HU201098B - Process for producing cyclic peptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient - Google Patents

Process for producing cyclic peptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient Download PDF

Info

Publication number
HU201098B
HU201098B HU881539A HU153988A HU201098B HU 201098 B HU201098 B HU 201098B HU 881539 A HU881539 A HU 881539A HU 153988 A HU153988 A HU 153988A HU 201098 B HU201098 B HU 201098B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
tyr
met
glu
gly
trp
Prior art date
Application number
HU881539A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46709A (en
Inventor
Waleed Danho
Vincent Stewart Madison
Joseph Triscari
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HUT46709A publication Critical patent/HUT46709A/hu
Publication of HU201098B publication Critical patent/HU201098B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/12—Cyclic peptides with only normal peptide bonds in the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/595—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/27—Cyclic peptide or cyclic protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Description

zött képezett ciklizált származékok esetében X jelentése H
R1 jelentése Met
R2 jelentése Glu
R3 jelentése Met
R4 jelentése Thr(SO3H); vagy
Tyr(SOjH) és R3 között képezett ciklizált származékok esetében
X jelentése H
R1 jelentése Met
R2 jelentése Gly
R3 jelentése Glu
R4 jelentése Thr(S03H); vagy
R1 és R4 között képezett ciklizált
kok esetében
X jelentése CO-CH3
R1 jelentése Lys
R2 jelentése Gly
R3 jelentése Met
R4 jelentése Asp/ előállítására, oly módon, hogy a megfelelő nemszulfatált terméket valamely szulfatálóezerrel kezeljük.
A fenti új peptidek táplálékfelvétel-visszaszoritó vagy étvágy szabályozó hatással rendelkeznek.
Χ-Tyr (SO1H)-R,-G(y -Trp-K* -Asp-/V-W·'' Pln’-/V|L (l)
Tyr(5OjH)-R-6lu-Trp-R -R' -N-metil -Phe-N(ll)
Tyr (sOjH)-Rí-Gly-Trp-Glu-R^-N-matil-Phe-(Ilii ( Hl)
A leírás terjedelme: 12 oldal, 3 rajz, 11 ábra
HU 201098 Β
Találmányunk új gyűrűs peptidekre és ezek előállítására vonatkozik.
A gazdasági jólét bizonyos szintjét elérő országokban az elhízás az egészségvédelem igen jelentős költségtényezőjévé vált. igy pl. az Amerikai Egyesült Államok lakói közül kb. 34 millió ember a kívánatosnál legalább 20%-kal nagyobb testsúlyú olyannyira, hogy orvosi kezelésük ajánlatos [lásd: a legutóbbi NIH consensus konferencia, National Institutes of Health consensus Panel Report. 1985. február 13; lásd továbbá Science, 227: 1019-1020 (1985)].
Ezeknél az egyéneknél az elhízottség hozzájárul a keringési megbetegedések, magasvérnyomás, hiperkoleszterolémia, nem inzulinfüggő diabetes (NIDD) és a méh-, mell-, epehólyag-, vastagbél-, végbél és prosztatarák fokozott gyakoriságú fellépéséhez. Ezenkívül az elhízás ill. a súlyfelesleg a lakosság pusztulási aránya szempontjából is kedvezőtlen olyannyira, hogy extrém vagy halálos mértékű elhízás esetén a halálozási arány az átlagérték 12-szeresét is elérheti.
Nem inzulinfüggő diabetesben, magasvérnyomásban, hiperkoleszterolémiában, koronária artériás szívbetegségekben, kőszvényben és osteoarthritisben szenvedő betegek gyógyítása során gyakran először a testsúly-csökkentést javasolják. Az orvos azonban csupán viszonylag kevés gyógyászati eszközzel rendelkezik a súlycsökkentés terén. A diétás étrend során használatos anyagok általában csupán rövid időn át végzett terápiában használhatók, azonban hosszú időn ét történő alkalmazásra alkalmatlanok tolerancia kifejlődése, a központi idegrendszerre kifejtett hatások és nemkívánatos mellékhatások miatt. így a sikeresen lefogyasztott betegek kb. 95%-a 12-84 hónap alatt eredeti testsúlyát visszanyeri.
Krónikus terápiában várhatóan sikeresebben alkalmazhatók a táplálékfelvételt a test saját perifériás telítettségi jelzéseinek utánzásával csökkentő szerek, amelyek kevesebb kedvezőtlen mellékhatást mutatnak és a központi idegrendszerre nem hatnak.
A kolekisztokinin (CCK) nevű polipeptid hormont először a sertés gyomorbélrendszeréből izolálták 33 aminosavból álló pepiidként [Mutt és tsai: Biochem J. (Proced. Biochem. Soc.), 125, 57-58. oldal (1971); Mutt és tsai: Clin. Endocrinol., Supplement, 5, 175-183 (1976)]. Perifériásán adagolt CCK patkányon, birkán és majmon telítettségi érzést idéz elő (Jorpes Acta Chem. Scand., 18, 2408-2410 (1964); Della-Fera és tsai.: Science, 206, 471-73, (1979); Gibbs és tsai.: J. Comp. and Physiol Psychol., 84, 488-495 (1973)]. A CCK-8 ez a CCK-val analóg oktapeptid - infúziója sovány és elhízott embereken táplálékfelvétel-csökkenést idéz elő [J. Smith, Int. J. of Obesity, 8, Supplement 1. 35-38 (1984)].
Elfogadott tény, hogy a CCK telítettségi érzést előidéző hatással rendelkezik és ezért emberen a táplálékfelvétel csökkentésére vagy visszaszorítására alkalmazható.
A CCK-33 jelű polipeptid hormon aminosav-szekvenciája a következő:
5 10
Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Ser-Met-Ile15 20
Ly8-Asn-Leu-Gln-Ser-Leu-Asp-Pro-Ser-His25
Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly30 33
Trp-Met-Asp-Phe-NH2.
A CCK fragmensei - pl. a CCK-8 és CCK-7 ugyancsak telítettségi érzést előidéző hatást mutatnak.
A CCK-8 aminosav-szekvenciája a következő:
27 28 29 30 31 32 33
Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2.
A CCK-7 eggyel kevesebb aminosavat tartalmaz, mint a CCK-8, azaz a 26-helyzetű Asp-ot nem tartalmazó CCK-8-nak felel meg.
Az ismert peptidek lineáris konfigurációjüak.
A lineáris peptidek általában nagyon rugalmas molekulák és nincs jól definiált konformációjuk. A lineáris pepiidben levő minden aminosav a környező közeg hatásának kitett egység és ezáltal a lineáris peptidek enzimatikus és kémiai lebontásokkal szemben sokkal érzékenyebbek a jól meghatározott konformációval rendelkező molekuláknál.
Ismeretes, hogy a CCK-33, CCK-8 és különböző analógjaik valamint a CCK-7 lineáris formái telítettségi érzést előidéző hatással rendelkeznek, ezek a peptidek azonban hatásukat csak rövid időn át képesek kifejteni. Ezenkívül a lineáris CCK-8 emberi gyomornedvek hatására nagyon gyorsan lebomlik. A fenti, telítettségi érzést előidéző vegyületek hatékony orális adagolása ezért kizártnak tekinthető.
Fentiek miatt szükséges a telítettségi érzést hosszabb időn át kifejtő vegyületek előállítása ill. az ilyen hatású vegyületek hatékony orális adagolásának kidolgozása.
Ciklikus peptidnek olyan peptideket tekintünk, amelyekben a peptid-láncban levő egyik aminosav béta- vagy gamma-végállású karboxilcsoportja amidkötés kialakításával a peptidláncban lévő másik aminosav alfa-, delta- vagy epszilon-vágállású aminocsoportjához kapcsolódik. A láncban levő két aminosav összekapcsolódása gyűrűs szerkezetet eredményez.
A gyűrűs peptidek biológiai tulajdonságai lényegesen eltérnek lineáris analógjaik hatásától. A gyűrűs peptidek ridegebbek, jól meghatározott alakúak és a belül elhelyezkedő aminosav-maradékok a molekulát körülvevő környezettel szemben leárnyékoltak, védettek. Ezek a különbségek a peptidek biológiai tulajdonságaiban tükröződnek. A gyűrűs peptidek hatásukat hosszabb idón át fejtik
HU 201098 Β ki, minthogy tömör szerkezetük következtében kémiai és enzimes lebontással szemben kevésbé érzékenyek. A gyűrűs peptidek biológiai értékesíthetősége a védett belső aminosav-maradékok által előidézett szöveti eloszlás következtében nagyobb. Ezenkívül a gyűrűs peptidek jól meghatározott alakjuk miatt a megcélzott receptorhoz nagyobb specifikussággal kapcsolódnak és ezáltal a kívánt hatást kísérő nemkivánatos biológiai aktivitások valószínűsége csökken. Ezzel ellentétben egy lineáris peptid általában mind központi mind perifériális receptorokkal rendelkezik és ezért egy adott peptid számottevő kereszt-reakcióképességet mutat egy másik peptid receptoraival szemben.
Találmányunk a leírásban meghatározott specifikus szekvenciával rendelkező lineáris peptidekre és e peptidek gyűrűs formáira vonatkozik.
Állatok táplálékfelvételét oly módon szoríthatjuk vissza, hogy az állatnak a takarmányfelvételt csökkentő mennyiségben valamely találmányunk szerint előállított peptidet adjuk be.
Találmányunk tárgya eljárás (XI) általános képletű a Tyr(SOsH) és R2 között vagy Tyr(SO3H, és R3 között vagy R1 és R4 között ciklizált peptid-származékok mely képletben X jelentése CO-CH3, H
R1 jelentése Lys, Met
R2 jelentése Gly, Glu
R3 jelentése Met, Glu
R4 jelentése Asp, Thr(SO3H), azzal a feltétellel, hogy Tyr(SO3,H és R2 között képezett ciklizált származékok esetében X jelentése H
R1 jelentése Met
R2 jelentése Glu
R3 jelentése Met
R4 jelentése Thr(SO3H); vagy
Tyr(S03H, és R3 között képezett ciklizált származékok esetében
X jelentése H
R1 jelentése Met
R2 jelentése Gly
R3 jelentése Glu
R4 jelentése Thr(SO3H); vagy
R1 és R4 között képezett ciklizált
kok esetében
X jelentése CO-CH3
R1 jelentése Lys
R2 jelentése Gly
R3 jelentése Met
R4 jelentése Asp/
előállítására, oly módon, hogy a megfelelő nemszulfatizált terméket valamely szulfatálószerrel kezeljük.
A jelen találmányi leírás értelmében gyűrűs pepiidnek olyan peptidet tekintünk, amelyben a peptid láncban levő egyik aminosav béta- vagy gamma-végéllású karboxilcsoportja a peptidláncban levő másik aminosav alfa-, delta- vagy epszilon-végéllésú aminocsoportjához kapcsolódik. A jelen találmányi leírásban az alábbi konfigurációk szerepelnek feltéve, hogy mást nem közlünk.
Aminosav Ciklikus peptidet kialakító a láncban aminosav végállású csoportja
Lys ε amino (ε = epszilon,
Orn δ amino (a - delta)
Tyr (SO3H) oC amino (cC = alfa)
Asp ű karboxi (fi = béta)
Glu Ή karboxi (¾ = gamma,
A találmányunk szerinti specifikus gyűrűs peptideket oly módon állítjuk elő, hogy a láncban levő aminosavak funkcionális csoportjait azokon a helyeken, amelyeken gyűrűs kapcsolódást nem kívánunk kialakítani, megvédjük és a védetlen aminosavakat gyűrűs szerkezet kialakítása céljából reagálni hagyjuk.
A szilárdfázisú szintézis módszereknél a különböző aminosavak reakcióképes oldallánc-csoportjait megfelelő védőcsoportokkal megvédjük, ezek a védőcsoportok az adott helyen a kémiai reakció lejátszódását megakadályozzák, majd a védőcsoportokat a kívánt reakció lejátszódása után eltávolítják. A láncban levő egyes aminosavak az adott aminosavra kidolgozott oldatfázieú szintéziseknél általánosan használatos szokásos védöcsoportokkal védhetők meg. A láncban levő védetlen aminosavak megfelelően reagálva kialakítják a találmányunk szerinti gyűrűs peptideket.
A leírásban az aminosavak, aktív csoportok, védöcsoportok és hasonlók megjelölésére az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk:
Szimbólum
AA Ac Orn
2-klór-Z Z
DMF Boc TFA CH3CN Phe-NH2
N-metil-Phe-NH2 Phe-NHCHa
N-metil-Phe-NHCHa (X)
Az aminosavakat az általánosan használatos 3 betűs rövidítésekkel jelöljük és mindenkor az L-izomert értjük feltéve, hogy mást nem közlünk.
Találmányunk az alábbi gyűrűs peptidek előállítására vonatkozik:
(I) általános képletű peptidek ahol
X = CO-CHs b1 = Lys,
R3 = Met,
Különösen előnyösek az alábbi képletű peptidek:
Megjelölt molekula vagy csoport aminosav acetil ornitin
2-klór-benziloxikarbonil benziloxikarbonil dimetil-formamid tért. butoxikarbonü trifluorecetsav acetonitril (VII) (VIII,
HU 201098 Β
CH3-CO-Tyr(SO3H)-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-NI-1
-metil-Phe-NH2 (Ili általános képletű peptidek ahol
R1 = Met,
R3 = Met,
R4 = Thr(SOsH),
Különösen előnyős az alábbi képletű peptid: Tyr (SO3H )-Met-Glu-Trp-Met-Thr (SO3H )-NJ-1
-metil-Phe-NH2 (III) általános képletű peptidek ahol
R1 = Met,
R4 = Thr(SÖ3H),
Különösen előnyős az alábbi képletű peptid: Tyr (SOsH )-Met-Gly-Trp-Glu-Thr (SO3H )-N< 1 metil-Phe-NH2
A R1 = Lys jelentésnek megfelelő (I) általános képletű peptidek esetében a Lys epszilon-végállású aminocsoportja kapcsolódik az Asp béta végállású karboxilcsoportjához és ily módon gyűrűs peptid jön létre.
A (II) általános képletű peptidek esetében a Tyr(SO3H) alfa végállásü aminocsoportja kapcsolódik a Glu gamma végállású karboxilcsoportjához, kialakítva a gyűrűs peptidet.
A (III) általános képletú peptidek esetében a Tyr(S03H) alfa végállású aminocsoportja kapcsolódik a Glu gamma végállásü karboxilcsoportjához és ily módon alakítja ki a gyűrűs szerkezetet.
Találmányunk továbbá az alábbi lineáris peptidekre vonatkozik:
(IV) általános képletű peptidek ahol
X = 1-4 COCH3
R1 = Lys,
R3 = Met, (V) általános képletű peptidek ahol
R1 = Met,
R3 = Met,
R4 = Thr(SO3H), (VI) általános képletű peptidek ahol
R1 = Met,
R4 = Thr(SO3H).
A találmányunk szerint előállított peptidek állaton telítettségi érzést idéznek elő és a táplálékfelvétel visszaszorítására használhatók. Ezeket a vegyületeket állatok testsúlyának beállítására vagy csökkentésére alkalmazhatjuk.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás gyógyászati készitmények - különösen a táplálékfelvétel szabályozására vagy visszaszorítására alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a fenti eljárással előállított (XI) általános képletű peptid Tyr(SO3H) és R2 között vagy Tyr(SO3H) és R3 között vagy R1 és R4 között képezett ciklizált származékát inért gyógyászati hordozóanyagokkal összekeverjük és a keveréket galenikus formára hozzuk.
A leírásban használt .táplálékfelvételt visszaszorító mennyiség' kifejezésen a peptid azon mennyiségét értjük (tömegben kifejezve, az állat 1 kg testtömegére vonatkoztatva), amelyet a táplálékfelvétel visszaszorítása céljából az állatnak be kell adni. A fenti mennyiségek meghatározása az alkalmazás módja, a kezelendő állat fajtája és testtömege alapján a szakember kötelező tudásához tartozik. A CCK-8 telítettségét előidéző (fogyasztó) szerként történő alkalmazásával kapcsolatban az alábbi, a korábbi ismereteket összefoglaló irodalmi helyre hivatkozunk: Morley, J. E., .Minireview The Ascent of Cholecystokinin (CCK) From Gut to Brain' Life Sciences, 1982, 30, 479-493, különösen 485-488. oldal (1982).
Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fentiekben meghatározott peptidek előállítására, oly módon, hogy
a. ) szilárdfázisú gyantához kapcsolódó, megfelelő blokkolt lineáris peptidet készítünk;
b. ) a lineáris peptidet a gyantáról eltávolítjuk és HPLC úton tisztítjuk;
c. ) a lineáris peptidet valamely ciklizáló szerrel kezeljük és amidkőtés képzésével és HPLC tisztítással gyűrűs peptidet nyerünk;
d. ) a gyűrűs peptidet szulfátéi juk és HPLC úton tisztítjuk.
a.) Szilárd fázisú gyantához kapcsolódó megfelelő blokkolt lineáris peptid előállítása:
A peptideket szilárdfázisú szintézissel, a Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85, 2149-2154 (1963) irodalmi helyen leirt általános módszerrel állíthatjuk elő, azonban az irodalomban ismert bármely más ekvivalens kémiai szintézist is alkalmazhatunk. A szilárdfázisú szintézist az előállítandó peptid végállásü karboxilcsoportján kezdjük oly módon, hogy valamely védett alfa-aminosavat amidkőtéssel megfelelő gyantához kapcsolunk. E célra pl. benzil-hidrilamin (BHA) vagy metil-benzil-hidrilamin (MBHA) gyantát alkalmazhatunk. A BHA és MBHA gyantahordozók kereskedelmi forgalomban levő termékek és általánosan használatosak a végállású karboxilcsoporton helyettesitetlen amidot tartalmazó peptidek szintézise esetén.
A találmányunk szerinti eljárásnál felhasznált oldószerek - pl. metilén-klorid (CH2CI2), 2-propanol és dimetil-formamid (DMF) - mindegyike a Burdick és Jackson .Distilled in Glass* minőségnek felel meg és
HU 201098 Β további desztilláció nélkül felhasználható. A trifluor-ecetsav (TFA), diizopropil-etilarain (DIPEA) és a diciklohexil-karbodiimid (DCC) a Chemical Cyanamid Corporation cégtől vásárolt .szekvenciális tisztaságú termék. Az etán-ditiolt (EDT) a Sigma Chemical Co. cégtől vásároltuk és további tisztítás nélkül használtuk fel. Találmányunk során L-konfigurációjú és a Bachem cégtől vásárolt védett aminosavakat alkalmazunk feltéve, hogy mást nem közlünk.
A szilárdfázisú szintézis módszereknél a különböző aminosav-egységek reakcióképes oldallánc-csoportjait olyan tipikus védöcsoportokkal védjük meg, amelyek megakadályozzák a kémiai reakció lejátszódását az adott helyen, majd a védőcsoportot a kívánt reakció lejátszódása után eltávolítjuk. Bár a szilárdfázisú szintézis kapcsán bizonyos védőcsoportokat kiemeltünk, megjegyezzük, hogy az egyes aminosavak az oldatfázisú szintéziseknél használt bármely szokásos megfelelő aminosav-védöcsoporltal megvédhetők. A fenti védócsoportok közül a karboxilcsoport megvédésére szokásos védőcsoportok példáiként az észtereket, pl. aril-észtereket, különösen fenil-észtereket vagy kis szénatomszámú alkil-, halogén-, nitro-, tio- vagy kis szénatomszámú (1-7 szénatomos) alkil-tio-helyettesitót hordozó fenilésztereket említjük meg. Az összes alfa-amino-csoportot tercier butoxikarbonil-csoporttal (BOC) védjük meg. Az oldallánc csoportokat a következőképpen védjük: Asp, Glu, Thr benzilcsoporttal; Trp formilcsoporttal és Tyr 2,6-diklór-benzílcsoporttal; Lys 2-klór-Z vagy Z-csoporttal. A fenti vegyületek tisztaságát vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) és az optikai forgatóképesség mérésével igazoljuk. Benzil-hidril-amin (BHA) gyantaként a Beckman Instruments cégtől beszerzett, szemcse alakban (200-400 mesh) levő, 1% divinil-benzolt tartalmazó sztirol) divinil-benzol kopolimert alkalmazunk. Az összes nitrogéntartalom 0,654 milliekvivalens/g.
Az alábbi berendezéseket alkalmazzuk. A vékonyréteg-kromatografálást (TLC) üvegre felvitt, előre bevont szilikagél 60 F254 lemezeken (Merck) megfelelő oldószer-rendszerek felhasználásával végezzük el. A foltokat UV fluoreszencia segítségével (254 nm abszorpció), jódos megfestéssel vagy ninhidrines permetezéssel (primer és szekunder aminok esetében) mutatjuk ki.
Az aminosav-analizis céljából a peptideket fenolt tartalmazó 6 n sósavban 115 °C-on 24 órán ét vákuum alá helyezett Reacti-Therra hidrolízis csövekben hidrolizáljuk (Wheaton Scientific Company, Milville N.J. 08332). Az analízist Beckman 121 M aminosav analizátorral hajtjuk végre.
A nagy teljesítőképességű folyadékkromatografálást (HPLC) Laboratory Data Control (LDC) márkájú készülékben végezzük el, amely Constametric I szivattyúból,
Constametric III szivattyúból, Gradient Master oldószer programozóból és keverőbői, valamint Spectromonitor III változtatható hullámhosszú UV detektorból áll. Az analitikai HPLC-t Waters Micro Bondapack Cie fordított fázisú oszlopok (0,4 x 25 cm) segítségével végezzük el. A preperativ HPLC szétválasztásokat Whatman (2,5 x 50 cm) Partisii M20 10/50 ODS-3 oszlopon vagy (2,3 x 30 cm) mikro Bondapack Cm oszlopon futtatjuk; mindkét esetben Whatman Co; Pell ODS pelliculáris töltetet tartalmazó elö-oszlopot alkalmazunk.
A peptideket lépésenként szilárd hordozón, Vega 250 peptid szintetizátor felhasználásával kapcsoljuk össze. A kémiai modult Model 300 mikroprocesszorral (Vega Biochemicals) a 16. és 20. lépés műveleteinél pedig kézi működtetéssel szabályozzuk.
g Boc-N-metil-Phe-t (17 millimól) benzhidrilamin gyantához (5 g) kapcsolunk, 1,8 g DCC (9 millimól) felhasználásával, 0 °C-on. A felvételt aminosav-analizissel határozzuk meg; a mért érték 0,20 millimól/g gyanta. A reagálatlan aminocsoportokat 6-6 ekvivalens ecetsavanhidriddel és piridinnel történő kezeléssel blokkoljuk.
Egy, a gyantával kezdődő tipikus szintézis-ciklus menetét az alábbiakban ismertetjük.
Lépés Reagens Ldő
1 1% EDT/CH2CI2 1x30 mp
2 50% TFA/CH2CI2 1% EDT lxl perc
3 4 1. lépést megismételni 50% TFA/CH2CI2 1% EDT 1x15 perc
5 CH2CI2 1x30 mp
6 2-propanol 1x30 mp
7-8 9 5. és 6. lépést megismételni CH2CI2 2x30 mp
10 8% DIPEA 2x2 perc
11-15 16 5-9. lépést megismételni 5 ekv. Boc-Aminosavanhidrid 1x30 perc
17 1% DIPEA 1x5 perc
18-19 20-21 22 6-9. lépést megismételni Ha Kaiser-teszt pozitív, 16-17. lépést megismételni 2-propanol 1x30 mp
23-24 25 5-6. lépést megismételni CH2CI2 1x30 mp
26 DMF 2x30 mp
27 CH2CI2 3x30 mp
Az összes mosási és kapcsolási műveletnél az oldószer térfogata 10-20 ml/g gyanta. A kapcsolásokat a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeivel végezzük el. A reakciókat CHíClz-ben 0 °C-on 15 percen át, 10 ekviva-59
HU 201098 Β lene Boc-aminosav és 5 ekvivalens DCC felhasználásával végezzük el.
A kapcsolási reakciókat Kaiser-féle ninhidrin-teszttel követjük nyomon és meghatározzuk, hogy a kapcsolódás a 19. lépés után teljes-e [Kaiser E. és tsai: Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970)]. A teljes ciklus-idó 54-160 perc/aminosav
b.) A lineáris peptid eltávolítása a gyantáról és tisztítás preparatív HPLC útján
A teljesen kialakított peptid-gyantákat nagyvákuumban egy éjjelen át szárítjuk. A védőcsoport eltávolítását és a lehasitásokat Tam és tsai: [Tetrahedron Letters 23, 4435-4438 (1982)] a CCK-8 analógokra optimalizált általános módszerének módosított körülményei között végezzük el. A peptid-gyantát teflon HF készülékben (Peninsula) hidrogén-fluoriddal, dimetil-szulfiddal és p-krezollal (5:13:2) egy órán át 0 °C-on kezeljük, majd kis térfogatra bepároljuk és a reakcióedénybe friss vízmentes hidrogén-fluoridot (18 ml) desztillálunk be, ezt a második kezelést másfél órán ét 0 °C-on végezzük. Alapos bepárlás után a száraz gyantát 3-3 térfogat EtíO-al és EtOAc-al mossuk, majd 4x15 ml 30%-os ecetsavval titráljuk és szúrjuk. A vizes szűrlet liofilizálása után nyers lineáris peptidet kapunk.
A preparatív tisztítást közvetlenül a nyers peptiddel HPLC módszerrel (2,3x30 cm) mikro. Bondapack Cie vagy (2,5x50 cm) Whatmann ODS-3 oszlopon végezzük el. A peptideket minimális térfogatú 50%-os AcOH-ban visszük fel és 5-65%-os lassú grádiens szerint (4 óra) 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel, 8,0 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A frakciókat háromperces időközökben gyűjtjük össze és analitikai HPLC meghatározás után egyesitjük. A 97%-osnál nagyobb tisztaságú frakciókat összegyűjtjük és liofílizáljuk.
A peptidek tisztaságát HPLC segítségével határozzuk meg; minden esetben 99%-os tisztaságot mértünk. Az egyes peptidek aminosav-analízisét elvégeztük és minden esetben a várt értéket kaptuk. Az analógok UV, IR és MS értékeit meghatározzuk és ily módon is igazoljuk a peptidek kémiai szerkezetét.
c.) A lineáris peptidet ciklizáló szerrel kezelve amid-kötésen keresztül, majd HPLC tisztítás útján gyűrűs peptidet kapunk.
A lineáris peptidet DMF-ben oldjuk és 3 n sósav/dioxán eleggyel kezelve a szabad aminocsoportot hidroklorid só alakjában protonáljuk. A sót difenil-foszfenil-aziddal kezeljük és egy órán át -20 °C-on aktiváljuk. A reakcióelegyet DMF-el (15 térfogat) hígítjuk és a pH-t N-metil-morfolinnal 7,5-re állítjuk be. A ciklilzációs reakciót 2 napon át +5 °C-on végezzük el és ez alatt a pH-t ellenőrizzük és N-metil-morfolin hozzáadásával semleges értéken (pH=7,4) tartjuk. A szerves oldószerben a .pH-t oly módon határozzuk meg, hogy az oldat aliquot részét megnedvesített keskeny pH-papírcsíkra visszük fel.
A gyűrűzárás előrehaladását a reakcióelegy aliquot részének HPLC analízisével követjük nyomon. A kiindulási lineáris peptid 1-2 nap után általában ciklikus monomerré vagy a lineáris peptid polimer formájává alakul.
A kapott nyers gyűrűs peptidet preparatív HPLC módszerrel (2,3x30 cm) mikro Bondapack Cis oszlopon tisztítjuk. A peptideket minimális térfogatú ecetsavban visszük fel és 5-65%-os lassú gradiens szerint (4 óra) 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel 8,0 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A frakciókat háromperces időközökben gyűjtjük össze és HPLC analízis után egyesítjük. A gyűrűs peptidek tisztaságát analitikai HPLC, aminosav-analízis és MS meghatározásával mérjük.
d.) A gyűrűs peptidek szulfatálása és HPLC tisztítása
A kénsavészter-csoportot tartalmazó peptideket a hidroxilcsoportok (tirozin, szerin, treonin vagy hidroxi-prolin) kettős szulfatálásával, piridin-acetilkénsav reagens felhasználásával állítjuk elő. A tipikus szulfatálást a következőképpen végezzük el:
60-240 mg piridinium-acetil-szulfátot (PÁS) 5 ml piridinben oldunk és 60 °C-on 10 percen át keverjük. 10 mg N-acetil-CKK-8 analógot 5 ml piridinben oldunk, amelyhez a PÁS reagenst hozzáadjuk. A reakcióelegyet 60 °C-on 45-60 percen át melegítjük és keverjük, majd 2 térfogat 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük, liofilizáljuk és HPLC tisztításnak vetjük alá.
A szulfátéit peptideket preparatív fordítottfázisú HPLC úton tisztítjuk; Cie-10 μ (ES Industries) (1,25x30 cm) oszlopon 10-40%-os 2 órás gradiens szerint, 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonát és acetonitril elegyeiben, átfolyási sebesség 5 ml/perc, kimutatás 240 nm-nél. Az ősszegyűjtendö frakciók meghatározása és a peptid-tisztaság mérése analitikai HPLC módszerrel, Bondapack Cu, 10 μ Waters-oszlopon (0,30x30 cm), acetonitril/ammónium-hidrogén-karbonát gradienssel 2 ml/perc átfolyási sebességgel történik; kimutatás 215 nm-nél.
A szulfátéit peptidek tisztaságát analitikai HPLC, aminosav-analizis, UV, IR, MS és NMR segítségével határozzuk meg.
Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. Az étvégyszabélyozó hatású peptideket a fenti eljárés7
-611
HU 201098 Β sál állítjuk elő. A példákban a peptidek jellemzését és tisztaságuk meghatározását aminosav-analizis, analitikai HPLC, UV, IR és MS segítségével végezzük el.
1. példa
Ac-Tyr(SO3H)-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metilJ_l
-Phe-NH2 előállítása g (17,8 millimól) Boc-N-metil-Phe-t 50 ml metilén-klorid és 50 ml dimetil-formamid 0 “C-ra hűtött elegyében oldunk, majd keverés közben 1,8 g (9 millimól, diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és az elegyet 60 percen át 0 °C-on keverjük.
Másik lombikban 5 g benzilhidril-amin-gyantát (0,56 millimól N/g: sztirol és 1% divinil-benzol térhálósított kopolimerje) 10% diizopropil-etil-amint tartalmazó metilén-kloriddal 30 percen át mossuk, majd szűrjük és metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal és metilén-kloriddal mossuk. A lehűtött elegyet a gyantához adjuk és 24 órán ét szobahőmérsékleten keverjük. A gyantát szűrjük, metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal, izopropanollal, metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal, izopropanollal és metilén-kloriddal mossuk, majd nagyvákuumban szárítjuk.
A gyanta aminosav-analízis szerint 0,20 millimól N-metil-fenil-alanint/g gyanta tartalmaz. A reagálatlan aminocsoportokat oly módon fogjuk be, hogy a gyantát 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml diizopropil-etil-amin metilén-kloridos oldatával 60 percen át rázatjuk. A gyantát szűrjük és metilén-kloriddal, izopropanollal dimetil-formamiddal és metilén-kloriddal mossuk. 4,8 g (0,96 millimól) Boc-N-metil-fenil-alanin gyantát az alábbiakban ismertetésre kerülő eljárás szerint szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetjük alá. Az összes kapcsolást a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeinek felhasználáséval, a leírt módon végezzük el. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat az alábbi megfelelő reakcióidőkkel adagoljuk: hat különálló ciklust végzünk, éspedig Boc-aszparaginsav-β-benzil-észterrel (1,6 g 5 millimól, 60 perc;
1,6 g 5 millimól, 60 perc); Boc-metioninnal (1,25 g, 5 millimól, 30 perc; 1,25 g 30 perc, 5 millimól); Boc-N’-formil-triptofánnal (1,70 g, 5 millimól, 30 perc; 1,70 g, 5 millimól, 30 perc); Boc-glicinnel (900 mg, 5 millimól, 30 perc, 900 mg, 5 millimól, 30 perc); Boc-£-2-klór-Z-lizinnel (2,10 g, 5 millimól, 30 perc; 2,10 g, 5 millimól, 30 perc) és Boc-2,6-diklór-benzil-tirozinna) (2,2 g 5 millimól, 30 perc; 2,2 g, 5 millimól, 30 perc).
A Boc-védöcsoportok le hasítása és a gyanta 20 ml ecetsavanhidriddel 20 ml piridinben és metilén-kloridban végzett acetilezése után 5,2 g acetilezett heptapeptidil-gyantát kapunk.
1,9 g peptidil-gyantát - 2 ml dimetil-szulfidot, 1 ml anizolt és 0,7 ml ditioetánt tartalmazó - 25 ml hidrogén-fluoriddal egy órán át 0 “C-on végzett kezeléssel hasítunk. Az elegyet alaposan bepároljuk, a gyantát 2 térfogat etil-acetáttal moseuk, majd 4x15 ml 30%-os ecetsavval titráljuk, szűrjük és liofilizáljuk. 300 mg nyers pepiidet kapunk.
150 mg nyers peptidet preparatív HPLC segítségével mikro Bondapack Cis oszlopon (2,3x30 cm) tisztítunk. A peptidet 5-65%-os lineáris grédiens szerint 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel eluáljuk; étfolyási sebesség 8 ml/perc. A kimutatást 280 nm-nél végezzük. A főcsúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 20 mg (11%) Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metil-Phe-NHz-t kapunk. A kapott termék HPLC szerint homogén és a megfelelő aminosav-analízist és MS-t adja.
mg (0,02 mól) lineáris peptidet 1 ml dimetil-formamidban oldunk és 0,1 ml 3 mólos sósavas dioxánt adunk hozzá. A reakcióelegyet szárazra pároljuk és a maradékot 1 ml DMF-ben oldjuk. Ezután 0,13 ml (0,005 millimól) difenil-foszforil-azidot adunk hozzá, majd az elegyet -20 °C-ra hűtjük és egy órán át -20 °C-on keverjük. A reakcióelegyet 15 ml DMF-al hígítjuk, majd a pH-t N-metil-morfinnai 7,5-re állítjuk be (megnedvesített pH papírcsíkkal mérjük,. A reakcióelegyet 5 “C-ra hagyjuk felmelegedni, majd ezen a hőmérsékleten pH=7,4 értéken két napon ét állni hagyjuk. A pH-t N-metil-morfolin kis aliquot részeinek hozzáadásával ezen az értéken tartjuk.
A reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot 1 ml ecetsavban oldjuk és mikro Bondapack Cis oszlopra (2,3x30 cm) visszük fel. Az oszlopot 5-65%-os lassú gradiens szerint (4 óra) 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel eluáljuk, 8,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A kimutatást 280 nm-nél végezzük el. A frakciókat 3 perces időközökben gyűjtjük össze és a vágásokat analitikai HPLC meghatározás után végezzük. A gyűrűs peptidnek megfelelő csúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk.
mg (45%) Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N1_I
-metil-Phe-NH2 képletű terméket kapunk.
A fenti termék HPLC szerint homogén és az alábbi aminosav-analízist adja: Asp 1,00 (1); Gly 1,07 (1); Met 1,00 (1); Tyr 1,12 (1); Lys 1,00 (1); a Trp-t és N-metil-Phe-t nem határozzuk meg; a termék a várt MS-t mutatja.
Összegképlet: C49H62N10O10S, molekulatömeg 982,14.
190 mg piridin-acetil-szulfáthoz (PÁS, 10 ml frissen desztillált piridint adunk. A kapott elegyet 60 “C-on keverés közben 10 percen át melegítjük. Az oldatot hűlni hagyjuk, majd 8,0 mg Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met1_.
-Asp-N-metil-Phe 10 ml piridinnel képezett
-713
HU 201098 Β oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük és liofilizáljuk. A tisztítást fordított fázisú preparatív HPLC segítségével ES Industries Cie-10 μ oszlopon (1,25x30 cm) végezzük el, 0,05 mólos NH4HCO3/CH3CN elegyekkel 10-40%-os lineáris gradiens szerint, 5 ml/perc átfolyási sebesség mellett; a kimutatást 240 nm-nél végezzük el.
7,0 mg (87%)
Ac-Tyr (SO3H )-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metilI_1
Phe-NH2-t kapunk.
Aminosav-analizis: Asp 1,00 (1); Gly 1,00 (1); Met 1,00 (1); Tyr 1,12 (1); Lys 1,00 (1); Trp-t és N-metil-Phe-t nem határoztuk meg. Összegképlet: C49H62N10O13S2, molekulatömeg 1063,21.
UV-adatok: 0,1 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxidban
λ vall 272 nm ε = 5260
λ max 280 nm ε = 5530
λ max 288 nm ε = 4750
IR-adatok: kálium-bromidban 3325 cm-1: OH, NH 1655 cm*1: amid, karbonil 1530 cm’1: amid II 1505 cm1: tirozin 1200 cm*1: szulfát
2. példa
Tyr (SO3H )-Met-Glu-Trp-Met-Thr (SO3H )-N-me1_j til-Phe-NH2 előállítása
4,0 mg (0,8 millimól), az 1. példában leirt módon készített Boc-N-raetil-fenil-alanin gyantát az 1. példában ismertetett szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetünk alá. Az összes kapcsolást a korábbiakban leirt Boc-aminosav vegyes anhidridek felhasználásával végezzük el. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat az alábbi megfelelő reakcióidőkkel adagoljuk: hat különálló ciklust végzünk, éspedig Boc-O-benzil-treoninnal (1,5 g, 5 millimól, 60 perc; 1,5 mg, 5 millimól, 60 perc); Boc-metioninnal (1,25 g 5 millimól 30 perc; 1,25 g, 5 millimól, 30 perc); Boc-N1-formil-triptofánnal (1,7 g 5 millimól, 30 perc;
1,7 g, 5 millimól, 30 perc); Boc-glutaminsav-^-benzil-észterrel (1,6 g, 5 millimól, 30 perc; 1,6 mg, 5 millimól, 30 perc); Boc-metioninnal (1,25 g, 5 millimól, 30 perc; 1,25 mg, 5 millimól, 30 perc) és Boc-2,6-diklór-benzil-tirozinnal (2,2 g, 5 millimól, 30 perc; 2,2 g, 50 millimól, 30 perc). A Boc-védőcsoportok eltávolítását az 1. példában leírt módon hajtjuk végre; 4,9 g heptapeptidil-gyantát kapunk.
g gyantát - 12 ml dimetil-szulfidot,
2,0 ml p-krezolt és 1 ml ditio-etánt tartalmazó-hidrogén-fluoriddal (5 ml) történő kezeléssel hasítunk. Az elegyet kis térfogatra pároljuk be, majd a reakcióedénybe 18 ml friss vízmentes hidrogén-fluoridot desztillálunk be és ezt a második kezelést 2 órán át 0 °C-on végezzük. Az elegyet alaposan bepároljuk, a gyantát etil-acetáttal mossuk, majd 30%-os ecetsavval titráljuk, szűrjük és liofilizáljuk. 210 mg nyers peptidet kapunk. 100 mg fenti nyers peptidet preparatív HPLC segítségével mikro Bondapack Cis oszlopon (2,3x30 cm) tisztítunk. A peptidet 5-65%-os lineáris gradiens szerint 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel eluáljuk, 8 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A kimutatást (detektálást) 280 nm-nél végezzük el. A főcsúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 15 mg (19%) Tyr-Met-Glu-Trp-Met-Thr-N-metil-Phe-NH2-t kapunk. A termék HPLC szerint homogén és a kívánt aminosav-analizist és MS-t adja.
mg (0,02 mól) lineáris peptidet az 1. példában ismertetett módon difenil-foszforil-azid felhasználásával ciklizálunk.
mg (41%) Tyr-Met-Glu-Trp-Met-Thr-N-me1_l til-Phe-NH2-t kapunk. A termék HPLC szerint homogén és aminosav-analizise a következő: Thr 0,90 (1); Glu 1,00 (1); Met 2,00 (2); Tyr. 1,00 (1); Trp 0,80 (1); az N-metil-Phe-t nem határoztuk meg. A termék a kívánt MS-el rendelkezik.
Összegképlet: C49H63N9O10S2, molekulatömeg 1002,0.
mg piridin-acetil-szulfáthoz (PÁS) 6 ml vízmentes desztillált piridint adunk. A kapott elegyet 60 °C-on 10 percen át keverés közben melegítjük. Az oldatot lehűlni hagyjuk, majd 3 mg Tyr-Met-Glu-Trp-MetJ-1
Thr-N-metil-Phe-NH2 3 ml piridinnel képezett oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük és liofilizáljuk. A tisztítást preparatív fordított fázisú HPLC módszerrel, ES-Industries Cie-10 μ oszlopon (1,25x30 cm) 10-40%-os lineáris gradiens szerint 0,05 NH4HCO3/CH3CN elegyekkel, 120 percen át, 5 ml/perc átfolyási sebességgel végezzük el. A kimutatás 240 nm-nél történik. Kitermelés 1,4 mg (45%) Tyr(SO3H)-Met-Glu-Trp-Met-Thr(SO3H)-N-me1_l til-Phe-NHz
Aminosav-analizis: Thr 0,85 (1); Glu 1,00; (1); Met 1,80 (2); Tyr 1,00 (1); Trp 0,75 (1); N-metil-Phe-t nem határoztuk meg.
Összegképlet: C49H63N9O1SS4, molekulatömeg 1162,32.
UV-adatok: 0,11 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxidban λ váll 272/273 nm £ 4660 λ váll 280 nm ε 4760 λ váll 289 nm ε 4055
IR-adatok: kálim-bromidban
3400 cm·*: OH, NH
1675 cm*1: amid, karbonil
-815
HU 201098 Β
1530 cnr1: amid Π 1505 cm’1: tirozin 1248 cm1: szulfát
3. példa
Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Glu-Thr(SO3H)-N-meI_1 til-Phe-NHz előállítása
5,0 g (1 millimól), az 1. példában leírt módon előállított Boc-N-raotil-fenil-alanin gyantát az 1. példában ismertetett eljárás szerint szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetünk alá. Az összes kapcsolást a korábban leírt módon, a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeinek felhasználásával végezzük el. A 16. és 20. lépés során az aktivált aminosavakat a megfelelő alábbi reakcióidőkkel adjuk hozzá: hat különálló ciklust végzünk, éspedig Boc-O-benzil-treoninnal (1,5 g 5 millimól, 60 perc; 1,5 g 5 millimól, 60 perc); Boc-glutaminsav-·#- benzil-észterrel (1,6 g, 5 millimól, 30 perc; 1,6 g 5 millimól 30 perc); Boc-íH-formil-triptofánnal (1,7 g 5 millimól, 30 perc; 1,7 g 5 millimól, 30 perc); Boc-glicinnel (900 mg, 5 millimól, 30 perc; 900 mg, 5 millimól, 30 perc); Boc-metioninnal (1,25 g, 5 millimól, 30 perc; 1,25 g, 5 millimól, 30 perc); és Boc-2,6-diklór-benzil-tirozinnal (2,2 g, 5 millimól, 30 perc; 2,2 g, 5 millimól, 30 perc).
A Boc-védőcsoport lehasítását az 1. példában leírt módon végezzük el és 5,80 g heptapeptidil-gyantát kapunk 2,4 g gyantát-dimetil-szulfidot, p-krezolt és ditio-etánt tartalmazó hidrogén-fluoriddal kezelünk, a 2. példában leírt módon. A gyantát etil-acetáttal mossuk, 30%-os ecetsavval titráljuk, szűrjük és liofilizáljuk. 452 mg nyers peptidet kapunk.
100 mg nyers peptidet preparatív HPLC módszerrel (2,3x30 cm) mikro Bondapack Cie oszlopon tisztítunk. A peptidet 5-65%-os lineáris gradiens ezerint 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel, 8 ml-perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk. A kimutatás 280 nm-nél történik. A fócsúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 20 mg (23%)
Tyr-Met-Gly-Trp-Glu-Thr-N-metil-Phe-NHz-t kapunk.
A termék HPLC szerint homogén és a kívánt aminosav-analízist és MS-t adja.
mg (0,02 millimól) lineáris peptidet difenil-foszforil-azid felhasználásával, az 1. példában leírt módon ciklizálunk. 4 mg (21%) Tyr-Met-Gly-Trp-Glu-Thr-N-metil-Phe-NH2-t l-1 kapunk.
A fenti termék HPLC szerint homogén és az alábbi aminosav-analízist adja: Thr 0,90 (1); Glu 1,00 (1); Gly 1,00 (1); Met 0,90 (1); Tyr 0,97 (1); Trp 0,63 (1); az N-metil-Phe-t nem határoztuk meg.
. 10
A MS a kívánt értéknek felel meg.
Összegképlet: C«H5?N90ioS, molekulatömeg 928,07.
mg Tyr-Met-Gly-Trp-Glu-Thr-N-metil-PheI-1
-NHz-t 5 ml piridinben oldunk és 80 rag piridinium-acetil-szulfát (PÁS) 5 ml piridinnel képzett oldatához adjuk; utóbbi oldatot az 1. példában leirt módon készítjük el. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük és liofilizáljuk. A tisztítást preparatív HPLC módszerrel, az 1. példában ismertetett körülmények között végezzük el.
3,8 g (94%)
Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Glu-Thr(SO3H)-N-mei_--1 til-Phe-NH2-t kapunk.
Aminosav analízis: Thr 0,90 (1); Glu 1,04 (1); Gly 1,01 (1); Met 0,85 (1); az N-metil-Phe-t és Trp-t nem határoztuk meg.
Összegképlet: C46H57N9O16S3, molekulatömeg 1088,20.
(UV-adatok: 0,31 mg peptid 3 ml 0,1 n kálium-hidroxid bán λ max 249/250 nm £ 3915 λ max 256 nm £ 4125 λ max 262/263 nm £ 4170 λ váll 280 nm £ 3915 λ váll 287/288 nm £ 3516
IR-adatok: kálium-bromidban 3450 cm-1: OH, NH 1730 cm'1: észter-kötés 1630 cm1: amid, karbonil 1200 cm-1: szulfát
4. példa
In vitro receptor kötődési teszt
Fagyasztott szarvasmarha striatumot (kb. 5 g) és friss patkány pankreászt Xkb. 5 g) a zsírtól és a külső szövettől megtisztítjuk és HEPES 1. pufferrel homogenizáljuk (10 millimól HEPES, 130 millimól nátrium-klorid, 5 millimól magnézium-klorid, pH 7,4), 35 rész puffer (1 rész szövet arányban, nedves tőmeg/térfogat-alapon (kb. 175 ml). A szövetet 2x15 mp-ig homogenizáljuk, 0 °C-on Polytron-homogenizátorban, ülepedési érték 6. A szövetet 0 °C-on centrifugálással 10 percig izoláljuk (48 000 g mellett). A kapott szövet pelletet HEPES 2. pufferben újraszuszpendáljuk [10 millimól HEPES, 130 millimól nátrium-klorid, 5 millimól magnézium-klorid, 1 mg/1 fenil-metánszulfonil-klorid (PMSF), 200 mg/1 bacitracin]; 1 rész striatalis szövet (eredeti nedves tömeg) per 80 rész puffer és 1 rész pankreész szövet (eredeti nedves tömeg) per 70 rész puffer arányban.
Az inkubálást oly módon indítjuk be, hogy különböző koncentrációjú természetes CCK-8-t vagy (1) képletű peptidet 3H-CCK-8-(SO3H)-val (végső koncentráció =
-917
HU 201098 Β = 0,15 nmól) és szövethomogenizátummal (striátium 0,26 mg fehérje, 2 ml végső térfogat; pankreász 0,165 mg fehérje 1 ml végső térfogatban) kombinálunk.
A mintákat 30 percen át 25 °C-on inku- ® báljuk és az inkubálást oly módon fejezzük be, hogy az elegyet Sandbeck-féle többszörös vákuumszúrón elönedvesitett Whatman GF/B szűrőre öntjük. Az inkubációs csöveket 2x3 ml jéghideg HEPES 2. pufferrel mossuk, majd a mosófolyadékot GF/B szűrőn átszűrjük. A szűrőt levegőn 10 percen át szárítjuk, majd 12 ml Beckman HP/b .Ready-Solv' szcintillációs cocktaillel együtt szcintillációs fiolába helyezzük. A fiolákat 2-12 órán át rázatjuk, majd Beckman 7800 folyadékszcintillációs spektrofotométerrel mérjük a szcintilléciót. A nem-specifikus kötődést 1 pmól természetes CCK-8 jelenlétében meghatározzuk és a specifikus kötődés meghatározása célja- 20 ból az összes mintából levonjuk. Az összes specifikus 3H-CCK-8-(SO3H) kötődés 50%-os gátláshoz szükséges peptid-koncentrációt (ICso) a log-probit analízissel határozzuk meg. 25
Az eredményeket az I. táblázatban foglaljuk össze.
o ·—« •Φ rt j* CM
-Ö £ 43 2 g w>
to t
rt rt N ω
E _ .2 E £ c {fi (A o o o cm cm cm eo co co o
o o
o rt cu rt '5 c
φ >
X
Φ
N (fi
TJ
CU
Φ
CU
CM co
CO
X X
o « 2 z
Q X 1 1
φ Φ
I X X
Ν Φ cu cu
x x Λ » 2 CU ·Γ! X
1 Φ X r“« *3 Φ ε Φ B
cu Φ 1 rx 1
►M B 2 X
cu (0 < i 2 1 1 3 1
Φ 2 -Asp r(S0 O CA L
CU Ui Met X Eh 1 X 1
1 cu 4J Φ 1 3
u 2 O I
|
3 1 CU Cu
k Ui
φ 0 E-« Eh
X 1 (0 i 3 1 >>
X th J 5“ | 3 t
ő 4-> Φ 4.» Φ
CA X n X X
U< O 1
>> fi CA X X
X ő Ő
cu >> CA CA
(0
< 1 X X
ü >» J
X < É-i
Ul •Φ c
rt no β
•rt β
tC β
o ’S «a to φ
B “psO.OOl, »pi0,01, xp£0,05
N.S. = nem szingifikáns
-1019
HU 201098 Β
5. példa
Kétszeri etetésből álló táplálási kísérlet
180-200 g testtömegű hím Sprague-Dawley (CD) patkányokat (Charles River Breeding Laboratories) 22 °C hőmérsékletű kamrában 12 órás világos/sötét ciklusokkal (reggel 6 órától délután 6 óráig) akklimatizáltatunk. Az állatokat két napon át éheztetjuk, majd lemérjük, egyenként külön ketrecekbe helyezzük és a négynapos etetési tréninget megkezdjük. Ez alatt az idő alatt a patkányok etetőedényekben őrölt laboratóriumi tápot (Purina Láb Chow) kapnak reggel 9,00 és reggel 10,00 között; az etetőedényeket reggel 10,00 és 12,00 között eltávolítjuk, majd 12,00 és délután 1,00 óra között a ketrecekbe visszahelyezzük. E .1-2-1' etetési időszak során a patkányok a két óra alatt naponta hozzávetőlegesen annyi tápot fogyasztanak mint azok a patkányok, amelyek a napi teljes 24 óra alatt ad libitum fogyaszthatnak élelmet. Az állatokat a 4. napon újra lemérjük és a több mint 5 g testtömeg-veszteséget mutató patkányokat kizárjuk a kísérletből. Az állatokat ezután kísérleti (n=5-6) és kontroll (n=6—12) csoportokba osztjuk, testtömegüktől függetlenül.
A találmányunk szerinti eljárással előállított peptideket nátrium-klorid-oldatban (oldható peptidek esetében) vagy 1%-os gumi-arabicumban (oldhatatlan vegyületek esetében) szuszpendáljuk, 32-320 ug/ml/kg testtömeg koncentrációban, majd az etetési időszak 5. napján az első etetés előtt 15 perccel intraperitoneálisan beadagoljuk. A patkányokat ugyanúgy etetjük, mint az első négy napon és a tápot tartalmazó etetőedényeket minden egyes etetés előtt és után a táplálékfelvétel meghatározása céljából lemérjük. A táplálékfelvételt az átlagérték átlagos és standard hibájaként a különböző csoportok kontroli-értékeinek százalékában fejezzük ki. A kezelt csoportok értékeit a kontroll csoportnál mért adatokkal a .t'-teszt analízissel hasonlítjuk össze. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza.
6. példa
400 mikroliter gyomornedvet és 200 mg Ac-Tyr(SO3H)-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-meI_l til-Phe-NH2 képletű, az 1. példa szerinti peptidet és CCK-8-t [H-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2] 37 °C-on különböző időtartamokon át inkubálunk. A lebomlást analitikai HPLC módszerrel mikro Bondapack Cia oszlopon (0,4x x30 cm) 10-40% lineáris gradiens szerint 0,01 mólos NH4AC/CH3CN elegyekkel 40 percen át követjük nyomon, 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett; a kimutatás 225 nra-nél történik.
Az eredményeket az 1. példa szerinti peptid esetében a szulfatálatlan Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metil-Phe-NH2 feltétele1 zett termelésére, mig a CCK-8 esetében a CCK-8-nak megfelelő csúcs eltűnésére alapozzuk.
Peptid Inkubációs idő (perc) %-O8 lebomlás (terület)
1. példa 0 0
60 1.4
180 3.6
1380 12.8
CCK-8 0 0
15 90
60 100
-1121

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (XI) általános képletű a Tyr(SOaH) és R2 között vagy TyríSOaH) és R3 között vagy Rl és R4 között ciklizált peptid- 5 -származékok /mely képletben
    X jelentése CO-CH3, H
    R1 jelentése Lys, Met
    R2 jelentése Gly, Glu 10
    R3 jelentése Met, Glu
    R4 jelentése Asp, ThríSOaH);
    azzal a feltétellel, hogy
    Tyr(SO3H) és R2 között képezett ciklizált származékok esetében 15
    X jelentése H
    R1 jelentése Met
    R2 jelentése Glu
    R3 jelentése Met
    R4 jelentése Thr(SO3H); vagy 20
    Tyr(SOjH) ós R3 között képezett ciklizált származékok esetében
    X jelentése H R1 jelentése Met R2 jelentése Gly 25 R3 jelentése Glu R4 jelentése Thr(SO3H); vagy R1 és R4 között képezett ciklizált származó- kok esetében X jelentése CO-CH3, 30 R1 jelentése Lys R2 jelentése Gly R3 jelentése Met R4 jelentése Asp/
    előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfe- 35 lelő nemszulfatált terméket valamely szulfatálószerrel kezeljük.
  2. 2. Eljárás gyógyászati készítmények - különösen a táplálékfelvétel szabályozására vagy visszaszorítására alkalmas gyógyászati 40 készítmények - előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (XI) általános képietú peptidet valamint a Tyr(SŰ3H) és R2 között vagy Tyr(SOsH) és R3 között vagy R1 és R4 között 45 képezett ciklizált származékát inért gyógyászati hordozóanyagokkal összekeverjük és a keveréket gaíenikus formára hozzuk.
    Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4960 - KJK
    90.3346.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató
    -12HU 201098 Β
    Int Cl5 C 07 K 7/54
    C 61 K 37/02
    Χ-Tyr (5O3H ) - R - Gly -Tr p - R - Asp - L· P(i c - M
    0)
    Tyr (5O3h)-R-61u-Trp — R -R’ -N -mctíl - Ph<z~N H; ( || )
    Tyr (5O3H) -R - Gly-Trp-Glu - R^-N -metíl-Phc -ÍVHz. (III)
    X - Tyr (SO3H) - R- Gly-Trp -R - Asp - ÍV fú- M - l'h < (IV )
    Tyr (S03h)-R-GIu-Trp-R^-R^-N-mc-til-Phe-7iH; (v )
    Tyr(sO3H)-R-Gly-Trp-Glu-pX-N -mctíl-Phe “KnL (vi)
    -13HU 201098 Β
    Int Cl3 C 07 K 7/54
    C 61 K 37/02
    Η O (vii)
    CH?—C — C — i
    nhch3
    NH, (vili) ch2-c—c—nhch3
    NH.
    (IX)
    H 0
    I II aCH;-C—C —NHCH, (X)
    -14HU 201098 Β
HU881539A 1987-03-30 1988-03-28 Process for producing cyclic peptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient HU201098B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/031,632 US4808701A (en) 1987-03-30 1987-03-30 Cyclic peptides having appetite regulating activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46709A HUT46709A (en) 1988-11-28
HU201098B true HU201098B (en) 1990-09-28

Family

ID=21860562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU881539A HU201098B (en) 1987-03-30 1988-03-28 Process for producing cyclic peptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient

Country Status (16)

Country Link
US (1) US4808701A (hu)
EP (1) EP0285061A3 (hu)
JP (1) JPS63258489A (hu)
KR (1) KR880011198A (hu)
AU (1) AU610144B2 (hu)
DK (1) DK174388A (hu)
FI (1) FI881470A (hu)
HU (1) HU201098B (hu)
IL (1) IL85885A0 (hu)
MC (1) MC1913A1 (hu)
NO (1) NO881384L (hu)
NZ (1) NZ224051A (hu)
PH (1) PH25149A (hu)
PT (1) PT87111B (hu)
YU (2) YU62688A (hu)
ZA (1) ZA881621B (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5086042A (en) * 1985-12-19 1992-02-04 Fisons Corporation Peptides with sulfate ester groups
FR2611722B1 (fr) * 1987-03-02 1989-08-11 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux peptides derives de la cck8, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5395823A (en) * 1988-08-26 1995-03-07 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Neuropeptide Y agonists and partial agonists
US5084442A (en) * 1988-09-06 1992-01-28 Hoffmann-La Roche Inc. Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof
US5270302A (en) * 1988-12-21 1993-12-14 Abbott Laboratories Derivatives of tetrapeptides as CCK agonists
US5502164A (en) * 1989-11-27 1996-03-26 Fisons Corporation Peptide compounds having therapeutic activity
KR927003630A (ko) * 1989-11-27 1992-12-18 씨 비 크레이그 황산 에스테르기를 갖는 헥사펩티드
US5952465A (en) * 1993-04-23 1999-09-14 Virginia Commonwealth University Polypeptides that include conformation-constraining groups which flank a protein-protein interaction site
US5965698A (en) * 1993-04-23 1999-10-12 Virginia Commonwealth University Polypeptides that include conformation-constraining groups which flank a protein--protein interaction site
US6258550B1 (en) 1993-04-23 2001-07-10 Virginia Commonwealth University Polypeptides that include conformation-constraining groups which flank a protein-protein interaction site
AU6770794A (en) * 1993-04-23 1994-11-21 Herbert J. Evans Polypeptides that include conformation-constraining groups which flank a protein-protein interaction site
US5928896A (en) * 1993-04-23 1999-07-27 Virginia Commonwealth University Polypeptides that include conformation-constraining groups which flank a protein--protein interaction site
US6084066A (en) * 1993-10-29 2000-07-04 Virginia Commonwealth University Polypetides that include conformation-constraining groups which flank a protein-protein interaction site
US20030008843A1 (en) * 2001-04-09 2003-01-09 Shaw Craig Stuart Andrew Bulking agents as satiety agents
FI20020078A (fi) * 2002-01-15 2003-07-16 Danisco Immuunijärjestelmän stimulointi polydextroosilla
CN115353553B (zh) * 2022-06-27 2023-06-02 上海理工大学 一种靶向钙敏感受体的促cck分泌肽及其制备方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3705140A (en) * 1967-10-05 1972-12-05 Luigi Bernardi Peptides related to the c-terminal sequence of cck-pz and caerulein
US3839315A (en) * 1968-05-03 1974-10-01 Squibb & Sons Inc Novel peptides having cholecystokinin activity and intermediates therefor
US4351289A (en) * 1980-08-06 1982-09-28 Renda Vince A Water injection system for internal combustion engines
US4351829A (en) * 1980-09-26 1982-09-28 Farmitalia Carlo Erba Spa Use of polypeptides as analgesic drugs
US4490364A (en) * 1983-05-20 1984-12-25 The Salk Institute For Biological Studies CCK Agonists II
NZ218607A (en) * 1985-12-19 1989-10-27 Pennwalt Corp Tri-to acta-peptides with sulphate ester groups: obesity treatment
ZA873796B (en) * 1986-06-06 1987-12-07 F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Peptides

Also Published As

Publication number Publication date
YU62688A (en) 1989-10-31
NO881384L (no) 1988-10-03
NO881384D0 (no) 1988-03-29
YU109089A (en) 1991-04-30
DK174388A (da) 1988-10-01
FI881470A (fi) 1988-10-01
KR880011198A (ko) 1988-10-27
PH25149A (en) 1991-03-13
PT87111B (pt) 1992-07-31
NZ224051A (en) 1991-02-26
MC1913A1 (fr) 1989-04-06
US4808701A (en) 1989-02-28
HUT46709A (en) 1988-11-28
JPS63258489A (ja) 1988-10-25
AU1382488A (en) 1988-09-29
AU610144B2 (en) 1991-05-16
EP0285061A2 (de) 1988-10-05
FI881470A0 (fi) 1988-03-29
EP0285061A3 (de) 1990-07-25
IL85885A0 (en) 1988-09-30
DK174388D0 (da) 1988-03-29
PT87111A (pt) 1988-04-01
ZA881621B (en) 1988-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5767239A (en) Process for preparing cardiodilatin fragments; highly purified cardiodilatin fragments and intermediate products for the preparation of same
Marshall et al. Modified support for solid-phase peptide synthesis which permits the synthesis of protected peptide fragments
US6407059B1 (en) Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
HU201098B (en) Process for producing cyclic peptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient
CA2192305A1 (en) Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
US5084442A (en) Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof
JP2024147650A (ja) インクレチン類似体を作製する方法
JPH10510814A (ja) ベタイドを製造するためのアミノ酸並びにベタイドライブラリーのスクリーニング方法及び製造方法
US4866039A (en) Peptides containing the 18 to 23 residues of vasoactive intestinal peptide, and analogues
JPH06116284A (ja) 新規ペプチド
EP0226217B1 (en) Peptides with sulfate ester group
RU2361876C2 (ru) Пептидные векторы
US5013722A (en) Cholecystokinin analogs for controlling appetite
US20020165132A1 (en) Lanthionine bridged peptides
EP0296574A2 (en) Cholecystokinin analogs for controlling appetite
AU666244B2 (en) New angiopeptin cyclopeptide compounds, process for the preparation thereof, and pharmaceutical compositios containing them
US4959352A (en) Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof
EP0495013B1 (en) Hexapeptides with sulphate ester groups
US6617423B1 (en) Superpotent calcitonin analogs having greatly increased hypocalcemic action in vivo
US5010174A (en) Novel calcitonin derivative and salt thereof
HU206373B (en) Process for producing new pentapeptides and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient
EP0324130A2 (en) 8-Glycine, 16-X, Des-19-Leucine-Calcitonin
IL148553A (en) Backbone cyclized peptide analogs comprising more than one cyclization
IL142499A (en) Building units for synthesis of backbone cyclized peptide analogs

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee