FR2662166A1

FR2662166A1 - PROCESS FOR PREPARING HIGHLY HIGH PURITY FACTOR VIII COMPRISING A RAPID IMMUNOADSORPTION STEP

Info

Publication number: FR2662166A1
Application number: FR9006252A
Authority: FR
Inventors: Chtourou Abdessatar Alias Sami
Original assignee: FONDATION NALE TRANSFUSION SAN
Current assignee: FONDATION NALE TRANSFUSION SAN
Priority date: 1990-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1991-11-22
Also published as: WO1991018017A1

Abstract

A method for preparing high-purity Factor VIII from a complex aqueous mixture containing von Willebrand Factor-complexed Factor VIII, indluding immunoadsorption on an anti-Factor VIII monoclonal antibody. The method is characterized in that (a) a sufficient quantity of divalent ions is added to the complex aqueous mixture to ensure the dissociation of the Factor VIII/von Willebrand Factor complex; (b) the mixture containing Factor VIII is contacted with an immunoadsorbent consisting of an anti-Factor VIII monoclonal antibody which is immobilized on a rigid support by a covalent bond, said monoclonal antibody being so selected that it is directed against the light chain of the Factor VIII and can both inhibit the coagulative activity of the Factor VIII:C and bond the Factor VIII through strong hydrophobic interactions; and (c) the immunoadsorbent Factor VIII solution is eluted.

Description

L'invention a pour objet un procédé de préparation de Facteur
VIII de très haute pureté à partir d'un mélange aqueux complexe comprenant du Facteur VIII.The subject of the invention is a method for preparing a factor
VIII of very high purity from a complex aqueous mixture comprising Factor VIII.

De nombreux procédés ont déjà été décrits, visant à préparer des formes purifiées de Facteur VIII humain, en raison de l'importance industriel le de ce facteur pour les hémophiles et surtout, de la nécessité de disposer de Facteur VIII dépourvu de contaminants. Numerous methods have already been described, aimed at preparing purified forms of human factor VIII, because of the industrial importance of this factor for hemophiliacs and especially the need to have contaminant free factor VIII.

Suivant les utilisations envisagées, une pureté plus ou moins grande est requise, soit que le Facteur VIII soit destiné à être utilisé tel quel dans une forme de pureté intermédiaire, soit qu'un état de pureté intermédiaire constitue justement un état transitoire avant le mise en oeuvre d'étapes ultérieures de purification plus poussée. Depending on the intended uses, a greater or less purity is required, either that the Factor VIII is intended to be used as such in a form of intermediate purity, or that a state of intermediate purity is precisely a transitional state before the implementation. subsequent steps of further purification.

Pour préparer du Facteur VIII de très haute pureté, c'est-à-dire une pureté correspondant à une activité spécifique comprise entre environ 2000 et environ 6000 UI/mg de protéines, un certain nombre de procédés proposent de mettre en oeuvre, à partir de diverses sources de Facteur VIII, une étape d'immunoadsorption utilisant comme immunoadsorbant un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII. To prepare very high purity Factor VIII, that is to say a purity corresponding to a specific activity of between about 2000 and about 6000 IU / mg protein, a number of methods propose to implement, from various sources of Factor VIII, an immunoadsorption step using as immunoadsorbent an anti-factor VIII monoclonal antibody.

Ainsi, la publication du brevet européen EP-A-0 286 323 décrit un procédé de purification de Facteur VIII à partir d'un mélange de polypetides qui comprend une étape d'immunopurification puis d'élution de la solution purifiée de Facteur VIII, suivie d'une étape de chromatographie, l'étape d'immunopurification consistant à mettre en contact ledit mélange avec un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, à laver le produit adsorbé pour éliminer le Facteur von Willebrand, puis à éluer la solution de Facteur
VIII pour désorber le Facteur VIII de l'anticorps monoclonal anti-Facteur
VIII.Thus, the publication of the European patent EP-A-0 286 323 describes a method for purifying Factor VIII from a polypetide mixture which comprises a step of immunopurification and then elution of the purified solution of Factor VIII, followed a chromatography step, the immunopurification step of contacting said mixture with an anti-Factor VIII monoclonal antibody, washing the adsorbed product to remove von Willebrand Factor, and then eluting the Factor solution.
VIII to desorb Factor VIII of the anti-factor monoclonal antibody
VIII.

En effet, dans tous les mélanges complexes contenant du Facteur
VIII, tels que le plasma, le cryoprécipité remis en solution, les concentrés de pureté intermédiaire ou encore les surnageants de culture qui contiennent du vWF destiné à stabiliser le Facteur VIII, le Facteur VIII se trouve complexé à son transporteur naturel qui est le facteur von
Willebrand (vWF). Ce complexe de haut poids moléculaire (20.106 D) est stable et ne se dissocie qu'en présence d'ions divalents tels que le Ca
Mg++, Mon , à des concentrations généralement supérieures à 0,25 M. Le
Facteur VIII est lui-même formé d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère associées par l'intermédiaire d'un ion calcium.Indeed, in all complex mixtures containing the factor
VIII, such as plasma, cryoprecipitate in solution, intermediate purity concentrates or culture supernatants which contain vWF for stabilizing Factor VIII, Factor VIII is complexed with its natural carrier which is the von factor
Willebrand (vWF). This complex of high molecular weight (20.106 D) is stable and dissociates only in the presence of divalent ions such as Ca
Mg ++, Mon, at concentrations generally greater than 0.25 M.
Factor VIII is itself formed of a heavy chain and a light chain associated via a calcium ion.

