HU215090B - Eljárás növényi génszerkezetek és az azokkal transzformált növények előállítására - Google Patents

Eljárás növényi génszerkezetek és az azokkal transzformált növények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215090B
HU215090B HU912484A HU248491A HU215090B HU 215090 B HU215090 B HU 215090B HU 912484 A HU912484 A HU 912484A HU 248491 A HU248491 A HU 248491A HU 215090 B HU215090 B HU 215090B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
plant
sequence
repressor
protein
Prior art date
Application number
HU912484A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT60777A (en
HU912484D0 (en
Inventor
Ian George Bridges
Simon William Jonathan Bright
Andrew James Greenland
Wolfgang Walter Schuch
Original Assignee
Zeneca Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeneca Ltd. filed Critical Zeneca Ltd.
Publication of HU912484D0 publication Critical patent/HU912484D0/hu
Publication of HUT60777A publication Critical patent/HUT60777A/hu
Publication of HU215090B publication Critical patent/HU215090B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8217—Gene switch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S47/00—Plant husbandry
    • Y10S47/01—Methods of plant-breeding and including chromosome multiplication

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás növényi génszerkezetek, valamint az azokkal transzformált növények előállítására. A találmány szerint előállított génszerkezetek haszonnövények termékenységének molekuláris szintű szabályozását teszik lehetővé.
A mezőgazdaságban igen sokféle haszonnövényt termesztenek emberi fogyasztásra szánt élelmiszerek előállítására, emberi fogyasztásra szánt kereskedelmi termékek előállítására, állati takarmányozásra, ipari termékek előállításához és más célokra. Valamennyi termesztési eljárás induló lépése az, hogy a gazdálkodó elveti a magtermelőtől vásárolt növényi magvakat. A termesztési eljárás zárólépésében a haszonnövény értékes részét - például a teljes növényt, vagy a növény gyümölcseit vagy magvait - betakarítják, majd a fenti célok valamelyikére hasznosítják. A gazdálkodó a magtermelőtől vásárolt magvakon kívül a korábbi évek terméseiből visszamaradt magvakat is elvetheti. Ez a megoldás azonban gazdaságossági szempontokból csak növényi beltenyészetek vagy keresztezetlen magvak esetén előnyös. Ez a megoldás gazdaságossági szempontokból előnytelen hibrid növények termesztésekor, amikor a növények heterózisa révén jelentős termékenységfokozódás érhető el. A nagyobb mezőgazdasági területeken nagy tömegben termesztett növényeket rendszerint hibridmagvakból termesztik; ez a megoldás a gazdálkodó számára jelentős termésnövekedést eredményez.
A specializálódott magtermelő társaságok által alkalmazott, hibridmagvakat szolgáltató eljárás költséges és bonyolult művelet. Az eljárás során olyan beltenyésztett szülőnövény-vonalakat kell termeszteni és szelektálni, amelyekből megfelelő kombinációban az adott környezeti feltételekhez maximális mértékben alkalmazkodó és ugyanakkor maximális hozamot szolgáltató utódnövények alakíthatók ki. Hibridmagvak termeléséhez vagy hímivarú, vagy nőivarú beltenyésztett szülőnövényt választanak ki, amelynek keresztezésével FI hibridmagvak termelhetők. Minthogy a legtöbb haszonnövény hímnős, a keresztezésbe bevont nőivarú szülőnövényt hímivartalanítani kell annak érdekében, hogy a magtermelés során kiküszöbölhető legyen a növény önbeporzása. Nyitvatermő növények - például kukorica - esetén speciális termesztési rendszert alkalmaznak annak érdekében, hogy a nőivarú szülőnövény önbeporzását a minimumra szorítsák vissza. A termesztés során elkülönítik egymástól a hímivarú egyedekként és a nőivarú szülőnövényekként felhasználandó növényeket. Ilyen megoldást alkalmazva a szezon végén könnyen elkülöníthetők az FI hibridmagvak.
A növények hímivartalanítására mechanikus megoldások (például kukorica esetén), kézi eljárások (például paradicsom esetén), kémiai műveletek (például búza vagy rizs esetén) vagy genetikus megoldások (például citoplazmaeredetű hímivarú sterilitás (cytoplasmic male sterility, CMS) vagy genetikai inkompatibilitás előidézése olajrepce, cukorrépa és más haszonnövények esetén) alkalmasak. Az ismert megoldások során alkalmazott mezőgazdasági és növénykezelési műveletek bonyolultsági foka ugyan eltérő, közös jellemzőjük azonban, hogy bevezetésük költséges, végrehajtásuk nehézkes, és - az alkalmazott rendszertől függő mértékben többé-kevésbé hatástalanok. A viszonylagos hatástalanság abból ered, hogy az adott növény típusától függő méretű, de rendszerint igen nagy kitelj edésű termőterületen kell a termékeny növényeket magtermelés céljára sterilizálni; így a nőivarú növényeket nagyüzemi méretekben kell kezelni. Alapkövetelmény, hogy az alkalmazott kezelések után kapott magvak a következő generációban - amit a gazdálkodó vet - életképesek legyenek.
A találmány célja a fenti hátrányok kiküszöbölése vagy csökkentése.
A találmány olyan növényi génszerkezet előállítására vonatkozik, amely az élőképes pollen biogenezisének letörésére alkalmas fehérjét kódoló letörő gént tartalmaz, tartalmaz továbbá egy, az adott génszerkezetet tartalmazó növényre külső forrásból felvitt külső kémiai indukálószerrel - amelynek a növényben való jelenléte vagy távolléte vezérli a hímivarú termékenységet - indukálható promotor szekvenciát tartalmazó génvezérlő szekvenciát. Ezt a génszerkezetet a találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy a letörő gént közvetlenül vagy más szekvenciák közbeiktatásával egyesítjük a génvezérlő szekvenciával.
A vezérlő szekvencia előnyösen a letörő gént vezérlő operátor szekvenciát tartalmaz, tartalmaz továbbá egy, a letörő gén operátorával kölcsönhatásba lépő és a letörő fehéije kifejeződését gátló represszor fehéijét kódoló, a kémiailag indukálható promotor által vezérelt represszor gént.
A génszerkezet előnyösen a letörő génhez operatívan kapcsolódó, hímivarú virágokra specifikus promotor szekvenciát is tartalmaz, amely a letörő gén kifejeződését a növény hímivarú virágrészeire korlátozza.
A találmány továbbá a fenti génszerkezetet tartalmazó transzformált növények és növényi részek (például sejtek, protoplasztok és magvak) előállítására vonatkozik.
Egy előnyös megoldás szerint a megfelelő szekvenciák összekapcsolásával növény genomjába illeszthető, a növényen visszafordítható hímivarú sterilitást előidéző olyan rekombináns DNS szerkezetet állítunk elő, amely
a) külső kémiai indukálószer jelenlétére vagy távollétére reagáló első gén promotor szekvenciát,
b) az első promotor szekvencia vezérlése alatt represszor fehéijét kódoló gént,
c) a represszor fehéijére reagáló operátor szekvenciát,
d) egy csak a növény hímivarú részeiben működőképes második gén promotor szekvenciát, és
e) egy, az életképes pollen termelése szempontjából lényeges növényi tulajdonságot gátló fehéijét kódoló gént tartalmaz, ahol a növény hímivarú termékenysége vagy sterilitása a külső kémiai indukálószer jelenlétének vagy távollétének megfelelően változtatható.
A találmány tárgya továbbá eljárás visszafordítható hímivarú sterilitású növények előállítására oly módon, hogy a növények genomjába stabilan beépítjük a fenti rekombináns DNS szerkezetet.
HU 215 090 Β
Előnyös, ha az első promotor a külső kémiai indukálószer által szolgáltatott ingerre reagálva serkenti a represszor fehérje kifejeződését, míg kémiai indukálószer távollétében az operátorral kölcsönhatásba lépni képes represszor fehérje nem fejeződik ki, és így lehetővé válik a hímivarú termékenység inhibitorát kódoló gén kifejeződése. Előnyös tehát, ha a kémiai indukálószer jelenlétében kifejeződik a represszor fehérje, ami megakadályozza a hímivarú termékenység inhibitorát kódoló gén kifejeződését, ezáltal a növény termékeny marad. Ennek megfelelően a találmány szerint előállított szerkezet előnyösen több, egymással operatív kapcsolatban álló szekvenciát tartalmaz. A leírás egyszerűsítése érdekében a továbbiakban a fenti a szekvenciát „kémiai átkapcsolósnak, a b szekvenciát „represszor szekvenciá”-nak, a c szekvenciát „operatorsnak, a d szekvenciát „MFS vezérlés”-nek [azaz hímivarú virágra specifikus (male flower specific) vezérlésnek], míg az e gént „letörő gén”-nek nevezzük. A találmány szerint előállított növényi génszerkezet két kötelező komponense a fenti a és e szekvencia, azaz a kémiai átkapcsoló és a letörő gén, míg a további szekvenciák jelenléte nem kötelező, de rendkívül előnyös. Az egyes szekvenciák lényeges alkotóelemeit és azok kölcsönhatását a későbbiekben a rajzokra hivatkozva ismertetjük. A találmány szerint előállítható génszerkezet egyes elemeiről - az-az a fenti a-e szekvenciáról és azok kialakításáról a későbbiekben a I-IV. fejezetben közlünk részletesebb információkat és példákat. A találmány szerinti eljárásra ezek után, az V. fejezetben közlünk példát.
A találmány olyan természetes állapotú (beltenyészeti) növények termesztését teszi lehetővé, amelyeken molekuláris szintű beavatkozással hímivarú sterilitás idézhető elő. Az ilyen növényeknek a termékenység megfordíthatóságának biztosítására kémiai átkapcsoló rendszerre van szükségük [reverzibilis hímivarú sterilitás (reversible male sterility), RMS]. A rendszer mindkét oldala Mendel-jellemzőként öröklődik. Ezt azáltal érhetjük el, hogy a növény genomjába beépítjük az RMS szabályozott működéséhez szükséges molekuláris elemeket.
A találmány szerinti megoldás a tenyésztő vagy termesztő igényeinek megfelelően bármely egy- vagy kétszikű növényen alkalmazható FI hibridmagvak termelése céljából, ha az adott növény transzformálására megfelelő technika áll rendelkezésre. A találmány szerinti megoldás különösen előnyösen alkalmazható kukoricán, búzán, napraforgón, olaj repcén, paradicsomon és más zöldségféléken, cukorrépán, valamint leveles vagy virágzó dísznövényeken. A találmány szerinti megoldás legfontosabb előnyei a következők: jelentősen csökkenti az FI hibridmagvak termelésével kapcsolatos növénykezelési költségeket; a hibridmagvak tisztasága könnyen szabályozható; RMS termővonalak és populációk tarthatók fenn; az RMS tulajdonság termővonalak és populációk között átadhatóvá válik.
A következőkben példaként olyan növények - elsősorban természetes (beltenyészeti) állapotú növények termelését írjuk le, amelyeket molekuláris szintű technikával sterilizáltunk. Ezek a növények visszafordíthatok termőkké, ha a növényeket a termékenység visszaállítását célzó molekuláris vezérlő kaszkádot működésbe hozó vegyszerrel permetezzük be. A következőkben ismertetendő eljárás több olyan egyedi megoldást tartalmaz, amelyek önálló szabadalmi bejelentések tárgyai; ezeket az egyedi megoldásokat a megfelelő szabadalmi bejelentések részletesebben ismertetik.
1. A folyamat általános ismertetése
Az 1. ábra a találmány szerint előállított DNS szerkezet működésének blokkdiagramja „hímsteril” állapotban. Külső kémiai indukálószer távollétében a kémiai átkapcsoló inaktív, és a represszor szekvencia nem fejez ki represszor fehérjét. Represszor fehérje távollétében az operátor szekvencia lehetővé teszi a letörő fehéije kifejeződését a hímspecifikus szövetekben; az MFS vezérlő szekvencia jelenléte a kifejeződést specifikusan a növény hímivarú részeihez irányítja. A folyamat végeredménye az, hogy a növény hímivarúlag steril, nem képes életképes pollent termelni, így önbeporzásra képtelen. Ennek a hatásnak az a gyakorlati haszna, hogy ha ezeket a növényeket - amelyek egy végrehajtandó keresztezés nőivarú egyedei - a végrehajtandó keresztezés hímivarú szülőnövényeinek közelébe ültetjük vagy vetjük, a nőivarú egyedeket a kívánt hímivarú szülőnövény pollenje porozza be.
A 2. ábra a találmány szerint előállított DNS szerkezet működésének blokkdiagramja „hímivarúlag termékeny” állapotban. Amikor a kémiai indukálószer érintkezésbe kerül a növénnyel, aktiválódik a kémiai átkapcsoló, ennek hatására kifejeződik a represszor fehérje. A represszor fehérje megköti az operátort, ez a folyamat megakadályozza a letörő fehéije kifejeződését, és a növény hímivarú termékenysége helyreáll. A szerkezet ilyen irányú működésének az a gyakorlati jelentősége, hogy lehetővé teszi életképes pollen termelését és a növény önbeporzását, így a szerkezetet tartalmazó növényi vonal fenntartható jövőbeli felhasználás céljára.
2. A kémiai átkapcsoló
Nagyszámú növényi promotorról feltételezik, hogy kémiai jelzésekkel indukálható. Eddig azonban csak igen kevés példán igazolták, hogy a jelen modellhez szükséges szövetben specifikus vegyszerek hatására beindul a génkifejeződés. Különös jelentősége van a glutation-S-traszferáz II (GSTII) 2k alegységét kódoló génnek. Ez a gén kémiai biztosítókkal végzett kezelés hatására indukálódik növényi szövetekben, elsősorban a portok-termelő szövetekben. A kémiai biztosítók azaz az indukáló vegyszerek - egyik képviselője az N,N-diallil-2,2-diklór-acetamid; más hasonló szerkezetű vegyületek is ismertek azonban, amelyek kedvezőbb mozgékonysággal rendelkeznek a növényi szövetekben, és az adott felhasználás szempontjából perzisztenciájuk, hatékonyságuk és biztonságuk is kedvezőbb. Ezeket a vegyületeket a szakirodalom részletesen ismerteti.
Nyilvánvaló, hogy ebben a körben más kémiailag indukált promotorok is alkalmazhatók. Ezek egy része növényi eredetű lehet, míg más képviselőik gombavagy élesztő-eredetűek. A találmány értelmében az
HU 215 090 Β
RMS kialakulásához vezető egyéb promotor-vegyszer kombinációkat is alkalmazhatjuk.
3. A represszor és operátor szekvencia
Az egyik lehetséges megoldás szerint a bakteriális operátorok és represszoraik között fennálló, jól jellemzett kölcsönhatás alkalmazható a letörő génfunkció kifejezésének vezérlésére. A bakteriális represszorok, elsősorban a lac represszor, vagy a 434, P22 és lambda bakteriofágok által hasznosított represszorok igen hatásosan alkalmazhatók a kifejezés vezérlésére növényi sejtekben.
Más megoldás szerint „pszeudo-operátorok”-at is alkalmazhatunk, azaz olyan operátorokat, amelyek nem azonosak az adott operátor-represszor kombináció szokásosan felhasznált operátoraival, de hasonlóak azokhoz. Kimutattuk, hogy alkalmas szelekciós rendszer felhasználásával olyan mutáns represszorok generálhatók, amelyek felismerik a növények génjeiben lévő pszeudooperátorokat. A növények génjeiben található pszeudooperátorok felismerésére alkalmas mutáns represszorok szelektálását a későbbiekben ismertetjük.
A letörő gének alulszabályozásának további lehetősége az érzékelésgátló RNS alkalmazása. Ez a megoldás jól alkalmazható például a paradicsom érése során kifejeződött poligalakturonáz szabályozására. A megoldást a szakirodalom részletesen ismerteti. [J. mól. Bioi. 202, 913-915 (1988)]
4. Hímivarú virágokra specifikus (MFS) kifejező kazetta
Miként már közöltük, a letörő géneknek a hímivarú virágokra specifikus (MFS) szövetekben kell kifejeződniük. Ezek például a kialakuló portokban lévő szövetek vagy a kialakuló portokkal és pollennel kapcsolatban álló szövetek lehetnek.
A gének MFS szövetekben való kifejeződését serkentő DNS promotor szekvenciákat az MFS szövetekben kifejezett gének azonosítására alkalmas ismert munkamenettel [különböző vektorrendszerekben klónozott cDNS könyvtárak differenciált szűrése; ezeket a cDNSeket kódoló gének elkülönítése genom könyvtárakból bakteriofág lambda vektorok felhasználásával; azok promotor szekvenciájának meghatározása DNS szekvenciálással és analitikus növénytranszformációs kísérletekkel; lásd például Nucleic Acids Rés. 14, 7227-7235 (1986)] állapíthatjuk meg.
5. Letörő gén
A pollenképződést új letörő gének felhasználásával gátoljuk, amelyek a pollenképződés során a hímivarú virágokban specifikusan kifejeződve (a folyamat részleteit fentebb ismertettük) sejtpusztuláshoz vezetnek a portokban és az ahhoz kapcsolódó szövetekben, a pollen anyasejtekben, a pollenben és az ahhoz kapcsolódó szövetekben. Ennek következtében a pollenképződés megszakad, és a növény hímsterillé válik. A letörő gének különféle természetes forrásokból - például emberi sejtekből, élesztősejtekből, növényi sejtekből, gombasejtekből - származhatnak, vagy teljes mértékben szintetikus gének lehetnek, amelyek a természetben előforduló és/vagy normál esetben a természetben elő nem forduló DNS szekvenciákból állíthatók össze.
Előnyösek azok a letörő gének, amelyek a mitokondriális anyagcserére hatnak, ismert ugyanis, hogy a termékeny pollen képződésének elengedhetetlen feltétele az, hogy a sejteknek nagy energiaforrás álljon rendelkezésükre. A letörő funkció azonban más alapvető biokémiai funkciókat is hatásosan célba vehet, így például a DNS anyagcserét, a fehérjeszintézist és más anyagcsere-folyamatokat. Két ilyen DNS szerkezet az emlősök barna zsírszövetét lecsatoló fehérjét kódoló szekvenciákból (vagy annak variánsaiból) áll, vagy olyan szintetikus génből, amely egy mitokondriumot célba vevő tartományból és egy, a fehérjének a mitokondriális hártyába való beépülését lehetővé tevő lipofil tartományból áll.
6. MFS promotor szekvenciákból és letörő génekből álló kifejező modul kialakítása
A hímivarú virágokra specifikus gént vezérlő (MFS vezérlő) szekvenciákból és letörő génekből álló kifejező modult ismert molekuláris technikával alakíthatjuk ki. A modul kifejeződése elit természetes állapotú (beltenyésztett) növényeken ahhoz vezet, hogy a letörő gén hatása csak a hímivarú virágokra specifikus szövetekben érvényesül; ennek következtében hímsteril növények képződnek.
7. Transzformálás
A transzgenikus növényeket úgy alakíthatjuk ki, hogy a fentiekben ismertetett szerkezetet beépítjük a növények genomjába. A génszerkezet beépítésének pontos módszere a találmány szempontjából nem döntő jelentőségű tényező. A szakirodalomban számos erre alkalmas módszert ismertettek; ezek közül csupán néhányat említve, alkalmazhatjuk például az agrofertőzést Agrobacterium tumefaciens-szel vagy Ti plazmidjával; az elektroporálást; a növényi sejtek és protoplasztok mikroinjektálását; a pollenvezeték-transzformálást stb. Ezeket az ismert módszereket a szakirodalom részletesen tárgyalja.
8. A sterilitás visszafordítása
Nyilvánvaló, hogy a fent közöltek szerint sterillé tett növényekre önmagukban nincs nagy szükség. Ezért dolgoztunk ki olyan mólekuláris elemekből álló kaszkádot, amelynek segítségével a biomémöki úton előidézett sterilitás termékenységre fordítható át, így a növények fenntarthatok, és huzamosan alkalmazhatók FI hibridmagvak termelésére.
A jelen esetben végbemenő reverziós folyamat három különálló elem összehangolt működésén alapul. Ezek az elemek a következők:
a) kémiailag működésbe hozható promotor;
b) bakteriális operátor szekvencia;
c) a fenti operátorhoz nagy affinitással kötődő bakteriális represszor gén.
A felsorolt elemek összehangolt működése a következő: Ha szükség van a termékenység helyreállítására (például a növény fenntartó beltenyésztése céljából), a növényeket vegyszerrel permetezzük be. A vegyszer a kémiailag indukálható promotor működésbe hozása révén megindítja a bakteriális represszor molekula kifejeződését, ami az MFS vezérlő szekvenciákban lévő operátor DNS szekvenciákhoz kötődik. Az így kialakult
HU 215 090 Β kötés gátolj a a letörő gén működését; ennek következté- zésére három genetikai színtér áll rendelkezésre attól ben helyreáll a normális pollenképződés. függően, hogy azok domináns vagy recesszív gének9a Felhasználás FI hibridek termelésére ként hatnak, és hogy a kifejezés a sporophyta vagy a
Az 1. ábra szemlélteti azokat a molekuláris folya- gametophyta szülő szöveteiben jelenik-e meg. A genematokat, amelyek RMS tulajdonságúvá tett elit nővé- 5 tikai variációs lehetőségeket az I. táblázatban foglaljuk nyékben mennek végbe. A bevezetett jellemzők kifeje- össze.
I. táblázat
FI hibridek termelése
A kifejezés genetikai státusa RMS genotípus Termékeny pollenű FI hibridek részaránya
Nőivarú (hímsteril) beltenyésztett Hímivarú beltenyésztett FI hibrid
Sporofita domináns RMS/+ +/+ RMS/+ vagy +/+ a növények 50%-a (+/+) 100%-osan termékeny
Sporofita recesszív rms/rms +/+ rms/+ a növények 100%-a 100%-osan termékeny
Gametofita RMS vagy RMS + vagy + RMS + vagy + a növények 50%-a 50%-osan termékeny
Ha például az RMS komponensek - elsősorban a letörő gén-funkciók - domináns gén(ek)ként fejeződnek ki, az RMS-t heterozigótás állapotban (a fenti „sporofita domináns” osztályozás szerint RMS/+) célszerű felhasználni. Ebben az esetben az FI hibridmagvak termelése 30 során a hibridek RMS/+ vagy +/+ genotípusúak lesznek.
Ez azt jelenti, hogy a szemtermelésre használt FI hibridekben csak a növények 50%-a (+/+) képes részt venni a pollentermelésben. Ez az arány a legtöbb haszonnövény esetén - elsősorban kukorica esetén, ami nagy mennyisé- 35 gű pollent termel - elegendő.
Az RMS-t más osztályba tartozó hibridek, például háromutas és négyutas keresztezések termelésében is felhasználhatjuk. Ebben az esetben ha a domináns sporofita kifejezést használjuk, az első keresztezésben RMS/RMS genotípusú nőivarú növényt +/+ pollinátorral keresztezve rendszerint RMS/+ genotípushoz jutunk. Az rms/+ genotípus képezi a második keresztezéshez felhasználandó hímsteril nőivarú szülőnövényt (lásd a II. táblázatot).
9B Felhasználás termesztési programokban
II. táblázat
Háromutas vagy négyutas keresztezések termelése
A kifejezés genetikai státusa RMS genotípus
Első nőivarú Első hímivarú Második nőivarú Második hímivarú** Három- vagy négyutas hibrid
Sporofita domináns RMS/RMS +/+ —>RMS/+ +/+ RMS/+ vagy +/+
sporofita recesszív rms/rms rms/rms* —>rms/rms +/+ rms/+
Gametofita RMS vagy RMS RMS vagy RMS* -^RMS vagy RMS + vagy + RMS vagy +
*Az első pollinátort a hímivarú termékenység helyreállítása céljából kémiai átkapcsolószerrel kezeljük **A második pollinátor beltenyésztett növény (háromutas keresztezés) vagy hibridnövény (négyutas keresztezés) lehet
A találmány szerint kialakított új növényi sajátságot (RMS) a hibridmagvak termelésében való széleskörű alkalmazhatóságon kívül előnyösen hasznosíthatjuk termesztési programokban is, például a kereszteződések 60 megerősítésére mesterséges populációkban, amelyekből új beltenyésztett vonalak származtathatók. A három- és négyutas keresztezések kialakításának első ciklusában például a II. táblázatban feltüntetett genetikai variációs
HU 215 090 Β lehetőségeket alkalmazhatjuk. A kémiai átkapcsolás alkalmazása megkönnyíti az önállósuló ciklusok sorozatának elvégzését új és javított tulajdonságokkal rendelkező genotípusok termelésére. Az utódnövényeket a találmány szerinti RMS kialakítására felhasznált DNS szekvenciákból származó DNS szekvenciákkal végzett molekuláris szűréssel (RFLP analízis) vizsgálhatjuk annak ellenőrzésére, hogy a beltenyésztés során kapott utódok sorozatában fennmaradt-e az RMS rendszer valamennyi eleme. Ezek az eszközök egyszerű és hatékony módszert biztosítanak az RMS sajátság új csíraplazmába való átvitelére.
