JP2001504233A - Whole blood / mitogen assays and kits for early detection of subjects with cancer - Google Patents

Whole blood / mitogen assays and kits for early detection of subjects with cancer

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、卵巣癌または乳癌を有する被験者を検出する方法であって、ａ）該被験者から全血サンプルを得、ｂ）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生につながるリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、ｃ）工程ｂ）で得られた培養物を特異的腫瘍抗原にさらし、それにより抗原−抗体免疫複合体を形成させ、ｄ）工程ｃ）の抗原−抗体免疫複合体を検出する工程を含んでなり、腫瘍抗原関連抗体の存在が、該癌を有する被験者を示すことを特徴とする方法を提供する。 (57) Abstract: The present invention is a method for detecting a subject having ovarian cancer or breast cancer, comprising: a) obtaining a whole blood sample from the subject; and b) containing a mitogen in the presence or absence of an antigen. Incubating the whole blood sample in a culture containing a culture medium to induce polyclonal and specific activation of lymphocyte cells leading to antibody production, c) culturing the culture obtained in step b) Exposing to a specific tumor antigen, thereby forming an antigen-antibody immune complex, and d) detecting the antigen-antibody immune complex in step c), wherein the presence of the tumor antigen-related antibody is Providing a subject having the following.

Description

【発明の詳細な説明】 癌を有する被験者の早期検出のための全血／マイトジェンアッセイおよびキット発明の背景 癌を有する被験者に対する現在利用可能な診断手段としては、組換えタンパク 質に基づくアッセイおよび／または合成ペプチドに基づく抗体アッセイ、遺伝子 増幅技術などが挙げられる。本発明は、免疫系を介した、被験者における腫瘍の 簡便な早期初期スクリーニングまたは検出を提供する。 癌または腫瘍細胞は、体内（ヒトおよび腫瘍を有することが知られている他の 任意の動物との両方）の「正常」な細胞フローラから出現する。癌化／腫瘍形成 は、細胞の変化を伴う。これらの変化は細胞の遺伝暗号の突然変異として始まり 、一方、細胞の挙動の変化はタンパク質の発現レベルの変化から生じる。腫瘍が 増殖するにつれて、それが免疫系を抑制する効果が益々強力になり、そのため、 活性な抗体分泌が非常に低下したり、更にはほとんど検出できなくなることもあ る。 腫瘍細胞に特有の構造体は、「腫瘍抗原」である。腫瘍細胞に特有ではないも のの腫瘍細胞上で異なって発現されたり過剰に発現されうる構造体は、「腫瘍関 連抗原」とみなされる。場合によっては、それは、その抗原性を決定する炭水化 物または脂質によるタンパク質の「コーティング」である。例えば乳腺由来のム チンの場合には、該タンパク質は腫瘍細胞内で変化しないが、乳癌（ときには卵 巣癌）の患者では、それに対する抗体が見出される。その理由は、おそらく、糖 鎖の濃厚なコーティング（すなわち、該タンパク質は非常に濃密にグリコシル化 されている）のため、正常細胞内の該タンパク質が全く露出されないことにある 。腫瘍細胞ではグリコシル化が不完全であり、したがって、免疫系に対する新た な抗原として機能する（または機能しうる）タンパク質配列が新たに露出される ことになる。本発明は、たとえ抗体産生がin vivoで抑制される場合であっても 腫瘍特異的抗体の検出を可能にする免疫系の体液性アーム（humoral arm）の可 能性を明らかにする。発明の概要 本発明は、癌を有するか又は発癌ウイルスに感染した被検者を検出するための 改良されたアッセイに関する。本発明は、1）個体が癌を有するか否かを判定す るための診断薬、2）予後指示薬、3）抗癌治療の有効性（または新規潜在的抗癌 薬または抗癌剤の有効性）をモニターするための方法、4）被験者の腫瘍の除去 または療法の後の再発を判定するための方法、および5）臨床試験所および研究 所におけるアッセイで癌を検出し定量するための方法としての用途を意図する。 本発明は、被験者において腫瘍を検出したり腫瘍または癌を有する被験者を検 出するためのスクリーニングアッセイとして有用である。イメージングおよび療 法の増強のために、誘導された抗体を使用する。 本発明は、被験者から得られたサンプル中の腫瘍抗原関連抗体を検出するため のin vitro方法であって、a）該被験者から全血サンプルを得、b）マイトジェン を抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中で該全血サンプ ルをインキュベートして、抗体産生につながるリンパ球細胞のポリクローナル的 および特異的な活性化を誘導し、c）工程b）で得られた培養物を腫瘍抗原にさら し、それにより抗原−抗体免疫複合体を形成させ、d）工程c）の抗原−抗体免疫 複合体を検出する工程を含んでなり、腫瘍関連抗体の存在が、癌を有する被験者 を示すことを特徴とする方法を提供する。図面の簡単な説明 図１：P3-一次元分析 図２：P3およびP2-二次元分析 図3A〜3B：P1およびP3、P2およびP3-二次元分析 図4A〜4F：血清反応陰性マンガベイにおけるSIV特異的抗体の検出。図4Aは、E LISA（培養後）上のO.D.読取り値のレベルが、真の陰性、血清反応陽性および「 無症状感染／曝露」の間で識別可能であることを示す。図4B〜4Fは、O.D.サンプ ル／O.D.陰性対照の比率である。発明の詳細な説明 本発明は、癌を有するか又は発癌ウイルスに感染した被検者を検出するための 改良されたアッセイに関する。本発明は、1）個体が癌を有するか否かを判定す るための診断薬、2）予後指示薬、3）抗癌治療の有効性（または新規潜在的抗癌 薬または抗癌剤の有効性）をモニターするための方法、4）被験者の腫瘍の除去 または療法の後の再発を判定するための方法、および5）臨床試験所および研究 所におけるアッセイで癌を検出し定量するための方法としての用途を意図する。 本発明は、被験者から得られたサンプル中の腫瘍抗原関連抗体を検出するため のin vitro方法であって、a）該被験者から全血サンプルを得、b）マイトジェン を抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中で該全血サンプ ルをインキュベートして、抗体産生につながるリンパ球細胞のポリクローナル的 および特異的な活性化を誘導し、c）工程b）で得られた培養物を腫瘍抗原にさら し、それにより抗原−抗体免疫複合体を形成させ、d）工程c）の抗原−抗体免疫 複合体を検出する工程を含んでなり、腫瘍関連抗体の存在が、癌を有する被験者 を示すことを特徴とする方法を提供する。 １つの実施形態では、リンパ球細胞のサンプルを被験者から得、マイトジェン を抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中で該サンプルを インキュベートして、リンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を 誘導する。もう１つの実施形態では、リンパ球細胞のサンプルを被験者から得、 マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中で 該サンプルをインキュベートして、Ｂリンパ球細胞のポリクローナル的および特 異的な活性化を誘導する。もう１つの実施形態では、PBMCのサンプルを被験者か ら得、マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養 物中で該サンプルをインキュベートして、Ｂリンパ球細胞のポリクローナル的お よび特異的な活性化を誘導する。 癌／腫瘍の型には、骨髄性白血病、例えば慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血 病、急性前骨髄球性白血病、急性単球性白血病、急性骨髄単球性白血病；悪性リ ンパ腫、例えばバーキットリンパ腫および非ホジキンリンパ腫；リンパ性白血病 、例えば急性リンパ芽球性白血病および慢性リンパ芽球性白血病；髄膜腫；腺腫 ；腺癌、例えば小細胞肺、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸の腺癌；肉腫 、例えば脂肪肉腫、粘液様肉腫、滑液膜肉腫、ユーイング腫、胞状肉腫、ウィル ム ス腫、神経芽細胞腫、精巣ジスゲルミノーマ、網膜芽細胞腫および黒色腫が含ま れるが、これらに限定されるものではない。 本発明で用いる乳癌は、乳房で見出される任意の型の組識に由来する任意の腫 瘍を意味する。本発明で用いる卵巣癌は、卵巣で見出される任意の型の組識に由 来する任意の腫瘍を意昧する。本発明で定義する「腫瘍抗原関連抗体」は、腫瘍 抗原または腫瘍関連抗原に対する抗体を意味する。 １つの実施形態では、特異的抗体を産生する細胞を検出する。工程b）の培養 により上清を得、該上清を腫瘍抗原にさらし、それにより抗原−抗体免疫複合体 を形成させることが可能である。また、該培養物の白血球または細胞画分を使用 して、検出する抗体産生細胞を増殖させ、クローニングし、不死化する。 １つの実施形態においては、腫瘍抗原には、MUC-1、HERneu2、BrCal、p53、He r-2-c-neu(AcIISAVVGIL-NH2)、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、TAG-72、CA15 -3、CA549、BA46、乳房血清抗原、粘液癌抗原、PEMペプチド抗原、MUC1グリコシ ル化部位ペプチド、グリコシル化されたMUC1グリコシル化部位ペプチド、MUC1コ ア縦列反復ペプチド、MUC2コア縦列反復ペプチド、MUC3コア縦列反復ペプチド、 MUC5ACペプチド、SIMA、ルイスＸ抗原、シアリル・ルイスＸ抗原(BSAコンジュゲ ート)、Ｉ抗原(Gall,4、GlcNAc、1,3 Gal-R)、Ｔ抗原、TN抗原（OSM）シアリルT n抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗体は、「裸」の抗原 に対するもの、またはそれが形質転換用遺伝子の産物と共に形成する複合体に対 するものとみなされることが可能である。 腫瘍特異的抗体の検出に必要な腫瘍抗原は、いくつかの形態であることが可能 である。すなわち、a）全細胞（腫瘍の）が抗原として機能することが可能であ り、b）抗原として使用することが可能な産物を与える細胞膜、c）特有の腫瘍構 造またはタンパク質の配列（またはそのセグメント）を、ベクターを介して他の 産生体（細胞、細菌、酵母、ファージ）中に挿入し、次いで個々のタンパク質お よび構造体を産生させることが可能であり、d）腫瘍特異的タンパク質のアミノ 酸が既知の場合には、全タンパク質の断片であるペプチド（または全タンパク質 自体）を生化学的に合成し、抗原として使用することが可能であり、e）血清ま たは他の体液から高力価で単離することが可能である。 誘導または移植されたほとんどの実験動物腫瘍が、それに続く同一腫瘍での攻 撃に対してレシピエントを免疫するが、正常組識または他の腫瘍の移植に対して は免疫しない。TAAは、腫瘍によって異なる個々に特異的な抗原を有する傾向に ある化学発癌物質誘発腫瘍により(さらには、同一発癌物質により誘発された腫 瘍により)、また、ある所与のウイルスにより誘発された腫瘍間で交差反応性を 示す傾向にあるウイルス誘発腫瘍により、特によく示されている。ウイルス感染 は、「修飾された自己(modified self)」、すなわち主要組織適合遺伝子複合体と 共に又はその環境(context)中で認識される新たな抗原を与える可能性がある。 腫瘍抗原は、（1）ウイルスにより導入された新たな遺伝情報、（2）通常は不 活性な遺伝物質（おそらく胚発生中は除外）を癌遺伝子へと活性化し細胞表現型 にて発現させる、原癌遺伝子の活性化によると考えられる発癌物質による遺伝的 機能の改変、（3）腫瘍細胞が膜構成体（例えば、シアル酸）を合成する能力を 有さないことにより、通常は正常細胞上に存在するか又は細胞膜中に「埋もれて いる」抗原を露出させること、および（4）腫瘍細胞の死による、通常は細胞中 またはその細胞小器官中に隔離されている抗原の遊離により形成される。 動物腫瘍中のTATAを示すための技術には、標準的な組識移植方法、免疫蛍光法 、色素取込みまたは放射性同位体の遊離による細胞傷害性試験、免疫化ドナー由 来のリンパ球様細胞または血清に腫瘍をさらすことによるin vitroまたはin viv oでの腫瘍増殖の阻害、遅延型過敏症皮膚試験、およびin vitroにおけるリンパ 球のトランスフォーメーションが含まれる。 ヒト悪性腫瘍中のTAAに関する証拠は、いくつかの腫瘍（例えば、バーキット リンパ腫、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、骨肉腫、いくつかのGI癌など）で示され ている。女性における絨毛癌は、免疫応答が惹起される際に「腫瘍特異的」抗原 として機能しうる父親由来の組識適合抗原を有する。化学療法による絨毛癌の完 全治癒は、少なくとも一部は、そのような免疫応答に起因している可能性がある 。残念なことに、それらはTAAを有しているかもしれないが、すべてのヒト腫瘍 が宿主内で抗原性というわけではないらしい。 したがって、免疫系にとって新規と考えられる任意の構造を、腫瘍抗原とみな すことができる。免疫系にとって新規な抗原として出現し機能する正常なタンパ ク質のもう１つの一般例は、新規な環境中に出現する正常なタンパク質（例えば 、成熟（または成体）細胞上の胚性タンパク質）の例である。その場合、該新規 エピトープは、それらの２つの構造体の間の境界（すなわち、免疫系が見つけ出 し反応する新規な形態および構造体を形成する境界）内に存在するであろう。 腫瘍関連抗原（TAA）は、腫瘍細胞に関連した抗原であり、正常細胞上にも存 在するものの少量で存在するか又は異なる被検者生活相（phase of a subjects life）において存在する(すなわち、胚性タンパク質)。 本発明は、腫瘍を有する被験者を検出する方法であって、a）該被験者から全 血サンプルを得、b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培 地を含む、培養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生につなが るリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、c）核酸配 列を回収するために該細胞を処理し、d）得られた核酸配列を、ハイブリダイゼ ーション条件下、腫瘍抗原に対する曝露により産生する抗体の核酸配列に特異的 にハイブリダイズしうる一本鎖標識オリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、 そしてe）癌を有する被験者を示す該増幅産物の存在を検出する工程を含んでな る方法を提供する。 工程c）の細胞は、該細胞の核酸配列を露出させるよう処理することができる 。露出方法は当業者に公知である。別法として、二本鎖増幅産物を与えるよう核 酸配列にハイブリダイズするプライマー対により、工程d）で得られた核酸配列 を増幅することができる。増幅産物は検出可能である。 もう１つの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件下で可変領域の末端の 核酸配列にハイブリダイズしうる得られた核酸配列とプライマーとを接触させ 、特異的検出を行なう。腫瘍抗原および腫瘍関連抗体のプライマーおよびプロー ブは、当業者に公知である。 本発明は、腫瘍を有する被験者を検出する方法であって、a）該被験者から全 血サンプルを得、b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培 地を含む、培養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生につなが るリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、c）核酸配 列を別々に回収するために該細胞を処理し、d）得られた核酸配列を複数の一本 鎖 標識オリゴヌクレオチドプライマー対（前記の各対は、腫瘍抗原に対する曝露に より産生する抗体の核酸配列にハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブ リダイズする能力を有する）と接触させ、e）プライマー対がハイブリダイズす るいずれかの核酸配列を増幅して、二本鎖増幅産物を得、f）前記のいずれかの 二本鎖増幅産物を処理して、それより一本鎖核酸配列を得、g）得られたいずれ かの一本鎖核酸配列を、ハイブリダイゼーション条件下で該腫瘍抗原関連抗体に 特異的にハイブリダイズしうる標識オリゴヌクレオチドプローブと接触させ、h ）得られたいずれかのハイブリッドを、該標識プローブと複合体を特異的に形成 しうる（該プローブが前記複合体中に複合体形成条件下で存在する場合）検出可 能に付けられたタグと接触させ、そしてi）癌を有する被験者を示す得られたい ずれかの複合体の存在を検出する工程を含んでなる方法を提供する。 本発明では、抗原の存在下または非存在下でマイトジェンと共にインキュベー トする前に、バフィーコート（種々の容量の赤血球および血漿を有する）として も知られる境界層を集め、それにより、白血球に富む血液サンプル容量の一部を 培養物中に加える。白血球を富化する方法は当業者に公知である。例えば、管内 の中間層としてのバフィーコートを直接吸引したり、あるいは、まず血漿容量の 大部分を除去し、ついで残存血漿と共にバフィーコートを採取することが可能で ある。別法として、赤血球を細胞溶解し、遠心分離し、底部から白血球を集める 。 １つの実施形態では、該方法は、a）該被験者から全血サンプルを得、b）該全 血サンプルを、境界層を含む複数の成分層に分離し、c）該全血サンプルから該 境界層を集め、d）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地 を含む、培養物中で該境界層をインキュベートして、抗体産生につながるリンパ 球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、e）工程d）で得られ た培養物を抗原にさらし、それにより抗原−抗体免疫複合体を形成させ、f）工 程e）の抗原−抗体免疫複合体を検出する工程を含んでなり、ウイルス特異的抗 体の存在が、該抗原にさらされている被験者を示す。 １つの実施形態では、該方法は、a）被験者から全血サンプルを得、b）該全血 サンプルを、境界層を含む複数の成分層に分離し、c）該全血サンプルから該境 界層を集め、d）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を 含 む、培養物中で該境界層をインキュベートして、Ｂリンパ球細胞のポリクローナ ル的および特異的な活性化およびウイルスの増殖を誘導し、e）核酸配列を別々 に回収するために該細胞を処理し、f）得られた核酸配列を複数の一本鎖標識オ リゴヌクレオチドプライマー対（前記の各対は、ヒト免疫不全ウイルスにハイブ リダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする能力を有する）と接触さ せ、g）プライマー対がハイブリダイズするいずれかの核酸配列を増幅して、二 本鎖増幅産物を得、h）一本鎖増幅産物を得るために前記のいずれかの二本鎖増 幅産物を処理して、ヒト免疫不全ウイルスにハイブリダイゼーション条件下で特 異的にハイブリダイズしうる標識オリゴヌクレオチドプローブを有する一本鎖核 酸配列を得、j）得られたいずれかのハイブリッドを、該標識プローブと複合体 を特異的に形成しうる(該プローブが前記複合体中に複合体形成条件下で存在す る場合)検出可能に付けられたタグと接触させ、そしてk）ヒト免疫不全ウイルス の存在を示す得られたいずれかの複合体の存在を検出する工程を含む。 本発明は、腫瘍抗原関連抗体を検出するための方法であって、a）被験者から 全血サンプルを得、b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する 培地を含む、培養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生につな がるリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、c）該細 胞を露出させて、該腫瘍抗原関連抗体の核酸配列を別々に回収し、d）サンプル 中の腫瘍抗原関連抗体のRNAの逆転写を行なって、DNAコピーを得、e）該DNAのポ リメラーゼ連鎖反応増幅を行なって、複数のDNAコピーを得、f）該DNAコピーを 、複数の相補的DNAプローブにハイブリダイズさせて、該サンプルのDNA含量を検 出し、それにより腫瘍抗原関連抗体を検出することを含んでなる方法を提供する 。 本発明は、サンプル中の標的RNA配列を増幅するための方法であって、a）被験 者から全血サンプルを得、b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含 有する培地を含む、培養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生 につながるリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、c ）該細胞を露出させて、該腫瘍抗原関連抗体の核酸配列を別々に回収し、d）第 １プライマーおよび第２プライマー（第１プライマーは、標的RNAにハイブリ ダイズするのに十分な程度に、また、該標的RNAに相補的なcDNA配列の合成を開 始させるのに十分な程度に、該標的RNAに対して相補的であり、第２プライマー は、該cDNAにハイブリダイズするのに十分な程度に、また、伸長産物の合成を開 始させるのに十分な程度に、該標的RNAに対して相同である）ならびに耐熱性DNA ポリメラーゼを４個すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下に適当 なバッファー（該バッファーはMn+2を含む）中に含む反応混合物中、該耐熱性DN Aポリメラーゼが第１プライマーの伸長産物の合成を開始して該標的RNAに相補的 なcDNA配列を与えるのに十分な温度で、該サンプルを処理し、e）該反応混合物 を適当な温度で処理して、一本鎖cDNAを得、f）該耐熱性DNAポリメラーゼが第２ プライマーの伸長産物の合成を開始するための適当な温度で該反応混合物を処理 して、二本鎖cDNA配列を得、そしてg）工程e）の二本鎖cDNA配列をポリメラーゼ 連鎖反応により増幅することを含んでなる方法を提供する。好ましい実施形態で は、該バッファーは、酢酸マンガン(Mn(OAc)2またはMn(CH3CO2)2とも表される) 、ビシン-KOH(ビシンは、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)および酢酸カ リウム（KOAcまたはKCH3CO2とも表される）を含む。 本発明はまた、オリゴヌクレオチドプローブ配列の構造中に少なくとも１つの 標識を結合させる又は組込むことを特徴とする標識方法を意図する。標識は、一 般には、腫瘍抗原の検出を容易にすると意図される。標識は、酵素、発蛍光団、 高親和性コンジュゲート、ケミホア（chemiphore）および放射性原子（「放射能 標識」）よりなる群から選ばれる。他の標識を使用することも可能であるが、本 発明は、1）酵素アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびグルコー スオキシダーゼ、2）ビオチン−アビジンの親和性コンジュゲート系、3）フルオ レセインである発蛍光団、4）ルミノールであるケミホア、および5）好ましい放 射能標識である3H、14Cおよび32Pを意図する。 本発明は、腫瘍を有する被験者を検出する方法であって、a）該被験者から全 血サンプルを得、b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培 地を含む、培養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生につなが るリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、c）工程b） で得られた培養物を特異的腫瘍抗原関連抗体にさらし、それにより抗体−腫瘍抗 原免疫複合体を形成させ、d）工程c）の抗体−腫瘍抗原免疫複合体を検出する工 程を含んでなり、腫瘍抗原関連抗体の存在が、卵巣癌または乳癌を有する被験者 を示すことを特徴とする方法を提供する。 １つの実施形態では、工程b）の培養により上清を得、該上清を特異的腫瘍抗 原関連抗体にさらし、それにより抗体−腫瘍抗原免疫複合体を形成させる。 本発明は、被験者からの特異的腫瘍抗原関連抗体を検出するためのキットであ って、該キットが、全血サンプルを集めるための容器を含んでなり、該容器が、 抗体産生および該特異的腫瘍抗原関連抗体の検出のためのアッセイにつながるリ ンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導するのに有効なマイ トジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含有することを特徴と 図される。 １つの実施形態では、白血球細胞のサンプルを、被験者から得、マイトジェン を抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中で該サンプルを インキュベートして、リンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を 誘導する。もう１つの実施形態では、リンパ球細胞のサンプルを、被験者から得 、マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培養物中 で該サンプルをインキュベートして、Ｂリンパ球細胞のポリクローナル的および 特異的な活性化を誘導する。もう１つの実施形態では、PBMCのサンプルを、被験 者から得、マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、 培養物中で該サンプルをインキュベートして、Ｂリンパ球細胞のポリクローナル 的および特異的な活性化を誘導する。単一または複数の抗原を該容器に結合させ ることが可能である。 本発明では、抗原の存在下または非存在下に有効濃度のマイトジェン（例えば 、アメリカヤマゴボウマイトジェンおよび関連した腫瘍抗原およびペプチド）の 溶液を含有する試験管（例えば、バキュチューブ(vacutube)）に、血液サンプル を加える。試験する血液サンプルを、アメリカヤマゴボウマイトジェンの存在下 、 in vitroで培養する。アメリカヤマゴボウマイトジェンの代わりに又はそれに加 えて、抗体の産生または分泌をもたらすＢリンパ球細胞または体液系の他の活性 化物質およびTh2型免疫応答の活性化物質を使用して、同じ機能を達成すること ができる。インキュベーションの後、アリコートを該液体から採取し、ついで標 準的なELISA法および／またはウエスタンブロット分析により、所望の腫瘍抗原 関連抗体の存在に関してアッセイする。サンプルを後日アッセイしようとする場 合には、血液を遠心分離し、上清液体を集め、凍結し、保存することができる。 結果は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）/FACSの技術を用いて確認することができ る。該容器中の細胞画分を、PCRまたはELISPOTにおいて使用することができる。 抗体を検出するための他の方法は、当業者に公知である。 本発明の方法は、腫瘍抗原関連抗体の存在の判定が可能となるよう、必要に応 じて、血液の流体部分から血液細胞を分離することを含む。血液の流体部分から の血液細胞の分離は、当業者によく知られているいくつかの方法（例えば、遠心 分離、濾過または密度勾配）のいずれかにより行なうことができる。血液細胞を 液体から物理的に分離することは必ずしも必要でないと理解されるべきである。 抗原の存在下または非存在下でマイトジェンと共に全血をインキュベートした後 、血液からの液体を容易に抽出し、腫瘍抗原関連抗体に関して試験することがで きる。必要に応じて、穏やかな浸透圧ショックにより又は穏やかな界面活性剤で 赤血球を細胞溶解することができる。この場合、白血球は依然として生存可能で ある。 本発明の１つの実施形態では、抗原の存在下または非存在下に培地およびマイ トジェンを含有する血液収集管内に全血を集める。ついで該血液サンプルを、約 1：500の最終希釈度のアメリカヤマゴボウマイトジェンと共に、2×106個/mlの 生存リンパ球の濃度にて、7％CO2の加湿雰囲気中、37℃で1〜12日間インキュベ ートする。血液を遠心分離することが可能であり、直ちに上清流体を集め、約1 〜12時間以内にアッセイするか、またはELISA/ELISPOTおよび／またはウエスタ ンブロット法により反応性特異的抗体に関して試験するために後に凍結する。別 法として、液体または細胞または細胞成分のアリコートを、サンプルから直接採 取することができる。 本発明はまた、抗原の存在下または非存在下に有効濃度のマイトジェンを含有 する血液収集容器を含んでなるキットを含む。該容器は、必要に応じて、培地を 含有し得る。好ましい容器は試験管である。該血液収集容器は、プラスチック、 ガラスまたは血液培養に適した他の任意の物質であることが可能である。本発明 は、血液収集管以外の血液含有手段（例えば、血液のインキュベートが可能なウ ェルを含有するマイクロタイタープレート、組識培養フラスコ、ガラスフラスコ 、エーレンマイヤーフラスコおよび血液の培養が可能な他の任意の容器などであ るが、これらに限定されるものではない）も含むと理解されるべきである。 特異的腫瘍抗原に特異的に結合する腫瘍抗原関連抗体は、当業者に公知である 。さらに、該腫瘍抗原に結合させるためのタグとして、抗体を使用することがで きる。１つの実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体である。もう１つの実 施形態では、該抗体はポリクローナル抗体である。 本発明は、アミノ酸配列SGSGHGVTSAPDTR（配列番号1）を有するペプチドをコ ードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、アミノ酸配列SGSGAPDTRPAP GSTAP（配列番号2）を有するペプチドをコードする単離された核酸分子を提供す る。本発明は、アミノ酸配列IISAVVGIL（配列番号3）を有するペプチドをコード する単離された核酸分子を提供する。本発明は、表面に対する結合のための核酸 上のタグを提供する。 本発明は、配列番号１、２または３の核酸配列の配列に特異的にハイブリダイ ズしうる少なくとも15ヌクレオチドの核酸配列を提供する。 本発明は、ペプチドSGSGHGVTSAPDTR（配列番号1）、SGSGAPDTRPAPGSTAP（配列 番号2）またはIISAVVGIL（配列番号3）に対する抗体を提供する。１つの実施形 態では、該抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることが可能であ る。該抗体は、タグを有することが可能である。もう１つの実施形態において、 本発明は、該ペプチドに結合するリガンドを提供する。 本発明はまた、癌細胞の細胞表面に結合する能力を有しかつイメージング剤で 標識付けした、配列番号1、2、もしくは3のペプチドに対する抗体の少なくとも1 つを、モノクローナル抗体と細胞表面抗原との間で複合体を形成する条件下で、 被験体へ投与することを含んでなる被験体の卵巣癌もしくは乳癌をイメージング する方法を提供する。本発明はさらに、該ペプチドに対する抗体の有効イメージ ング量および製薬的に許容可能な担体を含有する組成物を提供する。該ペプチド 配列に対する抗体の知識は、治療すなわち免疫毒素治療に、またはin vitroの診 断用途すなわち免疫組織化学、もしくはin vivoの診断用途すなわち毒素による ターゲッティングのための放射能標識付けに有用である。 前記キットは、腫瘍抗原もしくはその免疫反応性フラグメントと特異的に反応 する腫瘍抗原関連抗体の存在を検出することができる。このキットは、基体に結 合した腫瘍抗原、該抗体に反応性がある２次腫瘍抗原および２次腫瘍抗原と該抗 体との反応を検出するための試薬を含むことができる。かかるキットは、ELISA キットのような抗体捕捉アッセイキットであり得、そして基体、適宜に１次およ び２次抗体、ならびに検出可能成分、酵素基質および発色試薬のような上記の他 の必要な試薬を含んでもよい。あるいはまた、抗体捕捉診断キットは、一般的に 本明細書に記載した成分および試薬を含んでなる免疫ブロットキットであってよ い。本発明の診断キットに含まれる特定の試薬および他の成分は、そのキットで 実施される特定の診断方法に合わせて当業界で利用可能なものから選択すること ができる。かかるキットは、被験体から得た培養前後の組織および体液のような 生物学的サンプル中の抗体を検出するために使うことができる。 本発明は、下記容器が、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異 的活性化を誘導するために有効な、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェン 含有培地を含む、全血サンプル採集用の真空密閉容器を含んでなる、被験体から の特定の腫瘍抗原関連抗体を検出するためのキット、ならびに１以上の腫瘍関連 抗体を検出するためのアッセイを提供する。 本発明では、リガンドと腫瘍抗原との反応の検出は、適切な事例では、様々な エピトープと特異的に反応するかまたはリガンドもしくは反応抗体と非特異的に 反応する２次抗体もしくは他のリガンドの使用より、さらに促進される。 本発明は、a)被験体から全血サンプルを得ること；b)全血サンプルを、リンパ 球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘導する、抗原を含むかもしくは含ま ないマイトジェン含有培地の存在下に培地中でインキュベートすること；c)リン パ球由来の核酸配列を得ること；d)その核酸配列を、単離したDNAと特異的にハ イブリダイズする能力のある少なくとも15ヌクレオチドの標識した核酸配列に、 ハイブリダイズする条件下で接触させること；e)ハイブリダイズした核酸配列の 存在（その存在が被験体中の腫瘍抗原関連抗体の指標となる）を測定し、それに よって被験体を診断することを含んでなる、癌について被験体を診断する方法を 提供する。 １つの実施形態では、腫瘍抗原関連抗体からのDNA配列を工程(b)の前で増幅す る。他の実施形態では、核酸配列の増幅にPCRを用いる。核酸配列の増幅方法は 当業者には公知である。 ある薬物が使用できるかどうかを決定する腫瘍抗原関連抗体物質スクリーニン グアッセイが本発明において意図されている。かかるアッセイは、全血、B細胞 のようなリンパ球またはPBMCを、抗原を含むか含まないマイトジェンおよび腫瘍 抗原関連抗体薬物と共にインキュベートすることを含んでなり、細胞が腫瘍抗原 関連抗体を発現するかを評価して、それからかかる薬物の活性に及ぼす化合物の 影響を判定する。 本発明は、抗原に曝露された被験体を検出するための改良アッセイに関する。 この発明は、1）個人が抗原に曝露されたことがあるかを判定する診断、2）予後 徴候指示薬、3）抗抗原治療の有効性または新しい可能性のある抗抗原薬剤の有 効性をモニターする方法、としての使用を意図している。 本発明は、次の工程を含んでなる被験体から得たサンプル中の抗原に対する抗 体のin vitro検出方法を提供する。すなわち、a)被験体から全血サンプルを得る こと；b)全血サンプルを、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異 的活性化を誘導する、抗原を含むかもしくは含まない培地でマイトジェンの存在 下にインキュベートすること；c）工程b）で生じた培養物を抗原に曝露し、それ によって抗原−抗体免疫複合体を形成させること；d）工程c）の抗原−抗体免疫 複合体を検出し、特異的抗原抗体の存在は被験体が抗原に曝露されたことを示す ものである、各工程を含んでなる。 １つの実施形態では、白血球のサンプルを被験体から得て、Bリンパ球のポリ クローナル的かつ特異的活性化を誘導するように、抗原を含むかもしくは含まな いマイトジェンを含有する培地の存在下で培養下にインキュベートする。他の実 施形態では、リンパ球のサンプルを被験体から得て、Bリンパ球のポリクローナ ル的かつ特異的活性化を誘導する、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェン を含有する培地の存在下で培養下にインキュベートする。他の実施形態では、PB MCのサンプルを被験体から得て、Bリンパ球のポリクローナル的かつ特異的活性 化を誘導する、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存 在下で培養下にインキュベートする。 １つの実施形態では、特異的抗体を産生する細胞を検出する。他の実施形態で は、工程b）の培養物が上清をもたらし、上清を抗原に曝露して、抗原−抗体免 疫複合体を形成させる。他の実施形態では、培養物の細胞画分が使われる。他の 実施形態では、白血球が使われる。 本発明はさらに、次の工程を含んでなる、抗原に曝露された被験体を検出する 方法を提供する。すなわち、a)被験体から全血サンプルを得ること；b)全血サン プルを、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘導す る、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下で培養 下にインキュベートすること；c）核酸配列を回収するように、細胞を処理する こと；d）得られた核酸配列を、抗原に曝露した結果として産生された抗体の核 酸配列と特異的にハイブリダイズする能力をもつプライマーである１本鎖標識付 きオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリダイズする条件下で接触させるこ と；e）増幅産物の存在を検出し、その存在が抗原の存在を示すものである、各 工程を含んでなる。 工程c）の細胞は、細胞の核酸配列を露出するように処理される。露出方法は 、当業者に公知である。あるいは、工程d）の得られた核酸配列を、核酸分子と ハイブリダイズする１対のプライマーにより増幅して２本鎖の増幅産物を得る。 増幅産物を検出することもできる。 他の実施形態では、可変領域の端で核酸配列とハイブリダイズする能力のある プライマーを、得られた核酸配列とハイブリダイズする条件下で接触させ、特異 的に検出する。 本発明はまた、次の工程を含んでなる、抗原に曝露された被験体を検出する方 法も提供する。すなわち、a)被験体から全血サンプルを得ること；b)全血サンプ ルを、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘導する 、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下で培養下 にインキュベートすること；c）核酸配列を別個に回収するように細胞を処理す ること；d）得られた核酸配列を、核酸配列とそれぞれ特異的にハイブリダイズ する能力のある複数対の１本鎖標識付きオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイ ブリダイズする条件下で接触させること；e）１対のプライマーがハイブリッド する任意の核酸配列を増幅して、２本鎖増幅産物を得ること；f）かかる２本鎖 増幅産物のどれかを処理して、それから１本鎖核酸配列を得ること；g）生じた １本鎖核酸配列を、抗原に曝露した結果として産生されたた抗体の核酸配列と特 異的にハイブリダイズする能力のある標識付きオリゴヌクレオチドプローブと、 ハイブリダイズする条件下で接触させること；h）生じたハイブリッドを、かか る複合体に標識付きプローブが存在するとき該プローブと特異的に複合体を形成 する能力のある検出可能にマークされたタグと、複合体形成条件下で接触させる こと；およびi）生じた複合体のどれかの存在を検出し、その存在がその抗原の 存在を示すものである、各工程を含んでなる。 「抗原」は限定されるものでないが、免疫原、アレルゲン、発癌物質、同種抗 原、自己抗原（自家抗原）、癌抗原、癌関連抗原、移植抗原、血液型抗原、また は汚染物質を含む。本明細書に定義される全ての抗原は免疫応答を引き出す。し たがって、抗原に対する（１または複数の）抗体を探すことは、検出系および試 験のための抗原として、その全体またはセグメント（ペプチド）を使うことを意 味する。 抗原は、タンパク質、ペプチド、フラグメント、解離物、（任意の長さの）ペ プチド；リポタンパク質；糖タンパク質および糖脂質（両方とも例えば細菌壁、 血液型抗原、および骨髄腫構造物に代表される）のような炭水化物；オリゴ糖／ 多糖；脂質／脂肪；ハプテン；ならびにTNP（トリニトロフェニル）、ベンゼン アルセネート（benzene arsenate）および非有機化合物のような化学薬品であっ てよい。 ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacterium pylori）は大部分の消化性潰瘍の 原因として示唆される細菌である。この細菌は多くの抗原／抗原エピトープまた は構造体をもつ。全細菌、またはそのタンパク質、炭水化物、ムチン、もしくは ペプチドのいくつかは、抗体検出のための抗原となり得る。 本発明はまた、a)被験体から全血サンプルを得ること；b)全血サンプルを、抗 体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘導する、抗原を 含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下で培養下にインキ ュベートすること；c）抗原への曝露から生じる抗体の核酸配列を別個に回収す るように、細胞を処理すること；d）４種全部のデオキシリボヌクレオシド三リ ン酸の存在下で、Mn+2を含む適切なバッファー中で、熱安定性DNAポリメラーゼ が第１プライマーの伸長産物の合成を開始して標的RNAに相補的なcDNA配列を与 えるに十分な温度で、第１および第２プライマー（第１プライマーは標的RNAに 十分相補的であってそれとハイブリダイズし、標的RNAと相補的なcDNA配列合成 を開始し、第２プライマーは標的RNAと十分相同性であってcDNAとハイブリダイ ズし、伸長産物の合成を開始する）ならびに熱安定性DNAポリメラーゼの混合物 を含んでなる反応混合物中でサンプルを処理すること；e）反応混合物を、１本 鎖cDNAを与えるに適切な温度で処理すること；f）反応混合物を、熱安定性DNAポ リメラーゼが第２プライマーの伸長産物の合成を開始して２本鎖cDNA配列を与え るに適切な温度で、処理すること；およびg）工程e）の２本鎖cDNA配列を、ポリ メラーゼ連鎖反応により増幅することを含んでなる、サンプル中の標的RNA配列 を増幅する方法も提供する。好ましい実施形態では、バッファーは酢酸マンガン （またはMn(OAc)2またはMn(CH3CO2)2)とも記す）、ビシネ−KOH（ビシネはN,N- ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシンである）、および酢酸カリウム（またはKOAc もしくはKCH2CO2とも記す）を含有する。 本発明は、全血サンプルを採集するための、抗体産生に導くリンパ球のポリク ローナル的かつ特異的活性化を誘導するために有効な、抗原を含むかもしくは含 まないマイトジェンを含有する培地を容れる容器を含んでなる、被験体から抗原 に曝露して生じる特異的な抗体を検出するためのキット、並びに抗原への曝露か ら生じる特異的な抗体の検出のためのアッセイを提供する。容器は、全血サンプ ルを採集するための真空密閉容器であってよく、抗体産生に導くリンパ球のポリ クローナル的かつ特異的活性化を誘導するために有効な、抗原を含むかもしくは 含まないマイトジェンを含有する培地を含む。単一または複数の抗原がその容器 に結合され得る。 本発明によれば、全血サンプルは、抗原を含むかもしくは含まないアメリカヤ マゴボウマイトジェンのごときマイトジェンの有効濃度の溶液を容れたバキュウ ムチューブのような試験管中に吸い込む。試験すべき全血サンプルをアメリカヤ マゴボウマイトジェンの存在下でin vitro培養する。同じ機能を達成するために 、アメリカヤマゴボウマイトジェンの代わりにまたは追加して、抗体産生または 分泌につながるTh2型免疫応答を活性化する、他のBリンパ球の活性化物質または 体液系を使うことができる。インキュベーション後、培養液からアリコートをと り、その後、標準ELISA手法および／またはウェスタンブロット分析を使って、 所望の抗原の存在をアッセイする。後日サンプルをアッセイするのであれば、血 液を遠心分離し上清液を採集し、凍結して保存する。結果は、他のどの検出技術 を使って得てもよい。細胞画分をPCRおよびELISPOTと共に使うことができる。 本発明の方法は、抗体の存在を測定するため、任意に血球を血液の液部から分 離することを含む。血液の液部からの血球の分離は、遠心分離、濾過または密度 勾配を含む当業者に公知のいくつかの方法のどれかによって行うことができる。 血球を液部から物理的に分離する必要がないことは理解されるべきである。抗原 を含むもしくは含まないマイトジェンと全血とのインキュベーション後に、血液 から液部を容易に抽出し、抗体を試験することができる。任意に、赤血球を穏和 な浸透圧ショックまたは穏和な界面活性剤のいずれかにより溶解することができ る。この方法では白血球は生存し続ける。 特定の抗体に特異的に結合する抗原は当業者に公知である。さらに、抗体は抗 原に結合するタグとして使ってもよい。１つの実施形態では、抗体はモノクロー ナル抗体である。他の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。 １つ以上の抗原に対する特異的な抗体の存在を免疫酵素的に検出する他の方法 は、ウェスタンブロットである。抗原を電気泳動により分離し、ニトロセルロー ス膜もしくは他の適切な支持体に移す。その後、試験すべき液を膜と接触させて 、形成される免疫複合体の存在を既に記載した方法により検出する。この方法の 変法では、精製抗原を膜上に線もしくはスポットとして塗布して結合させる。そ の後、膜を培養前および後の試験すべき体液と接触させ、形成される免疫複合体 を先に記載した技術を使い検出する。 本発明は、a）被験体から全血サンプルを得ること；b)全血サンプルを、リン パ球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘導するために、抗原を含むかもし くは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下に培養下でインキュベートす ること；c）リンパ球から核酸配列を得ること；d）核酸配列を、単離したDNAと 特異的にハイブリダイズする能力のある少なくとも15ヌクレオチドの標識した核 酸配列に、ハイブリダイズする条件下で接触させること；e)ハイブリダイズした 核酸配列の存在（その存在が被験体の抗原への曝露を示す）を測定し、それによ って被験体を診断することを含んでなる、抗原に曝露した被験体を診断する方法 を提供する。 上記の方法で、ポリアクリルアミドゲルにより行うサイズ分画を用いてもよい 。１つの実施形態では、サイズ分画はアガロースゲルで行う。さらに、DNA断片 の固体マトリックスへの移行は、ハイブリダイゼーション工程の前に実施しても よい。かかる固体マトリックスの１例はニトロセルロース・ペーパーである。 抗原の感染もしくは曝露の結果として産生された特異的抗体を検出する方法に は、PCRおよび／またはブロットハイブリダイゼーションが使用される。検出も しくは予知のための抗原物質の有無、または抗原のリスクアセスメントは、サザ ントランスファー、溶液ハイブリダイゼーションまたは非放射能検出システムを 含み、これらは全て当業者に周知である。ハイブリダイゼーションはプローブを 使って行われる。ハイブリダイズした部分の可視化により、病原物質の有無の定 性的測定が可能となる。 本発明は、薬物が使用可能かどうかを判定する抗原物質スクリーニングアッセ イを意図している。かかるアッセイは、全血、B細胞のようなリンパ球、またはP BMCを、抗原を含むか含まないマイトジェンおよび抗原薬物と共にインキュベー トし、細胞が抗原を発現するかを評価して、それからかかる物質の活性に及ぼす 化合物の作用を判定することを含んでなる。 本発明は、ウイルスに感染した被験体を検出する改良アッセイに関する。本発 明は；1)個人がウイルスに感染しているかどうかを判定する診断、2）予後徴候 指示薬、および3）抗ウイルス治療の有効性（または新しい可能性のある抗ウイ ルス薬または剤の有効性）をモニターする方法、としての使用を意図する。 本発明は、次の工程を含んでなる、被験体から得たサンプル中のウイルスに対 する抗体のin vitro検出法を提供する。すなわち、a)被験体から全血サンプルを 得ること；b)全血サンプルを、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ 特異的活性化を誘導する、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェン含有培地 で培養下にインキュベートすること；c）工程b）で得られた培養物をウイルス抗 原に曝露し、それによって抗原−抗体免疫複合体を形成させること；d）工程c） の抗原−抗体免疫複合体を検出し、ウイルス特異的抗体の存在が被験体がウイル スに曝露されたことを示すものである、各工程を含んでなる。 １つの実施形態では、特異的抗体を産生する細胞を検出する。工程b）の培養 物から上清を得、その上清をウイルス抗原に曝露し、それにより抗原−抗体免疫 複合体を形成させることができる。また、白血球または培養物の細胞画分を使う こともできる。 本発明はさらに、次の工程を含んでなる、ウイルスに曝露された被験体を検出 する方法を提供する。すなわち、a)被験体から全血サンプルを得ること；b)全血 サンプルを、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘 導する、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下に 培養下でインキュベートすること；c）核酸配列を回収するように、細胞を処理 すること；d）得られた核酸配列を、ウイルスに曝露した結果として産生された 抗体の核酸配列と特異的にハイブリダイズする能力をもつプライマーである１本 鎖標識付きオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリダイズする条件下で接触 させること；e）増幅産物の存在を検出し、その存在がウイルスの存在を示すも のである、各工程を含んでなる。 工程c）の細胞は、その細胞の核酸配列を露出するように処理される。露出方 法は当業者に公知である。あるいはまた、工程d）の得られた核酸配列を、核酸 分子とハイブリダイズする１対のプライマーにより増幅し、２本鎖の増幅産物を 得ることができる。増幅産物は検出可能でありうる。 他の実施形態では、可変領域の端で核酸配列とハイブリダイズする能力のある プライマーと、得られた核酸配列とを、ハイブリダイズする条件下で接触させ、 特異的に検出する。 本発明は、次の工程を含んでなる、ウイルスに感染した被験体を検出する方法 を提供する。すなわち、a)被験体から全血サンプルを得ること；b)全血サンプル を、抗体産生に導くリンパ球のポリクローナル的かつ特異的活性化を誘導する、 抗原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下に培養下で インキュベートすること；c）核酸配列を別個に回収するように細胞を処理する こと；d）得られた核酸配列を、ウイルスへの曝露の結果として産生された抗体 の核酸配列とそれぞれ特異的にハイブリダイズする能力のある複数対の１本鎖標 識付きオリゴヌクレオチドプライマーと、ハイブリダイズする条件下で接触させ ること；e）１対のプライマーがハイブリダイズする核酸配列のどれかを増幅し て、２本鎖増幅産物を得ること；f）かかる２本鎖増幅産物のどれかを処理して 、それから１本鎖核酸配列を得ること；g）生じた１本鎖核酸配列のどれかを、 かかるウイルス抗体と特異的にハイブリダイズする能力のある標識付きオリゴヌ クレオチドプローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させること；h）生じ たハイブリッドのどれかを、かかる複合体中に標識付きプローブが存在するとき 該プローブと特異的に複合体を形成する能力のある検出可能にマークされたタグ と、複合体形成条件下で接触させること；およびi）生じた複合体の存在を検出 し、その存在がウイルスの存在を示すものである、各工程を含んでなる。 ウイルス特異的抗体の検出に必要なウイルス抗原は、様々な形で存在し得る。 すなわち、a）全ウイルス、または解離されていてよい不活化ウイルス（音波処 理、ホモジナイズ、界面活性剤、酵素により解離；産物はグループでまたは個々 に抗原として使うことができる）；c）ウイルス配列（またはそのセグメント） はベクターにより他の産生体（細胞、細菌、酵母ファージ）に挿入することがで き、その後、個々のタンパク質と構造体が産生される；d）全タンパク質のペプ チドフラグメント（裸およびグリコシル化の両方または脂質と結合したもの、特 定のペプチド単独、または大きなもしくは種々の粒子／物体／細胞／担体／表面 上に拘束した／結合した／連結した／の部分／発現させたもの）は生化学的に合 成可能であり、抗原として使用される；e）ウイルスと細胞の間のインターフェ ース、またはウイルス抗原が感染細胞の表面上で発現される方法そのものが、特 異的抗原エピトープとしての役割も果たすことができよう。 ウイルスとしては、限定されるものでないが、トリ脳脊髄炎ウイルス（avian encephalomyelitis virus）、トリレオウイルス（avian reovirus）、トリパラ ミキソウイルス（avian paramyxovirus）、トリインフルエンザウイルス（avian influenza virus）、トリアデノウイルス（avian adenovirus）、鶏痘ウイルス （fowl pox virus）、トリコロナウイルス（avian coronavirus）、トリロタウ イルス（avian rotavirus）、ニワトリ貧血ウイルス（chick anemia virus(agen t)）、Salmonellaspp.、E．coli、Pahsteurella spp.、Bordetella spp.、Eimer ia spp.、Histomonas spp.、Trichomonas spp.、トリ脳脊髄炎ウイルス（avian encephalomyelitis virus）、トリレオウイルス（avian reovirus）、トリパラ ミキソウイルス（avian paramyxovirus）、トリインフルエンザウイルス（avian influenza virus）、トリアデノウイルス（avian adenovirus）、鶏痘ウイルス （fowl pox virus）、トリコロナウイルス（avian coronavirus）、トリロタウ イルス（avian rotavirus）、ニワトリ貧血ウイルス（chick anemia virus(agen t)）、Salmonella spp.、E．coli、Pasteurella spp.、Bordetella spp.、Eimer ia spp.、Histomonas spp.、Trichomonnas spp.、家禽線虫（Poultry nematodes ）、条虫（cestodes）、吸虫（trematodes）、家禽ダニ／シラミ（poultry mite s/lice）、家禽原虫（poultry protozoa）を含む。 非ヒト霊長類のウイルスとしては、限定されるものでないが、Aotineherpesvi rus 1、Aotinehe rpesvirus 3、Cercopithecine herpesvirus 1(B型ウイルス、H V simiae)、Cercopithecine herpesvirus 2(SA8)、Cercopithecine herpesvirus 3(SA6)、Cercopithecine herpesvirus 4(SA15)、Cercopithecine herpesvirus 5（アフリカミドリザル・サイトメガロウイルス）、Cercopithecine herpesviru s 6(リバプールベルベットモンキーウイルス（Liverpool vervet monkey virus）)、Cercopithecine herpesvirus 7(パタスモンキー（Patas monkey）HV ；MMVまたはPHV delta HV)、Cercopithecine herpesvirus 8(アカゲザル・サイ トメガロウイルス)、Cercopithecine herpesvirus 9(Medical LakeマカクHV sim ian varicella HV)、Cercopithecine herpesvirus 10(アカゲザル白血球関連HV 株I)、Cercopithecine herpesvirus 12（HV papio、ヒヒ（baboon）HV）、Cerco pithecine herpesvirus 13(Herpesvirus cyclopis)、Cercopithecineherpesviru s14(アフリカミドリザルEBV-様ウイルス)、Cercopithecine herpesvirus 15(ア カゲザルEBV-様HV)、Ateline herpesvinrs 1(クモザル（Spider monkey）HV)、A teline herpesvirus 2(HV ateles)、Callitrichine herpesvirus(HV saguinus) 、Callitrichine herpesvirus(SSG、キヌザル（marmoset）サイトメガロウイル ス)、Cebine herpesvirus I(オマキザル（capuchin）HV)、Cebine herpesvirus 2(オマキザルHV)、Pongine herpesvirus 1(チンパンジーHV;pan HV)、Pongine h erpesvirus 2(オランウータンHV)、Pongine herpesvirus 3(ゴリラHV)、Saimiri ine herpesvirus 1(キヌザルHV，herpes T，HV)、tamarinus，HV platyrrhinae 、(Saimiriine herpesvirus 2型）リスザル（squirrel monkey）HV、およびHV s aimiriを含む。 哺乳動物のウイルスとしては、限定されるものでないが、ウシ・ヘルペスウイ ルス1-5、ヒツジ・ヘルペスウイルス1-2、Alcelaphineヘルペスウイルス1、パル ボウイルス(Parvovirus)(マウスminute virus、ミンクのアリューシャン病、ウ シ・パルボウイルス、イヌ・パルボウイルス、ニワトリ・パルボウイルス、ネコ panleukopenia、ネコ・パルボウイルス、ガチョウ・パルボウイルス、HBパルボ ウイルス、H-1パルボウイルス、Kilham rat lapineパルボウイルス、ミンク腸炎 を含む)、エリトロウイルス(Erythrovirus)(アデノ随伴型1-5、ウシアデノ随伴 、イヌアデノ随伴、ウマアデノ随伴、ヒツジアデノ随伴を含む)を含む。 ウイルスは、限定されるものでないが、カリフラワー、バドナウイルス(Badna viruses)、ゲミニウイルス(Geminiviruses)、植物レオウイルス(Reoviruses)、 クリプトウイルス(Cryptoviruses)、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)、トマトSp otted、テヌイウイルス(Tenuiviruses)、タバコ、ジャガイモウイルス、ポチウ イルス(Potyviridae)、クロステロウイルス(Closteroviruses)、黄色カブラ、 低木トマト（Tomato Bushy）、ルテオウイルス(Luteoviruses)、セクイウイルス (Sequiviridae)、タバコ、ササゲ（Cowpea）、タバコ、Pean Enation、赤クロー バー（Red Clover）、Brome(イネ科スズメノチャヒキ)、キュウリ、アルファル ファ、大麦、黒斑ビート（Beet Necrotic）、dsRNA、サッカロミセス・セレビシ エ(Saccharomyces cerevisiae)、Cryphonectria parasitica、リーシュマニア(L eishmania)、Giardia Lamblia、トリコモナス（Tricomonas）、コレラ（Chlorel la）、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を含む。 さらに、次のファミリーからのウイルスが含まれる：バキュロウイルス(Bacul oviridae)およびヌディウイルス(Nudiviruses)、ポリドナウイルス(Polydnaviri dae)、アスコウイルス(Ascoviridae)、ノダウイルス(Nodaviridae)、テトラウイ ルス(Tetraviridae)、トンブスウイルス(Tombusviridae)、コロナウイルス(Coro naviridae)、フラビウイルス(Flaviviridae)、トガウイルス(Togaviridae)、ブ ロモウイルス(Bromoviridae)、バルナウイルス(Barnaviridae)、トチウイルス(T otiviridae)、パルチチウイルス(Partitiviridas)、ハイポウイルス(Hypovirida e)、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)、 フィロウイルス(Filoviridae)、オルトミクソウイルス(Orthomyxoviridae)、ブ ンヤウイルス(Bunyaviridae)、アレナウイルス(Arenaviridae)、レビウイルス(L eviviridae)、ピコルナウイルス(Picornaviridae)、セクイウイルス(Sequivirid ae)、コモウイルス(Comoviridae)、ポチウイルス(Potyviridae)、カルチウイル ス(Calciviridae)、アストロウイルス(Astroviridae)、ノダウイルス(Nodavirid ae)、イノウイルス(Inoviridae)、ミクロウイルス(Microviridae)、ゲミニウイ ルス(Geminiviridae)、シルコウイルス(Circoviridae)、パルボウイルス(Parvov iridae)、ヘパドナウイルス(Haepadnaviridae)、レトロウイルス(Retroviridae) 、シストウイルス(Cystoviridae)、レオウイルス(Reoviridae)、ビルナウイルス (Birnaviridae)、ミオウイルス(Myoviridae)、シフォウイルス(Siphoviridae)、 ポドウイルス(Podoviridae)、テクチウイルス(Tectiviridae)、コルチコウイル ス(Corticoviridae)、プラスマウイルス(Plasmaviridae)、Lipothrixviridae、F uselloviridae、Poxviridae、アフリカブタ熱様ウイルス（African swine fever -like viruses）、Iridoviridae、Phycodnaviridae、Baculoviridae、Herpesvir idae、Adenoviridae、Papovaviridae、Polydnaviridae、Picornaviridae、Calic iviridae、Astroviridae、Togaviridae、Flaviridae、Coronaviridae、Arterivi rus、Paramyxoviridae、Rhabdoviridae、Filoviridae、Orthomyxoviridae、Buny aviridae、Arenaviridae、Reoviridae、Birnaviridae、Retroviridae、Hepadnav iridae、Circoviridae、Parvoviridae、Papovaviridae、アデノウイルス(Adenov iridae)、ヘルペスウイルス(Herpesviridae)、ポックスウイルス(Poxviridae)、 イリドウイルス(Iridoviridae)。 