JP2002538790A - 長いｄｎａ配列を経済的に合成し、そして組み立てるための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、短い合成オリゴヌクレオチドから長いＤＮＡ配列を組み立てる、費用効率が高い方法に関する。より具体的には、短いオリゴヌクレオチドを固体支持体上で、ｉｎ ｓｉｔｕで合成し、そして続いて、全長ＤＮＡ配列への組み立て前または組み立て中に、固体支持体から切断する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、本明細書に完全に援用される、１９９９年３月８日に提出された米
国特許出願第０９／２６４，３８８号の一部継続出願である。

【０００２】発明の分野 本発明は、短い合成オリゴヌクレオチドから長いＤＮＡ配列を組み立てる、費
用効率の高い方法に関する。より具体的には、短いオリゴヌクレオチドを固体支
持体上で、ｉｎ ｓｉｔｕで合成し、そして続いて、全長配列への組み立て前ま
たは組み立て中に、固体支持体から切断する。

【０００３】発明の背景 迅速な配列決定技術の出現は、有用な遺伝子情報を含む、ＤＮＡ配列の巨大な
データベースを生成してきている。残る問題は、これらの遺伝子産物が、実際は
何をしているか、これらがどのように相互作用し、生物全体を制御するか、そし
て究極的には、これらをどのように操作し、遺伝子治療、タンパク質治療、およ
び診断において、有用性を見出すことが可能であるかを見出すことである。遺伝
子機能の解明は、多様な遺伝子が、健康および疾患において果たす役割をさらに
理解するため、野生型配列の知識のみでなく、設計された変異を含む配列の利用
可能性も必要とする。突然変異誘発は、興味深い配列変異のランダムまたは指示
ライブラリーを生成するため、実験室で日常的に行われる。しかし、ＤＮＡ配列
における変化の機能上の影響に対する実験を行うため、ＤＮＡの巨大部分を操作
する能力は、修飾酵素の利用可能性およびその関連費用により、制限されてきて
いる。例えば、研究者は、伝統的な突然変異誘発法を介し、ＤＮＡの特定の領域
または配列の、特定の付加または欠失を容易に調節することは不可能であり、そ
して遺伝子変異を含むライブラリーから興味深いＤＮＡ配列を選択することに頼
らなければならない。

【０００４】 研究者がＤＮＡの巨大領域を体系的に合成し、こうした領域の機能に対する配
列中の相違の影響を決定することが可能であれば、最も有用であろう。しかし、
伝統的な方法を用いたＤＮＡ合成は、全体の収率が減少するため、実際的でない
。例えば、ＤＮＡ合成のホスホロアミダイト法において、工程当たり９９．５％
の収率であっても、５００塩基対長の全長配列の総収率は、１％未満であろう。
同様に、例えば、遺伝子治療ベクターとして有用なアデノウイルスの重複鎖を合
成しようとすると、必要とされる５０−７０キロ塩基の合成ＤＮＡは、最近の塩
基当たりおよそ１．００ドルの低価格であっても、全長配列当たり、５０，００
０ドルを超える費用がかかり、現実的であるにはあまりにも高すぎるであろう。

【０００５】 ＤＮＡの長い部分の回収は、ＤＮＡ化学合成を、組換えＤＮＡ技術と組み合わ
せると、改善される可能性がある。Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６（１）：１０６−１１０（１９７９）
； Ｉｔａｋｕｒａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６−１０６３（１９
７７）；およびＨｅｙｎｅｋｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ２６３：７４８−７５２
（１９７６）。ＤＮＡの長い部分の合成は、いくつかの中程度の大きさのＤＮＡ
断片を化学合成により合成して開始し、そして続いて、中程度の大きさの断片を
酵素的に連結し、望ましい長いＤＮＡ部分を産生してもよい。合成的に作成され
た中程度の長さのＤＮＡ断片はまた、制限酵素およびリガーゼを用い、ＤＮＡプ
ラスミドに融合させ、望ましい長いＤＮＡ配列を得てもよく、該プラスミドを適
切な宿主内で転写し、そして翻訳してもよい。最近、自己プライミングＰＣＲ技
術を用い、リガーゼを使用せず、ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、重
複するオリゴヌクレオチドのプールからＤＮＡ配列の巨大部分が組み立てられて
きている。Ｄｉｌｌｏｎら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（３）：２９８
−３００（１９９０）； Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ ５（８）：８２７−８２９（１９９２）； Ｃｈｅｎら， Ｊ
． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：８７９９−８８００（１９９４）
；およびＨａｙａｓｈｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７（２）：３１
０−３１５（１９９４）。つい最近、部分的ＤＮＡアーゼＩ消化により、または
オリゴヌクレオチドの混合物から生成されたランダム断片から、遺伝子を組み立
てる、ＤＮＡシャッフリング法が導入された。Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｎａｔｕｒ
ｅ ３７０：３８９−３９１（１９９４）； Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１
（１９９４）； Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３（１９９
６）； Ｃｒａｍｅｒｉら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４３
６−４３８（１９９７）； Ｚｈａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９（１９９７）； Ｃｒａｍ
ｅｒｉら， Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１（１９９８）； Ｃｈｒｉ
ｓｔｉａｎｓら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４
（１９９９）、米国特許第５，８３０，７２１号、第５，８１１，２３８号、第
５，８３０，７２１号、第５，６０５，７９３号、第５，８３４，２５２号、お
よび第５，８３７，４５８号；並びにＰＣＴ公告ＷＯ ９８／１３４８７、Ｗ０
９８／２７２３０、ＷＯ ９８／３１８３７、ＷＯ ９９／４１４０２、９９／
５７１２８およびＷＯ ９９／６５９２７。

【０００６】 非常に多様な短いまたは中程度の大きさのオリゴヌクレオチドを合成するため
の方法が、詳しく記載されてきている。該方法の１つは、マイクロアレイ技術を
使用し、多数のオリゴヌクレオチドを、固体支持体の表面上で、同時に合成する
。マイクロアレイ技術は、Ｇｒｅｅｎら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｃ
ｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４０４−４１０（１９９８）、Ｇｅｒｈｏｌｄら，
ＴＩＢＳ， ２４：１６８−１７３（１９９９）、米国特許第５，５１０，２７
０号、第５，４１２，０８７号、第５，４４５，９３４号、第５，４７４，７９
６号、第５，７４４，３０５号、第５，８０７，５２２号、第５，８４３，６５
５号、第５，９８５，５５１号、および第５，９２７，５４７号に記載されてき
ている。ガラス支持体上にＤＮＡ断片の高密度アレイを合成するための１つの方
法は、光指示コンビナトリアル合成を使用する。しかし、フォトリソグラフィー
合成法は、後の酵素的組み立てに十分に純粋なオリゴヌクレオチドを提供しない
し、また順応性があり、そして費用効率が高い方法でもない。例えば、フォトリ
ソグラフィーを用いたｉｎ ｓｉｔｕ合成は化学的カップリング収率が低いため
、各オリゴヌクレオチドは、望ましい長さのオリゴヌクレオチドに加え、かなり
の数の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）産物を含む可能性がある。例えば、１０
量体および２０量体では、それぞれ、全長のオリゴヌクレオチドは、約４０％お
よび１５％でしかない。Ｆｏｒｍａｎ， Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏ
ｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， 第１３章， ｐｐ ２０
６−２２８， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ （１９
９８）およびＭｃＧａｌｌら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１ ９ ：５０８１−５０９０（１９９７）。さらに、実用的な組み立てには、いかな
る既定の一連の配列に対しても特異的な数千ドルのマスクが必要である。

【０００７】 長いＤＮＡ配列の合成のための既存の方法はまた、多くの欠点も有し、例えば
、慣用的な固相ＤＮＡ合成の長さの制限、ＤＮＡの両方の鎖を合成する必要性、
および段階的組み立てのための複数の酵素的反応の複雑さである。これらの欠点
は、必然的に、長いＤＮＡ配列を得る費用を増加させる。当業には、複数のオリ
ゴヌクレオチドを経済的に合成し、そして続いて、これらを長いＤＮＡ配列に組
み立てる必要性がある。こうした安価でそしてオーダーメードの合成および組み
立て法は、多くの使用を有する。目的の遺伝子配列を組み立て、そして例えば、
とりわけ、遺伝子コード配列に対するプロモーターの相対的位置の機能、イント
ロン対エクソンの役割、機能に必要な遺伝子配列の最小化、多型および突然変異
の役割、遺伝子治療ベクターに対する配列変化の有効性、特定の実験または産業
適用のためのタンパク質コード遺伝子の最適化などの、多様な機能性（ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｌｉｔｙ）に関し、試験することが可能である。これらの機能解析は
、本当に研究者の調節下にある、ＤＮＡ設計を用いて、調べることが可能である
。他の場合では、組み立て配列中の特定の変異を用い、機能または機能の阻害を
試験するため、多くのありうる遺伝子変異を含む、構造化ライブラリーを生成し
てもよい。最終的には、本方式で、全ゲノムを容易に合成し、組み立て、そして
機能的に試験することが可能である。要約すると、合成遺伝子またはゲノムのモ
デル系を、研究者の調節下で、特定の方式で変化させることが可能ないかなる実
験も、容易にそしてより安価に行うことが可能である。