A találmányt a továbbiakban példaként különböző gén modul komponensek leírása kapcsán ismertetjük részletesebben. Az ismertetés során a csatolt rajzokra hivatkozunk.
Az ábrák felsorolása
Az 1. ábra a találmány szerinti génszerkezet működésének blokkdiagramja hímsteril állapotban lévő növényekben.
A 2. ábra a találmány szerinti génszerkezet működésének blokkdiagramja arra az esetre, amikor a növények hímivarúan termékenyek.
A 3. ábra a gyökerekben és hajtásokban mérhető teljes GST aktivitás adatait mutatja be 23, illetve 44 órával az R25-tel végzett kezelés után (a kezelést a későbbiekben ismertetjük).
A 4. ábra a GST I és GST II izoenzimek kromatográfiás elválasztásának eredményét szemlélteti.
Az 5. ábra a kezeletlen portok szövetekben lévő GST I aktivitást mutatja be.
A 6. ábra azt mutatja be, hogy az R25-tel végzett (a későbbiekben ismertetendő) kezelés hogyan serkenti a GST II aktivitást.
A 7. ábrán a GST II aktivitás serkentését mutatjuk be olyan kísérleti elrendezésben, ahol az R25-öt a szárra illesztett tartályból juttattuk a portokokhoz.
A 8. ábrán a GST II aktivitás fokozódását mutatjuk be olyan kísérleti elrendezésben, amikor az R25-öt közvetlenül a növényre permeteztük.
A 9. ábra a teljes GST aktivitás változását mutatja be az R25788-cal végzett inkubálás idejének függvényében.
A 10. ábra a p35SlacI vektor szerkezetét mutatja be. All. ábra a pCGl és pCG2 alapszerkezetét szemlélteti.
A 12. ábra a kukorica CAB promotor nukleotid szekvenciáját mutatja be.
A 13. ábra a plazmidok pAD és pPsl sorozatának térképét mutatja be.
A 14. ábra a kukoricavirág specifikus kiónjainak elkülönítésére alkalmazott könyvtár-szűrési eljárást szemlélteti.
A 15. ábra a növekvő hosszúságú kukorica címerekből kivont teljes RNS (4 pg/folt) kromatogramját mutatja be.
A 16A, 16B és 16C ábra kukorica kalászka-részek in situ hibridizációját mutatja be pMS14 érzékelésgátló RNS próbákkal.
A 17. ábra a pMSIO hímivarú virágra specifikus (MFS) cDNS klón nukleotid- és dedukált aminosav-szekvenciáját mutatja be.
A 18. ábra a pMS14 hímivarú virágra specifikus (MFS) cDNS klón nukleotid- és dedukált aminosav-szekvenciáját mutatja be.
A 19. ábra a pMS18 hímivarú virágra specifikus (MFS) cDNS klón nukleotid- és dedukált aminosav-szekvenciáját mutatja be.
A 20. ábra a 10/CT8-3 klónból származó 9 kb EcoRI fragmens restrikciós térképe.
A21.ábra a 14/17M klónból származó 17 kb EcoRI fragmens restrikciós térképe.
A 22. ábra a 18/CT3 klónból származó 16 kb EcoRI fragmens restrikciós térképe.
A 23. ábra a pMS10-5 klón plazmid térképe.
A 24. ábra a pTAKl, pTAK2 és a pTAK3 szerkezetét mutatja be.
A 25. ábra a pMS10-6GUS klón térképe.
A 26. ábra a pCGSl 10-UCP plazmid térképe.
A 27. ábra a 24. ábrán bemutatott pCGSl 10-UCP plazmidból származó lecsatoló emlős fehérje gén mRNS szekvenciáját mutatja be.
A 28. ábra egy leu2, gall élesztősejt kialakításának folyamatábrája.
A 29. ábrán táblázatban szemléltetjük a galaktóz adagolásának hatását BET9 és BET27 transzformátumok növekedésére.
A 30. ábra a gly/cas táptalajon galaktóz jelenlétében vagy távollétében 65 órán át tenyésztett BET9 (28A ábra) és BET27 (28B ábra) transzformátum növekedési görbéit szemlélteti az idő függvényében.
A 31. ábra gly/cas táptalajon galaktóz jelenlétében vagy távollétében 50 órán át tenyésztett BET9 törzsben lévő patkány UCP növekedési görbéit szemlélteti az idő függvényében.
A 32. ábra raffinóz táptalajon galaktóz jelenlétében vagy távollétében 45 órán át tenyésztett BET9 törzsben lévő patkány UCP növekedési görbéit szemlélteti az idő függvényében.
A 33. ábra az YIP/UCP plazmid kialakítását mutatja be pKV49-UCP-ből és YIp5-ből.
A 34. ábra a pGR208 plazmid (32A ábra) térképét és az Fj-ATP-áz β-alegység génjének mutációjához felhasznált oligonukelotidok szekvenciáit szemlélteti.
A 35. ábra a pKV49 plazmid (35A ábra) és a pKV49-UCP plazmid (35B ábra) térképét szemlélteti.
HU 215 090 Β
A 36. ábra sematikusan ábrázolja egy p-alegység/pgalaktozidáz fúziós fehérje kialakítását.
A 37. ábra a pKV49/BLZ szerkezet plazmid térképe.
A 38. ábra a pMS10-5 plazmid térképe.
A 39. ábra a pBin/MSIO-UCP plazmid térképe.
A 40. ábra a GST II génből elkülönített, kémiailag indukálható promotor szekvenciáját szemlélteti.
A 41. ábra a Zm/RMS14 kukorica transzformáló vektor plazmid térképe.
A plazmidok
A III. táblázatban felsorolt plazmidokat a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria gyűjteményben (Aberdeen, Nagy-Britannia) helyeztük letétbe.
III. táblázat
Plazmid Gazdaszervezet A letétbe helyezés napja A letét száma
pGAL2 E. coli DH5a 1988. 12. 06. NCIB 40087
p35SlacI E. coli TG-2 1988. 12. 12. NCIB 40092
pPsl E. coli DH5a 1988. 12.21. NCIB 40097
pAD18 E. coli DH5a 1988. 12.21. NCIB 40096
pMSIO E. coli RR1 1989.01.09. NCIB 40098
pMS14 E. coli DH5a 1989. 01.09. NCIB 40099
pMS18 E. coli RR1 1989. 01.09. NCIB 40100
I. A kémiai átkapcsoló
Ezt a génszerkezeti elemet a kukorica glutation-Stranszferáz (GST II) gén 27kd alegységéből elkülönített, kémiailag indukálható gén promotor szekvencia példáján ismertetjük részletesebben. A szekvenciát a 40. ábra mutatja be.
A gyakorlatban a találmány szerinti, kémiailag indukálható promotort promotor szekvenciaként építjük be a növényi szervezetbe beépítendő rekombináns génszerkezetbe. Ezután a génszerkezetet transzformálással építjük be a növényi szervezetbe. A szerkezetben lévő fehérjekódoló gének kifejezését - ami a találmány szerinti, kémiailag indukálható promotor vezérlése alatt áll - úgy vezérelhetjük, hogy a növényre kémiai indukálószert juttatunk.
Hatásos promotor/indukálószer kombinációknak bizonyultak azok a kombinációk, amelyekben a promotor a fenti GST II promotor, az indukálószer pedig N,Ndiallil-2,2-diklór-acetamid (nemzetközi szabad néven: dikloramid) vagy 2-klór-4-(trifluor-metil)-5-tiazol-karbonsav-benzil-észter (nemzetközi szabad néven: flurazol).
A GSTII 27kd alegység kifejezését potenciálisan indukáló további kémiai indukálószerek a következők:
1. 2-klór-4-(trifluor-metil)-5-tiazol-karbonsavbenzil-észter,
2. naftalin-1,8-dikarbonsav-anhidrid,
3. 2-(diklór-metil)-2-metil-1,3-dioxolán,
4. l-(diklór-acetil)-hexahidro-3,3,8a-trimetilpirrol [ 1,2-a]-pirimidin-6(2H)-on,
5. 2,2,5-trimetil-N-(diklór-acetil)-oxazolidin,
6. l,3-dioxolan-2-il-metoxi-imino(fenil)-benzolacetonitril,
7. 4,6-diklór-2-fenil-pirimidin,
8. 2,2-diklór-[N-allil-N-(l,3-dioxolano-2-metil)]acetamid,
9. 1 -(ciano-metoxi-imino)-benzacetonitril,
10. 4’-klór-2,2,2-trifluor-acetofenon-O-(l,3dioxolan-2-il)-metil-oxim,
11. 2,2-diklór-l-(3,4-dihidro-3-metil-2H-l,4benzoxazin-4-il)-etanon,
12. 3-(diklór-acetil)-2,2-dimetil-oxazolidin,
13.4-metoxi-3,3-dimetil-benzofenon,
14. 1 -ciklohexil-4,4-dimetil-2-( 1 Η-1,2,4-triazol-1 il)-pent-l-en-3-ol,
15. 2,2-diklór-N-(3-metil-4-tiazolin-2-ilidén)acetamid,
16. O,O-dietil-O-fenil-foszfortioát,
17.2,2-spirociklohexil-N-(diklór-acetil)-oxazolidin,
18. N-benzil-N-etil-diklór-acetamid,
19. 3-(klór-acetil)-4,4-ciklohexán-spiro-2,2-dimetil1,3-oxazolidin, és
20. spiro-oxazolidin-acetamid.
A glutation-S-transzferázok (GST) olyan enzimcsaládot képeznek, amelyek katalizálják a glutation szulfhidril csoportján keresztül történő konjugációját egy sor hidrofób, elektrofil vegyülethez. Ez a konjugáció a rovarok és emlősök szervezetébejutott vegyületek méregtelenítéséhez vezet: a konjugációs kötéssel megkötött vegyületek eltávoznak a szövetekből.
A GST enzimek jelenlétét számos haszonnövény köztük kukorica, búza, cirok és borsó - szervezetében kimutatták. A GST enzimek az elsárgult kukoricapalánták teljes oldható fehérje-tartalmának 1-2%-át teszik ki.
A GST fő izoformja kimutatható a kukorica szöveteiben. A GST konstitutívan kifejeződik, és alkalmas arra, hogy a glutationt alklórral és atrazinnal (kikelés előtti herbicid hatóanyagok) konjugálja. A kukoricaszövetekben kémiai biztosítókkal (például N,N-diallil2.2- diklór-acetamiddal) végzett kezelés hatására növekedik a GST I aktivitása, ami részt vesz a kikelés előtti herbicid hatóanyagok méregtelenítésében.
Kukoricaszövetek kezelése kémiai biztosítókkal
Fiatal kukoricapalánták kezelése céljából a magvakat nedves szűrőpapíron csíráztattuk. Kicsírázás és növekedés után (legföljebb 1 hét elteltével) az N,N-diallil2.2- diklór-acetamidot (a továbbiakban: R25) a szűrőpapíron lévő vízhez adtuk 0,003 és 30 pg/cm-I. * 3 közötti koncentrációkban, majd a palántákat további 23—44 órán át növekedni hagytuk, és ezután elkülönítettük a gyökér- és hajtásszöveteket. A gyökerekben és hajtásokban mért teljes GST aktivitást 23, illetve 44 óra elteltével a 3. ábrán szemléltetjük. A 4. ábrán a GST I és GST II izoenzimek elkülönítését mutatjuk be.
Kukorica-címer- és -portok-szövetek kezelésére 800 pg R25-öt tartalmazó oldatot injektáltunk a közvet7
HU 215 090 Β lenül a kifejlődésben lévő címer alatti nódiumba. Ezután a növényeket 48-72 órán át növesztettük. Miként az 5. ábráról leolvasható, a kezeletlen portok-szövetekben csak GSTI aktivitás mutatható ki, míg a fenti kezelés hatására a szövetekben GST II aktivitás is megjelenik (lásd a 6. ábrát).
Egy másik kísérleti elrendezésben a kukoricaszárnak közvetlenül a kifejlődésben lévő címer alatti részéhez 100 pg/cm3 R25-öt tartalmazó oldattal töltött üvegtartályt illesztettünk. A kezelés eredményét a 7. ábrán szemléltetjük.
Egy további kísérleti elrendezésben 100 μ g/cm3 R25-öt tartalmazó permetlevet juttattunk közvetlenül a kifejlődésben lévő címerre. A kezelés eredményét a 8. ábrán szemléltetjük.
Mindkét GST fehéqe natív móltömege körülbelül 50 kilodalton (kd). A kukorica szervezetében található GST-k - az emlős GST-khez hasonlóan - dimerek; a GST I két látszólag azonos, egyenként 29 kd móltömegű alegységből áll, míg a GST II heterodimer; egy, a GST I-ben lévőhöz hasonló 29 kd móltömegű alegységet és egy új, 27 kd móltömegű alegységet tartalmaz. Az utóbbi alegység csak a kémiai biztosítókkal kezelt szövetekben van jelen. Ez alól kivételt képeznek a palánta gyökérszövetei, ahol a 27 kd alegység konstitutívan kifejeződik, de ezekben a szövetekben is serkenthető az alegység kifejeződése kémiai biztosítóval végzett kezeléssel.
A GST I 29 kd alegységének megfelelő gént és cDNS-t már korábban klónoztunk és szekvenciáltunk. Ezen kívül a kukoricapalánták GST készletének egy harmadik, kis mennyiségben jelenlévő képviselője (GST III) 24 kd alegységének megfelelő cDNS-t is klónoztunk és szekvenciáltunk korábbi vizsgálatainkban.
Enzimvizsgálat
Az enzimaktivitást spektrofotometriásán mértük 340 nm hullámhosszon, szubsztrátumként l-klór-2,4dinitro-benzolt (CDNB) használva. A reakcióhoz használt puffer 0,1 mól EDTA-t, 0,001 mól CDNB-t és 0,0025 mól glutationt tartalmazott.
Extraktumok előállítása és az enzim tisztítása
A növényi szövetet dörzsmozsárban, 0,001 mól EDTA-t, 0,001 mól DTT-t és 7,5% poli(vinil-pirrolidon)-t tartalmazó 0,05 mólos Trisz HC1 pufferoldatban (pH: 7,8) 4 °C-on homogenizáltuk, majd 30000 g gyorsuláson centrifugáltuk. így nyers extraktumot kaptunk.
A GST izoformákat a következőképpen különítettük el a nyers extraktumból: A nyers extraktumot DEAE Sepharose oszlopra vittük fel, és az oszlopot 0,01 mólos Trisz HC1 pufferoldattal (pH 7,8), 0,001 mólos EDTA oldattal és 0,001 mólos DTT oldattal mostuk. A megkötött GST-t 0,3 mólos kálium-klorid oldattal eluáltuk. A GST aktivitást mutató frakciókat egyesítettük, és PD10 gélszűrő oszlopok felhasználásával sómentesítettük. A GST I és GST II izoformákat FPLC technikával különítettük el mono-Q oszlopon, O-tól 0,4 mólosig növekvő mennyiségű kálium-kloridot tartalmazó vizes kálium-klorid oldatok felhasználásával.
A GST I és GST II tiszta mintáit úgy különítettük el, hogy a fentiek szerint kapott, GST I-et és GST Il-t tartalmazó frakciókat sómentesítés után glutation-SSepharose affinitás oszlopra vittük fel, amit előzetesen
0,05 mólos foszfátpufferrel (pH 7,3) egyensúlyba hoztuk. Az oszlopot a pufferoldattal mostuk, majd a megkötött GST-t 0,005 mólos glutation oldattal eluáltuk.
A GST I vagy GST II enzimből úgy készítettünk gélpreparátumot (17,5%, 30:0,174 tömegarányú akrilamid:metakril-amid), hogy a tiszta GST mintákat Amicon Centricon 10 Microconcentrations (védjegy) berendezésen koncentráltuk, a mintákat Laem mii puffért tartalmazó merkapto-etanolban denaturáltuk, majd a géleket Coomassie Blue színezékkel megfestettük.
Antitestek kifejlesztése az enzimmel szemben
A fentiekben ismertetett műveletsort többször megismételve és az elkülönített enzim alegységeket egyesítve nyulak immunizálásához elegendő mennyiségű fehérjét gyűjtöttünk össze. Ezután a 27 kd GST II polipeptidet poli(akril-amid) gélszeletekről végzett elektro-eluálással látszólagos homogenitásig tisztítottuk, és a 27 kd polipeptiddel szemben antiszérumokat készítettünk. A nyulak immunizálását lényegében Mayer és Walker módszerével (1978) végeztük.
N-terminális szekvencia-analízis
A GST II enzim teljes 27 kd alegységének vagy az alegység részleges proteolitikus hasításával kapott peptideknek N-terminális aminosav-szekvenciáját Edman-féle szekvenciális lebontással és azt követő aminosav-elemzéssel határoztuk meg. Az aminosavelemzéshez nagynyomású folyadékkromatográfiát alkalmaztunk.
Az enzim-kifejeződés időbeli változásának vizsgálata
Vizsgáltuk, hogy a kémiai biztosítóval végzett kezelés után időben hogyan változik a GST enzimek kifejeződése. Háromnapos palánták gyökereire 30 μg/cm3 R25-öt tartalmazó oldatot vittünk fel, és a növényekből a kezelést követően időről időre szövetmintát vettünk. A szövetminták GST aktivitását a korábban ismertetett módon vizsgáltuk. A vizsgálatok eredményeit a 9. ábrán grafikusan szemléltetjük.
cDNS könyvtárak szintézise
A GST aktivitás időbeli változásának vizsgálata kimutatta, hogy a GST kifejezése a biztosítóval végzett kezelés után 48 órával maximumot ér el. Ezért két cDNS könyvtárt hoztunk létre a szövetekből a kezelés után 24, illetve 48 órával kivont RNS felhasználásával. Annak érdekében, hogy meggyőződjünk arról, hogy az indukció sikeresen végbement, a kezelés után 24 órával elkülönített szövet 1 g-os részletét GST II jelenlétére vizsgáltuk. A vizsgálat kimutatta, hogy a cDNS könyvtár kialakítására felhasznált szövet indukálása sikeres volt; a szövetben lévő GST II a teljes GST aktivitás 45,5%-át tette ki.
Az oligo dT-cellulózon tisztított RNS-ből kétszálú cDNS-t készítettünk az egyszálú cDNS előzetes tisztítása nélkül, a második szál szintéziséhez RNázH-t és E. coli DNS polimeráz I-et használva (Gubler és Hoffmann, 1983).
A cDNS könyvtárak szűrése antiszérumokkal GST I-re és GST 11-re
HU 215 090 Β
Kukorica-címer GST enzimet kódoló cDNS klón azonosítása céljából a bővített cDNS könyvtárból származó bakteriofágokat anti-kukorica GST enzim szérummal szűrtük. A legerősebb jeleket szolgáltató kiónokat újból szűrtük.
A cDNS könyvtárak szűrése oligo próbákkal
Foszforamidites kémiai szintézissel a fentiekben meghatározott aminosav-szekvencián alapuló szintetikus oligonukleotidok elegyeit állítottuk elő. Az oligonukleotidok 5’ végeit a szakirodalomban leírtak szerint polinukleotid kinázzal jelöltük.
cDNS-t tartalmazó körülbelül 40000 fágot lemezeken terítettünk szét, ezután nitrocellulózra vittük át. A szűrőket oligonukleotid próbákká hibridizáltuk; a kezelést a keverékben lévő legalacsonyabb olvadáspontú próba olvadáspontjánál 2-5 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végeztük. A hibridizáló plakkokat elkülönítettük, és két vagy több, a fentiekkel azonos módon de kisebb sűrűséggel végrehajtott ciklusban újra szűrtük.
cDNS gén szekvenciák elkülönítése PCR módszerrel
A fent ismertetett könyvtárakból a parciális proteolitikus hasítással kapott aminosav szekvencián alapuló oligo primerek - vagy genom DNS esetén az előzőek szerint meghatározott cDNS szekvencián alapuló primerek - felhasználásával különítettünk el cDNS vagy DNS szekvenciákat.
A GST cDNS klánok azonosítása és szekvencia-analízise
Az elkülönített cDNS-t ismert módszerekkel azonosítottuk és szekvenciáltuk.
A genom szekvenciák elkülönítése λ EMBL3-ba klónozott teljes kukorica DNS fragmentjeinek meglévő genom könyvtárát használtuk fel olyan kiónok elkülönítésére, amelyek a korábbiakban közöltek szerint elkülönített cDNS kiónokká hibridizálnak.
Más megoldás szerint a fentiekben ismertetett PCR módszert is alkalmazhatjuk gén fragmensek szelektív sokszorozására és klónozására. A képződött GSTI géneket és azok promotor szekvenciáit ismert módszerekkel különíthetjük el és azonosíthatjuk. Kimutatható, hogy a GSTII promotor szekvenciák közvetítik a kémiai biztosító által indukált gén-aktivitást, ha azokat marker génekhez (például GUS és CAT) kapcsoljuk, majd transzgenikus növényekben vizsgáljuk.
II. A represszor és operátor szekvenciák
A találmány szerint előállított génszerkezetnek ez az eleme szabályozza a növényi gén kifejezést. Pontosabban, az adott elem bakteriális vagy alacsonyabbrendű eukariótaeredetű represszor molekulák felhasználásával szabályozza a növényi gén kifejezést.
A javított jellemzőkkel rendelkező haszonnövényfajták kialakításának hagyományos módszere szerint genetikai keresztezésekkel viszik be a növénybe a kívánt jellemzőket. Noha ezek a termesztési technikák nagyon eredményesek, nem nyújtanak lehetőséget az újonnan bevezetett jellemzők kifejezésének szabályozására. A technika újabb fejlődése révén már lehetővé vált a növények szerkezetét meghatározó és a növények produktivitásáért és a termés minőségéért felelős gének azonosítása és elkülönítése. Ezen a területen a fejlesztések fő célja ma a terméseredmények javulását eredményező komplex genetikai megoldások kidolgozása. Ebben a fejlesztési folyamatban alapvető tényező olyan megoldás kidolgozása, amellyel lehetővé válik egyes specifikus növényi gének kifejezésének tetszés szerinti szabályozása.
Az a lehetőség, hogy az egyes jellemzők kifejezését a körülményeknek megfelelően szabályozhatjuk, számos területen alkalmazható jó eredménnyel: így például lehetségessé válik rovarokra rezisztens gének működésének szabályozása, szabályozhatóvá válik a növény magassága, időzíthető a növény virágzása, és szabályozható a növény termékenysége. A növények genetikai tanulmányozásához felbecsülhetetlen értékű segítséget nyújt az a lehetőség, hogy egyes gének működését kívánság szerint indíthatjuk be vagy állíthatjuk le anélkül, hogy megzavarnánk a növény fiziológiáját vagy környezetét.
Jelenleg a hibrid haszonnövények (például kukorica) magvainak termeléséhez a szülőnövények hímivarú részeinek munkaigényes és költséges kézi vagy mechanikai eltávolítására van szükség annak érdekében, hogy megakadályozzák a növény önbeporzását. A hímivarú részek eltávolítására genetikai lehetőség is áll rendelkezésre a citoplazma-eredetű hímivarú sterilitás (cytoplasmic male sterility, CMS) előidézésével. Ez a sajátság számos haszonnövény-fajtában kialakítható. A CMS beavatkozik a hímivarú gametogenezisbe, ennek eredményeként gátolja a pollenképződést, normál esetben azonban nem csökkenti a nőivarú termékenységet. Ennek megfelelően az így kialakított „hímsteril” növények képesek magvak termelésére, a magtermelés azonban csak keresztbeporzás eredménye lehet. Ha az ilyen gének kifejezése szabályozható, a hibrid haszonnövények magvainak termelése során szükségtelenné válik a költséges kézi sterilizálás, mert a gén gátolja a hímivarú gametogenezist; ugyanakkor azonban a hímivarú szülőnövény hagyományos termesztési programokkal genetikailag tovább fej elszthető marad.