ウイルスは、限定されるものでないが、次のものを含む：マレク病ウイルス(M arek's disease virus)(家禽)、ミンク腸炎ウイルス(Mink Enteritis virus)、 マウスのMinuteウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウスポ リオウイルス (タイレルウイルス(Theiler's virus))、粘膜病ウイルス(ウシ)、 粘液腫ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス(家禽) 、オルフウイルス（伝染性膿疱性口内炎ウイルス）、パラインフルエンザウイル ス3、パラインフルエンザウイルス1（センダイウイルス）、小反芻動物病ウイル ス(Peste-des-petits-ruminants virus)(ヒツジおよびヤギ)、マウス肺炎ウイル ス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、偽牛痘ウイルス（搾乳者小結節ウイルス）、仮 性狂犬病ウイルス、ウサギ出血病ウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス1-3 、リフトバレー熱ウイルス、牛疫ウイルス、多種のロタウイルス、スクラピー因 子(ヒツジおよびヤギ)、羊痘ウイルス、ショープ乳頭腫ウイルス、サル免疫不全 ウイルス、ブタ水痘性疾患ウイルス、豚痘ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、伝 染性胃腸炎ウイルス(ブタ)、シチメンチョウ・ブルーコムウイルス(Turkey blue comb virus)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、小水疱性発疹ウイルス(ブタ) 、水疱性口内炎ウイルス、シカおよびエルクの消耗病、ヴェッセルスブロン病ウ イルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、アフリカウマ病ウイルス1-9、アフリカ豚 コレラウイルス、アリューシャンミンク病ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、 トリ肉腫-白血症ウイルス、Bウイルス(Cercopithecusヘルペスウイルス)、ベル ネウイルス(Berne virus)(ウマ)、ブルータングウイルス1-25、ボーダー病ウイ ルス(ヒツジ)、ボルナ病ウイルス(ウマ)、ウシエンテロウイルス1-7、ウシ一過 性熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血症ウイルス、Bovine mamil litis vitus、ウシ乳頭腫ウイルス、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、ウシ呼吸器性 シンシチアルウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ブレダウイルス(コウ シ)、イヌアデノウイルス2、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、 ヤギ関節炎-脳脊髄炎ウイルス、牛痘ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、エ ボラウイルス、エクトメリアウイルス(マウスポックスウイルス)、脳心筋炎ウイ ルス、伝染性出血性疾患ウイルス(シカ)、ウマ流産ウイルス(EHV1)、ウマアデノ ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ交疹ウイルス(EHV3)、ウマ伝染性貧血ウイ ルス、ウマ鼻肺炎ウイルス(EHV4)、ネコカリシウイルス(Feline calicivirus)、 ネコ免疫不全ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイル ス、ネコ肉腫・白血病ウイルス、ウサギおよび野ウサギおよびリスの線維腫ウイ ルス、口蹄疫ウイルス、鶏痘ウイルス、Hemagglutinating encephalomyelitis v irus(ブタ)、Hog cholera virus、Infectious bovine rhinotrachetitis virus 、伝染性気管支炎ウイルス(家禽)、Infectious bursal disease virus(家禽)、 イヌ伝染性肝炎ウイルス、Infectious hemaropoietic necrcosis virus(魚)、in fectious laryngotrachetis virus、Infectious hematopoietic necrosis virus (魚)、ブタ、ウマ、アザラシおよびトリのインフルエンザウイルス、日本脳炎ウ イルス、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス(マウス)、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス 、マエディ/ビスナウイルス(ヒツジ)、マルブルクウイルス、Rocio virus、ロス 川ウイルス、風疹ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、Sandfly fever-Naples v irus、Sandfly fever-Sicilian virus、セントルイス脳炎ウイルス、SV 40ウイ ルス、タヒナウイルス、ワクシニアウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス(ヒトヘル ペスウイルス3)、痘瘡ウイルス、Venezuelan equine encephalitis virus、Vesi cular stomatitis viruses、西ナイルウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、黄 熱病ウイルス、アデノウイルス1-49、アストロウイルス1、2、Bウイルス(Cercop ithecus herpesvirus)、BK virus、Bunyamwera virus、カリフォルニア脳炎ウイ ルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、コロラドダニ熱ウ イルス、Congo-Crimean hemorrhagic fever virus、Cowpox virus、Coxsacieuir uses A 1-21およびA 24、Coxsackieviruses B 1-6、Creutzfeldt-Jakob disease agent、Prions、デング熱ウイルス1-4、Duvenhage virus 、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス1-9および11-27 および29-34、エンテロウイルス68-71、エプスタイン-バーウイルス(ヒトヘルペ スウイルス4)、ハンターンウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型 肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1 および2(ヒトヘルペスウイルス1および2)、Human enteric coronavirus、Human enteric conoravinrs、ヒトサイトメガロウイルス(ヒトヘルペスウイルス5)、ヒ トヘルペスウイルス6A、6B、および7、ヒト免疫不全ウイルス1および 2、Human respiratory coronaviruses 229EおよびOC43、ヒトロタウイルス、Human T-lymp hotropic viruses 1および2、インフルエンザウイルスAおよびB、日本脳炎ウイ ルス、JC virus、Junin virus(アルゼンチン出血熱ウイルス)、Kuru agent、キ ャサヌール森林病ウイルス、La Crosse virus、ラッサ熱ウイルス、リンパ球脈 絡髄膜炎ウイルス、Macuopo virus（ボリビア出血熱ウイルス）、マルブルクウ イルス、麻疹ウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイル ス、Muerto、Canyon virus、流行性耳下腺炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイル ス、Norwalk virus(および関連ウイルス)、O'nyong-nyong virus、オムスク出血 熱ウイルス、オルフウイルス（ヒツジ膿疱性皮膚炎ウイルス）、Oropouche viru s、乳頭腫ウイルス1-60、パラインフルエンザウイルス1および3、パラインフル エンザウイルス2および4、パルボウイルスB-19、ポリオウイルス1-3、偽牛痘ウ イルス（搾乳者小結節ウイルス）、RA-Iウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸シンシ チアルウイルス、ライノウイルス1-113、およびリフトバレー熱ウイルス。 ブドウ球菌性膿瘍(Staphylococcal abscesses);ブドウ球菌性肺炎(Staphyloco ccal pneumonia);ブドウ球菌性菌血症(Staphylococcal bacteremia);ブドウ球菌 性骨髄炎(Staphylococcal osteomyelitis);ブドウ球菌(Staphylococcal);Ａ型、 Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルス(Influenzaviruses Ａ，Ｂ and Ｃ);１ 〜４型パラインフルエンザウイルス(Parainfluenzaviruses 1-4);流行性耳下腺 炎ウイルス(Mumps virus);アデノウイルス(Adenoviruses);レオウイルス(Reovir uses);呼吸シンシチアルウイルス(Respiratory syncytial virus);エプスタイン -バーウイルス(Epstein-Barrvirus)、ライノウイルス(Rhinoviruses);ポリオウ イルス(Polioviruses);コロラドダニ熱(Colarado tick fever)、フレボトムス熱 (Phlebotomus fever)、ベネズエラウマ脳脊髄炎(Venezuelen equine encephalit is);リフトバレー熱(Rift valley fever);デング熱(Dengue fever);西ナイル熱( West Nile fever);バーマ森林ウイルス(Barmah Forest virus);チクングンヤ病( Chikungunya disease);マヤロウイルス病(Mayaro virus disease);ロス川ウイル ス病(Ross river virus disease);シンドビスウイルス病(Sindbis virus diseas e)(Okelbo病、Pogosta病、Karelian熱);東部ウマ脳脊髄炎(Eastern equine ence phalitis);西部ウマ脳脊髄炎(Westernequine encephalitis);セントルイス脳炎( St.Louis encephalitis);ベネズエラウマ脳脊髄炎(Venezuelen equine encephal itis);カリフォルニアウイルス群(California virus group);日本脳炎(Japanese encephalitis);ポーワッサンウイルス(Powassan virus);マリーバレー脳炎(Mur ray Valley encephalitis);キャサヌール森林病(Kyasanur Forest disease);ダ ニ媒介脳炎ウイルス(Tick-borneencephalitis virus);リンパ球性脈絡膜炎(Lymp hocytic choriomeningitis);黄熱病(Yellow fever);デング出血性熱(Dengue hem orrhagic fever)、キャサヌール森林病(Kyasanur Forest disease);オムスク出 血熱(Omsk hemorrhagic fever)、クリミア-コンゴ出血熱(Crimean-Congo hemorr hagic fever);ハンターンウイルス(Hantaan virus);ソウルウイルス(Seoul viru s);プーマラウイルス(Puumala virus)、マチュポウイルス(Machupo virus);ジュ ニンウイルス(Junin virus);ラッサ熱(Lassa fever);マルブルクウイルス(Marbu rg virus);エボラウイルス(Ebola virus)、ラスモデイウム(lasmodium)spp;トリ パノソーマ(Trypanosoma) spp;ミクロフィラリア(Microfilarie);レイシュマニア(Leishmania)spp;ネグレ リアハルトンアメーバアカントアメーバ群(naegleria Hartmannella Acanthamoe ba group);ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、ストロンギロイデス(Strongyloi des)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum);赤痢アメーバ(Entamoeba his tolytica)、他のアメーバ;ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia);クリプトスポリジ ウム(Cryptosporidium);ヒト鞭虫(Trichuris trichiura)、回虫(Ascaris lumbri coides)、鉤虫ストロンギロイデス(Hookworm Strongyloides)、サナダムシ(Tape worm)、吸虫類(Fluke);エンテロウイルス虫(Enterobiusvermicularis);赤痢アメ ーバ(Entamoeba histolytica);ヴェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani) ;赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、ストロンギロイデス(Strongyloides) 、単包条虫(Echinococcus granulosus)、鉤虫(Hookworm)、回虫(Ascaris)spp、 ヌーモーシスティスカリーネイ(Pneumocystis carinii);ヌーモーシスティスカ リーネイ(Pneumocystis carinii);回旋糸状虫リーシュマニア(Onchocerca volvu lus Leishmania)spp、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);カギサナダ(Taeni a solium);トリコモナス(Trichomonas)spp;ビルハルツ住血吸虫(Schistosoma ha ematobium)を含む。 病原体は、限定されるものでないが:ネコ病原体、イヌ病原体、ウマ病原体、 ウシ病原体、トリ病原体、ブタ病原体、またはヒト病原体を含む。ヒト病原体は 、限定されるものでないが:単純疱疹１型ウイルス(herpes simplex virus-1)、 単純疱疹２型ウイルス(herpes simplex virus-2)、ヒトサイトメガロウイルス、 エプスタイン-バーウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス(Varicell-Zostervirus)、 ヒトヘルペスウイルス-6(human herpesvirus-6)、ヒトヘルペスウイルス-7(huma n herpesvirus-7)、ヒトインフルエンザ、ヒト免疫欠損ウイルス、狂犬病ウイル ス、麻疹ウイルス(measles virus)、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス を含む。さらに、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、マラリアまたはプラスモ ディウムファルシパラム(Plasmodium falciparum)、ボルデテラ(Bordetella)か らなる群由来の悪性腫瘍と関連しているかもしれない。 ウマ病原体は、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスから 誘導することができる。かかる抗原性ポリペプチドの例は、ウマインフルエンザ Ａ型ウイルス/Alaska 91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザＡ型ウイルス/P rague 56ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザＡ型ウイルス/Miami 63ノイラ ミニダーゼ、ウマインフルエンザＡ型ウイルス/Kentucky 81ノイラミニダーゼ、 ウマヘルペス１型ウイルス糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペス１型ウイルス糖 タンパク質Ｄである。 ウシ病原体は限定されるものでないが：ウシ呼吸シンシチアルウイルス(bovin e respiratory syncytial virus)またはウシパラインフルエンザウイルスを含む 。ウマインフルエンザウイルスから誘導されるウシ呼吸シンシチアルウイルス(b ovine respiratory syncyrial virus)ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウシ 呼吸シンシチアルウイルス付着タンパク質(BRSV G)、ウシ呼吸シンシチアルウイ ルス融合タンパク質(BRSV F)、ウシ呼吸シンシチアルウイルスヌクレオキャプシ ドタンパク質(BRSV N)、ウシパラインフルエンザ３型ウイルス融合タンパク質お よびウシパラインフルエンザ３型ウイルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼである 。 本発明は、a)被験者から全血サンプルを得ること；b)全血サンプルを、抗原を 含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下の培養でインキュ ベートして、リンパ球細胞のポリクローナル的かつ特異的な活性化を誘導し、抗 体産生を導くこと；c）細胞を曝露してウイルス特異的抗体の核酸配列を別々に 回収すること；d）サンプル中のウイルス特異的抗体のRNAの逆転写を実施して、 DNA複写物を産生すること；e）RNAゲノムのDNA複写物のPCR増幅を実施して、複 数のDNA複写物を産生すること；f）DNA複写物と複数の相補DNAプローブとのハイ ブリダイゼーションを実施して、サンプルのDNA含量を検出し、それによりウイ ルス感染を検出することを含む、ウイルス検出の方法を提供する。 本発明は、抗体産生を導くリンパ球細胞のポリクローナル的かつ特異的な活性 化を誘導するために有効な、抗原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有 する培地を含む全血サンプル採集用容器、および特異的ウイルス抗体を検出する ためのアッセイを含む、被験者から特異的ウイルス抗原を検出するためのキット を提供する。 本発明はまた、抗原を含むかまたは含まないマイトジェンの有効な濃度を含有 する血液採集容器を含むキットも含む。該容器は、任意に培養培地を容れること ができる。好ましい容器は試験管である。血液採集容器はプラスチック、ガラス 、または培養血液と適合する他のどんな材料でもあってもよい。本発明は、血液 採集チューブ以外の血液収容手段も含み、限定されるものでないが、血液をイン キュベーションすることができるウエルを含有するマイクロタイタープレート、 組織培養フラスコ、エルレンマイヤーフラスコ（Erlenmeyer flask）のようなガ ラスフラスコおよび他の血液培養ができるどの容器も含むと理解されるべきであ る。 本発明は、a)被験者から全血サンプルを得ること；b)全血サンプルを、抗 原を含むかもしくは含まないマイトジェンを含有する培地の存在下の培養でイン キュベートして、リンパ球細胞のポリクローナル的かつ特異的な活性化を誘導す ること；c）リンパ球から核酸配列を得ること；d）該核酸配列を、特異的な抗体 の単離したDNAと特異的にハイブリダイズする能力のある少なくとも15ヌクレオ チドの標識した核酸配列に、ハイブリダイズする条件下で接触させること；およ びe)その存在が被験者中のウイルスの存在を示す、ハイブリダイズした核酸配列 の存在を測定し、それによって被験者のウイルスを診断することを含む、被験者 のウイルスを診断する方法を提供する。 本発明は、ウイルスに感染／曝露した被験者の診断／予後指示薬として使用す る、次の工程を含みなるin vitroの方法を提供する：a)被験者から全血サンプル を得ること；b)全血サンプルを、抗原を含むかもしくは含まない培地のマイトジ ェンの存在下の培養でインキュベートして、抗体産生につながるリンパ球細胞の ポリクローナル的かつ特異的な活性化を誘導すること；c）工程b）で生じた培養 をウイルス抗原に曝露し、それによって抗原−抗体免疫複合体を形成させること ；d）複合体の量を先に検出した複合体の第２の量と比較して、工程c）の抗原− 抗体免疫複合体の量を検出すること(この量の増加は被験者の抗体陽転(seroconv ereting)を示す)。１つの実施様態では、定量的(すなわち抗体力価レベル)また は定性的な抗体の量は、或る時点と他の時点とを比較して求める。 １つの実施様態では、ウイルスからのDNA配列を工程（b）の前に増幅する。 他の実施様態では、核酸配列増幅のためにPCRを使う。核酸配列増幅の方法は、 当業者には公知である。 HTVのためのプライマー対は、当業界では公知である。例えば、次のものを使 うことができる： SK 38/79- （プローブSK19）gag SK 63/69 SK 101/145 pol SK68-/Benvb env B163 env/Benvend env １つの実施様態では、ウイルス酵素は逆転写酵素(RT)である。他の実施様態で は、ウイルス酵素はプロテアーゼである。他の実施様態では酵素はインテグラー ゼである。他の酵素は当業者に公知である。 非経口的に伝達した非Ａ型、非Ｂ型肝炎（PT-NANBH）ウイルスで感染した患者 からの血清に免疫反応性のあるこのような抗原と特異的抗体の例は、ペプチドを コードするポリヌクレオチド配列について、該ペプチドを産生する能力のある発 現系について、そしてヒト血清におけるPT-NANBH感染を検出するためのペプチド の使用方法について、当業者に公知である。特に、本発明は、HCVゲノムコア、N S4領域、表面結合HCV抗原、409-1-1抗原（409-1-1(abc)、409-1-1(c-a)、および 関係する抗原）の使用を意図する。Yoshikura Hiroshi,ら，米国特許第5,552,31 0号Replication of Hepatitis C virus genome and identification of virus h aving high infectivity;Reyes，Gregory,ら，米国特許第5,538,865号、第5,443 ,965号および第5,436,318号Hepatitis C virus epitopes;Resnick,Robert M,ら ，米国特許第5,527,669号，Methods，primers and probes for detection of he patitis C and novel variants;ならびにWang,Chang Y.，米国特許第5,436,126 号Synthetic peptides specific for the detection of specific antibodies t o HCV diagnosis of HCV infection。 さらなる抗原が当業者には公知である。例えば、次の抗原を使うことができる ：SOD/HCVポリペプチドc100-3(363AA);第２ポリペプチド;およびカプソイド・ペ プチド(capsoid peptide)。 本明細書で定義される「サンプル」は、生物から得られるサンプルのいずれか を意味する。生物学的サンプルの例は、体液および組織検体を含む。サンプルの ソースは、血液、血清、血漿、母乳、膿、組織掻取物、洗浄液、尿、およびリン パ節、脾などの組織のような生理学的基質から得ることができる。 被験者は哺乳動物、またはさらに特定的にはヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ 、ヒツジ、ヤギ、サル、ウシ、ネコ、もしくは、げっ歯類であってよい。好まし い実施様態では、被験者はヒトである。 本明細書に定義されているように、「マイトジェン」とは、特定の抗体を分泌 または産生させるために、リンパ球を活性化するいずれの物質をも意味する。１ つの実施形態では、マイトジェンはアメリカヤマゴボウマイトジェン、レクチン 、細菌内毒素、抗原、脂質ＡまたはリンホカインのようなＢ細胞活性化物質であ る。もう１つの実施形態では、マイトジエンはブドウ球菌(staphylococci)を含 む細菌由来の毒素およびブドウ球菌Ａ毒素(30KD毒素)、腸毒素Ａ、Ｂ、C1、C2、 Ｄ、Ｅ(黄色ブドウ球菌(staphylococcus aureus)由来)、外毒素Ａ、Ｂ、Ｃおよ び表皮剥脱毒素Ａ、Ｂのようなスーパー抗原である。もう１つの実施形態では、 マイトジェンはグラム陰性LPS配列である。もう１つの実施形態では、マイトジ ェンは、例えばトキシックショック症候群毒素TSST-1、ExFT、MAM、Strep M、ま たはグラム陰性リポ多糖(LPS)配列のような、グラム陰性細菌およびグラム陽性 細菌双方由来のペプチドグリカンである。もう１つの実施形態では、マイトジェ ンは、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、レトロウイルス、マウス乳癌ウイル ス(MMTV)、ピコルナウイルス(ラット)、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎 ウイルスおよび麻疹ウイルス、ならびにMtvウイルス(1-9、11、13、43)のような ヘルペスウイルスである。もう１つの実施形態においては、マイトジェンは熱シ ョックタンパク質(HSP)である。もう１つの実施形態では、マイトジェンは、限 定されるものではないが：抗CD3抗体、抗TCR(T細胞受容体)、抗IgM、抗IgD、可 溶性型または結合型抗CD28を含む抗体である。単独でまたは付加的な因子と共に 、IL-4のようなインターロイキン類またはサイトカイン類も加えてよいことが考 えられる。もう１つの実施形態では、マイトジェンは、ホルボールミリステート アセテート等のホルボールエステル、カルシウムイオノフォアおよび IL-4と併用されるPMAである。もう１つの実施形態では、PIP2誘導第２メッセン ジャー経路のような、経路において作用する、薬理学的活性化物質(ジアシルグ リセロール等)である。もう１つの実施形態では、マイトジェンは、アメリカヤ マゴボウマイトジェン(PWM)および、抗原存在下または不在下で類似する作用を 有するマイトジェンを含むレクチンである。好ましい実施形態では、アメリカヤ マゴボウマイトジェンが使用される。アメリカヤマゴボウマイトジェンには、Ph ylotacca Americana由来の純粋および粗抽出物が含まれる。 本明細書において使用されているように、「全血」とは、動物またはヒトから 採取された血液を意昧する。全血は、残存する白血球の生存度を維持したまま細 胞溶解し得る赤血球を含む。全血は、ヘパリン、EDTA、クエン酸または、血液凝 固および血餅形成を妨げる他のいずれの物質を用いて採取することができる。 １つの実施形態では、抗原存在下、または抗原不在下でのマイトジェンの至適 濃度は、過度の実験を行うことなく、当業者により容易に決定される。好ましい マイトジェンであるアメリカヤマゴボウマイトジェンに関しては、好ましい濃度 範囲は、保存PWMの約1:100〜1:1600希釈である。最も好ましい濃度範囲は、保存 PWMの約1:200〜1:1:400希釈である。保存PWMの好ましい供給源はGIBCO,New York ,New York.である。凍結乾燥されたPWMは、5mlの蒸留水で元に戻され、これを保 存溶液とする。 アメリカヤマゴボウマイトジェン濃度は、約0.025〜50.0μl/mlの範囲でよい 。濃度範囲は約0.1〜0.5μl/mlでよい。好ましい濃度は、0.2μl/mlである。マ イトジェンがコムギ胚芽凝集素である場合、濃度範囲は約0.1〜2.5μl/mlである 。マイトジェンがSac Cowan Iマイトジェンである場合、濃度範囲は1:200〜1:20 00希釈である， 本明細書において定義されているように、「培地」とは、限定されるものでは ないが、ウシ胎児血清を含有または含有しないRPMI 1640(GIBCO,New York,New Y ork)を含む、本発明を行うためにサンプルを維持する目的で使用可能ないずれの 培地をも意味し、好ましくは適切な抗生物質およびグルタミンが補われている。 本発明の実施に使用してよいその他の培地には、限定されるものではないが、Ea gles、Dubecco's、McCoy's、Media 199、Waymouth's mediaおよび補足 剤含有または非含有の血清非含有培地が含まれる。もう１つの実施形態では、マ イトジェンには培地を用いない。 本明細書に記載される核酸配列は、DNA、RNAまたはcDNAであってよい。種々の 長さのPCR産物を提供するために、単一または複数のプライマーセットとポリメ ラーゼ連鎖反応を用いて増幅を行う。複数のプライマーセットは、PCRによりと もに増幅される。それぞれのプライマーセットは、PCRにより別々に増幅される 。 ２つの異なるプライマーセットを用いる場合、本発明は、第１のプライマーセ ットは、定義された増幅条件下での、核酸への付加化合物の付加に対して本質的 に明白であるに十分短い長さの産物を生成し得ることを意図するものである。そ れは付加化合物の共有結合型付加の効率に関係なく、産物の長さが十分であるた め、結果として増幅産物が検出されるであろう。 第２のプライマーセットはまた、前記と同じ増幅条件下での、核酸含有抗体の 核酸への付加化合物の付加により、完全には阻害されないが、部分的に阻害され るに十分長い長さの産物を生成し得る。これは、付加化合物の共有結合型付加の 効率が検出される増幅産物の量に反映されるためであろう。 ３つの異なるプライマーセットが用いられる場合、本発明は、第１のプライマ ーセットは、定義された増幅条件下での、核酸への付加化合物の付加に対して本 質的に明白であるに十分短い長さの産物を生成し得ることを意図するものである 。言い換えれば、付加化合物の共有結合型付加の効率に関係なく、産物の長さが 十分であるため、結果として増幅産物が検出されるであろう。第２のプライマー セットはまた、前記と同じ増幅条件下での、核酸含有抗体の核酸への付加化合物 の付加により、完全には阻害されないが、部分的に阻害されるに十分長い長さの 産物を生成し得る。また、付加化合物の共有結合型付加の効率が、検出される増 幅産物の量に反映されるであろう。第３のプライマーセットは、核酸含有抗体の 核酸への付加化合物の付加により、完全に阻害されるに十分長い長さの産物を生 成し得る。付加化合物の共有結合型付加は、測定可能な増幅産物の完全な不在に より反映されるであろう。 例えば、増幅後に、PCR反応混合物の一部を分離し、32P標識アデノシン三リ ン酸末端標識プローブのような、末端標識ヌクレオチドプローブとのハイブリダ イゼーションに供することができる。PCRにおいて、末端標識オリゴヌクレオチ ドプローブは、溶液中において、増幅された配列の領域へハイブリダイズし、そ の過程において、特異的エンドヌクレアーゼ部位を再構築する。かくして、増幅 された配列と標識プローブのハイブリダイゼーションにより、選択的制限酵素に よる消化に感受性を有する二本鎖DNAが生成される。エンドヌクレアーゼによる 制限の後に、得られたサンプルをポリアクリルアミド上で分析することができ、 診断用標識断片を含むゲルの一部分のオートラジオグラムが得られる。オートラ ジオグラムにおける診断用断片の出現(例えば10〜15塩基長)は、PBMCs中の腫瘍 抗原関連抗体ヌクレオチド配列の存在を示す。 「PCR」は、１以上の特異的な核酸配列の増幅工程を表し、(1)増幅される配列 の末端を決定するオリゴヌクレオチドプライマーが、被検サンプル中の一本鎖核 酸とアニーリングし、(2)核酸ポリメラーゼがアニーリングしたプライマーの３ ’末端を伸長させ、プライマーがアニーリングした核酸配列に相補的な核酸鎖を 形成し、(3)得られた二本鎖核酸を変性させて、一本鎖核酸を生じさせ、(4)容易 に同定でき、定量できる量の、プライマーにより定義される配列を生成するまで プライマーのアニーリング、プライマーの伸長および産物の変性の工程を繰り返 す。配列のアニーリング、伸長および変性工程の実際の制御は、通常、反復周期 的に反応容器の温度を変化させることにより行われる。アニーリングおよび伸長 は、40℃〜80℃の温度範囲が最も好ましく(正確な値は、プライマーの濃度およ び配列に依存する)、一方、変性には80℃〜100℃の範囲の温度が要求される(正 確な値は、標的配列および濃度に依存する)。 PCRによるDNA増幅法は周知であり、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号 および同第4,965,188号に記載されており、それぞれ引用により本明細書に組み 入れる。本発明により供される利益の理解を容易にするために、PCRの概要を提 供する。PCRには、増幅する二本鎖標的核酸配列をハイブリダイズする２つのプ ライマーが必要である。PCRにおいて、この二本鎖標的配列を変性させ、１つの プライマーが変性した標的のそれぞれの鎖へアニーリングする。互いに離れた部 位において、１つのプライマーの伸長産物がその相補体から分離された時、も う一方のプライマーとハイブリダイズできるような方向で、プライマーが標的核 酸へアニーリングする。ひとたび所与のプライマーが標的配列へハイブリダイズ すれば、そのプライマーは、DNAポリメラーゼの作用により伸長される。次いで 伸長産物を標的配列から変性させ、この工程を繰り返す。核酸増幅の交差汚染の 影響を最小限にするための１つの特別な方法は、米国特許第5,035,996号に記載 されており、これは引用により本明細書に組み入れる。 PCR技術は、血清反応陽性または血清反応陰性の患者が検出可能なレベルの特 異的抗体を有しているかどうかの決定に有用である。PCR技術において、特異的 腫瘍関連抗体に対するオリゴヌクレオチドプライマーは、患者が癌であることを 示す。 増幅されるDNA領域の２つの３'境界に相補的に生成された癌抗原関連抗体を合 成する。次いで、２つのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。PCR プロトコール：方法と適用の指針[PCR Protocols;A Guide to Methods and Appl ications (1990)Innis,M.,Gelfand D.,Sninsky,J and White,T.,eds.,Academic P ress,San Diego]を参照。PCR増幅に引き続き、腫瘍抗原関連抗体のPCR増幅領域 を、前記の３つの特異的核酸プローブとハイブリダイズするそれらの能力につい て試験することができる。あるいは、腫瘍抗原関連抗体の核酸と前記の核酸プロ ーブとのハイブリダイゼーションを、DNA増幅せずに、本明細書に記載されてい るストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもと、サザンブロット法に より行うことができる。米国特許第5,494,810号Barany,Francisら「ポリメラー ゼ連鎖反応(PCR)」は、向かい合った鎖へハイブリダイズし、標的DNAの目的の領 域と隣接する(flank)2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特異的DNA 断片の対数増幅のための特許された工程(米国特許第4,683,202号および同第4,68 3,195号に記載)に言及しており、引用により本明細書に組み入れる。また、以下 の米国特許：米国特許第4,459,359号に開示されているそれらのアッセイは、引 用により本明細書に組み入れられる。 PCRプライマー配列の選択、PCR試薬および反応混合液の調製、ならびにPCR反 応の計画および実施は、PCR技術において周知の手段である。標準的なPCRチュー ブ内の懸濁細胞に対して核酸増幅を行う場合、細胞は従来のPCR試験サ ンプルのいずれとも同じように扱う、すなわち、増幅を始める直前に反応混合液 に、およそ100〜およそ106の範囲の細胞総数になるよう希釈する。 複数のサンプルを異なるチューブで同時に増幅する場合は、交叉汚染を防ぐた め、新しいサンプラーチップを用いて各チューブに消費された試薬を加える。す べてのチューブを調製し、封をした後、サーマルサイクラー・マイクロプロセッ サの制御下で、およそ10〜40サイクルで、変性、アニーリング、および伸長から なる標準的な３温度の熱サイクルプログラムを行う。また、アニーリングと伸長 を、通常、プライマーの鋳型へのストリンジェントなアニーリングのために最適 化した単一温度で行う、一連の２温度サイクルがしばしば好ましい。反応速度は 、細胞を含まない核酸に比べ、細胞調製物ではいくらか遅いと考えられるので、 変性、アニーリング、伸長またはアニーリング-伸長サイクルのセグメントの時 間を、試験サンプルが細胞を含まない核酸を含む場合の標準値より数倍長くする 必要があろう。この調節は、増幅した核酸の検出の際に見られるシグナル強度を 最大にする、または与えられたシグナル強度に達するために必要なサイクル数を 最小にする条件を探すことによって容易に行われる。反応混合液のMgCl2、dNTP 、プライマー、および酵素濃度についても同様の至適化手段を用いることができ 、これらのパラメーターはしばしば異なる標的に対しては異なる至適条件を示し 、また、固定細胞内で増幅が起こる場合にも影響すると考えられる。 10-300塩基対離れて位置する既知の配列のプライマ一対は、増幅させるDNAの プラスおよびマイナス鎖に相補的であり、周知のオリゴヌクレオチド合成技術に より調製できる。プライマーを特異的な抗体の核酸配列へアニーリングさせる場 合、各プライマーの一方の末端を伸長、修飾して制限エンドヌクレアーゼ部位を 作り出すことができる。PCR反応混合物は特異的な抗体のDNA、DNAプライマー対 、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、MgCl2、DNAポリメラーゼ、および 通例のバッファーを含んでよい。DNAは多数回のサイクルで増幅させることがで きる。一般に、多数のサイクルを用いることにより検出の感度を上げることがで き、各サイクルは、短時間の高温での特異的抗体DNAの変性、反応混合物の冷却 、およびDNAポリメラーゼでの重合からなる。オリゴヌクレオチドプライマーお よびプローブは当業者に公知である。 プローブまたはPCRプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、Needham -VanDevanter[Needham-VanDevanter,D.R.ら,(1984)Nucleic AcidsRes,12:6159-6 168]に記載されているような自動合成装置を用い、BeaucageおよびCarruthers[B eaucage and Carruthers(1981)Tetrahedron Lett.22:1859-1862]により最初に記 載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成される。 オリゴヌクレオチドの精製は、Pearson,J.D.およびRegnier,F.E．[Pearson,J.D. およびRegnier,F.E.,(1983)J．Chrom．255:137-14976]に記載されたように、天 然アクリルアミドゲル電気泳か、または陰イオン交換HPLCのいずれかによる。合 成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam，A.M.およびGilbert，W[Maxam，A.M.お よびGilbert，W．Methods in Enzymology(1980)Grossman,L.およびMoldave，D. 編,Academic Press,New York，65:499-560]の化学分解法を用いて変更可能であ る。Tavernarakis,N.,米国特許5,569,582号は、腫瘍抗原関連抗体核酸の増幅お よび検出に関し、引用により本明細書に組み入れる。 本発明は、抗腫瘍抗原関連抗体の核酸配列の増幅およびそれに次ぐ検出により 、癌を有する被験者の診断に適用可能である。「増幅」とは、鋳型特異性を含む 特殊な場合の核酸の複製である。これは非特異的鋳型複製（すなわち、鋳型に依 存するが、特異的鋳型に依存するわけではない複製）と対比される。ここでは、 鋳型特異性は複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成）や ヌクレオチド（リボまたはデオキシリボ）特異性からは区別される。鋳型特異性 は「標的」特異性という言葉で記載されることが多い。標的配列は、他の非標的 核酸配列の存在下で優先的に増幅または検出されることが求められるという意味 において「標的」である。増幅技術はもともと、特異的標的配列の検出のために 設計されたものである。ほとんどの増幅技術で鋳型特異性は酵素の選択により達 成される。増幅酵素とは、それらが使用される条件の下で、不均一な核酸混合物 中の特異的な核酸配列だけを処理する。 T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は、連結反応部分においてオリゴヌクレオチ ド基質と鋳型の間に誤対合があるときは、２つのオリゴヌクレオチドを連結しな い。D.Y.WuおよびR.B.Wallace,Genomics 4:560(1980)。最後に、Taqポリ メラーゼは、その高温での作用力により、プライマーが結合し、かくしてプライ マーにより定義された配列に対して高い特異性を示し；高温のため、プライマー が特異的標的配列と好もしくハイブリダイズし、かつ、非標的配列とはハイブリ ダイズしないという熱力学条件がもたらされる。R.K.Saiki，PCR Technology，P rinciples and Applications for DNA Amplification(H.A．Erlich編)，7-16頁( 1989)。 増幅技術には、標的を増幅し、次いで検出するというアプローチを取るものも あり、標的を検出し、次いでプローブを増幅するアプローチを取るものもある。 アプローチに関わらず、高い効率で起こるよう、核酸を含有するサンプルが増幅 に対する阻害剤を含んではならない 増幅「試薬」とは、増幅に必要な、核酸および増幅酵素以外の試薬（プライマ ー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸など）と定義される。典型的には、増幅 試薬は他の反応成分とともに置かれ、反応容器（試験管、マイクロウェルなど） 内に含まれる。 好ましい溶解剤としては、プロテアーゼＫがある。プロテアーゼＫはTritirac hium album由来のタンパク質分解酵素である。これは有意なDNase活性を持たず 、ゆえに、核酸を分解して増幅を妨げないので、本発明では特に有用である。ま たこの酵素は安価であり、市販されている（例えば、Sigma,St.Louis,Mo.,U.S.A .,カタログ番号p4914「プロテイナーゼＫ」）ので魅力がある。プロテアーゼＫを 用いる種々の処理条件が有用であることがわかっている。細胞および腫瘍抗原関 連抗体を完全に分解するためには、高濃度のプロテアーゼＫ(例えば、1.5-2.5mg /ml)を短いインキュベーション時間(5-10分）で用いることが好ましい。より低 い濃度のプロテアーゼＫ(例えば、0.5mg/ml)を用いると、同じ効果を達成するに はより長いインキュベーション時間が必要となる(30-60分)。加熱による溶解を はじめとする他の溶解アプローチも考えられる。 PCRにより増幅された核酸の「検出」とは、PCR反応物から識別されるようなPC Rの増幅産物と特異的に関連していると推定される分析シグナルを観察する、位 置決定する、または定量するプロセスをいう。分析シグナルは可視もしくは紫外 吸収、または蛍光、化学発光、または吸収、蛍光、化学発光、もしくは電 離放射線の写真もしくは、オートラジオグラフ画像から得られる。In situでのP CR産物の検出は、このようなシグナルの顕微鏡観察または記録を含む。このシグ ナルはPCRプライマーもしくはdNTPに、または核酸プローブに結合した分子「タ グ」から直接または間接的に得られ、このようなタグは放射活性原子、発色団、 蛍光団、化学発光試薬、発色、蛍光もしくは化学発光生成物を生成できる酵素、 または分析シグナルを直接有するか、もしくは触媒により生成する他の配列もし くは粒子と反応できる結合部分であってよい。一般的な結合部分としては、スト レプトアビジンまたはアビジンと強く結合するビオチン、または抗ジゴキシゲニ ン抗体と強く結合するジゴキシゲニン、および抗フルオレセイン抗体と強く結合 するフルオレセインがある。アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体は、発色 団、蛍光団、放射活性原子、および発色、蛍光または化学発光シグナルを生成で きる酵素と容易に結合する。 RNAは多数の方法のいずれによって調製してもよく；その選択はサンプルの供 給源および有効性による。RNAの調製方法は、Davisら,1986,Basic Methods in M olecular Biology，Elsevier，NY，第11章;Ausubelら,1987，Current Protocols in Molecular Biology，第４章，John WileyおよびSons，NY;KawasakiおよびWa ng，1989，PCR Technology，Erlich編，Stockton Press NY;Kawasaki，1990，PC R Protocols;A Guide to Methods and Applications，Innisら編，Academic Pre ss,San Diego;ならびにWangおよびMark，1990，PCR Protocols;A Guide to Meth ods and Applications，Innisら編,Academic Press，San Diegoに記載されてお り、これらはすべて参照により本明細書に組み入れる。前記のように、特異的な 腫瘍抗原と関連した抗体核酸と特異的にハイブリダイズ可能であるプローブは、 癌を有する被験者の指標となる。 このような「特異的ハイブリダイゼーション」は、プローブが、サンプル中に 存在する他の核酸（例えば、動物細胞または他の細菌の核酸）とはハイブリダイ ズしない条件の下で、検出可能なシグナルによって証明されたように、該プロー ブが標的核酸とハイブリダイズする場合に起こる。プローブの長さおよび塩基組 成、プローブと標的核酸の間でミスマッチしている塩基の範囲、塩および有機溶 媒の有無、プローブ濃度、ならびに温度をはじめとする種々の因子がハイブリダ イゼーションに影響を及ぼし、ハイブリダイゼーションの至適条件ばしばしば経 験的に決定しなければならない。核酸プローブの設計およびアニーリング条件に 関する考察としては、例えば、Ausubel,F.ら,Methods in Enzymology[Methods i n Enxymology 第152巻，(1987)Berger，S.およびKimmel，A.編，Academic Press ，New York]またはHybridization with Nucleic Acid Probesを参照し、これら はすべて参照により本明細書に組み入れる。 高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強 度およびpHで、特異的配列の熱融解点(Tm)より約５℃低い温度で選択される。Tm とは、標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度 （規定されたイオン強度およびpHの下）である。典型的には、ストリンジェント な条件とは、pH7で塩濃度が少なくとも約0.02モル、かつ、温度が少なくとも約6 0℃というものである。その他のうち、相補鎖の塩基組成および大きさ、有機溶 媒の有無、すなわち塩またはホルムアミドの濃度、ならびに塩基のミスマッチの 範囲をはじめとする他の因子もハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに 有意に影響を及ぼすので、これらのパラメーターの組み合わせが、互いの絶対測 定値(absolute measure)よりも重要である。例えば、高いストリンジェンシーは 、例えば6xSSC溶液中、約68℃で一晩ハイブリダイズし、室温にて6xSSC溶液で洗 浄し、次いで6xSSC含有0.6xSSX溶液中、約68℃で洗浄することにより達成しても よい。 中程度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、例えば、1)3x塩 化ナトリウム、クエン酸ナトリウム(SSC)、50％ホルムアミド、0.1Mトリスバッ ファー(pH7.5)、5xデンハート溶液からなる溶液でフィルタープレハイブリダイ ゼーションおよびハイブリダイゼーションを行い；2)37℃にて４時間プレハイブ リダイゼーションを行い；3)37℃にて,3,000,000cpmと等量の標識プローブと計1 6時間ハイブリダイズし；4)2xSSCおよび0.1％SDS溶液中で洗浄し；5)室温で各１ 分間４回、60℃にて各30分間４回洗浄し；次いで6)乾燥し、フィルムに露光する ことにより達成してもよい。 「選択的にハイブリダイズする」とは、全細胞DNAまたはRNAの調製物中に 標的配列が存在する場合に、特定の標的DNAまたはRNA配列とのみハイブリダイズ する、二重らせんを形成する、または結合する核酸プローブに対していう。選択 的にハイブリダイズするとは、プローブが、高いストリンジェンシーのハイブリ ダイゼーション条件下で、非標的配列とは異なる様式で検出可能な様式で与えら れた標的と結合することを意味する。「相補的」または「標的」核酸配列とは、 核酸プローブと選択的にハイブリダイズする核酸配列をいう。適切なアニーリン グ条件は、例えば、プローブの長さ、塩基組成、ならびにミスマッチの数および プローブ上のそれらの位置に依存し、それらはしばしば経験的に決定しなければ ならない。核酸プローブの設計およびアニーリング条件に関する考察としては、 例えば、Sambrookら，[Sambrookら，(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryMan ual( 第２版) ,Cold Spring Harbor Laboratory，第1-3巻]またはAusubel,F.ら,[A usubel，F.ら,(1987)Current Protocols in Moleculer Biology,New York]を参 照。 腫瘍抗原関連抗体のDNAまたはmRNAは、サザンブロッティング、一本鎖高次構 造多型ゲル電気泳動(SSCP)、PCRもしくは他のDNAに基づく技術により、またはRN A種についてはノーザンブロッティング、PCRもしくは他のRNAに基づく技術によ り検出し得る。 本明細書で定義したように、核酸プローブはDNAまたはRNA断片であってもよい 。DNA断片は、例えば、プラスミドDNAを消化することによって、もしくはPCRの 使用によって調製してもよいし、または、双方とも参照により本明細書に組み入 れるBeaucageおよびCarruthersによって記載されたホスホルアミダイト法か、も しくはMatteucciら,[Matteucciら(1981)Am ．Chem．Soc．103:3185]に従ったトリ エステル法のいずれかにより合成してもよい。次いで所望により、適当な条件の 下で一緒に化学合成した一本鎖をアニーリングすることにより、または適当なプ ライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を合成することにより二 本鎖断片を得てもよい。核酸プローブに対して特異的な抗体が与えられた場合、 相補鎖もまた同定され、包含されると理解される。相補鎖は、標的が二本鎖の核 酸である状況下で十分同等に働くと考えられる。また、特異的な配列が核プロー ブの使用のために同定される場合、一覧化された25塩 基対以上の長さの配列の部分配列もプローブとしての使用のために包含されると いうことも理解される。 抗体またはDNA配列は、限定されるものではないが、放射活性標識、または比 色、発光、もしくは蛍光マーカー、または金をはじめとする検出可能なマーカー で標識してもよい。放射活性標識としては、限定されるものではないが、3H、14 C、32P、33P、35S、36Cl、51Cr、57Co、59Co、59Fe、90Y、125I、131I、および1 86 Reが挙げられる。蛍光マーカーとしては、限定されるものではないが、フルオ レセイン、ローダミン、およびオーラミンが挙げられる。比色マーカーとしては 、限定されるものではないが、ビオチンおよびジゴキシゲニンが挙げられる。ポ リクローナルまたはモノクローナル抗体を産生する方法は当業者には公知である 。 さらに、抗体または核酸配列複合体は、アルカリホスファターゼまたは西洋ワ サビペルオキシダーゼなどの酵素と結合させ得る二次抗体によって検出してもよ い。使用してもよい他の酵素は、当業者には十分に公知である。 また、腫瘍抗原もしくは抗体は、当技術分野で公知の技術を用い、蛍光標識、 酵素標識、フリーラジカル標識、またはバクテリオファージ標識を用いて標識し てもよい。典型的な蛍光標識としては、フルオレセインイソチオシアネート、ロ ーダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびテキ サスレッドが挙げられる。 特異的酵素は共有結合により他の配列と結合し得るので、それらをトレーサー 物質の製造のための標識として使用できる可能性もある。適切な酵素としては、 アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロ ゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。酵 素のイムノアッセイのタイプとしては、固相酵素免疫検定法(ELISA)、ELISPOTお よび均一系酵素イムノアッセイがあり、エンザイム・マルチプライド・イムノア ツセイ(enzyme-multiplied immunoassay)(EMIT．Syva Corporation，Palo Alto ，CA)としても知られている。ELISA系では、分離は、例えば固相に結合させた抗 体の使用によって達成してもよい。EMIT系は、トレーサー-抗体複合体中の酵素 の失活に依存し；従ってこの活性を分離工程を必要とせずに測定することができ る。 加えて、化学発光化合物を標識として用いてもよい。典型的な化学発光化合物 としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミ ダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。同様に、生 物発光化合物を標識として利用してもよく、生物発光化合物としては、ルシフェ リン、ルシフェラーゼおよびエクオリンがある。 ひと度標識すると、その抗体は、当技術分野で十分公知の技術を用いて、免疫 対照物（抗体または腫瘍抗原性ポリペプチド）を同定および定量するために使用 し得る。抗体としては、限定されるものではないが、IgGおよびサブセットであ るIgA、IgE、IgM、IgDが挙げられる。 「腫瘍抗原関連抗体と特異的に結合する」または「特異的に免疫反応する」と は、腫瘍抗原関連抗体についていう場合、腫瘍抗原関連抗体の有無が決定できる 結合反応をいう。このように、示されたイムノアッセイ条件下で、明示された腫 瘍抗原関連抗体は、腫瘍抗原関連抗体と結合するが、そのサンプル中に存在する 他の抗体とは有意な量では結合しない。このような条件の下では、腫瘍抗原関連 抗体に対する特異的な結合には、特定のタンパク質に対するその特異性に関して 選択された腫瘍抗原が必要とされる。 特定のタンパク質と特異的に免疫反応する特異的な抗体を選択するためには、 種々のイムノアッセイ様式を用いてよい。例えば、タンパク質と特異的に免疫反 応するモノクローナル抗体を選択するには、固相ELISAイムノアッセイが慣例的 に用いられる。特異的な免疫反応性を決定する使用できるイムノアッセイ様式お よび条件に関しては、HarlowおよびLane[HarlowおよびLane，(1988)Antibodies, A Laborary Manual ,Cold,Spring Harbor Publicetion New York]を参照。 ラジオイムノアッセイ(RIA)についての記載は、Laboratory Techniques in Bi ochemistry and Molecular Biology[Laboratory Techniques in Binchemistry a nd Molecular Biology (1978)North Holland Publishing Company,New York]中の 特にChard,T.による"An Introduction to Radioimmune Assay and Related Tech niques"と題された章に関して見出され、これは参照により本明細書に組み入れ る。 種々のタイプの一般的なイムノメトリックアッセイの記載は、以下の米国特許 第4,376,110号(Davidら）または同第4,098,876号(Piasio)および同第4,870,003 号(Kortright)に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み入れる 。 生物学的サンプルの腫瘍抗原関連抗体の存在を検出する、または定量するため には、この抗原-抗体複合体の有無または濃度を測定する。 ペプチド配列に対するリガンドは、金属イオン（鉄または亜鉛他）などの特異 的な物質を腫瘍内に運び、かくして、腫瘍に対して、有毒物質（放射活性または 細胞傷害性の化学物質、すなわち、リシンまたは細胞傷害性アルキル化剤または 細胞傷害性プロドラッグ）を送達する手段として機能する。抗体と毒素または放 射性同位元素との結合は化学的なものであってよい。直接結合する毒素の例とし ては、ドキソルビシン、クロラムブシル、リシン、シュードモナス菌外毒素など が挙げられ、あるいは半分はペプチドに対する特異性を有し、かつ、他の半分は 毒素に関する特異性を有するようにハイブリッド毒素を作製することができる。 このような二価分子は、腫瘍に結合し、他の半分は腫瘍に細胞傷害性を送達する か、または細胞傷害性リンパ球に結合し、これを活性化させるように機能する( 例えば、T1-T3受容体複合体との結合)。また、求められる特異性を有する抗体は 、Ｔ細胞受容体(TcR)の免疫グロブリンドメインを置換し；望ましいMab重鎖およ び軽鎖中にクローン化し；αおよびβ TCR鎖の定常領域を有するUhおよびUL遺伝 子セグメントをスプライシングし、次いでこれらキメラAb/TcR遺伝子を患者のＴ 細胞にトランスフェクトし、これらハイブリッド細胞を増殖させ、次いでそれら を患者に注入することにより、Ｔ細胞中にクローン化できる。標的に対して組織 特異的な抗原およびこのような標的に対して特異的なMabの作製に関する特殊な 知見は、これを使用可能なアプローチとする助けとなろう。 TGF-α由来のcDNAとシュードモナス外毒素の有毒部分とを有し、このためハイ ブリッドのTGF部分が上皮増殖因子受容体(EGFR)と結合し、シュードモナス部分 が細胞に酵素的に取り込まれ、次いでタンパク質合成を行うリボソームの能力を 活性化させて細胞死を起こす、遺伝子組換え体TP-40などの有毒な遺伝子キメラ を作製することができる。 抗体(またはリガンド)の腫瘍抗原との反応の検出は、当技術分野で公知の方法 により検出可能な部分で標識した抗体またはリガンドの使用により容易にするこ とができる。このような検出可能な部分により、沈殿もしくは変色の視覚的検出 、顕微鏡による視覚的検出、または分光測定もしくは放射性測定などによる自動 化検出を可能にする。検出可能な部分の例としては、フルオレセインおよびロー ダミン(蛍光顕微鏡用)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(光学顕微鏡または電子顕 微鏡のいずれかおよび生化学的検出用)、ビオチン-ストレプトアビジン（光学ま たは電子顕微鏡用）およびアルカリホスファターゼ（変色による生化学的検出用 ）が挙げられる。使用する検出方法および検出部分は、例えば、前記リストまた は他の適切な例から、かかる選択に適用される標準的な基準により選択できる(H arlowおよびLane,Antibodies:A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labor atory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)。 免疫蛍光アッセイ(IFA)、光分析アッセイ、固相酵素免疫検定法(ELISA)、ELIS POTおよびイムノブロッティングなどの酵素イムノアッセイを適用して、容易に 特異的な抗体の検出を達成することができる。腫瘍抗原関連抗体の検出に有効な ELISA法は例えば以下のようであってよい：(1)腫瘍抗原を基質に結合させ；(2) 結合した腫瘍抗原を、抗体を含有する培養前後の体液、または培養前後の組織サ ンプルもしくはリンパ球などの生物学的サンプルと接触させ；(3)前記を検出可 能な部分（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファタ ーゼ酵素）と結合した二次抗体と接触させ；(4)前記を酵素に対する基質と接触 させ；(5)前記を呈色試薬と接触させ；(6)色の変化を観察する。 腫瘍抗原を標識する場合、標識としては、放射性同位元素、蛍光団、酵素、発 色剤または粒子がある。これらおよび他の標識は当技術分野で十分公知であり、 例えば以下の米国特許第3,766,162号、同第3,791,932号、同第3,817,837号、同 第3,996,345号および同第4,233,402号に記載されている。細胞系由来の腫瘍抗原 関連抗体を使用するアッセイは、不均一（すなわち分離工程を必要とする）であ っても、均一であってもよい。アッセイが不均一である場合には、遠心分離、濾 過、クロマトグラフィーまたは磁気学をはじめとする種々の分離手段が使用でき る。 また、使用可能な他の検出系には、ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)Cowan Ｉ系統由来のプロテインＡ、ブドウ球菌エスピー．Ｃ群(26RP66系統）由来のプ ロテインＧに基づくもの、またはビオチン-アビジン結合反応の使用を用いる系 がある。 抗体の存在の免疫酵素検出の別法としては、ウエスタンブロットがある。腫瘍 抗原は電気泳動により分離しニトロセルロース膜または他の適切な支持体に転移 させる。次いで試験する体液をこの膜と接触させ、生じた免疫複合体の存在を、 既に記載した方法により検出する。この方法に対する変法では、精製した腫瘍抗 原関連抗体を膜上にライン状、またはスポット状に塗布して結合させる。次いで 、この膜を試験すべき培養前後の体液と接触させ、前記した技術を用いて生じた 免疫複合体を検出する。 また、培養前後の体液中の特異的な抗体の存在は、凝集によって検出してもよ い。本発明に従い記載された腫瘍抗原関連抗体の溶解物、腫瘍抗原または精製組 成物は、例えば均一な懸濁液を形成するラテックス粒子を被覆するのに用いる。 ラテックス粒子は、存在する抗体に対して特異的な抗原を含有する血清と混合し た場合、凝集を引き起こし、大きな凝集塊が視覚的に検出できる。 また、腫瘍抗原の特異的抗体と反応する腫瘍抗原関連抗体は、種々のイムノア ッセイ法によっても測定できる。イムノアッセイ技術による抗体の測定に適用可 能な免疫学的方法およびイムノアッセイ法に関する概説としては、Basic and Cl inical Immunology第７版[Basic and Clinical Immunology第７版D.Stites and A.Terr編]。 血球凝集反応阻害(HI)および補体結合(CF)は、抗体の存在に関して試験するこ とにより腫瘍抗原関連抗体を検出するのに使用可能な２つの実験室的試験である 。 当業者ならば、被験者を診断するために適切なDNAサンプルを得ることができ る。前記の方法により得られたDNAサンプルを制限酵素により切断すればよい。D NAの切断のための制限酵素の使用、およびこのような切断を行う条件は当技術分 野で十分公知である。 前記の方法では、ポリアクリルアミドゲルにより達成されるサイズ分画を使用 してもよい。１つの実施形態では、このサイズ分画はアガロースゲルによって達 成される。さらに、ハイブリダイゼーション工程の前に固相マトリックスへの DNA断片の転移を用いてもよい。