ITMI20121419A1 - Metodo per la produzione di tabacco volto a ridurre il tenore di nitrosammine. - Google Patents
Metodo per la produzione di tabacco volto a ridurre il tenore di nitrosammine. Download PDFInfo
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Description
"METODO PER LA PRODUZIONE DI TABACCO VOLTO A RIDURRE IL TENORE DI NITROSAMMINE"
del
D E S C R I Z I O N E
Il presente trovato ha come oggetto un metodo di produzione del tabacco.
Il metodo oggetto del presente trovato mira in particolare a ridurre la concentrazione di nitrosammine specifiche (TSNA = Tobacco Specific NitrosAmines) del tabacco.
Come à ̈ noto, le nitrosammine sono ritenute composti cancerogeni (IARC Monographs voi. 89) e la riduzione della loro concentrazione à ̈ un obiettivo primario della ricerca per il contenimento dei danni da consumo di tabacco in genere e da fumo in particolare.
Le nitrosammine specifiche studiate su tabacco (TSNA) sono soprattutto quattro: NNN (N2-NitrosoNorNicotina), NNK (4-(metilnitrosamino)-1 -(3-piridiI)- 1 -butanone), NAB (N2-NitrosoAnaBasina) e NAT (N2-NitrosoAnaTabina).
La presente invenzione non si limita a queste, ma considera per similitudine tutte le nitrosammine presenti nel tabacco allo stato verde o neoformate, attraverso vari meccanismi, nel periodo post-raccolta, ovvero nel periodo compreso tra la raccolta e la cura del tabacco, e tra cura, fermentazione o invecchiamento e stoccaggio del tabacco stesso, fino alla fase di manifattura di prodotti da fumo o da consumo diretto a base di tabacco.
Queste nitrosammine si formano per reazione tra gli alcaloidi del tabacco e vari composti dell'azoto (nitrati, nitriti, NOx), mediata dalla temperatura, daN'umidità e dalla presenza di batteri responsabili dell'attività nitrato reduttasica del tabacco, in condizioni di anaerobiosi.
Il problema delle nitrosammine riguarda tutti i tipi di tabacco: air-cured come il Burley, flue-cured come il Virginia Bright e fire-cured come il Kentucky, per citare i principali tipi e senza escludere altri.
Tuttavia, Ã ̈ stato maggiormente studiato nel Burley e nei tabacchi scuri, in conseguenza di fattori genetici (linee cosiddette "converter" dove la nicotina tende a trasformarsi in nornicotina), agronomici (eccesso di concimazione azotata), condizioni di cura (in particolare tra ingiallimento ed essiccazione) e stoccaggio (temperatura, rimozione dei piccioli delle foglie, ecc.) che tendono a determinare un accumulo di TSNA.
Neirambito dei possibili metodi per contenere la produzione di nitrosammine nel tabacco, sono stati proposti metodi d'induzione di stress meccanico, come il taglio delle radici [Qi Li et Al. in: J. Agronomy & Crop Science 192, 267 — 277 (2006)] o incisioni anulari dello xilema [Krauss et Al. US Pat. US 2003/0056801], in grado di stimolare la produzione di antiossidanti endogeni.
Tuttavia i risultati di queste ricerche, per l'incostanza dei risultati conseguiti ed i costi operativi collegati alle proposte tecniche, non hanno avuto ricadute applicative.
In alternativa, su tabacco Burley (curato ad aria) hanno palesato buoni risultati i trattamenti con UV [Krauss et Al., US 2006/0016125], probabilmente volti . a determinare un certo livello di igienizzazione delle foglie dai batteri, responsabili dell'azione nitrato-reduttasica.
Tuttavia, anche in questo caso, l'impraticabilità operativa ed economica non ne hanno consentito la diffusione.
In alcuni casi sono state proposte anche applicazioni, realizzate secondo varie modalità , di sostanze antiossidanti di origine esogena.
Queste sostanze si ritiene che inibiscano la formazione di nitrosammine agendo da "spazzini" nei riguardi dei nitriti, formati durante la cura e la conservazione del tabacco, i quali promuovono la reazione che dà origine alle nitrosammine.
Le foglie di tabacco allo stato verde contengono significa tive quantità di tocoferoli e polifenoli, in grado di limitare la formazione di TSNA.
Ad esempio, nel Virginia Bright il 28,7% del totale della capacità antiossidante à ̈ costituito da acido clorogenico, e Γ1 1 ,5% da rutina, mentre nel Burley queste percentuali scendono al 13,4 e al 6,2%, rispettivamente.
