FR2769093A1 - Detecting platelet activation and predicting risk of thrombosis - Google Patents
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Abstract
Description
L'invention concerne un procédé in vitro d'évaluation des risques thrombotiques à l'origine d'accidents vasculaires, notamment artériels chez un sujet par le dosage du fibrinogène plasmatique homodimérique yy et du fibrinogène plasmatique hétérodimérique W' et évaluation du rapport des concentrations fibrinogène hétérodimérique I fibrinogène homodimérique. The invention relates to an in vitro method for evaluating the thrombotic risks that cause vascular accidents, in particular arterial in a subject, by assaying homodimeric plasma fibrinogen yy and heterodimeric plasma fibrinogen W 'and evaluating the ratio of fibrinogen concentrations. heterodimeric I homodimeric fibrinogen.
La thrombose est un processus biologique qui consiste en la coagulation du sang (ou formation d'un thrombus) à l'intérieur d'une cavité vasculaire (veine, artère) ou d'une cavité cardiaque. Elle aboutit à l'obturation de la lumière du vaisseau ou de la cavité concernée et interdit toute circulation sanguine. Les mécanismes mis en jeu dans la formation d'une thrombose sont les mêmes que ceux de l'hémostase (pour arrêter les hémorragies spontanées, ou pathologiques). Par ailleurs, dans le système artériel,
I'athérosclérose est un processus pathologique que l'on peut définir comme une maladie artérielle généralisée associant des dépôts lipidiques (ou athérome) sur la surface interne des parois artérielles à une sclérose (rigidification) de ces parois vascuiaires. L'athérosclérose; qui contribue à réduire la lumière d'un vaisseau et le débit sanguin, est un facteur déclenchant de la thrombose.Thrombosis is a biological process that involves blood clotting (or thrombus formation) within a vascular cavity (vein, artery) or heart chamber. It results in the filling of the lumen of the vessel or cavity concerned and prevents any blood circulation. The mechanisms involved in the formation of a thrombosis are the same as those of hemostasis (to stop spontaneous hemorrhages, or pathological). Moreover, in the arterial system,
Atherosclerosis is a pathological process that can be defined as a generalized arterial disease associating lipid deposits (or atheroma) on the inner surface of the arterial walls to a sclerosis (stiffening) of these vascular walls. Atherosclerosis; which helps to reduce the light of a vessel and blood flow, is a triggering factor of thrombosis.
L'obturation vasculaire pathologique, consécutive à la thrombose associée à l'athérosclérose (on parle d'athérothrombose lorsque les deux sont conjuguées), est à l'origine d'accidents qui sont localisés le plus fréquemment au niveau cardiaque, cérébral, au niveau des membres inférieurs mais peuvent intervenir également dans tous les autres organes. Ces accidents peuvent être de gravité diverse. On connaît l'accident vasculaire cérébral (AVC), les ischémies cérébrales, les ischémies cardiaques, les insuffisances coronaires (IC) et l'infarctus du myocarde (IM), les artériopathies oblitérantes des membres inférieurs (AOMI), I'infarctus mésentérique, etc. Pathological vascular closure, secondary to thrombosis associated with atherosclerosis (atherothrombosis when both are conjugated), is responsible for accidents that are most frequently localized at the cardiac, cerebral lower limbs but can also intervene in all other organs. These accidents can be of different gravity. Stroke, cerebral ischemia, cardiac ischemia, coronary insufficiency (CI) and myocardial infarction (MI), peripheral arterial disease of the lower limb (AOMI), mesenteric infarction, etc.
Le mécanisme de la thrombose en circulation artérielle passe par
les étapes initiales essentielles suivantes qui impliquent préférentiellement les plaquettes sanguines. Ces étapes sont;
- I'adhésion des plaquettes sanguines circulantes à la paroi vasculaire lésée sur laquelle elles reconnaissent l'exposition de surfaces de réaction,
- I'activation des plaquettes adhérentes qui expriment des récepteurs de surface pour des molécules d'adhésion, et qui libèrent des médiateurs qui viennent recruter de nouvelles plaquettes circulantes,
- I'agrégation de ces plaquettes à la surface des plaquettes déjà déposées et formation d'un thrombus plaquettaire.The mechanism of thrombosis in arterial circulation involves
the following essential initial steps that preferentially involve blood platelets. These steps are;
The adhesion of the circulating blood platelets to the damaged vascular wall on which they recognize the exposure of reaction surfaces,
The activation of adherent platelets which express surface receptors for adhesion molecules and release mediators which recruit new circulating platelets;
The aggregation of these platelets on the surface of already deposited platelets and formation of a platelet thrombus.
Parallèlement, les surfaces exposées déclenchent le processus en cascade de la coagulation alors que la surface des plaquettes déposées activées contribue à développer la formation de fibrine (à laquelle aboutit l'activation de la coagulation plasmatique) qui vient compléter et renforcer les thrombus plaquettaires, en même temps que la thrombine, qui est générée par l'activation de la coagulation. At the same time, the exposed surfaces trigger the cascading process of coagulation while the activated platelet-deposited surface contributes to the development of fibrin formation (which results in the activation of plasma coagulation) which complements and reinforces platelet thrombi. same time as thrombin, which is generated by activation of coagulation.
Ce schéma coopératif entre les plaquettes et la coagulation aboutit à la formation du thrombus dont le développement va rentrer en compétition avec, d'une part, les forces circulatoires et d'autre part, avec des processus actifs de destruction dont le processus fibrinolytique. Le thrombus peut donc, soit rester limité à la paroi jusqu'à une prochaine évolution de la lésion, soit se dissocier et être responsable d'accidents emboliques, soit grossir jusqu'à devenir totalement obstructif et bloquer l'irrigation des tissus et organes en aval qui donc meurent par ischémie. This cooperative scheme between platelets and coagulation results in the formation of the thrombus, the development of which will compete with, on the one hand, the circulatory forces and, on the other hand, with active processes of destruction including the fibrinolytic process. The thrombus can either remain limited to the wall until a future evolution of the lesion, or dissociate and be responsible for embolic accidents, or grow to become totally obstructive and block the irrigation of tissues and organs in downstream who therefore die by ischemia.
Une des méthodes de prévention efficaces contre les accidents vasculaires consiste précisément en l'administration de médicaments, les antiagrégants plaquettaires, qui vont inhiber la formation du thrombus plaquettaire. En effet, lors de l'activation des plaquettes, un récepteur spécifique du fibrinogène apparaît à leur surface. II s'agit d'une protéine membranaire, responsable de l'agrégation plaquettaire, appelée complexe
GPllb/llla, ou intégrine allb-ss3. Lors de l'activation plaquettaire, I'intégrine allb-Q3 devient le récepteur du fibrinogène. Par sa structure dimérique, comme cela est indiqué ci-après, le fibrinogène peut se fixer sur deux plaquettes adjacentes et permettre la formation de ponts moléculaires entre les plaquettes qui est le substratum anatomique de l'agrégat plaquettaire.One of the most effective prevention methods against stroke is the administration of drugs, antiplatelet agents, which will inhibit platelet thrombus formation. Indeed, during platelet activation, a specific fibrinogen receptor appears on their surface. It is a membrane protein, responsible for platelet aggregation, called complex
GPllb / llla, or integrin allb-ss3. During platelet activation, allb-Q3 integrin becomes the fibrinogen receptor. By its dimeric structure, as indicated below, the fibrinogen can bind to two adjacent platelets and allow the formation of molecular bridges between platelets which is the anatomical substratum of the platelet aggregate.