Dans les conditions indiquées dans le document cité ci-dessus, on a constaté que les temps nécessaires pour mettre en contact la totalité du mélange complexe à purifier avec l'immunoadsorbant sont relativement importants, de l'ordre de 15 à 30 heures. Ces durées sont probablement dues au fait que le Facteur VIII est mis en contact avec l'immunoadsorbant alors qu'il se trouve sous sa forme complexée au Facteur von Willebrand, ce qui tend à ralentir le processus. Ces conditions sont également souvent associees à un rendement assez faible, une partie non négligeable de
Facteur VIII restant fixée sur l'immunoadsorbant ou même étant très rapidement déstabilisée avant même de pouvoir se fixer.Under the conditions indicated in the document cited above, it has been found that the times necessary to bring the entire complex mixture to be purified into contact with the immunoadsorbent are relatively long, of the order of 15 to 30 hours. These times are probably due to the fact that Factor VIII is brought into contact with the immunoadsorbent while it is in its form complexed von Willebrand factor, which tends to slow down the process. These conditions are also often associated with a rather low yield, a significant part of
Factor VIII remaining fixed on the immunoadsorbent or even being very quickly destabilized even before being able to bind.

L'invention se propose de fournir des moyens pour obtenir plus rapidement et éventuellement avec un meilleur rendement que par les procédés connus, un Facteur VIII de très haute pureté, à partir de sources diverses de Facteur VIII. The invention proposes to provide means for obtaining faster and possibly with a better yield than by the known methods, a factor VIII of very high purity, from various sources of factor VIII.

L'invention se propose également de fournir un procédé de purification de Facteur VIII à partir d'un mélange aqueux complexe qui met en oeuvre une étape d'immunoadsorption, qui remédie aux inconvénients des procédés connus, et ce, quelle que soit la nature du mélange aqueux complexe de départ. The invention also proposes to provide a process for purifying Factor VIII from a complex aqueous mixture which implements an immunoadsorption step, which overcomes the disadvantages of the known processes, and whatever the nature of the complex aqueous mixture of starting.

L'inventeur a maintenant découvert que, de façon surprenante, ce but est atteint lorsque, préalablement à l'étape d'immunoadsorption avec un immunoadsorbant contenant un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, le mélange aqueux complexe est mis en présence d'ions divalents en quantité suffisante pour obtenir la dissociation du complexe Facteur VIII-vWF, l'anticorps monoclonal anti-Facteur VIII étant par ailleurs choisi tel qu'il est dirigé conre la chaîne légère du Facteur VIII et a à la fois une aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII:C et à lier le
Facteur VIII par des fortes interactions hydrophobes. The inventor has now discovered that, surprisingly, this object is achieved when, prior to the immunoadsorption step with an immunoadsorbent containing an anti-Factor VIII monoclonal antibody, the complex aqueous mixture is placed in the presence of divalent ions. in sufficient quantity to dissociate the Factor VIII-vWF complex, the anti-Factor VIII monoclonal antibody being further selected as directed to the Factor VIII light chain and has both the ability to inhibit coagulant activity of Factor VIII: C and to bind the
Factor VIII by strong hydrophobic interactions.

C'est pourquoi l'invention a tout d'abord pour objet un procédé de préparation de Facteur VIII de très haute pureté à partir d'un mélange aqueux complexe contenant du Facteur VIII complexé au Facteur von Willebrand, comprenant une étape d'immunoadsorption sur un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, caractérisé en ce que
a) on ajoute audit mélange aqueux complexe des ions divalents en quantité suffisante pour obtenir la dissociation du complexe Facteur
VIII-Facteur von Willebrand
b) on met en contact le mélange obtenu en a) avec un immunoadsorbant constitué d'un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII immobilisé par liaison covalente sur un support rigide, ledit anticorps monoclonal étant dirigé contre la chaîne légère du Facteur VIII et ayant à la fois une aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII::C et à lier le Facteur VIII par des fortes interactions hydrophobes
c) on élue de l'immunoadsorbant la solution de Facteur VIII obtenue.This is why the subject of the invention is firstly a process for the preparation of very high purity Factor VIII from a complex aqueous mixture containing factor VIII complexed with von Willebrand factor, comprising a step of immunoadsorption on an anti-factor VIII monoclonal antibody, characterized in that
a) adding to said complex aqueous mixture divalent ions in an amount sufficient to obtain the dissociation of the complex Factor
VIII-von Willebrand Factor
b) the mixture obtained in a) is brought into contact with an immunoadsorbent consisting of a covalently immobilized anti-Factor VIII monoclonal antibody on a rigid support, said monoclonal antibody being directed against the light chain of Factor VIII and having at the ability to inhibit Factor VIII :: C coagulant activity and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions
c) the resulting Factor VIII solution is eluted from the immunoadsorbent.

Ainsi, il est du mérite de l'inventeur d'avoir établi que en choisissant correctement l'anticorps monoclonal, il était possible de mettre en oeuvre l'étape d'immunoadsorption dans des conditions de dissociation du complexe Facteur VIII-vWF et, par là même, de diminuer de façon considérable le temps de contact entre le mélange complexe à purifier et l'immunoadsorbant. Thus, it is to the merit of the inventor to have established that by correctly choosing the monoclonal antibody, it was possible to carry out the immunoadsorption step under dissociation conditions of the Factor VIII-vWF complex and, by in this way, considerably reduce the contact time between the complex mixture to be purified and the immunoadsorbent.