Tuttavia, queste sostanze tendono a perdersi nel corso della cura: dal 50 all· 80 % nei primi 14 giorni nel Burley, tanto che le concentrazioni di acido clorogenico e rutina scendono a meno del 15% rispetto al tenore che avevano alla raccolta (Li et AL, 2006).
NeN'ambito delle sostanze antiossidanti esogene la bibliografia brevettuale ha preso in esame miscele di antiossidanti, non meglio precisate, in combinazione a bicarbonato di sodio, acido ascorbico, glutatione e selenio (Krauss et al., in US 2003/0056801 A1 del 27-03-2003), oppure l'acido ferulico e suoi esteri (Thomas et al. in US 7,757,697 B2 del 20-07-2010), applicati sia in pre che in post-raccolta del tabacco, in soluzione alcolica ed in miscela a surfattanti.
Tuttavia, le scoperte fin qui codificate in brevetti non hanno ad oggi condotto a processi commerciali, in quanto le modalità di realizzazione delle applicazioni ed il loro costo, legato anche all'uso di antiossidanti di grado farmaceutico, non sono stati in grado di dar luogo a processi percorribili sotto il profilo del risultato tecnico ed economico.
Questo dato di fatto à ̈ stato ribadito al 242° Meeting statunitense della Società per la ricerca sul cancro, che ha aperto i lavori il 28-08-201 1 a Denver (CO) con una relazione dal titolo "Carcinogenic nitrosamines in U.S. cigarettes: Three decades of remarkable neglect by thà ̈ tobacco industry" [Nitrosammine carcinogeniche nelle sigarette USA: 30 anni di rimarchevole dimenticanza da parte dell'industria del tabacco] dove si parla di "apparent lack of effort to control thà ̈ levels of these carcinogens in cigarette tobacco and smoke by thà ̈ cigarette manufacturers" [apparente mancanza di sforzi da parte dei produttori di sigarette di controllare i livelli di questi carcinogeni nel tabacco da sigarette e nel fumo].
Compito del presente trovato à ̈ quello di realizzare un metodo per la produzione di tabacco che superi i problemi della tecnica nota citata sopra.
NeN'ambito di questo compito, uno scopo del trovato à ̈ quello di realizzare un metodo di produzione del tabacco che sia basato sull'uso di un estratto vegetale naturale o di sue frazioni standardizzate, con caratteristiche di antiossidanti.
Questo ed altri scopi, che meglio appariranno evidenziati in seguito, sono raggiunti da un metodo per la produzione del tabacco, caratterizzato dal fatto di comprendere l'uso di estratto di tannini di castagno o sue frazioni per ridurre la formazione di nitrosammine nel tabacco.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'oggetto del presen te trovato risulteranno maggiormente evidenziati attraverso un esame della descrizione di una forma di realizzazione preferita, ma non esclusiva, del trovato, illustrata a titolo indicativo e non limitativo nei disegni allegati, in cui:
la figura 1 mostra il profilo cromatografico relativo all'estratto liquido fraz. 6 di legno di castagno, registrato a 280 nm;
la figura 2 mostra il profilo cromatografico relativo alla soluzione acquosa di estratto secco (spray dried) di legno di castagno, registrato a 280 nm;
la figura 3 Ã ̈ una tabella che illustra come le foglie apicali di una coltura di Virginia Bright cv. VFC-ITB678, provenienti dalla quarta raccolta, siano state suddivise in 7 campioni, con due replicazioni, nell'esempio 4;
la figura 4 mostra i dati relativi al contenuto di nitrosammine relativi ad uno dei campioni della prima serie in analisi (serie L), nell'esempio 4;
la figura 5 mostra il profilo cromatografico relativo all'estratto idroalcolico del campione CHV01 (testimone), acquisito a 254 nm (in alto) e 330 nm (in basso);
la figura 6 Ã ̈ una tabella dell'analisi quali-quantitativa dei singoli metaboliti secondari e della nicotina presenti negli estratti idroalcolici ottenuti dai campioni dell'esempio 5;
la figura 7 mostra un istogramma del contenuto in derivati flavonolici totali e derivati idrossicinnamici totali per un campione, serie CHV, di tabacco varietà Virginia Bright;
la figura 8 mostra un istogramma del contenuto in derivati flavonolici totali e derivati idrossicinnamici totali per un campione, serie PV, di tabacco varietà Virginia Bright;
la figura 9 mostra un istogramma del contenuto in derivati flavonolici totali e derivati idrossicinnamici totali per un campione, serie RB, di tabacco varietà Burley;
la figura 10 mostra un istogramma del contenuto in derivati flavonolici totali e derivati idrossicinnamici totali per un campione, serie BEB, di tabacco varietà Burley;
la figura 11 Ã ̈ una tabella, la quale illustra il contenuto di TSNA misurato sui campioni dell'esempio 4;
la figura 12 Ã ̈ una tabella, la quale illustra il contenuto di TSNA misurato sui campioni dell'esempio 5.
L'estratto di tannini di castagno à ̈ caratterizzato dalla presenza di tannini idrolizzabili, costituiti generalmente da gruppi fenolici come acidi gallici ed ellagici, parzialmente o totalmente esterificati con una molecola di D-glucosio. L'attività antiossidante dell'estratto acquoso, determinata con il saggio FRAP (riduzione del complesso tripiridiltriazina/Fe(l II) alla forma ferrosa blu, con aumento dell'assorbanza a 593 nm), à ̈ superiore a 3500 nmol equivalenti di acido ascorbico per mg di estratto. Il prodotto e sue frazioni standardizzate esercitano anche una moderata azione antimicotica ed antimicrobica.
Inaspettatamente, si à ̈ scoperto che l'applicazione su tabacco dell'estratto di tannini di castagno in acqua, o delle sue frazioni standardizzate, effettuata nel corso della crescita in campo della pianta fino alla raccolta, oppure dopo la raccolta, al confezionamento dei cestoni dove ha luogo la cura del tabacco Virginia Bright (flue-curing), oppure alla formazione delle filze di foglie o di piante intere di tabacco Burley negli appositi capanni di cura (air-curing) oppure subito prima o durante la cura a fuoco (fire-curing) del tabacco Kentucky e successivamente, nel periodo compreso tra cura e manifattura dei prodotti finiti, riduce la formazione di TSNA, senza modificare le altre caratteristiche estrinseche (ad esempio: colore, consistenza e aroma delle foglie) ed intrinseche (ad esempio: tenore in nicotina e zuccheri riduttori) del tabacco, a parità di gradi di maturazione. Le TSNA sono determinate mediante il metodo descritto da Li et Al. in J. Agronomy & Crop Science 192, 267 — 277 (2006).
A differenza di altri antiossidanti fin qui proposti, l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni standardizzate sono inoltre caratterizzati da aromi che non alterano il naturale gusto del tabacco, con vantaggi tecnologici non trascurabili. Inoltre, sono prodotti già usati, anche se con altre finalità , nella produzione agricola del tabacco, ad esempio per la correzione del pH del terreno e dell'acqua irrigua e come stimolante la crescita in base alle domande di brevetto EP 1 464 635 (A1) del 26-08-2003 e EP 2 345 628 (A1 ) del 14-01-11 , rispettivamente a nome di Nuova Rivart S.p.A., attualmente confluita nella richiedente il presente brevetto, e Sadepan Chimica S.p.A., facente parte della holding Saviola. Il presente brevettto costituisce, a tutti gli effetti, una continuazione e sviluppo delle domande di brevetto sopra citate.
Ai fini della presente invenzione, senza però limitarne le possibilità applicative, vengono usati l'estratto di tannini di castagno in forma liquida all' 1 -37% di tannini o sue frazioni, e preferibilmente al 13%. Questi prodotti possono essere distribuiti: 1 ) al terreno in prossimità delle piantine, nei successivi stadi di crescita in semenzaio e in campo, veicolati dall'acqua irrigua o da un fertilizzante appositamente preparato; 2) alla pianta (raccolta a pianta intera) o alle foglie (raccolta per corone) del tabacco nel periodo precedente la raccolta, e specificatamente in corrispondenza della cimatura e nell'intervallo compreso tra 10 giorni prima della raccolta ed immediatamente prima della raccolta, e più specificatamente tra 3 e 1 giorno prima della raccolta. In caso di raccolta effettuata per successive corone, le applicazioni saranno in tal caso in numero corrispondente al numero di raccolte. In caso di raccolta a pianta intera verrà effettuato un unico intervento; 3) alla pianta intera o alle foglie del tabacco raccolte e in fase di allestimento per la successiva cura, da attuarsi secondo le modalità specifiche per i diversi tipi di tabacco: flue-cured, air-cured, fire-cured e sun-cured (tabacchi orientali). In alcuni tipi di tabacco, come il Virginia Bright, il Burley ed il Kentucky, i trattamenti possono aver luogo anche nelle fasi suecessive alla cura e fino alla manifattura dei prodotti finiti, ad esempio durante le fasi di "battitura" (separazione del lembo fogliare dalla costola). Nel caso delle applicazioni al terreno in prossimità delle piantine di tabacco, direttamente o veicolato in acqua irrigua o in un fertilizzante, l'estratto di tannini di castagno in soluzione al 13%, o sue frazioni, vengono applicati a concentrazioni comprese tra 0,1 e 50%, e preferibilmente tra 5 e 10%, somministrando complessivamente -nel corso del ciclo del tabacco in più trattamenti- fino a 50 kg/ha di tannini. Nel caso delle applicazioni alla pianta intera o alle foglie di tabacco prima della raccolta, si interviene a concentrazioni comprese tra 0,1 e 5%, e preferibilmente tra 1 e 3%, distribuendo complessivamente -in successivi trattamenti precedenti le singole raccolte- fino a 20 kg/ha di tannini. Nel caso, infine, delle applicazioni effettuate su tabacco in post-raccolta, si interviene a concentrazioni comprese tra 0,5 e 10%, e preferibilmente tra 1 e 5%. In tal caso, si applicano fino 50 mi di soluzione per metro quadrato di superficie fogliare, corrispondenti a circa 0,65 g di tannino o sue frazioni.
Per effettuare le applicazioni al terreno, l'estratto di tannini o le sue frazioni sono preferibilmente diluiti nell'acqua d'irrigazione oppure in un fertilizzante liquido, usando le normali apparecchiature di miscelazione, e distribuiti, ad esempio, con la tecnica della microirrigazione. Nel caso in cui il veicolo sia costituito da un fertilizzante allo stato solido, questo viene preferibilmente localizzato alla piantina, per aumentarne l'assorbimento. Per le applicazioni alle foglie, sia in pre- che in post-raccolta, l'estratto di tannini di castagno e sue frazioni sono irrorati con le normali apparecchiature in uso presso le aziende agrarie, che spruzzano i prodotti liquidi effettuandone una buona nebulizzazione, così da aumentare la superficie di contatto tra goccioline e pagina fogliare.
I seguenti esempi vengono forniti solo a scopo illustrativo della presente invenzione e non devono essere intesi in senso limitativo dell'ambito di protezione, quale risulta definito dalle accluse rivendicazioni.
Esempio 1
Esempio di frazionamento dell'estratto di tannini di castagno e delle frazioni utilizzabili.
Sono stati analizzati campioni provenienti da un impianto di estrazione acquosa a caldo di legno di castagno e frazionamento a freddo mediante tecnologia a membrane.
In particolare, le frazioni prese in esame sono state:
Brodi tannici filtrati;
Permeato da nanofiltrazione I;
Concentrato da nanofiltrazione I;
Concentrato da nanofiltrazione II;
Permeato da nanofiltrazione II;
Concentrato da nanofiltrazione III;
Permeato osmosi;
Concentrato osmosi;
Sedimentato da chiarificazione.
Per l'analisi HPLC à ̈ stata utilizzata una colonna Luna C18 250x4.60 mm, 5/ym (Phenomenex, Torrance, CA), la fase mobile impiegata à ̈ costituita da H20 (pH 3.2 per HCOOH), (A) e CH3CN (B). È stato applicato un gradiente lineare a quattro rampe, flusso 0,8 mL/min, per 55 minuti. Il profilo di eluizione utilizzato à ̈ il seguente: inizialmente 100% A , quindi il solvente A à ̈ stato portato all'85% in 20 min, mantenuto costante per 5 min, diminuito al 75% in 10 min, mantenuto costante per 8 min, infine riportato allo 0% (100% B) in 5 min e mantenuto costante per 4 min per poi tornare alle condizioni iniziali in 3 min. I derivati gallici sono stati calibrati a 280 nm con acido gallico, quelli ellagici a 254 nm con acido ellagico.
Nelle figure 1 e 2 si riportano, a titolo di esempio, i profili cromatografici relativi a due frazioni: la prima, liquida, ottenuta da concentrazione mediante nanofiltrazione (frazione 6), con peso specifico 1 ,06 (Fig. 1 ), e la seconda ottenuta per spray drying a partire da quest'ultima (Fig. 2).
