JP2000081438A - 被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法 - Google Patents
被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法Info
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- JP2000081438A JP2000081438A JP11168478A JP16847899A JP2000081438A JP 2000081438 A JP2000081438 A JP 2000081438A JP 11168478 A JP11168478 A JP 11168478A JP 16847899 A JP16847899 A JP 16847899A JP 2000081438 A JP2000081438 A JP 2000081438A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来法より精度良く操作が簡単で危険性がな
い、被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法
を提供する。 【解決手段】 使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量が、測定しようとする液量に等しい水を採取して抽出
を行ったときの抽出液中の濃度として、0.5EU/m
l以下とされている測定容器に血液を採取し、血液と接
触させることにより該血液中に生理活性物質の産生を誘
導する材料と反応させ、該血液中に産生される生理活性
物質の量を測定することを特徴とする被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法。
い、被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法
を提供する。 【解決手段】 使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量が、測定しようとする液量に等しい水を採取して抽出
を行ったときの抽出液中の濃度として、0.5EU/m
l以下とされている測定容器に血液を採取し、血液と接
触させることにより該血液中に生理活性物質の産生を誘
導する材料と反応させ、該血液中に産生される生理活性
物質の量を測定することを特徴とする被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法に関する。
法による免疫機能低下の測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】現在、種々の癌の治療は、主として、外
科手術、放射線療法及び種々の抗癌剤による化学療法に
よって行われている。しかしながら、現在の抗癌剤によ
る化学療法では、抗癌剤が癌細胞だけでなく、副作用と
して骨髄などの造血器官をも傷害することによって、患
者の免疫機能が低下し、その結果、肺炎などの種々の感
染症に罹り、しばしば重篤な事態に陥ることが大きな問
題点となっている。そのため、癌化学療法においては、
患者の免疫機能のモニタリングが重要である。
科手術、放射線療法及び種々の抗癌剤による化学療法に
よって行われている。しかしながら、現在の抗癌剤によ
る化学療法では、抗癌剤が癌細胞だけでなく、副作用と
して骨髄などの造血器官をも傷害することによって、患
者の免疫機能が低下し、その結果、肺炎などの種々の感
染症に罹り、しばしば重篤な事態に陥ることが大きな問
題点となっている。そのため、癌化学療法においては、
患者の免疫機能のモニタリングが重要である。
【0003】従来、上記の癌化学療法における免疫機能
のモニタリングは、主として末梢血液中の白血球数を測
定することによって行われてきたものの、患者の免疫機
能低下の指標として、あまり鋭敏ではなかった。
のモニタリングは、主として末梢血液中の白血球数を測
定することによって行われてきたものの、患者の免疫機
能低下の指標として、あまり鋭敏ではなかった。
【0004】また、従来、被験者の免疫機能の指標とし
て、末梢血液からリンパ球を分離し、レクチンで刺激し
たときのリンパ球の増殖度合いを測定するリンパ球幼若
化試験が行われてきた。しかしながら、この方法は、血
液からリンパ球を分離し、3〜4日培養するため、熟練
した技術が必要であり、測定結果を得るまで時間がかか
るため、癌化学療法による治療モニタリングとしては不
適当であった。
て、末梢血液からリンパ球を分離し、レクチンで刺激し
たときのリンパ球の増殖度合いを測定するリンパ球幼若
化試験が行われてきた。しかしながら、この方法は、血
液からリンパ球を分離し、3〜4日培養するため、熟練
した技術が必要であり、測定結果を得るまで時間がかか
るため、癌化学療法による治療モニタリングとしては不
適当であった。
【0005】生体の免疫機能は、主に顆粒球、単球、マ
クロファージ、リンパ球等の白血球によって担われてお
り、近年、これらの細胞が産生する種々のサイトカイン
等の生理活性物質が生体の免疫機構の恒常性を保つ上で
重要であることが解ってきている。そのため、これらの
細胞の上記生理活性物質の産生機能の測定は、癌化学療
法による免疫機能低下の指標として重要であると考えら
れる。
クロファージ、リンパ球等の白血球によって担われてお
り、近年、これらの細胞が産生する種々のサイトカイン
等の生理活性物質が生体の免疫機構の恒常性を保つ上で
重要であることが解ってきている。そのため、これらの
細胞の上記生理活性物質の産生機能の測定は、癌化学療
法による免疫機能低下の指標として重要であると考えら
れる。
【0006】上記白血球の機能を測定する方法として、
血液や血液から分離した白血球からのサイトカイン産生
機能を調べる種々の方法が報告されている。例えば、特
表平01−503331号公報、特開平02−1969
61号公報、特開平03−285692号公報には血液
にリポ多糖やレクチンを反応させ、産生誘導されたTN
F−α、IL−1β等のサイトカインを測定する方法が
開示されている。また、特開平06−209992号公
報、特開平07−67955号公報には、特定の表面粗
さを有する高分子材料や特定の化学構造を有する高分子
材料と血液とを接触させ、TNF−αの産生を誘導する
方法が開示されている。また、特開平07−29973
2号公報、特開平07−151752号公報には、特定
の表面粗さを有する高分子材料と血液とを接触させ、T
NF−α、IL−1βの産生量を測定する生体反応検査
方法が開示されている。
血液や血液から分離した白血球からのサイトカイン産生
機能を調べる種々の方法が報告されている。例えば、特
表平01−503331号公報、特開平02−1969
61号公報、特開平03−285692号公報には血液
にリポ多糖やレクチンを反応させ、産生誘導されたTN
F−α、IL−1β等のサイトカインを測定する方法が
開示されている。また、特開平06−209992号公
報、特開平07−67955号公報には、特定の表面粗
さを有する高分子材料や特定の化学構造を有する高分子
材料と血液とを接触させ、TNF−αの産生を誘導する
方法が開示されている。また、特開平07−29973
2号公報、特開平07−151752号公報には、特定
の表面粗さを有する高分子材料と血液とを接触させ、T
NF−α、IL−1βの産生量を測定する生体反応検査
方法が開示されている。
【0007】また、上記のサイトカイン産生機能に対す
る種々の薬剤の効果を試験する方法が報告されている。
例えば、特表平07−500905号公報には、ヒト末
梢血白血球からのサイトカインの産生に対する免疫調節
物質の活性を測定する方法が開示されている。
る種々の薬剤の効果を試験する方法が報告されている。
例えば、特表平07−500905号公報には、ヒト末
梢血白血球からのサイトカインの産生に対する免疫調節
物質の活性を測定する方法が開示されている。
【0008】しかしながら、血液を採取し、特定の測定
容器内において、サイトカインの産生量を測定する場
合、例えば、注射器のような血液採取器や測定容器、あ
るいは刺激剤として用いられる抗原の中に元々、グラム
陰性菌由来のエンドトキシン(LPS)が混入している
場合に、正確な測定が困難になることが従来法の大きな
問題点であった。エンドトキシンは、極微量で白血球か
ら種々のサイトカインの産生を誘導するため、例えば、
製造工程での微量の埃の混入、使用する洗浄水からの汚
染により、少量のエンドトキシンが上記血液採取器や測
定容器、あるいは刺激剤として用いられる抗原に混入し
た場合、信頼できる測定結果を得ることは不可能であ
る。例えば、「Cytokine productio
n by phytohemagglutinin s
timulated human blood cel
ls : Effect of corticoste
roids, T Cell immununosup
pressants andphosphodiest
erase 4 inhibitors」 J. Va
n Wauwe, F. Aerts, H. Wal
ter and M.de Boer, Inflam
m Res 44, 400−405 (1995)に
は、刺激剤として用いたphytohemagglut
ininに混入したエンドトキシンが、IL−2、IL
−5、γ−INF、GM−CSFの産生量に大きく影響
することが報告されている。
容器内において、サイトカインの産生量を測定する場
合、例えば、注射器のような血液採取器や測定容器、あ
るいは刺激剤として用いられる抗原の中に元々、グラム
陰性菌由来のエンドトキシン(LPS)が混入している
場合に、正確な測定が困難になることが従来法の大きな
問題点であった。エンドトキシンは、極微量で白血球か
ら種々のサイトカインの産生を誘導するため、例えば、
製造工程での微量の埃の混入、使用する洗浄水からの汚
染により、少量のエンドトキシンが上記血液採取器や測
定容器、あるいは刺激剤として用いられる抗原に混入し
た場合、信頼できる測定結果を得ることは不可能であ
る。例えば、「Cytokine productio
n by phytohemagglutinin s
timulated human blood cel
ls : Effect of corticoste
roids, T Cell immununosup
pressants andphosphodiest
erase 4 inhibitors」 J. Va
n Wauwe, F. Aerts, H. Wal
ter and M.de Boer, Inflam
m Res 44, 400−405 (1995)に
は、刺激剤として用いたphytohemagglut
ininに混入したエンドトキシンが、IL−2、IL
−5、γ−INF、GM−CSFの産生量に大きく影響
することが報告されている。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点に
鑑みてなされたものであり、その目的は、従来法の欠点
を解決し、従来法より精度良く操作が簡単で危険性がな
い、被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法
を提供することである。
鑑みてなされたものであり、その目的は、従来法の欠点
を解決し、従来法より精度良く操作が簡単で危険性がな
い、被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法
を提供することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】請求項1記載の被験者の
癌化学療法による免疫機能低下の測定方法は、使用前の
測定容器中のエンドトキシン含量が、測定しようとする
液量に等しい水を採取して抽出を行ったときの抽出液中
の濃度として、0.5EU/ml以下とされている測定
容器に血液を採取し、血液と接触させることにより該血
液中に生理活性物質の産生を誘導する材料と反応させ、
該血液中に産生される生理活性物質の量を測定すること
を特徴とする被験者の癌化学療法による免疫機能低下の
測定方法である。
癌化学療法による免疫機能低下の測定方法は、使用前の
測定容器中のエンドトキシン含量が、測定しようとする
液量に等しい水を採取して抽出を行ったときの抽出液中
の濃度として、0.5EU/ml以下とされている測定
容器に血液を採取し、血液と接触させることにより該血
液中に生理活性物質の産生を誘導する材料と反応させ、
該血液中に産生される生理活性物質の量を測定すること
を特徴とする被験者の癌化学療法による免疫機能低下の
測定方法である。
【0011】請求項2記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、血液と接触させることによ
り該血液中に生理活性物質の産生を誘導する材料が、予
め血液と接触可能な状態に収納されていることを特徴と
する請求項1記載の被験者の癌化学療法による免疫機能
低下の測定方法である。
免疫機能低下の測定方法は、血液と接触させることによ
り該血液中に生理活性物質の産生を誘導する材料が、予
め血液と接触可能な状態に収納されていることを特徴と
する請求項1記載の被験者の癌化学療法による免疫機能
低下の測定方法である。
【0012】請求項3記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、血液と接触させることによ
り該血液中に生理活性物質の産生を誘導する材料がエン
ドトキシンであり、該エンドトキシンの血液と接触させ
た際の全液中の濃度が、0.6〜100000EU/m
lとなるようにされていることを特徴とする請求項1又
は2記載の被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測
定方法である。
免疫機能低下の測定方法は、血液と接触させることによ
り該血液中に生理活性物質の産生を誘導する材料がエン
ドトキシンであり、該エンドトキシンの血液と接触させ
た際の全液中の濃度が、0.6〜100000EU/m
lとなるようにされていることを特徴とする請求項1又
は2記載の被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測
定方法である。
【0013】請求項4記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、測定容器内が減圧にされて
いることを特徴とする請求項1、2又は3記載の被験者
の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法である。
免疫機能低下の測定方法は、測定容器内が減圧にされて
いることを特徴とする請求項1、2又は3記載の被験者
の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法である。
【0014】請求項5記載の被験者の癌化学療法による
免疫機能低下の測定方法は、血液中に産生される生理活
性物質の量を酵素免疫測定により定量することを特徴と
する請求項1、2、3又は4記載の被験者の癌化学療法
による免疫機能低下の測定方法である。
免疫機能低下の測定方法は、血液中に産生される生理活
性物質の量を酵素免疫測定により定量することを特徴と
する請求項1、2、3又は4記載の被験者の癌化学療法
による免疫機能低下の測定方法である。
【0015】本発明で用いられる生理活性物質の産生を
誘導する材料は、血液細胞、特に顆粒球、単球、マクロ
ファージ、リンパ球等の白血球と反応し、これらの細胞
の活性化を促し、サイトカイン等の誘導を引き起こす材
料であり、従来、上記細胞の活性化物質として知られる
種々の材料が用いられる。例えば、BCG死菌やコリネ
バクテリウム属などの種々の微生物、合成リピドA、ピ
ランコポリマー、レクチン(フィトヘマグルチニン、コ
ンカナバリンA、ポークウィードマイトゲン等)、OK
432(ピシバニール)、PSK(クレスチン)、レン
チナン、ザイモザン、エンドトキシン(LPS)、カル
シウムイオノフォア、ホルボルエステル、免疫グロブリ
ン固定化担体、ホルミルメチオニルロイシルフェニルア
ラニン(FMLP)等のホルミルペプチド、種々のサイ
トカイン等が挙げられる。特に、エンドトキシンが生理
活性物質の誘導活性が高く好適である。
誘導する材料は、血液細胞、特に顆粒球、単球、マクロ
ファージ、リンパ球等の白血球と反応し、これらの細胞
の活性化を促し、サイトカイン等の誘導を引き起こす材
料であり、従来、上記細胞の活性化物質として知られる
種々の材料が用いられる。例えば、BCG死菌やコリネ
バクテリウム属などの種々の微生物、合成リピドA、ピ
ランコポリマー、レクチン(フィトヘマグルチニン、コ
ンカナバリンA、ポークウィードマイトゲン等)、OK
432(ピシバニール)、PSK(クレスチン)、レン
チナン、ザイモザン、エンドトキシン(LPS)、カル
シウムイオノフォア、ホルボルエステル、免疫グロブリ
ン固定化担体、ホルミルメチオニルロイシルフェニルア
ラニン(FMLP)等のホルミルペプチド、種々のサイ
トカイン等が挙げられる。特に、エンドトキシンが生理
活性物質の誘導活性が高く好適である。
【0016】上記生理活性物質の産生を誘導する材料と
して、また、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピ
ー性皮膚炎、消化管アレルギー、寄生虫アレルギー等の
