ
インを共有する転写因子をコードする。最初のＥｔｓ遺伝子は元は、Ｅ２６ニワ
トリ白血球ウイルスゲノムにおけるウイルス癌遺伝子として同定されたものであ
り、ショウジョウバエからヒトまでの生物に亘る多数の細胞相同体が同定されて
いる。今日、少なくとも30の異なるＥｔｓ遺伝子が脊椎動物で既知である。増殖
、形質転換、分化およびアポトーシスの調節におけるＥｔｓタンパク質に関する
重要な役割が確認されている（Dittmar and Nordheim, Biochem. Biophys. Acta
1377:F1-F11, 1988）。
【０００８】 構造的に、Ｅｔｓタンパク質は、約85のアミノ酸で構成される高度保存ＤＮＡ
結合ドメインであるＥｔｓドメインにより特性化される。このＥｔｓドメインは
、ウイングド・へリックス−ターン−へリックス組のＤＮＡ結合タンパク質との
構造類似性を保有する。Ｅｔｓドメインは、今日まで研究されてきた全てのＥｔ
ｓ調節化プロモーター中に見出されるコア認識モチーフ５‘−ＧＧＡ（Ａ／Ｔ）
−３’と結合する。コア認識モチーフとフランキングするＤＮＡにおけるヌクレ
オチド結合に関するさらに別の選択が存在する。しかしながらＤＮＡ認識より上
およびそれを超える制御のレベルがＥｔｓタンパク質に関して存在し、これらの
レベルは個々のＥｔｓタンパク質の特定作用を介在することが必要とされる、と
いうことは明らかである（Graves and Petersen, Adv. In Cancer Res. 75:1-5
4, 1998）。
【０００９】 Ｅｔｓドメインはタンパク質のＮ末端近く、中心領域またはＣ末端近くに見出
され得る。多数のＥｔｓ遺伝子中に見出された第二ドメインは、ＰＮＴとして既
知の別の高度保存ドメイン、またはポインテッドドメインをコードする。ポイン
テッドドメインは、通常は異種性を有するタンパク質−タンパク質相互作用にお
いて機能する。ＰＮＴドメイン（およびその他のドメイン）を介したタンパク質
−タンパク質相互作用は、パートナータンパク質の選択的ＤＮＡ結合を通して、
プロモーターに対するＥｔｓタンパク質の特異性および親和性を有意に強化し得
る。転写活性ドメイン（ＴＡＤ）は多数のＥｔｓタンパク質において同定されて
おり、種々の異なるメカニズムがこのファミリーにおける転写活性化の媒介に関
して確認された。転写活性化および抑制の両方がある種のＥｔｓタンパク質に関
して見出された、ということに留意すべきである。
【００１０】 Ｅｔｓファミリーの転写因子は、多数のシグナル伝達経路に対する核標的とし
て同定された。増殖因子シグナリング経路は、小ＧＴＰ結合タンパク質を介して
作用し、下流キナーゼを刺激し、これが最後にはマイトジェン活性化タンパク質
（ＭＡＰ）キナーゼを活性化する。いくつかのＥｔｓタンパク質は、ＭＡＰキナ
ーゼのための基質であり、セリンおよびトレオニン残基でのリン酸化を引き起こ
すことが示されている。このようなリン酸化は、Ｅｔｓタンパク質による転写活
性化を強化することが報告されている（Wasylyk et al., TIBS 23:213-216, 199
8）。
【００１１】 Ｅｔｓタンパク質活性を調節する別のメカニズムは、ＤＮＡ結合を負に調節す
るＥｔｓドメインにフランキングする抑制配列による自己抑制によっている。こ
の現象はいくつかのＥｔｓタンパク質に関して定義されており、Ｅｔｓ機能が脱
抑制により調整され得る方法の１つを構成する。これは、Ｅｔｓ活性化因子の分
子作用をも説明し得る。
【００１２】 Ｅｔｓ遺伝子座を包含する染色体転座は多数の癌において見出される。これら
の例としては、ユーイング肉腫の85％の転座が挙げられる。急性骨髄性白血病、
慢性骨髄単球性白血病およびリンパ芽球性白血病を引き起こすその他の転座が実
証されている（Rabbits, Nature 372:143, 1994；Look, Science, 278:1059-106
4, 1997）。
【００１３】 ２つのヒト転写因子であるＥｔｓ−１およびＥｔｓ−２の発現は、多数の肉腫
および癌腫細胞株における腫瘍形成性に、ならびに侵襲に直接結び付けられてい
る。優性陰性形態のＥｔｓ−１およびＥｔｓ−２を用いた試験は、Ｅｔｓファミ
リー成員が哺乳類癌におけるウロキナーゼプラスミノーゲン活性剤（ｕＰＡ）活
性、細胞運動性および侵襲の制御に関与することを実証した。Ｅｔｓ−１活性は
、胃および膵臓癌における腫瘍形成性とも相関した（Vandenbunder et al., Inv
asion and Metastasis 14:198-209, 1994）。ＥＧＦおよびＦＧＦを含めた増殖
因子はＥｔｓ−１およびＥｔｓ−２発現を促進して、他の転写因子とともにＥｔ
ｓタンパク質によりｕＰＡおよびマトリックスメタロプロテイナーゼプロモータ
ーの活性化をもたらす（Chen et al., Cancer Res. 57:2009-2013, 1997）。
【００１４】 前立腺癌の場合、隣接組織における発現と比較した場合、高レベルのＥｔｓ−
２転写が原発性腫瘍で検出されている。これは前立腺癌細胞株においても見出さ
れている。Ｅｔｓ−２に対して標的化されたアンチセンス分子は、優性陰性Ｅｔ
ｓ−２突然変異対タンパク質の場合と同様に、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞株に
おいて寒天中のコロニー形成を低減する。侵襲性遺伝子の調節におけるアンドロ
ゲン受容体およびＥｔｓタンパク質間の相互作用を実証する前立腺細胞における
さらに別の報告がある。これらの相互作用は、前立腺腫瘍細胞増殖のアンドロゲ
ン調節において重要であり得る（Zang et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 94:
5673-5678, 1997）。Ｅｔｓ結合部位およびホルモン応答素子は、maspin遺伝子
のプロモーターにおいて同定されている。これは、前立腺および乳房で発現され
る腫瘍抑制プロテアーゼ阻害剤である。Ｅｔｓタンパク質によるその調節は、こ
れも腫瘍形成過程における転写因子のこのファミリーと関係がある（Sementchen
ko et al., Oncogene 17:2883-2888, 1998；Oettgen et al., J. Biol. Chem. 2
75:1216-1225, 2000）。
【００１５】 腫瘍形成におけるＥｔｓタンパク質の役割を支持する豊富な証拠にかんがみて
、前立腺および乳房で発現される（そして同様に前立腺癌、乳癌および卵巣がん
において増大される）新規のＥｔｓタンパク質の同定は、前立腺および乳癌の診
断および治療に重要な関連を有する。 発明の要約 本発明は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓとして本明細書中で呼ばれる新規の転写因子を
独自にコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペ
プチドは、アミノ酸１３１〜２１３でタンパク質−タンパク質相互作用に関与す
るポインテッドドメイン、アミノ酸２４６〜３３２でＤＮＡ結合に関与するＥｔ
ｓドメインにより特性化されるが、その両方が、タンパク質のＥｔｓファミリー
に特徴的な一般構造である。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓは、転写因子のＥｔｓファミリ
ーのいくつかの成員との相同性を示し、８７を上回るアミノ酸でショウジョウバ
エＥｔｓ−４とおよそ74％の相同を有する。ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓと本明細書で呼
ばれ、図１（配列番号１）で本明細書中に記載されているポリヌクレオチド配列
は、図２（配列番号２）で示されるＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに対するアミノ酸配列を
コードする。
【００１６】 これらの、そしてその他の目的に対して、とりわけ、図２（配列番号２）に記
述されたアミノ酸配列とその他のＥｔｓ様転写因子ポリペプチドの既知のアミノ
酸配列との間の相同により新規のＥｔｓ様転写因子として同定されたポリペプチ
ドを提供することは、本発明の一目的である。
【００１７】 さらにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特にＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓと本明細書中で呼ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供することは、本発明のさらに別の目的である。
【００１８】 本発明のこの局面にしたがって、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含めた
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓをコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、本発明のこ
の局面のさらに別の実施態様では、生物学的、診断的、臨床的または治療的に有
用なそれらの変異体、類似体または誘導体、あるいはそれらの断片、例えば変異
体、類似体および誘導体の断片が提供される。
【００１９】 本発明のこの局面の特に好ましい実施態様は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと本明細書
中で呼ばれるポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドの天然対立遺
伝子変異体である。
【００２０】 本発明のこの局面にしたがって、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと本明細書中で呼ばれる
ヒト起源の新規のポリペプチド、ならびに生物学的、診断的または治療的に有用
なそれらの断片、変異体および誘導体、断片の変異体および誘導体、そして前記
のものの類似体が提供される。
【００２１】 本発明のこの局面の特に好ましい実施態様は、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレ
オチドの天然対立遺伝子変異体によりコードされるＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの変異体
である。
【００２２】 前記のポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体および誘導体、変異体および
誘導体の断片、ならびに前記のものの類似体の製造方法を提供することは、本発
明の別の目的である。本発明のこの局面の好ましい実施態様では、前記のＰＲＯ
ＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの製造方法であって、宿主中でのヒトＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓの発現のための条件下で外因的に得られたＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓコードポリヌ
クレオチドをその中に発現可能的に組入れた宿主細胞を培養し、次に発現ポリペ
プチドを回収することを包含する方法が提供される。
【００２３】 本発明の別の目的にしたがって、とりわけ調査、生物学的、臨床的および治療
的目的のために前記のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する生成物、
組成物、過程および方法が提供される。
【００２４】 本発明のこの局面のある種の好ましい実施態様にしたがって、とりわけＰＲＯ
ＳＴ−ＥｔｓポリペプチドまたはＰＲＯＳＴ−ＥｔｓコードｍＲＮＡを確定し、
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに関する遺伝子中の遺伝的変異および異常、例えば欠陥を検
定することにより、細胞中のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現を査定するための生成物、
組成物および方法が提供される。
【００２５】 本発明のこのおよびその他の局面のある種の好ましい実施態様にしたがって、
ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするプローブが提供
される。
【００２６】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドまたはそれらの断片に関して高度に選択的で
あり、そして前立腺癌に関連し得るＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現の診断および／また
は検出のための方法に用いられ得る抗体を提供することは、本発明のさらなる目
的である。本発明のこの局面のある種の好ましい実施態様にしたがって、抗体は
、検出可能シグナルを生じるような方法で標識される。特に好ましいのは、放射
性標識、酵素、染色体または蛍光体で標識された抗体である。
【００２７】 本発明のさらに別の局面では、in vitroで細胞に、ex vivoで細胞に、そしてi
n vivoで細胞にまたは多細胞生物に投与するための治療薬と複合された抗体が提
供される。この点で特に好ましいのは、細胞傷害性である治療薬である。ある種
の好ましい実施態様では、この点では、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性または発現によ
り特性化される疾患状態、例えば前立腺癌の治療のためのヒト患者へのこのよう
な複合抗体の投与である。
【００２８】 本発明のさらに別の局面では、免疫応答を刺激するために用いられ得るペプチ
ドおよび抗イディオタイプ抗体が提供される。
【００２９】 本発明のさらに別の局面では、in vitroで細胞に、ex vivoで細胞に、そしてi
n vivoで細胞にまたは多細胞生物に投与するための、リボザイムおよびｐｒｏｓ
ｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド（即ちアンチセンスポ
リヌクレオチド）が提供される。この点で特に好ましいのは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓ活性または発現のレベルを低減することにより軽減される疾患状態、例えば前
立腺癌または良性前立腺過形成の治療のためのヒト患者へのアンチセンス分子の
投与である。
【００３０】 本発明のさらに別の局面では、in vitroで細胞に、ex vivoで細胞に、そしてi
n vivoで細胞にまたは多細胞生物に投与するためのｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌク
レオチドまたはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを含む組成物が提供される。本
発明のこの局面のある種の特に好ましい実施態様では、組成物は、疾患の治療の
ための宿主生物体中でのＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの発現のためのｐｒｏ
ｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドを含む。この点で特に好ましいのは、ＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓ活性のレベルを低減することにより軽減される疾患状態の治療のための
ヒト患者におけるポリペプチドの発現である。
【００３１】 本発明のその他の目的、特徴、利点および局面は、以下の説明により当業者に
明らかになる。しかしながら以下の説明および特定の実施例は、本発明の好まし
い実施態様を示して入るが、説明のために示されたに過ぎない、と理解されるべ
きである。本発明の精神および範囲内の種々の変更および修正は、以下の説明を
読めば、そして本発明の開示の他の部分を読めば、当業者には容易に明らかにな
る。 本発明の詳細な説明 定義 本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いる場合、そうでな
いと別記しない限り、以下の用語は指示された意味を有する。
【００３２】 「ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ」とは、図２（配列番号２）に記述されたアミノ酸配列
を有するポリペプチド、その変異体、類似体、誘導体および断片、変異体、類似
体および誘導体の断片を指す。「断片」、「誘導体」および「類似体」という用
語は、図２（配列番号２）のポリペプチドを指している場合、本質的に図２（配
列番号２）のポリペプチドと同一の生物学的および／または免疫学的活性を保有
するポリペプチドを意味する。
【００３３】 「ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ」とは、図１（配列番号１）に記述された配列を有する
ポリヌクレオチド、および図２（配列番号２）に記述されたＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ変異体、類似体、誘導体および断片、そして変異体、類似体
および誘導体の断片をコードするポリヌクレオチドを指す。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
は、ＲＮＡで構成されるこのようなポリヌクレオチド、ならびに図２（配列番号
２）に記述されたポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの相補体であ
るポリヌクレオチドも指す。
【００３４】 「ポリヌクレオチド（単数または複数）」とは一般に、非修飾化ＲＮＡまたは
ＤＮＡ、あるいは修飾化ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオ
チドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えばポリヌク
レオチドは、本明細書中で用いる場合、中でも一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本
鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならび
に一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であり得る、さらに典
型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよび
ＲＮＡで構成されるハイブリッド分子を指す。さらにポリヌクレオチドは、本明
細書中で用いる場合、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方
で構成される三重鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同一分子からまたは異
なる分子からのものであり得る。当該領域は、１つまたはそれ以上の分子の全て
を含み得るが、しかしさらに典型的には、いくつかの分子の一領域のみを包含す
る。三重らせん領域の分子の１つはしばしば、オリゴヌクレオチドである。
【００３５】 本明細書中で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つまたはそ
れ以上の修飾化塩基を含有する前記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む。したが
ってその用語が本明細書中で意図されるように、安定性のためにまたはその他の
理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「ポリヌクレオチ
ド」である。２つだけ例を挙げると、さらに普通でない塩基、例えばイノシンま
たは修飾化塩基、例えばトリチウム標識塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、当該
用語が本明細書中で用いられるようなポリヌクレオチドである。
【００３６】 非常に種々の修飾が、当業者に既知の多数の有用な目的に役立つＤＮＡおよび
ＲＮＡに対して成されていると理解される。「ポリヌクレオチド」という用語は
、本明細書中で用いられる場合、このような化学的、酵素的または代謝的修飾形
態のポリヌクレオチド、ならびにとりわけウイルスおよび細胞に、例えば簡単な
および複雑な細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００３７】 「ポリペプチド」とは、本明細書中で用いる場合、下記のような全てのポリペ
プチドを含む。ポリペプチドの塩基構造は周知であり、数えきれないほど多くの
教科書および当業界のその他の出版物に記載されている。この情況において、本
用語は、ペプチド結合により線状鎖中で互いに連結された２つまたはそれ以上の
アミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質に言及するために本明細書中で
用いられる。本明細書中で用いる場合、本用語は、例えば一般に当業界でペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖、ならびに多くの種類が
存在するタンパク質と当業界で一般的に呼ばれる長鎖の両方を指す。
【００３８】 ポリペプチドはしばしば20個の天然アミノ酸と一般に呼ばれる20個のアミノ酸
以外のアミノ酸を含有し、そして末端アミノ酸を含めた多数のアミノ酸が、グリ
コシル化またはその他の翻訳後修飾のような天然過程により、あるいは当業界で
周知の化学修飾技法により、所定のポリペプチド中で修飾され得る、と理解され
る。ポリペプチド中で天然に起こる一般的修飾でさえ、多すぎてここで列挙でき
ないほどであるが、しかしそれらは基礎的教科書で、さらに詳細なモノグラフで
、ならびに大部の研究文献において十分に説明されており、そしてそれらは当業
者には周知である。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の修飾は、いくつ
かの実例を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、
フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノ
シトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的
架橋の形成、シスチン生成、ピログルタメート生成、ホルミル化、γ−カルボキ
シル化、グリケーション、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化
、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化
、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパ
ク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加、およびユビキチン化である。
【００３９】 このような修飾は当業者には周知であり、科学文献に詳細に記載されている。
いくつかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタ
ミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は
、ほとんどの基礎的教科書、例えば、I.E. Creighton, Proteins-Structure and
Molecular Properties, 2nd Ed., W.H. Freeman and Company New York, 1993
に記載されている。この目的に関して、多数の詳細な検討、例えば、Wold, F.,
in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed
., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983；Seifter et al., Meth. Enzymo
l. 182:626-646, 1990およびRattan et al., Protein Synthesis: Posttranslat
ional Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992によ
り提供されたものが利用可能である。
【００４０】 周知であるように、そして前記のように、ポリペプチドは常に完全に線状であ
るわけではないと理解される。例えばポリペプチドはユビキチン化の結果として
分枝され得るし、それらは一般的に翻訳後事象、例えば天然プロセッシング事象
および天然では起こらないヒト操作によりもたらされる事象の結果として、分枝
を伴いあるいは伴わずに、環状であり得る。環状、分枝鎖および分枝環状ポリペ
プチドは、非翻訳的天然過程により、そして同様に完全合成方法により合成され
得る。
【００４１】 修飾は、ポリペプチド中のどこでも、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端で起こり得る。実際、共有修飾によるポリペプ
チド中のアミノまたはカルボキシル基またはその両方の遮断は、天然および合成
ポリペプチドで共通あり、このような修飾は、同様に本発明のポリペプチド中に
も存在し得る。例えばタンパク質分解的プロセッシング前に大腸菌中で作られる
ポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンである
。
【００４２】 ポリペプチド中で起こる修飾は、しばしば、それが作られる方法の一機能であ
る。例えば宿主中でクローン化遺伝子を発現することにより作製されるポリペプ
チドに関しては、大部分の修飾の性質および程度は、宿主細胞翻訳後修飾能力お
よびポリペプチドアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより確定される。例
えば周知のように、グリコシル化はしばしば細菌宿主、例えば大腸菌において起
こるというわけではない。したがってグリコシル化が望ましい場合、ポリペプチ
ドはグリコシル化宿主、一般的に真核細胞で発現される必要がある。昆虫細胞は
しばしば、哺乳類細胞と同一の翻訳後グリコシル化を実行し、このために、昆虫
細胞発現系は、中でもネイティブパターンのグリコシル化を有する哺乳類タンパ
ク質を効率的に発現するよう開発されてきた。同様の考えは、他の修飾にも当て
はまる。
【００４３】 同一種類の修飾は所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同一程度にまたは
種々の程度に示され得る、と理解される。さらに所定のポリペプチドは、多数の
種類の修飾を含有し得る。
【００４４】 概して、本明細書中で用いる場合、ポリペプチドという用語は全てのこのよう
な修飾を、特に宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現することにより合成される
ポリペプチド中に存在するものを包含する。
【００４５】 「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは、本明細書中で用いる場
合、本発明のポリペプチド、特に図２（配列番号２）に記述されたアミノ酸配列
を有するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオ
チドを包含する。当該用語は、付加的領域と一緒にポリペプチドをコードする単
一連続領域または不連続領域（例えばイントロンにより中断される）を含むポリ
ヌクレオチドを包含する。
【００４６】 「生物学的活性」とは、天然ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの構造的、調節
的または生化学的機能を指す。
【００４７】 「免疫学的活性」とは、適切な動物または細胞における特異的免疫応答を誘導
し、且つ特異的抗体と結合する天然、組換え体または合成ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓあ
るいはそれらの任意の断片の能力を指す。
【００４８】 「オリゴヌクレオチド（単数または複数）」とは、相対的に短いポリヌクレオ
チドを指す。しばしば本用語は一本鎖デオキシリボヌクレオチドをさすが、しか
しそれは同様に、中でも、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを指し得る。オリゴヌクレオチド、例えば一
本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドはしばしば、化学的方法により、例えば
自動オリゴヌクレオチド合成機で実行されるものにより合成される。しかしなが
らオリゴヌクレオチドは、種々のその他の方法により、例えばin vitro組換えＤ
ＮＡ媒介性技法により、ならびに細胞および生物体中でのＤＮＡの発現により作
製され得る。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」あるいはポリヌクレ
オチド「断片」、「部分」または「セグメント」とは、少なくとも約10個のヌク
レオチドおよび約60という多数のヌクレオチド、好ましくは約15〜30ヌクレオチ
ド、さらに好ましくは約20〜25ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を指す。
【００４９】 「天然ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ」とは、遺伝子工学処理されたことのないヒト細胞
により産生されるＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを指し、そして特に、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化および切断を含めたしか
