JP2003029151A - 共焦点レーザ走査型顕微鏡装置および制御プログラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】観察試料の期待画像の取得を素早く行なって観
察時間の短縮化を図り、さらにレーザ光による観察試料
の無駄な退色を防止できるような共焦点レーザ走査型顕
微鏡装置、およびこれを制御するプログラムを提供する
こと。 【解決手段】観察試料１０８上のＸ軸Ｙ軸方向へのレー
ザ光による走査の内、Ｙ軸方向の走査を間引く方式と間
引かない方式とを選択的に使用できるようにして、かつ
前記各方式に応じて共焦点位置に配置するピンフォール
１１０の径を自動的に調節して、さらにこの径の変化に
応じてレーザ光の光強度を調節できるように制御部２で
制御する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は共焦点レーザ走査型
顕微鏡装置および制御プログラムに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、特開昭６１−２１９９１９号公報
に開示されているような走査型顕微鏡装置が知られてい
る。この装置は光源から発せられるレーザ光を対物レン
ズにおいて微小なスポットに絞り、これを観察試料のＸ
軸Ｙ軸方向に走査させる。この照射したスポットによる
観察試料からの光、例えば透過光、反射光や励起による
観察試料からの蛍光などがフォトマルなどの光検出器に
取り込まれて電気信号に変換されて、その電気信号をモ
ニタに観察画像として表示させる。

【０００３】特に、照射したスポットによる観察試料か
らの光とこの光を取り込む検出器との間の光学系におい
て、この光、例えば反射光や励起による観察試料からの
蛍光を入射光路に戻してダイクロイックミラーで反射さ
せたものを共焦点面にレンズで集光し、この位置にピン
フォールを配置して共焦点光学系を形成する方法が知ら
れており、共焦点レーザ走査型顕微鏡、或いは共焦点レ
ーザ走査型顕微鏡装置と呼ばれている。このように共焦
点光学系を形成することにより、合焦位置の周りから送
られてくる余分な光を遮断する共焦点効果が期待でき
て、厚みのある観察試料に対してもより鮮明な画像を取
得することができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述したよう
な共焦点レーザ走査型顕微鏡及び共焦点レーザ走査型顕
微鏡装置における観察対象領域の決定にあたって、以下
に示す２つの問題が生じている。

【０００５】第１の問題は、スポットのＸ軸Ｙ軸方向へ
の走査速度が数百キロヘルツから数千キロヘルツ程度で
あるため、１秒間に数フレームから数十フレームの画像
情報しか取得することができず、観察試料に対して短時
間で期待画像を取得することは困難であるということで
ある。

【０００６】第２の問題は、この種類の顕微鏡のピンフ
ォールは、観察試料への染色方法、観察試料からの蛍光
波長、その光学系に設置されている対物レンズの倍率、
および開口数により一意的に決まる径に調節されて、合
焦位置と光学的に共役となる位置（共焦点面）に設置さ
れることで、観察試料における合焦位置以外からの光を
排除するように設計されているので、焦点深度の狭い領
域にある観察画像を取得することが特徴的であるため、
大まかな観察領域を捉えるには、この共焦点光学系では
困難であるということである。

【０００７】そこで、この２つの問題を回避するため
に、先ずレーザ光を使用しない目視による顕微鏡観察に
よって観察対象領域を大まかに捉えて、それから観察対
象領域に対してレーザ光をスポットで走査させて、モニ
タに表示された観察画像を見ながら、光検出器の感度を
調節したり、観察試料を設置したステージの位置を調節
して、期待画像を取得する方法が一般的に行なわれてい
た。

【０００８】ところが、前述してきたようなレーザ光を
スポットで観察試料のＸ軸Ｙ軸方向に走査させて、観察
画像を取得する第１の走査方式に対して、観察試料のＸ
軸方向に走査させるスポットの速度を最速に保ちつつ、
Ｙ軸方向における走査ラインを２、４またはそれ以上の
数だけ間引きながら走査させて、その走査したラインの
情報のみから擬似的な観察画像を取得する第２の走査方
式があり、この方式を採用することにより、走査ライン
を間引くことによる観察画像の取得時間を短縮すること
が可能となり、これは一つ目の問題を解決している。