I numeri di riferimento della Fig. 1 si riferiscono ai seguenti componenti: 1. Acido gallico; 2. Monogalloil glucosio; 3. Gallotannino m/z 677; 4. Pentagalloil glucosio; 5. Galloil-HHDP glucosio; 6. HHDP glucosio; 7. Ellagitannino m/z 925; 8. Castalagina/vescalagina; 9. Ellagitannino m/z 1085; 10. Acido ellagico.
I numeri di riferimento della Fig. 2 si riferiscono ai seguenti componenti: 1. Monogalloil glucosio; 2. Acido gallico; 3. Digalloil glucosio; 4. Trigalloil glucosio; 5. Tetragalloil glucosio; 6. Pedunculagina isomero; 7. Ellagitannino m/z 683; 8. Ellagitannino m/z 925; 9. Castalagina/vescalagina; 10. Ellagitannino m/z 613; 11. Galloil-HHDP glucosio; 12. Acido ellagico.
Oltre alle precedenti due frazioni sono state analizzate le altre provenienti dallo stesso processo produttivo a membrana.
Esempio 2
Applicazione al terreno e via microirrigazione su V. Bright. L'estratto secco di tannini di castagno dell'esempio 1 Ã ̈ stato applicato ad una coltura di tabacco Virginia Bright in campo in corrispondenza di due fasi: al momento del trapianto, nell'acqua usata per bagnare la piantina (200 ml/pianta della soluzione al 5% p/p) e in fertirrigazione, in tre trattamenti, alla dose di 4,5 kg/ha, previo scioglimento del prodotto in acqua ed iniezione in manichetta del liquido ottenuto.
Dopo la raccolta e la cura in locali per il flue-curing, à ̈ stato programmato il controllo analitico del contenuto di TSNA delle foglie di tabacco così trattate in confronto ad un testimone, coltivato in tutto e per tutto allo stesso modo, salvo che per il trattamento sperimentale.
L'analisi delle foglie dopo la cura à ̈ in fase di completamento.
Esempio 3
Applicazione in pre-raccolta su tabacco V. Bright
L'estratto di tannini di castagno fraz. 6 à ̈ stato applicato ad una coltura di tabacco Virginia Bright in campo in corrispondenza della fase di cimatura, e più precisamente, nell'intervallo compreso tra questo intervento, che consiste nella rimozione dell'infiorescenza apicale della pianta insieme alle ultime foglioline, e 48-24 ore prima delle successive 3-4 raccolte.
Queste hanno luogo per successive corone, appena ciascuna raggiunge la maturità tecnologica, ben nota all'esperto del settore.
La frazione à ̈ stata diluita in acqua a concentrazioni comprese tra lo 0,005 e lo 3% di tannini. In particolare, le soluzioni con concentrazione compresa tra 0,5 e 1 % di tannini non hanno determinato fitotossicità sulla pianta, quando applicate su vegetazione turgida e con temperature inferiori a 20°C, mediante ugelli in grado di polverizzare finemente il getto sulle foglie. In un'esperienza sono stati applicati 150 l/ha di soluzione all' 1 % per 4 volte; ciascun trattamento ha avuto luogo nell'intervallo compreso tra la cimatura e 24 ore prima di una raccolta, interessando precisamente i palchi fogliari maturi e quindi pronti per questo intervento.
Dopo la raccolta e la cura in locali per il flue-curing, à ̈ stato programmato il controllo analitico del contenuto di TSNA delle foglie di tabacco così trattate in confronto ad un testimone, coltivato in tutto e per tutto allo stesso modo, salvo che per il trattamento sperimentale.
L'analisi delle foglie dopo la cura à ̈ in fase di completamento.
Esempio 4
Applicazione in post-raccolta su tabacco V. Bright, svolta presso la Fattoria Autonoma Tabacchi di Città di Castello (PG) (coltivatore in area Città di Castello).
Come illustrato nella tabella di figura 3, le foglie apicali di una coltura di Virginia Bright cv. VFC-ITB678, provenienti dalla quarta raccolta, sono state suddivise in 7 campioni, con due replicazioni, sottoposte ai trattamenti sperimentali descritti, e curate secondo la buona pratica, nota all'esperto del settore.
Il Teavigo, estratto concentrato da tà ̈ verde utilizzato nel settore biomedico e negli alimenti funzionali, à ̈ costituito essenzialmente da monomeri galloilati di tannini condensati, la cui concentrazione à ̈ del 97% (HPLC); quindi la concentrazione di 5 g/l equivale a circa 10 mM di tannini.
Il Teavigo à ̈ stato volutamente scelto per queste sperimentazioni in virtù delle dimostrate attività antimicrobiche ed antimicotiche su microorganismi di interesse biomedico ed alimentare.
Il tannino di castagno à ̈ una miscela di frazioni 1 -8, con titolo in tannini del 4,6% (HPLC); quindi la concentrazione di 1 15 g/l equivale a circa 10 mM di tannini.
Di seguito à ̈ descritto il metodo di preparazione dei campioni per le analisi.
Pesate per lavaggi ed estratti acquosi a caldo:
CHV01 : 752.1 mg
CHV02: 752.6 mg
CHV03: 752.0 mg
CHV04: 749.8 mg
CHV05: 751.4 mg
CHV06: 749.6 mg
CHV07: 750.6 mg
CHV05 per decotto senza lavaggio: 751.7 mg
I campioni pesati sono stati tagliati in pezzi di piccole dimensioni.
Lavaggi:
I campioni 1-7 sono stati posti in beuta e lavati agitandoli manualmente per circa 2'30" con 10.0 mL di acqua millipore. L'acqua di lavaggio à ̈ stata prelevata con una pipetta, quindi un volume esatto della soluzione di lavaggio à ̈ stato concentrato 5:1 , centrifugato e messo in vial.
Estratti acquosi a caldo:
I campioni precedentemente lavati sono stati lasciati asciugare, quindi sono stati mantenuti a ebollizione, sotto agitazione, con 50.0 mL di acqua millipore per 15'. Gli estratti ottenuti sono stati lasciati freddare, filtrati a pressione ridotta, portati a volume esatto, centrifugati e posti in vial per l'analisi HPLC/DAD/ESI-MS.
Estratto acquoso a caldo senza lavaggio:
Il campione n°8 (ulteriore pesata del CHV05) Ã ̈ stato po sto in beuta, senza preventivo lavaggio, con 50.0 mL di acqua millipore e mantenuto ad ebollizione per 15', quindi lasciato freddare e filtrato a pressione ridotta. E' stato quindi portato a volume esatto e posto in vial.
Estratti idroalcolici:
Per ciascun campione (CHV01- CHV07) à ̈ stato pesato 1 .0 g di materiale vegetale. Il materiale pesato à ̈ stato tagliato in piccoli pezzi e posto sotto agitazione in 50.0 mL di soluzione EtOH/H20 70:30 a pH 3.2 per acido formico.
Dopo 20 h i campioni sono stati filtrati a pressione ridotta, portati a volume esatto e posti in vial.
Attraverso le metodiche di preparazione di cui sopra, sono stati preparati i seguenti campioni:
Lavaggi: CHV01 L, CHV02L, CHV03L, CHV04L, CHV05L, CHV06L, CHV07L (serie L).
Estratti acquosi a caldo dopo lavaggio: CHV01 D, CHV02D, CHV03D, CHV04D, CHV05D, CHV06D, CHV07D (serie D).
Estratto acquoso a caldo senza lavaggio: CHV05DT.
Estratti idroalcolici: CHV01 E, CHV02E, CHV03E, CHV04E, CHV05E, CHV06E, CHV07E (serie E).
ANALISI QUALI-QUANTITATIVA HPLC/DAD E
HPLC/DAD/MS
Le analisi sono state condotte al fine di valutare il contenuto delle foglie trattate sia in nicotina, nitrosammine e in particolare TSNA (Tobacco Specific NitrosAmines), sia in metaboliti secondari prodotti dalla pianta.
L'analisi HPC/DAD/MS HPLC à ̈ stata eseguita utilizzando una colonna Luna C18 250x4.60 mm, 5Î1⁄4ιτι (Phenomenex, Torrance, CA). La fase mobile impiegata à ̈ costituita da H20 acidificata a pH 3.2 per HCOOH (A) e CH3CN (B). È stato applicato un gradiente lineare a quattro rampe, flusso 0,8 mL/min, per 55 minuti. Il profilo di eluizione utilizzato à ̈ il seguente: inizialmente 100% A , quindi il solvente A à ̈ stato portato all'85% in 20 min, mantenuto costante per 5 min, diminuito al 75% in 10 min, mantenuto costante per 8 min, infine riportato allo 0% (100% B) in 5 min. I derivati idrossicinnamici sono stati calibrati a 330 nm, quelli flavonolici a 350 nm e nicotina e derivati a 254 nm.
Nella figura 4 si riportano, a titolo di esempio, i dati relativi al contenuto in nicotina e nitrosammine relativi ad uno dei campioni della prima serie in analisi (serie L).
Per i parametri chimici i valori di incertezza estesa sono riferiti ad un intervallo di confidenza del 95%.
Il limite di determinazione (LOD) risulta uguale a 1 /10LOQ*3.
N.D. - inferiore a LOQ (limite di quantificazione).
I nitriti, precursori delle nitrosammine, non si formano quando i livelli di antiossidanti polifenolici, acidi idrossicinnammici e flavonoidi, sono alti in contenuto quali-quantitativo. La procedura adottata ha consistito nella valutazione della quantità di molecole, applicate tramite trattamento superficiale, consumate da ciascun campione durante il tempo di cura e il contenuto totale e di singole molecole di metaboliti antiossidanti presenti. Solitamente il campione non trattato mantiene un contenuto più basso di antiossidanti di tutela che aumentano in contenuto quali-quantitativo nei diversi campioni trattati e con diversi livelli di trattamento. Tutti i campioni sono risultati conformi sotto soglia legale di contenuto di nitrosammine igienesicurezza, cosicché si può affermare che il metodo ritrovato risulta in grado di garantire e assicurare qualità ed igiene dei campioni nel tempo. Si può inoltre affermare che il positivo aumento di antiossidanti naturalmente presenti nel tabacco, possa garantire, con attività sinergica, la tutela della qualità nel tempo dei campioni, evitando l'aumento del tenore di nitrosammine nelle fasi di stoccaggio.
Nella figura 5, si illustra, a titolo di esempio, il profilo cromatografico relativo all'estratto idroalcolico di foglie di tabacco trattate in cura senza aggiunta di soluzione di tannini (CHV01 , testimone), con la legenda dei composti identificati.
I numeri di riferimento della figura 5 identificano i seguenti componenti: 1. nicotina; 2. acido monocaffeoil chinico I; 3. acido monocaffeoil chinico II; 4. acido monocaffeoil chinico III; 5. quercetina ramnosil-glucoside; 6. kaempferolo ramnosilglucoside.
Come mostrato in figura 5, e nella successiva tabella di figura 6, il metodo di analisi descritto permette di identificare e quantificare gli alcaloidi presenti nelle foglie di tabacco ma anche le sostanze di natura polifenolica dotate di attività antiossidante ed antiradicalica. I singoli derivati sono stati calibrati utilizzando specifiche curve di calibrazione secondo il metodo sopra descritto, in modo da ottenere i dati quantitativi relativi sia ai singoli composti che alle sottoclassi chimiche.
Nella tabella di figura 6 Ã ̈ riportata l'analisi qualiquantitativa dei singoli metaboliti secondari e della nicotina presenti negli estratti idroalcolici ottenuti dai campioni presi in esame, con i dati espressi in milligrammi per grammo di materiale vegetale campionato.
Gli istogrammi riportati nelle figure 7-10 mostrano il contenuto in derivati flavonolici totali e derivati idrossicinnamici totali valutato per quattro serie di campioni, di cui i primi due (serie CHV e PV) sono costituiti da foglie di tabacco varietà Virginia Brighi e gli altri due (serie RB e BEB) da foglie di tabacco varietà Burley.
Le analisi sono state eseguite con lo stesso metodo descritto su estratti idroalcolici di foglie di tabacco dopo il processo di cura, ed i risultati sono espressi in milligrammi di polifenoli per grammo di materiale vegetale.
Ognuna delle quattro prese in esame à ̈ una serie di campioni di tabacco su cui sono stati effettuati i sei diversi trattamenti con soluzioni di tannino di castagno, di Teavigo e di tà ̈ verde (10, 100, 200 g/L e 0.5, 5.0, 10.0 g/L rispettivamente). I derivati flavonoiici e quelli idrossicinnamici risultano essere entrambi presenti in tutti i campioni eccetto quelli della serie "RB", dove i derivati idrossicinnamici sono presenti solo in tracce. Il contenuto in nicotina, nell'ambito delle quattro serie analizzate, varia invece tra 12 e 43 mg/g di materiale vegetale.
CONTENUTO IN TSNA - metodo descritto da Li et Al, 2006.
La tabella della figura 1 1 mostra i risultati ottenuti, da cui si evince, a seguito dei trattamenti effettuati, un calo delle TSNA totali rispetto al testimone.
Esempio 5
Applicazione in post-raccolta su tabacco Burley, svolta presso la Fattoria Autonoma Tabacchi di Città di Castello (coltivatore in area Caserta). In post-raccolta, e subito dopo la predisposizione delle filze di foglie appese negli appositi capanni di cura, sono stati effettuati i trattamenti sperimentali alle concentrazioni e dosi previste, sempre ponendo a confronto tannini idrolizzabili di castagno e tannini condensati da tà ̈ verde.
