JP2002530430A

JP2002530430A - Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼ阻害用の医薬組成物

Info

Publication number: JP2002530430A
Application number: JP2000583956A
Authority: JP
Inventors: ペツシ，アントネツロ; インガリネツラ，パオラ; ビアンキ，エリサベツタ
Original assignee: イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー
Priority date: 1998-11-26
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2002-09-17
Also published as: AU1387100A; WO2000031129A1; EP1144446A1; CA2352493A1; GB9825946D0; AU764589B2

Abstract

(57)【要約】天然の基質のＰおよびＰ’領域に基づいた、Ｃ型肝炎ウイルスＮ５３プロテアーゼのペプチドインヒビターを開示する。インヒビターのＰ’部分を、酵素のＳ’領域との相互作用によって最大結合エネルギーを達成するように最適化する。ＮＳ３プロテアーゼによってインヒビターが実質的に切断されることができないようにアミノ酸を選択することによって、低ナノモル力価〜ナノモル範囲以下の力価を有するＮＳ３プロテアーゼインヒビターを得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３プロテアーゼのインヒビターと
して作用することができる化合物、ならびにこのような化合物の使用およびその
調製に関する。

【０００２】（背景技術）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非経口感染で散発性の非Ａ、非Ｂ型肝炎（Ｎ
ＡＮＢ−Ｈ）の主要な原因因子である。全世界で人口のおよそ１％が罹患してい
ると考えられる。ウイルス感染により、慢性肝炎および肝硬変を罹患し、それに
より肝細胞癌を引き起こし得る。現在、組換えインターフェロンαのみまたはリ
バビリンと組み合わせた治療によって少数の症例で一部治療が成功しているが、
ワクチンも治療法も確立されていない。したがって、新規で広範囲に有効な治療
薬が緊急に必要とされている。

【０００３】いくつかのウイルスがコードする酵素は、メタロプロテアーゼ（ＮＳ２−３）
、セリンプロテアーゼ（ＮＳ３）、ヘリカーゼ（ＮＳ３）、およびＲＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）を含め、治療介入の推定標的である。ＮＳ３プ
ロテアーゼは、ＮＳ３タンパク質のＮ末端ドメインに位置し、ＮＳ３／４Ａ部位
での分子内切断およびＮＳ４Ａ／４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／５Ａ、およびＮＳ５Ａ／５Ｂ
結合部で下流分子内プロセシングを担うので、主な薬物標的と考えられる。

【０００４】以前の研究により、ある程度のＮＳ３プロテアーゼ阻害活性を示すペプチド群
、特にヘキサペプチド類が同定されている。本発明の目的は、類似の、可能であ
れば改良された活性を示すさらなる化合物を提供することである。

【０００５】Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ＆Ｂｅｒｇｅｒ（１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７、１５７〜１６２）の命名法によれば
、ＮＳ３プロテアーゼ基質中の切断部位は、Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ
１・・・Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−（Ｐは、それぞれアミノ酸を示し、
Ｐ１とＰ１’との間に切断しやすい結合が存在する）と呼ばれる。これに対応す
る酵素の結合部位は、Ｓ６−Ｓ５−Ｓ４−Ｓ３−Ｓ２−Ｓ１・・・Ｓ１’−Ｓ２
’−Ｓ３’−Ｓ４’−と呼ばれる。

【０００６】本出願人は、天然の切断部位のＰ領域に基づき、低ナノモル力価に最適化され
ている、いわゆる産物インヒビターを以前に開示している（１９９８、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃｔｒｙ、３７、８８９９〜８９０５および１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、３７、８９０６〜８９１４）。これらのインヒビターは、Ｃ末端カ
ルボン酸からその結合エネルギーの多くを引き出し、残されたＮＳ３との相互作
用は、天然の基質によって使用される相互作用と類似し、これには、Ｓ_１ポケッ
トでの結合およびＰ６−Ｐ５酸性結合の顕著な静電的相互作用が含まれる。

【０００７】Ｐ領域と異なり、基質のＰ’領域は、触媒作用に重要である一方で、Ｋｍ値と
して示される酵素に対する基底状態結合に有意に影響を及ぼさない。言いかえる
と、初期非共有結合複合体を形成するための酵素との基質の相互作用によって放
出される結合エネルギーは、本質的にＰ領域の残基の相互作用によるもので、Ｐ
’領域の残基は、より狭い範囲で結合エネルギーに寄与する。したがって、天然
の基質のＰ’領域に基づくペプチド（残基Ｐ_１’〜Ｐ_１０’にわたる）は、いか
なる有意な範囲でもＮＳ３を阻害しない。これにもかかわらず、４Ａを含むか含
まないＮＳ３の結晶構造（さらに最近ではＮＳ３のＮＭＲ構造）の検査により、
活性部位に指向するインヒビターの結合に利用し得るＳ’領域中の結合ポケット
の存在が示された。したがって、Ｓ’結合リガンドは、基質が使用した酵素とは
異なる酵素との相互作用範囲を示し、ＮＳ３インヒビターの新規のクラスを表す
。

【０００８】Ｌａｎｄｒｏら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６、９３４０〜９
３４８は、ＮＳ５Ａ／５Ｂ切断部位に基づいて、Ｐ_１’セリンをかさ高い環状芳
香族化合物（テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）またはより小さな環
状アルキル化合物（プロリンまたはピペコリン酸）と置換することで一定の非切
断デカペプチド類を合成した。彼らは、次いで、ＮＳ４Ａ補因子の存在下または
非存在下のいずれかでの、このデカペプチドのＮＳ３の基質結合部位との相互作
用を調査した。分子のＰまたはＰ’部位のいずれかでの切りつめ効果（ｅｆｆｅ
ｃｔｏｆｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）の調査により、彼らは、デカペプチドの結
合エネルギーのほとんどが、分子のＰ側でのＮＳ３−ＮＳ４Ａ複合体との相互作
用によると結論付けた。Ｐ’側の切りつめは、ＮＳ４Ａ補因子の存在下で比較的
大きな効果があるが、ＮＳ４Ａが存在しない場合、効果は少なくなる。彼らは、
その分子中に存在するＰ４’基質のＴｙｒ残基が密接に近位であるか、ＮＳ４Ａ
と直截接触して存在しており、この残基がＮＳ４Ａの存在下での結合に有意に寄
与すると結論付けた。

【０００９】本発明者は、そのＰ’側でより良好に結合するので、Ｌａｎｄｒｏらによって
記載されたインヒビターよりも強力なインヒビターを開発した。言い換えれば、
このインヒビターはＮＳ３のＳ領域との結合に加えて、Ｓ’領域との結合をうま
く利用している。Ｐ’アミノ酸残基を変化させることによって、本発明者は、最
適化または非最適化Ｐ’領域を有するインヒビターは１０００倍を超える力価で
あるので、Ｓ’領域の結合から引き出することができる結合エネルギーは相当な
ものであるということを示した。単離Ｐ’領域に対応するいずれのペプチド中に
も活性がないので、Ｓ’結合フラグメントの最適化を、Ｐ_６からＰ_４’にわたる
非切断デカペプチドの範囲で探求した。

【００１０】本発明者らは、ＬａｎｄｒｏのＰ４’Ｔｙｒ残基のロイシンへの置換により、
ＮＳ３プロテアーゼインヒビターとしてのデカペプチドの有効性を向上させるこ
とができることを見出した。ＰＮＳ３によって切断可能なデカペプチド基質中、
４’位のロイシンはチロシンよりも良好であることが以前に示されていたにもか
かわらず（Ｕｒｂａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、９
２０４〜９２０９）、これは、この置換を酵素の影響下で切断されないデカペプ
チドインヒビターに適用した始めての示唆である。Ｐ４’残基そしてＰ２’−Ｐ
３’フラグメントを最適化し、これらを最適化したＰ領域と使用することにより
、本発明者らは、低いナノモル〜ナノモル以下の範囲で力価を示すオリゴペプチ
ドに到達した。

【００１１】（発明の開示）本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）を有する化合物が得られる。Ｐｅｐ−Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’（Ｉ）（左側にＮ末端、右側にＣ末端を記載する）式中、「Ｐｅｐ」は、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼに結合することができるぺ
プチドまたはペプチドアナログであり、特に、プロテアーゼのＳ領域で結合する
ことができる、Ａ’は、例えば、１〜３個の置換基を有する任意選択的に置換されるプロリン
残基であり、Ｂ’は、非極性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、好まし
くは、この側鎖は３〜１０個、特に、４〜８個の炭素原子を含むアルキル、アリ
ール、またはアラルキル基であり、Ｃ’は、極性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、極性側鎖
の例は、２〜１０個、好ましくは２〜６個の炭素原子を含んでもよく、Ｄ’は、ロイシン、あまり好ましくないが非極性脂肪族側鎖（バリン、イソロ
イシン、ノルロイシン、またはメチオニンなど）別のアミノ酸であるか、あるい
はこれらのアミノ酸の１つを有する短鎖ペプチドまたはペプチドアナログ（特に
、Ｎ末端のロイシン）であり、短鎖ペプチドまたはペプチドアナログは、例えば
、２〜６個、好ましくは２〜４個のアミノ酸またはアミノ酸アナログを含むこと
ができる。

