JP2001037470A - クロストリジウム・ブチリカム芽胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酪酸菌クロストリジウム・ブチリカムの芽胞
を簡便に、高率で回収することができるクロストリジウ
ム・ブチリカム芽胞の製造方法を提供する。 【解決手段】 クロストリジウム・ブチリカムを培養す
る際、接種菌液を物理化学的に処理することにより、栄
養体の菌を殺し、芽胞のみを選択的に培地に接種するこ
とを特徴とするクロストリジウム・ブチリカム芽胞の製
造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、クロストリジウム
・ブチリカム(Clostridium butyricum)の芽胞形成率を
高めることにより、高率で芽胞を回収することができる
クロストリジウム・ブチリカム芽胞の製造方法に関する
ものである。さらに詳しく述べると、本発明は、偏性嫌
気性の芽胞形成細菌であるクロストリジウム・ブチリカ
ムの芽胞を回収することを目的として、クロストリジウ
ム・ブチリカムの栄養体のみを殺して芽胞を選択的に培
地へ接種できるような物理化学的な処理を予め施した接
種菌液を培地に接種することにより、該細菌の芽胞を高
率で形成せしめ、回収することができるクロストリジウ
ム・ブチリカム芽胞の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】クロストリジウム・ブチリカム(Clostri
dium butyricum)（以下、括弧書きを省略する）は、偏
性嫌気性、芽胞形成性のグラム陽性桿菌である。

【０００３】このクロストリジウム・ブチリカムの栄養
体は酸素の暴露により死滅してしまうのに対して、芽胞
は休止細胞であり、薬剤、酸や熱などに対して耐性があ
るため、芽胞の形態で経口投与されると胃液などの酸度
の強い状態にも耐え、腸管発酵部位に達して増殖し、代
謝産物として酪酸を主とする低級揮発性脂肪酸やビタミ
ン類を産生する。このうち、産生された酪酸を主とする
低級揮発性脂肪酸は、腸管内のｐＨを下げ、毒素産生大
腸菌やサルモネラ菌等の中性の環境を好む病原菌の生育
を阻害する。また、産生されたビタミン類は、乳酸菌等
の有用菌に対する増殖因子として作用する。このため、
結果としてクロストリジウム・ブチリカムが腸管内で増
殖することは、正常な腸内菌叢を維持するのに非常に寄
与している。

【０００４】また、クロストリジウム・ブチリカムの芽
胞は、このような作用を利用して、現在、整腸剤等の医
薬品や食品及び家畜用飼料等の様々な分野において有用
菌として広く使用されており、一般に認知されている。

【０００５】ところで、クロストリジウム・ブチリカム
は、一般に、栄養のバランスなどが増殖に適した条件下
に芽胞又は栄養体を接種すると、芽胞は発芽して栄養体
となり、また栄養体は更に栄養体へと分裂増殖するが、
培地中の栄養成分の枯渇や代謝産物の蓄積等により生育
環境が悪化してくると、１栄養細胞当たり１個の芽胞を
形成（内生）するという性質を有する。この時に形成さ
れる芽胞は、分裂増殖する時の栄養体とは、生理的にも
形態的にも異なる細胞であり、芽胞を選択的に回収する
ことを目的とする場合には、芽胞と栄養体という異なる
性質の細胞を含む全生活環を順調に行わせしめる必要が
ある。

【０００６】また、内生された芽胞の成熟が進むと、栄
養体成分は溶け、芽胞が遊離されるが、この遊離した芽
胞は、熱や乾燥、化学薬品等の物理化学的要因に対して
強い抵抗性を有し、長期間生命を維持することができ
る。

【０００７】一般にクロストリジウム・ブチリカムを培
養する際、全ての栄養体が芽胞を内生することは無い。
その原因はいまだ明らかにはなっていないが、栄養体か
ら芽胞という生理的・形態的に異なる細胞への変化はお
そらく競争的に進むため、培地中の栄養成分等が影響し
ているのではないかと考えられる。