A génkifejezés szabályozása prokarióta és eukarióta szervezetekben elsődlegesen egyes szabályozó fehéij ék és specifikus DNS szekvenciák kölcsönhatásán alapul. A kölcsönhatások jellegétől függően a rokon promotorokból való átírás visszaszorítható vagy aktiválható. Esetenként - a kölcsönhatások jellegétől függően ugyanaz a fehérje átírást visszaszorító és átírást aktiváló hatást egyaránt kifejthet. Egyes szabályozó fehérjék célszekvencia-megkötő képessége ligandumok hozzákapcsolásával vagy specifikus proteolitikus hasítással is módosítható. A növényigén-szabályozásra alkalmazandó módszerek kifejlesztésekor ezek a mechanizmusok jól hasznosíthatók.
A legjobban jellemzett szabályozó rendszerek azok a bakteriális rendszerek, amelyekben a DNS-megkötő fehérjék (represszorok) és a célzott DNS szekvenciák (operátorok) közötti kölcsönhatások igen részletesen ismertek. A legjobban ismert rendszerek — így a λ és 434 bakteriofág represszor és cro fehérjéi, a Laci represszor és a katabolit gén-aktiváló fehéije (CAP) 9
HU 215 090 Β összehasonlításából számos közös ismérv állapítható meg. Ezek a szabályozó fehérjék dimerekként vagy tetramerekként kötődnek nagyfokú diád-szimmetriával rendelkező rövid operátorokhoz. A legtöbb esetben a DNS-felismerésért felelős tartomány, amely elkülönül a 5 monomerek oligomerizációjával kapcsolatos tartománytól, megőrzött kettős helix szerkezetet tartalmaz.
Az egyedi monomerek fenti szerkezetében lévő specifikus helix - a felismerő helix - a DNS fő barázdájához igazodik, és fúnkcionális represszor/operátor komplex 10 csak akkor alakulhat ki, ha speciális kapcsolatok jönnek létre a felismerő helix aminosavjai és a szomszédos DNS bázisai között. Ezek a kölcsönhatások rendkívül specifikusak, és a nagy affinitású komplexek rendkívül gyors reakciókban jönnek létre. 15
Az eukarióta szervezetekben végbemenő génkifejezés szabályozásának mechanizmusa az előzőnél lényegesen kisebb részletességgel ismert. Elesztősejtekben és emlős-sejtekben a promotor szekvenciákban nagyszámú kötőhelyet azonosítottak esetleges regulátor fehér- 20 jék számára, és egyes esetekben a felelős fehérjéket is elkülönítették. A fehérje-DNS kölcsönhatások molekuláris részletei és az átírás szabályozásának mechanizmusa azonban csak néhány esetre ismert.
Növényi szervezetekben a génkifejezés szabályozá- 25 sának folyamata csak kezdeti szinten ismert. Promotor szekvenciákban már számos szabályozó elemet azonosítottak, és egyes szabályozó fehéqék kezdeti szintű vizsgálatát is elvégezték már. Nagy szükség van további fehérjék elkülönítésére, és a lezajló mechanizmusok 30 részleteinek felderítésére.
Az eukarióta szabályozó rendszerek nagyobb szerkezeti változatosságot mutatnak és bonyolultabbak a megfelelő prokarióta szabályozó rendszereknél. így például az eukarióta promotorokból történő átírás sza- 35 bályozása a jelenlegi feltételezések szerint több (esetleg tízes nagyságrendű) fehéqe kölcsönhatását igényli a szabályozó DNS-el. Ezen túlmenően a különböző eukarióta szabályozó faktorok DNS-megkötésének specifikusságát legalább háromféle fehérjeszerkezet 40 (összecsavarodott kettős helix, cink-ujj és leucin-cipzár) befolyásolja.
A DNS-kötő fehérjék a fehéqék olyan csoportját alkotják, amelyekre jellemző, hogy gének DNS-éhez képesek kötődni, és így a hozzájuk kötött gén működé- 45 sét visszaszorítják vagy aktiválják. Amennyiben mást nem közlünk, a következőkben az egyszerűség érdekében ezeket a DNS-kötő fehérjéket represszoroknak nevezzük.
A tárgyalt elem tehát rekombináns növényi gén, 50 amely bakteriális eredetű represszor gént és növényekben a represszor gén kifejezését serkentően működő promotort tartalmaz. Ez a gén egy kiválasztott célzott növényi génnel kapcsolatos operátor szekvenciával kölcsönhatásba lépni képes represszor fehéqét kódol oly módon, hogy a represszor fehérje kifejezésekor a célzott növényi gén kifejezése gátolt.
A fenti DNS-t tartalmazó, p35SlacI vektort E. coli TG-2 törzsben mint gazdaszervezetben 1988. december 12-én helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Ltd. (Aberdeen, NagyBritannia) gyűjteményben NCIB 40092 számon.
Egy alkalmas növénytranszformáló vektor a fenti plazmidot befogadó Agrobacterium tumefaciens-t tartalmaz.
A tárgyalt elem egy speciális kiviteli alakjánál a génkifejezés szabályozására bakteriális lacl operátor rendszert használunk. A lac repressziót izopropiltiogalaktoziddal (IPTG) és más cukor-analógokkal szüntethetjük meg.
Ezt az elemet a következőkben példa kapcsán ismertetjük részletesebben.
Példa
1. A lac represszort kifejező növények kialakítása
A pJRl vektorban lévő konstitutív CaMV 35S promotorból vagy a kukorica CAB promotorból (nyers szövet-specifikus promotor) a Laci gént kifejező vektort alakítottunk ki. A bakteriális represszor azonban a növény más részeiben kifejezett bármely növényi promotorból kifejezhető, így a növényi gén kifejezése a növény bármely részében szabályozható.
1.1. A lacl represszor gén módosítása a pJRl-be illesztése
A lac represszor (lacl®) a pMJR 156 plazmidon található. Annak érdekében, hogy ez a gén növényekben kifejezhető legyen, a transzlációt megindító kodont (CTG) ATG-re kellett cserélnünk. Ezen kívül célszerűnek mutatkozott egy alkalmas restrikciós enzim-hasító hely kialakítása a génnek növényi kifejező vektorba való klónozásához. A lacl 3’ végén a növényi kifejező vektorba való illesztésre alkalmas restrikciós helyek vannak (Hindin és PstI). Az 5’ végen a megfelelő restrikciós helyek kialakítására a következő kísérleteket hajtottuk végre:
a) A 134 helyzetben Cfr 10 restrikciós hely található.
A pMJR-t Cfr 10-zel hasítottuk, és a pJRl-be olyan szintetikus DNS fragmenst illesztettünk, amely helyreállítja a lacl gén N-terminális részét, tartalmazza a módosított transzlációt megindító kodont (ATG), a transzláció hatékony iniciálására növényi konszenzus szekvenciát tartalmaz, és BamHI restrikciós helyet is tartalmaz. A szintetikus DNS fragmens szekvenciája a következő volt:
A pJRL-t BamHI-vel és Pstl-vel hasítottuk. A fenti szintetikus fragmenst és a lacl gént tartalmazó, CfrlOBamHI konszenzus
GATCC AACAATGGCT -AAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTAT G
G TTGTTACCGA TTTGGTCATTGCAATATGCTACAGCGTCTCATA CGGCC
Cfl 10
HU 215 090 Β tői Pstl-ig terjedő fragmenst ismert körülmények között a hasított pJRl vektorral ligáltuk. A ligációs elegyet E. coli TG-2-be transzformáltuk. A rekombinánsokat kanamicin-tartalmú lemezen választottuk ki, és DNS szekvencia-analízissel azonosítottuk. Az így kapott szerkezetet p35SlacI-nek nevezzük.
b) A lacl 5’ végén a változtatások bevezetésére a Saiki és munkatársai által (Science 239, 487—491) kidolgozott polimeráz láncreakciót (polymerase chain reaction, PCR) alkalmaztuk, a 3’ vég szekvenciájának változatlanul tartásával. A pMJR 156-hoz két oligonukleotidot hibridizáltunk, amelyek szekvenciája a következő volt:
i) ágén 5’végétől:
BamHI konszenzus
GAGAGTCAATTCAGGGT GGATCC AACAATGGCT AAACCAGTAACGTTATACG ii) a gén 3’végétől:
CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCC
A PCR reakciót a fenti közleményben előírt körülmények között végeztük. A terméket - az újonnan kialakított restrikciós helyen - BamHI-vel, valamint Pstl-vel hasítottuk. A kapott fragmenst BamHII-vel és Pstl-vel hasított pJRl-be klónoztuk. A rekombinánsokat hibridizációval és restrikciós analízissel azonosítottuk, standard előiratok felhasználásával. A kapott kiónok egyikét DNS szekvenciaanalízissel azonosítottuk.
Az a és b módszerrel ugyanazt a p35SlacI jelű szerkezetet kaptuk. A p35SlacI vektor szerkezetét a 10. ábra szemlélteti.
1.2. A CaMV 35S promotor helyettesítése kukorica CAB promotorral
A Lac represszor/operátor rendszer növényekben való általános alkalmazhatóságának bemutatása céljából olyan kifejező vektort alakítottunk ki, amely lehetővé teszi a lacl indukálható és szövetspecifikus kifejezését növényekben. Munkánkhoz a fénnyel indukálható kukorica klorofill a/b kötő fehéq ét (CAB) kódoló gén promotorát használtuk fel.
Ezt a vektort úgy alakítottuk ki, hogy a p35SlacI5 bán lévő CaMV promotort a pCAB48.1 vektorban található kukorica CAB promotorral helyettesítettük, amelynek DNS szekvenciáját a 12. ábra szemlélteti. A CaMV promotor eltávolítására a p35SlacI-et standard körülmények között EcoRI-vel és BamHI-vel hasí10 tottuk. A CAB promotor elkülönítésére a ‘+AB48.1-et Xbal-el és Sau3A-val hasítottuk, Sau3 A esetén parciális restrikciós körülményeket alkalmazva. Az így kapott promotor fragmenst ezután a promotor nélküli p35SlacI-be illesztettük. A kapott - pCABlacI jelű 15 vektort restrikciós térkép felvételével és DNS szekvencia-analízissel azonosítottuk.
1.3. Dohánynövények transzformálása
A fenti vektorokból képezett kifejező modult ismert körülmények között végrehajtott levélkorong-transzfor20 mációval vittük át BIN 19-be, majd dohánynövénybe. A plazmidokat háromszülős párosítással vittük át Agrobacterium mikroorganizmusokba. A mikroorganizmusokat tisztítottuk, majd levélkorong-transzformációs kísérletekben használtuk fel. 37 darab, a CaMV25 lacl kifejező modult tartalmazó növényt, és 38 darab, a BAB-lacI szerkezetet tartalmazó növényt regeneráltunk, és a növényeket a lacl relatív kifejezésére vizsgáltuk.
1.4. Transzgenikus növények vizsgálata lacl kifeje30 zésre
A lacl gén kifejezését az extrahált fehérjék nyugati irányú analízisével vizsgáltuk. A vizsgálandó növényekből extrahált fehérjéket poli(akril-amid) gélre vittük fel, és a gélpreparátumokat nyugati irányú analí35 zisre készítettük elő. Az analízisek eredményei azt igazolták, hogy a transzformált növényekben kifejeződik a lacl génszerkezet. A lacl gén kifejeződésének szintje eltérő volt a különböző független transzformátumokban. A CaMV-lacI szerkezettel transzformált növényeken észlelt eredményeket a IV. táblázatban közöljük.
IV. táblázat
A növény minta jele A Lac kifejeződése (sávintenzitás)
L1 -
L2 ++
L3 -
L5 -
L8 +++
L9 +
L10 +
Lll -
L13 +
HU 215 090 Β
IV. táblázat (folytatás)
A növényminta jele A Lac kifejeződése (sávintenzitás)
L14 ++
L15 -
L16 +++
L18 -
L22 +/-
L23 -
L24 ++
L25 +
L26 44-4-
L27 +4-4-
L28 -
L29 ++++++
L31 ++
L32 ++++
L33 +/-
L34 +/-
L35 ++
L37 +
A - ++++++ jelölés a nyugati foltokból származó Lac represszor sávintenzitását jelöli.
2. A lac operátor beillesztése célzott génekbe
a) A kukorica CAB promotor
A kukorica CAB promotor pCAB48.1 plazmidban található. Azt tapasztaltuk, hogy ez a promotor képes az idegen gének kifejezésének serkentésére tranziens dohány kifejező rendszerben és stabilan transzformált növényekben. Ezért ez a gén kitűnően alkalmazható célzott génként a Laci által vezérelt folyamatok bemutatására, mert in vitro és in vivő körülmények között egyaránt nagymértékű kifejeződés érhető el. Az adott promotor kiválasztásának másik oka az volt, hogy más rendszerek (búza, borsó és dohány) CAB promotorait már részletesen vizsgálták és ismertették a szakirodalomban; az ott közölt információk megkönnyítik az operátor beillesztésére alkalmas helyek kiválasztását. Harmadsorban az adott promotort azért választottuk, mert a pCAB48.1 kukorica promotor, így az adott rendszer példáján a találmány szerinti megoldás egyszikű növényeken (így kukoricán, búzán, árpán és cirokon) való alkalmazhatóságát szemléltethetjük.
b) A lac operátor beillesztése kukorica CAB promotorba
A CAB promotor fontos cisz-hatású elemeinek jellemzéséről a szakirodalomban viszonylag kevés adat található. Ezért számítógépes összehasonlító vizsgálatokkal elemegyezéseket (konszenzus) kerestünk a CAB promotor és több növényi gén felszálló szabályozó elemei (upstream regulatory elements, URE-k) között. Amint várható volt, a CAB promotor mindkét szálában számos lehetséges URE-t találtunk. Az operátor beillesztésére a következő lehetséges helyek állnak rendelkezésre:
1. a CAAT doboz 5’helyére,
2. a CAAT doboz és a TATA doboz közé,
3. a TATA doboz köré,
4. a TATA doboz és az átírás kiindulási pontja közé, és
5. az átírás kiindulási pontja és a transzláció kiindulási pontja közé.
A lac operátor kukorica CAB promotorba illesztésére két módszert alkalmaztunk:
1. természetben előforduló restrikciós helyekbe illesztés, és
2. az operátor PCR módszerrel való beillesztése a kiválasztott helyekbe.
1. módszer:
A promotor szekvencia elemzése azt mutatta, hogy ez a tartomány csak kevés egyedi restrikciós helyet tartalmaz. A promotor régió különböző vektorokba való átklónozásával azonban két hely hozzáférhetővé tehető.
a) ΤΑ TA és TSP közé illesztés
A PvuII restrikciós enzim a CAB gént tartalmazó, 2,8 kb mólekulatömegű PstI fragmensen belül egyetlen helyet ismer fel. Ez a hely a CAB promotor TATA eleme és az átírás kiindulási pontja (transcription start point, TSP) között van. A pCAB48.1 vektor azonban (a pUC19-en belül) számos PvuII helyet tartalmaz. Ezért a 2,8 kb mólekulatömegű PstI fragmenst a PvuII helyet nem tartalmazó standard klónozó pAT153 vektorba klónoztuk, és így pCABPl-et alakítottunk ki.
Az operátor szekvenciákat a pCABP 1-ben lévő egyedi PvuII helyre illesztettük be. Szekvenciálás után meghatározhatóvá vált, hogy melyik kiónokba illeszkedett be egyetlen operátor, és mely kiónokba illeszkedtek be operátorok egymásutáni elrendezésben. A munkánk12
HU 215 090 Β hoz szükséges szintetikus szimmetrikus lac operátor szerkezete a következő:
lac operátor 1:
5’ -ATTGTGAGCGCTCACATT- 3’
Ez az operátor egy 18 bázispárból álló palindrom, ami analóg a lac represszort a vad típusú operátornál nyolcszor erősebben kötő mutáns operátorral.
b) Beillesztés a CAAT szekvencia fölé
A következőképpen jártunk el: i) A pCAB48.1-et Hindül-mal (ami a promotor régión kívül és a pUC18-on belül hasít) és BglII-vel (ami az egyedi Ncol hely alatt és a kódoló régión belül hasít) kezeltük. így olyan fragmenst kaptunk, amely a CAAT szekvencia fölött egyedi Sphl helyet tartalmaz.
ii) A pUC18-at HindlII-mal és BamHI-gyel kezeltük, és beillesztettük az i pont szerint előállított promotor fragmenst. így pCABP2-t kaptunk. A pUC 18-ból a BamHI-gyel végzett kezelés eltávolítja az egyetlen Sphl helyet. Ezért a képződött pCABP2 egyedi Sphl helyet tartalmaz, ahová operátorok illeszthetők,
A fenti eljárásban felhasznált operátor szekvenciája a következő volt lac operátor 2: 5*-ATTGTGAGCGCTCACAATCAT G-3* ’-GTACTAACTCTCGCGAGTGTTA-5’
Meg kell jegyeznünk, hogy a fenti a és b megoldás során az operátor szekvenciákat nem közvetlenül a vélelmezett szabályozó elemekbe illesztettük be; a szekvenciák bárhová történő beillesztése azonban várhatóan módosítja a promotor aktivitást.
2. módszer:
Amint fentebb ismertettük, az operátor szekvenciák beillesztésére két természetes restrikciós hely áll rendelkezésre. Ha az operátor szekvenciákat más helyekre kívánjuk illeszteni, más megoldásokat kell alkalmaznunk.
Az operátor beillesztése a TSP és az ATG kodon közé:
Ezt a műveletet PCR módszerrel végezhetjük. Mint15 hogy a TSP tartomány közelében egyedi Puvl hely van, ezt használjuk referenciapontként a szubklónozás céljára. A PCR reakcióban kiindulási anyagként pCABPl-et, azaz a fentiek szerint kialakított pAT 153 CAB promotor vektort használjuk. A reakció egyik oldalról való beindítására a PvuII hellyel átfedő és változásokat nem tartalmazó oligonukleotidot használunk, amelynek szerkezete a következő:
CAB ollgonukleotld-li
PvuII
5*-GG GAGCTG CTGTGTTCTGTTATGAC-3’
A második oligonukleotid az Ncol hellyel fed át, és a következő operátor szekvenciát tartalmazza:
CAB nukleotfd-4;
Xbal
5’-CCCAAACAG TCTAGA TATGTTTCT-3’
CAB nukleotid-5;
PvuII operátor_
5’-CAGAACACAG CAGCTG CCTTTTATAC ATTGTGAGCGCTCACAAT-AGTTGGGTTTGGATAGCAGGTCATC-3’
CAB nukleotfd-6:
PvuII operátor-1_
5’-CAGAACACAG CAGCTG CCTTTTATAC ATTGTGAGCGCTCACAAToperátor-2
-ATTGTGAGCGCTCACAAT AGTTGGGTTTGGATAGCAGGTCATC-3’
A PCR reakciók után az újonnan szintetizált DNS-t PvuII-vel és Ncol-gyel hasítjuk. A kapott fragmenst ezután a fentiekkel azonosan hasított pCABPl-be visszük át és szekvenciáljuk.
A fenti megoldás kismértékben módosított variánsát is alkalmazhatjuk, amelynél a pCABPl-be való közbenső klónozási művelet elhagyható. Ebben az esetben a CAB promotor egyedi Xbal helyével átfedő oligonukleotidot használunk a fent ismertetett operátor nukleotidokkal együtt. A PCR módszerrel kialakított DNS-t Xbal/NcoI-gyel hasítva olyan fragmenshez jutunk, amit közvetlenül PCGl-be és pCG2-be klónozhatunk. A PCR reakcióval kialakított, Xbal-től Ncol-ig terjedő fragmens azonban lényegesen nagyobb az előző módszer szerint kialakított, PvuII-től Ncol-ig terjedő fragmensnél.
HU 215 090 Β
Az operátor beillesztése a CAAT és TATA dobozok közé:
Ezt a műveletet PCR reakcióval végezzük a következő nukleotidok kialakítása útján:
CAB nukleotid-4;
Xbal
5’-CCCAAACAG TCTAGA TATGTTTCT-3’
CAB nukleotid-5;
PvuII opetátoi__
5’-CAGAACACAG CAGCTG CCTTTTATAC ATTGTGAGCGCTCACAAT-A GTT GGGTTTGGATAGCA GGTCATC-3’
CAB nukIeotld-6:
PvuII operátor-l_
5’-CAGAACACAG CAGCTG CCTTTTATAC ATTGTGAGCGCTCACAAToperátor-2
-ATTGTGAGCGCTCACAAT AGTTGGGTTTGGATAGCAGGTCATC-3’
A PCR reakciót követően a DNS-t Xbal-gyel és Pvul-gyel hasítjuk, majd hasonlóan hasított pCABPl-be klónozzuk. A kiónokat most is szekvenciálással azonosítjuk, és a megfelelő DNS-eket Xbal-gyel és Ncol-gyel hasítjuk, majd pCGl-e és pCG2-be klónozzuk. Az így kialakított vektorok alapszerkezeté, ábrán mutatjuk be.
A CAMVpromotor
Azt tapasztaltuk, hogy a promotormentes 35 S vek- 30 torok kiválóan alkalmazhatók receptorokként aktiváló szekvenciák beillesztésére. Ebbe a vektorba (p-A-35S) beépíthető a lac operátor, majd a beépítés után a 35S serkentőt a lac operátor fölötti 5’ részbe illesztjük.
3) A génkifejezés vezérlése lac repesszorral
a) A célzott gén kifejezésének vezérlése tranziens kifejező rendszerben
Protoplasztokból lacl-et konstitutívan kifejező, p351acl-gyel transzformált növényeket alakíthatunk ki, majd azokat a korábbiakban ismertetett módszerekkel a 40 lacl fehérje kifejezésére vizsgálhatjuk. A célzott génszerkezeteket ezután ismert módszerekkel beépíthetjük a protoplasztokba. Kontrollként transzformálatlan növényekből származó protoplasztokat használunk. További kontrolokként alkalmazhatjuk olyan növények protoplasztjait, amelyekben a GUS marker gén kifejezését beillesztett operátorokat nem tartalmazó CAB promotor vezérli.
b) Génkifejezés indukálása IPTG-vel
A lac represszor által előidézett represszió kivédésé- 50 re IPTG-t használhatunk. Ezáltal ki-be kapcsolható működésű génrendszer jön létre.
c) A célzott gén kifejezésének modulálása
A lac represszor/operátor kölcsönhatások növényi szervezetekben változó mértékű alulszabályozást fejt- 55 hetnek ki a marker gén kifejezésére. Ez igen fontos hatás, mert adódhatnak olyan helyzetek, amikor más mértékű alulszabályozásra van szükség.
d) A célzott gén kifejezésének vezérlése stabilan transzformált növényekben
Miután a fent ismertetett módon kimutattuk, hogy a lac represszor alkalmas a CAB promotor által kiváltott 25 GUS kifejeződés alulszabályozására protoplasztokban, a korábbiakban ismertetett módszerekkel megfelelő beépített operátorokat tartalmazó szerkezeteket vihetünk át dohánynövényekre. A regenerált növényeket a fent ismertetett, lacl-et kifejező növényekkel (amelyek a lac represszort a konstitutív CaMV35S promotor vezérlése alatt fejezik ki) keresztezhetjük.
Olyan növényeket is kialakíthatunk, amelyek a lacl gént a fénnyel indukálható kukorica CAB promotor vezérlése alatt fejezik ki. Ezekben a növényekben a lacl 35 gén kifejezése fénnyel indukálható. Ezeket a növényeket olyan növényekkel keresztezhetjük, amelyek beillesztett lacl operátort tartalmazó CaMV promotorból származó GUS marker gént tartalmaznak.
Több operátor beillesztése a CAB promotorba
Az egyedi operátorok beillesztésével kapcsolatban ismertetettekhez hasonló műveletekkel több operátort is beilleszthetünk a célzott promotorba. Eljárhatunk például úgy, hogy az operátor többszörös másolatait illesztjük egy helyre, vagy olyan promotor fragmenseket 45 kombinálhatunk, amelyek az operátort a promotor különböző helyeire illesztve tartalmazzák. Az utóbbi megoldással olyan vektorokhoz jutunk, amelyekben a különböző operátorok a promotor több különböző helyén helyezkednek el.
A találmány szerinti eljárás más kiviteli alakja
A most ismertetendő kiviteli alak szerint a gén kifejezését úgy szabályozzuk, hogy a génbe vagy a génre pszeudo-operátor szekvenciát illesztünk, és olyan mutáns szabályozó gént alakítunk ki, amely a pszeudooperátorhoz kötődő aminosav-szekvenciát tartalmazó represszort kódol.
