JP2002529096A - 転写アクチベータｌｅｃ１核酸、ポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents

転写アクチベータｌｅｃ１核酸、ポリペプチドおよびそれらの使用

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JP2002529096A JP2000581224A JP2000581224A JP2002529096A JP 2002529096 A JP2002529096 A JP 2002529096A JP 2000581224 A JP2000581224 A JP 2000581224A JP 2000581224 A JP2000581224 A JP 2000581224A JP 2002529096 A JP2002529096 A JP 2002529096A
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サンリザ ラスコ−ゴーント，
レベッカ イー． カホーン，
キシファン サン，
ジョージ ジェイ． ホースター，
キャロライン アン グレゴリー，
ラムゴパル ナディムパリ，
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パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド
イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離された核酸を提供する。そして本発明はさらに、転写アクチベータとして作用する、単離された核酸がコードするタンパク質を提供する。また、本発明は、さらに単離された核酸、および転写アクチベータとして作用する、単離された核酸がコードするタンパク質の使用方法を提供する。本発明はさらに、発現カセットを提供する。本発明はなお、形質転換された宿主細胞を提供し、そしてさらにトランスジェニック植物および植物の部分、ならびに抗体組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、概して植物の分子生物学に関する。より詳細には、本発明は、核酸
および植物中でのその発現調節方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 植物形質転換における主な進歩が、最近２〜３年にわたって生じている。しか
し、主な穀物植物（トウモロコシおよびダイズ）においては、重大な遺伝子型の
制限がなお存在する。農学的に重要なトウモロコシ近交系統の形質転換は、困難
かつ時間浪費の両方でありつづけている。伝統的に、培養応答を誘発する唯一の
方法は、培地成分および／または外植材料および供給源を最適化することによっ
ていた。これは、いくつかの遺伝子型においては成功を導いたが、ほとんどの選
りすぐりのハイブリッドは、好ましい培養応答を生じない。モデル遺伝子型の形
質転換は効率的であるとはいえ、生成近交系への導入遺伝子の商業的移入プロセ
スは、骨が折れ、高価でかつ時間浪費的である。遺伝子がハイブリッドに直接導
入され得、そして商業的ハイブリッド中で直接評価され得るならば、かなりの時
間および費用が節約される。
【０００３】 トウモロコシにおける遺伝子操作のための現在の方法は、新しいＤＮＡのレシ
ピエントとしての特異的細胞型を必要とする。これらの細胞は、比較的未分化で
迅速に生長するカルス細胞中で、または未成熟胚の胚盤表面（カルスを生じる）
で見出される。現在用いられる送達方法にかかわらず、ＤＮＡは、事実上、数千
の細胞に導入されているが、形質転換体は、一過性に発現する細胞に対して１０ -5 の頻度で回収される。この問題、すなわち、ＤＮＡ導入を伴う外傷を悪化させ
ることは、レシピエント細胞に細胞周期停止を指示し、そして蓄積する証拠はこ
れらの細胞の多くがアポトーシスまたはプログラムされた細胞死へ指示されるこ
とを示唆する。（参考文献 Ｂｏｗｅｎら、Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９
９１、Ａｂｓｔｒａｃｔ １０９３）。従って、多数の細胞型において形質転換
効率を増加させ得る改善方法を提供することが所望される。
【０００４】 形質転換細胞を回収するためには、代表的に選択マーカーが用いられる。伝統
的な選択スキームは、全ての細胞を植物毒性の因子に暴露し、そして形質転換体
を回収するための耐性遺伝子の導入に依存する。不幸にも、死亡する細胞の存在
が、安定な形質転換の効率を減少させ得る。従って、形質転換体を回収するため
に積極的な選択システムを提供することが有用である。
【０００５】 収量および世界の収穫面積の増大にかかわらず、今後１０年間にわたって、ト
ウモロコシについての需要を満たすには、現在の生産をさらに２０％増やす必要
があると予想される（Ｄｏｗｓｗｅｌｌ、Ｃ．Ｒ．、Ｐａｌｉｗａｌ，Ｒ．Ｌ．
、Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｒ．Ｐ．，１９９６，Ｍａｉｚｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｉ
ｒｄ Ｗｏｒｌｄ、Ｗｅｓｔｖｉｅｗ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）。
【０００６】 ハイブリッド作物（穀物、脂肪種子、飼料、果実および野菜を含む）では、ハ
イブリッド種子の開発および生産に関する問題が存在する。植物の他家受粉のプ
ロセスは、面倒でかつ費用がかさむ。他家受粉のプロセスでは、雌性植物は、そ
れ自体の花粉により受精することを防がれなければならない。多くの方法、例え
ば、２〜３例をあげると、トウモロコシの場合、雄穂を取り除くこと、雄性不稔
性系統を開発および維持すること、ならびにそれ自体の花粉に不和合性である植
物を開発すること、が長年にわたって開発されてきた。ハイブリッドは実際には
交配繁殖しないので、このプロセスはあらゆるハイブリッド種子ロットの産生の
ために反復されなければならない。
【０００７】 このプロセスをさらに複雑にするのは、近交系統の交雑である。例えば、トウ
モロコシの場合、近交系は低収量であり得る。これは、ハイブリッド種子トウモ
ロコシの産生における主要な難題を提供する。実際、特定のハイブリッドは、多
少なりとも近交系統の能力のせいで市販化され得ない。ハイブリッド種子の産生
は、引き続き高価であり、時間浪費的であり、そして既知の危険性および未知の
危険性を提供する。従って、ハイブリッド種子の産生効率の上昇に貢献する新し
い方法を開発することが有用である。
【０００８】 遺伝子操作の手段により新しい形質が市販の作物に付加されるにつれ、「積み
重ね（スタッキング）」形質における問題が生じる。遺伝性の積み重なった形質
を開発するために、この形質は、集団分離のために連鎖されなければならない。
この形質の連鎖を必要としないハイブリッド種子を開発するための改善方法は、
市販のハイブリッド種子を開発するための時間を有意に短縮する。
【０００９】 遺伝子サイレンシング（抑制）は、遺伝子操作による遺伝性形質開発における
別の問題である。遺伝子サイレンシングは、減数分裂後に頻繁に見られる。この
問題の排除または低減は、この領域での科学および産業の状態を進歩させる。
【００１０】 （発明の要旨） 胚形成に関する核酸およびポリペプチドを提供することが本発明の目的である
。
【００１１】 胚形成における転写調節に関与する相互作用タンパク質を同定するために用い
られ得る核酸およびポリペプチドを提供することが本発明の別の目的である。
【００１２】 本発明のポリペプチドの抗原性フラグメントを提供することが本発明の別の目
的である。
【００１３】 本発明の核酸を含有するトランスジェニック植物および植物の部分を提供する
ことが本発明の別の目的である。
【００１４】 本発明の核酸の発現を、トランスジェニック植物において調節するための方法
を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１５】 形質転換頻度を改善するための方法を提供することが、本発明の別の目的であ
る。
【００１６】 種々の供給源由来の細胞において形質転換効率を改善する方法を提供すること
が、本発明の別の目的である。
【００１７】 積極的な選択システムのための方法を提供することが、本発明の別の目的であ
る。
【００１８】 無配偶生殖を介してハイブリッド種子を効率的に生産する方法を提供すること
が、本発明の別の目的である。
【００１９】 形質の連鎖を必要としない形質を積み重ねる方法を提供することが、本発明の
別の目的である。
【００２０】 遺伝子サイレンシングの問題を減少させる方法を提供することが、本発明の別
の目的である。
【００２１】 本発明は、ＨＡＰ３型 ＣＣＡＡＴボックス結合転写アクチベータのポリヌク
レオチドおよびポリペプチドに関し、詳細には、ｌｅａｆｙ ｃｏｔｙｌｅｄｏ
ｎ １転写アクチベータ（ＬＥＣ１）のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに
関する。他の局面において、本発明は、必要に応じて、アンチセンス方向で連結
した発現カセット、少なくとも１つの発現カセットでトランスフェクトされた宿
主細胞、ならびにこの発現カセットを含むトランスジェニック植物および種子と
関連する。本発明のさらなる局面は、このポリヌクレオチドおよびポリペプチド
を使用する方法を含む。さらなる局面において、本発明は、植物における本発明
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を調節する方法に関する。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、非形質転換コント
ロール植物に対して増大または減少され得る。
【００２２】 （発明の詳細な説明） （定義） 用語「単離された（単離した）」は、以下である、核酸またはタンパク質など
の材料をいう：（１）その天然に存在する環境において見出される物質を通常と
もなう成分、またはその物質と相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含ま
ない、あるいは（２）その物質がその天然環境にある場合、その物質は、組成物
への意図的なヒトの介入により変更されているか、そして／またはこの物質に対
して天然の遺伝子座以外の細胞中の遺伝子座に配置されている。
【００２３】 本明細書において用いる場合、「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味し、そし
て一本鎖または二本鎖ポリマーのデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌク
レオチド塩基を含む。核酸はまた、ポリメラーゼによる正しい読み通しを可能に
し、そしてこのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を変更
しない改変ヌクレオチドを含み得る。
【００２４】 本明細書において用いる場合、「ＬＥＣ１核酸」は、ＬＥＣ１ポリペプチドを
コードする核酸またはポリヌクレオチドを意味する。
【００２５】 本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク質
フラグメント、改変タンパク質、アミノ酸配列および合成アミノ酸配列を意味す
る。このポリペプチドはグリコシル化されても、またはされなくてもよい。
【００２６】 本明細書において用いる場合、「ＬＥＣ１ポリペプチド」は、ＨＡＰ３ファミ
リーメンバーであるＣＣＡＡＴボックス結合転写アクチベータポリペプチド（こ
れは、胚発生中の遺伝子発現を調節し、そして配列番号２３に示される保存配列
を含む）を意味する。
【００２７】 本明細書において用いる場合、「植物」は、植物および植物の部分を含む。こ
れには、植物細胞、植物組織（例えば、葉、幹、根、花および種子）を含むがこ
れらに限定されない。
【００２８】 本明細書において用いる場合、「プロモーター」は、転写の開始から上流であ
り、そして転写を開始するための、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の
認識および結合に関与するＤＮＡの領域への言及を含む。
【００２９】 「フラグメント」とは、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列の一部、
それ故、それによりコードされるタンパク質の一部を意図する。ヌクレオチド配
列のフラグメントは、ネイティブな核酸の生物学的活性を保持するタンパク質フ
ラグメントをコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして
有用なヌクレオチド配列のフラグメントは、一般に生物学的活性を保持するフラ
グメントタンパク質をコードしない。従って、ヌクレオチド配列のフラグメント
は、一般に２０、３０、５０、１００、１５０、２００または３００ヌクレオチ
ドより大きく、そして本発明のタンパク質をコードする全ヌクレオチド配列まで
である。概して、このプローブは１０００ヌクレオチドより短く、そして好まし
くは５００ヌクレオチドより短い。本発明のフラグメントは、本発明のポリヌク
レオチドの発現を減少させるために用いられたアンチセンス配列を含む。このよ
うなアンチセンスフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌク
レオチド、約１００ヌクレオチド、かつ全コード配列以下までの範囲で長さが変
化し得る。
【００３０】 ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関していう場合の「機能的等価」は、植
物細胞中でＬＥＣ１タンパク質活性のレベルを調節するのに十分な長さのポリヌ
クレオチドまたはタンパク質を意図する。ポリヌクレオチド機能的等価物は、セ
ンス方向またはアンチセンス方向であり得る。
【００３１】 「改変体」とは、実質的に類似の配列を意図する。概して、本発明の核酸配列
改変体は、ネイティブのヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、６５％
、または７０％、好ましくは７５％、８０％または９０％、より好ましくは少な
くとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
ここで配列同一性％は、配列全体に基づき、そして５０のＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔ
および３のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを用いるＧＡＰ分析により決定される。
概して、本発明のポリペプチド配列改変体は、ネイティブのタンパク質に対して
、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０
％、好ましくは少なくとも約８５％または９０％、そしてより好ましくは少なく
とも約９５％の配列同一性を有する。ここで配列同一性％は、配列全体に基づき
、そして１２のＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔおよび４のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを
用いるＧＡＰ分析により決定される。
【００３２】 「応答性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）植物細胞」または「応答性宿主細胞」は、
ＬＥＣ１ポリペプチドもＬＥＣ１ポリヌクレオチドも導入されていない細胞に比
較して、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１ポリヌクレオチドの導入に正の応
答を示す細胞をいう。この応答は、組織培養応答を増強する、体細胞胚形成を誘
導する、無配偶生殖を誘導する、形質転換効率を増大させる、または再生植物の
回収を増大させるものであり得る。
【００３３】 「不応性（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）植物細胞」は、一般に組織培養応答、
形質転換効率または再生植物の回収などの正の応答を示さない応答性植物細胞で
ある。
【００３４】 （核酸） 本発明は、ＨＡＰ３型ＣＣＡＡＴボックス結合転写アクチベータに関し、そし
て詳細には、ｌｅａｆｙ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ １転写アクチベータ（ＬＥＣ１
）に関する。ＬＥＣ１ポリヌクレオチドの発現は、胚様構造の形成を開始し、そ
して形質転換体の生長および回収を改善する。用語、無配偶生殖は、有性生殖方
法を置換または交換する無性生殖を記載するために用いられる。無配偶生殖が生
じる場合、胚は母性の組織から生成され、そして母性のゲノムのみを用いる。
【００３５】 詳細には、本発明は、以下： （ａ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号３および４、５および６、９および１０、または１１および１
２のプライマー、またはＶｅｃｔｏｒ ｎｔｉ Ｓｕｉｔｅ、ＩｎｆｏｒＭａｘ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ５を用いることにより決定されたプライマーを用いて、植物
核酸ライブラリーから増幅されたポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１の少な
くとも２０の連続する塩基を含むポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号２３の保存モチーフを有する植物ＨＡＰ３型 ｃｃａａｔボッ
クス転写アクチベータをコードするポリヌクレオチドであって、このポリヌクレ
オチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物由来である、ポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号１、９、１１、１３、１７または２１に対して少なくとも６０
％の配列同一性を有するかまたは、配列番号１５もしくは１９に対して６５％の
配列同一性を有するか、または配列番号７に対して７０％の配列同一性を有する
ポリヌクレオチドであって、この配列同一性％は、配列全体に基づき、そして５
０のＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを用いるＧＡ
Ｐ分析により決定される、ポリヌクレオチド； （ｆ）少なくとも２５ヌクレオチド長を含むポリヌクレオチドであって、この
ポリヌクレオチドは、配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９また
は２１に示す配列を有するポリヌクレオチドに対して、高ストリンジェンシー条
件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２のタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここでこのポリヌクレオチド
は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物由来である、ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１に示す
配列を有するポリヌクレオチド；ならびに （ｉ）（ａ）から（ｈ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、 からなる群より選択されるメンバーを含む、単離された核酸に関する。
【００３６】 無配偶生殖の多くの場合、珠心または内珠皮のような母性組織は、「芽を出し
て（ｂｕｄ ｏｆｆ）」体細胞胚を生成する。次いで、これらの胚は、正常に種
子へと発達する。減数分裂および受精が回避されるので、このような種子から発
生する植物は、母性植物と遺伝的に同一である。ｌｅａｆｙ ｃｏｔｙｌｅｄｏ
ｎ１遺伝子の珠心珠皮中での発現、または大胞子母細胞中での細胞特異的発現は
、母性組織からの胚形成を誘発する。
【００３７】 親に同一な種子を産生することは多くの利点を有する。例えば、高収量のハイ
ブリッドが種子生成に用いられ、高収量ハイブリッド種子の同一コピーを増やし
得る。これは、種子のコストを大いに下げ、そして市販される遺伝子型の数を増
加させる。遺伝子は、市販のハイブリッドにおいて直接評価され得る。なぜなら
、子孫は分離しないからである。これにより戻し交配の年数が削減される。
【００３８】 無配偶生殖はまた、雄性不稔と組み合わされた場合、導入遺伝子の封じ込めの
方法を提供する。雄性不稔自律性アガモスパーミーの構築は、遺伝的に操作した
形質が、雑草のような関連物とハイブリダイズすることを防ぐ。
【００３９】 遺伝子の積み重ねは、無配偶生殖で比較的容易である。ハイブリッドは、種々
の新しい形質で首尾よく再形質転換され、そして無配偶生殖を介して繁殖され得
る。この形質は、連鎖される必要がない。なぜなら、無配偶生殖は分離に関連す
る問題を回避するからである。
【００４０】 無配偶生殖は、遺伝子サイレンシングの低下を提供し得る。遺伝子サイレンシ
ングは減数分裂後に頻繁にみられる。減数分裂は決して生じないので、遺伝子サ
イレンシングの頻度を排除または減少することは可能であり得る。無配偶生殖は
また、雑種強勢のような複合形質を有する所望の表現型を安定化するために用い
られ得る。このような形質は、無配偶生殖を介して容易に維持され、そして同一
に繁殖され得る。
【００４１】 カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物内（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）形質転換
の間、ＬＥＣ１を過剰発現するために用いられた（Ｈａｒａｄａら、ＷＯ９８／
３７１８４）。Ｈａｒａｄａらにより指摘されたように、３５Ｓは強力なプロモ
ーターであり、かれらの実験において、３５Ｓ：ＬＥＣ１は、形質転換を改善せ
ず、そして実際にそれを妨げるようであったことが見出された（３５Ｓ：ＬＥＣ
１での形質転換効率は、通常得られる効率の０．６％と見積もられた）。従って
、発生の配偶体段階における過剰発現のような細胞型の過剰発現は、形質転換プ
ロセスおよび形質転換された子孫の首尾よい回収にとって不適切かつ有害であり
得る。対照的に、本発明者らは、適切な制御エレメント（組織特異的プロモータ
ーおよび／または誘導性プロモーターを含む）下で、そして適切な植物細胞中で
のＬＥＣ１遺伝子の異所性の発現が、通常培養されにくい組織／遺伝子型中で胚
形成を刺激するために用いられ得ることを示している。同様に、培養されにくい
遺伝子型における異所性発現は、胚前駆細胞の数を増加させ得（または胚へと発
達する数を増加させ得）、これは形質転換頻度における増加を導く。ＲＮＡまた
はタンパク質を用いる一過性発現は、胚形成を導く事象のカスケードを開始する
のに十分であり得る。これは、トウモロコシ胚盤、未成熟葉基部、未成熟雄穂な
どのような標的組織において貴重である。ＬＥＣ１遺伝子は、陽性の選択マーカ
ーとして用いられ得る。すなわち、これはトランスジェニック細胞中で周囲の野
生型細胞を殺傷することなく胚形成を誘発する。導入された遺伝子を受け取って
いる細胞が胚形成をうけるか、または既に組織中で胚形成をうけている組織中で
ＬＥＣ１発現が体細胞胚のより迅速な再反復を刺激するために、これが起こる。
【００４２】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＬＥＣ１ポリペプチドが、真核生物転写アクチベー
タの「ＣＣＡＡＴ−ボックス結合因子」クラスのＨＡＰ３サブユニットに相同で
あることは、配列類似性を通じて見出されている（Ｌｏｔａｎら、１９９８、Ｃ
ｅｌｌ ９３：１１９５〜１２０５）。Ｈａｐ２／３／４および５からなるこの
クラスのタンパク質は、真核生物細胞において特定の遺伝子セットを活性化する
ようであるヘテロオリゴマー転写複合体を形成する。このファミリー（例えば、
Ｈａｐ２およびＨａｐ５）の特定のメンバーは、遍在性に発現されるようである
。一方、異なるＨａｐ３メンバーは、発生性調節および環境性調節の下にある。
植物ＨＡＰ３ポリペプチドは、このタンパク質の「Ｂドメイン」における他のＨ
ＡＰ３ホモログに対する高い程度の配列同一性により認識され得る。例えば、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＬＥＣ１のＢドメイン（アミノ酸残基２８〜残基１１７
）は、ＨＡＰ３ファミリーの他のメンバー（トウモロコシ（ＨＡＰ３）、ニワト
リ、ヤツメウナギ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ヒト、マウス、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎ
ｉｄｕｌｅｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＫｌｕｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｌａｃｔｉｓを含む）に対して５５％と６３％との間の同一性（７５〜
８５％類似性）を共有する（Ｌｏｔａｎら、１９９８）。
【００４３】 形質転換細胞におけるＬＥＣ１遺伝子の発現は、胚発生を開始させ、そして既
に存在する胚の発生を刺激する。通常、ＬＥＣ１発現は、胚発生の後期段階での
適切な胚成熟に必須であり、従ってＬＥＣ１導入遺伝子発現はまた、これらのプ
ロセスを促進し得る。体細胞胚形成へのこれらの影響の組み合わせた効果は、形
質転換細胞の生長を刺激することだけでなく、形質転換した体細胞胚が正常な生
存可能な様式で発生することを保証する（形質転換した体細胞胚が活発に発芽す
る能力を増大させる）ことでもある。胚成熟を超える継続した異所性の過剰発現
は、発芽および栄養性の植物生長（これらの発生段階の間のＬＥＣ１導入遺伝子
の下方調節を必要とし得る）に負に影響し得る。
【００４４】 ＬＥＣ１遺伝子の発現は、胚形成生長を開始または維持する能力を有する細胞
中で生長を刺激する。樹立された分裂組織における細胞または分裂組織由来細胞
系列は、胚への移行をうける傾向が低いかもしれない。さらに、特定の生殖組織
（または細胞）を標的とする形質転換方法（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓへ
のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの真空浸潤）は、形質転換体の回収に対して有害
な効果を有し得る（胚形成に関連する遺伝子を誘発することは、これらの細胞の
適切な機能を破壊し得る）。
【００４５】 本発明の植物ＬＥＣ１遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号２
３に示される診断モチーフを用いることにより非ＬＥＣ ＨＡＰ３タンパク質か
ら識別され得る。
【００４６】 本発明の単離された核酸は、以下：（ａ）標準的組換え方法、（ｂ）合成技術
またはそれらの組み合わせ、を用いて作製され得る。いくつかの実施形態におい
て、本発明のポリヌクレオチドは、クローニングされ、増幅され、または単子葉
類もしくは双子葉類から構築される。好ましい実施形態において、単子葉類はト
ウモロコシ、ソルガム、オオムギ、コムギ、キビ（ｍｉｌｌｅｔ）、またはイネ
である。好ましい双子葉類は、ダイズ、ヒマワリ、アブラナ、アルファルファ、
ジジャガイモまたはキャッサバを含む。
【００４７】 本発明に含まれる機能的フラグメントは、ストリンジェントな条件下で選択的
にハイブリダイズするプライマーを用いて獲得され得る。プライマーは、一般に
、少なくとも１２塩基長であり、そして２００塩基ほどと長くともよいが、一般
に１５〜７５、好ましくは１５〜５０である。機能的フラグメントは、種々の技
術（例えば、制限分析、サザン分析、プライマー伸長分析、およびＤＮＡ配列分
析）を用いて同定され得る。
【００４８】 本発明は、同一のアミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドを含む。
遺伝コードの縮重は、このような「サイレント改変体」を可能にする。これは、
例えば、本発明のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体を選択的にハイブリダイ
ズおよび検出するために用いられ得る。さらに、本発明は対立遺伝子改変体を含
む単離された核酸を含む。用語「対立遺伝子」は、本明細書において用いる場合
、同じ遺伝子の関連する核酸をいう。
【００４９】 本発明に含まれる種々の核酸は、例えば、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発
、リンカースキャンニング変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる変異誘発な
どにより獲得され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、第８．０．３〜８．５．９頁
を参照のこと。また、一般には、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編）、ＤＩＲＥＣＴＥＤ
ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、（Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）を参照のこと。このように、本発明はまた、本発
明の配列と実質的な配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を包
含する。
【００５０】 本発明に含まれる改変体は、核酸配列またはポリペプチド配列に対する、個々
の置換、欠失または付加を含み得る。これらは、これらのコードされた配列中の
単一アミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更、付加または欠失しており、
ここで、「保存的に改変された改変体」は、この変更が、化学的に類似のアミノ
酸でのアミノ酸の置換を生じるものである。核酸が合成的に調製または変更され
る場合、意図される宿主の既知のコドン優先度が利用され得る。
【００５１】 本発明はまた、所望の特徴を得るために本発明のポリヌクレオチドの配列シャ
ッフリングにより生成された「シャッフル体（ｓｈｕｆｆｌｅｎｔ）」を含む。
配列シャッフリングは、ＰＣＴ公開番号９６／１９２５６に記載されている。ま
た、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９４：４５０４〜４５０９（１９９７）を参照のこと。
【００５２】 本発明はまた、異種コード配列の翻訳の調節のための５’および／または３’
のＵＴＲ領域の使用を含む。陽性の配列モチーフは、翻訳開始コンセンサス配列
（Ｋｏｚａｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８１２５（１９８
７））および７−メチルグアノシンキャップ構造（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：７３７５（１９８５））を含む。陰性の
エレメントは、安定な分子内５’ＵＴＲステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構
造（Ｍｕｅｓｉｎｇら、Ｃｅｌｌ ４８：６９１（１９８７））、および５’Ｕ
ＴＲ中のＡＵＧ配列または適切なＡＵＧに先導される短いオープンリーディング
フレーム（Ｋｏｚａｋ、前出、Ｒａｏら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．８：２８４（１９８８））を含む。
【００５３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドのポリペプチドコードセグメントは、コド
ンの用法を変更するために改変され得る。変更されたコドン用法は、翻訳効率を
変更するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのコード領域中のコド
ン用法は、市販のソフトウェアパッケージ（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ
ｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐか
ら入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４）を参
照のこと）またはＭａｃＶｅｃｔｏｒ ４．１（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ
Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ））を用いて統計的に分析され得る。
【００５４】 例えば、本発明の核酸は、目的の植物中の発現を強化するために最適化され得
る。例えば、ＥＰＡ０３５９４７２；ＷＯ９１／１６４３２；Ｐｅｒｌａｋら（
１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３２４〜
３３２８；およびＭｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１７：４７７〜４９８を参照のこと。この様式では、このポリヌクレオチ
ドは、植物の好ましいコドンを利用して合成され得る。例えば、Ｍｕｒｒａｙら
（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７〜４９８（こ
の開示は本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
【００５５】 本発明は、本発明の配列の少なくとも１６の連続する塩基を含む単離された核
酸を含むサブ配列を提供する。例えば、単離された核酸は、本発明の配列の少な
くとも１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、または１００の連続
するヌクレオチドを含む核酸を含む。単離した核酸のサブ配列は、核酸に結合、
インターカレート、切断および／または架橋する化合物のサブ配列への導入によ
り遺伝子発現を調節または検出するために用いられ得る。
【００５６】 本発明の核酸は、ポリヌクレオチドの単離を補助するための核酸に挿入された
１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を便利に
も含み得る。また、翻訳可能配列は、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単
離において補助となるよう挿入され得る。例えば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー
配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。
【００５７】 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよ
び／または発現のためのベクター、アダプター、プロモーター、移行ペプチドま
たはリンカーに結合され得る。クローニングおよび／または発現におけるそれら
の機能を最適化するため、ポリヌクレオチドの単離を補助するため、またはポリ
ヌクレオチドの細胞への導入を改善するために、さらなる配列が、このようなク
ローニング配列および／または発現配列に付加され得る。クローニングベクター
、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は、当該分野で周知であり、
そして広範に記載されている。このような核酸の記載については、例えば、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇｓ １９
９５、１９９６、１９９７（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；およびＡｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｔａｌｏｇ ’９７（Ａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を参照のこと。
【００５８】 本発明の単離された核酸組成物（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、
またはそれらのハイブリッド）は、当業者に公知の多数のクローニング方法論を
用いて植物の生物学的供給源から獲得され得る。いくつかの実施形態において、
ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドプローブは、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮ
Ａライブラリーにおける所望の配列を同定するために用いられる。
【００５９】 代表的な総ＲＮＡおよびｍＲＮＡ単離プロトコールは、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｌ
ａｒｋ、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）；な
らびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよび
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）に記載
されている。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡ単離キットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、および５’−３’（Ｐａ
ｏｌｉ、ＰＡ）などの供給業者から市販されている。米国特許第５，６１４，３
９１号；および同第５，４５９，２５３号もまた参照のこと。
【００６０】 代表的なｃＤＮＡ合成プロトコールは、当業者に周知であり、そしてＰｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９
９７）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９９５）などの標準的参考文献に記載されている。ｃＤＮＡ合成キットはＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅまたはＰｈａｒｍａｃｉａなどの種々の商業的供給業者から入手
可能である。
【００６１】 ９５％より高い純度の全長ｃＤＮＡライブラリーを構築する代表的方法は、Ｃ
ａｒｎｉｎｃｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３７：３２７〜３３６（１９９６）によ
り記載されている。全長ライブラリーを生成するための他の方法は当該分野で公
知である。例えば、Ｅｄｅｒｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（６）：
３３６３〜３３７１（１９９５）；およびＰＣＴ出願ＷＯ９６／３４９８１を参
照のこと。
【００６２】 ためｃＤＮＡライブラリーを正規化して、それぞれのクローンがより等しく提
示されるライブラリーを作製することはしばしば便利である。ｃＤＮＡライブラ
リーを正規化するための多数のアプローチは、当該分野で公知である。正規化ラ
イブラリーの構築は、Ｋｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８（１９）：５
７０５〜５７１１（１９９０）；Ｐａｔａｎｊａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１９４３〜１９４７（１９９１）；米国特許５，
４８２，６８５号、および同第５，６３７，６８５号；ならびにＳｏａｒｅｓら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９２２８〜９２３２
（１９９４）に記載されている。
【００６３】 差引きしたｃＤＮＡライブラリーは、少ない量のｃＤＮＡ種の割合を増加する
ための別の手段である。Ｆｏｏｔｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）；ＫｈｏおよびＺａｒｂ
ｌ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ３（２）：５８〜６３（１９９１）；Ｓｉｖｅおよび
Ｓｔ．Ｊｏｈｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（２２）：１０９３７（
１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
９５）；ならびにＳｗａｒｏｏｐら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（８
）：１９５４（１９９１）を参照のこと。ｃＤＮＡ差引きキットは、市販されて
いる。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照のこと。
【００６４】 ゲノムライブラリーを構築するため、ゲノムＤＮＡの大きいセグメントが無作
為断片化により生成される。適切な分子生物学的技術および装置の例は、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、第１〜３巻（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、編、Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９８７）、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｐｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ
−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）
に見出される。ゲノムライブラリーの構築のためのキットもまた市販されている
。
【００６５】 ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーは、本明細書において開示さ
れるもののような、本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いてスクリーニン
グされ得る。プローブは、同じ植物種または異なる植物種における相同ポリヌク
レオチドを単離するために、ゲノムｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列とのハイブリダ
イズに用いられ得る。当業者は、このアッセイにおいて、種々の程度のストリン
ジェンシーのハイブリダイゼーションが、使用され得ること；およびこのハイブ
リダイゼーションまたは洗浄媒体のいずれかがストリンジェントであり得ること
を理解する。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨおよびホル
ムアミドのような部分的変性溶媒の存在により制御され得る。
【００６６】 代表的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ｐＨ７．０〜
８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、代表的には約０．０１〜１．
０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が短いプローブ（例
えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプ
ローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃で
ある。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加
で達成され得る。
【００６７】 本発明を規定する目的のために、以下の条件が提供される。代表的な低いスト
リンジェンシー条件は、３７℃で、３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼー
ション、および５０℃での１×〜２× ＳＳＣ（２０× ＳＳＣ＝３．０Ｍ Ｎ
ａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸３ナトリウム）での洗浄を含む。代表的な中度スト
リンジェンシー条件は、３７℃で、４０〜４５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％ ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および５５℃での０．５×〜１
× ＳＳＣでの洗浄を含む。代表的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃で、
５０％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中のハイブリダイゼーシ
ョン、および６０℃での０．１× ＳＳＣ中での洗浄を含む。代表的なハイブリ
ダイゼーション時間は４〜１６時間である。
【００６８】 核酸のハイブリダイゼーションへの広範な手引きは、以下に見出される：Ｔｉ
ｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，第Ｉ部
、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）。しばしば、ｃＤＮＡライブラリーは、比較的まれな
ｃＤＮＡの再提示を増加させるために正規化される。
【００６９】 本発明の核酸は、増幅技術を用いて核酸サンプルから増幅され得る。例えば、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は，本発明のポリヌクレオチドの配列およ
びゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに直接由来する関連ポ
リヌクレオチドを増幅するために用いられ得る。ＰＣＲおよび他のインビトロ増
幅方法はまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクロ
ーニングするため、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプロー
ブとして使用するための核酸を作製するため、核酸配列決定のため、または他の
目的のために有用であり得る。
【００７０】 インビトロ増幅方法に有用な技術の例は、以下に見出される：Ｂｅｒｇｅｒ、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら、米国特許
番号４，６８３，２０２（１９８７）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉ
ｎｎｉｓら、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、ＣＡ（１９９０）。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販のキットは当該分野で公
知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉ
ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照のこと。Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、長いＰＣＲ産物の収量を改善するために用
いられ得る。ＰＣＲに基づくスクリーニング方法もまた、記載されている。Ｗｉ
ｌｆｉｎｇｅｒらは、ＰＣＲに基づく方法を記載している。この方法では、最長
のｃＤＮＡが最初の工程で同定され、それにより不完全なクローンが研究から除
外され得る。Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２２（３）：４８１〜４８６（１
９９７）。
【００７１】 本発明の１つの局面では、核酸は、植物核酸ライブラリーから増幅され得る。
核酸ライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、またはイン
トロンプロセシングの任意の段階で核転写物から一般的に構築されたライブラリ
ーであり得る。ライブラリーは、種々の植物組織から作製され得る。有糸分裂的
に活性な組織（例えば、シュート分裂組織、シュート分裂組織培養物、胚、カル
スおよび懸濁培養物、未成熟の雌穂および雄穂、ならびに若い実生）を用いて良
好な結果が得られている。本発明のｃＤＮＡは、未成熟の接合体胚および再生中
のカルスライブラリーから得られた。
【００７２】 あるいは、本発明の配列は、他の生物体、特に他の植物、より詳細には他の単
子葉類における対応する配列を単離するために用いられ得る。この様式において
、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどのような方法が用いられ、本発明の配列
に実質的な配列類似性を有するような配列が同定され得る。例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、
およびＩｎｎｉｓら（１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。本明細書に記載の本発明
のコード配列全体またはそれらのフラグメントに対するそれらの配列同一性に基
づいて単離されたコード配列は、本発明により包含される。
【００７３】 本発明の単離された核酸はまた、以下のような方法による直接の化学合成によ
り調製され得る：Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９
９（１９７９）のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．６８：１０９〜１５１（１９７９）のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕ
ｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１）の
ジエチルホスホルアミダイト方法；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ
、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９〜１８６２（１９８１）に
より記載される固相ホルホルアミダイトトリエステル方法（例えば、Ｎｅｅｄｈ
ａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２
：６１５９〜６１６８（１９８４）に記載のような、例えば、自動化シンセサイ
ザーを用いる）；ならびに米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法。
化学合成は一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは相補的配列と
のハイブリダイゼーションにより、または鋳型としてこの一本鎖を用いるＤＮＡ
ポリメラーゼでの重合により、二本鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、ＤＮＡ
の化学合成は、約１００塩基の配列に制限されるが、より長い配列は、より短い
配列の連結により獲得され得ることを理解する。
【００７４】 本発明の核酸は、以下のプライマー対を用いて増幅された核酸を含む：配列番
号３および４、５および６、９および１０、または１１および１２、あるいはＶ
ｅｃｔｏｒ ｎｔｉ Ｓｕｉｔｅ、ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５を用
いることにより決定されたプライマー。
【００７５】 （発現カセット） 別の実施形態において、本発明の単離された核酸を含む発現カセットが提供さ
れる。発現カセットは、代表的に、意図された宿主細胞（例えば、形質転換植物
の組織）中でポリヌクレオチドの転写を指向する転写開始調節配列に作動可能に
連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。
【００７６】 本発明と組み合わせて使用され得るこのような発現カセットの構築は、本発明
の開示を考慮すれば、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；（１９８９）；Ｇ
ｅｌｖｉｎら；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（１９９０）；Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｏｍｍｅｒｃｉ
ａｌ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｐｌｏｂｌｅｍｓ、Ｐｒａｋａｓｈら編；
Ｏｘｆｏｒｄ＆ＩＢＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ、
Ｉｎｄｉａ；（１９９３）；およびＨｅｓｌｏｔら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｙｅａ
ｔｓ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；（１９９２）（それぞれは、そ
の全体が参考として本明細書に援用されている）を参照のこと。
【００７７】 例えば、植物発現ベクターは、以下を含み得る：（１）５’および３’調節配
列の転写制御下のクローニングされた植物遺伝子、および（２）優性選択マーカ
ー。このような植物発現ベクターはまた、所望の場合、プロモーター調節領域（
例えば、誘導性発現、構成的発現、環境調節的発現もしくは発生調節的発現、ま
たは細胞もしくは組織特異的／選択的発現を付与するもの）、転写開始開始部位