アレルゲン検査に用いられる特定抗原(ハウスダスト、
ダニ抗原;ブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出物、イネ
花粉抽出物等の種々の花粉抗原;真菌抗原、アスカリス
抽出物等の寄生虫抗原;卵白アルブミン、小麦、大豆、
エビ、カニ、肉類等の食物抗原;ハチ毒等)が用いられ
る。また、これらの材料を種々の天然、合成高分子材料
に公知の固定化方法によって固定化した材料等が挙げら
れる。
して、また、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピ
ー性皮膚炎、消化管アレルギー、寄生虫アレルギー等の
アレルゲン検査に用いられる特定抗原(ハウスダスト、
ダニ抗原;ブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出物、イネ
花粉抽出物等の種々の花粉抗原;真菌抗原、アスカリス
抽出物等の寄生虫抗原;卵白アルブミン、小麦、大豆、
エビ、カニ、肉類等の食物抗原;ハチ毒等)が用いられ
る。また、これらの材料を種々の天然、合成高分子材料
に公知の固定化方法によって固定化した材料等が挙げら
れる。
【0017】上記生理活性物質の産生を誘導する材料の
必要量としては、用いる材料ごとにその量を変化させ、
指標とする生理活性物質の誘導活性を測定して、その用
量反応曲線から最適量を設定する。例えば、エンドトキ
シン(LPS)を生理活性物質の産生を誘導する材料と
して用い、指標とする生理活性物質としてTNF−αを
用いる場合には、血液中のエンドトキシン濃度として、
0.6〜100000EU/mlとするのが好ましい。
必要量としては、用いる材料ごとにその量を変化させ、
指標とする生理活性物質の誘導活性を測定して、その用
量反応曲線から最適量を設定する。例えば、エンドトキ
シン(LPS)を生理活性物質の産生を誘導する材料と
して用い、指標とする生理活性物質としてTNF−αを
用いる場合には、血液中のエンドトキシン濃度として、
0.6〜100000EU/mlとするのが好ましい。
【0018】上記血液細胞から産生される生理活性物質
は、例えば、インターロイキンー1(IL−1)、IL
−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL
−10、IL−12、IL−13、TNF−α、リンフ
ォトキシン等のインターロイキン、INF−α、INF
−β、INF−γ等のインターフェロン、コロニー刺激
因子、RANTES等の走化性因子などの種々のサイト
カインやPGE2、PGI2等のプロスタグランジン、L
TB4、LTC4等のロイコトリエン、一酸化窒素、活
性酸素、ヒスタミン、血小板活性化因子(PAF)等の
種々のケミカルメディエーターが挙げられる。また、可
溶性ICAM1等の接着因子、可溶性IL−2レセプタ
ー等の可溶性サイトカインレセプターも挙げられる。特
に、TNF−αは短時間で誘導されるため好適である。
は、例えば、インターロイキンー1(IL−1)、IL
−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL
−10、IL−12、IL−13、TNF−α、リンフ
ォトキシン等のインターロイキン、INF−α、INF
−β、INF−γ等のインターフェロン、コロニー刺激
因子、RANTES等の走化性因子などの種々のサイト
カインやPGE2、PGI2等のプロスタグランジン、L
TB4、LTC4等のロイコトリエン、一酸化窒素、活
性酸素、ヒスタミン、血小板活性化因子(PAF)等の
種々のケミカルメディエーターが挙げられる。また、可
溶性ICAM1等の接着因子、可溶性IL−2レセプタ
ー等の可溶性サイトカインレセプターも挙げられる。特
に、TNF−αは短時間で誘導されるため好適である。
【0019】本発明でいう癌とは、頭・頚部癌、肺癌、
咽頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、乳
癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、骨肉
腫、白血病等現在臓器ごとに分類されている種々の癌を
言う。
咽頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、乳
癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、骨肉
腫、白血病等現在臓器ごとに分類されている種々の癌を
言う。
【0020】本発明の癌化学療法に用いられる抗癌剤
は、現在化学療法に用いられている種々の薬剤をいい、
例えば、シクロフォスファミド、イホスファミド、ニト
ロソウレア、タカルバジン、シスプラチン等のアルキル
化剤;メトトレキセート、5−フルオロウラシル、シタ
ラビン等の代謝拮抗剤;ビンクリスチン、ビンブラスチ
ン、ビンデシン等の植物アルカロイド;マイトマイシン
C、ドキソルビシン、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物
質;プレドニゾロン、デキサメタゾン等のホルモン剤等
が挙げられる。
は、現在化学療法に用いられている種々の薬剤をいい、
例えば、シクロフォスファミド、イホスファミド、ニト
ロソウレア、タカルバジン、シスプラチン等のアルキル
化剤;メトトレキセート、5−フルオロウラシル、シタ
ラビン等の代謝拮抗剤;ビンクリスチン、ビンブラスチ
ン、ビンデシン等の植物アルカロイド;マイトマイシン
C、ドキソルビシン、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物
質;プレドニゾロン、デキサメタゾン等のホルモン剤等
が挙げられる。
【0021】本発明に用いられる測定容器のエンドトキ
シン含量は、採取血液量と同量のエンドトキシンフリー
水を該容器内に採取し、37℃、1時間の条件で攪拌下
抽出を行ったとき、該抽出液中のエンドトキシン含量が
0.5EU(国際エンドトキシンユニット)/ml以下
である必要がある。なお、上記の抽出を行う際のエンド
トキシンフリー水の量は、上記のように測定しようとす
る採取血液量に全く等しい量である必要は必ずしもな
く、抽出が十分になされるなら測定しようとする採取血
液量未満であってもよいが、この場合であっても、抽出
液中のエンドトキシン含量が0.5EU/ml以下であ
る必要がある。
シン含量は、採取血液量と同量のエンドトキシンフリー
水を該容器内に採取し、37℃、1時間の条件で攪拌下
抽出を行ったとき、該抽出液中のエンドトキシン含量が
0.5EU(国際エンドトキシンユニット)/ml以下
である必要がある。なお、上記の抽出を行う際のエンド
トキシンフリー水の量は、上記のように測定しようとす
る採取血液量に全く等しい量である必要は必ずしもな
く、抽出が十分になされるなら測定しようとする採取血
液量未満であってもよいが、この場合であっても、抽出
液中のエンドトキシン含量が0.5EU/ml以下であ
る必要がある。
【0022】後述の実験例から明らかなように、上記測
定容器のエンドトキシン含量が0.5EU/mlを超え
ると、顕著にサイトカインの誘導を引き起こす。従っ
て、本発明による癌化学療法による被験者の免疫機能低
下の測定を正確に行うためには、使用前の測定容器のエ
ンドトキシン含量がサイトカインの誘導を引き起こさな
いレベルでなければならない。
定容器のエンドトキシン含量が0.5EU/mlを超え
ると、顕著にサイトカインの誘導を引き起こす。従っ
て、本発明による癌化学療法による被験者の免疫機能低
下の測定を正確に行うためには、使用前の測定容器のエ
ンドトキシン含量がサイトカインの誘導を引き起こさな
いレベルでなければならない。
【0023】本発明でいうエンドトキシン含量の測定方
法は、第13改正日本薬局方解説書「エンドトキシン試
験法」における発色合成基質の加水分解による発色を指
標とする比色法であり、例えば、市販品のエンドスペシ
ー(生化学工業社製)を用いて測定することができる。
法は、第13改正日本薬局方解説書「エンドトキシン試
験法」における発色合成基質の加水分解による発色を指
標とする比色法であり、例えば、市販品のエンドスペシ
ー(生化学工業社製)を用いて測定することができる。
【0024】本発明において、エンドトキシンを除去も
しくは失活させる方法としては、加熱処理、酸、アルカ
リ処理による不活化やメンブレンフィルターによる限外
濾過法、アニオン性のキトサン系樹脂やエンドトキシン
に対して特異的に結合するポリミキシンB、エンドトキ
シンに対する抗体を固定化した吸着剤による除去方法
等、公知の種々の方法を用いることができる。本発明の
エンドトキシン以外の生理活性物質を誘導する材料や血
液抗凝固剤については、サイトカインの誘導を起こさな
いレベル以下にする際、加熱処理や酸、アルカリ処理に
よる不活化は、それらの活性を変化させる恐れがあるた
め、限外濾過法、吸着剤による除去方法が好ましい。ま
た、上記エンドトキシン除去操作に用いる器具、容器
は、ガラス製の場合には、250℃、1時間以上の乾熱
処理をし、プラスチック製の場合には、0.2M水酸化
ナトリウム水溶液に浸し、エンドトキシンフリー水で洗
浄し、エンドトキシンを失活させたものを用いる必要が
ある。また、水は、エンドトキシンフリー水を用いる必
要があり、操作環境はクリーンルーム等できる限り二次
的なエンドトキシンの汚染を防止できる環境で実施する
のが好ましい。
しくは失活させる方法としては、加熱処理、酸、アルカ
リ処理による不活化やメンブレンフィルターによる限外
濾過法、アニオン性のキトサン系樹脂やエンドトキシン
に対して特異的に結合するポリミキシンB、エンドトキ
シンに対する抗体を固定化した吸着剤による除去方法
等、公知の種々の方法を用いることができる。本発明の
エンドトキシン以外の生理活性物質を誘導する材料や血
液抗凝固剤については、サイトカインの誘導を起こさな
いレベル以下にする際、加熱処理や酸、アルカリ処理に
よる不活化は、それらの活性を変化させる恐れがあるた
め、限外濾過法、吸着剤による除去方法が好ましい。ま
た、上記エンドトキシン除去操作に用いる器具、容器
は、ガラス製の場合には、250℃、1時間以上の乾熱
処理をし、プラスチック製の場合には、0.2M水酸化
ナトリウム水溶液に浸し、エンドトキシンフリー水で洗
浄し、エンドトキシンを失活させたものを用いる必要が
ある。また、水は、エンドトキシンフリー水を用いる必
要があり、操作環境はクリーンルーム等できる限り二次
的なエンドトキシンの汚染を防止できる環境で実施する
のが好ましい。
【0025】本発明で用いられる測定容器の形状として
は、例えば、チューブ状、プレート状のものが挙げら
れ、チューブ状のものとして、採血管、試験管等が、プ
レート状のものとして、マイクロプレート等が挙げられ
る。
は、例えば、チューブ状、プレート状のものが挙げら
れ、チューブ状のものとして、採血管、試験管等が、プ
レート状のものとして、マイクロプレート等が挙げられ
る。
【0026】上記測定容器のチューブ状のものとして
は、例えば、一端が開口し他端が閉塞してなる有底管体
であって、開口部が栓体によって閉塞可能なものが挙げ
られる。
は、例えば、一端が開口し他端が閉塞してなる有底管体
であって、開口部が栓体によって閉塞可能なものが挙げ
られる。
【0027】上記有底管体としては、例えば、反応後上
記生理活性物質を測定するための遠心分離操作に好適な
試験管状のものであって、サイズとしては、外径が、5
〜30mm、高さ20〜150mm程度のものが挙げら
れる。
記生理活性物質を測定するための遠心分離操作に好適な
試験管状のものであって、サイズとしては、外径が、5
〜30mm、高さ20〜150mm程度のものが挙げら
れる。
【0028】上記測定容器においては、該測定容器に血
液を入れる際に、二次的なエンドトキシンの汚染を引き
起こし、その結果、生理活性物質の誘導が起こり、正確
な測定ができなくなる恐れがあることから、該測定容器
に予め生理活性物質の産生を誘導する材料及び血液抗凝
固剤を添加し、所定の血液量を採取できるように減圧下
で密栓したものが好適である。
液を入れる際に、二次的なエンドトキシンの汚染を引き
起こし、その結果、生理活性物質の誘導が起こり、正確
な測定ができなくなる恐れがあることから、該測定容器
に予め生理活性物質の産生を誘導する材料及び血液抗凝
固剤を添加し、所定の血液量を採取できるように減圧下
で密栓したものが好適である。
【0029】上記測定容器の材質としては、例えば、プ
ラスチックやガラス等が挙げられる。
ラスチックやガラス等が挙げられる。
【0030】上記プラスチックとしては、熱可塑性樹
脂、熱硬化性樹脂のいずれもが用いられる。
脂、熱硬化性樹脂のいずれもが用いられる。
【0031】上記熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチル
メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフ
タレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチ
レン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸
共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、
エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸
共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が
挙げられる。
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチル
メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフ
タレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチ
レン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸
共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、
エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸
共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が
挙げられる。
【0032】上記熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽
和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリ
レート樹脂等が挙げられる。
和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリ
レート樹脂等が挙げられる。
【0033】上記測定容器のチューブ状のものにおいて
は、その内部を減圧に維持するために、通常、栓体を使
用する。上記栓体の材質としては、例えば、ブチルゴ
ム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマー等が挙げ
られる。上記減圧の程度は、上記測定容器の中に常圧の
検体血液が吸入され得る程度の圧力であればよく、吸入
しようとする検体血液の量によって決められる。
は、その内部を減圧に維持するために、通常、栓体を使
用する。上記栓体の材質としては、例えば、ブチルゴ
ム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマー等が挙げ
られる。上記減圧の程度は、上記測定容器の中に常圧の
検体血液が吸入され得る程度の圧力であればよく、吸入
しようとする検体血液の量によって決められる。
【0034】上記測定容器において、チューブ状のもの
を用いる場合は、採取する血液量は、測定容器の容積に
よって異なるが、通常4〜5mlの容積の容器を用いる
場合であれば、0.5〜2ml程度でよい。また、マイ
クロプレート状のものを用いる場合の採取血液量は、5
0μl〜2ml程度でよい。
を用いる場合は、採取する血液量は、測定容器の容積に
よって異なるが、通常4〜5mlの容積の容器を用いる
場合であれば、0.5〜2ml程度でよい。また、マイ
クロプレート状のものを用いる場合の採取血液量は、5
0μl〜2ml程度でよい。
【0035】上記測定容器中には、必要に応じて血液が
凝固しないように血液抗凝固剤を添加する必要がある。
上記血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合物、クエン酸
化合物、シュウ酸化合物等が挙げられ、ヘパリンナトリ
ウム等が細胞の生物学的反応を阻害しないので好まし
い。上記ヘパリンナトリウムの該測定容器中の収容量と
しては、該測定容器に血液が収容されたときに、その血
液中の濃度が低くなると血液凝固の恐れがあり、高くな
ると細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがある
ので、4〜50u/ml、より好ましくは、8〜20u
/mlになるように収容する。
凝固しないように血液抗凝固剤を添加する必要がある。
上記血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合物、クエン酸
化合物、シュウ酸化合物等が挙げられ、ヘパリンナトリ