Par temps de contact, on entend le temps nécessaire à la mise en oeuvre de l'étape b), jusqu'à fixation de la totalité du Facteur VIII présent dans le mélange complexe, déterminé pour une quantité de Facteur VIII par mg d'anticorps monoclonal allant de 200 à 600 Ui. By contact time is meant the time required for carrying out step b), until all of the Factor VIII present in the complex mixture, determined for a quantity of Factor VIII per mg of antibody, is fixed. monoclonal ranging from 200 to 600 IU.

En se fixant sur la chaîne légère du Facteur VIII, l'anticorps monoclonal inhibe l'activité coagulante par blocage du site d'activation par la thrombine. Ceci conduit à une stabilisation du Facteur VIII et peut dans certains cas contribuer à une amélioration du rendement de l'étape d'immunoadsorption. By binding to the Factor VIII light chain, the monoclonal antibody inhibits clotting activity by blocking the activation site with thrombin. This leads to stabilization of Factor VIII and may in some cases contribute to an improvement in the efficiency of the immunoadsorption step.

En outre, dans les conditions indiquées, on constate que seul le
Facteur VIII se fixe sur l'anticorps monoclonal.Moreover, under the conditions indicated, it is found that only the
Factor VIII binds to the monoclonal antibody.

On constate que selon l'invention, il est possible d'avoir des temps de contact inférieurs à 1 heure et 30 minutes, et même parfois inférieurs à 1 heure. It is found that according to the invention, it is possible to have contact times of less than 1 hour and 30 minutes, and even sometimes less than 1 hour.

Avantageusement, le procédé selon l'invention s'applique à différents mélanges aqueux complexes, notamment le plasma, le cryoprécipité remis en solution, un concentré de pureté intermédiaire, un concentré de haute pureté, un surnageant de culture contenant du Facteur
VIII recombinant.Advantageously, the process according to the invention is applicable to various complex aqueous mixtures, in particular plasma, cryoprecipitate put back into solution, a concentrate of intermediate purity, a concentrate of high purity, a culture supernatant containing a factor
Recombinant VIII.

Les concentrations d'ions divalents nécessaires pour obtenir la dissociation du complexe FVIII-vWF dépendent à la fois de la nature des ions utilisés ainsi que de la source de Facteur VIII utilisée comme mélange complexe de départ. En pratique, une concentration allant de 0,1 à 0,6 M, de préférence de 0,2 à 0,4 M convient particulièrement bien. The divalent ion concentrations required to dissociate the FVIII-vWF complex depend both on the nature of the ions used as well as the source of Factor VIII used as the starting complex mixture. In practice, a concentration ranging from 0.1 to 0.6 M, preferably from 0.2 to 0.4 M, is particularly suitable.

Le concept à la base de l'invention repose sur la découverte qu'avec des anticorps monoclonaux anti-Facteur VIII présentant certaines caractéristiques précises, il est possible d'éviter les inconvénients habituellement liés à une concentration élevée d'ions divalents dans le mélange à purifier. The concept underlying the invention is based on the discovery that with anti-Factor VIII monoclonal antibodies having certain precise characteristics, it is possible to avoid the drawbacks usually associated with a high concentration of divalent ions in the mixture. purify.

Ces inconvénients sont illustrés par la figure 1 qui montre en effet qu'en présence de sels dissociants tels que CaC12, MgCl2, on obtient une quantité plus faible de Facteur VIII après une heure d'incubation, que lorsque le cryoprécipité est tel quel (exemple témoin). These drawbacks are illustrated in FIG. 1, which indeed shows that in the presence of dissociating salts such as CaCl 2, MgCl 2, a smaller amount of Factor VIII is obtained after one hour of incubation, than when the cryoprecipitate is as it is (example witness).

Tous les ions divalents ayant un effet de force ionique peuvent être utilisés. De façon non limitative, on peut citer les ions Mg , Mn Caff, Ba++. Cependant, on utilisera de préférence les ions Ca++, plus particulièrement sous la forme CaC12 ou gluconate de calcium ou sels apparentés
En ce qui concerne le mélange aqueux de départ, il est préférable qu'il soit autant que possible débarrassé de ses contaminants éventuels avant l'étape d'immunoadsorption. C'est pourquoi, on procède avantageusement à une inactivation virale. Une telle opération peut par exemple être réalisée selon le procédé décrit dans les brevets US 4 481 189 et US 4 540 573 qui utilisent un mélange solvant et détergent tel que le mélange Tween 80/TnBP (Tri-n-butyl phosphate).All divalent ions having an ionic strength effect can be used. In a nonlimiting manner, mention may be made of Mg, Mn Caff, Ba ++ ions. However, the Ca ++ ions will be used, more particularly in the form CaC12 or calcium gluconate or related salts
With regard to the aqueous starting mixture, it is preferable that it be as free as possible of its possible contaminants before the immunoadsorption step. Therefore, advantageously proceeds to viral inactivation. Such an operation may for example be carried out according to the method described in US Pat. Nos. 4,481,189 and 4,540,573 which use a solvent and detergent mixture such as Tween 80 / TnBP (tri-n-butyl phosphate) mixture.

La nature et les quantités de solvant et détergent à utiliser en pratique dépendent à la fois de la nature du mélange aqueux complexe et de la nature des solvants et détergents. The nature and amounts of solvent and detergent to be used in practice depend both on the nature of the complex aqueous mixture and the nature of the solvents and detergents.

D'une manière générale, il est avantageux de procéder à une inactivation virale de tous les produits qui interviennent dans la mise en oeuvre du procédé, c'est-à-dire notamment du support d'immobilisation des anticorps monoclonaux, comme des anticorps monoclonaux eux-mêmes. In general, it is advantageous to carry out a viral inactivation of all the products involved in the implementation of the method, that is to say in particular the immobilization support of the monoclonal antibodies, such as monoclonal antibodies. themselves.

Pour préparer l'immunoadsorbant utilisable selon l'invention, on prépare d'une part un support d'immobilisation des anticorps monoclonaux et d'autre part, les anticorps monoclonaux eux-mêmes. In order to prepare the immunoadsorbent that can be used according to the invention, an immobilization support for the monoclonal antibodies is prepared on the one hand and the monoclonal antibodies themselves on the other hand.

Différents supports tels que les billes d'agarose, d'acrylamide, de silice, de polymères synthétiques ou encore à base de mélange de ces substances peuvent être activés avec différents types de réactifs chimiques. Different supports such as agarose beads, acrylamide, silica, synthetic polymers or mixtures of these substances can be activated with different types of chemical reagents.

On utilisera de préférence des gels de très forte porosité, notamment des gels d'acrylamide. On peut citer en particulier le gel formé d'un mélange de dextran et d'acrylamide Séphacryl S1000, commercialisé par la société
Pharmacia, que l'on active avec de la benzoquinone selon une technique classique décrite par Brandt et al, Bioch. Biophys. Acta, 1975, 386, 192-202. Gels of very high porosity, in particular acrylamide gels, will preferably be used. There may be mentioned in particular the gel formed of a mixture of dextran and acrylamide Sephacryl S1000, marketed by the company
Pharmacia, which is activated with benzoquinone according to a conventional technique described by Brandt et al, Bioch. Biophys. Acta, 1975, 386, 192-202.

En général, après élimination par différents lavages des groupements non réactifs, le gel activé est mis en contact avec la solution d'anticorps monoclonal. Afin de minimiser les fuites d'anticorps, il est préférable que le taux d'anticorps à immobiliser ne soit pas trop élevé. In general, after the nonreactive groups have been removed by different washings, the activated gel is brought into contact with the monoclonal antibody solution. In order to minimize antibody leakage, it is preferable that the antibody level to be immobilized is not too high.

C'est pourquoi, la concentration d'anticorps monoclonal est de préférence de 0,1 à 5 mg/ml de gel, plus préférentiellement encore de 0,3 à 1 mg/ml. Therefore, the concentration of monoclonal antibody is preferably from 0.1 to 5 mg / ml of gel, more preferably from 0.3 to 1 mg / ml.

Ensuite, après une certaine durée de réaction de l'ordre de 24 heures, les protéines en excès sont éliminées par lavage. Les sites activés restants sont bloqués par addition de tampons, par exemple des tampons contenant de la glycine, de l'éthanolamine ou encore du Tris.Then, after a certain reaction time of the order of 24 hours, the excess proteins are removed by washing. The remaining activated sites are blocked by addition of buffers, for example buffers containing glycine, ethanolamine or Tris.

Pour préparer les anticorps monoclonaux (ACM), les cellules productrices de l'anticorps sont cultivées, soit in vivo chez des souris
Balb/C, soit de préférence in vitro dans un cytoculteur dans un milieu approprié. Les ACM sont donc purifiés à partir soit de liquides d'ascites, soit de surnageants de culture. On utilisera de préférence des ACM tels que décrits dans la publication de M. P. Croissant et al, Thrombosis and
Haemostasis 56(3) 271-276, 1986, c'est-à-dire qui fixent 100 % de Facteur
VIII en présence de CaC12 à une concentration de 0,25 M et plus particulièrement encore 1'ACM désigné sous l'appellation 463A8 dans cette publication.To prepare the monoclonal antibodies (mAbs), the cells producing the antibody are cultured, either in vivo in mice
Balb / C, preferably in vitro in a cytocultor in a suitable medium. The ACMs are therefore purified from either ascites liquids or culture supernatants. ACMs will preferably be used as described in the publication by MP Croissant et al, Thrombosis and
Haemostasis 56 (3) 271-276, 1986, that is to say which fix 100% of factor
VIII in the presence of CaCl 2 at a concentration of 0.25 M and more particularly the ACM referred to as 463A8 in this publication.

Enfin, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, cette étape d'immunopurification est suivie d'une étape de chromatographie d'affinité, de préférence sur un échangeur d'ions anioniques. Cette étape de chromatographie vise à la fois à concentrer le Facteur VIII et à éliminer les anticorps monoclonaux d'origine murine qui auraient pu contaminer le produit. Finally, according to an advantageous embodiment of the invention, this immunopurification step is followed by an affinity chromatography step, preferably on an anionic ion exchanger. This chromatography step aims at both concentrating Factor VIII and eliminating monoclonal antibodies of murine origin that could have contaminated the product.

L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel en tant que mélange complexe de départ, on utilise le plasma humain Dans ces conditions, préalablement à l'étape b), on ajuste le pH aux environs de 6,5 à 6,8. Dans ce cas également, il sera préférable, lorsqu'on effectue une inactivation virale, d'utiliser des quantités plus importantes du mélange d'inactivation virale approprié que celles utilisées pour les autres mélanges complexes. The subject of the invention is more particularly the process as described above, in which, as a starting complex mixture, human plasma is used. Under these conditions, prior to step b), the pH is adjusted to around 6. , 5-6.8. In this case also, it will be preferable, when performing viral inactivation, to use larger amounts of the appropriate virus inactivation mixture than those used for the other complex mixtures.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante de différents modes de réalisation de l'invention. Other features and advantages of the invention will become apparent from the following detailed description of various embodiments of the invention.

Les figures 1 à 4 illustrent l'invention. Figures 1 to 4 illustrate the invention.

La figure 1 représente l'évolution de la quantité de Facteur VIII présent dans un cryoprécipité en fonction du temps d'incubation de ce cryoprécipité avec différents ions monovalents et divalents, le témoin étant le cryoprécipité. FIG. 1 represents the evolution of the amount of factor VIII present in a cryoprecipitate as a function of the incubation time of this cryoprecipitate with different monovalent and divalent ions, the control being cryoprecipitate.

La figure 2 représente l'évolution de la quantité de Facteur VIII non adsorbé sur une colonne d'immunoaffinité comprenant les ACM anti-Facteur VIII en fonction du temps de contact entre le Facteur VIII et 1'ACM considéré, dans des conditions dissociantes et non dissociantes, le mélange complexe de départ étant un concentré de pureté intermédiaire inactivé viralement. FIG. 2 represents the evolution of the amount of non-adsorbed Factor VIII on an immunoaffinity column comprising the anti-Factor VIII ACMs as a function of the contact time between the Factor VIII and the ACM under consideration, under dissociative conditions and not dissociating, the starting complex mixture being a virally inactivated intermediate purity concentrate.

La figure 3 représente la même évolution que celle présentée à la figure 2, le mélange complexe de départ étant le plasma. FIG. 3 shows the same evolution as that presented in FIG. 2, the starting complex mixture being plasma.

La figure 4 représente la même évolution que celle représentée à la figure 3, mais en comparant l'effet des ions divalents et monovalents, le mélange complexe de départ étant un concentré de pureté intermédiaire. FIG. 4 represents the same evolution as that represented in FIG. 3, but comparing the effect of the divalent and monovalent ions, the starting complex mixture being a concentrate of intermediate purity.

Comme indiqué ci-dessus, l'invention peut être mise en oeuvre à partir de diverses sources de Facteur VIII, qui peuvent être préparées de la façon suivante avant l'étape d'immunoadsorption. As indicated above, the invention can be carried out from various sources of Factor VIII, which can be prepared as follows prior to the immunoadsorption step.

a) plasma
Le plasma est décongelé rapidement. Après addition des ions divalents et éventuellement d'un mélange inactivation virale, il est mis en contact avec l'immunoadsorbant.a) plasma
The plasma is thawed quickly. After addition of the divalent ions and optionally of a viral inactivation mixture, it is brought into contact with the immunoadsorbent.

b) cryoprécipité
Pour préparer un cryoprécipité, on centrifuge du sang humain collecté en présence de citrate de sodium, afin d'éliminer la fraction cellulaire. Le plasma obtenu est congelé à -40 C dans des poches plastiques. On procède ensuite en trois étapes successives pour obtenir le cryoprécipité
- Prédécongélation du plasma : il est réchauffé progressivement de manière à ce que sa température passe de -40 C à -11 C en 8 heures
- Décongélation du plasma : on élimine les poches plastiques puis on place le plasma congelé dans un broyeur pendant environ 2 minutes.On maintient la température de la suspension obtenue entre O et 0,5"C
- Séparation du cryoprécipité : on centrifuge la suspension à une température comprise entre 1 et 4"C. b) cryoprecipitate
To prepare cryoprecipitate, human blood collected in the presence of sodium citrate is centrifuged to eliminate the cell fraction. The plasma obtained is frozen at -40 ° C. in plastic bags. We then proceed in three successive steps to obtain the cryoprecipitate
- Pre-freezing of the plasma: it is gradually warmed up so that its temperature goes from -40 C to -11 C in 8 hours
- Thawing of the plasma: the plastic bags are removed and then the frozen plasma is placed in a mill for about 2 minutes. The temperature of the suspension obtained is maintained between 0 and 0.5 ° C.
- Separation of Cryoprecipitate: the suspension is centrifuged at a temperature between 1 and 4 ° C.

Ensuite, il est généralement resuspensdu dans un tampon tel que
Tris-HCl 0,025 M pH 7. Après dissolution, 98 g (3% partie/volume) d'Al(OH)3 sont ajoutés par kg de cryoprécipité de départ. Après 10 mn d'agitation, le mélange est centrifugé à 3000 g. Le surnageant est éventuellement inactivé viralement puis les ions dissociants sont ajoutés et la solution est mise en contact avec l'immunoadsorbant.Then it is usually resuspensdu in a buffer such as
0.025 M Tris-HCl pH 7. After dissolution, 98 g (3% part / volume) of Al (OH) 3 are added per kg of starting cryoprecipitate. After stirring for 10 minutes, the mixture is centrifuged at 3000 g. The supernatant is optionally inactivated virally and the dissociating ions are added and the solution is brought into contact with the immunoadsorbent.

c) Facteur VIII de pureté intermédiaire
Le cryoprécipité est remis en suspension dans un tampon puis les protéines contaminantes sont éliminées et le Facteur VIII peut être récupéré sous forme d'une solution concentrée ayant une activité spécifique aux environs de 1 Ui/mg. L'inactivation virale et la dissociation du Facteur
VIII peuvent être réalisées comme pour la préparation du cryoprécipité.(c) Intermediate Purity Factor VIII
The cryoprecipitate is resuspended in a buffer then the contaminating proteins are removed and Factor VIII can be recovered in the form of a concentrated solution having a specific activity around 1 IU / mg. Viral inactivation and dissociation of the factor
VIII can be performed as for the preparation of cryoprecipitate.

Pour l'ensemble des exemples de réalisation qui vont suivre, la préparation de l'immunoadsorbant se fait dans les conditions indiquées ci-après
Obtention des anticorps monoclonaux 1 - Immunisation
Une souris Balb/c est immunisée de la façon suivante, avec un
Facteur VIII purifié de la façon décrite dans la publication M.P. Croissant et al, déjà citée.For all the examples of embodiment which will follow, the preparation of the immunoadsorbent is done under the conditions indicated below.
Obtaining monoclonal antibodies 1 - Immunization
A Balb / c mouse is immunized as follows, with a
Purified factor VIII as described in MP Croissant et al., Already cited.

Semaines 1 et 4 : Injection sous cutanée de 150 p1 d'AL(OH3) contenant
50 UI de Facteur VIII
Semaine 8 : Injection par voie intraveineuse de 50 UI de Facteur VIII.Weeks 1 and 4: Subcutaneous injection of 150 μl of AL (OH3) containing
50 IU Factor VIII
Week 8: Intravenous injection of 50 IU Factor VIII.

3 jours après la dernière injection, l'animal est sacrifié pour
le prélèvement de la rate.3 days after the last injection, the animal is sacrificed for
the removal of the spleen.

2" - Fusion et production d'hvbridomes murins
Les splénocytes murins sont fusionnés avec des cellules myélomateuses NS1 dans un rapport 10:1.2 "- Fusion and production of murine hybridomas
Murine splenocytes are fused with NS1 myeloma cells in a 10: 1 ratio.

Les cellules sont par la suite sélectionnées sur un milieu HAT puis testées quant à leur aptitude à secréter des anticorps répondant à ces deux critères
- Aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII:C et - Aptitude à lier le Facteur VIII par de fortes interactions hydrophobes.The cells are subsequently selected on a HAT medium and then tested for their ability to secrete antibodies meeting these two criteria.
- Ability to inhibit the coagulant activity of Factor VIII: C and - Ability to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions.

Les cellules répondants à ces critères ont été clonées par dilution limite. Cells responding to these criteria were cloned by limiting dilution.

582 hybrides ont été ainsi testées. 20 96 des surnageants cellulaires contiennent des anticorps anti-Facteur von Willebrand et 2,5 % des anticorps anti-Facteur VIII:C. Parmi les lignées stables après clonage, et secrétant un anticorps anti-Facteur VIII:C la lignée CAG-1 463A8 a été sélectionné (M.P. Croissant et al, déjà citée). 582 hybrids were thus tested. Cell supernatants contain anti-von Willebrand factor antibodies and 2.5% anti-Factor VIII: C antibodies. Among the stable lines after cloning, and secreting an anti-Factor VIII: C antibody the line CAG-1 463A8 was selected (M. P. Croissant et al, already mentioned).

30 - Préparation des anticorps monoclonaux
Les cellules productrices sont cultivées in vivo dans un cytoculteur dans un milieu approprié.30 - Preparation of monoclonal antibodies
The producer cells are cultured in vivo in a cytocultor in a suitable medium.

Le protocole de purification suivant peut être appliqué. The following purification protocol can be applied.

1. Séparation des cellules et débris cellulaires par une filtration tangentielle sur 0,45 puis 0,22 p
2. Concentration 10 fois du surnageant de culture par ultrafiltration.1. Separation of cells and cellular debris by tangential filtration on 0.45 and 0.22 p
2. Concentration 10 times of the culture supernatant by ultrafiltration.

3. Chromatographie sur protéine A Sépharose FF commercialisée par la société Pharmacia. 3. Protein A Sepharose FF Chromatography sold by the company Pharmacia.

4. Ajustement du pH et de la résistivité de l'éluat de la protéine A Sépharose. 4. Adjustment of the pH and resistivity of the Protein A Sepharose eluate.

5. Chromatographie d'échange d'ions anioniques par exemple sur Q Sépharose FF. 5. Anionic ion exchange chromatography for example on Q Sepharose FF.

6. Dialyse et ultrafiltration pour ajuster le taux d'anticorps à la concentration voulue. 6. Dialysis and ultrafiltration to adjust the antibody level to the desired concentration.

7. Inactivation virale de la solution d'anticorps par pasteurisation. 7. Viral inactivation of the antibody solution by pasteurization.