しこれらに限定されないポリペプチドの翻訳後修飾から生じる種々のＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓ形態を意図する。
【００５０】 ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「変異体（単数または複数）」という
用語は、本明細書中で用いる場合、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味での変
異体は、以下にならびに本発明の他の箇所にさらに詳細に記載されている。
【００５１】 （１）別の参照ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド配列が異なるポリヌクレ
オチド。一般に、差異は、参照および変異体のポリヌクレオチド配列全体的に非
常によく似ており、そして多数の領域で同一であるよう、限定される。
【００５２】 下記のように、変異体のポリヌクレオチド配列の変化はサイレントである。即
ちそれらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変え得ない。変化
がこの種類のサイレント変化に限定される場合、変異体は参照と同一アミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする。さらに下記のように、変異体のポリヌク
レオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変え得る。このようなポリヌクレオチド変化は、下記のように
、参照配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠
失、融合および切頭を生じ得る。
【００５３】 （２）別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般に、
差異は参照および変異体の配列が全体的に非常によく似ており且つ多くの領域に
おいて同一であるよう限定される。変異体および参照ポリペプチドは、任意の組
合せで存在し得る１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失、融合および切頭によ
りアミノ酸配列が異なり得る。これらの同一または類似ポリペプチドをコードす
る組換え変異体は、遺伝暗号中に「リダンタシー」を使用することにより、合成
または選択され得る。種々の制限部位を生じる種々のコドン置換、例えばサイレ
ント変化は、プラスミドまたはウイルスベクター中へのクローニングを、あるい
は特定の原核生物または真核生物系発現を最適化するよう誘導され得る。突然変
異は、リガンド結合親和性、鎖間親和性あるいはポリペプチド分解または代謝回
転率を変えるためにポリペプチドの特性を修正するよう導入され得る。
【００５４】 「対立遺伝子変異体」とは、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドの代替形態
を指す。対立遺伝子は突然変異に、即ちポリヌクレオチド配列の変化に起因し、
一般的にその構造または機能が変わることも変わらないこともあるｍＲＮＡまた
はポリペプチド変化を生じる。対立遺伝子を生じる一般の突然変異的変化は一般
に、ヌクレオチドの天然欠失、付加または置換の結果である。これらの種類の変
化は各々単独で起こるか、あるいは他のものと組合せて、あるいは１つまたはそ
れ以上の回数所定の配列中で起こり得る。
【００５５】 「誘導体」とは、ヒトタンパク質では普通は起こらない、化学修飾、例えばユ
ビキチン化、標識化（例えば放射性核種、種々の酵素修飾による）、ペギル化（
ポリエチレングリコールによる誘導）による、あるいはアミノ酸、例えばオルニ
チンの挿入または置換（またはこのようなアミノ酸をコードするヌクレオチドの
置換）による、それぞれ天然ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓまたはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ由来
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
【００５６】 「欠失」とは、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸残基が
それぞれ存在しないポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化と定義される。
【００５７】 「挿入」または「付加」とは、天然ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較し
た場合に、それぞれ１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸残基
の付加を生じているポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。
【００５８】 「置換」は、それぞれ異なるポリヌクレオチドまたはアミノ酸による１つまた
はそれ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸の置換に起因する。
【００５９】 好ましくはアミノ酸置換は、あるアミノ酸を同様の構造的および／または化学
的特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果、例えばイソロイシンまたはバリ
ンによるロイシンの、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の、あるいはセリ
ンによるトレオニンの置き換え、即ち保存的アミノ酸置換である。挿入または欠
失は、典型的には約1〜5アミノ酸の範囲である。許容された変異は、組換えＤＮ
Ａ技術を用いてポリペプチド中のアミノ酸の挿入、欠失または置換の系統的に作
製し、その結果生じた組換え変異体を活性に関して検定することにより実験的に
確定され得る。
【００６０】 「断片」は、一部は完全に同一であるが、しかし前記のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポ
リペプチドおよびその変異体または誘導体のアミノ酸配列の全てが同一であると
いうわけではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００６１】 ポリペプチドの「断片」、「一部分」または「セグメント」は、少なくとも約
5アミノ酸、しばしば少なくとも約7アミノ酸、典型的には少なくとも約9〜13ア
ミノ酸、そして種々の実施態様においては少なくとも約17又はそれ以上のアミノ
酸のアミノ酸残基の一続きである。
【００６２】 「組換え体」または「組換えＤＮＡ分子」とは、天然にはない、あるいは本来
分離されている二つの配列セグメントの人工的組合せにより作製されるポリヌク
レオチド配列を指す。「組換え的に生成される」とは、化学合成手段により、ま
たはポリヌクレオチドの単離セグメントの人工的操作により、例えば遺伝子工学
技術によりしばしば成し遂げられる人工的組合せを意味する。このような操作は
、典型的には配列認識部位を導入または除去しながら、同一または保存的アミノ
酸をコードする余分のコドンであるコドンを置き換えるために通常は成される。
あるいはそれは、ポリヌクレオチドセグメントを所望の基のと一緒に連結して、
一般の天然形態では見いだされない機能の所望の組合せを含む単一遺伝的存在物
を生成するために実施される。制限酵素認識部位、調節配列、制御配列またはそ
の他の有用な特徴は、設計により組入れられ得る。「組換えＤＮＡ分子」として
は、クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。「組換え体」とは、ポリペ
プチドをコードし、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されるポリヌクレオチドもさ
す。
【００６３】 「単離された」とは、その天然状態から「ヒトの手により」変更されたことを
、即ちそれが天然に起こる場合、そのオリジナル環境から変更または取り出され
たかあるいはその両方であることを意味する。例えば、天然状態で生きている動
物中に天然に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」
ないが、しかしその天然状態の共存物質から分離される同一ポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、この用語が本明細書中で用いられるように「単離されてい
る」。例えばポリヌクレオチドに関しては、単離されたという用語は染色体およ
び細胞から分離されたことを意味し、これは天然に起こる。ポリヌクレオチドお
よびポリペプチドは、組成物、例えば培地処方物、例えばポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの細胞中への導入のための溶液、例えば天然組成物でないそして
その中に本明細書中で用いるような用語の意味内の単離ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを保有する化学または酵素反応のための組成物または溶液中に生じ
得る。
【００６４】 「実質的に純粋」および「実質的に均質」とは、互換的に用いられ、ＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓポリペプチドまたはその断片またはそれをコードするポリヌクレオチ
ドセグメントを説明し、この場合、このようなポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドは天然にそれに随伴する構成成分から分離されている。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
ポリペプチドまたはその断片あるいはそれをコードするＤＮＡセグメントは、そ
れがその天然状態でそれに随伴する天然夾雑物から分離されている場合、実質的
に天然関連構成成分を含有しない。したがって、化学的に合成されるかまたはそ
れが天然に生じた細胞とは異なる細胞系中で合成されるポリペプチドは、その天
然関連構成成分を実質的に含有しない。同様に、化学的に合成されるかまたはそ
れが天然に生じた細胞とは異なる細胞系中で合成されるポリヌクレオチドは、天
然関連構成成分を実質的に含有しない。
【００６５】 「相同」とは、ポリヌクレオチドを説明するために用いる場合、２つのポリヌ
クレオチドまたはその支持された配列が、任意に整列され、比較された場合に、
適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも70％で
、通常は約75％〜99％、さらに好ましくはヌクレオチドの少なくとも約98〜99％
で同一であることを示す。
【００６６】 「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、米国特許第4,683,195号（1
987年7月28日発行）に記載されているようにＤＮＡの特定の小片が増幅される手
法を指す。一般的に、当該ポリペプチド断片の末端またはそのほかの配列情報は
、オリゴヌクレオチドプライマーが設計され得るし、これらのプライマーは互い
に向けており、増幅される鋳型の反対鎖と配列が同一であるかまたは類似してい
るよう、利用可能である必要がある。２つのプライマーの末端ヌクレオチドは、
増幅物質の末端と合致する。ＰＣＲは、総ゲノムＤＮＡ、総細胞ＲＮＡから転写
されたｃＤＮＡ、プラスミド配列等から特定のＤＮＡ配列を増幅するために用い
られ得る（一般に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,
51:263, 1987；Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989参照
）。
【００６７】 「ストリンジェンシー」とは典型的には、約Ｔｍ（融解温度）−5℃（プロー
ブのＴｍより5℃低い）〜Ｔｍより約20℃〜25℃低い範囲で起こる。当業者に理
解されるように、緊縮ハイブリダイゼーションを用いて、同一ポリヌクレオチド
配列を同定または検出し、あるいは類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定
または検出し得る。本明細書中で用いる場合、「ストリンジェント条件」という
用語は、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在す
る場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６８】 「ハイブリダイゼーション」とは、本明細書中で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド鎖が塩基対合により相補鎖と連結する任意の方法」を包含する（Coombs, J.
, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994）。
【００６９】 「治療的有効量」とは、疾患状態の徴候または症状を軽減するポリペプチドま
たはその抗体、アンタゴニストまたは阻害剤、例えばアンチセンス分子およびリ
ボザイムの量を指す。このような化合物の治療効力および毒性は、細胞培養また
は実験動物における標準製薬手法により、例えばＥＤ50（集団の50％において治
療的に有効な用量）およびＬＤ50（集団の50％に対して致死的な用量）により確
定され得る。治療的および毒性作用間の用量比が治療指数であり、それはＥＤ50 ／ＬＤ50比として表され得る。
【００７０】 「処置」または「治療」とは、本明細書中で用いる場合、ヒト患者における疾
患状態の治療を網羅し、疾患状態は前立腺腫瘍増殖に関連があり、患者がＰＲＯ
ＳＴ−Ｅｔｓレベル低減を必要とする疾患状態を含む。
【００７１】 発明の詳しい説明 本発明は、中でも以下で詳細に説明されているような、新規のＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓポリペプチド、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドおよびＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓポリペプチドに向けられる抗体に関する。特に本発明は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓポリペプチド、これらのＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドに関し、そして特に図２（配列番号２）に記述されたアミノ酸配列を
有するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ、ならびに図１（配列番号１）に記述されたポリヌク
レオチド配列を有するｐｒｏｓｔ−ｅｔｓに関する。本発明は、ＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓ変異体も包含する。好ましいＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ変異体は、図２（配列番号
２）に示されたポリペプチド配列と少なくとも70％の類似性（好ましくは少なく
とも70％の同一性）を、さらに好ましくは図２（配列番号２）に示されたポリペ
プチドと少なくとも90％の類似性（さらに好ましくは少なくとも90％の同一性）
を、さらに好ましくは図２（配列番号２）に示されたポリペプチドと少なくとも
95％の類似性（さらに好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するものであり
、一般に少なくとも30個のアミノ酸を、さらに好ましくは少なくとも50個のアミ
ノ酸を含有するポリペプチドのこのような部分を伴うこのようなポリペプチドの
一部も含む。
【００７２】 推定の活性形態のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドに関するコード配列は、図
１（配列番号１）に示されたヌクレオチド配列の５‘末端から422塩基対で開始
する。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓは、Ｅｔｓファミリーのタンパク質に特徴的な2つの
ドメインを含有する：即ち、アミノ酸１３１〜２１３のポインテッドドメイン（
タンパク質−タンパク質相互作用に関与）とアミノ酸２４６〜３３２のＥｔｓド
メイン（ＤＮＡ結合に関与）である。
【００７３】 本発明は一部は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと、転写因子のＥｔｓファミリーのもう
ひとつの成員であるショウジョウバエＤ−Ｅｔｓ−４との間の、図３に示された
構造相同性を基礎にしている。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓのアミノ酸配列は、87アミノ
酸に及ぶショウジョウバエＤ−Ｅｔｓ−４と約74％相同である。
【００７４】 本発明は一部は、前立腺組織ライブラリーにおける発現および前立腺腫瘍ライ
ブラリーにおける過剰発現により特性化されるｐｒｏｓｔ−ｅｔｓｍＲＮＡの発
現プロフィールを基礎にしている。この組織プロフィールは、ノーザンブロッテ
ィングによるおよびＰＣＲベースのTaqman分析による正常および腫瘍組織からの
組織標本中でのｍＲＮＡ発現の分析において観察される。両分析方法は、ＰＲＯ
ＳＴ−ＥｔｓをコードするｍＲＮＡが前立腺組織中で、そして限定数のその他の
組織、例えば結腸および乳房中で高レベルで発現されることを実証した。
【００７５】 本発明は一部は、培養中の前立腺腫瘍細胞増殖に及ぼすＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを
コードするｍＲＮＡのレベルの低減の作用を実証する多数の機能性試験も基礎に
している。先ず、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓｍＲＮＡ発現を低減するためにアンチセン
スオリゴヌクレオチドを用いて、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓｍＲＮＡレベルの低減作用
を前立腺腫瘍細胞株ＰＣ−３で立証した。脂質の存在下で細胞に投与した場合に
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに関するｍＲＮＡレベルを低減する３つのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド試薬が見出された。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド試
薬のＰＣ−３細胞への投与は、用量依存的方式で細胞の増殖を抑制した。同一用
量範囲で、一組の無作為23merオリゴヌクレオチドで構成された対照オリゴヌク
レオチド混合物は、細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。相補的実験では、ＰＲ
ＯＳＴ−Ｅｔｓ配列の領域に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細
胞内のアンチセンス分子の転写をドキシサイクリン誘導性にさせるよう修飾され
ていたＰＣ−３細胞中にトランスフェクトされた。ドキシサイクリンの存在下で
、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓｍＲＮＡに向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドで
トランスフェクトされたＰＣ３細胞は、対照細胞と比較して、細胞増殖の低減を
示した。これらの実験組はともに、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓｍＲＮＡ発現の抑制がＰ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドが正常に発現される腫瘍細胞株の増殖を低減する
ことを立証する。
【００７６】 ポリヌクレオチド 本発明の一局面にしたがって、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有す
るＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供さ
れる。
【００７７】 図１（配列番号１）に記述されたポリヌクレオチド配列のような本明細書中に
提供された情報を用いて、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドをコードする本発明
のポリヌクレオチドは、標準クローニングおよびスクリーニング手法、例えば出
発物質としてヒト組織の細胞からのｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングす
るための手法を用いて得られる。本発明の実例としては、ヒト前立腺組織から得
られたｃＤＮＡクローン中に図１（配列番号１）のポリヌクレオチド配列が見出
された。前立腺または腫瘍特異的方式で発現された配列に関してIncyteのLifeSe
q遺伝子発現データベースを引き出すことにより、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓは前立腺
中で発現される遺伝子と同定された。
【００７８】 同定されたオリジナルクローンは、前立腺腫瘍ライブラリー中で発見されたIn
cyteクローン581956であった。これは、例えばIncyteクローン、例えば1813005
および1794731とクラスターリングした。これらのクローンはIncyteから入手さ
れ、配列決定および発現分析を含めた実験目的のために用いられた。クローン58
1965のヌクレオチド配列は、Incyteのデータベース中の全ての組織ライブラリー
中の遺伝子の発現の電子ノーザン分析のために用いられた。初期スクリーニング
は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ遺伝子が前立腺中で大いに発現され、前立腺腫瘍中で過
剰発現されることを立証した。データベースの更新バージョンでは、前立腺腫瘍
においてだけでなく、乳房腫瘍および卵巣腫瘍ライブラリーにおいても発現され
ることが見出された。Genetics Computer Group（ＧＣＧ、Wisconsinパッケージ
）遺伝子アセンブリープログラムおよび評価された集合ｍＲＮＡの配列を用いて
、ＰＲＯＳＴ−ＥｔｓをコードするIncyteのLifeseqライブラリー中の全クロー
ンが集合された。この配列は連続集合配列の質を改良するために編集され、タン
パク質をコードするオープンリーディングフレームが同定された。Lifeseqデー
タベース中の最も完全な５‘配列を含有するIncyte（クローン1794731）から物
理的クローンを得て、そしてＤＮＡをシーケンシングすることにより、ｍＲＮＡ
の配列が確証された。この配列は、図１（配列番号１）に示されている。
【００７９】 本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態で、あるいは例
えばクローニングにより得られるかまたは化学合成技法により生成されるまたは
それらの組合せによる、あるいは本明細書中に記載した方法により得られるｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡを含めたＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖ま
たは一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖としても既知のコード鎖であり
得るし、あるいはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
【００８０】 ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）で示されるポリ
ヌクレオチドのコード配列と同一であり得る。それは、遺伝暗号の冗長性（縮重
）の結果として図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる配列を有
するポリヌクレオチドでもあり得る。
【００８１】 図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの
例としては、ポリペプチドそれ自体に関するコード配列；ポリペプチドに関する
コード配列および付加的コード配列、例えばリーダーまたは分泌配列をコードす
るもの、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−配列；付加的非コード配列
、例えばイントロンならびに非コード５および３配列、例えば転写、ｍＲＮＡプ
ロセッシング（例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル）に一役を
演じる転写化非翻訳配列と一緒に前記の付加的コード配列を有するかまたは有さ
ないポリペプチドのコード配列、あるいは付加的アミノ酸をコードする付加的コ
ード配列、例えば付加的機能を提供するものが挙げられるが、これらに限定され
ない。したがって例えばポリペプチドはマーカー配列、例えば融合ポリペプチド
の生成を促すペプチドと融合され得る。本発明のこの局面のある種の好ましい実
施態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば中でもｐＴｒ
ｃＨｉｓＢベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＯＲＡｐｅｔ15Ｂベクター
（Novagen）中で提供されるタグであり、このうちの多くが市販されている。例
えばGentz等（Pro. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989）に記載されてい
るように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製に備える。ＨＡタ
グはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するが、
これは例えばWilson等（Cell 37:767, 1984）により記載されている。
【００８２】 ポリヌクレオチドは、ポリペプチド＋付加的アミノまたはカルボキシル末端ア
ミノ酸、あるいはポリペプチド内のアミノ酸（例えば活性形態が１つより多いポ
リペプチド鎖を有する場合）であるポリペプチドをコードし得る。このような配
列は、中でも前駆体から最終形態へのポリペプチドのプロセッシングに一役を演
じ、ポリペプチドの横行を促し、ポリペプチド半減期を延長または短縮し、ある
いは検定または生成のためのポリペプチドの操作を促し得る。一般的にin situ
の場合、付加的アミノ酸は細胞酵素によりポリペプチドから離れて処理され得る
。
【００８３】 １つまたはそれ以上のプロ配列に融合された最終形態のポリペプチドを有する
前駆体ポリペプチドは、不活性形態のポリペプチドであり得る。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列のいくつか
または全部が、活性化前に除去され得る。一般にこのような前駆体はプロポリペ
プチドと呼ばれる。
【００８４】 本発明はさらに、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの断片、類似体および誘導体をコードする本明細書中の前記のポリヌクレオチ
ドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然変異体、例えば天然対
立遺伝子変異体であり得るし、あるいはそれは天然で起こることが既知でない変
異体であり得る。ポリヌクレオチドのこのような非天然変異体は、突然変異誘発
技法、例えばポリヌクレオチド、細胞または生物体に適用される方法により作製
され得る。
【００８５】 この点での変異体は、ポリヌクレオチド置換、欠失または付加により前記のポ
リヌクレオチドと異なる変異体である。置換、欠失または付加は、１つまたはそ
れ以上のポリヌクレオチドを包含し得る。変異体はコードまたは非コード領域あ
るいはその両方で変更され得る。コード領域の変化は、保存的または非保存的ア
ミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。
【００８６】 この点での本発明の特に好ましい実施態様は、図２（配列番号２）に記述され
たＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓのアミノ酸配列、その変異体、類似体および断片、ならび
に変異体、類似体および誘導体の断片を有するポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドである。
【００８７】 この点でのさらに別の特に好ましいのは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ変異体、類似体
、誘導体および断片をコードするポリヌクレオチド、断片の変異体、類似体およ
び変異体であり、これらは図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチ
ドのアミノ酸配列を有し、そのいくつか、数個、5〜10、1〜5、1〜3、2、1また
は0個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加される。これらの
中で特に好ましいのは、サイレント置換、付加および欠失であって、これらはＰ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの特性および活性を変更しない。この点でさらに
