FR3101423A1 - Method for determining the ability of an individual to respond to a stimulus - Google Patents
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Abstract
Procédé pour déterminer LA CAPACITE D’UN INDIVIDU A REPONDRE A UN STIMULUS La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, basé sur la mesure de l’expression d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis dans des listes différentes parmi trois listes de biomarqueurs, à partir d’un échantillon sanguin dudit individu, incubé avec ledit stimulus, ainsi que des outils permettant la mise en œuvre de ce procédé et l’utilisation de ces outils. The present invention relates to an in vitro or ex vivo method for determining the ability of an individual to respond to a stimulus, based on measurement of the expression of a stimulus. at least two different biomarkers, chosen from different lists among three lists of biomarkers, from a blood sample of said individual, incubated with said stimulus, as well as tools allowing the implementation of this method and the use of these tools .
Description
La présente invention concerne un procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, basé sur la mesure de l’expression d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis dans des listes différentes parmi trois listes de biomarqueurs, à partir d’un échantillon sanguin dudit individu, incubé avec ledit stimulus, ainsi que des outils permettant la mise en œuvre de ce procédé et l’utilisation de ces outils. The present invention relates to an in vitro or ex vivo method for determining the capacity of an individual to respond to a stimulus, based on the measurement of the expression of at least two different biomarkers, chosen from different lists among three lists of biomarkers, from a blood sample of said individual, incubated with said stimulus, as well as tools allowing the implementation of this method and the use of these tools.
Le système immunitaire est un système de défense de l’organisme contre ce qui est reconnu comme du non-soi, tel que des pathogènes. La réponse immunitaire nécessite une régulation très fine et peut parfois se retrouver altérée, notamment dans le cas de maladies inflammatoires, allergiques ou auto-immunes (dans lesquelles le système immunitaire est plus actif que la normale), ou de maladies caractérisées par une immunosuppression (dans lesquelles le système immunitaire est moins actif que la normale). Cette immunosuppression peut avoir différentes origines, prendre de nombreuses formes, et affecter l’immunité innée et/ou l’immunité adaptative.The immune system is the body's defense system against what is recognized as non-self, such as pathogens. The immune response requires very fine regulation and can sometimes be altered, especially in the case of inflammatory, allergic or autoimmune diseases (in which the immune system is more active than normal), or diseases characterized by immunosuppression ( in which the immune system is less active than normal). This immunosuppression can have different origins, take many forms, and affect innate immunity and/or adaptive immunity.
En particulier, le sepsis a été reconnu comme priorité de santé par l’OMS en 2017, et représente un problème mondial en termes de morbidité, de mortalité, ainsi que de coûts. On estime que 31.5 millions d’individus développent un sepsis chaque année à travers le monde, parmi lesquels 6 millions décèderont de la pathologie et 3 millions souffriront de troubles pouvant mener à une réadmission à l’hôpital. Chez un patient atteint de sepsis (dit également, en état septique), la réponse immunitaire est dérégulée, suite à une infection, ce qui conduit à une défaillance et des dysfonctions d’organes multiples et potentiellement mortelles. Cette réponse immunitaire est complexe et évolue en fonction du temps, avec des phénomènes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires excessifs et pouvant être concomitants. L’ensemble de ces dérèglements du système immunitaire conduit aux défaillances d’organes, à la paralysie du système immunitaire et aux infections secondaires. Le choc septique est un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat. Au stade initial du sepsis, c’est une réponse inflammatoire, voire hyper-inflammatoire (incluant un choc cytokinique), qui semble prédominer, et qui est à l’origine de dommages tissulaires et de défaillances organiques, notamment au niveau rénal. C’est pourquoi les essais cliniques dans le domaine du sepsis se sont pendant longtemps concentrés sur des traitements anti-inflammatoires, mais avec des résultats peu concluants. Des études plus récentes sur la pathophysiologie du sepsis ont conduit à montrer qu’une réponse anti-inflammatoire ou d’immunosuppression survenait chez les patients en état septique, soit de manière concomitante à l’inflammation initiale, soit plus tard, afin de tenter de compenser la réponse hyper-inflammatoire. Le patient peut alors se retrouver dans un état d’immunosuppression, potentiellement sévère, en fonction des degrés respectifs des réponses pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Ces patients immunodéprimés présentent un risque élevé de développer des infections nosocomiales (ou HAI,Hospital-Acquired InfectionsouHealthcare-Associated Infections) et d’être sujets à une réactivation virale, et pourraient avantageusement bénéficier de traitements immunostimulants. Cependant, des premières études réalisées chez des patients en choc septique n’ont montré aucun bénéfice avec de tels traitements. Cela peut être dû à la complexité de la pathophysiologie du sepsis (y compris la variabilité inter-individuelle de la réponse immunitaire), mais également à la dynamique de la réponse de l’hôte.In particular, sepsis was recognized as a health priority by the WHO in 2017, and represents a global problem in terms of morbidity, mortality, as well as costs. It is estimated that 31.5 million people develop sepsis each year worldwide, of which 6 million will die from the disease and 3 million will suffer from disorders that can lead to readmission to hospital. In a patient with sepsis (also said to be sepsis), the immune response is dysregulated, following an infection, which leads to multiple and life-threatening organ failure and dysfunction. This immune response is complex and evolves over time, with excessive pro-inflammatory and anti-inflammatory phenomena that can be concomitant. All of these immune system disorders lead to organ failure, immune system paralysis and secondary infections. Septic shock is a subtype of sepsis, in which hypotension persists, despite adequate vascular filling. At the initial stage of sepsis, it is an inflammatory or even hyper-inflammatory response (including cytokine shock), which seems to predominate, and which is at the origin of tissue damage and organic failures, in particular at the renal level. This is why clinical trials in the field of sepsis have long focused on anti-inflammatory treatments, but with inconclusive results. More recent studies on the pathophysiology of sepsis have shown that an anti-inflammatory or immunosuppressive response occurs in sepsis patients, either concomitant with the initial inflammation or later, in an attempt to offset the hyper-inflammatory response. The patient can then find himself in a state of immunosuppression, potentially severe, depending on the respective degrees of pro-inflammatory and anti-inflammatory responses. These immunocompromised patients are at high risk of developing nosocomial infections (or HAI, Hospital-Acquired Infections or Healthcare-Associated Infections ) and of being prone to viral reactivation, and could advantageously benefit from immunostimulant treatments. However, early studies in patients with septic shock showed no benefit with such treatments. This may be due to the complexity of the pathophysiology of sepsis (including inter-individual variability in the immune response), but also to the dynamics of the host response.
La stratification des patients selon leur profil immunologique semble par conséquent essentielle à leur prise en charge efficace. Un outil diagnostic permettant une identification précise de la fonctionnalité du système immunitaire et du statut immunitaire est d’une importance fondamentale, afin de pouvoir adapter et personnaliser la prise en charge thérapeutique. Or, les individus ayant des dérèglements du système immunitaire ne présentent pas de signes cliniques spécifiques ; en particulier, l’interprétation de la réponse de l’hôte chez des patients septiques reste un challenge. Des biomarqueurs solubles ou membranaires ont été proposés, tels que l’expression du HLA-DR (human leucocyte antigen – D related) à la surface des monocytes (mHLA-DR) ou l’expression du CD88 chez les neutrophiles, ainsi que la numération des lymphocytes ou des plaquettes, mais ils sont chacun restreints à une seule population cellulaire, ce qui sous-estime probablement la contribution immunitaire globale.The stratification of patients according to their immunological profile therefore seems essential to their effective management. A diagnostic tool allowing precise identification of the functionality of the immune system and the immune status is of fundamental importance, in order to be able to adapt and personalize the therapeutic management. However, individuals with immune system disorders do not show specific clinical signs; in particular, the interpretation of the host response in septic patients remains a challenge. Soluble or membrane biomarkers have been proposed, such as the expression of HLA-DR ( human leukocyte antigen – D related ) on the surface of monocytes (mHLA-DR) or the expression of CD88 in neutrophils, as well as the count lymphocytes or platelets, but they are each restricted to a single cell population, which probably underestimates the overall immune contribution.
Dans certaines situations cliniques (comme la tuberculose latente), des tests fonctionnels, ou tests fonctionnels immunitaires (IFA,Immune Functional Assays), ont permis d’améliorer significativement la prise en charge des patients. Les tests fonctionnels mesurent directement,ex vivo, la capacité d’une ou plusieurs population(s) cellulaire(s) à répondre à un stimulus avec lequel les cellules sont mises en contact, et ont par exemple été utilisés en recherche pour étudier l’anergie des monocytes, le plus souvent en mesurant le TNFα au niveau protéique après une stimulationex vivoavec du lipopolysaccharide (LPS), ainsi qu’en clinique, dans le cas de la tuberculose, en mesurant l’interféron γ au niveau protéique après une stimulation avec un antigène deMycobacteria tuberculosis. Des tests fonctionnels ont également été utilisés dans le cadre d’une étude visant à définir les limites d’une réponse immunitaire normale (i.e.en contexte « sain ») en réponse à différents challenges infectieux (Urrutia et al (2016), Cell Reports 16 : 2777-2791).In certain clinical situations (such as latent tuberculosis), functional tests, or immune functional tests (IFA, Immune Functional Assays ), have made it possible to significantly improve patient care. Functional tests measure directly, ex vivo , the ability of one or more cell population(s) to respond to a stimulus with which the cells are brought into contact, and have for example been used in research to study the anergy of monocytes, most often by measuring TNFα at the protein level after ex vivo stimulation with lipopolysaccharide (LPS), as well as clinically, in the case of tuberculosis, by measuring interferon γ at the protein level after stimulation with a Mycobacteria tuberculosis antigen. Functional tests were also used as part of a study aimed at defining the limits of a normal immune response ( ie in a "healthy" context) in response to different infectious challenges (Urrutia et al (2016), Cell Reports 16 : 2777-2791).