Egymással kölcsönhatásban álló represszor és operátor géneket tartalmazó sejteket a következőképpen különíthetünk el: lacZ, lacY és lac A géneket tartalmazó 60 Escherichia coli lac operont, valamint represszor fehér14
HU 215 090 Β jét kódoló gént tartalmazó rekombináns plazmidot készítünk, ezt a plazmidot bakteriális gazdaszervezetbe visszük be, a gazdaszervezetet orto- vagy para-nitrofenil-l-tio-P-galaktozidáz jelenlétében tenyésztjük, ami gátolja azon sejtek növekedését, amelyekben a represszor molekula nem szorítja vissza a lac gén kifejezését, nem gátolja viszont azon sejtek növekedését, amelyek represszor/operátor kötést tartalmaznak, majd a növekedésükben nem gátolt sejteket elkülönítjük.
Az eljárás során mutáns represszorokat használhatunk, vagy a lac operon operátor tartományába külső forrásból potenciális pszeudo-operátort építhetünk be. A külső forrásból származó potenciális pszeudo-operátor előnyösen növényi eredetű lehet.
Bakteriális gazdaszervezetként előnyösen Escherichia coli-t használunk.
Ezáltal lehetőség nyílik a génkifejezés represzszorának módosítására és így a gének inaktiválására. A pszeudo-operátorok olyan DNS szekvenciák, amelyek megtartják az operátorok általános diád-szimmetriáját, azonban az operátorokétól eltérő alkotó bázisokat tartalmaznak. A zöldbab GPAL2 génjének és promotorának, valamint az emlős c-myc gének ismert DNS szekvenciáinak számítógépes elemzésével számos olyan DNS szekvenciát tártunk fel, amelyek különböző bakteriális represszorokhoz pszeudo-operátorokként alkalmazhatóak lehetnek.
A pGAL2 plazmidot Escherichia coli DH5 törzsben 1988. december 6-án helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben NCIB 40087 számon.
Valószínű tehát, hogy minden génben találhatók „pszeudo-operátor” szekvenciák. Általánosságban véve tehát a pszeudo-operátor megjelölésen valamely gén köztük valamely növényi gén - megfelelő helyzetében lévő olyan DNS szekvenciát értünk, amelyhez ha represszor kapcsolódik, az eredmény a gén kifejeződésének gátlása lesz.
A pAD18 plazmidot a Budapesti Megállapodásnak megfelelően Escherichia coli DH5oc törzsben mint gazdaszervezetben 1988. december 21-én helyeztük letétbe a National Collections of Industrial and Maríné Bacteria Limited (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben NCIB 40096 számon.
A pPsl plazmidot a Budapesti Megállapodásnak megfelelően Escherichia coli DH5a törzsben mint gazdaszervezetben 1988. december 21-én helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Limited (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben NCIB 40097 számon.
Ez az eljárás olyan fehéqe-mólekulákra is alkalmazható, amelyek a gén aktivitásának növekedéséhez vezetnek. A megoldás különösen előnyösen alkalmazható specifikus vegyszerekre reagáló represszor/aktivátor fehéqe párok kiválasztására. A vegyszerek kötési tartományának megfelelő megválasztásával és specifikus kezelésével olyan specifikus, vegyszerhatásra reagáló fehérje/DNS kombinációkat alakíthatunk ki, amelyek a biotechnológiában például kémiai átkapcsolókként alkalmazhatók; ezáltal a növényi gének működése külső forrásból felvitt kémiai indukálószerrel kézbentarthatóan szabályozhatóvá válik.
Az in vivő körülmények között végbemenő mutációk egyaránt érintik a represszorokat és az operátorokat. In vitro körülmények között viszont kialakíthatók módosított DNS-felismerő sajátságokkal rendelkező represszorok. Kialakíthatók tehát olyan ritka represszor mutánsok, amelyek képesek egy feltételesen halott gén működését beindítani azáltal, hogy olyan pszeudo-operátor szekvenciákhoz kapcsolódnak, amelyeket a natív represszor nem képes felismerni.
A találmány szerinti eljárás most tárgyalt kiviteli alakját a következő példa kapcsán ismertetjük részletesebben. Hivatkozunk továbbá a pPs és pAD plazmidok és variánsaik térképeit szemléltető ábrákra.
Példa
A találmány szerinti szelekciós rendszert 434 represszor fág példáján ismertetjük. Megjegyezzük azonban, hogy ehhez a szelekciós rendszerhez elvben bármely más represszor is felhasználható.
1. A szelekciós rendszer
Olyan szelekciós rendszert állítottunk össze, amely a represszor/operátor rendszerek széles választékánál felhasználható mutánsok szelektálására. A szelekciós rendszer plazmidok és az azoknak megfelelő E. coli gazdasejtek sorozatából, valamint a plazmidokra és a gazdaszervezetekre alkalmazható szuicid szubsztrátum-szelekciós műveletből áll.
Végső formájában a rendszer alkalmazhatósága azon alapul, hogy a ritka represszor mutánsok képesek-e egy feltételesen halott gén működését beindítani azáltal, hogy olyan „pszeudo-operátor”-hoz kapcsolódnak, amelyhez a vad típusú represszor nem képes kötődni. A következőkben ismertetendő szelekciós rendszer olyan megoldásokat tartalmaz, amelyek révén a végső sejtpopulációban azonosítható kívánt represszor mutánsok gyakorisága maximálissá válik.
A szelekciós eljárásban az Escherichia coli lac operonját alkalmazzuk, szuicid szubsztrátumként pedig p-nitro-fenil-l-tio-P-D-galaktozidot (TPNPG) használunk. A lacZ, lacY és lacA géneket tartalmazó lac operont az átírás kezdőpontja és a lacZ gén között elhelyezkedő lacO operátor szekvenciához kapcsolódó Laci represszor kötődésével vezéreljük. A LacY gén által termelt laktóz permeáz felelős a laktóz és a rokonszerkezetű vegyületek aktív felvételéért a sejtfolyadékba, ahol azok a lacZ gén által termelt β-galaktozidáz hatására galaktózzá és glükózzá hidrolizálnak.
A pozitív szelekciós rendszer azt a felismerést hasznosítja, hogy TONPG vagy TPNPG jelenlétében szelektíven gátolt a lacY gént kifejező sejtek növekedése (a szelektív gátlás feltehetőleg a sejtek transzportfolyamataiban bekövetkező anyagcsere-energiaveszteségekre vezethető vissza). Az említett vegyületek szelektivitása fokozható, ha szénforrásként szukcinátot használunk.
A szelekció mögöttes oka az, hogy a 434 represszor a lac génkazetta kifejeződését megindító promotorban
HU 215 090 Β lévő pszeudo-operátor szekvenciákhoz képest kötődni. 434 represszor/operátor komplex távollétében a lac operon kifejeződik, és TPNPG jelenlétében a folyamat sejtpusztuláshoz vezet. Az adott komplex jelenlétében viszont a LacY permeáz nem fejeződik ki, így a szuicid szubsztrátum - a TPNPG - nem képes behatolni a sejtekbe. Ezt az elemzést figyelembe véve egy, a célzott növényi gén természetes szekvenciájából kiválasztott pszeudo-operátort a Sáli helyre klónozunk, és 434 represszorokat kódoló olyan génforrással kombináljuk, ahol az a3 helix egyes aminosavjait véletlenszerűen más aminosavak helyettesítik. TPNPG jelenlétében csak azok a sejtek szelektálódnak, amelyek a pszeudo-operátorhoz kötődni képes mutáns represszort fejeznek ki, azaz amelyekben visszaszorul a lacY kifejeződése.
2. A plazmidok
2.1. pAD18 plazmid és származékainak kialakítása
Kísérleteink céljára egy sorozat plazmidot alakítottunk ki. Ezek prototípusa a pAD18 plazmid, amelynek térképét a 13. ábra szemlélteti. Ez a vektor egy pSCIOl replikonon alapul, amiről ismert, hogy E. coli gazdaszervezetben stabilan fenntartható, és kisszámú másolatot szolgáltat. (A pSCIOl plazmid 1973 óta hozzáférhető; teljes szerkezetét a Mól. Microbiol. 5, 233 (1991) közlemény ismerteti.) Az utóbbi sajátság lényeges, mert a DNS-kötő fehéijék túlzott mértékű kifejeződése károsan befolyásolhatja a gazdaszervezet növekedését. Ha ez egyes kísérletekben nehézségeket okoz, célszerű a pAD18-on lévő géneket bakteriofág vektorra átvinni annak érdekében, hogy egyetlen génmásolatként legyenek a bakteriális genomba illeszthetők.
A pAD18 kanamicinnel szelektálható markerrel rendelkezik az E. coli törzsekben való fenntartásra.
A pAD18 a lac operont is tartalmazza. A lacZ és lacY géneket a lac promotor/operátor kombináció vezérli. A lac operátorba biomémöki úton Sáli restrikciós helyet építettünk be a 434 operátor - vagy pAD18-származékok esetén mutáns 434 operátorok vagy előre kiválasztott „pszeudo-operátorok” - beillesztésére. Ezt a restrikciós helyet olyan helyzetben alakítottuk ki, ahol sztérikus gátlások nem akadályozhatják lac operon kifejeződését a lac promotorból abban az esetben, amikor az adott restrikciós helyre klónozott operátor megkötéséhez elegendő mennyiségű represszor szintetizálódik. Azokat a bázisokat alakítottuk át Sáli restrikciós helyekké, amelyekről ismert, hogy RNS polimerázzal érintkezve nem vesznek részt a reakcióban. így a lac operon kifejeződését a 434 represszor vezérli. A pAD18 - ami a fenti plazmid-sorozat prototípusa - a vad típusú (természetes) 434 operátort tartalmazza.
A pAD18 tetraciklin rezisztencia gént tartalmaz, amihez - nagy kifejezési szint elérésére - hozzáilleszthető a lacUV5 promotor által vezérelt vad típusú 434 represszor gén. Ezt a vektort pPS 1-nek nevezzük. A további származékokat a későbbiekben ismertetjük.
Egy másik vektorban a 434 represszort úgy módosítottuk, hogy a DNS-kötő helix egyik oldalára KpnI és Notl helyet iktattunk be; ebben a tartományban fenntartottuk a natív aminosav szekvenciát. Az így módosított
434 represszor génbe véletlenszerűen kiválasztott oligonukleotidokat iktathatunk be, amelyek - kifejeződés után — módosított DNS-kötő tartományokat kifejező 434 represszor molekulákat képeznek. A szuicid szubsztrátumot alkalmazó szelekciós rendszer ekkor olyan 434 mutáns represszorok szelekcióját teszi lehetővé, amelyek a „pszeudo-operátor”-hoz kötődnek. Egyes esetekben ez a szelekciós rendszer egyúttal a represszor mutánsok elkülönítéséhez szükséges szelekciós nyomást is szolgáltathatja. A rendszer represszor mutánsok elkülönítésére való alkalmassága a lacY permeáz kifejezésének/repressziójának függvénye.
A pAD18 és származékai tehát operátorok vagy represszor gének beiktatását lehetővé tevő klónozó helyeket tartalmaznak. Eljárhatunk úgy, hogy az operátorokat a pAD18 prekurzor vektoraiba - előnyösen pRW283 vektorba - klónozzuk, amiből ezután kimetsszük az operátort tartalmazó, EcoRl-től Pstl-ig terjedő fragmenst, majd azt EcoRI-gyel és Pstl-gyel kezelt pAD 18-ba klónozzuk (lásd a 13. ábrát).
Vizsgálataink egyik célja annak bemutatása volt, hogy a fentiekben ismertetett plazmidok által hordozott lac operon kifejeződése 434 represszor/operátor kölcsönhatások révén vezérelhető. Ennek bemutatására három plazmidot alakítottunk ki, amelyekben a pAD lóban, pAD 17-ben és pAD 18-ban lévő 434 operátorokat a pAD 15.2-ben lévő vad típusú 434cl génnel kombináltuk. A pAD 15.2-ből származó nagyméretű (9,4 kb) XhoESstI fragmenset tisztítottuk, majd a pAD 16-ból, 17-ből és 18-ból származó, tisztított kisméretű (3,7 kb) XhoESstI fragmenshez ligáltuk, és így a pPS2, pPS3 és pPSl plazmidot állítottuk elő. Az egyes ligációkbpl származó több transzformátumból elkülönített plazmid DNS restrikciós analízise azt mutatta, hogy az összes pPS plazmid a várt szerkezettel rendelkezett. A plazmidok szerkezetét a 13. ábra szemlélteti.
A pAD és pPS plazmidokban lévő operátorok integritását szekvenciálással ellenőriztük. Első lépésben az egyedi pAD és pPS plazmidokból elkülönítettük a körülbelül 200 bázispárt tartalmazó EcoRI/PstI fragmenst, amely a teljes lac promotort és a lacZ gén 5’ végét hordozza, majd az elkülönített fragmenseket M13mpl8 polikapcsolóba szubklónoztuk. A kapott egyszálú templátokat ismert módon tisztítottuk és szekvenciáltuk. Más megoldás szerint plazmid szekvenciálást alkalmaztunk a munkaigényes szubklónozási művelet kiküszöbölésére. Az elemzési eredmények azt igazolták, hogy az összes releváns plazmid Sáli helyén a megfelelő 14-tagú operátor szekvencia található. A lac promotor más lényeges jellemzőit is igazoltuk a vizsgálatokkal.
2.2. A pPs plazmidok funkcionális 434 represszort kódolnak
A pAD15.2 és a pPS plazmidok által termelt 434 represszor láthatóvá tétele céljából szelektív körülmények között tenyésztett középlogaritmikus tenyészetekből teljes fehéq’e extraktumokat készítettünk, majd poli(akril-amid) gélen végzett elektroforézis után az extraktumokat Coomassie brilliant blue (G250) színezékkel festettük meg. A 434cl gént tartalmazó törzsekben nem
HU 215 090 Β tudtunk a represszor méretének megfelelő fehéqeket kimutatni. Más kísérleteink eredményei azonban azt mutatták, hogy ezzel a viszonylag kis érzékenységű technikával 1 pg-nál kisebb mennyiségű tisztított represszor már nem tehető láthatóvá. Ezért a teljes sejtfehéqe legalább 1%-ának megfelelő kifejezési szint lenne szükséges ahhoz, hogy az alkalmazott mennyiségű extraktumban kimutathatóvá váljon a 434 represszor. A kimutatást a más hasonló méretű fehérjék háttér-hatása is megnehezíti. Ezért a represszor kimutatására a lényegesen érzékenyebb nyugati irányú foltképzési technikát használtuk. A kimutatáshoz szükséges primer antitestet úgy állítottuk elő, hogy a tisztított intakt 434 represszort nyulakba injektáltuk. Az így kapott poliklónos antiszérum specificitását tisztított represszor és a 434cl gént magában foglaló E. coli törzsekből származó extraktumok felhasználásával vizsgáltuk. Kismértékben hígított antiszérummal a bakteriális extraktumokból a 434 represszor mellett számos egyéb fehéqe is kimutatható volt. Az antiszérumot tovább hígítva azonban már csak a 434 represszor maradt kimutatható; a maximális specificitást 1:10000 és 1:20000 közötti hígításoknál észleltük.
A fenti antitest preparátumot és a jégretek peroxidáz konjugátumos kimutatási technikát alkalmazó eljárás érzékenységét úgy vizsgáltuk, hogy 6300Alac4169 nyers sejtextraktumához — ami nem tartalmaz 434cl gént változó mennyiségben adtunk tisztított represszort. Standard körülmények között 5 ng represszor 5 Bg extraktumban már könnyen kimutatható; ez az érzékenység a teljes sejtfehérje 0,01%-ának megfelelő kifejezési szintnek felel meg.
A vizsgált plazmidokat hordozó 6300Allac4169 törzsek fentiek szerint végzett elemzése azt mutatta, hogy a pAD15.2, pPSl, pPS2 és pPS3 plazmidot magában foglaló összes sejt szintetizál 434 represszort. A kapott sávok relatív intenzitásait pásztázó denzitométerrel vizsgáltuk. Az eredmények szerint mind a négy törzs teljes sejtfehérjéinek körülbelül 0,4%-át teszi ki a 434 represszor.
A 434 represszor vad típusú operátor szekvenciákhoz kötődését funkcionális vizsgálattal határoztuk meg, 434cl, 434vir és Xcl bakteriofágok felhasználásával. Ezen fágok életciklusában a megfelelő represszomak a PR promotorban lévő operátorokhoz való kötődése visszaszorítja a sejtoldódásért felelős gének átírását. Következésképpen azok a sejtek, amelyek endogén úton cl represszort szintetizálnak, ellenállnak a megfelelő fágok sejtoldó hatásának, mert a már meglévő represszor gátolja a sejtoldódásért felelős gén kifejeződését. Minthogy a cl mutáns fágok nem képesek represszort szintetizálni, a fágokkal való megfertőzés után fellépő sejtoldódás azt jelzi, hogy a gazdasejtből hiányzik a represszor. A vir mutáns fágok PR operátorai csökkent affinitást mutatnak a represszorhoz, ennek következtében kis mennyiségű endogén represszor jelenlétében ez a fág sejtoldó, nagyobb represszor jelenlétében ez a fág sejtoldó, nagyobb represszor koncentrációk esetén azonban gátolt a szuperfertőzés.
A felsorolt fágokat a vizsgált törzsekkel együtt tenyésztve azt tapasztaltuk, hogy a pPS plazmidokat magukban foglaló sejtek a 434cl és 434vir fág által kiváltható szuperfertőzéssel szemben immunisak, a Xcl fágra azonban érzékenyek. A más pAD plazmidokat tartalmazó törzsek mindhárom fágra érzékenyek voltak. Ez a tény egyértelműen jelzi, hogy a pPS plazmidokat tartalmazó sejtek nagy mennyiségű 434 represszort szintetizálnak, ami funkcionálisan képes az operátorhoz kötődni és a PR-ből történő átírást gátolni. Az adott represszor/operátor kölcsönhatás specifikusságát az a tény jelzi, hogy a 434 represszor nem képes a λεί fág operátoraihoz kötődni, amelyek szekvenciája eltér a 434 fág szekvenciájától, ezért bekövetkezik a sejtoldódás.
Vizsgálataink tehát azt mutatták, hogy mind a három pPS plazmid a kívánt szerkezettel rendelkezik, mindhárman hordozzák a várt 434 operátor szekvenciát, és képesek funkcionális 434 represszort szintetizálni.
2.3. Vektor-tökéletesítés
Miként a későbbiekben részletesebben ismertetjük, a pAD és pPS plazmidot tartalmazó törzsek populációjának egy része szelekció során fehér telepeket képez. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy ha a fenti plazmidokat tartalmazó törzseket több hónapon át tartjuk szelektív táptalajokon - szükség esetén szubkultúrákat képezve -, a populációban nő a fehér telepek száma.
Feltevésünk szerint ezek a fehér telepek olyan plazmidokat tartalmaznak, amelyekben a lac operon egy része vagy teljes egésze mutációt szenvedett vagy hiányzik. Az ilyen jellegű problémák minimumra szorításának rendszerinti módja az, hogy rekombináció-szegény törzset alkalmaznak. A Alac4169 és recA56 egységek kombinálása azonban a törzset - eddig még nem tisztázott okból - TPNPG jelenlétében életképtelenné teszi. Ezért megkíséreltük a rekombinációs események valószínű forrását feltárni. Itt jegyezzük meg, hogy a pPS plazmidokban a lac operont és a 434 represszor gént kifejező promotorok egyaránt a lac promotorból származnak, ezért szekvenciájuk nagymértékben hasonló egymáshoz. Ezen szekvenciák egymás közötti rekombinációja a lac operon eltűnéséhez vezet, feltéve hogy az alkalmazott szelekciós körülmények közötti az eredő szekvenciák és a kanamicin-rezisztencia gén változatlan marad.
A pAD15.2 kialakítása során a 434cl gént a pRP42 plazmidról egy 1 kb mólekulatömegű Sau3A fragmensre vittük át. A 434 represszort beolvasó keret leállító kodonja egybeesik a fragmens jobboldalán lévő Sau3A hellyel, következésképpen a pAD15.2-be klónozott gén nem tartalmaz átírást leállító jeleket. Ez a Sau3A fragmens pBR322-maradékot is hordoz, amely az ampicillin-rezisztencia gén promotort tartalmazza. Ezért a felsorolt problémák kiküszöbölése céljából a szekvenciákat a 434cl kódoló szekvencia alatt és fölött egyaránt módosítottuk. A felső tartományt megfelelő oligonukleotidok felhasználásával triptofán promotorral és egy konszenzus Shine-Dalgamo szekvenciával helyettesítettük. Mindkét változtatás kiküszöböli a plazmidok közötti rekombinációt; a változtatással
HU 215 090 Β ugyanakkor az ampicillin-rezisztencia gén promotort is eltávolítottuk.
A 434cl gén-átírások lezárása céljából a 434cl kódoló szekvencia 3’ végére beiktattuk az rrn TI terminátort. Azért választottuk ezt az rho-független terminátort, mert ismert, hogy kétirányú lezáró aktivitással rendelkezik, így a 434cl átírások lezárásán kívül arra is alkalmas, hogy a vektorban bárhol iniciált ellenirányú átírásoknak a 434cl kifejezésre gyakorolt letörő hatását megakadályozza.
2.4. A pTPl plazmid kialakítása
A vad típusú trp promotor szekvenciát és a konszenzus Shine-Dalgarno szekvenciát (AGGAGGT) 5 bázispárral a 434cl gén transzlációt indító hely fölé építettük be oligonukleotidok felhasználásával. Ez az elhelyezés biztosítja a 434cl gén maximális transzlációs aktivitását. Minthogy a 434cl gén startpontjánál nincsenek megfelelő restrikciós helyek, a kódoló szekvenciában 33 bázispárral beljebb lévő EcoRI helyet használtuk. Ezért a kódoló tartomány 5’ végét be kellett illesztenünk az oligonukleotidba. A kívánt, 126 bázispár hosszúságú szekvenciát négy átfedő oligonukleotidból alakítottuk ki. Az oligonukleotidok összeillesztése után a duplex 126 bázispárból álló fragmenst elkülönítettük, és EcoRI-vel hasított pUC19 vektorba klónoztuk. A transzformátumokat ampicillint és BCIG-t tartalmazó táptalajokon szelektáltuk, majd több fehér telepből származó DNS-t plazmid szekvenciáló eljárással szekvenciáltunk. A vizsgálat szerint a promotor szekvencia a várt szerkezettel rendelkezik.
2.5. A pTTl plazmid kialakítása
Az rrn TI terminátor szekvenciájának hosszú, A = T-ben dús tartományokkal szegélyezett hosszú, G = C-ben dús törzsszerkezete van, ami az adott anyagot mindkét irányban erősen ható átírási terminátorrá teszi. A szekvencia invertált ismétlődő jellegére tekintettel a szekvenciát négy oligonukleotid felhasználásával építettük be, kiküszöbölve ezáltal az egyedi szálakon belüli ön-összefonódásból származó problémákat. Az oligonukleotidokat párosával illesztettük össze, majd a képződött kétszálú DNS-eket külön-külön elkülönítettük, és a sejtek ampicillin-rezisztenssé transzformálása előtt EcoRI/HindlII-mal hasított pTPl DNS-hez ligáltuk. Ezután ellenőriztük a beiktatott terminátor szerkezet szekvenciáját.
2.6. A pTRTl plazmid kialakítása
A trp promotor mögé klónozandó 434cl gén forrásaként pRP42-76 plazmidot használtunk. Az a3 felismerő helixet kódoló szekvencia egyik oldalán in vitro körülmények között végrehajtott mutagenezissel restrikciós helyeket alakítottunk ki KpnI és XmalII számára. Ily módon olyan oligonukleotidok válnak beépíthetővé, amelyekben az a3 helixben lévő egyes kodonok véletlenszerűen mutagén változáson estek keresztül. A 434cl gént hordozó, körülbelül 600 bázispárból álló EcoRI/Sau3A fragmenst elkülönítettük, és EcoRI/BglII-vel hasított pTPl-be klónoztuk. Ez a művelet pontosan helyreállítja a 434cl nyitott beolvasó keretét, és a Sau3A/BglII kapcsolatban fennmarad a transzlációt leállító kodon. A kapott terméket elkülönítettük, ezután a kazetta egyik végéhez illesztett polikapcsolókban lévő BamHI helyek felhasználásával kivágtuk a trpP-434cI-rmTl kazettát, és ezzel helyettesítettük a pAD és pPS plazmidokban lévő 434cl gént.
Triptofán jelenlétében a pTRTl kialakításához felhasznált triptofán promotor szekvenciáját a trp represszor megköti, és így gátolja az átírást. Az utóbbi represszor kötőhelyeit szándékosan tartottuk fenn annak érdekében, hogy jövőbeni kísérletekben - szükség esetén - szabályozhassuk a 434cl gén kifejezését. Rendszerint azonban 434 represszor szintézisének lehetővé tételére olyan törzseket alakítunk ki, amelyek kromoszómájából elhagytuk a trpR gént.
3. Szelekciós műveletek
3.1. Szelekció TONPG-vel
Olyan, TONPG-t (o-nitro-fenil-P-tiogalaktozidot) alkalmazó szelekciós eljárást dolgoztunk ki, amely azon kiónok szelektálását teszi lehetővé, amelyekben mutáns represszor kötődik a mutáns 434 operátorhoz, és ezáltal visszaszorul a lacY kifejezése (feltételes gátlás visszaszorításán alapuló szelekció).
A TONPG gátolja a lacY permeáz gént kifejező E. coli sejtek növekedését. Az egyetlen lacY+ E. coli másolattal végzett korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy ezek a sejtek szukcinát minimális tápközegben a lacY kifejezés szempontjából 500-1000 pg/ml TONPG-re a legérzékenyebbek. A kevert populációkon végzett vizsgálatok azt igazolták, hogy a TONPG alkalmas lacY sejtek kiválasztására vegyes lacY+/~ populációból. Ezeket a vizsgálatokat lacY+ és lacY~ pAD píazmidokkal megismételtük. A TONPG-t alkalmazó szelekció csak lacmentesített E. coli gazdasejtben működik. Az előnyösen felhasználható gazdaszervezetet a későbbiekben ismertetjük. A szelekció folyékony tenyészetekben nagyobb hatásfokkal végezhető, azonban agarlemezeken is végrehajtható. Szilárd táptalajon jobb eredményeket érhetünk el, ha a szelekcióhoz más galaktozid-analógot, azaz pnitro-fenil-P-tiogalaktozidot (TPNPG) használunk. Folyékony tenyészetekben TONPG-t és lemezeken TPNPG-t használva a szelekcióval rendszerint a kezdeti populációban jelenlévő lac-pAD plazmidok hatszoros logaritmikus feldúsulását érhetjük el.
3.2. Az E. coli gazdaszervezet
Olyan bakteriális gazdaszervezetet választottunk ki, amely lehetővé teszi a TONPG-vel végzett szelekciót. Ehhez arra van szükség, hogy a gazdaszervezet minimális szukcinát táptalajon növekedésre képes legyen. Ebben a példában olyan gazdaszervezetet használtunk, amiből a teljes lac operont elhagytuk, azonban más alkalmas mutáns gazdaszervezeteket, például laci--t vagy lacY~-t is használhatunk. Egy alkalmas törzset W1485 (CGSC 6300) törzs származékából alakítottunk ki, amiből transzpozonhoz kapcsolt Pl transzdukcióval eltávolítottuk a teljes lac operont.
3.3. Szelekció TPNPG-vel
Kevert populációjú kísérleteket végeztünk 63001ac+ törzs és Alac4169 származéka tenyészetein annak megállapítására, hogy képes-e a TPNPG a lacsejteket lac+ sejtek hátteréből szelektálni. A törzseket a
HU 215 090 Β laktóz operon kifejezésének indukálása céljából 1 mmól IPTG jelenlétében középlogaritmikus fázisig tenyésztettük. A két tenyészetet változó arányban összekevertük egymással, majd a keverék tenyészetekből 1 mmól IPTG-t és 50 pg/l BCIG-t tartalmazó minimális szukcinát/só lemezeken, TPNPG jelenlétében és TPNPG távollétében sorozathígításokat készítettünk.
A kezdeti kísérletek azt mutatták, hogy 500 pg/ml TPNPG csak a lac+ sejtek növekedésének késleltetésére alkalmas; 48 órán át 28 °C-on végzett inkubálás után kis kék telepek képződnek. 1 mg/ml TPNPG jelenlétében azonban ezek a háttérsejtek eltűntek; a lemezekre felvitt (legföljebb 7χ10-’ hígításig vizsgált) lac+ sejtek egyike sem volt képes kék telepeket képezni (lásd az V. táblázatot). Ugyanakkor ez a TPNPG koncentráció nem csökkentette észrevehető mértékben a lac- sejtek életképességét. Ez azt mutatja, hogy a TPNPG lac!+ sejtekkel szem5 ben igen erős szelekciós hatást fejt ki még akkor is, ha a lacY gén kromoszomális, azaz a másolatszám kis érték. Megjegyezzük, hogy a nagyobb másolatszám (ennek megfelelően a lac gének kifejezési szintjének növekedése pPS plazmidon) azt eredményezi, hogy a TPNPG felvételekor nagyobb az enerigaveszteség, ami a lac+ sejtek nagyobb mértékű pusztulásához vezet. A TPNPGvel végzett szelekciós vizsgálatok eredményeit az V. táblázatban közöljük.
K táblázat
A lemezekre felvitt lacés lac+ sejtek közelítő aránya Képződött telepek száma/ml
TPNPG távollétében TPNPG jelenlétében
Fehér Kék Fehér Kék
1:102 Ι,ΙχΙΟ2 2,0x10* 1,2x102 0
l:103 1,3x102 2,0 xlO5 1,2χ102 0
l:104 * 1,8x10« Ι,ΙχΙΟ2 0
1:105 * 1,5χ107 Ι,ΙχΙΟ2 0
1:5χ 105 * 7,0x10’ 1,2x102 0
♦meg nem határozható mennyiség
A TPNPG hatását a különböző pAD és pPS plazmidokat hordozó 6300Alac4169 sejtek túlélésére úgy vizsgáltuk, hogy a sejteket megfelelő sorozathígításban a fentiekben ismertetett szilárd táptalajon tenyésztettük. Két kísérletsorozat eredményei azt mutatták, hogy TPNPG jelenlétében valamennyi plazmid estén fehér és kék telepek egyaránt képződnek, míg TPNPG távollétében fehér telepek nem mutathatók ki (lásd a VI. táblázatot).
VI. táblázat
Hordozott plazmid Képződött telepek száma/ml
TPNPG távollétében TPNPG jelenlétében
Fehér Kék Fehér Kék
1. kísérletsorozat:
nincs 2,8X 10» 0 3,0x10» 0
pADlő * 3,5x10» l,2xl03 2,0xl03
pAD17 * 2,3x10» 1,3χ104 l,6xl03
pAD18 * 2,3x10» 2,3 xlO3 2,2x1ο3
pPSl * 3,8x10’ 2,0χ104 2,7x10’
pPS2 * 7,2x10’ 7,0x102 4,8x10’
pPS3 + 5,6x10« 2,0xl04 2,0x10'
2. kísérletsorozat:
nincs 3,1x10» 0 3,0x10» 0
pADlő * 2,9x10» Ι,ΙχΙΟ4 4,2x102
HU 215 090 Β
VI. táblázat (folytatás)
Hordozott plazmid Képződött telepek száma/ml
TPNPG távollétében TPNPG jelenlétében
Fehér Kék Fehér Kék
pAD17 * 3,4χ108 6,7x10? 5,9x10?
pAD18 * 2,7* 108 4,1x10? 2,5x10’
pPSl * 4,2x10? 8,5x10? 1,2x10’
pPS2 * 8,4x10? 5,2x10? 1,6x10?
pPS3 * 5,8x10? 5,7x10? 6,3x10'
*meg nem határozható mennyiség
Miként már korábban észlelték, valamennyi pAD és pPS plazmid fejleszt kék telepeket BCIG-t tartalmazó közegeken, függetlenül a 434 represszor/operátor kölcsönhatások megjelenésétől. Ez azt a feltevést látszik megerősíteni, hogy a képződött fehér telepek mutált vagy hiányos plazmidot hordozó sejtekből származnak, ahol a mutáció vagy a hiány a sejteket ténylegesen lac- sejtekké alakította. A fehér telepek előfordulásának viszonylag kis gyakorisága (a felvitt sejtek körülbelül 10~5-öd része) arra utal, hogy TPNPG-t nem tartalmazó közegeken ezek a telepek a főtömeget alkotó kék telepek között észlelhetetlenek maradnak. A fehér telepeket fejlesztő sejtekben lévő píazmidok elemzése kimutatta a várt hiányokat (lásd fent).
TPNPG jelenlétében a pAD-hordozó törzsek által képezett kék telepek száma 105-106-od részére csökken.
Ez azt jelzi, hogy a TPGNG a nem-represszált lac operont tartalmazó populáció nagy részét elpusztítja. Hasonló mértékben pusztul el TPNPG jelenlétében a pPS3-at hordozó törzs is - amint várható -, feltéve hogy a 434 represszor nem képes a lac gének átírását gátolni ebben a plazmidban. Minden esetben azonban TPNPG jelenlétében a felvitt sejtek körülbelül 105-öd részét kitevő mennyiségű kék telep fennmarad. Ezek a telepek feltehetőleg lacY- mutáns plazmidot magukban foglaló sejtekből származnak, korábban ugyanis kimutattuk, hogy a TPNPG szelekciós képessége elég erős ahhoz, hogy a felvitt sejtek elsöprő többségét elpusztítsa, félté- 45 ve hogy azok mind lac+-ok maradtak. Minthogy a korábbi vizsgálatok a kromoszomális lacY génnel kapcsolatban nem mutattak ki nagy mutációs gyakoriságot, feltételezzük, hogy a viszonylag nagy mutánsszámért plazmidközi rekombináció a felelős. Korábbi vizsgálatokkal már kimutatták, hogy ezek a píazmidok rec+ törzsekben instabilitásra hajlanak, és az ilyen típusú rekombinációk megelőzésére elvben alkalmas 6300Alac4169 recA56 törzsek TPNPG jelenlétében életképtelenek.
Az egyéb sejtekkel éles ellentétben a pPSl-et és pPS2-t tartalmazó sejtek túlnyomó többsége túléli a TPNPG hatását, a kék telepek száma csak a kezdeti érték felére - ötödére csökken; a csökkenés a pPSl-t tartalmazó sejteknél a legkisebb. Ez szoros korrelációban áll a β-galaktozidáz aktivitás jelentős csökkenésével (ami feltehetőleg a lacY kifejezést is jelentősen 20 csökkenti), amit ezekkel a plazmidokkal kapcsolatban korábban már megállapítottak. Ebből az a lényeges következtetés vonható le, hogy a 434 represszor és a hozzá tartozó operátor kölcsönhatása elég nagy mértékben csökkenti a lac gén kifejezését ahhoz, hogy a sejtek 25 többsége túlélje a szelekciós eljárást.
4. Módosított specificitású represszorok szelektálása
4a Módosított 434 represszor szelektálása
Wharton és Ptashane (Natúré 316, 601-605) a 30 434 represszorkötő tartomány véletlenszerű mutagenezisének elősegítése céljából véletlenszerű oligonukleotid-beépítéssel módosított 343 gént ismertet. A 434 represszor génbe mutagenezissel a DNS felismerő helix egyik oldalára KpnI és NotI restrikciós 35 enzimhasítási helyeket építettek be. A kívánt kohéziós végekkel rendelkező olyan oligonukleotidok sorozatát állították elő, amelyek a DNS felismerő a helixben véletlenszerű eloszlásban változó gyakoriságú mutációkat tartalmaztak. Ezeket az oligonukleotid-keverékeket a 40 módosított 434 represszor gén KpnI és NotI kohézív végei közé klónozták. Más megoldás szerint a „piszkos oligo”-módszert is alkalmazták a DNS-kötő tartományban különböző báziscseréket tartalmazó oligonukleotidkeverék előállítására.
4b Növényi génekben található módosított 434 represszor-felismerőpszeudo-operátor szelektálása
A módosított represszor szelektálására természetben előforduló pszeudo-operátort használtunk. Munkánk célpontja többek között a zöldbab GPAL2 génje 50 és a kukorica klorofill a/b kötő fehérje génje volt. Számítógépes elemzéssel kimutattuk, hogy a GPAL2 gén tartományában számos potenciális 434 pszeudo-operátor található. A módosított specificitású 434 represszor szelektálására a GPAL2 promotor ezen tartományait 55 használtuk, a „pszeudo-operátor” szekvenciákat a lacZ/lacY gének működését előidéző lac promotor -10-től -35-ig terjedő tartományába iktattuk be. A 434 represszor génbe „piszkos oligomer”-eket illesztettünk be, és a keverékeket E. coli 6300-ba transz60 formáltuk. Ezután ismert módon elvégeztük a szelekci20
HU 215 090 Β ót, és a telepeket elkülönítettük. Mikrobiológiai és molekuláris technikákkal igazoltuk, hogy ezzel a megoldással mutáns represszorok szelektálhatok. A represszor gént DNS szekvenciaanalízissel azonosítottuk, és a represszor kötéserősségének meghatározására kötési vizsgálatokat végeztünk.
A találmány szerint tehát gazdaszervezetből - előnyösen bakteriális törzsekből és plazmidokból - és érzékeny szuicid szubsztrátumot alkalmazó szelekciós eljárásból kialakított szelekciós rendszert dolgoztunk ki. Ezt a szelekciós rendszert módosított specificitású represszorok szelektálására alkalmazhatjuk. Az így kialakított, módosított specificitású represszorokkal a találmány értelmében szabályozhatjuk a gének szervezetekben való kifejeződését. A génkifejeződés fentiek szerinti szabályozásához a következőkre van szükség: a célzott gén DNS szekvenciája; a normál operátor szekvenciához hasonló DNS-szekvenciájú „pszeudo-operátorok” azonosítása; a „pszeudo-operátorok”-hoz kötődni képes represszorok szelektálására alkalmas szelekciós rendszer.
III. Hímivarú virágokra specifikus (MFS) génszekvenciák
Ez a modul a 17., 18. és 19. ábrán bemutatott polinukleotidokat tartalmazó, hímivarú virágszövetekben specifikusan kifejeződő hímivarú virágokra specifikus DNS szekvenciákat tartalmazza.
A 17. ábrán bemutatott génszekvenciát tartalmazó pMSIO plazmidot Eseherichia coli Rl törzsben mint gazdaszervezetben 1989. január 9-én helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria gyűjteményben NCIB 40098 számon.
A 18. ábrán bemutatott gén vezér lő szekvenciát tartalmazó pMS14 plazmidot Eseherichia coli DH5a törzsben mint gazdaszervezetben 1989. január 9-én helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria gyűjteményben 40099 számon.
A 19. ábrán bemutatott génvezérlő szekvenciát tartalmazó pMS18 plazmidot Eseherichia coli Rl törzsben mint gazdaszervezetben 1989. január 9-én helyeztük letétbe a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria gyűjteményben NCIB 40100 számon.
A következőkben ezen cDNS szekvenciák elkülönítését és azonosítását, valamint ezen cDNS szekvenciáknak a megfelelő genom szekvenciák azonosítására és elkülönítésére molekuláris tesztanyagként való alkalmazását ismertetjük.
Ismertetjük továbbá a genom szekvenciákat hordozó kiónokat, valamint az ismertetett kiónok egyikéből kiinduló promotor kazetta előállítását bármely fent említett kiónra általánosan alkalmazható módszerrel. Ismertetjük továbbá egy promotor tudósító génnel alkotott fúziójának előállítását és a kapott szerkezet átalakítását vizsgálandó egyeddé.
Amennyiben a példákban mást nem közlünk, a nukleinsavakon végzett műveleteket a Sambrook, Fritsch és Maniatis „molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2. kiadás, 1989) szakkönyvben közölt ismert módszerekkel hajtottuk végre.
1. példa
1. Hímivarú virágokra specifikus cDNS elkülönítése kukoricából, és a kapott cDNS azonosítása
A kukorica hímivarú virágaiban kifejeződő gének cDNS-ekkel való klónozására két cDNS könyvtárt alakítottunk ki. A kukorica hímivarú virágait a főszárat lezáró címer tartalmazza, az 1. könyvtárt korai meiotikus portokokat (a meiociták többsége korai meiotikus előfázisban van) hordozó teljes kukoricacímerek poli (A) RNS-éből alakítottuk ki, míg a 2. könyvtárt késői meiotikus portokokat (főtömegében diád és korai tetrád állapot) hordozó teljes címerekből származó poli (A) + RNS-ből képeztük. A könyvtárszűrési eljárást a 14. ábrán szemléltetjük. Ezzel az eljárással öt egyedi korai meiotikus MFS cDNS-t és egy egyedi késői meiotikus cDNS-t különítettünk el. A differenciális szűrési eljárással elkülönített PMS3 kiónt (120 bázispárból álló részleges cDNS) használtuk hibridizációs próbaként a megfelelő függő közel teljes hosszúságú klón (PMS18) elkülönítésére.
Az elkülönített cDNS kiónok egyes jellemzőit a VII. táblázatban foglaljuk össze. A korai meiotikus könyvtárból elkülönített ot MFS cDNS mRNS kifejezését korai és késői meiotikus címer-mintákból elkülönített RNS-ben vizsgáltuk. Az említett cDNS-eknek megfelelő mRNS-ek nem teljesen specikusak hímivarú virágokra, és lényegesen kisebb mennyiségekben levelekben (pMSIO és pMS18), illetve levelekben, kukoricacsőben és gyökerekben (pMSl, pMS2 és pMS4) is kimutathatók. Ezzel szemben a pMS14 mRNS csak a késői meiotikus RNS-ben található, és levelekben, kukoricacsövekben és gyökerekben nem észlelhető.
VII. táblázat
pMSl pMS2 pMS4 pMSIO pMS14 pMS18
Könyvtár1 1 1 1 1 2 1
Az inzert mérete2 750 500 720 1350 620 940
Az mRNS mérete3 900 950 850 1600 900 1100
Szervspecifikusság4 + + + ++ +++ ++
Kifejezési ablak5 E/L E/L E/L E/L L E/L
HU 215 090 Β
Magyarázat a VII. táblázathoz:
Az 1. (korai meiotikus) cDNS könyvtárból vagy a 2.
(késői meiotikus) cDNS könyvtárból elkülönítve
Bázispárokban megadott közelítő méret
Nukleotidokban megadott közelítő méret + = címerekben, valamint - lényegesen kisebb szinten - levelekben, kukoricacsövekben és gyökerekben fejeződik ki ++ = címerekben, valamint - lényegesen kisebb szinten - levelekben fejeződik ki +++ = csak címerekben fejeződik ki
E/L = az mRNS a korai és késői meiotikus címerekből származó RNS-ben egyaránt jelen van
L = az mRNS csak a késői meiotikus címerekből származó RNS-ben van jelen.
A felsorolt cDNS-eknek megfelelő gének kifejeződését a címerfejlődés folyamán hibridizációs foltelemzéssel vizsgáltuk (15. ábra). Az elemzést úgy végeztük, hogy a teljes RNS-t nitrocellulózhoz kötöttük, majd radioaktívan jelzett pMS cDNS-ekkel hibridizáltuk. Az összes szűrőt - a pMSIO kivételével, ahol a kezelést 168 órán át végeztük - 48 órán át -70 °C-on tartottuk. Az egyes mintákat a következő hosszúságú címerekből vettük: (A): >2 cm; (B): 2-5 cm; (C): 5-10 cm; (D): 10-15 cm; (E): 15-20 cm; (F): 20-30 cm; (G): 20-30 cm. A 15. ábrán feltüntetett vastag vonalak az egyes minták fejlődési szakaszait tüntetik fel a mikrosporogenezishez viszonyítva. A betűjelzések jelentése a következő: PM: premeiózis; M: meiózis; IP: éretlen pollen; MP: érett pollen.
A korai meiotikus mRNS-ek (pMSl, pMS2, pMS4, pMSIO és pMS18) a fejlődés igen korai szakaszában felhalmozódnak a 2 cm-nél rövidebb címerekben. A virágmerisztémiumban való kifejeződést ennél koraibb fejlődési szakaszban nem vizsgáltuk. Ezek az mRNS-ek a meiotikus portok-stádiumokban fennmaradnak, majd a pollenszemcsék érési folyamata során mennyiségük csökken. Ezzel ellentétben a pMS 14-ből származó késői meiotikus mRNS 5 cm-nél rövidebb címerekben nem mutatható ki, mennyisége azonban rohamosan növekszik, ahogy a portok sporogén sejtjei elérik a meiózist (lásd a 15. ábrát). Miként a korai meiotikus mRNS-ek, a késői meiotikus mRNS mennyisége is hirtelen csökken, ahogy az érett pollen felhalmozódik a portokokban (lásd a 15. ábrát).
Ezek az adatok azt igazolják, hogy a kukorica hímivarú növényeinek kifejlődése során a génkifejeződést időben eltérő folyamatok szabályozzák. A korai meiotikus mRNS-ek felhalmozódását programozó vezérlési folyamatok vélhetően nagymértékben hasonlóak egymáshoz, azonban jelentősen eltérnek a késői meiotikus mRNS megjelenését és felhalmozódását programozóaktól. A korai és késői meiotikus mRNS-ek egyaránt olyan fejlődési folyamatokkal kapcsolatosak, amelyek az érett pollenszemcsék felhalmozódása előtt mennek végbe. Ezek nyilvánvalóan nem kapcsolatosak a portokfejlődés későbbi szakaszaival (például a felhasadással), és az érett pollenben felhalmozódó mRNS-eknek sem tekinthetők.
Az MFS mRNS-ek szövetbeli lokalizációját kukorica hímivarú virágaiban in situ hibridizációval határoztuk meg. A meghatározáshoz Wright és Greenland módszerét használtuk [SEB Seminar Series 43. kötet (szerk.: N. Harris és D. Wilkman), Cambridge University Press, Cambridge, 1990 (közlés alatt)]. A következőkben a pMS14 mRNS megfelelő adatait ismertetjük.
A 16A és 16B ábra pMS14 érzékelésgátló RNS mintákkal végzett in situ hibridizációt mutat be. Az érzékelő és érzékelésgátló mintákat úgy állítottuk elő, hogy a pMS14 egy 300 bázispárból álló fragmensét pBS vektorba szubklónoztuk, majd radioaktívan jelzett T3 és T7 polimer átiratokat alakítottunk ki a vektor forgalmazója által ajánlott módszerekkel [Stratagene (védjegy)]. A hibridizációs vizsgálatok azt mutatják, hogy a pMS14 mRNS a fejlődésben lévő mikrospórákat körülvevő burkoló sejtrétegben helyezkedik el. A pMS14 érzékelésgátolt mintája a szekcióban lévő más sejtekben nem hibridizálódik. Hasonlóan, a pMS14 érzékeny mintája sem mutat specifikus hibridizációt lásd a 16C ábrát). A vizsgált metszeteket 15-20 cm hosszú kukoricacímerekből vettük abban a fejlődési állapotban, amikor azokban maximális volt a pMS14 mRNS szintje (lásd a 15. ábrát). Ezekben és a további kísérletekből származó metszetekben a portokok tapetumjához való hibridizáció az egyik virágocskában végbemegy, a másikban azonban nem. A 16A és 16B ábrán bemutatott esetekben a pMS14 mRNS-t tartalmazó tapetum-rétegek a tetrád-stádiumban lévő késői meiotikus mikrospórákat vesznek körül, míg a pMS14 mRNS-t nem tartalmazó tapetum-rétegek olyan sporogén sejteket vesznek körül, amelyek még nem estek át a meiózison. A kukorica jellemző tulajdonsága, hogy a kalászka egyedi virágocskái nem fejlődnek összehangoltan. Az in situ hibridizációs vizsgálatok tehát azt mutatják, hogy a pMS14 mRNS felhalmozódása szövetspecifikus, és megerősítik a foltelemzéssel (15. ábra) kapott azon információt, hogy a pMS14 mRNS kifejeződése fejlődési szakasz-specifikus, mert ez az mRNS először a meiotikus sejteket körülvevő tapetumban jelenik meg.
2. példa
A pMSIO DNS szekvenciájának meghatározása
A pMSIO cDNS kiónból származó DNS-t szekvencia analízis céljára ismert módon M13mp 18-ba szubklónoztuk. A szubklónok nukleotid szekvenciáit az ismert didezoxi-módszerrel határoztuk meg. A nukleotid szekvencia meghatározására a Sequence (védjegy) módszert is alkalmaztuk a forgalmazók által szolgáltatott előirat szerint. A klónrégiók szekvenciálására indítókként olyan szintetikus oligonukleotidokat használtunk, amelyeket megelőző gél-beolvasásból származó szekvenciából alakítottuk ki. Az alkalmazott oligonukleotidkoncentrációk azonosak voltak az univerzális primerekkel kapcsolatban használtakkal.