La tabella della figura 12 mostra i risultati ottenuti, da cui si evince, a seguito dei trattamenti effettuati, un calo delle TSNA totali rispetto al testimone.
I risultati indicano che il tabacco oggetto di studio, anche in condizioni di non trattamento, mostra un modesto contenuto in nitrosammine in accordo anche con studi scientifici su Burley casertano che riporta valori di TSNA sotto 1 ppm (Monitoraggio del contenuto in nitrosamine nel tabacco Burley, M.l. Sifola, Deltafina S.p.A., progetto finanziato 2007, dati divulgati 2010).
Il metodo analitico riportato permette quindi di poter individuare e quantificare singolarmente sia gli alcaloidi che le due diverse sottoclassi di metaboliti secondari di natura polifenolica con spiccate proprietà antiossidanti ed antiradicaliche, quali i derivati flavonolici ed idrossicinnammici.
Si à ̈ in pratica constatato come il trovato raggiunga il compito e gli scopi prefissati.
Infatti, come descritto nell'introduzione, i derivati flavonolici e caffeici possiedono elevata capacità antiossidante ed antiradicalica.
Il metodo oggetto della presente invenzione permette quindi non solo di quantificare gli alcaloidi, ma anche di valutare l'attività antiossidante totale e l'attività antiradicalica totale, mai riportata su tessuti fogliari delle due varietà di tabacco analizzate.
Claims (15)
- R I V E N D I C A Z I O N I 1 . Metodo per la produzione del tabacco, caratterizzato dal fatto di comprendere l'uso di estratto di tannini di castagno o sue frazioni per ridurre la formazione di nitrosammine nel tabacco.
- 2. Metodo, secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono concentrati esclusivamente con mezzi fisici, senza impiego di additivi chimici.
- 3. Metodo, secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che i mezzi fisici sono rappresentati preferibilmente da osmosi inversa e nanofiltrazione.
- 4. Metodo, secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono applicati al terreno, in prossimità delle piante, veicolati da acqua irrigua o un fertilizzante.
- 5. Metodo, secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono applicati sulla pianta intera o sulle foglie delle piante di tabacco in pre-raccolta.
- 6. Metodo, secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono applicati sulla pianta intera o sulle foglie delle piante di tabacco in post-raccolta.
- 7. Metodo, secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono applicati in soluzione acquosa a concentrazioni comprese tra 0,1 e 50%, e preferibilmente tra 5 e 10%, in più interventi nel corso del ciclo del tabacco.
- 8. Metodo, secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono applicati in soluzione acquosa a concentrazioni comprese tra 0,1 e 5%, e preferibilmente tra 1 e 3%, in successivi trattamenti precedenti le singole raccolte.
- 9. Metodo, secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che l'estratto di tannini di castagno o sue frazioni sono applicati in soluzione acquosa a concentrazioni comprese tra 0,5 e 10%, e preferibilmente tra 1 e 5%, successivamente alla raccolta.
- 10. Metodo, secondo le rivendicazioni 8 e 9, caratterizzato dal fatto di comprendere l'applicazione fino a 50 mi di soluzione per metro quadrato di superficie fogliare.
- 11 . Metodo, secondo una o più rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal che il tabacco à ̈ del tipo flue-cured, air-cured, fire-cured o sun-cured e loro miscele in tutte le proporzioni.
- 12. Metodo, secondo una o più rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la fase di post-raccolta include l'allestimento del tabacco per la cura, la cura, la cernita, la conservazione e tutte le fasi di lavorazione manifatturiera fino all'approntamento dei prodotti commerciali a base di tabacco, anche in miscela con altre componenti.
- 13. Metodo, secondo una o più rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che l'uso dell'estratto di tannini di castagno o sue frazioni riduce il tenore di nitrosammine del tabacco trattato dal 10 al 50%, rispetto al non trattato.
- 14. Metodo per la produzione del tabacco, caratterizzato dal fatto di comprendere l'uso di Teavigo per ridurre la formazione di nitrosammine nel tabacco.
- 15. Metodo analitico caratterizzato dal fatto di consentire di individuare qualitativamente e quantificare singolarmente sia gli alcaloidi che i metaboliti secondari di natura polifenolica con spiccate proprietà antiossidanti ed antiradicaliche, e in particolare i derivati flavonolici ed idrossicinnammici.
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