Or, il a été découvert que, de façon tout-à-fait surprenante, des tests fonctionnels basés sur la mesure de l’expression de certains biomarqueurs particuliers, classifiés en trois listes, à partir d’un échantillon sanguin d’un individu, incubé avec un stimulus, permettaient de déterminer la capacité de cet individu (pouvant être aussi bien un individu sain qu’un individu malade, tel qu’un patient atteint de sepsis) à répondre à ce stimulus. En particulier, ces tests fonctionnels permettent de mettre en évidence l’hétérogénéité inter-patients de la réponse immunitaire, de manière dynamique, en termes de dysfonctions de la réponse immunitaire innée et/ou adaptative, et donc de capturer la singularité de la capacité de réponse de chaque patient, de manière à en déduire des informations utiles quant au diagnostic, au pronostic et/ou à la prise en charge thérapeutique du patient. Le test fonctionnel selon l’invention permet en particulier de mettre en évidence trois catégories d’individus : des individus présentant un profil immunitaire non altéré à légèrement altéré (cluster S1), des individus présentant un profil immunitaire fortement altéré (cluster S2) et des individus présentant un profil immunitaire intermédiaire (cluster S3). Les individus du cluster S2, dont l’immunité apparaît fortement altérée et présentant une plus grande probabilité de mortalité, pourraient avantageusement bénéficier d’interventions thérapeutiques plus « agressives » et/ou plus précoces, tandis que lestandard of careserait suffisant pour des individus du cluster S1, dont l’immunité est peu altérée ; chez les individus du cluster S3, dont l’immunité semble restaurable, des traitements personnalisés (e.g. IL-7, interféron γ) pourraient avantageusement être testés.However, it has been discovered that, quite surprisingly, functional tests based on measuring the expression of certain specific biomarkers, classified into three lists, from an individual's blood sample, incubated with a stimulus, made it possible to determine the capacity of this individual (which could be both a healthy individual and a sick individual, such as a patient suffering from sepsis) to respond to this stimulus. In particular, these functional tests make it possible to highlight the inter-patient heterogeneity of the immune response, dynamically, in terms of dysfunctions of the innate and/or adaptive immune response, and therefore to capture the singularity of the ability to response of each patient, so as to deduce useful information about the diagnosis, prognosis and/or therapeutic management of the patient. The functional test according to the invention makes it possible in particular to highlight three categories of individuals: individuals presenting an unaltered to slightly altered immune profile (cluster S1), individuals presenting a strongly altered immune profile (cluster S2) and individuals with an intermediate immune profile (cluster S3). Individuals in cluster S2, whose immunity appears to be greatly altered and presenting a greater probability of mortality, could advantageously benefit from more "aggressive" and/or earlier therapeutic interventions, while the standard of care would be sufficient for individuals the S1 cluster, whose immunity is little altered; in individuals of the S3 cluster, whose immunity seems to be restorable, personalized treatments (eg IL-7, interferon γ) could advantageously be tested.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence pour déterminer la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus, comprenant :
a) Une étape d’incubation d’un échantillon sanguin dudit individu avec ledit stimulus, et
b) Une étape de mesure de l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a), d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SLAMF7, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2 : ADGRE3, ARL14EP, BST2, C3, CCL2, CCL20, CCL8, CCNB1IP1, IL7R, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, SLAMF7, TGFB1 ;
- Liste S3 : 121601901-HERV0116, BST2, C3, CCL20, CCL4, CCL8, CCR1, IL7R, CD209, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.Thus, the present invention relates to an in vitro or ex vivo method for determining the ability of an individual to respond to a stimulus, preferably to determine the ability of an individual's immune system to respond to a stimulus, comprising:
a) A step of incubating a blood sample from said individual with said stimulus, and
b) A step for measuring the expression, from the stimulated blood sample resulting from step a), of at least two different biomarkers, chosen respectively from at least two different lists, from the following lists:
- List S1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SLAMF7, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- List S2 : ADGRE3, ARL14EP, BST2, C3, CCL2, CCL20, CCL8, CCNB1IP1, IL7R, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA- DMB, HLA-DPB1, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, SLAMF7, TGFB1;
- List S3 : 121601901-HERV0116, BST2, C3, CCL20, CCL4, CCL8, CCR1, IL7R, CD209, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
TableauPainting 11 . Localisation chromosomique des. Chromosomal location of biomarqueursbiomarkers selon leaccording to GRCh38/hg38GRCh38/hg38
Dans le cadre de la présente invention :In the context of the present invention:
- Le terme « individu » désigne un être humain, quel qu’il soit (et notamment quel que soit son état de santé, qu’il s’agisse d’un individu sain ou d’un individu malade). Le terme « patient » désigne un individu qui est entré en contact avec un professionnel de la santé, tel qu’un médecin (par exemple, un médecin généraliste) ou une structure médicale (par exemple, un hôpital, et plus particulièrement le service des urgences, le service de réanimation, une unité de soins intensifs ou une unité de soins continus). Un patient est généralement un individu malade, mais il peut également s’agir d’un individu sain (comme par exemple, une personne âgée venant se faire vacciner) ;The term “individual” designates a human being, whatever he is (and in particular whatever his state of health, whether he is a healthy individual or a sick individual). The term "patient" means an individual who has come into contact with a healthcare professional, such as a physician (eg, general practitioner) or a medical facility (eg, a hospital, and more specifically the emergency room, intensive care unit, intensive care unit or continuing care unit). A patient is usually a sick individual, but it can also be a healthy individual (such as an elderly person coming for vaccination);
- Le « stimulus » correspond à une ou plusieurs molécules, capable(s) d’induire une réponse immune et permettant d’évaluer qualitativement et/ou quantitativement la réponse immune de l’individu ; en particulier, il peut s’agir d’immunogène(s) (ou « challenge(s) ») ou de molécule(s) à visée thérapeutique ;The "stimulus" corresponds to one or more molecules capable of inducing an immune response and making it possible to qualitatively and/or quantitatively assess the individual's immune response; in particular, it may be immunogen(s) (or "challenge(s)") or molecule(s) for therapeutic purposes;
- Déterminer la « capacité d’un individu à répondre à un stimulus » peut avoir plusieurs utilités, aussi bien diagnostique (e.g. identifier le statut immunitaire de l’individu, qui peut être un statut normal, un statut d’inflammation ou un statut d’immunosuppression) que pronostique (e.g. identifier les individus dont le statut immunitaire peut évoluer - par exemple, d’un statut normal vers un statut d’inflammation ou inversement, ou encore les individus qui vont passer d’un statut d’immunosuppression à un statut d’inflammation), afin par exemple d’adapter la prise en charge thérapeutique, ou encore de prédiction et/ou de suivi de l’efficacité de réponse à un traitement ;Determining an individual's "ability to respond to a stimulus" can have many uses, both diagnostic (e.g. identifying the individual's immune status, which can be normal status, inflammatory status, or immunosuppression) than prognostic (e.g. identify individuals whose immune status may evolve - for example, from a normal status to an inflammatory status or vice versa, or even individuals who will go from an immunosuppressed status to an inflammation), in order for example to adapt the therapeutic management, or even to predict and/or monitor the effectiveness of response to a treatment;
- Un « échantillon sanguin » désigne un échantillon de sang total ou un échantillon cellulaire dérivé du sang (i.e. un échantillon obtenu à partir du sang et contenant au moins un type de cellules, tel qu’un échantillon de cellules mononuclées du sang périphérique ou PBMC) ;"Blood Sample" means a whole blood sample or a blood-derived cell sample (i.e. a sample obtained from blood and containing at least one cell type, such as a sample of peripheral blood mononuclear cells or PBMCs) ;
- Un « biomarqueur » ou « marqueur » est une caractéristique biologique mesurable objectivement qui représente un indicateur des processus biologiques normaux ou pathologiques ou de réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique. Il peut s’agir en particulier d’un biomarqueur moléculaire, de préférence détectable au niveau ARNm. Plus particulièrement, le biomarqueur peut être un biomarqueur endogène ou loci (tel qu’un gène ou un HERV /Human Endogenous RetroVirus, qui se retrouvent dans le matériel chromosomique d’un individu) ou un biomarqueur exogène (tel qu’un virus) ;A "biomarker" or "marker" is an objectively measurable biological characteristic that represents an indicator of normal or pathological biological processes or of pharmacological response to a therapeutic intervention. It may in particular be a molecular biomarker, preferably detectable at the mRNA level. More particularly, the biomarker can be an endogenous biomarker or loci (such as a gene or a HERV/ Human Endogenous RetroVirus , which are found in the chromosomal material of an individual) or an exogenous biomarker (such as a virus);
De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1-1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD83, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-1 : ADGRE3, ARL14EP, C3, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CD3D, CD44, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, TGFB1 ;
- Liste S3-1 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, IL7R, CD44, CD74, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.Preferably, in the method as described above, the at least two different biomarkers are chosen respectively from at least two different lists, from the following lists:
- List S1-1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD83, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- List S2-1 : ADGRE3, ARL14EP, C3, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CD3D, CD44, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, TGFB1;
- List S3-1 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, IL7R, CD44, CD74, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
De préférence encore, dans le procédé tel que décrit précédemment, les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1-2 : CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD44, CD83, CXCL2, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-2 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, DYRK2, IFITM1, TGFB1 ;
- Liste S3-2 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, IL2, SLAMF7.Preferably again, in the method as described above, the at least two different biomarkers are chosen respectively from at least two different lists, from the following lists:
- List S1-2 : CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD44, CD83, CXCL2, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- List S2-2 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, DYRK2, IFITM1, TGFB1;
- List S3-2 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, IL2, SLAMF7.
De manière encore plus préférée, dans le procédé tel que décrit précédemment, les au moins deux biomarqueurs différents sont choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1-3 : IFNG, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-3 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, CDKN1A, CX3CR1, IFITM1, TGFB1 ;
- Liste S3-3 : 121601901-HERV0116, CCR1, EIF2AK4, HLA-DPA1, IL2.Even more preferably, in the method as described above, the at least two different biomarkers are chosen respectively from at least two different lists, from the following lists:
- List S1-3 : IFNG, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- List S2-3 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, CDKN1A, CX3CR1, IFITM1, TGFB1;
- List S3-3 : 121601901-HERV0116, CCR1, EIF2AK4, HLA-DPA1, IL2.
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment est un procédéin vitroouex vivopour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence pour déterminer la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus, comprenant :
a) Une étape d’incubation d’un échantillon sanguin dudit individu avec ledit stimulus, et
b) Une étape de mesure de l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a), d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans :
- La Liste S1, la Liste S2 et la Liste S3 ;
- La Liste S1-1, la Liste S2-1 et la Liste S3-1 ;
- La Liste S1-2, la Liste S2-2 et la Liste S3-2 ; ou
- La Liste S1-3, la Liste S2-3 et la Liste S3-3.Preferably, the method as described above is an in vitro or ex vivo method for determining the ability of an individual to respond to a stimulus, preferably for determining the ability of an individual's immune system to respond to a stimulus, including:
a) A step of incubating a blood sample from said individual with said stimulus, and
b) A step for measuring the expression, from the stimulated blood sample resulting from step a), of at least three different biomarkers, chosen respectively from:
- List S1, List S2 and List S3;
- List S1-1, List S2-1 and List S3-1;
- List S1-2, List S2-2 and List S3-2; Or
- List S1-3, List S2-3 and List S3-3.
De préférence encore, dans l’étape b) ci-dessus, on mesure l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a) :
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45, au moins 46 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1, S2 et S3 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, auPreferably again, in step b) above, the expression is measured, from the stimulated blood sample resulting from step a):
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least at least 28, at least 29, at least 30, at least 31, at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37, at least 38, at least 39, at least 40 , at least 41, at least 42, at least 43, at least 44, at least 45, at least 46 different biomarkers selected from each of Lists S1, S2 and S3;
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least at least 28, at least 29, at least 30, at least 31, at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37, at least 38, at least 39, at least 40 , at least 41, at least 42, at least 43, at least 44, at least 45 different biomarkers selected from each of Lists S1-1, S2-1 and S3-1;
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at
moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-3, S2-3 et S3-3.at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29 , at least 30, at least 31, at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37, at least 38 different biomarkers selected from each of Lists S1-2, S2-2 and S3-2; Or
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21 different biomarkers selected from each of Lists S1-3, S2-3 and S3-3.
Les combinaisons de deux et trois biomarqueurs particulièrement préférées, pour être utilisées dans le cadre du procédé tel que décrit précédemment, sont divulguées dans le Tableau 2.Particularly preferred two- and three-biomarker combinations for use in the method as described above are disclosed in Table 2.
Tableau 2. Combinaisons préférées de deux et trois biomarqueursTable 2. Preferred combinations of two and three biomarkers
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, est appliqué à un échantillon sanguin provenant d’un patient, de préférence un patient à l’hôpital, de préférence encore un patient au sein du service des urgences, d’un service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus, de manière encore plus préférée un patient atteint de traumatismes (de préférence, de traumatismes graves), de brûlures (de préférence, de brûlure graves), ayant reçu une chirurgie (notamment, une chirurgie lourde) ou en état septique, et de manière tout particulièrement préférée un patient en choc septique. Par patient en état septique (ou patient atteint de sepsis), on entend un patient présentant au moins une défaillance d’organe menaçant le pronostic vital et causée par une réponse inappropriée de l’hôte à une infection. Par choc septique, on entend un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat.Preferably, the method as described above, in all its embodiments, is applied to a blood sample from a patient, preferably a patient in the hospital, more preferably a patient in the emergency department, of an intensive care unit, intensive care unit or continuous care unit, even more preferably a patient suffering from trauma (preferably, severe trauma), burns (preferably, severe burn), having received surgery (in particular major surgery) or in a septic state, and very particularly preferably a patient in septic shock. A sepsis patient (or sepsis patient) is defined as a patient with at least one life-threatening organ failure caused by an inappropriate host response to an infection. By septic shock is meant a subtype of sepsis, in which hypotension persists, despite adequate vascular filling.
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, est appliqué à un échantillon sanguin contenant des leucocytes. L’échantillon sanguin peut par exemple être un échantillon de cellules mononuclées du sang périphérique (ou PBMC,Peripheral Blood Mononuclear Cells), qui est constitué des lymphocytes (B, T et cellules NK), des cellules dendritiques et des monocytes, et qui est généralement obtenu par la méthode Ficoll, bien connue de l’homme du métier. Cependant, de manière particulièrement avantageuse, on préfèrera utiliser directement un échantillon de sang total (c’est-à-dire contenant l’ensemble des leucocytes, érythrocytes, plaquettes et le plasma), tel que collecté par la voie veineuse (par exemple en utilisant des tubes contenant un anticoagulant), afin de minimiser les manipulations de l’échantillon et de préserver les interactions cellulaires physiologiques entre les différentes populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire, et de mieux refléter la complexité des réponses immunitaires innées et adaptatives chez l’individu. En particulier, alors que les PBMC ne contiennent que les cellules mononuclées, le sang total contient également des granulocytes (ou polynucléaires). Il est également particulièrement avantageux d’utiliser des systèmes permettant une standardisation des procédures ; en particulier, on pourra utiliser des systèmes de culture semi-fermés (e.g. des tubes) pré-remplis avec le milieu de culture et le stimulus d’intérêt, qui sont standardisés, e.g. qui contiennent un stimulus bien défini (i.e. sans variabilité inter-lots au niveau de la production du stimulus, quant à sa nature/sa composition) et/ou chargé en « batch », de manière à contrôler la quantité de stimulus dans le tube et avoir une reproductibilité de tube à tube. De préférence, ces tubes peuvent également permettre la collecte de l’échantillon de sang (ce qui permet de stimuler les cellules au moment de la collecte), et de préférence encore, ils permettent la collecte d’un volume précis de sang. On peut citer à titre d’exemple de systèmes standardisés les tubes TruCulture®.Preferably, the method as described previously, in all its embodiments, is applied to a blood sample containing leukocytes. The blood sample can for example be a sample of peripheral blood mononuclear cells (or PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells ), which consists of lymphocytes (B, T and NK cells), dendritic cells and monocytes, and which is generally obtained by the Ficoll method, well known to those skilled in the art. However, in a particularly advantageous manner, it will be preferred to use directly a whole blood sample (that is to say containing all the leukocytes, erythrocytes, platelets and plasma), as collected by the venous route (for example in using tubes containing an anticoagulant), in order to minimize manipulations of the sample and to preserve the physiological cellular interactions between the different cell populations involved in the immune response, and to better reflect the complexity of the innate and adaptive immune responses in the individual. In particular, while PBMCs only contain mononuclear cells, whole blood also contains granulocytes (or polymorphonuclear cells). It is also particularly advantageous to use systems allowing standardization of procedures; in particular, it is possible to use semi-closed culture systems (eg tubes) pre-filled with the culture medium and the stimulus of interest, which are standardized, eg which contain a well-defined stimulus (ie without inter- batches at the level of the production of the stimulus, as to its nature/composition) and/or loaded in "batch", so as to control the quantity of stimulus in the tube and to have tube-to-tube reproducibility. Preferably, these tubes can also allow the collection of the blood sample (which makes it possible to stimulate the cells at the time of collection), and more preferably, they allow the collection of a precise volume of blood. One example of standardized systems is the TruCulture® tubes.
Le prélèvement de l’échantillon sanguin peut avoir été réalisé à la demande du médecin, par exemple pour savoir si un individu va répondre à une injection vaccinale. Le prélèvement peut également avoir été réalisé à l’admission ou au décours de l’évolution du patient ; notamment, pour des patients atteints de sepsis ou des patients atteints de traumatismes, le prélèvement peut en particulier avoir été réalisé lors de la première semaine (e.g. de J3 à J7, et notamment à J3/4) après l’agression (i.e. le sepsis ou le traumatisme) ou après le choc septique (en particulier, lorsque le patient a besoin de vasopresseurs et que son lactate dépasse les 2 mmol/L).The blood sample may have been taken at the doctor's request, for example to find out if an individual will respond to a vaccine injection. The sample may also have been taken on admission or during the evolution of the patient; in particular, for patients suffering from sepsis or patients suffering from trauma, the sample may in particular have been taken during the first week (e.g. from D3 to D7, and in particular at D3/4) after the aggression (i.e. the sepsis or trauma) or after septic shock (especially when the patient needs vasopressors and his lactate exceeds 2 mmol/L).
Dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l’étape d’incubation de l’échantillon sanguin de l’individu avec le stimulus peut être réalisée à différentes températures (préférentiellement à 37°C) et à différents temps d’incubation (préférentiellement entre 1h et 48h d’incubation ; par exemple avec une incubation d’1h ou moins, de 2h ou moins, de 4h ou moins, de 12h ou moins, de 24h ou moins, ou de 48h ou moins). Des temps d’incubation courts sont particulièrement avantageux pour la mise en œuvre du test en clinique.In the method as described above, in all its embodiments, the step of incubating the blood sample of the individual with the stimulus can be carried out at different temperatures (preferably at 37° C.) and at different times. incubation (preferably between 1h and 48h incubation; for example with an incubation of 1h or less, 2h or less, 4h or less, 12h or less, 24h or less, or 48h or less) . Short incubation times are particularly advantageous for the implementation of the test in the clinic.
Le stimulus utilisé dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, peut être de différentes natures.The stimulus used in the method as described previously, in all its embodiments, can be of different natures.
Selon un mode de réalisation, le stimulus peut comprendre une (ou plusieurs) molécule(s) de type immunogène(s). Dans ce mode de réalisation, le procédé est particulièrement utile pour déterminer un diagnostic (en particulier concernant le statut immunitaire de l’individu), un pronostic (en particulier concernant l’évolution du statut immunitaire de l’individu), et/ou adapter la prise en charge thérapeutique dudit individu.According to one embodiment, the stimulus may comprise one (or more) molecule(s) of the immunogenic type(s). In this embodiment, the method is particularly useful for determining a diagnosis (in particular relating to the immune status of the individual), a prognosis (in particular relating to the evolution of the immune status of the individual), and/or adapting the therapeutic care of said individual.
Le stimulus de type immunogène peut par exemple comprendre une (des) molécule(s) capable(s) de lier au moins un type de cellule de l’immunité innée (comme une cellule présentatrice d’antigène, e.g. un monocyte, un macrophage, ou une cellule dendritique), d’une part, et au moins un type de cellule de l’immunité adaptative (comme un lymphocyte T ou un lymphocyte B), d’autre part ; de préférence, ce stimulus comprend une molécule de type superantigène ou une molécule analogue à un superantigène. Les superantigènes sont des toxines de nature protéique, capables de stimuler un grand nombre de lymphocytes T, par l’intermédiaire de leur liaison simultanée à la chaîne β du domaine variable (Vβ) d’un récepteur des cellules Tviala région hypervariable CDR4, et à une molécule du CMH II (complexe majeur d’histocompatibilité de classe II), présente en surface d’une cellule présentatrice d’antigène (CPA). L’interaction forcée qui s’établit entre la cellule présentatrice d’antigène portant le CMH et les lymphocytes T dont le récepteur des cellules T porte le segment Vβ, provoque une activation polyclonale de ces lymphocytes T, indépendamment de leur spécificité pour l’antigène peptidique présenté. Lorsqu’un stimulus comprenant une molécule de type superantigène est utilisé, l’échantillon sanguin utilisé dans le procédé selon l’invention, contient des lymphocytes T et des cellules présentatrices d’antigène. Parmi les superantigènes plus particulièrement d’intérêt, on peut notamment citer les superantigènes produits par les espèces staphylococciques et les superantigènes produits par les espèces streptococciques. De préférence, le stimulus comprend au moins une molécule choisie parmi SEB (Staphylococcal Enterotoxin B) et SEA (Staphylococcal Enterotoxin A). Parmi les molécules analogues à un superantigène, on peut par exemple citer des anticorps bispécifiques, capables de se lier d’une part à un lymphocyte T, et d’autre part à une cellule présentatrice d’antigène (comme, par exemple, des anticorps capables de se lier d’une part au Vβsur les lymphocytes T, et, d’autre part à une molécule du CMHII ou à un récepteur de type TLR, sur les cellules présentatrices d’antigène).The immunogenic-type stimulus may for example comprise one or more molecules capable of binding at least one type of innate immunity cell (such as an antigen-presenting cell, eg a monocyte, a macrophage, or a dendritic cell), on the one hand, and at least one type of adaptive immunity cell (such as a T lymphocyte or a B lymphocyte), on the other hand; preferably, this stimulus comprises a superantigen-like molecule or a superantigen-like molecule. Superantigens are toxins of a protein nature, capable of stimulating a large number of T lymphocytes, through their simultaneous binding to the β chain of the variable domain (V β ) of a T cell receptor via the hypervariable region CDR4 , and to an MHC II molecule (class II major histocompatibility complex), present on the surface of an antigen-presenting cell (APC). The forced interaction that is established between the antigen-presenting cell carrying the MHC and the T lymphocytes whose T cell receptor carries the V β segment, causes a polyclonal activation of these T lymphocytes, independently of their specificity for the peptide antigen presented. When a stimulus comprising a molecule of the superantigen type is used, the blood sample used in the method according to the invention contains T lymphocytes and antigen-presenting cells. Among the superantigens of more particular interest, mention may in particular be made of the superantigens produced by staphylococcal species and the superantigens produced by streptococcal species. Preferably, the stimulus comprises at least one molecule chosen from SEB ( Staphylococcal Enterotoxin B ) and SEA ( Staphylococcal Enterotoxin A ). Among the molecules analogous to a superantigen, mention may be made, for example, of bispecific antibodies, capable of binding on the one hand to a T lymphocyte, and on the other hand to an antigen-presenting cell (such as, for example, antibodies capable of binding on the one hand to V β on T lymphocytes, and on the other hand to a CMHII molecule or to a TLR-type receptor, on antigen-presenting cells).
Il peut également s’agir d’un stimulus qui active directement les lymphocytes T, qui est de préférence choisi parmi des anticorps reconnaissant et activant un récepteur à la surface du lymphocyte T de manière à déclencher un signal d’activation au niveau du lymphocyte T, de préférence encore ces anticorps étant associés physiquement et/ou chimiquement entre eux, de préférence encore par couplage sur polymères, par couplage sur billes ou par couplage entre eux. Il peut par exemple s’agir d’anticorps anti-CD3 (tel que le Muromonab-CD3, commercialisé sous le nom Orthoclone OKT3), de préférence associés avec des anticorps anti-CD28, anti-CD2 et/ou anti-CD137/TNFRSF9.It can also be a stimulus which directly activates the T lymphocytes, which is preferably chosen from antibodies recognizing and activating a receptor on the surface of the T lymphocyte so as to trigger an activation signal at the level of the T lymphocyte , more preferably these antibodies being associated physically and/or chemically with each other, more preferably still by coupling on polymers, by coupling on beads or by coupling between them. They may for example be anti-CD3 antibodies (such as Muromonab-CD3, marketed under the name Orthoclone OKT3), preferably associated with anti-CD28, anti-CD2 and/or anti-CD137/TNFRSF9 antibodies. .
Il peut encore s’agir d’un stimulus de type imidazoquinolines, analogues structuraux d’un nucléoside, comportant un anneau dans leur structure, de bas poids moléculaire. Ce type de stimulus produitin vivodes effets antiviraux et antitumoraux. On peut citer à titre d’exemple de stimulus de type imidazoquinoline, le Resiquimod (R848), qui se lie au TLR7 et au TLR8 humains sur des cellules dendritiques, ou plus généralement sur des cellules présentatrices d'antigène, ou CPA (réponse NF-KB dépendante). Des effets directs sur les lymphocytes T ont également été décrits (Smits et al (2008), Oncologist 13(8) : 859-875).It may also be a stimulus of the imidazoquinolin type, structural analogues of a nucleoside, comprising a ring in their structure, of low molecular weight. This type of stimulus produces in vivo antiviral and antitumor effects. An example of an imidazoquinoline-type stimulus, Resiquimod (R848), which binds to human TLR7 and TLR8 on dendritic cells, or more generally on antigen-presenting cells, or APC (NF response -KB dependent). Direct effects on T lymphocytes have also been described (Smits et al (2008), Oncologist 13(8): 859-875).
Selon un autre mode de réalisation, le stimulus peut comprendre, de préférence consister essentiellement en, de préférence encore consister en, une molécule à visée thérapeutique (en particulier, un médicament ou un candidat médicament), et plus préférentiellement une molécule ayant un effet immunomodulateur (en particulier, une molécule ayant un effet immunostimulant ou anti-inflammatoire). On peut citer à titre d’exemples l’IL-7 ou l’interféron γ. Dans ce mode de réalisation, le procédé est particulièrement utile pour prédire et/ou suivre l’efficacité de réponse à ladite molécule à visée thérapeutique.According to another embodiment, the stimulus may comprise, preferably consist essentially of, more preferably consist of, a molecule for therapeutic purposes (in particular, a drug or a drug candidate), and more preferably a molecule having an immunomodulatory effect (in particular, a molecule having an immunostimulant or anti-inflammatory effect). Examples include IL-7 or interferon γ. In this embodiment, the method is particularly useful for predicting and/or monitoring the efficacy of response to said molecule for therapeutic purposes.
La mesure de l’expression (ou du niveau d’expression) d’un biomarqueur consiste à quantifier au moins un produit d'expression de ce biomarqueur. Le produit d’expression d’un biomarqueur au sens de l’invention est toute molécule biologique issue de l’expression de ce biomarqueur. Plus particulièrement, le produit d’expression d’un biomarqueur peut être un transcrit ARN. Par « transcrit », on entend les ARN, et en particulier les ARN messagers (ARNm), issus de la transcription du biomarqueur. Plus précisément, les transcrits sont les ARN produits par la transcription d’un gène suivi des modifications post-transcriptionnelles des formes pré-ARN.Measuring the expression (or level of expression) of a biomarker consists in quantifying at least one expression product of this biomarker. The expression product of a biomarker within the meaning of the invention is any biological molecule resulting from the expression of this biomarker. More particularly, the expression product of a biomarker can be an RNA transcript. By "transcript", we mean RNAs, and in particular messenger RNAs (mRNAs), resulting from the transcription of the biomarker. More specifically, transcripts are RNAs produced by the transcription of a gene followed by post-transcriptional modifications of pre-RNA forms.
Ainsi, de préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l’expression des biomarqueurs est mesurée au niveau transcrit ARN ou ARNm. Dans le cadre de la présente invention, la mesure du niveau d’expression d’un ou plusieurs transcrits ARN du même biomarqueur peut être effectuée. La détermination de la quantité de plusieurs transcrits peut être mise en œuvre séquentiellement ou simultanément, selon des procédés bien connus de l’homme du métier. La détection d’un transcrit ARNm peut être réalisée par une méthode directe, par tout procédé connu de l’homme du métier permettant de déterminer la présence dudit transcrit dans l’échantillon, ou par détection indirecte du transcrit après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit en ADN. De nombreuses méthodes existent pour la détection des acides nucléiques (voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ; Relier G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249). L’expression des biomarqueurs peut notamment être mesurée parReverse Transcription-Polymerase Chain Reactionou RT-PCR, de préférence par RT-PCR quantitative ou RT-qPCR (par exemple en utilisant la technologie FilmArray®), par séquençage (de préférence par séquençage haut débit) ou par des techniques d’hybridation (par exemple avec des micropuces d’hybridation ou par des techniques du type NanoString® nCounter®). Les techniques permettant le multiplexage (comme le FilmArray® ou le NanoString® nCounter®) sont préférées.Thus, preferably, in the method as described previously, in all its embodiments, the expression of the biomarkers is measured at the RNA or mRNA transcript level. In the context of the present invention, the measurement of the level of expression of one or more RNA transcripts of the same biomarker can be carried out. The determination of the quantity of several transcripts can be implemented sequentially or simultaneously, according to methods well known to those skilled in the art. The detection of an mRNA transcript can be carried out by a direct method, by any method known to those skilled in the art making it possible to determine the presence of said transcript in the sample, or by indirect detection of the transcript after transformation of the latter into DNA. , or after amplification of said transcript or after amplification of the DNA obtained after transformation of said transcript into DNA. Many methods exist for the detection of nucleic acids (see for example Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458; Relier GH et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 and 6, p.173-249). The expression of the biomarkers can in particular be measured by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction or RT-PCR, preferably by quantitative RT-PCR or RT-qPCR (for example using FilmArray® technology), by sequencing (preferably by sequencing high throughput) or by hybridization techniques (for example with hybridization microchips or by techniques of the NanoString® nCounter® type). Techniques allowing multiplexing (such as FilmArray® or NanoString® nCounter®) are preferred.
Dans le cadre de la présente invention, la mesure du niveau d’expression permet de déterminer la quantité d’un ou plusieurs transcrits présents dans l’échantillon testé ou d’en donner une valeur dérivée. Une valeur dérivée de la quantité peut par exemple être la concentration absolue, calculée grâce à une courbe de calibration obtenue à partir de dilutions successives d’une solution d’amplicons de concentration connue. Elle peut également correspondre à la valeur de la quantité normalisée et calibrée, comme le CNRQ (Calibrated Normalized Relative Quantity, (Hellemans et al (2007), Genome biology 8(2):R19)), qui intègre les valeurs d’un échantillon de référence, d’un calibrateur et d’un ou plusieurs gènes de ménage (appelés également gènes de référence). A titre d’exemples de gène de référence, on peut citer les gènes PPIB, PPIA, GLYR1, RANBP3, HPRT1, 18S, GAPDH, RPLP0 et ACTB.In the context of the present invention, the measurement of the level of expression makes it possible to determine the quantity of one or more transcripts present in the sample tested or to give a derived value therefrom. A value derived from the quantity can for example be the absolute concentration, calculated using a calibration curve obtained from successive dilutions of a solution of amplicons of known concentration. It can also correspond to the value of the normalized and calibrated quantity, such as the CNRQ ( Calibrated Normalized Relative Quantity , (Hellemans et al (2007), Genome biology 8(2):R19)), which integrates the values of a sample reference, a calibrator and one or more housekeeping genes (also called reference genes). As examples of a reference gene, mention may be made of the PPIB, PPIA, GLYR1, RANBP3, HPRT1, 18S, GAPDH, RPLP0 and ACTB genes.
De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l’expression des biomarqueurs est normalisée par rapport à l’expression d’un ou plusieurs des gènes de référence suivants : HPRT1, DECR1 et TBP ; en particulier, on peut utiliser pour la normalisation la moyenne géométrique des 3 gènes HPRT1, DECR1 et TBP. Preferably, in the method as previously described, in all its embodiments, the expression of the biomarkers is normalized with respect to the expression of one or more of the following reference genes: HPRT1, DECR1 and TBP; in particular, the geometric mean of the 3 genes HPRT1, DECR1 and TBP can be used for normalization.
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, peut comprendre également une étape de mesure de l’expression, à partir d’un échantillon sanguin contrôle sans stimulation (c’est-à-dire l’échantillon sanguin incubé dans les mêmes conditions que l’échantillon sanguin stimulé, mais en l’absence de stimulus), des mêmes biomarqueurs que ceux mesurés à partir de l’échantillon sanguin stimulé. De préférence encore, le procédé comprend une étape de calcul des ratios de l’expression (préférentiellement, l’expression normalisée) de chaque biomarqueur dans l’échantillon sanguin stimulé, par rapport à l’expression (préférentiellement, l’expression normalisée), du même biomarqueur dans l’échantillon sanguin contrôle. De manière encore plus préférée, le procédé comprend une étape de transformation des ratios obtenus par une transformation logarithmique de base 10, et éventuellement des étapes de transformation en variables centrées réduites.Preferably, the method as described above, in all its embodiments, can also comprise a step of measuring the expression, from a control blood sample without stimulation (that is to say the sample blood incubated under the same conditions as the stimulated blood sample, but in the absence of stimulus), of the same biomarkers as those measured from the stimulated blood sample. Preferably again, the method comprises a step of calculating the ratios of the expression (preferably, the normalized expression) of each biomarker in the stimulated blood sample, relative to the expression (preferably, the normalized expression), of the same biomarker in the control blood sample. Even more preferably, the method comprises a step of transforming the ratios obtained by a base 10 logarithmic transformation, and possibly steps of transforming into reduced centered variables.
L’invention a également pour objet un kit comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi :
- les Listes S1, S2 et S3 ;
- les Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- les Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- les Listes S1-3, S2-3 et S3-3 ;
de préférence comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes :
- Listes S1, S2 et S3 ;
- Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- Listes S1-3, S2-3 et S3-3 ;
de préférence encore comprenant des moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) :
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45, au moins 46 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1, S2 et S3 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38, au moins 39, au moins 40, au moins 41, au moins 42, au moins 43, au moins 44, au moins 45 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-1, S2-1 et S3-1 ;
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, au moins 36, au moins 37, au moins 38 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-2, S2-2 et S3-2 ; ou
- d’au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21 biomarqueurs différents choisis dans chacune des Listes S1-3, S2-3 et S3-3 ;
- ledit kit étant caractérisé en ce que l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 (de préférence au plus 90, de préférence au plus 80, de préférence au plus 70, de préférence au plus 60, de préférence au plus 50, de préférence au plus 40, de préférence au plus 30, de préférence au plus 20, de préférence au plus 10, de préférence, au plus 5) biomarqueurs, au total.The invention also relates to a kit comprising means for amplifying and/or detecting (preferably primers and/or probes) at least two different biomarkers, chosen respectively from at least two different lists from:
- Lists S1, S2 and S3;
- Lists S1-1, S2-1 and S3-1;
- Lists S1-2, S2-2 and S3-2; Or
- Lists S1-3, S2-3 and S3-3;
preferably comprising means for amplifying and/or detecting (preferably primers and/or probes) at least three different biomarkers, chosen respectively from each of the three lists:
- Lists S1, S2 and S3;
- Lists S1-1, S2-1 and S3-1;
- Lists S1-2, S2-2 and S3-2; Or
- Lists S1-3, S2-3 and S3-3;
more preferably comprising amplification and/or detection means (preferably primers and/or probes):
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least at least 28, at least 29, at least 30, at least 31, at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37, at least 38, at least 39, at least 40 , at least 41, at least 42, at least 43, at least 44, at least 45, at least 46 different biomarkers selected from each of Lists S1, S2 and S3;
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least at least 28, at least 29, at least 30, at least 31, at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37, at least 38, at least 39, at least 40 , at least 41, at least 42, at least 43, at least 44, at least 45 different biomarkers selected from each of Lists S1-1, S2-1 and S3-1;
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least at least 28, at least 29, at least 30, at least 31, at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37, at least 38 different biomarkers chosen from each of Lists S1 -2, S2-2 and S3-2; Or
- at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 , at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21 different biomarkers selected from each of Lists S1-3, S2-3 and S3-3;
- said kit being characterized in that all of the amplification and/or detection means of said kit allow the detection and/or amplification of at most 100 (preferably at most 90, preferably at most 80, preferably at most 70, preferably at most 60, preferably at most 50, preferably at most 40, preferably at most 30, preferably at most 20, preferably at most 10, preferably at most 5) biomarkers , in total.
Ainsi, ledit kit peut par exemple comprendre également des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage. Le kit peut également comprendre des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation.Thus, said kit may for example also comprise means for amplifying and/or detecting one or more housekeeping genes. The kit can also include positive control means to qualify the quality of the RNA extraction, the quality of any amplification and/or hybridization process.
On entend par « amorce » ou « amorce d'amplification », un fragment nucléotidique pouvant être constitué de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d’amorces », constitués de deux amorces. Lorsque l’on souhaite réaliser l’amplication de plusieurs biomarqueurs (e.g des gènes) différents, plusieurs couples d’amorces différents sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s’hybrider spécifiquement avec un biomarqueur différent.The term "primer" or "amplification primer" is understood to mean a nucleotide fragment which may consist of 5 to 100 nucleotides, preferably of 15 to 30 nucleotides, and possessing a hybridization specificity with a target nucleotide sequence, under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction of the target nucleotide sequence. Typically, "primer pairs" are used, consisting of two primers. When it is desired to carry out the amplification of several different biomarkers (e.g. genes), several different pairs of primers are preferably used, each preferably having the ability to hybridize specifically with a different biomarker.
On entend par « sonde » ou « sonde d’hybridation », un fragment nucléotidique constitué typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu’un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l’on souhaite cibler plusieurs biomarqueurs (e.g. des gènes) différents, plusieurs sondes différentes sont de préférence utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s’hybrider spécifiquement avec un biomarqueur différent.The term “probe” or “hybridization probe” is understood to mean a nucleotide fragment typically consisting of 5 to 100 nucleotides, preferably 15 to 90 nucleotides, even more preferably 15 to 35 nucleotides, possessing a hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide sequence. The probe also includes a reporter (such as a fluorophore, an enzyme or any other detection system), which will allow the detection of the target nucleotide sequence. In the present invention, the target nucleotide sequence can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA (mRNA) or a nucleotide sequence included in a complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription of said mRNA. When it is desired to target several different biomarkers (e.g. genes), several different probes are preferably used, each preferably having the ability to hybridize specifically with a different biomarker.
Par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.By "hybridization" is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as for example a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences, are capable of forming a double strand with stable and specific hydrogen bonds. A nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment capable of hybridizing with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in a known manner. The hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. The hybridization is all the more specific as it is carried out at higher stringency. Stringency is defined in particular according to the base composition of a probe/target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids. The stringency can also be a function of the reaction parameters, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and/or the hybridization temperature. The stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will mainly depend on the hybridization probes used. All of these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art. In general, depending on the length of the hybridization probes used, the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 70°C, in particular between 35 and 65°C in a saline solution at a concentration of about 0 .5 to 1 M. A step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
Par « réaction d'amplification enzymatique », on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491, et LAMP (Loop mediated isothermal amplification) avec le brevet US6410278. Lorsque la réaction d’amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l’étape d’amplification est précédée d’une étape de réverse-transcription d’ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.By “enzymatic amplification reaction”, is meant a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment, by the action of at least one enzyme. Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and the following techniques may be mentioned in particular: PCR ( Polymerase Chain Reaction ), LCR ( Ligase Chain Reaction ), RCR ( Repair Chain Reaction ), 3SR ( Self Sustained Sequence Replication ) with patent application WO-A-90/06995, NASBA ( Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ), TMA ( Transcription Mediated Amplification ) with patent US-A-5,399,491, and LAMP ( Loop mediated isothermal amplification ) with patent US6410278. When the enzymatic amplification reaction is a PCR, we will speak more particularly of RT-PCR (RT for " reverse transcription "), when the amplification step is preceded by a step of reverse-transcription of messenger RNA ( mRNA) to complementary DNA (cDNA), and qPCR or RT-qPCR when the PCR is quantitative.
L’invention a également pour objet l’utilisation :
- de moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) tels que décrits précédemment dans le kit selon l’invention, dans tous ses modes de réalisation ; de préférence, de moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi les listes S1 à S3 (ou S1-1 à S3-1, ou S1-2 à S3-2, ou S1-3 à S3-3), de préférence encore des moyens d’amplification et/ou de détection d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes S1 à S3 (ou S1-1 à S3-1, ou S1-2 à S3-2, ou S1-3 à S3-3)), ou
- d’un kit comprenant de tels moyens d’amplification et/ou de détection, de préférence l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 (de préférence au plus 90, de préférence au plus 80, de préférence au plus 70, de préférence au plus 60, de préférence au plus 50, de préférence au plus 40, de préférence au plus 30, de préférence au plus 20, de préférence au plus 10, de préférence au plus 5) biomarqueurs, au total, et optionnellement ledit kit comprend des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage et/ou des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation,
pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus.The invention also relates to the use:
- amplification and/or detection means (preferably primers and/or probes) as described previously in the kit according to the invention, in all its embodiments; preferably, means for amplifying and/or detecting (preferably primers and/or probes) at least two different biomarkers, chosen respectively from at least two different lists among lists S1 to S3 (or S1- 1 to S3-1, or S1-2 to S3-2, or S1-3 to S3-3), more preferably means for amplifying and/or detecting at least three different biomarkers, chosen respectively from each of the three lists S1 to S3 (or S1-1 to S3-1, or S1-2 to S3-2, or S1-3 to S3-3)), or
- a kit comprising such amplification and/or detection means, preferably all of the amplification and/or detection means of said kit allow the detection and/or amplification of at most 100 ( preferably at most 90, preferably at most 80, preferably at most 70, preferably at most 60, preferably at most 50, preferably at most 40, preferably at most 30, preferably at most 20, preferably at most 10, preferably at most 5) biomarkers, in total, and optionally said kit comprises means for amplifying and/or detecting one or more housekeeping genes and/or positive control means making it possible to qualify the quality of RNA extraction, the quality of any amplification and/or hybridization process,
to determine an individual's ability to respond to a stimulus, preferably the ability of an individual's immune system to respond to a stimulus.
Figurestricks
La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.The present invention is illustrated without limitation by the following examples.
ExemplesExamples
Matériels et MéthodesMaterials and methods
Population d’individus testésPopulation of individuals tested
L’étude clinique a été approuvée par le comité régional d’éthique (Comité de Protection des Personnes Sud-Est II, numéro 11236), et enregistrée auprès du ministère Français de la Recherche (Ministère de lʼEnseignement supérieur, de la Recherche et de lʼInnovation ; DC-2008-509) et de la Commission nationale de la protection des données (Commission Nationale de l’Informatique et des Libertés). Cette étude a été menée sur des patients en choc septique admis à l’unité de soins intensifs de l’hôpital Edouard Herriot (Hospices Civils de Lyon, Lyon, France) et fait partie d’une étude plus vaste portant sur les dysfonctionnements immunitaires liés à l’unité de soins intensifs (NCT02803346).The clinical study was approved by the regional ethics committee (Comité de Protection des Hommes Sud-Est II, number 11236), and registered with the French Ministry of Research (Ministry of Higher Education, Research and Innovation ; DC-2008-509) and the National Data Protection Commission (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés). This study was conducted on patients with septic shock admitted to the intensive care unit of the Edouard Herriot Hospital (Hospices Civils de Lyon, Lyon, France) and is part of a larger study looking at immune dysfunctions related in the intensive care unit (NCT02803346).
Les patients en choc septique ont été inclus de manière prospective. Le choc septique a été défini selon le consensus Sepsis-3 de la Société de Médecine de Soins Critiques et de la Société Européenne de Médecine de Soins intensifs (Singer et al (2016), JAMA 315:801-10) : patients nécessitant l’administration de vasopresseur et ayant une mesure de la concentration en lactate sérique supérieure à 2 mmol/L en l’absence d’hypovolémie chez un patient ayant une infection, ou suspecté d’avoir une infection (i.e. critères qui définissent l’entrée en choc septique chez un patient ayant un sepsis). Les critères d’exclusion étaient un âge inférieur à 18 ans et la présence d’une aplasie ou d’une maladie immunosuppressive connue. Au moment de l’admission, les données recueillies incluaient les caractéristiques démographiques (âge, sexe) et le site d’infection primaire ; la sévérité initiale a été évaluée par l’indice de gravité simplifié (IGS II ; gamme de valeurs : 0-163) à l’admission. Les informations concernant le décès au cours du séjour en unité de soins intensifs ont été recueillies, et la sévérité 24 heures après l’admission a été évaluée par le score d’évaluation séquentielle des défaillances d’organes (SOFA) (gamme de valeurs: 0-24). Des données de laboratoire au cours du suivi ont également été recueillies, y compris les valeurs de HLA-DR des monocytes (mHLA-DR), ainsi que la mesure de la sécrétion de protéine TNFα après stimulation par le LPS.Patients with septic shock were included prospectively. Septic shock has been defined according to the Sepsis-3 consensus of the Society for Critical Care Medicine and the European Society for Critical Care Medicine (Singer et al (2016), JAMA 315:801-10): patients requiring administration of a vasopressor and having a measurement of the serum lactate concentration greater than 2 mmol/L in the absence of hypovolemia in a patient having an infection, or suspected of having an infection (i.e. criteria which define the onset of shock septic in a patient with sepsis). The exclusion criteria were an age below 18 years and the presence of aplasia or a known immunosuppressive disease. At admission, data collected included demographic characteristics (age, gender) and site of primary infection; the initial severity was assessed by the simplified severity index (IGS II; range of values: 0-163) on admission. Information regarding death during ICU stay was collected, and severity 24 hours after admission was assessed by Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) score (range of values: 0-24). Laboratory data during follow-up were also collected, including monocyte HLA-DR (mHLA-DR) values, as well as measurement of TNFα protein secretion after LPS stimulation.
Parallèlement, des échantillons de sang provenant d’individus sains (ou volontaires sains) ont été obtenus auprès du service national du sang (Établissement Français du Sang) et utilisés immédiatement.At the same time, blood samples from healthy individuals (or healthy volunteers) were obtained from the national blood service (French Blood Establishment) and used immediately.
Tests fonctionnels immunitairesImmune functional tests
- IncubationIncubation en tubesin tubes TruCultureTruCulture
Du sang total hépariné (1 mL) provenant de patients en choc septique, prélevé aux jours 3-4 après le début du choc septique, ou provenant d’individus sains, a été distribué dans des tubes TruCulture (Myriad Rbm, Austin, Texas, États-Unis) préchauffés, contenant le milieu seul (« échantillon contrôle ») ou le milieu avec SEB (400 ng/mL). Ces tubes ont ensuite été insérés dans un incubateur à bloc sec et maintenus à 37°C pendant 24 heures. Après incubation, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 2 ml de TRI Reagent® LS (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne), agité au vortex pendant 2 minutes et laissé à reposer pendant 10 minutes à température ambiante, avant un stockage à -80°C.Heparinized whole blood (1 mL) from patients in septic shock, collected on days 3-4 after onset of septic shock, or from healthy individuals, was dispensed into TruCulture tubes (Myriad Rbm, Austin, Texas, USA) pre-warmed, containing either medium alone (“control sample”) or medium with SEB (400 ng/mL). These tubes were then inserted into a dry block incubator and maintained at 37°C for 24 hours. After incubation, the cell pellet was resuspended in 2 ml of TRI Reagent® LS (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany), vortexed for 2 minutes and allowed to stand for 10 minutes at room temperature, before storage at room temperature. -80°C.
- Mesure de l’expression de biomarqueursMeasurement of biomarker expression
Pour la manipulation de culot cellulaire de TruCulture et le traitement et la détection de l’ARN, le protocole a été suivi conformément à l’étude d’Urrutia et al (2016), Cell Reports 16, 2777-2791. Les culots cellulaires provenant des stimulations par TruCulture et conservés dans le TRI Reagent® LS (Sigma-Aldrich) ont été décongelés sous agitation. Avant le traitement, les échantillons décongelés ont été centrifugés (à 3000 g pendant 5 minutes à 4°C) pour faire sédimenter les débris cellulaires générés au cours de la lyse au Trizol. Pour l’extraction, un protocole modifié du kit NucleoSpin 96 RNA tissue (Macherey-Nagel Gmbh&Co. KG, Düren, Allemagne) a été suivi en utilisant un système à vide. En bref, 600 µl de lysat clair obtenu par lyse au Trizol ont été transférés dans un tube préchargé de 900 µl d’éthanol à 100%.For TruCulture cell pellet manipulation and RNA processing and detection, the protocol was followed according to Urrutia et al (2016), Cell Reports 16, 2777-2791. The cell pellets originating from the stimulations by TruCulture and preserved in the TRI Reagent® LS (Sigma-Aldrich) were thawed under shaking. Prior to processing, thawed samples were centrifuged (at 3000g for 5 minutes at 4°C) to sediment cellular debris generated during Trizol lysis. For extraction, a modified protocol of the NucleoSpin 96 RNA tissue kit (Macherey-Nagel Gmbh&Co. KG, Düren, Germany) was followed using a vacuum system. Briefly, 600 µl of clear lysate obtained by Trizol lysis was transferred to a tube preloaded with 900 µl of 100% ethanol.
Le mélange a été transféré dans une colonne de silice, puis lavé avec les tampons MW1 et MW2, et l’ARN a été élué en utilisant 30 µL d’eau exempte d’ARNase. La technologie Nanostring a été utilisée pour la détection de l’ARNm d’un panel de 46 biomarqueurs (Tableau 3) – il s’agit d’un essai multiplex basé sur l’hybridation et caractérisé par l’absence d’étape d’amplification ; 300 ng d’ARN ont été hybridés aux sondes à 67°C pendant 18 heures en utilisant un thermocycleur (Biometra, Tprofesssional TRIO, Analytik Jena AG, Jena, Allemagne).The mixture was transferred to a silica column, then washed with buffers MW1 and MW2, and RNA was eluted using 30 µL of RNase-free water. Nanostring technology was used for mRNA detection of a panel of 46 biomarkers (Table 3) – this is a hybridization-based multiplex assay characterized by the absence of a amplification; 300 ng of RNA were hybridized to the probes at 67°C for 18 hours using a thermocycler (Biometra, Tprofesssional TRIO, Analytik Jena AG, Jena, Germany).
Après élimination des sondes en excès, les échantillons ont été chargés dans nCounter Prep Station (NanoString Technologies, Seattle, WA, États-Unis) pour la purification et l’immobilisation sur la surface interne d’une cartouche d’échantillon pendant 2-3 heures. La cartouche d’échantillon a ensuite été transférée et imagée sur l’analyseur numérique nCounter Digital Analyzer (NanoString Technologies) où les codes de couleur ont été comptés et mis en tableau pour les 46 biomarqueurs.After removal of excess probes, samples were loaded into nCounter Prep Station (NanoString Technologies, Seattle, WA, USA) for purification and immobilization on the inner surface of a sample cartridge for 2-3 hours. The sample cartridge was then transferred and imaged on the nCounter Digital Analyzer (NanoString Technologies) where color codes were counted and tabulated for the 46 biomarkers.
Tableau 3. Biomarqueurs cibles utilisés pour le Nanostring® nCounter®, et leur numéro d’accession (ou localisation chromosomique)Table 3. Target biomarkers used for the Nanostring® nCounter®, and their accession number (or chromosomal location)
- Génération de données normaliséesGeneration of normalized data
Chaque échantillon a été analysé dans une réaction multiplexée distincte comportant chacune, 8 sondes négatives et 6 concentrations en série de sondes témoins positives. Une analyse de témoins négatifs a été réalisée pour déterminer le bruit de fond pour chaque échantillon. Les données ont été importées dans le logiciel d’analyse nSolver (version 4.0, NanoString technologies) pour le contrôle de qualité et la normalisation des données.Each sample was analyzed in a separate multiplexed reaction each comprising 8 negative probes and 6 serial concentrations of positive control probes. Negative control analysis was performed to determine background for each sample. Data were imported into nSolver analysis software (version 4.0, NanoString technologies) for quality control and data normalization.
Une première étape de normalisation utilisant des témoins positifs internes a permis de corriger la source de variation potentielle associée à la plate-forme technique. Pour ce faire, nous avons calculé pour tous les échantillons le niveau du bruit de fond moyen comme étant la médiane +3 écarts-types de l’ensemble des six sondes négatives. Chaque échantillon sous le niveau de bruit de fond a été fixé à cette valeur.A first standardization step using internal positive controls corrected for the potential source of variation associated with the technical platform. To do this, we calculated for all samples the level of the average background noise as being the median +3 standard deviations of all six negative probes. Each sample below the background noise level was set to this value.
Ensuite, nous avons calculé pour chaque échantillon la moyenne géométrique des sondes positives. Un facteur d’échelle pour un échantillon était un ratio de la moyenne géométrique de l’échantillon et de la moyenne de toutes les moyennes géométriques. Pour chaque échantillon, nous avons divisé toutes les valeurs des gènes par le facteur d’échelle correspondant.Then, we calculated for each sample the geometric mean of the positive probes. A scale factor for a sample was a ratio of the geometric mean of the sample and the mean of all the geometric means. For each sample, we divided all gene values by the corresponding scaling factor.
Enfin, pour normaliser les différences de quantité d’ARN introduit, nous avons utilisé le même procédé que celui dans la normalisation par des témoins positifs, sauf que les moyennes géométriques ont été calculées pour trois gènes de ménage (HPRT1 (NM_000194.1), DECR1 (NM_001359.1) et TBP (NM_001172085.1)).Finally, to normalize for differences in the amount of RNA introduced, we used the same method as in normalization by positive controls, except that geometric means were calculated for three housekeeping genes (HPRT1 (NM_000194.1), DECR1 (NM_001359.1) and TBP (NM_001172085.1)).
Ces gènes ont été sélectionnés en utilisant la méthode NormFinder, une approche établie pour l’identification de gènes de ménage stables intra- et inter- groupes, à partir des 6 gènes candidats inclus dans le panel de gènes personnalisé. Les résultats sont exprimés en ratio d’expression (ou « fold change »). Un tube TruCulture contenant du SEB n’a pas passé le contrôle de qualité et n’a pas été inclus dans l’analyse.These genes were selected using the NormFinder method, an established approach for the identification of stable intra- and inter-group housekeeping genes, from the 6 candidate genes included in the custom gene panel. The results are expressed as an expression ratio (or "fold change"). A TruCulture tube containing SEB failed quality control and was not included in the analysis.
- Mesure de l’expression de mHLA-DR par cytométrie en fluxMeasurement of mHLA-DR expression by flow cytometry
L’expression de HLA-DR à la surface des monocytes circulants (mHLA-DR) des patients a été évaluée aux jours 3-4 après le début du choc septique, sur du sang total périphérique prélevé dans des tubes EDTA, par cytométrie en flux (NAVIOS ; Beckman-Coulter, Brea, CA, États-Unis). Les résultats sont exprimés en nombre d’anticorps liés par cellule (Ab/C).The expression of HLA-DR on the surface of circulating monocytes (mHLA-DR) of patients was evaluated at days 3-4 after the onset of septic shock, on peripheral whole blood collected in EDTA tubes, by flow cytometry (NAVIOS; Beckman-Coulter, Brea, CA, USA). The results are expressed as the number of antibodies bound per cell (Ab/C).
- Détection de protéinesProtein detection
La protéine TNFα dans le surnageant des tubes TruCulture a été quantifiée, pour les patients en choc septique et les individus sains, en utilisant le système nanofluidique ELLA (Biotechne, Minneapolis, MI, États-Unis), conformément aux instructions du fabricant. Les résultats sont exprimés en pg/ml.TNFα protein in the supernatant of TruCulture tubes was quantified, for septic shock patients and healthy individuals, using the ELLA nanofluidic system (Biotechne, Minneapolis, MI, USA), according to the manufacturer's instructions. The results are expressed in pg/ml.
- Analyse statistiqueStatistical analysis
Les résultats sont exprimés en médiane et écarts interquartiles [IQR] pour les variables continues. Les données paramétriques ont été analysées par ANOVA et les données non paramétriques ont été analysées par le test de Kruskal-Wallis. Les analyses statistiques ont été menées en utilisant le logiciel GraphPad Prism® (version 5 ; logiciel GraphPad, La Jolla, CA, États-Unis) et R (version 3.5.1). Une valeur p ajustée < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. L’analyse en composantes principales (PCA) a été réalisée en utilisant Genomics Suite 7 (Partek, St. Louis, MO, États-Unis).Results are expressed as median and interquartile ranges [IQR] for continuous variables. Parametric data were analyzed by ANOVA and non-parametric data were analyzed by Kruskal-Wallis test. Statistical analyzes were conducted using GraphPad Prism® software (version 5; GraphPad software, La Jolla, CA, USA) and R (version 3.5.1). An adjusted p-value < 0.05 was considered statistically significant. Principal component analysis (PCA) was performed using Genomics Suite 7 (Partek, St. Louis, MO, USA).
- Création de clustersCluster creation
Les données ont été transformées par transformation logarithmique de base 10, centrées et réduites. Deux matrices de distances et une matrice de corrélation ont été construites sur les données et 10 méthodes de clustering ont été lancées («hierarchical», « kmeans», « diana », « fanny », « som », « model », « sota », « pam », « clara » et « agnes »). Pour chaque méthode, k = 3 à k = 18 clusters ont été testés. Les meilleures méthodes de clustering ont été sélectionnées en utilisant 7 indices combinant des mesures internes (connectivité, largeur de la silhouette et indice de Dunn) et de stabilité (la proportion moyenne de non chevauchement (APN), la distance moyenne (AD), la distance moyenne entre les moyennes (ADM) et le facteur de mérite (FOM)). La méthode la plus stable pour SEB a été sélectionnée : il s’agit de la méthode PAM utilisant la matrice de corrélation (indice de score = 31).The data were transformed by base 10 logarithmic transformation, centered and reduced. Two distance matrices and a correlation matrix were built on the data and 10 clustering methods were launched (“hierarchical”, “kmeans”, “diana”, “fanny”, “som”, “model”, “sota ', 'pam', 'clara' and 'agnes'). For each method, k = 3 to k = 18 clusters were tested. The best clustering methods were selected using 7 indices combining internal measures (connectivity, silhouette width and Dunn's index) and stability (average proportion of nonoverlapping (APN), average distance (AD), average distance between means (ADM) and figure of merit (FOM)). The most stable method for SEB was selected: it is the PAM method using the correlation matrix (score index = 31).
RésultatsResults
- Diversité de la réponse à une stimulation avec du SEBDiversity of response to stimulation with SEB
Afin d’identifier les biomarqueurs contribuant principalement à la variation quantitative de la réponse à la stimulation par SEB (Figure 1A) pour les individus sains et pour les patients en choc septique, ceux-ci ont été représentés graphiquement et le poids des biomarqueurs expliquant la variance a été obtenu (Tableau 4). Parmi les plus importants contributeurs à la variance de la réponse au SEB (Figure 1B) pour la première composante PC1 (39%), il a été constaté queRARRES3etSTAT2étaient les plus fortement exprimés par les individus du côté droit de la composante, tandis queIL1A,CXCL2etIFNGétaient plus fortement exprimés par les individus du côté opposé. En ce qui concerne la deuxième composante PC2 (19%), la variance était induite « en tête » par un élément de rétrovirus endogène humain ou HERV (121601901-HERV0116), mais aussi parSLAMF7,CCL4,C3etCXCL10.In order to identify the biomarkers contributing mainly to the quantitative variation of the response to stimulation by SEB (Figure 1A) for healthy individuals and for patients in septic shock, these were represented graphically and the weight of the biomarkers explaining the variance was obtained (Table 4). Among the largest contributors to SEB response variance (Figure 1B) for the first PC1 component (39%), RARRES3 and STAT2 were found to be most strongly expressed by individuals on the right side of the component, while IL1A , CXCL2 and IFNG were more strongly expressed by individuals on the opposite side. With regard to the second PC2 component (19%), the variance was induced "in the lead" by an element of human endogenous retrovirus or HERV (121601901-HERV0116), but also by SLAMF7 , CCL4 , C3 and CXCL10 .
Tableau 4. Poids des biomarqueurs responsables de la plus grande variance de la première composante (PC1) et de la deuxième composante (PC2) pour la stimulation par SEB dans les deux populations. Pour chaque composante, les biomarqueurs ont été classés, du poids le plus élevé (en valeur absolue) au poids le moins élevé (en valeur absolue).Table 4. Weights of the biomarkers responsible for the greatest variance of the first component (PC1) and the second component (PC2) for stimulation by SEB in the two populations. For each component, the biomarkers were ranked, from the highest weight (in absolute value) to the lowest weight (in absolute value).
- Test fonctionnel immunitaire comme outil de stratification des patients en état septiqueImmune functional test as a stratification tool for sepsis patients
En tenant compte des deux populations (individus sains et patients), nous avons réalisé une classification (clustering) non supervisée avec l’ensemble du panel moléculaire afin d’identifier les motifs géniques. Les individus sains étaient groupés ensemble après la stimulation par SEB, montrant une grande homogénéité dans leur réponse immunitaire. Lors de la stimulation par SEB, 6 patients ont été groupés avec des individus sains (n = 16, cluster S1) et les autres ont été séparés en 2 groupes de nombre presque égal (n = 11 pour le cluster S2 et n = 12 pour le cluster S3 ; Figure 2). La composition de donneurs de chaque cluster est présentée dans le Tableau 5.Taking into account the two populations (healthy individuals and patients), we carried out an unsupervised classification (clustering) with the entire molecular panel in order to identify the gene motifs. Healthy individuals were clustered together after SEB stimulation, showing great homogeneity in their immune response. During SEB stimulation, 6 patients were grouped with healthy individuals (n = 16, cluster S1) and the others were separated into 2 groups of almost equal number (n = 11 for cluster S2 and n = 12 for the S3 cluster; Figure 2). The donor composition of each cluster is shown in Table 5.
Tableau 5. Composition individuelle (par donneur) des clusters obtenus après stimulation avec du SEB. Les individus sains apparaissent en italique, les non-survivants en gras, et ceux ayant développé une infection nosocomiale sont soulignés. D : DonneurTable 5. Individual composition (per donor) of the clusters obtained after stimulation with SEB. Healthy individuals appear in italics, non-survivors in bold, and those having developed a nosocomial infection are underlined. D: Donor
Une analyse bivariée a ensuite été réalisée entre les clusters et les paramètres biologiques ou cliniques.A bivariate analysis was then carried out between the clusters and the biological or clinical parameters.
Pour la stimulation par SEB, un résultat statistiquement significatif a été trouvé pour mHLA-DR (p ajustée = 0,0131) ainsi que pour la sécrétion de protéine TNFα après stimulation par LPS (p ajustée ≤ 0,0001 ; Tableau 6).For stimulation by SEB, a result statistically significant was found for mHLA-DR (adjusted p = 0.0131) as well as for TNFα protein secretion after LPS stimulation (adjusted p ≤ 0.0001; Table 6).
Comme attendu du fait de la classification avec les individus sains, les 6 patients se trouvant dans le cluster S1 présentent la médiane la plus élevée pour mHLA-DR (10938 Ab/C, IQR : [9456-14642]) et présentent une concentration en protéine TNFα après stimulation par LPS la plus élevée (3799 pg/mL, IQR : [2067,2-5401,2]).As expected due to the classification with healthy individuals, the 6 patients in cluster S1 present the highest median for mHLA-DR (10938 Ab/C, IQR: [9456-14642]) and present a concentration of highest TNFα protein after LPS stimulation (3799 pg/mL, IQR: [2067.2-5401.2]).
En comparant les résultats des clusters S1 et S2, la seule différence significative est la concentration médiane en protéine TNFα après stimulation par LPS (p < 0,0001). Le cluster S2 présente le niveau médian en protéine TNFα le plus bas parmi les 3 clusters.By comparing the results of the S1 and S2 clusters, the only significant difference is the median concentration of TNFα protein after stimulation by LPS (p < 0.0001). The S2 cluster presents the lowest median TNFα protein level among the 3 clusters.
En comparant le cluster S1 à S3, il y a une différence significative pour les deux paramètres (p < 0,001), le cluster S3 présente un niveau médian intermédiaire de concentration en protéine TNFα après stimulation par LPS entre les 3 clusters, tandis que les niveaux médians de mHLA-DR sont le plus bas (Figure 3).Comparing the S1 to S3 cluster, there is a significant difference for the two parameters (p < 0.001), the S3 cluster presents an intermediate median level of TNFα protein concentration after stimulation by LPS between the 3 clusters, while the levels mHLA-DR medians are the lowest (Figure 3).
De plus, nous pouvons observer que parmi les 20 (sur 30) patients qui souffraient d’au moins une comorbidité, 10 (50%) appartenaient à S3, représentant 83,3% du cluster.Moreover, we can observe that among the 20 (out of 30) patients who suffered from at least one comorbidity, 10 (50%) belonged to S3, representing 83.3% of the cluster.
De même, parmi les 5 patients non survivants, les quatre qui sont décédés avant le jour 28 (80%) appartiennent au cluster S2, représentant 36% de ce cluster, tandis que le cinquième, décédé tardivement à l’hôpital, appartient au cluster S3 (Tableau 6). Il convient de noter que le seul patient qui a développé une infection nosocomiale se trouve dans le cluster S2.Similarly, among the 5 non-surviving patients, the four who died before day 28 (80%) belong to cluster S2, representing 36% of this cluster, while the fifth, who died late in hospital, belongs to cluster S3 (Table 6). It should be noted that the only patient who developed a nosocomial infection is in cluster S2.
(n=16)(n=16)
(n=11)(n=11)
(n=12)(n=12)
[9456-14642]10938
[9456-14642]
[4653-11673]7301
[4653-11673]
[3444-6250]3839.5
[3444-6250]
[2067.2-5401.2]3799
[2067.2-5401.2]
[122.2-861.8]282.7
[122.2-861.8]
[457.8-913.3]700.8
[457.8-913.3]
SOFA:sequential organ failure assessment SOFA: sequential organ failure assessment
CCI:Charlson Comorbidity Index CCI: Charlson Comorbidity Index
HLA-DR:human leukocyte antigenDRHLA-DR: human leukocyte antigen DR
Ab/C: antibodies bound per cell Ab/C : antibodies bound per cell
TNFα:tumor necrosis factoralphaTNFα: tumor necrosis factor alpha
LPS: lipopolysaccharideLPS: lipopolysaccharide
IQR : écart interquartileIQR: interquartile range
*: paramètres mesurés exclusivement pour les patients en choc septique*: parameters measured exclusively for patients in septic shock
Tableau 6. Analyses bivariées entre les clusters S1, S2 et S3 lors d’une stimulation par SEB pour les paramètres cliniques et biologiques.6 paramètres sont représentés lorsque des analyses statistiques ont été réalisées entre les clusters S1 (n = 16 ou n = 6 lorsqu’il n’y avait pas d’informations disponibles pour les individus sains), S2 (n = 11) et S3 (n = 12) définis en utilisant la méthode PAM avec distance de corrélation. La valeur p ajustée pour des tests multiples a été donnée en sortie. La présence de comorbidités était affirmative lorsqu’au moins une comorbidité était présente chez le patient : une maladie pulmonaire chronique, une insuffisance cardiaque, un infarctus du myocarde, un ulcère, le diabète, une insuffisance rénale ou une tumeur solide maligne. Table 6. Bivariate analyzes between S1, S2 and S3 clusters during SEB stimulation for clinical and biological parameters. 6 parameters are represented when statistical analyzes were performed between clusters S1 (n = 16 or n = 6 when there was no information available for healthy individuals), S2 (n = 11) and S3 ( n = 12) defined using the PAM method with correlation distance. The p-value adjusted for multiple tests was output. The presence of comorbidities was affirmative when at least one comorbidity was present in the patient: chronic lung disease, heart failure, myocardial infarction, ulcer, diabetes, renal failure or malignant solid tumour.
Le test fonctionnel immunitaire développé a donc permis de mettre en évidence que, si la réponse immunitaire des individus sains est homogène, la réponse immunitaire des patients en choc septique est quant à elle hétérogène, et l’hétérogénéité de la réponse réside dans le bras adaptatif de l’immunité. Les patients regroupés dans le cluster S1, avec les individus sains, ont un profil immunitaire plus “normal”/“sain”, contrairement aux autres patients. A priori ces patients ne nécessiteraient de pas vigilance particulière et unstandard of careserait suffisant. Les patients du cluster S2 correspondent quant à eux à des patients “sévères”, caractérisés par un taux de mortalité élevé. Ces patients dont l’immunité apparaît fortement altérée et présentant une plus grande probabilité de mortalité, pourraient avantageusement bénéficier d’interventions thérapeutiques plus « agressives » et/ou plus précoces. Enfin, le troisième groupe (patients du cluster S3) correspond à des patients de phénotype intermédiaire à sévère, pouvant présenter un degré de récupération immunitaire. Ainsi, ces patients dont l’immunité semble restaurable pourraient faire l’objet de traitements personnalisés (e.g. IL-7, interféron γ). Ainsi, ces résultats montrent que le test fonctionnel immunitaire développé dans le cadre de cette invention permet d’obtenir une stratification des patients, que ne permettent pas les marqueurs de référence (ougold standard) communément admis par la communauté scientifique, tels que mHLA-DR ou encore le TNF-α.
The immune functional test developed has therefore made it possible to demonstrate that, if the immune response of healthy individuals is homogeneous, the immune response of patients with septic shock is heterogeneous, and the heterogeneity of the response lies in the adaptive arm. of immunity. Patients grouped in cluster S1, with healthy individuals, have a more “normal”/“healthy” immune profile, unlike other patients. A priori, these patients would not require any particular vigilance and a standard of care would be sufficient. Patients in the S2 cluster correspond to “severe” patients, characterized by a high mortality rate. These patients whose immunity appears to be strongly altered and who present a greater probability of mortality, could advantageously benefit from more “aggressive” and/or earlier therapeutic interventions. Finally, the third group (patients of the S3 cluster) corresponds to patients with an intermediate to severe phenotype, who may show a degree of immune recovery. Thus, these patients whose immunity seems to be restorable could be the subject of personalized treatments (eg IL-7, interferon γ). Thus, these results show that the immune functional test developed in the context of this invention makes it possible to obtain a stratification of patients, which the reference markers (or gold standard ) commonly accepted by the scientific community, such as mHLA- DR or even TNF-α.
Claims (28)
- Une étape d’incubation d’un échantillon sanguin dudit individu avec ledit stimulus, et
- Une étape de mesure de l’expression, à partir de l’échantillon sanguin stimulé résultant de l’étape a), d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes, parmi les listes suivantes :
- Liste S1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SLAMF7, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2 : ADGRE3, ARL14EP, BST2, C3, CCL2, CCL20, CCL8, CCNB1IP1, IL7R, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, SLAMF7, TGFB1 ;
- Liste S3 : 121601901-HERV0116, BST2, C3, CCL20, CCL4, CCL8, CCR1, IL7R, CD209, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
- A step of incubating a blood sample from said individual with said stimulus, and
- A step for measuring the expression, from the stimulated blood sample resulting from step a), of at least two different biomarkers, chosen respectively from at least two different lists, from the following lists:
- S1 list : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB, HLA-DPB1, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3 , DDX58, SLAMF7, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- S2 list : ADGRE3, ARL14EP, BST2, C3, CCL2, CCL20, CCL8, CCNB1IP1, IL7R, CD209, CD3D, CD44, CD74, CD83, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL10, CXCL2, CXCL9, DYRK2, FAM89A, HLA-DMB , HLA-DPB1, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, SLAMF7, TGFB1;
- S3 List : 121601901-HERV0116, BST2, C3, CCL20, CCL4, CCL8, CCR1, IL7R, CD209, CD44, CD74, CD83, CLEC7A, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA -DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
- Liste S1-1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD83, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-1 : ADGRE3, ARL14EP, C3, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CD3D, CD44, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, TGFB1 ;
- Liste S3-1 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, IL7R, CD44, CD74, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2.
- List S1-1 : BST2, CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD3D, CD44, CD83, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, RARRES3, DDX58, SRC, STAT2, STING, TNFA, TNFSF13B , ZBP1;
- List S2-1 : ADGRE3, ARL14EP, C3, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CD3D, CD44, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, CXCL2, DYRK2, HLA-DMB, HLA-DRA, IFITM1, IRAK2, TGFB1;
- List S3-1 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, IL7R, CD44, CD74, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DRA, IL1A, IL2, RARRES3, SLAMF7, STAT2 .
- Liste S1-2 : CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD44, CD83, CXCL2, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-2 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, DYRK2, IFITM1, TGFB1 ;
- Liste S3-2 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, IL2, SLAMF7.
- List S1-2 : CCL20, CCL4, CCL8, CD209, CD44, CD83, CXCL2, IFNG, IL1A, IRAK2, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- List S2-2 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, IL7R, CDKN1A, CLEC7A, CX3CR1, DYRK2, IFITM1, TGFB1;
- List S3-2 : 121601901-HERV0116, C3, CCR1, CXCL10, CXCL9, EIF2AK4, HLA-DMB, HLA-DPA1, IL2, SLAMF7.
- Liste S1-3 : IFNG, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1 ;
- Liste S2-3 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, CDKN1A, CX3CR1, IFITM1, TGFB1 ;
- Liste S3-3 : 121601901-HERV0116, CCR1, EIF2AK4, HLA-DPA1, IL2.
- List S1-3 : IFNG, PTGS2, DDX58, SRC, STING, TNFA, TNFSF13B, ZBP1;
- List S2-3 : ADGRE3, ARL14EP, CCL2, CCNB1IP1, CDKN1A, CX3CR1, IFITM1, TGFB1;
- List S3-3 : 121601901-HERV0116, CCR1, EIF2AK4, HLA-DPA1, IL2.
- de moyens d’amplification et/ou de détection (de préférence des amorces et/ou des sondes) d’au moins deux biomarqueurs différents, choisis respectivement dans au moins deux listes différentes parmi les listes de l’une des revendications 1 à 4, de préférence des moyens d’amplification et/ou de détection d’au moins trois biomarqueurs différents, choisis respectivement dans chacune des trois listes de l’une des revendications 1 à 4, ou
- d’un kit comprenant de tels moyens d’amplification et/ou de détection, de préférence l’ensemble des moyens d’amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 biomarqueurs, au total, et optionnellement ledit kit comprend des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage et/ou des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et /ou d’hybridation,
pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus, de préférence la capacité du système immunitaire d’un individu à répondre à un stimulus.Use :
- means for amplifying and/or detecting (preferably primers and/or probes) at least two different biomarkers, chosen respectively from at least two different lists among the lists of one of claims 1 to 4 , preferably means for amplifying and/or detecting at least three different biomarkers, chosen respectively from each of the three lists of one of claims 1 to 4, or
- a kit comprising such amplification and/or detection means, preferably all of the amplification and/or detection means of said kit allow the detection and/or amplification of at most 100 biomarkers , in total, and optionally, said kit comprises means for amplifying and/or detecting one or more housekeeping genes and/or positive control means making it possible to qualify the quality of the extraction of the RNA, the quality of any amplification and/or hybridization process,
to determine an individual's ability to respond to a stimulus, preferably the ability of an individual's immune system to respond to a stimulus.
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2019
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