特に好ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは、置換を伴わずに、図
２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである。
【００８８】 本発明のさらに好ましい実施態様は、図２（配列番号２）に記述されたアミノ
酸配列を有するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
ならびにこのようなポリペプチドと相補的であるポリヌクレオチドと少なくとも
70％同一であるポリヌクレオチドである。あるいは最も好ましいのは、ＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれと相補的なポ
リヌクレオチドと少なくとも80％同一である領域を含むポリヌクレオチドである
。この点では、当該同一物と少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドが特に
好ましく、これらの特に好ましいポリペプチドの中で、少なくとも95％同一であ
るものが特に好ましい。さらに少なくとも95％同一であるものの中では少なくと
も97％同一であるものが非常に好ましく、これらの中では少なくとも98％および
少なくとも99％同一であるものが特に好ましく、少なくとも99％同一であるもの
がより好ましい。
【００８９】 さらにこの点での特に好ましい実施態様は、図１（配列番号１）のポリヌクレ
オチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同一の生物学的活性を保
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００９０】 本発明はさらに、本明細書中の前記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。この点で本発明は特に、本明細書中の前記のポリヌクレオチドと
ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
【００９１】 例えば本発明のポリヌクレオチド検定に関して本明細書中で付加的に考察され
ているように、前記のような本発明のポリヌクレオチドはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを
コードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、そしてｐｒｏ
ｓｔ−ｅｔｓ遺伝子との高配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離するためのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリ
ダイゼーションプローブとして用いられ得る。このようなプローブは一般に、少
なくとも15塩基を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも30塩基を有
し、そして少なくとも50塩基を有し得る。
【００９２】 例えばｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ遺伝子のコード領域は、既知のＤＮＡ配列を用いて
スクリーニングして、オリゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離さ
れ得る。次に本発明のポリヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する標識化オ
リゴヌクレオチドを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをスク
リーニングして、プローブがハイブリダイズするライブラリーの成員を確定する
。
【００９３】 要するに、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチド、ポリペプチド＋リー
ダー配列（プレポリヌクレオチドと呼ばれ得る）、プレポリペプチドのリーダー
配列ではない１つまたはそれ以上の前配列を有するポリペプチドの前駆体、ある
いはリーダー配列および１つまたはそれ以上の前配列を有する、プロポリペプチ
ドに対する前駆体であるプレプロポリペプチド（これらは一般に活性形態のポリ
ペプチドを生成するプロセッシング過程中に除去される）をコードし得る。
【００９４】 本発明は、中でも、ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、ポリペ
プチド断片をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド、特にストリンジェント条件下でハイブリダイズするもの、ならびにポリペプ
チド断片をコードするポリヌクレオチドを増幅するための、ＰＣＲプライマーの
ようなポリヌクレオチドにも関する、と理解される。これらの点では好ましいポ
リペプチドは、下記のような好ましいポリペプチドに対応するものである。
【００９５】 ポリペプチド 本発明はさらに、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓポリペプチドに関する。
【００９６】 本発明は、これらのポリペプチドの断片、類似体および誘導体にも関する。断
片、誘導体および類似体という用語は、図２（配列番号２）のポリペプチドを指
す場合は、このようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的活性を保有するポ
リペプチドを意味する。したがって類似体は、プロポリペプチド部分の切断によ
り活性化されて本発明の活性ポリペプチドを生成し得るプロポリペプチドを包含
する。
【００９７】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチドであり得る。ある種の好ましい実施態様では、それは組換えポリペ
プチドである。
【００９８】 図２（配列番号２）のポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１
つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存性または非保存性アミノ酸残基（好まし
くは保存性アミノ酸残基）で置換されたものであって、このような置換アミノ酸
残基は遺伝暗号によりコードされたものであり得るし、そうでない場合もあるも
の、あるいは（ｉｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を包含するも
の、あるいは（ｉｉｉ）ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減
期を増大するための化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されたもの
、あるいは（ｉｖ）さらに別のアミノ酸が融合されたポリペプチド、例えばリー
ダーまたは分泌配列あるいはポリペプチドの精製に用いられる配列と融合された
ものであり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示か
ら当業者の範囲内であるとみなされる。
【００９９】 この点での本発明の特に好ましい実施態様は、図２（配列番号２）に記述され
たＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体、類似
体、誘導体および断片、ならびに断片の変異体、類似体および誘導体である。
【０１００】 好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換により参照から変化するものである。
このような置換は、同様の特徴を有する別のアミノ酸によりポリペプチド中の所
定のアミノ酸を置換するものである。典型的には、保存的置換として観察される
のは、置換体、即ち脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中の
あるものに代わるもの、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基
ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残
基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換
である。
【０１０１】 この点でさらに特に好ましいのは、図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
ポリペプチドのアミノ酸配列を有する変異体、類似体、誘導体および断片、なら
びに断片の変異体、類似体および変異体であり、そのいくつか、数個、5〜10、1
〜5、1〜3、2、1または0個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付
加される。これらの中で特に好ましいのは、サイレント置換、付加および欠失で
あって、これらはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの特性および活性を変更しな
い。この点でさらに特に好ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは、
置換を伴わずに、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。
【０１０２】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供
され、そして好ましくは均質に精製される。
【０１０３】 本発明のポリペプチドは、図２（配列番号２）のポリペプチド、ならびに図２
（配列番号２）のポリペプチドと少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくと
も70％の同一性）を、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドと少
なくとも90％の類似性（さらに好ましくは少なくとも90％の同一性）を、さらに
好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドと少なくとも95％の類似性（さら
に好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドも包含し、そして
少なくとも30個のアミノ酸を、さらに好ましくは少なくとも50個のアミノ酸を一
般的に含有するポリペプチドのこのような部分を伴うこのようなポリペプチドの
一部も包含する。
【０１０４】 当業界で既知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、あるポリペプ
チドのアミノ酸配列およびその保存性アミノ酸置換基を第二のポリペプチドの配
列と比較することにより確定される。
【０１０５】 本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成により対応する全長
ポリペプチドを生成するために用いられ得る。したがって断片は全長ポリペプチ
ドを生成するための中間体として用いられ得る。
【０１０６】 断片 さらに本発明のこの局面の好ましい実施態様は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの断片、
特に図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの断片、ならびに図２（配列番号
２）のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの変異体および誘導体の断片を含むポリペプチドであ
る。
【０１０７】 この点で、断片は、前記のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドおよびその変異体
または誘導体のアミノ酸配列と部分としては完全に同一であるが、しかし全体と
して同一であるというわけではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１０８】 このような断片は、「独立している」、即ち、他のアミノ酸またはポリペプチ
ドの一部でなく、またはそれらに融合されておらず、あるいはそれらはそれらが
一部または領域を構成するより大きいポリペプチド内に含まれ得る。より大きな
ポリペプチド内に含まれる場合、ここで考察される断片は、最も好ましくは単一
連続領域を形成する。しかしながらいくつかの断片は単一大型ポリペプチド内に
含まれ得る。例えばある種の好ましい実施態様は、宿主中での発現のために設計
され、そしてＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ断片のアミノ末端に融合された異種プレ−およ
びプロポリペプチド領域ならび２断片のカルボキシル末端に融合された付加的領
域を有する前駆体ポリペプチド内に含まれる本発明のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペ
プチドの断片に関する。したがって本明細書中で意図された意味の一局面におけ
る断片は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ由来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の
単数または複数の部分を指す。
【０１０９】 本発明のポリペプチド断片の代表例としては、約25〜約335個のアミノ酸を有
するものが挙げられる。この情況において、「約」とは、特に列挙された範囲、
ならびにいずれかの末端でまたは両端での数個、2〜3、5、4、3、2または1個の
アミノ酸にだけ大きいまたは小さい範囲を包含する。例えばこの情況での約25個
のアミノ酸とは、25個プラスまたはマイナス数個、2〜3、5、4、3、2または1個
のアミノ酸〜335個プラスまたはマイナス数個、2〜3、5、4、3、2または1個のア
ミノ酸、即ち25マイナス数個のアミノ酸〜335個プラス数個のアミノ酸という広
い範囲から、25プラス数個のアミノ酸〜335マイナス数個のアミノ酸という狭い
範囲のポリペプチド断片を意味する。
【０１１０】 この点で非常に好ましいのは、列挙された範囲プラスまたはマイナス一端また
は両端の5アミノ酸である。特に非常に好ましいのは、列挙された範囲プラスま
たはマイナス列挙された一端または両端の3アミノ酸である。特に非常に好まし
いのは、列挙された範囲プラスまたはマイナス一端または両端の1アミノ酸、あ
るいは列挙された範囲に何も付加または欠失を伴わない範囲である。この点で全
ての中で最も好ましいのは、約25〜約335個のアミノ酸の断片である。
【０１１１】 本発明の特に好ましい断片は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの切頭突然変異体である。
切頭突然変異体は、図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓあるいはその変異
体または誘導体を包含するが、但し、図２（配列番号２）に示される配列のアミ
ノ末端を含む一連の連続残基（即ち、連続領域、一部または部分）、あるいはカ
ルボキシル末端を含む一連の連続残基、あるいは二重切頭突然変異体中のような
、アミノ末端を含むものとカルボキシル末端を含むものの２つの連続シリーズの
残基の欠失は除く。前記のようなサイズ範囲を有する断片も切頭断片の好ましい
実施態様であり、これは一般的に断片の中で特に好ましい。
【０１１２】 本発明のこの局面において特に好ましいのは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの生物学的
および／または免疫学的属性により特性化される断片である。最も好ましいのは
、図２（配列番号２）に示されているような少なくともアミノ酸１３１〜２１３
およびアミノ酸２４６〜３３２を包含するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの予測活性ドメイ
ンを含有する断片である。
【０１１３】 これらの点でのある種の好ましい領域は図２（配列番号２）に記述されており
、その例としては図２（配列番号２）に記述されたアミノ酸配列の分析により同
定される前記の種類の領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】 この点での非常に好ましい断片は、いくつかの構造的特徴、例えば前記の特徴
を併有するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの領域を含むものである。この点で、Ｅｔｓファ
ミリーの転写因子に特徴的である、それぞれおよそアミノ酸１３１〜２１３およ
び２４６〜３３２を包含する「ポインテッド」および「Ｅｔｓ」ドメインは、特
に好ましい領域である。このような領域は大型ポリペプチド内に含まれ得るし、
あるいはそれ自体、前記のような本発明の好ましい断片であり得る。「およそ」
という用語は、この段落で用いる場合、概して断片に関して前記のような意味を
有する、と理解される。
【０１１５】 さらに好ましい領域は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの活性を媒介するものである。こ
の点で最も好ましいのは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの化学的、生物学的またはその他
の活性を有する断片、例えば類似の活性または改良された活性を有するか、ある
いは望ましくない活性を低減されたものである。この点で非常に好ましいのは、
関連ポリペプチド、例えばＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを包含するＥｔｓ様転写因子ファ
ミリーのその他のタンパク質の活性領域と配列においてまたは位置において、あ
るいは配列および位置の両方において相同である領域を含有する断片である。
【０１１６】 ベクター、宿主細胞および発現系 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺
伝子工学処理される宿主細胞、ならびに組換え技術による本発明のポリペプチド
の産生にも関する。このような技術は、Sambrook et al.(1989) Molecular clon
ing:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989
およびAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989に記載されている。
【０１１７】 宿主細胞は遺伝子工学処理されて、ポリヌクレオチドを組入れ、そして本発明
のポリペプチドを発現し得る。例えばポリヌクレオチドは、感染、形質導入、ト
ランスフェクション、トランスベクションおよび形質転換の周知の技術を用いて
宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独で、または他のポリヌク
レオチドとともに導入され得る。このような他のポリヌクレオチドは、別々に導
入され、同時導入され、あるいは本発明のポリヌクレオチドと連結されて導入さ
れ得る。
【０１１８】 したがって例えば本発明のポリヌクレオチドは、例えば哺乳類細胞における同
時トランスフェクションおよび選択のための標準技法を用いて、選択可能マーカ
ーをコードするもうひとつの別個のポリヌクレオチドとともに宿主細胞中にトラ
ンスフェクトされ得る。この場合、ポリヌクレオチドは一般に、宿主細胞ゲノム
中に安定的に組入れられる。
【０１１９】 あるいはポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のために選択可能マーカーを含
有するベクターに連結され得る。ベクター構築物は、前記の技法により宿主細胞
中に導入され得る。一般にプラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシ
ウム沈殿物中の、または荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入される。電気
穿孔も、宿主中にポリヌクレオチドを導入するために用いられ得る。ベクターが
ウイルスである場合、それはin vitroでパッケージングされ得るか、またはパッ
ケージング細胞中に導入され、そしてパッケージングウイルスは細胞中に形質導
入され得る。本発明のこの局面にしたがったポリヌクレオチドの作製にならびに
細胞中へのポリヌクレオチドの導入に適した広範な種々の技法は、当業者には周
知であり、ルーチンである。このような技法は、これらの技法を詳述する多数の
実験室マニュアルの実例である前記引用のSambrook等で詳細に検討されている。
本発明のこの局面にしたがって、ベクターは、例えばプラスミドベクター、一本
鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイ
ルスベクターであり得る。このようなベクターは、細胞中にＤＮＡおよびＲＮＡ
を導入するための周知の技法により、ポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮ
Ａとして細胞中に導入され得る。ベクターは、ファージおよびウイルスベクター
の場合には、感染および形質導入のための周知の技法により包装またはキャプシ
ド封入ウイルスとして細胞中に導入され得るし、好ましくは導入される。ウイル
スベクターは、複製受容性または複製欠陥性であり得る。後者の場合、ウイルス
増殖は一般に、相補性宿主細胞中でのみ起こる。
【０１２０】 好ましいベクターは、ある点では、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの発現のためのものである。一般にこのようなベクターは、発現されるポリ
ヌクレオチドに操作可能的に連結された宿主中での発現に有効なシス作用制御領
域を含む。適切なトランス作用因子は、宿主により供給され、相補性ベクターに
より供給され、または宿主中への導入時にベクターそれ自体により供給される。
【０１２１】 この点でのある種の好ましい実施態様では、ベクターは特異的発現に備える。
このような特異的発現は、誘導性発現であるかまたはある種類の細胞においての
みの発現であるか、あるいは誘導性および細胞特異性の両方であり得る。特に好
ましい誘導性ベクターは、温度および栄養添加物のような操作が容易である環境
因子により発現のために誘導され得るベクターである。本発明のこの局面に適し
た種々のベクター、例えば原核生物および真核生物宿主中で用いるための構成性
および誘導性発現ベクターが周知であり、当業者によりルーチンに用いられる。
【０１２２】 工学処理宿主細胞は、特にプロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、ま
たは遺伝子を増幅するのに適切であるように改質され得る慣用的栄養培地中で培
養され得る。発現のために選定された宿主細胞に関して従来用いられた培養条件
、例えば温度、ｐＨ等は一般に、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチ
ドの発現に適している。
【０１２３】 非常に種々の発現ベクターが、本発明のポリペプチドを発現するために用いら
れ得る。このようなベクターとしては、染色体、エピソームおよびウイルス由来
ベクター、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージから、酵母エピソー
ムから、酵母染色体素子から、ウイルスから、例えばバキュロウイルス、パポバ
ウイルス、例えばＳＶ40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス
、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから得られるベクター、ならびにそ
れらの組合せから得られるベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝子素子、例えばコスミドおよびファージミドから得られるものが挙げられ
、全て、本発明のこの局面にしたがって発現のために用いられ得る。一般に宿主
細胞中でポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを保持し、増殖しまた
は発現するのに適した任意のベクターは、この点での発現のために用いられ得る
。
【０１２４】 適切なＤＮＡ配列は、種々の周知の且つルーチンの技法によりベクター中に挿
入され得る。概して発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクター
を１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて制限断片を一緒に連結することにより、発現ベクターに連結される
。この目的のために用いられ得る制限および結繋のための手法は、当業者には周
知であり、且つルーチンである。この点での、そして当業者に周知且つルーチン
である代替的技法を用いて発現ベクターを構築するための適切な手法は、本明細
書中の別の箇所に引用したSambrook等に詳細に記述されている。
【０１２５】 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（単数または複数）、例
えばｍＲＮＡ転写を指図するためのプロモーターに操作可能的に連結される。こ
のようなプロモーターの代表例としては、λファージＰＬプロモーター、大腸菌
ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、レトロウイルスＬＴＲの単数または
複数のＳＶ40初期および後期プロモーターが数個の周知のプロモーターとして挙
げられる。記載されていない多数のプロモーターも本発明のこの局面に用いるの
に適しており、周知であって、そして本明細書中の考察および実施例により説明
されている方法で当業者に容易に用いられ得る、と理解される。
【０１２６】 概して発現構築物は、転写開始および終結のための部位を、そして転写済領域
では翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。当該構築物により発現される
転写体のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置された開始
および終結コドンに翻訳開始ＡＵＧを含む。
【０１２７】 さらに構築物は、発現を調節しならびに起こす制御領域を含有し得る。一般に
、多数の一般的に実施される手法にしたがって、中でもリプレッサー結合部位お
よびエンハンサーといったような領域は、転写を制御することにより操作される
。
【０１２８】 増殖および発現のためのベクターは一般に、選択可能マーカーを包含する。こ
のようなマーカーは増幅にも適し得るし、あるいはベクターはこの目的のための
付加的マーカーを含有し得る。この点では、発現ベクターは好ましくは、形質転
換化宿主細胞の選定のための表現型特性を提供するために、１つまたはそれ以上
の選択可能マーカー遺伝子を含有する。好ましいマーカーとしては、真核生物細
胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、なら
びに大腸菌およびその他の細菌を培養するためのテトラサイクリン、テオマイシ
ン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１２９】 本明細書中の別の箇所に記載したような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプ
ロモーターおよびその他の適切な制御配列を含有するベクターは、所望のポリペ
プチドのその中での発現に適した種々の周知の技法を用いて、適切な宿主中に導
入され得る。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプ
トミセス属およびサルモネラ属のネズミチフス菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細
胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動
物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびBowes黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙
げられる。好ましい宿主は、昆虫細胞ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ1-4である。非常に種
々の発現構築物のための宿主が周知であり、当業者は本発明の開示により、本発
明のこの局面にしたがってポリペプチドを発現するための宿主を容易に選定し得
る。
【０１３０】 種々の哺乳類細胞培養系が、同様に発現のために用いられ得る。哺乳類発現計
の例としては、サル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７株が挙げられる（Gluzman et a
l., Cell 23:175, 1991）。匹敵するベクターを発現し得るその他の細胞株とし
ては、例えばＣ127、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓293およびＢＨＫ細胞
株が挙げられる。哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用さ
れ得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、ＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓをコードするポリヌクレオチド配列は、後期プロモーターおよび三部分リー