【０００８】上述したように、クロストリジウム・ブチ
リカムを有効利用しようとする際には、芽胞の形態で取
り扱うことが好ましいため、該細菌を培養する際、いか
に芽胞形成率を高めるかが工業的生産において採算面か
ら必須事項である。

【０００９】このため、上記を目的として、従来から培
地成分の検討、培地への炭酸カルシウム等のｐＨ中和剤
の添加及び発芽抑制物質の添加（例えば、特公昭５２−
４８，１６９号公報、特開昭６２−５８，９９０号公
報、及び「耐久型細胞」、蜂須賀養悦、堀越弘毅編、岩
波書店、頁３９８〜４０４、１９７６年）など、様々な
試みがなされてきたが、いずれの場合も芽胞形成率を実
用的な工業生産に見合うレベルにまで向上されたもので
はない。

【００１０】また、最近では、前培養液を被接種培養液
（本培養用培地）に高温条件下で接種することにより芽
胞形成率を上げる方法が特開平１１−４２，０８１号公
報に報告されているが、この方法は、確かに小容量の実
験室レベルでは十分芽胞形成率を向上できるものの、通
常の工業レベルでは、被接種培養液は容量も大きいた
め、被接種培養液を所定の温度にまで上昇させるため
に、さらには高温の被接種培養液を培養温度にまで冷却
するためにも多大なエネルギーと時間を要してしまい、
工業上の観点から好ましくない。上記問題に加えて、芽
胞の回収率もまだまだ実用上の観点からは不十分である
と考えられる。

【００１１】上述したように、クロストリジウム・ブチ
リカムの芽胞の形成率を十分向上するための種々の改良
法が提案されているものの、必ずしも満足できる方法と
はいえなかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyr
icum)の芽胞形成率を高めることにより、結果として芽
胞を高い割合で回収することができるクロストリジウム
・ブチリカムの製造方法を提供することを目的とするも
のである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決するため鋭意検討した結果、クロストリジウ
ム・ブチリカムが芽胞を形成する際、その細胞分化過程
が競争的に進行することに着目し、接種菌液中の栄養体
を殺すような物理化学的処理を接種菌液に施して、この
ような芽胞を選択的に含むよう処理された接種菌液を大
量培養用の培地（本培養用の培地）に接種することによ
って、クロストリジウム・ブチリカムの生育ステージを
揃え、バランス良くかつより多くの栄養体が芽胞形成過
程へシンクロナイズされうることを見出し、これにより
本発明を完成させるに至った。

【００１４】すなわち、上記目的は、下記（ア）〜
（ケ）によって達成される。

【００１５】（ア）クロストリジウム・ブチリカム(Clo
stridium butyricum)を培養する際、接種菌液を物理化
学的に処理することにより、栄養体の菌を殺し、芽胞の
みを選択的に培地に接種することを特徴とするクロスト
リジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)芽胞の
製造方法。

【００１６】（イ）前記物理化学的処理方法は、接種菌
液を４０℃以上６０℃未満の処理温度で１０〜１８０分
間、加熱処理することからなる、前記（ア）に記載の方
法。

【００１７】（ウ）前記物理化学的処理方法は、接種菌
液にアルコールを５〜９０（ｖ／ｖ）％の濃度になるよ
うに添加し、１０分〜１２０分間、アルコール処理する
ことからなる、前記（ア）に記載の方法。

【００１８】（エ）前記物理化学的処理方法は、接種菌
液のｐＨが１〜４となるまで酸を添加し、１０〜１２０
分間、酸処理することからなる、前記（ア）に記載の方
法。

【００１９】（オ）前記物理化学的処理方法は、接種菌
液を５〜５０ｋＨｚの周波数で５〜１２０分間、音波処
理することからなる、前記（ア）に記載の方法。

【００２０】（カ）前記物理化学的処理方法は、接種菌
液を曝気または攪拌することにより接種菌液中の溶解酸
素と菌とを５分以上、接触させる酸素暴露処理からな
る、前記（ア）に記載の方法。