【０００８】発明の概要 本方法は、短いオリゴヌクレオチドから長いＤＮＡ配列を合成し、そして組み
立てるための方法であって：（ａ）固体支持体上に、オリゴヌクレオチド配列の
アレイを合成し、ここで、該オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡの両方の鎖を集
合的にコードし、そして切断可能部分を用い、固体支持体に共有結合している；
（ｂ）固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し；そして（ｃ）オリゴヌクレ
オチドを標的全長配列に組み立てる、工程を含む、方法である。本発明に意図さ
れる標的の長いＤＮＡ配列は、酵素的連結により、ＤＮＡポリメラーゼを使用す
ることにより、制限酵素を使用することにより、または当業に知られる他の適切
な組み立て法により、直接または間接的に、重複するオリゴヌクレオチドから組
み立てることが可能である、制御配列、遺伝子またはその断片、ベクター、プラ
スミド、ウイルス、生物の全ゲノム、またはいかなる他の生物学的に機能するＤ
ＮＡ配列であってもよい。

【０００９】 好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、固体支持体上で、ｉｎ ｓｉ
ｔｕ合成により、調製することが可能である。特に、オリゴヌクレオチドのｉｎ
ｓｉｔｕ合成は、インクジェットプリンターに使用されるものと類似の技術を
使用する、「ドロップオンデマンド（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）」法を使
用してもよい。さらに、親水性および疎水性表面のパターン化された領域からな
る、親水性／疎水性アレイまたは表面張力アレイを使用してもよい。好ましくは
、長いＤＮＡ配列の大きさは、約２００ないし１０，０００塩基、より好ましく
は、約４００ないし５，０００塩基の範囲である。好ましくは、各オリゴヌクレ
オチドの長さは、約１０ないし２００塩基長の範囲、より好ましくは、約２０な
いし１００塩基長の範囲であってもよい。好ましくは、固体支持体上で合成され
るオリゴヌクレオチドの数は、約１０ないし２０００、より好ましくは、約１０
ないし５００である。

【００１０】発明の詳細な説明 本発明は、短い合成オリゴヌクレオチドから長いＤＮＡ配列を組み立てるため
の費用効率の高い方法に関する。一般的に、本方法は、長いＤＮＡ配列を合成し
、そして組み立てるための方法であって：（ａ）固体支持体上に、オリゴヌクレ
オチド配列のアレイを合成し、ここで、該オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡの
両方の鎖を集合的にコードし、そして切断可能部分を用い、固体支持体に共有結
合している；（ｂ）固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し；そして（ｃ）
オリゴヌクレオチドを標的全長配列に組み立てる、工程を含む、方法である。本
発明に意図される標的の長いＤＮＡ配列は、酵素的連結により、ＤＮＡポリメラ
ーゼを使用することにより、制限酵素を使用することにより、または当業に知ら
れる他の適切な組み立て法により、直接または間接的に、重複するオリゴヌクレ
オチドから組み立てることが可能である、制御配列、遺伝子またはその断片、ベ
クター、プラスミド、ウイルス、生物の全ゲノム、またはいかなる他の生物学的
に機能するＤＮＡ配列であってもよい。

【００１１】 オリゴヌクレオチドおよび固体支持体への切断可能部分の結合 診断および他のハイブリダイゼーションに基づく解析のため設計された固相ま
たはマイクロアレイオリゴヌクレオチド合成では、最終オリゴヌクレオチド産物
は、調節孔ガラス（ＣＰＧ）またはチップなどの固体支持体に結合したままであ
る。典型的には、非切断可能リンカー、例えば図１のヒドロキシルリンカーＩま
たはＩＩが用いられる。これらのヒドロキシルリンカーは、脱保護および精製法
の間、そしてハイブリダイゼーション解析の間、損なわれないままである。しか
し、後により長いＤＮＡ部分に組み立てるための多数の重複オリゴヌクレオチド
の合成は、合成オリゴヌクレオチドの切断を可能にするリンカー上で行われる。
切断可能部分は、オリゴヌクレオチドを分解しない条件下で除去される。好まし
くは、リンカーは、２つのアプローチを用い、（ａ）脱保護工程と同じ条件下で
同時に、または（ｂ）脱保護工程の完了後、リンカー切断のための異なる条件ま
たは試薬を利用して続いて、切断してもよい。前者のアプローチは、リンカーの
切断が、ヌクレオシド塩基の脱保護と同時に行われるため、有益である可能性が
ある。さらなる合成後化学反応を避けるため、時間および労力が節約される。リ
ンカー切断に脱保護と同じ試薬を用いることにより、費用が低下する。第二のア
プローチは、続くリンカー切断が精製前工程として作用し、組み立て前に溶液か
らすべての保護基を除去する可能性があるため、望ましい可能性がある。

【００１２】 本発明には、いかなる適切な固体支持体を用いてもよい。これらの素材には、
とりわけ、ガラス、ケイ素、ウエファー（ｗａｆｅｒ）、ポリスチレン、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレンが含まれる。典型的には
、固体支持体は、オリゴヌクレオチドへの共有結合のための切断可能リンカーを
提供するよう官能化される。リンカー部分は長さ６原子またはそれ以上であって
もよい。あるいは、切断可能部分は、オリゴヌクレオチドの内部にあってもよく
、そしてｉｎ ｓｉｔｕ合成中、導入されてもよい。固相およびマイクロアレイ
オリゴヌクレオチド合成の業では非常に多様な切断可能部分が入手可能である。
Ｐｏｎ， Ｒ．，“Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｓ； ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”中， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍ
ｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：４６５−４９６（１９９３）； Ｖｅｒｍａら，
Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７：９９−１３４（１９９８）；
並びに米国特許第５，７３９，３８６号、第５，７００，６４２号および第５，
８３０，６５５号。適切な切断可能部分は、とりわけ、ヌクレオシド塩基の保護
基の性質、固体支持体の選択、試薬搬送様式と適合するように選択することが可
能である。切断法は、多様な酵素的または非酵素的手段、例えば化学的、熱的、
または光分解性切断を含む可能性がある。好ましくは、固体支持体から切断され
るオリゴヌクレオチドは、未結合３’−ＯＨ端を含む。未結合３’−ＯＨ端はま
た、オリゴヌクレオチドの切断後、化学的または酵素的処理により得ることも可
能である。

【００１３】 共有固定化部位は、オリゴヌクレオチドの５’端であってもまたはオリゴヌク
レオチドの３’端であってもよい。いくつかの場合、固定化部位は、オリゴヌク
レオチドの内部（すなわちオリゴヌクレオチドの５’または３’端以外の部位）
であってもよい。切断可能部位は、オリゴヌクレオチド骨格沿いに位置する、例
えば、ホスホジエステル基の１つの代わりの修飾３’−５’ヌクレオチド間結合
、例えば、リボース、ジアルコキシシラン、ホスホロチオエート、およびホスホ
ロアミデートヌクレオチド間結合であってもよい。切断可能オリゴヌクレオチド
類似体はまた、塩基または糖の１つに対する置換または取り替え、例えば、７−
デアザグアノシン、５−メチルシトシン、イノシン、ウリジン、およびそれらに
匹敵するものを含んでもよい。

【００１４】 １つの態様において、修飾オリゴヌクレオチド内に含まれる切断可能部位は、
化学的切断可能基、例えばジアルコキシシラン、３’−（Ｓ）−ホスホロチオエ
ート、５’−（Ｓ）−ホスホロチオエート、３’−（Ｎ）−ホスホロアミデート
、５’−（Ｎ）−ホスホロアミデート、およびリボースを含んでもよい。化学的
切断可能オリゴヌクレオチドの合成および切断条件は、米国特許第５，７００，
６４２号および第５，８３０，６５５号に記載される。例えば、導入しようとす
る切断可能部位の選択に応じ、官能化ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシド二量
体をまず調製し、そしてその後、オリゴヌクレオチド合成の経過中、成長するオ
リゴヌクレオチド断片に選択的に導入してもよい。ジアルコキシシランの選択的
切断は、フルオリドイオンでの処理により、達成することが可能である。ホスホ
ロチオエートヌクレオチド間結合は、穏やかな酸化条件下で選択的に切断するこ
とが可能である。ホスホロアミデート結合の選択的切断は、穏やかな酸化条件下
、例えば８０％酢酸で行うことが可能である。リボースの選択的切断は、希水酸
化アンモニウムでの処理により、行うことが可能である。

【００１５】 好ましい態様において、非切断可能ヒドロキシルリンカー（図１）を切断可能
リンカーに変換するため、ホスホロアミダイトまたはＨ−ホスホネートオリゴヌ
クレオチド合成前に、特別なホスホロアミダイトを、ヒドロキシル基にカップリ
ングさせてもよい。こうした特別のホスホロアミダイトの１つの好ましい態様、
化学的リン酸化剤が、図２に示される。化学的リン酸化剤とヒドロキシル基をカ
ップリングするための反応条件は、当業者に知られる。オリゴヌクレオチド合成
完了時の、化学的リン酸化剤の切断は、３’端にリン酸基を持つオリゴヌクレオ
チドを生じる。３’リン酸端は、当業者により日常的に行われる、化学薬品また
は酵素、例えばアルカリホスファターゼでの処理により、３’ヒドロキシル端に
変換してもよい。

【００１６】 切断可能リンカーの別の種類は、ＭｃＬｅａｎらにより、ＰＣＴ公告ＷＯ ９
３／２００９２に記載される。この種類の切断可能リンカーは、合成当たり２オ
リゴヌクレオチド（ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｐｅｒ ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ）を表すＴＯＰＳとしても知られ、まず、固体支持体上でオリゴ
ヌクレオチドを合成し、第一のオリゴヌクレオチドに切断可能ＴＯＰＳリンカー
を結合させ、ＴＯＰＳリンカー上に第二のオリゴヌクレオチドを合成し、そして
最後に、第一および第二両方のオリゴヌクレオチドからリンカーを切断すること
により、合成当たり、２つのオリゴヌクレオチドを生成するよう、設計された。
しかし、本発明において、ＴＯＰＳホスホロアミダイトを用い、固体支持体上の
非切断可能ヒドロキシル基を、多数の重複するオリゴヌクレオチドを合成するの
に適した、切断可能リンカーに変換してもよい。ＴＯＰＳ試薬の好ましい態様は
、図３に示される、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＴＯＰＳ^TMホスホロアミダイトである
。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＴＯＰＳ^TMホスホロアミダイト調製、カップリングおよ
び切断のための条件は、本明細書に援用される、Ｈａｒｄｙら、 Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（１５）：２９９８−３００４（１９
９４）に詳述される。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＴＯＰＳ^TMホスホロアミダイトは、
塩基性条件下、例えば長いアンモニアおよび／またはアンモニア／メチルアミン
処理などで除去し、天然３’ヒドロキシオリゴヌクレオチドを生じることが可能
な、環状３’リン酸を生じる。

【００１７】 切断可能アミノリンカーはまた、重複オリゴヌクレオチドの合成に使用するこ
とも可能である。ホスホロアミダイト結合を介しリンカーに結合している、生じ
たオリゴヌクレオチドは、８０％酢酸で切断し、３’リン酸化オリゴヌクレオチ
ドを生じてもよい。

【００１８】 別の態様において、修飾オリゴヌクレオチド内に含まれる切断可能部位は、酵
素、とりわけヌクレアーゼ、グリコシラーゼなどにより切断可能なヌクレオチド
を含んでもよい。広い範囲のオリゴヌクレオチド塩基、例えばウラシルは、塩基
およびデオキシリボースの間でＮ−グリコシル結合を切断し、こうして無塩基性
部位を生じる、ＤＮＡグリコシラーゼにより、除去することが可能である。Ｋｒ
ｏｋａｎら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２５：１−１６（１９９７）。オリ
ゴヌクレオチド中の無塩基性部位は、その後、エンドヌクレアーゼＩＶにより切
断し、未結合３’−ＯＨ端を残してもよい。別の態様において、切断可能部位は
、制限エンドヌクレアーゼ切断可能部位、例えばクラスＩＩ制限酵素切断可能部
位であってもよい。例えば、ＢｐｍＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｍＦＩ、お
よびＦｏｋＩ認識配列を、固定化オリゴヌクレオチド中に取り込み、そして続い
て切断しオリゴヌクレオチドを遊離させてもよい。

【００１９】 別の態様において、固定化オリゴヌクレオチド内の切断可能部位は、光切断可
能リンカー、例えば、オルト−ニトロベンジル種の光切断可能リンカーを含んで
もよい。光不安定性オリゴヌクレオチドの固体支持体上の合成および切断条件は
、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら， Ｊ． ｏｆ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６１：５２
５−５２９（１９９６）、Ｋａｈｌら， Ｊ． ｏｆ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６４ ：５０７−５１０（１９９９）、Ｋａｈｌら， Ｊ． ｏｆ Ｏｒｇ． Ｃ
ｈｅｍ． ６３：４８７０−４８７１（１９９８）、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，
Ｊ． ｏｆ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５９：７４６−７５３（１９９４）、Ｈｏ
ｌｍｅｓら， Ｊ． ｏｆ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２：２３７０−２３８０
（１９９７）、および米国特許第５，７３９，３８６号に記載される。オルト−
ニトロベンジルに基づくリンカー、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチ
ル、およびＦｍｏｃ−アミノエチルカルボン酸リンカーもまた、商業的に得るこ
とが可能である。

【００２０】 目的の長いＤＮＡ配列をコードする重複オリゴヌクレオチドの決定 本発明は、重複オリゴヌクレオチドのアレイからいかなる長いＤＮＡ配列も合
成し、そして組み立てるための一般的な方法に相当する。好ましくは、長いＤＮ
Ａ領域の大きさは、約２００ないし１０，０００塩基の範囲である。より好まし
くは、長いＤＮＡ領域の大きさは、約４００ないし５，０００塩基の範囲である
。目的の長いＤＮＡ配列を一連の重複するオリゴヌクレオチドに分けることが可
能である。長いＤＮＡ配列の酵素的組み立てでは、目的の長いＤＮＡ配列のセン
スおよびアンチセンス鎖両方のすべての塩基を合成することは必要ではない。重
複オリゴヌクレオチドは、典型的には、目的のＤＮＡ領域の両方の鎖を集合的に
コードすることが必要とされる。各重複オリゴヌクレオチドの長さおよび重複の
度合いは、オリゴヌクレオチド合成および組み立ての方法および条件に応じ、多
様である可能性がある。いくつかの一般的な要因、例えば、とりわけ、費用およ
び中程度の大きさのオリゴヌクレオチドを合成するのに関連する誤り、重複オリ
ゴヌクレオチドのアニーリング温度およびイオン強度、ユニークな重複の形成、
並びに非特異的結合および分子内塩基対形成の最小化を考慮してもよい。原則と
して、標的配列に組み立てるのに使用してもよい重複オリゴヌクレオチドの数に
は、生得的な制限はないが、重複オリゴヌクレオチドの数は、好ましくは、約１
０ないし２０００、そしてより好ましくは、約１０ないし５００である。

【００２１】 特に、ＤＮＡポリメラーゼを用いた組み立て法では、組み立て後に正しい大き
さの長いＤＮＡ配列を産生するため、ユニークな重複が好ましい。ユニークな重
複は、重複の度合いを増加させることにより、達成することが可能である。しか
し、増加する度合いの重複は、必要とされる塩基の数を増やし、これは当然、オ
リゴヌクレオチド合成において、さらなる費用を招く。当業者は、重複オリゴヌ
クレオチドの最適な長さ、並びにオリゴヌクレオチド合成および組み立て法に適
した重複の最適な長さを選択するであろう。特に、各重複領域の配列を持つ標的
配列の両方の鎖のコンピューター検索を用い、非特異的結合を生じる可能性が最
も低いオリゴヌクレオチドのユニークな設計を示してもよい。好ましくは、各オ
リゴヌクレオチドの長さは、約１０ないし２００塩基長の範囲であってもよい。
より好ましくは、各オリゴヌクレオチドの長さは、約２０ないし１００塩基長の
範囲である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、その相補体と、約１０ないし
１００塩基、重複する。この範囲の最低、少なくとも１０塩基の重複が、各鎖の
ポリメラーゼ伸長の安定したプライミングを生成するのに必要である。最高の２
００塩基長の最大重複オリゴヌクレオチドは、１００塩基の相補的重複を含むで
あろう。より好ましくは、長さ約１５−２０塩基対の範囲の重複領域を設計し、
望ましい、例えば５２−６６℃の範囲の融解温度を生じ、オリゴヌクレオチド特
異性を確実にしてもよい。すべての重複オリゴヌクレオチドが、類似の重複度合
いを有し、そしてしたがって、類似のアニーリング温度を有することもまた好ま
しい可能性があり、これは、ＰＣＲ周期中のアニーリング条件を標準化するであ
ろう。

【００２２】 オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドの合成は、多様なチップおよびマイクロアレイに基づくオ
リゴヌクレオチド合成法を用いて最適に達成することが可能である。特に、望ま
しいＤＮＡ配列を組み立てるのに必要なオリゴヌクレオチドの数が少ない場合、
伝統的な調節孔ガラス上の固相オリゴヌクレオチド合成を使用してもよい。オリ
ゴヌクレオチドは、自動化ＤＮＡ合成装置上で、例えば、５−ジメトキシトリチ
ルヌクレオシドβ−シアノエチルホスホロアミダイトを用い、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ａ合成装置上で合成してもよい。合成は、平均孔
サイズ１０００Åの０．２μＭスケールＣＰＧ固体支持体上で行ってもよい。オ
リゴヌクレオチドは、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または当業に知られる他の適切
な方法により、精製してもよい。

【００２３】 好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、段階的方式で、固体支持体上
のｉｎ ｓｉｔｕ合成により、調製してもよい。合成の各周期で、各スポットで
、望ましい配列および長さが達成されるまで、成長している鎖にヌクレオチド構
築ブロックを付加してもよい。特に、オリゴヌクレオチドのｉｎ ｓｉｔｕ合成
は、インクジェットプリンターに使用されるものと類似の技術を使用する、「ド
ロップオンデマンド」法を使用してもよい。米国特許第５，４７４，７９６号、
第５，９８５，５５１号、第５，９２７，５４７号、Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，
Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １１：６８７
−６９０（１９９６）、およびＳｃｈｅｎａら， ＴＩＢＴＥＣＨ １６：３０
１−３０６（１９９８）。本アプローチは、典型的には、圧電性または他の形式
の推進力を利用し、試薬を小型のノズルから固体表面に移動させる。例えば、プ
リンターヘッドは、アレイを横切って移動し、そして各スポットで、電場が収縮
し、試薬の微小滴をアレイ表面上に搾り出す。洗浄および脱保護に続き、次の周
期のオリゴヌクレオチド合成を行う。圧電性プリンティング法の工程収率は、典
型的には、伝統的なＣＰＧオリゴヌクレオチド合成に匹敵し、そして上回りさえ
する。ドロップオンデマンド技術は、実質的にいかなる目的の試薬の高密度グリ
ッド化も可能にする。また、本方法を用いると、オリゴヌクレオチド合成のため
、すでに開発されている広範囲にわたる化学反応、例えば、とりわけ、配列設計
の柔軟性、オリゴヌクレオチド類似体の合成、５’−３’方向の合成を利用する
ことがより容易である。インクジェット技術は、直接的な表面接触を必要としな
いため、圧電性搬送は高処理向けに修正可能である。

【００２４】 好ましい態様において、圧電性ポンプを用い、試薬をオリゴヌクレオチドのｉ
ｎ ｓｉｔｕ合成に添加してもよい。５０ピコリットルないし２マイクロリット
ルの試薬小滴をアレイ表面に搬送することが可能である。圧電性ポンプの設計、
構築、および機構は、米国特許第４，７４７，７９６号および第５，９８５，５
５１号に記載されている。圧電性ポンプは、非常に正確な方式で、表面に細かい
液体小滴を搬送することが可能である。例えば、ピコポンプは、１０，０００
Ｈｚでまでピコリットルの試薬を産生することが可能であり、そして２ ｃｍの
距離で、２５０ミクロンの標的に正確に当たる。

【００２５】 本発明の好ましい態様において、親水性および疎水性表面のパターン化された
領域からなる、親水性／疎水性アレイまたは表面張力アレイを使用してもよい。
米国特許第４，７４７，７９６号および第５，９８５，５５１号。親水性／疎水
性アレイは、疎水性バックグラウンドに対し、多数の親水性領域を含んでもよい
。各親水性領域は、親水性スポットの間の疎水性マトリックスにより、隣の親水
性領域から空間的に分離される。記載される表面張力アレイを本発明に使用して
もよい。典型的には、支持体表面は、１ ｍｍ²当たり約１０−５０ ｘ １０^{- 15} モルの官能結合部位を有し、そして各官能化結合部位は、直径約５０−２００
０ミクロンである。

【００２６】 表面張力局在化および試薬微小搬送によりアレイを作成することにはかなりの
利点がある。支持体表面をパターン化するのに用いられるリソグラフィーおよび
化学反応は、単純にアレイ特徴の大きさおよび分布を定義する、一般的な方法で
ある。これらは、各部位で合成され、または搬送されるオリゴヌクレオチド配列
とは完全に別個である。さらに、オリゴヌクレオチド合成化学反応は、オーダー
メードの合成試薬より、標準的なものを使用する。組み合わせた結果が、アレイ
に用いられるオリゴヌクレオチドの配列および長さ、アレイ特徴の数および配置
、並びにこれらを作成するのに用いる化学反応に関する完全な設計柔軟性である
。ひとたび設計されてしまえば、アレイの組成を変化させることに関連する費用
はない。本方法は、アレイ製作のための安価で、柔軟性があり、そして再現可能
な方法を提供する。

【００２７】 本質的には、親水性／疎水性アレイの製作は、光耐性物質で固体表面を被覆し
、そしてその後、一般的な光マスクを用い、これらを光に曝露することにより、
アレイパターンを明示することを伴う可能性がある。陽性または陰性光耐性物質
は、当業に公知である。例えば、光学的陽性光耐性物質、例えば、ＡＺ１３５０
（Ｎｏｖｏｌａｃ^TM型Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌａｎｅｓｅ^TM、Ｎｏｖｏｌａｃ^TM は、所有されるｎｏｖｏｌａｋ樹脂であり、該樹脂は、酸縮合媒体中のフェノー
ルとホルムアルデヒドの反応産物である）、またはＥ−ビーム陽性光耐性物質、
例えばＥＢ−９（Ｈｏｙａ^TMによるポリメタクリレート）を使用してもよい。

【００２８】 光耐性物質被覆表面を続いて曝露し、そして現像し、第一の曝露支持体表面の
パターン化された領域を生成する。曝露表面は、その後、フルオロアルキルシラ
ンと反応させ、安定な疎水性マトリックスを形成する。残った光耐性物質をその
後、除去し、そしてガラスチップを、アモニシランまたはヒドロキシ基を持つシ
ランと反応させ、親水性スポットを形成する。あるいは、支持体表面をヒドロキ
シまたはアミノアルキルシランと反応させ、誘導体化親水性支持体表面を形成す
ることにより、パターン化した支持体表面を作成してもよい。その後、支持体表
面を、一時的な光不安定性ブロッキング剤としてのｏ−ニトロベンジル塩化カル
ボニルと反応させ、光遮断支持体表面を提供する。その後、マスクを通じて光遮
断支持体表面を光に曝露し、非遮断ヒドロキシまたはアミノアルキルシランを含
む支持体表面上に非遮断領域を生成する。その後、曝露表面をペルフルオロアル
カノイルハロゲン化物またはペルフルオロアルキルスルホニルハロゲン化物と反
応させ、安定な疎水性（ペルフルオロアシルまたはペルフルオロアルキルスルホ
ンアミド）アルキルシロキサンマトリックスを形成する。この残った光遮断支持
体表面を最後に曝露し、非遮断ヒドロキシまたはアミノアルキルシランのパター
ン化された領域を生成し、誘導体化親水性結合部位領域を形成する。いくつかの
シロキサン官能化試薬を用いてもよい。例えば、ヒドロキシアルキルシロキサン
、ジオール（ジヒドロキシアルキル）シロキサン、アミノアルキルシロキサン、
および二量体型二次アミノアルキルシロキサンを用い、パターン化された親水性
ヒドロキシルまたはアミノ領域を得てもよい。

【００２９】 圧電性ポンプを用い、オリゴヌクレオチド合成に、いくつかの固体支持体を用
いてもよい。パターン化されたオリゴヌクレオチド合成には、マスク化表面の重
要な特性が２つある。第一に、マスク化表面は、通常のオリゴヌクレオチド合成
の条件に不活性でなければならない。マスク化表面は、バルク溶媒界面に、未結
合ヒドロキシまたはアミノ基を提示してはならない。第二に、表面は、より極性
の官能化結合部位に比較し、一般的な有機溶媒、例えばアセトニトリルおよびグ
リコールエーテルによる浸潤が劣っていなければならない。湿潤現象は、固体−
液体界面での分子間の表面張力または引力の尺度であり、そしてダイン／ｃｍ²
で定義される。フルオロカーボンは、炭素−フッ素結合のユニークな極性（陰電
性）のため、非常に低い表面張力を有する。緊密に構造化されたラングミュラー
−ブロジェット型膜では、層の表面張力は、主に、アルキル鎖の末端のフッ素の
パーセントにより、決定される。緊密に配置されたフィルムでは、単一末端トリ
フルオロメチル基が、表面をペルフルオロアルキル層とほぼ同じ疎油性（ｌｉｐ
ｏｐｈｏｂｉｃ）にするであろう。フルオロカーボンが下層の誘導体化固体（非
常に架橋されたポリマー性）支持体に共有結合している場合、反応部位の密度は
、一般的にラングミュラー−ブロジェットおよび基の密度より低いだろう。しか
し、ペルフルオロアルキルマスク化剤は、支持体表面の溶媒接近可能領域に、比
較的高いフッ素含量を保持する。

【００３０】 ガラス（ポリテトラシロキサン）は、半導体産業により開発された、光耐性剤
の厚いフィルム（１−５ミクロン）を用い、曝露ガラス表面にマスク化パターン
を生成する多くの技術があるため、試薬を搬送する圧電性ポンプを用いた、パタ
ーン化オリゴヌクレオチド合成に、特に適している。最初に曝露されるガラス表
面は、好ましくは、揮発性フルオロアルキルシランで、ガス相拡散を用い、誘導
体化し、緊密に充填された疎油性単層を生成してもよい。ポリマー化光耐性剤は
、曝露領域の誘導体化期間中、ガス性フルオロアルキルシランに対する、有効な
不浸透性バリアを提供する。しかし、疎油性誘導体化後、残った光耐性剤は、温
かい有機溶媒（メチル、イソブチル、ケトン、またはＮ−メチルピロリドン）中
での溶解により、容易に除去され、未処理のガラスの第二の表面を曝露する一方
、第一の適用シラン層を損なわれないままにすることが可能である。この第二の
領域のガラスをその後、固相オリゴヌクレオチド合成を係留するのに適したヒド
ロキシルまたはアミノ基いずれかを含む、第二の極性シランを用い、溶液または
ガス相法により、誘導体化してもよい。シロキサンは、強いアルカリ条件下では
、いくぶん制限された安定性を有する。

【００３１】 いくつかの有機ポリマーもまた、パターン化親水性／疎水性アレイのための望
ましい特性を有する。例えば、テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチ レン）は、理想的な疎油性表面を提供する可能性がある。この種類の素材のパタ ーン化された誘導体化は、物理的マスクを通じた反応性イオンまたはプラズマエ ッチング、あるいは電子ビームを用いた後、表面ヒドロキシメチル基を還元する ことにより、達成することが可能である。ポリプロピレン／ポリエチレンは、ガ ンマ照射またはクロム酸酸化により表面誘導体化し、そしてヒドロキシまたはア ミノメチル化表面に変換してもよい。非常に架橋されたポリスチレン−ジビニル ベンゼン（およそ５０％）は、非膨張性であり、そしてクロロメチル化により、 容易に表面誘導体化し、そして続いて他の官能基に変換することが可能である。 ナイロンは、直接活性である、ヘキシルアミノ基の最初の表面を提供する。これ らの表面の疎油性パターン化は、ガラスと同じ種類の溶液に基づく薄層マスク化 技術およびガス相誘導体化を用い、またはｏ−ニトロベンジルカルボニルブロッ キング基を用いた直接光化学的パターン化により、達成してもよい。これらの表 面のパターン化に続き、ヌクレオシドホスホロアミダイトの添加前に、適切な切 断可能リンカーを、反応基、例えばヒドロキシまたはアミノ基にカップリングす る。

【００３２】 記載されるように、最初のシランを誘導体化した後、調製されたドット上での
オリゴヌクレオチドの組み立てを、ホスホロアミダイト法にしたがって行う。開
放ガラス表面での溶媒の蒸発を防ぐため、アセトニトリルの代わりにアジポニト
リルおよびアセトニトリル（４：１）高沸点混合物を使用する。ブロッキングさ
れたホスホロアミダイトおよび活性化剤（Ｓ−エチル−テトラゾール）の搬送は
、ピコポンプ装置を用い、個々のスポットに向けられる。脱トリチル化、キャッ
プ化、酸化および洗浄を含む、すべての他の工程は、バッチ法で、表面を適切な
試薬に浸すことにより、アレイ上で行われる。

【００３３】 合成完了に際し、重複オリゴヌクレオチドは、組み立て工程前にまたは該工程
中に、切断してもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、標準的脱保護法、例え
ばアンモニアまたはメチルアミン／アンモニア処理により、固体支持体から切断
してもよい。脱保護オリゴヌクレオチドの生じた混合物は、組み立てに直接使用
することが可能である。

【００３４】 重複オリゴヌクレオチドの、全長標的配列への組み立て 一連の重複オリゴヌクレオチドからの標的の長いＤＮＡ配列の組み立ては、当
業者に公知の文献中の多様な方法を用い、行ってもよい。標準的アプローチは、
望ましい長さの標的ＤＮＡに到達するために、酵素的連結を使用するものである
。重複オリゴヌクレオチドは、アニーリングさせ、一本鎖および／または二本鎖
中断を持つ、二本鎖ＤＮＡ配列を形成してもよい。これらの中断をその後、当業
に知られる方法を用い、ＤＮＡポリメラーゼで埋め込み、そして／またはＤＮＡ
リガーゼで酵素的に連結してもよい。ホスホジエステル結合の形成を通じた、オ
リゴヌクレオチドの５’および３’端の分子内連結は、典型的には、５’ホスホ
リルドナー基を持つ１つのオリゴヌクレオチドおよび未結合３’−ヒドロキシル
アクセプターを持つ別のものを必要とする。オリゴヌクレオチドは、当業に知ら
れる方法を用い、リン酸化してもよい。全長標的ＤＮＡ配列は、その後、当業に
知られる方法を用い、ＰＣＲに基づく方法を用いて増幅しても、または選択した
ベクターにクローニングしてもよい。さらなる組み立て法にはまた、制限酵素ま
たはＤＮＡポリメラーゼの使用が含まれる。

【００３５】 １．制限酵素を用いた組み立て 制限酵素を使用し、短いオリゴヌクレオチドを長いＤＮＡ配列に組み立てても
よい。制限酵素は、特定の塩基配列でＤＮＡを内部で切断する酵素群である。例
えば、オリゴヌクレオチド指示二本鎖中断修復を用いてもよい。Ｍａｎｄｅｃｋ
ｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７１７
７−７１８１（１９８６）； Ｍａｎｄｅｃｋｉら， Ｇｅｎｅ ６８：１０１
−１０７（１９８８）およびＭａｎｄｅｃｋｉら， Ｇｅｎｅ ９４：１０３−
１０７（１９９０）。一般的には、本方法は、３つの工程：（１）適切な挿入物
をプラスミドＤＮＡにクローニングし；（２）挿入物含有プラスミドＤＮＡから
突出端を持つ制限断片を生成し；そして（３）制限断片を標的の長いＤＮＡ配列
に組み立てることを含む。

【００３６】 好ましい態様において、工程１におけるプラスミドＤＮＡ中の挿入物のクロー
ニングは、ブリッジ突然変異誘発プロトコルとしても知られる、オリゴヌクレオ
チド指示二本鎖中断修復を用いて行ってもよい。オリゴヌクレオチド指示二本鎖
中断修復は、本質的に、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド挿入物および
直線化プラスミドＤＮＡの変性混合物を用いた、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の形
質転換を伴い、ここで、オリゴヌクレオチド挿入物の５’および３’端は、直線
化プラスミドＤＮＡの二本鎖中断（すなわち切断部位）に隣接する配列に相同で
ある。オリゴヌクレオチド挿入物の５’および３’端での相同配列は、ｉｎ ｖ
ｉｖｏで、直線化プラスミドＤＮＡの二本鎖中断の修復を指示する。二本鎖中断
の各側およびオリゴヌクレオチド挿入物の各端の間の相同配列は、典型的には、
１０ ｎｔ長以上である。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドの５’お
よび３’端並びに二本鎖中断の２つの側での相同配列は、ＦｏｋＩ認識部位（５
’−ＧＧＡＴＧ−３’）を含む。標的ＤＮＡ配列の一連の重複サブ配列を、２つ
のＦｏｋＩ部位の間に挿入する。

【００３７】 ＦｏｋＩ制限酵素は、その認識部位から９および１３ ｎｔ離れたＤＮＡ部位
で、付着（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）二本鎖中断を生成し、これは、ＦｏｋＩでのプ
ラスミドＤＮＡ切断に際し、ユニークな４ ｎｔ長５’突出端を含む制限部位を
遊離させる。端がユニークなことにより、標的の長いＤＮＡ配列を形成する、制
限断片の効率的でそして直接的な同時連結が可能になる。遺伝子組み立てのＦｏ
ｋＩ法を用いたオリゴヌクレオチド挿入物は、標的の長いＤＮＡ配列を、一連の
クローニング可能な大きさのサブ配列、典型的には２０ ｎｔないし２００ ｎ
ｔの範囲のものに分割することにより、設計される。分割点は、好ましくは、標
的の長いＤＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドンの間で
あってもよい。各サブ配列は、クローニングされたサブ配列が、ＦｏｋＩ制限酵
素でプラスミドＤＮＡから除去される際、重複領域が相補的付着末端を形成する
ように、どちらかの側で、４ ｎｔ、隣接するサブ配列と重複していてもよい。
特に、重複サブ配列は、典型的には、これらがユニークであるように選択され、
これは、ＦｏｋＩ切断に続き、標的の長いＤＮＡ配列にサブ配列を組み立てる間
、これらが互いに適切な配置でアニーリングすることを確実にするであろう。特
に、標的ＤＮＡ配列中にいかなるものでもよいＦｏｋＩ部位が存在する場合、好
ましくは、該部位を重複領域内に置いてもよく、これは、この部位でのＦｏｋＩ
切断が、クローニングされた領域の外側で起こるようにする。４ ｎｔ重複を含
むサブ配列を決定したら、２つのアームを添加し、ＤＮＡプラスミドの二本鎖中
断の２つの側に必要な配列相同性を提供することにより、オリゴヌクレオチド挿
入物の配列を得てもよい。したがって、オリゴヌクレオチド挿入物の配列は、ア
ーム１＋サブ配列（４ ｎｔ重複を含む）＋アーム２の形を取り、ここで、アー
ム１およびアーム２は、各々ＦｏｋＩ部位を含み、ＤＮＡプラスミドの二本鎖中
断の各側に相同である。オリゴヌクレオチド挿入物の全長は、中断修復の効率を
最適化するため、変化させてもよい。さらに、相同部位に関するサブ配列の位置
もまた、修復の効率を最適化するため、変化させてもよい。修復効率は、サブ配
列および相同配列の間の距離が増加するにつれ、減少することが知られる。遺伝
子組み立てのＦｏｋＩ法を用いた特に好ましい態様において、サブ配列の平均長
は、約７０ ｎｔであり、そしてオリゴヌクレオチド挿入物のアーム１およびア
ーム２は各１５ ｎｔであり、ＦｏｋＩ部位およびプラスミドＤＮＡの二本鎖中
断に隣接する配列に相補的な配列を含む。したがって、特に好ましい態様におい
て、オリゴヌクレオチド挿入物の平均長は、１００ ｎｔ（アーム１＋サブ配列
＋アーム２）である。

【００３８】 その後、ブリッジ突然変異誘発プロトコルにより、適切なベクターにオリゴヌ
クレオチド挿入物をクローニングしてもよい。適切なプラスミド系は、プラスミ
ドＤＮＡを切断するためのユニーク制限部位のクラスターの存在および挿入物含
有プラスミドコロニーの容易でそして正確なスクリーニング法の適切さに基づき
、選択してもよい。呈色スクリーニング法が特に好ましい。マルチクローニング
サイトおよび指標遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子またはその断片）を含むｐＵＣプラス
ミドを用いてもよい。特に、適切なスクリーニング法を達成するため、ｐＵＣの
マルチクローニングサイトにフレームシフト突然変異を導入してもよい。例えば
、ＰｓｔＩ部位での１つの残基の欠失を、ｐＵＣプラスミドに導入してもよい。
その後、突然変異プラスミドに導入されたオリゴヌクレオチド挿入物は、１つの
余分なヌクレオチドを含み、プラスミドＤＮＡの二本鎖中断の修復が起こった際
、ｌａｃＺの読み枠を回復させてもよい。この方式だと、修復プラスミド（また
は挿入物含有プラスミド）は青色コロニーを形成し、一方、ヌクレオチド欠失（
親）プラスミドを含む細胞は、白色コロニーを生じさせるため、挿入物含有プラ
スミドが容易に選択される。プラスミドに導入されるすべての挿入物を、これら
がマルチクローニングサイトのユニークな制限部位を破壊し、そして同時に新た
な制限部位を生成するように設計することもまた、有益である。本特徴は、プラ
スミドＤＮＡの制限消化による、挿入事象のさらなる確認を可能にするであろう
。遺伝子組み立てのＦｏｋＩ法に用いられる適切なＤＮＡプラスミドは、制限酵
素で、好ましくはユニークな制限部位で切断してもよい。１つの部位での制限酵
素切断により直線化プラスミドを得ることが好都合であるが、本発明はまた、直
線化プラスミドＤＮＡを生成する他の方法、例えば、とりわけ、多数の部位での
制限酵素切断、ＤＮＡ断片を連結することによる直線プラスミドの再構築、また
はＤＮアーゼ消化、超音波を用いたＤＮＡのランダム切断による方法も意図する
。当業に知られる方法を用い、直線化ＤＮＡプラスミドを、変性条件下で、オリ
ゴヌクレオチド挿入物と混合し、そして適切なコンピテント細胞を用い、混合物
を適切な生物、例えば大腸菌に形質転換してもよい。修復効率を改善する条件、
例えば、とりわけ、オリゴヌクレオチド挿入物およびプラスミドＤＮＡのモル比
、変性条件は、変化させてもよい。典型的には、プラスミドＤＮＡに対するオリ
ゴヌクレオチドのモル過剰が、二本鎖の効率的な修復に必要であり、典型的には
、オリゴヌクレオチド挿入物の１０倍ないし１０００倍モル過剰の範囲である。
形質転換を用いる前に、例えば、プラスミドＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド挿
入物の混合物を、１００℃で３分間インキュベーションすることにより、直線プ
ラスミドＤＮＡを変性させることも必要である可能性がある。ＦｏｋＩ断片を含
むプラスミド構築物は、設計されたスクリーニング法を用い、選択してもよい。

【００３９】 挿入物含有ＤＮＡプラスミドをその後、製造者に推奨される条件下で、Ｆｏｋ
Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化してもよい。ＦｏｋＩ断
片をその後、精製し、そして当業に知られる標準的プロトコルにしたがい、単一
連結反応で、共に結合してもよい。オリゴヌクレオチド挿入物のＦｏｋＩ断片は
、ユニークな相補的４ ｂｐ突出部を持つサブ配列を含み、アニーリングし、そ
して連結されると、標的の長いＤＮＡ配列を形成する。ＦｏｋＩ制限断片の連結
は、ブリッジ突然変異誘発により導入されるＤＮＡ断片に対するものに限定され
ないことに注目すべきである。４ ｎｔの５’突出部を持つ突出端は、他の方法
により、例えば、いかなるものでもよいＤＮＡ配列のＦｏｋＩ消化により、生成
してもよい。標的の長いＤＮＡ配列の組み立ての成功は、ＤＮＡ配列決定、ハイ
ブリダイゼーションに基づく診断法、分子生物学技術、例えば制限消化、選択マ
ーカー、または他の適切な方法により、確認することが可能である。ＤＮＡ操作
および酵素処理は、当業に確立されたプロトコルおよび製造者が推奨する方法に
したがって、行う。適切な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（第２版）， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コール
ドスプリングハーバー（１９８２、１９８９）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．（第６８、１００、１０１、１１８、および１５２−１５５巻）（
１９７９、１９８３、１９８６および１９８７）；およびＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ， Ｄ．Ｍ． Ｃｌｏｖｅｒ監修， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， オックスフォー
ド（１９８５）に記載されている。

【００４０】 オリゴヌクレオチド指示二本鎖中断修復を用いた組み立て法は、標的ＤＮＡ配
列内にいかなる制限部位の存在も必要でない場合、特に柔軟性がある。標的の長
いＤＮＡ配列を構築するのに必要とされる合成オリゴヌクレオチドの全長が減少
するため、本方法の費用は低い。両方のＤＮＡ鎖を合成で作成する慣用法に比較
し、標的ＤＮＡ配列の１つのＤＮＡ鎖のみを合成で得ることが必要である。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ連結よりむしろｉｎ ｖｉｖｏ二本鎖修復は、非修飾オリゴヌクレ
オチドの生物学的選択を可能にし、そして挿入物含有コロニーの続くスクリーニ
ングが望ましくない組換え産物をさらに除去するため、本方法は、配列の誤りの
頻度が低く、正確である。

【００４１】 ２．ＰＣＲに基づく方法を用いた組み立て ＰＣＲに基づく方法もまた、短いオリゴヌクレオチドを長いＤＮＡ配列に組み
立てるのに使用してもよい。ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ監修， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，
ニューヨーク州ニューヨーク， １９９２）ヌクレオチド合成を指示するのに用
いるポリメラーゼには、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼのクレノウ断片、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、熱安定性酵素、
例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、およびそれらに匹敵するも
のが含まれる可能性がある。

【００４２】 例えば、自己プライミングＰＣＲまたはＤＮＡシャッフリング法もまた、短い
重複オリゴヌクレオチドを長いＤＮＡ配列に組み立てるのに用いてもよい。Ｄｉ
ｌｌｏｎら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（３）：２９８−３００（１９
９０）、Ｈａｙａｓｈｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７（２）：３１
０−３１５（１９９４）、Ｃｈｅｎら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．
１１６：８７９９−８８００（１９９４）、Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕら， Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５（８）：８２７−８２９（１９９２）、
Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３（１９９５）、米国特許第
５，８３０，７２１号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第
５，６０５，７９３号、第５，８３４，２５２号および第５，８３７，４５８号
、並びにＰＣＴ公告ＷＯ ９８／１３４８７、Ｗ０９８／２７２３０、ＷＯ ９
８／３１８３７、ＷＯ ９９／４１４０２、９９／５７１２８およびＷＯ ９９
／６５９２７。本質的には、集合的に標的の長いＤＮＡ配列に相当する重複オリ
ゴヌクレオチドを混合し、そしてＰＣＲ反応に供し、その３’端で重複するもの
が伸長し、より長い二本鎖産物を生じるようにし、そして全長標的配列が得られ
るまで繰り返す。

【００４３】 重複オリゴヌクレオチドは、ｄＮＴＰ、選択したＤＮＡポリメラーゼ、および
緩衝液を含む、標準的ＰＣＲで混合してもよい。オリゴヌクレオチドの重複端は
、アニーリングに際し、二本鎖ＤＮＡの短い領域を生成し、そしてＰＣＲ反応に
おけるＤＮＡポリメラーゼによる伸長のプライマーとして働く。伸長反応の産物
は、より長い二本鎖ＤＮＡの形成のための基質として働き、最終的に、全長標的
配列の合成を生じる。ＰＣＲ条件を最適化し、標的の長いＤＮＡ配列の収率を増
加させることが可能である。ＰＣＲ反応のためのＤＮＡポリメラーゼの選択は、
その特性に基づく。例えば、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼを
用いてもよい。さらに、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼは、すべて、ＰＣＲ反応
の効率および正確さを改善するよう働く、３’−５’校正活性、鎖置換活性およ
びはるかに低い末端トランスフェラーゼ活性を持つため、Ｔａｑポリメラーゼよ
りＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを選択してもよい。

【００４４】 単一の工程で、すべての重複オリゴヌクレオチドを混合することにより、標的
配列を得ることが可能であるが、ＰＣＲ反応はまた、多数の工程で行い、ＰＣＲ
反応産物を混合し、そして第二の周期のＰＣＲに供する、一連の別個のＰＣＲ反
応から、より長い配列を組み立てるようにしてもよい。例えば、第一の周期のＰ
ＣＲ反応の終了時の、５’および３’プライマーの付加が、全長ＤＮＡ産物を生
成するのに有益である可能性があることが示されてきている。他の場合、さらな
る配列、例えば、とりわけ、制限部位、シャイン・ダルガーノ配列、および転写
ターミネーターを望ましいように標的配列に付加し、標的配列遺伝子の発現ベク
ターへの続くクローニングを促進してもよい。これらの新たな配列は、さらなる
プライマーおよびさらなるＰＣＲ反応を必要とする可能性がある。さらに、自己
プライミングＰＣＲが、単一の反応から全長産物を生じることに失敗した場合、
重複オリゴヌクレオチド、または標的ＤＮＡ配列のより小さい部分の別個のＰＣ
Ｒ増幅対により、または慣用的な埋め込みおよび連結法により、組み立てを守っ
てもよい。

【００４５】 標的の長いＤＮＡ配列の組み立ての成功は、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼ
ーションに基づく診断法、分子生物学技術、例えば制限消化、選択マーカー、ま
たは他の適切な方法により、確認することが可能である。ＤＮＡ操作および酵素
処理は、当業に確立されたプロトコルおよび製造者が推奨する方法にしたがって
、行う。適切な技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（第２版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， コールドスプリン
グハーバー（１９８２、１９８９）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
．（第６８、１００、１０１、１１８、および１５２−１５５巻）（１９７９、
１９８３、１９８６および１９８７）；およびＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｄ．
Ｍ． Ｃｌｏｖｅｒ監修， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， オックスフォード（１９８
５）に記載されている。

【００４６】 ＰＣＲに基づく方法を用いた組み立て法には、いくつかの利点がある。一般的
に、リン酸化または連結いずれも必要としないが、高収率である。本方法の費用
は、本方法が合成構築に必要とされるオリゴヌクレオチドの数を減少させるため
、相対的に低い。各鎖の部分的配列に相当するオリゴヌクレオチドのみを合成し
、そしてアニーリングしたオリゴヌクレオチド内のギャップは、ＰＣＲ中、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用い、埋め込む。重複オリゴヌクレオチドの組み立ては、中間
産物の単離および精製を必要としない、一容器単一工程ＰＣＲで達成することが
可能である。特に、オリゴヌクレオチドのゲル精製が必要でなく、そして未精製
オリゴヌクレオチド調製を、直接ＰＣＲに用いてもよい。さらに、本組み立て法
は、正確であり、そして標的配列における制限酵素部位の存在を必要としない。

【００４７】

【実施例】

以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、単に本発明を
例示することを意図し、そして制限するとみなしてはならない。本実施例は、本
発明の範囲内の方法を用い、達成することが可能なものを特に例示することを意
図する。実施例１ 固体支持体の調製 オリゴヌクレオチドは、ガラスプレート上に合成する。プレートをまず、安定
なフルオロシロキサン３−（１，１−ジヒドロペルフルオロエチルオキシ）プロ
ピルトリエトキシシランで被覆する。ＣＯ₂レーザーを用い、フルオロシロキサ
ンの領域を除去し、そして下層の二酸化ケイ素ガラスを曝露する。その後、ガラ
スの曝露領域上でのみ反応し、グリシジルエポキシドを形成する、グリシジルオ
キシプロピルトリメトキシシランで、プレートを被覆する。次に、プレートをヘ
キサエチレングリコールおよび硫酸で処理し、グリシジルエポキシドを、リンカ
ーアームとして働くヒドロキシアルキル基に変換する。ヒドロキシアルキル基は
、ヌクレオチドの５’水酸化物に似ており、そして固相合成を開始する安定なア
ンカーを提供する。ヒドロキシアルキルリンカーアームは、オリゴヌクレオチド
およびガラス表面の間に、３−４ ｎｍの平均距離を提供する。ガラスに対する
シロキサン結合は、オリゴヌクレオチド合成に典型的に用いられる酸性および塩
基性脱ブロッキング条件すべてに、完全に安定である。アレイプレートを調製す
る本計画は、図４Ａおよび４Ｂに例示される。

【００４８】実施例２ 固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成 ドット中のヒドロキシアルキルシロキサン表面は、およそγ＝４７の表面張力
を有し、一方、フルオロオキシシランは、γ＝１８の表面張力を有する。オリゴ
ヌクレオチド組み立てには、選択溶媒は、γ＝２９の表面張力を有するアセトニ
トリル、およびジエチルグリコールジメチルエーテルである。したがって、ヒド
ロキシアルキルシロキサン表面は、アセトニトリルにより完全に湿り、一方、ド
ット間のフルオロシロキサン・マスク化表面は、アセトニトリルにより、ほとん
ど湿らない。アセトニトリル中のオリゴヌクレオチド合成試薬の小滴は、ドット
表面に適用され、そして図５に示されるように、玉のようになる傾向がある。隣
接するドット間の混合は、非常に疎水性のマスクバリアにより妨げられる。マス
ク−ドット界面でのアセトニトリルの接触角は、およそθ＝４３°である。プレ
ートは、アレイマイクロリットルディッシュとして有効に作用し、ここで個々の
ウェルは、重力（ｇｒａｖｉｔｙ）よりむしろ表面張力により明示される。４０
ミクロン小滴の体積は、３３ピコリットルである。５０ミクロンのドットに保持
される最大体積は、およそ１００ピコリットル、または約３小滴である。１００
ミクロンのドットは、およそ４００ピコリットル、または約１２小滴を保持する
。最大装填、５０ミクロンおよび１００ミクロンのドットは、それぞれ、約０．
０７および０．２７フェントモルオリゴヌクレオチドに結合する。

【００４９】 調製されたドット上のオリゴヌクレオチド合成（図４B、下図）は、H−ホスホ
ネート法（図６）にしたがい、またはホスホロアミダイト法により、行われる。
両方法は当業者に公知である。Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ， Ｃ．，“Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， “Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｓ； ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”中，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１９−３１（１９９３）およびＢｅａｕｃａｇｅ，
Ｓ．， “Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ”， “Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｏｇｓ； ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒ
ｔｉｅｓ，”中， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：３３−６１
（１９９３）。アセトニトリル中の適切なブロッキングされたヌクレオチドおよ
び活性化剤の搬送は、実施例３に記載されるピコポンプ装置を用い、個々のドッ
トに向けられる。他の工程はすべて（例えばＤＭＴ脱ブロッキング、洗浄）、バ
ッチ法で、適切な試薬で表面を浸すことにより、アレイ上で行われる。８ノズル
圧電性ポンプヘッドを用い、ブロッキングされたヌクレオチドおよび活性化試薬
を、個々のドットに搬送し、そして１０００Ｈｚでの搬送小滴は、５１２ｘ５１
２（２６２ｋ）アレイに並べるのにわずか３２秒しか必要としない。カップリン
グ工程のいずれも重要な時間要求を持たないため、最初および最後の適用小滴の
間の反応時間は重要でない。

【００５０】実施例３ 圧電性インパルスジェットポンプ装置の構築 圧電性インパルスジェットは、ＵＶ感受性セラミックであるＰｈｏｔｏｃｅｒ
ａｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ、ニューヨーク州コーニング）から、ポンプ
の細部を産生する、標準的フォトリソグラフィー技術を用い、製作する。セラミ
ックに点火し、ガラス状状態に変換する。その後、生じた空所を、フッ化水素で
エッチングし、これは非曝露領域でより、曝露領域で、より速く作用する。１つ
のプレートで、空洞およびノズル細部が適切な厚さに覆われたら、第一のプレー
トに第二の（上層）プレートを拡散結合することにより、完全なチャンバーを形
成する。ノズル表面は、平らに覆い、そして表面処理し、その後、圧電性要素を
ポンプチャンバーの外側に接着する。圧電性要素に加圧すると、空洞を変形させ
、図７に示されるように、一方の側が低いもののようにする。

【００５１】 アセトニトリル小滴の正確な発射に適した穴サイズを決定するため、一連の減
少する穴サイズを持つジェットヘッドを用意し、そして試験する。４０ミクロン
ノズルは、約６５ピコリットルの小滴を産生する。

【００５２】 ４つのヌクレオチドの各々に、別個のノズルアレイヘッドを提供し、そしてカ
ップリングのための活性化試薬を搬送するため、第五のヘッドを提供する。第五
のヘッドを機械的に明示された空間で積み重ねる。各ヘッドは、４００ミクロン
離れ、８つのノズルのアレイを有する。

【００５３】 ヘッドを固定し、完全なポンプ装置を組み立て、そして図８に示されるように
、移動するアレイプレートに下向きに小滴を発射する。完全なポンプ装置集合（
３）は、４つのヌクレオチダーゼの各々のためのノズルアレイヘッド（４−７）
および活性化試薬のための第五のヘッド（８）からなる。加圧されると、微小滴
（９）がポンプノズルから発射され、そして官能化結合部位（２）でアレイプレ
ート（１）上に堆積する。

【００５４】 標的アレイを保持するプレートは、機械的ステージ中に保持され、そしてヘッ
ドの下のＸおよびＹ平面で、同時にねじ伝動（ｓｃｒｅｗ ｄｒｉｖｅ）により
、インデックス化する。機械的ステージは、小さな製粉装置、顕微鏡およびミク
ロトームに用いられるものと同様であり、そして２．５ミクロンまたは０．１ミ
ルより優れた再現可能な配置上の正確さを提供する。図９に示されるように、プ
レートホルダー（３）を細長いくぼみのあるスペーサー（４）に取り付け、これ
が、カバープレート（５）がアレイ（６）上をスライドし、囲まれたチャンバー
を形成するのを可能にする。周囲入り口（１）および出口（２）ポートは、プレ
ートが洗浄のため浸されること、共通のアレイ反応のための試薬の適用、または
次のドットアレイ適用周期のため、プレートに風を吹きかけ乾燥させることを可
能にするよう、提供される。

【００５５】 ステージおよびヘッド組み立ては共に、グローブボックス内に囲まれ、これは
無水状態を維持するため、空にし、またはアルゴンで浄化することが可能である
。プレートホルダーがスライドすると、ヘッドチャンバーの陽性置換プライミン
グまたは清浄な溶媒での洗い流しのため、ヘッドへの入り口のラインに加圧する
ことが可能である。操作中、試薬バイアルはボックスの周囲圧に維持する。

【００５６】 ６分の化学反応周期時間で、装置は、１時間当たり１プレートまたは１０⁶オ
リゴヌクレオチドの速度で、１０量体アレイプレートを産生することが可能であ
る。

【００５７】実施例４ 切断可能オリゴヌクレオチドのｉｎ ｓｉｔｕ合成 表面張力アレイ合成は、支持体表面調製にｉｎ ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド
合成が続く、２工程法である。支持体調製は、界面活性剤、その後、塩基および
酸（２％ Ｍｉｃｒｏ ９０、１０％ ＮａＯＨおよび１０％ Ｈ₂ＳＯ₄）中で
のガラス洗浄で始まり、Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ １８１８光耐性剤（Ｓｈｉｐｌ
ｅｙ、マサチューセッツ州マールボロ）の層を用いたスピン被覆が続き、これは
９０℃３０分間の穏やかな焼きつけである。その後、アレイ特徴の望ましい大き
さおよび分布を定義するマスクを用い、６０ ｍワット／ｃｍ²のＵＶ光で、光
耐性剤をパターン化する。曝露された光耐性剤を、Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ ３５
１現像剤（Ｓｈｉｐｌｅｙ、マサチューセッツ州マールボロ）に浸すことにより
、現像し、その後、１２０℃で２０分間養生させる（ｃｕｒｉｎｇ）。その後、
支持体を、乾燥トルエン中のトリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロ
オクチル）−１−トリクロロシラン（Ｕｎｉｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、ペンシルバニア州ブリストル）の１％溶液に浸し、まだ光耐性
剤に保護されているアレイ特徴を囲む、疎水性シラン層を生成する。フルオロシ
ランは、９０℃で３０分間養生させ、その後、アセトンで処理し、残った光耐性
剤を除去する。曝露された特徴部位を１％の４−アミノブチルジメチルメトキシ
シラン（Ｕｎｉｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ペンシルバ
ニア州ブリストル）で被覆し、その後、１０５℃で３０分間養生させる。最後に
これらの部位を、続くオリゴヌクレオチド合成を支持するであろうＴＯＰＳアミ
ダイトとカップリングさせる。長いＤＮＡ配列組み立ての概要図は、図１０に示
される。

【００５８】 表面張力パターン化支持体を、ロボットアレイ合成装置のＸ−Ｙステージ上に
配備されたくさび（ｃｈｕｃｋ）上に整列させ、ここで圧電性ノズル（Ｍｉｃｒ
ｏｆａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、テキサス州プラノ）を用い、活性化標準
的Ｈ−ホスホネートアミダイトの溶液を搬送する（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら， Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：５３３９−５４０７（１９８６））
。圧電性ジェットは、２段階波形を用い、６．６７ Ｈｚで作動し、該ジェット
は、およそ５０ピコリットルの個々の小滴を発射する。洗浄、脱ブロッキング、
キャップ化、および酸化試薬は、支持体表面上を試薬で浸し、そして反応間にく
さび配備を回転させ、過剰な試薬を除去することにより、搬送する。支持体表面
は、乾燥Ｎ₂ガスのブランケットで、合成を通じ、環境的に保護される。アミダ
イト搬送の局在化および測定は、あらかじめ決定されたオリゴヌクレオチドが、
各アレイ座標で合成されるように、圧電性ノズルバンクの各通過中、４つのアミ
ダイトの搬送を指示するコンピューターコマンドファイルにより仲介される。

【００５９】 圧電性プリントオリゴヌクレオチド合成は、以下の試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、バージニア州スターリング）を用いて行う：ホスホロアミダイト：ｐ
ａｃ−ｄＡ−ＣＥホスホロアミダイト、Ａｃ−ｄＣ−ＣＥホスホロアミダイト、
ｉＰｒ−ｐａｃ−ｄＧ−ＣＥホスホロアミダイト、ｄＴ ＣＥホスホロアミダイ
ト（すべて０．１ Ｍで）；活性化剤：５−エチルチオテトラゾール（０．４５
Ｍ）。アミダイトおよび活性化剤溶液は、合成前に、９０％アジポニトリル（
Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）：１０％アセトニトリル溶
液中で、１：１：ｖ／ｖに、あらかじめ混合する。補助試薬は、酸化剤（ＴＨＦ
／ピリジン／水中の０．１ Ｍヨウ素）、Ｃａｐ ｍｉｘ Ａ（ＴＨＦ／２，６
−ルチジン／無水酢酸）、Ｃａｐ ｍｉｘ Ｂ（１０％ １−メチルイミダゾー
ル／ＴＨＦ）、およびＤＣＭ中の３％ ＴＣＡである。

【００６０】 本発明は、現在好ましい態様に関し、記載されてきているが、本発明の精神か
ら逸脱することなく、多様な修飾を行うことが可能であることを理解すべきであ
る。

【００６１】 すべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が各々、特に、そして
個々に、本明細書に完全に援用されると示されるのと同じ度合いに、本明細書に
完全に援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、直接ガラスチップ上にある、ハイブリダイゼーションに
使用されるヒドロキシル基を持つ非切断可能リンカーを示す。

【図２】 図２は、合成後のオリゴヌクレオチドの切断を可能にする、特別
のアミダイトとしての化学的リン酸化剤のカップリングを示す。

【図３】 図３は、合成後のオリゴヌクレオチドの切断を可能にする、普遍
的ＣＰＧ支持体を調製するのに使用するアミダイト（ＴＯＰＳ）を示す。

【図４】 図４Ａは、固相合成のため準備ができているアレイ表面の形成を
例示する。 図４Ｂは、Ｏ−ニトロカルバメートアレイ作成化学反応を例示する。

【図５】 図５は、ドット−間隔界面での表面張力壁効果を例示する。固相
合成試薬を含む小滴は、表面張力壁のため、ドットの周囲を越えて広がらない。

【図６】 図６は、アレイ表面上の水素−ホスホネート固相オリゴヌクレオ
チド合成を例示する。

【図７】 図７Ａは、アレイプレート合成法において、個々のドットに固相
合成試薬を搬送するのに用いられる種類の圧電性インパルスジェットの平面図を
例示する。 図７Ｂは、アレイプレート合成法において、個々のドットに固相合成試薬を搬
送するのに用いられる種類の圧電性インパルスジェットの側面図を例示する。

【図８】 図８は、アレイプレート上の個々のドットに、ブロッキングされ
たヌクレオチドおよび活性化剤を搬送するための、圧電性インパルスジェットヘ
ッドの使用を例示する。示される配置は、固定ヘッド／移動プレート組み立てを
有する。

【図９】 図９は、アレイ反応のための囲みを例示し、アレイプレート、ス
ライディングカバー並びに試薬の入り口および出口のためのマニホールドを例示
する。

【図１０】 図１０は、短い合成オリゴヌクレオチドからの遺伝子組み立て
法を例示する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月２２日（２００１．３．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ヘイネカー，ハーバート・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94115， サンフランシスコ，スタイナー・ストリー ト 2244 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 EA04 HA19 4B064 AF27 CA21 CB27 CB30 CC21 CD30

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２００塩基より長いＤＮＡ配列を産生するための方法であ
   って： （ａ）固体支持体上に、前記ＤＮＡ配列のセンスまたはアンチセンス鎖いずれか
   をコードする約１０ないし２００塩基のオリゴヌクレオチドのアレイを合成し、
   ここで、前記オリゴヌクレオチドは、切断可能部分を用い、固体支持体に共有結
   合している； （ｂ）固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを切断し；そして （ｃ）オリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ配列に組み立てる 工程を含む、前記方法。
2. 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドが約２０ないし１００塩基長であ
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ配列の長さが約２００ないし１０，０００塩基
   の範囲である、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ配列の長さが約４００ないし５，０００塩基の
   範囲である、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 前記切断可能部分がスクシネート様部分である、請求項１
   記載の方法。
6. 【請求項６】 固体支持体上で合成されるオリゴヌクレオチドの数が約１
   ０ないし２０００である、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 固体支持体上で合成されるオリゴヌクレオチドの数が約１
   ０ないし５００である、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 工程（ｃ）が酵素的連結をさらに含む、請求項１記載の方
   法。
9. 【請求項９】 工程（ｃ）がＤＮＡポリメラーゼの使用をさらに含む、請
   求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 工程（ｃ）が制限酵素の使用をさらに含む、請求項１記
    載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ＤＮＡ配列が遺伝子をコードする、請求項１記載の
    方法。
12. 【請求項１２】 前記ＤＮＡ配列がプラスミドである、請求項１記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 前記ＤＮＡ配列がウイルスである、請求項１記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 前記ＤＮＡ配列が生物のゲノムである、請求項１記載の
    方法。
15. 【請求項１５】 請求項１の方法にしたがって回収される、２００塩基長
    より長いＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 請求項１の方法にしたがったオリゴヌクレオチド合成の
    ための切断可能部分を含む、固体支持体。
17. 【請求項１７】 ＤＮＡ配列の機能を最適化するための方法であって： （ａ）固体支持体上に、前記ＤＮＡ配列のセンスまたはアンチセンス鎖いずれか
    をコードする１０ないし２００塩基のオリゴヌクレオチドのアレイを合成し、こ
    こで、前記オリゴヌクレオチドは、切断可能部分を用い、固体支持体に共有結合
    している； （ｂ）固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを切断し； （ｃ）オリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ配列に組み立て； （ｄ）前記ＤＮＡ配列の機能を試験し；そして （ｅ）前記ＤＮＡ配列を変化させることにより、（ａ）−（ｄ）の工程を反復し
    、機能を最適化する 工程を含む、前記方法。
18. 【請求項１８】 請求項１にしたがって産生される、ＤＮＡ配列。
19. 【請求項１９】 請求項１（ａ）にしたがって調製される、固体支持体。