ダー配列から成るアデノウイルス転写／翻訳複合体に結繋され得る。ウイルスゲ
ノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入は、感染宿主細胞中でＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓを発現し得る生育可能ウイルスを生じる（Logan and Shenk, Pro. Natl
. Acad. Sci. USA 81:3655-59, 1984）。さらに転写エンハンサー、例えばラウ
ス肉腫ウイルス（ＲＶＳ）エンハンサーは、哺乳類宿主細胞中での発現を増大す
るために用いられ得る。
【０１３１】 特に本発明は、１つまたはそれ以上の前記の配列を含む組換え構築物、例えば
発現構築物も包含する。構築物は、本発明のこのような配列が挿入されたベクタ
ー、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを含む。配列は、前進または逆配
向で挿入され得る。この点でのある種の好ましい実施態様では、構築物はさらに
、調節配列、例えば当該配列と操作可能的に連結されたプロモーターを含む。多
数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に既知であり、そして本発明に
用いるのに適した多数の市販ベクターが存在する。
【０１３２】 市販されている以下のベクターが、実例として提供される。細菌中で用いるた
めの好ましいベクターは、ｐＱＥ７Ｏ、ｐＱＥ６ＯおよびｐＱＥ−９（Qiagen U
SA, Valencia, CA）；ｐＢＳベクター、ファゲスクリプト（登録商標）ベクター
、ブルースクリプト（登録商標）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ16ａ、ｐＮＨ18
Ａ、ｐＮＨ46Ａ（Stratagene, La Jolla CA）；並びにｐｔｒｃ99ａ、ｐＫ223-3
、ｐＫＫ233-3、ｐＤＲ54Ｏ、ｐＲＩＴ5（Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J
.）である。最も好ましいのは、ｐＴｒｃＨｉｓＢベクター（Introgenから入手
可能）またはｐＥＴ15ｂベクター（Novagen）である。好ましい真核生物ベクタ
ーは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ44、ＰＸＴＩおよびｐＳＧ（Stra
tageneから入手可能）；ならびにＰＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶ
Ｌ（Pharmacia Biotechから入手可能）である。これらのベクターは、本発明の
この局面にしたがって用いるために当業者が利用可能である多数の市販の且つ周
知のベクターの実例として単に列挙されただけである。例えば宿主中での本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、保持、増殖または発現に適した
任意のその他のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの局面に用いられ得る
、と理解される。
【０１３３】 プロモーター領域は、候補プロモーター断片、即ちプロモーターを含有し得る
断片を導入するための単数または複数の制限部位の下流の、プロモーター領域を
欠くレポーター転写単位、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（「ｃａｔ」）転写単位を含有するベクターを用いて、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。周知のように、ｃａｔ遺伝子は、標準ＣＡＴ検定により検出
され得るＣＡＴ活性の生成を引き起こす。この目的に適したベクターは周知であ
り、容易に入手可能である。したがって本発明のポリヌクレオチドの発現のため
のプロモーターとしては、周知の且つ容易に入手可能なプロモーターだけでなく
、レポーター遺伝子を用いて前記の技法により容易に生成され得るプロモーター
も挙げられる。
【０１３４】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知の細菌プロ
モーターは、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロ
モーター、Ｔ５ｔａｃプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、ならびにｔｒｐおよびｌａｃプロモーターから得られるｔｒｃハイ
ブリッドプロモーターである。この点で適した既知の真核動物ぷPもは、ＣＭＶ
極初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期Ｓ
Ｖ40プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラウス肉腫ウ
イルス（「ＲＳＶ」）のもの、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えば
マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターである。
【０１３５】 宿主中での発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選定は周知の手
法であり、そして発現ベクター構築、宿主中へのベクターの導入ならびに宿主中
での発現のための必要な技法は、当業界でのルーチン技能である。
【０１３６】 一般に組換え発現ベクターは、複製起点、下流構造配列の転写を指図するため
の高度発現遺伝子由来のプロモーター、およびベクターへの曝露後に細胞を含有
するベクターの単離を可能にするための選択可能マーカーを包含する。
【０１３７】 本発明は、前記の構築物を含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞、例えば哺乳類細胞または下等真核生物細胞、例えば酵母細胞であり
得るし、あるいは宿主細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞であり得る。宿主細
胞中の構築物は、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を生成するために慣
用的方法で用いられ得る。
【０１３８】 ポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下で、哺乳類細胞、酵母、細菌ま
たはその他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物由
来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を生成するために用いられ得る。原核
生物および真核生物宿主とともに用いるための適切なクローニングおよび発現ベ
クターは、本明細書中の別の箇所で引用されているSambrook等により記載されて
いる。
【０１３９】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大され得る。エンハンサーは
、所定の宿主細胞型中でのプロモーターの転写活性を増大するよう作用する、通
常は約10〜300 bpのＤＮＡのシス作用阻止である。エンハンサーの例としては、
100〜270 bpで複製起点の後側に位置するＳＶ40エンハンサー、サイトメガロウ
イルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサ
ーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１４０】 本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチド
は一般に、発現のためにプロモーターに操作可能的に連結されるよう、標準技法
を用いてベクター中に挿入される。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソ
ーム結合部位に対して約5で位置するよう、配置される。リボソーム結合部位は
、発現されるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して5である。一般に、
開始コドン、通常はＡＵＧで始まり、そしてリボソーム結合部位と開始ＡＵＧの
間に置かれるその他のオープンリーディングフレームは存在しない。さらに一般
的に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンは存在せず、転写された領域の３末
端に適切に配置されるポリアデニルかシグナルおよび転写終結シグナルが存在す
る。
【０１４１】 小胞体の管腔中への、細胞周辺腔へのまたは細胞害環境中への翻訳化タンパク
質の分泌のために、適切な分泌シグナルが発現ポリペプチド中に組入れられ得る
。シグナルはポリペプチドに対して内因性であり、あるいはそれらは異種シグナ
ルであり得る。ポリペプチドは修飾形態で、例えば融合タンパク質で発現され、
そして分泌シグナルだけでなく付加的異種機能領域も包含し得る。したがって例
えば付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、ポリペプチドのＮ末端に付加
されて、精製中またはその後の取り扱い及び貯蔵中の宿主細胞中での安定性およ
び持続性を改良し得る。さらに精製を促すために特定の領域もポリペプチドに付
加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去され得る。中
でも分泌または排出を引き起こすための、安定性を改良するための、そして精製
を促すためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当業界でよく知られた且
つルーチンの技法である。例えば大量のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓが抗体の誘導のため
に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指図
するベクターが所望され得る。このようなベクターとしては、ハイブリッドタン
パク質が産生されるよう、アミノ末端Ｍｅｔおよびその後のβ−ガラクトシダー
ゼの7残基に関する配列で枠内でベクターにｐｒｏｓｔ−ｅｔｓコード配列が結
繋され得る、ブルースクリプト（登録商標）（Stratagene）のような多機能性大
腸菌クローニングおよび発現ベクター；ｐＩＮベクター（Van Heede and Shuste
r, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989）等が挙げられるが、これらに限定さ
れない。ＰｔｒｃＨｉｓベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）またはｐＥＴ15
ｂベクター（Stratagene）は、迅速精製のためにポリヒスチジン（6ｘＨｉｓ）
タグを含有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために用いら
れ得る。このような系で作製されるタンパク質は、当該クローン化ペプチドが随
意に融合ペプチド部分から放出され得るよう、切断部位、例えばエンテロキナー
ゼ切断部位を包含するよう意図される。
【０１４２】 選定プロモーターが誘導可能である適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度への宿主株の増殖後、それは適切な手段（例えば温度シフトまたは化学誘導
物質への曝露）により誘導され、細胞がさらなる期間培養される。
【０１４３】 次に細胞は典型的には遠心分離により収穫され、物理的または化学的手段によ
り崩壊され、その結果生じた組成抽出物がさらなる精製のために保持される。
【０１４４】 タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、任意の便利な方法により、例え
ば凍結融解周期、音波処理、機械的崩壊または細胞溶解剤の使用により崩壊され
得るが、このような方法は当業者には周知である。
【０１４５】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドは、周知の方法、例えば硫酸アンモニウムま
たはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー
、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ーおよびレクチンクロマトグラフィーにより、組換え体細胞培養から回収され、
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
が精製のために用いられる。タンパク質をリフォールディングするための周知の
技法は、ポリペプチドが単離および／または精製中に変性された場合に活性配座
を再生するために用いられ得る。当業界で周知のタンパク質精製の種々のその他
の方法としては、Deutscher, M., Methods in Enzymology, Vol 182, Academic
Press, San Diego, 1982およびScopes, R., Protein Purification: Principles
and Practice Springer-Verlag, New York, 1982に記載されているものが挙げ
られる。
【０１４６】 あるいは本発明のポリペプチドは、固相技法を用いた直接ペプチド合成により
生成され得る（Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freema
n Co., San Francisco, 1969；Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-21
54, 1963）。In vitroタンパク質合成は、手動技法を用いて、または自動操作に
より実施され得る。自動合成は、例えばメーカーにより提供される使用説明書に
したがって、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer, Foster
City, Calif）を用いて成し遂げられ得る。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの種々の断片は
別々に化学的に合成され、当業界で既知の化学的方法を用いて併合されて、全長
分子を生成し得る。
【０１４７】 本発明のポリペプチドは、天然精製産物、化学合成手法の産物、ならびに原核
生物または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞
から組換え技法により製造される生成物を包含する。組換え製造手法に用いられ
る宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化され、または非グリコシ
ル化され得る。さらに本発明のポリペプチドは、初期修飾メチオニン残基も、い
くつかの場合には宿主媒介性過程の結果として包含し得る。
【０１４８】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド
の使用 ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドおよびＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド
は、種々の用途のために、特にＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの化学的および生物学的特性
を使用する用途のために本発明にしたがって用いられ得る。付加的用途は、前立
腺癌のような細胞増殖の疾患の診断にならびに治療に関する。本発明のこれらの
局面は、以下の考察によりさらに説明され、本明細書の本体内にさらに記載され
ている。
【０１４９】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の使用のための原理は、一
部は、本明細書中に開示されたＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドおよびその他の
Ｅｔｓ様転写因子分子間の化学的および構造的相同に、そして他の組織と比較し
た場合の前立腺および乳房組織中でのＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの選択的発現に基づい
ている。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓは、前立腺組織の不適切な増殖に関連した症状、障
害または疾患の診断および治療に用いられ得る。これらの例としては、癌および
転移性腫瘍増殖が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】 ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡプローブとして、ならび
にアンチセンスおよびリボザイム両方のための標的として、あるいはアンチセン
スポリヌクレオチドの産生のための鋳型として用いられ得る。細胞へのこのよう
なアンチセンスポリヌクレオチドの投与は、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡの発
現を抑制するために用いられ得る。
【０１５１】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドおよびそれらの断片は、細胞および組織中の
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドのレベルを検出するのに、そして原発性および
転移性腫瘍に対して薬剤を標的化するのに有用であり得る。あるいはその活性に
関与するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの領域を特異的に認識する抗体は、Ｐ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性に関連した疾患または症状を治療するために投与され得る
。
【０１５２】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ含有細胞に対する免
疫応答を刺激するために用いられ得る。
【０１５３】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓをコードするポリヌクレオチドは、細胞および組織中のＰ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓをコードするポリヌクレオチドのレベルを検出するための診断
検定に有用であり得る。
【０１５４】 本発明のｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドおよびＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリ
ペプチドは、しばしば「遺伝子療法」と呼ばれる治療形式において、このような
ポリペプチドのin vitroおよびin vivoでの発現により本発明にしたがって用い
られ得る。前立腺癌のようなＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性に関連した症状では、ＰＲ
ＯＳＴ−Ｅｔｓの活性を抑制するのが有益であり得る。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性
は、それらがコードするポリペプチドが細胞内の優性陰性試薬として作用して、
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を遮断する腫瘍細胞中へのＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプ
チドの領域をコードするポリヌクレオチドの導入により抑制され得る。あるいは
優性陰性試薬として作用するポリペプチドは、腫瘍細胞中に直接導入されて、Ｐ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を遮断し得る。
【０１５５】 ポリヌクレオチド検定 本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオチドを検出するための
ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ関連ポリヌクレオチドの使用にも関する。疾患状態に関連し
たｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドの検出は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの組織特
異的発現に起因する疾患の診断または疾患に対する感受性を付加または規定し得
るin vitroおよびin vivo診断の開発のための道具を提供する。
【０１５６】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓをコードする遺伝子の突然変異を保有する個体は、種々の
技法によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断のためのポリヌクレオチド試料は
、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質から得られる。
ゲノムＤＮＡは検出のために直接用いられ得るし、あるいは分析前にＰＣＲを用
いて酵素的に増幅され得る（Saiki et al., Nature, 324: 163-166, 1986）。Ｒ
ＮＡまたはｃＤＮＡも、同様に用いられ得る。一例として、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
をコードするポリヌクレオチドと相補的なＰＣＲプライマーは、ｐｒｏｓｔ−ｅ
ｔｓ発現および突然変異を同定し、分析するために用いられ得る。例えば欠失お
よび挿入は、正常遺伝子型との比較に際して、増幅産物のサイズの変化により検
出され得る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを放射能標識化ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓＲＮ
Ａあるいは放射能標識化ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓアンチセンスＤＮＡ配列とハイブリ
ダイズさせることにより同定され得る。完全適正配列は、ＲＮアーゼＡ消化によ
り、または融点の差により、不適正二重鎖と区別され得る。
【０１５７】 参照遺伝子と突然変異を有する遺伝子との間の配列差は、直接ＤＮＡシーケン
シングによっても明示され得る。さらにクローン化ＤＮＡセグメントをプローブ
として用いて、特定のＤＮＡセグメントを検出し得る。このような方法の感度は
、ＰＣＲまたは別の増幅方法の適切な使用により非常に強化され得る。例えばシ
ーケンシングプライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物または変法ＰＣＲにより精製され
る一本鎖鋳型分子とともに用いられる。配列決定は、放射能標識化ポリヌクレオ
チドを用いる慣用的手法により、または蛍光タグを用いる自動シーケンシング手
法により実施される。
【０１５８】 ＤＮＡ配列差に基づいた遺伝子検定は、変性剤を用いる場合と用いない場合の
ＤＮＡ断片の電気泳動的移動性の変化の検出により成し遂げられる。小配列欠失
および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により可視化され得る。異なる配列のＤＮ
Ａ断片は、異なるＤＮＡ断片の移動性がそれらの特定の融解または部分融解温度
により異なる位置でゲル中で遅延される変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別され
得る（例えばMyers et al., Science, 230: 1242, 1985参照）。
【０１５９】 特定の位置での配列変化は、ヌクレアーゼプロテクション検定により、例えば
ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクションまたは化学切断方によっても明示され得る
（例えば、Catton et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401, 1985）
。
【０１６０】 したがって特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ
プロテクション、化学的切断、直接ＤＮＡシーケンシングまたは制限酵素の使用
（例えば制限断片長多型（「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッテ
ィング）により成し遂げられ得る。
【０１６１】 より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡシーケンシングのほかに、突然変異は
in situ分析によっても検出され得る。
【０１６２】 ポリペプチド検定 本発明は、診断検定、例えば正常および異常レベルの確定を含めた細胞および
組織および体液中のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドのレベルを検出するための
定量的および診断的検定にも関する。したがって例えば正常対照組織試料と比較
した場合のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明
の診断検定は、新生物、例えば前立腺癌の存在を検出するために用いられ得る。
このような診断試験は、同様に転移性腫瘍増殖を検出するために用いられ得る。
宿主から得られた試料中の本発明のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドのようなポ
リペプチドのレベルを確定するために用いられ得る検定技法は、当業者には周知
である。このような検定方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合
結合検定法、ウエスタンブロット分析および酵素結合アブソーバント検定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）、および蛍光標示式細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これ
らの中で、ＥＬＩＳＡがしばしば選択される。ＥＬＩＳＡ検定は最初に、ＰＲＯ
ＳＴ−Ｅｔｓに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを
包含する。さらに、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が一般的に調
製される。レポーター抗体は、検出可能試薬、例えば放射性、蛍光または酵素試
薬、本実施例においてはホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素に結合される
。
【０１６３】 ＥＬＩＳＡを実行するために、試料は宿主から取り出され、試料中のポリペプ
チドを結合する固体支持体、例えばポリスチレン皿上でインキュベートされる。
次に皿上の任意の遊離ポリペプチド結合部位は、ウシ血清アルブミンのような非
特異的タンパク質とともにインキュベートすることにより被覆される。次にモノ
クローナル抗体が皿中でインキュベートされるが、この時間中、モノクローナル
抗体は、ポリスチレン皿に結合された任意のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドと
結合する。非結合モノクローナル抗体は緩衝液で洗い落とされる。ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体は皿中に入れられて、ＰＲ
ＯＳＴ−Ｅｔｓに結合された任意のモノクローナル抗体とのレポーター抗体の結
合を生じる。次に非結合レポーター抗体が洗い落とされる。次に比色定量基質を
含めたペルオキシダーゼ活性のための試薬がさらに付加される。一次および二次
抗体を介してＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに連結された固定化ペルオキシダーゼは、着色
反応産物を生成する。所定時間で発色した色の量は、試料中に存在するＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓポリペプチドの量を示す。定量的結果は、典型的には標準曲線に対す
る参照により得られる。
【０１６４】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに特異的な抗体が固体支持体に結合され、標識化ＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓおよび宿主由来の試料が固体支持体上に通されて、固体支持体に結合
された検出される標識の量は、試料中のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの量と相関し得る競
合検定が用いられ得る。
【０１６５】 これらのおよびその他の検定は、中でも、Hampton等（Serological Methods,
a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn. 1990）およびMaddox等（J.