【００２１】（キ）前記物理化学的処理方法は、接種菌
を寒天平板培地で嫌気培養し集落を形成させた後、好気
的雰囲気下で１２時間以上放置する酸素暴露処理からな
る、前記（ア）に記載の方法。

【００２２】（ク）前記物理化学的処理方法は、接種菌
液を常温で７日間以上放置する熟成処理からなる、前記
（ア）に記載の方法。

【００２３】（ケ）前記クロストリジウム・ブチリカム
(Clostridium butyricum)はクロストリジウム・ブチリ
カム ＮＩＰ１０２０(Clostridium butyricum NIP102
0)（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７９４）である、前記（ア）か
ら（ク）のいずれかに記載の方法。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２５】本発明は、酪酸菌クロストリジウム・ブチ
リカムの芽胞を製造するに当たり、栄養体のみを殺して
芽胞を選択的に含むような物理化学的処理を予め施した
接種菌液（前培養液）を本培養用の培地に接種して培養
を行うことによって、乾燥、熱及び化学薬品等の様々な
外的環境に対して優れた耐性を示す芽胞をより高い比率
で形成せしめ、回収することができるを特徴とするもの
である。

【００２６】本発明において用いられるクロストリジウ
ム・ブチリカム(Clostridium butyricum)は、これに属
するものであれば特に制限されるものではなく、例え
ば、クロストリジウム・ブチリカム ＮＩＰ１０２０(C
lostridium butyricum NIP1020)株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５７９４）及びＮＩＰ１０２１(Clostridium butyricum
NIP1021)株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７９５）、ならびにク
ロストリジウム・ブチリカム ＡＴＣＣ１９３９８、Ａ
ＴＣＣ８６０、ＩＦＯ３３１５及びＩＡＭ１９００１株
など、すべてのクロストリジウム・ブチリカムが使用で
きるが、これらのうち、好ましくは、クロストリジウム
・ブチリカム ＮＩＰ１０２０(Clostridium butyricum
NIP1020)株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７９４）及びＮＩＰ
１０２１(Clostridium butyricum NIP1021)株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５７９５）、特に好ましくはクロストリジウ
ム・ブチリカム ＮＩＰ１０２０(Clostridium butyric
um NIP1020)株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７９４）が使用さ
れる。

【００２７】本発明において行われるクロストリジウム
・ブチリカムの培養方法は、公知の方法、例えば、特開
平８−２５２，０８８号公報や特開平１１−４２，０８
１号公報に開示された方法によって行われる。

【００２８】本発明におけるクロストリジウム・ブチリ
カムの培養は、使用されるクロストリジウム・ブチリカ
ムの生育の範囲（ｐＨ及び温度等）等の生理学的性質に
よってその諸条件が異なるが、クロストリジウム・ブチ
リカムは偏性嫌気性であるため、通気しない、または窒
素若しくは炭酸ガスで培養系内を通気しながら、または
培地中に還元剤を加えることにより酸化還元電位を下げ
て、または静置培養による等の嫌気的条件下でクロスト
リジウム・ブチリカムの培養を行うことが必要である。
なお、本発明において、「培養」ということばは、特記
しない限り、接種菌液（前培養液）を調製するための前
培養及び実際に所望の芽胞を大量に形成させるための本
培養双方を含むものであり、また、前培養及び本培養
は、培養方法や条件が異なるものであってもあるいは同
じものであってもよく、目的・用途に応じて宜選択され
る。

【００２９】本発明における培養条件は、使用されるク
ロストリジウム・ブチリカムの生育の範囲（ｐＨ及び温
度等）、培地の組成や培養方法等を考慮して適宜選択さ
れ、特開平８−２５２，０８８号公報や特開平１１−４
２，０８１号公報に示される条件と同様である、または
当業者には既知である。具体的には、培養温度は、通
常、２０〜４２℃、好ましくは３５〜３７℃であり、ま
た、培地のｐＨは、通常、５〜８、好ましくは６〜７で
ある。また、本発明による本培養時における接種菌液の
本培養用培地への接種量は、接種されたクロストリジウ
ム・ブチリカムが十分生育できる量であれば特に制限さ
れないが、本培養用培地に対して、通常、０．０１〜２
０（ｖ／ｖ）％、好ましくは１〜１０（ｖ／ｖ）％であ
る。

【００３０】本発明におけるクロストリジウム・ブチリ
カムを培養するための培地は、使用するクロストリジウ
ム・ブチリカムの菌株の種類等によっても異なり、使用
するクロストリジウム・ブチリカムが資化しうる炭素
源、適量の窒素源、無機塩及びビタミン類などのその他
の栄養を含有する培地であれば、合成培地または天然培
地のいずれでもよい。

【００３１】例えば、本発明による培養において使用さ
れる炭素源の例として、使用する菌株が資化できる炭素
源であれば、特に制限されない。炭素原としては、必ず
しも糖に制限されないが、菌体の増殖を考慮すると、使
用する菌株が利用可能な糖または糖を含むものが好まし
く使用される。本発明において使用できる炭素源の具体
例としては、資化性を考慮して、セロビオース、グルコ
ース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マル
トース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、サ
リシン、スターチ、シュクロース、トレハロース、キシ
ロース、デキストリン及び糖蜜等が挙げられる。これら
の炭素源のうち、スターチ、グルコース、フルクトー
ス、シュクロース及び糖蜜が好ましく使用される。上記
した炭素源は、使用する菌株の資化性を考慮して、１種
または２種以上を選択して使用してもよい。この際、炭
素源の添加濃度は、使用する菌株や炭素源の種類及び使
用する培地の炭素源以外の培地組成等によっても異なる
が、通常、０．５〜５．０（ｗ／ｖ）％、好ましくは１
〜３（ｗ／ｖ）％である。

【００３２】また、本発明による培養において使用され
る窒素源及びビタミン類としては、一般的に使用される
窒素源及びビタミン類が使用されるが、例えば、肉エキ
ス、ポリペプトン、ペプトン、酵母エキスやアミノ酸液
等の大豆及び小麦の加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼ
イン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリ
カー、その他の動物、植物及び微生物の加水分解物等の
有機窒素化合物、及び硫酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩などが挙げられる。これらの窒素源及びビタミン類
のうち、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンステ
ィープリカー、アミノ酸液などが好ましく使用される。
上記した窒素源及びビタミン類は、使用する微生物の生
育等を考慮して、１種または２種以上選択して使用して
もよい。この際、窒素源およびビタミン類の添加濃度
は、使用する菌株や窒素源およびビタミン類の種類及び
使用する培地の組成等によっても異なるが、通常、０．
５〜４．０（ｗ／ｖ）％、好ましくは２〜３（ｗ／ｖ）
％である。

【００３３】さらに、本発明による培養において使用さ
れる無機塩としては、通常培養に使用されるのと同様の
当業者には公知の塩が使用できる。具体的には、マグネ
シウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウ
ム、モリブデン、ストロンチウム、ホウ素、銅、鉄、ス
ズ及び亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酪酸塩、プ
ロピオン酸塩及び酢酸塩等からなる群より選ばれた１種
または２種以上を使用することができる。また、培地中
に、必要に応じて、消泡剤、植物油、界面活性剤、血液
及び血液成分、ビタミン類及び抗生物質等の薬剤、植物
または動物ホルモン等の生理活性物質などを適宜添加し
てもよい。

【００３４】本発明は、酪酸菌クロストリジウム・ブチ
リカムの芽胞を製造するに際し、接種菌液に、栄養体の
みを殺して芽胞を選択的に含むような物理化学的処理を
本培養用培地に接種する前に予め施すことを必須とする
ものである。