8. Congélation à -80 C jusqu'à libération du lot après contrôle. 8. Freezing at -80 C until batch release after control.

Immobilisation de l'anticorps monoclonal
Après lavage avec des tampons de pH extrême (pH 4 et pH 9) et des agents chaotropes, c'est-à-dire des agents susceptibles de casser les interactions hydrophobes, afin d'éliminer les molécules fixées de façon aspécifique, le gel d'immunoaffinité est stocké à 4 C en présence d'agents empêchant la croissance des microorganismes.Immobilization of the monoclonal antibody
After washing with buffers of extreme pH (pH 4 and pH 9) and chaotropic agents, that is to say agents capable of breaking the hydrophobic interactions, in order to eliminate the molecules nonspecifically fixed, the gel of Immunoaffinity is stored at 4 ° C in the presence of agents preventing the growth of microorganisms.

De préférence, avant son utilisation, le gel est mis à incuber pendant 24 heures en présence d'un mélange d'inactivation virale tel que cité précédemment. Preferably, before use, the gel is incubated for 24 hours in the presence of a viral inactivation mixture as mentioned above.

Tampons utilisés dans les exemples
Immunoaffinité:
- tampon d'équilibrage (tampon A)
Imidazole-HCl 20 mM, pH 6,8 ; NaCI 150 mM,
- tampon d'élution (tampon B)
Imidazole 10 mM pH 7, NaCl 0,075 M, éthylène glycol 50 %,
Tween 80 1 96. L'ajout d'un détergent dans le tampon d'élution est particulièrement avantageux et il permet d'améliorer encore le rendement de l'étape.Buffers used in the examples
immunoaffinity:
- balancing buffer (buffer A)
20 mM imidazole-HCl, pH 6.8; 150 mM NaCl
- elution buffer (buffer B)
Imidazole 10 mM pH 7, 0.075 M NaCl, 50% ethylene glycol,
Tween 80 1 96. The addition of a detergent in the elution buffer is particularly advantageous and it makes it possible to further improve the yield of the step.

Chromatographie par échange d'ions
- tampon d'équilibrage (tampon C)
Tris-HCl 20mM, pH7, NaCI 0,27 M,
- tampon d'élution (tampon D),
glycine 0,1 M, lysine 0,03 M, NaCl 0,05 M, CaC12, 0,3 M, pH7
- tampon de dialyse (tampon E)
glycine 0,1M, lysine 0,03 M, NaCI 0,2M, CaCl2 lmM, pH7. Ion exchange chromatography
- balancing buffer (buffer C)
20 mM Tris-HCl, pH7, 0.27 M NaCl,
elution buffer (buffer D),
0.1M glycine, 0.03M lysine, 0.05M NaCl, 0.3M CaCl2, pH7
- dialysis buffer (buffer E)
0.1M glycine, 0.03M lysine, 0.2M NaCl, 1mM CaCl2, pH7.

Exemple de mise en oeuvre du procédé à partir d'un concentré de pureté intermédiaire
4 kg de cryoprécipité, obtenus à partir de 524 1 de plasma ont été remis en solution dans un tampon Tris 20 mM pH 7. Le pH de la soluton est ensuite ajusté à pH 7,1 et les principaux contaminants protéiques tels que fibronectine, fibrinogène, IgG sont éliminés en deux temps : une première précipitation à l'héparine obtenue par ajout de 24 unités d'héparine par ml de solution à 20"C, et le précipité formé est éliminé par centrifugation ; ensuite, on ajoute 22 g de gel d'hydroxyde d'aluminium par litre de solution, puis on abaisse le pH à 6,00. Le précipité formé est éliminé par centrifugation.Example of implementation of the process from a concentrate of intermediate purity
4 kg of cryoprecipitate, obtained from 524 l of plasma were put back into solution in 20 mM Tris buffer pH 7. The pH of the soluton is then adjusted to pH 7.1 and the main protein contaminants such as fibronectin, fibrinogen IgG are removed in two steps: a first heparin precipitation obtained by adding 24 units of heparin per ml of solution at 20 ° C, and the precipitate formed is removed by centrifugation, then 22 g of gel are added of aluminum hydroxide per liter of solution, then the pH is lowered to 6.00 The precipitate formed is removed by centrifugation.

On ajoute du CaC12 jusqu'à atteindre une concentration finale de 0.25M puis on ajoute un mélange d'inactivation virale à une concentration de 196 de Tween 80 et 0,3 96 de TnBP, puis on incube pendant 6 heures à 24"C. CaCl2 is added until a final concentration of 0.25M is reached, then a viral inactivation mixture is added at a concentration of 196 Tween 80 and 0.396 TnBP and incubated for 6 hours at 24 ° C.

La solution est alors prête pour l'étape d'immunoadsorption. The solution is then ready for the immunoadsorption step.

L'immunoadsorption est ensuite réalisée de la façon suivante
Pour préparer la colonne, on la remplit avec 1,2 1 du gel d'immunoaffinité (le Séphacryl S1000 activé à la benzoquinone) où se trouve fixé l'anticorps monoclonal 463A8 à une concentration de 0,5 mg/ml de gel en présence du mélange d'inactivation virale déjà décrit. La colonne est conservée ainsi 24 heures à 20"C, puis transférée dans une zone hors virus (ZHV) où le gel est équilibré par 10 volumes colonne de tampon A.The immunoadsorption is then carried out as follows
To prepare the column, it is filled with 1.2 l of the immunoaffinity gel (benzoquinone-activated Sephacryl S1000) where the monoclonal antibody 463A8 is fixed at a concentration of 0.5 mg / ml of gel in the presence of the viral inactivation mixture already described. The column is thus stored for 24 hours at 20 ° C. and then transferred to an off-virus zone (ZHV) where the gel is equilibrated with 10 column volumes of buffer A.