ウム等が細胞の生物学的反応を阻害しないので好まし
い。上記ヘパリンナトリウムの該測定容器中の収容量と
しては、該測定容器に血液が収容されたときに、その血
液中の濃度が低くなると血液凝固の恐れがあり、高くな
ると細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがある
ので、4〜50u/ml、より好ましくは、8〜20u
/mlになるように収容する。
【0036】上記測定容器の製造方法としては、例え
ば、内部を減圧にすることが可能である容器に、上記生
理活性物質を誘導する材料及び血液抗凝固剤を加え、容
器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をすること
によって製造する。上記測定容器は、エンドトキシンや
雑菌の混入をさけるため、できる限り、クリーンな環境
で製造されるのが好ましく、また、可能であれば、製造
後に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。
ば、内部を減圧にすることが可能である容器に、上記生
理活性物質を誘導する材料及び血液抗凝固剤を加え、容
器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をすること
によって製造する。上記測定容器は、エンドトキシンや
雑菌の混入をさけるため、できる限り、クリーンな環境
で製造されるのが好ましく、また、可能であれば、製造
後に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。
【0037】本発明の一実施態様として、上記内部を減
圧することが可能である測定容器に、上記生理活性物質
を誘導する材料及び血液抗凝固剤を加えることにより製
造した測定容器を用いて、被験者の癌化学療法による免
疫機能低下を測定する方法を以下に述べる。
圧することが可能である測定容器に、上記生理活性物質
を誘導する材料及び血液抗凝固剤を加えることにより製
造した測定容器を用いて、被験者の癌化学療法による免
疫機能低下を測定する方法を以下に述べる。
【0038】血管または採血容器と上記測定容器とを連
通させ、上記測定容器中に検体血液を吸入させる。次い
で、上記測定容器を適度に振とうしながら、血液細胞と
上記生理活性物質の産生を誘導する材料とを反応させ、
血液細胞からサイトカイン等の生理活性物質を産生させ
る。反応後、静置もしくは遠心分離により、血球と血漿
とに分離して、血液細胞から産生されたサイトカイン等
の生理活性物質の血漿中濃度をそれを定量可能な試薬に
より定量する。
通させ、上記測定容器中に検体血液を吸入させる。次い
で、上記測定容器を適度に振とうしながら、血液細胞と
上記生理活性物質の産生を誘導する材料とを反応させ、
血液細胞からサイトカイン等の生理活性物質を産生させ
る。反応後、静置もしくは遠心分離により、血球と血漿
とに分離して、血液細胞から産生されたサイトカイン等
の生理活性物質の血漿中濃度をそれを定量可能な試薬に
より定量する。
【0039】上記採血容器と上記測定容器を連通される
方法としては、例えば、マルチプル注射針(両端が搾針
でき、かつ連通されている採血針)を用いる方法や、採
血容器を注射針付きの注射筒としておき、上記注射針を
上記測定容器の栓体に突き刺す方法等が挙げられる。
方法としては、例えば、マルチプル注射針(両端が搾針
でき、かつ連通されている採血針)を用いる方法や、採
血容器を注射針付きの注射筒としておき、上記注射針を
上記測定容器の栓体に突き刺す方法等が挙げられる。
【0040】上記の血液と上記生理活性物質を誘導する
材料との反応温度は、上記生理活性物質の産生が効率的
に行われ、過度の溶血を引き起こさない温度である15
〜42℃が良く、より好ましくは、30〜40℃であ
る。反応時間は、上記生理活性物質の産生が効率的に行
われ、過度の溶血を引き起こさない反応時間である1〜
48時間が良く、より好ましくは、2〜24時間であ
る。
材料との反応温度は、上記生理活性物質の産生が効率的
に行われ、過度の溶血を引き起こさない温度である15
〜42℃が良く、より好ましくは、30〜40℃であ
る。反応時間は、上記生理活性物質の産生が効率的に行
われ、過度の溶血を引き起こさない反応時間である1〜
48時間が良く、より好ましくは、2〜24時間であ
る。
【0041】本発明の血液細胞から産生されたサイトカ
イン等の生理活性物質の血漿中濃度の定量方法の一態様
を以下に詳述する。
イン等の生理活性物質の血漿中濃度の定量方法の一態様
を以下に詳述する。
【0042】血液と上記生理活性物質を誘導する材料と
を上記測定容器の中で反応させ、生理活性物質を誘導
し、誘導後の血液を1600Gで遠心して、血球成分と
血漿成分を分離させる。次いで、分離された血漿を、上
記生理活性物質に対するモノクローナル抗体を固定化し
たマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより
添加し、37℃で2時間反応させる。次いで、反応後の
血漿液を吸引除去等の手段で廃棄し、さらに、未反応成
分を除くため、Tween20等のノニオン系の界面活
性剤を含有する中性pHの洗浄用緩衝液で上記ウェルを
洗浄する。次いで、西洋わさびペルオキシダーゼを固定
化した上記生理活性物質に対するポリクローナル抗体を
ピペッティングにより添加し、37℃で1時間反応させ
る。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダーゼ固定
化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗
浄したあと、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含
む基質溶液を添加し、5〜10分間反応させる。次い
で、1M硫酸溶液を添加し、反応を停止させて酵素反応
による基質の発色を450nmの吸光度から測定する。
この測定値と既知濃度の上記生理活性物質を用いて作成
した検量線から、上記生理活性物質の産生誘導量を測定
する。
を上記測定容器の中で反応させ、生理活性物質を誘導
し、誘導後の血液を1600Gで遠心して、血球成分と
血漿成分を分離させる。次いで、分離された血漿を、上
記生理活性物質に対するモノクローナル抗体を固定化し
たマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより
添加し、37℃で2時間反応させる。次いで、反応後の
血漿液を吸引除去等の手段で廃棄し、さらに、未反応成
分を除くため、Tween20等のノニオン系の界面活
性剤を含有する中性pHの洗浄用緩衝液で上記ウェルを
洗浄する。次いで、西洋わさびペルオキシダーゼを固定
化した上記生理活性物質に対するポリクローナル抗体を
ピペッティングにより添加し、37℃で1時間反応させ
る。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダーゼ固定
化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗
浄したあと、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含
む基質溶液を添加し、5〜10分間反応させる。次い
で、1M硫酸溶液を添加し、反応を停止させて酵素反応
による基質の発色を450nmの吸光度から測定する。
この測定値と既知濃度の上記生理活性物質を用いて作成
した検量線から、上記生理活性物質の産生誘導量を測定
する。
【0043】本発明の被験者の癌化学療法による免疫機
能低下を測定する測定キットに使用される血液細胞から
産生される生理活性物質の測定試薬としては、誘導され
た上記生理活性物質の量を定量可能な試薬であれば、特
に限定されないが、例えば、定量しようとする生理活性
物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体及びペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ等の酵素及び各々の酵素の発色基質などを利用した酵
素免疫測定方法が挙げられる。上記測定キットの使用方
法の1例としては、上述の、本発明の測定容器を用いて
被験者の癌化学療法による免疫機能低下を測定する1態
様を説明した方法と同様である。
能低下を測定する測定キットに使用される血液細胞から
産生される生理活性物質の測定試薬としては、誘導され
た上記生理活性物質の量を定量可能な試薬であれば、特
に限定されないが、例えば、定量しようとする生理活性