【００３５】本発明による物理化学的処理は、栄養体の
みを殺して芽胞を選択的に残すような処理方法であれば
特に制限されないが、例えば、加熱処理、アルコール処
理、酸処理、音波処理、酸素暴露処理及び熟成処理が挙
げられる。以下、本発明による上記好ましい物理化学的
処理方法について、それぞれ詳述する。

【００３６】第一に、本発明において物理化学的処理方
法として好ましく使用される加熱処理の実施態様として
は、接種菌液を、湯せん（湯浴）や恒温室等の公知の温
度を一定に保てる方法を用いて、４０℃以上６０℃未
満、好ましくは５０〜５５℃の温度で１０〜１８０分
間、好ましくは３０〜１２０分間、加熱処理する方法が
ある。この際、加熱処理温度が４０℃未満であると、栄
養体を効率よく殺せずに、接種菌液中に多量の栄養体が
含まれてしまい、好ましくない。これに対して、加熱処
理温度が６０℃以上であると、栄養体のみならず芽胞に
もダメージを与えてしまい、やはり好ましくない。

【００３７】第二に、本発明において物理化学的処理方
法として好ましく使用されるアルコール処理は、接種菌
液に所定の濃度になるようにアルコールを添加して処理
するものである。本発明によるアルコール処理に使用で
きるアルコールとしては、芽胞を死滅させることなく、
栄養体のみを選択的に死滅させるアルコールであれば制
限されないが、例えば、メタノール、エタノール、イソ
プロパノール、プロパノール、イソブタノール、ブタノ
ール等が挙げられる。これらのうち、好ましくは、エタ
ノール及びイソプロパノールが使用される。また、上記
アルコールは、単独で使用されてもあるいは２種以上を
混合して使用されてもよい。

【００３８】さらに、本発明によるアルコール処理にお
いて、接種菌液に添加するアルコール濃度は、全接種菌
液に対して、容量比で、好ましくは、５〜９０％、より
好ましくは２０〜５０％であり、処理時間は、好ましく
は、１０〜１２０分間、より好ましくは３０〜６０分間
である。この際、アルコール濃度が５（ｖ／ｖ）％未満
であると、栄養体を十分死滅させることができずに、接
種菌液中に多量の栄養体が残ってしまい、好ましくな
い。これに対して、アルコール濃度が９０（ｖ／ｖ）％
を超えると、本培養用の培地へのアルコールの持ち込み
濃度が高くなり、ゆえに本培養条件が悪くなり、やはり
好ましくない。また、本発明によるアルコール処理温度
は、特に制限されないが、通常、０〜４０℃、好ましく
は１５〜３０℃である。

【００３９】第三に、本発明において物理化学的処理方
法として好ましく使用される酸処理は、所定のｐＨにな
るように酸を添加して処理するものである。本発明によ
る酸処理に使用できる酸としては、芽胞を死滅させるこ
となく、栄養体のみを選択的に死滅させる酸であれば制
限されないが、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、及
び炭酸等の鉱酸及びギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、
乳酸、シュウ酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピ
ン酸及びアスコルビン酸等が挙げられる。これらのう
ち、好ましくは塩酸、リン酸、酢酸、酪酸及び乳酸が使
用され、より好ましくは酢酸及び酪酸が使用される。ま
た、上記酸は、単独で使用されてもあるいは２種以上を
混合して使用されてもよい。

【００４０】さらに、本発明による酸処理において、酸
の添加量は、接種菌液のｐＨが好ましくは１〜４、より
好ましくは２．５〜３．５となるような量であり、処理
時間は、好ましくは１０〜１２０分間、より好ましくは
３０〜６０分間である。この際、酸の添加量が接種菌液
のｐＨを１未満になるような量であると、栄養体のみな
らず芽胞も死んでしまい芽胞の回収率が低下し、好まし
くない。これに対して、酸の添加量が接種菌液のｐＨを
４超になるような量であると、栄養体が多量に残ってし
まい、やはり好ましくない。また、本発明による酸処理
温度は、特に制限されないが、通常、０〜４０℃、好ま
しくは１５〜３０℃である。

【００４１】第四に、本発明において物理化学的処理方
法として好ましく使用される音波処理の一実施態様とし
ては、槽式あるいは投げ込み式等の一般的に使用される
音波発生方法を用いて、好ましくは５〜５０ｋＨｚ、よ
り好ましくは１０〜４０ｋＨｚの周波数で、５〜１２０
分間、好ましくは１５〜６０分間、音波処理する方法が
ある。また、本発明による音波処理温度は、特に制限さ
れないが、通常、０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃
である。

【００４２】第五に、本発明において物理化学的処理方
法として好ましく使用される酸素暴露処理は、栄養体は
酸素の暴露により死滅する現象を利用するものであり、
接種菌液に酸素を接触させることにより栄養体を選択的
に死滅させるものである。なお、本明細書において、溶
解酸素ということばは、接種菌液中に溶解している溶存
酸素に加えて、バブリングなどにより接種菌液中に供給
される酸素をも含む。本発明による酸素暴露処理として
は、接種菌液中の十分量の溶解酸素を菌に接触させる方
法であれば特に制限されないが、その一実施態様として
は、接種菌液を曝気（散気式若しくは機械的エアレーシ
ョンなど）又は攪拌により接種菌液中の溶解酸素と菌と
を、好ましくは５分以上、より好ましくは１２時間以
上、最も好ましくは２４時間以上接触させる方法があ
る。この際、溶解酸素との接触時間が５分未満では、溶
解酸素との接触が不充分であり、栄養体を効率よく死滅
できず、好ましくない。また、本発明による酸素暴露温
度は、特に制限されないが、通常、１〜４０℃、好まし
くは１５〜３０℃である。

【００４３】または、本発明による酸素暴露処理の他の
実施態様としては、接種菌を寒天平板培地で嫌気培養し
て集落を形成させた後、好気的雰囲気下において、好ま
しくは１２時間以上、より好ましくは２４時間以上、酸
素と接触させた後、寒天平板培地上の集落を滅菌エーゼ
等で集め、滅菌水に懸濁したものを接種菌液とし、本培
養用培地に接種して培養を行うまたは前記のごとく集め
た集落を直接本培養用培地に接種して培養を行う方法が
ある。この際、好気的雰囲気下での酸素暴露時間が１２
時間未満であると、接種菌が酸素と十分接触されず、栄
養体が十分死滅せず、好ましくない。また、本発明によ
る好気的雰囲気下での培養温度は、特に制限されず、上
記と同様の酸素暴露温度が使用されるが、通常、１〜４
０℃、好ましくは４〜３０℃である。

【００４４】第六に、本発明において物理化学的処理方
法として好ましく使用される熟成処理は、接種菌液を長
期間放置して、培地中の栄養成分を枯渇させたり、代謝
産物を蓄積させたりすること等によりクロストリジウム
・ブチリカムの生育環境を悪化させることによって、栄
養体を死滅させるものである。本発明による熟成処理の
一実施態様としては、接種菌液を、好ましくは常温付近
で、好ましくは７日間以上、放置することにより、栄養
体を死滅させ、芽胞のみを得る。この際、熟成期間が７
日未満であると、生育環境の悪化が不充分であり、即
ち、栄養体が完全に死滅せず、好ましくない。また、本
発明において、熟成環境は、好気的または嫌気的雰囲気
のいずれであってもよいが、好ましくは好気的雰囲気で
ある。

【００４５】上記のように物理化学的処理を接種菌液に
施し、芽胞を選択的に培地に接種した後、本培養を行う
ことにより芽胞を高率に形成させることができる。

【００４６】また、このようにして得られた培養液は、
濾過、限外濾過、凝集分離及び遠心分離などの一般的な
方法によって集菌された後、送風乾燥、天日乾燥、減圧
乾燥懸懸、凍結乾燥やスプレードライヤーなどの一般的
な方法により乾燥・粉末化し、これをそのままの形態で
または必要に応じて保存性向上剤や他の薬剤を配合する
ことにより、芽胞を高含有率で含む整腸剤などの医薬
品、食品及び飼料添加剤などとして使用できる。

【００４７】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。

【００４８】調製例１ 下記実施例１〜２０及び２２ならびに比較例１に使用す
る接種菌液を、以下の方法により調製した。

【００４９】まず、コンスターチ２．０％、アミノ酸液
２．０％及び炭酸カルシウム０．７５％を含む培地（ｐ
Ｈ未調整）を１２１℃で、２０分間、オートクレーブ滅
菌した後、培地を約３７℃まで急冷した。

【００５０】次に、この培地１００ｍｌに、クロストリ
ジウム・ブチリカム ＮＩＰ１０２０株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５７９４）を一白金耳接種し、３７℃で４８時間、
静置培養し、これを物理化学的処理前の接種菌液とし
た。

【００５１】実施例１〜１５ 調製例１で得られた接種菌液３ｍｌを無菌的に滅菌した
試験管にとり、下記表１中に示す条件（湯浴温度及び浸
漬時間）にて、湯浴中で加熱処理を行った。

【００５２】実施例１６ 調製例１で得られた接種菌液３ｍｌを無菌的に滅菌した
試験管にとり、これにエタノール（９９．５％）を２０
（ｖ／ｖ）％の濃度になるように添加した後、室温約２
０℃で、１時間放置し、エタノール処理を行った。

【００５３】実施例１７ 実施例１６において、エタノールを５０（ｖ／ｖ）％の
濃度になるように添加した以外は、実施例１６と同様に
してエタノール処理を行った。

【００５４】実施例１８ 調製例１で得られた接種菌液３ｍｌを無菌的に滅菌した
試験管にとり、これに接種菌液のｐＨが２．８になるま
で酢酸（９９．５％）を添加した後、室温約２０℃で、
１時間放置し、酸処理を行った。なお、本実施例におい
て、酢酸の添加量は、全体の２０（ｖ／ｖ）％の濃度と
なる量であった。

【００５５】実施例１９ 調製例１で得られた接種菌液３ｍｌを無菌的に滅菌した
試験管にとり、水を入れた超音波水槽に浸潰し、２０〜
３０℃で、周波数３８ｋＨｚで１時間、音波処理を行っ
た。

【００５６】実施例２０ 調製例１で得られた接種菌液８０ｍｌを無菌的に滅菌し
た三角フラスコに仕込み、室温約２０℃で、スターラー
を用いて６０ｒｐｍの回転速度で２３時間攪拌し、酸素
暴露処理を行った。

【００５７】実施例２１ クロストリジウム・ブチリカム ＮＩＰ１０２０株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５７９４）を、ＢＬ平板培地（日水製薬
社製）に画線塗抹し、ガスパック法（ＢＢＬ社製）で３
７℃、４８時間、嫌気培養した後、平板培地を空気中に
て室温で２４時間放置し、酸素暴露処理を行った。

【００５８】実施例２２ 調製例１で得られた接種菌液３ｍｌを無菌的に滅菌した
試験管にとり、室温約２０℃において、７日間放置し、
熟成処理を行った。

【００５９】比較例１ 調製例１で得られた接種菌液３ｍｌを無菌的に滅菌した
試験管にとり、何ら処理を施さなかった。

【００６０】実施例２３ 実施例１〜２２で処理された処理接種菌液及び比較例１
で得られた無処理接種菌液３ｍｌを、それぞれ、上記調
製例１と同様にして調製されたオートクレーブ滅菌済み
の培地１００ｍｌに接種し、これを３７℃で４８時間、
静置培養した。ただし、実施例２１で酸素暴露処理され
た接種菌については、形成したコロニーを１白金耳、上
記と同様の培地１００ｍｌに接種し、３７℃で４８時
間、静置培養したものを用いた。培養終了後、それぞれ
の培養液中の芽胞数を血球計算盤（トーマ）を用いて計
測し、その結果を下記表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】上記表１から明らかなように、芽胞形成の
促進効果は、実施例１〜２２全ての処理区において認め
られたことから、本発明の製造方法を用いてクロストリ
ジウム・ブチリカムを培養することにより、芽胞形成率
が飛躍的に上がり、結果としてクロストリジウム・ブチ
リカムの芽胞が高率で回収できることが示される。