【０００９】また、ピンフォールを配置した共焦点光学
系と配置しない光学系の２つの光学系をもたせた構成の
走査型顕微鏡装置も知られているが、この装置は２つの
光学系用にそれぞれの光検出器が必要となるために、大
規模な構成となってしまう欠点を要している。

【００１０】本発明は、前記第２の走査方式を採用しつ
つ、前記第２の問題を共焦点効果の調節により解決し
て、同時に共焦点効果の調節に伴うレーザ強度の変化を
制御してレーザ光による組織観察試料の無駄な退色を防
止できる、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置およびこれを
制御するプログラムを提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は共焦点レーザ走
査型顕微鏡に適用されることを前提とする。そして本発
明の態様の一つである共焦点レーザ走査型顕微鏡装置
は、ステージ上の観察試料にレーザ光を絞り込んだスポ
ットを走査させて、前記スポットによる前記観察試料か
らの光を集光させて該集光位置にピンフォールを配置し
て該ピンフォールを通過する光に基づいて前記観察試料
の観察画像を取得する共焦点レーザ走査型顕微鏡装置で
あって、前記観察試料の一定方向に走査させたＸ軸走査
ラインを該観察試料と平行して該走査ラインとは直行す
るＹ軸方向に繰り返し走査させる第１の走査方式と、該
走査方式における走査速度を最大として前記Ｘ軸走査ラ
インをＹ軸方向に対して間引く第２の走査方式の２つの
観察画像の取得手段と、前記取得手段に前記第１および
第２の走査方式のどちらかを選択的に実行させ、該選択
された走査方式に応じたピンフォールの径の調節を行な
う制御手段と、を有するように構成する。

【００１２】上述した構成によれば、ピンフォールの径
を変化させられるので、前記第２の走査方法において径
を共焦点効果が得られる大きさよりも大きくすることが
可能となり、観察対象領域を決めやすい厚みのある観察
画像が得られるようになる。また、制御手段において、
前記ピンフォールの径の大きさに応じてレーザ光強度を
調節する機能を、有するように構成することで、観察試
料に対して適切な光強度でレーザ光を照射できるように
なる。

【００１３】本発明の態様の別の一つである顕微鏡の制
御プログラムは、ステージ上の観察試料にレーザ光を絞
り込んだスポットを走査させて、前記スポットによる前
記観察試料からの光を集光させて該集光させる位置にピ
ンフォールを配置して該ピンフォールを通過する光に基
づいて前記観察試料の観察画像を取得する共焦点レーザ
走査型顕微鏡を制御する装置に利用されるものであっ
て、前記共焦点レーザ走査型顕微鏡に対して前記観察試
料の一定方向に走査させたＸ軸走査ラインを該観察試料
と平行して該走査ラインとは直行するＹ軸方向に繰り返
し走査させる第１の走査方式と、該走査方式における走
査速度を最大として前記Ｘ軸走査ラインをＹ軸方向に対
して間引く第２の走査方式のどちらかを選択的に実行さ
せて、該選択された走査方式に応じてピンフォールの径
の制御を前記制御装置に行なわせるものである。

【００１４】また、前記ピンフォールの径の大きさに応
じてレーザ光強度を調節するような制御プログラムにし
てもよい。また、前記第２の走査方式を実行させること
で観察試料の情報を取得して、前記情報を基に観察者が
決定した合焦位置にフォーカスを合わせるような制御プ
ログラムにしてもよい。

【００１５】上述した制御プログラムによれば、観察者
は期待画像を素早く得る手段を本制御プログラムが作動
する環境上に一括して取得することができる。また、こ
の環境上で観察者は観察資料の合焦位置を選択すること
ができ、さらに観察試料に照射するレーザ光の強度を調
節できるようにもなる。

【００１６】

【発明の実施の形態】（第１の実施形態）図１は本発明
を適用した共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成を概略
で示したもので、その構成の各部に付与した番号を用い
てこの装置の構成を以下に説明する。

【００１７】図１において、１は共焦点レーザ走査型顕
微鏡本体であり、この共焦点レーザ走査型顕微鏡本体１
にはＰＣなどの制御部２が接続されている。また、この
制御部２にはキーボード、またはトラックボールやジョ
イスティックまたはマウスなどのポインティングデバイ
スからなる操作パネル３およびメモリ４が接続されてお
り、このメモリ４には画像モニタ５が接続されている。

【００１８】また、共焦点レーザ走査型顕微鏡本体１
（以下本体１とする）の構成について、本体１の背部に
はレーザ光源１０１が内蔵されており、レーザ光源１０
１の上方かつ本体１の上部にはミラー１０２が配置され
ており、このミラー１０２の前方にはダイクロイックミ
ラー１０３が配置されており、この下方にはレンズ１０
９が配置されており、さらに下方にはピンフォールであ
るコンフォーカルアパーチャ１１０が配置されており、
そのさらに下方には光検出器１１１がある。ダイクロイ
ックミラー１０３の前方かつ本体１の前部には走査ユニ
ット１０４が位置されている。この走査ユニット１０４
はＸ軸方向走査用の図示しないガルバノメータミラーと
Ｙ軸方向走査用の図示しないガルバノメータミラーとを
有している。そして、この走査ユニット１０４の下方に
はレボルバ１０５が位置しており、このレボルバ１０５
には対物レンズ１０６が取り付けられている。本体１の
下部の前方には、ステージ位置検出器１１２が取り付け
られており、その上にステージ１０７が取り付けられて
おり、ステージ１０７の上に観察試料１０８が置かれて
いる。

【００１９】また、制御部２において、その内部には変
更量設定部２ａと計算・処理部２ｂが収容されている。
次に、この装置の各部の機能を説明する。本体１におい
て、レーザ光源１０１から発せられるレーザ光はミラー
１０２に反射されてダイクロイックミラー１０３の方向
へ進み、このダイクロイックミラー１０３を透過して走
査ユニット１０４に入射する。この入射したレーザ光
は、制御部２から送られる制御信号によりＸ軸Ｙ軸方向
に走査される。また、このＸ軸方向への走査が１ライン
終わる毎に、走査の終了を示す制御信号を制御部２に送
出している。Ｘ軸Ｙ軸方向に走査されたレーザ光は対物
レンズ１０６で集光されて、観察試料１０８上にスポッ
ト光として照射される。このスポット光による観察試料
１０８からの光、例えば反射光、または励起による観察
試料からの蛍光を入射光路に戻し、ダイクロイックミラ
ー１０３で反射させ、レンズ１０９を介して集光する。
この集光位置には、コンフォーカルアパーチャ１１０を
配置して、ここを通過した光をフォトマルなどの光検出
器１１１で取り込む。この取り込んだ光の光量に対応し
た電気信号を制御部２に出力する。

【００２０】また、ステージ位置検出器１１２はステー
ジ１０７の位置情報（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を検出して、制御部
２に出力する。また、観察者の指示によるレーザ光の走
査を開始する命令や画像を入力する命令、さらには光検
出器１１１に対する感度を調節する命令などが操作パネ
ル３から制御部２に出力される。

【００２１】メモリ４は、観察試料１０８の最終ライン
の位置およびステージ１０７の移動をした後のライン位
置を記憶する位置情報の記憶部と光検出器１１１から制
御部２を介して転送されてくる画像情報を記憶する画像
記憶部とを有している。制御部２では、装置全体の制御
を司っており、操作パネル３からの走査を指示する命令
に対して、走査を制御する信号を走査ユニット１０４に
出力し、光検出器１１１から送られてくる観察画像の電
気信号をメモリ４に転送して、画像モニタ５にその画像
および操作メニューを表示する。また、操作パネル３か
ら入力される感度調節の命令に応じて、光検出器におけ
る印加電圧やゲインやオフセットなどの設定を行なう。