II existe des sujets plus exposés que d'autres au risque thrombotique, et donc aux accidents vasculaires. Certains le sont pour des raisons génétiques - par exemple, déficience en gène codant pour un inhibiteur de la coagulation - ou autres. Ces sujets sont en état d'hypercoagulabilité potentielle et risquent un accident vasculaire. Dans le sens d'un hyperfonctionnement, pour des raisons d'implications préférentielles, les anomalies dans le système de la coagulation, traduisent surtout un risque thrombotique veineux et les anomalies dans le système plaquettaire, traduisent surtout un risque thrombotique artériel. There are more exposed subjects than others to thrombotic risk, and therefore to vascular accidents. Some are for genetic reasons - for example, gene deficiency coding for a coagulation inhibitor - or others. These subjects are in a state of potential hypercoagulability and risk a stroke. In the sense of a hyperfunction, for reasons of preferential implications, abnormalities in the coagulation system, mainly reflect venous thrombotic risk and abnormalities in the platelet system, mainly reflect arterial thrombotic risk.
Pour les raisons qui précèdent et pour pouvoir appliquer la meilleure méthode préventive ou thérapeutique, il est essentiel de pouvoir estimer le risque thrombotique, notamment artériel/athérothrombotique, du sujet à un moment donné. Dans cette optique, I'une des meilleures approches est d'évaluer l'état d'activation plaquettaire, dans une phase encore asymptomatique, en vue de notamment prévenir les accidents ischémiques cliniques, conséquences des processus thrombotiques intra-artériels. For the foregoing reasons, and in order to be able to apply the best preventive or therapeutic method, it is essential to be able to estimate the thrombotic risk, particularly arterial / atherothrombotic, of the subject at a given moment. From this perspective, one of the best approaches is to evaluate the state of platelet activation, in a phase still asymptomatic, in particular to prevent clinical ischemic events, consequences of intra-arterial thrombotic processes.
Cependant, de nombreux facteurs non spécifiques peuvent favoriser une activation plaquettaire non pathologique du sujet comme, par exemple, I'effort physique, le régime nutritionnel, notamment lipidique, le mode de prélèvement du sang, le mode de conservation des plaquettes et divers facteurs environnementaux. Tous ces éléments contribuent donc à la difficulté actuelle d'évaluer directement l'état d'activation plaquettaire. However, many nonspecific factors may promote non-pathological platelet activation of the subject such as, for example, physical exertion, nutritional regime, including lipid, blood collection mode, platelet storage mode, and various environmental factors. . All of these elements therefore contribute to the current difficulty of directly assessing the state of platelet activation.
II est également établi que le fibrinogène plasmatique, en plus d'être un marqueur de la réaction inflammatoire, est un marqueur de risque cardio-vasculaire ou athérothrombotique majeur. Une augmentation de 1 girl de sa concentration double la probabilité de mortalité dans les 6 années (Banerjee et al. Thromb. Haemost. 1992, 68, pp 261-263). Un faible taux de fibrinogène plasmatique caractérise les sujets à faible risque d'accidents vasculaires. It is also established that plasma fibrinogen, in addition to being a marker of the inflammatory reaction, is a major cardiovascular or atherothrombotic risk marker. An increase of 1 girl in her concentration doubles the probability of mortality within 6 years (Banerjee et al., Thromb Haemost 1992, 68, pp 261-263). Low plasma fibrinogen levels characterize subjects at low risk of stroke.
Un des meilleurs modes d'appréciation - bien qu'indirect - de l'activation des plaquettes sera donc d'apprécier le degré d'implication du fibrinogène dans le processus d'agrégation plaquettaire. Le fibrinogène, polypeptide soluble du sang, lors de la coagulation consécutive à une phase hémorragique, sous l'action de la thrombine, est clivé en fibrine insoluble, constitutive du caillot interrompant l'hémorragie. One of the best - albeit indirect - ways of assessing platelet activation will therefore be to appreciate the degree of involvement of fibrinogen in the platelet aggregation process. Fibrinogen, a soluble polypeptide of the blood, during coagulation following a haemorrhagic phase, under the action of thrombin, is cleaved into insoluble fibrin, constitutive of the clot interrupting hemorrhage.
Le fibrinogène, composé de masse moléculaire d'environ 340
KDa, est constitué de deux parties ( demi-molécules ) chacune constituée de 3 chaînes polypeptidiques : la chaîne Aa composée de 610 acides aminés (AA), la chaîne BQ composée de 461 AA, et la chaîne y composée de 411 AA, encore appelée yA ou y. Ainsi, la structure complète du fibrinogène est de type Aa2Bss2y2. Les chaînes du fibrinogène sont reliées entre elles par des ponts disulfures.Fibrinogen, composed of about 340 molecular weight
KDa, consists of two parts (half-molecules) each consisting of 3 polypeptide chains: the Aa chain composed of 610 amino acids (AA), the BQ chain composed of 461 AA, and the y chain composed of 411 AA, also called yA or y. Thus, the complete structure of fibrinogen is of the type Aa2Bss2y2. The fibrinogen chains are interconnected by disulfide bridges.
Le fibrinogène, par ailleurs, est une molécule hautement polymorphe et hétérogène. En ce qui concerne la taille moléculaire, il existe plusieurs variants de synthèse de chacune des chaînes, des possibilités d'action enzymatique ou non (glycosylation, sulfatation...) et surtout des possibilités de dégradation partielle par des activités protéasiques circulantes. Fibrinogen, on the other hand, is a highly polymorphous and heterogeneous molecule. Regarding the molecular size, there are several synthetic variants of each chain, the possibility of enzymatic action or not (glycosylation, sulfation ...) and especially the possibility of partial degradation by circulating protease activities.
L'ensemble de ces phénomènes fait qu'il n'existe pas une
molécule de fibrinogène mais de nombreuses possibilités de formes de fibrinogène présentes dans un seul individu.All of these phenomena mean that there is no such thing as
fibrinogen molecule but many possibilities of forms of fibrinogen present in a single individual.
Jusqu'à présent, il n'existe qu'un test permettant de distinguer les molécules à chaîne Aa complète ou à chaîne Aa raccourcie, que l'on appelle
le fibrinogène de haut poids moléculaire [HMW] et le fibrinogène de bas poids
moléculaire [LMW] (Henschen Ah., Thromb Hemostasis, (1993), 70, pp 42-47;
Nieuwenhuizen W., Eur Heart J., (1995), 16 sup. A, pp 6-10; Hoegee de Nobel
E et al., Thromb Hemostasis, (1988), 60, pp 415418).So far, there is only one test to distinguish the complete Aa chain or shortened Aa chain molecules, which we call
high molecular weight fibrinogen [HMW] and low weight fibrinogen
Molecular [LMW] (Henschen Ah., Thromb Hemostasis, (1993), 70, pp 42-47;
Nieuwenhuizen W., Eur Heart J., (1995), 16 sup. A, pp 6-10; Hoegee from Nobel
E et al., Thromb Hemostasis, (1988), 60, pp 415418).
Qualitativement, des variations sont connues au niveau de chacun de ces types de chaînes du fibrinogène. Ainsi, la chaîne y ou y ou y50 peut se retrouver sous forme de variant structurel appelé y', ou y5,5. Le variant structurel appelé y' contient une séquence différente et additionnelle d'acides aminés (AA 408427) insérée, par un mécanisme d'épissage alternatif sur la chaîne y de base (Finlayson et Mosesson, Biochemistry (1963), 2, pp 4246;
Mosesson et al., J. Biol. Chem., (1972), 247, pp 5223-52-27; Kirschbaum et al., Blood, (1992); 79, n" 10, pp 2643-2648; Siebenlist K. et al., Biochem.Qualitatively, variations are known at each of these types of fibrinogen chains. Thus, the chain y or y or y50 can be found in the form of a structural variant called y ', or y5,5. The structural variant designated y 'contains a different and additional sequence of amino acids (AA 408427) inserted, by an alternative splicing mechanism on the base y chain (Finlayson and Mosesson, Biochemistry (1963), 2, pp 4246;
Mosesson et al., J. Biol. Chem., (1972), 247, pp 5223-52-27; Kirschbaum et al., Blood, (1992); 79, No. 10, pp 2643-2648, Siebenlist K. et al., Biochem.
(1996), 35, pp 10448-10453).(1996), 35, pp. 10448-10453).
Le tableau I ci-après indique les séquences C-terminales des chaînes y et y' du fibrinogène. Table I below shows the C-terminal sequences of the γ and γ chains of fibrinogen.
Le fibrinogène contenant une chaîne y' est un variant fonctionnellement non actif dans le processus de l'agrégation plaquettaire (Haidaris et al., Blood, (1989), 74 no 2, pp. 743-750). Il n'a pas d'affinité pour le récepteur spécifique du fibrinogène qui est la protéine GPllb/llla. Y-chain containing fibrinogen is a functionally non-active variant in the process of platelet aggregation (Haidaris et al., Blood, (1989), 74 No. 2, pp. 743-750). It has no affinity for the specific fibrinogen receptor which is GPllb / IIIa protein.
Chaque molécule de fibrinogène existe donc sous la forme de fibrinogène homodimérique yy ou de fibrinogéne hétérodimérique yy'. Ce dernier correspond à 5 à 7 % du fibrinogène plasmatique total. Le fibrinogène homodimérique y'y' n'existerait pas. L'ensemble fibrinogène homodimérique γγ et fibrinogéne hétérodimérique yy' sera appelé par la suite fibrinogène total. Each fibrinogen molecule thus exists in the form of homodimeric fibrinogen yy or heterodimeric fibrinogen yy '. The latter corresponds to 5 to 7% of the total plasma fibrinogen. Homodimeric fibrinogen y'y 'would not exist. The homodimeric fibrinogen group & gamma γ and fibrinogen heterodimeric yy 'will be called thereafter total fibrinogen.
TABLEAU I
<tb> Acide <SEP> aminé <SEP> CHAINE <SEP> y <SEP> CHAINE <SEP> y'
<tb> <SEP> N <SEP> (γ50) <SEP> <SEP> (γ57,5
<tb> <SEP> 397 <SEP> Gly <SEP> Gly
<tb> <SEP> 398 <SEP> Gln <SEP> Gln
<tb> <SEP> 399 <SEP> Gln <SEP> Gln
<tb> <SEP> 400 <SEP> His <SEP> His
<tb> <SEP> 401 <SEP> His <SEP> His
<tb> <SEP> 402 <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> <SEP> 403 <SEP> Gly <SEP> Gly
<tb> <SEP> 404 <SEP> Gly <SEP> Gly
<tb> <SEP> 405 <SEP> Ala <SEP> Ala
<tb> <SEP> 406 <SEP> Lys <SEP> Lys
<tb> <SEP> 407 <SEP> Gln <SEP> Gln
<tb> <SEP> 408 <SEP> Ala <SEP> Val
<tb> <SEP> 409 <SEP> Gly <SEP> Arg
<tb> <SEP> 410 <SEP> Asp <SEP> Pro
<tb> <SEP> 411 <SEP> Val <SEP> Glu
<tb> <SEP> 412 <SEP> His
<tb> <SEP> 413 <SEP> Pro
<tb> <SEP> 414 <SEP> Ala
<tb> <SEP> 415 <SEP> Glu
<tb> <SEP> 416 <SEP> Thr
<tb> <SEP> 417 <SEP> Glu
<tb> <SEP> 418 <SEP> Tyr
<tb> <SEP> 419 <SEP> As
<tb> <SEP> 420 <SEP> Ser
<tb> <SEP> 421 <SEP> ~~ <SEP> Leu
<tb> <SEP> 422 <SEP> Tyr
<tb> <SEP> 423 <SEP> Pro
<tb> <SEP> 424 <SEP> Glu
<tb> <SEP> 425 <SEP> Asp
<tb> <SEP> 426 <SEP> Asp
<tb> <SEP> 427 <SEP> Leu
<tb>
Les techniques actuelles de dosage du fibrinogène plasmatique telles que la méthode pondéra le, la méthode dite cinétique, la méthode de Von
Clauss - la mesure du temps de coagulation reflétant le fibrinogéne fonctionnel -, les tests immuno-enzymatiques , I'immunodiffusion radiale reflétant le fibrinogène antigéniquement intact - ne sont pas toujours cohérentes entre elles car elles apprécient divers aspects du fibrinogène.<tb> Acid <SEP> amine <SEP> CHAIN <SEP> y <SEP> CHAIN <SEP> y '
<tb><SEP> N <SEP>(γ 50) <SEP><SEP>(γ 57.5
<tb><SEP> 397 <SEP> Gly <SEP> Gly
<tb><SEP> 398 <SEP> Gln <SEP> Gln
<tb><SEP> 399 <SEP> Gln <SEP> Gln
<tb><SEP> 400 <SEP> His <SEP> His
<tb><SEP> 401 <SEP> His <SEP> His
<tb><SEP> 402 <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb><SEP> 403 <SEP> Gly <SEP> Gly
<tb><SEP> 404 <SEP> Gly <SEP> Gly
<tb><SEP> 405 <SEP> Ala <SEP> Ala
<tb><SEP> 406 <SEP> Lys <SEP> Lys
<tb><SEP> 407 <SEP> Gln <SEP> Gln
<tb><SEP> 408 <SEP> Ala <SEP> Val
<tb><SEP> 409 <SEP> Gly <SEP> Arg
<tb><SEP> 410 <SEP> Asp <SEP> Pro
<tb><SEP> 411 <SEP> Val <SEP> Glu
<tb><SEP> 412 <SEP> His
<tb><SEP> 413 <SEP> Pro
<tb><SEP> 414 <SEP> Ala
<tb><SEP> 415 <SEP> Glu
<tb><SEP> 416 <SEP> Thr
<tb><SEP> 417 <SEP> Glu
<tb><SEP> 418 <SEP> Tire
<tb><SEP> 419 <SEP> As
<tb><SEP> 420 <SEP> Ser
<tb><SEP> 421 <SEP> ~~ <SEP> Leu
<tb><SEP> 422 <SEP> Tire
<tb><SEP> 423 <SEP> Pro
<tb><SEP> 424 <SEP> Glu
<tb><SEP> 425 <SEP> Asp
<tb><SEP> 426 <SEP> Asp
<tb><SEP> 427 <SEP> Leu
<Tb>
The current plasma fibrinogen assay techniques such as the weighted method, the so-called kinetic method, the Von method
Clauss - the measurement of coagulation time reflecting functional fibrinogen - enzyme immunoassays, radial immunodiffusion reflecting antigenically intact fibrinogen - are not always consistent because they appreciate various aspects of fibrinogen.
De plus, les méthodes d'essai quantitatives actuelles mesurent la totalité du (des) fibrinogène(s), chacune sous un angle différent. Or, il apparaît de plus en plus important de déterminer et quantifier les variants moléculaires pour pouvoir déterminer leur fonctionnalité. In addition, the current quantitative assay methods measure all of the fibrinogen (s), each from a different angle. However, it is becoming increasingly important to determine and quantify molecular variants to determine their functionality.
W. Nieuwenhuizen (Nieuwenhuizen W., Eur. Heart Journal, 1995, 16 Sup. A, pp 6-10) a proposé et développé des protocoles en vue de mesurer le fibrinogène fonctionnel (Von Clauss) par le ratio de fibrinogène de haut poids moléculaire (HMW) sur le fibrinogène de bas poids moléculaire (LMW), détectés par un test immunoenzymatique. Ce ratio parait augmenter chez les patients atteints de maladies cardio-vasculaires et pourrait apporter une solution plus appropriée aux besoins. W. Nieuwenhuizen (Nieuwenhuizen W, Eur Heart Journal, 1995, 16 Sup A, pp 6-10) proposed and developed protocols for measuring functional fibrinogen (Von Clauss) by high-fibrinogen ratio. molecular weight (HMW) on low molecular weight fibrinogen (LMW), detected by enzyme immunoassay. This ratio seems to increase in patients with cardiovascular disease and could provide a more appropriate solution to the needs.
D'autres facteurs d'évaluation du risque cardio-vasculaire sont connus. La demande WO 93/00364 décrit un essai de détection de la fibrinolyse et de la fibrinogénolyse à l'aide de marqueurs C-terminaux de la chaîne Aa. Other cardiovascular risk assessment factors are known. The application WO 93/00364 describes an assay for detecting fibrinolysis and fibrinogenolysis using C-terminal markers of the Aa chain.
Les chaînes y et y' ont été étudiées sur le plan épitopique à l'aide d'anticorps spécifiques. Ainsi, des anticorps monoclonaux (Acm) dirigés contre les chaînes y (Acm H9B7 et J88B) ou y' (Acm L2B) ont été décrits par Haidaris et al. (Blood, (1989), 74 No 2, pp. 743-750). Des essais de type immunoempreinte (Western Blot), utilisant ces Acm à des fins purement analytiques et qualitatives ont été mis en oeuvre. Or, actuellement, il n'existe aucun essai quantitatif, à visée diagnostique ou pronostique, des chaînes y ou
II existe donc un besoin d'avoir une méthode prédictive de l'accident vasculaire, notamment artériel, se basant sur le degré d'activation plaquettaire, et qui soit fiable, robuste, reproductible, standardisée, permettant d'établir des valeurs fréquentes applicables à un seul individu et le moins influencées possible par les variations liées au prélèvement du sang.The y and y 'chains have been studied epitopically using specific antibodies. Thus, monoclonal antibodies (mAb) directed against y chains (mAb H9B7 and J88B) or y '(mAb L2B) have been described by Haidaris et al. (Blood, (1989), 74 No. 2, pp. 743-750). Western blot tests using these mAbs for purely analytical and qualitative purposes have been implemented. However, at present, there are no quantitative tests for diagnostic or prognostic purposes,
There is therefore a need to have a predictive method of the vascular accident, in particular arterial, based on the degree of platelet activation, and which is reliable, robust, reproducible, standardized, making it possible to establish frequent values applicable to a single individual and the least influenced possible by the variations related to the collection of blood.
II a maintenant été trouvé un procédé de dosage du fibrinogène, notamment du fibrinogène homodimérique W et du fibrinogéne hétérodimérique W' permettant d'établir le degré de l'activation plaquettaire et permettant ainsi d'évaluer le risque d'accident vasculaire, notamment artériel. It has now been found a method of assaying fibrinogen, in particular homodimeric fibrinogen W and heterodimeric fibrinogen W 'to establish the degree of platelet activation and thus to assess the risk of stroke, including arterial.
Notamment, il a été trouvé, de façon surprenante, que le dosage conjoint de fibrinogène homodimérique W et de fibrinogène hétérodimérique W' permet d'établir un rapport entre les concentrations du fibrinogène homodimérique yy et du fibrinogéne hétérodimérique yy' qui reflète l'état d'activation des plaquettes.In particular, it has been found, surprisingly, that the joint determination of homodimeric fibrinogen W and of heterodimeric fibrinogen W 'makes it possible to establish a ratio between the concentrations of homodimeric fibrinogen yy and heterodimeric fibrinogen yy' which reflects the state of d platelet activation.
La présente invention a pour objet un procédé permettant de mettre en évidence l'activation plaquettaire et de prédire les risques thrombotiques chez des sujets par l'évaluation du rapport: [y']l[y] où [y] est la concentration de fibrinogène homodimérique yy et [y'] est la concentration de fibrinogène hétérodimérique yy. The present invention provides a method for demonstrating platelet activation and predicting thrombotic risks in subjects by evaluating the ratio: [y '] 1 [y] where [y] is the concentration of fibrinogen homodimeric yy and [y '] is the concentration of heterodimeric fibrinogen yy.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de dosage de fibrinogène homodimérique W et de fibrinogéne hétérodimérique yy' du fibrinogéne plasmatique dans un échantillon de plasma caractérisé en ce que l'on met en contact un échantillon plasmatique avec au moins un anticorps spécifique du fibrinogène total et au moins un anticorps spécifique de fibrinogène hétérodimérique yy', dans des conditions permettant la formation de complexes [fibrinogène total-anticorps spécifique] et [fibrinogène hétérodimérique yy'-anticorps spécifique], que l'on détermine la concentration du fibrinogéne plasmatique total et celle du fibrinogène hétérodimérique W' et que l'on déduit la concentration de fibrinogène homodimérique W par la relation;
[y] = [total] - hi], dans laquelle [y] est la concentration de fibrinogène homodimérique W', [y'] est la concentration de fibrinogène hétérodimérique yy', et [total] est la concentration du fibrinogène plasmatique total.The present invention more particularly relates to a method for determining homodimeric fibrinogen W and fibrinogen heterodimeric yy 'plasma fibrinogen in a plasma sample characterized in that a plasma sample is brought into contact with at least one antibody specific for total fibrinogen and at least one heterodimeric fibrinogen specific antibody yy ', under conditions allowing the formation of complexes [total fibrinogen-specific antibody] and [heterodimeric fibrinogen yy'-specific antibody], that the concentration of plasma fibrinogen is determined total and that of the heterodimeric fibrinogen W 'and that the homodimeric fibrinogen concentration W is deduced by the relation;
[y] = [total] - hi], where [y] is the homodimeric fibrinogen concentration W ', [y'] is the concentration of heterodimeric fibrinogen yy ', and [total] is the concentration of total plasma fibrinogen.
La présente invention a également pour objet un procédé in vitro d'évaluation des risques thrombotiques d'un sujet, caractérisé en ce que l'on dose spécifiquement le fibrinogène homodimérique yy et le fibrinogène hétérodimérique yy' du fibrinogène plasmatique dudit sujet et que l'on établit le rapport: [γ']/[γ] où [y] est la concentration de fibrinogène homodimérique γγ et [y'] est la concentration de fibrinogène hétérodimérique n', la concentration de fibrinogéne homodimérique yy étant plus particulièrement déterminée selon la relation [y] = [total] - [y']. The subject of the present invention is also an in vitro method for evaluating the thrombotic risks of a subject, characterized in that the homodimeric fibrinogen yy and the heterodimeric fibrinogen yy 'of the plasma fibrinogen of said subject are specifically measured and that the the ratio: [γ '] / [γ] where [y] is the concentration of homodimeric fibrinogen γ γ and [y '] is the concentration of heterodimeric fibrinogen n', the concentration of homodimeric fibrinogen yy being more particularly determined according to the relation [y] = [total] - [y '].
La présente invention a également pour objet un procédé in vitro d'évaluation des risques thrombotiques d'un sujet, caractérisé en ce que l'on met en contact un échantillon plasmatique du sujet avec au moins un anticorps spécifique de fibrinogène hétérodimérique W' et au moins un anticorps reconnaissant le fibrinogène homodimérique W, dans des conditions permettant la formation de complexes [fibrinogène hétérodimérique W'- anticorps spécifique] et [fibrinogène homodimérique n-anticorps], que l'on détermine la concentration de fibrinogéne hétérodimérique W' et de fibrinogène homodimérique yy, et que l'on établit le rapport:
ysty = [y']/[y] où [y] est la concentration de fibrinogène homodimérique γγ et où [y'] est la concentration de fibrinogène hétérodimérique yy. The subject of the present invention is also an in vitro method for evaluating the thrombotic risks of a subject, characterized in that a plasma sample of the subject is brought into contact with at least one heterodimeric fibrinogen specific antibody W 'and less an antibody recognizing homodimeric fibrinogen W, under conditions allowing the formation of complexes [heterodimeric fibrinogen W'-specific antibody] and [homodimeric fibrinogen n-antibody], which is determined the concentration of heterodimeric fibrinogen W 'and fibrinogen homodimeric yy, and that the report is made:
ysty = [y '] / [y] where [y] is the concentration of homodimeric fibrinogen γγ and where [y '] is the concentration of heterodimeric fibrinogen yy.
La présente invention a également pour objet un procédé in vitro d'évaluation des risques thrombotiques d'un sujet caractérisé en ce que l'on met en contact un échantillon plasmatique avec au moins un anticorps spécifique du fibrinogène total et au moins un anticorps spécifique de fibrinogène hétérodimérique W' dans des conditions permettant la formation de complexes [fibrinogène total-anticorps spécifique] et [fi brinogène hétérodimérique w'-anticorps spécifique], que i'on détermine ensuite la concentration du fibrinogéne total et celle de fibrinogène hétérodimérique W' et que l'on établit le rapport: [γ']/([total]-[γ']) où [y'] est la concentration de fibrinogène hétérodimérique yy' et [total] est la concentration du fibrinogène plasmatique total. The subject of the present invention is also an in vitro method for evaluating the thrombotic risks of a subject, characterized in that a plasma sample is brought into contact with at least one antibody specific for total fibrinogen and at least one antibody specific for heterodimeric fibrinogen W 'under conditions allowing the formation of complexes [total fibrinogen-specific antibody] and [fibrinogen heterodimeric w'-specific antibody], which is then determined the concentration of total fibrinogen and that of heterodimeric fibrinogen W' and that the ratio: [γ '] / ([total] - [γ']) where [y '] is the concentration of heterodimeric fibrinogen yy' and [total] is the concentration of total plasma fibrinogen.
La présente invention a également pour objet un procédé de dosage, caractérisé en ce que l'on met en contact sur un support solide, sur lequel a été adsorbé du fibrinogène purifié, un anticorps spécifique du fibrinogène total, I'échantillon plasmatique à doser et au moins un anticorps spécifique de fibrinogène hétérodimérique W', dans des conditions permettant la formation de complexes [fibrinogène total-anticorps spécifique] et [fibrinogène hétérodimérique w'-anticorps spécifique, que l'on détermine la concentration du fibrinogène plasmatique total et celle du fibrinogène hétérodimérique W
II a été trouvé de façon surprenante que la valeur du rapport des concentrations plasmatiques fibrinogène hétérodimérique γγ'/fibrinogène homodimérique 77 ([yl]/[y]) reflète l'état d'activation plaquettaire et permet de prédire l'absence ou la présence de risques d'accident vasculaire, notamment artériel, chez des sujets, notamment chez des sujets jeunes, en apparence bien portants. En effet, il a été mis en évidence que le rapport [y']/[y] varie selon les sujets et permet de distinguer des catégories d'individus bien caractérisées. Plus particulièrement, il a été démontré que les individus ayant un rapport de la concentration plasmatique en fibrinogène hétérodimérique ~' sur la concentration plasmatique en fibrinogène homodimérique 77 égal ou supérieur à 0,06, plus spécialement d'environ 0,08, étaient des sujets présentant un risque de problème vasculaire, notamment artériel, futur.The subject of the present invention is also an assaying method, characterized in that a total fibrinogen-specific antibody, the plasma sample to be assayed, is placed in contact on a solid support on which purified fibrinogen has been adsorbed. at least one heterodimeric fibrinogen specific antibody W ', under conditions allowing the formation of complexes [total fibrinogen-specific antibody] and [specific heterodimeric fibrinogen w'-antibody, which is determined the concentration of total plasma fibrinogen and that of heterodimeric fibrinogen W
It has surprisingly been found that the ratio of plasma heterodimeric fibrinogen to gamma; gamma / homodimeric fibrinogen ([yl] / [y]) reflects the state of platelet activation and can predict the absence of or the presence of risks of vascular accident, especially arterial, in subjects, especially in young subjects, apparently healthy. Indeed, it has been shown that the ratio [y '] / [y] varies according to the subjects and makes it possible to distinguish categories of well-characterized individuals. More particularly, individuals having a ratio of plasma heterodimeric fibrinogen concentration of homodimeric fibrinogen plasma concentration of greater than or equal to 0.06, more preferably of about 0.08, were presenting a risk of vascular problem, in particular arterial, future.
II est donc maintenant possible, selon l'invention, d'effectuer des dosages, par immunoessais conventionnels, permettant d'obtenir sur des populations sélectionnées des valeurs fréquentes ou de référence applicables à la détermination du risque de chaque individu. La comparaison du rapport [y'] I [y] déterminé chez un sujet avec la valeur de référence 0,08 permettrait par exemple de prédire un risque thrombotique futur. It is now possible, according to the invention, to perform assays, by conventional immunoassays, to obtain on selected populations frequent or reference values applicable to the determination of the risk of each individual. The comparison of the ratio [y '] I [y] determined in a subject with the reference value 0.08, for example, would make it possible to predict a future thrombotic risk.
Selon l'invention, diverses méthodes d'immunoessais peuvent être mises en oeuvre . test radio-immunologique (RIA), test immunoenzymatique (EIA, ELISA), test fluoro-immunologique (FIA), test immunochimioluminescent (CLIA), test par immunoagglutination (lA), immunonéphélémétrie, etc. According to the invention, various immunoassay methods can be implemented. radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA), fluoroimmunoassay (FIA), immunochemiluminescent test (CLIA), immunoagglutination test (IA), immunonephelemetry, etc.
Les formats de dosages immunologiques utilisés pourront être de type compétitif, sandwich, sandwich modifié - double épitope etc. The immunoassay formats used may be of competitive type, sandwich, modified sandwich - double epitope etc.
L'immunoessai peut être effectué en un temps, deux temps, ou encore trois temps immunologiques (étapes), etc..The immunoassay can be performed in one time, two times, or three immunological times (steps), etc.
Les déterminations pourront être réalisées en phase liquide ou sur support solide. Parmi les supports solides, on peut citer à titre d'exemple non limitatif:
les supports particulaires ou discontinus tels que les billes,
constituées de plastique (polystyrène, ou autre), de verre, ou de tout autre
matériau solide permettant une bonne séparation des fractions libres et liées.The determinations may be carried out in the liquid phase or on solid support. Among the solid supports, there may be mentioned by way of nonlimiting example:
particulate or discontinuous media such as beads,
made of plastic (polystyrene, or other), glass, or any other
solid material allowing good separation of free and bound fractions.
Les billes peuvent éventuellement être de type paramagnétique et
sédimenter dans un champ magnétique. On peut aussi citer les latex, dont
les latex de polystyrène, ou autres matériaux solides permettant une bonne
séparation des fractions libres et liées,
les supports continus tels que les microplaques, ou
plaques de microtitrage, faite en polystyrène ou toutes sortes de matériau,
pourvu qu'elles permettent une bonne séparation des fractions libres et liées,
ainsi qu'une lecture du signal appropriée. On citera, à titre d'exemple, les
microplaques disponibles chez NuncX, Danemark. On peut aussi utiliser les
bandelettes de nitrocellulose, etc.The beads may optionally be of paramagnetic type and
sediment in a magnetic field. We can also mention the latex, which
polystyrene latexes, or other solid materials allowing good
separation of free and bound fractions,
continuous supports such as microplates, or
microtiter plates, made of polystyrene or all kinds of material,
provided they allow a good separation of free and bound fractions,
as well as a reading of the appropriate signal. For example,
microplates available from NuncX, Denmark. We can also use
nitrocellulose strips, etc.
Le groupe de marquage pourra être de nature diverse comme, par exemple, radioisotopique (tel que 1'25, H3), enzymatique (notamment au moyen de phosphatase alcaline, peroxydase du raifort ou ss-galactosidase), fluorescent, (notamment au moyen de fluorescéine ou de rhodamine), particulaire, (notamment au moyen de latex ou d'or colloïdal). Ces groupes de marquage sont bien connus de l'homme du métier. The labeling group may be of various nature as, for example, radioisotope (such as 1'25, H3), enzymatic (in particular by means of alkaline phosphatase, horseradish peroxidase or s-galactosidase), fluorescent, (especially by means of fluorescein or rhodamine), particulate, (especially by means of latex or colloidal gold). These labeling groups are well known to those skilled in the art.
La conjugaison ou couplage des divers marqueurs sur les réactifs (antigènes ou anticorps) est effectué par des méthodes classiques (couplage au glutaraldéhyde, carbodiimide, anhydride maléique, succinique, agents hétérobifonctionnels etc.). The conjugation or coupling of the various markers on the reagents (antigens or antibodies) is carried out by conventional methods (coupling with glutaraldehyde, carbodiimide, maleic anhydride, succinic, heterobifunctional agents, etc.).
Les échantillons plasmatiques seront prélevés sur milieu anticoagulant (sur héparine, citrate, ou tout autre milieu connu adéquat) selon les règles de ponctions veineuses en usage. Ils pourront être utilisés immédiatement ou conservés congelés à - 20"C. The plasma samples will be taken on anticoagulant medium (on heparin, citrate, or any other suitable known medium) according to the rules of venipunctures in use. They may be used immediately or kept frozen at -20 ° C.
Les anticorps anti-fibrinogène hétérodimérique W' devront être exclusivement spécifiques du seul fibrinogène hétérodimérique W'. The heterodimeric anti-fibrinogen antibodies W 'must be exclusively specific for the only heterodimeric fibrinogen W'.
Le fibrinogène, le fibrinogène homodimérique W ou le fibrinogène hétérodimérique 77' peuvent être utilisés comme antigène marqué, lorsque l'on choisira un format d'essai par compétition. Le fibrinogène purifié utilisé peut être obtenu aisément auprès des fabricants ordinaires. Fibrinogen, homodimeric fibrinogen W or heterodimeric fibrinogen 77 'can be used as the labeled antigen when a competitive test format is chosen. The purified fibrinogen used can easily be obtained from ordinary manufacturers.
Pour la préparation des étalons, le fibrinogéne purifié peut être utilisé aussi bien pour le dosage du fibrinogène total que pour le dosage du fibrinogène homodimérique γγ et du fibrinogène hétérodimérique 77'. En effet, on sait que le fibrinogène purifié contient 5 % de fibrinogène hétérodimérique 77. For the preparation of the standards, the purified fibrinogen can be used both for the determination of total fibrinogen and for the determination of homodimeric fibrinogen & gamma γ and heterodimeric fibrinogen 77 '. Indeed, it is known that the purified fibrinogen contains 5% of heterodimeric fibrinogen 77.
La présente invention a pour objet une trousse de dosage du fibrinogène hétérodimérique 77' et du fibrinogène homodimérique γγ, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps spécifique du fibrinogène hétérodimérique 77' et un anticorps spécifique du fibrinogène homodimérique γγ, des moyens de détection des complexes formés [fibrinogène hétérodimérique 77' - anticorps spécifique] et [fibrinogène homodimérique W - anticorps spécifique] et éventuellement, au moins un réactif étalon de fibrinogène hétérodimérique W' et un réactif étalon de fibrinogène homodimérique 77. The present invention relates to a kit for assaying heterodimeric fibrinogen 77 'and homodimeric fibrinogen γgamma; characterized in that it contains at least one heterodimeric fibrinogen-specific antibody 77' and an antibody specific for homodimeric fibrinogen γ & numsp & numsp                                         detecting means of the complexes formed [heterodimeric fibrinogen 77 '- specific antibody] and [homodimeric fibrinogen W - specific antibody] and optionally, at least one heterodimeric fibrinogen standard reagent W' and a homodimeric fibrinogen standard reagent 77
La présente invention a encore pour objet une trousse de dosage du fibrinogène total et du fibrinogène hétérodimérique 77' dans un échantillon plasmatique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps spécifique du fibrinogène total, au moins un anticorps spécifique de fibrinogène hétérodimérique 77', des moyens de détection des complexes formés [fibrinogène hétérodimérique w'-anticorps spécifique] et [fibrinogène total-anticorps spécifique] et, éventuellement au moins un réactif étalon de fibrinogène total etlou au moins un réactif étalon de fibrinogène hétérodimérique γγ'. The subject of the present invention is also a kit for assaying total fibrinogen and heterodimeric fibrinogen 77 'in a plasma sample, characterized in that it contains at least one antibody specific for total fibrinogen, at least one heterodimeric fibrinogen-specific antibody. ', means for detecting complexes formed [heterodimeric fibrinogen w'-specific antibody] and [total fibrinogen-specific antibody] and, optionally, at least one total fibrinogen standard reagent and / or at least one heterodimeric fibrinogen standard reagent γ .
LEGENDE DES FIGURES
La figure 1 représente la distribution des valeurs du rapport [y']/[y] chez 200 sujets sains âgés de 18 à 45 ans.LEGEND OF FIGURES
Figure 1 shows the distribution of the values of the ratio [y '] / [y] in 200 healthy subjects aged 18 to 45 years.
La figure 2 représente la distribution des valeurs du rapport [γ']/[γ] chez 233 sujets sains âgés de plus de 60 ans. Figure 2 shows the distribution of the values of the ratio [γ '] / [γ] in 233 healthy subjects over 60 years of age.
La figure 3 représente la distribution des valeurs du rapport [y']/[y] chez 233 sujets âgés de 18 à 45 ans atteints de pathologies artérielles diverses. Figure 3 represents the distribution of the values of the ratio [y '] / [y] in 233 subjects aged 18 to 45 years with various arterial pathologies.
La figure 4 représente la distribution des valeurs du rapport y'/y chez 24 sujets âgés de 18 à 45 ans atteints d'infarctus, issus du groupe des 233 sujets âgés de 18 à 45 ans. Figure 4 shows the distribution of y '/ y values in 24 18- to 45-year-old infarcted patients from the 233 population aged 18 to 45 years.
Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer l'invention. The following examples are given without limitation to illustrate the invention.
EXEMPLE 1 : Evaluation chez des sujets sains et chez des patients de la concentration de fibrinogène hétérodimérique W' et de fibrinogène homodimérique 77 dans un échantillon plasmatique et établissement du rapport [y]I[y']. EXAMPLE 1 Evaluation in healthy subjects and in patients of the concentration of heterodimeric fibrinogen W 'and of homodimeric fibrinogen 77 in a plasma sample and establishment of the ratio [y] I [y'].
Pour l'étude décrite ci-après les échantillons suivants ont été utilisés
.433 plasmas de sujets âgés de 18 à 45 ans dont 200 sains et 233 atteints de pathologies artérielles diverses, dont 24 d'infarctus du myocarde,
et,
233 plasmas de sujets sains âgés de plus de 60 ans.For the study described below the following samples were used
.433 Plasmas of subjects aged 18 to 45, including 200 healthy and 233 with various arterial diseases, including 24 with myocardial infarction,
and,
233 Plasmas of healthy subjects older than 60 years.
Le tampon de dilution des échantillons était un tampon, de pH égal à 7,4, contenant du PBS Dulbecco à 9,55 g/l, 50 mM en phosphate, 150 mM en chlorure de sodium (fournisseur SEROMED, ref L182-50) additionné de 0,3% de Tween 20 (fournisseur MERCK, référence produit 822184), de 0,3% de sérum albumine bovine (BSA de la société SIGMA, référence A4503), de
10% de sérum normal de lapin décomplémenté pendant 30 minutes à 56"C avant l'utilisation (fournisseur GIBCO, référence 16120-032), de 10% de sérum normal de chèvre décomplémenté pendant 30 minutes à 56"C avant
l'utilisation (fournisseur GIBCO, référence 16210-015) et enfin de 100 ,ug/ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF de la société SIGMA, référence P7626). Ce tampon est appelé TpC+L+PMSF. Les échantillons étaient dilués au 1/1.000ème. The sample dilution buffer was a pH 7.4 buffer containing Dulbecco PBS 9.55 g / l, 50 mM phosphate, 150 mM sodium chloride (supplier SEROMED, ref L182-50) supplemented with 0.3% Tween 20 (MERCK supplier, product reference 822184), 0.3% bovine serum albumin (BSA from SIGMA, reference A4503),
10% of normal rabbit serum decomplemented for 30 minutes at 56 ° C prior to use (GIBCO supplier, reference 16120-032), 10% normal goat serum decomplemented for 30 minutes at 56 ° C before use
use (supplier GIBCO, reference 16210-015) and finally 100 μg / ml of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF from SIGMA, reference P7626). This buffer is called TpC + L + PMSF. The samples were diluted to 1 / 1,000th.
(A). DOSAGE DU FIBRINOGENE TOTAL - ESSAI 1
Le dosage du fibrinogène a été effectué à partir de la trousse
Asserachrom commercialisée par Diagnostica Stago (France). Cette trousse met en oeuvre des fragments F(ab')2 polyclonaux et pour l'étalonnage utilise du fibrinogène humain purifié.(AT). ASSAY OF TOTAL FIBRINOGEN - TEST 1
The fibrinogen assay was performed from the kit
Asserachrom marketed by Diagnostica Stago (France). This kit uses polyclonal F (ab ') 2 fragments and for calibration uses purified human fibrinogen.
Pour l'étalonnage, il a été aussi utilisé du fibrinogène étalon international (NIBSC) décrit par Gaffney PJ, et all. dans Thromb. Haemost. For calibration, international standard fibrinogen (NIBSC) described by Gaffney PJ, et al. in Thromb. Haemost.
(1992); 68(4), pp 428432.(1992); 68 (4), pp 428432.
(B). DOSAGE DU FIBRINOGENE HETERODIMERIQUE yy - ESSAI 2
Ce dosage a été effectué selon la méthode du sandwich modifié - double épitope .(B). DETERMINATION OF HETERODIMERIC FIBRINOGEN yy - TEST 2
This assay was performed according to the modified sandwich - double epitope method.
On recouvre avec du fibrinogène purifié une première série de microplaques (NuNc MAXISORB) par adsorption passive classique, en ajoutant 100 p1 d'une solution de fibrinogène humain purifié (fournisseur Diagnostica
STAGO, référence produit 00519) à une concentration de 40 pg/ml dans du
PBS Dulbecco à 9,55 g/l, 50 mM en phosphate, 150 mM en chlorure de sodium, pH = 7,4. On laisse réagir pendant 3 heures à 37"C puis on lave tr en chlorure de sodium, pH=7,4 (fournisseur SEROMED, référence produit
L182-50) additionné de 0,3% de Tween 20 (mélange PBS/T20). On met à incuber ensuite les microplaques pendant 18 heures à 4 C avec une solution d'anticorps polyclonal anti-fibrinogène (fragment F(ab)'2 disponible chez la société Diagnostica Stago, France), dilué au 1/50ème dans un mélange
TpC+L. II s'agit de tampon PBS Dulbecco à 9,55 g/l, 50 mM en phosphate, 150mM en chlorure de sodium, pH=7,4 (fournisseur SEROMED, référence produit L182-50) additionné de 0,3 % de tween 20), de 0,3% de sérum albumine bovine (BSA de la société SIGMA, référence A-4503), de 10% de sérum normal de lapin décomplémenté pendant 30 minutes à 56"C avant l'utilisation (fournisseur GIBCO, référence 16120-032), et de 10% de sérum normal de chèvre décomplémenté pendant 30 minutes à 56"C avant l'utilisation (fournisseur GIBCO, référence 16210-015). On lave ensuite trois fois avec un mélange PBS/T20, puis avec une solution de saccharose à 20%.Purified fibrinogen is coated with a first series of microplates (NuNc MAXISORB) by conventional passive adsorption, by adding 100 μl of a purified human fibrinogen solution (Diagnostica supplier).
STAGO, product reference 00519) at a concentration of 40 μg / ml in
PBS Dulbecco at 9.55 g / l, 50 mM phosphate, 150 mM sodium chloride, pH = 7.4. Allowed to react for 3 hours at 37 ° C. and then washed with sodium chloride, pH = 7.4 (supplier SEROMED, product reference
L182-50) supplemented with 0.3% Tween 20 (PBS / T20 mixture). The microplates are then incubated for 18 hours at 4 ° C. with a polyclonal anti-fibrinogen antibody solution (fragment F (ab) '2 available from Diagnostica Stago, France), diluted 1 / 50th in a mixture.
TpC + L. This is Dulbecco's PBS buffer 9.55 g / l, 50 mM phosphate, 150 mM sodium chloride, pH = 7.4 (supplier SEROMED, product reference L182-50) supplemented with 0.3% tween 20), 0.3% bovine serum albumin (BSA from SIGMA, reference A-4503), 10% normal rabbit serum decomplemented for 30 minutes at 56 ° C before use (GIBCO supplier, reference 16120-032), and 10% goat normal serum decomplemented for 30 minutes at 56 ° C prior to use (GIBCO supplier, reference 16210-015). It is then washed three times with a PBS / T20 mixture and then with a 20% sucrose solution.
La microplaque ainsi préparée est utilisée immédiatement ou conservée à 20 C, pour utilisation différée.The microplate prepared in this way is used immediately or stored at 20 ° C for delayed use.
Pour effectuer le dosage on ajoute 100 ,ul de plasma dilué, comme cela a été indiqué précédemment, au 1/1000 ème avec un mélange
TpC+L+PMSF. On laisse réagir pendant 1 heure à 25"C sous agitation (400 rpm), puis on lave trois fois avec un mélange PBS/T20. On ajoute ensuite 100 ,ul d'une solution contenant un anticorps monoclonal anti fibrinogénes hétérodimériques ry'-l'anticorps monoclonal L2B, décrit par Haidaris P (Haidaris P et al, Blood, (1989), 74 n021 pp 743-750) - à une concentration de 10 Wug/mL dans un mélange de TpC+L. On laisse réagir pendant 1 heure 30 minutes à 25 C sous agitation, puis on lave cinq fois avec un mélange
PBS/T20. On ajoute 100 ,ul de conjugué peroxydase anti IgG et IgM (H+L) de souris (disponible chez la société JACKSON) dilué au 1/20000 ème dans un tampon TpC+L. On laisse réagir pendant 1 heure à 25 C sous agitation, puis on lave cinq fois avec un mélange PBS/T20. On ajoute 100 ,ul d'orthophenylènediamine, 2 HCI en tampon substrat (0,03% d'H202) et on
laisse 20 minutes à l'obscurité Ensuite, on arrête la réaction avec 50 ,ul
d'H2SO4 et on lit à # = 490 nm.To carry out the assay, 100 μl of diluted plasma, as indicated above, is added at 1/1000 with a mixture
TpC + L + PMSF. It is allowed to react for 1 hour at 25 ° C. with stirring (400 rpm), then it is washed three times with a PBS / T20 mixture, then 100 μl of a solution containing a monoclonal anti-fibrinogenous heterodimeric antibody ry'-1 are added. monoclonal antibody L2B, described by Haidaris P (Haidaris P et al., Blood, (1989), 74: 21 pp 743-750) - at a concentration of 10 Wug / ml in a mixture of TpC + L. hour 30 minutes at 25 ° C with stirring, then wash five times with a mixture
PBS / T20. 100 μl of anti-mouse IgG and IgM (H + L) peroxidase conjugate (available from the company JACKSON) diluted 1/20000 in TpC + L buffer are added. Allowed to react for 1 hour at 25 C with stirring, and then washed five times with a PBS / T20 mixture. 100 μl of orthophenylenediamine, 2 HCl in substrate buffer (0.03% of H 2 O 2) are added and
leaves 20 minutes in the dark Then we stop the reaction with 50, ul
H2SO4 and read at # = 490 nm.
(C). DOSAGE DU FIBRINOGENE HOMODIMERIQUE 77
L'évaluation du fibrinogène homodimérique 'N a été obtenue en appliquant la formule suivante: [γ]=[total]-[γ']
où [total] est la concentration en fibrinogène total trouvée dans. le plasma lors de l'essai 1 décrit ci-dessus en (A)
et
où [y'] est la concentration en fibrinogéne hétérodimérique yy' évaluée selon l'essai 2 décrit également ci-dessus en (B).(C). DOSAGE OF HOMODIMERIC FIBRINOGEN 77
The evaluation of homodimeric fibrinogen 'N was obtained by applying the following formula: [γ] = [total] - [γ']
where [total] is the total fibrinogen concentration found in. the plasma in test 1 described above in (A)
and
where [y '] is the heterodimeric fibrinogen concentration yy' evaluated according to test 2 also described above in (B).
D. ETABLISSEMENT DU RAPPORT DES CONCENTRATIONS FIBRINOGENE
HETERODIMERIQUE γγ'/FIBRINOGENE HOMODIMERIQUE γγ ([γ']/[γ]). D. ESTABLISHING THE REPORT OF FIBRINOGEN CONCENTRATIONS
HETERODIMERIC γγ HOMODIMERIC FIBRINOGEN & gamma γ([Γ'] / [γ]).
L'établissement de ce rapport a été effectué sur la base des résultats obtenus par les dosages décrits en (B) et (C). The establishment of this ratio was carried out on the basis of the results obtained by the assays described in (B) and (C).
RESULTATS DE L'ETUDE
Les valeurs enregistrées pour les témoins sains jeunes (200 sujets, sains, non traités, âgés de 18 à 45 ans) se distribuent sous une forme bimodale (voir Figure 1). II existe en effet deux groupes de population, l'un de médiane à 0,04, I'autre de médiane à 0,08.RESULTS OF THE STUDY
The values recorded for healthy young controls (200 subjects, healthy, untreated, aged 18 to 45 years) are distributed in a bimodal form (see Figure 1). There are indeed two population groups, one with a median of 0.04, the other with a median of 0.08.
Les valeurs enregistrées pour les témoins sains âgés (233 sujets âgés de plus de 60 ans) (voir Figure 2) se répartissent selon une distribution monomodale (de médiane proche de 0,04). The values recorded for healthy elderly controls (233 subjects over 60 years of age) (see Figure 2) are distributed in a monomodal distribution (median close to 0.04).
Les valeurs enregistrées pour les patients atteints de pathologies artérielles diverses se distribuent aussi sous une forme bimodale (voir Figure 3). Il existe deux groupes de population, I'un de médiane à 0,04, I'autre de médiane tendant vers 0,08. The values recorded for patients with various arterial diseases are also distributed in a bimodal form (see Figure 3). There are two population groups, one median to 0.04, the other median to 0.08.
Les valeurs enregistrées pour les patients atteints d'infarctus se répartissent selon une distribution monomodale (voir Figure 4) de médiane proche de 0,06. The values recorded for patients with infarction are distributed according to a monomodal distribution (see Figure 4) with a median close to 0.06.
L'examen de ces graphiques montre une anaiogie claire entre les populations : population saine âgée de 18 à 45 ans et population malade (toutes pathologies artérielles) d'une part, et population saine âgée de plus de 60 ans et population saine âgée de 18 à 45 ans, d'autre part. The examination of these graphs shows a clear anomaly between the populations: healthy population aged 18 to 45 years and sick population (all arterial pathologies) on the one hand, and healthy population aged over 60 and healthy population aged 18 at 45, on the other hand.
En d'autres termes, le rapport fibrinogène hétérodimérique yy'/ fibrinogène homodimérique 77 ([y']/[y]) met en évidence l'hétérogénéité de la population constituée de sujets sains âgés de 18 à 45 ans. In other words, the ratio heterodimeric fibrinogen yy '/ homodimeric fibrinogen 77 ([y'] / [y]) demonstrates the heterogeneity of the population consisting of healthy subjects aged 18 to 45 years.
Une partie de cette population présente un rapport avec une valeur centrée près de 0,04, valeur équivalente à celle de la population constituée de sujets sains âgés de plus de 60 ans. Ces sujets sains âgés de 18 à 45 ans préfigurent donc les futurs sujets âgés de plus de 60 ans sans problème artériel. Part of this population has a ratio with a value centered near 0.04, equivalent to that of the healthy population over 60 years of age. These healthy subjects aged 18 to 45 years foreshadow future subjects over 60 years old without arterial problems.
D'autre part, une deuxième partie de la population de sujets sains âgés de 18 à 45 ans présente un rapport avec une valeur centrée près de 0,08, valeur équivalente à celle de certains malades âgés de 18 à 45 ans (deuxième médiane) et proche de la valeur des patients atteints d'infarctus (0,06). Ces sujets sains de 18 à 45 ans préfigurent des futurs malades âgés de plus de 60 ans à problème artériel. On the other hand, a second part of the population of healthy subjects aged between 18 and 45 presents a ratio with a centered value close to 0.08, a value equivalent to that of some patients aged 18 to 45 (second median). and close to the value of patients with myocardial infarction (0.06). These healthy subjects aged between 18 and 45 prefigure future patients aged over 60 with arterial problems.
De cette étude, il ressort que le rapport de concentration fibrinogéne hétérodimérique yy'/fibrinogène homodimérique 77 est prédictif de l'état futur d'une population. On voit déjà chez les sujets jeunes et bien portants ceux qui auront des problèmes artériels -ou au moins des risques sérieux- et ceux qui n'ont pas de risque de problèmes vasculaires, notamment artériels futurs. From this study, it appears that the heterodimeric fibrinogen concentration ratio yy '/ homodimeric fibrinogen 77 is predictive of the future state of a population. In young and healthy subjects, we already see those who have arterial problems - or at least serious risks - and those who have no risk of vascular problems, especially arterial future.
L'évaluation du rapport des concentrations fibrinogéne hétérodimérique yy'/fibrinogène homodimérique 77 a donc une valeur pronostique très utile. Lorsque ce rapport est bas et notamment inférieur de 0,05, plus spécialement proche de 0,04 dans ce cas, on peut prédire l'absence de risque de problèmes vasculaires, notamment artériels futurs. The evaluation of the ratio of fibrinogen heterodimeric concentrations yy '/ homodimeric fibrinogen 77 therefore has a very useful prognostic value. When this ratio is low and especially less than 0.05, especially close to 0.04 in this case, it is possible to predict the absence of risk of vascular problems, in particular arterial future.
Lorsque le rapport des concentrations fibrinogéne hétérodimérique γγ'/fibrinogène homodimérique 77 est élevé notamment supérieur de 0,07, plus spécialement proche de 0,08, ce rapport est prédictif de risque de problèmes vasculaires, notamment artériels futurs. When the ratio of heterodimeric fibrinogen / gamma; / gamma; / homodimeric fibrinogen 77 concentrations is high, especially greater than 0.07, more particularly close to 0.08, this ratio is predictive of a risk of vascular problems, in particular future arterial problems.
II est donc possible, selon l'invention, d'effectuer des dosages, par immunoessais conventionnels, permettant d'obtenir sur des populations sélectionnées des valeurs fréquentes ou de référence applicables à un seul individu. It is therefore possible, according to the invention, to carry out assays, by conventional immunoassays, making it possible to obtain, on selected populations, frequent or reference values applicable to a single individual.
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| WO2002046769A2 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-13 | The Penn State Research Foundation | A monoclonal antibody-based diagnostic assay for gamma fibrinogen |
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-
1997
- 1997-09-30 FR FR9712143A patent/FR2769093B1/en not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2769093B1 (en) | 1999-11-12 |
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