物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体及びペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ等の酵素及び各々の酵素の発色基質などを利用した酵
素免疫測定方法が挙げられる。上記測定キットの使用方
法の1例としては、上述の、本発明の測定容器を用いて
被験者の癌化学療法による免疫機能低下を測定する1態
様を説明した方法と同様である。
【0044】
【発明の実施の形態】次に、実施例、比較例を挙げて本
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。
【0045】以下の実施例、比較例において、ガラス製
の器具、容器は250℃で2時間の乾熱処理を行い、プ
ラスチック製の器具、容器は市販のエンドトキシンフリ
ーのものを用いるか、予め、0.2M水酸化ナトリウム
水溶液に一晩浸してエンドトキシンを失活させ、十分に
エンドトキシンフリー水で洗浄したものを用いた。ま
た、操作はクリーンベンチ内で行った。
の器具、容器は250℃で2時間の乾熱処理を行い、プ
ラスチック製の器具、容器は市販のエンドトキシンフリ
ーのものを用いるか、予め、0.2M水酸化ナトリウム
水溶液に一晩浸してエンドトキシンを失活させ、十分に
エンドトキシンフリー水で洗浄したものを用いた。ま
た、操作はクリーンベンチ内で行った。
【0046】実施例1 測定容器としてエンドトキシンフリー(抽出液中のエン
ドトキシン含量が0.5EU/ml未満)のポリエチレ
ンテレフタレート製の5mlの採血管(12.6φ×7
5mm)(積水化学社製)を用いた。この測定容器に
E.coli055B5由来エンドトキシン(LBL社
製)を100EUずつ添加して、減圧乾燥した。つい
で、管径に合うブチルゴム製の栓体を試験管の開口部
に、開口部を密栓しないように、軽く載せたあと、減圧
にできる容器内に置き、約0.5mlの血液を吸引でき
るように、665mmHgに減圧したところで、試験管
の開口部を密栓した。
ドトキシン含量が0.5EU/ml未満)のポリエチレ
ンテレフタレート製の5mlの採血管(12.6φ×7
5mm)(積水化学社製)を用いた。この測定容器に
E.coli055B5由来エンドトキシン(LBL社
製)を100EUずつ添加して、減圧乾燥した。つい
で、管径に合うブチルゴム製の栓体を試験管の開口部
に、開口部を密栓しないように、軽く載せたあと、減圧
にできる容器内に置き、約0.5mlの血液を吸引でき
るように、665mmHgに減圧したところで、試験管
の開口部を密栓した。
【0047】8週齢のICR系雄性マウス(日本SLC
社より購入)を11日間の予備飼育の後、1群12匹と
して使用した。前記マウスに、抗癌剤として、Cis−
Platinum(II)Diamine Dichlo
ride(SIGMA社製)(表1・4中、シスプラチ
ンと表わす)を各群ごとにそれぞれ1、2及び5mg/
kgの用量で、3日間尾静脈内投与した。なお、コント
ロール群には、生理食塩水のみを投与した。
社より購入)を11日間の予備飼育の後、1群12匹と
して使用した。前記マウスに、抗癌剤として、Cis−
Platinum(II)Diamine Dichlo
ride(SIGMA社製)(表1・4中、シスプラチ
ンと表わす)を各群ごとにそれぞれ1、2及び5mg/
kgの用量で、3日間尾静脈内投与した。なお、コント
ロール群には、生理食塩水のみを投与した。
【0048】最終投与の約22時間後に、上記4群のマ
ウス各12匹のうち、各々の群からランダムに6匹ずつ
を選び、ヘパリン(8〜10u/ml)をあらかじめ収
容させたシリンジに27Gの注射針をつけて、約1〜
1.5mlずつ心採血した。この血液を採取したシリン
ジの針をエンドトキシンを添加していないエンドトキシ
ンフリーの採血管及び上記のエンドトキシンを添加した
エンドトキシンフリーの採血管の栓体に突き刺し、各々
の測定容器に血液を約0.5mlずつ添加した。次い
で、37℃で4時間、ゆっくりと攪拌しながら反応させ
た。反応終了後、4℃、1600Gで10分間遠心分離
して、上澄みの血漿を採取した。
ウス各12匹のうち、各々の群からランダムに6匹ずつ
を選び、ヘパリン(8〜10u/ml)をあらかじめ収
容させたシリンジに27Gの注射針をつけて、約1〜
1.5mlずつ心採血した。この血液を採取したシリン
ジの針をエンドトキシンを添加していないエンドトキシ
ンフリーの採血管及び上記のエンドトキシンを添加した
エンドトキシンフリーの採血管の栓体に突き刺し、各々
の測定容器に血液を約0.5mlずつ添加した。次い
で、37℃で4時間、ゆっくりと攪拌しながら反応させ
た。反応終了後、4℃、1600Gで10分間遠心分離
して、上澄みの血漿を採取した。
【0049】採取した血漿中のTNF−α量をTNF−
αモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定キットを用
いて測定した。TNF−α産生量の測定は、Genzy
me社製、商品名、Factor−Test−XTM M
ouse TNF−α ELISA KITを用いた。
なお、この測定方法の測定限界濃度は15pg/mlで
あった。結果を表1に示した。
αモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定キットを用
いて測定した。TNF−α産生量の測定は、Genzy
me社製、商品名、Factor−Test−XTM M
ouse TNF−α ELISA KITを用いた。
なお、この測定方法の測定限界濃度は15pg/mlで
あった。結果を表1に示した。
【0050】なお、使用前の測定容器中のエンドトキシ
ン含量を求めるために、使用した測定容器と同一Lot
の採血管を用いて、以下のような測定を行った。エンド
トキシンフリー水(大塚製薬社製)を約1mlを上記測
定容器に採取し、1時間、37℃で攪拌し、エンドトキ
シンを抽出した。つぎに、この抽出液中のエンドトキシ
ン含量をエンドスペシーES50Mセット(生化学工業
社製)を用いて、マイクロプレート法、赤色測定法にて
測定した。その結果、試験した測定容器のすべてにおい
て0.5EU/mlよりも低いエンドトキシン量であっ
た。
ン含量を求めるために、使用した測定容器と同一Lot
の採血管を用いて、以下のような測定を行った。エンド
トキシンフリー水(大塚製薬社製)を約1mlを上記測
定容器に採取し、1時間、37℃で攪拌し、エンドトキ
シンを抽出した。つぎに、この抽出液中のエンドトキシ
ン含量をエンドスペシーES50Mセット(生化学工業
社製)を用いて、マイクロプレート法、赤色測定法にて
測定した。その結果、試験した測定容器のすべてにおい
て0.5EU/mlよりも低いエンドトキシン量であっ
た。
【0051】比較例1 測定容器としてエンドトキシンフリー(抽出液中のエン
ドトキシン含量が0.5EU/ml未満)の採血管の代
わりに、規格のないポリエチレンテレフタレート製の5
mlの採血管(12.6φ×75mm)(積水化学社
製)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして試験し
た。ただし、血液は、実施例1の4群のマウス各12匹
のうち、各群について実施例1で用いなかった残り6匹
ずつのマウスから採血した血液を用いた。結果を表1に
示した。なお、使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量を求めるために、使用した測定容器と同一Lotの採
血管を用いて、実施例1と同様の測定を行った。その結
果、試験した測定容器のすべてにおいて0.5EU/m
lよりも高いエンドトキシンが測定された。
ドトキシン含量が0.5EU/ml未満)の採血管の代
わりに、規格のないポリエチレンテレフタレート製の5
mlの採血管(12.6φ×75mm)(積水化学社
製)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして試験し
た。ただし、血液は、実施例1の4群のマウス各12匹
のうち、各群について実施例1で用いなかった残り6匹
ずつのマウスから採血した血液を用いた。結果を表1に
示した。なお、使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量を求めるために、使用した測定容器と同一Lotの採
血管を用いて、実施例1と同様の測定を行った。その結
果、試験した測定容器のすべてにおいて0.5EU/m
lよりも高いエンドトキシンが測定された。
【0052】
【表1】
【0053】実施例2 抗癌剤として、Cis−Platinum(II)Dia
mine Dichloride(SIGMA社製)の
代わりに、5−Fuluoro Uracil(和光純
薬社製)を用い、投与用量をそれぞれ1、5及び20m
g/kgとした以外は、実施例1と同様に行った。結果
を表2に示した。
mine Dichloride(SIGMA社製)の
代わりに、5−Fuluoro Uracil(和光純
薬社製)を用い、投与用量をそれぞれ1、5及び20m
g/kgとした以外は、実施例1と同様に行った。結果
を表2に示した。
【0054】比較例2 抗癌剤として、Cis−Platinum(II)Dia
mine Dichloride(SIGMA社製)の
代わりに、5−Fuluoro Uracil(和光純
薬社製)を用い、投与用量を1、5及び20mg/kg
とした以外は、比較例1と同様に行った。ただし、血液
は、実施例2の4群のマウス各12匹のうち、各群につ
いて実施例2で用いなかった残り6匹ずつののマウスか
ら採血した血液を用いた。結果を表2に示した。
mine Dichloride(SIGMA社製)の
代わりに、5−Fuluoro Uracil(和光純
薬社製)を用い、投与用量を1、5及び20mg/kg
とした以外は、比較例1と同様に行った。ただし、血液
は、実施例2の4群のマウス各12匹のうち、各群につ
いて実施例2で用いなかった残り6匹ずつののマウスか
ら採血した血液を用いた。結果を表2に示した。
【0055】
【表2】
【0056】実施例3 抗癌剤としてCis−Platinum(II)Diam
ine Dichloride(SIGMA社製)の代
わりに、Cyclophosphamide(SIGM
A社製)を用い、投与用量をそれぞれ1、5及び10m
g/kgとした以外は、実施例1と同様に行った。結果
を表3に示した。
ine Dichloride(SIGMA社製)の代
わりに、Cyclophosphamide(SIGM
A社製)を用い、投与用量をそれぞれ1、5及び10m
g/kgとした以外は、実施例1と同様に行った。結果
を表3に示した。
【0057】比較例3 抗癌剤としてCis−Platinum(II)Diam
ine Dichloride(SIGMA社製)の代
わりに、Cyclophosphamide(SIGM
A社製)を用い、投与用量をそれぞれ1、5及び10m
g/kgとした以外は、比較例1と同様に行った。ただ
し、血液は、実施例3の4群のマウス各12匹のうち、
各群について実施例3で用いなかった残り6匹ずつのの
マウスから採血した血液を用いた。結果を表3に示し
た。
ine Dichloride(SIGMA社製)の代
わりに、Cyclophosphamide(SIGM
A社製)を用い、投与用量をそれぞれ1、5及び10m
g/kgとした以外は、比較例1と同様に行った。ただ
し、血液は、実施例3の4群のマウス各12匹のうち、
各群について実施例3で用いなかった残り6匹ずつのの
マウスから採血した血液を用いた。結果を表3に示し
た。
【0058】
【表3】
【0059】比較例4 20mg/mlのEDTA・2K溶液を10μl入れた
エッペンドルフチューブに実施例1で用いた血液を0.
2mlずつ入れて、生理食塩水で2倍に希釈した。次い
で、Sysmex−K1000(東亜医用電子社製)に
て、白血球数を測定した。結果を表4に示した。
エッペンドルフチューブに実施例1で用いた血液を0.
2mlずつ入れて、生理食塩水で2倍に希釈した。次い
で、Sysmex−K1000(東亜医用電子社製)に
て、白血球数を測定した。結果を表4に示した。
【0060】比較例5 実施例2で用いた血液について、比較例4と同様の測定
をおこなった。結果を表4に示した。
をおこなった。結果を表4に示した。
【0061】比較例6 実施例3で用いた血液について、比較例4と同様の測定
をおこなった。結果を表4に示した。
をおこなった。結果を表4に示した。
【0062】
【表4】
【0063】実施例1〜3より、エンドトキシンフリー
(抽出液中のエンドトキシン含量が0.5EU/ml未
満)の測定容器を用いた場合は、生理活性物質を誘導す
る材料としてエンドトキシンを添加しない場合は、TN
F−αの産生は認められなかった。
(抽出液中のエンドトキシン含量が0.5EU/ml未
満)の測定容器を用いた場合は、生理活性物質を誘導す
る材料としてエンドトキシンを添加しない場合は、TN
F−αの産生は認められなかった。
【0064】比較例1〜3より、エンドトキシンフリー
の測定容器を用いない場合は、生理活性物質を誘導する
材料としてエンドトキシンを添加しない場合でも、TN
F−αの産生が認めらた。
の測定容器を用いない場合は、生理活性物質を誘導する
材料としてエンドトキシンを添加しない場合でも、TN
F−αの産生が認めらた。
【0065】実施例1〜3より、エンドトキシンフリー
の測定容器を用い、生理活性物質を誘導する材料として
一定量のエンドトキシンを添加した場合は、抗癌剤の投
与用量に応じ、生理食塩水投与群に対して、有意なTN
F−α産生能の低下がみられた。
の測定容器を用い、生理活性物質を誘導する材料として
一定量のエンドトキシンを添加した場合は、抗癌剤の投
与用量に応じ、生理食塩水投与群に対して、有意なTN
F−α産生能の低下がみられた。
【0066】比較例1〜3より、エンドトキシンフリー
の測定容器を用いないで、生理活性物質を誘導する材料
として、一定量のエンドトキシンを添加した場合は、抗
癌剤の投与用量に応じて、有意な傾向がみられなかっ
た。
の測定容器を用いないで、生理活性物質を誘導する材料
として、一定量のエンドトキシンを添加した場合は、抗
癌剤の投与用量に応じて、有意な傾向がみられなかっ
た。
【0067】比較例4〜6より、従来、抗癌剤による免
疫機能低下の指標として用いられてきた白血球数は、抗
癌剤の投与量に応じて、有意な傾向がみられなかった。
疫機能低下の指標として用いられてきた白血球数は、抗
癌剤の投与量に応じて、有意な傾向がみられなかった。
【0068】参考例1 測定容器としてエンドトキシンフリー(抽出液中のエン
ドトキシン含量が0.5EU/ml未満)のポリエチレ
ンテレフタレート製の5mlの採血管(12.6φ×7
5mm)(積水化学社製)を用いた。注射器(テルモ社
製、テルモシリンジ)に、ヘパリンナトリウム(ノボ・
ノルディクスA/S社製、商品名ノボ・ヘパリン注10
00)を予め35Uとって、健常人の肘静脈から20m
lの血液を採血した。この血液を上記の測定容器に約1
mlずつ分注して、E.coliUKT−B由来エンド
トキシン(日本薬局方標準品)を各々の測定容器に、0
EU/ml、0.1EU/ml、0.2EU/ml、
0.5EU/ml、1EU/ml、2EU/ml、5E
U/ml、10EU/mlになるように0.05ml添
加した。 次いで、37℃で4時間、ゆっくりと攪拌し
ながら反応させた。反応終了後、4℃、1600Gで1
0分間遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。
ドトキシン含量が0.5EU/ml未満)のポリエチレ
ンテレフタレート製の5mlの採血管(12.6φ×7
5mm)(積水化学社製)を用いた。注射器(テルモ社
製、テルモシリンジ)に、ヘパリンナトリウム(ノボ・
ノルディクスA/S社製、商品名ノボ・ヘパリン注10
00)を予め35Uとって、健常人の肘静脈から20m
lの血液を採血した。この血液を上記の測定容器に約1
mlずつ分注して、E.coliUKT−B由来エンド
トキシン(日本薬局方標準品)を各々の測定容器に、0
EU/ml、0.1EU/ml、0.2EU/ml、
0.5EU/ml、1EU/ml、2EU/ml、5E
U/ml、10EU/mlになるように0.05ml添
加した。 次いで、37℃で4時間、ゆっくりと攪拌し
ながら反応させた。反応終了後、4℃、1600Gで1
0分間遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。
【0069】採取した血漿中のTNF−α、IL−1
β、IL−6の各サイトカイン量を各々のモノクローナ
ル抗体を用いた酵素免疫測定キットを用いて測定した。
TNF−α産生量の測定は、Genzyme社製、商品
名、PREDICTA Human TNF−α EL
ISA KITを用いて行った。なお、この測定方法の
検出限界濃度は、15pg/mlであった。また、IL
−1β産生量の測定は、Genzyme社製、商品名、
PREDICTA Human IL−1β ELIS
A KITを用いて行った。なお、この測定方法の検出
限界濃度は、35pg/mlであった。また、IL−6
産生量の測定は、Genzyme社製、商品名、PRE
DICTA Human IL−6 ELISA KI
Tを用いて行った。なお、この測定方法の検出限界濃度
は、35pg/mlであった。結果を表5に示した。こ
の結果から、エンドトキシン含量が0.5EU/ml以
上では、TNF−α、IL−1β、IL−6等の生理活
性物質の産生誘導が起こることが明らかである。
β、IL−6の各サイトカイン量を各々のモノクローナ
ル抗体を用いた酵素免疫測定キットを用いて測定した。
TNF−α産生量の測定は、Genzyme社製、商品
名、PREDICTA Human TNF−α EL
ISA KITを用いて行った。なお、この測定方法の
検出限界濃度は、15pg/mlであった。また、IL
−1β産生量の測定は、Genzyme社製、商品名、
PREDICTA Human IL−1β ELIS
A KITを用いて行った。なお、この測定方法の検出
限界濃度は、35pg/mlであった。また、IL−6
産生量の測定は、Genzyme社製、商品名、PRE
DICTA Human IL−6 ELISA KI
Tを用いて行った。なお、この測定方法の検出限界濃度
は、35pg/mlであった。結果を表5に示した。こ
の結果から、エンドトキシン含量が0.5EU/ml以
上では、TNF−α、IL−1β、IL−6等の生理活
性物質の産生誘導が起こることが明らかである。
【0070】
【表5】
【0071】
【発明の効果】本発明では、エンドトキシン含量が管理
された測定容器(抽出液中のエンドトキシン含量が0.
5EU/ml以下)を用いるため、細胞の不要な活性化
が惹起される問題もなく、正確に血液細胞、特に白血球
のサイトカイン等の生理活性物質の産生能力を測定する
ことができる。また、全血をそのまま利用することがで
き、血液から単球やリンパ球等を分離する必要がないた
め、操作が簡単化され、分離操作に伴う活性低下の問題
も解消される。また、被験者から血液を採血後、ピペッ
ティング等の手段で血液を種々の測定容器に移し替えた
り、細胞分離、細胞培養等の操作を必要としないため、
試験者は、肝炎、AIDS等の種々の感染症に感染する
危険性もほとんどないうえに、測定時間も短縮でき、R
I施設やフローサイトメーター等の高価な装置も必要と
しない。そのため、本方法は、白血球の生理活性物質の
産生能力を指標とした被験者の癌化学療法による免疫機
能低下を従来よりも、精度良く、簡単に測定することを
可能にする。
された測定容器(抽出液中のエンドトキシン含量が0.
5EU/ml以下)を用いるため、細胞の不要な活性化
が惹起される問題もなく、正確に血液細胞、特に白血球
のサイトカイン等の生理活性物質の産生能力を測定する
ことができる。また、全血をそのまま利用することがで
き、血液から単球やリンパ球等を分離する必要がないた
め、操作が簡単化され、分離操作に伴う活性低下の問題
も解消される。また、被験者から血液を採血後、ピペッ
ティング等の手段で血液を種々の測定容器に移し替えた
り、細胞分離、細胞培養等の操作を必要としないため、
試験者は、肝炎、AIDS等の種々の感染症に感染する
危険性もほとんどないうえに、測定時間も短縮でき、R
I施設やフローサイトメーター等の高価な装置も必要と
しない。そのため、本方法は、白血球の生理活性物質の
産生能力を指標とした被験者の癌化学療法による免疫機
能低下を従来よりも、精度良く、簡単に測定することを
可能にする。
Claims (5)
- 【請求項1】 使用前の測定容器中のエンドトキシン含
量が、測定しようとする液量に等しい水を採取して抽出
を行ったときの抽出液中の濃度として、0.5EU/m
l以下とされている測定容器に血液を採取し、血液と接
触させることにより該血液中に生理活性物質の産生を誘
導する材料と反応させ、該血液中に産生される生理活性
物質の量を測定することを特徴とする被験者の癌化学療
法による免疫機能低下の測定方法。 - 【請求項2】 血液と接触させることにより該血液中に
生理活性物質の産生を誘導する材料が、予め血液と接触
可能な状態に収納されていることを特徴とする請求項1
記載の被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方
法。 - 【請求項3】 血液と接触させることにより該血液中に
生理活性物質の産生を誘導する材料がエンドトキシンで
あり、該エンドトキシンの血液と接触させた際の全液中
の濃度が、0.6〜100000EU/mlとなるよう
にされていることを特徴とする請求項1又は2記載の被
験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法。 - 【請求項4】 測定容器内が減圧にされていることを特
徴とする請求項1、2又は3記載の被験者の癌化学療法
による免疫機能低下の測定方法。 - 【請求項5】 血液中に産生される生理活性物質の量を
酵素免疫測定により定量することを特徴とする請求項
1、2、3又は4記載の被験者の癌化学療法による免疫
機能低下の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11168478A JP2000081438A (ja) | 1998-06-25 | 1999-06-15 | 被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10-178929 | 1998-06-25 | ||
JP17892998 | 1998-06-25 | ||
JP11168478A JP2000081438A (ja) | 1998-06-25 | 1999-06-15 | 被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000081438A true JP2000081438A (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=26492169
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11168478A Withdrawn JP2000081438A (ja) | 1998-06-25 | 1999-06-15 | 被験者の癌化学療法による免疫機能低下の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2000081438A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009114212A (ja) * | 2000-11-06 | 2009-05-28 | Pharma Mar Sa | 効果的な抗腫瘍治療 |
US8895557B2 (en) | 2004-10-29 | 2014-11-25 | Pharma Mar, S.A., Sociedad Unipersonal | Pharmaceutical formulations of ecteinascidin compounds |
US9192568B2 (en) | 2005-10-31 | 2015-11-24 | Pharma Mar, S.A. | Formulations comprising jorumycin-, renieramycin-, safracin- or saframycin-related compounds for treating proliferative diseases |
-
1999
- 1999-06-15 JP JP11168478A patent/JP2000081438A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009114212A (ja) * | 2000-11-06 | 2009-05-28 | Pharma Mar Sa | 効果的な抗腫瘍治療 |
US8895557B2 (en) | 2004-10-29 | 2014-11-25 | Pharma Mar, S.A., Sociedad Unipersonal | Pharmaceutical formulations of ecteinascidin compounds |
US10322183B2 (en) | 2004-10-29 | 2019-06-18 | Pharma Mar, S.A., Sociedad Unipersonal | Pharmaceutical formulations of ecteinascidin compounds |
US9192568B2 (en) | 2005-10-31 | 2015-11-24 | Pharma Mar, S.A. | Formulations comprising jorumycin-, renieramycin-, safracin- or saframycin-related compounds for treating proliferative diseases |
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A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20080409 |