【００２２】次に第１の実施形態において期待画像を取
得するまでの動作を説明する。先ず始めに、観察者が操
作パネル３に前述した第２走査方式により観察試料を走
査させる命令を入力する。この命令を制御部２が受け
て、図２に示すフローチャートの処理を開始する。その
動作はコンフォーカルアパーチャ１１０の径を自動的に
開口して最大にするという命令を出力して（Ｓ２０
０）、その命令を受けて動作するコンフォーカルアパー
チャ１１０の径が実際に最大となったかどうかを判断す
る（Ｓ２０１）。その径が最大に調節されたことが判断
されると、観察試料上の走査を開始させる命令が出力さ
れて（Ｓ２０２）、レーザ光源１０１からレーザ光が照
射される。また、この最大となっている径に対応して、
照射されたレーザ光の強度が最適値に調節されているか
どうかを判断する（Ｓ２０３）。

【００２３】なお、この径の調節について、共焦点効果
が得られる径の値はこのコンフォーカルアパーチャ１１
０の径のもつ最大値よりも小さい値であり、このコンフ
ォーカルアパーチャ１１０の持つ最大及び最小の範囲で
設定することが望ましい。また、前記共焦点効果が得ら
れる径の値から前記コンフォーカルアパーチャ１１０の
径のもつ最大値の範囲で設定することがより望ましい。

【００２４】ここで説明するレーザ光の強度は基本的に
はコンフォーカルアパーチャの径と比例関係にあるが、
観察対象が蛍光画像である場合には蛍光物質から励起さ
れる効率を考慮に入れる必要がある。レーザ光の強度が
最適な値に調節されているかどうかは観察試料への走査
が終了するまで繰り返し監視を続けられており、観察試
料への走査が終了したかどうかの判断により（Ｓ２０
４）、終了していることが判断されると、次にレーザ光
を使用しないで、図１には図示しない反射光などによる
目視での観察するための光路、すなわちＢＩ光路が設定
されたかどうかを判断する（Ｓ２０５）。このＢＩ光路
に設定されると、この光路に設置されている対物レンズ
１０６の倍率、観察試料１０８の染色方法、観察試料１
０８からの蛍光波長、および開口数によって決まるコン
フォーカルアパーチャ１１０の径の最適値を、以下の計
算式Ｉまたはこれに準ずる計算式で計算して、この結果
の値に径を自動的に調節する命令を出す（Ｓ２０６）。

【００２５】

【数１】

【００２６】続いてＳ２０６で計算された値にコンフォ
ーカルアパーチャ１１０の径が調節を終えたかどうかの
判断がなされて（Ｓ２０７）、調節を終えると、ここで
目視の観察が行なえる。続いてこの時点におけるステー
ジ１０７の位置（現在ステージ位置）情報とあらかじめ
設定しておいた検査範囲、検査ステップ量および検査ス
テップの数を取得する（Ｓ２０８）。そして、この検査
範囲の開始位置へステージを移動させる命令を出力して
（Ｓ２０９）、この開始位置までステージ１０７が移動
したかどうかを判断する（Ｓ２１０）。開始位置まで移
動すると、検査範囲における検査の開始命令が出力され
て、Ｓ２０８で取得したステップ量に従った各ステップ
位置の輝度値を取得する（Ｓ２１１）。検査の終了は、
ステージ１０７が検査の終了位置まで到達したかどうか
で判断をして（Ｓ２１２）、到達すると、図３で示され
るＺ軸の検査範囲と各ステップ位置での輝度値との関係
を表すグラフ（以下Ｉ―Ｚグラフとする）をＳ２１１で
取得した各ステップ位置の輝度値から作成し、操作パネ
ル３に表示する（Ｓ２１３）。観察者は、このＩ−Ｚグ
ラフを基に、期待するＺ軸の合焦位置（以下期待合焦位
置とする）を判断して、操作パネル３に期待合焦位置を
入力する。この入力がされたかどうかを制御部２で判断
して（Ｓ２１４）、入力された場合には、期待合焦位置
へステージ１０７を移動するように命令して（Ｓ２１
５）、ステージ１０７の移動が完了したかどうかの判断
をする（Ｓ２１６）。移動が完了した場合には、予め設
定しておいた輝度値の閾値範囲を取得する（Ｓ２１
７）。そして、期待合焦位置における輝度値の上限と、
予め設定された輝度値の閾値範囲の下限とを比較して
（Ｓ２１８）、期待合焦位置の輝度値の上限が輝度値の
閾値範囲の下限を下回っている場合には、ゲインを最適
な輝度値に自動的に調節して（Ｓ２１９）、本処理を終
了する。また、Ｓ２１８で期待合焦位置の輝度値の上限
が輝度値の閾値範囲の下限を下回っていないと判断され
た場合には、期待合焦位置の輝度値の上限と、Ｓ２１７
で取得した輝度値の閾値範囲の上限とを比較する（Ｓ２
２０）。期待合焦位置の輝度値の上限が予め設定した輝
度値の閾値範囲の上限を上回っている場合には、ゲイン
を最適な輝度値に自動的に調節して（Ｓ２２１）、本処
理を終了する。この状態において、操作パネル３から制
御部２に観察試料１０８へのレーザ光のスポットによる
走査を開始する命令を出力すると、観察者の期待する合
焦位置での走査が可能となり、期待画像が得られる。 （第２の実施形態）本実施形態における共焦点レーザ走
査型顕微鏡の概略構成は、第１の実施形態の構成を利用
するものとし、またその機能も第１の実施形態と同様で
あるものとする。

【００２７】この条件による本実施形態での期待画像を
取得するまでの動作を説明する。先ず始めに、観察者が
操作パネル３に前述した第２の走査方式により観察試料
を走査させる命令を入力する。この命令を制御部２が受
けて、図４に示すフローチャートの処理を開始する。こ
の図４に示されるフローチャートにおいて、Ｓ２０８で
取得した情報を基にＳ２１２において各ステップでの輝
度値の検出の終了を判定するまでの処理は、前述した図
２の内容と同じである。Ｓ２１２以降に示されるＳ３０
０からの動作は図２とは異なる内容をもち、その内容
は、Ｓ２０８からＳ２１２の処理で取得した輝度情報を
基に図５に示すＩ―Ｚグラフを作成して、このＩ−Ｚグ
ラフを利用したピーク検出の処理の開始命令を出力する
（Ｓ３００）。図５において、操作者検出位置は観察者
が検出したＺ位置であり、これはＳ２０８で取得したス
テージ位置に相当する。また、ここでのピークとは、検
査範囲の最大輝度値だけを示すのではない。副次ピーク
も含めてあらかじめユーザが期待する検出条件を設定す
ることができて、その条件を基にＩ−Ｚグラフからピー
クを検出する。そして、観察者の検出条件に見合うピー
クが検出できたかどうか判断して（Ｓ３０１）、検出で
きなかった場合には、観察者に対してピーク検出が失敗
したことをダイアログ表示で通知して（Ｓ３０２）、Ｉ
−Ｚグラフによる期待合焦位置の入力を観察者に要求す
る。Ｓ３０１で観察者の検出条件に見合うピークを検出
できたと判断した場合、或いはＳ３０３で操作パネル３
への期待合焦位置の入力が確認された場合には、指定さ
れた期待合焦位置へステージを移動させる命令を出力す
る（Ｓ２１５）。その後のＳ２１６以下での動作は、前
述した図２での動作内容と同様の処理を行なう。

【００２８】この状態において、操作パネル３から制御
部２に観察試料１０８の走査を開始する命令を出力する
と、観察者の期待する合焦位置での走査が可能となり、
期待画像が得られる。 （付記１）ステージ上の観察試料にレーザ光を絞り込ん
だスポットを走査させて、前記スポットによる前記観察
試料からの光を集光させて該集光させる位置にピンフォ
ールを配置して該ピンフォールを通過する光に基づいて
前記観察試料の観察画像を取得する共焦点レーザ走査型
顕微鏡に利用される制御方法であって、前記共焦点レー
ザ走査型顕微鏡に対して前記観察試料の一定方向に走査
させたＸ軸走査ラインを該観察試料と平行して該走査ラ
インとは直行するＹ軸方向に繰り返し走査させる第１の
走査方式と、該走査方式における走査速度を最大として
前記Ｘ軸走査ラインをＹ軸方向に対して間引く第２の走
査方式のどちらかを選択的に実行させて、該選択された
走査方式に応じてピンフォールの径を制御する、ことを
特徴とする制御方法。 （付記２）さらに、前記ピンフォールの径の大きさに応
じてレーザ光強度を調節することを特徴とする付記１に
記載の制御方法。 （付記３）さらに、前記第２の走査方式を実行させるこ
とで観察試料の情報を得て、前記情報を基に観察者が決
定した合焦位置にフォーカスを合わせることを特徴とす
る付記１に記載の制御方法。

