JP2002537557A - High numerical aperture flow cytometer and method of using same - Google Patents
High numerical aperture flow cytometer and method of using sameInfo
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Abstract
(57)【要約】 【課題】 様々な細胞クラスタを容易に特徴付けるために細胞集積点の密度が低い流れ血球計算器装置及びこれと関連した方法を提供する。 【解決手段】 本発明の高開口数流れ血球計算器は、フローセル（１８）及びレーザー入力（２０）を含む。このレーザー入力は、血液細胞がフローセルを通過時する際にレーザー光が血液細胞に当たるように、フローセルを通る血液細胞の流れに対して実質的に垂直方向に配向された光線ビームを放射する。フローセル内の血液細胞に当たるレーザー入力からのビームの一部がレーザー入力のビームに対して実質的に直角に散乱される（「直角散乱」）。フローセル内の細胞に当たるレーザー入力からのビームの第２部分は、９０°よりも遙かに小さい角度で散乱される。この散乱を「低角度前方散乱光」と呼び、レーザー入力からの元のビームの配向から約２°乃至約５°の角度を有する。直角散乱光検出器（２２）は、上文中に言及した直角散乱光を受け取るように配向されている。低角度前方散乱光検出器（２４）は、レーザー入力からのビームに対して約２°乃至約５°で配向された上文中に言及した低角度前方散乱光を捕捉するように配向されている。 PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a flow cytometer device having a low density of cell accumulation points and a method related thereto in order to easily characterize various cell clusters. The high numerical aperture flow cytometer of the present invention includes a flow cell (18) and a laser input (20). The laser input emits a beam of light that is oriented substantially perpendicular to the flow of blood cells through the flow cell such that the laser light impinges on the blood cells as they pass through the flow cell. A portion of the beam from the laser input that strikes blood cells in the flow cell is scattered substantially perpendicular to the beam at the laser input ("right angle scatter"). A second portion of the beam from the laser input that strikes cells in the flow cell is scattered at an angle much less than 90 °. This scatter is referred to as "low angle forward scatter" and has an angle of about 2 to about 5 degrees from the orientation of the original beam from the laser input. The orthogonal scattered light detector (22) is oriented to receive the orthogonal scattered light mentioned above. The low angle forward scatter light detector (24) is oriented to capture the low angle forward scatter light mentioned above oriented at about 2 ° to about 5 ° with respect to the beam from the laser input. .
Description
【０００１】[0001]
本発明は、光の散乱による粒子の識別に関し、更に詳細には、高開口数を使用
した流れ血球計算器（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）及び粒子を識別する血球
計算方法に関する。開口数は、光が通過して集められる媒質の屈折率と光を集め
る角度の１／２の正弦値との積であると定義される。The present invention relates to particle identification by light scattering, and more particularly to a flow cytometer using a high numerical aperture and a blood cell counting method for identifying particles. Numerical aperture is defined as the product of the refractive index of the medium through which the light is collected and the sine of half the angle at which the light is collected.
【０００２】[0002]
粒子の識別は、血液中の細胞の種類及び数値の確認、流体試料中でのバクテリ
アやウィルス等の侵入性粒子の確認、及び流体試料内の細胞の密度及び容積の定
量を含む多くの臨床的検定法で有用である。Particle identification involves a number of clinical procedures, including identification of cell types and numbers in blood, identification of invading particles such as bacteria and viruses in fluid samples, and quantification of cell density and volume in fluid samples. Useful in assays.
【０００３】 上述の一つの方法は、グルース等に賦与された米国特許第５，０１７，４９７
号に開示されている。図１を参照すると、米国特許第５，０１７，４９７号は、
例えば血液等の細胞が実質的に一つづつ通過するフローセル２を開示する。レー
ザー入力４がレーザー光の偏光ビームを放射する。このビームは、偏光レーザー
光がフローセル２を通過する際に血液細胞に当たるように、フローセル２を通る
血液細胞の流れに対して実質的に垂直に配向される。「偏光」という用語は、レ
ーザー光の電界振動の平面が均等であるということを意味する。光学レンズ６は
、血液細胞から散乱された、７２°又はそれ未満の角度で集めることができる光
の円錐を制限する口径を有する。円錐の中央軸線は、偏光レーザー光の経路及び
フローセル２を通る血液細胞の流れの両方に対して９０°である。レンズ６から
発散する散乱光を当該技術分野で周知の方法でコラム状にする。これで、散乱光
は、細胞の種類の特徴である混合偏光を有する。光は、次に、光を２つの別々の
ビームに分割するビームスプリッター８を通過する。レンズ６から発散された元
の光線ビームと実質的に同心の第１光線ビームは、第１偏光アナライザー１０を
通過する。偏光アナライザー１０は、元のレーザー光と同じベクトルを持つ偏光
だけを通すように形成されている。ビームスプリッターから発散された第２ビー
ムは、ビームスプリッターから発散された第１ビームの配向に対して実質的に垂
直に配向されている。第２ビームは、第２偏光アナライザー１２に進入する。第
２偏光アナライザー１２は、偏光ベクトルが、ビームスプリッター８から偏光ア
ナライザー１０を通過する他方のビームの偏光ベクトルに対して実質的に直交す
る光だけを通すように形成されている。第１偏光アナライザー１０を通過したビ
ームは偏光検出器１４に進入し、第２偏光アナライザー１２を通過したビームは
偏光解消検出器１６に進入する。強さに基づいた偏光検出器１４の出力と偏光解
消検出器１６の出力との比が、偏光解消比を提供する。One method described above is disclosed in US Pat. No. 5,017,497 to Grus et al.