【００６３】

【発明の効果】上述したように、本発明は、酪酸菌クロ
ストリジウム・ブチリカムの芽胞を製造するに当たり、
栄養体のみを殺して芽胞を選択的に含むような物理化学
的処理を予め施した接種菌液を本培養用の培地に接種し
て培養を行うことを特徴とするものである。したがっ
て、本発明の方法を用いることにより、生きた栄養体は
含まずに芽胞のみを含む接種菌液を本培養用の培地に接
種できるため、培養後の培養液中の芽胞形成率は飛躍的
に向上し、結果として芽胞の回収率を上げることができ
る。

【００６４】また、本発明に用いられる物理化学的処理
は、いずれも操作が簡便であり、接種菌液や培地の加熱
・冷却等の工程を必要としない上、あらゆる培養設備に
も適用が可能であり、汎用性においても優れており、工
業上の観点からも非常に好ましいものである。

【００６５】さらに、上記利点に加えて、本発明の方法
によって得られた培養液は、従来法で得られるものに比
べて高濃度で芽胞を含むので、これを用いて得られた整
腸剤などの医薬品、食品及び飼料添加剤は乾燥、熱及び
化学薬品等の様々な外的環境に対してより優れた耐性を
発揮できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤田 逸樹 千葉県夷隅郡夷隅町松丸1240番地 日宝化 学株式会社内 Ｆターム(参考） 4B065 AA23X AC20 BB02 BB12 BB18 BC01 BC02 BC06 BC50 BD27 BD29 BD50 CA42 CA43 CA44

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 クロストリジウム・ブチリカム(Clostri
   dium butyricum)を培養する際、接種菌液を物理化学的
   に処理することにより、栄養体の菌を殺し、芽胞のみを
   選択的に培地に接種することを特徴とするクロストリジ
   ウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)芽胞の製造
   方法。
2. 【請求項２】 該物理化学的処理方法は、接種菌液を４
   ０℃以上６０℃未満の処理温度で１０〜１８０分間、加
   熱処理することからなる、請求項１に記載の製造方法。
3. 【請求項３】 該物理化学的処理方法は、接種菌液にア
   ルコールを５〜９０（ｖ／ｖ）％の濃度になるように添
   加し、１０分〜１２０分間、アルコール処理することか
   らなる、請求項１に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 該物理化学的処理方法は、接種菌液のｐ
   Ｈが１〜４となるまで酸を添加し、１０〜１２０分間、
   酸処理することからなる、請求項１に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 該物理化学的処理方法は、接種菌液を５
   〜５０ｋＨｚの周波数で５〜１２０分間、音波処理する
   ことからなる、請求項１に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 該物理化学的処理方法は、接種菌液を曝
   気または攪拌することにより接種菌液中の溶解酸素と菌
   とを５分以上、接触させる酸素暴露処理からなる、請求
   項１に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 該物理化学的処理方法は、接種菌を寒天
   平板培地で嫌気培養し集落を形成させた後、好気的雰囲
   気下で１２時間以上放置する酸素暴露処理からなる、請
   求項１に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 該物理化学的処理方法は、接種菌液を常
   温で７日間以上放置する熟成処理からなる、請求項１に
   記載の製造方法。
9. 【請求項９】 該クロストリジウム・ブチリカム(Clost
   ridium butyricum)はクロストリジウム・ブチリカム
   ＮＩＰ１０２０(Clostridium butyricum NIP1020)（Ｆ
   ＥＲＭ ＢＰ−５７９４）である、請求項１〜８のいず
   れか１項に記載の製造方法。