【００１２】本明細書中で使用される、用語「アミノ酸アナログ」は、例えば、互いにα−
に配列されたアミノ基およびカルボン酸基を含み、必ずしも天然に存在しない有
機化合物を含む。

【００１３】式（Ｉ）の化合物のＰｒｅｐ−Ａ結合は、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼによっ
て実質的に切断不可能である。例えば、以下の表題「基質アッセイ」に記載のア
ッセイを用いて切断が検出不可能であることが好ましい。

【００１４】式（Ｉ）の化合物の医薬に許容可能な塩および誘導体（エステルなど）は、本
発明の範囲内である。

【００１５】好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、Ｎ末端がアシル化、特にアセチル化されて
いるが、Ｎ末端の他の誘導体（例えば、Ｎ末端スルホキシド、スルホンアミド、
ウレタン、または尿素誘導体）も可能である。

【００１６】好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、Ｃ末端がアミド化されている。しかし、Ｃ
末端は非誘導化カルボン酸基であり得る。あるいは、他のＣ末端基が存在しても
良い。

【００１７】プロリン残基の置換がＡ’に存在しないと仮定すると、式（Ｉ）の化合物の好
ましいＣ末端部分は、Ｐｒｏ−Ｂ’−Ｃ’−Ｌｅｕ（おそらく、Ｌｅｕで短いＣ末端を有する）である。

【００１８】本発明の第１の態様の化合物において、Ｂ’に含まれるアミノ酸またはアナロ
グの好ましい例には、β−シクロヘキシルアラニン、フェニルグリシン、ホモフ
ェニルアラニン、およびノルロイシンが含まれ、それよりは好ましくないが、他
の可能性としては、ロイシン、メチオニン、ノルバリン、およびβ−シクロプロ
ピルアラニンである。これら全てのうち、シクロヘキシルアラニンおよびフェニ
ルグリシンが最も好ましい。

【００１９】アミノ酸またはアナログの例として、Ｃ’にはアスパラギン酸、グルタミン酸
、γ−カルボキシグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、およびヒドロキシ
プロリンが含まれる。Ｎ−β−Ａｌｏｃ−ジアミノ酪酸、チアゾリルアラニン、
メチオニンスルホキシド、ピリジルアラニン、およびセリンはそれよりは若干好
ましくない。これら全てのうち、アスパラギン酸が最も好ましい。

【００２０】以下のＢ’およびＣ’でのアミノ酸残基の組み合わせが好ましく、シクロヘキ
シルアラニンとアスパラギン酸との組み合わせが特に好ましい。

【００２１】

【表１】脚注：Ｃｈａ＝β−シクロヘキシルアラニン。Ｎｌｅ＝ノルロイシン。Ｐｈｇ＝フェニルグリシン。Ｈｏｆ＝ホモフェニルアラニン。Ｈｙｐ＝ヒドロキシプロリン。

【００２２】残基Ｄ’がＣ末端伸長として小さなペプチドを有するロイシン（または他のア
ミノ酸）の場合、天然基質の対応するＰ’部分と比較してペプチドを選択するこ
とができる。

【００２３】残基Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、およびＤ’は、Ｄ型またはＬ型立体化学を有し得るが
、一般に、それぞれＬ型立体化学が好ましい。

【００２４】式（Ｉ）の化合物のＰｅｐ部分に関して、これは、例えば、ＰｅｐがＣ末端に
カルボン酸基のみを保有する場合、Ｃ末端残基Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’の非存在
下でもＨＣＶＮＳ３プロテアーゼに結合することができるペプチドまたはペプ
チドアナログが好ましい。例えば、下記の阻害アッセイで試験した場合、フラグ
メントＰｅｐ−ＯＨは１００μＭ未満（例えば、２０μＭ未満、特に１０μＭ未
満、最適には１μＭ未満）のＩＣ_５０を有することが好ましい。好ましくは、Ｐ
ｅｐは、以下の式ＩＩＦ−Ｅ−Ｄ−Ｃ−Ｂ−Ａ（ＩＩ）を有するヘキサ、ペンタ、またはテトラペプチドである。式中、Ａは、比較的小さな（Ｃ_１〜Ｃ_６）脂肪族側鎖を有するアミノ酸または
アミノ酸アナログである。この基について可能な選択には、システイン、アミノ
酪酸（Ａｂｕ）（ジおよびトリフルオロＡｂｕを含む）、ノルバリン、アリルグ
リシン、およびアラニンが含まれ、それぞれ、Ｎメチル化することができる。こ
れらのうち、Ａにはシステインおよびフッ素化アミノ酪酸が好ましい選択である
。

【００２５】Ｂは、非極性または酸性側鎖を有するアミノ酸またはアナログである。極性で
あるが電荷のない側鎖を有するいくつかのアミノ酸も適切であり得る。適切なア
ミノ酸の例には、グルタミン酸およびアスパラギン酸、グリシンおよびメチルグ
リシン、２−アミノ酪酸、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、システ
イン、ナフチルアラニン、ならびにβ−シクロヘキシルアラニンが含まれる。こ
れらのうち、シクロヘキシルアラニンが特に好ましい。

【００２６】Ｃは、非極性または酸性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログである
。例えば、このようなアミノ酸の例としては、上記Ｂで示されたアミノ酸をＣに
も適用する。この場合、イソロイシンおよびグルタミン酸が特に好ましい。

【００２７】Ｄは、疎水性側鎖（メチオニン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、バ
リン、メチルバリン、フェニルグリシン、またはジフェニルアラニンなど）を有
するアミノ酸またはアミノ酸アナログである。これらのうち、ロイシン、および
特に、ジフェニルアラニンが好ましい。疎水性部分を含むいくつかの極性アミノ
酸（チロシン、チエニルアラニン、およびクロロフェニルアラニンなど）が適切
であり得る。

【００２８】Ｅは、Ｆと共に存在しなくても良いが、存在する場合、一般に、酸性側鎖を有
するアミノ酸またはアミノ酸アナログである。好ましい例は、グルタミン酸およ
びアスパラギン酸であるが、前者が好ましい。あるいは、Ｅは、非極性または極
性であるが電荷のない側鎖を有するアミノ酸またはアナログであり得る。非極性
アミノ酸のうち、フェニルアラニン、ジフェニルアラニン、イソロイシン、およ
びバリンが好ましく、特に、Ｄ型鏡像異性体が好ましい。極性アミノ酸のうち、
適切な例はチロシンおよび４−ニトロフェニルアラニンである。あるいは、Ｆが
存在しない場合（以下を参照のこと）、Ｅは６個までの炭素原子を含み、酸性ア
ミノ酸のアミノ基を欠くジカルボン酸であり得る。適切な例は、グルタル酸およ
びコハク酸である。

【００２９】Ｆは（それ単独で、またはＥと共に）存在しなくても良いが、存在する場合、
酸性側鎖を有するアミノ酸またはアナログである。アスパラギン酸が好ましいが
、グルタミン酸の可能性もある。Ｅのように、Ｆもまた６個までの炭素原子を含
み、酸性アミノ酸のアミノ基を欠くジカルボン酸であり得る。例は、グルタミン
酸およびコハク酸である。

【００３０】残基ＥおよびＦのうち、少なくともＥが存在することが好ましい。特に、両方
存在することが好ましい。

【００３１】アミノ酸およびアナログＡ〜Ｆは、Ｌ型またはＤ型鏡像異性体のいずれかであ
るが、一般に、全ての残基でＬ型が好ましい。いくつかの場合、残基の一方また
は他がＤ型である一方で、残りがＬ型であることが有利であり得る。特に、Ｅが
Ｄ−ｇｌｕであることが有利であり得る。

【００３２】ペプチド「Ｐｅｐ」の好ましい例を、Ｃ末端を伸長しない場合、ＩＣ_５０と共
に以下の表２および表３に列挙する。Ｎ末端にスクシニル残基を有する化合物以
外の全ての化合物を、Ｎ末端でＮアセチル化した。

【００３３】

【表２】Ｐｅｐの特に好ましい例を、そのＩＣ_５０（μＭ）と共に以下の表３に示す。

【００３４】

【表３】 ^＊デカペプチドとしてのみ試験した。

【００３５】これらの化合物において、Ａｌｇ＝アリルグリシン。ＭＧｌｙ＝メチルグリシン。ＭＶａｌ＝メチルバリン。Ａｂｕ＝２−アミノ酪酸。ＧｌｕＳ＝Ｎ−スクシニルグルタミン酸。ＡｓＧｌｕ＝Ｎ末端にアシルスルホンアミドを有するグルタミン酸。Ｃｈａ＝β−シクロヘキシルアラニン。Ｎａｐ＝ナフチルアラニン。ＡｓｐＳ＝Ｎ−スクシニルアスパラギン酸。Ｎｌｅ＝ノルロイシン。Ｄｉｆ＝３，３−ジフェニルアラニン。Ｔｈａ＝２−チエニルアラニン。ＦＣＩ＝４−クロロフェニルアラニン。Ｐｈｇ＝フェニルグリシン。ＣｙｓＭｅ＝Ｓ−メチルシステイン。Ｃｙｓ（ＡＣＳ）＝Ｃ末端アシルスルホンアミドを有するシステイン。ＤＨＡｌａ＝デヒドロアラニン。Ｃｐｃ＝１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸。ＣｎＡｌａ＝シアノアラニン。ＭＧｌｕ＝Ｎ−メチルグルタミン酸。Ｆｎｏ＝４−ニトロフェニルアラニン。Ｇｌａ＝γ−カルボキシグルタミン酸。Ｄａｐ＝β−ジアミノプロピオン酸。Ｄｎｓ＝ダンシル（５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）。

【００３６】本発明の化合物の例は、マイクロモルまたはナノモルレベルでのＮＳ３プロテ
アーゼのインヒビターとして有効であり得る。好ましくは、下記のアッセイで測
定した場合、ＩＣ_５０は１００ｎＭ未満、特に好ましくは２０ｎＭ未満、最適に
は５ｎＭ未満である。

【００３７】第２の態様によれば、本発明は、任意の治療用途、好ましくはＨＣＶＮＳ３
プロテアーゼの阻害用途および／またはＣ型肝炎もしくは関連病態の治療または
予防用途の第１の態様による化合物、塩、または誘導体を提供する。「関連病態
」は、Ｃ型肝炎ウイルスによって直接的または間接的に発症するか発症し得る、
いずれにしてもＨＣＶが関連する病態を意味する。

【００３８】第３の態様によれば、本発明は、Ｃ型肝炎または関連病態の治療または予防用
の薬物製造における第１の態様による化合物または誘導体の使用を提供する。

【００３９】本発明の第４の態様は、第１の態様による１つまたは複数の化合物または誘導
体を含む医薬組成物を提供する。

【００４０】組成物はまた、キャリア、緩衝液、安定剤、および他の賦形剤などの医薬に許
容可能な補助剤を含み得る。これには、他の治療上活性な薬剤（特に、Ｃ型肝炎
または関連病態の治療または予防用途のもの）をさらに含み得る。

【００４１】医薬組成物は、意図する投与法に依存して、任意の適切な形態であり得る。形
態は、例えば、経口投与には錠剤、カプセル、または液体の形態であり、非経口
投与には溶液または懸濁液の形態であり得る。

【００４２】本発明の第５の態様によれば、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ活性の阻害法、お
よび／またはＣ型肝炎または関連病態の治療法を提供し、本方法は、前記病態に
罹患しているヒトまたは動物（好ましくは哺乳動物）被験体に治療または予防有
効量の本発明の第４の態様による組成物または第１の態様による化合物または誘
導体を投与する工程を包含する。「有効量」とは、被験体に効果をもたらすか、
少なくとも被験体の病態に変化を起こすのに十分な量を意味する。

【００４３】化合物、誘導体、または組成物が投与される投薬速度は、被験体の性質、病態
の性質および重症度、使用した投与法などに依存する。適切な値を、訓練を受け
た医者が選択することができる。好ましい化合物の１日量は、約１〜１００ｍｇ
のオーダーであろう。化合物、誘導体、または組成物を、単独または他の治療と
同時または連続して組み合わせて投与することができる。任意の適切な経路（経
口、静脈内、皮膚、皮下など）で投与することができる。静脈内投与が好ましい
。適切な部位に直接投与するか、特定の部位（一定の型の細胞）を標的化する様
式（適切な標的法はすでに公知である）で投与することができる。

【００４４】本発明の第６の態様は、１つまたは複数の本発明の第１の態様による化合物ま
たは誘導体と１つまたは複数の医薬に許容可能な補助剤、および／または１つま
たは複数の他の治療または予防活性剤とを混合する工程を包含する、医薬組成物
の調製法を提供する。

【００４５】本発明の第７の態様によれば、式Ｉの化合物の製造法が提供される。これらの
化合物を、好ましくは保護されたそれぞれのアミノ酸またはオリゴペプチドから
開始する化学合成および公知のペプチド合成法によって全体的または部分的に作
製することができる。

【００４６】本発明の実施の態様本発明の実施形態を、例示のみを目的として例証する。

【００４７】実施例（１）合成本発明の化合物の１つの合成を以下に記載する。他の化合物を、類似の方法に
よって合成することができる。

【００４８】Ａｃ−ＡＳｐ−（Ｄ）Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｈａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｈａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ａｃ）−ＮＨ_２の合成

【００４９】固相連続フローＦｍｏｃ−ポリアミド法（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．ａｎｄＳ
ｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．、１９８９、Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄ
ｅｓｙｔｈｅｓｉｓ、Ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ．）で合成を行った。使用した樹脂は、修飾Ｒｉｎｋ
アミドリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）
−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（
Ｒｉｎｋ，Ｈ．、１９８７、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、２８、３７
８７〜３７８９、Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．、Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｓ．Ｂ
．ａｎｄＫｏｓｔｅｒ，Ｈ．、１９８９、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔ
ｔ．、３０、４６４５〜４６６７）で誘導体化したＴｅｎｔａｇｅｌであった。
全てのカップリング反応を、Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩ
ＥＡ（１：１：１：２）活性化を用いて、樹脂に結合していいないアミノ基上で
５倍過剰の活性化アミノ酸と３０分間行い、システイン残基には、二重カップリ
ングを使用した。アセンブリの終了時に、乾燥ペプチド−樹脂をトリフルオロ酢
酸／水／トリイソプロピルシラン（９２．５：５：２．５）と室温で１．５時間
処理した。樹脂をろ過し、ペプチドを冷メチルｔ−Ｂｕエーテルで沈殿させ、沈
殿物を、０．１％ＴＦＡを含む５０％水／アセトニトリルに再溶解し、凍結乾燥
した。

【００５０】９８％を越える均質な精製を、溶出液として（Ａ）０．１％トリフルオロ酢酸
水溶液および（Ｂ）０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液を用いて、
ＷａｔｅｒｓＲＣＭ（Ｃ−１８）カラム（１００×２５ｍｍ、１５ｍｍ）を備
えた分取用ＨＰＬＣによって行った。使用した勾配は、４０％Ｂの定組成で５分
間、４０〜６０％で２０分以上（流速３０ｍｌ／分）であった。画分を、ＨＰＬ
Ｃ（カラム：ＢｅｃｋｍａｎＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ、Ｃ−１８、２５×４．
６ｍｍ、５ｍｍ；勾配：３５〜６５％で２０分間、分取と同じ溶出液、流速１ｍ
ｌ／分）で分析し、純粋な物質を含む画分を、プールして凍結乾燥した（収率５
０％）。マススペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡＰＩ−１００分光計
によって得た：ＭＳ＝１６９５．０３（計算値）１６９４．６（実測値）。

【００５１】（２）阻害アッセイ化合物のＮＳ３プロテアーゼ阻害能力を、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよび
ＮＳ４Ａペプチドの修飾形態Ｐｅｐ４ＡＫ［ＫＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳ
ＧＲ（ＮＨ_２）］を含むＮＳ３／４Ａ複合体を用いて評価した。基質として、Ｈ
ＣＶポリタンパク質のＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ切断部位の配列に基づいた基質ペプチ
ド４ＡＢ［ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ］を使用した。

【００５２】３μｌの基質ペプチドを添加した、５７μｌの５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７
．５）、１％ＣＨＡＰＳ、１５％グリセロール、１０ｍＭＤＴＴ（緩衝液Ａ）
中で切断アッセイを行った。プロテアーゼ補因子として、ＮＳ４Ａタンパク質の
中心部の疎水性コア（残基２１〜３４）にわたるペプチド、Ｐｅｐ４ＡＫ［ＫＫ
ＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＲ（ＮＨ_２）］を使用した。８０μＭのＰｅｐ４
ＡＫを含む緩衝液を、１０〜２００ｎＭプロテアーゼと１０分間プレインキュベ
ートし、基質の添加によって反応を開始させた。異なる基質濃度での６連のデー
タポイントを使用して、速度パラメータを計算した。基質変換が７％未満となる
ようにインキュベーション時間を選択し、反応を４０μｌの１％ＴＦＡの添加に
よって停止させた。ペプチド基質の切断を、オートサンプラーを備えたＭｅｒｃ
ｋ−Ｈｉｔａｃｈｉクロマトグラフを用いたＨＰＬＣによって同定した。８０μ
ｌのサンプルを、ＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣ１８逆相カートリッジカラム（４
×７４ｍｍ、５μｍ、Ｍｅｒｃｋ）に注入し、フラグメントを、１０〜４０％ア
セトニトリルの５％／分勾配を用いて２．５ｍｌ／分の流速で分離した。ピーク
の検出を、２２０ｎｍでの吸光度およびチロシン蛍光（λ_ｅｘ＝２６０ｎｍ、λ _ｅｍ＝３０５ｎｍ）の監視によって行った。切断産物を、適切な標準に関してク
ロマトグラムの積分によって定量した。速度パラメータを、ミカエリス−メンテ
ンの速度論と仮定して、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを用いた基質濃
度の関数として初速度の非線形最小二乗法によって計算した。

【００５３】ペプチドインヒビターのＫ_１値を、漸増量のインヒビターの存在下で行った基
質滴定実験から計算した。実験データセットを、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェ
アを用いてマルチカーブフィットマクロを用いて等式１にあてはめた。

【００５４】Ｖ＝（Ｖ_ｍａｘＳ）／（Ｋ_ｍ（１＋ｋ_ｉ／Ｉ）＋Ｓ）（式１）あるいは、式２ＩＣ５０−（１＋Ｓ／Ｋ_ｍ）Ｋ_ｉ（式２）
にしたがって、ＩＣ５０値から４パラメータロジスティック関数を用いてＫ_ｉ値
を導いた。

【００５５】以下の表は、本アッセイで試験した種々のペプチドのＩＣ_５０値を示し、本発
明のいくつかの最適化化合物はナノモルまたはナノモル以下のレベルで活性であ
ることを立証する。Ｎ末端にスクシニル残基を有する化合物２６を除く全ての試
験化合物を、Ｎアセチル誘導体として試験した。

【００５６】これらの化合物のいくつかは、現在までに報告されているＨＣＶプロテアーゼ
で最も強力なｉｎｖｉｔｒｏインヒビターである。これらの化合物は、可逆的
で、分子中に求電子（「セリン捕捉」）部分を含まない非共有結合インヒビター
である。これらの化合物は酵素のＳ領域およびＳ’領域の両方と結合し、酵素の
ＳまたはＳ’領域のいずれかに結合する化合物と競合するので、これは競合結合
アッセイを行うのに適切である。

【００５７】

【表４】表Ｉで使用した略語。Ａｂｕ＝アミノ酪酸Ｃｈａ＝β−シクロヘキシルアラニンＨｏｆ＝ホモフェニルアラニンＨｙｐ＝ヒドロキシプロリンＬｙｓ（Ａｃ）またはＫ（Ａｃ）＝Ｎε−アセチル−リジンＮｌｅ＝ノルロイシンＰｈｇ＝フェニルグリシンＳｔａ＝スタチン［（３Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチル
ヘプタン酸］Ｄｉｆ＝３，３−ジフェニルアラニンＳｕｃ＝スクシニルＮ−メチル化を、アミノ酸の３文字表記の前に（Ｍｅ）を記載して示す。ＰＹＫ＝プロリン−チロシン−リジン（３）基質アッセイインヒビター分子がＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの基質であるかどうかを同定
するために、上記の切断アッセイの改変バージョンを、上記のようにＮＳ３プロ
テアーゼドメインと修飾形態のＮＳ４ＡペプチドＰｅｐ４ＡＫ［ＫＫＫＧＳＶ
ＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＲ（ＮＨ_２）］を用いて行った。

【００５８】１μＭの酵素複合体を、候補基質ペプチドとしての１０μＭのインヒビターの
存在下で１６時間インキュベートした。５７μｌの５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ
７．５）、１％ＣＨＡＰＳ、１５％グリセロール、１０ｍＭＤＴＴ中でアッセ
イを行った。

【００５９】その後、ＨＰＬＣを使用して、切断による任意のペプチドを分離し、切断産物
を検出した。

【００６０】サンプルを、９５％の溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡのＨ２０溶液）および５％溶媒
Ｂ（０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液）で平衡化したＢｅｃｋｍａｎ０．
４６×２５ｃｍＣ１８逆相カラムを用いて流速１ｍｌ／分のＨＰＬＣによって
分析した。サンプルを、５％〜９０％のＢの４５分間の直線勾配でこのカラムか
ら溶出させた。ピークの検出を、２２０ｎｍの吸光度の監視によって行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ビアンキ，エリサベツタイタリー国、イ−00195・ローマ、ビア・サボテイーノ、31 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA01 BA10 BA23 CA59 DC32 NA01 NA14 ZA751 ZB331 ZB332 ZC202 4H045 AA10 AA30 BA10 DA55 EA29 EA50 FA34 FA44 GA25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）の化合物または医薬に許容可能なその塩もしくは誘
導体。Ｐｅｐ−Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’（Ｉ）（式中、式（Ｉ）は、左側のＮ末端から右側のＣ末端へと記載され、「Ｐｅｐ」は、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼに結合することができるペプチド
またはペプチドアナログであり、Ａ’は任意選択的に置換されるプロリン残基であり、Ｂ’は、非極性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、Ｃ’は、極性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、Ｄ’は、ロイシン、非極性脂肪族側鎖を有する他のアミノ酸またはアミノ酸ア
ナログ、およびロイシンまたはＮ末端残基として非極性脂肪族側鎖を有する他の
アミノ酸またはアミノ酸アナログを有する２〜６アミノ酸のペプチドから選択さ
れ、ＰｅｐとＡ’との間の結合はＨＣＶＮＳ３プロテアーゼによって実質的に切
断することができない。）
【請求項２】Ｃ末端がアミド化されている、請求項１に記載の化合物、医
薬に許容可能なその塩または誘導体。
【請求項３】Ｎ末端がアシル化されている、請求項１または請求項２に記
載の化合物、医薬に許容可能なその塩または誘導体。
【請求項４】Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’が式Ｐｒｏ−Ｂ’−Ｃ’−Ｌｅｕ（式中、Ｂ’およびＣ’は請求項１で定義されている）のテトラペプチドである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の化合物、
塩、または誘導体。
【請求項５】Ｂ’が、β−シクロヘキシルアラニン、フェニルグリシン、
ホモフェニルアラニン、ノルロイシン、ロイシン、メチオニン、ノルバリン、お
よびβ−シクロプロピルアラニンから選択される、前記請求項のいずれか１項に
記載の化合物、塩、または誘導体。
【請求項６】Ｂ’が、シクロヘキシルアラニンおよびフェニルグリシンか
ら選択される、請求項５に記載の化合物、塩、または誘導体。
【請求項７】Ｃ’がアスパラギン酸、グルタミン酸、γ−カルボキシグル
タミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、Ｎ−β−Ａｌｏｃ
−ジアミノ酪酸、チアゾリルアラニン、メチオニンスルホキシド、ピリジルアラ
ニン、およびセリンから選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物
、塩、または誘導体。
【請求項８】Ｃ’がアスパラギン酸である、請求項７に記載の化合物、塩
、または誘導体。
【請求項９】アミノ酸Ｂ’Ｃ’の組み合わせが、Ｃｈａ−ＳｅｒＣｈａ−ＡｓｐＮｌｅ−ＡｓｐＨｏｆ−ＡｓｐＰｈｇ−ＡｓｐＣｈａ−ＧｌｎＮｌｅ−ＧｌｎＨｏｆ−ＧｌｎＣｈａ−ＨｙｐＮｌｅ−ＨｙｐＨｏｆ−ＨｙｐＮｌｅ−Ｓｅｒから選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物、塩、または誘導体
。
【請求項１０】Ｐｅｐ−ＯＨが、Ｃ末端残基Ａ’−Ｂ’−Ｃ’−Ｄ’の不
在下でＨＣＶＮＳ３プロテアーゼと結合することができ、阻害アッセイにおい
て１００μＭ未満のＩＣ_５０である、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物
、塩、または誘導体。
【請求項１１】Ｐｅｐが、以下の式（ＩＩ）Ｆ−Ｅ−Ｄ−Ｃ−Ｂ−Ａ（式中、Ａは、１〜６個の炭素原子の脂肪族側鎖を有するアミノ酸またはアミノ
酸アナログであり、Ｂは、非極性、酸性、または極性であるが、電荷のない側鎖を含むアミノ酸ま
たはアナログであり、Ｃは、非極性または酸性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログであり
、Ｄは、疎水性側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、Ｅは、Ｆと共に存在しなくてもよく、存在するならば、酸性、非極性、または
極性であるが、電荷のない側鎖を含むアミノ酸またはアミノ酸アナログであるか
、６個までの炭素原子を含み、酸性アミノ酸のアミノ基を欠くジカルボン酸であ
り、Ｆは（それ単独で、またはＥと共に）存在しなくても良いが、存在する場合、
酸性側鎖を有するアミノ酸またはアナログであるか、６個までの炭素原子を含む
ジカルボン酸である）を有するヘキサペプチド、ペンタペプチド、またはテトラ
ペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物、塩、または誘導体
。
【請求項１２】Ａが、システイン、アミノ酪酸、ジ−およびトリフルオロ
アミノ酪酸、ノルバリン、アリルグリシン、およびアラニンから選択され、Ｂが、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、メチルグリシン、２−アミ
ノ酪酸、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、システイン、ナフチルア
ラニン、およびβ−シクロヘキシルアラニンから選択され、Ｃが、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、メチルグリシン、２−アミ
ノ酪酸、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、システイン、ナフチルア
ラニン、およびβ−シクロヘキシルアラニンから選択され、Ｄが、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、バリン、メチル
バリン、フェニルグリシン、ジフェニルアラニン、チロシン、チエニルアラニン
、およびクロロフェニルアラニンから選択され、Ｅは、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ジフェニルアラニ
ン、イソロイシン、バリン、チロシン、４−ニトロフェニルアラニン、グルタル
酸、およびコハク酸から選択され、Ｆが、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタル酸、およびコハク酸から選択
される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】治療用途の、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物、
塩、または誘導体。
【請求項１４】前記請求項のいずれか１項に記載の化合物、塩、または誘
導体および医薬に許容可能な賦形剤、希釈剤、またはキャリアを含む、医薬組成
物。
【請求項１５】Ｃ型肝炎または関連病態の治療または予防用の薬物の製造
における、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物、塩、または誘導体の使用
。
【請求項１６】ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ活性の阻害法および／または
Ｃ型肝炎または関連病態の治療法または予防法であって、前記病態に罹患したヒ
トまたは哺乳動物被験体に治療上または予防上有効量の請求項１４に記載の組成
物または請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の化合物を投与する工程を
包含する、方法。