Issue. Referring to FIG. 1, US Pat.
For example, a flow cell 2 through which cells such as blood pass substantially one by one is disclosed. A laser input 4 emits a polarized beam of laser light. This beam is oriented substantially perpendicular to the flow of blood cells through the flow cell 2 so that the polarized laser light strikes the blood cells as it passes through the flow cell 2. The term "polarized light" means that the plane of the electric field oscillation of the laser light is uniform. The optical lens 6 has an aperture that limits the cone of light scattered from the blood cells that can be collected at an angle of 72 ° or less. The central axis of the cone is 90 ° to both the path of the polarized laser light and the flow of blood cells through the flow cell 2. The scattered light emanating from lens 6 is columnarized in a manner well known in the art. The scattered light now has a mixed polarization characteristic of the cell type. The light then passes through a beam splitter 8, which splits the light into two separate beams. A first light beam substantially concentric with the original light beam diverging from the lens 6 passes through a first polarization analyzer 10. The polarization analyzer 10 is formed to pass only polarized light having the same vector as the original laser light. The second beam emanating from the beam splitter is oriented substantially perpendicular to the orientation of the first beam emanating from the beam splitter. The second beam enters the second polarization analyzer 12. The second polarization analyzer 12 is formed such that the polarization vector passes only light that is substantially orthogonal to the polarization vector of the other beam passing through the polarization analyzer 10 from the beam splitter 8. The beam passing through the first polarization analyzer 10 enters the polarization detector 14, and the beam passing through the second polarization analyzer 12 enters the depolarization detector 16. The ratio of the output of polarization detector 14 to the output of depolarization detector 16 based on the intensity provides the depolarization ratio.
【０００４】 図４に示すように、白血球の部分集合である好酸球は、上述の形体によって定
量される散乱光の直角を他のグルコシト（ｇｌｕｃｏｓｉｔｅｓ）よりも大きく
偏光解消する。図４は、偏光検出器１４の出力を一方の軸線にとり、偏光解消光
検出器１６の出力を軸線にとったグラフである。以上の発明は、白血球、更に詳
細には好酸球に関する幾つかの有用なデータを提供するけれども、図６Ｂ、図７
Ｂ、図８Ｂ、及び図９Ｂに示すように、好酸球クラスタ内の集積点（「ＤＥＰＯ
Ｌ（デポール）」を一方の軸線として有し且つ「ＯＲＴＨＡＧＯＮＡＬ（オルソ
ゴナル）」を他方の軸線として有するグラフの斜めの閾値線の上方の集積点）は
、極めて密になっている。好酸球クラスタ内の点が密になっているのは、クラス
タを確認し同定するコンピューターソフトウェアプログラムで好酸球クラスタを
正確に同定するのが困難であるためである。更に、この従来技術の形体は、光電
子増倍管、及びレンズ６、第１偏光増幅器１０、及び第２偏光増幅器１２等の高
価な光学装置を必要とする。As shown in FIG. 4, eosinophils, a subset of leukocytes, depolarize the scattered light at right angles, quantified by the above features, to a greater extent than other glucosites. FIG. 4 is a graph in which the output of the polarization detector 14 is set on one axis and the output of the depolarized light detector 16 is set on the axis. Although the above inventions provide some useful data on leukocytes, and more particularly on eosinophils, FIGS.
B, FIG. 8B, and FIG. 9B, the accumulation points within the eosinophil cluster (“DEPO
L (depole) as one axis and the collection point above the diagonal threshold line in the graph with "ORTHAGONAL" as the other axis) are very dense. The denseness of the points in the eosinophil cluster is due to the difficulty in accurately identifying the eosinophil cluster with a computer software program that identifies and identifies the cluster. In addition, this prior art configuration requires a photomultiplier tube and expensive optical equipment such as lens 6, first polarization amplifier 10, and second polarization amplifier 12.
【０００５】[0005]
かくして、様々な細胞クラスタを容易に特徴付けるために細胞集積点の密度が
低い流れ血球計算器装置及びこれと関連した方法が必要とされている。更に、高
価な構成要素が少ない上述の装置及び方法が必要とされている。Thus, there is a need for a flow cytometer device and associated method with a low density of cell accumulation points to easily characterize various cell clusters. Further, there is a need for an apparatus and method as described above with few expensive components.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】 本発明の高開口数流れ血球計算器は、フローセル及びレーザー入力を含む。レ
ーザー入力は、血液細胞がフローセルを通過する際にレーザー光が血液細胞に当
たるように、フローセルを通る血液細胞の流れに対して実質的に垂直に配向され
た光線ビームを放射する。従来技術と異なり、レーザー入力が放射したレーザー
光は、本発明による細胞の分析のため、偏光している必要がない。フローセル内
の血液細胞に当たるレーザー入力からのビームの一部が、レーザー入力のビーム
に対してほぼ直角に散乱される（「直角散乱」）。フローセル内の細胞に当たる
レーザー入力からのビームの第２部分は、９０°よりも遙かに小さい角度で散乱
される。この散乱を「低角度前方散乱光」と呼び、レーザー入力からの元のビー
ムの配向から約２°乃至約５°の角度を有する。直角散乱光検出器は、上文中に
言及した直角散乱光を受け取るように配向されている。直角散乱光検出器は、好
ましくは、フローセル内の血液細胞から約２ｍｍのところに配置される。本発明
の重要な特徴は、血液細胞から約２ｍｍの距離のところで、直角散乱光検出器が
、少なくとも１００°又はそれ以上、好ましくは１３０°又はそれ以上の散乱光
の円錐を集めるということである。このように光の円錐値が従来技術の約７２°
の光円錐よりも大きいため、本発明のクラスタ分離は大きい。これは更に大きな
信号が集められるためである。これとは対照的に、従来技術の小さな７２°の円
錐は、失われる信号が多く、クラスタ分離が小さい。SUMMARY OF THE INVENTION A high numerical aperture flow cytometer of the present invention includes a flow cell and a laser input. The laser input emits a beam of light that is oriented substantially perpendicular to the flow of blood cells through the flow cell such that the laser light impinges on the blood cells as they pass through the flow cell. Unlike the prior art, the laser light emitted by the laser input does not need to be polarized for the analysis of the cells according to the invention. A portion of the beam from the laser input that strikes the blood cells in the flow cell is scattered approximately perpendicular to the beam at the laser input ("right angle scatter"). A second portion of the beam from the laser input that strikes cells in the flow cell is scattered at an angle much less than 90 °. This scatter is referred to as "low angle forward scatter" and has an angle of about 2 to about 5 degrees from the orientation of the original beam from the laser input. The orthogonal scattered light detector is oriented to receive the orthogonal scattered light referred to above. The orthogonal scattered light detector is preferably located about 2 mm from the blood cells in the flow cell. An important feature of the invention is that at a distance of about 2 mm from the blood cells, the orthogonal scattered light detector collects a cone of scattered light of at least 100 ° or more, preferably 130 ° or more. . Thus, the cone of light is about 72 ° of the prior art.
, The cluster separation of the present invention is large. This is because a larger signal is collected. In contrast, the small 72 ° cone of the prior art has more signal loss and less cluster separation.
【０００７】 低角度前方散乱光検出器は、レーザー入力からのビームに対して約２°乃至約
５°で配向された上文中に言及した低角度前方散乱光を捕捉するように配向され
ている。[0007] The low angle forward scatter detector is oriented to capture the low angle forward scatter light referred to above, oriented at about 2 ° to about 5 ° with respect to the beam from the laser input. .
【０００８】 本発明の一実施例では、平面サイトログラム（ｃｙｔｒｏｇｒａｍ）を形成す
るため、直角散乱光検出器及び低角度前方散乱光検出器の両方を使用する。しか
しながら、本発明の別の実施例では、直角散乱光検出器だけを使用し、低角度前
方散乱光検出器を使用せず、好酸球の特徴付けを行うことができるということに
着目しなければならない。[0008] In one embodiment of the present invention, both a right-angle scattered light detector and a low-angle forward scattered light detector are used to form a planar cytogram. However, it should be noted that in another embodiment of the present invention, eosinophil characterization can be performed using only the right-angle scattered light detector and without using the low angle forward scattered light detector. Must.
【０００９】 本発明のこれらの及び他の目的及び特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付
図面と関連して読めば、更に明らかになるであろう。[0009] These and other objects and features of the present invention will become more apparent when the following detailed description of the invention is read in conjunction with the accompanying drawings.
【００１０】[0010]
図２を参照すると、本発明の高開口数流れ血球計算器はフローセル１８を含む
。このフローセルは、好ましくは、マサチューセッツ州フィッチバーグのオプコ
・ラボラトリーズが製造している石英フローセルである。好ましくは、フローセ
ル１８は、約１ｃｍの流れ長さ及び４ｍｍ×４ｍｍの断面を有する。細胞、例え
ば血液等からの細胞は、分析中、フローセル１８を通って実質的に一つづつ流れ
る。レーザー入力２０は、血液細胞がフローセル１８を通過する際にレーザー光
が血液細胞に当たるように、フローセル１８を通る血液細胞の流れに対して実質
的に垂直に配向された光線ビームを放射する。従来技術とは異なり、入力２０が
放射したレーザー光は、本発明による細胞の分析のため、偏光している必要はな
い。レーザー入力２０は、例えば、ヒタチが製造し、ニュージャージー州ニュー
トンのトールラブス社から入手できる出力が１０ｍＷの６３５ｎｍ半導体ダイオ
ードレーザーである。フローセル１８内の血液細胞に当たるレーザー入力２０か
らのビームの一部が、レーザー入力２０のビームに対してほぼ直角に散乱される
（直角散乱光）。フローセル１８内の細胞に当たるレーザー入力２０からのビー
ムの第２部分は、９０°よりも遙かに小さい角度で散乱される。この散乱を「低
角度前方散乱光」と呼び、レーザー入力２０からの元のビームの配向から約２°
乃至約５°の角度を有する。直角散乱光検出器２２は、上文中に言及した直角散
乱光を受け取るように配向されている。直角散乱光検出器は、フローセル１８内
の血液細胞から約２ｍｍのところに配置されている。本発明の重要な特徴は、血
液細胞から約２ｍｍの距離のところで、直角散乱光検出器２２が、少なくとも１
００°又はそれ以上、及び好ましくは１３０°又はそれ以上の散乱光の円錐を集
めるということである。このように光円錐値が従来技術の約７２°の光円錐より
も大きいため、更に大きな信号を合わせることにより、本発明でのクラスタ分離
が大きくなる。これとは対照的に、従来技術の比較的小さな７２°の円錐では、
失われる信号があり、クラスタ分離が小さくなる。Referring to FIG. 2, the high numerical aperture flow cytometer of the present invention includes a flow cell 18. The flow cell is preferably a quartz flow cell manufactured by Opco Laboratories, Fitchburg, MA. Preferably, the flow cell 18 has a flow length of about 1 cm and a cross section of 4 mm x 4 mm. Cells, such as cells from blood or the like, flow substantially one by one through the flow cell 18 during the analysis. Laser input 20 emits a beam of light that is oriented substantially perpendicular to the flow of blood cells through flow cell 18 such that the laser light impinges on the blood cells as they pass through flow cell 18. Unlike the prior art, the laser light emitted by input 20 need not be polarized for the analysis of cells according to the invention. Laser input 20 is, for example, a 10 mW 635 nm semiconductor diode laser manufactured by Hitachi and available from Toll Labs, Inc. of Newton, NJ. A portion of the beam from the laser input 20 that strikes the blood cells in the flow cell 18 is scattered approximately perpendicular to the beam at the laser input 20 (right angle scattered light). A second portion of the beam from laser input 20 that strikes cells in flow cell 18 is scattered at an angle much less than 90 °. This scatter is referred to as "low angle forward scatter" and is about 2 ° from the original beam orientation from the laser input 20.
Have an angle of about 5 °. The orthogonal scattered light detector 22 is oriented to receive the orthogonal scattered light mentioned above. The orthogonal scattered light detector is located at about 2 mm from the blood cells in the flow cell 18. An important feature of the present invention is that at a distance of about 2 mm from the blood cells,
Collecting a cone of scattered light of 00 ° or more, and preferably 130 ° or more. Since the light cone value is larger than the light cone of about 72 ° in the related art, the cluster separation in the present invention is increased by combining a larger signal. In contrast, with the relatively small 72 ° cone of the prior art,
Some signals are lost and cluster separation is reduced.
【００１１】 低角度前方散乱光検出器２４は、レーザー入力２０のビームから約２°乃至約
５°で配向された上文中に言及した低角度前方散乱光を捕捉するように配向され
ている。直角散乱光検出器２２及び低角度前方散乱光検出器２４は、両方とも、
ニュージャージー州ブリッジウォーターのハママツ社が製造しているシリコーン
ＰＩＮ光ダイオード型式番号第Ｓ５１０６ＰＩＮ号であるのがよい。The low angle forward scatter detector 24 is oriented to capture the low angle forward scatter light referred to above, oriented at about 2 ° to about 5 ° from the beam of the laser input 20. The right angle scattered light detector 22 and the low angle forward scattered light detector 24 are both
It may be a silicone PIN photodiode model number S5106 PIN manufactured by Hamamatsu of Bridgewater, NJ.
【００１２】 本発明の一実施例では、平面サイトログラムを形成するため、直角散乱光検出
器２２及び低角度前方散乱光検出器２４の両方を使用する。しかしながら、本発
明の別の実施例では、直角散乱光検出器２２だけを使用し、低角度前方散乱光検
出器２４を使用せず、好酸球の特徴付けを行うことができるということに着目す
べきである。In one embodiment of the present invention, both a right angle scattered light detector 22 and a low angle forward scattered light detector 24 are used to form a planar cytogram. However, another embodiment of the present invention focuses on the ability to characterize eosinophils using only the right angle scattered light detector 22 and not the low angle forward scattered light detector 24. Should.
【００１３】 図２の電子光学的エレメントを特定の構成要素を使用して上文中に説明したが
、上文中に説明した所望の結果を得るために様々な構成要素を使用できるという
ことは当業者には容易に明らかになるであろう。更に詳細には、ワイレー−リス
出版が１９５５年に刊行したハワード Ｍ・シャフィロ著の「流れ血球計算実務
第３版」ＩＳＢＮ番号第０−４７１−３０３７６−３号を参照されたい。同文献
に触れたことにより、その文献に開示されている内容は本明細書中に組入れたも
のとする。Although the electro-optical element of FIG. 2 has been described above using specific components, those skilled in the art will recognize that various components can be used to achieve the desired results described above. Will be readily apparent. For further details, see Howard M. Shafiro's 3rd Edition, Flowing Blood Cell Counting Practice, ISBN No. 0-471-30376-3, published in 1955 by Wileley-Lith Publishing. By touching the document, the contents disclosed in the document are incorporated herein.
【００１４】 図３を参照すると、直角散乱光検出器２２及び低角度前方散乱光検出器２４か
らの例えば電圧又は電流の形態の電気出力を前置増幅器２６で増幅した後、信号
プロセッサ２８に送出する。信号プロセッサ２８は、直角散乱光検出器２２及び
／又は低角度前方散乱光検出器２４から受け取った電圧曲線又は電流曲線の下の
面積を計測し、又は電圧曲線又は電流曲線のピークを計測する。信号プロセッサ
２８からのデータをアナログ−デジタルコンバータ３０によって変換する。次に
、デジタルデータを中央演算処理回路３２によってソフトウェアプログラムに基
づいて処理し、データのグラフをディスプレー３４に表示する。信号の増幅、処
理、変換、及び表示は、ワイレー−リス出版が１９５５年に刊行したハワード
Ｍ・シャフィロ著の「流れ血球計算実務第３版」ＩＳＢＮ番号第０−４７１−３
０３７６−３号に開示された方法を含む多くの周知の方法で行うことができると
いうことは当業者には容易に明らかになるであろう。同文献に触れたことにより
、その文献に開示されている内容は本明細書中に組入れたものとする。Referring to FIG. 3, the electrical output, eg, in the form of voltage or current, from the right angle scattered light detector 22 and the low angle forward scattered light detector 24 is amplified by a preamplifier 26 and then sent to a signal processor 28. I do. The signal processor 28 measures the area under the voltage or current curve received from the right angle scatter light detector 22 and / or the low angle forward scatter light detector 24, or measures the peak of the voltage or current curve. Data from the signal processor 28 is converted by an analog-to-digital converter 30. Next, the digital data is processed by the central processing circuit 32 based on the software program, and a graph of the data is displayed on the display 34. The amplification, processing, conversion and display of the signal is performed by Howard-Willis Publishing in 1955.
M. Shafiro, "Flow Blood Cell Counting Practice 3rd Edition", ISBN No. 0-471-3
It will be readily apparent to those skilled in the art that it can be done in many well-known ways, including the method disclosed in No. 0376-3. By touching the document, the contents disclosed in the document are incorporated herein.
【００１５】 図５を参照すると、本発明の流れ血球計算器からのデータ出力が示してある。
図５は、直角散乱光検出器２２の出力を一方の軸線として有し、低角度前方散乱
光検出器２４を他方の軸線として有する。好酸球は、ソフトウェア閾値線の右側
にあり、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ、及び図９Ａに示すように、従来技術よりも集
中していない集積点を発生する。集積点に基づいてクラスタを同定するのに使用
されるコンピューターソフトウェアプログラムは、本発明に従って更に確実に同
定できる。Referring to FIG. 5, there is shown the data output from the flow cytometer of the present invention.
FIG. 5 has the output of the right angle scattered light detector 22 as one axis and the low angle forward scattered light detector 24 as the other axis. Eosinophils are to the right of the software threshold line and generate accumulation points that are less concentrated than in the prior art, as shown in FIGS. 6A, 7A, 8A, and 9A. Computer software programs used to identify clusters based on accumulation points can be more reliably identified in accordance with the present invention.
【００１６】 次に、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、図７Ｂ、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、及び図９
Ｂを参照し、特に好酸球同定を参照して白血球の同定をグラフで表示する。図６
Ａ、図７Ａ、図８Ａ、及び図９Ａのデータは、本発明の装置を使用して使用され
た。図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ、及び図９Ａでは、用語Ｒ２は一次リンパ球を示し
、用語Ｒ３は一次単核細胞を示し、用語Ｒ４は一次好中球を示し、用語Ｒ５は一
次好酸球を示す。図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ、及び図９Ｂは、実質的に米国特許第
５，０１７，４９７号に開示の装置を使用するデータに関する。本発明の又は従
来技術の装置を用いた分析を行う前に、犬の血液又は人間の血液のいずれかの全
血試料を以下の通りに準備する。全血試料を、燐酸塩で緩衝した塩水で１０：１
に希釈する。次いで、燐酸塩緩衝塩水で処理した４０μｌ（マイクロリットル）
の全血試料を、１２００μｌの溶解溶液即ちライシング溶液（ｌｙｓｉｎｇ ｓ
ｏｌｕｔｉｏｎ）と混合する。ライシング溶液は、１ｌ（リットル）あたり、塩
化アンモニウムを８．３ｇ、炭酸水素カリウムを１ｇ、ＥＤＴＡ４ナトリウムを
０．３７ｇ含む。全血試料を２０分間乃至３０分間に亘って溶解する。溶解時間
を３０秒乃至１分間に減少することは、容易に行うことができるということは当
業者には容易に理解されよう。Next, FIGS. 6A, 6B, 7A, 7B, 8A, 8B, 9A, and 9
With reference to B, in particular with reference to eosinophil identification, the identification of leukocytes is displayed graphically. FIG.
The data in FIGS. 7A, 7A, 8A, and 9A were used using the apparatus of the present invention. 6A, 7A, 8A, and 9A, the term R2 indicates primary lymphocytes, the term R3 indicates primary mononuclear cells, the term R4 indicates primary neutrophils, and the term R5 indicates primary eosinophils. Is shown. FIGS. 6B, 7B, 8B and 9B relate to data substantially using the apparatus disclosed in US Pat. No. 5,017,497. Prior to performing an analysis using the device of the present invention or the prior art, a whole blood sample, either dog blood or human blood, is prepared as follows. Whole blood samples were washed 10: 1 with phosphate buffered saline.
Dilute to. 40 μl (microliter) then treated with phosphate buffered saline
Of the whole blood sample in 1200 μl of lysing solution (lysings).
solution). The licing solution contains 8.3 g of ammonium chloride, 1 g of potassium bicarbonate, and 0.37 g of tetrasodium EDTA per liter. Lyse the whole blood sample for 20-30 minutes. One skilled in the art will readily appreciate that reducing the dissolution time from 30 seconds to 1 minute can be readily accomplished.
【００１７】 図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ、及び図９Ａの本発明の好酸球と図６Ｂ、図７Ｂ、図
８Ｂ、及び図９Ｂに示す従来技術のＤＥＰＯＬ／ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ（デポー
ル／オルソゴナル）グラフ表示の好酸球データとの間には良好な相関が存在する
。更に詳細には、図６Ａ及び図６Ｂに関し、好酸球値は、本発明については２．
１％であり、従来技術については２．０％である。図７Ａ及び図７Ｂに関し、好
酸球データは、本発明については７．６％であり、従来技術については８．２％
である。図８Ａ及び図８Ｂに関し、好酸球データは、本発明については１３．１
％であり、従来技術については９．８％である。図９Ａ及び図９Ｂに関し、好酸
球データは、本発明については１０．８％であり、従来技術については１４．６
％である。本発明の以上のグラフ表示の全てについて、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ
、及び図９Ａは、好酸球クラスタをＲ５に示す。図６Ｂ、図７Ｂ、及び図８Ｂの
従来技術のデータに関し、ＳＩＺＥ／ＣＯＭＰＬＥＸＩＴＹ（サイズ／コンプレ
キシティ）のグラフ表示は、好酸球クラスタがないことを示すが、図９Ｂのグラ
フ表示はクラスタを示す。図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ、及び図９Ａからの本発明の
データと図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ、及び図９Ｂの従来技術のデータとを比較する
と、好酸球クラスタ内の集積点の密度即ち濃度が大幅に低下したことが示されて
いる。これらの集積点を分離することにより、様々なクラスタの位置を定め且つ
同定するソフトウェアプログラムにより、本発明の装置及び方法によって発生し
たクラスタを従来技術によるものと比較して容易に位置を定め且つ同定すること
ができる。The eosinophils of the present invention of FIGS. 6A, 7A, 8A, and 9A and the prior art DEPOL / ORTHOGONAL graphical representation shown in FIGS. 6B, 7B, 8B, and 9B. There is a good correlation between the eosinophil data of More specifically, with reference to FIGS. 6A and 6B, the eosinophil values are 2.
1% and 2.0% for the prior art. 7A and 7B, the eosinophil data is 7.6% for the present invention and 8.2% for the prior art.
It is. 8A and 8B, the eosinophil data was 13.1 for the present invention.
%, And 9.8% for the prior art. 9A and 9B, the eosinophil data is 10.8% for the present invention and 14.6 for the prior art.
%. 6A, 7A and 8A for all of the above graphical representations of the present invention.
, And FIG. 9A shows the eosinophil cluster at R5. For the prior art data of FIGS. 6B, 7B, and 8B, the SIZE / COMPLEXITY (size / complexity) graphical representation shows the absence of eosinophil clusters, while the graphical representation of FIG. Show. Comparing the inventive data from FIGS. 6A, 7A, 8A, and 9A with the prior art data of FIGS. 6B, 7B, 8B, and 9B, the accumulation points of the eosinophil clusters are shown. It is shown that the density or concentration has been greatly reduced. By separating these accumulation points, a software program for locating and identifying various clusters can easily locate and identify clusters generated by the apparatus and method of the present invention as compared to those of the prior art. can do.
【００１８】 本発明を特定の実質的に及び用途を参照して説明したが、本発明の教示に基づ
き、様々な実施例及び用途が可能である。Although the present invention has been described with reference to particular embodiments and applications, various embodiments and applications are possible in light of the teachings of the present invention.
【図１】 従来技術の電子−光学的構成要素の概略図である。FIG. 1 is a schematic diagram of a prior art electro-optical component.
【図２】 本発明の電子−光学的構成要素の概略図である。FIG. 2 is a schematic diagram of the electro-optical components of the present invention.
【図３】 本発明の電子式処理構成要素のブロックダイヤグラムである。FIG. 3 is a block diagram of the electronic processing components of the present invention.
【図４】 好酸球及び他の白血球細胞構成要素の分離を従来技術の光散乱に基づいて示す
グラフである。FIG. 4 is a graph showing the separation of eosinophils and other white blood cell components based on prior art light scattering.
【図５】 好酸球及び他の白血球細胞構成要素の分離を本発明の光散乱に基づいて示すグ
ラフである。FIG. 5 is a graph showing the separation of eosinophils and other white blood cell components based on light scattering of the present invention.
【図６】 Ａは、従来技術を使用した、２％犬好酸球データを示すグラフであり、Ｂは、
本発明を使用した、２％犬好酸球データを示すグラフである。FIG. 6A is a graph showing 2% canine eosinophil data using the prior art;
Figure 4 is a graph showing 2% dog eosinophil data using the present invention.
【図７】 Ａは、従来技術を使用した、８％犬好酸球データを示すグラフであり、Ｂは、
本発明を使用した、８％犬好酸球データを示すグラフである。FIG. 7A is a graph showing 8% canine eosinophil data using the prior art;
Figure 4 is a graph showing 8% dog eosinophil data using the present invention.
【図８】 Ａは、従来技術を使用した、１０％犬好酸球データを示すグラフであり、Ｂは
、本発明を使用した、１０％犬好酸球データを示すグラフである。FIG. 8A is a graph showing 10% canine eosinophil data using the prior art, and FIG. 8B is a graph showing 10% canine eosinophil data using the present invention.
【図９】 Ａは、従来技術を使用した、ヒト好酸球データを示すグラフであり、Ｂは、本
発明を使用した、ヒト好酸球データを示すグラフである。FIG. 9A is a graph showing human eosinophil data using a conventional technique, and FIG. 9B is a graph showing human eosinophil data using the present invention.
１８ フローセル ２０ レーザー入力 ２２ 直角散乱光検出器 ２４ 低角度前方散乱光検出器 18 Flow cell 20 Laser input 22 Right angle scattered light detector 24 Low angle forward scattered light detector
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA04 AA28 CA11 CA25 CB21 FA12 FA37 GA03 JA01 JA04 【要約の続き】 された上文中に言及した低角度前方散乱光を捕捉するよ うに配向されている。──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID , IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference 2G045 AA04 AA28 CA11 CA25 CB21 FA12 FA37 GA03 JA01 JA04 [Continued from Summary] It is oriented to capture the low-angle forward scattered light mentioned in the above sentence.
Claims (28)
において、 検出されるべき粒子を含む流体試料が通過する通路を持つフローセル、 流体試料中の粒子がフローセルを通過する際にレーザーが粒子に当たるように
、前記フローセルを通過する流体試料の流れに対して実質的に垂直方向に配向さ
れた光線ビームを放射するレーザー入力、及び 前記フローセルを通過した後の光を受け取って計測するように配向された少な
くとも一つの光検出器を含み、前記光検出器は、少なくとも１００°の散乱光の
円錐を集める、流れ血球計算器。1. A high numerical aperture flow cytometer for detecting particles in a fluid sample, wherein the flow cell has a passage through which a fluid sample containing particles to be detected passes, and the particles in the fluid sample pass through the flow cell. A laser input that emits a beam of light that is oriented substantially perpendicular to the flow of the fluid sample through the flow cell so that the laser strikes the particles when receiving the light after passing through the flow cell. A flow cytometer comprising at least one photodetector oriented to measure the light, said photodetector collecting a cone of scattered light of at least 100 °.
、請求項１に記載の流れ血球計算器。2. The flow cytometer of claim 1, wherein the laser light entering the flow cell is unpolarized.
算器。3. The flow cytometer of claim 1, wherein said flow cell is quartz.
器。4. The flow cytometer of claim 1, wherein said particles are blood cells.
算器。5. The flow cytometer of claim 1, wherein said blood cells are white blood cells.
器。6. The flow cytometer according to claim 1, wherein said leukocytes are eosinophils.
器。7. The flow cytometer of claim 1, wherein said particles are viruses.
射する半導体ダイオードレーザーである、請求項１に記載の流れ血球計算器。8. The flow cytometer of claim 1, wherein the laser input is a semiconductor diode laser that emits laser light at a wavelength of about 635 nm.
入力からの光線ビームの一部が前記レーザー入力のビームに対して実質的に直角
に散乱される、請求項１に記載の流れ血球計算器。9. The flowing blood cell of claim 1, wherein a portion of the beam of light from the laser input that strikes a particle as it passes through the flow cell is scattered substantially perpendicular to the beam of the laser input. Calculator.
載の流れ血球計算器。10. The flow cytometer of claim 1, wherein the cone of scattered light is at least 130 °.
垂直に散乱された光線ビームを受け入れるように配向されている、請求項９に記
載の流れ血球計算器。11. The flow cytometer of claim 9, wherein the photodetector is oriented to receive a beam of light scattered substantially perpendicular to the beam at the laser input.
ところに位置決めされている、請求項９に記載の流れ血球計算器。12. The flow cytometer of claim 9, wherein the photodetector is positioned about 2 mm from particles in the flow cell.
ー入力からのビームの別の部分が、前記レーザー入力からのビームの配向から９
０°未満の角度で散乱される、請求項９に記載の流れ血球計算器。13. Another part of the beam from the laser input, which strikes a particle as it passes through the flow cell, is 9% from the orientation of the beam from the laser input.
10. The flow cytometer of claim 9, wherein the flow cytometer is scattered at an angle of less than 0 [deg.].
角度で散乱される、請求項１３に記載の流れ血球計算器。14. The flow cytometer of claim 13, wherein light scattered at an angle of less than 90 ° is scattered at an angle of about 2 ° to about 5 °.
°乃至５°の角度で散乱された光線ビームを受け入れるように配向されている、
請求項１４に記載の流れ血球計算器。15. A second photodetector comprising: a second photodetector for detecting a direction of a beam of the laser input;
Oriented to accept a beam of light scattered at an angle of between 5 ° and 5 °,
A flow cytometer according to claim 14.
第２光検出器を使用する、請求項１５に記載の流れ血球計算器。16. The flow cytometer according to claim 15, wherein the photodetector and the second photodetector are used to produce a planar cytogram.
よって散乱光を発生するように、前記フローセルを通過する流体試料の流れに対
して実質的に垂直方向に配向された光線ビームを放射するレーザー入力、及び 前記フローセルを通過した後の散乱光を受け取って計測するように配向された
、少なくとも１００°の散乱光の円錐を集める少なくとも一つの光検出器を含む
、高開口数流れ血球計算器を提供する工程と、 流れ血球計算器に流体試料を通し、前記光検出器から読みを得る工程と、 前記光検出器から得た読みを示すグラフを作成する工程と、 検出されるべき試料中の粒子を同定する工程とを有する、方法。17. A method for detecting particles in a fluid sample, comprising: a flow cell having a passage through which a fluid sample containing particles to be detected passes; wherein a laser strikes the particles in the fluid sample as the particles pass through the flow cell. A laser input that emits a beam of light that is oriented substantially perpendicular to the flow of the fluid sample through the flow cell so as to generate scattered light, and receives scattered light after passing through the flow cell. Providing a high numerical aperture flow cytometer including at least one photodetector that collects a cone of scattered light of at least 100 °, oriented to measure the flow rate, and passing a fluid sample through the flow cytometer. Obtaining a reading from the photodetector; creating a graph showing the reading obtained from the photodetector; and determining particles in the sample to be detected. And a step of constant method.
され、前記光検出器は、散乱光の円錐を集めるように配向されている、請求項１
７に記載の方法。18. The light of claim 1, wherein the light is scattered substantially at right angles to the beam of the laser input, and wherein the photodetector is oriented to collect a cone of scattered light.
7. The method according to 7.
れた散乱光とは異なる角度で散乱された光を集めるように配向された第２光検出
器を有する、請求項１７に記載の方法。19. The flow cytometer has a second photodetector oriented to collect light scattered at a different angle than the scattered light collected by the first photodetector. 18. The method according to 17.
に直角に散乱された光線ビームを受け入れるように配向されており、前記第２光
検出器は、レーザー光のビームから９０°未満の角度で散乱された光線ビームを
受け入れるように配向されている、請求項１９に記載の方法。20. The first photodetector is oriented to receive a beam of light scattered substantially at right angles to the beam of laser light, and the second photodetector is configured to receive a beam of laser light. 20. The method of claim 19, wherein the method is oriented to accept a beam of light scattered at an angle less than 90 degrees from the beam.
ビームをレーザー光のビームから約２°乃至約５°の角度で散乱する、請求項２
０に記載の方法。21. The light beam scattered at an angle of less than 90 ° from the beam of laser light is scattered at an angle of about 2 ° to about 5 ° from the beam of laser light.
The method according to 0.
つの軸線及び前記第２光検出器からの読みを記録する第２軸線を含む、請求項２
０に記載の方法。22. The graph includes one axis for recording readings from the first photodetector and a second axis for recording readings from the second photodetector.
The method according to 0.
つの軸線及び前記第２光検出器からの読みを記録する第２軸線を含む、請求項２
１に記載の方法。23. The graph includes one axis for recording readings from the first photodetector and a second axis for recording readings from the second photodetector.
2. The method according to 1.
める、請求項１７に記載の方法。27. The method of claim 17, wherein the light detector collects a cone of scattered light of at least 130 °.
ない、請求項１７に記載の方法。28. The method of claim 17, wherein said laser light emitted by said laser input is unpolarized.
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