Az MFS pMSIO kiónhoz tartozó teljes hosszúságú cDNS 1535 bázispárból áll. A teljes nukleotid szekvenciát és a várható aminosav szekvenciát a 17. ábrán mutatjuk be. A szekvencia 1022 nukleotidból álló nyitott beolvasó keretet tartalmaz, ami 341 aminosavból álló, 37371 kd számított mólekulatömegű, glicin maradé22
HU 215 090 Β kokban dús polipeptidet kódol. A nyitott beolvasó keretet 129, illetve 201 bázisból álló 5’ és 3’ nemtranszlatált tartomány szegélyezi.
3. példa
A pMS14 DNS-szekvenciájának meghatározása
A nukleotid szekvenciát a 2. példában leírt eljárással határoztuk meg.
A pMS14 klón 581 bázispárból álló, nem teljes cDNS; a teljes nukleotid szekvenciát és az abból levezetett aminosav szekvenciát a 18. ábrán mutatjuk be. A szekvencia az 1. nukleotidtól a 278. nukleotidig terjedő nyitott beolvasó keretet tartalmaz, ami 127 aminosavból álló részleges polipeptidet kódol. A polipeptid különösen dús alanin- és arginin-maradékokban. A nyitott beolvasó keretet 203 nukleotidból álló 3 ’ nem kódoló tartomány szegélyezi. Az 548. helyen AATAAA konszenzus feldolgozó és poliadenilező szignál hexanukleotid van.
4. példa
A pMS18 DNS-szekvenciájának meghatározása
A nukleotid szekvenciát a 2. példában leírt eljárással határoztuk meg.
A pMS18 klón 933 bázisból álló, csaknem teljes hosszúságú cDNS. A teljes nukleotid szekvenciát és az abból levezetett aminosav szekvenciát a 19. ábrán mutatjuk be. A pMS 18-ból a 3’ végről 28 nukleotid hiányzik. A hiányzó nukleotidok a pMJ3 kiónban vannak jelen, ami 91 további nukleotiddal átfed a pMS18 szekvenciájával. A cDNSek differenciális szűrésekor elkülönített eredeti klón a pMS3 volt, amit a továbbiakban a pMS18 elkülönítéséhez hibridizációs próbaként használtunk. A pMS18 a 151. nukleotidtól a 813. nukleotidig terjedő nyitott beolvasó keretet tartalmaz, ami egy 221 aminosavból álló, 25 kilodalton várható mólekulatömegű polipeptidet kódol. A polipeptid arginin-maradékokban különösen dús. A nyitott beolvasó keretet az 5’ és 3’ végen egy-egy, 150, illetve 120 nukleotidból álló nem kódoló tartomány szegélyezi.
5. példa
A pMSIO-nek megfelelő genom klánok elkülönítése
A pMSIO cDNS-nek megfelelő géneket hordozó genom DNS kiónokat kukorica DNS részleges MbOl fragmenseinek EMBL háromfázisú könyvtárából különítettük el. A könyvtárt in vitro körülmények között szintetizált és radioaktívan jelzett „long-mer” próbákkal szűrtük. Ez a rendszer 50 mg szintetikus, 100 bázisból (a PMS10452-551. helyzetű bázisai, lásd a 17. ábrát) álló oligonukleotidot, 500 mg szintetikus primer oligonukleotidot (szekvencia: TAGTTTCCT-CGGTAG) amely a hosszú oligonukleotid 3’ végével bázispárt alkot, egy vagy két radioaktívan jelzett oligonukleotidot (rendszerint 32PdCTP-t és/vagy 32P-dGTP-t) és 5-10 egység, DNS polimeráz-1-ből származó Klenow fragmenst tartalmazott. A reakciókat 37 °C-on 30 percig végeztük a DNS radioaktív jelzésére használt „véletlenszerű primelés” módszerben alkalmazottal azonos pufferben, azzal az eltéréssel, hogy a véletlenszerű hexanukleotidokat elhagytuk. Nylon „Hybaid” (védjegy) szűrőkön immobilizált 5 millió fág kiónt hibridizáltunk 65 °C-on ezekkel a próbákkal a szűrő forgalmazója (Amersham International) által javasolt előhibridizációs és hibridizációs pufferekben. A szűrőket 65 °C-on SSC-vel háromszor, majd 0,1 %-os SDS-sel mostuk. Ezzel a műveletsorral 50-60 olyan EMBL3 fág kiónt különítettünk el, amelyek teljes pMSIO gént vagy a pMSIO gén résztartományait tartalmazták. A teljes pMSIO gént tartalmazó három EMBL3 fág klónból elkülönített DNS-t enzimes hasítással analizáltuk. Mindegyik klón közös 9 Kb EcoRI fragmenst tartalmaz, ami a pMSIO gén harmadik intronjától a gén 5’ nem kódoló és promotor tartományaiig terjed. A 9 Kb EcoRI fragmens parciális restrikciós térképét a 20. ábrán szemléltetjük.
6. példa
A pMS14-nek megfelelő genom klánok elkülönítése A pMS14 cDNS-nek megfelelő géneket hordozó genom DNS kiónok elkülönítésére két megoldást alkalmaztunk. Az egyik megoldás esetén az 5. példában leírtak szerint jártunk el, azzal az eltéréssel, hogy az 5 millió fág kiónt a teljes cDNS szekvenciával szűrtük. Hibridizáció és mosás után két pozitív kiónt (14/CTA és 14/CTD) kaptunk. A második megoldás szerint egy kukorica genom DNS-ből hasított 12 Kb EcoRI frakciót, ami déli irányú foltelemzés szerint a pMS14 gént tartalmazza, EcoRI-vel hasított λ fág EMBL4 DNS-be ligáltunk, és így klónozott 17 Kb DNS fragmensekből álló könyvtárt alakítottunk ki. A fenti módszerrel durván 200 000 kiónt szűrtünk, és két pozitív kiónt (14/17m és 14/17R) különítettünk el, amelyek pMS14-gyé hibridizáló 17 Kb EcoRI fragmenst tartalmaztak. További elemzés során azt tapasztaltuk, hogy a részleges MboI/EMBL3 könyvtárból elkülönített két pozitív klón belső 17 Kb fragmenst tartalmaz. Az összes kiónban közös 17 Kb EcoRI fragmens parciális restrikciós térképét a 21. ábrán mutatjuk be.
7. példa
A pMS18-nak megfelelő genom klánok elkülönítése A pMSl 8 cDNS-nek megfelelő géneket hordozó genom DNS kiónok elkülönítésére az 5. példában le-írt módszert alkalmaztuk. 5 millió EMBL3 fág kiónt a pMS18 133-222. helyzetű szekvenciájából szár- mazó „long-mer” próbává hibridizáltunk. A kom-plementer oligonukleotid szekvenciája 5-GCCTCGGCGGTCGAC-3’ volt. Ebből a szűrésből két, a pMS18 gént hordozó kiónt (18/CT3 és 18/CT23) különítettünk el. A kiónok restrikciós feltérképezése azt mutatta, hogy mindkét klón tartalmaz egy 4,5 Kb BamHI-Sall fragmenst, ami a pMS18 kódoló szekvenciájának 5’ tartományát és a gén promotor és felszálló tartományának körülbelül 4 Kb részét tartalmazza. A 18/CT3 klón parciális restrikciós térképét a 22. ábrán szemléltetjük.
HU 215 090 Β
8. példa
10/CT8—3-ból származó promotor kazetta kialakítása
A 10/CT8-3 EMBL3 klónból a következő szubklónokat alakítottuk ki: A 4,5 Kb Pstl-EcoRI fragmenst pUC 18-ba klónozva pMS10-2-t alakítottunk ki. A 2,7 Kb Xbal-EcoRI fragmenst pUC 18-ba klónozva a pMS10-3-at alakítottunk ki. Az 1,6 Kb HindlII-Xbal fragmenst pUCl 8-ba klónozva pMSIO—4et alakítottunk ki.
A pMS10-3 930 bp fragmensének megsokszorozására a polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmaztuk. A PCR reakcióhoz a következő primereket használtuk: a pUC/2 prímért, ami a polikapcsoló oldalt szegélyező pUC szekvenciával homológ, valamint a 10/9 prímért, ami a pMSIO szekvenciájának 106-129. szakaszával komplementer azzal az eltéréssel, hogy a 123. és 124. helyzetű bázisok között egy további timidin maradékot is tartalmaz. A felhasznált primerek szekvenciája a következő volt:
pUC/2: 5’ CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’
10/9: 5 ’ AGTCGGATCCCGCCCCGCGCAGCCG-3 ’
A PCR reakcióval végzett sokszorozás után olyan DNS fragmenst kaptunk, amelyben a szegélyező Xbal hely és a 10/CT8-3 klón megfelelő tartományában lévővel azonos, a transzlációs iniciátort közvetlenül megelőző bázisig terjedő szekvencia teljes hűséggel reprodukálódott, azzal az eltéréssel, hogy a timidin-maradék beiktatása révén a molekulába egy új BamHI hely iktatódott be. Ezt a 930 bp fragmenst géltisztításnak vetettük alá, majd Xbal-vei és BamHI-vel kezeltük. A kapott fragmenst előzetesen Xbal-vel és BamHI-vel kezeltük. A kapott fragmenst előzetesen Xbal-vel és BamHI-vel kezelt pMS10-4-be klónoztuk, így a pMS10-5 kiónt kaptuk. A pMS 10-5 génben az MS 10 génhez kapcsolódó promotor aktivitáshoz szükséges szekvenciák úgy módosultak, hogy a promotor most bármely génhez kapcsolható a BamHI helyen keresztül, ami közvetlenül a transzláció kezdőpontja előtt helyezkedik el. Szekvencia-analízissel igazoltuk, hogy ezeken a kívánt módosulásokon kívül más módosulás nem ment végbe.
9. példa
Promotor fúzió létrehozása az MS10 gén és a glükuronidáz tudósító gén között A pMS 10-5 1830 bp HindlII-BamHI fragmensét (lásd a 38. ábrát) előzetesen HmdlII-al és BamHI-vel hasított pTAKl-hez ligáltuk. A pTAKl a Bin 19 biner növénytranszformáló vektoron (Bevan: Nucleic Acids Research 12, 8711 (1984) alapul, és glükuronidáz (GUS) tudósító gént és Nos 3’ terminátort tartalmaz (lásd a 14. ábrát). Ezt a plazmidot pMS10-6GUS plazmidnak nevezzük. A plazmid átírási génfuziót alkot az MS10 gén promotora és a GUS tudósító gén között.
10. példa
Dohánynövények transzformálása MS10 promotor génszerkezetekkel
L-lemezeken pRK2013-t magában foglaló E. coli (HBlOl)-el végzett háromszülős párosítással a pMS10-6-GUS rekombináns vektort E. coli (TG-2)-ből
Agrobacterium tumefaciens (LBA 4404)-re mobilizáltuk. 50 pg/cm3 kanamicint és 50 pg/cm3 sztreptomicint tartalmazó minimális táptalajon transzkonjugátumokat szelektáltunk.
g/cm3 kanamicint tartalmazó 5 cm3 L-táptalajt egyetlen Agrobacterium teleppel oltottunk be. A tenyészetet éjszakán át 30 °C-on rázattuk 150 fordulat/perc sebességgel. Az így kapott tenyészet 500 μΐ-es részletét 50 μg/cm3 kanamicint tartalmazó L-táptalajba oltottuk, és a tenyészetet az előzőek szerint növesztettük. Közvetlenül a felhasználás előtt a tenyészetet 5 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és a kapott pelletált Agrobacterium sejteket azonos térfogatú folyékony Murashige - Skoog (MS) táptalajban szuszpendáltuk.
cm átmérőjű Petri-csészékben a következőképpen készítettünk táplemezeket: 1 mg/1 6-benzil-amino-purinnal (6-BAP) és 0,1 mg/1 1-naftil-ecetsawal (NAA) adalékolt szilárd MS táptalaj fölé 1 cm3 Nicotiana tabacum var. Samsun tenyészet-szuszpenziót rétegeztünk, és a felületre egy 9 cm átmérőjű és egy 7 cm átmérőjű szűrőpapír korongot helyeztünk.
A táplemezekbe szövettenyészetből növesztett dohánynövények teljes leveleit helyeztük. A lemezeket „Nescofílm”-mel (védjegy) lezártuk, és növénytermesztő helyiségben éjszakán át 26 °C-on erős fluoreszcens megvilágítás közben inkubáltuk.
A táplemezekből kiemelt leveleket 12 cm átmérőjű Petri-csészébe töltött Agrobacterium sejtszuszpenzióba helyeztük, és 1-1,5 cm2 területű részekre vágtuk szét. 20 perc elteltével a levéldarabkákat visszahelyeztük a táplemezekre, a lemezeket lezártuk, és visszahelyeztük a növénytermesztő helyiségbe. 48 órás inkubálás után a növényi anyagot Petri-csészékbe töltött, 1 mg/16-BAP val, 0,1 mg/1 NAA-val, 500 pg/cm3 karbenicillinnel és 100 pg/cm3 kanamicinnel kiegészített MS táptalajra vittük át, a Petri-csészéket lezártuk, és visszahelyeztük a növénytermesztő helyiségbe.
Az Agrobacteriummal végzett inokulálást követő harmadik hét elején a növénykezdeményekről eltávolítottuk a hajtásokat, és gyökereztetés céljából 200 pg/cm3 karbenicillinnel és 100 pg/cm3 kanamicinnel kiegészített MS táptalajba helyeztük. A transzformált növényeket az áthelyezés után 1-2 hétig gyökereztettük.
Gyökereztetés után a transzformált növényeket talajjal töltött cserepekbe ültettük át, és üvegházban növesztettük. A növények durván 1 hónappal az átültetés után virágoztak.
A dohánynövények pMS10-6GUS szerkezetet tartalmazó portokjait a GUS aktivitás kiváltására ismert módon permeteztük.
IV. Letörő fehérjét kódoló gén
Ez a modul olyan, növényekben kifejezhető gént tartalmaz, amely gátolja a mitokondriális funkciókat, ezáltal képes arra, hogy egy kiválasztott növényi sajátság teljes kifejeződését letörje.
Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás génkifejeződés gátlására célzott növényi szövetben oly módon, hogy egy növényi sejtet, amelyből teljes növény
HU 215 090 Β regenerálható, stabilan transzformálunk egy olyan génszerkezettel, amely a célzott növényi szövet sejtjeiben működő szövetspecifikus vagy fejlődés-specifikus promotort tartalmaz, tartalmaz továbbá egy, kifejeződés után a célzott szövetben lévő sejtek légzésének gátlását előidéző és ezáltal a sejteket elpusztító fehérjét kódoló letörő gént.
Előnyösen a következő letörő géneket alkalmazhatjuk:
a) Emlős (rendszerint patkány) barna zsírszövetből klónozott emlős lecsatoló fehéije (uncoupling protein, UCP); szekvenciáját a 27. ábra tartalmazza.
b) Az F^ATP-áz β-alegységét létrehozó gén olyan mutált formája, amely a hozzáadott vagy elhagyott szekvenciák révén megtartja azt a képességét, hogy más alegységekkel egyesüljön, ugyanakkor azonban a változások zavarják az adott gén ATP szintázkénti funkcióját. Igen fontos, hogy a módosított alegységek helyesen tudjanak más alegységekkel egyesülni, mert a kifejeződésükhöz kapcsolódó kívánt fenő tipikus hatás megjelenése attól függ, hogyan tudnak versenyezni az enzim-komplexben lévő kötőhelyekért a vad típusú alegységekkel. így a nemfunkcionális alegységeket tartalmazó komplexek csak gyenge hatást fognak kifejteni, és az ilyen komplexeket magukban foglaló mitokondriumokkal nem érhető el a kívánt hatás. Az F]-AtP-áz β alegységét kódoló gén szekvenciáját a J. Bioi. Chem. 258, 11465-11470 (1983) közlemény ismerteti. Alkalmas mutánsokat ismertet a J. Bioi. Chem. 263, 4740-4744 (1988) közlemény.
c) Az F0-ATP-áz 9-alegységét kódoló öli 1 gén mutált, szintetikus formája. A létrehozott mutációk megfelelnek a b) pontban megadottaknak.
d) mitokondriális tranzit előszekvencia olyan mutált formája, amely az átvitel során rosszul funkcionál, és így - feltehetőleg a receptor-helyek blokkolása révén - a mitokondriumba irányuló fehérje transzport megszakadását idézi elő.
e) Élesztő-eredetű β-alegység gén és E. coli-eredetű β-galaktozidáz gén fúzióját tartalmazó, letörő fúziós fehérjét kifejező génszerkezetek [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3983-3987 (1984)].
f) Barstart (a barnázt gátló fehérjét) kódoló gén [barstar gén; J. mól. Bioi. 202, 913-915 (1988)].
A promotor előnyösen tapetum-specifikus promotor vagy pollen-specifikus promotor lehet; így a letörő fehérje kifejeződése ezekben a szövetekben ahhoz vezet, hogy a regenerált növény hímsterillé válik. A tapetumspecifikus promotor szekvenciája például a 17., 18. vagy 19. ábrán bemutatottnak felelhet meg.
Ezeket a génvezérlő szekvenciákat a III. fejezetben leírtak szerint különíthetjük el és azonosíthatjuk.
Az ismertetett modul tehát a légzési funkciókat gátló génszerkezetek révén ad lehetőséget növényi sejtek növekedésének és fejlődésének megakadályozására vagy gátlására. Az ismertetett módszer széles körben alkalmazható számos haszonnövényen, ahol szükség van egyes sejtek vagy szövetek növekedésének vagy fejlődésének gátlására.
A módszer kiemelkedően fontos alkalmazási területe a kukorica hímivarú termékenységének gátlása FI hibridek in situ termelése céljából. A mitokondriális funkciók gátlásán alapuló hímsterilitás előidézésének alapgondolata a kukorica T-típusú citoplazmás hímivarú sterilitásának vizsgálatára irányuló korábbi kutatómunkából származik; ezek a korábbi kutatások ugyanis összefüggést mutattak ki a hímsteril fenotípus kialakulása és a mitokondriális diszfunkciók között. Noha a T-típusú citoplazmás hímivarú sterilitás (T-cms) és a mitokondriális diszfunkciók között közvetlen oki összefüggést eddig még nem mutattak ki, számos tapasztalati tény utal arra, hogy a hímivarú termékenység szempontjából lényeges a mitokondriumok - elsősorban a tapetum-sejtek - tökéletes működése. Ez különösen kritikus a mikrosporogenezis időszakában, amikor a tapetum-sejteket igénybe vevő anyagcsere-folyamatok révén a mitokondrium-szám 40-szeresére növekedik.
Olyan negatív mutációkat hozunk tehát létre, amelyek a mitokondriumban az oxidatív foszforilezés lecsatolását eredményezik. Ezek a mutációs változások a kukorica portok-szöveteire alkalmazva hímsteril fenotípus kialakulását eredményezik.
A letörő fehérjeként alkalmazható UCP az emlős barna zsírszövet termogenezisében alapvető szerepet játszik. Ez a fehérje dimer formájában fordul elő a mitokondriális belső membránban, ahol protoncsatomát képez, és a membránon keresztüli proton elektrokémiai potenciálkülönbségek megszüntetése révén lecsatolja az oxidatív foszforilezést.
Más megoldás szerint olyan ál-génszerkezeteket alkalmazhatunk, amelyekben egyes tartományok fel vannak cserélve, és így nem funkcionáló fehérjéket alkotnak. Ebben az esetben a célzott fehérje az Fj-ATP-áz β-alegysége és az Fo ATP-áz 9-alegysége. A működő ATP-áz komplexek összeillesztésekor a módosított álalegységek foglalják el azokat a kötőhelyeket, amelyeket normál esetben a természetben előforduló alegységek foglalnak el. Ez különösen akkor érvényes, ha az ál-alegységek az endogén géneknél nagyobb mértékben fejeződnek ki. Ez zavarokat idéz elő a mitokondrium működésében, mert a módosított alegységekhez kapcsolt FI és Fo ATP-ázok csak csekély aktivitást fejtenek ki, vagy egyáltalán nem működnek.
A növényi sejtek transzformálásának módszerei a találmány szempontjából nem döntő jelentőségűek; a célzott növény transzformálására bármely alkalmas módszert felhasználhatunk. A transzformált sejtekből transzgenikus növényeket regenerálhatunk. A szakirodalomból számos transzformálási módszer ismert; így például - csak néhányukat említve - az Agrobacterium tumefaciens-szel vagy annak Ti plazmidjával végzett agrofertőzés, az elektroporálás, a növényi sejtek és protoplasztok mikroinjektálása, a mikroprojektív transzformálás és a pollenvezeték-transzformálás. Az ismert módszereket a szakirodalom teljes részletességgel tárgyalja.
A következőkben az ilyen génszerkezetek kifejlesztését és a mitokondrium-funkciókra gyakorolt letörő hatásuk vizsgálatát ismertetjük élesztőben, mint egysejtű
HU 215 090 Β szervezetben. Leírjuk továbbá azt a lehetséges mechanizmust is, amelynek révén ezek a génszerkezetek növényi sejtek növekedésének és transzformált növényekben való differenciálódásának gátlására használhatók. Ezekben az eljárásokban az élesztőt modellrendszer- 5 ként használjuk a mitokondrium-funkciókat letörő fehérjéket kifejező génszerkezetek azonosítására és optimalizálására. Az így kiválasztott szerkezetekkel növényi sejteket transzformálunk, és a transzformált sejtekből regeneráljuk a teljes növényt.
A tárgyalt modul egyes kiviteli alakjait a következő példában ismertetjük.
Példa
Szakirodalomból ismert, hogy az élesztő/E. coli váltó-vektorba illesztett patkány UCP gén csak alacsony szinten fejezi ki az UCP-t. Élesztőként Saccharomyces cerevisiae YM147 törzset használtak; az alkalmazott UCP gén pCGSl 10-UCP plazmidból származott.
Tekintettel arra, hogy a vad típusú gén kifejezési 20 szintje gyakorlati célokra nem hasznosítható, a patkány UCP gént helyirányított mutagenezissel módosítottuk.
A következő módosításokat hajtottuk végre:
1. BamHI hely beiktatása hét nukleotiddal az 5’ irányba az AUG metionin iniciáló kodontól;
2. az AUG metionin iniciáló kodon körüli szekvencia módosítása az élesztő ATAATG konszenzus szekvenciájával összhangban;
3. egy belső BamHI hely elhagyása; és
4. BamHI hely beiktatása egy nukleotiddal a 3’ irányba a TAG záró kodontól.
Ezekkel a módosításokkal elhagytuk a lefordítatlan 10 5’ és 3’ patkány UCP szekvenciát, és a metionin iniciáló kodonnál élesztő konszenzus szekvenciát építettünk be.
A pCGSl 10-UCP plazmidból (a plazmid térképét a 26. ábrán, az UCP gén mRNS szekvenciáját pedig a 27. 15 ábrán szemléltetjük) származó, a GÁL 10 promotor tartományt és a patkány UCP cDNS-t hordozó 1,9 kb EcoRI/PstI fragmenst az M13mpl9 DNS EcoRI/PstI helyeibe klónoztuk. A szerkezet helyességének ellenőrzése céljából a kapott szerkezetet szekvenciáltuk.
Ezután az Amersham (védjegy) mutagenezis-készlethez csatolt előirat szerint helyirányított mutagenezist végeztünk a következő három különböző oligonukleotid felhasználásával:
UCP-1 vad típus CTCTGCCCTCCGAGCCAAGATGGTGAGTT CTCTGCCCTCGGATCC(ATAATG)GTGAGTT
mutáns
UCP-2 vad típus TGCGACTCGGATCCTGGAACG
mutáns TGCGACTCGGTTCCTGGAACG
UCP-3 vad típus ACCACATAGGCGACTTGGAG
mutáns ACCACATAGGATCCGACTTGGAG
Az UCP-1 oligonukleotiddal a metionin iniciáló kodon körüli élesztő konszenzus szekvenciát (zárójelbe tett rész) és a BamHI hasítóhelyet (aláhúzott rész) iktattuk be.
Az UCP-2 oligonukleotiddal egy belső BamHI helyet távolítottunk el (aláhúzott rész).
Az UCP-3 oligonukleotiddal egy BamHI helyet (aláhúzott rész) iktattunk be közvetlenül a TAG záró kodon után.
Ezzel a három mutációval a teljes UCP kódoló szekvenciát izolálhattuk egy 0,3 kb BamHI fragmensen.
A mutáns kiónok szelektálása után a módosított DNS-t BamHI-vel hasítottuk. A húsz szelektált klón közül három szolgáltatott 0,93 kb méretű inzerteket a BamHI-vel végzett hasítás hatására.
Az UCPS1 és UCPS4 kiónok szekvenciálása azt igazolta, hogy az UCP gént a vártnak megfelelően módosítottuk; nemkívánt változások nincsenek jelen. Ezután az UCP gént pKV49 élesztő kifejező plazmidra vittük át, ami lehetővé teszi idegen gének kifejeződését
S. cerevisiae sejtekben az erős PGK promotor és a GAL1-10 UAS vezérlése alatt; az idegen gén indukciója és repressziója annak megfelelően megy végbe, hogy a tápközeg tartalmaz-e galaktózt vagy sem. A módosított UCP gént tartalmazó 0,93 kb BamHI fragmenst a
BglII restrikciós helyen klónoztuk pKV49-be, és így a pKV49-UCP szerkezetet kaptuk.
Élesztő transzformálásapKV49-UCP szerkezettel
a) Az alkalmas élesztő törzs kifejlesztése
A pKV49-UCP szerkezethez recipiensként olyan élesztő törzsre volt szükségünk, amely a transzformáláshoz szükséges markereket hordozza, lehetővé teszi a génkifejezés indulálását GÁL 1-10 UAS-ból, ugyanakkor azonban nem képes szén- és energiaforrásként galaktózt hasznosítani (GÁLI, GAL2). Ilyen törzseket az YM147 és SF747 élesztőtörzs párosításával hoztunk létre. A diploidokat uracilt tartalmazó minimális táplemezeken szelektáltuk, és a telepeket spóraképző közegekbe vittük át. A képződött spórákat YDP lemezeken tenyésztettük, majd a kialakult élesztő-telepeket azonosítottuk (lásd a 18. ábrát). Két új élesztő törzset (BT9 (ura3, trpl, leu2, his3, gall) és BE27 (ura3, trpl, leu2, gall/) különítettünk el; mindkettő alkalmas pKV49 alapú szerkezetekkel való transzformálásra.
b) Élesztő transzformálás
A BET9 és BE27 élesztősejteket pKV9 és pKV49UCP DNS-el transzformáltuk, a transzformátumokat a megfelelő auxotróf szelekcióval (leu) szelektáltuk, és a plazmid elkülönítése, majd a restrikciós térkép felvétele alapján azonosítottuk. A kapott négy különbö26
HU 215 090 Β ző transzformátum (BET9/pKV49, BET9/pKV49UCP, BE27/pKV49 és BE27/pKV49-UCP) egyedi telepeit steril vízben újra szuszpendáltuk, és a szuszpenziót különféle szénforrásokat tartalmazó (lásd a 29. ábrát), galaktóz-tartalmú vagy galaktóz-mentes táplemezekre cseppentettük. Az eredmények (lásd a 29. ábrát) azt mutatták, hogy a szénforrások némelyikénél a galaktóz és a pKV49-UCP szerkezet együttes jelenléte az élesztőtelepek gyengébb növekedéséhez vezet. Mindkét pKV49-UCP transzformátum estén a galaktózt tartalmazó glicerin/kazamino (gly/cas) táptalajon tapasztaltuk a nagyobb növekedésgátló hatást. Az UCP gént nem tartalmazó vagy galaktózzal indukált transzformátumok ugyanolyan mértékben növekedtek, mint a nem transzformált BET9 és BE27 törzsek.
A növekedési görbe elemzése
Minthogy a táplemezeken végzett vizsgálatok szerint a pKV49-UCP transzformátumok galaktóz jelenlétében gly/cas táptalajon gyengén növekednek, folyékony tenyészetekben növekedési görbe-analízist végeztünk a növekedésgátlás mértékének pontosabb meghatározása céljából. A 30. ábrán bemutatott eredmények pótolják a táplemezeken mért eredményeket, és azt jelzik, hogy a pKV49-UCP DNS, illetve a galaktóz egyedül alkalmazva nem befolyásolja az élesztősejt növekedési sebességét, ugyanakkor azonban a kettő együttes jelenlétében nagymértékben lelassul a növekedés. Minthogy a pCGSllO-UCP szerkezettel transzformált YM147 élesztőtörzsön végzett korábbi vizsgálataink során egyik vizsgált szénforráson sem tapasztaltunk jelentősebb növekedési hiányosságot galaktóz jelenlétében, feltételezzük, hogy a most észlelt jelentős növekedésgátlás az UCP gén módosításának és/vagy a más vektor (pKV49) használatának a következménye.
Az UCP kifejezés analízise
Minthogy a növekedési görbe-analízis a BE27 és
BET9 transzformátumok között nem jelzett észrevehető eltéréseket (lásd a 30. ábrát), a következő vizsgálatokban csak a BET9 transzformátumokat használtuk. A BET9 transzformátumokkal gly/cas táptalajon galaktóz jelenlétében és távollétében ismételt növekedési vizsgálatokat végeztünk. A tenyészeteket 47 órán át hagytuk növekedni annak érdekében, hogy ismét a korábbiakban észlelt (lásd a 31. ábrát) jellemzőkkel rendelkező növekedési görbéhez jussunk. Ezután a sejteket elkülönítettük, a teljes sejtfehérjét elkülönítettük, és kétszeres ismétlésben 10%-os poli(akril-amid) gélen SDS-PAGE-val frakcionáltuk. A frakcionált fehéij ék egyik sorozatát Coomassie Blue színezékkel megfestettük, míg a másik sorozatot nylon membránra vittük fel, és nyugati irányú foltelemzésnek vetettük alá patkány UCP antitest felhasználásával. Az utóbbi elemzés két fontos jellegzetességet mutatott ki:
1. A BET9/pKV49-UCP transzformátum és a VY147/pCGS110-UCP transzformátum UCP kifejezésének szintjét összehasonlítva azt tapasztaltuk, hogy az általunk bevezetett módosítások következtében az UCP kifejeződése körülbelül 50-100-szorosára nőtt.
2. A gly/cas táptalaj on galaktóz j elenlétében lassabban növekedő élesztő transzformátum is jelentős mennyiségű UCP-t fejez ki.
A felsorolt eredményekből megállapítható, hogy az
UCP gén módosítása és/vagy annak pKV49 vektorba való klónozása a pCGSllO-UCP szerkezet bevitelével elérhetőnél nagyobb mértékű UCP kifejeződést eredményez. A növekedési görbe elemzése azt jelzi, hogy az UCP kifejeződése egyes körülmények között befolyásolja az élesztősejtek növekedési sebességét. Jelenleg még nem tudtuk meghatározni azt a specifikus hatást, amit az UCP kifejeződés növekedése az élesztősejteken előidéz (ami növekedésgátlásban nyilvánul meg), előzetes eredményeink azonban mitokondriális károsodást valószínűsítenek.
A raffinóz (a Gál vezérlést nem befolyásoló fermentálható szénfonás) táptalajon BET9 transzformátummal galaktóz jelenlétében és távollétében felvett növekedési görbék elemzése azt mutatta, hogy az UCP gén és a galaktóz együttes jelenléte nem befolyásolja a növekedési sebességet (lásd a 32. ábrát). A kísérletek során összegyűjtött sejtekből elkülönített fehéqék nyugati irányú foltelemzése szerint a sejtekben a galaktóz jelenlétben gly/cas táptalajon tenyésztett sejtekben találhatóhoz hasonló mennyiségű UCP fejeződött ki.
A galaktóz távollétében tenyésztett BET9/pKV49-UCP transzformátumokban észlelt UCP valószínűleg annak tulajdonítható, hogy a táptalajba a raffinóz hidrolízise révén - vélhetően az autoklávos kezelés során - galaktóz kerül. Ezek a tapasztalati tények arra utalnak, hogy a fermentálható szénforráson (ahol nincs szükség oxidatív foszforilezésre) tenyésztett élesztősejtekben az UCP jelenléte nem befolyásolja a sejtnövekedés sebességét, ugyanakkor azonban gly/cas táptalajon (nem fermentálható szénforráson) növekedő sejtek esetén az UCP kifejeződése károsító hatást fejt ki a növekedésre.
Az UCP elhelyezkedése az élesztősejtekben
A patkány UCP a barna zsírszövet mitokondriális belső membránjának fő komponense. A belső membránban található számos más polipeptiddel ellentétben a patkány UCP-nek nincs lehasítható szignál szekvenciája; a célinformáció a fehérje aminosav-szekvenciáján belül van kódolva. Minthogy vizsgáltaink szerint az UCP kifejeződése befolyásolja az élesztősejtek növekedését, fontos meghatározni, hogy a kifejezett fehérje pontosan hol helyezkedik el az élesztősejtekben. A teljes mitokondrium-fehéije nyugati irányú foltelemzésének eredményei azt mutatják, hogy a pKV49-UCP transzformátumban kifejezett UCP a mitokondriális frakcióban helyezkedik el.
A mitokondriális frakció továbbfrakcionálásával kapott eredmények szerint az UCP főtömege az élesztő mitokondriumainak belső membránfrakciójában helyezkedik el. Noha a vizsgálatok a membránon belüli térben is kimutattak kevés UCP-t, ez az eredmény feltehetőleg annak tulajdonítható, hogy ezt a frakciót a belső membránfrakció szennyezi. Hasonló eredményeket kaptunk az élesztősejt mitokondriumokból származó F^ATP-áz β27
HU 215 090 Β alegységének elhelyezkedésére is. A β-alegységet - ami a belső membrán egyik komponense - az általunk készített preparátumoknál a membránon belüli térben is kimutattuk. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a patkány UCP-ben lévő irányító (cél) információ elegendő ahhoz, hogy az UCP-t az élesztő mitokondriumok belső membránjába irányítsa, ahol az lekapcsoló fehérjeként tud működni.
UCP átírás vizsgálata
A vizsgálatokhoz a korábbiakban ismertetett növekedési kísérletekben kapott tenyészetekből RNS-t különítettünk el. Folyamatban lévő kísérleteinkben északi irányú foltelemzéseket végzünk annak meghatározására, hogy az UCP kifejeződésének jellege megmutatkozik-e az UCP átírási szignálokban.
A másolatszám hatása az UCP kifejeződésére
Ha élesztősejteket olyan váltóvektorokkal (például pKV49-UCP-vel) transzformálunk, amelyek a másolás origóját az élesztőtől számított 2 pm-es körben tartalmazzák, ezekben a plazmidokban sejtenként körülbelül 40-50 másolat lesz jelen. Következésképpen a plazmid által hordozott bármely idegen gén hasonló, viszonylag nagy másolatszámmal lesz jelen, ami azt eredményezheti, hogy az idegen fehérje kifejezési szintje meghaladja egy jelenlévő másik, kis másolatszámú gén által termekét. Ezért megkíséreltük az UCP gén másolatszámát úgy csökkenteni, hogy a gént egyetlen helyen iktattuk be az élesztő kromoszómába. így genetikailag stabil, egymásolatos transzformátumhoz jutottunk. Az YIp5 vektor (lásd a 33. ábrát) az ura3 gént tartalmazó integráló élesztő vektor, ami élesztőben nem képes autonóm módon másolatokat képezni.
A pKV49-UCP-ből származó 1,8 kb EcoRI/Sall fragmenst, ami a patkány UCP gént a PGK promotorral és a GÁL UAS-al együtt tartalmazza, az YIp5 DNS EcoRI/Sall helyeibe klónoztuk. Az így kapott UIP-UCP píazmidot (lásd a 33. ábrát) restrikciós enzimfeltérképezéssel vizsgáltuk annak megállapítására, hogy az UCP gén a kívánt helyekhez kapcsolódott-e. Az YiP-UCP píazmidot EeoRV restrikciós enzimmel hasítottuk (ami az URA3 gén (lásd a 33. ábrát) közepén hasít), és a BET9 és BE27 élesztő sejtvonalakat linearizált YIP/UCP DNS-el transzformáltuk. A transzformátumokat kezdetben minimális táplemezeken uracil prototró fiára szelektálva szűrtük, majd 7-10 nap elteltével az egyes sejtvonalakból származó két-két transzformátumot YPD táplemezekre (nem-szelektív) szélesztettünk. A transzformátumokat négy egymást követő periódusban nem-szelektív táptalajon tenyésztettük. A négy kiindulási transzformátumból származó 100-100 telepet ezután replika-módszerrel nem-szelektív táptalajra (YDP) és szelektív táptalajra (minimális táplemez + ura) vittünk fel. A szelektív táptalajon az összes telep növekedett, ami azt jelzi, hogy a UCP génhez genetikailag kapcsolódó URA3 gén (lásd a 33. ábrát) beépült az élesztősejt kromoszómájába. Mind a négy transzformátumból elkülönítettük a kromoszóma DNS-t, az elkülönített DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel hasítottuk, majd 0,08%-os agaróz gélen frakcionáltuk. A mintákat déli irányú foltelemzésnek vetettük alá, radioaktívan jelzett UCP próbát alkalmazva. Az elemzési adatok szerint az UCP gén mind a négy transzformátum kromoszómájában jelen van. Patkány UCP antitesttel végzett nyugati irányú foltelemzéssel az UCP kifejezési szintjét is kimutattuk a transzformátumokban. A galaktóz jelenlétében tenyésztett transzformátumok növekedési görbéinek elemzése azt mutatta, hogy a növekedésgátlás összefüggésben lehet egy mitokondriális károsodással.
3. példa
Az F\-ATP-áz ^-alegységének módosítása
Egy másik megoldás szerint a mitokondriális funkciókat károsító mutációk bevezetése céljából irányítottan módosítottuk azokat a funkcionális mitokondriális fehérjéket, amelyek élesztőben kifejeződve várhatóan zavarják az ATP kialakulását. Erre a célra fehérjeként az Fj-ATP-áz komplex β-alegységét választottuk. Az élesztő β-alegység gén DNS szekvenciája ismert; ezt a gént korábbi kísérleteinkben klónoztuk és szekvenciáitok.
Az ATP szintáz F|-ATP-áz része katalizálja az oxidatív foszforilezés zárólépését. Az Fj öt különböző α, β, γ, δ és ε jelű - polipetid együttese. Parsonage és munkatársai az E. coli-ból elkülönített Fj-ATP-áz β-alegységének módosítására irányuló vizsgálataik során olyan speciális aminosav-maradékokat azonosítottak a β-alegységben, amelyek az ATP szintézis és hidrolízis katalizálása szempontjából egyaránt rendkívül fontosak. Két mutációs változtatás különösen nagy mértékben csökkentette a katalitikus hatást anélkül, hogy a változtatások lényeges szerkezeti módosulást jelentettek volna az Fj-ATP-ázban. Az egyik ilyen mutáció a katalitikus nukleotid-kötő tartományban a 155. helyen lévő, erősen konzervált lizin maradék glutaminra cserélése, a másik ilyen mutáció pedig a 209. helyen lévő metionin maradék leucin maradékra cserélése volt. Mindkét mutáció azáltal fejti ki hatását, hogy megakadályozza az Fj komplexnek a katalitikus aktivitás kifejtéséhez szükséges konformációs változását.
Minthogy ezek a mutáns β-alegységek változatlanul beilleszthetők az F]-ATP-ázba, feltehető, hogy az élesztőben lévő β-alegység hasonló mutánsai versenyezhetnek egymással az F]-ATP-ázba való beépülés szempontjából. Abból az elgondolásból indultunk ki, hogy ha ugyanabba az F,-ATP-ázba vad típusú és mutáns β-alegységeket egyaránt beépítünk, visszaszorulhat a katalízis, ami az ATP termelés csökkenését és a sejtnövekedés lelassulását eredményezheti.
Számos különböző forrásból elkülönített Fj-ATP-áz β-alegységének vizsgálata azt mutatta, hogy azokban az aminosav-szekvencia nagymértékben konzervált. A S. cerevisiaeből származó β-alegység és az E. coli-ból származó β-alegység aminosav-szekvenciáját összehasonlítva megállapítható, hogy a szekvencia megtartja a Parsonage és munkatársai által a katalitikus hatás megjelenése szempontjából igen lényegesnek ítélt lizin és metionin maradékot (ezek az élesztő β-alegység szekvenciában a 196. és 255. helyen fordulnak elő).
A mutagén átalakítás végrehajtása céljából a pGR208 plazmidból (lásd a 34. ábrát) EcoRI/BamHI
HU 215 090 Β fragmens formájában élesztő β-alegység gént különítettünk el, amit Ml3mp 19-be klónoztunk. Két mutáns β-alegység gént alakítottunk ki: a BB1 mutánsban a 255. helyzetű Met maradékot izoleucinra és a 196. helyzetű Lys maradékot glutaminra cseréltük, míg a BB2 mutánsban csak a lizin maradékot cseréltük glutaminra (lásd a 34. ábrát). Szekvencia analízissel ellenőriztük, hogy csak a kívánt mutációk mentek végbe, és nemkívánt mutációk nem jelentek meg. Ezután a mutáns β-alegység géneket EcoRI/BamHI hasítással lehasítottuk az M13mp 19-ről. A géneket tartalmazó fragmenseket tompavégűekké alakítottuk, és előzetesen tompavégűvé alakított, majd BglII-vel hasított pKV49-hez (lásd a 25. ábrát) ligáltuk. Mindkét mutáns β-alegység gént pKV49-be klónoztuk (így a pKV49-BBl és pKV49-BB2 szerkezetet kaptuk), és a BET9 élesztőtörzset ezekkel a szerkezetekkel transzformáltuk. A két mutáns β-alegységet tartalmazó transzformátumok növekedési görbéi és táplemezen észlelt növekedési jellemzői megfeleltek a mitokondriális károsodást szenvedett törzseknél várhatóaknak.
A BET9 törzs mutáns β-alegység génnel való transzformálásával párhuzamosan génroncsolást is alkalmazhatunk a BET9 törzs olyan származékának kialakítására, amely nem képes β-alegységet szintetizálni. Az így kialakított törzs nem-fermentálható szénforrásokon növekedésképtelenné válik, fermentálható szénforrásokon (például glükózon) azonban könnyen fenntartható. Ezeket a törzseket mutáns β-alegység géneket hordozó plazmidokkal transzformálva, majd a kapott transzformátumok növekedési jellemzőit nem fermentálható szénforráson mérve azt tapasztaltuk, hogy a mutáns β-alegység nem képes az oxidatív foszforilezés elősegítésére.
4. példa
Fúziós fehérjék
A mitokondriumok működését szelektíven megzavaró tényezőket úgy is létrehozhatunk, hogy a sejtben olyan fúziós fehérjét fejezünk ki, ami visszaszorítja vagy megakadályozza az élesztősejtek növekedését. Vizsgálatainkhoz génfúzióval kialakított olyan fúziós fehérjét használtunk, amely az élesztő ATP szintáz βalegységének N-terminális tartományát tartalmazza az E. coli β-galaktozidáz legnagyobb hányadához fuzionálva (lásd a 36. ábrát). A korábbi vizsgálatok már kimutatták, hogy ez a β-alegység/β-galaktozidáz fúziós fehérje az élesztő mitokondrium belső membránjába irányul, és az adott fúziós fehéijét kifejező sejtek nem képesek nem-fermentálható szénforráson növekedni. A fúziós fehéije jelenlétében a mitokondriális membrán transzdukciós kapacitása (32P-ATP kicserélődési reakció alapján mérve) csak 9%-a a fúziós fehérje távollétében mért értéknek. A folyamat pontos mechanizmusát még nem ismerjük, feltételezzük azonban, hogy a génfúzió olyan fehérjét termel, ami beágyazódik a belső membránba, és ezáltal zavarja a légzéses növekedés szempontjából alapvető funkció(ka)t.
Az A TP2/LacZ génfúzió kialakítása
Az élesztő ATP2 DNS-t kódoló ATP szintáz β-alegység gént tartalmazó pGR208 plazmidot (lásd a 34.
ábrát) EcoRI-el és BamHI-el hasítottuk. így a β-alegység fehérje első 350 aminosavját kódoló 1,1 kb fragmenst kaptunk. A pMUR1720 pUC8-alapú plazmid, amely az EcoRI/NarI fragmensben LacZ gént tartalmaz (lásd a 36. ábrát). Az élesztő β-alegység fehérje első 350 aminosavját kódoló 1,1 kb EcoRI/BamHI DNS fragmenst a pMUR1720 EcoRI/BamHI helyeire klónozva (36A ábra) kereten belüli fúzió jön létre a β-alegység 350 aminosavja és a teljes LacZ fehéije között (az első nyolc aminosavat leszámítva) (lásd a 36. ábrát). A pMUR1720-BLZ szerkezetben most a teljes β-alegység/LacZ génfüzió a 4,3 kb EcoRI/NarI fragmensen van. Ezt a 4,3 kb EcoRI/NarI fragmenst a pKV49 vektorba klónozva a pKV49-BLZ szerkezethez jutunk (lásd a 37. ábrát), ami felhasználható a BET9 és BE27 élesztőtörzsek transzformálására. Az így transzformált törzseken galaktóz indukció hatására a mitokondriális károsodásokra jellemző növekedésgátlás tapasztalható.
5. példa
Promotor fúzió kialakítása az MS10 gén és az
UCP gén között
A pMSIO gén 1830 bp HindlII-BamHI fragmensét előzetesen HindlII-al és BamHI-el hasított Binl9 bináris növénytranszformációs vektorba ligáltuk.
A ligálás után a kapott plazmidot BamHI-el hasítottuk, és a pUC/UCP plazmid (a pUC 19 plazmid származéka, amely a módosított UCP gént a BamHI helyre klónozva tartalmazza) 930 bp UCP BamHI fragmenséhez ligáltuk. így fúziót hoztunk létre az MS10 gén promotor és az UCP gén között. Végül a pTAKl vektorból 250 bp Sstl-EcoRI fragmensként kapott 3’ terminátort az előzetesen Sstl-el és EcoRI-el hasított MS10-UCP szerkezetbe ligáltuk.
A kapott pBin/MSIO-UCP plazmid az MS10 promotort, az UCP gént és a 3’ terminátor kifejező kazettát tartalmazza az Agrobacterium T-DNS baloldali és jobboldali szekvenciái között, és hatásosan transzformálható dohánysejtekbe. A plazmid szerkezetét a 39. ábrán szemléltetjük.
6. példa
Dohánynövények transzformálása pBin/MSIOpromotor génszerkezetekkel L-lemezeken pRK2013-at magában foglaló E. coli (HBlOl)-el végzett háromszülős párosítással a pBin/MSIO-UCP rekombináns vektort E. coli (TG-2)ből Agrobacterium tumefaciens (LBA 4404)-re mobilizáltuk. 50 μ g/cm3 kanamicint és 500 mg/cm3 sztreptomicint tartalmazó minimális táptalajon transzkonjugátumokat szelektáltunk.
g/cm3 kanamicint tartalmazó 5 cm3 L-táptalajt egyetlen Agrobacterium teleppel oltottunk be. A tenyészetet éjszakán át 30 °C-on rázattuk 150 fordulat/perc sebességgel. Az így kapott tenyészet 500 μΐ-es részletét 50 μg/cm3 kanamicint tartalmazó L-táptalajba oltottuk, és a tenyészetet az előzőek szerint növesztettük. Közvetlenül a felhasználás előtt a tenyészetet 5 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és a kapott pelletált Agrobacterium sejteket azonos térfogatú
HU 215 090 Β folyékony Murashige—Skoog (MS) táptalajban szuszpendáltuk.
cm átmérőjű Petri-csészékben a következőképpen készítettünk táplemezeket: 1 mg/1 6-benzil-amino-purinnal (6-BAP) és 0,1 mg/1 1-naftil-ecetsavval (NAA) adalékolt szilárd MS táptalaj fölé 1 cm3 Nicotiana tabacum var. Samsun tenyészet-szuszpenziót rétegeztünk, és a felületre egy 9 cm átmérőjű és egy 7 cm átmérőjű szűrőpapír korongot helyeztünk.
A táplemezekbe szövettenyészetből növesztett dohánynövények teljes leveleit helyeztük. A lemezeket „Nescofilm”-mel (védjegy) lezártuk, és növénytermesztő helyiségben éjszakán át 26 °C-on erős fluoreszcens megvilágítás közben inkubáltuk.
A táplemezekből kiemelt leveleket 12 cm átmérőjű Petri-csészébe töltött Agrobacterium sejtszuszpenzióba helyeztük, és 1-1,5 cm2 területű részekre vágtuk szét. 20 perc elteltével a levéldarabkákat visszahelyeztük a táplemezekre, a lemezeket lezártuk, és visszahelyeztük a növénytermesztő helyiségbe. 48 órás inkubálás után a növényi anyagot Petri-csészékbe töltött, 1 mg/1 6-BAPal, 0,1 mg/1 NAA-val, 500 pg/cm3 karbenicillinnel és 100 pg/cm3 kanamicinnel kiegészített MS táptalajra vittük át, a Petri-csészéket lezártuk, és visszahelyeztük a növénytermesztő helyiségbe.