、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止部位、および／
またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００７８】 構成的な、組織優先プロモーターまたは誘導性プロモーターは、使用され得る
。構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５
Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−
ＤＮＡ由来の１’−プロモーターまたは２’−プロモーター、アクチンプロモー
ター、ユビキチンプロモーター、ヒストンＨ２Ｂプロモーター（Ｎａｋａｙａｍ
ａら、１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３０：１６７〜１７０）、Ｓｍａｓプロ
モーター、シンナミナルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第
５，６８３，４３９号）、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ルビス
コ（ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、および当該分
野で公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域を含む。
【００７９】 誘導性プロモーターの例は、低酸素または寒冷ストレスにより誘導性のＡｄｈ
１プロモーター、熱ストレスにより誘導性のＨｓｐ７０プロモーター、光により
誘導性のＰＰＤＫプロモーター、毒性緩和剤によって誘導されるＩｎ２プロモー
ター、エストロゲンによって誘導されるＥＲＥプロモーター、および光誘導され
るＰｅｐｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅプロモーターである。
【００８０】 発生制御下のプロモーターの例は、特定の組織（例えば、葉、根、果実、種子
または花）中の転写を優先的に開始するプロモーターを含む。例示的プロモータ
ーは、別の特異的プロモーター５１２６（米国特許第５，６８９，０４９号およ
び同第５，６８９，０５１号）である。種子優先（ｓｅｅｄ−ｐｒｅｆｅｒｒｅ
ｄ）プロモーターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：２
７ｋＤγゼインプロモーターおよびｗａｘｙプロモーター（Ｂｏｒｏｎａｔ，Ａ
．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｍ．Ｃ．，Ｒｅｉｎａ，Ｍ．，Ｐｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃ
ｈ，Ｐ．およびＰａｌａｕ、Ｊ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ｏｆ ２８ｋＤ ｇｌｕｔｅｌｉｎ−２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｍａｉ
ｚｅ；Ｃｏｍｍｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ５’ｆｌａｎｋｉｎｇ
ｒｅｇｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｚｅｉｎ ａｎｄ ｇｌｕｔｅｌｉｎ ｇｅｎ
ｅｓ；Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４７：９５〜１０２（１９８６）およびＲｅｉｎａ
，Ｍ．、Ｐｏｎｔｅ，Ｉ．，Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｐ．，Ｂｏｒｏｎａｔ，Ａ．およ
びＰａｌａｕ，Ｊ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍ
ｉｃ ｃｌｏｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ Ｚｃ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ
Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｗ６４ Ａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８
（２１）：６４２６（１９９０））。ｗａｘｙプロモーターに関する以下の部位
を参照のこと：Ｋｌｏｅｓｇｅｎ，Ｒ．Ｂ．、Ｇｉｅｒｌ，Ａ．Ｓｃｈｗａｒｚ
−Ｓｏｍｍｅｒ，Ｚ．Ｓ．およびＳａｅｄｌｅｒ，Ｈ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗａｘｙ ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｚｅａ ｍａ
ｙｓ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：２３７〜２４４（１９８６）。こ
れらのそれぞれの開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【００８１】 好ましくは、弱い構成的プロモーター（例えば、Ｎｏｓプロモーター）、誘導
性プロモーター（例えば、Ｉｎ２）、または珠心優先プロモーターまたは珠皮優
先プロモーターは、無胞子生殖を誘導するために用いられる。例えば、オオムギ
またはトウモロコシのＮｕｃ１プロモーター、トウモロコシのＣｉｍ １プロモ
ーターまたはトウモロコシのＬＴＰ２プロモーターが、珠心中で優先的に発現す
るために用いられ得る。例えば、１９９８年８月２０日提出、米国出願番号６０
／０９７，２３３号（この開示は参考として本明細書に援用される）を参照のこ
と。
【００８２】 異種プロモーターまたは非異種プロモーター（すなわち内因性プロモーター）
のいずれかが本発明の核酸の発現を指向するために使用され得る。これらのプロ
モーターはまた、例えば、所望の組織中で本発明のタンパク質の濃度および／ま
たは組成を減少、増加、または変更するためにアンチセンス核酸の発現を駆動す
るように発現カセット中で用いられ得る。
【００８３】 ポリペプチド発現が所望される場合、一般にポリヌクレオチドコード領域の３
’末端でポリアデニル化領域を含むことが所望される。ポリアデニル化領域は、
天然の遺伝子、種々の他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡから誘導され得る。付
加されるべき３’末端配列は、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子またはオクト
ピンシンターゼ遺伝子、あるいは別の植物遺伝子、または好適度は低いが他の任
意の真核生物遺伝子に由来し得る。
【００８４】 イントロン配列は、部分的コード配列の５’非翻訳領域またはコード配列に付
加され、蓄積する成熟メッセージの量を増加させ得る。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎ
およびＢｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４３９５〜４４０５（１９
８８）；Ｃａｌｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：１１８３〜１２００（１９
８７）を参照のこと。トウモロコシイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、
および６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は当該分野で公知である。一般に
、Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１６章、Ｆｒｅｅｌｉｎｇおよ
びＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照の
こと。
【００８５】 本発明のポリヌクレオチド由来の配列を含むベクターは、代表的に植物細胞に
選択可能表現型を付与するマーカー遺伝子を含む。通常、選択可能マーカー遺伝
子は、抗生物質耐性または除草剤耐性をコードする。適切な遺伝子としては、抗
生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性をコードする
遺伝子（例えば、ａａｄａ遺伝子）、ストレプトマイシン耐性をコードするスト
レプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシンまた
はジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性をコードするネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシン耐性をコードする
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子が挙げられる。
【００８６】 除草剤に対する耐性をコードする適切な遺伝子としては、アセトラクテートシ
ンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害するように作用する遺伝子、特に、スルホニル
ウレア型除草剤の作用を阻害するように働く遺伝子（例えば、特にＳ４および／
またはＨｒａ変異において、このような耐性を導く変異体を含有するアセトラク
テートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミンシンターゼの作用を阻害する
ように働く遺伝子（例えば、ホスフィノトリシンまたはバスタ（ｂａｓｔａ）（
例えば、ｂａｒ遺伝子））、または当該分野で公知の他のこのような遺伝子が挙
げられる。このｂａｒ遺伝子は、除草剤バスタに対する耐性をコードし、そして
ＡＬＳ遺伝子は、除草剤クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）に対
する耐性をコードする。上記の抗生物質および除草剤耐性選択マーカーと組み合
わせて有用である（すなわち、ＬＥＣ１遺伝子の使用は、化学物質選択を用いる
場合に形質転換頻度を増大させ得る）が、ＬＥＣ１発現の好ましい用途は、非形
質転換体の増殖を遅延させる阻害性化合物を要することなく、形質転換細胞に増
殖の利点を付与するこの遺伝子を利用する。従って、ＬＥＣ１形質転換体は、単
にそれらの異なる増殖利点に基づいて回収される。
【００８７】 高等植物における遺伝子の発現のために有用な代表的ベクターは、当該分野で
周知であり、そして、Ｒｏｇｅｒｓら、Ｍｅｔｈ．Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５
３：２５３〜２７７（１９８７）により記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクター
を含む。本明細書において有用な代表的Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターは
、Ｓｃｈａｒｄｌら、Ｇｅｎｅ、６１：１〜１１（１９８７）およびＢｅｒｇｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８４０２〜８４
０６（１９８９）のプラスミドｐＫＹＬＸ６およびｐＫＹＬＸ７である。本明細
書において有用な別のベクターは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能なプラスミドｐＢＩ１
０１．２である。
【００８８】 ベクターとして使用され得る種々の植物ウイルスは、当該分野で公知であり、
そしてそれにはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、ジェミニウイルス
（ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、ブロムモザイク（ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ）ウ
イルス、およびタバコモザイクウイルスが挙げられる。
【００８９】 本発明のポリヌクレオチドは、所望により、センス方向またはアンチセンス方
向のいずれかで発現され得る。植物細胞においては、アンチセンスＲＮＡは、目
的の酵素をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることにより遺伝子発現を阻害する
ことが示されている。例えば、Ｓｈｅｅｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８８０５〜８８０９（１９８８）；およびＨｉａｔｔ
ら、米国特許第４，８０１，３４０号を参照のこと。
【００９０】 抑制の別の方法は、センス抑制である。センス方向に構成された核酸の導入は
、標的遺伝子の転写をブロックする効果的な手段であることが示された。内因性
遺伝子の発現を調節するこの方法の使用の例については、Ｎａｐｏｌｉら、Ｔｈ
ｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９〜２８９（１９９０）および米国特許第
５，０３４，３２３号を参照のこと。
【００９１】 最近の研究は二本鎖ＲＮＡの使用での抑制を示してきた。このような研究はＴ
ａｂａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：５３８８：４３０〜４３１（１９９８
）に記載されている。
【００９２】 触媒性ＲＮＡ分子すなわちリボザイムはまた、植物遺伝子の発現を阻害するた
めに用いられ得る。アンチセンスＲＮＡ内へのリボザイム配列の包含は、アンチ
センスＲＮＡにＲＮＡ切断活性を付与し、それにより構築物の活性を増加する。
標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３４：５８５〜５９１（１９８８）に記載されている。
【００９３】 本発明のポリヌクレオチド上のペンダント基としての種々の架橋剤、アルキル
化剤、およびラジカル生成種は、核酸を結合、標識、検出および／または切断す
るために用いられ得る。例えば、Ｖｌａｓｓｏｖ，Ｖ．Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８６）１４：４０６５〜４０７６は、一本鎖ＤＮＡ
フラグメントと標的配列に相補的なヌクレオチドのアルキル化誘導体との共有結
合を記載している。同じグループによる類似の研究の報告は、Ｋｎｏｒｒｅ、Ｄ
．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９８５）６７：７８５〜７８９によるもので
ある。ＩｖｅｒｓｏｎおよびＤｅｒｖａｎはまた、切断を活性化し得る改変ヌク
レオチドの組み込みにより媒介される一本鎖ＤＮＡの配列特異的切断を示した（
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８７）１０９：１２４１〜１２４３）。Ｍ
ｅｙｅｒ、Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８９）１１１：８
５１７〜８５１９は、一本鎖標的ヌクレオチド配列に相補的なアルキル化剤を用
いて標的ヌクレオチドに対する共有架橋をもたらす。ソラレンにより媒介された
一本鎖オリゴヌクレオチドへの光活性化架橋は、Ｌｅｅ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）２７：３１９７〜３２０３により開示された。三
重らせん形成プローブにおける架橋の使用はまた、Ｈｏｍｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０）１１２：２４３５〜２４３７により開示された。一
本鎖オリゴヌクレオチドへの架橋のためのアルキル化剤としてのＮ４，Ｎ４−エ
タノシトシンの使用はまた、以下により記載されている：ＷｅｂｂおよびＭａｔ
ｔｅｕｃｃｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８６）１０８：２７６４〜
２７６５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８６）１４：７６６１〜
７６７４；Ｆｅｔｅｒｉｔｚら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４００
０（１９９１）。核酸を結合、検出、標識、および／または切断するための種々
の化合物は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，５４３，５０７号
；同第５，６７２，５９３号；同第５，４８４，９０８号；同第５，２５６，６
４８号；および同第５，６８１，９４１号を参照のこと。
【００９４】 （タンパク質） 別の局面において、本発明は、以下： （ａ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２の少
なくとも２５の連続するアミノ酸を含むポリペプチド； （ｂ）胚発生および成熟の間遺伝子発現を調節する植物ＨＡＰ３型ＣＣＡＴＴ
ボックス結合転写アクチベータである、ポリペプチド； （ｃ）配列番号２、１２、１４、１６、２０または２２に対して少なくとも６
０％の配列同一性、または配列番号８、１０、または１８に対して７０％の配列
同一性を有するポリペプチドであって、この配列同一性％は、配列全体に基づき
、そして１２のＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔおよび４のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを
用いるＧＡＰ分析により決定される、ポリペプチド； （ｄ）請求項１の核酸によりコードされるポリペプチド； （ｅ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、または２１の核
酸によりコードされるポリペプチド；ならびに （ｆ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２に示
す配列を有するポリペプチド、 からなる群より選択されたメンバーを含む、単離されたタンパク質に関する。
【００９５】 本発明のタンパク質は、ネイティブタンパク質における１つ以上の部位での１
つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮）、付加または置換によるネイティブタ
ンパク質に由来するタンパク質を含む。このような改変体は、例えば、遺伝子多
型性またはヒトの操作から生じ得る。このような操作のための方法は、当該分野
で一般に公知である。
【００９６】 例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、目的のネイティブタンパク質
をコードするクローン化ＤＮＡ配列における変異により調製され得る。変異誘発
およびヌクレオチド配列変化のための方法は、当該分野で周知である。例えば、
ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２；Ｋｕｎｋ
ｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２
；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびその中で引用
される参考文献（参考として本明細書において援用される）を参照のこと。目的
のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換についての手引き
はＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆ
ｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（参考として本明細書に援用さ
れる）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を類似の
特性を有する別のアミノ酸で交換すること）は、好適であり得る。
【００９７】 目的のタンパク質の改変体を構築することにおいて、改変体をコードするヌク
レオチド配列への改変は、改変体が所望の活性を保有し続けるようになされる。
明らかに、改変タンパク質をコードするＤＮＡにおいて作製された任意の変異は
、リーディングフレームの外側に配列を配置してはならず、そして好ましくは二
次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的領域を作製しない。ＥＰ特許出願公開番号７
５，４４４を参照のこと。
【００９８】 本発明のこの単離されたタンパク質は、本発明の核酸のいずれか１つによりコ
ードされる少なくとも２３の連続するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその
保存的に改変された改変体であるポリペプチドを含む。本発明のタンパク質また
はそれらの改変体は、本発明のポリペプチド由来の多数の連続するアミノ酸残基
を含み得る。ここでその数は、２３から本発明の全長ポリペプチドにおける残基
数からなる整数の群より選択される。必要に応じて、連続するアミノ酸のサブ配
列は、少なくとも２５、３０、３５、または４０アミノ酸長であり、しばしば少
なくとも５０、６０、７０、８０、または９０アミノ酸長である。
【００９９】 本発明は、触媒的に活性なポリペプチド（すなわち、酵素）を含む。触媒的に
活性なポリペプチドは、一般に、ネイティブ（非合成的）内因性ポリペプチドの
少なくとも２０％、３０％または４０％、そして好ましくは少なくとも５０％、
６０％または７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％、９０％または９
５％の比活性を有する。さらに、基質特異性（ｋcat／Ｋm）は、必要に応じてネ
イティブ（非合成）の内因性ポリペプチドと実質的に類似である。代表的に、Ｋ m は、ネイティブ（非合成）の内因性ポリペプチドのＫmの少なくとも３０％、４
０％または５０％；そしてより好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％ま
たは９０％である。酵素活性および基質特異性（ｋcat／Ｋm）の尺度のアッセイ
および定量の方法は、当業者に周知である。
【０１００】 本発明は、本発明のタンパク質に対してなされ得る改変を含む。詳細には、Ｌ
ＥＣ１遺伝子の活性を減じることが所望され得る。他の改変は、標的分子の融合
タンパク質へのクローニング、発現または組み込みを容易にするためになされ得
る。このような改変は当業者に周知であり、そして例えば、開始部位を提供する
ためアミノ末端に付加されたメチオニンを含むか、または都合良く配置された制
限部位もしくは末端コドンもしくは精製配列を作製するためにいずれかの末端に
配置されたさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を含む。
【０１０１】 本発明の核酸を用いて、組換え的に操作した細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫
、哺乳動物、または好ましくは植物細胞）中で本発明のタンパク質を発現し得る
。この細胞は、非天然条件（例えば、量、組成、位置および／または時間におい
て）でタンパク質を生成する。なぜならそれらは、生成するためにヒトの介入を
通じて遺伝的に変更されているからである。
【０１０２】 代表的に、中間宿主が本発明の実施において用いられクローニングベクターの
コピー数を増加させる。増加したコピー数を用いて、目的の遺伝子を含むベクタ
ーは、所望の植物細胞への導入のために有意な量で単離され得る。
【０１０３】 本発明の実施において用いられ得る宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ
ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＳｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのような細菌宿主を含む原核生物が挙げられる
。酵母または糸状菌のような真核生物宿主はまた、本発明において用いられ得る
。これらの宿主はまた微生物であるので、細菌においてポリペプチドの発現を生
じない植物プロモーターがベクターに用いられることを確認することが必須であ
る。
【０１０４】 通常用いられる原核生物制御配列としては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ
）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
１９８：１０５６（１９７７））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（
Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９
８０））およびλ由来Ｐ ＬプロモーターならびにＮ−遺伝子（Ｎ−ｇｅｎｅ）
リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８（
１９８１））のような通常用いられるプロモーターが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ
にトランスフェクトされたＤＮＡベクター中の選択マーカーを含むこともまた有
用である。このようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリン、また
はクロラムフェニコールに対する耐性を指定する遺伝子を含む。
【０１０５】 このベクターは、適切な宿主細胞への導入を可能にするために選択される。細
菌ベクターは、代表的にプラスミドまたはファージ起源のベクターである。本発
明のタンパク質を発現するための発現系は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種およびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２：２２９〜２３５（１９８３）；
Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３〜５４５（１９８３））を用
いて利用可能である。
【０１０６】 酵母中の異種タンパク質の合成は周知である。Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｆ．ら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）を参照のこと。真核生物タン
パク質の産生のための２つの広範に利用される酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａにおける発現のためのベクター、
株、およびプロトコールは、当該分野で公知であり、そして商業的供給業者（例
えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能である。適切なベクターは、通常、
所望により、発現制御配列（例えば、プロモーター）を有する。発現制御配列と
しては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはアルコールオキシダーゼ、およ
び複製起点、終結配列などが挙げられる。
【０１０７】 本発明のタンパク質は、一旦発現されれば、細胞を溶解すること、およびその
溶解物を標準的タンパク質単離技術に適用することにより酵母から単離され得る
。精製プロセスのモニタリングは、ウエスタンブロット技術または他の標準的イ
ムノアッセイ技術のラジオイムノアッセイを用いることにより達成され得る。
【０１０８】 本発明のタンパク質はまた、非細胞性合成方法を用いて構築され得る。約５０
アミノ酸長未満のタンパク質の固相合成は、不溶性支持体へのその配列のＣ末端
アミノ酸付着、その後のその配列中の残りのアミノ酸の連続的付加により達成さ
れ得る。固相合成のための技術は、以下によって記載されている：Ｂａｒａｎｙ
およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ、第３〜２８４頁 Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．；Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５６（
１９６３）、およびＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＩＩ（１９８４）。より短いフラグメントのアミノ酸末端とカルボキ
シ末端との縮合により、より長いタンパク質が合成され得る。カルボキシ末端の
活性化による（例えば、結合試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（
Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｙｃｙｌｏｈｅｘｙ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）の使用によ
る）ペプチド結合形成の方法は、当業者に公知である。
【０１０９】 本発明のタンパク質（組換えタンパク質または合成タンパク質）は、当該分野
で周知の標準的技術によりかなりの純度まで精製され得る。この方法には、界面
活性剤可溶化、硫酸アンモニウムのような物質での選択的沈殿、カラムクロマト
グラフィー、免疫精製方法などが挙げられる。例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２
）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照のこと。例えば
、抗体は、本明細書に記載のように、タンパク質に対して惹起され得る。Ｅ．ｃ
ｏｌｉからの精製は、米国特許第４，５１１，５０３号に記載の手順に従って達
成される。発現されたタンパク質の検出は、当該分野で公知の方法により達成さ
れる。この方法には、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット技術
または免疫沈降が挙げられる。
【０１１０】 本発明はさらに、植物またはそれらの部分において、本発明のポリペプチドの
濃度または組成を調節する（すなわち、増加するまたは減少する）ための方法を
提供する。改変は、植物中の濃度および／または組成（すなわち、本発明のポリ
ペプチドの比）を増加または減少させることによりもたらされ得る。
【０１１１】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットを用いて植物細胞を
形質転換して形質転換植物細胞を得る工程、植物細胞中の濃度および／または組
成を調節するのに十分な量で、植物細胞中のポリヌクレオチドの発現を可能にす
る条件下でこの形質転換植物細胞を生長させる工程を包含する。
【０１１２】 いくつかの実施形態において、植物中の本発明のポリペプチドの含量および／
または組成は、本発明の単離されていない遺伝子のプロモーターを、インビボま
たはインビトロで変更して遺伝子発現を上方調節または下方調節することにより
調節され得る。いくつかの実施形態において、本発明のネイティブ遺伝子のコー
ド領域は、コードされた酵素の活性を低下させるために、置換、付加、挿入、ま
たは欠失を介して変更され得る。例えば、Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，
３５０号；Ｚａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと。タ
ンパク質の下方調節の１つの方法は、タンパク質の分解のための標的を提供する
ＰＥＳＴ配列を用いる工程を包含する。高レベルのＬＥＣ１が発芽を防ぐことが
観察されている。Ｌｏｔａｎら、Ｃｅｌｌ １９９８年６月２６日；９３（７）
：１１９５〜１２０５を参照のこと。従って、ＬＥＣ１発現の時間的調節は、適
切な発芽、栄養増殖、開花および生殖を可能にするために特定の種において所望
され得る。
【０１１３】 いくつかの実施形態において、プロモーター配列を含む単離された核酸（例え
ば、ベクター）は、植物細胞にトランスフェクトされる。続いて、本発明のポリ
ヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含む植物細胞は、当業者に
公知の手段（例えば、限定はしないがサザンブロット、ＤＮＡ配列決定、または
このプロモーターおよびこの遺伝子に特異的なプライマーを用い、そしてそれら
から生成されるアンプリコンを検出するＰＣＲ分析）により選択される。前述の
実施形態により変更または改変された植物または植物の部分は、植物中での本発
明のポリペプチドの濃度および／または組成を調節するのに十分な時間で植物形
成条件下で生長させられる。植物形成条件は当該分野で周知である。
【０１１４】 概して、濃度または組成物は、前述の発現カセットを欠失する、ネイティブな
コントロールの植物、植物部分、または細胞に対して少なくとも５％、１０％、
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％まで増
加または減少される。本発明における調節は、所望の発生段階までの植物の生長
の間、および／またはそれに引き続いて生じ得る。時間的におよび／または特定
の組織において、核酸発現を調節することは、上記により詳細に記載されるよう
に、本発明のポリヌクレオチドに、例えば、センス方向またはアンチセンス方向
で作動可能に連結された適切なプロモーターを使用することにより制御され得る
。本発明のポリヌクレオチドの発現の誘導はまた、有効量の誘導化合物の外因性
投与により制御され得る。誘導性プロモーターおよび誘導化合物（これは、これ
らのプロモーターからの発現を活性化する）は、当該分野で周知である。好まし
い実施形態において、本発明のポリペプチドは、単子葉類または双子葉類、好ま
しくはトウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソツガム、アブラナ、コムギ、アルフ
ァルファ、イネ、オオムギおよびキビにおいて調節される。
【０１１５】 本発明のタンパク質を検出するための手段は、本発明の重要な局面ではない。
好ましい実施形態において、このタンパク質は、任意の多数の十分に認識された
免疫学的結合アッセイを用いて検出および／または定量される（例えば、米国特
許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８
８号；および同第４，８３７，１６８号を参照のこと）。一般的イムノアッセイ
の概説については、以下も参照のこと：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、第３７巻：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ａｓａｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
第７版、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編（１９９１）。さらに、本発明のイムノ
アッセイは、例えば、以下に概説される任意のいくつかの構成で実行され得る：
Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍａｇｇｉｏ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８０）；Ｔｉｊａｎ、Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙｓ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９
８５）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）；Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｃｈａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ（１９８７）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｎｅｗｍ
ａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）；ならびにＮｏｎ−
ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｎｇｏ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒ
ｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）。
【０１１６】 代表的方法としては、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析、分析的生
化学方法（例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ハイパーディフュージ
ョンクロマトグラフィーなど）、および種々の免疫学的方法（例えば、液体また
はゲル沈降素反応、免疫拡散（１重または２重）、免疫電気泳動、ラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッ
セイなどが挙げられる。
【０１１７】 非放射性標識は、しばしば間接的手段により付着される。概してリガンド分子
（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いでこのリガンドは固有に
検出可能であるか、またはシグナルシステム（例えば、検出可能酵素、蛍光化合
物、または化学発光化合物）に共有結合しているかのいずれかである抗リガンド
（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。多数のリガンドおよび抗リガ
ンドが用いられ得る。リガンドが天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキ
シンおよびコルチゾール）を有する場合、それは、標識された天然に存在する抗
リガンドと組み合わせて用いられ得る。あるいは、任意のハプテン化合物または
抗原性化合物は、抗体と組み合わせて用いられ得る。
【０１１８】 この分子はまた、シグナル生成化合物に、例えば、酵素または発蛍光団（ｆｌ
ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）との結合体化により直接結合体化され得る。標識としての
目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグ
リコシダーゼ、またはオキシドリダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍
光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘
導体、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）などが挙げ
られる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフェ
タラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。用いられ得る種々の標識
システムまたはシグナル産生システムの概説については、米国特許第４，３９１
，９０４号（参考として本明細書において援用される）を参照のこと。
【０１１９】 いくつかのアッセイ形式は、標識成分の使用を必要としない。例えば、凝集ア
ッセイは、標的抗体の存在を検出するために用いられ得る。この場合、抗原被覆
粒子は、標的抗体を含むサンプルにより凝集される。この形式では、どの成分も
標識される必要がなく、そして標的抗体の存在は単純な視覚検査により検出され
る。
【０１２０】 本発明のタンパク質は、本発明の触媒的に活性なポリペプチドに結合する化合
物（例えば、基質）、そして／またはそのポリペプチドの酵素活性を増加もしく
は減少させる（すなわち、調節する）化合物を同定するために用いられ得る。こ
の方法は、本発明のポリペプチドと、酵素に結合する能力または酵素活性を調節
する能力が決定されるべき化合物とを接触させる工程を包含する。使用されるこ
のポリペプチドは、このポリペプチドは、本発明のネイティブの全長ポリペプチ
ド（例えば、酵素）の比活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％
、または４０％、より好ましくは少なくとも５０％または６０％、そして最も好
ましくは少なくとも７０％または８０％を有する。酵素の反応速度論を測定する
方法は当該分野で周知である。例えば、Ｓｅｇｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６）を参照のこと。
【０１２１】 抗体は、本発明のタンパク質に対して惹起され得る。このタンパク質としては
、天然に存在する（全長）形態、および組換え形態の両方で、個体、対立遺伝子
、株、または種の改変体、およびそれらのフラグメントが挙げられる。さらに、
抗体は、そのネイティブな構成または非ネイティブな構成のいずれかで、これら
のタンパク質に対して惹起される。抗イディオタイプ抗体がまた生成され得る。
抗体作製の多くの方法が当業者に公知である。
【０１２２】 いくつかの場合、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、げっ歯類、霊長類、
ヒトなど）からのモノクローナル抗体の調製が所望され得る。このようなモノク
ローナル抗体を調製するための技術の記載は、以下に見出される：例えば、Ｂａ
ｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｓｔｉｔ
ｅｓら、編、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ
Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびその文献に引用される参考文献；Ｈａｒｌｏｗおよび
Ｌａｎｅ（前出）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ第２版、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒ
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）
。
【０１２３】 他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラ
リーの選択を包含する（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７
５〜１２８１（１９８９）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４
〜５４６（１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４（１９９６）を参照のこと）。あるいは
、高いアビディティ（結合活性）のヒトモノクローナル抗体は、非再配列ヒト重
鎖Ｉｇ遺伝子座および軽鎖Ｉｇ遺伝子座のフラグメントを含むトランスジェニッ
クマウス（すなわち、ミニ遺伝子座トランスジェニックマウス）から獲得され得
る。Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：８４５〜８
５１（１９９６）。また組換えイムノグロブリンは生成され得る。Ｃａｂｉｌｌ
ｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１００２９〜１００３３（１９８９）を参照のこ
と。
【０１２４】 本発明の抗体は、本発明のタンパク質を単離することにおけるアフィニティー
クロマトグラフィーのために、正常タンパク質もしくは異常タンパク質のような
特定の発現産物についての発現ライブラリーをスクリーニングするために、また
はそれぞれの抗原の存在に関連する種々の病理学的状態を検出もしくは診断する
ために有用な抗イディオタイプ抗体を惹起するために用いられ得る。
【０１２５】 頻繁には、本発明のこのタンパク質および抗体は、検出可能シグナルを提供す
る物質を共有結合または非共有結合することのいずれかにより標識される。広範
な種々の標識および結合体化技術は、公知であり、そして科学論文および特許書
類の両方に広く報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質
、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる
。
【０１２６】 （細胞のトランスフェクション／形質転換） 形質転換／トランスフェクションの方法は、本発明に重要ではない；形質転換
またはトランスフェクションの種々の方法が現在利用可能である。より新しい方
法が作物または他の宿主細胞を形質転換するために利用可能になってきており、
それらは直接適用され得る。従って、宿主細胞のゲノムにＤＮＡ配列を挿入し、
配列の転写および／または翻訳を得て、生物体の表現型変化を達成するための、
広範な種々の方法が開発されてきた。従って、効率的な形質転換／トランスフェ
クションを提供する任意の方法が使用され得る。
【０１２７】 本発明の所望のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列、例えば、全長タン
パク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列が、所望の植物に導入され得る発
現カセットを構築するために用いられ得る。本発明の単離された核酸は、当該分
野で公知の技術に従って植物に導入され得る。一般に上記のような、そして植物
細胞の形質転換に適切な発現カセットが調製される。
【０１２８】 広範な種々の高等植物種を形質転換するための技術は、周知であり、技術文献
、科学文献および特許書類に記載されている。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１〜４７７（１９８８）を参照のこと。例
えば、ＤＮＡ構築物は、エレクトロポレーション、ＰＥＧポレーション、粒子ボ
ンバードメント、ケイ素繊維送達、または植物細胞プロトプラストもしくは胚形
成カルスのマイクロインジェクションのような技術を用いて、植物細胞のゲノム
ＤＮＡに直接導入され得る。例えば、Ｔｏｍｅｓら、Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｖｉａ
Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、第１９７〜２１３
頁、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏ．Ｌ．Ｇａｍｂｏｒｇおよび
Ｇ．Ｃ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５を参照のこと。あるいは
、このＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と結合され得、そして従来の
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターへ導入され
得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主のビルレンス
機能は、細胞がこの細菌によって感染される場合、植物細胞ＤＮＡへの構築物お
よび隣接するマーカーの挿入を指向する。米国特許第５，５９１，６１６号を参
照のこと。
【０１２９】 ポリエチレングリコール沈殿を用いるＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗ
ｓｋｉら、Ｅｍｂｏ Ｊ．３：２７１７−２７２２（１９８４）に記載される。
エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．８２：５８２４（１９８５）に記載される。バリスティック（ｂａｌ
ｌｉｓｔｉｃ）形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−
７３（１９８７）に記載される。
【０１３０】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換技術は、
科学論文に十分に記載される。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
３：４９６〜４９８（１９８４）、およびＦｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：４８０３（１９８３）を参照のこと。例えば、トウ
モロコシのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は、ＷＯ ９８／３２３２６に
記載される。ダイズのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は、米国特許第５，
５６３，０５５号に記載される。
【０１３１】 トランスフェクションまたは形質転換の他の方法は、以下を含む：（１）Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ媒介形質転換（例えば、Ｌｉｃ
ｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＦｕｌｌｅｒ：Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ、第６巻、ＰＷＪ Ｒｉｇｂｙ編、Ｌｏｎｄｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８７；およびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｐ．およびＤｒａｐ
ｅｒ，Ｊ．、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩＩ巻、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｏ
ｘｆｏｒｄ、ＩＲＩ Ｐｒｅｓｓ、１９８５を参照のこと）、出願ＰＣＴ／ＵＳ
８７／０２５１２（１９８８年４月７日に公開されたＷＯ８８／０２４０５）は
、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターｐＡＲＣ８またはｐＡＲＣ１６に加えて
Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ系統Ａ４およびそのＲｉプラスミドの使用を記載する
、（２）リポソーム媒介ＤＮＡ取りこみ（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５：１３５３、１９８４を参照のこと）、（
３）ボルテックス方法（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、Ｋｉｎ
ｄｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８７：１２２８（
１９９０）を参照のこと）。
【０１３２】 ＤＮＡはまた、以下に記載のように花粉への直接ＤＮＡ移入によって植物へ導
入され得る：Ｚｈｏｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０
１：４３３（１９８３）；Ｄ．Ｈｅｓｓ、Ｉｎｔｅｒｎ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．
１０７：３６７（１９８７）；Ｌｕｏら、Ｐｌａｎｅ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｐｏｒｔｅｒ、６：１６５（１９８８）。ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの発現は、Ｐｅｎａら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５：２７４（１９８７）によ
って記載されるような植物の生殖器官へのＤＮＡの注入によって得られ得る。Ｄ
ＮＡはまた、以下に記載のような未成熟胚の細胞および乾燥胚の再水和物へ直接
注入され得る：Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：
３０（１９８７）；およびＢｅｎｂｒｏｏｋら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｂｉ
ｏ Ｅｘｐｏ １９８６、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓ
ｓ．、２７−５４頁（１９８６）。
【０１３３】 動物および下等真核生物（例えば、酵母）宿主細胞は、種々の手段によってト
ランスフェクションにコンピテントであるかまたはコンピテントにされる。動物
細胞へＤＮＡを導入するいくつかの周知の方法が、存在する。これらは、以下を
含む：リン酸カルシウム沈殿、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとのレシピエン
ト細胞の融合、ＤＮＡを含むリポソームでのレシピエント細胞の処理、ＤＥＡＥ
デキストラン、エレクトロポレーション、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃｓ）、および細胞への直接的なＤＮＡのマイクロインジェクション。トラン
スフェクトされた細胞は、当該分野において周知の手段によって培養される。Ｋ
ｕｃｈｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｄｏｗｄｅｎ、Ｈｕｔｃ
ｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ、Ｉｎｃ．（１９７７）。
【０１３４】 （形質転換された植物細胞の積極的選択手段を提供するための非形質転換の植
物細胞および／または組織における体細胞胚形成抑制のための培養培地の変更） 体細胞胚形成を制御するための以下の方法を用い、目的の植物種における体細
胞胚形成の抑制のための植物組織培養培地成分（この効果に影響を与えるように
潜在的に調節され得る複数の成分をしばしば有する）を変更することが可能であ
る。このような条件は野生型組織にとって陰性または毒性のインビトロ環境与え
ないが、代わりに、単に体細胞胚形成生長形態を生成するのでもない。ＬＥＣ１
のような導入遺伝子を導入することは、形質転換された細胞または組織において
、体細胞胚形成および生長を刺激し、形質転換体を同定するために有用な明白に
異なる生長スクリーニングを提供する。
【０１３５】 広範な種々の培地成分を変更することは、体細胞胚形成を調節（種および特定
の培地成分に依存して胚形成を刺激または抑制のいずれかを行う）し得る。変更
した場合、体細胞胚形成を刺激または抑制し得る培地成分の例としては、以下が
挙げられる； １）基本培地自体（多量養素、微量養素およびビタミン；Ｔ．Ａ．Ｔｈｏｒｐｅ
、１９８１ 概説として「Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと）、 ２）オーキシン（インドール酢酸、インドール酪酸、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸、ナフタレン酢酸、ピクロラム、ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、および他
の機能的アナログ）、サイトカイニン（ゼアチン、カイネチン、ベンジルアミノ
プリン、２−イソペンチルアデニンおよび機能的関連化合物）アブシジン酸、ア
デニンおよびジベレリン酸のような植物の植物ホルモン、 ３）「生長調節」効果を発揮する他の化合物（例えば、ココナッツ水、カゼイン
加水分解物、およびプロリン）、ならびに ４）ゲル化剤の型および濃度、ｐＨ、ならびにスクロース濃度。
【０１３６】 上記列挙した個々の成分における変化（またはある場合には、成分の組み合わ
せ）が、広範な双子葉植物種および単子葉植物種にわたりインビトロで体細胞胚
形成を調節することが文献中で実証されている。例の編集物については、Ｅ．Ｆ
．Ｇｅｏｒｇｅら、１９８７．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍ
ｅｄｉａ．第１巻：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ．Ｅｘｅｒｇ
ｅｔｉｃｓ，Ｌｔｄ．，Ｐｕｂｌ．、Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照
のこと。
【０１３７】 （トランスジェニック植物の再生） 上記の任意の形質転換技術によって誘導される形質転換された植物細胞は、そ
の形質転換された遺伝子型を有する植物全体を再生するように培養され得る。こ
のような再生技術は、しばしば組織培養増殖培地中の特定の植物ホルモンの操作
に依存し、代表的に本発明のポリヌクレオチドとともに導入された生物致死剤マ
ーカーおよび／または除草剤マーカーに依存する。トウモロコシの形質転換およ
び再生に関しては、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
、２：６０３−６１８（１９９０）を参照のこと。
【０１３８】 植物発現ベクターによって形質転換された植物細胞は、例えば、標準的な植物
組織培養技術によって単一細胞、カルス組織または葉ディスクより再生され得る
。ほとんど任意の植物由来の種々の細胞、組織、および器官が、首尾よく培養さ
れて植物全体を再生し得ることは当該分野において周知である。培養されたプロ
トプラストからの植物再生は、以下に記載される：Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｏｐ
ｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１２４−１７６頁（１９
８３）；およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
ｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒ
ａｔｏｎ、２１−７３頁（１９８５）。
【０１３９】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって導入された外来遺伝子を含む植物の再生
は、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７：１２２９−１２３１（１９８５
）およびＦｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．、８０：４８０３（１９８３）によって記載されるように達成され得る。この
手順は、代表的に２〜４週間以内にシュートを生じ、そしてこれらの形質転換体
のシュートは、次いで細菌の増殖を防ぐ選択薬剤および抗生物質を含む適切な根
誘導培地（ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に移植される。本発明
のトランスジェニック植物は、稔性であってもまたは不稔性であってもよい。
【０１４０】 再生物はまた、植物カルス、外植片、器官、またはその一部より入手し得る。
このような再生技術は、Ｋｌｅｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈ
ｙｓ．３８：４６７−４８６（１９８７）に一般的に記載される。単一植物プロ
トプラストまたは種々の外植片のいずれかからの植物の再生は、当該分野におい
て周知である。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ．ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＨ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ
編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉ
ｆ．（１９８８）を参照のこと。トウモロコシの細胞培養および再生に関して、
一般的に以下を参照のこと：Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｆｒｅｅ
ｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９
４）；Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、第３版、Ｓｐｒ
ａｇｕｅおよびＤｕｄｌｅｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａ
ｇｒｏｎｏｍｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（１９８８）。
【０１４１】 当業者は、組換え発現カセットがトランスジェニック植物に安定して組み込ま
れかつ作動可能であることが確認されたあと、有性交雑によって他の植物へ導入
され得ることを認識する。任意の多数の標準育種技術は、交雑されるべき種に依
存して用いられ得る。
【０１４２】 栄養繁殖される作物において、成熟トランスジェニック植物は、挿し木を行う
ことによってか、無配偶生殖を通してか、または組織培養技術によって多数の同
一植物を産生するために繁殖され得る。望ましいトランスジェニックの選択が行
われ、そして新しい品種が得られ、そして商業的な使用のために栄養繁殖される
。種子繁殖される作物において、成熟トランスジェニック植物は、ホモ接合性近
交系植物を産生するために自家交雑され得る。近交系植物は、新しく導入された
異種核酸を含む種子を産生する。これらの種子を生長させて、選択された表現型
を生じる植物を産生し得る。
【０１４３】 再生された植物から得られる部分（例えば、花、種子、葉、枝、果実など）は
、本発明に含まれる。ただし、これらの部分は、本発明の単離された核酸を含む
細胞を含む。再生植物の子孫および改変体、ならびに変異体もまた、本発明の範
囲内に含まれる。ただし、これらの部分は、導入された核酸配列を含む。
【０１４４】 選択マーカーを発現するトランスジェニック植物は、例えば、標準イムノブロ
ット技術およびＤＮＡ検出技術によって、本発明の核酸の伝達についてスクリー
ニングされ得る。トランスジェニック系統はまた代表的に、異種核酸の発現レベ
ルについて評価される。ＲＮＡレベルでの発現は、発現陽性植物を同定および定
量するのに最初に決定され得る。ＲＮＡ分析のための標準技術が用いられ得、そ
して異種ＲＮＡ鋳型のみを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるＰＣＲ増幅アッセイおよび異種核酸特異的プローブを用いる溶液ハ
イブリダイゼーションアッセイを含む。次いでこのＲＮＡ陽性植物は、本発明の
特異的に反応性の抗体を用いるウエスタンイムノブロット分析によってタンパク
質発現について分析され得る。さらに、標準プロトコルによるインサイチュハイ
ブリダイゼーションおよび免疫細胞化学は、トランスジェニック組織内の発現の
部位を局在化するために、それぞれ異種核酸特異的なポリヌクレオチドプローブ
および抗体を用いて行われ得る。一般的に、多数のトランスジェニック系統は、
最も適切な発現プロフィールを伴う植物を同定および選択するために、組み込ま
れた核酸について通常スクリーニングされる。
【０１４５】 好ましい実施形態は、付加された異種核酸に関してホモ接合性であるトランス
ジェニック植物である；すなわち、２つの付加された核酸配列を含むトランスジ
ェニック植物であって、１つの遺伝子が、染色体対の各々の染色体上の同一の遺
伝子座に存在するトランスジェニック植物である。ホモ接合性トランスジェニッ
ク植物は、単一の付加された異種核酸を含むヘテロ接合性トランスジェニック植
物を有性交配（自家受粉）し、産生された種子のいくつかを出芽させ、そしてコ
ントロール植物（すなわち、ネイティブな、非トランスジェニック）と比べて、
本発明のポリヌクレオチドの変化した発現について、産生された得られた植物を
分析することによって得られ得る。親植物への戻し交配および非トランスジェニ
ック植物との異系交雑もまた、意図される。あるいは、ヘテロ接合性トランスジ
ェニック植物の増殖は無配偶生殖を通じて達成され得る。
【０１４６】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む植物を遺伝子型決定する方法を提
供する。遺伝子型決定は、染色体対のホモログを識別する手段を提供し、そして
植物集団における分離個体を識別するために用いられ得る。分子マーカー方法は
、系統発生研究のため、作物品種間の遺伝的関係を特徴付けるため、交雑または
体細胞ハイブリッドを同定するため、単一遺伝子形質に影響を与える染色体セグ
メントを位置付けるため、マップに基づいたクローニングのため、そして量的遺
伝の研究のために使用され得る。例えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第７章、Ｃｌａｒｋ
編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）を参照のこと
。分子マーカー方法については、一般的に、Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏ
ｎ １９９６（第２章）Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ（
Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ／Ｒ
．Ｇ．Ｌａｎｄｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、第７〜２１
頁）によるＴｈｅ ＤＮＡ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎを参照のこと。
【０１４７】 本発明における遺伝子型決定の特定の方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の
ような（しかし、これに限定されない）、かなり多数の分子マーカー分析技術を
使用し得る。ＲＦＬＰは、ヌクレオチド配列の変異性により引き起こされるＤＮ
Ａ制限フラグメント間の対立遺伝子差異の産物である。従って、本発明はさらに
、本発明の遺伝子または核酸ならびにこれらの遺伝子または核酸に遺伝的に連鎖
した染色体配列の分離を、ＲＦＬＰ分析のような技術を使用して追跡するための
手段を提供する。
【０１４８】 本発明の方法において用いられ得る植物は、単子葉植物種および双子葉植物種
を含む。好ましい植物としては、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、カラ
スムギ、ソルガム、キビ、ライムギ、ダイズ、ヒマワリ、アルファルファ、アブ
ラナおよびワタが挙げられる。
【０１４９】 形質転換された植物細胞、植物の部分または植物組織から再生された植物由来
の種子、または再生された形質転換植物から由来の子孫は、飼料または食餌とし
て直接用いられ得るか、またはさらなる処理が生じ得る。
【０１５０】 本出願に引用される全ての刊行物は、それぞれの個々の刊行物または特許出願
が参考として援用されることが詳細におよび個々に示されたのと同じ程度に、本
明細書において参考として援用されている。
【０１５１】 本発明は以下の詳細な実施例に参考としてさらに記載される。しかし、実施例
および詳細な説明に示されるものをこえて本発明の基礎的な主題に多くの伸展、
変化および改変が存在すること、それが本発明の精神および範囲内であることが
理解される。
【０１５２】 （実施例） （実施例１） （トウモロコシＬＥＣ１ ＥＳＴのために使用されるライブラリーの構築） （Ａ．総ＲＮＡ単離） 総ＲＮＡをトウモロコシ胚より単離し、そしてＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよび
Ｓａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．、およびＳａｃｃｈｉ，Ｎ．Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６（１９８７））により記載されるグアニ
ジンイソチオシアナート／酸−フェノール手順の改変を使用して、ＴＲＩｚｏｌ
Ｒｅｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてカルス組織を再生した。簡潔には、植物組織サンプル
を、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅｇｅｎｔの添加の前に液体窒素中で微粉砕し、次いで、
さらに乳鉢および乳棒を用いてホモジナイズした。水相と有機相の分離のために
クロロホルムを添加し、次に遠心分離を行った。総ＲＮＡを水相からイソプロピ
ルアルコールを用いる沈澱により回収した。
【０１５３】 （Ｂ．ポリ（Ａ)＋ＲＮＡ単離） 総ＲＮＡからポリ（Ａ)＋ＲＮＡの選択を、ＰｏｌｙＡＴａｃｔ系（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した
。簡潔には、ビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ｍＲＮＡの３’
ポリ（Ａ）テイルにハイブリダイズさせた。このハイブリッドを常磁性粒子およ
び磁気分離スタンドと結合したストレプトアビジンを使用して捕獲した。このｍ
ＲＮＡを高ストリンジェントな条件にて洗浄し、そしてＲＮａｓｅを含まない脱
イオン水により溶出した。
【０１５４】 （Ｃ．ｃＤＮＡライブラリー構築） ｃＤＮＡ合成を実施し、そして一方向性ｃＤＮＡライブラリーをＳｕｐｅｒ
Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して構築した。ｃＤＮＡ
の第１鎖をＮｏｔ Ｉ部位を含むオリゴ（ｄＴ）プライマーをプライミングする
ことにより合成した。この反応を、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩにより４５℃にて触媒した。ｃＤＮＡの第
２鎖をα−32Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識し、そして反応物の一部をアガロースゲ
ル電気泳動により分析して、ｃＤＮＡサイズを決定した。５００塩基対より小さ
なｃＤＮＡ分子および非連結アダプターをＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ４００クロマ
トグラフィーにより除去した。選択されたｃＤＮＡ分子をＮｏｔ Ｉ部位とＳａ
ｌ Ｉ部位との間においてｐＳＰＯＲＴ１ベクター中に連結した。
【０１５５】 （実施例２） （トウモロコシＬＥＣ１ ＥＳＴのために使用される配列決定およびｃＤＮＡ
サブトラクション手順） （Ａ．鋳型調製物の配列決定） 個々のコロニーを選び、そしてＤＮＡを、Ｍ１３正方向プライマーおよびＭ１
３逆方向プライマーを用いるＰＣＲまたはプラスミド単離のいずれかによって調
製した。すべてのｃＤＮＡクローンをＭ１３逆方向プライマーを使用して配列決
定した。
【０１５６】 （Ｂ．Ｑ−ｂｏｔサブトラクション手順） サブトラクション手順に供されるｃＤＮＡライブラリーを、１プレート当り約
３,０００コロニーの密度で２２×２２ｃｍ2寒天プレート上にプレートアウトし
た。このプレートを３７℃インキュベーターにおいて１２〜２４時間インキュベ
ートした。コロニーをロボットコロニーピッカー（Ｑ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ
Ｌｉｍｉｔｅｄ）、により３８４ウェルプレートに選出した。これらのプレー
トを３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１５７】 一旦十分なコロニーが選ばれると、Ｑ−ｂｏｔを使用して、コロニーを２２×
２２ｃｍ2ナイロンメンブレン上に固定した。各メンブレンは９,２１６コロニー
または３６,８６４コロニーを含んだ。これらのメンブレンを適切な抗生物質と
ともに寒天プレート上に置いた。このプレートを３７℃にて一晩インキュベート
した。
【０１５８】 コロニーをその次の日に回収した後、これらのフィルターを変性溶液で予め湿
らせておいたろ紙上に４分間置き、次いで、さらに４分間、沸騰水浴の頂部でイ
ンキュベートした。次いで、このフィルターを中和溶液で予め湿らせておいたろ
紙上に４分間置いた。過剰な溶液を、乾燥ろ紙上にそのフィルターを置くことに
より除去した後、そのフィルターのコロニー面をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液
中に置き、３７℃で４０〜５０分間インキュベートした。このフィルターを乾燥
ろ紙上に置き、一晩乾燥した。次いで、ＤＮＡをＵＶ光処理によりナイロンメン
ブレンに架橋させた。
【０１５９】 コロニーハイブリダイゼーションをＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ
，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版）に記載されるように
実行した。以下のプローブをコロニーハイブリダイゼーションにおいて使用した
： １．最も重複するクローンを除去するために作製されたライブラリーと同じ組織
由来の第１鎖ｃＤＮＡ。 ２．以前の配列決定データに基づく、同じライブラリー由来の４８〜１９２の最
も重複するｃＤＮＡクローン。 ３．コーン配列全体のデータベースにおいて、１９２の最も重複するｃＤＮＡク
ローン ４．Ｓａｌ−Ａ２０オリゴヌクレオチド：ＴＣＧ ＡＣＣ ＣＡＣ ＧＣＧ Ｔ
ＣＣ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ、これはポリ
Ａテイルを含むがｃＤＮＡを含まないクローンを除去する。 ５．ｒＲＮＡ由来のｃＤＮＡクローン。
【０１６０】 オートラジオグラフィーの画像をコンピューターにスキャンし、そしてシグナ
ル強度および各コロニーの非放射性コロニーのアドレスを分析した。３８４ウェ
ルプレートから９６ウェルプレートへの非放射性コロニーの再配列をＱ−ｂｏｔ
を使用して実行した。
【０１６１】 （実施例３） （コンピューター相同性検索からのトウモロコシＬＥＣ ＥＳＴの同定） 遺伝子同一性を、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９３）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照のこと）検索をＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データ
べース（すべての非重複ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳物、３次元構造Ｂｒｏｏｋ
ｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタン
パク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースの最近の主な
発表に由来する配列を含む）に含まれる配列に対する類似性に関するデフォルト
パラメーター下において実行することにより決定した。このｃＤＮＡ配列を、Ｂ
ＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる公に入手可
能なすべてのＤＮＡ配列に対する類似性について分析した。このＤＮＡ配列をす
べてのリーディングフレームにおいて翻訳し、そしてＮＣＢＩにより提供される
ＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１
９９３）Ｎａｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）を使用して「ｎ
ｒ」データベースに含まれる公に入手可能なすべてのタンパク質配列に対する類
似性を比較した。いくつかの場合において、ＤＮＡの重複セグメントを含む２つ
以上のクローンに由来する配列決定データを使用して、連続したＤＮＡ配列を構
築した。
【０１６２】 （実施例４） （単離するために使用されたｃＤＮＡライブラリーの組成物およびさらなるｃ
ＤＮＡクローンの配列） 種々のコーン、ケシ、ダイズおよびＶｅｒｎｏｎｉａ組織由来のｍＲＮＡを表
すｃＤＮＡライブラリーを調製した（表１参照のこと）。このライブラリーの特
徴を以下に記載する。
【０１６３】
【表１】 ｃＤＮＡライブラリーを製造業者のプロトコールに従ってＵｎｉ−ＺＡＰTMＸ
Ｒベクターにおいて調製した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。Ｕｎｉ−ＺＡＰTMＸＲライブラリーのプ
ラスミドライブラリーへの転換をＳｔｒａｔａｇｅｎｅにより提供されたプロト
コールに従って達成した。転換に関して、ｃＤＮＡインサートをプラスミドベク
ターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに包含した。組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラス
ミドを含むランダムに選出された細菌コロニー由来のｃＤＮＡインサートを、挿
入されたｃＤＮＡ配列に近接するベクター配列に対して特異的なプライマーを使
用するポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅するか、またはプラスミドＤＮＡを、
培養細菌細胞から調製した。増幅されたインサートＤＮＡまたはプラスミドＤＮ
Ａを色素プライマー配列決定反応において配列決定し、部分的ｃＤＮＡ配列を生
成した（発現された配列タグすなわち「ＥＳＴ」；Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄら（１９
９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１を参照のこと）。得られたＥＳＴをＰ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７７蛍光シークエンサーを使用して分
析した。
【０１６４】 （実施例５） （表１に記載される組織より得られたｃＤＮＡクローンの同定） 植物転写因子をコードするＥＳＴを、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら
、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照のこと）検索をＢＬＡ
ＳＴ「ｎｒ」データべース（すべての非重複ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳物、３
次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＳＷＩ
ＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータ
ベースの最近の主な発表に由来する配列を含む）に含まれる配列に対する類似性
について実行することにより同定した。実施例１において得られたｃＤＮＡ配列
を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズ
ムを使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる公に入手可能な全てのＤＮＡ配列
に対する類似性について分析した。このＤＮＡ配列をすべてのリーディングフレ
ームにおいて翻訳し、そしてＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズ
ム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｕｒｅ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅ
ｎ Ｆら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９
−３４０２）を使用して「ｎｒ」データベースに含まれる公に入手可能なすべて
のタンパク質配列に対する類似性について比較した。
【０１６５】 （実施例６） （ＬＥＣ１遺伝子についての診断的タンパク質モチーフの同定） ＬＥＣ１遺伝子についての構造要求を決定するために、ＨＡＰ３ホモログを、
本発明者らのＥＳＴデータベースにおいて同定し、そして整列した。転写活性因
子の植物ＨＡＰ３ファミリーの間で配列相同性を分析することにより、これらの
配列を観察して、少なくとも２つの異なる群に分類した。種子または胚の特定の
ライブラリーに由来する全てのＨＡＰ３配列は、共通の進化起源を示唆する異な
るＬＥＣ１群を形成する（系統樹により確かめられた）。例えば、試験されたす
べての植物のＬＥＣ１配列の「Ｂドメイン」内において、高度に保存されたＣＣ
ＡＡＴボックス結合モチーフは、非可変残基のメチオニン、プロリン、イソロイ
シン、アラニン、アスパラギン、バリン、およびイソロイシン（ＭＰＩＡＮＶＩ
）を含むことが見出されている。ＬＥＣ１遺伝子は、ＤＮＡ結合モチーフおよび
サブユニット相互作用モチーフにおよぶ領域を除いて、高度に分岐している。こ
れらの遺伝子間の低レベルの相同性が、単にハイブリダイゼーションストラテジ
ーに基づいてこれらを同定することを困難にする。トウモロコシ、ダイズ、ムギ
、有棘ケシ、Ｖｅｒｎｏｎｉａ、およびシロイヌナズナ由来の配列を使用して、
ＬＥＣ１遺伝子についての診断モチーフを同定し、これらの種についての特定の
アミノ酸置換を明らかにし（図１）、そしてＬＥＣ１群内でアミノ酸置換が生じ
る位置を決定した（配列番号２３）。Ｂｌａｓｔを使用して、配列番号２３にお
けるモチーフを使用し、ＬＥＣ１を他の近縁する植物ＨＡＰ３転写活性因子と正
確に区別した。
【０１６６】 （実施例７） （トウモロコシカルスの形質転換および再生） 温室または野外で生長したＨｉｇｈ ｔｙｐｅＩＩドナー植物由来の未熟なト
ウモロコシ胚を、本発明（ＬＥＣ１）のポリヌクレオチドを含むプラスミドを用
いて衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｅｄ）した。このＬＥＣ１ポリヌクレオチドを構成プ
ロモーター（例えば、ｎｏｓ）または誘導性プロモーター（例えば、ｌｎ２）に
作動可能に連結し、緑色蛍光タンパク質と融合した除草剤Ｂｉａｌａｐｈｏｓに
対する耐性を与える選択マーカー遺伝子ＰＡＴ（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら、（１９
８８）Ｇｅｎｅ７０：２５−３７）を含むプラスミドを加えた。形質転換を以下
のように実施した。
【０１６７】 穂を、０．５％Ｍｉｃｒｏ洗剤を添加した５０％Ｃｈｌｏｒｏｘ漂白剤中で２
０分間表面滅菌し、そして滅菌水を用いて２回リンスした。未熟胚を切除し、そ
して１プレート当り２５胚を胚軸側面を下にして（胚盤側を上）置いた。これら
を、暗室で衝撃する前に５６０Ｌ培地上で４日間培養した。培地５６０Ｌは、エ
リクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ）ビタミン、チアミン、スクロース、２，４−
Ｄおよび硝酸銀を含むＮ６ベース培地である。衝撃の日、この胚を５６０Ｙ培地
に４時間移し、そして２．５ｃｍの標的ゾーン内に配置した。培地５６０Ｙは、
高浸透圧培地（高スクロース濃度を有する５６０Ｌ）である。
【０１６８】 選択されたプロモーターと作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを
含むプラスミドベクターを構築した。ＰＡＴ選択マーカーを含むプラスミドＤＮ
Ａが加えられたこのプラスミドＤＮＡを以下のようなＣａＣｌ2沈澱手順を使用
して、１．１μｍ（平均直径）のタングステンペレット上に沈澱させた：水中に
調製されたタングステン粒子（０．６ｍｇ）１００μｌ、ＴｒｉｓＥＤＴＡ緩衝
液（合計１μｇ）中の２０μｌ（２μｇ）ＤＮＡ、１００μｌの２．５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ2、４０μｌの０．１Ｍスペルミジン。
【０１６９】 各試薬をタングステン粒子懸濁液に続けて添加した。最終混合物を単時間超音
波処理した。沈澱期間の後、この管を単時間遠心分離して、液体を除去し、５０
０ｍｌの１００％エタノールを用いて洗浄し、そして再び３０秒間遠心分離した
。再び、液体を除去して、そして６０μｌの１００％エタノールを最終タングス
テン粒子ペレットに添加した。パーティクルガンボンバードメントのために、こ
のタングステン／ＤＮＡ粒子を単時間超音波処理し、そして５μｌを各マクロキ
ャリアの中央にスポットし、衝撃の前に約２分間乾燥させた。
【０１７０】 このサンプルプレートをＤｕｐｏｎｔ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓヘリウムパーテ
ィクルガンを使用して、遮断スクリーンから組織までの８ｃｍの距離において衝
撃した。全てのサンプルは、調製された粒子／ＤＮＡの各管から選出された合計
１０アリコートを用いて６５０ＰＳＩにて１ショットを受けた。
【０１７１】 衝撃後４〜１２時間、この胚を５６０Ｐに移し（低硝酸銀を有する以外は、５
６０Ｌと類似する低浸透圧カルス開始培地）、次いで、３〜７日間５６０Ｒ選択
培地（３ｍｇ／リットルＢｉａｌａｐｈｏｓを含む５６０Ｐと類似するＮ６ベー
ス培地）に移し、そして２週間毎に継代培養した。多細胞性ＧＦＰ細胞クラスタ
ーが２週間後に可視化し、そしてその数を定期的に記録した。選択からおよそ１
０週後、選択耐性ＧＦＰ陽性カルスクローンをＰＣＲおよび目的のポリヌクレオ
チドの活性のためにサンプリングした。陽性系統を２８８Ｊ培地（低いスクロー
スレベルおよびホルモンレベルを有するＭＳベース培地）に移し、植物再生を開
始した。体細胞胚成熟（２〜４週間）後、十分に発達した体細胞胚を発芽のため
に培地に移し、そして明るい培養室に移した。約７〜１０日後、発達した小植物
を７〜１０日間、小植物が良く定着するまで、試験管内の培地に移した。次いで
、植物を鉢植え用土を含むインサートに平らに移し（２．５’’ポットに相当す
るもの）、そして１週間、生長チャンバー内で生長させ、引き続きさらに１〜２
週間温室内で生長させて、次いで、ＣｌａｓｓｉｃTM６００ポット（１．６ガロ
ン）に移し、そして成熟するまで生長させた。植物を目的のポリヌクレオチドの
発現についてモニターする。
【０１７２】 （実施例８） （体細胞胚発生を誘導するためためのトウモロコシＬＥＣ１の異所的発現） 例として、遺伝子型Ｈｉｇｈ ｔｙｐｅＩＩを使用して、胚を単離し、そして
５６０Ｌ培地上で３〜５日間培養した。衝撃４〜１２時間前に、これらの胚を高
浸透圧５６０Ｙ培地に移した。次いで、ＬＥＣ１ｃＤＮＡを含む発現カセットを
、実施例７に記載される方法を使用して、緑色蛍光タンパク質と融合したＰａｔ
遺伝子を含む発現カセットと共にこれらの胚の胚盤（ｓｃｕｔｅｌｌａ）に同時
導入した。単一穂由来の胚を、処理の間に、均等に分割した。衝撃４〜１２時間
後、次いで胚を低浸透圧カルス開始培地（５６０Ｐ）に戻し、２６℃にて暗室に
おいてインキュベートした。培養３〜７日後、これらの胚を５６０Ｒ選択培地に
移した。次いで、培養物を、形質転換コロニーが現れるまで２週間毎移した。ま
た、培養物をＧＦＰ発現について顕微鏡的に検査した。ＬＥＣ１発現は、外来植
物胚形成を刺激することが期待された。これは、培養物をコントロール（ＬＥＣ
１ ｃＤＮＡを伴わずに形質転換されたものか、または非誘導のもの）と比較し
た場合、明らかであった。
【０１７３】 （Ａ．タバコにおけるトウモロコシＬＥＣ１ポリヌクレオチドの局所的発現は
、タバコの葉における体細胞胚発生を誘導するのに十分である。） トウモロコシＬＥＣ１ポリヌクレオチドをトウモロコシセーフナー（ｓａｆｅ
ｎｅｒ）誘導ｌｎ２プロモーター（このプロモーターは漏出性であり、誘導を伴
わずに低レベルにて発現する）により駆動されるアグロバクテリウム発現カセッ
トに配置した。また、左Ｔ−ＤＮＡ境界と右Ｔ−ＤＮＡ境界との間に、３５Ｓプ
ロモーターにより駆動されるｂａｒ遺伝子およびユビキチンプロモーターにより
駆動される緑色蛍光タンパク質が存在した。類似の構築物が、コントロールとし
て使用されるべきＬＥＣ１ポリヌクレオチドを用いずに作製された。種々のＳＲ
１に由来するタバコ葉ディスクを、カナマイシンよりはむしろビアラホス（ｂｉ
ａｌａｐｈｏｓ）を用いて選択したことを除いて、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１）により記載されるようにアグロ
バクテリウムを用いて同時培養した。形質転換体を、３ｍｇ／ｌのビアラホスを
含む培地上で選択した。得られた多数の形質転換苗条のうち、異所的胚が単一Ｌ
ＥＣ形質転換体の葉上に見られた。コントロール植物には何も見られなかった。
頻度は低いが、異所体細胞胚形成はまた、シロイヌナズナＬＥＣ１形質転換体に
おいて稀な事象であることが報告された（Ｌｏｔａｎら、１９８８）。
【０１７４】 （Ｂ．形質転換頻度を粒子媒介ＤＮＡ送達を使用して導入されるＬＥＣ１によ
り改善した。） 一連の発現カセットを作製して、トウモロコシ形質転換に対するＬＥＣ１発現
の効果を評価した。トウモロコシＬＥＣ１ポリヌクレオチドをｌｎ２プロモータ
ー（通常の培養条件下で使用されるオーキシンレベル用いて弱く誘導され、そし
てセーフナーを用いて強く誘導される）、オオムギＮＵＣ１プロモーター（珠心
で強く発現される）ユビキチンプロモーター（恒常的に強く発現される）および
ｎｏｓプロモーター（恒常的に弱く発現される）の制御下に配置した。ｌｎ２：
ＬＥＣ１カセットのフレームシフトバージョンを、ネガティブコントロールとし
て使用するために、ｌｎ２：ＺＭ−ＮＦ−ＹＢ（これからはｌｎ２：ＨＡＰ３と
称する）構築物（トウモロコシＺＭ ＮＦ−ＹＢは非ＬＥＣ１型のＨＡＰ３転写
活性化因子である（Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１０
８７−１０９１））と共に作製した。全てのこれらの構築物をｈｉｇｈ ｔｙｐ
ｅＩＩ胚に実施例７に記載されるようにＰａｔ〜ＧＦＰ融合構築物（ＰＡＴ〜Ｇ
ＦＰと称する）とともに同時衝撃した。また、実施例７のように、未熟な胚を別
個の穂から収集し、そして各穂に由来する胚を処理の間に等しく分割し、穂対穂
可変性を説明した（例えば、コントロールプラスミドとそのプラスミドにＬＥＣ
１を加えたプラスミドとの比較実験において、各穂に由来する全胚の２分の１を
各処理について使用した）。いくつかの場合において、コントロール処理は、Ｇ
ＵＳを用いて同時衝撃されたＰａｔ〜ＧＦＰ構築物を含んだ。形質転換頻度を、
大きな多細胞性ＧＦＰポジティブ細胞クラスターを有する胚の数をＧＦＰ顕微鏡
を使用して計数することにより決定し、これらを最初の数の衝撃された胚のパー
センテージとして表した。単一事象または複数事象を有する胚の間における区別
は生成されなかった。全ての場合において、機能的ＬＥＣ１発現カセットは、コ
ントロール処理を超えて形質転換頻度を増加させた（ＬＥＣ１発現カセットはま
た、同じ未熟胚から増殖する複数、すなわち２〜３の多細胞性トランスジェニッ
ククローンの発生率を増加させたが、上記で言及されたように、本発明者らは、
単にこれらを単一事象として記録し、そして形質転換を改善するＬＥＣ１の能力
の保存的表示を提供している）。例えば、コントロール処理における形質転換頻
度は、３つの連続実験について、５．１％、７．４％および０．８％であった。
同じ３つの試験についてのバランスのとれた並行比較において、ＬＥＣ１ポリヌ
クレオチド（ｌｎ２：：ＬＥＣ１：：ｐｉｎＩＩ）を用いた形質転換頻度は、各
々２８．８％、２５．７％および１２．４％であった。所定の量の標的組織から
回収された形質転換体の絶対数を増加させることに加えて、ＬＥＣ１形質転換体
は、コントロール形質転換体よりも初期に出現した（これはＬＥＣ１ポリヌクレ
オチドはまた、生長速度を刺激したことを示唆している）。
【０１７５】 よりストリンジェントなコントロールとして、ＬＥＣ１遺伝子を開始コドンの
直後からフレームシフトされるようにｌｎ２プロモーターの後方に配置した発現
ベクターを構築した。３つの別々の穂に由来する胚を使用するこの実験において
、コントロール（フレームシフトＬＥＣ１）処理における形質転換頻度は、２．
７％、６．０％および２．０％であったが、ＬＥＣ１処理についての形質転換頻
度は、６２．７％、２６％および４２．７％であった。これは明らかに、インフ
レームＬＥＣ１ポリヌクレオチドの発現は、形質転換効率の劇的な増加に関連し
たことを実証した。
【０１７６】 プロモーター強度（ＬＥＣ１発現を駆動する）を増加させることは、形質転換
頻度を増加させた。例えば、実験を実施して、ｌｎ２プロモーター、ｎｏｓプロ
モーターおよびＵＢＩプロモーターを比較した。他の遺伝子を駆動するこれら２
つのプロモーターを用いる本発明者らの経験に基づいて、ｌｎ２プロモーター（
培地由来のオーキシンとは異なるインデューサーの非存在下において）は非常に
低いレべルにおいて発現を駆動する。ｎｏｓプロモーターは、中程度から低いレ
ベルの導入遺伝子発現を駆動することが示されている（この実験にて使用される
培養条件下で、トウモロコシユビキノンプロモーターよりもおよそ１０倍〜３０
倍低いが、なおｌｎ２も強い）。２つのコントロール処理（ｌｎ２プロモーター
により駆動されるフレームシフトＬＥＣ１、またはトウモロコシｌｎ２：ＨＡＰ
３ポリヌクレオチド（ＬＥＣ１が属する転写因子ファミリーの代表である「非−
ＬＥＣ１型」））をこの実験において使用した。両方のコントロール処理は、低
い形質転換頻度を生じた。３週間後、ｌｎ２：フレームシフトＬＥＣ１（ＦＳ）
処理についての形質転換頻度は、４．８％だったが、ｌｎ２：ＨＡＰ３処理につ
いては、形質転換頻度は２％を生じた。ｌｎ２：ＬＥＣ１、ｎｏｓ：ＬＥＣ１お
よびＵＢＩ：ＬＥＣ１処理は、それぞれ、１４％の形質転換頻度、２８％の形質
転換頻度、および３０％の形質転換頻度を生じた。これらの処理の範囲内で、大
きく、迅速に生長するカルスの全体頻度における増加もまた存在した。コントロ
ール処理について、大きく、活力のあるＧＦＰ添加カルスの頻度（胚の開始数と
関連して）は低いものであった（フレームシフトまたはｌｎ２：ＨＡＰ３につい
てそれぞれ１．６％および０％であった）。ｌｎ２、ｎｏｓおよびＵＢＩ処理に
ついて、大きく、活力のあるカルスの全体頻度は、それぞれ４％、１３．３％お
よび２０％であった。これは、増加したＬＥＣ１発現はトランスジェニック組織
のより迅速なインビトロ増殖を生じたという解釈と一致する。この様式において
記録される形質転換実験に関して代表的であるように、３〜６週間の間、回収さ
れた形質転換体の数は増加し続ける。５週間後（衝撃後）、良好に増殖する形質
転換体の頻度は、ＦＳコントロールおよびＨＡＰ３コントロールについて４．８
％および７．３％であったが、ｌｎ２、ｎｏｓおよびＵＢＩ駆動ＬＥＣ処理につ
いての頻度は、２２％、２９．３％および３５．３％であった。
【０１７７】 （Ｃ．アグロバクテリウムを使用して導入されたＬＥＣ１により、形質転換頻
度を改善した。） 実施例８Ａにおいて記載されるスーパーバイナリー（ｓｕｐｅｒｂｉｎａｒｙ
）プラスミドを含むアグロバクテリウム株を形質転換Ｈｉｇｈ ｔｙｐｅＩＩ胚
に対して使用した。簡潔には、操作されたアグロバクテリウムを含むコロニーを
最小Ａ培地において対数期まで増殖させた。対数期細胞を遠心分離により収集し
て、５６１Ｑ培地（Ｎ６塩、エリクソンビタミン、１．５ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄ
、６８．５ｇ／ｌスクロース、３６ｇ／ｌグルコース、および２０ｍｇ／ｌのア
セトシリンゴン添加）に再懸濁した。未熟胚（長さ１．５〜２ｍｍ）を切除し、
５×１０8細菌細胞／ｍｌの濃度において、この溶液中に浸した。この培地中で
胚をボルテックスし、５分間静置した。次いで、この胚を取り出して、５６２Ｐ
培地（１００ｍＭアセトシリンゴンを有する５６２Ｐ培地）に置き、２０℃にて
３日間インキュベートした。再び、胚を５６３Ｎ培地（１００ｍｇ／ｌのカルベ
ニシリン、０．５ｇ／ｌ ＭＥＳおよび還元２，４−Ｄを有する５６０Ｐに類似
の寒天凝固培地）に移し、２８℃にて３日間培養した。次いで、胚を５６３Ｏ培
地（３ｍｇ／ｌのビアラホスを有する５６３Ｎ培地）に移し、その後１４日毎に
新鮮な５６３Ｏ培地に移した。
【０１７８】 ビアラホス耐性ＧＦＰ＋コロニーを、ＧＦＰ顕微鏡を使用して計数し、形質転
換頻度を実施例８Ｂにおいて記載されるように決定した。パーティクルガン実験
と同様に、形質転換頻度をＬＥＣ１処理においてかなり増加された。例えば、７
つの別個の穂から得られる胚に対するコントロール処理に対する形質転換頻度は
、７．１％、４０．９％、１１．１％、７．４％、１１．５％、１２％、３０．
８％および１６．６％であった。ＬＥＣ処理についての並行比較（上記の穂と同
じ順序において）は、形質転換頻度が、１３．５％、４７％、５５．８％、３７
．１％、４０．６％、３０％、５７．１％および４０．８％であることを示した
。７穂すべてに渡って平均すると、コントロールに対する平均の形質転換頻度は
、１６．６％であったが、ＬＥＣ１処理の平均は、４０．８％であった。これは
、アグロバクテリウム媒介性形質転換により産生されるすでに高いベースライン
に対する実質的な増加を表す。穂を全体に渡って比較すると、形質転換頻度に対
する有益な効果は、コントロール頻度が低い場合に最も大きかったことが観察さ
れた。
【０１７９】 (Ｄ．培地において、減少したオーキシンレベル下またはオーキシンの非存在
下および除草剤または抗生物質選択の非存在下におけるＬＥＣ１発現を使用して
、形質転換体を回収した。） ＬＥＣ１がポジティブ選択スキームにおいて使用され得るか否かを決定するた
めに、パーティクルガン形質転換実験を実施例４において記載されるように開始
し、そして形質転換体を通常のオーキシンレベルを有する培地上で、または減少
したオーキシンもしくはオーキシンを含まない培地上で、または視覚的に（ＧＦ
Ｐを使用して）ビアラホスを含まない培地上で選択した。形質転換頻度は、１つ
以上の多細胞性ＧＦＰポジティブ細胞クラスターを有する胚の数に基づいた。こ
の概念を試験するための第１の実験において、２つの可変処理が存在した。第１
は、未熟胚をコントロールプラスミド（ＵＢＩ：ＰＡＴ〜ＧＦＰ）またはＵＢＩ
：ＰＡＴ〜ＧＦＰ＋ｌｎ２：ＬＥＣ１を用いて衝撃したことであった。第２の可
変は、衝撃した胚を通常のビアラホス含有選択培地（２ｍｇ／ｌ ２,４−Ｄの
通常オーキシンレベルを有する）か、またはビアラホスを含まず、かつ減少した
２,４−Ｄレベル（０．５ｍｇ／ｌ）を有する培地のいずれかに分割したことで
あった。以前の結果から予期されるように、ビアラホス選択に対して、ＬＥＣ１
処理は、コントロールより高い形質転換頻度を生じた（５．７％対２．５％）。
低濃度のオーキシン培地（０．５ｍｇ／ｌ ２,４−Ｄ）は、減少した増殖速度
を生じるもまた予期された。このことに一致して、コントロールプラスミド処理
（ＵＢＩ：ＰＡＴ〜ＧＦＰ）について、ＧＦＰ発現（蛍光）コロニーの回収率は
、非常に効果的なビアラホス選択処理に関連して減少し、０．６％まで落ちた。
対照的に、ＬＥＣ１発現は、胚発生の刺激の間中、低濃度のオーキシン環境を補
い、トランスジェニックコロニーに増殖利益を供給し、そして４．０％において
形質転換体回収率の効率（それでもまだ、ＬＥＣ１／ビアラホス選択処理と同じ
範囲において）を維持していたかもしれないようであった。この結果から、ＬＥ
Ｃ１の封入が、コントロールと比較して、減少したオーキシンに対するコロニー
増殖を改善したことが明らかである。
【０１８０】 完全にオーキシンを含まない培地上で、ＬＥＣ１処理においてのみ、コロニー
が観察された。この実験において、未熟胚をコントロールプラスミド（ＵＢＩ：
ＰＡＴ〜ＧＦＰ）を用いてか、またはＵＢＩ：ＰＡＴ〜ＧＦＰ＋ｌｎ２：ＬＥＣ
１のいずれかを用いて衝撃し、次いで、３．０ｍｇ／ｌビアラホス、２．０ｍｇ
／ｌ ２，４−Ｄ培地またはビアラホスを含まず、２，４−Ｄも含まない培地（
この後者の処理において、野生型のトウモロコシカルスは胚形成増殖を示さなか
った）のいずれかの培地にプレートした。再び、予期されるように、ＬＥＣ１ポ
リヌクレオチドは、通常のオーキシン含有ビアラホス選択培地上で、形質転換を
コントロールプラスミド値の８％を超える２２．７％まで増加させた。また、予
期されたように、外来性オーキシンを欠く培地上のコントロールプラスミドを有
する形質転換体は回収されなかった。驚くべきことに、ＬＥＣ１処理された胚に
おいて、形質転換体を４％頻度にて回収した（これは、ビアラホス選択に対する
コントロールプラスミドよりさらに高かった）。
【０１８１】 オーキシン含有培地に対してさえも、ＧＦＰ＋発現と組み合わせたＬＥＣ１ポ
リヌクレオチドを使用して、化学的選択を伴わずに形質転換体を回収し得る。例
えば、これらの条件下において、形質転換体の回収は、比較的効率的であった（
ビアラホス選択の１８％と比較して１６％）が、これは、増殖するカルス集団か
らＧＦＰ発現コロニーを分離するために、上記の低濃度オーキシン処理または非
オーキシン処理より多くの注意を要求した。
【０１８２】 （Ｅ．ＬＥＣ１は、近交系の胚形成表現型および再生能力を改善する） 近交系ＰＨＰ３８に由来する未熟胚を単離し、培養し、そして以下の変化とと
もに実施例４に記載されるように形質転換をした。初めに、胚を６０１Ｈ培地（
０．１ｍｇ／ｌゼアチン、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、ＭＳおよびＳＨビタミン、プ
ロリン、硝酸銀、余剰な硝酸カリウム、カゼイン加水分解物、ゲルライト（ｇｅ
ｌｒｉｔｅ）、１０ｇ／ｌグルコースおよび２０ｇ／ｌスクロースを有するＭＳ
ベース培地）上で培養した。衝撃の前、胚を高浸透圧培地（２ｍｇ／ｌ ２，４
−Ｄおよび１２％スクロースを有する改変Ｄｕｎｃａｎ培地）に移した。衝撃後
、胚を３ｍｇ／ｌのビアラホスを有する６０１Ｈ培地に２週間移した。次いで、
胚をプロリンおよびカゼイン加水分解物を含まず、３ｍｇ／ｌビアラホスを含む
６０１Ｈ培地に移し、２週間毎に移した。形質転換頻度を、ビアラホス耐性ＧＦ
Ｐポジティブコロニーの数を計数することにより決定した。また、コロニーが胚
形成表現型（再生可能な）または非胚形成表現型を有するか否かに関してコロニ
ーを記録した。ＰＨＰ３８において、ＬＥＣ１ポリヌクレオチドは、形質転換頻
度を増加させ、そしてそのカルスの再生の可能性を改善した。例えば、平衡実験
（収穫された各穂に由来する胚を処理の間に等しく分割した）を実施し、この試
験においてＰＨＰ３８の未熟胚をコントロールプラスミド（ＵＢＩ：：ＰＡＴ〜
ＧＦＰ：：ｐｉｎＩＩ）を用いて衝撃し、１つの処理において、ＵＢＩ：：ＰＡ
Ｔ〜ＧＦＰ：：ｐｉｎＩＩプラスミド＋ｌｎ２：：ＬＥＣ１を用いて衝撃し、ま
たはＵＢＩ：：ＰＡＴ〜ＧＦＰ：：ｐｉｎＩＩプラスミド＋ｎｕｃ１：：ＬＥＣ
１（ＬＥＣ発現を駆動するトウモロコシ珠心特異的プロモーター）を用いて衝撃
した。ビアラホス含有培地上で増殖するＧＦＰ＋カルスの頻度（胚の開始数と比
較して）は衝撃６週間後に決定した。コントロール処理について、形質転換頻度
は、１．２％であったが、ｌｎ２：ＬＥＣ１およびｎｕｃ１：：ＬＥＣ１処理に
ついての形質転換頻度は、それぞれ３．２％および２．０％であった。さらに、
ＬＥＣ１ポリヌクレオチドの存在は、回収された形質転換体の再生能力を大幅に
改善しているようであった。コントロール形質転換体（ＵＢＩ：：ＰＡＴ〜ＧＦ
Ｐ：：ｐｉｎＩＩ単独）は、胚形成表現型、再生表現型を有しなかったが、ｌｎ
２：ＬＥＣ１処理およびｎｕｃ１：：ＬＥＣ１処理から回収された全ての形質転
換体は、より活力のある胚形成増殖パターンを示した。これは、植物を回復させ
る能力から生まれた。ｌｎ２：ＬＥＣ１およびｎｕｃ１：：ＬＥＣ１処理に由来
するカルスは、多数の健常な植物を産生した。
【０１８３】 （実施例９） （体細胞性胚形成を誘導するためのＬＥＣ１ポリヌクレオチド産物の一過性発
現） ＬＥＣ−１ポリヌクレオチド産物を一過性発現させることにより体細胞胚形成
を「キックスタート（ｋｉｃｋ ｓｔａｒｔ）」することが、所望され得る。こ
れは、ＬＥＣ１ ５’キャップポリアデニル化ＲＮＡ、ＬＥＣ−１ ＤＮＡを含
む発現カセット、またはＬＥＣ−１タンパク質を送達することによりなされ得る
。全てのこれらの分子は、微粒子銃を使用して送達され得る。例えば、５’キャ
ップポリアデニル化ＬＥＣ１ ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ’ｓ Ｍｅｓｓａｇｅ
ｍＭａｃｈｉｎｅ ｋｉｔを使用して、容易にインビトロで作製され得る。その
手順の概要に従って、上記ＲＮＡを、農学的に有用な発現カセットを含むＤＮＡ
とともに同時送達する。そのＲＮＡを受けた細胞は、直ぐに体細胞胚を形成し、
そしてこれらの大部分は農学的遺伝子を統合する。次いで、これらの胚から再生
された植物は、農学的遺伝子の存在についてスクリーニングされ得る。
【０１８４】 （実施例１０） （無配偶生殖を誘導するためのトウモロコシＬＥＣ１の使用） ＬＥＣ１発現を内側の珠皮または珠心に対して方向づけるトウモロコシ発現カ
セットは、容易に構築され得る。ＬＥＣ１ポリヌクレオチドの発現を珠心に対し
て方向づける発現カセットを、オオムギＮｕｃ１プロモーターを使用して作製し
た。胚を、上記の珠心特異的ＬＥＣ１発現カセットとともにＧＦＰ遺伝子に融合
した選択マーカーＰＡＴを用いて同時衝撃した。近交系（ＰＨＰ３８）形質転換
体およびＧＳ３形質転換体を実施例４および５に記載されるように得、そして再
生した。形質転換頻度はまた、ｎｕｃ１：ＬＥＣ１ポリヌクレオチドを使用して
コントロール以上に増加した（上記の実施例８を参照のこと）。
【０１８５】 次いで、再生した植物は、ＬＥＣ１発現珠心細胞から胚をデノボ産生し得るこ
とが予期される。これは、穂を受粉することにより補完され、正常な中心細胞受
精および胚乳発達を促進させる。このスキームの別の変化において、ｎｕｃ１：
ＬＥＣ１形質転換が、受精を伴わないデノボ胚発生および胚乳発生の両方を促進
するＦＩＥ無効遺伝子背景を使用してなされ得る（Ｏｈａｄら、１９９９ Ｔｈ
ｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：４０７−４１５；また１９９９年、８月３１
日に出願された米国係属出願第６０／１５１５７５号もまた参照のこと）。発生
胚の顕微鏡的試験に関して、無配偶生殖は珠心を発芽させる胚の存在により生じ
ることが明らかである。このスキームのさらに別の変化において、ＬＥＣ１ポリ
ヌクレオチドは、ホモ接合性接合子−胚−致死遺伝子型に上記のように送達され
得る。体細胞性珠心組織から産生された不定胚のみが、種子の中で発達する。
【０１８６】 （実施例１１） （微生物細胞におけるキメラ遺伝子の発現） インスタント転写因子をコードするｃＤＮＡは、Ｔ７ Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベク
ターｐＢＴ４３０に挿入され得る。このベクターは、バクテリオファージＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を使用するｐＥＴ−３ａ（Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５）の誘導体である。
プラスミドｐＢＴ４３０を、ｐＥＴ−３ａのＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位をその本来の位置にて最初に破壊することにより構築した。ＥｃｏｒＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むオリゴヌクレオチドアダプターをｐＥＴ−３ａ
のＢａｍＨＩ部位に挿入した。これは、その発現ベクターに遺伝子を挿入するた
めのさらに独特のクローニング部位を有するｐＥＴ−３ａＭを作成した。次いで
、翻訳開始位置のＮｄｅＩ部位を、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使
用して、ＮｃｏＩ部位に変換した。この領域におけるｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配
列（５’−ＣＡＴＡＴＧＧ）を、ｐＢＴ４３０において５’−ＣＣＣＡＴＧＧに
変換した。
【０１８７】 ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、このタンパク質をコードする核酸フラグ
メントを放出するように適切に消化され得る。次いで、このフラグメントを１％
ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧTM低融点アガロースゲル（ＦＭＣ）上で精製し得る。緩衝
液およびアガロースは、ＤＮＡフラグメントの視覚化のために、１０μｇ／ｍｌ
臭化エチジウムを含む。次いで、このフラグメントを製造業者の指示に従ってＧ
ＥＬａｓｅTM（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる消化
によりそのアガロールから精製され得、エタノール沈澱され得、乾燥され得、そ
して２０μＬの水に再懸濁され得る。適切なオリゴヌクレオチドアダプターは、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，ＭＡ）を使用してそのフラグメントに連結され得る。連結されたアダプター
を含むそのフラグメントは、上記のような低融点アガロースを使用して、余分な
アダプターから精製され得る。ベクターｐＢＴ４３０をアルカリホスファターゼ
（ＮＥＢ）を用いて消化、脱リン酸化し、そして上記のようにフェノール／クロ
ロホルムを用いて徐タンパクする。次いで、調製したベクターｐＢＴ４３０およ
びフラグメントを１６℃で１５時間連結させ、続いて、ＤＨ５エレクトロコンピ
テント細胞（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換する。形質転換体は、ＬＢ培地およ
び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天プレート上で選択され得る。次い
で、この転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換体を、制限酵素
分析により、Ｔ７プロモーターに関する正確な方向についてスクリーニングする
。
【０１８８】 高レベル発現について、そのＴ７プロモーターに関連して正確な方向にあるｃ
ＤＮＡインサートを有するプラスミドクローンは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）に形質転換され得る（Ｓｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１８９：１１３−１３０）。培養物をアンピシリンを含む（１００ｍｇ／
Ｌ）ＬＢ培地において２５℃にて増殖させる。６００ｎｍにおける吸光度がおよ
そ１の時点で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）が
、０．４ｍＭの最終濃度に添加され得、そしてインキュベーションを２５℃にて
３時間続け得る。次いで、細胞を遠心分離により収集して、そして０．１ｍＭ
ＤＴＴおよび０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むｐＨ８．
０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの５０μＬ中に再懸濁する。少量の１ｍｍガラ
スビーズが添加され得、そしてその混合物は、マイクロプローブ超音波処理器を
用いて１回につき約５秒間の３回の超音波処理をされ得る。この混合物を遠心分
離し、そして上清のタンパク質濃度を決定する。その培養物の可溶性画分に由来
する１μｇのタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離され得る。ゲルは、予期される分子量の地点に移動するタンパク質バンドにつ
いて観察され得る。
【０１８９】 （実施例１２） （植物転写因子の活性を阻害する能力について化合物を評価する工程） 本明細書中に記載される転写因子は、当業者に公知の多くの任意の方法を使用
して産生され得る。そのような方法には、実施例６に記載されるような細菌にお
ける発現、または真核生物細胞培養における発現、植物細胞培養における発現、
および適切に感染した生物体または細胞株におけるウイルス発現系の使用が挙げ
られるが、それらに限定されない。インスタント転写因子は、インビボにおいて
観察されるようなそのタンパク質の成熟形態として、または種々の酵素、タンパ
ク質、もしくは親和性タグに対する共有結合性接着による融合タンパク質として
のいずれかとして発現され得る。共通の融合タンパク質パートーナーには、グル
タチオンＳトランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、チオレドキシン（「Ｔｒｘ」）
、マルトース結合タンパク質、およびＣ−末端ヘキサヒスチジンポリペプチド（
「Ｈｉｓ）6」）および／またはＮ−末端ヘキサヒスチジンポリペプチド（「Ｈｉ
ｓ）6」）が挙げられる。この融合タンパク質は、その融合地点において、プロテ
アーゼ認識部位を用いて操作され得、その結果、インタクトな成熟タンパク質を
産生するように、融合パートナーがプロテアーゼ消化により分離され得る。その
ような、プロテアーゼの例には、トロンビン、エンテロキナーゼおよびＸａ因子
が挙げられる。しかし、融合タンパク質および酵素を結合するペプチドを特異的
に切断する任意のプロテアーゼが使用され得る。
【０１９０】 所望される場合、インスタント転写因子の精製は、タンパク質精製分野におけ
る当業者によく知られる多くの任意の分離技術を利用し得る。そのような方法の
例には、均質化、ろ過、遠心分離、熱変性、硫酸アンモニウム沈澱、脱塩、ｐＨ
沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよ
びアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、それらに限定されず、こ
こで、アフィニティーリガンドは、基質、基質アナログまたはインヒビターを示
す。転写因子が融合タンパク質として発現される場合、精製プロトコールは、発
現される酵素に接続された融合タンパク質タグに対して特異的なアフィニティー
樹脂またはその酵素に対して特異的なリガンドを含むアフィニティー樹脂の使用
を含み得る。例えば、転写因子は、チオレドキシンのＣ末端と結合した融合タン
パク質として発現され得る。さらに、（Ｈｉｓ）6ペプチドは、アフィニティー
精製についてさらなる機会を与えるために融合されたチオレドキシン部分のＮ末
端に操作され得る。他の適切なアフィニティー樹脂は、適切なリガンドを例えば
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂのような任意の適切な樹脂に連結させることにより、
合成され得る。代替的実施形態において、チオレドキシン融合タンパク質は、ジ
チオスレイトールを使用して、溶出され得るが、溶出は、その樹脂からチオレド
キシンをはずすように相互作用する他の試薬を使用して達成され得る。これらの
試薬は、β−メルカプトエタノールまたは他の還元チオールを含む。所望される
場合、溶出された融合タンパク質は、上記で言及されたような伝統的な手段によ
るさらなる精製に供され得る。チオレドキシン融合タンパク質およびその酵素の
タンパク質分解性切断は、その融合タンパク質が精製された後か、またはそのタ
ンパク質がＴｈｉｏＢｏｎｄTMアフィニティー樹脂もしくは他の樹脂にまだ結合
している間に、達成され得る。
【０１９１】 粗製の酵素、部分的に精製された酵素、または精製された酵素（単独または融
合タンパク質のいずれか）を、本明細書中に開示される転写因子の酵素的活性を
阻害する能力について化合物を評価するためのアッセイにおいて利用し得る。ア
ッセイは、最適な酵素活性を可能にする周知の実験条件下で実施され得る。
【０１９２】 （実施例１３） （ＬＥＣ１発現は、増加した増殖速度を生じ、これは形質転換体のポジティブ
選択のためのスクリーニング基準として使用され得る。） トウモロコシにおけるＬＥＣ１発現を駆動する強度を増大させる２つのプロモ
ーターを使用すると、ＬＥＣ１は、コントロール処理以上にカルス増殖を刺激し
、そしてＬＥＣ１を駆動するより強いプロモーターは、低レベルのプロモーター
を有するものよりも、より速い増殖を生じた。例えば、実験を実施して、ｌｎ２
およびｎｏｓプロモーターを比較した。上記のように、他の遺伝子を駆動するこ
れら２つのプロモーターを用いる本発明者らの経験に基づいて、ｌｎ２プロモー
ター（培地に由来するオーキシンとは異なる誘導物質の非存在下において）は、
非常に低いレベルで発現を駆動する。そのｎｏｓプロモーターは、中程度〜低レ
ベルの導入遺伝子発現（この実験に使用される培養条件下において、トウモロコ
シユビキチンプロモーターよりも、およそ１０倍〜３０倍低いが、ｌｎ２よりさ
らに強い）を示した。１つのコントロール処理をこの実験において使用した（Ｕ
ＢＩ：ＰＡＴ〜ＧＦＰｍｏ：ｐｉｎＩＩ構築物それ自体（ＬＥＣ１を含まない）
）。Ｈｉ−ＩＩ未熟胚を以前に記載されるように衝撃し、そしてトランスジェニ
ック事象、増殖事象を３週目および６週目に記録した。そのコントロール処理は
、０．８％の形質転換頻度を生じた。ｌｎ２：ＬＥＣ１処理およびｎｏｓ：ＬＥ
Ｃ１処理は、それぞれ２６．５％および４０．７％の形質転換頻度を生じた。
【０１９３】 これらの処理の範囲内で、コントロール処理と比較して、大きく、迅速に増殖
するカルスの全体頻度における増加もまた存在した。このデータについて、形質
転換カルスの生重量を、衝撃後２ヶ月目に記録した。全てのトランスジェニック
事象が、衝撃して数日以内に１つの形質転換細胞として開始したと仮定すると、
これらの重量は、この期間の間のこれらの形質転換体の相対増殖速度を示す（す
べての組織を継代培養して、各形質転換体について重さを量り、平均重量および
標準偏差を各処理について計算した）。コントロール処理について、２ヶ月後の
形質転換体の平均重量は、３７＋／−１５ｍｇ（ｎ＝６）であった。ｌｎ２：Ｌ
ＥＣ１処理およびｎｏｓ：ＬＥＣ１処理について、形質転換体の平均重量は、そ
れぞれ１２６＋／−１０６ｍｇおよび４４１＋／−４３０ｍｇであった。コント
ロール処理を、１．０の相対増殖値に設定した場合、これは、ｌｎ２：ＬＥＣ１
処理およびｎｏｓ：ＬＥＣ１処理の形質転換体は、コントロールの３．４倍およ
び１２倍の速さで増殖したことを意味する。このデータから、増加したＬＥＣ１
発現が、カルスの増殖速度の同時的増加を生じたことが明らかである。
【０１９４】 （実施例１４） （コムギの形質転換のため、そしてコムギ組織の再生能力を改善するためのポ
ジティブ選択系としてのＬＥＣ１ポリヌクレオチドの使用） （方法） （植物材料） コムギ種子Ｈｙｂｒｉｎｏｖａ系統ＮＨ５３５およびＢＯ０１４をプラグトレ
ー内の土壌に蒔き、６℃にて８週間春化処理した。春化処理した実生を８’’ポ
ット内に移し、そして制御された環境室で増殖させた。使用された増殖条件は、
以下であった１）土壌成分：７５％Ｌ＆Ｐファイングレードピート、１２％の篩
にかけられた滅菌ローム、１０％６ｍｍの篩にかけられた石灰を含まない沈砂、
３％の培地グレードのバーミキュライト、土壌１ｍ3あたり３．５ｋｇのＯｓｍ
ｏｃｏｔｅ（徐放性肥料、１５−１１−１３ＮＰＫ＋微量栄養素）、１ｍ3あた
り０．５ｋｇＰＧミックス（１４−１６−１８ＮＰＫ顆粒状肥料添加微量栄養素
、２）１６時間の明期（約７５０μＥｓ-1ｍ-2の衝撃量を供給する４００Ｗナト
リウムランプ）、日中は１８℃〜２０℃そして夜間は１４℃〜１６℃の温度、５
０〜７０％の相対大気湿度ならびに３）ペストコントロール：４〜６週間毎の硫
黄スプレーおよびＡｍｂｌｙｓｅｉｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｕｓ（Ｎｏｖａｒ
ｔｉｓ ＢＣＭ Ｌｔｄ、ＵＫ）を使用するアザミウマの生物学的コントロール
。
【０１９５】 （外植体の単離および培養開始） 主要な外植体の２つの供給源（胚盤（ｓｃｕｔｅｌｌａｒ）および花序組織）
を使用した。胚盤について、未熟な半透明胚を含む初期から中期の乳段階の穎果
を収集し、そして７０％エタノールで５分間および０．５％次亜塩素酸塩溶液で
１５〜３０分、表面滅菌した。花序について、０．５〜１．０ｃｍの花序を含む
分げつ枝を花序を保有する節の下を切断することにより収集した（分げつ枝の第
２節）。分げつ枝を切りとって、およそ８〜１０ｃｍの長さまで調節し、Ｎｅｓ
ｃｏｆｉｌｍ（Ｂａｎｄｏ Ｃｈｅｍｉｃｌ Ｉｎｄ．Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を
用いてシールした上部末端を用いて上記のように表面滅菌した。
【０１９６】 無菌条件下において、長さがおよそ０．５〜１．０ｍｍの胚を単離し、そして
胚軸を除去した。花序を分げつ枝から解体し、そしておよそ１ｍｍ片に切り分け
た。３０の胚盤または１ｍｍ花序外植体を、ＭＤ０．５またはＬ７Ｄ２培養培地
を含む９０ｍｍペトリ皿の中心（１８ｍｍの標的円）に配置した。胚軸側を胚盤
を衝撃に対して曝露した培地に接触させて配置したが、花序片をランダムに配置
した。衝撃前に、培養物を２５±℃にて、暗室において、およそ２４時間インキ
ュベートした。衝撃後、衝撃された各プレートに由来する外植体を、カルス誘導
のために３枚のプレートの全域にスプレッドした。
【０１９７】 （培養培地） 胚盤組織（ＭＤ０．５）のための標準的なカルス誘導培地は、９％スクロース
、１０ｍｇｌ-1 ＡｇＮＯ3および０．５ｍｇｌ-1 ２，４−Ｄ（Ｒａｓｃｏ−
Ｇａｕｎｔら、１９９９）を補充した凝固（０．５％Ａｇａｒｇｅｌ、Ｓｉｇｍ
ａ Ａ３３０１）改変化ＭＳ培地から構成された。花序組織を、９％マルトース
および２ｍｇｌ-1 ２，４−Ｄ（Ｒａｓｃｏ−ＧａｕｎｔおよびＢａｒｃｅｌｏ
，１９９９）を補充した凝固（０．５％Ａｇａｒｇｅｌ）Ｌ３培地上から構成さ
れたＬ７Ｄ７上で培養した。基本の苗条誘導培地、ＲＺ含有Ｌ塩、ビタミンおよ
びイノシトール、３％ｗ／ｖマルトース、０．１ｍｇｌ-1２，４−Ｄおよび５ｍ
ｇｌ-1ゼアチン（Ｒａｓｃｏ−ＧａｕｎｔおよびＢａｒｃｅｌｏ、１９９９）。
再生された小植物を、ＲＺと同じ組成物を有するが、２，４−Ｄおよびゼアチン
を有しないＲＯ培地において維持した。
【０１９８】 （ＤＮＡ沈澱手順および粒子衝撃） 本来のＢｉｏ−Ｒａｄ手順（ＢａｒｃｅｌｏおよびＬａｚｚｅｒｉ，１９９５
）から改変されたプロトコールに従って、サブミクロン金粒子（０．６μＭｉｃ
ｒｏｎ Ｇｏｌｄ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、トウモロコシｌｎ−２：ＬＥＣ１構築
物を含むプラスミドを用いて被覆した。標準的な沈澱混合物は、５０μｌ ＳＤ
Ｗ中１ｍｇの金粒子、５０μｌの２．５Ｍ塩化カルシウム、２０μｌの１００ｍ
Ｍスペルミジンを含まない塩基および５μｌＤＮＡ（１μｇμｌ-1濃度）から構
成された。この成分を合成後、この混合物をボルテックスして、上清を捨てた。
次いで、その粒子を１５０μｌの無水エタノールを用いて洗浄し、最後に８５μ
ｌの無水エタノールに再懸濁した。このＤＮＡ／金エタノール溶液を、エタノー
ル蒸発を最小にするために氷上に保持した。各衝撃について、５μｌのＤＮＡ／
金エタノール溶液（約６０μｇの金）をマクロキャリアに充填した。
【０１９９】 ６５０ｐｓｉ加速圧および２８ｉｎ．Ｈｇチャンバー真空圧にて、停止プレー
トから５．５ｃｍの標的距離を有するＤｕＰｏｎｔ ＰＤＳ １０００／Ｈｅ銃
を使用して粒子衝撃を実行した。
【０２００】 （形質転換体の再生） カルス誘導について、衝撃外植体を、最初の皿および他の２つの皿において培
地の表面に渡って分配し、暗室において３週間、２５±１℃にて培養した。各カ
ルスに由来する体細胞胚の発生を定期的に記録した。苗条誘導について、カルス
をＲＺ培地に移し、１２ｈ光（２５０μＥｓ-1ｍ-2、冷白色蛍光灯由来）下にお
いて、２５℃±１℃で３週間、２回培養した。同じカルスに由来して再生する全
ての植物を記述した。Ｒ０培地において６〜９週間後、コントロール培養よりも
より活発に増殖する植物を土壌に植えた。その小植物を増殖因子中で１〜２週間
、気候順応させた。その後、上記の生長条件下で、成熟するまで生長させた。
【０２０１】 （カルスおよび葉組織からのＤＮＡ単離） ゲノムＤＮＡを、ＳｔａｃｅｙおよびＩｓａａｃ（１９９４）により記載され
るＣＴＡＢ（セチルトリエチルアンモニウム臭化物、Ｓｉｇｍａ Ｈ５８８２）
方法の改変版を使用してカルスまたは葉から抽出した。およそ、１００〜２００
ｍｇの凍結組織を液体窒素中で粉末状に粉砕し、１ｍｌのＣＴＡＢ抽出緩衝液（
２％ＣＴＡＢ、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８、１
．４Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＤＴＴ）中、６５℃にて３０分間ホモジェナイズ
した。およそ１ｍｌの２４：１ｖ／ｖクロロホルム：オクタノールを用いる単一
タンパク質抽出がなされる前に、ホモジェナイズされたサンプルを室温にて１５
分間冷却させた。サンプルを７分間、１３，０００ｒｐｍにて遠心分離し、そし
て上清の上層を大きな口のピペットチップを使用して収集した。ＤＮＡを、氷上
で１時間９５％エタノール中でのインキュベーションにより上清から沈澱させた
。ＤＮＡスレッドをガラスフック上にスプールし、０．２Ｍの酢酸ナトリウムを
含む７５％エタノールで１０分間洗浄し、５分間風乾し、ＴＥ緩衝液中に再懸濁
した。５μｌのＲＮＡｓｅ Ａをサンプルに添加し、そして３７℃で１時間イン
キュベートした。
【０２０２】 ゲノムＤＮＡの定量化について、ゲル電気泳動を０．８％アガロールゲルを使
用して、１×ＴＢＥ緩衝液中で実施した。１μｌのサンプルを、２００、４００
、６００および８００ｎｇμｌ-1 のλアンカットＤＮＡマーカーを並べて分画
した。
【０２０３】 （ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析） トウモロコシＬＥＣ１ポリヌクレオチドの存在を１００〜２００ｎｇのテンプ
レートＤＮＡを１×濃度酵素緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００）、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭのプライマーおよび
０．０２２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）を含む３０ｍｌのＰＣＲ反応混合物中で使用するＰＣＲにより分析した
。温度サイクリング条件は、以下のようであった（３０サイクル）：９５℃３０
秒における変性、５５℃１分におけるアニーリングおよび７２℃１分における伸
長。使用されたプライマー配列（Ｆ＝正方向；Ｒ＝逆方向）は、（Ｆ）５’−Ｃ
ＧＣ ＴＣＴ ＧＴＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＴＧＴ ＡＣＴ Ｃ−３’(Ｒ）５’
−ＣＧＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＣＴＣ Ｃ−３’であっ
た。おおよそのＰＣＲ産物長は、６２０ｂｐであった。
【０２０４】 （結果） 増加した再生能力およびトウモロコシＬＥＣ１の発現によるトウモロコシ形質
転換頻度の改善を示すような実験後、次いで、そのポリヌクレオチドをコムギ胚
盤および花序外植体に導入し、トウモロコシｌｎ２プロモーターにより駆動した
。両方の組織をコムギ形質転換のために使用する。
【０２０５】 ２，４−Ｄ−含有誘導培地上で３週間後の両組織に由来する体細胞胚の誘導に
続いて、カルスを、苗条再生培地上に移す前に評価する。カルス評価は以下：ａ
）カルスを０＝非胚形成カルス、１＝２５％のカルス表面胚形成、２＝２５％の
カルス表面胚形成、３＝５０〜７５％のカルス表面胚形成、４＝７５〜１００％
のカルス表面胚形成として記録する工程、およびｂ）胚形成カルスの数／評価さ
れるカルス（胚盤または花序）の総数としての割合において表される胚形成能力
を決定する工程を含む。
【０２０６】 （胚盤カルス） コントロールコムギＮＨ５３５系統の胚盤組織の平均カルス得点（１．４±０
．３）およびＬＥＣ−衝撃コムギＮＨ５３５系統の胚盤組織の平均カルス得点（
１．４±０．３）には、有意な差異は存在しなかった。しかし、コムギＢＯ ０
１４系統のＬＥＣ衝撃杯盤のカルス得点（１．５±０．５）は、コントロールと
比較して（０．５±０．２）有意に改善された。同様に、ＮＨ５３５系統の胚形
成能力は、ＬＥＣ処理により影響されるようには観察されなかった（ＬＥＣカル
ス＝８４．３±９．３％、コントロールカルス＝９０％）。しかし、ＬＥＣ衝撃
ＢＯ ０１４系統は、胚形成カルス頻度において明らかな増加を有した（ＬＥＣ
カルス＝７５．４±１６．８％、コントロールカルス＝３６．７±４．７％）。
形成された胚形成カルスの質を試験すると、両方の系統は、産生された「良好」
カルス（すなわち、３または４の得点を有するカルス）の数において有意な増加
を示した。ＮＨ５３５系統の「良好な」質カルスは、５％から２２．３％に増加
したが、ＢＯ ０１４系統は、０％から２３．６％に増加した。これらのカルス
は、一般的に大きく、迅速に増殖し、そして活発である。
【０２０７】 カルス誘導および評価の後、カルスを合計６週間、苗条誘導培地に移した。カ
ルスの苗条再生を、苗条再生カルスの数／評価されたカルスの総数（パーセンテ
ージとして表される）として決定した。培養物の苗条再生は、各カルスにおいて
産生された体細胞胚の質および量と対応した。故に、ＮＨ５３５系統のＬＥＣ衝
撃カルス組織（７１．９±１２．１）およびコントロールカルス組織（７０±１
４）の再生に、有意な差異は存在しなかった。しかしコムギＢＯ ０１４系統の
ＬＥＣ衝撃カルスの再生（５２．３±２６．９）は、コントロール（１５．６±
６．３）と比較して有意に改善された。
【０２０８】 コムギに対するポジティブ選択系としてＬＥＣの適合性を試験するために、活
発なカルスに由来するサンプル組織を、ＬＥＣ配列の存在について分析した。４
１のＢＯ ０１４および１３ＮＨ５３５カルスを選択した。結果は、１０／４１
ＢＯ ０１４カルスおよび８／１３ＮＨ５３５は、ＰＣＲポジティブであった。
従って、形質転換系統を選択を伴わずに２４．４％および６１．５％の頻度にて
同定した。これらの頻度は、従来の選択系（例えば、除草剤耐性系、および抗生
物質耐性系（例えば、ｂａｒ、ｎｐｔＩＩ））と比較可能であり、選択「逸脱」
頻度が一般的に高く、かつ可変性であるコムギ形質転換において適用される。さ
らに、本発明者らは、選択薬剤の非存在下における形態学的選択によるコムギ形
質転換の報告を知らない。
【０２０９】 カルス形質転換頻度は、ＮＨ５３５系統およびＢＯ０１４系統において、それ
ぞれ５．６％および４．４％であった。またトランスジェニック植物をＬＥＣ−
ポジティブカルス系統から回収した。７つの非クローン植物をＮＨ５３５から回
収し、６つの非クローン植物をＢＯ ０１４から回収して、衝撃された外植体の
数に基づいて、それぞれ植物形質転換頻度３．９％および３．３％を示した。
【０２１０】 （花序カルス） 外植体として、コムギの組織培養および形質転換のための花序組織の使用は、
種子外植体（例えば、胚盤）以上のいくつかの利点を提供する（Ｒａｓｃｏ−Ｇ
ａｕｎｔおよびＢａｒｃｅｌｏ、１９９９）。しかし、この組織の培養に対する
応答は、非常に遺伝子型依存性であり、そしてカルスはしばしば非再生的である
にもかかわらず、「高度な胚形成の」外見を有する。従って、ＬＥＣを花序組織
に導入すると、ＢＯ ０１４のような再生の乏しい系統に対して、再生が増強さ
れ得るか否かが分かる。
【０２１１】 ＢＯ ０１４系統を使用して、苗条再生をＬＥＣ衝撃組織において有意に改善
したが、カルスの質は、衝撃組織およびコントロール組織のおいて類似している
ようであった。コントロール培養物からは苗条は再生しなかったが、ＬＥＣ衝撃
カルスからは８つの植物が再生し、１０．７％の苗条再生頻度を生じた。
【０２１２】
【表２】
【０２１３】
【表３】
【０２１４】
【表４】 （実施例１５） （双子葉植物細胞におけるキメラ遺伝子の発現） ＬＥＣ１ポリヌクレオチドはまた、ダイズの形質転換を改善するために使用さ
れ得る。これを実証するために、ｌｎ２プロモーターおよびＬＥＣ１コード領域
からなる構築物を、Ｐａｒｒｏｔｔ，Ｗ．Ａ．、Ｌ．Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｄ．
Ｆ．Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，Ｅ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＧ．Ｂ．Ｃｏｌ
ｌｉｎｓ、（１９８９）Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｎｔｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７
：６１５−６１７に記載される方法を本質的に使用して、粒子ボンバードメント
によりダイズの胚形成懸濁培養物に導入した。改変を伴うこの方法は、以下に記
載される。
【０２１５】 子葉が３ｍｍと５ｍｍの間の長さであった場合、種子をｐｏｄから除去した。
その種子をＣｈｌｏｒｏｘ溶液（０．５％）中で１５分滅菌し、その後、その種
子を滅菌蒸留水を用いてリンスした。胚軸を含む種子の一部を最初に切り取るこ
とによりその未熟子葉を切除した。次いで、小刀葉（ｓｃａｌｐｅｌ ｂｌａｄ
ｅ）の平滑末端を有する種子の遠位端を穏やかに押すことによりその子葉を種皮
から除去する。次いで、その子葉をＳＢ１開始培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２
０ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ、３１．５ｇ／ｌスクロース、８ｇ／Ｌ ＴＣ Ａｇａｒ
、ｐＨ５．８）に置いた（平らな面を上に）。ペトリ皿を２６℃にて明所でイン
キュベートした（１日に１６時間；７５〜８０μＥ）。４週間のインキュベーシ
ョンの後、子葉を新鮮なＳＢ１培地に移した。さらに２週間後、増殖領域を示す
球状段階の体細胞胚を切除し、ＦＮ Ｌｉｔｅ 液体培地（Ｓａｍｏｙｌｏｖ，
Ｖ．Ｍ．、Ｄ．Ｍ．ＴｕｃｋｅｒおよびＷ．Ａ．Ｐａｒｒｏｔｔ（１９９８）Ｓ
ｏｙｂｅａｎ[Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌｌ]ｅｍｂｒｙｏｇ
ｅｎｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎ
ｄ ｔｏｔａｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒ
ａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ
３４−１３）に移した。体細胞胚の約１０〜１２の小クラスターを、３５ｍｌの
ＳＢ１７２培地を含む２５０ｍｌフラスコに置いた。ダイズ胚形成懸濁培養物を
回転振盪機上（１５０ｒｐｍ）で、２６℃にて、蛍光灯（２０μＥ）を用いて昼
１６時間／夜８時間のスケジュールで３５ｍＬ液体培地において維持した。およ
そ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地に接種することにより、２週間毎に培養
物を継代培養した。
【０２１６】 次いで、ダイズ胚形成懸濁培養物をパーティクルガンボンバードメントを使用
して形質転換した（Ｋｌｅｉｎら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
３２７：７０，米国特許第４，９４５，０５０号）。ＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏｌｉ
ｓｔｉｃTMＰＤＳ１０００／ＨＥ機器をこれらの形質転換のために使用した。ダ
イズ形質転換を促進するために使用された選択マーカー遺伝子は、カリフラワー
モザイクウイルスに由来する３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、（１９８５）
Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２２５に由来する
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉに由来する；Ｇｒｉ
ｔｚら、（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１７９〜１８８）、およびＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに由来
するノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域から構成されるキメラ遺伝子である。
【０２１７】 ５０μＬの６０ｍｇ／ｍＬ１μｍ金粒子懸濁液に、（順番に）５μＬＤＮＡ（
１μｇ／μＬ）、２０μｌスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬＣａＣｌ 2 （２．５Ｍ）を添加した。この粒子調製物を３分間攪拌し、微量遠心器におい
て１０秒間回転し、そして上清を除去した。ＤＮＡ被覆粒子を４００μＬの７０
％エタノールで一回洗浄し、４０μＬの無水エタノールに再懸濁した。このＤＮ
Ａ／粒子懸濁液を１秒ずつ３回超音波処理した。次いで、５μＬのＤＮＡ被覆金
粒子を各マクロキャリアーディスクに充填した。
【０２１８】 およそ、３００〜４００ｍｇの２週間経過懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍペ
トリ皿に置いて、ピペットを用いて組織から残りの液体を除去した。膜破裂圧を
１１００ｐｓｉに設定し、チャンバーから、２８インチ水銀の真空まで空気を抜
いた。この組織を固定スクリーンから、およそ８ｃｍ離れた所に置き、そして３
回衝撃した。衝撃後、この組織を半分に分割し、３５ｍＬのＦＮ Ｌｉｔｅ培地
に戻した。
【０２１９】 衝撃後５〜７日間、液体培地を新鮮な培地に交換した。衝撃後１１日目に、こ
の培地を５０ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含む新鮮な培地と交換した。この選
択培地を毎週、新たにする。衝撃後７〜８週目に、緑色の形質転換組織は、形質
転換されていない壊死性の胚形成クラスターに由来する増殖が観察された。単離
された緑色の組織を除去し、そして個々のフラスコに接種して、新たな、クロー
ン増殖性（ｃｌｏｎａｌｌｙ ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ）の形質転換胚形成懸濁培
養物を産生した。各々の新しい系統を、独立した形質転換事象として処理した。
次いで、これらの懸濁液を継代培養し、そして未熟胚のクラスターとして維持し
たか、または組織を個々の胚の成熟および出芽によって植物全体に再生した。
【０２２０】 ２つの異なる遺伝子型（９２Ｂ９１および９３Ｂ８２）をこれらの実験におい
て使用した。組織のサンプルを、ヒグロマイシン耐性遺伝子単独か、またはヒグ
ロマイシン耐性遺伝子およびＬＥＣ１構築物の１：１混合物のいずれかを使用し
て衝撃した。９２Ｂ９１から産生された胚形成培養物は、一般的に形質転換事象
を生成するが、９３Ｂ８２に由来する培養物を形質転換することは非常に難しい
。９２Ｂ９１を用いる形質転換実験について、およそ等しい数の形質転換体を、
ＬＥＣ１ポリヌクレオチドを含まないものとしてＬＥＣ１ポリヌクレオチドを用
いて実行された衝撃体から回収した。２９の形質転換体をＬＥＣ１処理９２Ｂ９
１組織から回収したが、２７の形質転換体をヒグロマイシン耐性遺伝子のみを受
けた組織から回収した。対照的に、形質転換体をＬＥＣ１ポリヌクレオチドを受
けた９３Ｂ８２組織からのみ回収した（ヒグロマイシン耐性遺伝子のみを使用す
る処理からは回収されなかった）。５つの形質転換体をＬＥＣ１ポリヌクレオチ
ドを用いて衝撃された９３Ｂ８２組織から回収したが、ヒグロマイシン耐性遺伝
子のみを用いて処理された組織からは形質転換体は回収されなかった。これらの
結果は、ＬＥＣ１ポリヌクレオチドは、ダイズの困難な遺伝子型への遺伝子移入
について非常に価値がある。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、種々の配列の比較および保存領域の整列を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月１９日（２００１．１．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】 カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物内（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）形質転換
の間、ＬＥＣ１を過剰発現するために用いられた（Ｈａｒａｄａら、ＷＯ９８／
３７１８４）。Ｈａｒａｄａらにより指摘されたように、３５Ｓは強力なプロモ
ーターであり、かれらの実験において、３５Ｓ：ＬＥＣ１は、形質転換を改善せ
ず、そして実際にそれを妨げるようであったことが見出された（３５Ｓ：ＬＥＣ
１での形質転換効率は、通常得られる効率の０．６％と見積もられた）。従って
、発生の配偶体段階における過剰発現のような細胞型の過剰発現は、形質転換プ
ロセスおよび形質転換された子孫の首尾よい回収にとって不適切かつ有害であり
得る。ＷＯ ９９／６７４０５ Ｈａｒａｄａらは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｌｅｃ１プロモーターを開示している。 対照的に、本発明者らは、適切な制御エ
レメント（組織特異的プロモーターおよび／または誘導性プロモーターを含む）
下で、そして適切な植物細胞中でのＬＥＣ１遺伝子の異所性の発現が、通常培養
されにくい組織／遺伝子型中で胚形成を刺激するために用いられ得ることを示し
ている。同様に、培養されにくい遺伝子型における異所性発現は、胚前駆細胞の
数を増加させ得（または胚へと発達する数を増加させ得）、これは形質転換頻度
における増加を導く。ＲＮＡまたはタンパク質を用いる一過性発現は、胚形成を
導く事象のカスケードを開始するのに十分であり得る。これは、トウモロコシ胚
盤、未成熟葉基部、未成熟雄穂などのような標的組織において貴重である。ＬＥ
Ｃ１遺伝子は、陽性の選択マーカーとして用いられ得る。すなわち、これはトラ
ンスジェニック細胞中で周囲の野生型細胞を殺傷することなく胚形成を誘発する
。導入された遺伝子を受け取っている細胞が胚形成をうけるか、または既に組織
中で胚形成をうけている組織中でＬＥＣ１発現が体細胞胚のより迅速な再反復を
刺激するために、これが起こる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローエ， ケイス エス． アメリカ合衆国 アイオワ 50131， ジ ョーンストン， ハーバー オークス ド ライブ 6407 (72)発明者 ゴードン−カム， ウィリアム ジェイ． アメリカ合衆国 アイオワ 50322， ア ーバンデール， 67ティーエイチ ストリ ート 3916 (72)発明者 クレイン， セオドア エム． アメリカ合衆国 デラウェア 19810， ウィルミントン， ローズウッド ドライ ブ 2229 (72)発明者 ラスコ−ゴーント， サンリザ イギリス国 エーエル６ ０ピーワイ ハ ートフォードシェア， ウェルウィン， オークランズ， キャノンズフィールド ロード 29 (72)発明者 カホーン， レベッカ イー． アメリカ合衆国 デラウェア 19806， ウィルミントン， ウエスト 18ティーエ イチ ストリート 2331 (72)発明者 サン， キシファン アメリカ合衆国 アイオワ 50322， ア ーバンデール， 66ティーエイチ ストリ ート 4609 (72)発明者 ホースター， ジョージ ジェイ． アメリカ合衆国 アイオワ 50310， デ ズ モインズ， ペイン ロード 2623 (72)発明者 グレゴリー， キャロライン アン アメリカ合衆国 アイオワ 50325， ク ライブ， エヌ．ダブル． 137ティーエ イチ コート 1411 (72)発明者 ナディムパリ， ラムゴパル アメリカ合衆国 ニュー ジャージー 07003， ブルームフィールド， フーバ ー アベニュー 364 ユニット 124， ビルディング ８ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 CA24 CA53 4H045 AA10 AA30 BA10 BA21 CA31 CA32 CA33 EA05 FA74

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸であって、以下： （ａ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２のポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１の少な
    くとも５０の連続する塩基を含むポリヌクレオチド； （ｃ）植物ＨＡＰ３型 ｃｃａａｔ−ボックス転写アクチベータを有するポリ
    ヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の
    植物由来である、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１の全体
    配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって
    、該配列同一性％は、５０のＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ Ｗ
    ｅｉｇｈｔを用いるＧＡＰ分析により決定される、ポリヌクレオチド； （ｅ）少なくとも３００ヌクレオチド長を含むポリヌクレオチドであって、該
    ポリヌクレオチドは、配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９また
    は２１に示す配列を有するポリヌクレオチドに対して、高ストリンジェンシー条
    件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号２３のポリペプチドをコードする保存領域を含むポリヌクレオ
    チドであって、該ポリヌクレオチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物由来
    である、ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１に示す
    配列を有するポリヌクレオチド；ならびに （ｈ）（ａ）から（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、 からなる群より選択されたメンバーを含む、単離された核酸。
  2. 【請求項２】 （ｄ）中の前記転写アクチベータが、トウモロコシ、ダイズ
    、コムギ、イネ、Ｖｅｒｏｎｉａ、またはＡｒｇｅｍｏｎｅ由来である、請求項
    １に記載の単離された核酸。
  3. 【請求項３】 （ｆ）中の前記ポリヌクレオチドが、機能的等価物である、
    請求項１に記載の単離された核酸。
  4. 【請求項４】 請求項１の少なくとも１つの核酸を含む、ベクター。
  5. 【請求項５】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項１に記載の少
    なくとも１つの核酸を含む発現カセットであって、該核酸がセンス方向またはア
    ンチセンス方向である、発現カセット。
  6. 【請求項６】 前記核酸が、前記プロモーターにアンチセンス方向で作動可
    能に連結される、請求項５に記載の発現カセット。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載の少なくとも１つの発現カセットを含む、植
    物宿主細胞。
  8. 【請求項８】 植物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
  9. 【請求項９】 請求項５に記載の少なくとも１つの発現カセットを含むトラ
    ンスジェニック植物。
  10. 【請求項１０】 前記植物が、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、コムギ、
    イネ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、またはワタである、請求項９に記
    載のトランスジェニック植物。
  11. 【請求項１１】 請求項９に記載のトランスジェニック植物由来の種子。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のトランスジェニック植物由来の種子。
  13. 【請求項１３】 単離されたタンパク質であって、以下： （ａ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２の少
    なくとも２５の連続するアミノ酸を含むポリペプチド； （ｂ）配列番号２３の保存モチーフを含むＬＥＣ１転写アクチベータであるポ
    リペプチドであって、該ポリペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物由
    来である、ポリペプチド； （ｃ）配列番号２、１２、１４、１６、２０もしくは２２に対して少なくとも
    ６０％の配列同一性、または配列番号８、１０もしくは１８に対して７０％の配
    列同一性を有するポリペプチドであって、該配列同一性％は、配列全体に基づき
    、そして１２のＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔおよび４のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを
    用いるＧＡＰ分析により決定される、ポリペプチド； （ｄ）請求項１に記載の核酸によりコードされるポリペプチド； （ｅ）配列番号１、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、または２１の核
    酸によりコードされるポリペプチド；ならびに （ｆ）配列番号２、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２に示
    す配列を有するポリペプチド、 からなる群より選択されたメンバーを含む、単離されたタンパク質。
  14. 【請求項１４】 （ｂ）中の前記転写アクチベータが、トウモロコシ、ダイ
    ズ、コムギ、イネ、Ｖｅｒｏｎｉａ、またはＡｒｇｅｍｏｎｅ由来のＬＥＣ１タ
    ンパク質である、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載のタンパク質をコードするリボ核酸配列
    。
  16. 【請求項１６】 植物中のＬＥＣ１活性を調節するための方法であって、以
    下： （ａ）請求項５に記載の少なくとも１つの発現カセットを用いて植物細胞を形質
    転換する工程、および （ｂ）該植物中のＬＥＣ１活性を調節するのに十分な量で前記少なくとも１つの
    核酸を発現する形質転換された植物を再生する工程、 を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 前記植物が、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、コムギ、
    イネ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、またはワタである、請求項１６に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ＬＥＣ１活性が増加している、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＬＥＣ１活性が減少している、請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 植物細胞中のＬＥＣ１活性のレベルを一過性に調節する方
    法であって、請求項１に記載の少なくとも１つの核酸を導入する工程を包含する
    、方法。
  21. 【請求項２１】 前記少なくとも１つの核酸がリボ核酸である、請求項２０
    に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 植物細胞中のＬＥＣ１活性のレベルを一過性に調節する方
    法であって、請求項１３に記載の少なくとも１つのポリペプチドを導入する工程
    を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 植物細胞中の組織培養応答を増強する方法であって、少な
    くとも１つのＬＥＣ１ポリペプチドまたは少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレ
    オチドを、組織培養応答を増強するために十分な条件下で、該植物細胞に導入す
    る工程、を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 前記植物細胞が、少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオ
    チドを用いて形質転換される、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記植物細胞にお
    いて発現を駆動し、そして該植物細胞を生長させるプロモーターに作動可能に連
    結されている、請求項２３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記植物細胞が不応性細胞である、請求項２３に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 前記植物細胞が近交系植物細胞である、請求項２６に記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 植物細胞中の体細胞胚形成を誘導する方法であって、少な
    くとも１つのＬＥＣ１ポリペプチドまたは少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレ
    オチドを、応答性植物細胞に導入する工程を含み、ここで該応答性植物細胞は、
    形質転換された胚の生成を刺激するために十分な条件下で形質転換され、そして
    生長され、そして該植物細胞はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞以外である、方法。
  29. 【請求項２９】 前記植物細胞が、少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオ
    チドを用いて形質転換される、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物細胞中で発
    現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 植物生長条件下で前記形質転換した胚を生長させて再生植
    物を生成する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記植物細胞が、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、コム
    ギ、イネ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、またはワタ由来である、請求
    項２８に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２８に記載の方法により生成される植物。
  34. 【請求項３４】 形質転換細胞の積極的選択の方法であって、少なくとも１
    つのＬＥＣ１ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのＬＥＣ１ポリペプチドを
    、応答性植物細胞に導入する工程、および形質転換植物細胞を生長させる工程、
    を包含し、ここで該応答性植物細胞は、胚形成を誘導するのに十分な条件下で、
    形質転換され、そして生長されて、積極的選択手段を提供する、方法。
  35. 【請求項３５】 前記植物細胞が、少なくとも１つのポリヌクレオチドを用
    いて形質転換される、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、植物において発現
    を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３５に記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】 形質転換植物細胞の生長に適したように培地成分を変更す
    る工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記培地成分が、非形質転換細胞における体細胞胚形成を
    低下させるために変更される、請求項３４に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記ポリヌクレオチドが切り出される、請求項３６に記載
    の方法。
  40. 【請求項４０】 前記ポリヌクレオチドがＦＲＴ配列に隣接されて、該ポリ
    ヌクレオチドのＦＬＰ媒介切り出しを可能にする、請求項４０に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 植物細胞中で無配偶生殖を誘導するための方法であって、
    少なくとも１つのＬＥＣ１ポリペプチドまたは少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌ
    クレオチドを、応答性植物細胞に導入する工程、および該植物細胞を生長させる
    工程を包含し、ここで該導入する工程および生長させる工程は形質転換された体
    細胞性の胚を生成するために十分な条件下で行われる、方法。
  42. 【請求項４２】 前記植物細胞が、少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオ
    チドを用いて形質転換される、請求項４１に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、植物細胞にお
    ける発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される、請求項４１に記載の
    方法。
  44. 【請求項４４】 センス方法またはアンチセンス方法を用いて、ＦＩＥポリ
    コウムポリヌクレオチドの前記植物細胞中における発現を抑制する工程をさらに
    包含する、請求項４１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 植物生長条件下で前記胚を生長させて再生植物を生成する
    工程をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項４
    ３に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、珠皮組織また
    は珠心組織において発現される、請求項４３に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４１に記載の方法により生成される植物。
  49. 【請求項４９】 前記植物が雄性不稔である、請求項４８に記載の植物。
  50. 【請求項５０】 形質転換効率を上昇させる方法であって、形質転換効率を
    上昇させるために十分な条件下で、少なくとも１つのＬＥＣ１ポリペプチドまた
    は少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオチドを、応答性植物細胞に導入する工
    程を包含する、方法。
  51. 【請求項５１】 前記形質転換が、非形質転換植物における体細胞胚生長の
    生長を遅延させる培地中で行われる、請求項５０に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 形質転換が、低下したレベルのオーキシンまたは無オーキ
    シンで行われる、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記植物細胞が、少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオ
    チドを用いて形質転換される、請求項５０に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、植物細胞にお
    ける発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される、請求項５３に記載の
    方法。
  55. 【請求項５５】 前記植物細胞が不応性細胞である、請求項５０に記載の方
    法。
  56. 【請求項５６】 前記植物細胞が近交系細胞である、請求項５５に記載の方
    法。
  57. 【請求項５７】 再生植物の回収を上昇させる方法であって、少なくとも１
    つのＬＥＣ１ポリペプチドまたは少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオチドを
    、応答性植物細胞に導入する工程、および該植物細胞を生長させる工程を包含し
    、ここで該導入する工程および生長させる工程は再生植物を生成するために十分
    な条件下にある、方法。
  58. 【請求項５８】 前記植物細胞が、少なくとも１つのＬＥＣ１ポリヌクレオ
    チドを用いて形質転換される、請求項５７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、植物細胞にお
    ける発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される、請求項５８に記載の
    方法。
  60. 【請求項６０】 前記植物細胞が不応性細胞である、請求項５８に記載の方
    法。
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