FR2825370A1 - Keratinocytes obtenus a partir de cellules souches embryonnaires de mammiferes - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à une méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en kératinocytes, comprenant les étapes suivantes : - isolement d'une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères,- culture en parallèle des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié en présence de LIF,- ensemencement des cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire, - culture des cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées en absence de LIF pendant un délai suffisant pour leur différenciation en kératinocytes, et - recueillement des kératinocytes ainsi obtenus.
Description
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KERATINOCYTES OBTENUS A PARTIR DE CELLULES SOUCHES
EMBRYONNAIRES DE MAMMIFERES Objet de l'invention
La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de kératinocytes à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères.
EMBRYONNAIRES DE MAMMIFERES Objet de l'invention
La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de kératinocytes à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères.
Une application thérapeutique possible d'un tel procédé est la reconstitution de tissus dérivés des kératinocytes, en particulier, la fabrication de peau artificielle.
Etat de la technique
Le nom de matrice extracellulaire ou MEC est le nom généralement donné au réseau complexe de macromolécules extracellulaires avec lequel sont en contact la plupart des cellules des organismes pluricellulaires.
Le nom de matrice extracellulaire ou MEC est le nom généralement donné au réseau complexe de macromolécules extracellulaires avec lequel sont en contact la plupart des cellules des organismes pluricellulaires.
La composition de la matrice extracellulaire et sa forme varient en fonction du tissu, de sorte que l'on parle plus volontiers des matrices extracellulaires, que de la matrice extracellulaire. Néanmoins, les matrices extracellulaires ont en commun d'être constituées de macromolécules qui sont essentiellement des protéines et des polysaccharides sécrétés localement et qui s'organisent pour former un réseau en trois dimensions au niveau des espaces intercellulaires de la plupart des tissus.
Parmi ces macromolécules, on trouve par exemple des protéoglycannes, des protéines fibreuses ayant une fonction essentiellement structurale telles que
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l'élastine et les collagènes, et des protéines fibreuses ayant une fonction essentiellement d'adhésion telles que la fibronectine et les laminines.
La matrice extracellulaire n'est pas seulement une glue biologique, elle forme aussi des structures hautement spécialisées telles que le cartilage, les tendons, la membrane basale laminale, le squelette et les dents.
En outre, il apparaît que les matrices extracellulaires jouent un rôle critique dans la régulation du comportement des cellules avec lesquelles elles sont en contact. Elles sont ainsi impliquées dans des phénomènes aussi différents que le développement cellulaire, la prolifération, le métabolisme, la forme et la polarité des cellules. Un autre phénomène dans lequel les matrices extracellulaires interviennent est la différenciation des cellules.
Les cellules souches embryonnaires dérivent de cellules totipotentes de l'embryon. Ce sont des cellules pluripotentes capables de se différencier in vivo en n'importe quel type cellulaire (Bradley et al., Nature 309, 255-256 (1984) ; Nagy et al., Development 110,815-821 (1990)) et in vitro en un nombre plus restreint de types cellulaires (Doetschman et al., J. Embryo. Exp. Morph. 87, 27-45 (1985) ; Wobus et al., Biomed. Biochim. Acta 47,965- 973 (1988) ; Robbins et al., J. Biol. Chem. 265,11905- 11909 (1990) ; Schmitt et al., Genes and Development j, 728-740 (1991)).
Cependant, les cellules souches embryonnaires sont difficiles à cultiver en laboratoire et leur culture nécessite l'ajout, dans le milieu de culture, d'un facteur inhibant la différenciation, communément appelé le LIF (Leukemia Inhibitory Factor), afin d'éviter tout phénomène de différenciation spontanée (Williams et al., Nature 336,
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684-687 (1988) ; Smith et al., Nature 336,688-690 (1988) ; Gearing et al., Biotechnology 7, 1157-1161 (1989)).
Le LIF est une protéine de sécrétion qui peut être fournie en maintenant des cellules souches embryonnaires sur une couche nourricière de cellules produisant ce LIF (Robertson, Tetracarcinomas and Embryonic stem cells : a practical approach, Washington DC, IRL Press (1987)) ou, en absence de couche nourricière, en ajoutant au milieu de culture du LIF purifié (Pease et al., Exp.
Cell. Res. 190, 209-211 (1990)).
Il a été démontré que la différenciation spontanée de cellules souches embryonnaires se produit dès l'instant où l'on supprime le LIF du milieu de culture où ces cellules se trouvent, et qu'elle peut être également induite par manipulation dans certaines conditions (Gutierrez-Ramos et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 89, 9111- 9175 (1992)).
Cette différenciation a lieu sous l'effet de l'agrégation des cellules souches embryonnaires, conduisant à la formation de corps embryoïdes (structures tridimensionnelles) à partir desquels les cellules se différencient spontanément en différents types cellulaires.
Rudnicki et al. ont décrit une méthode générale d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires dite méthode des gouttes pendantes (Rudnicki et al., Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines , in Teratocarcinomas and embryonic stem cells : a practical approach, (E. J. Robertson, Ed.), 19-49 (1978), IRL Press, Oxford). Dans cette méthode, pour que les cellules souches embryonnaires se différencient, il est nécessaire de former des structures tridimensionnelles appelées corps embryoïdes dont il a été fait mention ci-dessus.
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L'absence de LIF au cours de cette méthode est nécessaire pour permettre aux cellules souches embryonnaires de se différencier. Après 3 jours, les corps embryoïdes formés sont transférés sur des boîtes de Pétri bactériologiques et sont maintenus en suspension pendant 2 jours, afin d'éviter leur adhésion et de favoriser leur croissance. Les corps embryoïdes sont ensuite mis à adhérer sur des boîtes de culture cellulaire. Dès le 2ème jour après adhésion, on peut observer, au sein de ces corps, différents types cellulaires, dont des cellules battantes (cardiomyocytes). Selon les conditions de culture utilisées, on identifie des cellules musculaires squelettiques et lisses, des cellules nerveuses, des cellules de la glie et des dérivés du système hématopoïétique (Rathjen et al., properties and uses of embryonic stem cells : prospects for application to human biology and gene therapy > > , Reprod. Fertil. Dev. 10 (1), 31- 47 (1998), Review).
Depuis peu, des conditions de culture permettant d'induire majoritairement et de manière reproductible la différenciation des cellules souches embryonnaires vers un lignage particulier ont été mises au
point (Rathjen et al., op. cit.)
Il est désormais clairement établi que le LIF maintient les cellules souches embryonnaires pluripotentes sous forme indifférenciée, et que son retrait du milieu cellulaire permet à ces cellules d'initier, sous forme de corps embryoïdes, un programme de différenciation.
point (Rathjen et al., op. cit.)
Il est désormais clairement établi que le LIF maintient les cellules souches embryonnaires pluripotentes sous forme indifférenciée, et que son retrait du milieu cellulaire permet à ces cellules d'initier, sous forme de corps embryoïdes, un programme de différenciation.
Le document de Bagutti et al. (Bagutti et al., Developmental Biology 179,184-196 (1996)) décrit plus particulièrement la différenciation spontanée de cellules souches embryonnaires de souris en kératinocytes en utilisant la méthode des gouttes pendantes, avec apparition de kératinocytes à partir du 21ère jour.
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Néanmoins, il n'existe pas encore actuellement de méthode d'induction de la différenciation des cellules souches embryonnaires en kératinocytes qui constituerait une réelle alternative, en terme de rapidité et de rendement, à la méthode des gouttes pendantes.
Buts de l'invention
La présente invention vise à fournir une méthode et des moyens d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires en kératinocytes, qui permettent d'obtenir plus rapidement et en nombre plus grand des kératinocytes différenciés, comparativement aux méthodes de l'état de la technique.
La présente invention vise à fournir une méthode et des moyens d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires en kératinocytes, qui permettent d'obtenir plus rapidement et en nombre plus grand des kératinocytes différenciés, comparativement aux méthodes de l'état de la technique.
La présente invention vise également à fournir une méthode et des moyens d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifère en kératinocytes qui soient reproductibles et fiables.
Résumé de l'invention
La présente invention se rapporte à l'obtention de kératinocytes à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères, en particulier à une méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en kératinocytes, comprenant les étapes suivantes : on isole une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères, on cultive parallèlement des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié, on ensemence ensuite lesdites cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire ou sur une ou plusieurs de ses fractions
La présente invention se rapporte à l'obtention de kératinocytes à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères, en particulier à une méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en kératinocytes, comprenant les étapes suivantes : on isole une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères, on cultive parallèlement des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié, on ensemence ensuite lesdites cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire ou sur une ou plusieurs de ses fractions
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comprenant des constituants particuliers, notamment la laminine-5, le collagène de type IV, le collagène de type I ou des fibronectines, on cultive ensuite lesdites cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées, en absence du LIF susmentionné pendant un délai suffisant pour obtenir la différentiation en kératinocytes, et on recueille les kératinocytes ainsi obtenus, isolés et amplifiés par des techniques connues de clonage (dispase, trypsine, tri cellulaire).
De manière avantageuse, les cellules souches embryonnaires sont maintenues préalablement à l'état indifférencié en présence de LIF, de préférence à une concentration de l'ordre de 10 unités/ml de culture.
Selon l'invention, l'induction de la différenciation des cellules souches embryonnaires sur une matrice extracellulaire est initiée dès 8 jours et largement engagée à 15 jours. Ce facteur de temps n'est nullement limitatif et peut être accéléré par différents procédés adaptables par l'homme du métier.
En outre, il est également possible de traiter les souches embryonnaires avant la différenciation en kératinocytes par différentes modifications génétiques, en particulier par des modifications génétiques sur des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC), de manière à créer des lignées pluripotentes universelles immunotolérantes.
Un autre aspect de la présente invention concerne la fabrication d'une peau artificielle, en particulier un tissu épidermique comprenant lesdits kératinocytes ainsi obtenus, ainsi que leur utilisation pour soigner des patients victimes de plaies thermiques (en particulier des grands brûlés), des plaies vasculaires
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(tels que des ulcères) ou des patients atteints de pathologies liées à des défauts de cicatrisation.
La présente invention sera détaillée à l'aide de la description d'une forme d'exécution préférée de l'invention présentée à titre d'illustration non limitative de l'objet de l'invention.
Description détaillée de l'invention
Les exemples présentés ci-dessous illustrent la méthode selon la présente invention. Dans ces exemples, une lignée de cellules souches embryonnaires murines CGR8 (Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4303-4307 (1994) ), au stade blastocyste, a été cultivée à l'état indifférencié en présence de LIF (Leukemia Inhibiting Factor) (103 unités/ml) sur des boîtes de culture préalablement gélatinisées (0,1% dans du PBS) en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur.
Les exemples présentés ci-dessous illustrent la méthode selon la présente invention. Dans ces exemples, une lignée de cellules souches embryonnaires murines CGR8 (Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4303-4307 (1994) ), au stade blastocyste, a été cultivée à l'état indifférencié en présence de LIF (Leukemia Inhibiting Factor) (103 unités/ml) sur des boîtes de culture préalablement gélatinisées (0,1% dans du PBS) en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur.
Le milieu de culture se composait de GMEM/BHK21 (Glasgow's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF ; Hyclone), 0, 23% de bicarbonate de sodium, 1% d'acides aminés non essentiels, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM de-mercaptoéthanol.
Ces cellules souches embryonnaires à l'état indifférencié ont ensuite été ensemencées, en absence de LIF, soit sur un substrat amorphe (verre ou plastique, contrôle négatif), soit sur de la gélatine, soit sur des lames coatées de matrice extracellulaire provenant de différents types de cellules (voir ci-dessous). On a ainsi testé des cellules d'origine épithéliale (lignée 804G ; lignée Rac-11P ; lignée SCC25 ; lignée MCF-10 A ; lignée KHSV ; lignée NBTII ; lignée HaCaT) et des cellules fibroblastiques (lignée J2 ; lignée NIH-3T3, fibroblastes dermiques humains
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en culture primaire). Les lignées épithéliales produisent, entre autre, des quantités importantes de laminine-5, et forment in vitro de nombreuses structures d'ancrage de type hémidesmosome (Langhofer M. et al., J. Cell Science 105, 753-764 (1993)).
Les cellules souches embryonnaires ont également été ensemencées sur des lames coatées uniquement avec des constituants majeurs des lames basales (laminine-5 purifiée ; collagène de type IV purifié ; collagène de type I purifié ; fibronectines purifiées).
Afin de récolter leur matrice extracellulaire, les lignées mentionnées ci-dessus ont été cultivées à confluence sur lamelles. Une fois arrivées à confluence, ces cellules ont été décollées grâce à une solution constituée de PBS contenant 20mM d'hydroxyde d'ammonium ou à une solution d'HBSS (Hanks balanced salt solution, GIBCO-BRL) contenant 20 mM d'EDTA, 20 mM d'Hepes et 1 mM d'EGTA) de manière à ne garder que la matrice extracellulaire sécrétée, intacte sur les lamelles. Les lamelles ainsi"coatées"ont été conservées à 4 C.
La présence de kératinocytes a été évaluée par marquage immunofluorescent avec des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre les cytokératines 14 (K14 ; Sigma) et 5 (Dr. B. Lane, Université de Dundee, UK).
Les cytokératines 14 et 5 font partie des filaments intermédiaires spécifiques des kératinocytes basaux. Les cellules souches embryonnaires ont été cultivées sur des lamelles de verre stériles avec ou sans dépôt de matrice extracellulaire. Après lavage au PBS, les cellules ont été fixées avec du méthanol froid 10 minutes à-20 C. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS avant d'être incubées pour une heure avec l'anticorps primaire anti-K14 (dilué au 1/100e dans un tampon PBS contenant 3 mg/ml de BSA, en chambre humide) ou avec l'anticorps primaire anti-
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K5 (dilué au 1/5e dans le même tampon, en chambre humide). Après un nouveau lavage au PBS de 5 minutes, les lamelles ont été incubées pour une heure à l'obscurité avec un anticorps secondaire relevant couplé à un marqueur. Après un dernier rinçage, les lamelles ont été incubées avec un marqueur nucléaire (Hoechst ou iodure de propidium) dilués au 1/1000e dans du PBS pendant 10 minutes à l'abri de la lumière, puis montées sur lames après lavage à l'eau distillée. Toutes les manipulations ont été effectuées à température ambiante. Les lames ont été observées sous un microscope"Zeiss Axiophot".
Les résultats obtenus ont montré que sur support amorphe, aucun kératinocyte n'est observé, même après 15 jours de culture sans LIF. Les résultats sur gélatine ont montré que seulement une proportion infime de cellules souches embryonnaires CGR8 s'est différenciée en kératinocytes : une présence sporadique de kératinocytes peut être observée à 8 jours de culture, et cette proportion est augmentée au 15e jour, les kératinocytes observés restant en majorité isolés, ne formant pas d'amas.
Les résultats obtenus sur des lames coatées avec une fraction totale ou partielle de la matrice extracellulaire des types cellulaires se sont révélés dramatiquement différents des résultats obtenus sur support amorphe.
Résultats obtenus sur la matrice extracellulaire provenant des différents type cellulaires utilisés
Une différenciation kératinocytaire a été obtenue sur les différentes matrices extracellulaires étudiées. Cependant, les variations d'efficacité d'induction entre ces différentes matrices nécessitent de les répartir en deux catégories distinctes : (A) matrices à
Une différenciation kératinocytaire a été obtenue sur les différentes matrices extracellulaires étudiées. Cependant, les variations d'efficacité d'induction entre ces différentes matrices nécessitent de les répartir en deux catégories distinctes : (A) matrices à
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haute capacité d'induction ; (B) matrices à capacité moyenne d'induction (voir aussi tableau I).
(A) Matrices à haute capacité d'induction de la différenciation kératinocytaire a)-Matrice extracellulaire produite par les cellules FHN : Les FHN (fibroblastes humains normaux) ont été obtenus à partir de biopsies de prépuce et entretenus en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37 C et sous 5% de C02 dans un incubateur. A confluence, les cellules FHN ont été décrochées et les cellules souches embryonnaires CGR8 ont été ensemencées sur la matrice extracellulaire déposée par les cellules FHN.
Au huitième jour de culture des cellules souches embryonnaires CGR8 sur la matrice produite par les FHN, de nombreux kératinocytes isolés sont identifiables par immunofluorescence. Au quinzième jour de culture, les kératinocytes plus nombreux sont observés en larges amas ("patches") formant une sorte de feuillet épidermique. De nombreux kératinocytes isolés sont également détectables.
Ainsi, la présence de matrice sécrétée par les cellules FHN provoque un effet significatif sur la différenciation des cellules souches embryonnaires en kératinocytes. En effet, alors qu'aucune différenciation n'est observée en culture directe sur un substrat amorphe même après 15 jours de culture, une quantité importante de kératinocytes est obtenue en culture directe sur la matrice extracellulaire produite par les cellules FHN. De plus, cette différenciation est plus précoce que celle obtenue via les corps embryoïdes puisque dès le huitième jour de culture en monocouche sans LIF, une proportion importante de kératinocytes est observée.
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b)-Matrice extracellulaire produite par les lignées cellulaires NIH-3T3, Rac-11P, KHSV et NBTII :
L'expérience susmentionnée (cellules FHN) a été reproduite sur la matrice produite par les lignées cellulaires : i) NIH-3T3 : ATCC, CRL 1658. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's MediumGIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. ii) Rac-11P : Sonnenberg A. et al. (1996) J. Cell Science 106 : 1083. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. iii) KHSV : Miquel C. et al. (1996). Exp. Cell Res. 224 : 279-290. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) contenant 50% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone), 0,4 g/ml d'hydrocortisone, 0,1 ng/ml de toxine cholérique et 10 ng/ml d'Epidermal Growth factor. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. iiii) NBTII : ATCC CRL 1655. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's MediumGIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur.
L'expérience susmentionnée (cellules FHN) a été reproduite sur la matrice produite par les lignées cellulaires : i) NIH-3T3 : ATCC, CRL 1658. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's MediumGIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. ii) Rac-11P : Sonnenberg A. et al. (1996) J. Cell Science 106 : 1083. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. iii) KHSV : Miquel C. et al. (1996). Exp. Cell Res. 224 : 279-290. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) contenant 50% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone), 0,4 g/ml d'hydrocortisone, 0,1 ng/ml de toxine cholérique et 10 ng/ml d'Epidermal Growth factor. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. iiii) NBTII : ATCC CRL 1655. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's MediumGIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur.
Dans ces quatre autres exemples, on obtient des résultats similaires à ceux obtenus avec la matrice des cellules FHN. En effet, le dépôt de cellules souches embryonnaires sur les lames coatées avec de la matrice extracellulaire produite par ces lignées cellulaires
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conduit à l'apparition de kératinocytes K14-positifs dès le huitième jour de culture en monocouche. Les différences qualitative et quantitative sont représentées sur le tableau I.
(B) Matrices à capacité moyenne d'induction de la différenciation kératinocytaire a)-Matrice extracellulaire produite par la lignée 804G : La lignée 804G, dérivée de cellules épithéliales de vessie de rat (Riddelle KS et al., J. (1991) J. Cell Biol. 112, 159-168), a été préalablement cultivée en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone). Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. A confluence, les cellules 804G ont été décrochées et les cellules souches embryonnaires CGR8 ont été ensemencées sur la matrice extracellulaire déposée par les cellules 804G.
Au huitième jour de culture des cellules souches embryonnaires CGR8 sur la matrice produite par les 804G, des kératinocytes isolés sont identifiables par immunofluorescence. Au quinzième jour de culture, des kératinocytes plus nombreux sont également détectables.
Ainsi, la présence de matrice sécrétée par les cellules 804G provoque un effet significatif sur la différenciation des cellules souches embryonnaires en kératinocytes. En effet, alors qu'aucune différenciation n'est observée en culture directe sur un substrat amorphe même après 15 jours de culture, une quantité importante de kératinocytes est obtenue en culture directe sur la matrice extracellulaire produite par les cellules 804G. De plus, cette différenciation est plus précoce que celle obtenue via les corps embryoïdes puisque dès le huitième jour de culture en monocouche sans LIF, une proportion importante
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de kératinocytes est observée. Les différences qualitative et quantitative sont représentées sur le tableau I. b)-Matrice extracellulaire produite par les lignées cellulaires SCC25, MCF-10A et HaCaT :
L'expérience susmentionnée (cellules 804G) a été reproduite sur la matrice produite par les lignées cellulaires : i) SCC25 : ATCC CRL 1628. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) contenant 50% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté
avec 10% de SVF (Hyclone) et 0, 4 g/ml d'hydrocortisone. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. ii) MCF-10A : ATCC CRL 10317. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's MediumGIBCO BRL) contenant 25% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone), 1,5 ng/ml de
triiodo-L-thyronine, 5llg/ml d'insuline, 0, 5 g/ml d'hydrocortisone, 20 gg/ml d'adénine, 5 gg/ml d'apo- transferrine et 2 ng/ml d'Epidemal Growth Factor. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. iii) HaCaT : Boukamp P. et al. (1988). J. Cell Biol. 106 : 761-771. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Médium-GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) et 1% de solution d'acides aminés non essentiels. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37 C et sous 5% de C02 dans un incubateur.
L'expérience susmentionnée (cellules 804G) a été reproduite sur la matrice produite par les lignées cellulaires : i) SCC25 : ATCC CRL 1628. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Medium-GIBCO BRL) contenant 50% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté
avec 10% de SVF (Hyclone) et 0, 4 g/ml d'hydrocortisone. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. ii) MCF-10A : ATCC CRL 10317. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's MediumGIBCO BRL) contenant 25% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone), 1,5 ng/ml de
triiodo-L-thyronine, 5llg/ml d'insuline, 0, 5 g/ml d'hydrocortisone, 20 gg/ml d'adénine, 5 gg/ml d'apo- transferrine et 2 ng/ml d'Epidemal Growth Factor. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 370C et sous 5% de C02 dans un incubateur. iii) HaCaT : Boukamp P. et al. (1988). J. Cell Biol. 106 : 761-771. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles's Médium-GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) et 1% de solution d'acides aminés non essentiels. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37 C et sous 5% de C02 dans un incubateur.
Dans ces trois autres exemples, on obtient des résultats similaires à ceux obtenus avec la matrice des cellules 804G. En effet, le dépôt de cellules souches embryonnaires sur les lames coatées avec de la matrice extracellulaire produite par ces lignées cellulaires
<Desc/Clms Page number 14>
conduit à l'apparition de kératinocytes K14-positifs dès le huitième jour de culture en monocouche. Les différences qualitative et quantitative sont représentées sur le tableau I.
Résultats obtenus avec la lignée de cellules souches embryonnaires D3 sur la matrice extracellulaire produite par les lignées susmentionnées
La lignée D3 (Doetschman et al., J. Embryol.
La lignée D3 (Doetschman et al., J. Embryol.
Exp. Morphol. 87,27-45 (1985)) a été préalablement cultivée sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires murins.
Des résultats similaires à ceux obtenus avec la lignée de cellules souches embryonnaires CGR8 ont été obtenus.
Des résultats similaires à ceux obtenus avec les matrices ont été observés en utilisant le milieu conditionné des mêmes lignées cellulaires.
La méthode selon présente invention présente donc l'avantage, par rapport à la méthode des gouttes pendantes telle qu'appliquée par Bagutti et al. (op. cit.) pour induire la différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en kératinocytes, de permettre une obtention plus efficace et plus rapide de kératinocytes.
Ceci est particulièrement important dans les cas où il est nécessaire de produire en masse de tels kératinocytes, comme par exemple dans le cas de la production de peau artificielle. La peau est en effet un organe constitué de trois tissus d'origines embryologiques différentes : l'ectoderme pour l'épiderme, le mésoderme pour le derme et l'hypoderme. Les kératinocytes représentent 95% de la population épidermique et ils se renouvellent en permanence à partir d'une assise germinale
<Desc/Clms Page number 15>
basale suivant un programme de différenciation qui aboutit à la formation d'une couche cornée constituée de cornéocytes.
La constitution de peau artificielle est une technologie ayant pour but de soigner des patients victimes de plaies thermiques, en particulier des grands brûlés, de plaies vasculaires telles que des ulcères, ou encore les patients atteints de pathologies liées à des défauts de cicatrisation.
Trois types principaux de modèles pour reconstituer de la peau humaine en laboratoire sont actuellement disponibles et réalisables : les dermes équivalents (Procacci et al., J. Inv. Dermatol. 115,518 (2000) ; Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,1274- 1278 (1979) ; Bell et al., J. Invest. Dermatol. 81,2s-10s (1983)), la peau composite dermo-épidermique allogénique (Burke et al., Am. Surg. 194,413-428 (1981)) et l'épiderme en culture allogénique (Hansbrough et al., J.
Am. Med. Ass. 262,2125-2140). Ces différents modèles sont préparés à partir de cultures primaires de kératinocytes et/ou fibroblastes.
Si ces modèles se prêtent bien à des études pharmacologiques, leur utilisation à des fins théarpeutiques est néanmoins jugée insatisfaisante par un certain nombre d'équipes chirurgicales dans le monde, notamment parce qu'elle s'accompagne de rejet de greffes (Compron et al., Lab. Invest. 60, 600-612 (1989)).
L'autogreffe d'épiderme reconstitué à partir d'une biopsie cutanée sur le patient, suivie d'une culture des kératinocytes pendant environ trois semaines serait la meilleure solution, car elle éviterait tout risque de rejet immunologique. Néanmoins, cette solution présente l'inconvénient d'être longue à mettre en oeuvre.
<Desc/Clms Page number 16>
A l'heure actuelle, pour le chirurgien, l'allogreffe expansée de peau de cadavre reste le meilleur substitut cutané. Cependant, cette solution n'est pas viable à long terme car, outre le problème du manque de donneurs, cette solution expose le patient à une contamination virale potentielle.
C'est pourquoi, des efforts ont été entrepris afin de proposer une alternative à ces méthodes.
La culture de cellules souches embryonnaires humaines étant désormais possible en laboratoire, les méthodes représentées permettent l'obtention illimitée d'épidermes reconstitués greffables sans risque de rejet, les cellules embryonnaires souches présentant le double avantage d'être immortelles sans être immortalisées et d'être aisément manipulables par transfection et recombinaison homologue. Pour que ces kératinocytes persistent chez le patient receveur, des modifications de certains loci, tels que celui des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité qui jouent un rôle dans la reconnaissance des cellules étrangères par le système immunitaire, permettent de créer des lignées totipotentes universelles immunotolérantes.
<Desc/Clms Page number 17>
Effet de différentes matrices sur la différenciation kératinocytaire
<tb>
<tb> Matrices <SEP> J8 <SEP> J15
<tb> Verre
<tb> Gélatine-/+ <SEP> +
<tb> FHN <SEP> +++ <SEP> ++++
<tb> 3T3 <SEP> +++ <SEP> ++++
<tb> 804G <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Racll <SEP> P <SEP> ++ <SEP> ++++
<tb> SCC25 <SEP> ++ <SEP> +
<tb> MCF10 <SEP> +++ <SEP> +
<tb> KHSV <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> NBTII <SEP> + <SEP> +++
<tb> HaCaT <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb> Matrices <SEP> J8 <SEP> J15
<tb> Verre
<tb> Gélatine-/+ <SEP> +
<tb> FHN <SEP> +++ <SEP> ++++
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<tb> 804G <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Racll <SEP> P <SEP> ++ <SEP> ++++
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<tb> MCF10 <SEP> +++ <SEP> +
<tb> KHSV <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> NBTII <SEP> + <SEP> +++
<tb> HaCaT <SEP> + <SEP> +
<tb>
Les cellules ES ont été déposées sur des matrices sécrétées par des cellules d'origines différentes. La présence de kératinocytes néo-formés a été détectée à 8 (J8) et 15 jours (J15) par immunomarquage anti-kératinel4.
La présence de cellules K14-positives est représentée quantitativement par : (-) : absence de kératinocyte ; (+) faible quantité de kératinocytes ; quantités moyennes (++), fortes (+++) et très fortes (++++) de kératinocytes.
Cette quantification représente les résultats de plusieurs expériences indépendantes, exécutées en triplicat.
<Desc/Clms Page number 18>
La présente invention propose donc une méthode originale pour induire la différentiation de cellules souches embryonnaires de mammifères en kératinocytes, comprenant les étapes suivantes : - isolement d'une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères, - culture en parallèle des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié en présence de LIF, - ensemencement des cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire, - culture des cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées en absence du LIF pendant un délai suffisant pour obtenir la différentiation en kératinocytes, et - recueillement des kératinocytes ainsi obtenus.
Avantageusement, le délai de culture des cellules souches embryonnaires ensemencées sur la matrice extracellulaire est efficace dès le 8ème jour et inférieur à 21 jours, et les cellules dont on récupère la matrice extracellulaire sont des cellules humaines, à l'exception des cellules germinales.
Claims (4)
1. Méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en kératinocytes, comprenant les étapes suivantes : - isolement d'une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères, - culture en parallèle des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié en présence de LIF, - ensemencement des cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire, - culture des cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées en absence de LIF pendant un délai suffisant pour leur différenciation en kératinocytes, et - recueillement des kératinocytes ainsi obtenus.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules souches embryonnaires sont maintenues préalablement à l'état indifférencié à l'aide du facteur LIF, à une concentration de l'ordre de
10 unités/ml de culture.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le délai de culture des cellules souches embryonnaires ensemencées sur la matrice extracellulaire est efficace dès le Sème jour et inférieur à 21 jours.
4. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules dont on récupère la matrice extracellulaire sont des cellules humaines, à l'exception des cellules germinales.
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