Az Agrobacteriummal végzett inkubálást követő harmadik hét elején a növénykezdeményekről eltávolítottuk a hajtásokat, és gyökereztetés céljából 200 pg/cm3 karbenicillinnel és 100 pg/cm3 kanamicinnel kiegészített MS táptalajban helyeztük. A transzformált növényeket az áthelyezés után 1-2 hétig gyökereztettük.
Gyökereztetés után a transzformált növényeket talajjal töltött cserepekbe ültettük át, és üvegházban növesztettük. A növények durván 1 hónappal az átültetés után virágoztak.
A pBin/MS10-UCP szerkezetet tartalmazó dohánynövények portokjait az RNS minták északi irányú foltelemzésével vizsgáltuk az UCP gén kifejezésére, és meghatároztuk az UCP kifejeződés hatását a pollenfejlődésre.
V. Kukorica transzformálása a találmány szerint előállított génszerkezettel: az eredmények értékelése
Kukoricanövények transzformálására a Zm/RMS14 vektort használtuk, amelynek plazmid-térképét a 41. ábra szemlélteti. A 41. ábrán sorszámokkal jelölt szerkezeti elemek a következők:
1. = a 18. ábrán bemutatott tapetum-specifikus promotor szekvencia, ami a génkifejeződést a kukorica portokjaiba irányítja
2. = Bacillus amyloliquiefaciens eredetű bamáz gén [J. mól. Bioi. 202, 913-915 (1988)]
3. = Agrobacterium tumefaciens eredetű nos poliA addíciós szekvencia
4. = CaMV35S promotor szekvencia
5. = Bacillus amyloliquefaciens eredetű barstar gén [J. mól. Bioi, 202, 913-915 (1988)], ami letörő génként szolgál
6. = a kukorica ADHI gén intronja
7. = Streptomyces virdochromogenes eredetű pat gén
8. = a pUC19-ben lévő ampicillin rezisztencia-gén
9. = kukorica-eredetű GST-27 promotor [a kukorica glutation S-transzferáz 27 izoformját [GST27, lásd Pest. Biochem. Physiol. 6, 442—456 (1976)] kódoló génből elkülönített, 0,9 kilobázis méretű fragmens, ami 3-(diklór-acetil)-2,2,5-trimetil-l,3-oxazolidonnal (R-29148) indukálható, így kémiai átkapcsolóként szolgál].
Ezzel a vektorral - amit az egyedi szerkezeti elemek ligálásával állítottunk elő - Register és munkatársai módszerével [Plánt mól. Bioi. 25, 951-961 (1994)] kukoricasejteket transzformáltunk, majd a transzformált sejtekből ugyanezen közlemény szerint transzgén kukoricanövényeket neveltünk.
Az egyes függetlenül transzformált kiónokból üvegházi körülmények között fejlődött növények leveleinek kis mintáiból kivont DNS-t PCR-val vizsgáltuk a Zm/RMS14 szerkezet jelenlétére. A növényeket virágzásig neveltük, majd megvizsgáltuk a címerek és a portokok állapotát. A vizsgálat alapján az összes olyan klónból nevelt növényt, amelynek DNS-állományában megjelent a Zm/RMS14 szerkezet, sterilnek találtuk. Az így kapott növényi vonalak egyikét - a WU25 vonalat - üvegházi körülmények között 3-(diklór-acetil)2,2,5-trimetil-l,3-oxazolidont tartalmazó öntözővízzel öntöztük, majd összehasonlítottuk az indukálószerrel kezelt és az indukálószerrel nem kezelt növények címereinek állapotát. Az eredményeket (amelyek 15-15 növényen végzett vizsgálat átlagértékei) az alábbi táblázatban közöljük.
A címerek állapota
Jellemző Kezelt növény Kezeletlen növény
Hossz (a főszár hossza az oldalágak nélkül, az első címerelágazást hordozó csomótól a csúcsig mérve), cm 43 36
Tömeg (oldalágakkal együtt), g 2,03 1,04
A csomók száma 12 8
A kalászkák száma 683 339
Valamennyi jellemző esetén szignifikáns különbséget észleltünk a kezelt és a kezeletlen növények között (p<0,1).
A táblázat adatai azt igazolják, hogy az indukálószerrel való kezelés hatására jelentősen fokozódott a címemövekedés. A nem transzgén, termékeny növényeken végzett összehasonlító vizsgálatban az indukálószerrel való kezelés sem a címemövekedésben, sem a növény termékenységében nem eredményezett változást. A kezelt 15 növény közül 12 esetében a portokokban jelentős mértékű mikrospóra-fejlődést is észleltünk. A felsorolt eredmények azt igazolják, hogy kémiai indukálószer hatására valóban reverzibilisen visszafordítható a találmány szerint előállított transzgén növények hímivarú sterilitása.

Claims (30)

1. Eljárás növényi génszerkezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az életképes pollen biogenezisét letörni képes fehérjét kódoló letörő gént közvetlenül vagy egy vagy több más szekvencia közbeiktatásával egyesítünk egy, az adott génszerkezetet tartalmazó növényre külső forrásból felvitt külső kémiai indukálószerrel amelynek a növényben való jelenléte vagy távolléte vezérli a hímivarú termékenységet - indukálható promotor szekvenciát tartalmazó génvezérlő szekvenciával.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan génvezérlő szekvenciát használunk, amely a letörő gént vezérlő operátor szekvenciát tartalmaz, tartalmaz továbbá egy, a letörő gén operátorával kölcsönhatásba lépő és a letörő fehérje kifejeződését gátló represszor fehérjét kódoló, a kémiailag indukálható promotor által vezérelt represszor gént.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan génszerkezetet alakítunk ki, amely a letörő gén kifejeződésének a növény hímivarú virágrészeire való korlátozására egy a letörő génhez operatívan kapcsolódó, hímivarú virágra specifikus promotor szekvenciát is tartalmaz.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő szekvenciák összekapcsolásával (a) egy külső kémiai indukálószer jelenlétére vagy távollétére reagáló első gén promotor szekvenciát, (b) az első promotor szekvencia vezérlése alatt represszor fehérjét kódoló gént, (c) a represszor fehérje gén által kifejezett represszor fehérjére reagáló operátor szekvenciát, (d) egy csak a növény hímivarú részeiben működőképes második gén promotor szekvenciát, és (e) egy az életképes pollen termelése szempontjából lényeges növényi tulajdonságot gátló fehéqét kódoló gént tartalmazó, a növény hímivarú termékenységét vagy sterilitását a külső kémiai indukálószer jelenlétének vagy távollétének megfelelően megváltoztató génszerkezetet állítunk elő.
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kémiailag indukálható promotor szekvenciaként egy, a kukorica glutation-S-transzferáz (GSTII) génből elkülönített 27 kd méretű alegységet kódoló szekvenciát használunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy N,N-diallil-2,2-diklór-acetamiddal vagy 2-klór-4(trifluor-metil)-5 -tiazol-karbonsav-benzil-észterrel indukálható promotor szekvenciát használunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy N,N-diallil-2,2-diklór-acetamiddal indukálható promotor szekvenciát használunk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy letörő génként emlős lecsatoló fehérje (UCP) gént használunk.
9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy letörő génként az F,-ATP-áz βalegységét kialakító gén olyan mutánsát használjuk, amely a szekvenciák beépítésével vagy elhagyásával létrehozott mutációs változások révén megtartja a más alegységekhez való kapcsolódási képességét, ugyanakkor azonban megzavaq'a az ATP szintázkénti működését.
10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy letörő génként az F0-ATP-áz 9-alegységét kódoló öli 1 gén mutált, szintetikus formáját használjuk.
11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy letörő génként egy mitokondriális tranzit előszekvencia olyan mutált formáját használjuk, amely a transzfer folyamatokban diszfunkcionálisan működve a mitokondriumokhoz való fehérjetranszport megszakadását eredményezi.
12. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy letörő génként egy az élesztő ATP szintáz β-alegység génjének és az E. coli βgalaktozidás génjének fúzióját tartalmazó, letörő fúziós fehéqét kifejező génszerkezetet használunk.
13. A 2-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy represszor génként a letörő gén operátorával kölcsönhatásba lépő DNS-kötő fehérjét kódoló, a kémiailag indukálható promotor által vezérelt DNS-kötő fehérje gént használunk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan represszor fehéqét kódoló DNS-kötő fehéqe gént használunk, amelynek kifejeződése gátolja a letörő gén által kódolt fehérje kifejeződését.
15. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-növényi eredetű DNS-kötő fehérje gént és nem-növényi eredetű operátort használunk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális eredetű DNS-kötő fehérje gént és bakteriális eredetű operátort használunk.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli lacl génjéből származó represszor gént és operátort használunk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy represszor génként és operátorként egyaránt az Escherichia coli TG-2 törzsben mint gazdaszervezetben a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Limited (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben 1988. december 12-én NCIB 40092 számon letétbe helyezett p35SlacI plazmidból elkülönített anyagot használunk.
19. A 2-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a letörő gén operátoraként egy pszeudo-operátor szekvenciát, represszor génként pedig egy, a pszeudo-operátorhoz kötődő aminosav szekvenciával rendelkező represszort kódoló mutáns szabályozó gént használunk.
20. A 3-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként a hímivarú virágok szöveteiben specifikusan működőképes, a 17. ábrán bemutatott szekvenciájú polinukleotidot vagy annak a genetikai kód degeneráltsága által megengedett variánsát használjuk.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként az Escherichia coli El törzsben mint gazdaszerve31
HU 215 090 Β zetben a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Limited (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben 1989. január 9-én NCIB 40090 számon letétbe helyezett pMSIO plazmidból elkülönített anyagot használjuk.
22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként és letörő génként egyaránt a 39. ábrán bemutatott szerkezetű pBin/MSIO-UCP plazmidból elkülönített anyagot használunk.
23. A 3-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként a hímivarú virágok szöveteiben specifikusan működőképes, a 18. ábrán bemutatott szekvenciájú polinukleotidot vagy annak a genetikai kód degeneráltsága szempontjából megengedett variánsát használjuk.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként az Escherichia coli DH5a törzsben mint gazdaszervezetben a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Limited (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben 1989. január 9-én NCIMB 40099 számon letétbe helyezett pMS14 plazmidból elkülönített anyagot használjuk.
25. A 3-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként a hímivarú virágok szöveteiben specifikusan működőképes, a 19. ábrán bemutatott szekvenciájú polinukleotidot vagy annak a genetikai kód degeneráltsága szempontjából megengedett variánsát használjuk,
26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímivarú virágokra specifikus szekvenciaként az Escherichia coli RÍ törzsben mint a gazdaszervezetben a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Limited (Aberdeen, Nagy-Britannia) gyűjteményben 1989. január 9-én NCIB 40100 számon letétbe helyezett pMS18 plazmidból elkülönített anyagot használunk.
27. Eljárás transzformált növény vagy növényi rész, előnyösen sejt, protoplaszt vagy mag előállítására, azzal jellemezve, hogy a növényt vagy annak részét az 1—26. igénypontok bármelyike szerint előállított szerkezettel transzformálj uk.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás visszafordítható hímivarú sterilitású növény előállítására, azzal jellemezve, hogy a növény genomjába stabilan beépítjük az 1-26. igénypontok bármelyike szerint előállított szerkezetet.
29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kétszikű növényt transzformálunk.
30. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyszikű növényt transzformálunk.
HU912484A 1989-01-26 1990-01-26 Eljárás növényi génszerkezetek és az azokkal transzformált növények előállítására HU215090B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898901677A GB8901677D0 (en) 1989-01-26 1989-01-26 Hybrid seed production

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU912484D0 HU912484D0 (en) 1992-07-28
HUT60777A HUT60777A (en) 1992-10-28
HU215090B true HU215090B (hu) 1998-09-28

Family

ID=10650617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU912484A HU215090B (hu) 1989-01-26 1990-01-26 Eljárás növényi génszerkezetek és az azokkal transzformált növények előállítására

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5808034A (hu)
EP (1) EP0455665B1 (hu)
JP (2) JPH04504500A (hu)
AT (1) ATE217022T1 (hu)
AU (1) AU621195B2 (hu)
BR (1) BR9007061A (hu)
CA (1) CA2008700C (hu)
DE (1) DE69033957T2 (hu)
DK (1) DK0455665T3 (hu)
ES (1) ES2176175T3 (hu)
GB (1) GB8901677D0 (hu)
HU (1) HU215090B (hu)
RO (1) RO112642B1 (hu)
WO (1) WO1990008830A1 (hu)
ZA (1) ZA90608B (hu)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8610785D0 (en) * 1986-05-02 1986-07-09 Vickers Plc Attachment for armoured vehicle
GB8901677D0 (en) 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
AU659509B2 (en) * 1988-03-23 1995-05-18 University Of Melbourne, The Ryegrass pollen allergen
GB8901697D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Male flower specific gene sequences
ATE294872T1 (de) * 1989-02-02 2005-05-15 Pioneer Hi Bred Int Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten
US5689041A (en) * 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
DE69033764T2 (de) * 1989-08-10 2002-05-23 Aventis Cropscience N.V., Gent Pflanzen mit modifizierten Blüten
US5202422A (en) * 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
US7005560B1 (en) 1989-10-27 2006-02-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
CA2274870C (en) * 1990-06-12 2003-02-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of microsporogenesis by externally inducible promoter sequences
US5478369A (en) * 1990-06-12 1995-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US5824524A (en) * 1990-06-12 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
AU8723791A (en) * 1990-09-06 1992-03-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compounds and constructs for producing male sterile plants
FR2667078B1 (fr) * 1990-09-21 1994-09-16 Agronomique Inst Nat Rech Sequence d'adn conferant une sterilite male cytoplasmique, genome mitochondrial, mitochondrie et plante contenant cette sequence, et procede de preparation d'hybrides.
SG80514A1 (en) * 1990-09-26 2001-05-22 Fb Invest Pty Ltd Plants and methods of modification thereof
AU665339B2 (en) * 1990-09-26 1996-01-04 Fb Investments Pty Ltd A plant and method of modification
ES2299172T3 (es) * 1991-02-07 2008-05-16 Bayer Bioscience N.V. Promotores especificos de estambres de maiz.
AU1192392A (en) * 1991-02-08 1992-09-07 Plant Genetic Systems N.V. Stamen-specific promoters from rice
IE921206A1 (en) * 1991-04-16 1992-10-21 Mogen Int Male-sterile plants, method for obtaining male-sterile¹plants and recombinant dna for use therein
US5907086A (en) * 1991-05-01 1999-05-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant promoter sequences
GB9114259D0 (en) * 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
GB9216151D0 (en) * 1992-07-29 1992-09-09 Ici Plc Containment of plant germplasm
US5409823A (en) * 1992-09-24 1995-04-25 Ciba-Geigy Corporation Methods for the production of hybrid seed
WO1994029465A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Nunhems Zaden B.V. Process for generating male sterile plants
EP0628635A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-14 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
US6066456A (en) * 1993-12-30 2000-05-23 Zeneca Limited Plant-derived enzyme and DNA sequences and uses thereof
US5837850A (en) * 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
US5837851A (en) * 1994-12-08 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. DNA promoter 5126 and constructs useful in a reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
US5750868A (en) * 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
US5717129A (en) * 1995-02-16 1998-02-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for maintaining sterility in plants
HUP9800353A3 (en) 1995-03-03 2001-01-29 Syngenta Participations Ag Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand
CA2232712A1 (en) 1995-10-10 1997-04-17 Lyle Dean Crossland Juvenile hormone or one of its agonists as a chemical ligand to control gene expression in plants by receptor mediated transactivation
JPH1033179A (ja) * 1996-07-24 1998-02-10 Fuso Yakuhin Kogyo Kk 感染症診断用プローブ
US6852908B2 (en) 1997-05-30 2005-02-08 Mcgill University Method for enhancement of naturally occurring cytoplasmic male sterility and for restoration of male fertility and uses thereof in hybrid crop production
JP2002500512A (ja) 1997-05-30 2002-01-08 マクギル・ユニヴァーシティ 天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用
US7154024B2 (en) 1997-06-23 2006-12-26 Pioneer Hi-Bred, Inc. Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same
US6037523A (en) * 1997-06-23 2000-03-14 Pioneer Hi-Bred International Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
WO1999006578A2 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Zeneca Limited Genetic method for controlling sprouting
FR2768745B1 (fr) 1997-09-23 2001-10-05 Agronomique Inst Nat Rech Promoteur specifique des microspores et procede d'obtention de plantes hybrides
IL137972A0 (en) 1998-02-20 2001-10-31 Zeneca Ltd Hybrid seed production
EP1054970A1 (en) * 1998-02-20 2000-11-29 Zeneca Limited Pollen specific promoter
US7220893B1 (en) 1999-05-19 2007-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Plasmids and methods for construction of non-redundant, indexed, saturation, gene-disruption plant and animal libraries
ES2167161B1 (es) * 1999-06-22 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Procedimiento de superexpresion de genes regulada por un circuito genetico en cascada.
US6395962B1 (en) 1999-06-22 2002-05-28 University Of South Carolina Enhancing expression of a silenced target sequence in plants using plant viral enhancers and amplicons
ATE278786T1 (de) 1999-06-22 2004-10-15 Consejo Superior Investigacion Genetische kaskaderegulierte expression von klonierten genen
CA2316036A1 (en) * 1999-08-27 2001-02-27 Keqiang Wu Repressing gene expression in plants
GB2355459B (en) * 1999-11-29 2001-09-26 Isis Innovation A dominant conditional lethal genetic system
JP2004512007A (ja) 2000-02-28 2004-04-22 エール　ユニヴァーシティ トランス遺伝子の伝達を削減または排除する方法および組成物
US7105718B2 (en) 2000-03-31 2006-09-12 The Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods for regulating metabolism in plants
AU2001285990A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-25 Gencell S.A. System for regulating in vivo the expression of a transgene by conditional inhibition
WO2005001101A1 (en) 2003-06-03 2005-01-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Conditional sterility in plants
GB2404382B (en) 2003-07-28 2008-01-30 Oxitec Ltd Pest control
WO2005070088A2 (en) * 2004-01-15 2005-08-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Chimeric sequences for tissue-specific gene expression in plants
GB2443186A (en) 2006-10-25 2008-04-30 Oxitec Ltd Expression system for mediating alternative splicing
US8222388B2 (en) * 2006-11-22 2012-07-17 Ceres, Inc. Broadly expressing regulatory regions
DE102007009957A1 (de) 2006-12-27 2008-07-03 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionsptentials transgener Pflanzen
US7818176B2 (en) * 2007-02-06 2010-10-19 Voicebox Technologies, Inc. System and method for selecting and presenting advertisements based on natural language processing of voice-based input
DE102007018452A1 (de) 2007-04-17 2008-10-23 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102007045921A1 (de) * 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
EP2113172A1 (de) 2008-04-28 2009-11-04 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
EP2223602A1 (de) 2009-02-23 2010-09-01 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen
CN102333445B (zh) 2008-12-29 2014-09-03 拜尔农作物科学股份公司 改善利用转基因植物生产潜力的方法
GB2500113A (en) 2012-03-05 2013-09-11 Oxitec Ltd Arthropod male germline gene expression system
GB201303932D0 (en) 2013-03-05 2013-04-17 Oxitec Ltd Muscle actin promoter
EP2781151A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Bayer CropScience AG Methods of separating hybrid seed from a mixture of seeds
CN104837334B (zh) * 2013-05-23 2017-06-23 深圳市作物分子设计育种研究院 植物新型保持系及不育系建立及其用途
US9101100B1 (en) 2014-04-30 2015-08-11 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of transgene combinations
GB2526867A (en) 2014-06-05 2015-12-09 Oxitec Ltd Gene expression system
WO2016095934A2 (en) * 2014-12-14 2016-06-23 El Abd Hisham Mohamed Magdy A novel genetic device to engineer cell behavior
BR112019002771A2 (pt) 2016-08-12 2019-05-14 Oxitec Ltd polinucleotídeo de módulo de controle de união de doublesex, sistema de expressão de gene, plasmídeo vetor de expressão, inseto geneticamente engenheirado, métodos para produzir insetos geneticamente engenheirados, para cultivar seletivamente insetos macho geneticamente engenheirados, para reduzir uma população de inseto selvagem, para criar um mosquito aedes aegypti transgênico e para detectar a presença de uma molécula de dna, local alvo cromossômico de aedes aegypti, mosquito aedes aegypti geneticamente engenheirado, molécula de dna, e, kit de detecção de dna.
CA3083436A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Weedout Ltd. Compositions, kits and methods for controlling weed of the amaranthus genus

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
GB8901677D0 (en) 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
IL89495A (en) * 1988-03-08 1995-08-31 Ciba Geigy Ag The chemically controlled AND segment, which is used to control the replication of the AND segment related to plants or plant tissues and their production
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
GB8901697D0 (en) 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Male flower specific gene sequences
GB8901675D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Inhibitor of gene expression
GB8901673D0 (en) 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Gene switch
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US5432068A (en) 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
AU1192392A (en) 1991-02-08 1992-09-07 Plant Genetic Systems N.V. Stamen-specific promoters from rice
US5409823A (en) 1992-09-24 1995-04-25 Ciba-Geigy Corporation Methods for the production of hybrid seed
US5723765A (en) 1994-08-01 1998-03-03 Delta And Pine Land Co. Control of plant gene expression
US5837851A (en) 1994-12-08 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. DNA promoter 5126 and constructs useful in a reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
HUP9800353A3 (en) 1995-03-03 2001-01-29 Syngenta Participations Ag Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand

Also Published As

Publication number Publication date
EP0455665B1 (en) 2002-05-02
CA2008700A1 (en) 1990-07-26
DK0455665T3 (da) 2002-06-17
ZA90608B (en) 1990-10-31
ATE217022T1 (de) 2002-05-15
CA2008700C (en) 2006-01-10
WO1990008830A1 (en) 1990-08-09
GB8901677D0 (en) 1989-03-15
HUT60777A (en) 1992-10-28
HU912484D0 (en) 1992-07-28
BR9007061A (pt) 1991-11-12
ES2176175T3 (es) 2002-12-01
DE69033957T2 (de) 2002-11-28
AU4945690A (en) 1990-08-24
US6172279B1 (en) 2001-01-09
EP0455665A1 (en) 1991-11-13
AU621195B2 (en) 1992-03-05
JPH04504500A (ja) 1992-08-13
DE69033957D1 (de) 2002-06-06
JP2001086987A (ja) 2001-04-03
US5808034A (en) 1998-09-15
RO112642B1 (ro) 1997-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215090B (hu) Eljárás növényi génszerkezetek és az azokkal transzformált növények előállítására
EP0658207B1 (en) Method for the genetic containment of plants
CA2106718C (en) Methods for the production of hybrid seed
US5925808A (en) Control of plant gene expression
US5723765A (en) Control of plant gene expression
EP2183355B1 (en) Compositions and methods for the modification of physiological responses in plants
JPH08501923A (ja) 根特異的又は根に高率の遺伝子発現のためのアブラナ属調節配列
JP2000507808A (ja) 植物における鱗翅目制御のための修飾バチルス・サーリンジェンシス遺伝子
WO1989000193A1 (en) Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
JPH09503652A (ja) Ｈｍｇ２プロモーター発現系ならびに植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産
KR20010041129A (ko) 화분 특이적 프로모터
PL156394B1 (pl) Sposób wytwarzania zasadniczo czystej nitrylazy bakteryjnej PL PL
JP2000116258A (ja) 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法
CA2183067A1 (en) Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
US6294716B1 (en) Plants having modified response to ethylene by transformation with an ETR nucleic acid
BRPI9814369B1 (pt) sequência de dna, gene quimérico, vetor de clonagem, processo de transformação de células vegetais, processo de controle das ervas daninhas e processo de cultura das plantas
US5861480A (en) Antimicrobial proteins from aralia and impatiens
HU224706B1 (en) Novel uses of male sterility in plants
US20040224412A1 (en) Repressor-mediated regulation system for control of gene expression in plants
JP2003079385A (ja) ウイルス伝播抑制遺伝子
HU219505B (hu) Eljárás növényből származó intracelluláris fehérjék extracelluláris térbe való irányítására és patogénellenes hatásuk fokozására
EP0667905A1 (en) Antifungal chitin binding proteins and dna coding therefor

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: ZENECA LTD., GB

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees