JP2002533130A - Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株 - Google Patents
Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株Info
- Publication number
- JP2002533130A JP2002533130A JP2000591206A JP2000591206A JP2002533130A JP 2002533130 A JP2002533130 A JP 2002533130A JP 2000591206 A JP2000591206 A JP 2000591206A JP 2000591206 A JP2000591206 A JP 2000591206A JP 2002533130 A JP2002533130 A JP 2002533130A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- hiv
- transgenic
- cells
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 126
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 title claims abstract description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 9
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- -1 CCR2B Proteins 0.000 claims description 4
- 102100030949 Apelin receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036305 C-C chemokine receptor type 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025618 C-X-C chemokine receptor type 6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061304 CXCR6 Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 101000716063 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 claims description 2
- 102100023416 G-protein coupled receptor 15 Human genes 0.000 claims 1
- 101000793362 Homo sapiens Apelin receptor Proteins 0.000 claims 1
- 101000829794 Homo sapiens G-protein coupled receptor 15 Proteins 0.000 claims 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 7
- 238000011824 transgenic rat model Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 128
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 72
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 67
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 59
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 43
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 22
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 101000946926 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 19
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 11
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 11
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 11
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 11
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 102000048160 human CCR5 Human genes 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 101150075764 CD4 gene Proteins 0.000 description 9
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 9
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 101000910488 Homo sapiens Cyclin-T1 Proteins 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 5
- 108010068106 Cyclin T Proteins 0.000 description 5
- 102000002435 Cyclin T Human genes 0.000 description 5
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 5
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 102000053523 human CXCR4 Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 3
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 3
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 3
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000713711 Primate lentivirus group Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 108010046018 leukocyte inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 230000007484 viral process Effects 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 201000008686 ARC syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000003685 Arthrogryposis-renal dysfunction-cholestasis syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108700011778 CCR5 Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010068155 Cyclin C Proteins 0.000 description 1
- 102000002428 Cyclin C Human genes 0.000 description 1
- 108010025461 Cyclin-Dependent Kinase 9 Proteins 0.000 description 1
- 102000013702 Cyclin-Dependent Kinase 9 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 1
- 101100497623 Homo sapiens CXCR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000699678 Mesocricetus Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000019014 Positive Transcriptional Elongation Factor B Human genes 0.000 description 1
- 108010012271 Positive Transcriptional Elongation Factor B Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101100336621 Sus scrofa GPRL15 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005029 transcription elongation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70514—CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Public Health (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒトCD4受容体およびヒトケモカイン受容体をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれたトランスジェニック齧歯類動物またはトランスジェニック齧歯類動物の細胞からなる、HIVのためのトランスジェニック齧歯類動物モデルを特徴とする。特に、本発明はHIV感染に対して感受性を示し、HIVの構造遺伝子の発現もしくはHIVの複製が可能なことを特徴とするトランスジェニックラット、またはマウスに関するものである。本発明によるトランスジェニック齧歯類動物または齧歯類細胞系は新規の抗ウイルス薬またはワクチンの試験法に加えて、HIVの感染、複製、病原性の分子的基礎を研究するのに有用である。
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、概してヒト免疫不全ウイルス（HIV）の非ヒトトランスジェニック
動物モデルに関し、より具体的にはHIVのための齧歯類動物モデルの生産および
使用方法に関する。
動物モデルに関し、より具体的にはHIVのための齧歯類動物モデルの生産および
使用方法に関する。
【０００２】 発明の背景 後天性免疫不全症候群（AIDS）はヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染が原因
となる重篤な免疫不全疾患である。HIV感染の主な結果として、HIV感染の標的細
胞である「ヘルパー」T-細胞として広く知られている種類のT-細胞が重大な損傷
を受けることが認められている。HIVがこのようなT-細胞やその他の標的細胞に
侵入するためには、細胞表面にあるCD4分子およびケモカイン受容体を有するHIV
ウイルスと、細胞およびケモカイン受容体の両方に対する特異性を示す異なるHI
V株との相互作用が必要である(Speckら、(1997) J. of Virol 71 (9):7136-7139
)。HIVのエンベロープタンパク質中のアミノ酸が、ケモカイン受容体に対する選
択性に加えてHIV株の細胞指向性を決定していると考えられる(Speckら、前掲)。
例えば、ケモカイン受容体CCR5はマクロファージ指向性を示すHIVの侵入を仲介
し(Dengら、Nature 381:661-666(1996)、ケモカイン受容体CXCR4はT細胞系に指
向性を示す単離株のウイルスの侵入を仲介する(Fengら、Science 272:872-877 (
1996))。
となる重篤な免疫不全疾患である。HIV感染の主な結果として、HIV感染の標的細
胞である「ヘルパー」T-細胞として広く知られている種類のT-細胞が重大な損傷
を受けることが認められている。HIVがこのようなT-細胞やその他の標的細胞に
侵入するためには、細胞表面にあるCD4分子およびケモカイン受容体を有するHIV
ウイルスと、細胞およびケモカイン受容体の両方に対する特異性を示す異なるHI
V株との相互作用が必要である(Speckら、(1997) J. of Virol 71 (9):7136-7139
)。HIVのエンベロープタンパク質中のアミノ酸が、ケモカイン受容体に対する選
択性に加えてHIV株の細胞指向性を決定していると考えられる(Speckら、前掲)。
例えば、ケモカイン受容体CCR5はマクロファージ指向性を示すHIVの侵入を仲介
し(Dengら、Nature 381:661-666(1996)、ケモカイン受容体CXCR4はT細胞系に指
向性を示す単離株のウイルスの侵入を仲介する(Fengら、Science 272:872-877 (
1996))。
【０００３】 ヒトCD4を発現しているトランスジェニックウサギは、HIV疾病のトランスジェ
ニックウサギモデルを開発しようとする努力の中で作製された(Dunn, C.S.ら、J
. Gen. Virol. 76(Pt6):1327-1336 (1995); Gillespie, F.P.ら、Mol. Cell Bio
l. 13:2952-2958 (1993); Leno, M.ら、Virology 213:450-454(1995); 米国特許
第5,529,765号)。これらの研究からヒトCD4を発現するトランスジェニックウサ
ギは、HIV-1感染に対する感受性がトランスジェニックではない正常なウサギよ
りも高いことが示された。しかし、ヒトCD４を発現しているトランスジェニック
マウスを用い、同様な研究を行ったところ、マウスの細胞はHIV感染に耐性であ
ることが示された(Loresら、 (1992) AIDS Res. Hum. Retroviruses 8; 2063)。
ヒトCD4トランスジェニックウサギモデルとヒトCD4トランスジェニックマウスと
において、このように感染性が異なる理由はウイルス侵入後の過程に種特異的な
補助因子が関連していることが考えられる。
ニックウサギモデルを開発しようとする努力の中で作製された(Dunn, C.S.ら、J
. Gen. Virol. 76(Pt6):1327-1336 (1995); Gillespie, F.P.ら、Mol. Cell Bio
l. 13:2952-2958 (1993); Leno, M.ら、Virology 213:450-454(1995); 米国特許
第5,529,765号)。これらの研究からヒトCD4を発現するトランスジェニックウサ
ギは、HIV-1感染に対する感受性がトランスジェニックではない正常なウサギよ
りも高いことが示された。しかし、ヒトCD４を発現しているトランスジェニック
マウスを用い、同様な研究を行ったところ、マウスの細胞はHIV感染に耐性であ
ることが示された(Loresら、 (1992) AIDS Res. Hum. Retroviruses 8; 2063)。
ヒトCD4トランスジェニックウサギモデルとヒトCD4トランスジェニックマウスと
において、このように感染性が異なる理由はウイルス侵入後の過程に種特異的な
補助因子が関連していることが考えられる。
【０００４】 このようにHIVの分野では、インビボにおいて、より使いやすく費用効率の良
いHIV感染研究方法を提供できる動物モデルを必要としている。齧歯類動物モデ
ルはその大きさ、生殖周期、飼育費用など多くの特性のために、HIVにとってよ
り望ましいモデルである。HIVの分野では、免疫システムについての特徴が十分
に研究されている動物モデルも必要とされている。
いHIV感染研究方法を提供できる動物モデルを必要としている。齧歯類動物モデ
ルはその大きさ、生殖周期、飼育費用など多くの特性のために、HIVにとってよ
り望ましいモデルである。HIVの分野では、免疫システムについての特徴が十分
に研究されている動物モデルも必要とされている。
【０００５】 発明の概要 本発明は、HIVの感染および複製に関する研究のためのトランスジェニック齧
歯類動物モデル（例えば、ラット、マウスおよびハムスター）を特徴とし、この
トランスジェニック齧歯類動物は、１）ヒトCD4受容体の発現および２）１つま
たは複数のヒトケモカイン受容体の発現によって特徴づけられる。トランスジェ
ニック動物はこのような改変に関してホモ接合体であってもヘテロ接合体であっ
てもどちらでもよい。本発明に係る二遺伝子型（bigenic）あるいは多遺伝子型
（polygenic）動物はさらに、トランスジェニック齧歯類動物の細胞内、すなわ
ちインビボおよびトランスジェニック動物由来のインビトロにおける培養細胞の
中で、HIV感染性およびHIV複製が増強されていることを特徴とする。
歯類動物モデル（例えば、ラット、マウスおよびハムスター）を特徴とし、この
トランスジェニック齧歯類動物は、１）ヒトCD4受容体の発現および２）１つま
たは複数のヒトケモカイン受容体の発現によって特徴づけられる。トランスジェ
ニック動物はこのような改変に関してホモ接合体であってもヘテロ接合体であっ
てもどちらでもよい。本発明に係る二遺伝子型（bigenic）あるいは多遺伝子型
（polygenic）動物はさらに、トランスジェニック齧歯類動物の細胞内、すなわ
ちインビボおよびトランスジェニック動物由来のインビトロにおける培養細胞の
中で、HIV感染性およびHIV複製が増強されていることを特徴とする。
【０００６】 本発明の全体的な目的は、ゲノムにヒトCD4受容体および／またはヒトケモカ
イン受容体が安定して組み込まれておりHIV感染に対して感受性を示すトランス
ジェニック齧歯類動物、特にハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス）、クマ
ネズミ属（Rattus）（例えば、ラット）、およびシリアンハムスター属（Mesocr
icetus）（例えば、ハムスター)から選択される属に属する齧歯類動物を提供す
ることである。
イン受容体が安定して組み込まれておりHIV感染に対して感受性を示すトランス
ジェニック齧歯類動物、特にハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス）、クマ
ネズミ属（Rattus）（例えば、ラット）、およびシリアンハムスター属（Mesocr
icetus）（例えば、ハムスター)から選択される属に属する齧歯類動物を提供す
ることである。
【０００７】 一局面において、本発明はHIV感染に付随する現象（例えば、免疫抑制、付随
して起こる日和見感染、癌性の増殖など）を調節するような生物学的活性物質の
スクリーニング方法を特徴とし、該方法は１）ヒトCD4受容体の発現および２）
ヒトケモカイン受容体の発現を有するトランスジェニック齧歯類動物と候補物質
とを組み合わせる段階、ならびにHIV感染に伴う現象に対する該物質の効果を判
定する段階を含む。例えば、本発明は、ウイルスの過程を途絶させるワクチンの
スクリーニングにおいて本発明に係る動物を使用する方法を提供する。
して起こる日和見感染、癌性の増殖など）を調節するような生物学的活性物質の
スクリーニング方法を特徴とし、該方法は１）ヒトCD4受容体の発現および２）
ヒトケモカイン受容体の発現を有するトランスジェニック齧歯類動物と候補物質
とを組み合わせる段階、ならびにHIV感染に伴う現象に対する該物質の効果を判
定する段階を含む。例えば、本発明は、ウイルスの過程を途絶させるワクチンの
スクリーニングにおいて本発明に係る動物を使用する方法を提供する。
【０００８】 本発明の主要な目的は、HIV感染に伴う現象に対する候補物質(例えば、小分子
の薬物、内因性因子、抗ウイルス物質、など)の効果を調べるためのトランスジ
ェニック齧歯類モデルを提供することである。このようなトランスジェニック動
物モデルはARCおよび／またはAIDSの症状の予防、治療、または軽減のために用
いられる候補物質のスクリーニングに有用である。
の薬物、内因性因子、抗ウイルス物質、など)の効果を調べるためのトランスジ
ェニック齧歯類モデルを提供することである。このようなトランスジェニック動
物モデルはARCおよび／またはAIDSの症状の予防、治療、または軽減のために用
いられる候補物質のスクリーニングに有用である。
【０００９】 別の目的は、HIV感染の齧歯類動物モデルを提供することであり、それによっ
て感染性および付随する症候群の進行を研究し、HIV感染を予防する手段を同定
するのに有用な手段を提供することである。
て感染性および付随する症候群の進行を研究し、HIV感染を予防する手段を同定
するのに有用な手段を提供することである。
【００１０】 さらに本発明の別の目的は、HIVの構造遺伝子を発現しているトランスジェニ
ック齧歯類動物またはトランスジェニック齧歯類細胞を提供することである。
ック齧歯類動物またはトランスジェニック齧歯類細胞を提供することである。
【００１１】 また、別の目的は、特定のHIV単離株の感染力および病原性を評価するための
モデルを提供することである。
モデルを提供することである。
【００１２】 本発明の別の局面において、本発明に係るトランスジェニック齧歯類動物はさ
らに、ウイルスの配列に結合するヒト遺伝子、例えばTatなどのHIVトランス活性
化ドメインと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子、を発現するように操
作されている。このヒト遺伝子は好ましくは、Cyclin Tである。
らに、ウイルスの配列に結合するヒト遺伝子、例えばTatなどのHIVトランス活性
化ドメインと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子、を発現するように操
作されている。このヒト遺伝子は好ましくは、Cyclin Tである。
【００１３】 本発明の特徴は、本発明に係るトランスジェニック齧歯類動物（例えば、マウ
スおよびラット）が、その表面にヒトCD4受容体およびヒトケモカイン受容体を
発現している細胞を有することである。
スおよびラット）が、その表面にヒトCD4受容体およびヒトケモカイン受容体を
発現している細胞を有することである。
【００１４】 本発明の利点は、本発明のトランスジェニック齧歯類動物または齧歯類細胞(
例えば、ラットおよびマウス)は、種々の異なるHIV株の接種によって感染し、ウ
イルスの複製を支持することである。
例えば、ラットおよびマウス)は、種々の異なるHIV株の接種によって感染し、ウ
イルスの複製を支持することである。
【００１５】 本発明の上記およびその他の目的、利点および特徴は、以下により詳しく述べ
る本発明の詳細を読むことにより、当業者には明らかになると思われる。
る本発明の詳細を読むことにより、当業者には明らかになると思われる。
【００１６】 本発明の詳細な説明 本発明のトランスジェニック動物及びそれらの使用について記載する前に、本
発明は記載される特定の方法、手順、細胞系、動物種または属、構築物および試
薬に制限されるものではなく、当然ながら変更がありうることを理解される必要
がある。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様のみを説明するための
ものであり、本発明の範囲を限定するためのものではなく、それは添付した請求
の範囲によってのみ制限されることも理解される必要がある。
発明は記載される特定の方法、手順、細胞系、動物種または属、構築物および試
薬に制限されるものではなく、当然ながら変更がありうることを理解される必要
がある。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様のみを説明するための
ものであり、本発明の範囲を限定するためのものではなく、それは添付した請求
の範囲によってのみ制限されることも理解される必要がある。
【００１７】 本明細書および添付した請求の範囲において用いられる単数形の「1つの（a,
an）」および「その（the）」は、文脈内で明らかに特記されない限り、複数の
ものに関する言及も含むことに留意されたい。したがって、例えば「1つの構築
物（a construct）」という言及は複数のこのような構築物を含み、「ケモカイ
ン受容体をコードする核酸」及び「CD4をコードする核酸」という言及はそれぞ
れ、ケモカイン受容体をコードする1つまたは複数の核酸及びCD4をコードする1
つまたは複数の核酸、ならびに当業者に公知のそれらの等価物などという言及を
含む。
an）」および「その（the）」は、文脈内で明らかに特記されない限り、複数の
ものに関する言及も含むことに留意されたい。したがって、例えば「1つの構築
物（a construct）」という言及は複数のこのような構築物を含み、「ケモカイ
ン受容体をコードする核酸」及び「CD4をコードする核酸」という言及はそれぞ
れ、ケモカイン受容体をコードする1つまたは複数の核酸及びCD4をコードする1
つまたは複数の核酸、ならびに当業者に公知のそれらの等価物などという言及を
含む。
【００１８】 数値範囲が与えられた場合、この範囲の上限値および下限値が特に文中で示さ
れていなければ下限値の小数点第一位までの間に存在する各数値も、具体的に明
示されていると理解される。明示された数値範囲内で明示されたすべての数値ま
たは介在する数値と、与えられた数値範囲内で明示されたその他すべての数値ま
たは介在する数値との間にある各々のより小さい範囲は、本発明の範囲内に含ま
れる。このような小さな範囲の上限値および下限値は、与えられた範囲内で独立
に含まれても、または除外されてもよく、より小さな範囲において限界値の片方
が含まれる、両方とも含まれない、または両方とも含まれる場合、各々の小さな
範囲もまた、本発明の範囲内に含まれ、明示された範囲で具体的に除外された限
界値すべてに従属する。明示された範囲に限界値の片方または両方が含まれる場
合、限界値の片方または両方ともを除いた範囲もまた、本発明に含まれる。
れていなければ下限値の小数点第一位までの間に存在する各数値も、具体的に明
示されていると理解される。明示された数値範囲内で明示されたすべての数値ま
たは介在する数値と、与えられた数値範囲内で明示されたその他すべての数値ま
たは介在する数値との間にある各々のより小さい範囲は、本発明の範囲内に含ま
れる。このような小さな範囲の上限値および下限値は、与えられた範囲内で独立
に含まれても、または除外されてもよく、より小さな範囲において限界値の片方
が含まれる、両方とも含まれない、または両方とも含まれる場合、各々の小さな
範囲もまた、本発明の範囲内に含まれ、明示された範囲で具体的に除外された限
界値すべてに従属する。明示された範囲に限界値の片方または両方が含まれる場
合、限界値の片方または両方ともを除いた範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１９】 別に特記しない限り、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が
属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明
の実践または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意
の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料は以下に
記載する。
属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明
の実践または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意
の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料は以下に
記載する。
【００２０】 本明細書に記載した刊行物はすべて、例えば、本明細書で説明される発明と関
連して用いられる可能性のある、その刊行物に記載された細胞系、構築物および
方法を説明および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。上記
および本文の全体にわたって考察される刊行物は、本出願の出願日以前にそれら
が開示されているためだけに提供される。本明細書のいかなる内容も、先行発明
に基づいて本開示が成された日付を早める権利が本発明者らには無いことを自認
したものと解釈されるべきではない。さらに、公布の日付は実際の刊行日とは異
なる可能性があり、それらは個別に確認する必要があると思われる。
連して用いられる可能性のある、その刊行物に記載された細胞系、構築物および
方法を説明および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。上記
および本文の全体にわたって考察される刊行物は、本出願の出願日以前にそれら
が開示されているためだけに提供される。本明細書のいかなる内容も、先行発明
に基づいて本開示が成された日付を早める権利が本発明者らには無いことを自認
したものと解釈されるべきではない。さらに、公布の日付は実際の刊行日とは異
なる可能性があり、それらは個別に確認する必要があると思われる。
【００２１】定義 「導入遺伝子」という用語は、本明細書において、非ヒト哺乳動物、特に非ヒ
ト哺乳動物の生きた細胞のゲノム中に人為的に挿入された、またはされようとす
る遺伝物質を説明するために用いられる。
ト哺乳動物の生きた細胞のゲノム中に人為的に挿入された、またはされようとす
る遺伝物質を説明するために用いられる。
【００２２】 「HIV」とは、霊長類およびまたはヒトに感染すると免疫疾患であるAIDSを引
き起こす、霊長類の免疫不全ウイルスとして分類されるウイルス全てを意味する
。これは既知のHIV株、例えばHIV-1およびHIV-2、これらの変異株、同定されて
いる株、または未同定株、ならびにサル免疫不全ウイルス（SIV）、SIVの変異株
およびこれらの株間での組換えキメラ全てを含む。この用語は、未同定のヒトお
よび霊長類の免疫不全ウイルス株も含むものとする。この用語はHIVの実験株、H
IVのリコンビナント株、および初代臨床単離株を含む。このような単離株はイン
ビトロにおける分子クローニング技術を用いて生産してもよく、および／または
生物学的試料から単離してもよい。
き起こす、霊長類の免疫不全ウイルスとして分類されるウイルス全てを意味する
。これは既知のHIV株、例えばHIV-1およびHIV-2、これらの変異株、同定されて
いる株、または未同定株、ならびにサル免疫不全ウイルス（SIV）、SIVの変異株
およびこれらの株間での組換えキメラ全てを含む。この用語は、未同定のヒトお
よび霊長類の免疫不全ウイルス株も含むものとする。この用語はHIVの実験株、H
IVのリコンビナント株、および初代臨床単離株を含む。このような単離株はイン
ビトロにおける分子クローニング技術を用いて生産してもよく、および／または
生物学的試料から単離してもよい。
【００２３】 「HIVに付随する現象」とは、HIV感染に伴う生理的、細胞的、分子的、または
機能的な事象の組み合わせ全てを意味する。このような現象は、細胞へのウイル
スの接着、ウイルスの組み込み、ウイルスの複製、T-細胞の枯渇、付随して起こ
る日和見感染、癌性変化などが含まれるが、これらに限定するものではない。
機能的な事象の組み合わせ全てを意味する。このような現象は、細胞へのウイル
スの接着、ウイルスの組み込み、ウイルスの複製、T-細胞の枯渇、付随して起こ
る日和見感染、癌性変化などが含まれるが、これらに限定するものではない。
【００２４】 「感染に対する感受性」とは、細胞がHIVウイルスに侵入されやすいトランス
ジェニック齧歯類動物または、HIVにより侵入されやすいトランスジェニック齧
歯類細胞、好ましくは侵入した後、HIVの複製が可能な齧歯類細胞を示すために
用いられる。
ジェニック齧歯類動物または、HIVにより侵入されやすいトランスジェニック齧
歯類細胞、好ましくは侵入した後、HIVの複製が可能な齧歯類細胞を示すために
用いられる。
【００２５】 「形質転換」とは、新たなDNA（すなわち細胞からみて外因性であるDNA）の組
み入れ後に細胞に導入された、永続的または一時的な遺伝的変化、好ましくは永
続的な遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合には、永続的な遺
伝的変化は一般に細胞のゲノム中へのDNAの導入によって達成される。
み入れ後に細胞に導入された、永続的または一時的な遺伝的変化、好ましくは永
続的な遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合には、永続的な遺
伝的変化は一般に細胞のゲノム中へのDNAの導入によって達成される。
【００２６】 「トランスジェニック齧歯類動物」とは、細胞の一部に染色体外要素として存
在するか、またはその生殖系DNA中（すなわち大部分またはすべての細胞のゲノ
ム配列中）に安定的に組み込まれた非内因性（すなわち異種）核酸配列を有する
、齧歯類動物（例えばマウス、ラット、ハムスターなど）を意味する。異種核酸
は、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝的操作により、このようなトラ
ンスジェニック動物の生殖系に導入される。
在するか、またはその生殖系DNA中（すなわち大部分またはすべての細胞のゲノ
ム配列中）に安定的に組み込まれた非内因性（すなわち異種）核酸配列を有する
、齧歯類動物（例えばマウス、ラット、ハムスターなど）を意味する。異種核酸
は、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝的操作により、このようなトラ
ンスジェニック動物の生殖系に導入される。
【００２７】 「二遺伝子型」動物とは、少なくとも2つの導入遺伝子を持つトランスジェニ
ック動物を意味し、好ましくは一番目の導入遺伝子はヒトCD4受容体をコードし
、二番目の導入遺伝子はヒトケモカイン受容体をコードする。
ック動物を意味し、好ましくは一番目の導入遺伝子はヒトCD4受容体をコードし
、二番目の導入遺伝子はヒトケモカイン受容体をコードする。
【００２８】 「多遺伝子型」動物は少なくとも3つの外因性遺伝子をコードする導入遺伝子
を持つ動物を意味する。ある態様において、本発明に係る多遺伝子型動物は１つ
のヒトCD4受容体および複数のヒトケモカイン受容体をコードする。別の態様で
は、本発明に係る多遺伝子型動物は、１つのヒトCD4受容体、少なくとも１つの
ヒトケモカイン受容体、およびCyclin Tなどのトランス活性化ドメインのような
HIVドメインと相互作用するタンパク質をコードする導入遺伝子を有する。
を持つ動物を意味する。ある態様において、本発明に係る多遺伝子型動物は１つ
のヒトCD4受容体および複数のヒトケモカイン受容体をコードする。別の態様で
は、本発明に係る多遺伝子型動物は、１つのヒトCD4受容体、少なくとも１つの
ヒトケモカイン受容体、およびCyclin Tなどのトランス活性化ドメインのような
HIVドメインと相互作用するタンパク質をコードする導入遺伝子を有する。
【００２９】 遺伝子の「ノックアウト（knock-out）」とは、好ましくは標的遺伝子の発現
が検出不能または無意味となるような標的遺伝子の機能低下をもたらす遺伝子の
配列の改変を意味する。内因性遺伝子のノックアウトとは、発現が検出不能また
は無意味なレベルで存在するに過ぎないほどに遺伝子の機能が実質的に低下して
いることを意味する。「ノックアウト」トランスジェニック生物は、遺伝子のヘ
テロ接合型ノックアウトまたは遺伝子のホモ接合型ノックアウトを有するトラン
スジェニック動物でありうる。「ノックアウト体」には、例えば標的遺伝子の改
変を促進する物質に対する動物の曝露、標的遺伝子部位の組換えを促進する酵素
（例えばCre-lox系におけるCre）の導入、または出生後に標的遺伝子の改変を指
向するためのその他の方法を用いた際に標的遺伝子の改変を起こすことができる
条件的ノックアウト体も含まれる。
が検出不能または無意味となるような標的遺伝子の機能低下をもたらす遺伝子の
配列の改変を意味する。内因性遺伝子のノックアウトとは、発現が検出不能また
は無意味なレベルで存在するに過ぎないほどに遺伝子の機能が実質的に低下して
いることを意味する。「ノックアウト」トランスジェニック生物は、遺伝子のヘ
テロ接合型ノックアウトまたは遺伝子のホモ接合型ノックアウトを有するトラン
スジェニック動物でありうる。「ノックアウト体」には、例えば標的遺伝子の改
変を促進する物質に対する動物の曝露、標的遺伝子部位の組換えを促進する酵素
（例えばCre-lox系におけるCre）の導入、または出生後に標的遺伝子の改変を指
向するためのその他の方法を用いた際に標的遺伝子の改変を起こすことができる
条件的ノックアウト体も含まれる。
【００３０】 標的遺伝子の「ノック-イン (knock-in)」とは、例えば、標的遺伝子をもう１
コピー導入する、または標的遺伝子の内因性コピーの発現を増強するような調節
配列を人為的に挿入することによる、標的遺伝子の発現が変化（例えば、(異所
性のものを含めて)増加）するような宿主細胞のゲノムにおける改変を意味する
。本発明にとって重要な「ノック-イン」トランスジェニックとは、動物の内因
性CD4受容体、動物の内因性ケモカイン受容体、またはその両方のノック-インを
持つトランスジェニック動物でありうる。このようなトランスジェニックは、CD
4 遺伝子に関してはヘテロ接合体のノック-イン、CD4遺伝子のノック-インに関
してはホモ接合体、ケモカイン受容体遺伝子のノック-インに関してはヘテロ接
合体、ケモカイン受容体遺伝子のノック-インに関してはホモ接合体、またはCD4
のホモ接合/ヘテロ接合体およびケモカイン受容体のホモ接合/ヘテロ接合体の、
どのような組み合わせも可能である。「ノック-イン」は、条件的なノック-イン
も含む。
コピー導入する、または標的遺伝子の内因性コピーの発現を増強するような調節
配列を人為的に挿入することによる、標的遺伝子の発現が変化（例えば、(異所
性のものを含めて)増加）するような宿主細胞のゲノムにおける改変を意味する
。本発明にとって重要な「ノック-イン」トランスジェニックとは、動物の内因
性CD4受容体、動物の内因性ケモカイン受容体、またはその両方のノック-インを
持つトランスジェニック動物でありうる。このようなトランスジェニックは、CD
4 遺伝子に関してはヘテロ接合体のノック-イン、CD4遺伝子のノック-インに関
してはホモ接合体、ケモカイン受容体遺伝子のノック-インに関してはヘテロ接
合体、ケモカイン受容体遺伝子のノック-インに関してはホモ接合体、またはCD4
のホモ接合/ヘテロ接合体およびケモカイン受容体のホモ接合/ヘテロ接合体の、
どのような組み合わせも可能である。「ノック-イン」は、条件的なノック-イン
も含む。
【００３１】 本明細書で使用される「ES細胞」という用語は、多能性の胚性幹細胞、および
胚発生の非常に早い段階における多能性細胞などを意味し、発生の胚盤胞期にお
ける細胞を含むが、これに限定するものではない。
胚発生の非常に早い段階における多能性細胞などを意味し、発生の胚盤胞期にお
ける細胞を含むが、これに限定するものではない。
【００３２】 「構築物」とは、特定のヌクレオチド配列を発現させる目的で作製された、ま
たはその他の組換えヌクレオチド配列の作製に用いようとする組換え核酸、一般
には組換えDNAを意味する。「機能的に結合された」とは、DNA配列および調節配
列が、適切な分子（例えば、転写活性化蛋白質）がその調節配列に結合した際に
遺伝子発現が可能となるような方式で連結されていることを意味する。
たはその他の組換えヌクレオチド配列の作製に用いようとする組換え核酸、一般
には組換えDNAを意味する。「機能的に結合された」とは、DNA配列および調節配
列が、適切な分子（例えば、転写活性化蛋白質）がその調節配列に結合した際に
遺伝子発現が可能となるような方式で連結されていることを意味する。
【００３３】 「機能的に挿入された」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、導入された関
心対象のヌクレオチド配列の転写および翻訳を指向する（すなわち、例えばCD4
配列またはケモカイン受容体配列にコードされるポリペプチドなどの産生を促進
する）ヌクレオチド配列に隣接した位置に置かれることを意味する。
心対象のヌクレオチド配列の転写および翻訳を指向する（すなわち、例えばCD4
配列またはケモカイン受容体配列にコードされるポリペプチドなどの産生を促進
する）ヌクレオチド配列に隣接した位置に置かれることを意味する。
【００３４】 「相当する」という用語は、指定された配列に相同、または実質的に同等、ま
たは機能的に同等であることを意味する。
たは機能的に同等であることを意味する。
【００３５】 「ケモカイン受容体」とは、選択的にケモカインまたはその他の小さなリガン
ドを結合し、HIVの細胞感染に作用することができるタンパク質を意味する。
ドを結合し、HIVの細胞感染に作用することができるタンパク質を意味する。
【００３６】 「HIV配列への結合」および同様の表現は、HIVのmRNA、逆転写されたDNAまた
はすべてのHIVタンパク質への結合を意味する。
はすべてのHIVタンパク質への結合を意味する。
【００３７】 「cDNA」とは天然の成熟mRNA分子種にみられる、エクソンならびに3'および5'
側の非コード領域の配列エレメントの配置を持つ全ての核酸を意味する。通常、
mRNA分子種は核内RNAのスプライシングによって介在イントロンが除去されて隣
接するエクソンを持つようになり、タンパク質をコードしている連続的なオープ
ンリーディングフレームを形成する。
側の非コード領域の配列エレメントの配置を持つ全ての核酸を意味する。通常、
mRNA分子種は核内RNAのスプライシングによって介在イントロンが除去されて隣
接するエクソンを持つようになり、タンパク質をコードしている連続的なオープ
ンリーディングフレームを形成する。
【００３８】 「ゲノム配列」とは、非連続的なオープンリーディングフレームを持つ配列を
意味しており、この中のイントロンはタンパク質コード領域を分断するものであ
る。さらに、成熟ｍRNAにみられる3'および５'側の非翻訳領域を含んでいてもよ
い。さらにゲノム配列は、プロモーター、エンハンサーなどの特異的な転写およ
び翻訳のための調節配列を含み、また、転写された領域の5'または3'末端のどち
らかにおいて約1 kb（それより大きなものも可能であるが）のフランキングゲノ
ムDNAを含んでもよい。ゲノムDNAは、100 kbpまたはそれより小さな断片として
単離され、実質的には染色体のフランキング配列を含まない。
意味しており、この中のイントロンはタンパク質コード領域を分断するものであ
る。さらに、成熟ｍRNAにみられる3'および５'側の非翻訳領域を含んでいてもよ
い。さらにゲノム配列は、プロモーター、エンハンサーなどの特異的な転写およ
び翻訳のための調節配列を含み、また、転写された領域の5'または3'末端のどち
らかにおいて約1 kb（それより大きなものも可能であるが）のフランキングゲノ
ムDNAを含んでもよい。ゲノムDNAは、100 kbpまたはそれより小さな断片として
単離され、実質的には染色体のフランキング配列を含まない。
【００３９】発明の全体像 本発明は、HIV感染およびHIV感染に付随する現象のためのトランスジェニック
齧歯類動物モデルを提供するものであり、トランスジェニック齧歯類動物または
齧歯類細胞のゲノムにヒトCD4受容体および／または少なくとも1つのヒトケモカ
イン受容体を組み込んだものである。好ましい態様において、動物は１）ヒトCD
4受容体を発現し、且つ２）1つまたは複数のヒトケモカイン受容体を発現するよ
うに遺伝的に改変されている。トランスジェニック動物はこのような遺伝的な改
変に関してホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれであってもよい。本発明の動
物は、HIVに感染した個体の治療、感染前（すなわち、ワクチン）、感染後また
はHIV関連疾患の発症後の直接的な予防のための候補物質の試験に有用である。
齧歯類動物モデルを提供するものであり、トランスジェニック齧歯類動物または
齧歯類細胞のゲノムにヒトCD4受容体および／または少なくとも1つのヒトケモカ
イン受容体を組み込んだものである。好ましい態様において、動物は１）ヒトCD
4受容体を発現し、且つ２）1つまたは複数のヒトケモカイン受容体を発現するよ
うに遺伝的に改変されている。トランスジェニック動物はこのような遺伝的な改
変に関してホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれであってもよい。本発明の動
物は、HIVに感染した個体の治療、感染前（すなわち、ワクチン）、感染後また
はHIV関連疾患の発症後の直接的な予防のための候補物質の試験に有用である。
【００４０】 今日までに研究された様々な齧歯類動物は、ウイルスの感染と複製に対して明
らかに制限があると考えられるため、遺伝子導入操作により適していると考えら
れる、より制限の少ない齧歯類動物種が試験された。特に、(１)ラットは交配す
るのに便利である、（２）ラットの免疫システムの特徴は比較的十分研究されて
おり、多数の試薬が長期の試験に利用できる、および(３)トランスジェニック産
生がラットでは成功していることを含む、いくつかの理由でラット細胞が調査さ
れてきた。
らかに制限があると考えられるため、遺伝子導入操作により適していると考えら
れる、より制限の少ない齧歯類動物種が試験された。特に、(１)ラットは交配す
るのに便利である、（２）ラットの免疫システムの特徴は比較的十分研究されて
おり、多数の試薬が長期の試験に利用できる、および(３)トランスジェニック産
生がラットでは成功していることを含む、いくつかの理由でラット細胞が調査さ
れてきた。
【００４１】 本発明はラットの細胞がHIV感染に感受性であること、ならびにHIVの構造遺伝
子を発現することができるという知見に基づいている。それゆえ、本発明に係る
トランスジェニック齧歯類動物は、HIV感染に対して感受性であり、HIVの構造遺
伝子の発現が可能であることを特徴とする。さらに、本発明に係るトランスジェ
ニック齧歯類動物は、好ましくは該トランスジェニック齧歯類動物の細胞内にお
けるHIVの複製が可能であることを特徴とする。本発明のトランスジェニック齧
歯類動物またはトランスジェニック齧歯類動物細胞株は、HIV感染の研究、HIVの
複製、およびHIV病原性、ならびに抗ウイルスおよび／またはワクチン開発手段
のための候補物質のスクリーニングを含むがこれらに限定されない、様々な適用
に有用である。
子を発現することができるという知見に基づいている。それゆえ、本発明に係る
トランスジェニック齧歯類動物は、HIV感染に対して感受性であり、HIVの構造遺
伝子の発現が可能であることを特徴とする。さらに、本発明に係るトランスジェ
ニック齧歯類動物は、好ましくは該トランスジェニック齧歯類動物の細胞内にお
けるHIVの複製が可能であることを特徴とする。本発明のトランスジェニック齧
歯類動物またはトランスジェニック齧歯類動物細胞株は、HIV感染の研究、HIVの
複製、およびHIV病原性、ならびに抗ウイルスおよび／またはワクチン開発手段
のための候補物質のスクリーニングを含むがこれらに限定されない、様々な適用
に有用である。
【００４２】 本発明の二遺伝子型動物は、ヒトCD4に関して単独にトランスジェニックであ
る齧歯類動物にみられる感染性の問題を克服できる。加えて、ウイルスの感染お
よび複製は、ヒトCyclin Tのように、ウイルス塩基配列と相互作用するタンパク
質をコードする補足的なヒト遺伝子の導入によって増強される場合もある。
る齧歯類動物にみられる感染性の問題を克服できる。加えて、ウイルスの感染お
よび複製は、ヒトCyclin Tのように、ウイルス塩基配列と相互作用するタンパク
質をコードする補足的なヒト遺伝子の導入によって増強される場合もある。
【００４３】 トランスジェニック齧歯類動物は、HIV感染の研究、ならびにHIV感染の治療お
よび／または予防のための候補物質の同定に有用であると本明細書に記載してい
るが、トランスジェニック齧歯類動物はヒトCD4および／またはケモカイン受容
体を利用するすべてのウイルスまたは微生物病原体の研究においても有用である
ことが予見される。このように、HIV研究、HIV感染のアッセイ法、およびHIV感
染の予防および／または治療のための候補物質の同定におけるトランスジェニッ
ク齧歯類動物の使用に関する記載は、本開示を読むことにより当業者には明白で
あるように、その他のウイルスおよび微生物病原体による感染に適用することが
可能である。
よび／または予防のための候補物質の同定に有用であると本明細書に記載してい
るが、トランスジェニック齧歯類動物はヒトCD4および／またはケモカイン受容
体を利用するすべてのウイルスまたは微生物病原体の研究においても有用である
ことが予見される。このように、HIV研究、HIV感染のアッセイ法、およびHIV感
染の予防および／または治療のための候補物質の同定におけるトランスジェニッ
ク齧歯類動物の使用に関する記載は、本開示を読むことにより当業者には明白で
あるように、その他のウイルスおよび微生物病原体による感染に適用することが
可能である。
【００４４】トランスジェニック動物 関心対象の遺伝子（例えばCD4またはケモカイン受容体）を含有する導入遺伝
子は、トランスジーンの外因性DNAの組み入れ後に細胞に導入された永続的また
は一時的な遺伝的変化、好ましくは永続的な遺伝的変化を意味し、細胞を形質転
換するために用いられる。永続的な遺伝的変化は一般に細胞のゲノム中にDNAを
導入することによって達成される。安定的組み込みに適したベクターには、プラ
スミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YACなどが含まれる。関
心対象となるのは、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど、特にラット、マウス、ハムス
ターなどの齧歯類などのトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。好ましくは
、トランスジェニック動物はラットである。
子は、トランスジーンの外因性DNAの組み入れ後に細胞に導入された永続的また
は一時的な遺伝的変化、好ましくは永続的な遺伝的変化を意味し、細胞を形質転
換するために用いられる。永続的な遺伝的変化は一般に細胞のゲノム中にDNAを
導入することによって達成される。安定的組み込みに適したベクターには、プラ
スミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YACなどが含まれる。関
心対象となるのは、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど、特にラット、マウス、ハムス
ターなどの齧歯類などのトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。好ましくは
、トランスジェニック動物はラットである。
【００４５】 トランスジェニック動物は、そのすべてまたは一部の細胞、特に生殖細胞中に
染色体外要素として存在するか、または安定的に組み込まれた外因性核酸配列を
含む。別に特記しない限り、トランスジェニック動物は生殖系列配列に対する安
定的な変化を含むものと仮定される。本動物を最初に作製する際には、細胞のあ
るサブセットのみが改変されたゲノムを有する「キメラ」または「キメラ動物」
が作製される。キメラは主に、望ましいトランスジェニック動物の作製を目的と
する交配のために用いられる。キメラの交配により、ヘテロ接合性の変化を有す
る動物が作製される。典型的には雄および雌のヘテロ接合体が交配され、ホモ接
合型の動物が作製される。
染色体外要素として存在するか、または安定的に組み込まれた外因性核酸配列を
含む。別に特記しない限り、トランスジェニック動物は生殖系列配列に対する安
定的な変化を含むものと仮定される。本動物を最初に作製する際には、細胞のあ
るサブセットのみが改変されたゲノムを有する「キメラ」または「キメラ動物」
が作製される。キメラは主に、望ましいトランスジェニック動物の作製を目的と
する交配のために用いられる。キメラの交配により、ヘテロ接合性の変化を有す
る動物が作製される。典型的には雄および雌のヘテロ接合体が交配され、ホモ接
合型の動物が作製される。
【００４６】 外因性遺伝子は通常宿主動物とは異なる種由来であるか、さもなくばコード配
列または非コード配列が改変されている。導入される遺伝子は野生型遺伝子、天
然にみられる多型、または例えばコードもしくは非コード領域における欠失、置
換または挿入を有する遺伝的に操作された配列であってもよい。導入される遺伝
子がコード配列である場合には、それは通常、構成的または誘導的でありうるプ
ロモーター、および宿主動物における発現に必要なその他の調節配列に機能的に
結合されている。「機能的に結合された」とは、DNA配列および調節配列が、転
写活性化蛋白質などの適切な分子がその調節配列に結合した際に遺伝子発現が可
能となるような方式で連結されていることを意味する。
列または非コード配列が改変されている。導入される遺伝子は野生型遺伝子、天
然にみられる多型、または例えばコードもしくは非コード領域における欠失、置
換または挿入を有する遺伝的に操作された配列であってもよい。導入される遺伝
子がコード配列である場合には、それは通常、構成的または誘導的でありうるプ
ロモーター、および宿主動物における発現に必要なその他の調節配列に機能的に
結合されている。「機能的に結合された」とは、DNA配列および調節配列が、転
写活性化蛋白質などの適切な分子がその調節配列に結合した際に遺伝子発現が可
能となるような方式で連結されていることを意味する。
【００４７】 一般に、本発明に係るトランスジェニック齧歯類動物は、１）ヒトCD4の発現
および２）少なくとも１つのヒトケモカイン受容体、例えばCCR5の発現を得るた
めの遺伝子改変を含む。特異的なCD4およびケモカイン受容体をコードする、重
要な構築物を以下に記載する。
および２）少なくとも１つのヒトケモカイン受容体、例えばCCR5の発現を得るた
めの遺伝子改変を含む。特異的なCD4およびケモカイン受容体をコードする、重
要な構築物を以下に記載する。
【００４８】 本発明に係るトランスジェニック動物はCD4コード配列またはケモカイン受容
体コード配列の存在に加えて、他の遺伝子改変を含む場合もある。例えば、内因
性遺伝子(例えば、内因性CD4および／またはケモカイン受容体遺伝子)の機能に
作用して宿主のゲノムが改変されてもよいし、マーカー遺伝子、または本発明の
目標に一致するその他の遺伝子改変も含まれうる。
体コード配列の存在に加えて、他の遺伝子改変を含む場合もある。例えば、内因
性遺伝子(例えば、内因性CD4および／またはケモカイン受容体遺伝子)の機能に
作用して宿主のゲノムが改変されてもよいし、マーカー遺伝子、または本発明の
目標に一致するその他の遺伝子改変も含まれうる。
【００４９】 ノックアウトおよびノックイン 本発明の実施には必須ではないが、本明細書に記載されたトランスジェニック
動物は、上述の遺伝子改変に加えて、内因性遺伝子の改変を含んでいてもよい。
例えば、本発明の目標に一致するように、宿主動物は標的遺伝子に関して「ノッ
クアウト」および／または「ノックイン」のどちらでもよい（例えば、宿主動物
の内因性CD4が「ノックアウト」されており、および／または内因性ケモカイン
受容体遺伝子が「ノックイン」されていてもよい）。ノックアウトは、重要な内
因性遺伝子（例えば、CD4）の対立遺伝子の一方または両方において、部分的ま
たは完全な機能喪失を示す。ノックインは内因性遺伝子の遺伝子配列および／ま
たは機能が改変された導入遺伝子を導入したものである。これら2つは、例えば
、本来存在する遺伝子が機能を失い、改変された形の遺伝子が導入される、とい
うように組み合わされてもよい。例えば、宿主動物の内因性CD4遺伝子をノック
アウトし、一方外因性CD4遺伝子(例えば、ヒトCD4遺伝子)を導入することが望ま
しい。
動物は、上述の遺伝子改変に加えて、内因性遺伝子の改変を含んでいてもよい。
例えば、本発明の目標に一致するように、宿主動物は標的遺伝子に関して「ノッ
クアウト」および／または「ノックイン」のどちらでもよい（例えば、宿主動物
の内因性CD4が「ノックアウト」されており、および／または内因性ケモカイン
受容体遺伝子が「ノックイン」されていてもよい）。ノックアウトは、重要な内
因性遺伝子（例えば、CD4）の対立遺伝子の一方または両方において、部分的ま
たは完全な機能喪失を示す。ノックインは内因性遺伝子の遺伝子配列および／ま
たは機能が改変された導入遺伝子を導入したものである。これら2つは、例えば
、本来存在する遺伝子が機能を失い、改変された形の遺伝子が導入される、とい
うように組み合わされてもよい。例えば、宿主動物の内因性CD4遺伝子をノック
アウトし、一方外因性CD4遺伝子(例えば、ヒトCD4遺伝子)を導入することが望ま
しい。
【００５０】 ノックアウトでは、好ましくは標的遺伝子の発現は検出できないか、または微
少である。例えば、CD4遺伝子のノックアウトとは、CD4の機能が実質的に減少し
、その結果、その発現は検出できないか、または微少なレベルでしか存在しない
ことを意味する。これは、例えば1つまたは複数の終止コドンの挿入、DNA断片の
挿入などによるコード配列の分断、コード配列の欠失、コード配列と終止コドン
の置換などを導入することを含む、様々な機序で達成できる。ある例では、外因
性導入遺伝子の配列が最終的にゲノムから削除され、天然の配列に対して正味の
変化が残っている。「ノックアウト」を達成するために別な方法を用いてもよい
。非コード領域、特にプロモーター領域、3'側の調節配列、エンハンサーの欠失
、またはCD4の発現を活性化する遺伝子の欠失を含む、天然の遺伝子の全部また
は一部の染色体の欠失が導入されてもよい。機能的なノックアウトは天然の遺伝
子の発現を遮断するアンチ-センス構築物の導入によって達成することも可能で
ある（例えば、LiおよびCohen (1996) Cell 85:319-329）。「ノックアウト」に
は条件的なノックアウト、例えば、標的遺伝子の改変を促進する物質に動物を曝
露することで標的遺伝子の改変を生ずる場合や、標的遺伝子部位(例えば、Cre-l
oxシステムのCre)で組換えを促進する酵素の導入、または生後に標的遺伝子の改
変を行う他の方法も含まれる。
少である。例えば、CD4遺伝子のノックアウトとは、CD4の機能が実質的に減少し
、その結果、その発現は検出できないか、または微少なレベルでしか存在しない
ことを意味する。これは、例えば1つまたは複数の終止コドンの挿入、DNA断片の
挿入などによるコード配列の分断、コード配列の欠失、コード配列と終止コドン
の置換などを導入することを含む、様々な機序で達成できる。ある例では、外因
性導入遺伝子の配列が最終的にゲノムから削除され、天然の配列に対して正味の
変化が残っている。「ノックアウト」を達成するために別な方法を用いてもよい
。非コード領域、特にプロモーター領域、3'側の調節配列、エンハンサーの欠失
、またはCD4の発現を活性化する遺伝子の欠失を含む、天然の遺伝子の全部また
は一部の染色体の欠失が導入されてもよい。機能的なノックアウトは天然の遺伝
子の発現を遮断するアンチ-センス構築物の導入によって達成することも可能で
ある（例えば、LiおよびCohen (1996) Cell 85:319-329）。「ノックアウト」に
は条件的なノックアウト、例えば、標的遺伝子の改変を促進する物質に動物を曝
露することで標的遺伝子の改変を生ずる場合や、標的遺伝子部位(例えば、Cre-l
oxシステムのCre)で組換えを促進する酵素の導入、または生後に標的遺伝子の改
変を行う他の方法も含まれる。
【００５１】 本発明のトランスジェニック動物において、宿主のCD4および／またはケモカ
イン受容体遺伝子のノックアウトが可能である一方、ヒトCD4/ケモカイン受容体
を有する二遺伝子型動物の実用性は必要ではないことに注意するべきである。
イン受容体遺伝子のノックアウトが可能である一方、ヒトCD4/ケモカイン受容体
を有する二遺伝子型動物の実用性は必要ではないことに注意するべきである。
【００５２】 標的遺伝子の「ノックイン」は宿主細胞のゲノムを改変するとその結果、本来
存在する標的遺伝子の発現または機能が改変されることを意味する。発現の増加
(異所性のものを含む)または減少は、標的遺伝子をもう１コピー導入する、また
は標的遺伝子の内因性コピーの発現を増強させるような調節配列を機能的に挿入
することにより達成されうる。これらの変化は構成的な変化、または条件的な変
化であってもよく、すなわち活性化因子または抑制因子の存在に依存していても
よい。本発明のトランスジェニック動物を作製するために、外因性配列の生産と
組み合わせてノックイン技術を使用してもよい。例えば、本発明のCD4/ケモカイ
ン受容体を持つトランスジェニック動物は、T細胞において所望のCD4発現レベル
を得るために宿主の内因性CD4コード配列のノックインを含み、また外因性ヒト
ケモカイン受容体のコード配列を含む。
存在する標的遺伝子の発現または機能が改変されることを意味する。発現の増加
(異所性のものを含む)または減少は、標的遺伝子をもう１コピー導入する、また
は標的遺伝子の内因性コピーの発現を増強させるような調節配列を機能的に挿入
することにより達成されうる。これらの変化は構成的な変化、または条件的な変
化であってもよく、すなわち活性化因子または抑制因子の存在に依存していても
よい。本発明のトランスジェニック動物を作製するために、外因性配列の生産と
組み合わせてノックイン技術を使用してもよい。例えば、本発明のCD4/ケモカイ
ン受容体を持つトランスジェニック動物は、T細胞において所望のCD4発現レベル
を得るために宿主の内因性CD4コード配列のノックインを含み、また外因性ヒト
ケモカイン受容体のコード配列を含む。
【００５３】核酸の組成 本発明で使用する構築物は、所望のCD4コード配列および選択されたケモカイ
ン受容体が所望のレベルまで発現されているトランスジェニック動物を作製する
ための使用に適した構築物全てを含む。これらの構築物には、cDNA、ゲノム配列
、またはその両方が含まれる。所望の配列に加えて、宿主動物において選択され
た配列の発現に適切な構築物の単離およびクローニング方法は、当技術分野にお
いてよく知られている。本構築物には、CD4およびケモカイン受容体のコード配
列以外の配列が含まれてもよく、一つの好ましい態様では、齧歯類動物はHIVタ
ンパク質をコードするHIV配列を少なくとも1つ発現する。加えて、lac Zのよう
なマーカー遺伝子が構築物に含まれてもよく、コードされた配列の発現のアップ
レギュレーションは表現型における変化として容易に検出できるようになる。
ン受容体が所望のレベルまで発現されているトランスジェニック動物を作製する
ための使用に適した構築物全てを含む。これらの構築物には、cDNA、ゲノム配列
、またはその両方が含まれる。所望の配列に加えて、宿主動物において選択され
た配列の発現に適切な構築物の単離およびクローニング方法は、当技術分野にお
いてよく知られている。本構築物には、CD4およびケモカイン受容体のコード配
列以外の配列が含まれてもよく、一つの好ましい態様では、齧歯類動物はHIVタ
ンパク質をコードするHIV配列を少なくとも1つ発現する。加えて、lac Zのよう
なマーカー遺伝子が構築物に含まれてもよく、コードされた配列の発現のアップ
レギュレーションは表現型における変化として容易に検出できるようになる。
【００５４】 「CD4遺伝子」および「ケモカイン受容体遺伝子」という用語は、一般的にヒ
トのCD4遺伝子およびケモカイン受容体遺伝子、例えばこれらのヒト遺伝子のイ
ソ型、変異体、スプライス変異体、突然変異型変異体などを意味するものとして
使われる。これらの用語はまた、特異的なポリペプチドをコードするオープンリ
ーディングフレーム、イントロン、および発現の調節に関わる5'および3'側に隣
接した非コードヌクレオチド配列で、コード領域を越えて最大で約1kbを意味す
るが、どちらか一方向のものでもよい。CD4および／またはケモカイン受容体を
コードするDNA配列は、cDNAもしくはゲノムDNAまたはそれらの断片でもよい。遺
伝子は適当なベクターに導入され、染色体外で維持されるか、または宿主に組み
込まれる。
トのCD4遺伝子およびケモカイン受容体遺伝子、例えばこれらのヒト遺伝子のイ
ソ型、変異体、スプライス変異体、突然変異型変異体などを意味するものとして
使われる。これらの用語はまた、特異的なポリペプチドをコードするオープンリ
ーディングフレーム、イントロン、および発現の調節に関わる5'および3'側に隣
接した非コードヌクレオチド配列で、コード領域を越えて最大で約1kbを意味す
るが、どちらか一方向のものでもよい。CD4および／またはケモカイン受容体を
コードするDNA配列は、cDNAもしくはゲノムDNAまたはそれらの断片でもよい。遺
伝子は適当なベクターに導入され、染色体外で維持されるか、または宿主に組み
込まれる。
【００５５】 特に重要なゲノム配列は、開始コドンと終止コドンとの間にある核酸を含み、
天然の染色体に通常存在するイントロン全てを含む。これらはさらに、成熟mRNA
にある3'および5'側の非翻訳領域を含む。これらは、さらに特異的な転写および
翻訳のための調節領域、例えばプロモーター、エンハンサーなどを含み、また転
写された領域の5'末端または3末端'のどちらかで、約1 kb（それより長いもおも
可能であるが）のフランキングゲノムDNAを含んでもよい。ゲノムDNAは100 kbま
たはそれより小さい断片として単離してもよく、実質的には、染色体のフランキ
ング配列は含まない。
天然の染色体に通常存在するイントロン全てを含む。これらはさらに、成熟mRNA
にある3'および5'側の非翻訳領域を含む。これらは、さらに特異的な転写および
翻訳のための調節領域、例えばプロモーター、エンハンサーなどを含み、また転
写された領域の5'末端または3末端'のどちらかで、約1 kb（それより長いもおも
可能であるが）のフランキングゲノムDNAを含んでもよい。ゲノムDNAは100 kbま
たはそれより小さい断片として単離してもよく、実質的には、染色体のフランキ
ング配列は含まない。
【００５６】 CD4遺伝子の5'領域の配列、ならびにさらに5'上流配列および3'下流配列は、
エンハンサー結合部位を含み、通常CD4が発現されるような組織においてCD4を発
現させるプロモーターのエレメントとして使用してもよい。組織特異的な発現は
天然の発現パターンを模倣するプロモーターを提供するのに役立つ。プロモータ
ー領域で自然に生じる多型は、発現において天然の変異、特に疾病を伴うような
ものを決定するのに有用である。または確立された実験系で、変化を起こしてい
る発現の影響を調べるために、プロモーター領域に突然変異を導入してもよい。
転写因子の結合に関与する特異的なDNAモチーフを同定する方法は、例えば既知
の結合モチーフに対する配列類似性、ゲル遅延解析など、当技術分野において知
られている。例えば、Blackwellら、(1995) Mol Med 1:194-205; Mortlockら、(
1996) Genome Res.6:327-33；ならびにJoulinおよびRichard-Foy (1995)Eur J B
iochem 232:620-626 を参照のこと。
エンハンサー結合部位を含み、通常CD4が発現されるような組織においてCD4を発
現させるプロモーターのエレメントとして使用してもよい。組織特異的な発現は
天然の発現パターンを模倣するプロモーターを提供するのに役立つ。プロモータ
ー領域で自然に生じる多型は、発現において天然の変異、特に疾病を伴うような
ものを決定するのに有用である。または確立された実験系で、変化を起こしてい
る発現の影響を調べるために、プロモーター領域に突然変異を導入してもよい。
転写因子の結合に関与する特異的なDNAモチーフを同定する方法は、例えば既知
の結合モチーフに対する配列類似性、ゲル遅延解析など、当技術分野において知
られている。例えば、Blackwellら、(1995) Mol Med 1:194-205; Mortlockら、(
1996) Genome Res.6:327-33；ならびにJoulinおよびRichard-Foy (1995)Eur J B
iochem 232:620-626 を参照のこと。
【００５７】 本発明で使用された核酸の組成は、適切なヒトCD4およびケモカイン受容体の
全部または一部をコードしてもよい。例えば、これらの遺伝子のヒト-齧歯類動
物キメラは完全長のヒトCD4および/またはケモカイン受容体遺伝子の代わりに使
用してもよい。断片は、従来の方法に従い、化学的にオリゴヌクレオチドを合成
する方法、制限酵素による分解、PCR増幅などによってDNA配列を得てもよい。大
部分において、DNA断片は少なくとも15nt、通常では少なくとも18nt、さらに通
常では少なくとも約50ntであると考えられる。このように小さなDNA断片は、PCR
、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのプライマーとして有用である。
より大きなDNA断片で、100nt以上の大きさのものは、コードされたポリペプチド
の産生に有用である。
全部または一部をコードしてもよい。例えば、これらの遺伝子のヒト-齧歯類動
物キメラは完全長のヒトCD4および/またはケモカイン受容体遺伝子の代わりに使
用してもよい。断片は、従来の方法に従い、化学的にオリゴヌクレオチドを合成
する方法、制限酵素による分解、PCR増幅などによってDNA配列を得てもよい。大
部分において、DNA断片は少なくとも15nt、通常では少なくとも18nt、さらに通
常では少なくとも約50ntであると考えられる。このように小さなDNA断片は、PCR
、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのプライマーとして有用である。
より大きなDNA断片で、100nt以上の大きさのものは、コードされたポリペプチド
の産生に有用である。
【００５８】 ヒトCD4および選択されたヒトケモカイン受容体は、2系統（またはそれ以上）
のトランスジェニック齧歯類動物を作製するために別々に使用されてもよい：ヒ
トCD4受容体のトランスジェニック、および他の選択されたケモカイン受容体の
トランスジェニック。ヒトCD4およびヒトケモカイン受容体の両方を持つ齧歯類
動物のトランスジェニックを作製するために、2つの系統を交配させることがで
きる。または、ヒトCD4および選択されたケモカイン受容体の両方を持つトラン
スジェニック齧歯類動物を作製するために、ヒトCD4および選択されたケモカイ
ン受容体は、同一ベクターの一部分もしくは別々のベクター上のいずれかとして
、同一の齧歯類動物の胚もしくはES細胞中に導入してもよい。
のトランスジェニック齧歯類動物を作製するために別々に使用されてもよい：ヒ
トCD4受容体のトランスジェニック、および他の選択されたケモカイン受容体の
トランスジェニック。ヒトCD4およびヒトケモカイン受容体の両方を持つ齧歯類
動物のトランスジェニックを作製するために、2つの系統を交配させることがで
きる。または、ヒトCD4および選択されたケモカイン受容体の両方を持つトラン
スジェニック齧歯類動物を作製するために、ヒトCD4および選択されたケモカイ
ン受容体は、同一ベクターの一部分もしくは別々のベクター上のいずれかとして
、同一の齧歯類動物の胚もしくはES細胞中に導入してもよい。
【００５９】 本発明のトランスジェニック齧歯類動物を産生するために使用されたヒトCD4
およびヒトケモカイン受容体の核酸配列は、適切なヒトCD4受容体もしくはヒト
ケモカイン受容体の全部、または一部をコードしていてもよい。好ましくは、CD
4および選択されたケモカイン受容体のコード配列は、トランスジェニック齧歯
類動物の細胞内へHIVが侵入するのに十分な領域を含む。例として、CD4のコード
配列領域は、CD4タンパク質の細胞外領域であるD1-D4ドメインを含み、且つ選択
されたケモカイン受容体のコード配列領域は、アミノ末端、細胞外結合部位、お
よび/または膜貫通ドメイン領域をコードする部分を含んでいてもよい。
およびヒトケモカイン受容体の核酸配列は、適切なヒトCD4受容体もしくはヒト
ケモカイン受容体の全部、または一部をコードしていてもよい。好ましくは、CD
4および選択されたケモカイン受容体のコード配列は、トランスジェニック齧歯
類動物の細胞内へHIVが侵入するのに十分な領域を含む。例として、CD4のコード
配列領域は、CD4タンパク質の細胞外領域であるD1-D4ドメインを含み、且つ選択
されたケモカイン受容体のコード配列領域は、アミノ末端、細胞外結合部位、お
よび/または膜貫通ドメイン領域をコードする部分を含んでいてもよい。
【００６０】 ヒトCD4および選択されたケモカイン受容体のコード配列の一部または断片は
、従来の方法に従ったオリゴヌクレオチドの化学的合成、制限酵素による切断、
PCR増幅法などにより得られる。導入されたコード配列、またはそれらの一部は
、野生型遺伝子、自然に生じる多型、または遺伝的に操作された配列（コード領
域あるいは非コード領域における欠失、置換あるいは挿入など）に由来するもの
でもよい。切断されたり、あるいは改変（例えば、突然変異）されたヒトCD4あ
るいはケモカイン受容体をコードする配列も、重要である。
、従来の方法に従ったオリゴヌクレオチドの化学的合成、制限酵素による切断、
PCR増幅法などにより得られる。導入されたコード配列、またはそれらの一部は
、野生型遺伝子、自然に生じる多型、または遺伝的に操作された配列（コード領
域あるいは非コード領域における欠失、置換あるいは挿入など）に由来するもの
でもよい。切断されたり、あるいは改変（例えば、突然変異）されたヒトCD4あ
るいはケモカイン受容体をコードする配列も、重要である。
【００６１】 本発明で使用するのに適したベクターは、CD4またはケモカイン受容体をコー
ドする核酸配列に、少なくとも1つの発現制御エレメントを操作可能に結合させ
たものを含む。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御、調節するための
ベクターの中に挿入される。発現制御エレメントの例としては、lacシステム、
ラムダファージのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、な
らびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、またはSV40に由来するプ
ロモーターを含むが、これらに限定されることはない。ベクターはさらに別のオ
ペレーションエレメントからなり、これにはリーダー配列、終止コドン、ポリア
デニル化シグナル、ならびにCD4もしくは選択されたケモカイン受容体をコード
する核酸配列の適切な転写および/もしくは翻訳に必要な、または好ましいその
他の配列すべてを含むが、これに限定されることはない。
ドする核酸配列に、少なくとも1つの発現制御エレメントを操作可能に結合させ
たものを含む。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御、調節するための
ベクターの中に挿入される。発現制御エレメントの例としては、lacシステム、
ラムダファージのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、な
らびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、またはSV40に由来するプ
ロモーターを含むが、これらに限定されることはない。ベクターはさらに別のオ
ペレーションエレメントからなり、これにはリーダー配列、終止コドン、ポリア
デニル化シグナル、ならびにCD4もしくは選択されたケモカイン受容体をコード
する核酸配列の適切な転写および/もしくは翻訳に必要な、または好ましいその
他の配列すべてを含むが、これに限定されることはない。
【００６２】 このようなベクターは、従来の方法論 （Sambrookら(編) (1989), 「分子クロ
ーニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」 C
old Spring Harbor Press, Plainview, New York; Ausubel ら(編) (1987) 「分
子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」Jh
on Wiley and Sons, New York, New York） を参照のこと）を用いて構成される
か、または市販されていることが、当業者に理解されると思われる。
ーニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」 C
old Spring Harbor Press, Plainview, New York; Ausubel ら(編) (1987) 「分
子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」Jh
on Wiley and Sons, New York, New York） を参照のこと）を用いて構成される
か、または市販されていることが、当業者に理解されると思われる。
【００６３】 いくつかの態様においては、ヒトに本来存在する発現パターンを模倣してい
るヒトCD4および選択されたケモカイン受容体が、組織中で発現することが好ま
しい。特異的な発現パターンは、ヒトCD4または選択されたケモカイン受容体を
コードしている核酸を誘導プロモーターもしくは発生調節プロモーターの制御下
、または組織特異的プロモーターもしくは細胞タイプに特異的なプロモーター(
例えば、リンパ球特異的プロモーター)の制御下に配置することで達成されうる
。例として、特異的な発現パターンは、ヒトCD4および選択されたケモカイン受
容体のゲノム配列を利用することで達成されうる。
るヒトCD4および選択されたケモカイン受容体が、組織中で発現することが好ま
しい。特異的な発現パターンは、ヒトCD4または選択されたケモカイン受容体を
コードしている核酸を誘導プロモーターもしくは発生調節プロモーターの制御下
、または組織特異的プロモーターもしくは細胞タイプに特異的なプロモーター(
例えば、リンパ球特異的プロモーター)の制御下に配置することで達成されうる
。例として、特異的な発現パターンは、ヒトCD4および選択されたケモカイン受
容体のゲノム配列を利用することで達成されうる。
【００６４】 CD4をコードする構築物は、野生型のCD4コード配列、またはCD4の突然変異型
、特にヒトにおけるHIVの宿主特異性を変化させるようなものを含むことができ
る。同様に、特異的なケモカイン受容体をコードする構築物は、野生型のケモカ
イン受容体コード配列、または改変されたケモカイン受容体のコード配列を含む
ことができる。望ましくは、フランキングプロモーター領域およびコード領域を
含むCD4および/またはケモカイン受容体の配列は、コードされたタンパク質の配
列における標的化された変化、およびスプライス変異体の産生などを引き起こす
ために、当技術分野で周知の様々な方法で突然変異を行ってもよい。配列の変化
は、置換、挿入、または欠失であってもよい。欠失は、ドメインまたはエクソン
の欠失のような大規模な変化を含みうる。関心対象となるその他の修飾には、FL
AGシステム、HAなどを用いたエピトープタギング（epitope tagging）が含まれ
る。細胞内の局在を検討するために、緑色蛍光タンパク質（GFP)を利用してもよ
い。このように突然変異した遺伝子は、CD4および別のケモカイン受容体の構造-
機能の関係を研究するため、またはこれらの機能もしくは制御に作用するタンパ
ク質の特性を変化させるために使用されうる。
、特にヒトにおけるHIVの宿主特異性を変化させるようなものを含むことができ
る。同様に、特異的なケモカイン受容体をコードする構築物は、野生型のケモカ
イン受容体コード配列、または改変されたケモカイン受容体のコード配列を含む
ことができる。望ましくは、フランキングプロモーター領域およびコード領域を
含むCD4および/またはケモカイン受容体の配列は、コードされたタンパク質の配
列における標的化された変化、およびスプライス変異体の産生などを引き起こす
ために、当技術分野で周知の様々な方法で突然変異を行ってもよい。配列の変化
は、置換、挿入、または欠失であってもよい。欠失は、ドメインまたはエクソン
の欠失のような大規模な変化を含みうる。関心対象となるその他の修飾には、FL
AGシステム、HAなどを用いたエピトープタギング（epitope tagging）が含まれ
る。細胞内の局在を検討するために、緑色蛍光タンパク質（GFP)を利用してもよ
い。このように突然変異した遺伝子は、CD4および別のケモカイン受容体の構造-
機能の関係を研究するため、またはこれらの機能もしくは制御に作用するタンパ
ク質の特性を変化させるために使用されうる。
【００６５】 インビトロにおける、クローン化された遺伝子の変異誘発技術が既知である。
突然変異を調査するためのプロトコルの例としては、ガスティン（Gustin）ら、
1993 Biotechniques 14:22;バーラリー（Barany）, 1985 Gene 37:111-23;コリ
ースリー（Colicelli）ら、1985 Mol Gen Genet 199:537-9;およびプレンティキ
ー（Prentki）ら、1984 Gene 29:303-13.で見出すことができる。部位特異的な
突然変異誘発の方法は、サムブルック（Sambrook）ら、1989「分子クローニング
：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, CSH Pres
s, pp.15.3-15.108; ウェイナー（Weiner）ら、1993 Gene 126:35-41; セイラー
（Sayers）ら、1992 Biotechniques 13:592-6;ジョーンズ（Jones）およびウィ
ニストルファー（Winistorfer）, 1992 Biotechniques 12:528-30;バートン（Ba
rton）ら、1990 Nucleic Acids Res 18:7349-55;マロッティ（Marotti）および
トミッチ（Tomich）, 1989 Gene Anal Tech 6:67-70;およびズー（Zhu）、1989
Anal Biochem 177:120-4.において見出すことができる。
突然変異を調査するためのプロトコルの例としては、ガスティン（Gustin）ら、
1993 Biotechniques 14:22;バーラリー（Barany）, 1985 Gene 37:111-23;コリ
ースリー（Colicelli）ら、1985 Mol Gen Genet 199:537-9;およびプレンティキ
ー（Prentki）ら、1984 Gene 29:303-13.で見出すことができる。部位特異的な
突然変異誘発の方法は、サムブルック（Sambrook）ら、1989「分子クローニング
：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, CSH Pres
s, pp.15.3-15.108; ウェイナー（Weiner）ら、1993 Gene 126:35-41; セイラー
（Sayers）ら、1992 Biotechniques 13:592-6;ジョーンズ（Jones）およびウィ
ニストルファー（Winistorfer）, 1992 Biotechniques 12:528-30;バートン（Ba
rton）ら、1990 Nucleic Acids Res 18:7349-55;マロッティ（Marotti）および
トミッチ（Tomich）, 1989 Gene Anal Tech 6:67-70;およびズー（Zhu）、1989
Anal Biochem 177:120-4.において見出すことができる。
【００６６】 本発明のトランスジェニック動物を産生するための使用に適するCD4遺伝子、
各種のケモカイン受容体遺伝子、およびその代表的な誘導体を以下に記載する。
各種のケモカイン受容体遺伝子、およびその代表的な誘導体を以下に記載する。
【００６７】ケモカイン受容体 本発明による二遺伝子型（bigenic）動物へ導入されたケモカイン受容体-コー
ド配列は、当技術分野において周知である、任意のケモカイン受容体であっても
よく、研究されているHIV株によって部分的に選択されたものであってもよい。
本発明のトランスジェニック齧歯類動物を作製するために使用される霊長類ケモ
カイン受容体の例としては、CCR3、CCR5、CCR2B、CXCR4、CCR8、GPRL15、STRL33
、APJおよびLTB4を含むが、これらに限定されることはない。当業者は、CD4受容
体と関連して使用されるケモカイン受容体の選択が、細胞の指向性および本発明
のトランスジェニック齧歯類動物への感染に使用されるHIV株のケモカイン受容
体の選択性に一部依存することを理解すると思われる。例えば、マクロファージ
指向性非多核性を導入したHIV-1単離株が使用される場合には、選択的ケモカイ
ン受容体はCCR5になる(例えば、Huangら、(1996) Nature Medicine 2: 1240-124
3を参照のこと)。いくつかのケモカイン受容体配列が単離、クローン化され、配
列が決定されている。表1に本発明で使用するのに適当と思われるケモカイン受
容体配列のリストの一部と、このような配列に関係するゲンバンクアセッション
番号を示す。
ド配列は、当技術分野において周知である、任意のケモカイン受容体であっても
よく、研究されているHIV株によって部分的に選択されたものであってもよい。
本発明のトランスジェニック齧歯類動物を作製するために使用される霊長類ケモ
カイン受容体の例としては、CCR3、CCR5、CCR2B、CXCR4、CCR8、GPRL15、STRL33
、APJおよびLTB4を含むが、これらに限定されることはない。当業者は、CD4受容
体と関連して使用されるケモカイン受容体の選択が、細胞の指向性および本発明
のトランスジェニック齧歯類動物への感染に使用されるHIV株のケモカイン受容
体の選択性に一部依存することを理解すると思われる。例えば、マクロファージ
指向性非多核性を導入したHIV-1単離株が使用される場合には、選択的ケモカイ
ン受容体はCCR5になる(例えば、Huangら、(1996) Nature Medicine 2: 1240-124
3を参照のこと)。いくつかのケモカイン受容体配列が単離、クローン化され、配
列が決定されている。表1に本発明で使用するのに適当と思われるケモカイン受
容体配列のリストの一部と、このような配列に関係するゲンバンクアセッション
番号を示す。
【表１】 ケモカイン受容体配列
【００６８】 ヒトケモカイン受容体をコードする導入遺伝子は、好ましくは生物活性を有す
るペプチドのようなポリペプチドの発現および分泌を提供するべきである。宿主
動物におけるケモカイン受容体の発現は、構成的なもの、または誘導的なものの
いずれかでありうる。外因性ヒトケモカイン受容体の発現は、全身性、または組
織特異的であってもよく、好ましくは組織特異的なものである(例えば、ヒトケ
モカイン受容体の発現は、実質的にはT-細胞および/またはマクロファージに特
異的である)。
るペプチドのようなポリペプチドの発現および分泌を提供するべきである。宿主
動物におけるケモカイン受容体の発現は、構成的なもの、または誘導的なものの
いずれかでありうる。外因性ヒトケモカイン受容体の発現は、全身性、または組
織特異的であってもよく、好ましくは組織特異的なものである(例えば、ヒトケ
モカイン受容体の発現は、実質的にはT-細胞および/またはマクロファージに特
異的である)。
【００６９】 ケモカイン受容体をコードする配列は、融合タンパク質として提供されてもよ
い。ケモカイン受容体構築物の産生方法は、当技術分野においては周知である(
例えば、R. E. Atchisonら、Science 274:1924-6 (1996)を参照のこと)。
い。ケモカイン受容体構築物の産生方法は、当技術分野においては周知である(
例えば、R. E. Atchisonら、Science 274:1924-6 (1996)を参照のこと)。
【００７０】CD4遺伝子およびその誘導体 ヒトCD4受容体またはヒトケモカイン受容体をコードする核酸配列はcDNAもし
くはゲノムDNAまたはそれらの断片であってもよい。当技術分野において公知で
あるヒトCD4の配列を当技術分野において公知の齧歯類CD4遺伝子と共に使用して
、齧歯類モデルにおけるHIVの感染を可能にするキメラヒト/齧歯類導入遺伝子を
作製することもできる。表2に、本発明の導入遺伝子を作製する際に有用なヒト
およびマウスCD4配列のリストを提供し、掲載されているCD4配列に関するジーン
バンク(Genbank)アクセッション番号を提供する。
くはゲノムDNAまたはそれらの断片であってもよい。当技術分野において公知で
あるヒトCD4の配列を当技術分野において公知の齧歯類CD4遺伝子と共に使用して
、齧歯類モデルにおけるHIVの感染を可能にするキメラヒト/齧歯類導入遺伝子を
作製することもできる。表2に、本発明の導入遺伝子を作製する際に有用なヒト
およびマウスCD4配列のリストを提供し、掲載されているCD4配列に関するジーン
バンク(Genbank)アクセッション番号を提供する。
【表２】 ヒトおよびマウスCD4配列
【００７１】他のヒト遺伝子 数多くの他のヒトタンパク質がHIV感染、発病、複製等に関与していることが
知られている。本発明の二遺伝子型動物は、HIVが細胞に感染し、複製するなど
の能力を増強することができる追加のヒト遺伝子を保有することができる。好ま
しい一態様において、本発明のトランスジェニック齧歯類動物は、HIV転写およ
び/またはウイルスタンパク質生産に関与するタンパク質をコードするヒト遺伝
子を安定的に伝播している。例えば、CDK9キナーゼ、サイクリンTおよび他の関
連する因子を含む数多くのサブユニットからなるヒト転写延長因子P-TEFbは、P-
TEFbを枯渇させたHeLa核抽出物においてTatと相互作用してTat活性を回復させる
ことが報告されている。ゾウ(Zhou Q)ら、EMBO J., 17: 3681-91(1998)。1つ以
上のヒトサブユニットを保有する齧歯類動物はインビボにおいてHIV複製を増強
することができる。
知られている。本発明の二遺伝子型動物は、HIVが細胞に感染し、複製するなど
の能力を増強することができる追加のヒト遺伝子を保有することができる。好ま
しい一態様において、本発明のトランスジェニック齧歯類動物は、HIV転写およ
び/またはウイルスタンパク質生産に関与するタンパク質をコードするヒト遺伝
子を安定的に伝播している。例えば、CDK9キナーゼ、サイクリンTおよび他の関
連する因子を含む数多くのサブユニットからなるヒト転写延長因子P-TEFbは、P-
TEFbを枯渇させたHeLa核抽出物においてTatと相互作用してTat活性を回復させる
ことが報告されている。ゾウ(Zhou Q)ら、EMBO J., 17: 3681-91(1998)。1つ以
上のヒトサブユニットを保有する齧歯類動物はインビボにおいてHIV複製を増強
することができる。
【００７２】 ヒトサイクリンT、87 kDaサイクリンC-関連タンパク質はHIV Tatのトランス活
性化ドメインと特異的に相互作用する。TatのサイクリンTとの相互作用はTat: T
AR RNA相互作用の親和性および特異性を強力に増強し、TARのループ中のTat単独
によって認識されない配列の要件を付与する。ヒトサイクリンTの過剰発現は非
許容的な齧歯類細胞においてTat活性を救済することが報告されている(Wei P.ら
、Cell, 92:451-62(1998))。好ましい態様において、ヒトサイクリンT遺伝子は
本発明の二遺伝子型齧歯類のゲノムに安定的に伝播される。
性化ドメインと特異的に相互作用する。TatのサイクリンTとの相互作用はTat: T
AR RNA相互作用の親和性および特異性を強力に増強し、TARのループ中のTat単独
によって認識されない配列の要件を付与する。ヒトサイクリンTの過剰発現は非
許容的な齧歯類細胞においてTat活性を救済することが報告されている(Wei P.ら
、Cell, 92:451-62(1998))。好ましい態様において、ヒトサイクリンT遺伝子は
本発明の二遺伝子型齧歯類のゲノムに安定的に伝播される。
【００７３】トランスジェニック動物の生産方法 ランダム導入のためのDNA構築物には、組換えを仲介する相同領域を必ずしも
含まなくてもよい。相同組換えが望ましい場合には、DNA構築物は望ましい遺伝
子改変を有する標的遺伝子の少なくとも一部を含み、標的遺伝子座と相同な領域
を含む。陽性および陰性選択のためのマーカーを含めることが好都合である。相
同組換えによって標的遺伝子に改変を有する細胞を作製するための方法は当技術
分野で公知である。哺乳動物のトランスフェクションのための種々の技法につい
ては、ケオウン（Keown）ら（1990）、Methods in Enzymology 185：527〜537を
参照されたい。
含まなくてもよい。相同組換えが望ましい場合には、DNA構築物は望ましい遺伝
子改変を有する標的遺伝子の少なくとも一部を含み、標的遺伝子座と相同な領域
を含む。陽性および陰性選択のためのマーカーを含めることが好都合である。相
同組換えによって標的遺伝子に改変を有する細胞を作製するための方法は当技術
分野で公知である。哺乳動物のトランスフェクションのための種々の技法につい
ては、ケオウン（Keown）ら（1990）、Methods in Enzymology 185：527〜537を
参照されたい。
【００７４】 胚性幹（ES）細胞については、ES細胞系を用いてもよく、マウス、ラット、ハ
ムスターなどの宿主から胚細胞を新たに採取してもよい。この種の細胞は、適切
な線維芽細胞フィーダー層上で増殖させるか、白血球抑制因子（LIF）などの適
切な増殖因子の存在下で増殖させる。
ムスターなどの宿主から胚細胞を新たに採取してもよい。この種の細胞は、適切
な線維芽細胞フィーダー層上で増殖させるか、白血球抑制因子（LIF）などの適
切な増殖因子の存在下で増殖させる。
【００７５】 胚細胞または齧歯類ES細胞が、ヒトCD4または選択されたケモカイン受容体の
どちらかの全てまたは一部をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換され
う手段として、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入
、トランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは当業者に
公知の他の方法が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい手段にはマイ
クロインジェクションおよびエレクトロポレーションが挙げられる。哺乳類細胞
を形質転換するための種々の技術については、ケオウン(Keown)ら、(1990) Meth
ods in Enzymology 185: 527-537を参照のこと。
どちらかの全てまたは一部をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換され
う手段として、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入
、トランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは当業者に
公知の他の方法が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい手段にはマイ
クロインジェクションおよびエレクトロポレーションが挙げられる。哺乳類細胞
を形質転換するための種々の技術については、ケオウン(Keown)ら、(1990) Meth
ods in Enzymology 185: 527-537を参照のこと。
【００７６】 形質転換の後に、細胞を適切な培地中にあるフィーダー層上に播く。構築物を
含む細胞は、選択培地を用いることによって検出しうる。コロニーが増殖するま
で十分な時間をおいた後、それらを摘出し、相同組換えまたは構築物の組み込み
の発生に関して分析する。続いて、陽性のコロニーを胚操作および胚盤胞への注
入のために用いる。胚盤胞は4〜6週齢の過排卵性の雌から採取する。ES細胞をト
リプシン処理し、改変された細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞
を偽妊娠させた雌の各々の子宮角に戻す。その後、雌を出産させ、この結果得ら
れた同腹仔を、構築物を有する変異細胞の有無に関してスクリーニングする。胚
盤胞およびES細胞に異なる表現型を与えることにより、キメラ型の子孫を容易に
検出することができる。
含む細胞は、選択培地を用いることによって検出しうる。コロニーが増殖するま
で十分な時間をおいた後、それらを摘出し、相同組換えまたは構築物の組み込み
の発生に関して分析する。続いて、陽性のコロニーを胚操作および胚盤胞への注
入のために用いる。胚盤胞は4〜6週齢の過排卵性の雌から採取する。ES細胞をト
リプシン処理し、改変された細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞
を偽妊娠させた雌の各々の子宮角に戻す。その後、雌を出産させ、この結果得ら
れた同腹仔を、構築物を有する変異細胞の有無に関してスクリーニングする。胚
盤胞およびES細胞に異なる表現型を与えることにより、キメラ型の子孫を容易に
検出することができる。
【００７７】 キメラ動物を改変遺伝子の有無に関してスクリーニングし、改変を有する雄お
よび雌を交配させてホモ接合型の子孫を得る。遺伝子の変化によって発生中の何
らかの時点で致死性が生じる場合には、組織または器官を同種異系もしくはコン
ジェニック系グラフトまたは移植片として、またはインビトロ培養系において維
持することができる。
よび雌を交配させてホモ接合型の子孫を得る。遺伝子の変化によって発生中の何
らかの時点で致死性が生じる場合には、組織または器官を同種異系もしくはコン
ジェニック系グラフトまたは移植片として、またはインビトロ培養系において維
持することができる。
【００７８】 二遺伝子型ヒトCD4/ケモカイン受容体動物が望ましい場合には、好ましくは、
当技術分野において周知の方法により、単一トランスジェニックヒトCD4動物を
単一トランスジェニックケモカイン受容体動物と交雑し、二遺伝子型動物を同定
することによって、ラットを作製する。
当技術分野において周知の方法により、単一トランスジェニックヒトCD4動物を
単一トランスジェニックケモカイン受容体動物と交雑し、二遺伝子型動物を同定
することによって、ラットを作製する。
【００７９】薬物スクリーニング解析 本トランスジェニック動物またはそれに由来する細胞の使用により、HIV感染
に関連した現象、例えば、ウイルスの細胞への付着、ウイルスの組み込み、ウイ
ルスの複製、T細胞欠乏、関連する日和見感染症、癌への変質などを調節するリ
ガンドまたは基質を同定することができる。特に関心がもたれるのは、ヒト細胞
に対する毒性の低い作用物質に関するスクリーニング解析である。
に関連した現象、例えば、ウイルスの細胞への付着、ウイルスの組み込み、ウイ
ルスの複製、T細胞欠乏、関連する日和見感染症、癌への変質などを調節するリ
ガンドまたは基質を同定することができる。特に関心がもたれるのは、ヒト細胞
に対する毒性の低い作用物質に関するスクリーニング解析である。
【００８０】 この目的のためには、行動学的試験、投与後の薬物の局在の決定、アミロイド
沈着検出のためのイムノアッセイなどを含む、非常に多岐にわたるアッセイ法を
用いうる。個々のアッセイ法に応じて、動物全体またはそれに由来する細胞を用
いることができる。細胞は新たに単離されたものでもよく、培養物として不死化
されたものでもよい。特に関心対象の細胞は、免疫細胞である。
沈着検出のためのイムノアッセイなどを含む、非常に多岐にわたるアッセイ法を
用いうる。個々のアッセイ法に応じて、動物全体またはそれに由来する細胞を用
いることができる。細胞は新たに単離されたものでもよく、培養物として不死化
されたものでもよい。特に関心対象の細胞は、免疫細胞である。
【００８１】 本明細書において使用する「薬剤（agent）」という用語は、HIV感染に関連す
る分子的現象および臨床的現象を予防または抑制する能力を有する例えば、タン
パク質、小分子または医薬品のような任意の分子を指す。これには、HIV-関連現
象を予防、治療および/または改善することができる、ワクチンを含む薬剤が挙
げられる。一般には、種々の濃度に対する異なる反応を得るために、さまざまな
作用物質の濃度により複数のアッセイ混合物を並行して処理する。典型的には、
これらの濃度のうち1つが陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満
のものとして役立つ。
る分子的現象および臨床的現象を予防または抑制する能力を有する例えば、タン
パク質、小分子または医薬品のような任意の分子を指す。これには、HIV-関連現
象を予防、治療および/または改善することができる、ワクチンを含む薬剤が挙
げられる。一般には、種々の濃度に対する異なる反応を得るために、さまざまな
作用物質の濃度により複数のアッセイ混合物を並行して処理する。典型的には、
これらの濃度のうち1つが陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満
のものとして役立つ。
【００８２】 候補作用物質には多数の化学的分類が含まれるが、典型的にはそれらは有機分
子、好ましくは分子量が50を上回って約2,500ダルトン未満である低分子有機化
合物である。候補作用物質は、蛋白質との構造的相互作用、特に水素結合に必要
な官能基を含み、典型的には少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシ
ルまたはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基のうち少なくとも2つ
を含む。候補作用物質はしばしば、上記の官能基の1つまたは複数が置換された
形で環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構
造を含む。また、候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリ
ン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを非制限的に含
む生体分子からも見出される。
子、好ましくは分子量が50を上回って約2,500ダルトン未満である低分子有機化
合物である。候補作用物質は、蛋白質との構造的相互作用、特に水素結合に必要
な官能基を含み、典型的には少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシ
ルまたはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基のうち少なくとも2つ
を含む。候補作用物質はしばしば、上記の官能基の1つまたは複数が置換された
形で環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構
造を含む。また、候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリ
ン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを非制限的に含
む生体分子からも見出される。
【００８３】 候補作用物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、非常に多岐に
わたる源から入手しうる。例えば、非常に多岐にわたる有機化合物および生体分
子のランダムおよび定方向（directed）合成には、ランダム化されたオリゴヌク
レオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む多数の手段を用いることができる。
または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラ
リーが入手可能であり、または容易に作製しうる。さらに、天然または合成的に
作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的
手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために
用いることもできる。既知の薬理作用物質に対して、構造的類似体を作製するた
めにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（amidification）などの定
方向性またはランダムな化学修飾を行ってもよい。
わたる源から入手しうる。例えば、非常に多岐にわたる有機化合物および生体分
子のランダムおよび定方向（directed）合成には、ランダム化されたオリゴヌク
レオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む多数の手段を用いることができる。
または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラ
リーが入手可能であり、または容易に作製しうる。さらに、天然または合成的に
作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的
手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために
用いることもできる。既知の薬理作用物質に対して、構造的類似体を作製するた
めにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（amidification）などの定
方向性またはランダムな化学修飾を行ってもよい。
【００８４】 薬理活性をもつ既知の化合物およびその化学的類似体に対して、スクリーニン
グを行うことができる。
グを行うことができる。
【００８５】 望ましい結果を得るために、薬剤を送達するのに望ましいおよび/または適当
な任意の方法で候補薬剤を投与することができる。例えば、候補薬剤は注射（例
えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または望ましい効果が達成される予定
の組織内への直接注射）、経口または任意の他の望ましい手段によって投与する
ことができる。通常、インビボスクリーンは、候補薬剤の量および濃度を変えて
（薬剤を含有しないものから動物への送達を成功させることができる量の上限ま
での薬剤量まで）数多くの動物に投与することを伴い、異なる剤形での薬剤の送
達を含むことができる。薬剤は単独で投与しても、特に薬剤の併用投与が相乗効
果を生じる場合には、2種以上を組み合わせて併用してもよい。薬剤投与がトラ
ンスジェニック齧歯類動物に与える影響は従来の方法によってモニターすること
ができる。
な任意の方法で候補薬剤を投与することができる。例えば、候補薬剤は注射（例
えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または望ましい効果が達成される予定
の組織内への直接注射）、経口または任意の他の望ましい手段によって投与する
ことができる。通常、インビボスクリーンは、候補薬剤の量および濃度を変えて
（薬剤を含有しないものから動物への送達を成功させることができる量の上限ま
での薬剤量まで）数多くの動物に投与することを伴い、異なる剤形での薬剤の送
達を含むことができる。薬剤は単独で投与しても、特に薬剤の併用投与が相乗効
果を生じる場合には、2種以上を組み合わせて併用してもよい。薬剤投与がトラ
ンスジェニック齧歯類動物に与える影響は従来の方法によってモニターすること
ができる。
【００８６】 本発明のトランスジェニック齧歯類動物または齧歯類細胞を使用して、感染性
、すなわち、HIVの侵入に対する細胞の許容性を検討することもできる。例えば
、本発明のトランスジェニック齧歯類動物または齧歯類細胞は、野生型ウイルス
株および弱毒化ウイルス株に関する比較検討、または異なる単離株間の比較研究
を実施する便利な手段を提供する。適当な数のトランスジェニック細胞または動
物に選択した弱毒化株または単離株を感染させた後、代表的なHIV株、好ましく
はHIV-1またはHIV-2による感染と比較した感染の影響に関する測定を実施する（
例えば、組織学、種々の細胞サブセットの生存性、薬剤に対する応答、ウイルス
の複製等）。比較検討は、代表的なHIVと比較して、弱毒化株または新規単離株
によってどのくらいの損傷が生じるかを測定するのに有用である。
、すなわち、HIVの侵入に対する細胞の許容性を検討することもできる。例えば
、本発明のトランスジェニック齧歯類動物または齧歯類細胞は、野生型ウイルス
株および弱毒化ウイルス株に関する比較検討、または異なる単離株間の比較研究
を実施する便利な手段を提供する。適当な数のトランスジェニック細胞または動
物に選択した弱毒化株または単離株を感染させた後、代表的なHIV株、好ましく
はHIV-1またはHIV-2による感染と比較した感染の影響に関する測定を実施する（
例えば、組織学、種々の細胞サブセットの生存性、薬剤に対する応答、ウイルス
の複製等）。比較検討は、代表的なHIVと比較して、弱毒化株または新規単離株
によってどのくらいの損傷が生じるかを測定するのに有用である。
【００８７】 選択したHIV配列および他のウイルス配列を含有するキメラウイルスは、広域
的な目的、すなわち本質的にHIV自身を使用してもよいと思われる全てのことの
ために、トランスジェニック動物におけるHIVの代用として有用である。このよ
うなキメラは、ある種の望ましい特徴を提供することによって、例えばトランス
ジェニック齧歯類動物により高いウイルスレベルを提供することによって、代用
として特に有用となりうる。
的な目的、すなわち本質的にHIV自身を使用してもよいと思われる全てのことの
ために、トランスジェニック動物におけるHIVの代用として有用である。このよ
うなキメラは、ある種の望ましい特徴を提供することによって、例えばトランス
ジェニック齧歯類動物により高いウイルスレベルを提供することによって、代用
として特に有用となりうる。
【００８８】 例えば、トランスジェニック齧歯類動物にキメラウイルス構築物を感染させる
ことを使用して、選択したHIV配列および他の非-HIVウイルス配列を含有するキ
メラウイルスを齧歯類動物に感染させることによって、HIVの感染性および/また
は病原性に関与するHIV領域を同定することができる。ある種のHIV配列を選択し
、これらの配列を他のウイルス配列と組み合わせることによって、選択したHIV
配列がヒト細胞において特異的に感染および複製を仲介する能力を検討すること
ができる。これにより、ワクチンなどの治療薬を設計するための有益な情報が得
られ、その結果薬剤はウイルスの過程において重要であると同定されるHIV配列
を標的とするように設計することができる。
ことを使用して、選択したHIV配列および他の非-HIVウイルス配列を含有するキ
メラウイルスを齧歯類動物に感染させることによって、HIVの感染性および/また
は病原性に関与するHIV領域を同定することができる。ある種のHIV配列を選択し
、これらの配列を他のウイルス配列と組み合わせることによって、選択したHIV
配列がヒト細胞において特異的に感染および複製を仲介する能力を検討すること
ができる。これにより、ワクチンなどの治療薬を設計するための有益な情報が得
られ、その結果薬剤はウイルスの過程において重要であると同定されるHIV配列
を標的とするように設計することができる。
【００８９】 別の実施例において、キメラウイルスは、キメラHIVウイルスを感染させたト
ランスジェニック齧歯類動物に薬剤を投与することによって、HIVに感染したヒ
ト被験者に対する薬剤の予測される影響を測定するための代用とすることができ
る。候補薬剤に対する齧歯類動物の応答は、キメラウイルスのHIV配列に対して
設計された治療薬に対するヒト被験者の応答の予測となりうる。
ランスジェニック齧歯類動物に薬剤を投与することによって、HIVに感染したヒ
ト被験者に対する薬剤の予測される影響を測定するための代用とすることができ
る。候補薬剤に対する齧歯類動物の応答は、キメラウイルスのHIV配列に対して
設計された治療薬に対するヒト被験者の応答の予測となりうる。
【００９０】 本発明はまた、ゲノムにヒトCD4受容体およびヒトケモカイン受容体が組み込
まれているトランスジェニック齧歯類細胞に関する。本発明のトランスジェニッ
ク齧歯類細胞は、HIVによる感染に感受性であり、HIVの構造遺伝子を発現するこ
とができることによって特徴付けられる。本発明のトランスジェニック齧歯類細
胞は、任意の属の齧歯類、好ましくはハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス
）、クマネズミ属（Rattus）（例えば、ラット）およびシリアンハムスター属（
Mesocricetus）（例えば、ハムスター）からなる群より選択される属の齧歯類か
ら選択することができる。より好ましくは、齧歯類細胞はラットまたはマウスの
細胞である。トランスジェニック齧歯類細胞は、トランスジェニック齧歯類の作
製について上述されているものと同じヒトCD4およびヒトケモカイン受容体のコ
ード配列、同じベクターおよび同じ形質転換手段を使用して作製することができ
る。使用することができる齧歯類細胞の例には、ラットES細胞、マウスES-D3細
胞（ATCC（登録商標） No. CRL-1934）、マウスES-E14TG2a細胞（ATCC（登録商
標） No. CRL-1821）、マウスSCC-PSA1細胞（ATCC（登録商標） No. CRL-1535）
、ラット-2細胞（ATCC（登録商標） No. CRL-1764）等が挙げられるが、それら
に限定されない。
まれているトランスジェニック齧歯類細胞に関する。本発明のトランスジェニッ
ク齧歯類細胞は、HIVによる感染に感受性であり、HIVの構造遺伝子を発現するこ
とができることによって特徴付けられる。本発明のトランスジェニック齧歯類細
胞は、任意の属の齧歯類、好ましくはハツカネズミ属（Mus）（例えば、マウス
）、クマネズミ属（Rattus）（例えば、ラット）およびシリアンハムスター属（
Mesocricetus）（例えば、ハムスター）からなる群より選択される属の齧歯類か
ら選択することができる。より好ましくは、齧歯類細胞はラットまたはマウスの
細胞である。トランスジェニック齧歯類細胞は、トランスジェニック齧歯類の作
製について上述されているものと同じヒトCD4およびヒトケモカイン受容体のコ
ード配列、同じベクターおよび同じ形質転換手段を使用して作製することができ
る。使用することができる齧歯類細胞の例には、ラットES細胞、マウスES-D3細
胞（ATCC（登録商標） No. CRL-1934）、マウスES-E14TG2a細胞（ATCC（登録商
標） No. CRL-1821）、マウスSCC-PSA1細胞（ATCC（登録商標） No. CRL-1535）
、ラット-2細胞（ATCC（登録商標） No. CRL-1764）等が挙げられるが、それら
に限定されない。
【００９１】 本発明のトランスジェニック細胞はまた、HIV感染、HIV複製およびHIV病原性
に関する検討並びに抗ウイルス療法の候補薬剤のスクリーニングが挙げられるが
、それらに限定されない種々の適用に有用である。
に関する検討並びに抗ウイルス療法の候補薬剤のスクリーニングが挙げられるが
、それらに限定されない種々の適用に有用である。
【００９２】 HIV株はHIV、好ましくはHIV-1またはHIV-2として用いた。組換えHIVクローン
の例には、偽型ウイルス（例えば、HIV構造遺伝子および水疱性口炎ウイルス（V
SV）などの別のウイルスのenvの全てまたは一部）が挙げられるが、それらに限
定されない。
の例には、偽型ウイルス（例えば、HIV構造遺伝子および水疱性口炎ウイルス（V
SV）などの別のウイルスのenvの全てまたは一部）が挙げられるが、それらに限
定されない。
【００９３】 使用するウイルスストックは、ヒト抹消血リンパ球（PBL）でのエンドポイン
ト希釈が挙げられるが、それらに限定されない従来の方法によって滴定すること
ができる。例えば、ワイザー(Weiser B.)ら、PNAS 91: 8037-41(1994)を参照。
インビトロHIV感染、遺伝子発現および複製は、当業者に公知の種々の方法によ
ってモニターすることができる。例として、このような方法には、遺伝子発現を
測定するためのp24についての免疫化学的アッセイ法（例えば、免疫細胞化学、F
ACS、ウェスタン、ELISA等）（例えばAtchison, R.E.ら(1996) Science 274:192
4-1926を参照）；S1ヌクレアーゼアッセイ法によるRev機能の評価（Malim, M.ら
(1993) Mol. Cell. Biol. 13: 6180-6189）；Tat発現ベクターが存在する場合ま
たは存在しない場合の（レポーター遺伝子に結合した）HIV-1-LTR構築物の同時
トランスフェクションによるTat機能の評価（Newstein, M. (1990) J. Virol. 6
4: 4565-4567）；および上清を採取し、代表的なヒト細胞での再感染エンドポイ
ント分析を実施することによる感染性ウイルス粒子生産の定量を挙げることがで
きる。
ト希釈が挙げられるが、それらに限定されない従来の方法によって滴定すること
ができる。例えば、ワイザー(Weiser B.)ら、PNAS 91: 8037-41(1994)を参照。
インビトロHIV感染、遺伝子発現および複製は、当業者に公知の種々の方法によ
ってモニターすることができる。例として、このような方法には、遺伝子発現を
測定するためのp24についての免疫化学的アッセイ法（例えば、免疫細胞化学、F
ACS、ウェスタン、ELISA等）（例えばAtchison, R.E.ら(1996) Science 274:192
4-1926を参照）；S1ヌクレアーゼアッセイ法によるRev機能の評価（Malim, M.ら
(1993) Mol. Cell. Biol. 13: 6180-6189）；Tat発現ベクターが存在する場合ま
たは存在しない場合の（レポーター遺伝子に結合した）HIV-1-LTR構築物の同時
トランスフェクションによるTat機能の評価（Newstein, M. (1990) J. Virol. 6
4: 4565-4567）；および上清を採取し、代表的なヒト細胞での再感染エンドポイ
ント分析を実施することによる感染性ウイルス粒子生産の定量を挙げることがで
きる。
【００９４】 インビボにおける感染はいくつかの方法によってモニターすることができる。
例として、方法には、市販のキットを使用して抹消血試料をモニタリングするこ
とができる抗体陽転、または接種後のトランスジェニック齧歯類動物の組織試料
のgap p24の存在についてのPCR分析が挙げられるが、それらに限定されない。
例として、方法には、市販のキットを使用して抹消血試料をモニタリングするこ
とができる抗体陽転、または接種後のトランスジェニック齧歯類動物の組織試料
のgap p24の存在についてのPCR分析が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９５】本発明の齧歯類動物における治療薬剤の作製 本発明の齧歯類動物を使用してヒト治療薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド
、抗体等）を作製することができる。齧歯類動物はヒトCD4および/またはヒトケ
モカイン受容体を発現するので、トランスジェニック齧歯類動物において作製さ
れるある種の治療薬剤はヒトに使用するのにふさわしいと考えられる。一例にお
いて、ヒトケモカイン受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物に標的ペ
プチドまたはタンパク質を接種する。このペプチドまたはタンパク質に対して生
じる抗体はヒト受容体に対する有害な免疫学的反応を示さない。その理由は、ラ
ット抗体はヒト受容体を外来であると認識しないからである。このような抗体は
、HIV感染および発病の予防および/または改善のためのワクチンとして有用とな
りうる。別の例において、治療薬をコードする核酸配列をトランスジェニック齧
歯類動物に導入することができる。好ましくは、このような核酸を、レトロウイ
ルスまたはアデノウイルスベクターなどの適当な発現ベクターとして齧歯類動物
に導入してもよい。
、抗体等）を作製することができる。齧歯類動物はヒトCD4および/またはヒトケ
モカイン受容体を発現するので、トランスジェニック齧歯類動物において作製さ
れるある種の治療薬剤はヒトに使用するのにふさわしいと考えられる。一例にお
いて、ヒトケモカイン受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物に標的ペ
プチドまたはタンパク質を接種する。このペプチドまたはタンパク質に対して生
じる抗体はヒト受容体に対する有害な免疫学的反応を示さない。その理由は、ラ
ット抗体はヒト受容体を外来であると認識しないからである。このような抗体は
、HIV感染および発病の予防および/または改善のためのワクチンとして有用とな
りうる。別の例において、治療薬をコードする核酸配列をトランスジェニック齧
歯類動物に導入することができる。好ましくは、このような核酸を、レトロウイ
ルスまたはアデノウイルスベクターなどの適当な発現ベクターとして齧歯類動物
に導入してもよい。
【００９６】 トランスジェニック齧歯類動物における治療薬の作製およびこの技術を使用す
る利点は、本発明の開示内容を読むことにより当業者には明らかになると思われ
る。
る利点は、本発明の開示内容を読むことにより当業者には明らかになると思われ
る。
【００９７】実施例 以下の実施例は、本発明の作成および使用の方法に関する完全な開示および説
明を当業者に対して行うことが目的であり、発明とみなされる内容の範囲を制限
するものではない。使用する数字（例えば、量、温度、濃度など）に関して正確
であるように努力は払っているが、実験的誤差および偏差が含まれている可能性
は考慮する必要がある。別に特記しない限り、各部分は総重量に占める部分であ
り、分子量は平均分子量であり、温度は℃であり、圧力は大気圧またはその近傍
圧である。
明を当業者に対して行うことが目的であり、発明とみなされる内容の範囲を制限
するものではない。使用する数字（例えば、量、温度、濃度など）に関して正確
であるように努力は払っているが、実験的誤差および偏差が含まれている可能性
は考慮する必要がある。別に特記しない限り、各部分は総重量に占める部分であ
り、分子量は平均分子量であり、温度は℃であり、圧力は大気圧またはその近傍
圧である。
【００９８】 本発明は理解を明確にするために例示としてある程度詳細に記載されているが
、一定の変更および改良が特許請求の範囲内で実施できることは明らかであると
思われる。当業者に明らかとなるこのような改良および変更は本発明の範囲内に
包含されるものとする。
、一定の変更および改良が特許請求の範囲内で実施できることは明らかであると
思われる。当業者に明らかとなるこのような改良および変更は本発明の範囲内に
包含されるものとする。
【００９９】 実施例1:齧歯類細胞におけるHIV-1複製の制限 齧歯類細胞(CHO)およびヒト第12染色体(CHO-12として公知)を含有する照射ハ
イブリッドにHIV-1受容体ウイルスを負荷した。これらの複製欠損ウイルスはHIV
-特異的侵入要件を回避するようVSV-Gタンパク質に偽型化されており、逆転写、
導入およびウイルス遺伝子発現の成功の定量的マーカーとなるホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子を含有する。この系では、CHO-12細胞は、レポーターウイルスによる
感染の結果強力なルシフェラーゼシグナルを示したが、親のCHO細胞は顕著に（1
00倍）低いシグナルを示した。この結果は、親のCHO細胞におけるTat-依存的転
写機能の公知の障害と一致している。ウイルスの生活環におけるこの制限の分子
的な基盤は、両標的細胞にヒトサイクリンTをコードする発現プラスミドをトラ
ンスフェクトし、培養物にレポーターウイルスを接種することによって検討した
。実際、サイクリンTはCHO細胞においてルシフェラーゼシグナルを有意に再構成
したが、CHO-12細胞にはほとんど影響を与えなかった。
イブリッドにHIV-1受容体ウイルスを負荷した。これらの複製欠損ウイルスはHIV
-特異的侵入要件を回避するようVSV-Gタンパク質に偽型化されており、逆転写、
導入およびウイルス遺伝子発現の成功の定量的マーカーとなるホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子を含有する。この系では、CHO-12細胞は、レポーターウイルスによる
感染の結果強力なルシフェラーゼシグナルを示したが、親のCHO細胞は顕著に（1
00倍）低いシグナルを示した。この結果は、親のCHO細胞におけるTat-依存的転
写機能の公知の障害と一致している。ウイルスの生活環におけるこの制限の分子
的な基盤は、両標的細胞にヒトサイクリンTをコードする発現プラスミドをトラ
ンスフェクトし、培養物にレポーターウイルスを接種することによって検討した
。実際、サイクリンTはCHO細胞においてルシフェラーゼシグナルを有意に再構成
したが、CHO-12細胞にはほとんど影響を与えなかった。
【０１００】 CHO細胞におけるHIV-1複製の種々の制限をさらに解明するために、CHOおよびC
HO-12細胞にBaL、複製能を有するCCR5-依存的HIV-1株を負荷し、構造遺伝子産物
p24の細胞内発現を、後期遺伝子発現にいたるウイルスの全ての段階の進行の成
功の指標として定量した。CHOおよびCHO-12細胞はどちらもHIV-1の完全な受容体
が存在しない場合にはウイルス抗原の有意な発現を示さなかった。これは、細胞
内侵入がCHO-12細胞ではTat-依存的機能の再構成にもかかわらず、増殖性感染を
制限していることを示唆している（図2A）。重要なことに、CHO-12は、ヒトCD4
およびヒトCCR5をコードする発現プラスミドの同時トランスフェクションの結果
、細胞内p24の有意な発現を示したが、親のCHO細胞は示さなかった。これは、細
胞の侵入およびTat-依存的機能の両方が許容される場合には、感染の成功が回復
されたことを示している。ヒトCD4、ヒトCCR5およびヒトサイクリンTを一過的に
発現するCHO細胞を感染させたのと同様の結果が得られた。
HO-12細胞にBaL、複製能を有するCCR5-依存的HIV-1株を負荷し、構造遺伝子産物
p24の細胞内発現を、後期遺伝子発現にいたるウイルスの全ての段階の進行の成
功の指標として定量した。CHOおよびCHO-12細胞はどちらもHIV-1の完全な受容体
が存在しない場合にはウイルス抗原の有意な発現を示さなかった。これは、細胞
内侵入がCHO-12細胞ではTat-依存的機能の再構成にもかかわらず、増殖性感染を
制限していることを示唆している（図2A）。重要なことに、CHO-12は、ヒトCD4
およびヒトCCR5をコードする発現プラスミドの同時トランスフェクションの結果
、細胞内p24の有意な発現を示したが、親のCHO細胞は示さなかった。これは、細
胞の侵入およびTat-依存的機能の両方が許容される場合には、感染の成功が回復
されたことを示している。ヒトCD4、ヒトCCR5およびヒトサイクリンTを一過的に
発現するCHO細胞を感染させたのと同様の結果が得られた。
【０１０１】 実施例2:HIV感染に対するラット細胞の許容性 ラット-2細胞にトランスフェクションし、抗生物質で選択することにより、ヒ
トCD4を発現する細胞株またはヒトCD4およびヒトCCR5を発現する細胞株を誘導し
た。適当なタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって確認した
。複製能を有するHIV-1株BaLを負荷したラット-2-CD4/CCR5細胞は、顕著な細胞
変性効果を示し、細胞合胞体となる数多くの多核構造物を生じたが、未感染培養
物またはラット-2-CD4細胞はこのような効果を示さなかった。これらの所見は、
ラット-2-CD4/CCR5細胞がHIV-1による増殖性感染に対して許容性であるというこ
とを最初に示すものとなった。BaLを接種したラット-2、ラット-2-CD4またはラ
ット-2-CD4/CCR5細胞；ラット-2-CD4/CCR5細胞の培養上清に分泌されるウイルス
p24を測定することによってさらなる証拠が得られたが、他は上清中に有意な量
のp24を生じなかった。さらに、培養物をBalで終夜パルスし（pulsing）、翌日
細胞を新鮮な培地で広範囲にわたり洗浄し、その後の経過時点において上清中の
細胞外p24レベルをモニターすることによって時間経過検討を実施した。これら
の実験は培地中のp24レベルの進行的な増加を示しており、これらの細胞の増殖
性感染のさらなる実証となる。また、活性化したヒト抹消血単核細胞の培養物に
移したとき実証されているように、接種したラット-2-CD4/CCR5細胞の上清は複
製能を有するウイルスを含有したが、ラット-2-CD4細胞は含有しなかった。
トCD4を発現する細胞株またはヒトCD4およびヒトCCR5を発現する細胞株を誘導し
た。適当なタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって確認した
。複製能を有するHIV-1株BaLを負荷したラット-2-CD4/CCR5細胞は、顕著な細胞
変性効果を示し、細胞合胞体となる数多くの多核構造物を生じたが、未感染培養
物またはラット-2-CD4細胞はこのような効果を示さなかった。これらの所見は、
ラット-2-CD4/CCR5細胞がHIV-1による増殖性感染に対して許容性であるというこ
とを最初に示すものとなった。BaLを接種したラット-2、ラット-2-CD4またはラ
ット-2-CD4/CCR5細胞；ラット-2-CD4/CCR5細胞の培養上清に分泌されるウイルス
p24を測定することによってさらなる証拠が得られたが、他は上清中に有意な量
のp24を生じなかった。さらに、培養物をBalで終夜パルスし（pulsing）、翌日
細胞を新鮮な培地で広範囲にわたり洗浄し、その後の経過時点において上清中の
細胞外p24レベルをモニターすることによって時間経過検討を実施した。これら
の実験は培地中のp24レベルの進行的な増加を示しており、これらの細胞の増殖
性感染のさらなる実証となる。また、活性化したヒト抹消血単核細胞の培養物に
移したとき実証されているように、接種したラット-2-CD4/CCR5細胞の上清は複
製能を有するウイルスを含有したが、ラット-2-CD4細胞は含有しなかった。
【０１０２】 HIV-1遺伝子発現に対するラットリンパ球の許容性を評価するために、VSV-Gま
たは両種指向性モロニーマウス白血病ウイルスエンベロープタンパク質で偽型化
したレポーター（ルシフェラーゼ）ウイルスを使用してラットT-細胞株NB-2に負
荷した。両方の偽型ストックは、ヒトT-細胞株ジャーカットにおいて産生される
ものを超えるルシフェラーゼシグナルをNB-2細胞中で産生した。従って、これら
のラットリンパ球は、Tatまたは他のHIV-1遺伝子産物のヒト補助因子が存在しな
い場合でも強靭なLTR駆動性遺伝子発現を支持する。
たは両種指向性モロニーマウス白血病ウイルスエンベロープタンパク質で偽型化
したレポーター（ルシフェラーゼ）ウイルスを使用してラットT-細胞株NB-2に負
荷した。両方の偽型ストックは、ヒトT-細胞株ジャーカットにおいて産生される
ものを超えるルシフェラーゼシグナルをNB-2細胞中で産生した。従って、これら
のラットリンパ球は、Tatまたは他のHIV-1遺伝子産物のヒト補助因子が存在しな
い場合でも強靭なLTR駆動性遺伝子発現を支持する。
【０１０３】 集合的に、これらの所見は、ラット由来の細胞は、ヒトウイルス受容体複合体
が存在しないことにより、主に侵入レベルにおいてHIV-1複製が制限されるが、
ハムスター由来の細胞は、侵入阻止以外に選択的なTat-依存的制限を発現するこ
とを明らかにしている。ラット線維芽細胞およびTリンパ球において測定される
ように、ウイルス複製サイクルにおける侵入後段階はこの種では主に保存されて
いると思われる。特に、TatおよびRevなどの他のウイルス因子は、さらに伝播す
る能力を有する感染性ビリオンの複製および生産を支持するのに十分な量でこの
宿主では明らかに機能する。従って、ヒトCD4とヒトCCR5などの補助受容体とか
らなるウイルス受容体複合体の再構成はこのような細胞にHIV-1複製サイクルの
許容性を与える。
が存在しないことにより、主に侵入レベルにおいてHIV-1複製が制限されるが、
ハムスター由来の細胞は、侵入阻止以外に選択的なTat-依存的制限を発現するこ
とを明らかにしている。ラット線維芽細胞およびTリンパ球において測定される
ように、ウイルス複製サイクルにおける侵入後段階はこの種では主に保存されて
いると思われる。特に、TatおよびRevなどの他のウイルス因子は、さらに伝播す
る能力を有する感染性ビリオンの複製および生産を支持するのに十分な量でこの
宿主では明らかに機能する。従って、ヒトCD4とヒトCCR5などの補助受容体とか
らなるウイルス受容体複合体の再構成はこのような細胞にHIV-1複製サイクルの
許容性を与える。
【０１０４】 実施例3:ラット脾細胞における感染性HIV-1の生産 非近郊系Sprague-Dawleyラットの精製した初代ラット脾細胞を、プレート固定
した抗ラットCD3および抗ラットCD28モノクローナル抗体並びにヒト組換えIL-2
で2日間活性化した。その後、細胞に1）水疱性口炎ウイルス(VSV)Gタンパク質で
偽型化したHIV-1 NL4-3を感染し、2)HIV-1 NL4-3エンベロープ配列を感染し、ま
たは3)偽感染した。図1参照。ヒト293T細胞株にHIV-1 NL4-3のプロウイルスDNA
およびVSV-Gタンパク質をコードする発現プラスミド（偽型NL4-3）または空の発
現ベクター(NL4-3野生型)を同時トランスフェクションすることによってウイル
スストックを作製した。終夜感染後、細胞をPBSで3回洗浄し、トリプシン/EDTA
中で37℃において5分間インキュベーションし、培養培地で3回洗浄した。その後
、上清の一部を1日目に取り出し、p24分析によってHIV-1産生について上清を分
析した。3日目のさらに別の上清の一部を取り出し、活性化したヒト抹消血単核
細胞(PBMC)に上清を移した。ヒトPBMCを翌日（4日目）洗浄し、これらの培養物
中のHIV-感染の動態を8、12および15日目にHIV-1 p24値を測定することによって
モニターした。ヒトPBMCの接種後のp24値の上昇は、初代ラット細胞から誘導し
たビリオンがヒト細胞に感染性であることを示している。
した抗ラットCD3および抗ラットCD28モノクローナル抗体並びにヒト組換えIL-2
で2日間活性化した。その後、細胞に1）水疱性口炎ウイルス(VSV)Gタンパク質で
偽型化したHIV-1 NL4-3を感染し、2)HIV-1 NL4-3エンベロープ配列を感染し、ま
たは3)偽感染した。図1参照。ヒト293T細胞株にHIV-1 NL4-3のプロウイルスDNA
およびVSV-Gタンパク質をコードする発現プラスミド（偽型NL4-3）または空の発
現ベクター(NL4-3野生型)を同時トランスフェクションすることによってウイル
スストックを作製した。終夜感染後、細胞をPBSで3回洗浄し、トリプシン/EDTA
中で37℃において5分間インキュベーションし、培養培地で3回洗浄した。その後
、上清の一部を1日目に取り出し、p24分析によってHIV-1産生について上清を分
析した。3日目のさらに別の上清の一部を取り出し、活性化したヒト抹消血単核
細胞(PBMC)に上清を移した。ヒトPBMCを翌日（4日目）洗浄し、これらの培養物
中のHIV-感染の動態を8、12および15日目にHIV-1 p24値を測定することによって
モニターした。ヒトPBMCの接種後のp24値の上昇は、初代ラット細胞から誘導し
たビリオンがヒト細胞に感染性であることを示している。
【０１０５】 実施例4:トランスジェニックラット系統の作製 ヒトCD4、CCR5およびCXCR4を保有するラット系統を作製するために使用した4
種のトランスジェニックベクターを図2〜5に略図で示す。図2は、CD4エンハンサ
ー/プロモーターエレメント、ヒトCD4イントロンIおよびヒトCXCR4遺伝子を含有
するベクターpCD4-hCXCR4の略図を示す。この構築物を含有するトランスジェニ
ックラットは、ジョン ムリンズ博士（Dr. John Mullins）(University of Edi
nburgh)による契約下で本プロジェクトのために作製した。図3は、CD4エンハン
サー/プロモーターエレメント、ヒトCD4イントロンIおよびヒトCCR5 cDNAを含有
するベクターpCD4-hCCR5の略図を示す。この構築物を含有するトランスジェニッ
クラットは、業者（Chrysalis DNX Transgenic Sciences, Princeton, NJ）によ
る契約下で本プロジェクトのために作製した。図4はベクターpCD4-hCD4(Killeen
ら、EMBO J. 12: 1547-1553(1993))の略図である。この構築物を含有するトラン
スジェニックラットは、業者による契約下で本プロジェクトのために作製した。
（Chrysalis DNX Transgenic Sciences, Princeton, NJ）。図5は、CD3デルタプ
ロモーターを含有するベクターpCD3-hCD4を例示する略図である。導入遺伝子は
、ヒトCD4遺伝子のエクソン2〜4およびエクソン5の一部をコードするcDNA断片が
、ヒトCD4遺伝子のエクソン5の残りの部分、エクソン6〜9およびエクソン10の一
部をコードするゲノム断片に融合したものからなる（Fuggerら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 91: 6151-6155(1994)）。トランスジェニックラット系統はロバ
ート・ハマー博士(Robert Hammer)およびジョエル・タウログ博士(Joel Taurog)
(University of Texas, Southwestern)によって以前に作製された。
種のトランスジェニックベクターを図2〜5に略図で示す。図2は、CD4エンハンサ
ー/プロモーターエレメント、ヒトCD4イントロンIおよびヒトCXCR4遺伝子を含有
するベクターpCD4-hCXCR4の略図を示す。この構築物を含有するトランスジェニ
ックラットは、ジョン ムリンズ博士（Dr. John Mullins）(University of Edi
nburgh)による契約下で本プロジェクトのために作製した。図3は、CD4エンハン
サー/プロモーターエレメント、ヒトCD4イントロンIおよびヒトCCR5 cDNAを含有
するベクターpCD4-hCCR5の略図を示す。この構築物を含有するトランスジェニッ
クラットは、業者（Chrysalis DNX Transgenic Sciences, Princeton, NJ）によ
る契約下で本プロジェクトのために作製した。図4はベクターpCD4-hCD4(Killeen
ら、EMBO J. 12: 1547-1553(1993))の略図である。この構築物を含有するトラン
スジェニックラットは、業者による契約下で本プロジェクトのために作製した。
（Chrysalis DNX Transgenic Sciences, Princeton, NJ）。図5は、CD3デルタプ
ロモーターを含有するベクターpCD3-hCD4を例示する略図である。導入遺伝子は
、ヒトCD4遺伝子のエクソン2〜4およびエクソン5の一部をコードするcDNA断片が
、ヒトCD4遺伝子のエクソン5の残りの部分、エクソン6〜9およびエクソン10の一
部をコードするゲノム断片に融合したものからなる（Fuggerら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 91: 6151-6155(1994)）。トランスジェニックラット系統はロバ
ート・ハマー博士(Robert Hammer)およびジョエル・タウログ博士(Joel Taurog)
(University of Texas, Southwestern)によって以前に作製された。
【０１０６】 実施例:5トランスジェニックラットのリンパ球におけるヒトCCR5受容体の発現 ヒトCCR5導入遺伝子を保有する3種の創始系統(A、BおよびC)ならびに非トラン
スジェニック対照ラットのF2世代のラットのヘパリン処理した血液を、市販のPE
-結合抗ヒトCCR5モノクローナル抗体で染色し、FACScan分析によって分析した。
創始系統A、B、Cにおける抹消リンパ球のかなりのサブセットが、それぞれ、低
い、中程度または高いレベルのヒトCCRC発現を示した（図6参照）。
スジェニック対照ラットのF2世代のラットのヘパリン処理した血液を、市販のPE
-結合抗ヒトCCR5モノクローナル抗体で染色し、FACScan分析によって分析した。
創始系統A、B、Cにおける抹消リンパ球のかなりのサブセットが、それぞれ、低
い、中程度または高いレベルのヒトCCRC発現を示した（図6参照）。
【０１０７】 各系統のトランスジェニック動物を交配し、両方の導入遺伝子由来の受容体を
発現する二遺伝子型動物を選択することによって、二重トランスジェニックCD4/
CCR5ラットを作製した。具体的には、ヒトCD-4トランスジェニック系統(CD3プロ
モーター駆動型のCD4発現)とヒトCCRC5-トランスジェニック系統Cとの交雑から
ラットを作製した。ヒトCD4およびCCR5抗原は、二重トランスジェニックラット
から誘導されるCD4-陽性T-細胞上で同時発現した（図7参照）。二重トランスジ
ェニックラットの脾細胞をPE-結合抗ラットCD4モノクローナル抗体、FITC-結合
抗ヒトCCR5モノクローナル抗体およびPercP結合抗ヒトCD4モノクローナル抗体で
同時染色し、FACScanによって分析した。図7の上図右側の細胞はヒトCD4および
ヒトCCR5の両方を発現した。下図左側のパネルは、ヒトCCR5を発現する全ての細
胞は内因性（ラット）CD4-陽性T-細胞に制限されていたことを示す。下図右側の
パネルは、ヒトCD4は主にラットCD4-陽性T細胞だけでなく、ラットCD4-陰性リン
パ球分画でも発現されたことを示している。
発現する二遺伝子型動物を選択することによって、二重トランスジェニックCD4/
CCR5ラットを作製した。具体的には、ヒトCD-4トランスジェニック系統(CD3プロ
モーター駆動型のCD4発現)とヒトCCRC5-トランスジェニック系統Cとの交雑から
ラットを作製した。ヒトCD4およびCCR5抗原は、二重トランスジェニックラット
から誘導されるCD4-陽性T-細胞上で同時発現した（図7参照）。二重トランスジ
ェニックラットの脾細胞をPE-結合抗ラットCD4モノクローナル抗体、FITC-結合
抗ヒトCCR5モノクローナル抗体およびPercP結合抗ヒトCD4モノクローナル抗体で
同時染色し、FACScanによって分析した。図7の上図右側の細胞はヒトCD4および
ヒトCCR5の両方を発現した。下図左側のパネルは、ヒトCCR5を発現する全ての細
胞は内因性（ラット）CD4-陽性T-細胞に制限されていたことを示す。下図右側の
パネルは、ヒトCD4は主にラットCD4-陽性T細胞だけでなく、ラットCD4-陰性リン
パ球分画でも発現されたことを示している。
【０１０８】 実施例6:トランスジェニックラットのリンパ球におけるヒトCXCR4受容体の発現 サザンブロット法により2つのヒトCXCR4導入遺伝子-陽性ラット創始細胞が同
定された。7匹のG0ラットの尾生検から抽出したDNAをSal I/Bgl II-消化し、次
いでSDS-PAGEによって分離し、ナイロン膜にブロットし、32P-標識したヒトCXCR
4 cDNAプローブでハイブリダイゼーションした。-80℃において3日間オートラジ
オグラフィーを実施した。2.7 kbのバンドは、CXCR4導入遺伝子で作製された導
入遺伝子組込陽性創始細胞を同定するための判断材料（diagnostic）となった。
定された。7匹のG0ラットの尾生検から抽出したDNAをSal I/Bgl II-消化し、次
いでSDS-PAGEによって分離し、ナイロン膜にブロットし、32P-標識したヒトCXCR
4 cDNAプローブでハイブリダイゼーションした。-80℃において3日間オートラジ
オグラフィーを実施した。2.7 kbのバンドは、CXCR4導入遺伝子で作製された導
入遺伝子組込陽性創始細胞を同定するための判断材料（diagnostic）となった。
【０１０９】 ヒトCXCR4はトランスジェニックラット系統由来の抹消血リンパ球上で発現さ
れた。HCXCR4-トランスジェニック創始細胞#54(創始系統1)および#55(創始系統2
)並びに非トランスジェニック対照ラットのヘパリン処理した血液を、CXCR4を検
出する市販のPE-結合モノクローナル抗体で染色し、FACScanによって分析した。
創始系統1および2の抹消血リンパ球のかなりのサブセットが中程度のレベルのヒ
トCXCR4を発現した（図8参照）。
れた。HCXCR4-トランスジェニック創始細胞#54(創始系統1)および#55(創始系統2
)並びに非トランスジェニック対照ラットのヘパリン処理した血液を、CXCR4を検
出する市販のPE-結合モノクローナル抗体で染色し、FACScanによって分析した。
創始系統1および2の抹消血リンパ球のかなりのサブセットが中程度のレベルのヒ
トCXCR4を発現した（図8参照）。
【０１１０】 実施例7:ヒトCD4およびCCR5を同時発現する細胞におけるHIV-1感染 ヒトCD4およびCCR5を同時発現するトランスジェニックラットの脾細胞はHIV-1
株による感染を受けやすいことが示された。ヒトCD4/CCR5(系統C)二重トランス
ジェニックラットおよびヒトCD4だけについてトランスジェニックした同腹兄弟
ラットのラット脾細胞を、ヒト組換えIL-2を含有する培地中で2日間単細胞懸濁
液として培養した。その後、細胞に、HIV-1 ADAもしくはHIV-1 JRFLのCCR5特異
的エンベロープ、またはHIV-1 NL4-3のCXCR4-特異的エンベロープ（陰性対照）
のいずれかを含有する偽型化したHIV-1ルシフェラーゼレポーターウイルスを感
染させた。以前に記載されているように（Chanら、J. Virol. 73: 2350-2358(19
99)）、偽型HIV-1ルシフェラーゼレポーターウイルスが293T細胞上で作製された
。
株による感染を受けやすいことが示された。ヒトCD4/CCR5(系統C)二重トランス
ジェニックラットおよびヒトCD4だけについてトランスジェニックした同腹兄弟
ラットのラット脾細胞を、ヒト組換えIL-2を含有する培地中で2日間単細胞懸濁
液として培養した。その後、細胞に、HIV-1 ADAもしくはHIV-1 JRFLのCCR5特異
的エンベロープ、またはHIV-1 NL4-3のCXCR4-特異的エンベロープ（陰性対照）
のいずれかを含有する偽型化したHIV-1ルシフェラーゼレポーターウイルスを感
染させた。以前に記載されているように（Chanら、J. Virol. 73: 2350-2358(19
99)）、偽型HIV-1ルシフェラーゼレポーターウイルスが293T細胞上で作製された
。
【０１１１】 感染3日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。値