このような固相マトリックスの一例には、ニト ロセルロースペーパーがある。 同様に、RNAまたは逆転写酵素PCRのサンプル中のメッセージを検出するのにノ ーザントランスファーを使用してよく、cDNAは前記の方法により検出できる。こ の手法もまた当業者に公知である。 腫瘍抗原関連抗体の感染、または曝露の結果として産生された特異的抗体の存 在を決定する代替手段としては、in situハイブリダイゼーション、またはより 最近のものとしてはin situポリメラーゼ連鎖反応がある。in situ PCRはNeuvo ら[Neuvoら，(1993)American Journal of Surgical Pathology 17(7),683-690] 、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した腫瘍抗原cDNAの細胞内局在化；Bag asraら[Bagasraら(1992)J.New England Journal of Medicine 326(21):1385-139 1]、in situポリメラーゼ連鎖反応による腫瘍抗原の検出；およびHenifordら[He nifordら(1993)Nucleic Acids Research 21(14):3159-3166]、in situ逆転写酵 素ポリメラーゼ連鎖反応により示された細胞質EGF受容体mRNA発現における変異 、に記載されている。in situハイブリダイゼーションアッセイは十分公知であ り、参照により本明細書に組み入れるMethods Enzymol．に概説されている。in situハイブリダイゼーションでは、細胞を固相支持体、典型的にはスライドガラ スに固定する。次いで、この細胞を、標識された標的特異的プローブのアニーリ ングが可能な中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プロー ブは放射性同位元素または蛍光リポーターで標識することが好ましい。 前記のプローブはまた、種々の生物学的組織において、in situハイブリダイ ゼーション、すなわち、この遺伝子を発現する組織の位置決定を行うために、ま たはこの遺伝子もしくはそのmRNAの存在に関しての他のハイブリダイゼーション アッセイのために有用である。in situハイブリダイゼーションは、腫瘍抗原の 発現によらない、または天然、対変性条件に関わらない鋭敏な位置決定法である 。 オリゴヌクレオチドは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー ゼを用い、１ｘ1010dpm/ugの範囲の特異的活性に対し、[α-35S]dATPで3'末端標 識する。組み込まれていない標識ヌクレオチドは、Sephadex G-25カラムを通 しての遠心分離により、またはWaters Sep PakC-18カラムからの溶出によりオリ ゴプローブから除去する。 プローブは、サンプルが標的腫瘍抗原関連抗体と動物細胞（例えば神経細胞） の双方を含む、本発明のプロトコールに従って処理されたサンプルに該プローブ がハイブリダイズすることにより、その標的核酸と特異的にハイブリダイズする ことができると証明できる。プローブの特徴的なシグナルが、サンプル中の腫瘍 抗原関連抗体DNAと関連しており、かつ、サンプル中の宿主細胞および非生物学 的材料（例えば基質）のDNAとは概して関連していないならば、該プローブは特 異的である。 以下のストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で、非特異 的なプローブと特異的プローブ（例えば蛍光標識したDNAプローブ）とを十分識 別される：変性プローブ、50％ホルムアミド、2X SSCおよび0.1％(w/v)硫酸デキ ストランを含有する溶液中で37℃にて12時間、サンプルとともにプローブをイン キュベートし、次いで、1X SSC中で70℃にて５分間；2X SSC中で37℃にて５分間 ；0.2X SSC中で室温にて５分間；さらに水中で室温にて５分間洗浄する。当業者 ならば、核酸ハイブリダイゼーション（すなわちin situサザンその他）におい ては、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄液に界面活性剤(例えばドデシル 硫酸ナトリウム)、キレート剤(例えばEDTA）、その他試薬（例えばバッファー、 デンハート溶液、硫酸デキストラン）を含むことがしばしば有利であることに気 付くであろう。 プローブが腫瘍抗原関連抗体の核酸に特異的であるかどうかを決定する簡便な 方法は、１以上の腫瘍抗原関連抗体から調製したDNAを用いるサザンブロット（ またはドットブロット）を使用するものであることは、当業者には明白であろう 。便宜には、標的特異的なプローブを同定するため、腫瘍抗原関連抗体からDNA を単離する。試験DNAを固相（例えば電荷ナイロン）マトリックスに転移させる 。プローブは従来法に従い標識する。当技術分野で公知の変性および／またはプ レハイブリダイゼーション工程の後、ストリンジェントな条件の下で、プローブ を固定化したDNAにハイブリダイズさせる。ストリンジェントなハイブリダイゼ ーション条件は、使用するプローブに依存し、算出したハイブリダイゼ ーションプローブのTm（融解温度）から評価できる(Tmの算出に関する記載とし ては例えば、Sambrookを参照)。 放射活性標識したDNAまたはRNAプローブに関してのストリンジェントなハイブ リダイゼーション条件の例としては、変性プローブおよび5x SSCを含有する溶液 中で、65℃にて8-24時間のハイブリダイゼーション、次いで、0.1x SSC、0.1％ SDS（ドデジル硫酸ナトリウム）中、50-60℃の洗浄というものである。一般に、 温度および塩濃度は、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリッドのTmよ り約５℃低い温度で行うよう選択する。このように特定の塩濃度に対して温度は Tmより約５℃低い温度を選択し、または逆に、特定の温度に対して塩濃度は、ハ イブリッドのTmが洗浄温度より５℃高くなるように選択する。ストリンジエント なハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、適当な標的と会合したシグナルの存 在および非標的核酸からのシグナルの不在により証明されるように、腫瘍抗原関 連抗体とハイブリダイズするプローブが同定される。さらに、プローブ特異性を を決定する際、また腫瘍抗原関連抗体を検出するために本発明の方法を用いる際 には、ある量のバックグランドシグナルが典型的に存在し、当業者により特異的 シグナルから容易に識別できることが認識される。バックグランドの２倍のシグ ナルが許容される。 以下の実験詳細の節で本発明をさらに説明する。この節は本発明の理解を助け るために示され、以下の請求の範囲で示すように、本発明を限定することを意図 したものではなく、また限定するものと解釈すべきではない。試験詳細： 実施例１： 卵巣癌および乳癌の早期発見方法および物質： 乳癌腫瘍から摘出した抗体は癌細胞に結合され、ムチン、特にMuc-1分子に結 合することが示されている。さらなる解析により、この抗体はムチン-1のタンパ ク質コア／主鎖と結合することが示された。遺伝突然変異はムチン-1のタンパク 質鎖には見られない。正常タンパク質（非突然変異の）の異種抗原としての作用 は、タンパク質コアの脱グリコシル化が起因すると考えられた。タンパク質コア の脱グリコシル化が、ムチン-1が異種抗原として認識される原因であると考えら れる。ペプチドP1-P3は、数種の形態を有し乳癌および卵巣癌に共通のムチン-1 の縦列反復の主要抗原決定基エピトープを覆うよう設計された。用いられてきた ペプチドは、MUC-1の縦列反復から誘導された。 OC-P1=SGSGHGVTSAPDTR-NH2,（配列番号１） OC-P2=SGSGAPDTRPAPGSTAP-NH2,（配列番号２） OC-P3=IISAVVGIL-NH2,（配列番号３） 最初の２種は水に可溶性であり、最後のものは非常に疎水性が大きく、それを 溶解させるのに非常に低いpHを必要とする。最初の２種はそれらのAc側（技術的 根拠）のビオチンに結合し、３番目のものは結合していなかった。OC-P1およびO C-P2の純度レベルは95％より高い。OC-P3はわずか〜60％純度である。結果： 予備データを採取した群は、推測されたOCにより手術を受けた15人の女性を含 んだ。対照サンプル(n=21)は血液提供サービスから入手可能であった。6-7日間 のリンパ球の培養に引き続いて、抗体を血清(IBTS)および上清(IBTC)の双方で探 索した。用いた３種のペプチドは公開されたMUC-1およびHER-2neuの配列に基づ いて設計した。 表１で示されるように、組織病理学的結論に基づいて、11/15は悪性であると わかった。対照は、血清において、またはin vitro培養後、３種のペプチドのい ずれに対しても反応が全くない。IBTSおよびIBTCは、10/11の場合において、少 なくとも１つのペプチドに対して反応性を示した。アッセイを組合せた場合、11 /11(100％）は抗体陽性であった。総ての４の良性の場合では、IBTS陽性であっ たが、１サンプルのみIBTCを用いて、(弱く)陽性であった。検査された個体数が 大規模な統計上の分析および予測に対して少なすぎたにもかかわらず、データは 両アッセイを用いることにより、OCに対してハイリスクの個体群において試験す るのに都合がよく、かつ実用的な手段を提供し、あらゆる腫瘍がペプチド特異的 な抗体によって確認され得ることを示すと考えられる。10/11が悪性の場合に おいてそうであったのと同様に、1/4の良性の場合のみIBTC陽性であったという 事実により、IBTCが良性か悪性の場合の識別を助けるであろうことを示すことが できた。 表1.診断グレード評価による新しいIBTの診断値 血液サンプルは推測されたOCにより手術を受けた患者、および健康な血液供与 者から採取した。組織病理学的結論に基づいて、グレード評価を行った。考察： （抗体の）免疫応答試験は抗原特異的である。スクリーン用に選択された抗原 は、癌またはいずれの特異的な癌（この場合では乳房）の試験の特異性をも決定 する。卵巣癌と乳癌の交差反応性があること、およびMUC-1のような数種の抗原 が双方の検出に使用できることが可能であることが、繰り返して示されてきた。 交差反応性は、双方の癌が同一のホルモンによるホルモン感受性であるという事 実に起因すると考えられる。 癌抗原の他の例は乳癌のHERneu2を含む。BC（例えば家族性BCにおいて）に対 してハイリスクな女性は、HERneu2に対する抗体での徴候が、マンモグラフィー および／または手による身体の診察による発見より先に起こるということを、長 期的なの研究によって示すことができる。実施例２： 本発明は免疫系により被験者の腫瘍の簡単かつ早期の初期スクリーニングまた は発見を提供する。腫瘍が成長するにつれて、免疫系への抑制効果はより強くな り、かくして抗体の能動分泌は非常に低くまたかろうじて検出可能でさえあると 考えられる。本発明は、抗体の産生がin vivoで抑制されても、腫瘍特異的抗体 の検出を可能にする免疫系の体液性アームの可能性を明らかにするものである。 従って、警告シグナルとして作用する。方法： 血液および組織サンプル（腫瘍）は同意の上、卵巣癌患者から採取した。その 患者はすべて手術を受けた女性であった。そこで適切な嚢胞性液を採取した。 全血、分離血漿およびPBMCを研究に用いた。細胞を4-6日間RPMI完全培地およ び1200アメリカヤマゴボウマイトジェン(PWM)とともに37 C CO2培養器で培地に 入れた。サンプルを後に、標準ペプチドELISA(1μg/ウエルペプチド、BSAにより 阻止された)を用いて抗ペプチドの抗体を試験した。結果： 結果はELISAのO.D.読み取り値として記載する。各マークまたは文字（h=健康 またはc=癌）は試験した１サンプルである。統計上の分析は95％信頼区間に基づ いている。 図１：P3-1次元分析 O.D.のサンプルの分類をするとc=癌、h=健康の２群となる。示されるように、 癌患者の間で、ペプチドに対してより高く、より特異的な感受性の傾向がある。 しかしながら、１次元分析は、このサイズのサンプルで癌を有している患者の指 標として十分であるようには思えない。 図２：P3およびP2-2次元分析 両ペプチドの１試験。コンピユータは正常（＝健康）サンプルを作り上げるこ とができた(x:.5;y:.52)(0.6-0.65O.D.の範囲にある3-5の公知な高い陽性の対照 を0.25-0.3O.D.の範囲にある3-5の公知な陰性サンプルの対照と共に試験した、 それは図２には示されていない)。そうすることにより、非常にわずかな癌サン プルだけが正常であると考えられ逆も成り立つ。 図3A-3B：P2、P1およびP3-2次元分析 研究されたサンプルを各々100以下のグループで実施した。２つの異なるペプ チドELISAの２次元分析を同一のサンプル組で実施した。p2およびp3の図3A、な らびにp1およびp3の図3Bは、明確な境界線でh=健康患者とc=癌患者とを分けるこ とを示す。境界線の右方の忠者はその中に免疫学的な側面により卵巣癌または乳 癌の徴候を示す人である。一方、境界線の左方の患者は患者が健康であることを 示す。p2およびp3、またはp1およびp3間のO.D.読み取り値の比率が診断を決定す る。 表2. ３次元線形分類の結果 表２は組合せた３種のペプチドの線形分類を示す。示されるように、統計上の 計算の両方法を用いる高い分解能がある。実施例３： 前立腺癌の早期発見 前立腺特異的腫瘍抗原(PSA)は、腫瘍増殖により著しく増加する。正常レベル での血清のPSAおよび腫瘍によりまたはそれが原因で産生されたPSA間の腫瘍抗原 的／腫瘍抗原差があるかどうかは明確ではない。（乳癌のMUC-1のような）他の 例に基づいて、かかる差があるであろう。それゆえ、それが前立腺癌患者の血清 からのPSA追跡治療に役立つであろう抗体の検出は、腫瘍抗原ペプチド／セグメ ントがそれを、または腫瘍の細胞系からの細胞を形成するよう使用されると考え られる。 新規な培養方法からの血清および上清をPSA特異的反応性に関して試験をする 。数人の患者の血清では、正常な対照の個体群より高い抗体レベルがあるが、そ れらのはるかに高い割合が培養液中に抗PSA抗体を有するであろうことが推測さ れる。 これらの腫瘍抗原が、細胞膜の発現に関する限りRNAウイルスについてより一 般的に見つけられても、ウイルスはウイルス(DNAおよびRNAの両方のウイルス)を 誘導する腫瘍から腫瘍抗原をコードしていた。 例えばウイルスエンベロープ糖タンパク質からのgp70（化学的に誘導された腫 瘍でも見つけられる）。精製されたgp70は腫瘍抗原として（または定義されたペ プチド／セグメントがそれを生成するように、または感染した細胞がそれを発現 するように）用いられる。新規方法の培養血清および上清をgp70特異的反応性に 関して試験をする。数人の患者の血清では、正常な対照の個体群より高い抗体レ ベルがあるが、それらのはるかに高い割合が培養液中に抗gp70抗体を有するであ ろうことが推測される。実施例４： 多様な腫瘍抗原アッセイ （数種の担体のタイプの）腫瘍抗原は培養（血液培養）のインキュベーション 期間の間、試験管内にある。腫瘍抗原の存在はおもに、「検出剤」および「結合 剤」（リガンド用の）として、培養液に存在する（また産生される）腫瘍抗原特 異的抗原に対して利用できる。それは同時に、試験管内で起こっている免疫プロ セスについて特異的なセグメントの特異的な興奮剤として利用することもできる 。 腫瘍抗原は培養中のいずれの時間点での血液採取（または細胞添加）または添 加より前に試験管内に存在するであろう。（かくして、それは培養日、時間また は分の間接触している。）腫瘍抗原は：1)培養液のレベル以上か、培養液のレベ ルか、または培養液のレベル以下のいずれかの試験管自体に付着（または結合） 可能：2)ニトロセルロース細片に結合可能：3)いずれの合成担体（あらゆる種類 のプラチック）に結合可能；4)ビーズ、微小球などに結合可能；5)「乾式化学」（ またはより厳密な「乾式免疫化学」系[閉鎖または開放]）の部分であり得る。前記 のものすべて（特にビーズ）の表面は平滑もしくは溝付であり、またはその表面 積を拡大する形状の任意の他の形であり得る。 腫瘍抗原は、前記のすべての担体に直接的に、または担体、「アーム」、およ び銀と「担体の」表面間に距離を置く他の方法によって結合される。腫瘍抗原は いずれの形態またはサイズ：試験管を取り囲む輪、線、点、＋の形、＋、Ｐまた はいずれの他の文字または形で、「担体」に用いることができる。 腫瘍抗原を、1種の与えられた濃度または数種の濃度で（不連続「部位」とし てまたは連続「部位」（または勾配）としてのいずれか）担体に付着させること ができる。1以上の腫瘍抗原が、1の試験管（もしくは担体、またはビーズ、ビー ズ群など）に用いられるように、腫瘍抗原はいくつかの腫瘍抗原であり得る。異 なる腫瘍抗原を（混合物として）同時に、もしくは群で、または個々に用いるこ とができる。1箇所以上に用いられる場合は、同一の形の印を用いて、または各 々の腫瘍抗原に異なるものを用いて使用することができる。 腫瘍抗原に結合する抗体の検出は、これまでに公知の（または後に見出される であろう）「発現」および検出システムのいずれによっても行うことができる。 発現試薬は初めから試験管内にあってもよいし、または後に添加してもよい。非 常に簡便な方法としては、培養期間の終了時、またはそれがすべて終了した後に 、発現工程が終了する。その発現は「タグ付き」抗体の直接結合か、または競合 アッセイのいずれかによる。「タグ」は酵素、金属、カラーコロイド、（または 蛍光物質、発光性物質）である。実施例5： アロ抗体： 輸血に関して非常に慎重な血液型適合の後でさえ、いくつかの小さな組織適合 性抗原に対して供与者が免疫応答を引き出すかもしれず、かくしてアロ抗体が産 生されるであろう。ほとんどの場合において、この事象は病理学的効果がない。 数人の患者において、応答が強く、供与者の血液の溶血現象を引き起こし、受容 者をより大きな危険にさらす。これらのアロ抗体は輸血後、数ケ月で消え、不適 切であった同一の各患者には次の血液適合を施す(2種の血液をin vitroで混合し 、逆効果を検出するが、抗体がそこになければ、2種の血液は適合性を表すであ ろう。)。その人がアロ抗体を産生する記憶を保有しているのであれば、これら はすぐに現れ、第2の輸血後、その男性／女性の生命を危険にさらして、すぐに 死に至らせるかもしれない。 新しい培養方法を用いて、受容者の血液の1サンプルを培養し、上清を提案さ れた血液ユニットとのその反応性の試験をし、かくして、溶解せず、またはin v ivoで他の障害を引き起こさないであろうユニットの選択を可能にする。実施例6： 移植された組織または器官が生き延びる可能性を増大させること、および受容 性のある２つのパラメーターにより順応することは平行して論じられる;1.免疫 系は移植に先立って抑制され、それに引き続く。2.組織を可能な限り最もよい方 法で適合させる。適合の２つの主要な方法：1.抗原的／構造的、すなわち多数の および少数の移植抗原が確認され、求められる最適な適合。2.生物学的／免疫学 的すなわちin vitroで試験する受容者の血液（またはその成分白血球および血漿 ）の供与者の細胞との反応。 免疫系の抗体レパートリーの多くは活性型ではなく、与えられた時間内に分泌 されないので、移植に対する潜在的体液性応答の多くは現在の方法では見ること はできない。新しい培養方法がこれらの抗体を明らかにし、培養上清または細胞 を供与者の細胞とともにin vitroで試験して、原形は予測され、備えられている ので、供与者の最終選択およびより強いin vivoでの拒絶反応に先立って危険を 明らかにすることが可能である。実施例7： H.PYLORIに対する抗体の検出 血清反応陽性の個体群の抗体型の正確な解釈は、主要抗原決定基エピトープの 適合を理解するのに重要である。抗原に向けられた個体群は通例 多くの抗原に対して一般的な体液性応答を増す。抗原暴露の早期検出、または暴 露の確認がこのアッセイに基づいて可能である。 ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)株は慢性Ｂ型胃炎と関連してお り、消化性潰瘍疾患で病因的役割を果たすと考えられる。さらに最近の証明では 胃癌の発生におけるヘリコバクター・ピロリに対する役割を示唆している。ヘリ コバクター・ピロリによる感染を検出する方法は、尿素呼吸検査の使用および免 疫蛍光、ラテックス凝集反応、および補体結合アッセイのような技術による患者 の血清における抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出を含む。しかしながら、最 も一般的に用いられる系は酵素結合免疫検定法(ELISA)に基づいたものである。 多くのELISA系は全細胞タンパク質抽出物（酸性グリシンまたは全細胞超音波破 壊物）から調製した抗原を用いる。 この細菌は多数の抗原／免疫原エピトープまたは構造を有する。全細菌、もし くはそのタンパク質のいくつか、炭水化物、ムチン、またはペプチドは抗体検出 に抗原として利用できる。最初に来国の患者から単離されたヘリコバクター・ピ ロリ株は、超音波破壊物により破裂させる。遠心分離後、試験抗原として上清を ため、平底のマイクロタイターウェル(Immulon-2，Dynatech Laboratorles，Ale xandria，Va.)上の0.05M炭酸塩バッファー(pH9.6)に入れる。 ヘリコバクター・ピロリに対する抗体は、酵素免疫アッセイ法によりIgG、IgA 、IgE、IgD、およびIgMの個々の評価が可能である。吸光度の読みは終点力価の 逆数に変換する。高分子量の細胞関連抗原調製物は、分子量400,000-700,000の 範囲の少なくとも２つのタンパク質を含む。かくして、ヘリコバクター・ピロリ に対する抗体（抗体群）を探すことは、全免疫原またはそれのセグメント（ペプ チド）を検出系および試験に抗原として用いるということを意味する。 ヘリコバクター・ピロリに対する抗体の存在は消化性潰瘍背景の徴候であり、 これはヘリコバクター・ピロリ感染の適切な治療法をもたらし、、かくして消化 器系統の粘膜ライニングの治療が可能となる。実施例8： HTLVの抗体の早期検出方法および物質： 血液銀行供与者からの、ヘパリンで凝結防止した血液サンプルをこの試験で使 用した。1ml.の血液を2ml.の完全培地およびマイトジェンと混合した。試験管を 37℃給湿CO2インキュベーターで培養した。培養液をウイルス-I特異的抗体の存 在について市販のELISAを用いて試験した。結果はO.D.読み取り値である。対照 のO.D.読み取り値は陰性:O.006、陽性;0.370であった。結果： 表1:HILV-1抗体の血清学対新試験 サンプル番号1、3、4、9および10は、HTLV-Iに対して血清反応陰性であったが 、ウイルスに対する抗体は培養後検出可能であった。アステリスク(*)により印 をつけたサンプルは、さらなる確認を行った（行われたカットオフは0.1000.D. であった）。実施例9： HCV暴露の特異的抗体の早期検出 血清反応陽性の個体群の抗体型の正確な解釈は、主要抗原決定基エピトープマ ッピングを理解するのに重要である。構造および非構造タンパク質の両方におい て、HCVゲノムによりコードされる非常に多数の免疫学的エピトープがある。感 染した個体群は通例多くの抗原に対して一般的な体液性免疫応答を増す；しかし ながら、持続的HCV感染からの回復を識別可能にする特異的抗体型は確認されて いない。いくつかの場合ではNS4(c-100-3)またはNS5抗原に対する抗体が最初に 産生するが、将来的に続く多くの急性感染した患者では、コア(c22-3)およびNS3 (c33-c)抗原に対する抗体が前に、他の抗原に対する抗体より高い力価で発現す る。いずれの血清変換型についても感染の結末を予測するということは示されて いない。主要抗原決定基エピトープはコア抗原(aa20ないし34)のN-末端内、およ びNS4領域(aa1712ないし1731)内で見つけ出されてきており、後者は組換え抗原( 各々Ｃ-22-3およびＣ-100-3)に対応している。すべてではないが、大部分の慢性 的に感染した患者は、E2/NS1遺伝子生成物(gp70)の超可変5'末端に対する抗体を 有する。 さらに、生検で証明された慢性肝炎が、見かけ上の急性自己制限Ｃ型肝炎患者 および正常なALTレベルを持続的に有している抗HCV陽性血液供与者の双方で報告 されている。輸血関連Ｃ型肝炎(TAH)ウイルスが抗HCV陰性血液受容者内に出現し ていること、インターフェロン治療下にあり、次いでインターフェロン投与中止 後ウイルス血症を再発した忠者の血清からHCV-RNAが常習的に減少していること 、および血清反応陰性の慢性Ｃ型肝炎患者の肝臓中にHCV-RNAが 見られることが報告されているが、これらはALTの正常化も、抗HCV抗体の消失も 、また血清HCV-RNAの消失も、完全な回復を必ずしも意味するものではないこと を示唆している。従って、大多数のHCV感染患者に持続的感染（活性または鎮静 期のいずれか）が起こり得ると考えられる。 HCV持続性の基礎をなすメカニズムは知られていないが、いくつかの観察は、H CVがその溶菌力を調節し、さらに宿主の免疫系による検出および排除を回避する 戦略の可能性を示唆している。HCVはDNA中間生成物を通じては複製しないので、 その持続性は宿主ゲノム中へのウイルスゲノムの組み込みによる潜伏期間の点か らは説明できない。 現在利用可能なHCV感染の診断法には、組換えタンパク質に基づく血清学的ア ッセイおよび／または合成ペプチドに基づく抗体捕捉アッセイ、血清または肝臓 におけるHCV-RNA配列の検出のための遺伝子増幅技術、ならびに組織におけるHCV 抗原またはHCV-RNA配列の検出のための免疫組織化学的技術および「insitu」ハイ ブリダイゼーション技術が含まれる。組織に基づく技術は発達の初期段階におけ るものであり、限られた数の研究施設でしか利用できない。HCV検出アッセイの Ｃ型肝炎の臨床経過との関係は図2-2に示されている。 第一世代抗HCVアッセイは、NS3のＣ末端の小部分に相当する単一の組換え抗原 (C-100-3)に対する抗体を検出し、ほとんどすべてのNS4遺伝子産物は酵母で融合 タンパク質として発現した。 最も広範囲に評価された２番目に作られた試験(EIA-2)は、C-33(NS3)およびC- 100-3(NS4)を含む、組換えタンパク質の組成を示す、コア組換えタンパク質C-22 -3に対する抗体および組換えタンパク質C-200に対する抗体を検出する。EIA-2は 急性の、輸血関連肝炎、または散発性NANB肝炎における血清変換速度を10ないし 20％まで速め、疾病の発症と血清変換の間の時間を平均８週間まで短縮し；70な いし80％の場合において、EIA-2は疾病の発症から４週間以内に抗ＨＣＶを検出 できる。 最も広範囲に評価された「確認アッセイ」は、第二世代組換えイムノブロット アッセイ(RIBA-2,Chiron Corporation,Emeryville,CA)である。このアッセイは 、２種のレベルのヒトIgGおよびスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)対照ととも に組換えHCVタンパク質5.1.1(NS4)、C-100-3(NS4)、C33-c(NS3)、およびC-22-3( コア）が別個のバンドとしてブロットされたニトロセルロースストリップチップ からなる。 ほぼ一致したIgM抗HCV応答がヌクレオキャプシド（コア）抗原に対して向けら れ、いくつかの場合では、活性型抗HCV血清変換の第1のマーカーとなる。 IgMの反応性はIgGに比べ寿命が短いが、それゆえ、IgM抗体はHCV感染の急性期マ ーカーとして使用できる。 異なるHCV単離物の構造および非構造コード領域の双方における配列の多様性 は、擬陰性PCR反応性を生じる結果となる。高度に保存された5'UTRに対して特異 的なプライマーを用いて、配列の異種性による失したウイルス血症を回避しなけ ればならない。感受性を増強するため、またハイブリダイゼーション工程を回避 するためにしばしば用いられるネスティッドPCR(nested PCR)(ネスティッドプラ イマーを用いるダブルOCR)の使用は、内在するコンタミネーションの危険性を大 幅に大きくし、期待される大きさの非特異的な増幅産物をもたらすと考えられる 。方法および材料 高リスクのHCV感染により追跡されている患者由来の、ヘパリンを添加した血 液サンプルをこの実験に用いた。1mlの血液を2mlの完全培地と混合し、マイトジ ェン(PWM)を加えた。試験管を37℃の加湿したCO2インキュベーター内で培養した 。ELISAキット(Minoliga)を用い、培養液をHCV特異的抗体の存在に関して試験し た。結果はO.D.読み取り値である。この試行のカットオフは0.392であった。研 究センターではそのカットオフ(-0.470)の少なくとも1.2であるものが陽性とみ なす。立体配座試験は、構造的および非構造的抗体に関するものであった(血清 においてのみ)。結果 ： 表２のサンプルはすべてＣ型肝炎ウイルスに関する高リスク群由来の被験体で ある。 抗体はすべてＣ型肝炎ウイルス特異的であった。 表２un=測定されず サンブル5319は、血清学を通じてより培養を通じての方がよりよく検出される 明確なサンプルである。カットオフは0.4O.D.に近かったので、サンプル5314も 培養後のみで明確に陽性である(これもまた確認)。ある試験において初期陽性ま たは境界線ELISAを有する患者集団においてさらに研究する。結果 表３ un=測定されず 立体配座は、血清中の構造および非構造タンパク質抗体試験を用いて行ったの みであった。サンプル5322、5325、5326は培養後にのみ陽性診断であった例であ る。実施例10： ELISPOT検出方法および材料 本発明では、特異的抗体を活発に分泌する細胞を検出し、計数し得るELISPOT などのような抗体検出系が考えられる。方法および材料 不活性化した全SIVを96ウェルプレート中のニトロセルロース膜に塗布した。S IVを洗い流し、膜を0.2％脱脂粉乳でブロッキングした。限界希釈で細胞をウェ ルに加え、６時間インキュベートした。このプレートをPBS-Tweenで５回すすぎ 、次いで抗体αヒトIgG（サルIgGとも結合する）と着色剤の非可溶性生成物を用 いて現像し、SIV特異的抗体（細胞より分泌）がウェル中のSIVと結合したところ のドットを視覚化した。倍率x4（またはx10）の下で青紫のスポットを計数した 。標準的な限界希釈法により、SIV特異的細胞の頻度および数を算出した。 この実験には、SIVのサイレントキャリヤーであることが既に確認されている すず色マンガベイザル（Sooty Mangabey Monkey）由来の、また、いくつかの陽 性および陰性対照由来の、ヘパリンを添加した血液サンプルを用いた。1mlの血 液を2mlの完全培地と混合した。各マイトジェンを別々の試験管で試験した。試 験管を37℃の加湿したCO2で培養した。粉砕、不活性化した全SIV粒子を抗原とし て用いる自家SIV ELISAキットを用い、培養液をSIV特異的抗体の存在に関して試 験した。結果はO.D.読み取り値である。結果： 表５ Ｂ細胞を分泌する抗SIV Igの頻度 活発に抗体を分泌するSIV特異的Ｂ細胞は、血清反応陽性のサルでしか検出で きない。 表６ 血清反応陰性のMangabeyザル由来のPWMとの培養物由来のELISPOTの ELISA力価との比較 サル番号１はSIVに関して真に陰性であった。（細胞は血清反応陰性のアカゲ ザルから採取した。）SIV特異的細胞は検出されなかった。 血清反応陰性のサルでは、それらが（サイレント）キャリヤーである場合でさ えも、SIV抗体産生細胞は検出できなかったが、培養後のELISPOTにより、SIVが 誘導したＢ細胞は検出できた。それらはまた、培養物中に検出可能な抗体を有し ている。「サイレントキャリヤー」におけるSIV特異的細胞の頻度および数は、 血清反応陽性のSIVキャリヤーにおけるものよりもずっと低い。実施例11： ウエスタンブロット検出 また、新規な方法を、検出方法としてウエスタンブロットとともに用いた。こ の研究からSIVおよびHIVに関して以下のことが示された：1.陽性血清サンプルは すべて培養後も陽性であった；2.培養期間によるバンドの消失はなかった；3.い くつかの血清反応陽性の場合では、培養段階により付加的バンドが生じた；4.EL ISA試験が陽性である血清反応陰性の高リスク個体（およびサル）では、主要なH IV（およびSIV）タンパク質のすべての明瞭なバンドが反応性を示した。 いくつかのサンプルはバンドに一部、通常はenvおよびコア（core）しか有して いなかった。実施例12： Ｂ型肝炎(HBV)の早期検出 in vivoにおいては、感染と抗体形成の間には、現在の診断試験（通常ELISA） の検出レベルまでには少なくとも数週間のウインドウ期間がある。新規な方法お よびキットを用い、血清／血漿および培養上清の双方での、HBV特異的抗体の存 在に関する集団のスクリーニング(ELISAを使用）により、血清反応陽性のすべ てが新規な方法によっても陽性であり(100％相対的特異性)、一方、血清反応陰 性サンプルのいくつかは新規な方法およびキットを用いては陽性であることを示 すものである。より後の時点では、これら新規な方法で示された陽性は、血清変 換し、ゆえにアッセイの真の特異性（擬陽性がサンプルの不一致をもたらすこと はない）ならびにその優れた感受性を明確に示すであろう。 感染の存在を証明する他の方法では、PCRなどを使用できる。 Ｂ型肝炎コア抗原（抗HBc）に対する抗体− 合衆国においては輸血されるす べての血液は抗HBcに関してスクリーニングされている。最初に非Ａ型非Ｂ型肝 炎に関する代用試験として導入されたが、それは今や、他のウイルス（HIVなど ）の潜在的キャリヤーを検出するための「ライフスタイル」指標として、また、 抗原陰性であるがなお感染しているまれなＢ型肝炎キャリヤー（抗HBc単独[抗Hb sは持たない]がＢ型肝炎を伝染させる可能性を持つことが示された）を検出する ための試験として用いられる。抗HBcに関する現在の試験法はELISAである。実施例13： HPVの早期検出 HPV感染の極めて早期の段階にある女性では、子宮頸部塗抹試験を用いては検 出できない可能性がある。試験する抗体の値はあまり鮮明ではないが、抗体が容 易に検出できるレベルで産生されていない場合でさえ、新規な方法は、新規な方 法およびキットを用いたスクリーニングならびに極めて早期の検出を試みる機会 を与えるものである。実施例14： サイトメガロウイルス(CMV)の早期検出 成人人口におけるCMV曝露に対する罹患率はかなり高く、必ずしもすべての血 液ユニットがCMVに関してスクリーニングされているわけではない。さらに、新 生児および免疫抑制個体（放射線療法もしくは化学療法中の癌患者、または組織 移植後の患者など）にCMVに冒された血液が与えられた場合、輸血感染後死に至 る可能性がある。従って、CMV陰性の血液だけをこれらの患者に与えることがで きるように、血液の40数％がCMVに関してスクリーニングされている。これらCMV 陰性ユニットのうちいくらかはCMVを伝播して死をもたらす。 CMV- ほとんどのサイトメガロウイルス(CMV)感染は無症状であるが、このウイ ルスは３つの主な病状を伴う：1.子宮内感染後の先天的欠陥；2.新生児感染と 死；3.免疫抑制宿主、特に骨髄移植を受けている宿主におけるCMV肺炎。合衆国 人口の約半数が感染しており、これら相当な人口が、健康であり抗体を有してい るとしても、なおウイルスを保持（潜伏）している。ウイルスは宿主内で種々の 条件の下で活性化し得る。CMVはまた、CMV陰性受容者に与えられた場合、輸血に よって伝染する。その臨床上の重要性のため、感受性のあるCMV陰性患者に与え られる輸血がしばしばCMVに対する抗体に関してスクリーニングされ、陽性であ るならば、そのようなユニットは輸血を控えられる。合衆国で輸血されるおそら く1/3のユニットがCMV抗体に関してスクリーニングされ、必要であれば十分なス トックのCMV陰性血液を利用できる。実施例15： 培養アッセイの「推定値」について。同じ期間の追跡調査中には血清変換しな い他の60を超える「サイレントキャリヤー」サルでは、培養後のO.D.読み取り値 はすべて陽性ではあるが低いものであった(アッセイの陰性対照の〜２倍)。図1A ないし1F。材料および方法 与えられた間隔（陽性誘導後最初の２ないし４ケ月については、１週間に１度 の培養抗体試験、もしそれまでに血清変換が起こらなければ、「サイレントキャ リヤー」とみなすことができ、以降は１ケ月に１度ほど。）での血清および培養 後抗体に関する試験。２回の連続測定で50％を上回ってO.D.読み取り値(または 比率)が上昇すれば(または１回では100%上昇)、近い将来血清変換が示される。考察 異なる時点（ｘ軸）で採取した培養血液サンプルのＳＩＶ特異的抗体について の一連のO.D.読み取り値(ｙ軸)。図1Bないし1Fは各々ｌ個体のサルを示す。これ ら血清変換の５例の他、他の60個体を超えるサル(Mangabey)を２年間追跡した。 それらのin vitroにおけるSIV抗体産生レベルは常に低い陽性に維持されていた 。これら60個体のうち追跡調査期間中に血清変換したものはなかった。in vitro におけるSIV抗体レベルが血清変換サンプルでしか上昇しないサルがさらに３個 体いた。SIV抗体レベルは血清変換に先立って顕著に、かつ、確実に上昇した。 このように意外に早く血清変換の月が推定される。 この推定の重要性はいくつかの因子から生じる：a)ウイルス（例えばHIV）に 対するTh1からTh2応答へのシフトは血清変換をもたらすだけでなく、将来に疾病 の後遺症をもたらす；b)血清変換プロセスでは通常、ウイルス複製の高まりが先 行する。従って、潜在的な前血清変換状態においては奨励されない抗ウイルス治 療は、その段階で非常に有効であろう(それは実際のところプロセスを転じるこ とが可能であり、血清変換を防ぐ)；c)前血清変換の時点での、体液アーム(humo ral arm)を抑制する、またはより長い無症候期、高まる感染に伴うより良好な複 写を与える免疫機構において血清反応陽性状態に入るように免疫バランスに対し て他の受益的効果を持ついくつかの治療法の使用が奨励され得る。図1Aないし1F は、培養後のELISAにおけるO.D.読み取り値のレベルが真の陰性、血清反応陽性 、およびサイレント感染／曝露の間で識別できることを示している。実施例16：ヒトにおける推定値のアッセイ 表７ 抗HIV Ab ELISA O.D. in vitro抗体産生(IVAP)試験では、被験者由来のHIV特異的抗体はGENELAVIAを 用いて検出し、さらにELAVIA（双方ともDiagnostic Pasteurによる）で確認した 。PCRは２つの異なる実験で行い、３分の１はISH（in situハイブリダイゼーシ ョン）で行なった。陽性の結果は３つすべてにおける陽性を意味する。 表６で示したように、培養細胞のO.D.（＝抗体レベル）の上昇が明瞭な陽性PC R試験を進める、すなわち感染負荷量の上昇を進める。HIV抗体の検出は２週間時 点で行う。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Whole blood / mitogen assays and kits for early detection of subjects with cancerBackground of the Invention   Currently available diagnostic tools for subjects with cancer include recombinant protein Quality-based assays and / or synthetic peptide-based antibody assays, genes Amplification techniques and the like. The present invention relates to the treatment of tumors in a subject via the immune system. Provides convenient early early screening or detection.   Cancer or tumor cells are found in the body (human and other known to have tumors). (Both with any animal) emerge from the "normal" cell flora. Canceration / tumor formation Involves cell changes. These changes begin as mutations in the cell's genetic code On the other hand, changes in cell behavior result from changes in protein expression levels. The tumor As it grows, it has an increasingly powerful effect on suppressing the immune system, Active antibody secretion may be greatly reduced or even barely detectable. You.   A structure specific to tumor cells is a "tumor antigen". Not specific to tumor cells Constructs that can be differentially expressed or overexpressed on some tumor cells are described as "tumor-associated It is considered a "run antigen". In some cases, it is the carbohydrate that determines its antigenicity A "coating" of a protein with a substance or lipid. For example, mums In the case of chin, the protein is not altered in tumor cells, but is (Focal cancer) patients will find antibodies to it. The reason is probably the sugar Heavy chain coating (ie, the protein is very tightly glycosylated) The protein in normal cells is not exposed at all. . Glycosylation is incomplete in tumor cells, and therefore new to the immune system Newly exposed protein sequence that functions (or can function) as a novel antigen Will be. The present invention is directed to the case where antibody production is suppressed in vivo. Enables the humoral arm of the immune system to enable detection of tumor-specific antibodies Clarify the performance.Summary of the Invention   The present invention provides a method for detecting a subject having cancer or infected with an oncogenic virus. For an improved assay. The present invention provides: 1) determining whether an individual has cancer; Diagnostics, 2) prognostic indicators, 3) efficacy of anti-cancer treatment (or new potential anti-cancer) Method for monitoring the effectiveness of drugs or anticancer drugs), 4) removal of tumors in subjects Or methods to determine recurrence after therapy, and 5) clinical laboratories and studies It is intended for use as a method for detecting and quantifying cancer in an in situ assay.   The present invention is directed to detecting a tumor in a subject or detecting a subject having a tumor or cancer. Useful as a screening assay to generate. Imaging and therapy Derived antibodies are used for method enhancement.   The present invention provides a method for detecting a tumor antigen-related antibody in a sample obtained from a subject. An in vitro method of a) obtaining a whole blood sample from said subject; The whole blood sump in a culture comprising a medium containing in the presence or absence of an antigen. And incubate the polyclonal cells of the lymphocytes to produce antibodies. And c) exposing the culture obtained in step b) to tumor antigens. Thereby forming an antigen-antibody immune complex, d) antigen-antibody immunization of step c) Detecting the complex, wherein the presence of the tumor-associated antibody indicates that the subject has cancer. And providing a method characterized by:BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Figure 1: P3-one-dimensional analysis   Figure 2: P3 and P2-two-dimensional analysis   Figures 3A-3B: P1 and P3, P2 and P3-two-dimensional analysis   Figures 4A-4F: Detection of SIV-specific antibodies in seronegative Mangabay. FIG. The level of O.D. reading on the LISA (post culture) is true negative, seropositive and " It is distinguishable between "asymptomatic infection / exposure". Figures 4B-4F show O.D. sumps. OD / OD negative control ratio.Detailed description of the invention   The present invention provides a method for detecting a subject having cancer or infected with an oncogenic virus. For an improved assay. The present invention provides: 1) determining whether an individual has cancer; Diagnostics, 2) prognostic indicators, 3) efficacy of anti-cancer treatment (or new potential anti-cancer) Method for monitoring the effectiveness of drugs or anticancer drugs), 4) removal of tumors in subjects Or methods to determine recurrence after therapy, and 5) clinical laboratories and studies It is intended for use as a method for detecting and quantifying cancer in an in situ assay.   The present invention provides a method for detecting a tumor antigen-related antibody in a sample obtained from a subject. An in vitro method of a) obtaining a whole blood sample from said subject; The whole blood sump in a culture comprising a medium containing in the presence or absence of an antigen. And incubate the polyclonal cells of the lymphocytes to produce antibodies. And c) exposing the culture obtained in step b) to tumor antigens. Thereby forming an antigen-antibody immune complex, d) antigen-antibody immunization of step c) Detecting the complex, wherein the presence of the tumor-associated antibody indicates that the subject has cancer. And providing a method characterized by:   In one embodiment, a sample of lymphocyte cells is obtained from a subject and the mitogen Containing the medium in the presence or absence of the antigen. Incubate for polyclonal and specific activation of lymphocyte cells. Induce. In another embodiment, a sample of lymphocyte cells is obtained from a subject, In culture, including media containing mitogen in the presence or absence of antigen The sample is incubated to allow polyclonal and characteristic B lymphocyte cells. Induces differential activation. In another embodiment, a sample of PBMC is Culture medium containing a mitogen in the presence or absence of an antigen. Incubate the sample in a sample to obtain polyclonal and B lymphocyte cells. And induces specific activation.   Types of cancer / tumor include myeloid leukemias, such as chronic myeloid leukemia, acute myeloid leukemia Disease, acute promyelocytic leukemia, acute monocytic leukemia, acute myelomonocytic leukemia; Lymphomas, such as Burkitt's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma; lymphocytic leukemia For example, acute lymphoblastic leukemia and chronic lymphoblastic leukemia; meningioma; adenoma Adenocarcinoma, eg, adenocarcinoma of the small cell lung, kidney, uterus, prostate, bladder, ovary, colon; sarcoma Liposarcoma, myxoid sarcoma, synovial membrane sarcoma, Ewing's tumor, vesicular sarcoma, will M Includes carcinoma, neuroblastoma, testicular dysgerminoma, retinoblastoma and melanoma However, the present invention is not limited to these.   The breast cancer used in the present invention may be any tumor derived from any type of tissue found in the breast. Means ulcer. Ovarian cancer used in the present invention may be derived from any type of tissue found in the ovary. Meaning any tumor to come. "Tumor antigen-related antibody" as defined in the present invention An antibody to an antigen or a tumor-associated antigen is meant.   In one embodiment, cells that produce a specific antibody are detected. Culture of step b) And exposing the supernatant to a tumor antigen, whereby the antigen-antibody immune complex Can be formed. Also, using the leukocyte or cell fraction of the culture Then, the antibody-producing cells to be detected are expanded, cloned, and immortalized.   In one embodiment, the tumor antigen comprises MUC-1, HERneu2, BrCal, p53, He r-2-c-neu (AcIISAVVGIL-NH2), carcinoembryonic antigen, prostate specific antigen, TAG-72, CA15 -3, CA549, BA46, breast serum antigen, mucinous carcinoma antigen, PEM peptide antigen, MUC1 glycosy Glycosylation site peptide, glycosylated MUC1 glycosylation site peptide, MUC1 A tandem repeat peptide, MUC2 core tandem repeat peptide, MUC3 core tandem repeat peptide, MUC5AC peptide, SIMA, Lewis X antigen, sialyl Lewis X antigen (BSA conjugation ), I antigen (Gall, 4, GlcNAc, 1,3 Gal-R), T antigen, TN antigen (OSM) sialyl T n antigens, but is not limited thereto. Antibodies are "naked" antigens Or the complex that it forms with the product of the transforming gene. It can be considered to be   Tumor antigens required for the detection of tumor-specific antibodies can be in several forms It is. That is, a) it is possible that all cells (of the tumor) can function as antigens B) cell membranes that give products that can be used as antigens; c) specific tumor structures Structure or protein sequence (or a segment thereof) Inserted into the producer (cells, bacteria, yeast, phage) and then the individual proteins and D) the amino acid of the tumor-specific protein If the acid is known, the peptide (or total protein Itself) can be biochemically synthesized and used as an antigen, e) serum or Alternatively, it can be isolated from other bodily fluids at a high titer.   Most induced or implanted laboratory animal tumors are Immunize the recipient against the bombardment but against transplantation of normal tissue or other tumors Does not immunize. TAA tends to have individually specific antigens that vary by tumor By a chemical carcinogen-induced tumor (and even tumors induced by the same carcinogen) Cross-reactivity between tumors induced by a given virus. It is particularly well demonstrated by virus-induced tumors that tend to show. Virus infection Stands for `` modified self '', the major histocompatibility complex. It may give rise to new antigens that are recognized together or in the context.   Tumor antigens contain (1) new genetic information introduced by the virus, (2) Activates active genetic material (possibly excluded during embryonic development) into oncogenes and activates cellular phenotype Genetic by carcinogens that are thought to be due to activation of proto-oncogenes Function modification, (3) the ability of tumor cells to synthesize membrane components (eg, sialic acid) Not normally present on normal cells or "buried in cell membranes" "Exposed" antigen, and (4) death of tumor cells, usually in cells Alternatively, it is formed by the release of antigens sequestered in the organelle.   Techniques for showing TATA in animal tumors include standard tissue transplantation methods, immunofluorescence Cytotoxicity test by dye uptake or release of radioisotope, from immunized donor In vitro or in vivo by exposing tumors to native lymphoid cells or serum o Inhibition of tumor growth, delayed-type hypersensitivity skin test, and lymph in vitro Includes sphere transformation.   Evidence for TAA in human malignancies has been reported in several tumors (eg, Burkitt). Lymphoma, neuroblastoma, melanoma, osteosarcoma, and some GI cancers) ing. Choriocarcinoma in women is a "tumor-specific" antigen when an immune response is elicited It has a tissue-matched antigen from the father that can function as a. Complete choriocarcinoma with chemotherapy Full healing may be due, at least in part, to such an immune response . Unfortunately, they may have TAA, but all human tumors Does not appear to be antigenic in the host.   Therefore, any structure that is considered novel to the immune system is considered a tumor antigen. Can be Normal proteins that emerge and function as novel antigens for the immune system Another common example of protein is a normal protein that appears in a novel environment (eg, , Embryonic proteins on mature (or adult) cells. In that case, the new The epitope is the boundary between those two structures (ie, the immune system finds it). (The boundaries that form new forms and structures that react and react).   Tumor-associated antigen (TAA) is an antigen associated with tumor cells and is also present on normal cells. A phase of a subjects that exists or is present in a small amount or different life) (ie, embryonic protein).   The present invention relates to a method for detecting a subject having a tumor, comprising the steps of: Obtaining a blood sample and b) culture containing mitogen in the presence or absence of antigen Incubating the whole blood sample in culture, including soil, leads to antibody production. C) induces polyclonal and specific activation of lymphocytes Treating the cells to recover the sequence, and d) converting the resulting nucleic acid sequence Specific to the nucleic acid sequence of the antibody produced by exposure to tumor antigens under Contact with a single-stranded labeled oligonucleotide primer capable of hybridizing to And e) detecting the presence of the amplification product indicating a subject having cancer. Provide a way to   The cell of step c) can be treated to expose the nucleic acid sequence of the cell . Exposure methods are known to those skilled in the art. Alternatively, the nucleus can be used to give a double-stranded amplification product. The nucleic acid sequence obtained in step d) by means of a primer pair hybridizing to the acid sequence Can be amplified. Amplification products are detectable.   In another embodiment, the end of the variable region under hybridization conditions   Bringing the obtained nucleic acid sequence capable of hybridizing to the nucleic acid sequence into contact with a primer; Perform specific detection. Primers and probes for tumor antigens and tumor-associated antibodies Blocks are known to those skilled in the art.   The present invention relates to a method for detecting a subject having a tumor, comprising the steps of: Obtaining a blood sample and b) culture containing mitogen in the presence or absence of antigen Incubating the whole blood sample in culture, including soil, leads to antibody production. C) induces polyclonal and specific activation of lymphocytes Treating the cells to collect the rows separately, and d) combining the resulting nucleic acid sequences into multiple single chain Labeled oligonucleotide primer pairs (each pair described above were exposed to tumor antigens) Specifically hybridized under hybridization conditions to the nucleic acid sequence of the antibody produced Has the ability to hybridize) and e) the primer pair hybridizes Amplifying any of the nucleic acid sequences to obtain a double-stranded amplification product, f) any of the foregoing Processing the double-stranded amplification product to obtain a single-stranded nucleic acid sequence therefrom; The single-stranded nucleic acid sequence to the tumor antigen-related antibody under hybridization conditions. Contacting with a specifically hybridizable labeled oligonucleotide probe, h ) Specific formation of a complex with any of the obtained hybrids with the labeled probe Detectable (if the probe is present in the complex under complex forming conditions) Contact with an attached tag and i) indicate the subject with cancer Providing a method comprising detecting the presence of any of the complexes.   In the present invention, the incubation with the mitogen in the presence or absence of the antigen is performed. As a buffy coat (with varying volumes of red blood cells and plasma) Also collects a known boundary layer, thereby saving a portion of the leukocyte-rich blood sample volume. Add into culture. Methods for enriching leukocytes are known to those skilled in the art. For example, in a tube The buffy coat as the middle layer of the It is possible to remove most and then collect the buffy coat with the remaining plasma is there. Alternatively, lyse red blood cells, centrifuge, and collect white blood cells from the bottom .   In one embodiment, the method comprises: a) obtaining a whole blood sample from the subject; Separating the blood sample into a plurality of component layers, including a boundary layer, c) separating the blood sample from the whole blood sample; A medium containing the boundary layer and containing d) mitogen in the presence or absence of antigen Incubating the boundary layer in culture, including Induces polyclonal and specific activation of sphere cells, obtained in step e) e) Exposing the cultured culture to an antigen, thereby forming an antigen-antibody immune complex; And e) detecting the antigen-antibody immune complex of step e). The presence of the body indicates a subject that has been exposed to the antigen.   In one embodiment, the method comprises: a) obtaining a whole blood sample from a subject; Separating the sample into a plurality of component layers, including a boundary layer, c) removing the boundary layer from the whole blood sample; Collecting the media and d) a medium containing the mitogen in the presence or absence of the antigen. Including Incubating the boundary layer in culture to obtain a polyclonal B lymphocyte cell Induces specific and specific activation and virus propagation, e) separates nucleic acid sequences F) treating the resulting nucleic acid sequence with a plurality of single-stranded labeled oligonucleotides. Ligonucleotide primer pairs (each pair described above hybridizes to the human immunodeficiency virus). Has the ability to specifically hybridize under rehydration conditions) G) amplify any nucleic acid sequence to which the primer pair hybridizes; H) double stranded amplification of any of the above to obtain a single stranded amplification product The width product is processed to characterize human immunodeficiency virus under hybridization conditions. Single-stranded nuclei with differentially hybridizable labeled oligonucleotide probes An acid sequence is obtained, and j) any of the obtained hybrids is complexed with the labeled probe. (The probe is present in the complex under complexing conditions). Contact) a detectably attached tag, and k) a human immunodeficiency virus Detecting the presence of any of the resulting complexes indicating the presence of   The present invention provides a method for detecting a tumor antigen-related antibody, comprising the steps of: Obtaining a whole blood sample, b) containing mitogen in the presence or absence of antigen Incubating the whole blood sample in culture, including medium, leads to antibody production. Induces polyclonal and specific activation of lymphoid cells which c. Exposing the cells to collect the nucleic acid sequence of the tumor antigen-related antibody separately; Reverse transcription of the RNA of the tumor antigen-related antibody in the cell to obtain a DNA copy, and e) Performing a remelase chain reaction amplification to obtain a plurality of DNA copies; Is hybridized to a plurality of complementary DNA probes to determine the DNA content of the sample. And thereby detecting a tumor antigen-related antibody. .   The present invention provides a method for amplifying a target RNA sequence in a sample, the method comprising: A whole blood sample from an individual and b) containing the mitogen in the presence or absence of the antigen. Incubating the whole blood sample in culture, including medium having Induces polyclonal and specific activation of lymphocyte cells that lead to c A) exposing the cells to separately recover the nucleic acid sequences of the tumor antigen-related antibody; 1 and 2 primers (1st primer hybridizes to target RNA Initiate the synthesis of a cDNA sequence complementary to the target RNA to an extent sufficient to soy. A second primer that is complementary to the target RNA to an extent sufficient to initiate Initiates the synthesis of extension products to an extent sufficient to hybridize to the cDNA. Homologous to the target RNA to an extent sufficient to initiate Appropriate polymerase in the presence of all four deoxyribonucleoside triphosphates In the reaction mixture contained in a buffer (the buffer contains Mn + 2) A polymerase initiates the synthesis of the extension product of the first primer and is complementary to the target RNA Treating the sample at a temperature sufficient to provide a complete cDNA sequence; At a suitable temperature to obtain a single-stranded cDNA, and f) the heat-resistant DNA polymerase Treat the reaction mixture at a suitable temperature to initiate the synthesis of primer extension products To obtain a double-stranded cDNA sequence, and g) the double-stranded cDNA sequence of step e) A method comprising amplifying by a chain reaction is provided. In the preferred embodiment The buffer is manganese acetate (Mn (OAc)TwoOr Mn (CHThreeCOTwo)Two(Also expressed as) , Bicine-KOH (bicine is N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine) and potassium acetate Li (KOAc or KCHThreeCOTwoAlso represented).   The present invention also provides that at least one A labeling method comprising attaching or incorporating a label is contemplated. The sign is one Generally, it is intended to facilitate the detection of tumor antigens. Labels include enzymes, fluorophores, High affinity conjugates, chemiphores and radioactive atoms ("radioactivity" Label "). Although other signs can be used, The invention relates to 1) the enzymes alkaline phosphatase, β-galactosidase and glucose Soxidase, 2) Biotin-avidin affinity conjugate system, 3) Fluo A fluorophore which is a restain, 4) a chemiphor which is a luminol, and 5) a preferred release. Is a radioactive signThreeH,14C and32Intended P.   The present invention relates to a method for detecting a subject having a tumor, comprising the steps of: Obtaining a blood sample and b) culture containing mitogen in the presence or absence of antigen Incubating the whole blood sample in culture, including soil, leads to antibody production. Induces polyclonal and specific activation of lymphoid cells, c) step b) Exposing the culture obtained in step 1 to a specific tumor antigen-related antibody, Forming an original immune complex, and detecting the antibody-tumor antigen immune complex in step d) d) The presence of a tumor antigen-related antibody in the presence of ovarian or breast cancer And providing a method characterized by:   In one embodiment, a supernatant is obtained by the culture of step b), and the supernatant is Exposure to a proto-associated antibody, thereby forming an antibody-tumor antigen immune complex.   The present invention provides a kit for detecting a specific tumor antigen-related antibody from a subject. Thus, the kit comprises a container for collecting a whole blood sample, wherein the container comprises: Literature leading to assays for antibody production and detection of the specific tumor antigen-related antibody Effective mimics to induce polyclonal and specific activation of lymphocyte cells Characterized by containing a medium containing togen in the presence or absence of an antigen Illustrated.   In one embodiment, a sample of white blood cells is obtained from a subject and the mitogen Containing the medium in the presence or absence of the antigen. Incubate for polyclonal and specific activation of lymphocyte cells. Induce. In another embodiment, a sample of lymphocyte cells is obtained from a subject. A culture medium containing a mitogen in the presence or absence of an antigen. Incubate the sample with polyclonal and B lymphocyte cells. Induce specific activation. In another embodiment, a sample of PBMC is A medium containing the mitogen in the presence or absence of the antigen, Incubating the sample in culture to obtain polyclonal B lymphocyte cells Induces specific and specific activation. Binding one or more antigens to the container It is possible to   In the present invention, an effective concentration of mitogen (for example, in the presence or absence of an antigen) Pokeweed mitogen and related tumor antigens and peptides) Place a blood sample in a test tube containing the solution (eg, a vacutube). Add. The blood sample to be tested is in the presence of American pokeweed mitogen. , Culture in vitro. Instead of or in addition to the American pokeweed mitogen B lymphocyte cells or other activities of the humoral system that result in the production or secretion of antibodies And ThTwoAchieve the same function using activators of the immune response Can be. After incubation, an aliquot was removed from the liquid and The desired tumor antigen can be obtained by standard ELISA and / or Western blot analysis. Assay for the presence of the relevant antibody. If you want to assay the sample at a later date If so, the blood can be centrifuged, the supernatant fluid collected, frozen, and stored. The results can be confirmed using polymerase chain reaction (PCR) / FACS technology. You. The cell fraction in the container can be used in PCR or ELISPOT. Other methods for detecting antibodies are known to those skilled in the art.   The method of the present invention is performed as necessary so that the presence of a tumor antigen-related antibody can be determined. Separating blood cells from the fluid portion of blood. From the fluid part of the blood Separation of blood cells can be accomplished by several methods well known to those skilled in the art (eg, centrifugation). Separation, filtration or density gradient). Blood cells It should be understood that physical separation from the liquid is not necessary. After incubating whole blood with mitogen in the presence or absence of antigen Fluids from blood can be easily extracted and tested for tumor antigen-related antibodies. Wear. If necessary, by gentle osmotic shock or with mild detergent Red blood cells can be lysed. In this case, the leukocytes are still viable is there.   In one embodiment of the present invention, the medium and mycelium in the presence or absence of antigen are Collect whole blood in a blood collection tube containing togen. The blood sample was then 2 × 10 with American pokeweed mitogen at a final dilution of 1: 5006Pcs / ml 7% CO in viable lymphocyte concentrationTwoIncubate at 37 ° C for 1-12 days in a humidified atmosphere To It is possible to centrifuge the blood and immediately collect the supernatant fluid, Assay within ~ 12 hours or ELISA / ELISPOT and / or Wester It is later frozen to test for reactive specific antibodies by immunoblotting. Another An aliquot of liquid or cells or cell components may be taken directly from the sample. Can be taken.   The present invention also includes an effective concentration of a mitogen in the presence or absence of an antigen. And a kit comprising a blood collection container. The container may contain a medium as needed. May be included. The preferred container is a test tube. The blood collection container is plastic, It can be glass or any other material suitable for blood culture. The present invention Are blood-containing means other than blood collection tubes (for example, Microtiter plate, tissue culture flask, glass flask containing gel , Ehrenmeyer flasks and any other vessels in which blood can be cultured. But not limited to these).   Tumor antigen-related antibodies that specifically bind to a specific tumor antigen are known to those of skill in the art. . Furthermore, an antibody can be used as a tag for binding to the tumor antigen. Wear. In one embodiment, the antibodies are monoclonal antibodies. Another fruit In embodiments, the antibodies are polyclonal antibodies.   The present invention relates to a peptide having the amino acid sequence SGSGHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 1). Providing an isolated nucleic acid molecule to be loaded. The present invention relates to the amino acid sequence SGSGAPDTRPAP Providing an isolated nucleic acid molecule encoding a peptide having GSTAP (SEQ ID NO: 2) You. The invention encodes a peptide having the amino acid sequence IISAVVGIL (SEQ ID NO: 3) To provide an isolated nucleic acid molecule. The invention relates to nucleic acids for binding to surfaces. Provide the above tag.   The present invention specifically hybridizes to the sequence of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3. Provided is a nucleic acid sequence of at least 15 nucleotides.   The present invention relates to the peptide SGSGHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 1), SGSGAPDTRPAPGSTAP (sequence No. 2) or IISAVVGIL (SEQ ID NO: 3). One implementation In some embodiments, the antibodies can be monoclonal or polyclonal. You. The antibody can have a tag. In another embodiment, The present invention provides a ligand that binds to the peptide.   The present invention also provides an imaging agent having the ability to bind to the cell surface of a cancer cell. At least one of the labeled antibodies against the peptide of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 One, under conditions that form a complex between the monoclonal antibody and the cell surface antigen, Imaging ovarian or breast cancer in a subject comprising administering to the subject Provide a way to The present invention further provides an effective image of an antibody against the peptide. Compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a pharmaceutically acceptable carrier. The peptide Knowledge of antibodies to sequences can be used in therapy, ie, immunotoxin therapy, or in vitro diagnostics. Diagnostic use, ie, immunohistochemistry, or in vivo diagnostic use, ie, by toxin Useful for radiolabeling for targeting.   The kit specifically reacts with a tumor antigen or an immunoreactive fragment thereof. The presence of a tumor antigen-related antibody can be detected. This kit is attached to the substrate A combined tumor antigen, a secondary tumor antigen reactive with the antibody and a secondary tumor antigen A reagent for detecting a reaction with the body can be included. Such kits are available from ELISA The kit can be an antibody capture assay kit, such as a kit, and the substrate, And secondary antibodies, as well as others such as detectable components, enzyme substrates and chromogenic reagents. May be included. Alternatively, antibody capture diagnostic kits are generally An immunoblot kit comprising the components and reagents described herein. No. Certain reagents and other components included in the diagnostic kits of the present invention are Choose from those available in the industry for the particular diagnostic method being performed Can be. Such kits include pre- and post-culture tissues and body fluids obtained from a subject. It can be used to detect antibodies in biological samples.   In the present invention, the following container is used for polyclonal and specific lymphocyte induction leading to antibody production. Mitogen, with or without antigen, effective to induce selective activation From a subject, comprising a vacuum-tight container for collecting a whole blood sample, including the containing medium. Kit for detecting specific tumor antigen-related antibodies of the invention, and one or more tumor-associated antibodies An assay for detecting antibodies is provided.   In the present invention, the detection of the reaction between a ligand and a tumor antigen is, where appropriate, Reacts specifically with an epitope or non-specifically with a ligand or reactive antibody This is further facilitated by the use of a reactive secondary antibody or other ligand.   The invention includes the steps of: a) obtaining a whole blood sample from a subject; b) Contains or contains an antigen that induces polyclonal and specific activation of the sphere Incubating in the medium in the presence of a mitogen-free medium; c) phosphorus Obtaining a nucleic acid sequence derived from the papule; d) combining the nucleic acid sequence with the isolated DNA specifically. To a labeled nucleic acid sequence of at least 15 nucleotides capable of hybridizing, Contacting under hybridizing conditions; e) detecting the hybridized nucleic acid sequence Measuring the presence (its presence is indicative of a tumor antigen-related antibody in the subject) Thus, a method of diagnosing a subject for cancer, comprising diagnosing the subject, provide.   In one embodiment, the DNA sequence from the tumor antigen-related antibody is amplified before step (b) You. In another embodiment, PCR is used to amplify the nucleic acid sequence. How to amplify nucleic acid sequences It is known to those skilled in the art.   Tumor antigen-related antibody substance screening to determine whether a drug can be used Assays are contemplated in the present invention. Such assays include whole blood, B cells Mitogens and tumors with or without antigen, such as lymphocytes or PBMCs Incubating with an antigen-related antibody drug, wherein the cells are tumor antigens. Assess whether to express relevant antibodies and then determine the effect of the compound on the activity of such drugs Determine the effect.   The present invention relates to an improved assay for detecting a subject exposed to an antigen. The invention includes 1) a diagnosis to determine whether an individual has been exposed to an antigen, 2) a prognosis Symptom indicator, 3) Effectiveness of anti-antigen therapy or availability of new anti-antigen drugs It is intended for use as a method of monitoring efficacy.   The present invention provides an antibody against an antigen in a sample obtained from a subject comprising the steps of: A method for in vitro detection of the body is provided. That is, a) obtaining a whole blood sample from a subject B) polyclonal and specific lymphocyte lymphocyte induction leading to antibody production Of mitogen in media with or without antigen, which induces selective activation C) exposing the culture resulting from step b) to the antigen; Forming an antigen-antibody immune complex; d) antigen-antibody immunization of step c) Detects the complex and the presence of a specific antigen-antibody indicates that the subject has been exposed to the antigen Each of the steps.   In one embodiment, a sample of leukocytes is obtained from a subject and the polymorph of B lymphocytes is obtained. With or without antigen to induce clonal and specific activation And incubated in culture in the presence of a medium containing fresh mitogen. Other fruit In embodiments, a sample of lymphocytes is obtained from a subject and the polyclonal Mitogen with or without antigen, which induces specific and specific activation And incubated in culture in the presence of a medium containing In another embodiment, the PB A sample of MC is obtained from the subject and the polyclonal and specific activity of B lymphocytes Media containing mitogen with or without antigen to induce Incubate in culture in the presence.   In one embodiment, cells that produce a specific antibody are detected. In another embodiment The culture of step b) results in a supernatant, which is exposed to antigen, Allow the epidemic complex to form. In another embodiment, the cell fraction of the culture is used. other In embodiments, leukocytes are used.   The invention further comprises detecting a subject exposed to the antigen, comprising: Provide a way. A) obtaining a whole blood sample from a subject; b) obtaining a whole blood sample. Pull induces polyclonal and specific activation of lymphocytes leading to antibody production Cultivation in the presence of a mitogen-containing medium with or without antigen Incubating down; c) treating cells to recover nucleic acid sequences D) the nucleus of an antibody produced as a result of exposing the resulting nucleic acid sequence to an antigen. Single-stranded label, a primer capable of specifically hybridizing to an acid sequence Oligonucleotide primer under hybridizing conditions. And e) detecting the presence of the amplification product, the presence of which is indicative of the presence of the antigen. A process.   The cells of step c) are treated to expose the nucleic acid sequence of the cells. The exposure method is , Known to those skilled in the art. Alternatively, the nucleic acid sequence obtained in step d) is Amplification is performed with a pair of hybridizing primers to obtain a double-stranded amplification product. Amplification products can also be detected.   In other embodiments, the ability to hybridize to the nucleic acid sequence at the end of the variable region The primer is brought into contact with the obtained nucleic acid sequence under conditions that hybridize to Detection.   The present invention also provides a method for detecting a subject exposed to an antigen, comprising the steps of: It also provides the law. A) obtaining a whole blood sample from a subject; b) a whole blood sump. Induces polyclonal and specific activation of lymphocytes leading to antibody production Culturing in the presence of a medium containing mitogen with or without antigen C) treating the cells to recover nucleic acid sequences separately D) specifically hybridizing the obtained nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence, respectively. Pairs of single-stranded labeled oligonucleotide primers Contact under bridging conditions; e) a pair of primers hybrid A) amplifying any nucleic acid sequence to obtain a double stranded amplification product; f) such a double stranded Processing any of the amplification products and obtaining a single-stranded nucleic acid sequence therefrom; g) resulting The single-stranded nucleic acid sequence differs from the nucleic acid sequence of the antibody produced as a result of exposure to the antigen. A labeled oligonucleotide probe capable of hybridizing differently, Contacting under hybridizing conditions; h) isolating the resulting hybrid When a labeled probe is present in a complex, a complex is formed specifically with the probe Contact with a detectably marked tag capable of binding under complexing conditions And i) detecting the presence of any of the resulting complexes and determining the presence of Each step is indicative of its presence.   An “antigen” is not limited to immunogens, allergens, carcinogens, alloantigens Progenitor, self antigen (autoantigen), cancer antigen, cancer-related antigen, transplantation antigen, blood group antigen, Contains contaminants. All antigens as defined herein elicit an immune response. I Thus, searching for the antibody (s) against the antigen is a matter of detection system and assay. To use whole or segments (peptides) as antigens for experiments To taste.   Antigens include proteins, peptides, fragments, dissociates, Lipoproteins; glycoproteins and glycolipids (both for example bacterial walls, Carbohydrates such as blood group antigens and myeloma structures); oligosaccharides / Polysaccharides; lipids / fats; haptens; and TNP (trinitrophenyl), benzene Chemicals such as benzene arsenate and non-organic compounds May be.   Helicobacter pylori is responsible for most peptic ulcers. Bacteria suggested as the cause. This bacterium has many antigens / antigen epitopes or Has a structure. Whole bacteria, or their proteins, carbohydrates, mucins, or Some of the peptides can be antigens for antibody detection.   The present invention also provides a) obtaining a whole blood sample from a subject; Antigens that induce polyclonal and specific activation of lymphocytes leading to body production Incubate in culture in the presence of medium with or without mitogen C) separately recovering the nucleic acid sequence of the antibody resulting from exposure to the antigen Treating the cells as follows; d) all four deoxyribonucleoside triads. In the presence of acid, Mn+2Thermostable DNA polymerase in a suitable buffer containing Starts synthesis of extension product of the first primer and gives cDNA sequence complementary to target RNA At a temperature sufficient to obtain the first and second primers (the first primer CDNA sequence synthesis that is sufficiently complementary, hybridizes with it, and is complementary to the target RNA And the second primer is sufficiently homologous to the target RNA and hybridizes with the cDNA. And start the synthesis of extension products) and a mixture of thermostable DNA polymerases Processing the sample in a reaction mixture comprising: e) combining the reaction mixture with one Treating at a temperature appropriate to give strand cDNA; f) allowing the reaction mixture to Rimerase initiates the synthesis of the extension product of the second primer to give a double-stranded cDNA sequence. And g) removing the double-stranded cDNA sequence of step e) A target RNA sequence in a sample comprising amplifying by a merase chain reaction Also provided is a method of amplifying A. In a preferred embodiment, the buffer is manganese acetate (Or Mn (OAc)TwoOr Mn (CHThreeCOTwo)Two)), Bishine-KOH (Bishine is N, N- Bis (2-hydroxyethyl) glycine), and potassium acetate (or KOAc Or KCHTwoCOTwoAlso referred to as).   The present invention relates to a lymphocyte polymorphism that leads to antibody production for collecting whole blood samples. Contains or contains an antigen effective to induce local and specific activation An antigen from a subject comprising a container containing a medium containing mitogens Kit for detecting specific antibodies resulting from exposure to Assays for the detection of specific antibodies resulting therefrom. The container is a whole blood sump Can be a vacuum-sealed container for collecting antibodies, and the polymorph of lymphocytes that leads to antibody production. Contains an antigen or is effective to induce clonal and specific activation Includes mitogen-free media. One or more antigens in the container Can be combined.   According to the present invention, whole blood samples are Bakuu containing a solution of an effective concentration of mitogen such as burdock mitogen Aspirate into a test tube such as a tube. Whole blood samples to be tested Culture in vitro in the presence of burdock mitogen. To achieve the same function , Instead of or in addition to the American pokeweed mitogen, produce antibodies or Th leads to secretionTwoActivators of other B lymphocytes that activate type I immune responses or Body fluid systems can be used. After incubation, remove aliquots from the culture And then using standard ELISA techniques and / or Western blot analysis, Assay for the presence of the desired antigen. If you want to assay the sample at a later date, The solution is centrifuged, the supernatant is collected, frozen and stored. The result is any other detection technology May be obtained using. The cell fraction can be used with PCR and ELISPOT.   The method of the present invention optionally involves separating blood cells from the fluid portion of the blood to determine the presence of the antibody. Including releasing. Separation of blood cells from the blood stream can be performed by centrifugation, filtration or density This can be done by any of several methods known to those skilled in the art, including gradients. It should be understood that the blood cells need not be physically separated from the fluid. antigen After incubation with whole blood with and without mitogen, From which the antibody can be easily tested. Optionally, mild red blood cells Can be dissolved by either mild osmotic shock or mild surfactant You. In this way, the leukocytes remain viable.   Antigens that specifically bind to a particular antibody are known to those of skill in the art. In addition, antibodies May be used as a tag to bind to the original. In one embodiment, the antibody is monoclonal Null antibody. In other embodiments, the antibodies are polyclonal antibodies.   Other methods for immunoenzymatically detecting the presence of specific antibodies to one or more antigens Is a Western blot. Antigen is separated by electrophoresis and nitrocellulose Transfer to a membrane or other suitable support. Then the solution to be tested is brought into contact with the membrane The presence of the immune complex formed is detected by the method already described. Of this method In a variant, the purified antigen is applied as a line or spot on the membrane and allowed to bind. So Afterwards, the membrane is brought into contact with the body fluid to be tested before and after the culturing and the immune complex formed Is detected using the technique described above.   The invention includes the steps of: a) obtaining a whole blood sample from a subject; b) May contain antigens to induce polyclonal and specific activation of papocytes Incubated in culture in the presence of mitogen-free medium C) obtaining the nucleic acid sequence from the lymphocytes; d) combining the nucleic acid sequence with the isolated DNA. A labeled nucleus of at least 15 nucleotides capable of specifically hybridizing Contacting the acid sequence under hybridizing conditions; e) hybridized Measuring the presence of the nucleic acid sequence, the presence of which is indicative of the subject's exposure to the antigen; Diagnosing a subject exposed to an antigen, comprising diagnosing the subject I will provide a.   In the above method, size fractionation performed by polyacrylamide gel may be used. . In one embodiment, size fractionation is performed on an agarose gel. In addition, DNA fragments Transfer to a solid matrix can be performed before the hybridization step. Good. One example of such a solid matrix is nitrocellulose paper.   A method to detect specific antibodies produced as a result of infection or exposure to an antigen PCR and / or blot hybridization is used. Detection The presence or absence of antigenic substances for prediction, or risk assessment of antigens Transfer, solution hybridization or non-radioactive detection systems And all are well known to those skilled in the art. Hybridization probe Done using The presence of pathogenic substances can be determined by visualizing the hybridized parts. Sexual measurement is possible.   The present invention provides an antigenic substance screening assay for determining whether a drug can be used. I intend. Such assays include whole blood, lymphocytes such as B cells, or P Incubate BMC with mitogen with or without antigen and antigen drug. Assess whether the cell expresses the antigen and then affect the activity of such substances Determining the effect of the compound.   The present invention relates to an improved assay for detecting a subject infected with a virus. Departure Ming is; 1) diagnosis to determine if an individual is infected with the virus, 2) prognostic signs Indicators, and 3) the effectiveness of antiviral therapy (or potentially new antiviral (The effectiveness of a drug or agent).   The present invention provides a method for combating a virus in a sample obtained from a subject, comprising the steps of: The present invention provides a method for detecting antibodies in vitro. That is, a) a whole blood sample from a subject B) obtaining a whole blood sample from the polyclonal and lymphocyte lymphocytes leading to antibody production. Mitogen-containing medium with or without antigen, which induces specific activation C) incubating the culture obtained in step b) with a virus Exposing the antigen to form an antigen-antibody immune complex; d) step c). Antigen-antibody immune complex, and the presence of virus-specific antibodies Each step, which indicates exposure to heat.   In one embodiment, cells that produce a specific antibody are detected. Culture of step b) From the product, exposing the supernatant to viral antigens, thereby allowing antigen-antibody immunization. A complex can be formed. Also use leukocytes or cell fraction of culture You can also.   The invention further comprises detecting a subject exposed to the virus, comprising: Provide a way to A) obtaining a whole blood sample from a subject; b) whole blood Induces polyclonal and specific activation of lymphocytes leading to antibody production In the presence of a medium containing mitogens with or without antigen Incubating in culture; c) treating cells to recover nucleic acid sequences D) producing the resulting nucleic acid sequence as a result of exposure to a virus One primer that has the ability to specifically hybridize with the nucleic acid sequence of the antibody Contact with strand-labeled oligonucleotide primers under hybridizing conditions E) detecting the presence of the amplification product, and its presence is indicative of the presence of the virus. It comprises each step.   The cell of step c) is treated so as to expose the nucleic acid sequence of the cell. How to expose Methods are known to those skilled in the art. Alternatively, the nucleic acid sequence obtained in step d) is Amplify with a pair of primers that hybridize with the molecule Obtainable. The amplification product may be detectable.   In other embodiments, the ability to hybridize to the nucleic acid sequence at the end of the variable region The primer is brought into contact with the obtained nucleic acid sequence under hybridizing conditions, Detect specifically.   The present invention provides a method for detecting a subject infected with a virus, comprising the following steps: I will provide a. A) obtaining a whole blood sample from a subject; b) a whole blood sample Induce polyclonal and specific activation of lymphocytes leading to antibody production, In culture in the presence of a medium containing mitogen with or without antigen Incubating; c) treating cells to separately recover nucleic acid sequences D) converting the resulting nucleic acid sequence into an antibody produced as a result of exposure to a virus. Pairs of single-stranded labels each capable of specifically hybridizing with the nucleic acid sequence of Contact with the identified oligonucleotide primer under hybridizing conditions. E) amplifying any of the nucleic acid sequences to which the pair of primers hybridizes; Obtaining a double-stranded amplification product; f) treating any of such double-stranded amplification products Obtaining a single-stranded nucleic acid sequence therefrom; g) replacing any of the resulting single-stranded nucleic acid sequences with: Labeled oligonucleotides capable of specifically hybridizing with such virus antibodies Contacting with a nucleotide probe under hybridizing conditions; h) occurring Any of the hybrids that have been labeled when a labeled probe is present in such a complex. A detectably marked tag capable of specifically forming a complex with the probe And complexing conditions; and i) detecting the presence of the resulting complex And the presence is indicative of the presence of the virus.   Viral antigens required for the detection of virus-specific antibodies can exist in various forms. A) whole virus or inactivated virus that may be dissociated (sonication) , Homogenization, dissociation by detergents, enzymes; products in groups or individually C) viral sequence (or a segment thereof) Can be inserted into other producers (cells, bacteria, yeast phage) by vector Then individual proteins and structures are produced; d) Tide fragments (both naked and glycosylated or conjugated to lipids, especially Fixed peptide alone or large or various particles / objects / cells / carriers / surfaces (Constrained / bound / linked / part / expressed) are biochemically And can be used as an antigen; e) the interface between the virus and the cells The method by which the source or viral antigens are expressed on the surface of infected cells is It could also serve as a foreign antigen epitope.   Viruses include, but are not limited to, avian encephalomyelitis virus (avian encephalomyelitis virus), avian reovirus (avian reovirus), avian para Myxovirus (avian paramyxovirus), avian influenza virus (avian)  influenza virus), avian adenovirus, fowlpox virus (Fowl pox virus), avian coronavirus, avian rotau Irus (avian rotavirus), chick anemia virus (agen t)), Salmonellaspp. , E. coli, Pahsteurella spp. , Bordetella spp. , Eimer ia spp. , Histomonas spp. , Trichomonas spp. Avian encephalomyelitis virus (avian encephalomyelitis virus), avian reovirus (avian reovirus), avian para Myxovirus (avian paramyxovirus), avian influenza virus (avian)  influenza virus), avian adenovirus, fowlpox virus (Fowl pox virus), avian coronavirus, avian rotau Irus (avian rotavirus), chick anemia virus (agen t)), Salmonella spp. , E. coli, Pasteurella spp. , Bordetella spp. , Eimer ia spp. , Histomonas spp. , Trichomonnas spp. , Poultry nematodes ), Tapeworms (cestodes), trematodes (trematodes), poultry mites / lice (poultry mite) s / lice), including poultry protozoa.   Non-human primate viruses include, but are not limited to, Aotineherpesvi rus 1, Aotinehe rpesvirus 3, Cercopithecine herpesvirus 1 (B virus, H V simiae), Cercopithecine herpesvirus 2 (SA8), Cercopithecine herpesvirus  3 (SA6), Cercopithecine herpesvirus 4 (SA15), Cercopithecine herpesvirus 5 (African green monkey cytomegalovirus), Cercopithecine herpesviru s 6 (Liverpool vervet monkey virus  virus)), Cercopithecine herpesvirus 7 (Patas monkey) HV MMV or PHV delta HV), Cercopithecine herpesvirus 8 (Rhesus monkey rhinoceros Tomegalovirus), Cercopithecine herpesvirus 9 (Medical Lake macaque HV sim ian varicella HV), Cercopithecine herpesvirus 10 (Rhesus monkey leukocyte-related HV) Strain I), Cercopithecine herpesvirus 12 (HV papio, baboon (baboon) HV), Cerco pithecine herpesvirus 13 (Herpesvirus cyclopis), Cercopithecineherpesviru s14 (African green monkey EBV-like virus), Cercopithecine herpesvirus 15 (A Monkey EBV-like HV), Ateline herpesvinrs 1 (Spider monkey HV), A teline herpesvirus 2 (HV ateles), Callitrichine herpesvirus (HV saguinus) , Callitrichine herpesvirus (SSG, marmoset) cytomegaloyl C), Cebine herpesvirus I (capuchin HV), Cebine herpesvirus 2 (Capuchin monkey HV), Pongine herpesvirus 1 (Chimpanzee HV; pan HV), Pongine h erpesvirus 2 (orangutan HV), Pongine herpesvirus 3 (gorilla HV), Sairimi ine herpesvirus 1 (cynomolgus HV, herpes T, HV), tamarinus, HV platyrrhinae , (Saimiriine herpesvirus type 2) squirrel monkey HV, and HV s Including aimiri.   Mammalian viruses include, but are not limited to, bovine herpes Lus 1-5, sheep herpesvirus 1-2, Alcelaphine herpesvirus 1, pal Parvovirus (mouse minute virus, mink Aleutian disease, Si parvovirus, dog parvovirus, chicken parvovirus, cat panleukopenia, feline parvovirus, goose parvovirus, HB parvo Virus, H-1 parvovirus, Kilham rat lapine parvovirus, mink enteritis ), Erythrovirus (Adeno-associated 1-5, Bovine adeno-associated) , Dog adeno-associated, equine adeno-associated, ovine adeno-associated).   Viruses include, but are not limited to, cauliflower, Badnavirus (Badnavirus). viruses), Geminiviruses, plant reoviruses, Cryptoviruses, Rhabdoviridae, Tomato Sp otted, tenuiviruses, tobacco, potato virus, potho Irus (Potyviridae), closteroviruses, yellow turnips, Shrub tomatoes (Tomato Bushy), Luteoviruses (Luteoviruses), Segui virus (Sequiviridae), tobacco, cowpea (Cowpea), tobacco, Pean Enation, red claw Bar (Red Clover), Brome (Poaceae Sparrow), cucumber, alfal Fa, barley, black spot beet (Beet Necrotic), dsRNA, Saccharomyces cerevisiae D (Saccharomyces cerevisiae), Cryphonectria parasitica, Leishmania (L eishmania), Giardia Lamblia, Tricomonas, Chlorel la), and Saccharomyces cerevisiae.   In addition, viruses from the following families are included: Baculovirus (Bacul) oviridae) and Nudiviruses, Polydnaviruses (Polydnaviri) dae), Ascoviridae, Nodaviridae, Tetrawi Rus (Tetraviridae), Tombus virus (Tombusviridae), Coronavirus (Coro naviridae), flavivirus (Flaviviridae), togavirus (Togaviridae), Lomovirus (Bromoviridae), Barnavirus (Barnaviridae), Tochivirus (T otiviridae), particiviridas (Partitiviridas), hypovirus (Hypovirida) e), Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filovirus (Filoviridae), Orthomyxoviridae, Nyavirus (Bunyaviridae), Arenavirus (Arenaviridae), Levivirus (L eviviridae), Picornavirus (Picornaviridae), Sequivirid (Sequivirid) ae), Comoviridae, Potyviridae, Caltivirus (Calciviridae), Astrovirus (Astroviridae), Nodavirid (Nodavirid) ae), Inovirus (Inoviridae), Microvirus (Microviridae), Geminiwi Rus (Geminiviridae), Circoviridae (Circoviridae), Parvovirus (Parvov iridae), hepadnavirus (Haepadnaviridae), retrovirus (Retroviridae) , Cystovirus (Cystoviridae), Reovirus (Reoviridae), Birnavirus (Birnaviridae), myovirus (Myoviridae), siphovirus (Siphoviridae), Podovirus (Podoviridae), Tectivirus (Tectiviridae), Corticovirus (Corticoviridae), Plasmavirus (Plasmaviridae), Lippothrixviridae, F uselloviridae, Poxviridae, African swine fever virus (African swine fever -like viruses), Iridoviridae, Phycodnaviridae, Baculoviridae, Herpesvir idae, Adenoviridae, Papovaviridae, Polydnaviridae, Picornaviridae, Calic iviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronaviridae, Arterivi rus, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Buny aviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae, Hepadnav iridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, adenovirus (Adenov iridae), herpes virus (Herpesviridae), poxvirus (Poxviridae), Iridovirus (Iridoviridae).   Viruses include, but are not limited to: Marek's disease virus (M arek's disease virus) (poultry), Mink Enteritis virus (Mink Enteritis virus), Mouse Minute virus, mouse hepatitis virus, mouse breast cancer virus, mouse po Liovirus (Theiler's virus), mucosal disease virus (bovine), Myxoma virus, Nairobi sheep disease virus, Newcastle disease virus (poultry) , Orf virus (Infectious Pustular Stomatitis Virus), Parainfluenza virus 3, parainfluenza virus 1 (Sendai virus), small ruminant disease virus (Peste-des-petits-ruminants virus) (sheep and goat), mouse pneumonia virus , Sheep progressive pneumonia virus, pseudocow pox virus (milker nodule virus), provisional Sexual rabies virus, rabbit haemorrhage virus, rabies virus, reovirus 1-3 , Rift Valley fever virus, rinderpest virus, various rotaviruses, scrapie agents Offspring (sheep and goat), sheeppox virus, shopp papillomavirus, monkey immunodeficiency Virus, swinepox virus, swinepox virus, tick-borne encephalitis virus, Infectious gastroenteritis virus (pig), turkey bluecomb virus (Turkey blue comb virus), Venezuelan equine encephalomyelitis virus, vesicular rash virus (pig) Vesicular stomatitis virus, deer and elk wasting disease, Wessel's bronchus Irus, Western equine encephalomyelitis virus, African equine disease virus 1-9, African swine Cholera virus, Aleutian Mink disease virus, Avian reticuloendotheliosis virus, Avian sarcoma-leukemia virus, B virus (Cercopithecus herpes virus), Bell Berne virus (horse), blue tongue virus 1-25, border disease virus Ruth (sheep), Borna disease virus (horse), bovine enterovirus 1-7, bovine transient Fever virus, bovine immunodeficiency virus, bovine leukemia virus, Bovine mamil litis vitus, bovine papillomavirus, bovine papillary stomatitis virus, bovine respiratory Syncytial virus, bovine viral diarrhea virus, B) canine adenovirus 2, canine distemper virus, canine parvovirus, Goat arthritis-encephalomyelitis virus, cowpox virus, western equine encephalomyelitis virus, d Bora virus, ectomeria virus (mouse poxvirus), encephalomyocarditis Lus, infectious hemorrhagic disease virus (deer), equine abortion virus (EHV1), equine adeno Virus, equine arteritis virus, equine respiratory syncytial virus (EHV3), equine infectious anemia Lus, equine rhinopneumonia virus (EHV4), feline calicivirus (Feline calicivirus), Feline immunodeficiency virus, feline infectious peritonitis virus, feline panleukopenia virus , Feline sarcoma / leukemia virus, rabbit and hare and squirrel fibroids Rus, foot-and-mouth disease virus, fowlpox virus, Hemagglutinating encephalomyelitis v irus (pig), Hog cholera virus, Infectious bovine rhinotrachetitis virus , Infectious bronchitis virus (poultry), Infectious bursal disease virus (poultry), Infectious hemaropoietic necrcosis virus (fish), in fectious laryngotrachetis virus, Infectious hematopoietic necrosis virus (Fish), swine, horse, seal and avian influenza virus, Japanese encephalitis Ils, lactate dehydrogenase virus (mouse), lymphocytic choriomeningitis virus , Maedi / Visna virus (sheep), Marburg virus, Rocio virus, Ross River virus, rubella virus, Russian spring and summer encephalitis virus, Sandfly fever-Naples v irus, Sandfly fever-Sicilian virus, St. Louis encephalitis virus, SV40 Rus, Tahina virus, Vaccinia virus, Varicella-zoster virus (Human health) Pesvirus 3), smallpox virus, Venezuelan equine encephalitis virus, Vesi cular stomatitis viruses, West Nile virus, Eastern equine encephalomyelitis virus, yellow Fever virus, adenovirus 1-49, astrovirus 1, 2, B virus (Cercop ithecus herpesvirus), BK virus, Bunyamwera virus, California Encephalitis Rus, Central European encephalitis virus, Chikungunya virus, Colorado tick fever Ils, Congo-Crimean hemorrhagic fever virus, Cowpox virus, Coxsacieuir uses A 1-21 and A 24, Coxsackieviruses B 1-6, Creutzfeldt-Jakob disease  agent, Prions, Dengue virus 1-4, Duvenhage virus , Eastern equine encephalomyelitis virus, Ebola virus, Echovirus 1-9 and 11-27 And 29-34, enterovirus 68-71, Epstein-Barr virus (human herpes Virus 4), Hunter virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, type C Hepatitis virus, Delta hepatitis virus, Hepatitis E virus, Herpes simplex virus 1 And 2 (human herpesviruses 1 and 2), Human enteric coronavirus, Human enteric conoravinrs, human cytomegalovirus (human herpesvirus 5), human Herpes virus 6A, 6B, and 7, human immunodeficiency virus 1 and 2, Human respiratory coronaviruses 229E and OC43, human rotavirus, Human T-lymp hotropic viruses 1 and 2, influenza viruses A and B, Japanese encephalitis virus Rus, JC virus, Junin virus (Argentine hemorrhagic fever virus), Kuru agent, Ki Jasanur Forest Disease Virus, La Crosse virus, Lassa fever virus, lymphocyte vein Meningitis virus, Macuopo virus (Bolivian hemorrhagic fever virus), Malburg Irus, measles virus, mokola virus, molluscum contagiosum virus, monkeypox virus , Munich, Canyon virus, mumps virus, Mary Valley encephalitis virus Virus, Norwalk virus (and related viruses), O'nyong-nyong virus, Omsk hemorrhage Fever virus, orf virus (sheep pustular dermatitis virus), Oropouche viru s, papillomavirus 1-60, parainfluenza virus 1 and 3, parainful Enzaviruses 2 and 4, parvovirus B-19, poliovirus 1-3, pseudocopox Ils (milker nodule virus), RA-I virus, rabies virus, respiratory syncytial Thial virus, rhinovirus 1-113, and Rift Valley fever virus.   Staphylococcal abscesses; Staphylococcal pneumonia ccal pneumonia); Staphylococcal bacteremia; Staphylococcus Osteomyelitis (Staphylococcal osteomyelitis); Staphylococci (Staphylococcal); type A, Influenza viruses A, B and C; 1 -Type 4 parainfluenza virus (Parainfluenzaviruses 1-4); epidemic parotid gland Mumps virus; Adenoviruses; Reovir uses); Respiratory syncytial virus; Epstein -Epstein-Barrvirus, Rhinoviruses; Polio Ilus (Polioviruses); Colorado tick fever, Frevotomous fever (Phlebotomus fever), Venezuelan equine encephalit is); Rift valley fever; Dengue fever; West Nile fever ( West Nile fever); Barmah Forest virus; Chikungunya disease ( Chikungunya disease); Mayaro virus disease; Ross River Will Disease (Ross river virus disease); Sindbis virus diseas e) (Okelbo disease, Pogosta disease, Karelian fever); Eastern equine encephalomyelitis phalitis); Western equine encephalomyelitis (Westernequine encephalitis); St. Louis encephalitis ( St. Louis encephalitis); Venezuelen equine encephal itis); California virus group; Japanese encephalitis (Japanese  encephalitis); Powassan virus; Murray Valley encephalitis (Mur ray Valley encephalitis); Kyasanur Forest disease; Tick-borneencephalitis virus; Lymphocytic choroiditis (Lymp hocytic choriomeningitis); Yellow fever; Dengue hem orrhagic fever), Kyasanur Forest disease; Omsk Omsk hemorrhagic fever, Crimean-Congo hemorrhage hagic fever); Hantaan virus; Seoul viru s); Puumala virus, Machupo virus; Junin virus; Lassa fever; Marbu virus rg virus); Ebola virus, lasmodium spp; Trypanosoma spp; Microfilarie; Leishmania spp; Negre Rear Halton amoeba Acanthamoeba group (naegleria Hartmannella Acanthamoe ba group); Giardia lamblia, Strongylois des), dysentery amoeba (Entamoeba histolytica), Schistosoma mansoni mansoni), Schistosoma japonicum; Entamoeba histolytica tolytica), other amoeba; Giardia lamblia; Cryptosporidium Aum (Cryptosporidium); human whipworm (Trichuris trichiura), roundworm (Ascaris lumbri) coides), Hookworm Strongyloides, Tapeworms (Tape) worm), flukes (Fluke); enteroviruses (Enterobiusvermicularis); dysentery -Entamoeba histolytica; Paragonimus westermani ; Dysentery amoeba (Entamoeba histolytica), Strongyloides (Strongyloides) , Single tapeworm (Echinococcus granulosus), hookworm (Hookworm), roundworm (Ascaris) spp, Pneumocystis carinii; Pneumocystis carinii Leney (Pneumocystis carinii); Rotifera leishmania (Onchocerca volvu lus Leishmania) spp, Entamoeba histolytica; Kagisanada (Taeni a solium); Trichomonas spp; Schistosoma ha ematobium).   Pathogens include, but are not limited to, cat pathogens, dog pathogens, horse pathogens, Includes bovine, avian, porcine, or human pathogens. Human pathogens , But not limited to: herpes simplex virus-1 Herpes simplex virus-2, human cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, varicella-zoster virus (Varicell-Zostervirus), Human herpesvirus-6 (human herpesvirus-6), human herpesvirus-7 (huma n herpesvirus-7), human influenza, human immunodeficiency virus, rabies virus Virus, measles virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus including. Further, the antigenic polypeptide of the human pathogen may be malaria or plasmo Diet falciparum, Bordetella? It may be associated with malignancies from the herd.   Equine pathogens are derived from equine influenza virus or equine herpes virus Can be guided. Examples of such antigenic polypeptides are equine influenza A virus / Alaska 91 neuraminidase, equine influenza A virus / P rague 56 neuraminidase, equine influenza A virus / Miami 63 neura Minidase, equine influenza A virus / Kentucky 81 neuraminidase, Equine herpes type 1 virus glycoprotein B, and equine herpes type 1 virus glycoprotein Protein D.   Bovine pathogens include, but are not limited to: bovine respiratory syncytial virus (bovin e respiratory syncytial virus) or bovine parainfluenza virus . Bovine respiratory syncytial virus (b) derived from equine influenza virus ovine respiratory syncyrial virus) Respiratory syncytial virus attachment protein (BRSV G), bovine respiratory syncytial virus Rus fusion protein (BRSV F), bovine respiratory syncytial virus nucleocapsid Protein (BRSV N), bovine parainfluenza type 3 virus fusion protein and And bovine parainfluenza type 3 virus hemagglutinin neuraminidase .   The present invention relates to a) obtaining a whole blood sample from a subject; Incubate in culture in the presence of medium with or without mitogen. To induce polyclonal and specific activation of lymphocyte cells, Directing body production; c) exposing cells to separate nucleic acid sequences of virus-specific antibodies Performing the reverse transcription of the RNA of the virus-specific antibody in the sample; Producing a DNA copy; e) performing a PCR amplification of the DNA copy of the RNA genome to obtain a copy; Producing a number of DNA copies; f) a high number of DNA copies and a plurality of complementary DNA probes. A hybridization is performed to detect the DNA content of the sample, thereby A method of detecting a virus, including detecting a virus infection.   The present invention relates to polyclonal and specific activity of lymphocyte cells leading to antibody production. Contains mitogen, with or without antigen, effective to induce activation For collecting whole blood samples, including the media to be removed, and detecting specific viral antibodies For detecting specific viral antigens in subjects, including assays for I will provide a.   The invention also includes effective concentrations of mitogen with or without antigen. It also includes a kit containing a blood collection container. The container can optionally contain a culture medium Can be. The preferred container is a test tube. Blood collection container is plastic or glass Or any other material that is compatible with the cultured blood. The present invention relates to blood This includes, but is not limited to, blood storage means other than collection tubes. A microtiter plate containing wells that can be incubated Gases such as tissue culture flasks and Erlenmeyer flasks It should be understood that this includes Las flasks and any other vessels that allow blood culture. You. The present invention relates to a) obtaining a whole blood sample from a subject; Cultures in the presence of mitogen-containing media with or without protogen Cuvates to induce polyclonal and specific activation of lymphocyte cells C) obtaining a nucleic acid sequence from lymphocytes; d) using the nucleic acid sequence as a specific antibody At least 15 nucleosomes capable of specifically hybridizing to the isolated DNA of Contacting the peptide with a labeled nucleic acid sequence under hybridizing conditions; and And e) a hybridized nucleic acid sequence whose presence indicates the presence of the virus in the subject. Measuring the presence of the subject, thereby diagnosing the subject's virus. A method for diagnosing a virus is provided.   The present invention finds use as a diagnostic / prognostic indicator for subjects infected / exposed to the virus. Providing an in vitro method comprising the steps of: a) a whole blood sample from a subject B) transferring the whole blood sample to mitosis in medium with or without antigen Incubate in culture in the presence of Inducing polyclonal and specific activation; c) culture resulting from step b) Exposing to a viral antigen, thereby forming an antigen-antibody immune complex D) comparing the amount of the complex with the second amount of the complex detected earlier, Detecting the amount of antibody immune complex (increase in this amount is due to seroconv ereting)). In one embodiment, quantitative (ie, antibody titer levels) or The amount of qualitative antibody is determined by comparing one time point with another time point.   In one embodiment, the DNA sequence from the virus is amplified before step (b). In another embodiment, PCR is used for nucleic acid sequence amplification. The method of nucleic acid sequence amplification is It is known to those skilled in the art.   Primer pairs for HTV are known in the art. For example, use I can: SK 38 / 79- (probe SK19) gag SK 63/69 SK 101/145 pol SK68- / Benvb env B163 env / Benvend env   In one embodiment, the viral enzyme is reverse transcriptase (RT). In another embodiment The viral enzyme is a protease. In another embodiment, the enzyme is an integrator It is Ze. Other enzymes are known to those skilled in the art.   Patients infected with parenterally transmitted non-A, non-B hepatitis (PT-NANBH) virus Examples of such antigens and specific antibodies immunoreactive with serum from The coding polynucleotide sequence is a gene capable of producing the peptide. Peptides for detecting PT-NANBH infection in current systems and in human serum The use of is known to those skilled in the art. In particular, the present invention relates to the HCV genome core, N S4 region, surface-bound HCV antigen, 409-1-1 antigen (409-1-1 (abc), 409-1-1 (c-a), and Related antigens). Yoshikura Hiroshi, et al., US Patent 5,552,31 No. 0 Replication of Hepatitis C virus genome and identification of virus h aving high infectivity; Reyes, Gregory, et al., US Patent Nos. 5,538,865 and 5,443. No. 5,965, No. 5,436,318 Hepatitis C virus epitopes; Resnick, Robert M, et al. No. 5,527,669, Methods, primers and probes for detection of he. patitis C and novel variants; and Wang, Chang Y. U.S. Pat. No. 5,436,126 No.Synthetic peptides specific for the detection of specific antibodies t o HCV diagnosis of HCV infection.   Further antigens are known to those skilled in the art. For example, you can use the following antigens : SOD / HCV polypeptide c100-3 (363AA); second polypeptide; Peptide (capsoid peptide).   A “sample” as defined herein is any sample obtained from an organism Means Examples of biological samples include body fluids and tissue specimens. sample Sources include blood, serum, plasma, breast milk, pus, tissue scraps, lavage fluid, urine, and phosphorus. It can be obtained from physiological substrates, such as tissues such as the nodes and spleen.   Subjects may be mammals, or more specifically humans, horses, pigs, rabbits, dogs , Sheep, goats, monkeys, cows, cats, or rodents. Preferred In a preferred embodiment, the subject is a human.   As defined herein, "mitogen" refers to the secretion of a particular antibody. Or any substance that activates lymphocytes to produce it. 1 In one embodiment, the mitogen is the pokeweed mitogen, lectin , Bacterial endotoxins, antigens, lipid A or B cell activating substances such as lymphokines. You. In another embodiment, the mitogen comprises staphylococci. Bacteria-derived toxins and staphylococcal A toxins (30KD toxin), enterotoxins A, B, C1, C2, D, E (from staphylococcus aureus), exotoxins A, B, C and And superantigens such as exudative toxins A and B. In another embodiment, Mitogen is a Gram-negative LPS sequence. In another embodiment, the mitosis Genes include, for example, toxic shock syndrome toxin TSST-1, ExFT, MAM, Strep M, or Gram-negative bacteria and Gram-positive, such as gram-negative lipopolysaccharide (LPS) sequences Peptidoglycan from both bacteria. In another embodiment, a mitoge Are Epstein-Barr virus (EBV), retrovirus, mouse breast cancer virus (MMTV), picornavirus (rat), coxsackievirus, epidemic parotitis Virus and measles virus, as well as the Mtv virus (1-9, 11, 13, 43) Herpes virus. In another embodiment, the mitogen is heat HOCK protein (HSP). In another embodiment, the mitogen is Although not specified: anti-CD3 antibody, anti-TCR (T cell receptor), anti-IgM, anti-IgD, yes Antibodies containing soluble or conjugated anti-CD28. Alone or with additional factors Considering that interleukins or cytokines such as IL-4 may be added. available. In another embodiment, the mitogen is phorbol myristate Phorbol esters such as acetate, calcium ionophore and PMA used in combination with IL-4. In another embodiment, the PIPTwoGuidance second messenger Pharmacological activators (diasilg) that act in pathways, such as the jar pathway Lycerol, etc.). In another embodiment, the mitogen is Similar effect in the presence and absence of burdock mitogen (PWM) Lectins containing mitogens. In a preferred embodiment, Maggot mitogen is used. American pokeweed mitogen, Ph Pure and crude extracts from ylotacca Americana are included.   As used herein, "whole blood" refers to an animal or human. I mean the blood sampled. Whole blood is preserved while maintaining the viability of remaining leukocytes. Contains erythrocytes that can lyse. Whole blood can be heparin, EDTA, citrate, or It can be collected using any other substance that prevents solid and clot formation.   In one embodiment, optimization of mitogen in the presence or absence of antigen Concentrations are readily determined by one skilled in the art without undue experimentation. preferable For the mitogen, the American pokeweed mitogen, the preferred concentration The range is about 1: 100 to 1: 1600 dilution of the conserved PWM. The most preferred concentration range is stored About 1: 200 to 1: 1: 400 dilution of PWM. GIBCO, New York is the preferred source of stored PWM , New York. The lyophilized PWM is reconstituted with 5 ml of distilled water and preserved. Solution.   American pokeweed mitogen concentration can range from about 0.025 to 50.0 μl / ml . The concentration range can be about 0.1-0.5 μl / ml. The preferred concentration is 0.2 μl / ml. Ma If itogen is wheat germ agglutinin, the concentration range is about 0.1-2.5 μl / ml . If the mitogen is a Sac Cowan I mitogen, the concentration range is from 1: 200 to 1:20 00 dilution,   As defined herein, “medium” is not limited, RPMI 1640 with or without fetal bovine serum (GIBCO, New York, New Y ork), including any that can be used to maintain a sample to perform the invention. It also means medium, preferably supplemented with appropriate antibiotics and glutamine. Other media that may be used in the practice of the present invention include, but are not limited to, Ea gles, Dubecco's, McCoy's, Media 199, Waymouth's media and supplements A serum-free medium with or without the agent is included. In another embodiment, the No medium is used for itogen.   The nucleic acid sequences described herein may be DNA, RNA or cDNA. Various Single or multiple primer sets and polymers to provide PCR products of length Amplification is performed using the lase chain reaction. Multiple primer sets can be It is also amplified. Each primer set is amplified separately by PCR .   When two different primer sets are used, the present invention provides a first primer set. Is essential for the addition of additional compounds to the nucleic acid under defined amplification conditions. It is intended to be able to produce products of short enough length to be apparent to So This is because the product length is sufficient regardless of the efficiency of the covalent addition of the adduct. As a result, amplification products will be detected as a result.   The second set of primers also provides for the nucleic acid containing antibody under the same amplification conditions as described above. Addition of additional compounds to nucleic acids does not completely inhibit, but partially inhibits Long enough to produce the product. This is a covalent addition of the adduct Efficiency may be reflected in the amount of amplification product detected.   When three different primer sets are used, the present invention relates to the first primer Sets are available for the addition of additional compounds to nucleic acids under defined amplification conditions. It is intended to be able to produce a product short enough in length to be qualitatively obvious . In other words, regardless of the efficiency of the covalent addition of the adduct, the length of the product is As a result, amplification products will be detected. Second primer The set also includes the addition compound of the nucleic acid-containing antibody to the nucleic acid under the same amplification conditions as described above. Is not completely inhibited, but is long enough to be partially inhibited. A product may be produced. In addition, the efficiency of the covalent addition of the adduct is increased Will be reflected in the amount of breadth product. The third primer set is a nucleic acid-containing antibody Addition of additional compounds to nucleic acids produces products long enough to be completely inhibited. Can be achieved. The covalent addition of the adduct will result in the complete absence of measurable amplification products. Will be more reflected.   For example, after amplification, a part of the PCR reaction mixture is separated,32P-labelled adenosine Hybridization with end-labeled nucleotide probes, such as acid end-labeled probes It can be subjected to isation. In PCR, end-labeled oligonucleotides The probe hybridizes in solution to the region of the amplified sequence and During the process, the specific endonuclease site is reconstructed. Thus, amplification Hybridization of the labeled sequence with the labeled probe results in selective restriction enzyme Double-stranded DNA is produced that is sensitive to digestion by the DNA. By endonuclease After restriction, the resulting sample can be analyzed on polyacrylamide, An autoradiogram of a portion of the gel containing the diagnostic label fragment is obtained. Autotra The appearance of a diagnostic fragment (e.g., 10-15 bases long) in the geogram indicates that the tumor in PBMCs 2 shows the presence of the antigen-related antibody nucleotide sequence.   "PCR" refers to the step of amplifying one or more specific nucleic acid sequences, and (1) the sequence to be amplified Oligonucleotide primers that determine the ends of the single-stranded nuclei in the test sample (2) Nucleic acid polymerase-annealed primer 3 'To extend the nucleic acid strand complementary to the nucleic acid sequence annealed by the primer (3) denature the resulting double-stranded nucleic acid to produce a single-stranded nucleic acid, (4) Until a identifiable and quantifiable amount of primer-defined sequence is generated Repeat primer annealing, primer extension and product denaturation steps You. The actual control of the sequence annealing, extension and denaturation steps is usually This is performed by changing the temperature of the reaction vessel. Annealing and elongation Is most preferably in the temperature range of 40 ° C to 80 ° C (exact values are based on primer concentration and On the other hand, denaturation requires a temperature in the range of 80 ° C to 100 ° C (correct The exact value depends on the target sequence and concentration).   Methods of DNA amplification by PCR are well known and are described in U.S. Patent Nos. 4,683,195 and 4,683,202. And 4,965,188, each of which is incorporated herein by reference. Put in. To facilitate an understanding of the benefits provided by the present invention, an overview of PCR is provided. Offer. PCR involves two steps that hybridize to the double-stranded target nucleic acid sequence to be amplified. You need a limer. In PCR, this double-stranded target sequence is denatured and one The primers anneal to each strand of the denatured target. Parts separated from each other Position, when the extension product of one primer is separated from its complement Prime the target nucleus in a direction that allows it to hybridize with the other primer. Anneal to the acid. Once a given primer has hybridized to the target sequence Then, the primer is extended by the action of DNA polymerase. Then The extension product is denatured from the target sequence and the process is repeated. Nucleic acid amplification of cross contamination One particular method for minimizing the effects is described in US Pat. No. 5,035,996. Which is incorporated herein by reference.   PCR techniques provide detectable levels of seropositive or seronegative patients. Useful for determining if you have foreign antibodies. Specific in PCR technology Oligonucleotide primers for tumor-associated antibodies will confirm that the patient has cancer Show.   A cancer antigen-related antibody complementary to the two 3 'boundaries of the DNA region to be amplified is combined. To achieve. Next, a polymerase chain reaction is performed using the two primers. PCR Protocol: Guidelines for Methods and Applications [PCR Protocols; A Guide to Methods and Appl ications (1990) Innis, M., Gelfand D., Sninsky, J and White, T., eds., Academic P ress, San Diego]. Following PCR amplification, the PCR amplification region of the tumor antigen-related antibody To their ability to hybridize to the three specific nucleic acid probes described above. Can be tested. Alternatively, the nucleic acid of the tumor antigen-related antibody and the nucleic acid Hybridization with the probe described herein without DNA amplification. Southern blotting under stringent hybridization conditions More can be done. U.S. Pat.No. 5,494,810 Barany, Francis et al. The `` Sequence Chain Reaction (PCR) '' hybridizes to opposite strands and Specific DNA using two oligonucleotide primers that flank the region Patented process for logarithmic amplification of fragments (U.S. Pat.Nos. 4,683,202 and 4,68 3,195) and incorporated herein by reference. Also, U.S. Patents: Those assays disclosed in U.S. Patent No. 4,459,359 And incorporated herein by reference.   Selection of PCR primer sequences, preparation of PCR reagents and reaction mixtures, and PCR Responsive planning and implementation is a well known tool in PCR technology. Standard PCR Chu When performing nucleic acid amplification on suspended cells in a cell, the cells are Treat the same as any of the samples, i.e., About 100 to about 106Dilute to a total number of cells in the range.   When amplifying multiple samples simultaneously in different tubes, avoid cross-contamination. Add the spent reagent to each tube using a new sampler tip. You After preparing and sealing all tubes, use a thermal cycler / microprocessor. Approximately 10 to 40 cycles from denaturation, annealing, and extension under the control of A standard three temperature heat cycle program is performed. Also, annealing and elongation Is typically optimized for stringent annealing of primers to the template A series of two temperature cycles, performed at a single temperature, is often preferred. The reaction rate is Since cell preparations are considered somewhat slower than nucleic acids without cells, During the denaturation, annealing, extension or annealing-extension cycle segment Time several times longer than the standard value when the test sample contains cell-free nucleic acids Would need to. This control increases the signal intensity seen when detecting amplified nucleic acids. The number of cycles needed to maximize or reach a given signal strength This is easily done by looking for the condition to minimize. MgCl in the reaction mixtureTwo, DNTP Similar optimization procedures can be used for primer, primer, and enzyme concentrations. These parameters often indicate different optimal conditions for different targets It may also affect the case where amplification occurs in fixed cells.   A pair of primers of known sequence, located 10-300 base pairs apart, Complementary to the plus and minus strands and compatible with well-known oligonucleotide synthesis techniques Can be prepared. For annealing primers to specific antibody nucleic acid sequences Extension and modification of one end of each primer to create a restriction endonuclease site. Can be produced. The PCR reaction mixture contains specific antibody DNA and DNA primer pairs. 4 kinds of deoxyribonucleoside triphosphates, MgClTwo, DNA polymerase, and Customary buffers may be included. DNA can be amplified in multiple cycles. Wear. In general, using multiple cycles can increase the sensitivity of detection. Each cycle consists of denaturing specific antibody DNA at high temperature for a short time and cooling the reaction mixture. , And polymerization with a DNA polymerase. Oligonucleotide primers And probes are known to those skilled in the art.   Oligonucleotides used as probes or PCR primers -VanDevanter [Needham-VanDevanter, D.R. et al., (1984)Nucleic AcidsRes, 12: 6159-6 168], using Beaucage and Carruthers [B eaucage and Carruthers (1981)Tetrahedron Lett.22: 1859-1862] It is chemically synthesized according to the solid phase phosphoramidite triester method described. Purification of oligonucleotides is described in Pearson, J.D. and Regnier, F.E. [Pearson, J.D. And Regnier, F.E., (1983) J. Chrom. 255: 137-14976] By either acrylamide gel electrophoresis or anion exchange HPLC. Combination The sequences of the synthesized oligonucleotides are described in Maxam, A.M. and Gilbert, W [Maxam, A.M. And Gilbert, W .;Methods in Enzymology(1980) Grossman, L. and Moldave, D. Ed., Academic Press, New York, 65: 499-560]. You. Tavernarakis, N., U.S. Patent No. 5,569,582 discloses amplification of tumor antigen-related antibody nucleic acids. And detection are incorporated herein by reference.   The present invention provides for the amplification and subsequent detection of the nucleic acid sequence of an anti-tumor antigen-related antibody. The present invention can be applied to diagnosis of a subject having cancer. "Amplification" includes template specificity A special case of nucleic acid replication. This is due to non-specific template replication (ie, That exist but do not depend on a specific template). here, Template specificity determines the fidelity of replication (ie, the synthesis of the appropriate polynucleotide sequence), Distinguishing from nucleotide (ribo or deoxyribo) specificity. Template specificity Are often described in terms of "target" specificity. The target sequence is Means that it is required to be preferentially amplified or detected in the presence of nucleic acid sequence Are "targets". Amplification technology was originally used to detect specific target sequences It was designed. For most amplification techniques, template specificity is achieved through enzyme selection Is done. Amplification enzymes are heterogeneous mixtures of nucleic acids under the conditions in which they are used. Only the specific nucleic acid sequence therein is processed.   In the case of T4 DNA ligase, this enzyme If there is a mismatch between the substrate and the template, do not ligate the two oligonucleotides. No. D.Y.Wu and R.B.Wallace, Genomics 4: 560 (1980). Finally, Taq Poly Merase has the ability to bind primers due to its high temperature High specificity for the sequence defined by the mer; primers due to high temperature Preferably hybridizes with the specific target sequence and hybridizes with the non-target sequence. This results in a thermodynamic condition of not soybean. R.K.Saiki, PCR Technology, P rinciples and Applications for DNA Amplification (H.A. Erlich), pp. 7-16 ( 1989).   Some amplification techniques take the approach of amplifying and then detecting the target Yes, some take the approach of detecting the target and then amplifying the probe. Regardless of the approach, samples containing nucleic acids are amplified to occur with high efficiency Must not contain inhibitors against   Amplification “reagent” is a reagent (primer) other than nucleic acid and amplification enzyme necessary for amplification. , Deoxyribonucleotide triphosphate, etc.). Typically, amplification Reagents are placed along with other reaction components, and reaction vessels (test tubes, microwells, etc.) Contained within.   A preferred lysing agent is protease K. Protease K is Tritirac It is a proteolytic enzyme derived from hium album. It has no significant DNase activity Therefore, it is particularly useful in the present invention, since it does not degrade nucleic acids to prevent amplification. Ma Tako enzyme is inexpensive and commercially available (eg, Sigma, St. Louis, Mo., U.S.A. ., Catalog number p4914 "Proteinase K"). Protease K The various processing conditions used have been found to be useful. Cell and tumor antigen In order to completely degrade the serial antibodies, a high concentration of protease K (for example, 1.5-2.5 mg / ml) with a short incubation time (5-10 minutes). Lower Using lower concentrations of Protease K (e.g., 0.5 mg / ml) may achieve the same effect. Requires longer incubation times (30-60 minutes). Dissolution by heating Other lysis approaches, including, but not limited to, are contemplated.   `` Detection '' of nucleic acid amplified by PCR is defined as PC Observe the analytical signal presumed to be specifically associated with the R amplification product. Determination or quantification process. Analytical signal is visible or ultraviolet Absorption, or fluorescence, chemiluminescence, or absorption, fluorescence, chemiluminescence, or Obtained from photographs of radioactive radiation or autoradiographic images. P in situ Detection of the CR product involves microscopic observation or recording of such a signal. This sig The null is the molecule that binds to the PCR primer or dNTP or to the nucleic acid probe. Tags, directly or indirectly from radioactive atoms, chromophores, Fluorophores, chemiluminescent reagents, enzymes capable of producing chromogenic, fluorescent or chemiluminescent products, Or any other sequence that has an analytical signal directly or is catalyzed. Alternatively, it may be a binding moiety capable of reacting with the particles. A common connection is a strike Biotin or anti-digoxigeni which binds strongly to leptavidin or avidin Digoxigenin, which binds strongly to anti-fluorescein antibodies There is fluorescein. Avidin, streptavidin and antibodies develop color Can generate fluorophores, fluorophores, radioactive atoms, and chromogenic, fluorescent or chemiluminescent signals. Easily binds to enzymes that can be cut.   RNA may be prepared by any of a number of methods; Depends on source and effectiveness. The method for preparing RNA is described in Davis et al., 1986, Basic Methods in M olecular Biology, Elsevier, NY, Chapter 11; Ausubel et al., 1987, Current Protocols  in Molecular Biology, Chapter 4, John Wiley and Sons, NY; Kawasaki and Wa ng, 1989, PCR Technology, Erlich, Stockton Press NY; Kawasaki, 1990, PC R Protocols; A Guide to Methods and Applications, edited by Innis et al., Academic Pre ss, San Diego; and Wang and Mark, 1990, PCR Protocols; A Guide to Meth. ods and Applications, edited by Innis et al., Academic Press, San Diego. All of which are incorporated herein by reference. As mentioned above, Probes that can specifically hybridize to antibody nucleic acids associated with tumor antigens It serves as an index for subjects with cancer.   Such "specific hybridization" is when the probe Hybridizes to other nucleic acids present (eg, animal cell or other bacterial nucleic acids) The probe, as evidenced by a detectable signal, Occurs when the probe hybridizes to the target nucleic acid. Probe length and base set Range of bases, salts and organic Various factors including the presence or absence of medium, probe concentration, and temperature Affect the hybridization and often run under optimal hybridization conditions. Must be determined empirically. For nucleic acid probe design and annealing conditions For considerations, see, for example, Ausubel, F. et al., Methods in Enzymology [Methods i n Enxymology Volume 152, (1987) Berger, S. and Kimmel, A. Ed., Academic Press , New York] or Hybridization with Nucleic Acid Probes Are all incorporated herein by reference.   Highly stringent hybridization conditions are defined for ionic strength. The temperature and temperature are selected at about 5 ° C. below the thermal melting point (Tm) of the specific sequence. Tm The temperature at which 50% of the target sequence hybridizes with a perfectly matched probe. (Under defined ionic strength and pH). Typically, stringent Conditions are pH 7 and a salt concentration of at least about 0.02 molar and a temperature of at least about 6 It is 0 ° C. Among others, the base composition and size of the complementary strand, Medium, ie salt or formamide concentration, and base mismatch Other factors, including range, also contribute to the stringency of hybridization The combination of these parameters is significantly More important than absolute measure. For example, high stringency For example, in a 6xSSC solution, hybridize overnight at about 68 ° C, and wash with a 6xSSC solution at room temperature. By washing in a 0.6xSSX solution containing 6xSSC at about 68 ° C. Good.   Hybridization at moderate stringency is, for example, 1) 3x salt Sodium chloride, sodium citrate (SSC), 50% formamide, 0.1 M Pre-hybridize with a solution consisting of fur (pH 7.5) and 5x Denhardt's solution Perform hybridization and hybridization; 2) Prehive at 37 ° C for 4 hours 3) At 37 ° C, 3,000,000 cpm and 1 equivalent of labeled probe Hybridized for 6 hours; 4) washed in 2xSSC and 0.1% SDS solution; 5) 1 each at room temperature Wash 4 times per minute, 4 times at 60 ° C for 30 minutes each; then 6) dry and expose to film It may be achieved by doing so.   "Selectively hybridize" refers to the preparation of total cellular DNA or RNA. Hybridizes only with a specific target DNA or RNA sequence when the target sequence is present To a nucleic acid probe that forms, binds, or binds a double helix. Choice Hybridization means that a probe is hybridized with high stringency. Under the conditions of the solicitation, it may be provided in a manner detectable in a manner different from the non-target sequence. Means binding to the target. A “complementary” or “target” nucleic acid sequence is A nucleic acid sequence that selectively hybridizes with a nucleic acid probe. Proper Anilin Conditions include, for example, probe length, base composition, and the number and Depends on their position on the probe, they often have to be determined empirically No. As considerations regarding nucleic acid probe design and annealing conditions, For example, Sambrook et al., [Sambrook et al., (1989)Molecular Cloning: A LaboratoryMan ual ( (2nd edition) , Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 1-3] or Ausubel, F. et al., [A usubel, F. et al., (1987)Current Protocols in Moleculer Biology, New York] Teru.   The DNA or mRNA of the tumor antigen-related antibody is obtained by Southern blotting, By polymorphism gel electrophoresis (SSCP), PCR or other DNA-based techniques, or RN For species A, use Northern blotting, PCR or other RNA-based techniques. Can be detected.   The nucleic acid probe may be a DNA or RNA fragment as defined herein . DNA fragments can be obtained, for example, by digesting plasmid DNA or May be prepared by use, or both are incorporated herein by reference. The phosphoramidite method described by Beaucage and Carruthers Or Matteucci et al., [Matteucci et al. (1981)Am . Chem. Soc.103: 3185] It may be synthesized by any of the ester methods. Then, if desired, under appropriate conditions Annealing the single strands chemically synthesized below, or Synthesizing the complementary strand using DNA polymerase with the primer sequence A main chain fragment may be obtained. When given a specific antibody to the nucleic acid probe, It is understood that the complementary strand is also identified and included. The complementary strand is a double-stranded nucleus It is thought to work equally well in acid situations. In addition, specific sequences are 25 salts listed if identified for use Subsequences of sequences longer than the base pair may also be included for use as probes. It is also understood.   The antibody or DNA sequence can be, but is not limited to, a radioactive label, Color, luminescent, or fluorescent markers, or detectable markers, including gold May be labeled. Radioactive labels include, but are not limited to,ThreeH,14 C,32P,33P,35S,36Cl,51Cr,57Co,59Co,59Fe,90Y,125I,131I, and1 86 Re. Fluorescent markers include, but are not limited to, Resin, rhodamine, and auramine. As a colorimetric marker But not limited to biotin and digoxigenin. Po Methods for producing clonal or monoclonal antibodies are known to those skilled in the art. .   Further, the antibody or nucleic acid sequence complex may be alkaline phosphatase or It may be detected by a secondary antibody that can bind to an enzyme such as rust peroxidase. No. Other enzymes that may be used are well known to those skilled in the art.   In addition, tumor antigens or antibodies can be fluorescently labeled, using techniques known in the art. Label with an enzyme label, free radical label, or bacteriophage label. You may. Typical fluorescent labels include fluorescein isothiocyanate, -Damine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin and textile Sass Red.   Because specific enzymes can bind covalently to other sequences, It could also be used as a label for the production of a substance. Suitable enzymes include: Alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose-6-phosphate dehydro Genases, malate dehydrogenases and peroxidases. Yeast The types of elementary immunoassays are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), ELISPOT and And homogeneous enzyme immunoassays. Thusei (enzyme-multiplied immunoassay) (EMIT. Syva Corporation, Palo Alto , CA). In ELISA systems, the separation can be, for example, It may be achieved by use of the body. The EMIT system is an enzyme in the tracer-antibody complex And thus this activity can be measured without the need for a separation step You.   In addition, a chemiluminescent compound may be used as a label. Typical chemiluminescent compounds Include luminol, isoluminol, aromatic acridinium ester, Dazole, acridinium salts and oxalates. Similarly, raw Luminescent compounds may be used as labels, and bioluminescent compounds include lucifer There are phosphorus, luciferase and aequorin.   Once labeled, the antibody is immunized using techniques well known in the art. Used to identify and quantify controls (antibodies or tumor antigenic polypeptides) I can do it. Antibodies include, but are not limited to, IgG and subsets. IgA, IgE, IgM, and IgD.   "Specifically binds to tumor antigen-related antibody" or "Specifically immunoreacts" Can refer to the presence or absence of tumor antigen-related antibodies when referring to tumor antigen-related antibodies It refers to a binding reaction. Thus, under the indicated immunoassay conditions, the defined tumors Tumor antigen-related antibody binds to tumor antigen-related antibody but is present in the sample It does not bind to other antibodies in significant amounts. Under these conditions, tumor antigen-related Specific binding to an antibody depends on its specificity for a particular protein. A selected tumor antigen is required.   To select a specific antibody that specifically immunoreacts with a specific protein, Various immunoassay formats may be used. For example, a specific immune response to protein Solid-phase ELISA immunoassays are routinely used to select the corresponding monoclonal antibodies Used for Available immunoassay formats to determine specific immunoreactivity Harlow and Lane [Harlow and Lane, (1988)Antibodies, A Laborary Manual , Cold, Spring Harbor Publicetion New York].   Radioimmunoassay (RIA) is described in Laboratory Techniques in Bi ochemistry and Molecular Biology [Laboratory Techniques in Binchemistry a nd Molecular Biology (1978) North Holland Publishing Company, New York] In particular, "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Tech" by Chard, T. niques ", which is incorporated herein by reference. You.   Descriptions of various types of common immunometric assays are set forth in the following U.S. Patents: Nos. 4,376,110 (David et al.) Or 4,098,876 (Piasio) and 4,870,003 (Kortright), which are incorporated herein by reference. .   To detect or quantify the presence of tumor antigen-related antibodies in biological samples Then, the presence or absence or concentration of the antigen-antibody complex is measured.   Ligands for peptide sequences are specific, such as metal ions (iron or zinc, etc.) Toxic substances (radioactive or radioactive) A cytotoxic chemical, i.e. lysine or a cytotoxic alkylating agent or (A cytotoxic prodrug). Antibodies and toxins or release The bond to the radioisotope may be chemical. Examples of directly binding toxins Doxorubicin, chlorambucil, ricin, pseudomonas exotoxin, etc. Or half have specificity for the peptide, and the other half Hybrid toxins can be made to have specificity for the toxin. Such bivalent molecules bind to the tumor and the other half deliver cytotoxicity to the tumor Or functions to bind to and activate cytotoxic lymphocytes ( For example, T1-TThreeBinding to the receptor complex). Antibodies with the required specificity are Replacing the immunoglobulin domain of the T cell receptor (TcR); U with the constant regions of the α and β TCR chainshAnd ULHeredity Child segments are then spliced and these chimeric Ab / TcR genes are then Transfect the cells, grow these hybrid cells, and then Can be cloned into T cells by injecting it into a patient. Tissue against target Specific antigens and specific generation of Mabs specific for such targets Knowledge will help make this a usable approach.   It contains cDNA derived from TGF-α and the toxic portion of Pseudomonas exotoxin, The TGF portion of the brid binds to the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the Pseudomonas portion Is enzymatically taken up by cells, and then the ability of the ribosome to synthesize proteins Toxic gene chimeras such as genetically modified TP-40 that can be activated to cause cell death Can be produced.   Detection of the reaction of an antibody (or ligand) with a tumor antigen can be performed by methods known in the art. Facilitates the use of antibodies or ligands labeled with moieties detectable by Can be. Such detectable moieties allow visual detection of precipitation or discoloration , Visual detection by microscope, or automatic by spectroscopic or radiometric measurement Enable detection Examples of detectable moieties include fluorescein and low Damin (for fluorescence microscope), horseradish peroxidase (light or electron microscope) For any of microscopy and biochemical detection), biotin-streptavidin (optical Or for electron microscopy) and alkaline phosphatase (for biochemical detection by discoloration) ). The detection method and the detection portion to be used are, for example, those described in the above list or Can be selected from other suitable examples by the standard criteria applicable to such selection (H arlow and Lane, Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor atory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).   Immunofluorescence assay (IFA), photometric assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), ELIS Easily apply enzyme immunoassays such as POT and immunoblotting Detection of specific antibodies can be achieved. Effective for detecting tumor antigen-related antibodies The ELISA method may be, for example, as follows: (1) binding the tumor antigen to the substrate; (2) The bound tumor antigen is transferred to a body fluid before and after culture containing the antibody or to a tissue sample before and after culture. Contact with biological sample such as sample or lymphocyte; (3) detectable Functional parts (eg, horseradish peroxidase enzyme or alkaline phosphatase) (4) contact with a substrate for the enzyme (5) bringing the above into contact with a coloring reagent; (6) observing a change in color.   When labeling a tumor antigen, the label may be a radioisotope, fluorophore, enzyme, There are colorants or particles. These and other labels are well known in the art, For example, the following U.S. Pat.Nos. 3,766,162, 3,791,932, 3,817,837, Nos. 3,996,345 and 4,233,402. Tumor antigens from cell lines Assays using related antibodies are heterogeneous (ie, require a separation step). Or uniform. If the assay is heterogeneous, centrifuge and filter. Various separation means can be used, including filtration, chromatography or magnetics. You.   Other detection systems that can be used include Staphylococcus aureus Cowan. I from protein A, Staphylococcus sp. Group C (26RP66 strain) Systems based on Rotein G or using the use of a biotin-avidin binding reaction There is.   An alternative to immunoenzymatic detection of the presence of antibodies is Western blot. tumor Antigen separated by electrophoresis and transferred to nitrocellulose membrane or other suitable support Let it. The body fluid to be tested is then contacted with the membrane and the presence of the resulting immune complex is determined. It is detected by the method already described. A variation on this method involves purifying the tumor The pro-associated antibody is applied on the membrane in a line or spot form and allowed to bind. Then This membrane was brought into contact with the pre- and post-culture bodily fluids to be tested and produced using the techniques described above. Detect immune complexes.   In addition, the presence of a specific antibody in a body fluid before and after culture may be detected by aggregation. No. Lysates, tumor antigens or purified sets of tumor antigen-related antibodies described according to the invention The composition is used, for example, to coat latex particles that form a uniform suspension. Latex particles are mixed with serum containing an antigen specific for the antibody present. In this case, aggregation is caused, and large aggregates can be visually detected.   In addition, tumor antigen-related antibodies that react with specific antibodies to tumor antigens are It can also be measured by the assay. Applicable for measuring antibodies by immunoassay technology For a review of working immunological and immunoassay methods, see Basic and Cl. inical Immunology 7th edition [Basic and Clinical Immunology7th edition D.Stites and A.Terr edition].   Hemagglutination inhibition (HI) and complement fixation (CF) should be tested for the presence of antibodies. And two laboratory tests that can be used to detect tumor antigen-related antibodies .   One of skill in the art can obtain a DNA sample suitable for diagnosing a subject. You. The DNA sample obtained by the above method may be cleaved with a restriction enzyme. D The use of restriction enzymes for cleavage of NA and the conditions for performing such cleavage are known in the art. It is well known in the field.   The method uses size fractionation achieved by a polyacrylamide gel May be. In one embodiment, this size fractionation is achieved by agarose gel. Is done. In addition, prior to the hybridization step, Transfer of DNA fragments may be used. One example of such a solid phase matrix is nitro There is rocellulose paper.   Similarly, it can be used to detect messages in RNA or reverse transcriptase PCR samples. Northern transfer may be used, and cDNA can be detected by the methods described above. This Are also known to those skilled in the art.   Presence of specific antibodies produced as a result of infection or exposure to tumor antigen-related antibodies Alternative means of determining location are in situ hybridization or more A more recent one is the in situ polymerase chain reaction. Neuvo for in situ PCR [Neuvo et al., (1993)American Journal of Surgical Pathology 17 (7), 683-690] , Intracellular localization of tumor antigen cDNA amplified by polymerase chain reaction (PCR); Bag asra et al. [Bagasra et al. (1992)J. New England Journal of Medicine 326 (21): 1385-139 1], detection of tumor antigens by in situ polymerase chain reaction; and Heniford et al. [He niford et al. (1993)Nucleic Acids Research 21 (14): 3159-3166], in situ reverse transcriptase Mutations in cytoplasmic EGF receptor mRNA expression revealed by elementary polymerase chain reaction ,It is described in. In situ hybridization assays are well known. Methods Enzymol., Which is incorporated herein by reference. Are outlined in in In situ hybridization, cells are placed on a solid support, typically a slide glass. Fixed to The cells are then annealed with a labeled target-specific probe. Contact with the hybridization solution at a moderate temperature to allow for priming. Plow The label is preferably labeled with a radioisotope or a fluorescent reporter.   The probes have also been used for in situ hybridization in a variety of biological tissues. For localization, i.e., localization of tissues that express this gene, Or other hybridization for the presence of this gene or its mRNA Useful for assays. In situ hybridization is used for tumor antigen A sensitive localization method that does not depend on expression or on natural or denaturing conditions .   Oligonucleotides are terminal deoxynucleotidyl transferers 1x10TenFor specific activities in the dpm / ug range, [α-35[S] 3A terminal label with dATP Understand. Unincorporated labeled nucleotides are passed through a Sephadex G-25 column. Centrifugation or elution from a Waters Sep Pak C-18 column. Remove from goprobe.   The probe is a sample whose target tumor antigen-related antibody and animal cells (eg, neurons) A probe treated according to the protocol of the present invention, Hybridizes specifically with its target nucleic acid Prove that you can do it. The characteristic signal of the probe is Host cells and non-biology associated with antigen-related antibody DNA and in the sample If the probe is not generally related to the DNA of the target material (eg, substrate), It is strange.   Non-specific with the following stringent hybridization and wash conditions: Sufficient knowledge of potential and specific probes (eg, fluorescently labeled DNA probes) Separated: denaturing probe, 50% formamide, 2X SSC and 0.1% (w / v) sulfate Inject probe with sample in solution containing strands at 37 ° C for 12 hours. Cuvate, then 5 min at 70 ° C. in 1 × SSC; 5 min at 37 ° C. in 2 × SSC Washing in 0.2X SSC at room temperature for 5 minutes; further washing in water at room temperature for 5 minutes; Skilled person If so, in nucleic acid hybridization (ie in situ Southern and others) In some cases, detergent (e.g., dodecyl) is added to the hybridization solution or washing solution. Sodium sulfate), chelating agent (eg, EDTA), other reagents (eg, buffer, (Denhardt's solution, dextran sulfate) is often advantageous. Will stick.   A simple method to determine whether a probe is specific for a tumor antigen-related antibody nucleic acid The method comprises Southern blots using DNA prepared from one or more tumor antigen-related antibodies ( Or dot blot) will be apparent to those skilled in the art. . Conveniently, to identify target-specific probes, DNA from tumor antigen-related antibodies Is isolated. Transfer test DNA to a solid phase (eg, charged nylon) matrix . Probes are labeled according to conventional methods. Modifications and / or probes known in the art After the rehybridization step, the probe Is hybridized to the immobilized DNA. Stringent hybridization The hybridization conditions depend on the probe used, and the calculated hybridization Solution probe Tm(Telting temperature) (TmAnd the calculation of For example, see Sambrook).   Stringent hives for radioactively labeled DNA or RNA probes Examples of redidation conditions include solutions containing denaturing probes and 5x SSC. Hybridization at 65 ° C. for 8-24 hours, followed by 0.1 × SSC, 0.1% Washing at 50-60 ° C in SDS (sodium dodecyl sulfate). In general, The temperature and salt concentration determine the post-hybridization wash, hybrid TmYo At about 5 ° C lower. Thus for a particular salt concentration the temperature is TmChoose a temperature about 5 ° C. lower, or conversely, for a particular temperature the salt concentration Hybrid TmIs 5 ° C. higher than the washing temperature. Stringent After extensive hybridization and washing, the presence of signal associated with the appropriate target is Tumor antigen antigens, as evidenced by the presence and absence of signals from non-target nucleic acids. Probes that hybridize to the serial antibodies are identified. In addition, probe specificity The method of the present invention for detecting tumor antigen-related antibodies. Typically has a certain amount of background signal and is more specific to those of skill in the art. It is recognized that the signal can be easily identified. Double the background sig Nulls are allowed.   The invention is further described in the experimental details section below. This section will help you understand the invention It is intended to limit the invention as shown and set forth in the following claims. It should not be construed as limiting or limiting.Exam details: Example 1 Early detection of ovarian and breast cancerMethods and substances:   Antibodies extracted from breast cancer tumors bind to cancer cells and bind to mucins, especially Muc-1 molecules. Are shown to match. Further analysis indicates that this antibody is a mucin-1 protein It has been shown to bind to cytoplasmic core / backbone. Genetic mutation is a mucin-1 protein Not found in the chain. Action of normal protein (non-mutated) as heterologous antigen Was thought to be due to deglycosylation of the protein core. Protein core May be responsible for the recognition of mucin-1 as a foreign antigen It is. Peptides P1-P3 are mucin-1 that have several forms and are common in breast and ovarian cancer Were designed to cover the major determinant epitopes of the tandem repeat. Has been used Peptides were derived from tandem repeats of MUC-1. OC-P1 = SGSGHGVTSAPDTR-NHTwo, (SEQ ID NO: 1) OC-P2 = SGSGAPDTRPAPGSTAP-NHTwo, (SEQ ID NO: 2) OC-P3 = IISAVVGIL-NHTwo, (SEQ ID NO: 3)   The first two are soluble in water, the last is very hydrophobic, Requires very low pH to dissolve. The first two are on their Ac side (technical Evidence) was bound to biotin, and the third was not. OC-P1 and O The purity level of C-P2 is higher than 95%. OC-P3 is only 〜60% pure.result:   The group from which the preliminary data was collected included 15 women who had undergone surgery due to inferred OC. I do. Control samples (n = 21) were available from the blood donation service. 6-7 days Following culture of lymphocytes, the antibody wasS) And supernatant (IBTC) I searched. The three peptides used were based on published MUC-1 and HER-2neu sequences. And designed.   As shown in Table 1, based on histopathological conclusions, 11/15 was malignant all right. Controls were for the three peptides in serum or after in vitro culture. There is no reaction to the deviation. IBTSAnd IBTCIs small in the case of 10/11 Reactive with at least one peptide. 11 when combined assays / 11 (100%) were antibody positive. In all 4 benign cases, IBTSPositive However, only one sample IBTCWas (weakly) positive using The number of individuals tested Despite being too small for large-scale statistical analysis and prediction, By using both assays, testing can be performed in populations at high risk for OC. Provides a convenient and practical means for all tumors to be peptide-specific It is believed that it can be confirmed by various antibodies. When 10/11 is malignant Just as was the case before, only 1/4 benign IBTCIt was positive By fact, IBTCTo show that will help distinguish between benign and malignant cases did it. Table 1. New IBT diagnostic values by diagnostic grade evaluation   Blood samples were obtained from patients with surgery due to inferred OC and healthy blood donation Were collected from the human. Grade assessments were made based on histopathological conclusions.Discussion:   Immune response tests (of antibodies) are antigen-specific. Antigen selected for screen Also determines the specificity of testing for cancer or any specific cancer (in this case, breast) I do. Ovarian and breast cancer cross-reactivity and several antigens such as MUC-1 Has been repeatedly shown to be able to be used for both detections. Cross-reactivity means that both cancers are hormone-sensitive by the same hormone. It is thought to be due in fact.   Other examples of cancer antigens include breast cancer HERneu2. BC (eg in familial BC) High-risk women show signs of antibodies to HERneu2 by mammography And / or that it occurs prior to discovery by physical examination by hand. Can be shown by periodical research.Example 2:   The present invention provides a simple and early initial screening or Provides discovery. As the tumor grows, it has a stronger inhibitory effect on the immune system Thus, the active secretion of antibodies is very low and even barely detectable. Conceivable. The present invention provides a tumor-specific antibody, even if the production of the antibody is suppressed in vivo. Reveals the potential of the humoral arm of the immune system to enable detection of Therefore, it acts as a warning signal.Method:   Blood and tissue samples (tumors) were obtained from ovarian cancer patients with consent. That All patients were women who had undergone surgery. Therefore, appropriate cystic fluid was collected.   Whole blood, isolated plasma and PBMC were used for the study. Cells are incubated in RPMI complete medium for 4-6 days. And 1200 American pokeweed mitogen (PWM) in a 37 C CO2 incubator I put it. Samples were later analyzed by standard peptide ELISA (1 μg / well peptide, BSA). Was tested for anti-peptide antibodies.result:   Results are reported as ELISA O.D. readings. Each mark or letter (h = health Or c = cancer) is one sample tested. Statistical analysis is based on 95% confidence intervals Have been. Figure 1: P3-1 dimension analysis   The O.D. samples are classified into two groups: c = cancer and h = healthy. As shown, There is a tendency for higher and more specific sensitivity to peptides among cancer patients. However, one-dimensional analysis can be performed on a finger of a patient with cancer in a sample of this size. It doesn't seem to be enough as a mark. Figure 2: P3 and P2-2 dimensional analysis   One test for both peptides. The computer can make a normal (= healthy) sample (X: .5; y: .52) (3-5 known high positive controls in the range of 0.6-0.65 O.D. Were tested with 3-5 known negative sample controls ranging from 0.25-0.3 O.D. It is not shown in FIG. 2). By doing so, very little cancer sun Only pull is considered normal and vice versa. Figure 3A-3B: P2, P1 and P3-2D analysis   The studied samples were each performed in less than 100 groups. Two different pep Two-dimensional analysis of the pseudo ELISA was performed on the same set of samples. Figure 3A for p2 and p3 Figure 3B, in p1 and p3, shows that h = healthy patients and c = cancer patients are separated by clear boundaries. And A loyal person to the right of the border contains ovarian cancer or breast A person who shows signs of cancer. On the other hand, patients to the left of the borderline Show. The ratio of O.D.readings between p2 and p3 or between p1 and p3 determines the diagnosis You. Table 2. Results of 3D linear classification   Table 2 shows the linear classification of the three peptides in combination. As shown, statistical There is high resolution using both methods of calculation.Example 3 Early detection of prostate cancer   Prostate specific tumor antigen (PSA) is significantly increased by tumor growth. Normal level Tumor antigens between serum PSA and PSA produced by or due to tumors It is not clear whether there is a target / tumor antigen difference. Other (such as breast cancer MUC-1) Based on examples, there will be such differences. Therefore, it is the serum of prostate cancer patients Of antibodies that may be useful for PSA follow-up therapy from Thought it would be used to form cells from the cell line of the tumor, or Can be   Test serum and supernatants from novel culture methods for PSA-specific reactivity . Although serum levels of some patients have higher antibody levels than normal control populations, It is speculated that a much higher proportion of these would have anti-PSA antibodies in the culture. It is.   These tumor antigens are better than RNA viruses as far as cell membrane expression is concerned. Although commonly found, viruses are viruses (both DNA and RNA viruses). It encodes a tumor antigen from the induced tumor.   For example, gp70 from a viral envelope glycoprotein (chemically induced tumor Can also be found in ulcers). Purified gp70 can be used as a tumor antigen (or as defined Peptides / segments produce it, or infected cells express it Used). New method for gp70-specific reactivity of serum and supernatant Test for The serum levels of some patients have higher antibody levels than normal control populations. There are bells, but a much higher percentage of them have anti-gp70 antibodies in the culture. It is speculated that wax will be present.Example 4: Multiple tumor antigen assays   Tumor antigens (of several carrier types) are incubated in culture (blood culture) In a test tube for a period. Presence of tumor antigens is mainly due to "detector" and "binding" Agents (for ligands) as tumor antigens present (and produced) in culture Available for different antigens. At the same time, the immune Can also be used as a specific stimulant for a specific segment of Seth .   Tumor antigens are collected at any time during culture (or Will be in the test tube prior to addition. (Thus, it depends on the culture day, time, Is in contact for a minute. ) Tumor antigens are: 1) above or at the level of the culture Adheres (or binds) to the test tube itself, either in the test tube or below the level of the culture medium Possible: 2) Can be bound to nitrocellulose strip: 3) Any synthetic carrier (any kind) ); 4) Bindable to beads, microspheres, etc .; 5) "Dry chemistry" ( Or it may be part of a more rigorous "dry immunochemistry" system [closed or open]). Said All (especially beads) have a smooth or grooved surface or surface It can be any other shape of the product expanding shape.   Tumor antigens can be delivered directly to all of the above carriers or to the carriers, "arms", and And other methods of spacing the silver and the "carrier" surface. Tumor antigens Any form or size: ring, line, dot, + shape, +, P or Can be used for "carrier" in any other letter or form.   Tumor antigens are given at one given concentration or at several concentrations (discontinuous "sites"). Attached to the carrier, either as a continuous or "site" (or gradient) Can be. One or more tumor antigens are transferred to one test tube (or carrier, or beads, beads) Tumor antigens can be any number of tumor antigens, as used in Different Tumor antigens can be used simultaneously (as a mixture), in groups, or individually. Can be. If used in more than one place, use the same shape Different tumor antigens can be used with different ones.   Detection of antibodies that bind to tumor antigens is known (or later found) It can be done by both "expression" and detection systems. The expression reagent may be initially in a test tube or may be added later. Non The always convenient method is at the end of the culture period or after all The expression step is completed. Its expression is either direct binding of "tagged" antibodies or competition Depending on any of the assays. "Tag" refers to enzymes, metals, color colloids, (or Fluorescent substance, luminescent substance).Example 5: Alloantibodies:   Some small histocompatibility, even after very careful blood group matching for transfusion The donor may elicit an immune response against the sexual antigen, thus producing alloantibodies. Will be born. In most cases, this event has no pathological effect. In some patients, the response was strong, causing haemolysis of the donor's blood People at greater risk. These alloantibodies disappear several months after transfusion and are unsuitable. The same patients who were severed were given the following hemocompatibility (mixing two blood types in vitro) Detects adverse effects, but if no antibody is present, the two blood types are compatible. Would. ). If the person has memory to produce alloantibodies, these Appears immediately, jeopardizing the life of the man / woman after the second transfusion, May lead to death.   Using a new culture method, culture one sample of the recipient's blood and propose a supernatant. Tests its reactivity with the isolated blood unit and thus does not lyse or in v Allows the selection of units that will not cause other obstacles in ivo.Example 6:   Increasing the likelihood of a transplanted tissue or organ surviving, and receiving Adaptation to the two sexual parameters is discussed in parallel; The system is suppressed prior to transplantation, followed by it. 2. The best possible organization Adapt by law. Two main methods of adaptation: 1. antigenic / structural, ie multiple And a few transplantation antigens have been identified and the optimal fit sought. 2. Biological / immunology Blood of the recipient (or its components, leukocytes and plasma) A) Reaction with donor cells.   Many of the immune repertoire of the immune system are not active and are secreted within a given time Many potential humoral responses to transplantation are not seen with current methods Can not. New culture methods have revealed these antibodies, and culture supernatants or cells Is tested in vitro with donor cells and the original form is predicted and provided So risks prior to the final choice of the donor and stronger in vivo rejection It is possible to clarify.Example 7: Detection of antibodies against H.PYLORI   Precise interpretation of antibody types in seropositive populations depends on the major epitope epitope. It is important to understand the fit. Populations directed to antigens are customary Increases the general humoral response to many antigens. Early detection or exposure of antigen exposure Confirmation of dew is possible based on this assay.   Helicobacter pylori strain is associated with chronic type B gastritis. And may play a pathogenic role in peptic ulcer disease. In a more recent proof, Suggests a role for Helicobacter pylori in the development of gastric cancer. Helicopter Methods for detecting infection by C. pylori are based on the use and immunization of urea respiratory tests. Patients with techniques such as epifluorescence, latex agglutination, and complement fixation assays The detection of anti-Helicobacter pylori antibodies in the serum of E. coli. However, most A commonly used system is also based on an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Many ELISA systems use whole cell protein extracts (acidic glycine or whole cell sonication). (Antigen) is used.   This bacterium has multiple antigen / immunogen epitopes or structures. All bacteria, if Antibody detection for some of its proteins, carbohydrates, mucins, or peptides Can be used as an antigen. Helicobacter P. was first isolated from a patient in Japan. Lori strains are ruptured by ultrasonic disruption. After centrifugation, the supernatant is used as the test antigen. For micro-titer wells with flat bottoms (Immulon-2, Dynatech Laboratorles, Ale xandria, Va.) in 0.05M carbonate buffer (pH 9.6).   Antibodies to Helicobacter pylori were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (IgG, IgA). , IgE, IgD, and IgM can be evaluated individually. The absorbance reading is the endpoint titer. Convert to reciprocal. The high molecular weight cell-associated antigen preparation has a molecular weight of 400,000-700,000. Includes at least two proteins in the range. Thus, Helicobacter pylori Searching for antibodies (antibodies) against the whole immunogen or a segment thereof (peptidic) Is used as an antigen in detection systems and tests.   The presence of antibodies to Helicobacter pylori is a sign of a peptic ulcer background, This results in an appropriate treatment for Helicobacter pylori infection and thus digestion The treatment of the mucosal lining of the organ system becomes possible.Example 8: Early detection of HTLV antibodiesMethods and substances:   Heparinized anticoagulated blood samples from blood bank providers are used in this test. Used. 1 ml of blood was mixed with 2 ml of complete medium and mitogen. Test tubes 37 ° C humidified COTwoThe cells were cultured in an incubator. Use culture medium containing virus-I specific antibodies. Was tested using a commercially available ELISA. The result is an O.D. reading. Contrast OD reading was negative: 0.006, positive; 0.370.result: Table 1: Serology vs. New Test for HILV-1 Antibody   Sample numbers 1, 3, 4, 9, and 10 were seronegative for HTLV-I Antibodies to the virus were detectable after culture. asterisk(*) Marked Samples marked with were further validated (the cutoff performed was 0.1000.D. Met).Example 9: Early detection of specific antibodies for HCV exposure   Precise interpretation of seropositive antibody types in seropositive populations depends on the major epitope It is important to understand the ping. Smell both structural and non-structural proteins Thus, there are numerous immunological epitopes encoded by the HCV genome. Feeling Stained populations typically increase the general humoral immune response to many antigens; however, However, specific antibody types have been identified that can distinguish recovery from persistent HCV infection Not in. In some cases, antibodies to the NS4 (c-100-3) or NS5 antigen are first In many acutely infected patients who produce but will continue in the future, core (c22-3) and NS3 (c33-c) Antibodies to antigens are previously expressed at higher titers than antibodies to other antigens You. Both seroconversions have been shown to predict the outcome of infection Not in. The major antigenic determinant epitope is within the N-terminus of the core antigen (aa 20-34) and And the NS4 region (aa 1712 to 1731), the latter being a recombinant antigen ( They respectively correspond to C-22-3 and C-100-3). Most, if not all, chronic Patients who have been specifically infected have antibodies to the hypervariable 5 'end of the E2 / NS1 gene product (gp70). Have.   In addition, chronic hepatitis proven by biopsy is apparently acute self-limiting hepatitis C patient Reported in both anti-HCV-positive blood donors with persistent and normal ALT levels Have been. Transfusion-related hepatitis C (TAH) virus appears in anti-HCV negative blood recipients Have been treated with interferon, then discontinued interferon HCV-RNA is regularly reduced from serum of loyal followers who have relapsed post-viremia , And HCV-RNA in the liver of patients with chronic hepatitis C who are seronegative Have been reported, but these have been shown to normalize ALT and eliminate anti-HCV antibodies. , Or that serum HCV-RNA disappears does not necessarily mean complete recovery It suggests. Therefore, persistent infection (active or sedated) occurs in the majority of HCV-infected patients. Period) can occur.   Although the mechanisms underlying HCV persistence are unknown, some observations suggest that H CV regulates its lytic power and further avoids detection and elimination by the host immune system It suggests a possible strategy. Because HCV does not replicate through DNA intermediates, Is its persistence in terms of the incubation period due to integration of the viral genome into the host genome? Can not explain.   Currently available diagnostic methods for HCV infection include serological assays based on recombinant proteins. Antibody capture assays based on assays and / or synthetic peptides, serum or liver Amplification Technique for Detection of HCV-RNA Sequence in HCV and HCV in Tissue Immunohistochemical techniques for detection of antigen or HCV-RNA sequences and "insitu" Hybridization techniques. Tissue-based technology is in the early stages of development And is available only in a limited number of research facilities. HCV detection assay The relationship with the clinical course of hepatitis C is shown in Figure 2-2.   The first generation anti-HCV assay consists of a single recombinant antigen corresponding to a small portion of the C-terminus of NS3. Antibody to (C-100-3) detected, almost all NS4 gene products fused in yeast Expressed as a protein.   The second most widely evaluated trial (EIA-2) was C-33 (NS3) and C-33. Including 100-3 (NS4), showing the composition of the recombinant protein, core recombinant protein C-22 -3 and antibody to recombinant protein C-200 are detected. EIA-2 Seroconversion rates for acute, transfusion-related, or sporadic NANB hepatitis of 10 to Up to 20%, reducing the time between disease onset and seroconversion to an average of 8 weeks; 70 In 80% of cases, EIA-2 detects anti-HCV within 4 weeks of disease onset it can.   The most widely evaluated “confirmation assay” is the second generation recombinant immunoblot Assay (RIBA-2, Chiron Corporation, Emeryville, CA). This assay With two levels of human IgG and superoxide dismutase (SOD) control Recombinant HCV proteins 5.1.1 (NS4), C-100-3 (NS4), C33-c (NS3), and C-22-3 ( Nitrocellulose strip chip with core) blotted as a separate band Consists of   Nearly matched IgM anti-HCV responses directed against nucleocapsid (core) antigen And, in some cases, the first marker of active anti-HCV seroconversion. IgM reactivity has a shorter lifespan than IgG, and therefore, IgM antibodies are used in the acute phase of HCV infection. Can be used as a car.   Sequence diversity in both structural and nonstructural coding regions of different HCV isolates Results in false negative PCR reactivity. Unique to highly conserved 5 'UTR Use unique primers to avoid lost viremia due to sequence heterogeneity. I have to. To increase sensitivity and avoid hybridization steps Nested PCR (nested PCR) The use of double OCR with immers increases the risk of inherent contamination. It is thought to increase the width and result in nonspecific amplification products of the expected size .Methods and materials   Heparinized blood from patients being followed for high-risk HCV infection Liquid samples were used for this experiment. Mix 1 ml of blood with 2 ml of complete medium and mix Added (PWM). Test tubes were humidified at 37 ° C.TwoCultured in incubator . The culture was tested for the presence of HCV-specific antibodies using an ELISA kit (Minoliga). Was. The result is an O.D. reading. The cutoff for this trial was 0.392. Laboratory The research center considers a cutoff (-0.470) that is at least 1.2 to be positive. Eggplant Conformational studies were for structural and non-structural antibodies (serum Only).result :   All samples in Table 2 were from the high risk group for hepatitis C virus. is there.   All antibodies were hepatitis C virus specific. Table 2un = not measured   Samburu 5319 is better detected through culture than through serology A clear sample. The cutoff was close to 0.4 O.D. It is clearly positive only after culture (this is also confirmed). In some tests, the initial positive Or further study in patient populations with borderline ELISA.result Table 3   un = not measured   Conformations were performed using serum structural and non-structural protein antibody tests. It was only. Samples 5322, 5325, and 5326 were positive cases only after culture. You.Example 10:   ELISPOT detectionMethods and materials   In the present invention, ELISPOT capable of detecting and counting cells actively secreting a specific antibody An antibody detection system such asMethods and materials   All inactivated SIVs were applied to a nitrocellulose membrane in a 96-well plate. S The IV was washed off and the membrane was blocked with 0.2% non-fat dry milk. Weigh cells with limiting dilution And incubated for 6 hours. Rinse this plate 5 times with PBS-Tween Then, use the antibody α-human IgG (which also binds monkey IgG) and the insoluble product of the colorant. And developed, and SIV-specific antibody (secreted from cells) bound to SIV in well The dots were visualized. Blue-violet spots counted under magnification x4 (or x10) . The frequency and number of SIV-specific cells were calculated by standard limiting dilution.   The experiment has already been confirmed to be a SIV silent carrier Also from some soothing Mangabey Monkeys Heparinized blood samples from gender and negative controls were used. 1 ml of blood The liquid was mixed with 2 ml of complete medium. Each mitogen was tested in a separate tube. Trial Test tubes were humidified at 37 ° C.TwoAnd cultured. Pulverized and inactivated all SIV particles as antigen Cultures for the presence of SIV-specific antibodies using an autologous SIV ELISA kit Tested. The result is an O.D. reading.result: Table 5                      Frequency of anti-SIV Ig secreting B cells   SIV-specific B cells that actively secrete antibodies can only be detected in seropositive monkeys. I can't. Table 6       Culture-derived ELISPOT with Seronegative Mangabey Monkey PWM                             Comparison with ELISA titer   Monkey number 1 was truly negative for SIV. (Cells are seronegative rhesus Collected from monkeys. ) SIV-specific cells were not detected.   In seronegative monkeys, this is not the case if they are (silent) carriers. Although SIV antibody-producing cells could not be detected, SIV was not detected by ELISPOT after culture. Induced B cells could be detected. They also have detectable antibodies in the culture ing. The frequency and number of SIV-specific cells in the “silent carrier” Much lower than in the seropositive SIV carrier.Example 11:   Western blot detection   Also, a new method was used with Western blot as the detection method. This Studies showed the following for SIV and HIV: 1. Positive serum samples All were positive after culture; 2. No loss of band over culture period; 3. In some seropositive cases, additional bands were produced by the culture step; 4.EL Seronegative high-risk individuals (and monkeys) who test positive for ISA have major H All distinct bands of the IV (and SIV) protein were reactive. Some samples have only a part of the band, usually env and core did not exist.Example 12:   Early detection of hepatitis B (HBV)   In vivo, the current diagnostic test (usually an ELISA) between infection and antibody formation There is a window period of at least several weeks before the detection level of. A new way Of HBV-specific antibodies in both serum / plasma and culture supernatant Screening of the population for presence (using ELISA) Is also positive by the new method (100% relative specificity), while Some sex samples show positive using novel methods and kits It is something. At later time points, the positivity of these new methods was In other words, the true specificity of the assay (false positives can lead to sample mismatches) No) as well as its excellent sensitivity. Other methods of demonstrating the presence of an infection can use PCR and the like.   Antibodies to hepatitis B core antigen (anti-HBc)-transfused in the United States All blood has been screened for anti-HBc. First non-A non-B liver Introduced as a surrogate test for flame, it is now available for other viruses (such as HIV) ) As a “lifestyle” indicator to detect potential carriers, A rare hepatitis B carrier that is antigen-negative but still infected (anti-HBc alone [anti-Hb s has no possibility of transmitting hepatitis B) Used as a test for The current test for anti-HBc is ELISA.Example 13:   Early detection of HPV   In women in the very early stages of HPV infection, cervical smear tests are not You may not be able to get out. The value of the antibody being tested is not very clear, but Even when not produced at readily detectable levels, new methods are Opportunities for screening using methods and kits and for very early detection Is to give.Example 14:   Early detection of cytomegalovirus (CMV)   The prevalence of CMV exposure in the adult population is quite high, and not necessarily all blood Fluid units are not being screened for CMV. In addition, new Infants and immunosuppressed individuals (cancer patients undergoing radiation or chemotherapy, or tissue (Eg, patients after transplantation) given blood affected by CMV, May be Therefore, only CMV-negative blood can be given to these patients. As can be seen, some 40% of the blood has been screened for CMV. These CMV Some of the negative units propagate CMV and cause death. CMV-Most cytomegalovirus (CMV) infections are asymptomatic, Ruth has three main medical conditions: 1. Congenital defects following intrauterine infection; 2. Neonatal infection and Death; 3. CMV pneumonia in immunosuppressed hosts, especially those receiving bone marrow transplants. United States Approximately half of the population is infected, and these substantial populations are healthy and have antibodies. Even so, the virus is still retained (latent). Viruses vary in host May be activated under conditions. CMV is also available for transfusion when given to CMV-negative recipients. Therefore, it is transmitted. Given to susceptible CMV-negative patients due to its clinical significance Blood transfusions are often screened for antibodies to CMV and are positive. If such a unit is available, it is withheld from transfusion. Blood transfused in the United States One-third of the units are screened for CMV antibody and sufficient if necessary. Tok CMV negative blood is available.Example 15:   About "estimates" of culture assays. Do not seroconvert during follow-up O.D. readings after culture in more than 60 other "silent carrier" monkeys Were all positive but low (〜2 times the negative control in the assay). Figure 1A Or 1F.Materials and methods   At given intervals (once a week for the first 2 to 4 months after positive induction) Culture antibody test, if seroconversion has not occurred before, Liya ", and about once a month thereafter. ) Serum and culture Test for post-antibody. O.D. readings of more than 50% in two consecutive measurements (or Increasing (ratio) (or 100% at one time) indicates seroconversion in the near future.Consideration   About SIV-specific antibodies in cultured blood samples collected at different time points (x-axis) Series of O.D. readings (y-axis). 1B to 1F each show one monkey. this In addition to five cases of seroconversion, more than 60 other monkeys (Mangabey) were followed for 2 years. Their in vitro SIV antibody production levels always remained low and positive . None of these 60 individuals seroconverted during the follow-up period. in vitro Three more monkeys have elevated SIV antibody levels in seroconverted samples only I had a body. SIV antibody levels were significantly and steadily elevated prior to seroconversion. Thus, the seroconversion month is estimated surprisingly early.   The importance of this assumption stems from several factors: a) For viruses (eg, HIV) The shift from Th1 to Th2 response to seroconversion not only results in seroconversion, B) seroconversion process is usually preceded by increased viral replication Run. Therefore, antiviral treatment is not recommended in potential preseroconversion conditions Therapy would be very effective at that stage (it would actually turn the process To prevent seroconversion); c) the humor arm (humo) at the time of pre-seroconversion. ral arm) or longer asymptomatic period, better replication with increasing infection In the immune system that gives the transcript, the immune balance is set to enter the seropositive state. The use of some treatments with other beneficial effects may be encouraged. Figures 1A to 1F Means that the level of O.D.reading in ELISA after culture is true negative, seropositive , And silent infection / exposure.Example 16: Assay of estimates in humans Table 7 Anti-HIV Ab ELISA O.D.   In the in vitro antibody production (IVAP) test, HIV-specific antibodies from subjects And confirmed by ELAVIA (both from Diagnostic Pasteur) . PCR was performed in two different experiments, one-third of which was ISH (in situ hybridization). ). A positive result means a positive in all three.   As shown in Table 6, positive PC with a clear increase in OD (= antibody level) of the cultured cells Proceed with the R test, ie, increase the infection load. 2 weeks for HIV antibody detection Do at the point.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／７５５，２８７ (32)優先日 平成８年11月22日(1996．11．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７５５，４１２ (32)優先日 平成８年11月22日(1996．11．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７５５，４１３ (32)優先日 平成８年11月22日(1996．11．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７５５，４１４ (32)優先日 平成８年11月22日(1996．11．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７５５，４１５ (32)優先日 平成８年11月22日(1996．11．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (31) Priority claim number 08 / 755,287 (32) Priority date November 22, 1996 (November 22, 1996) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 755,412 (32) Priority date November 22, 1996 (November 22, 1996) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 755,413 (32) Priority date November 22, 1996 (November 22, 1996) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 755,414 (32) Priority date November 22, 1996 (November 22, 1996) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 755,415 (32) Priority date November 22, 1996 (November 22, 1996) (33) Priority country United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, F I, GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD , SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．被験者由来のサンプル中の腫瘍抗原関連抗体を検出するためのin vitro方法 であって、 a）該被験者から全血サンプルを得、 b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培 養物中で該全血サンプルをインキュベートして、腫瘍抗原関連抗体の産生および 腫瘍抗原特異的抗体の発現につながるリンパ球細胞のポリクローナル的および特 異的な活性化を誘導し、 c）工程b）で得られた培養物を腫瘍抗原にさらし、それにより抗原−抗体免 疫複合体を形成させ、そして d）工程c）の抗原−抗体免疫複合体を検出する工程を含んでなり、 抗原特異的抗体の存在が、腫瘍を有する被験者を示すことを特徴とする方法。 ２．工程b）の培養物から上清を得、該上清を腫瘍抗原にさらし、それにより抗 原−抗体免疫複合体を形成させる、請求項１に記載の方法。 ３．工程b）の培養物から細胞画分を得、それを抗原にさらし、それにより抗原 −抗体免疫複合体を形成させる、請求項１に記載の方法。 ４．該マイトジェンがリンパ球細胞の活性化物質である、請求項１に記載の方法 。 ５．該マイトジェンが、アメリカヤマゴボウマイトジェン、レクチン、細菌内毒 素、腫瘍抗原、リピドＡまたはリンホカインである、請求項４に記載の方法。 ６．該マイトジェンがアメリカヤマゴボウマイトジェンである、請求項５に記載 の方法。 ７．卵巣癌または乳癌を有する被験者をスクリーニングするための方法であって 、 a）該被験者から全血サンプルを得、 b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培 養物中で該全血サンプルをインキュベートして、腫瘍抗原関連抗体の産生および 腫瘍抗原特異的抗体の発現につながるリンパ球細胞のポリクローナル的および特 異的な活性化を誘導し、 c）工程b）で得られた培養物を腫瘍抗原にさらし、それにより抗原−抗体免 疫複合体を形成させ、そして d）工程c）の抗原−抗体免疫複合体を検出する工程を含んでなり、 腫瘍抗原特異的抗体の存在が、卵巣癌または乳癌を有することを示すことを特徴 とする方法。 ８．工程b）の培養物から上清を得、該上清を腫瘍抗原にさらし、それにより抗 原−抗体免疫複合体を形成させる、請求項７に記載の方法。 ９．該マイトジェンがリンパ球細胞の活性化物質である、請求項７に記載の方法 。 １０．該マイトジェンが、アメリカヤマゴボウマイトジェン、レクチン、細菌内 毒素、腫瘍抗原、リピドＡ、サイトカインまたはリンホカインである、請求項９ に記載の方法。 １１．該マイトジェンがアメリカヤマゴボウマイトジェンである、請求項９に記 載の方法。 １２．腫瘍を有する被験者を検出する方法であって、 a）該被験者から全血サンプルを得、 b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培 養物中で該全血サンプルをインキュベートして、腫瘍抗原関連抗体の産生につな がるリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、 c）該細胞を露出させて、核酸配列を別々に回収し、 d）得られた核酸配列を、ハイブリダイゼーション条件下で腫瘍抗原関連抗 体の核酸配列に特異的にハイブリダイズしうる一本鎖標識オリゴヌクレオチドプ ライマーと接触させ、 e）プライマー対がハイブリダイズするいずれかの核酸配列を増幅して、二 本鎖増幅産物を得、そして f)腫瘍抗原の存在を示す該増幅産物の存在を検出する工程を含んでなる方法 。 １３．該核酸配列が、DNA、RNAまたはcDNAである、請求項12に記載の方法。 １４．該一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーがビオチンで標識されている、請 求項12に記載の方法。 １５．該一本鎖オリゴヌクレオチドプローブがフルオレセインで標識されている 、 請求項12に記載の方法。 １６．該マーカーがアルカリホスファターゼである、請求項12に記載の方法。 １７．該マイトジェンがリンパ球細胞の活性化物質である、請求項12に記載の方 法。 １８．該マイトジェンが、アメリカヤマゴボウマイトジェン、レクチン、細菌内 毒素、ウイルス、リピドＡまたはリンホカインである、請求項12に記載の方法。 １９．被験者からの特異的腫瘍抗原関連抗体を検出するためのキットであって、 該キットが、全血サンプルを集めるための容器を含んでなり、 該容器が、抗体産生および該特異的腫瘍抗原関連抗体の検出のためのアッセ イにつながるリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導する のに有効なマイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含有す ることを特徴とするキット。 ２０．該アッセイが酵素結合免疫吸着アッセイまたは免疫蛍光アッセイである、 請求項19に記載のキット。 ２１．該容器がプラスチック、ガラスまたは金属物質よりなる、請求項19に記載 のキット。 ２２．該容器が試験管またはフラスコである、請求項21に記載のキット。 ２３．該容器が真空密封されている、請求項22に記載のキット。 ２４．腫瘍抗原が該容器に結合している、請求項19に記載のキット。 ２５．複数の腫瘍抗原が該容器に結合している、請求項24に記載のキット。 ２６．抗原にさらされた被験者を検出する方法であって、 a）該被験者から全血サンプルを得、 b）マイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含む、培 養物中で該全血サンプルをインキュベートして、抗体産生につながるリンパ球細 胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導し、 c）該細胞を露出させて、核酸配列を別々に回収し、 d）得られた核酸配列を、ハイブリダイゼーション条件下で抗原特異的抗体 の核酸配列に特異的にハイブリダイズしうる一本鎖標識オリゴヌクレオチドプラ イマーと接触させ、 e）プライマー対がハイブリダイズするいずれかの核酸配列を増幅して、二 本鎖増幅産物を得、そして f）該抗原の存在を示す該増幅産物の存在を検出する工程を含んでなる方法 。 ２７．該核酸配列が、DNA、RNAまたはcDNAである、請求項26に記載の方法。 ２８．該一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーがビオチンで標識されている、請 求項27に記載の方法。 ２９．該一本鎖オリゴヌクレオチドプローブがフルオレセインで標識されている 、請求項27に記載の方法。 ３０．該マーカーがアルカリホスファターゼである、請求項27に記載の方法。 ３１．該マイトジェンがリンパ球細胞の活性化物質である、請求項27に記載の方 法。 ３２．該マイトジェンが、アメリカヤマゴボウマイトジェン、レクチン、細菌内 毒素、ウイルス、リピドＡまたはリンホカインである、請求項31に記載の方法。 ３３．該マイトジェンがアメリカヤマゴボウマイトジェンである、請求項32に記 載の方法。 ３４．抗原にさらされることにより生じた被験者からの特異的抗体を検出するた めのキットであって、 該キットが、全血サンプルを集めるための容器を含んでなり、 該容器が、抗体産生および該特異的抗原抗体の検出のためのアッセイにつな がるリンパ球細胞のポリクローナル的および特異的な活性化を誘導するのに有効 なマイトジェンを抗原の存在下または非存在下に含有する培地を含有することを 特徴とするキット。[Claims] 1. An in vitro method for detecting tumor antigen-related antibodies in a sample from a subject And     a) obtaining a whole blood sample from said subject;     b) a medium containing a mitogen in the presence or absence of an antigen; Incubating the whole blood sample in feed to produce tumor antigen-related antibodies and Polyclonal and characteristic lymphocyte cells that lead to the expression of tumor antigen-specific antibodies Induces extraordinary activation,     c) exposing the culture obtained in step b) to a tumor antigen, whereby the antigen-antibody Form an epidemic complex, and     d) detecting the antigen-antibody immune complex of step c). A method wherein the presence of an antigen-specific antibody indicates a subject with a tumor. 2. A supernatant is obtained from the culture of step b), and the supernatant is exposed to a tumor antigen, thereby 2. The method of claim 1, wherein the antibody forms a proto-antibody immune complex. 3. Obtaining a cell fraction from the culture of step b) and exposing it to an antigen, whereby the antigen The method according to claim 1, wherein the antibody immune complex is formed. 4. The method according to claim 1, wherein the mitogen is an activator of lymphocyte cells. . 5. The mitogen is a pokeweed mitogen, lectin, bacterial endotoxin 5. The method according to claim 4, which is an element, a tumor antigen, lipid A or a lymphokine. 6. The mitogen is the American pokeweed mitogen. the method of. 7. A method for screening a subject having ovarian cancer or breast cancer, comprising: ,     a) obtaining a whole blood sample from said subject;     b) a medium containing a mitogen in the presence or absence of an antigen; Incubating the whole blood sample in feed to produce tumor antigen-related antibodies and Polyclonal and characteristic lymphocyte cells that lead to the expression of tumor antigen-specific antibodies Induces extraordinary activation,     c) exposing the culture obtained in step b) to a tumor antigen, whereby the antigen-antibody Form an epidemic complex, and     d) detecting the antigen-antibody immune complex of step c). The presence of a tumor antigen-specific antibody is indicative of having ovarian or breast cancer And how. 8. A supernatant is obtained from the culture of step b), and the supernatant is exposed to a tumor antigen, thereby 8. The method of claim 7, wherein the antibody forms an antigen-antibody immune complex. 9. The method according to claim 7, wherein the mitogen is an activator of lymphocyte cells. . 10. The mitogen is contained in American pokeweed mitogen, lectin, bacteria 10. A toxin, tumor antigen, lipid A, cytokine or lymphokine. The method described in. 11. 10. The method according to claim 9, wherein the mitogen is American pokeweed mitogen. The method described. 12. A method for detecting a subject having a tumor, comprising:     a) obtaining a whole blood sample from said subject;     b) a medium containing a mitogen in the presence or absence of an antigen; Incubating the whole blood sample in nutrients leads to the production of tumor antigen-related antibodies. Induces polyclonal and specific activation of lymphoid cells     c) exposing the cells to recover nucleic acid sequences separately;     d) Nucleic acid sequence obtained is subjected to Single-stranded labeled oligonucleotides that can specifically hybridize to Contact with the limer,     e) amplify any nucleic acid sequence to which the primer pair hybridizes, Obtaining the main-strand amplification product, and     f) detecting the presence of the amplification product indicating the presence of a tumor antigen . 13. 13. The method according to claim 12, wherein said nucleic acid sequence is DNA, RNA or cDNA. 14． The method wherein the single-stranded oligonucleotide primer is labeled with biotin. 13. The method according to claim 12. 15. The single-stranded oligonucleotide probe is labeled with fluorescein , The method according to claim 12. 16. 13. The method according to claim 12, wherein said marker is alkaline phosphatase. 17． 13. The method according to claim 12, wherein the mitogen is an activator of lymphocyte cells. Law. 18. The mitogen is contained in American pokeweed mitogen, lectin, bacteria 13. The method according to claim 12, which is a toxin, virus, lipid A or lymphokine. 19. A kit for detecting a specific tumor antigen-related antibody from a subject,     The kit comprises a container for collecting a whole blood sample,     The container contains an assay for antibody production and detection of the specific tumor antigen-related antibody. Induces polyclonal and specific activation of lymphocytes leading to a Containing a mitogen effective in the presence or absence of an antigen A kit comprising: 20. The assay is an enzyme-linked immunosorbent assay or an immunofluorescence assay. The kit according to claim 19. 21. 20. The container according to claim 19, wherein the container is made of plastic, glass or metal material. Kit. 22. 22. The kit according to claim 21, wherein said container is a test tube or a flask. 23. 23. The kit of claim 22, wherein said container is vacuum sealed. 24. 20. The kit of claim 19, wherein a tumor antigen is bound to said container. 25. 25. The kit of claim 24, wherein a plurality of tumor antigens are bound to said container. 26. A method for detecting a subject exposed to an antigen, comprising:     a) obtaining a whole blood sample from said subject;     b) a medium containing a mitogen in the presence or absence of an antigen; Incubate the whole blood sample in the nourishment to obtain lymphocyte cells that lead to antibody production. Induces polyclonal and specific activation of the vesicles,     c) exposing the cells to recover nucleic acid sequences separately;     d) obtaining the nucleic acid sequence under hybridization conditions using an antigen-specific antibody Single-stranded labeled oligonucleotide primer capable of specifically hybridizing to a nucleic acid sequence of Contact with the imer,     e) amplify any nucleic acid sequence to which the primer pair hybridizes, Obtaining the main-strand amplification product, and     f) detecting the presence of the amplification product indicating the presence of the antigen . 27. 27. The method according to claim 26, wherein said nucleic acid sequence is DNA, RNA or cDNA. 28. The method wherein the single-stranded oligonucleotide primer is labeled with biotin. 28. The method according to claim 27. 29. The single-stranded oligonucleotide probe is labeled with fluorescein 28. The method of claim 27. 30. 28. The method of claim 27, wherein said marker is alkaline phosphatase. 31. 28. The method of claim 27, wherein said mitogen is an activator of lymphocyte cells. Law. 32. The mitogen is contained in American pokeweed mitogen, lectin, bacteria 32. The method of claim 31, wherein the method is a toxin, virus, lipid A or lymphokine. 33. The method according to claim 32, wherein the mitogen is American pokeweed mitogen. The method described. 34. To detect specific antibodies from subjects resulting from exposure to antigen Kit for     The kit comprises a container for collecting a whole blood sample,     The container is connected to an assay for antibody production and detection of the specific antigen-antibody. Effective in inducing polyclonal and specific activation of curling lymphocyte cells Containing a mitogen in the presence or absence of an antigen. Features kit.
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