Exp. Med. 158: 12111, 1983）に記載されている。
【０１６６】 抗体 本発明はさらに、本明細書中でＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体と呼ばれるＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓと特異的に結合する抗体に関する。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの前立腺特異性
は、それを、スクリーニング、診断、予後、追跡検定および造像法のための優れ
たマーカーにする。さらにこの特性は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓが治療的方法、例え
ば標的化抗体療法、免疫療法および遺伝子療法のための優れた標的であり得るこ
とを示す。本明細書中で用いる場合、「〜と特異的に結合する」という用語は抗
体とポリペプチドとの相互作用を指し、この場合、相互作用はポリペプチド上の
特定の構造（即ち抗原決定基またはエピトープ）の存在によっている；言い換え
れば、抗体は概してタンパク質というよりむしろ特異的ポリペプチド構造を認識
し、それと結合している。
【０１６７】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド、それらの断片またはその他の誘導体、ある
いはその類似体またはそれらを発現する細胞は、それに対する抗体を産生するた
めの免疫原として用いられ得る（Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Pre
ss, NY (1989)）。これらの抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナ
ル抗体であり得る。本発明は、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａ
ｂ断片またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も包含する。当業界で既知の種々の
手法が、このような抗体および断片の産生のために用いられ得る。
【０１６８】 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物、好ましくは非ヒトにポリペプチドを
投与することにより得られる。そのようにして得られた抗体は次に、ポリペプチ
ドそれ自体を結合する。このようにして、ポリペプチドの断片のみをコードする
配列でさえ、全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成するために用いられ得る
。このような抗体は次に、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを
単離するために用いられ得る。
【０１６９】 モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養により産生される抗体を
提供する任意の技法が用いられ得る。例としては、ハイブリドーマ技法（Kohler
and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法
（Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983）およびヒトモノクローナル
抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al., in Monoclon
al Antibodies and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77-96, 1985）が挙げられる
。
【０１７０】 さらに「キメラ抗体」の製造のために開発された技法である、適切な抗原特異
性および生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子に対するマウス
抗体遺伝子のスプライシングが用いられ得る（Morrison et al., Pro. Natl. Ac
ad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1984；Neuberger et al., Nature 312: 604-608,
1984；Takeda et al., Nature 314: 452-454, 1985）。あるいは一本鎖抗体の
製造に関して記載された技法（米国特許第4,946,778号）がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
特異的一本鎖抗体を製造するために適応され得る。
【０１７１】 Orlandi等（Pro. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, 1989）およびWinter
とMilstein（Nature 349: 293-299, 1991）に開示されているように、抗体はリ
ンパ球集団中でのin vivo産生を誘導することにより、または組換え体免疫グロ
ブリンライブラリーまたは高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすること
により産生され得る。
【０１７２】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに関する特異的結合部位を含有する抗体断片も生成され得
る。例えばこのような断片としては、抗体分子のペプシン消化により産生され得
るＦ（ａｂ‘）2断片、ならびにＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元す
ることにより生成され得るＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいはＦａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａ
ｂ断片の迅速且つ容易な同定を可能にするよう構築され得る（Huse et al., Sci
ence 256: 1270-1281, 1989）。
【０１７３】 本明細書中に示されるＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓのアミノ酸配列を用いて、抗体を生
成するためのＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの特異的領域を選定し得る。当業
者に理解されるように、抗体が向けられるＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの領
域またはエピトープは、意図される用途に伴って変わり得る。例えば前立腺細胞
上の膜結合ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの検出のための免疫検定に用いるために意図され
た抗体は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド上の近づき得るエピトープに向けら
れる必要がある。免疫原性構造を示すＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの領域な
らびにその他の領域およびドメインは、当業界で既知の種々のその他の方法、例
えばChou-Fasman、Garnier-RobsonまたはJameson-Wolf分析を用いて容易に同定
され得る。これらの残基を含有する断片は、抗ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体を生成す
るのに特に適している。特に有用な断片としては、配列ERRDWSPSPPATPEQGLS（配
列番号６）、EQFRQRSPLGGD（配列番号７）およびNYDKLSRSIRQYYKK（配列番号８
）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの領域に対するポリクローナ
ル抗体の生成は、実施例４に記載されている。
【０１７４】 本発明のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、前立腺癌の処置のための診断検定、造像
法および治療方法に特に有用であり得る。本発明は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペ
プチドの検出のために、ならびに前立腺癌の診断のために有用な種々の免疫学的
検定を提供する。このような検定は一般に、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを
認識し、結合し得る１つまたはそれ以上のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体を含む。最も
好ましい抗体はＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに選択的に結合し、非ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポ
リペプチドには結合しない（または弱く結合する）。検定は当業界で周知の種々
の免疫学的検定フォーマットを包含し、その例としては種々の種類のラジオイム
ノアッセイ、酵素結合イムノアブソーベント検定等が挙げられるが、これらに限
定されない。さらに前立腺癌を検出し得る免疫学的造像法も本発明により提供さ
れ、その例としては標識化ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体を用いる放射性シンチグラフ
造像法が挙げられるが、これに限定されない。このような検定は、前立腺癌の検
出、モニタリングおよび予後において臨床的に有用であり得る。
【０１７５】 前記の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによる単離および／または
精製のために固体支持体に抗体を結合することにより、ポリペプチドを発現する
クローンを単離しまたは同定するために、あるいは本発明のポリペプチドを精製
するために用いられ得る。
【０１７６】 さらにＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、細胞分取および精製技法を用いてＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓ陽性細胞を単離するために用いられ得る。特にＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗
体は、抗体ベースの細胞分取またはアフィニティー精製技法を用いて、異種移植
腫瘍組織から、培養中の細胞等から前立腺癌細胞を単離するために用いられ得る
。本発明のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体のその他の用途としては、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓポリペプチドに類似する抗イディオタイプ抗体の生成が挙げられる。
【０１７７】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、前立腺癌または腫瘍転移の存在を検出するために
用いられ得る。種々の生物学的試料、例えば血清、前立腺およびその他の組織生
検検体内のこのようなＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ含有細胞の存在は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓ抗体により検出され得る。さらにＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、種々の造像法、
例えばＴｃ−99m（またはその他の同位元素）接合抗体を用いるイムノシンチグ
ラフィーにおいて、用いられ得る。例えばＩｎ−111接合抗ＰＳＭＡ抗体を用い
て近年記載されたものと同様の造像プロトコールを用いて、再発性および転移性
前立腺癌腫を検出し得る（Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997
）。
【０１７８】 本発明のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、検出可能マーカーで標識され得るし、あ
るいは二次分子、例えば細胞傷害剤と共役され、そしてＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ陽性
細胞に二次分子を標的化するために用いられ得る（Vitetta, E.S. et al., Immu
notoxin Therapy, in DeVita, Jr. V.T. et al., eds, Cancer: Principles and
Practice of Oncology, 4th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-
2636, 1993）。細胞傷害剤の例としては、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビ
シン、タキソール、臭化エチジウム、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、
ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオ
ン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、
ＰＥ４０、アブリンおよび糖質コルチコイドならびにその他の化学療法剤ならび
に放射性同位元素が挙げられるが、これらに限定されない。適切な検出可能マー
カーとしては、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物
、金属キレート化剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。適切な
放射性同位元素としては、以下のものが挙げられる：アンチモン−124、アンチ
モン−125、砒素−74、バリウム−103、バリウム−140、ベリリウム−7、ビスマ
ス−j206、ビスマス−207、カドミウム−109、カドミウム−115m、カルシウム−
45、セリウム−139、セリウム−141、セリウム−144、セシウム−137、クロム−
51、コバルト−56、コバルト−57、コバルト−58、コバルト−60、コバルト−64
、エルビウム−169、ユウロピウム−152、ガドリニウム−153、金−195、金−19
9、ハフニウム−175、ハフニウム−175-181、インジウム−11、ヨウ素−123、ヨ
ウ素−131、イリジウム−192、鉄−55、鉄−59、クリプトン−85、鉛−210、マ
ンガン−54、水銀−197、水銀−203、モリブデン−99、ネオジム−147、ネプツ
ニウム−237、ニッケル−63、ニオブ−95、オスミウム−185+191、パラジウム−
103、白金−195m、プラセオジム−143、プロメチウム−147、プロトアクチニウ
ム−233、ラジウム−2226、レニウム−186、ルビジウム−86、ルテニウム−103
、ルテニウム−106、スカンジウム−44、スカンジウム−46、セレン−75、銀−1
10m、銀−11、ナトリウム−22、ストロンチウム−85、ストロンチウム−89、ス
トロンチウム−90、硫黄−35、タンタル−182、テクネチウム−99m、テルル−12
5、テルル−132、タリウム−204、トリウム−228、トリウム−232、タリウム−1
70、スズ−113、チタン−44、タングステン−185、バナジウム−48、バナジウム
−49、イッテルビウム−169、イットリウム−88、イットリウム−90、イットリ
ウム−91、亜鉛−65およびジルコニウム−95。
【０１７９】 前立腺癌のための免疫療法 本発明は、前立腺癌を治療するための種々の免疫治療方法、例えば抗体療法、
in vivoっワクチンおよびex vivo免疫療法アプローチを提供する。一アプローチ
において、本発明は、前立腺癌を治療するために全身的に用いられ得るＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓ抗体を提供する。例えば非接合化ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、抗体が
前立腺癌細胞上または中のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと結合し、補体媒介性細胞溶解、
抗体依存性細胞性細胞傷害性、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの生理学的機能変更、および
／またはリガンド結合またはシグナル伝達経路の抑制を包含し得るメカニズムに
より細胞および腫瘍の破壊を媒介するよう、患者に導入され得る。リシンまたは
放射性同位元素のような毒性作因に接合されたＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、ＰＲ
ＯＳＴ−Ｅｔｓ保有前立腺腫瘍細胞に直接毒性作因を送達し、それにより腫瘍細
胞を破壊するために治療的にも用いられ得る。
【０１８０】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体を用いる前立腺癌免疫療法は、他の種類の癌、例えば
結腸癌（Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18:133-138, 1998）、多発性骨髄
腫（Ozaki et al., Blood 90: 3179-3186, 1997；Tsunenari et al., Blood 90:
2437-2444, 1997）、胃癌（Kasprzyk et al., Cancer Res. 52: 2771-2776, 19
92）、Ｂ細胞リンパ腫（Funakoshi et al., Immunther. Emphasis Tumor Immuno
l. 19: 93-101, 1996）、白血病（Zhong et al., Leuk. Res. 20: 581-589, 199
6）、結腸直腸癌（Moun et al., Cancer Res. 54: 6160-6166, 1994；Velders e
t al., Cancer Res. 55: 4398-4403, 1995）および乳癌（Shepard et al., J. C
lin. Immunol. 11: 117-127, 1991）に関して首尾よく用いられたことのある種
々のアプローチから生じた教示に従い得る。
【０１８１】 本発明はさらに、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドまたはその断片を含有する
よう処方されたワクチンを提供する。抗癌療法に用いるための体液性および細胞
媒介性免疫を生成するためのワクチン中での腫瘍抗原の使用は当業界で周知であ
り、ヒトＰＳＭＡおよび齧歯類ＰＡＰ免疫原を用いて前立腺癌に用いられてきた
（Hodge et al., Int. J. Cancer 63: 231-237, 1995；Fong et al., J. Immuno
l. 159: 3113-3117, 1997）。このような方法は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプ
チドまたはその断片、あるいはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ免疫原を発現し、適切に提示
し得るＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓコード核酸分子および組換えベクターを用いて前立腺
癌に用いられてきた。
【０１８２】 例えばウイルス遺伝子送達系を用いて、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓコード核酸分子を
送達し得る。本発明のこの局面の実施に用いられ得る種々のウイルス遺伝子送達
系としては、ワクチン、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス、インフルエンザ、
ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスおよびシンドビスウイル
スが挙げられるが、これらに限定されない（Restifo, in Curr. Opin, Immunol.
8: 658-663, 1996）。非ウイルス送達系も、抗腫瘍応答を誘導するために患者
に導入される（即ち筋内的に）ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドまたはその断片
をコードする裸ＤＮＡを用いることにより用いられ得る。一実施態様では、全長
ヒトｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｃＤＮＡが用いられ得る。別の実施態様では、ヒトｐ
ｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｃＤＮＡ断片が用いられ得る。別の実施態様では、特異的Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ核酸分子が用い
られ得る。ＣＴＬエピトープは、特異的ＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＰ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド内のペプチドを同定するために特定のアルゴリズ
ム（例えば、Epimer, Brown University）を用いて確定され得る。
【０１８３】 種々のex vivo戦略も用いられ得る。一アプローチは、患者の免疫系に対して
抗原としてＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを提示するための樹状細胞の使用を
包含する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７同時刺激剤およびＩＬ
−12を発現し、したがって高度特殊化抗原提示細胞である。前立腺癌においては
、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドでパルス化された自系樹状細胞が
、Ｉ期臨床試験に用いられて、前立腺癌患者の免疫系を刺激する（Tjoa et al.,
Prostate 28: 65-69, 1996；Murphy et al., Prostate 29: 371-380, 1996）。
樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の情況でＴ細胞に対してＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓポリペプチドを提示するために用いられ得る。一実施態様では、自系樹
状細胞は、ＭＨＣ分子と結合し得るＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドによりパル
ス化される。別の実施態様では、樹状細胞は完全ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチ
ドでパルス化される。
【０１８４】 さらに別の実施態様は、当業界で既知の種々の要件を満たしているベクター、
例えばアデノウイルス（Arthur et al., Cancer Gene Ther. 4: 17-25, 1997）
、レトロウイルス（Henderson et al., Cancer Res. 56: 3763-3770, 1996）、
レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ribas et
al., Cancer Res. 57: 2865-2869, 1997）および腫瘍由来ＲＮＡトランスフェ
クション（Ashley et al., J. Exp. Med. 186: 1177-1182, 1997）を用いて樹状
細胞中でｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ遺伝子の過剰発現を工学処理することを包含する。
【０１８５】 抗イディオタイプ抗ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ抗体は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプ
チドを発現する細胞に免疫応答を誘導するためのワクチンとして抗癌療法に用い
られ得る。特に抗イディオタイプ抗体の生成は当業界で周知であり、ＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓポリペプチド上のエピトープによく似た抗イディオタイプ抗ＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓ抗体を生成するために容易に適応され得る（例えばWagner et al., Hyb
ridoma 16: 33-40, 1997；Foon et al., J. Clin. Invest. 96: 334-342, 1995
；Herlyn et al., Cancer Immunol. Immunother. 43: 65-76, 1996参照）。この
ような抗イディオタイプ抗体は、腫瘍抗原に向けられる他の抗イディオタイプ抗
体を用いて目下実行されているように、抗イディオタイプ療法に用いられ得る。
【０１８６】 遺伝子感作方法は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを発現する癌細胞に向けられる予防的
または治療的体液性および細胞性免疫応答を生成するために用いられ得る。本明
細書中に記載したＰＲＯＳＴ−ＥｔｓコードＤＮＡ分子を用いて、筋肉または皮
膚の細胞が構築物を取り込み、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド／免疫原を発現
するよう、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド／免疫原をコードするＤＮＡおよび
適切な調節配列を含む構築物が個体の筋肉または皮膚に直接注射され得る。ＰＲ
ＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド／免疫原の発現は、前立腺癌に対する予防的または
治療的体液性および細胞性免疫の生成を引き起こす。当業界で既知の種々の予防
的および治療的遺伝子感作技法が用いられ得る（インターネットアドレスwww.ge
nweb.comに発表された情報および参考文献を参照）。
【０１８７】 遺伝子療法 本発明のｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドおよびＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリ
ペプチドは、しばしば「遺伝子療法」と呼ばれる治療様相におけるin vitroおよ
びin vivoでのこのようなポリペプチドの発現により本発明にしたがって用いら
れ得る。
【０１８８】 したがって例えば患者からの細胞は、ex vivoでポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡで工学処理され、次に工学処理細胞
は処置される患者にポリペプチドを提供し得る。例えば細胞は、本発明のポリペ
プチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用
により、ex vivoで工学処理され得る。このような方法は当業界で周知であり、
本発明におけるそれらの使用は、本明細書中の教示から明らかである。
【０１８９】 同様に細胞は、当業界で既知の手法によりin vivoでのポリペプチドの発現の
ためにin vivoで工学処理され得る。例えば本発明のポリヌクレオチドは、前記
のように、複製欠陥性レトロウイルスベクター中での発現のために工学処理され
得る。次にレトロウイルス発現構築物は単離され、パッケージング細胞がここで
当該遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生成するよう、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
されたパッケージング細胞中に導入され得る。これらのプロデューサー細胞は、
in vivoで細胞を工学処理し、そしてin vivoでポリペプチドを発現するために患
者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するため
のこれらのおよびその他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかになる必
要がある。
【０１９０】 本明細書中で前記したレトロウイルスプラスミドベクターが得られるレトロウ
イルスの例としては、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レト
ロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウ
イルス、ギボンザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レンチウイルス、
骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび哺乳類腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限
定されない。一実施態様では、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーネ
ズミ白血病ウイルスから得られる。
【０１９１】 レトロウイルス以外のウイルス、即ちＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス
およびアデノ随伴ウイルス、ならびにヘルペスウイルスおよびそれらの誘導体も
、選定ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリヌクレオチドを送達するために用いられ得る。当
該ヌクレオチド配列を含有するプラスミドも、脂質または脂質誘導体との複合体
中で、ならびにin vitroまたはin vivoでの細胞中へのポリヌクレオチドの送達
を促すことが既知である種々のその他の生物学的および化学的試薬との複合体中
で送達され得る（Walter and Stein, Gene Therapy of Cancer: Methods and Pr
otocols, Human Press, Totowa, NJ, 2000）。
【０１９２】 このようなベクターは、ポリペプチドを発現するために１つまたはそれ以上の
プロモーターを包含する。用いられ得る適切なプロモーターとしては、レトロウ
イルスＬＴＲ；ＳＶ40プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモーター（Miller et al., Biotechniques 7: 980-990, 1989）またはそ
の他のプロモーター（例えば細胞性プロモーター、例えば真核生物細胞プロモー
ター。その例としてはヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβアクチンプ
ロモーターが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに
限定されない。用いられ得るその他のウイルスプロモーターとしては、アデノウ
イルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ19パルボ
ウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは
、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然プロモーターでもあり得る。
適切なプロモーターの選定は、本明細書中に含入された教示から当業者には明ら
かである。
【０１９３】 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して
、プロデューサー細胞株を生成するために用いられる。トランスフェクトされ得
るパッケージング細胞の例としては、Miller, A., Human Gene Therapy 1: 5-14
, 1990に記載されているようなＰＥ５ＯＩ、ＰＡ317、Ｙ−2、Ｙ−ＡＭ、ＰＡＩ
2、Ｔ19-14Ｘ、ＶＴ−19-17−Ｈ2、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−86、ＧＰ
＋ｅｎｖＡＭＩ2およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターは、当業界で既知の任意の手段によりパッケージング細胞中に形質導入
され得る。このような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用およびＣａＰ
Ｏ4沈降が挙げられるが、これらに限定されない。一代替法では、レトロウイル
スプラスミドベクターは、リポソーム中に封入されるか、または脂質と結合され
、次に宿主に投与される。
【０１９４】 プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（
単数または複数）を包含する感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。こ
のようなレトロウイルスベクター粒子は次に、in vitroまたはin vivoで真核生
物細胞に形質導入するために用いられ得る。形質導入化真核生物細胞は、ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド（単数または複数）を発現する。形質導入
され得る真核生物細胞としては、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血性幹細
胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋原細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上
皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】 前記の種類のウイルスおよび非ウイルスベクターを用いて、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列、ならびにそ
れらの配列と相補的なポリヌクレオチド（即ちアンチセンスポリヌクレオチド）
を送達し得る。センスポリヌクレオチドは、全長ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡ
またはその断片をコードし得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、ｐｒｏｓｔ
−ｅｔｓ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域と相補的であり、そして任意の
長さであり得る。アンチセンスポリヌクレオチドの送達は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
タンパク質のレベルを低減するのに役立ち、そしてＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓタンパク
質レベルの低減が望ましい疾患に対して治療的であり得る。
【０１９６】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの断片をコードするポリヌクレオチドのin vivo発現も、
細胞中のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの生物学的活性を調整するために用いられ得る。こ
のような発現ポリペプチドは、ＤＮＡとのまたは調節タンパク質との結合に関し
てネイティブＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドと競合する。このような発現ポリ
ペプチドはしばしば、優性陰性ポリペプチドと呼ばれ、それらをコードするポリ
ヌクレオチドは優性陰性ポリヌクレオチドと呼ばれる。発現されるＰＲＯＳＴ−
Ｅｔｓポリペプチドの好ましい断片は、アミノ酸１３１〜２１３または２４６〜
３３２を含有するものであって、これはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドのぞれ
ぞれポインテッドおよびＥｔｓドメインを表す（Foos et al., J. Biol. Chem.
273: 18871-18880, 1998）。
【０１９７】 アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスベクターおよびリボザイム ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓと相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、合成的に調
製され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、細胞中へのアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの取込みを助け得る脂質を用いてまたは用いずに、細胞中に送達さ
れ得る。
【０１９８】 あるいはレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイル
スから得られる、あるいは種々の細菌プラスミドから得られる発現ベクターも、
アンチセンスｐｒｏｓｔ−ｅｔｓを発現する組換えベクターの構築および送達の
ために用いられ得る（例えば、Sambrook et al.(上記)およびAusubel et al.(上
記)に記載された技法を参照）。
【０１９９】 全長ｃＤＮＡ配列および／またはその調節素子を含むポリヌクレオチドは、遺
伝子機能の調節のために、センス鎖（Youssoufian and Lodish, Mol. Cell. Bio
l. 13: 98-104, 1993）またはアンチセンス鎖（Eguchi et al., Annu. Rev. Bio
chem. 60: 631-652, 1991）における検査道具としてｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌ
クレオチドを研究者が用いることを可能にする。このような技法は、目下当業者
には周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴマーあるいは大型断片が、コ
ードまたは制御領域に沿って、種々の位置から設計され得る。
【０２００】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓをコードする遺伝子は、高レベルの所望のｐｒｏｓｔ−ｅ
ｔｓポリヌクレオチド断片を発現する発現ベクターで細胞または組織をトランス
フェクトすることにより止められる。このような構築物は、非翻訳可能センスま
たはアンチセンス配列で細胞をあふれさせ得る。特に好ましいアンチセンス配列
としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない： UCCACCUGUGGCAGUUCCUCAAG（13594；配列番号９）、 UGACUCGACAAAGGCCACAGGCA（13595；配列番号１０）、および CCAGCAUUUCCAGAGCAGAGCCU（13642；配列番号１１）。ＤＮＡへの取込みの非存
在下でも、このようなベクターは、全てのコピーが内因性ヌクレアーゼにより無
能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続け得る。一過性発現は、非複製ベクター
により１ヶ月またはそれ以上の間存続し、適切な複製素子がベクター系の一部で
ある場合にはそれ以上長いこともあり得る。
【０２０１】 前記のように、遺伝子発現の修飾は、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓの領域、即ちプロモ
ーター、エンハンサーおよびイントロンを制御するようアンチセンス分子、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡを設計することにより得られる。転写開始部位、例えばリーダー
配列の−10〜＋10領域から得られるオリゴヌクレオチドが好ましい。アンチセン
ス分子も、転写体がリボソームと結合しないようにすることにより、ｍＲＮＡの
翻訳を遮断するよう設計され得る。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて
、抑制が成し遂げられ得る。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または
調節分子の結合に十分に開く二重らせんの能力を危うくする。三重鎖ＤＮＡを用
いた近年の治療的進展は、Gee, J.E. et al.（in Huber and Car, Molecular an
d Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994）
により再検討された。
【０２０２】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒し得る酵素性ＲＮＡ分子である（米
国特許第4,987,071号；WO 93/23057）。リボザイム作用のメカニズムは、相補性
標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後の
エンドヌクレアーゼ分解性切断を包含する。ＰＲＯＳＴ−ＥｔｓをコードするＲ
ＮＡのエンドヌクレアーゼ分解性切断を特異的且つ効率的に触媒し得る工学処理
ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は本発明の範囲内である。任意の考え得
るＲＮＡ標的内の特定のリボザイム切断部位は、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵお
よびＧＵＣを含むリボザイム切断部位に関して標的分子を走査することにより、
最初に同定される。一旦同定されれば、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に
対応する15〜20リボヌクレオチドという短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチド
を操作不可能にさせ得る二次構造特徴に関して評価され得る。リボヌクレアーゼ
プロテクション検定を用いて相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンに対する被影響性を試験することにより、候補標的の適合性も評価され得る
（Irie et al., Advance, Pharmacol. 40: 207-257, 1997）。
【０２０３】 本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成のための当
業界で既知の任意の方法により調製され得る。これらの例としては、固相ホスホ
ロアミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技
法が挙げられる。あるいはＲＮＡ分子は、in vitroおよびin vivo転写により、
あるいはＰＲＯＳＴ−ＥｔｓをコードするＤＮＡ配列により生成され得る。この
ようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターを有する広範な種々のベクター中に組入れられ得る。あるいは、アンチ
センスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、構成的または誘導的に
細胞株、細胞または組織中に導入され得る。
【０２０４】 ＲＮＡ分子は、細胞内安定性および半減期を増大するよう修飾され得る。考え
得る修飾としては、分子の５‘および／または３’末端でのフランキング配列の
付加、あるいは分子の主鎖ないのホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロ
チオエートまたは２‘Ｏ−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない
。安定性増大は、非伝統的塩基、例えばイノシンおよびクエオシン、ならびに内
因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニ
ン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾形
態の含入によっても達成され得る。
【０２０５】 細胞または組織中にアンチセンスベクターを導入する方法としては、以下で考
察される方法、そしてin vivo、in vitroおよびex vivo療法に同等に適している
方法が挙げられる。Ex vivo療法に関しては、米国特許第5,399,493号および第5,
437,994号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に示され
ているように、アンチセンスベクターが、患者から採取した細胞中に導入され、
自系移植片用にクローン増殖させて、同一患者に戻す。トランスフェクションに
よる、ならびにリポソームあるいは他の脂質ベースのまたは非脂質ベースの作因
による送達が、当業界では周知である。
【０２０６】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと結合する作因を同定するための検定 本発明は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと結合する作因を同定するために用いられ得る
検定および方法にも関する。特にＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと結合する作因は、ＰＲＯ
ＳＴ−Ｅｔｓと結合するＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓリガンドまたは他の作因または構成
分の能力によりおよび／またはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を抑制／刺激する能力に
より同定され得る。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを用いたＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓ活性（例えば結合）に関する検定は、高スループットスクリーニング法に用い
るのに適している。一実施態様では、検定は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを試験作因ま
たは細胞抽出物と混合することを包含する。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと作因または抽
出物の構成成分との会合を可能にする条件下での混合後、混合物が分析されて、
作因／構成成分がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓに結合されているか否かが確定される。結
合作因／構成成分は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓと結合し得ると同定される。交替的に
または引き続いて、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性のアゴ
ニストおよびアンタゴニストを同定するための一手段として直接査定され得る。
【０２０７】 あるいは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドに結合する作因は、酵母２ハイブ
リッド系または結合捕獲検定を用いて同定され得る。酵母２ハイブリッド系では
、２つのサブＵニット転写因子のうちの一方のサブユニットおよびＰＲＯＳＴ−
Ｅｔｓポリペプチドから作製された融合タンパク質をコードする発現単位が、酵
母細胞中に導入され、発現される。細胞は、（１）その発現が発現のための２つ
のサブユニット転写因子を必要とする検出可能マーカーをコードする発現単位、
ならびに（２）転写因子の第二サブユニットおよびＤＮＡのクローン化セグメン
トから作製される融合タンパク質をコードする発現単位を含有するようさらに修
飾される。ＤＮＡのクローン化セグメントがＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドと
結合するタンパク質をコードする場合、発現は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓおよびコー
ド化タンパク質の相互作用を引き起こす。これは転写因子の２つのサブユニット
を結合近接性にさせて、転写因子の再構成を可能にする。これは，検出可能マー
カーの発現を引き起こす。酵母ハイブリッド系は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの細胞結
合相手に関してセグメントをコードするｃでなのライブラリーをスクリーニング
するのに特に有用である。
【０２０８】 前記の検定に用いられ得るＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドとしては、単離Ｐ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの断片、ＰＲ
ＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを発現するよう変えられた細胞、あるいはＰＲＯＳ
Ｔ−Ｅｔｓポリペプチドを発現するよう変更された細胞の分画が挙げられるが、
これらに限定されない。さらにＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドは、全ポリペプ
チドまたはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの限定断片であり得る。それは、Ｐ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドが、例えば分子量または活性の変動により結合す
る作因に関して検定され得る限り、本発明の検定が用いられ得るということは、
当業者には明らかである。作因／細胞構成成分がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチ
ドと結合するか否かを確認するために用いられる方法は、用いられるＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓポリペプチドの性質に主に基づいている。あるいは免疫検出およびバイ
オチップ技法は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを用いた使用に適合され得る
。特定の作因がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドと結合するか否かを確定するた
めの多数の当業界で既知の技法を、当業者は容易に用い得る。
【０２０９】 作因および細胞構成成分はさらに、無細胞検定系または細胞検定計を用いて、
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの活性を調整する能力に関して試験され得る。
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの活性がより限定されるようになると、同定活
性を基礎にした機能検定が用いられ得る。
【０２１０】 本明細書中で用いる場合、作因は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を低減する場合、
ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を相殺すると言われる。好ましいアンタゴニストは、Ｐ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓを選択的に相殺し、任意のその他の細胞タンパク質に影響を及
ぼさない。さらに好ましいアンタゴニストは、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を50％以
上低減し、さらに好ましくは90％以上低減し、最も好ましくは全てのＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓ活性を排除する。
【０２１１】 前記の方法で検定される作因は、無作為に選択されるか、あるいは合理的に選
択または設計され得る。本明細書中で用いる場合、作因は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
ポリペプチドの特定の配列を考慮せずに無作為に選定されるばあくぃ、無作為に
選択されると言われる。無作為選定作因の一例は、化学的ライブラリーまたはペ
プチド組合せライブラリー、あるいは生物体の成長ブロスまたは植物抽出物の使
用である。
【０２１２】 本明細書中で用いる場合、作因は、標的部位および／または作因の作用と結び
つけたその配座の配列を考慮に入れる非無作為ベースで選択される場合、合理的
に選定または設計されると言われる。作因は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド
を作り上げるペプチド配列を利用することにより合理的に選択され、または合理
的に設計され得る。例えば合理的に選択されたペプチド作因は、そのアミノ酸配
列がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの断片と同一であるペプチドであり得る。
【０２１３】 本発明の方法で試験される作因は、実例として、ペプチド、オリゴヌクレオチ
ド、小分子およびビタミン誘導体、ならびに炭水化物であり得る。本発明のスク
リーニング法に用いられる作因の構造的性質に関しては制限はない、と当業者は
容易に認識し得る。本発明のある種類の作因は、そのアミノ酸配列がＰＲＯＳＴ
−Ｅｔｓポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて選択されるペプチド作因である
。
【０２１４】 ペプチド作因は、当業界で既知のような標準固相（または液相）ペプチド合成
法を用いて調製され得る。さらにこれらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販
のオリゴヌクレオチド合成機器を用いて合成され、標準組換え体産生系を用いて
組換え的に製造され得る。固相ペプチド合成を用いた製造は、無遺伝子コード化
アミノ酸が含まれる場合に必要とされる。
【０２１５】 本発明の別の種類の作因は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの重要な位置と
免疫反応性の抗体である。前記のように、抗体は、抗体により標的化されるよう
意図されたＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの一部分を抗原領域として含入するペプチドで適
切な哺乳類被験者を免疫感作することにより得られる。このような作因は、競合
的結合試験に用いられて、第二世代抑制作因を同定し、ならびに遮断し得る。
【０２１６】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性 本発明の方法で試験される細胞抽出物は、例えば、細胞または組織の水性抽出
物、細胞または組織の有機抽出物、または部分的精製細胞分画であり得る。本発
明のスクリーニング法に用いられる細胞抽出物の供給源に関して制限はない、と
当業者は容易に認識し得る。
【０２１７】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドを結合する作因、例えばＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
抗体は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの活性を調整し、適切な哺乳類細胞に対して抗癌剤
を標的化し、あるいはＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓとの相互作用を遮断する作因を同定す
るために用いられ得る。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓを発現する細胞は、ＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓと結合する作因を用いて標的化されるかまたは同定され得る。
【０２１８】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ結合剤が用いられる方法は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ結合剤の
性質によっている。例えばＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ結合剤は、接合化毒素、例えばジ
フテリア毒素、コレラ毒素、リシンまたはシュードモナス外毒素をＰＲＯＳＴ−
Ｅｔｓ発現細胞に送達し；ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性を調整し；ＰＲＯＳＴ−Ｅｔ
ｓ発現細胞を直接殺害するために用いられ得るし；あるいはスクリーニングにお
いてＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現細胞の増殖を直接抑制するが、一方、ＰＲＯＳＴ−
Ｅｔｓ結合剤は診断剤として用いられ得る。
【０２１９】 製剤組成物および投与 本発明は、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチド、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペ
プチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を、単独でまたは少な
くとも１つのその他の作用物質、例えば安定化化合物と組合せて含み、任意の滅
菌生物適合性製剤担体、例えば食塩水、緩衝化食塩水、デキストロースおよび水
（これらに限定されない）中に投与され得る製剤組成物にも関する。これらの分
子のいずれかが、患者に単独で、または他の作用物質、薬剤またはホルモンと組
合せて、それが賦形剤（単数または複数）または製薬上許容可能な担体と混合さ
れた製剤組成物中で投与され得る。本発明の一実施態様では、製薬上許容可能な
担体は、製薬的に不活性である。
【０２２０】 本発明は、製剤組成物の投与にも関する。このような投与は、経口的または非
経口的に成し遂げられる。非経口的送達の方法としては、局所、動脈内（腫瘍に
直接に）、筋内、皮下、髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹腔内または鼻腔内投与
が挙げられる。活性成分のほかに、これらの製剤組成物は、賦形剤および製薬的
に用いられ得る調製物への活性化合物の加工を促す助剤を含む適切な製薬上許容
可能な担体を含有し得る。処方物および投与のための技法に関するさらなる詳細
は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co. Easto
n, Pa)の最新版に見出され得る。
【０２２１】 経口投与のための製剤組成物は、経口投与に適した用量で、当業界で周知の製
薬上許容可能な担体を用いて処方され得る。このような担体は、製剤組成物を、
患者が摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、
スラリー、懸濁液等として処方されるようにし得る。
【０２２２】 経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、任意にその
結果生じた混合物を粉砕し、そして所望により、錠剤または糖衣錠コアを生成す
るために適切な助剤を付加後に、顆粒の混合物を加工することにより得られる。
適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば糖、例えばラクトー
ス、スクロース、マンニトールまたはソルビトール；トウモロコシ、コムギ、コ
メ、ジャガイモまたはその他の植物からのデンプン；セルロース、例えばメチル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはナトリウムカルボキシ
メチルセルロース；ならびにゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム
；ならびにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンである。所望により、
崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ま
たはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが付加され得る。
【０２２３】 糖衣錠コアは、適切なコーティング、例えばアラビアゴム、タルク、ポリビニ
ルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／またはに酸
化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物も含み得る濃縮
糖溶液を用いて提供される。染料または顔料は、製品同定のために，または活性
化後の量、即ち用量を特性化するために、錠剤または糖衣錠コーティングに付加
され得る。
【０２２４】 経口的に用いられ得る医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュ−フィットカプセル
、ならびにゼラチン製の軟質密封カプセル、およびグリセロールまたはソルビト
ールのようなコーティングを包含し得る。プッシュ−フィットカプセルは、充填
剤または結合剤、例えばラクトースまたはデンプン、滑剤、例えばタルクまたは
ステアリン酸マグネシウム、ならびに任意に安定剤と混合された活性成分を含有
し得る。軟質カプセルでは、活性化合物は適切な液体、例えば脂肪油、液体パラ
フィンまたは液体ポリエチレングリコール中に、安定剤とともにまたは安定剤を
伴わずに、溶解または懸濁され得る。
【０２２５】 非経口投与のための製剤処方物としては、活性化合物の水性溶液が挙げられる
。注射用には、本発明の製剤組成物は、水性溶液中に、好ましくは生理学的相溶
性緩衝液、例えばハンク溶液、リンガー溶液または生理学的緩衝化食塩水中に処
方され得る。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する物質、例えばナトリ
ウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含有し得
る。さらに活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。
適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成
脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、あるいはトリグリセリドまたはリポ
ソームが挙げられる。任意に懸濁液は、化合物の溶解度を増大して高濃縮溶液の
調製を可能にする適切な安定剤または作用物質も含有し得る。
【０２２６】 局所または鼻投与のためには、透過される特別なバリアに適した浸透剤が処方
物中に用いられる。このような浸透剤は、一般に当業界で既知である。
【０２２７】 キット 本発明はさらに、本発明の前記の組成物の１つまたはそれ以上の成分を充填さ
れる１つまたはそれ以上の容器を包含する製剤パックおよびキットに関する。こ
のような容器（単数または複数）に付随するのは、ヒト投与のための製品の製造
、使用または販売についての官庁の承認を反映する、製薬的または生物学的製品
の製造、使用または販売を調節する政府機関により規制される形態での通知書で
ある。
【０２２８】 製造および貯蔵 本発明の製剤組成物は、例えば慣用的混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、練り、
乳化、封入、閉じ込めまたは凍結乾燥過程により、当業界で既知であるように製
造され得る。
【０２２９】 製剤組成物は塩として提供され、そして多数の酸、例えば塩酸、硫酸、酢酸、
乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を用いて形成され得る。塩は、対応する遊
離塩基形態である水性またはその他のプロトン溶媒中でより可溶性になる傾向が
ある。他の場合には、好ましい製剤は、4.5〜5.5のｐＨでの1mM〜50mMヒスチジ
ン、0.1％〜2％スクロース、2％〜7％マンニトール中の凍結乾燥粉末であり、こ
れは使用前に緩衝液と併合される。
【０２３０】 許容可能な担体中に処方された本発明の化合物を含む製剤組成物が調製された
後、それらは適切な容器に入れられて、指示条件の処理のために標識される。Ｐ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓの投与のために、このような標識は、投与の量、頻度および方
法を包含する。
【０２３１】 治療的有効量 本発明に用いるのに適した製剤組成物は、活性成分が意図された目的、即ちＰ
ＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現により特性化される特定の疾患状態の治療を達成するのに
有効な量で含入される組成物を包含する。有効量の決定は、十分に当業者の能力
内である。
【０２３２】 任意の化合物に関して、治療的有効量は、最初に細胞培養検定で、例えば腫瘍
性細胞または動物モデルで、通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタで概算され
得る。動物モデルは、所望の濃度範囲および投与経路を達成するためにも用いら
れる。次にこのような情報を用いて、人における投与のための有用な用量および
経路を確定し得る。
【０２３３】 治療的有効量とは、徴候または症状を軽減するタンパク質またはその抗体、ア
ンタゴニストまたは阻害剤の量を指す。このような化合物の治療効力および毒性
は、細胞培養または実験動物における標準製薬手法により、例えばＥＤ50（集団
の50％において治療的に有効な用量）およびＬＤ50（集団の50％に対して致死的
な用量）により確定され得る。治療的および毒性作用間の用量比が治療指数であ
り、それはＥＤ50／ＬＤ50比として表され得る。大きい治療指数を示す製剤組成
物が好ましい。細胞培養検定および動物試験から得られたデータは、ヒト使用の
ための一連の用量を処方するのに用いられる。このような化合物の用量は、好ま
しくは、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ50を包含する一連の循環濃度内
である。用量は、用いられる投薬形態、患者の感受性および投与経路によって、
この範囲内で変わる。
【０２３４】 的確な投与量は、処置される患者にかんがみて、個々の医者が選定する。投与
量および投与は、十分レベルの活性部分を提供し、または所望の効果を維持する
よう調整される。考慮され得る付加的因子としては、疾患状態の重症度、例えば
腫瘍サイズおよび位置；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の回数および
頻度、薬剤組合せ（単数または複数）、反応感度、ならびに治療に対する耐容性
／応答が挙げられる。長期作用製剤組成物は、特定の処方物の半減期および清掃
率によって、3〜4日毎、毎週、または2週間に1回投与され得る。
【０２３５】 正常投与量は、投与経路によって0.1〜100,000μgから、約1 gの総用量まで変
わり得る。特定の投与量および送達方法に関する指針は、文献中に提供されてい
る（米国特許第4,657,760号、第5,206,344号または第5,225,212号参照）。当業
者は、タンパク質またはそれらあの阻害剤に関する処方物とは異なるポリヌクレ
オチドに関する処方物を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の送達は、特定の細胞、条件、位置等に特異的である。
【０２３６】 以下の実施例により本発明をさらに説明する。実施例は、特定の実施態様を参
照することにより本発明を単に説明するために提供されたものである。これらの
例示は、本発明のある特定の局面を説明して入るが、しかし本発明を限定するも
のでも、開示された本発明の範囲を制限するものでもない。
【０２３７】 実施例は全て、当業者に周知で且つルーチンである標準技法を用いて実行した
が、但し、そうでない場合は詳述した。以下の実施例のルーチンの分子生物学技
法は、標準実験室マニュアルに、例えばSambrook et al., Molecular cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989に記載
されているのと同様に実行し得る。
【０２３８】 実施例１：ヒトｐｒｏｓｔ−ｅｔｓポリヌクレオチドの同定 IncyteのLifeSeq遺伝子発現データベースを引き出すことにより、ｐｒｏｓｔ
−ｅｔｓを、前立腺中で発現される遺伝子と同定した。IncyteのLifeSeqは、前
立腺または腫瘍特異的方式で発現される配列に関して引き出した。同定されたオ
リジナルクローンは、前立腺腫瘍ライブラリー中で発見されたIncyteクローン58
1956であった。これは、他のIncyteクローン、例えば1813005および1794731とク
ラスタリングした。これらのクローンはIncyteから入手し、配列決定および発現
分析を含めた実験目的のために用いた。クローン581956のヌクレオチド配列を、
Incyteのデータベース中の全ての組織ライブラリー中の遺伝子の発現の電子ノー
ザン分析のために用いた。初期スクリーニングは、それが前立腺中で大いに発現
され、前立腺腫瘍中で過剰発現されることを立証した。データベースの更新バー
ジョンでは、それは前立腺腫瘍においてだけでなく、乳房腫瘍および卵巣腫瘍ラ
イブラリーにおいても発現される。Genetics Computer Group（ＧＣＧ、Wiscons
inパッケージ）遺伝子アセンブリープログラムおよび評価された集合ｍＲＮＡの
配列を用いて、ＰＲＯＳＴ−ＥｔｓをコードするIncyteのLifeseqライブラリー
中の全クローンを連続配列中に集合させた。この配列は連続集合配列の質を改良
するために編集され、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを
同定した。Lifeseqデータベース中の最も完全な５‘配列を含有するIncyte（ク
ローン1794731）から物理的クローンを得て、そしてＤＮＡをシーケンシングす
ることにより、ｍＲＮＡの配列を確証した。この配列は、図１に示されている。
【０２３９】 Ｂ．ＤＮＡおよびタンパク質配列分析 ヌクレオチド配列により予測したタン
パク質配列を、図２（配列番号２）に示す。同定したヌクレオチド配列は、非翻
訳化５‘および３’領域の両方を包含する。ヌクレオチドおよび予測タンパク質
配列とGenBankおよびSwiss Proデータベース中の配列との比較は、図３において
ＰＲＯＳＴ−ＥｔｓおよびショウジョウバエＥｔｓ−４に関して説明したように
、Ｅｔｓ転写因子のファミリーとの有意の相同を明示した。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
および他のＥｔｓ転写因子の両方に共通する２つのタンパク質ドメイン（「ポイ
ンテッド」および「Ｅｔｓ」）を、図４に示す。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ配列内のそ
れらの位置を、図２に示す。アミノ酸配列相同の程度およびＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
の予測ドメイン構造は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓが、ヒトにおけるＥｔｓ転写因子の
新規のファミリーの最初に報告された成員を構成する、ということを示す。
【０２４０】 実施例２：ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡ発現 正常および腫瘍組織からの種々の試料中での、ならびに細胞株中でのｐｒｏｓ
ｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡの発現を、以下の２つの方法により確定した：ノーザンブ
ロット分析およびTaqman検定を用いる半定量的ＰＣＲ（Perkin-Elmer）。Gleaso
nの変法等級システムにより等級分けした正常、良性および腫瘍前立腺組織試料
を、Urology Department at Stanford University School of Medicineから入手
した。標準手法により、これらからＲＮＡを単離した。他の腫瘍および正常組織
からのＲＮＡは、商業的供給元、例えばClontechおよびBiochainから購入した。
前立腺腫瘍細胞株（ＰＣ−３、ＬＮＣａＰおよびＤＵ145）は、アメリカ培養細
胞コレクションAmerican Type Culture Collectionから入手し、血清含有培地を
用いて標準法により培養中で増殖させた。これらの細胞株由来の異種移植片腫瘍
をヌードマウスで確立し、移植後約4〜6週間目にマウスから収穫した。標準手法
により腫瘍からＲＮＡを単離した。
【０２４１】 Ａ．ノーザンブロット分析 多数のヒト組織からの2μgのポリ（Ａ）ＲＮＡ（
Clontechから購入）を用いて、ノーザンブロットを実施した。ｐｒｏｓｔ−ｅｔ
ｓプラスミドの挿入物から作製した放射能標識プローブ（Incyte Clone 1794731
、図５参照）を用いて、ブロットをプローブした。2.4 KbのサイズのｍＲＮＡは
、前立腺中で高レベルで、そして結腸および小腸では低レベルで検出された。ｐ
ｒｏｓｔ−ｅｔｓの発現は、多数の他の組織、例えば肺、肝臓、腎臓、脳、膵臓
および脾臓中では検出されなかった。
【０２４２】 Ｂ．Taqman分析 プライマー：AGT GAC TCG ACA AAG GCC ACA（配列番号３）
およびTCC CTG CAC CAT GCC AG（配列番号４）、ならびにTaqmanプローブ：FAM-
CCT GCC TCC CAT TCT GCA CCA CA-TAMRA（配列番号５）を用いて、Taqmanベース
のＰＣＲ分析を実施した。
【０２４３】 Perkin Elmerのプライマー発現ソフトウェアを用いてこれらのプライマーおよ
びプローブを設計し、Synthetic Geneticsが合成した。ＰＣＲ反応を30〜40サイ
クル実行し、前立腺ＲＮＡを用いて定量して、相対比較のための標準曲線を作成
した。この分析は、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡが前立腺正常および腫瘍組織
中で、ならびに乳房腫瘍試料中でも検出されることを立証した。腫瘍中での発現
は一般に、正常組織中よりも高かった。
【０２４４】 実施例３：ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの発現 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓコード領域を、Stratageneから入手したタンパク質発現ベ
クターｐＥＴ15ｂ中に挿入した。6Xｈｉｓ−タグかＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプ
チドは、ＩＰＴＧによる誘導時に大腸菌中で発現された。当業界で周知のＮｉア
フィニティークロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製手法の組合せによ
り、発現ポリペプチドを90％より以上均質に精製した。約5 mgのこの物質をポリ
クローナル抗体生成のために用いた。
【０２４５】 実施例４：抗体生成 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド配列由来の３つの合成ペプチド配列に対して
、ウサギポリクローナル抗血清を生じさせた。表面エピトープをより認識しそう
な抗血清を生成するために、これらの配列を、それらの予測位置から選択した。
システイン残基をアミノ酪酸（Ａｂｕ）と置き換えて、合成を助長した。特定の
アミノ酸配列、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチド上の位置、３つのペプチドに関
する呼称を下記に示す。
【０２４６】 表示 位置 アミノ酸配列 Pep1 39-56 ERRDWSPSPPATPEQGLS （配列番号６） Pep2 189-200 EQFRQRSPLGGD （配列番号７） Pep3 301-315 NYDKLSRSIRQYYKK （配列番号８） 免疫原として用いるために、付加的アミノ−末端システインを介して、ペプチ
ドをキーホールカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と共有結合させた。同様に、Ｅ
ＬＩＳＡによる抗血清力価の分析のために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）接合
体を調製した。
【０２４７】 各ペプチドを用いて、２匹の動物を免疫感作した。フロイント完全アジュバン
ト（0.5 mg／動物）中で初期免疫感作を実施し、その後3週間間隔で、筋内的に
適用したフロイント不完全アジュバント中の0.25 mg／動物を用いて定期的に追
加免疫した。定期的試験用放血を採取し、特定のＢＳＡ−ペプチド接合体に対す
る抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定して、前免疫血清と比較した。
【０２４８】 大腸菌中で6Ｈｉｓ−ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ融合タンパク質として発現された精
製ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓタンパク質との結合に関して、ウエスタンブロットにより
抗血清を試験した（図７参照）。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ融合タンパク質を認識した
抗血清をさらに、ＰＣ３細胞から調製された溶解物中の天然タンパク質を認識す
るそれらの能力に関して試験した。
【０２４９】 大腸菌から精製した6Ｈｉｓ−ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ融合タンパク質に対して、
ウサギポリクローナル抗血清も惹起された。
【０２５０】 実施例５：前立腺腫瘍細胞増殖に及ぼすｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡの特異
的低減の影響 選定細胞株中でのｍＲＮＡ発現を低減するために、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドを用いて細胞増殖におけるＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの役割を評価するために、
前立腺腫瘍細胞株ＰＣ−３およびＬＮＣａＰを選定した。これら２つの前立腺腫
瘍細胞株はｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡを発現するが、一方、正常原発性前立
腺上皮細胞およびＢＰＨ試料由来の細胞は、有意レベルのこのｍＲＮＡを発現し
ない。用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列 UCCACCUGUGGCAGUUCCUC