は相対的光線単位(Relative Light Units(RLU))として表した。二重トランスジ
ェニックラットの脾細胞だけがCCR5を使用した両方の偽型ウイルスに対する検出
可能なルシフェラーゼ活性を生じた。図9参照。CXCR4を使用したHIV-1 NL4-3偽
型は二重または単一トランスジェニックラット細胞のどちらにおいても検出可能
なシグナルを生じなかった。
は相対的光線単位(Relative Light Units(RLU))として表した。二重トランスジ
ェニックラットの脾細胞だけがCCR5を使用した両方の偽型ウイルスに対する検出
可能なルシフェラーゼ活性を生じた。図9参照。CXCR4を使用したHIV-1 NL4-3偽
型は二重または単一トランスジェニックラット細胞のどちらにおいても検出可能
なシグナルを生じなかった。
【０１１２】 これらの結果は、ヒトCD4およびCCR5の同時発現により、トランスジェニック
動物の初代ラット細胞を、CCR5を使用したHIV-1単離株による感染に対して許容
性にしたことを証明している。
動物の初代ラット細胞を、CCR5を使用したHIV-1単離株による感染に対して許容
性にしたことを証明している。
【０１１３】 本明細書では、本発明に関して最も実践的であって好ましい態様と考えられる
ものを示し、説明している。しかし、この内容からの変更も可能であり、そうし
た変更も本発明の範囲内に含まれること、および本開示を読むことによって当業
者には明らかな改変が想起されることが理解される必要がある。したがって、本
発明は、前述の特許請求の範囲によってのみ制限される。
ものを示し、説明している。しかし、この内容からの変更も可能であり、そうし
た変更も本発明の範囲内に含まれること、および本開示を読むことによって当業
者には明らかな改変が想起されることが理解される必要がある。したがって、本
発明は、前述の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】 棒グラフは、感染性HIV-1を産生するラット脾臓細胞の能力を示
す。白抜きの四角は水胞性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質を持つ偽型HIV-1N
L4-3を感染させた細胞、黒の四角はHIV-1NL4-3外被を感染させた細胞、斜線の四
角は偽感染細胞を示す。
す。白抜きの四角は水胞性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質を持つ偽型HIV-1N
L4-3を感染させた細胞、黒の四角はHIV-1NL4-3外被を感染させた細胞、斜線の四
角は偽感染細胞を示す。
【図２〜５】 ヒトCD4、CCR5、およびCXCR4を有するトランスジェニックラ
ットの系統を作製するために、使用されたトランスジェニックベクターの模式図
である。
ットの系統を作製するために、使用されたトランスジェニックベクターの模式図
である。
【図６】 ヒトCCR5トランスジェニックラットの系統から得られた末梢リン
パ球におけるヒトCCR5の発現を示す一連の4枚のFACScanのグラフである。
パ球におけるヒトCCR5の発現を示す一連の4枚のFACScanのグラフである。
【図７】 ダブルトランスジェニックラットから得られたヒトCD4陽性T細胞
上にヒトCD4およびCCR5が共発現していることを示す一連の４枚のFACScanのグラ
フである。
上にヒトCD4およびCCR5が共発現していることを示す一連の４枚のFACScanのグラ
フである。
【図８】 トランスジェニックラットの系統から得られた末梢リンパ球にお
けるヒトCXCR4の発現を示すFACScanのグラフである。
けるヒトCXCR4の発現を示すFACScanのグラフである。
【図９】 偽型HIV-1ルシフェラーゼレポーターウイルスによるダブルトラ
ンスジェニックラット脾臓細胞への感染を示す2枚の棒グラフである。
ンスジェニックラット脾臓細胞への感染を示す2枚の棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アチソン ロバート イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン フランシスコ オファーレル ストリー ト ＃911 631 (72)発明者 ケプラー オリバー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン フランシスコ 10ス アベニュー 1540 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 CB17 DA12 DA13 DA14 4B024 AA01 BA63 CA02 DA02 4B065 AA91X AA94Y AB01 CA44
Claims (9)
- 【請求項１】 ヒトCD4受容体遺伝子およびケモカイン受容体遺伝子の発現
を特徴とするトランスジェニック齧歯類動物。 - 【請求項２】 ラット、マウスおよびハムスターからなる群より選択される
請求項１記載のトランスジェニック齧歯類動物。 - 【請求項３】 ケモカイン受容体がCCR3、CCR5、CCR2B、CXCR4、CXR3、CCR8
、GPR15、STRL33、APJおよびLTB4からなる群より選択される、請求項1または2記
載のトランスジェニック齧歯類動物。 - 【請求項４】 HIV配列と相互作用する配列をコードするヒト遺伝子の発現
をさらに特徴とする、請求項1、2または3記載のトランスジェニック齧歯類動物
。 - 【請求項５】 請求項1、2、3または4記載の齧歯類動物に由来する単離細胞
。 - 【請求項６】 ヒトCD4受容体遺伝子をコードする安定して組み込まれた第
一のヌクレオチド配列およびヒトケモカイン受容体遺伝子をコードする安定して
組み込まれた第二のヌクレオチド配列を含む、単離された齧歯類細胞。 - 【請求項７】 HIV感染に伴う現象を調節する生物学的に活性な物質をスク
リーニングする方法であって、ヒトCD4遺伝子配列およびヒトケモカイン受容体
を発現しているトランスジェニック齧歯類動物に候補物質を投与する段階、およ
びHIV感染に伴う現象に対する該物質の作用を判定する段階を含む方法。 - 【請求項８】 HIV配列と相互作用するタンパク質をコードするヒト遺伝子
をさらに発現する、請求項7記載の方法。 - 【請求項９】 HIV単離株の感染性を評価する方法であって、(a)ヒトケモカ
イン受容体およびヒトCD4を発現している第一のトランスジェニック齧歯類動物
に該HIV単離株を接種する段階、(b)ヒトケモカイン受容体およびヒトCD4を発現
している第二のトランスジェニック齧歯類動物に代表的なHIVを接種する段階、
および (c)HIV単離株の感染性を代表的なHIVと比較する段階を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11444398P | 1998-12-31 | 1998-12-31 | |
| US60/114,443 | 1998-12-31 | ||
| PCT/US1999/031007 WO2000039316A1 (en) | 1998-12-31 | 1999-12-23 | Transgenic rodents and rodent cell lines expressing hiv co-receptors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002533130A true JP2002533130A (ja) | 2002-10-08 |
Family
ID=22355243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000591206A Pending JP2002533130A (ja) | 1998-12-31 | 1999-12-23 | Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6372956B1 (ja) |
| EP (1) | EP1141360A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002533130A (ja) |
| AU (1) | AU2391000A (ja) |
| CA (1) | CA2354542A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000039316A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6660904B1 (en) * | 1998-04-09 | 2003-12-09 | University Of Maryland Biotechnology Institute | HIV and CD4 transgenic animals and uses therefor |
| JP2002533130A (ja) * | 1998-12-31 | 2002-10-08 | ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ | Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株 |
| US6410013B1 (en) * | 1999-01-25 | 2002-06-25 | Musc Foundation For Research Development | Viral vectors for use in monitoring HIV drug resistance |
| EP1373474A2 (en) * | 2001-01-02 | 2004-01-02 | Stemron, Inc. | A method for producing a population of homozygous stem cells having a pre-selected immunophenotype and/or genotype |
| CA2635722A1 (en) * | 2006-02-03 | 2007-08-09 | Nelson M. Karp | Animal model for hiv induced disease |
| NZ581396A (en) * | 2007-06-01 | 2012-07-27 | Omt Inc | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
| US10765093B2 (en) | 2010-11-27 | 2020-09-08 | James Zhu | Humanized transgenic animal |
| BR112014026294B1 (pt) | 2012-04-25 | 2021-11-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | Método para modificar um lócus genômico alvo em uma célula tronco embrionária (es) de camundongo |
| US20150211063A1 (en) * | 2012-09-11 | 2015-07-30 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Methods of Screening for Susceptibility to Virus Infection |
| MX2015010841A (es) | 2013-02-20 | 2016-05-09 | Regeneron Pharma | Modificacion genetica de ratas. |
| ES2888250T3 (es) | 2013-04-16 | 2022-01-03 | Regeneron Pharma | Modificación direccionada del genoma de rata |
| BR112016013400B1 (pt) | 2013-12-11 | 2023-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método in vitro para modificar um genoma em um lócus genômico de interesse em uma célula pluripotente |
| MX2016016133A (es) | 2014-06-06 | 2017-08-04 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para modificar un locus dirigido. |
| CN107002093B (zh) | 2014-06-26 | 2021-06-25 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向遗传修饰的方法和组合物，以及这些组合物的使用方法 |
| NZ731962A (en) | 2014-11-21 | 2022-07-01 | Regeneron Pharma | Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas |
| WO2016100819A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting |
| AU2018210420B2 (en) | 2017-01-19 | 2024-08-01 | Omniab Operations, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656271A (en) * | 1993-03-19 | 1997-08-12 | The Johns Hopkins University | Oral vaccine comprising anti-idiotypic antibody to chlamydia glycolipid exoantigen and process |
| US5939320A (en) * | 1996-05-20 | 1999-08-17 | New York University | G-coupled receptors associated with macrophage-trophic HIV, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US6528625B1 (en) * | 1996-10-28 | 2003-03-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Anti-CCR5 antibodies and kits comprising same |
| AU8158298A (en) * | 1997-06-23 | 1999-01-04 | J. David Gladstone Institutes, The | Transgenic rabbits expressing cd4 and chemokine receptor |
| JP2002533130A (ja) * | 1998-12-31 | 2002-10-08 | ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ | Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株 |
-
1999
- 1999-12-23 JP JP2000591206A patent/JP2002533130A/ja active Pending
- 1999-12-23 EP EP99967664A patent/EP1141360A4/en not_active Withdrawn
- 1999-12-23 US US09/470,817 patent/US6372956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-23 AU AU23910/00A patent/AU2391000A/en not_active Abandoned
- 1999-12-23 CA CA002354542A patent/CA2354542A1/en not_active Abandoned
- 1999-12-23 WO PCT/US1999/031007 patent/WO2000039316A1/en active Application Filing
-
2002
- 2002-02-06 US US10/072,381 patent/US20020157124A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1141360A4 (en) | 2002-11-06 |
| US20020157124A1 (en) | 2002-10-24 |
| US6372956B1 (en) | 2002-04-16 |
| WO2000039316A1 (en) | 2000-07-06 |
| AU2391000A (en) | 2000-07-31 |
| CA2354542A1 (en) | 2000-07-06 |
| EP1141360A1 (en) | 2001-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tybulewicz et al. | Neonatal lethality and lymphopenia in mice with a homozygous disruption of the c-abl proto-oncogene | |
| AU685811B2 (en) | Mammals lacking expression of CD28 transgenic | |
| US6372956B1 (en) | Transgenic rats and rat cell lines expressing human CD4 and a human chemokine receptor | |
| Davy et al. | Ephrin-B1 forward and reverse signaling are required during mouse development | |
| Laird et al. | In vivo analysis of Pim-1 deficiency | |
| JP3571337B2 (ja) | 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合 | |
| US5565321A (en) | Detection of mutations in a CD40 ligand gene | |
| US6552246B1 (en) | Transgenic mice comprising CD45 knockout | |
| KR20050084318A (ko) | 인간 ｃｄ２０을 발현하는 트랜스제닉 마우스 | |
| CA2153806C (en) | Detection and treatment of mutations in a cd40 ligand gene | |
| Zhang et al. | Distinct stage-specific cis-active transcriptional mechanisms control expression of T cell coreceptor CD8α at double-and single-positive stages of thymic development | |
| AU712016B2 (en) | Ikaros transgenic cells and animals | |
| Kieffer et al. | Human CD8α expression in NK cells but not cytotoxic T cells of transgenic mice | |
| WO2006090918A1 (ja) | 糖尿病モデル動物 | |
| AU8158298A (en) | Transgenic rabbits expressing cd4 and chemokine receptor | |
| AU751811B2 (en) | Vectors | |
| EP0789757A1 (en) | Transgenic organisms and their uses | |
| US20020104112A1 (en) | Ikaros regulatory elements and uses thereof | |
| Tanamachi | The Ly49 family of natural killer cell receptors: Genetic factors determining allelic and variegated gene expression | |
| Schwartzberg | Targeted mutagenesis of the mousec-abl gene | |
| GB2350613A (en) | YAC vectors |