【００２９】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、観
察対象領域を素早く捉えることができて、取得した観察
画像も最適化して、さらにレーザ光による無駄な照射に
よる観察試料の退色も防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１、第２の実施形態における概略構成図であ
る。

【図２】第１の実施形態におけるフローチャートであ
る。

【図３】第１の実施形態で作成するＩ−Ｚグラフであ
る。

【図４】第２の実施形態におけるフローチャートであ
る。

【図５】第２の実施形態で作成するＩ−Ｚグラフであ
る。

【符号の説明】

１ 共焦点レーザ走査型顕微鏡本体 ２ 制御部 ２ａ 変更量設定部 ２ｂ 計算・処理部 ３ 操作パネル ４ メモリ ５ 画像モニタ １０１ レーザ光源 １０２ ミラー １０３ ダイクロイックミラー １０４ 走査ユニット １０５ レボルバ １０６ 対物レンズ １０７ ステージ １０８ 観察試料 １０９ レンズ １１０ コンフォーカルアパーチャ １１１ 光検出器 １１２ ステージ位置検出器

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ステージ上の観察試料にレーザ光を絞り込
   んだスポットを走査させて、前記スポットによる前記観
   察試料からの光を集光させて該集光位置にピンフォール
   を配置して該ピンフォールを通過する光に基づいて前記
   観察試料の観察画像を取得する共焦点レーザ走査型顕微
   鏡装置であって、 前記観察試料の一定方向に走査させたＸ軸走査ラインを
   該観察試料と平行して該走査ラインとは直行するＹ軸方
   向に繰り返し走査させる第１の走査方式と、該走査方式
   における走査速度を最大として前記Ｘ軸走査ラインをＹ
   軸方向に対して間引く第２の走査方式の２つの観察画像
   の取得手段と、 前記取得手段に前記第１および第２の走査方式のどちら
   かを選択的に実行させ、該選択された走査方式に応じた
   ピンフォールの径の調節を行なう制御手段と、 を有することを特徴とする共焦点レーザ走査型顕微鏡装
   置。
2. 【請求項２】制御手段が、前記ピンフォールの径の大き
   さに応じてレーザ光強度を調節する機能を、 有することを特徴とした請求項１に記載の共焦点レーザ
   走査型顕微鏡装置。
3. 【請求項３】ステージ上の観察試料にレーザ光を絞り込
   んだスポットを走査させて、前記スポットによる前記観
   察試料からの光を集光させて該集光させる位置にピンフ
   ォールを配置して該ピンフォールを通過する光に基づい
   て前記観察試料の観察画像を取得する共焦点レーザ走査
   型顕微鏡の制御装置に利用されるものであって、 前記共焦点レーザ走査型顕微鏡に対して前記観察試料の
   一定方向に走査させたＸ軸走査ラインを該観察試料と平
   行して該走査ラインとは直行するＹ軸方向に繰り返し走
   査させる第１の走査方式と、該走査方式における走査速
   度を最大として前記Ｘ軸走査ラインをＹ軸方向に対して
   間引く第２の走査方式のどちらかを選択的に実行させ
   て、 該選択された走査方式に応じてピンフォールの径の制御
   を行なう、 ことを前記制御装置に行なわせるための制御プログラ
   ム。
4. 【請求項４】前記ピンフォールの径の大きさに応じてレ
   ーザ光強度を調節する、 ことを前記制御装置にさらに行なわせる請求項３に記載
   の制御プログラム。
5. 【請求項５】前記第２の走査方式を実行させることで観
   察試料の情報を取得して、 前記情報を基に観察者が決定した合焦位置にフォーカス
   を合わせる、 ことを前記制御装置にさらに行なわせる請求項３に記載
   の制御プログラム。