AAG（13594；配列番号９）、 UGACUCGACAAAGGCCACAGGCA（13595；配列番号１０
）、および CCAGCAUUUCCAGAGCAGAGCCU（13642；配列番号１１）を有する。これ
らの配列は、長さ23ヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子である試薬
として用いられる。使用したアンチセンス分子は、脂質（Atugen Corp.により提
供されたＮＣ388脂質混合物）の存在下で細胞に投与した場合にＰＲＯＳＴ−Ｅ
ｔｓに関するｍＲＮＡレベルを低減した。これらの試薬は、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ
ｍＲＮＡと相補的である図示されたオリゴヌクレオチド領域を含有する。これ
らの配列のＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞への投与は、脂質ＮＣ388との複合体
として投与される場合、7.5〜120 nMオリゴヌクレオチドの範囲での用量依存的
方式で細胞の増殖を抑制した。同一用量範囲で、一組の無作為23merオリゴヌク
レオチドで構成された対照オリゴヌクレオチド混合物（ＧＢＣ3.3）は、細胞の
増殖に影響を及ぼさなかった。核酸合成に必要とされる酵素である酵素イノシン
モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ ＩＩ）に対して向けられたア
ンチセンスオリゴヌクレオチドも、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞において増殖抑
制を引き起こした。この実験は、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現の低減が腫瘍細胞増殖
低減に反映されることを立証した。２塩基対不適正を含有するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、細胞増殖に及ぼす作用が有意に低かった（図８参照）。
【０２５１】 実施例６：ＰＣ３細胞のドキシサイクリン誘導性増殖抑制 ドキシサイクリンの存在下で、Tet-On系（Clontech）を用いて、ＰＣ３前立腺
腫瘍細胞の誘導体、ならびに結合し、転写を活性化するタンパク質である安定取
込みリプレッサー−ＶＰ16タンパク質を含有するＢＰＨ前立腺非腫瘍原性細胞株
を生成した。異なるレベルのｔｅｔ−ｏｎ活性を含有する4つのＰＣ３−ｔｅｔ
−ｏｎ細胞株および2つのＢＰＨ−ｔｅｔ−ｏｎ細胞株を、メーカーの使用説明
書にしたがって生成し、貯蔵した。これらのＰＣ３−ｔｅｔ−ｏｎ細胞株のうち
の2つは、それらの親ＰＣ３細胞株のin vitroでの増殖率およびin vivoでの腫瘍
原性特性を保有していた。
【０２５２】 ClontechからのｐＢＩ−ＥＧＦＰベクターを用いて、センスおよびアンチセン
スｐｒｏｓｔ−ｅｔｓメッセージを発現させた。ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓアンチセン
スメッセージの異なる断片を発現するいくつかの異なるアンチセンス構築物を作
製した。断片は，５‘非翻訳化領域を含有する約0.45 Kb断片、３’非翻訳化領
域を含有する約0.5 Kb断片、ならびに全長アンチセンス分子であった（図９中、
それぞれ5utr、3utrおよびｃＤＮＡ）。標準技法を用いて、これらの断片をベク
ター中に組入れた。
【０２５３】 断片を含有するベクターならびにベクター対照をＰＣ３−ｔｅｔ−ｏｎ細胞株
中でトランスフェクトさせて、安定プールを生成した。ドキシサイクリン誘導を
用いてならびに用いずに、培地中で細胞を培養することにより、アンチセンス断
片の活性を査定した。ドキシサイクリン処理はＰＣ３−ｔｅｔ−ｏｎ親または全
長アンチセンス分子でトランスフェクトさせたＰＣ３−ｔｅｔ−ｏｎ細胞の増殖
率を大きくは変えなかった。しかしながらこれに対比して、３‘非翻訳化および
５’非翻訳化アンチセンス構築物を用いてトランスフェクトしたＰＣ３−ｔｅｔ
−ｏｎ細胞の増殖率の有意の低減が起きた（図９参照）。これらの実験はさらに
、ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡの低減がＰＣ３前立腺腫瘍細胞の増殖の抑制を
もたらすことを立証する。
【０２５４】 実施例７：優性陰性突然変異体としてのＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓタンパク質Pのド
メイン ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓポリペプチドの種々の部分（Ｃ末端90アミノ酸；Ｎ末端24
8アミノ酸；全長ポリペプチド含有点突然変異）をコードするいくつかのポリヌ
クレオチド断片をベクター中に挿入し、ドキシサイクリンによる誘導後に、ＰＣ
３−ｔｅｔ−ｏｎ前立腺腫瘍細胞内で発現させた。あるいは断片は、ＨＩＶ Ｔ
ＡＴタンパク質由来のペプチドとの融合タンパク質として大腸菌中で発現される
。ＴＡＴペプチドは、転写因子を含めた多数の細胞内タンパク質のための効率的
「タンパク質形質導入ドメイン」として作用することが示されている。ポリペプ
チド発現のいずれかの方法を用いて、これらの発現タンパク質断片の存在が腫瘍
細胞増殖に陰性作用を及ぼすことが観察されたが、これは、これらの断片が優性
陰性試薬として作用していることを示す。
【０２５５】 前記の明細書中に記述した出版物および特許は全て、参照により本明細書中に
含まれる。特定の実施態様を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の真
の精神および範囲を逸脱しない限り、種々の変更が成され得るし、等価物は置換
され得ると、当業者には理解されるべきである。さらに特定の情況、物質、物質
の組成物、処理、単数または複数の処理過程を本発明の目的、精神および範囲に
適合させるよう、多数の修正が成され得る。このような修正は全て、本明細書に
添付した特許請求の範囲の範囲内であるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 生物学的または免疫学的活性形態のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓをコードするｐｒｏｓ
ｔ−ｅｔｓのポリヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図２】 活性形態のＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの推定アミノ酸配列（配列番号２）。配列内の
ポインテッド（ａａ１３１〜２１３）およびＥｔｓ（ａａ２４６〜３３２）ドメ
インに下線を付す。
【図３】 ショウジョウバエＤ−Ｅｔｓ−４の配列を伴うＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓのアミノ酸
アラインメント。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの配列は上段である。
【図４】 ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓタンパク質の予測ドメイン構造。
【図５】 ノーザンブロット分析によるヒト組織中でのｐｒｏｓｔ−ｅｔｓの発現。腫瘍
および正常のヒト組織ならびにヒト細胞株からのＲＮＡを、放射性標識化プロー
ブとのｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションに関して調べた
。2.4 KbのサイズのｍＲＮＡが、前立腺では高レベルで、結腸および小腸では低
レベルで検出された。検査した他の組織において、発現は検出されなかった。
【図６】 TaqmanベースのＰＣＲ分析によるヒト組織におけるｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲ
ＮＡの発現。標準技法により、腫瘍および正常の両方のヒト組織からのＲＮＡを
単離した。ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡ発現を検出するためのプライマーおよ
びプローブは、Perkin Elmerのプライマー発現ソフトを用いて設計され、Synthe
tic Geneticsにより合成された。ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ ｍＲＮＡは腫瘍および正
常の両方のヒト前立腺組織で検出され、そして乳房組織中では低レベルで検出さ
れたが、他の正常および腫瘍組織中では検出されなかった。
【図７】 細菌中で合成されたＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの免疫活性。合成ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ
配列に対して生成された抗血清（実施例４参照）は、大腸菌で発現されたＰＲＯ
ＳＴ−Ｅｔｓのウエスタンブロット分析に用いた。
【図８】 前立腺腫瘍細胞増殖に及ぼすｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡ発現の特異的低減
の影響。ｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ配列に対して標的化された３つのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（13594、13595、13642）（実施例５参照）を利用して（ＲＮＡ
／ＤＮＡハイブリッド分子の形態で）、ＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ発現ＰＣ３ヒト前立
腺細胞株におけるｐｒｏｓｔ−ｅｔｓ ｍＲＮＡの特異的低減の影響を確定した
。不適正アンチセンス分子は対照として用いられ、ＧＢＣ3.3は非特異的アンチ
センス対照である。核面積は細胞数に比例する。
【図９】 誘導性抗アンチセンスメッセージによるＰＣ３細胞の増殖抑制。ＰＲＯＳＴ−
Ｅｔｓアンチセンスメッセージを含有するベクターを用いてＰＣ３細胞株をトラ
ンスフェクトし（実施例６参照）、ドキシサイクリンで処理して、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの転写を誘導した。以下の処理により細胞増殖を測定し、増
殖のアンチセンス特異的抑制を実証した。使用したアンチセンス分子を以下に示
す：ｃＤＮＡ、全長アンチセンス分子；５ｕｔｒ、５‘アンチセンス分子；およ
び３ｕｔｒ、３’アンチセンス分子。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/537 Ａ６１Ｋ 31/704 ４Ｃ０８５ 31/704 31/7048 ４Ｃ０８６ 31/7048 31/7088 ４Ｃ２０６ 31/7088 31/7105 ４Ｈ０４５ 31/7105 39/395 Ｃ 38/00 Ｄ 39/395 Ｌ Ｎ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 48/00 37/04 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/82 37/04 16/32 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/32 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルーク，メイ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94116， サンフランシスコ，キャスティナーダ ア ベニュ 85 (72)発明者 モンテクラーロ，フィリップ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94539， フレモント，リトル フット プレイス 45369 (72)発明者 パークス，デボラ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94541， ヘイウォード，ハンプトン プレイス 19050 (72)発明者 パリー，ゴードン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596， ウォルナット クリーク，ハッカモア コ ート 2255 (72)発明者 シュタインブレッヒャー，レナーテ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596， ウォルナット クリーク，ハッカモア コ ート 2255 (72)発明者 バン ヒューイット，パメラ トーイ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94556， モラーガ，カンポリンド ドライブ 3965 (72)発明者 シャン，ジャン−アイ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94591， カストロ バレー，キット レーン 6729 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QR32 QR38 QR55 QR82 QS25 QS34 QS39 QX01 4B064 AG01 AG27 CA02 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA26X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA18 BA22 BA23 4C085 AA13 AA14 AA15 AA21 BB31 CC21 EE01 EE03 4C086 BA02 CB05 CB14 DA25 EA04 EA11 EA16 MA02 MA05 ZB21 ZB26 4C206 AA01 GA02 GA30 KA05 MA02 MA05 NA13 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA76 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の： (ａ)図２に記述されたアミノ酸配列(配列番号２)を含むポリペプチドあるいは
    その生物学的または免疫学的活性断片をコードするポリヌクレオチド； (ｂ)図２に記述されたアミノ酸１３１〜アミノ酸２１３(配列番号２)を含むポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド； (ｃ)図２に記述されたアミノ酸２４６〜アミノ酸３３２(配列番号２)を含むポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド；および (ｄ)（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌク
    レオチド から成る群から選択される一成員と少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド
    を含む単離ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 ゲノムＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 図２に記述されたアミノ酸１〜アミノ酸３３５(配列番号２)
    を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 図２に記述されたアミノ酸１３１〜アミノ酸２１３(配列番
    号２)を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 図２に記述されたアミノ酸２４６〜アミノ酸３３２(配列番
    号２)を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 図１に記述された配列(配列番号１)のヌクレオチド１からヌ
    クレオチド１９００までを含む請求項１記載のポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 図１に記述された配列(配列番号１)のヌクレオチド４２２か
    らヌクレオチド１４２９までを含む請求項１記載のポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 請求項２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載のベクターを含む宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 ポリペプチドの製造方法であって、請求項１１記載の宿主
    細胞から前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドを発現する
    ことを包含する方法。
  13. 【請求項１３】 ポリペプチドが図２に記述されたアミノ酸１〜アミノ酸３
    ３５(配列番号２)を含む請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ポリペプチドが図２に記述されたアミノ酸１３１〜アミノ
    酸２１３(配列番号２)を含む請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ポリペプチドが図２に記述されたアミノ酸２４６〜アミノ
    酸３３２(配列番号２)を含む請求項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 図２で示されたアミノ酸配列(配列番号２)を含むポリペプ
    チドの製造方法であって、以下の： (ａ) それによりポリペプチドが発現される条件下で請求項１１記載の宿主細
    胞を培養し、そして (ｂ)培養からポリペプチドを回収する 過程を包含する方法。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方法であって、請求項
    １０記載のベクターを用いて細胞を遺伝子工学処理することを包含する方法。
  18. 【請求項１８】 以下の： (ａ)図２に記述されたアミノ酸配列(配列番号２)を含むポリペプチドあるいは
    その生物学的または免疫学的活性断片； (ｂ)図２に記述されたアミノ酸１３１〜アミノ酸２１３(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｃ)図２に記述されたアミノ酸２４６〜アミノ酸３３２(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｄ)図２に記述されたアミノ酸３９〜アミノ酸５６(配列番号２)を含むポリペ
    プチド； (ｅ)図２に記述されたアミノ酸１８９〜アミノ酸２００(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｆ)図２に記述されたアミノ酸３０１〜アミノ酸３１５(配列番号２)を含むポ
    リペプチド；および (ｇ)（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)のポリペプチドと少なく
    とも70％同一であるポリペプチド から成る群から選択される一成員を含むポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 図２に記述されたアミノ酸１〜３３５(配列番号２)を含む
    請求項１８記載のポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 図２に記述されたアミノ酸１３１〜２１３(配列番号２)を
    含む請求項１８記載のポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 図２に記述されたアミノ酸２４６〜３３２(配列番号２)を
    含む請求項１８記載のポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 以下の： (ａ)図２に記述されたアミノ酸配列(配列番号２)を含むポリペプチドあるいは
    その生物学的または免疫学的活性断片； (ｂ)図２に記述されたアミノ酸３９〜アミノ酸５６(配列番号２)を含むポリペ
    プチド； (ｃ)図２に記述されたアミノ酸１８９〜アミノ酸２００(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｄ)図２に記述されたアミノ酸３０１〜アミノ酸３１５(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｅ)（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または(ｄ)のポリペプチドと少なくとも70％同一
    であるポリペプチド から成る群から選択される一成員を含むポリペプチドと特異的に結合する単離抗
    体または抗体断片。
  23. 【請求項２３】 アミノ酸配列ERRDWSPSPPATPEQGLS(配列番号６)と特異的に
    結合する請求項２２記載の抗体。
  24. 【請求項２４】 アミノ酸配列EQFRQRSPLGGD(配列番号７)と特異的に結合す
    る請求項２２記載の抗体。
  25. 【請求項２５】 アミノ酸配列NYDKLSRSIRQYYKK(配列番号８)と特異的に結
    合する請求項２２記載の抗体。
  26. 【請求項２６】 ポリクローナル抗体である請求項２２記載の抗体。
  27. 【請求項２７】 モノクローナル抗体である請求項２２記載の抗体。
  28. 【請求項２８】 以下の： (ａ)図２に記述されたアミノ酸配列(配列番号２)を含むポリペプチドあるいは
    その生物学的または免疫学的活性断片； (ｂ)図２に記述されたアミノ酸３９〜アミノ酸５６(配列番号２)を含むポリペ
    プチド； (ｃ)図２に記述されたアミノ酸１８９〜アミノ酸２００(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｄ)図２に記述されたアミノ酸３０１〜アミノ酸３１５(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｅ)治療薬に複合された（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または(ｄ)のポリペプチドと
    少なくとも70％同一であるポリペプチド から成る群から選択される一成員を含むポリペプチドと特異的に結合する単離抗
    体または抗体断片を含む免疫複合体。
  29. 【請求項２９】 治療薬が細胞傷害性薬である請求項２８記載の免疫複合体
    。
  30. 【請求項３０】 細胞傷害性薬がリシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン
    、タキソール、臭化エチジウム、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビン
    クリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、
    アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ
    ４０、リシン、アブリン、糖質コルチコイドおよび放射性同位元素から成る群か
    ら選択される請求項２９記載の免疫複合体。
  31. 【請求項３１】 抗体断片がＦｖ、Ｆ（ａｂ‘）およびＦ（ａｂ’）2断片
    から成る群から選択される請求項２８記載の免疫複合体。
  32. 【請求項３２】 図２（配列番号２）のポリペプチドを発現する細胞を選択
    的に破壊する方法であって、免疫複合体の治療薬が細胞を破壊し得るよう請求項
    ２８記載の免疫複合体を細胞と反応させることを包含する方法。
  33. 【請求項３３】 疾患状態がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの発現に関連するヒト患者
    における当該疾患状態の治療方法であって、治療的有効量の請求項２８記載の免
    疫複合体を患者に投与することを包含する方法。
  34. 【請求項３４】 疾患状態がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの発現に関連し、且つ以下
    の： （ａ）図２に記述されたアミノ酸配列（配列番号２）を含むポリペプチドある
    いはその生物学的または免疫学的活性断片、そして （ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも70％同一であるポリペプチド から成る群から選択される一成員を含むポリペプチドのレベルの低減を要する
    ヒト患者における当該疾患状態の治療方法であって、当該ポリペプチドをコード
    するＲＮＡを特異的に切断する治療的有効量のリボザイムを患者に投与すること
    を包含する方法。
  35. 【請求項３５】 疾患状態がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓの不適切な発現と関連があ
    り、そして患者が図２で記述されるようなアミノ酸配列（配列番号２）を有する
    ポリペプチドのレベルの低減を要するヒト患者における当該疾患状態の治療方法
    であって、図１で記述される配列（配列番号１）またはその一部分を含むポリヌ
    クレオチドと相補的である治療的有効量のポリヌクレオチドを患者に投与するこ
    とを包含する方法。
  36. 【請求項３６】 投与されるポリヌクレオチドが配列UCCACCUGUGGCAGUUCCUC
    AAG（配列番号９）を有する請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 投与されるポリヌクレオチドが配列UGACUCGACAAAGGCACAGG
    CA（配列番号１０）を有する請求項３５記載の方法。
  38. 【請求項３８】 投与されるポリヌクレオチドが配列CCAGCAUUUCCAGAGCAGAG
    CCU（配列番号１１）を有する請求項３５記載の方法。
  39. 【請求項３９】 診断方法であって、以下の： (ａ)図２に記述されたアミノ酸配列(配列番号２)を含むポリペプチドあるいは
    その生物学的または免疫学的活性断片； (ｂ)図２に記述されたアミノ酸３９〜アミノ酸５６(配列番号２)を含むポリペ
    プチド； (ｃ)図２に記述されたアミノ酸１８９〜アミノ酸２００(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｄ)図２に記述されたアミノ酸３０１〜アミノ酸３１５(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｅ)（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または(ｄ)のポリペプチドと少なくとも70％同一
    であるポリペプチド から成る群から選択される一成員を含むポリペプチドの存在に関して宿主由来の
    試料を分析することを包含する方法。
  40. 【請求項４０】 分析がポリペプチドと特異的に結合する請求項２２記載の
    抗体または抗体断片と試料を接触させ、そして試料中のポリペプチドと抗体との
    結合を検出することを包含する請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 診断方法であって、以下の： （ａ）図２に記述されたアミノ酸配列（配列番号２）を含むポリペプチドある
    いはその生物学的または免疫学的活性断片をコードするポリヌクレオチド、及び （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド から成る群から選択される一成員と少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド
    を含むポリヌクレオチドの存在に関して分析することを包含する方法。
  42. 【請求項４２】 図２のポリペプチド（配列番号２）と関連した転移を被験
    者において診断する方法であって、以下の： （ａ）組織および／または流体試料を被験者から得て、 （ｂ）試料を請求項２２記載の抗体と接触させ、そして （ｃ）試料中のポリペプチドとの抗体の結合を検出する ことを包含する方法。
  43. 【請求項４３】 抗体が直接または間接的に検出可能シグナルを生じるよう
    、放射性標識、酵素、発色団および蛍光体から成る群から選択される化合物で標
    識される請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 疾患状態がＰＲＯＳＴ−Ｅｔｓ活性と関連があり、そして
    患者が前記活性のレベルの低減を要するヒト患者における疾患状態の治療方法で
    あって、以下の： (ａ)図２に記述されたアミノ酸配列(配列番号２)を有するポリペプチド； (ｂ)図２に記述されたアミノ酸１３１〜アミノ酸２１３(配列番号２)を含むポ
    リペプチド； (ｃ)図２に記述されたアミノ酸２４６〜アミノ酸３３２(配列番号２)を含むポ
    リペプチド；および (ｄ)（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドと少なくとも70％同一である
    ポリペプチド から成る群から選択される一成員を含む治療的有効量のポリペプチドを患者に投
    与することを包含する方法。
  45. 【請求項４５】 前記治療的有効量のポリペプチドがポリペプチドをコード
    し、in vivoでポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを患者に提供すること
    により投与される請求項４４記載の方法。
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