23,5 1 de la solution de Facteur VIII prépurifiée, obtenue précédemment sont injectés dans la colonne à un débit de 16 volumes colonne/heure.23.5 1 of the prepurified Factor VIII solution, obtained previously, are injected into the column at a flow rate of 16 column / hour volumes.

Les protéines non retenues sont éliminées par lavage de l'immunoadsorbant avec 10 volumes colonne de tampon d'équilibrage A avec un débit de 16 volumes colonne/heure. Unretained proteins are removed by washing the immunoadsorbent with 10 column volumes of Equilibration Buffer A at a flow rate of 16 column / hour volumes.

Le Facteur VIII est élué avec 6,5 volume colonne d'un tampon B avec un débit de 8 volumes colonne/heure. Factor VIII is eluted with 6.5 column volume of buffer B with a flow rate of 8 column / hour volumes.

L'étape d'immunopurification est suivie d'une étape de chromatographie d'échange d'ions, selon laquelle 900 ml de Q Sépharose FF (gel commercialisé par Pharmacia) sont placés dans une colonne en présence d'éthanol à 20 ,Ó puis lavés successivement avec 2 1 NaOH 0,5 N, 5 1 d'eau distillée, 3 1 NaCI 2M, 5 1 d'eau distillée, puis enfin, équilibrés avec 7 1 du tampon C. L'éluat récupéré de la colonne d'immunoaffinité est alors injecté à un débit de 12 I/h. A la fin de l'injection, le gel est lavé avec 9 1 de tampon d'équilibrage A. Le Facteur VIII est élué avec 3 1 de tampon d'élution D à un débit de 6 l/h. Ensuite, pour préparer du Facteur
VIII prêt à la commercialisation, on dialyse la solution de Facteur VIII obtenu après addition d'albumine contre 6 volumes d'un tampon E à un débit de 15 I/h. La solution est ensuite filtrée stérilement, répartie en dose unitaire puis lyophilisée.The immunopurification step is followed by an ion exchange chromatography step, according to which 900 ml of Q Sepharose FF (gel marketed by Pharmacia) are placed in a column in the presence of 20% ethanol and then washed successively with 2 l of 0.5 N NaOH, 5 l of distilled water, 3 l of 2 M NaCl, 5 l of distilled water, and finally equilibrated with 7 l of buffer C. The eluate recovered from the column of immunoaffinity is then injected at a rate of 12 l / h. At the end of the injection, the gel is washed with 9 l of equilibration buffer A. Factor VIII is eluted with 3 l of elution buffer D at a flow rate of 6 l / h. Then to prepare the Factor
VIII ready for commercialization, the Factor VIII solution obtained after the addition of albumin is dialyzed against 6 volumes of buffer E at a flow rate of 15 l / h. The solution is then sterile filtered, divided into unit dose and freeze-dried.

Le temps nécessaire pour charger la solution de Facteur VIII (324.5 UI de Facteur VIII par mg d'anticorps monoclonal)dans la colonne d'immunoaffinité est de 1 h 20 mn, le lavage dure 45 mn et ltélution dure 58 mn. The time required to charge the Factor VIII solution (324.5 IU of Factor VIII per mg of monoclonal antibody) in the immunoaffinity column is 1 h 20 min, the wash lasts 45 min and the elution lasts 58 min.

Le tableau suivant représente les différentes caractéristiques du procédé selon l'invention. Les résultats comportent à la fois le rendement de chaque étape du procédé et le rendement global du procédé.

The following table shows the different characteristics of the process according to the invention. The results include both the efficiency of each step of the process and the overall yield of the process.

ETAPE <SEP> FVIII: <SEP> Unités <SEP> Rendement <SEP> étape <SEP> Rendement <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> <SEP> totales <SEP> (U/ml) <SEP> (%) <SEP> procédé <SEP> (%)
<tb> Plasma <SEP> humain <SEP> 524 <SEP> 600* <SEP> 100 <SEP> --- <SEP> 0.016
<tb> Cryoprécipité <SEP> 244 <SEP> 000 <SEP> 46.5 <SEP> 100 <SEP> 0.4
<tb> Concentré <SEP> de <SEP> pureté
<tb> Intermédiaire <SEP> 194 <SEP> 700 <SEP> 79.8 <SEP> 79.8 <SEP> 1
<tb> (inactive <SEP> viralement <SEP> par <SEP> un
<tb> mélange <SEP> solvant/détergent)
<tb> Immunopurification <SEP> 169 <SEP> 500 <SEP> 87 <SEP> 69.5 <SEP> --
Echange <SEP> d'ions <SEP> 152 <SEP> 500 <SEP> 89.9 <SEP> 62.5 <SEP> 2400
<tb> Dialyse <SEP> 144 <SEP> 800 <SEP> 94.9 <SEP> 59.3 <SEP> 9.6
<tb> STEP <SEP> FVIII: <SEP> Units <SEP> Yield <SEP> step <SEP> Yield <SEP> Specific <SEP> Activity
<tb><SEP> total <SEP> (U / ml) <SEP> (%) <SEP> process <SEP> (%)
<tb> Plasma <SEP> human <SEP> 524 <SEP> 600 * <SEP> 100 <SEP> --- <SEP> 0.016
<tb> Cryoprecipitate <SEP> 244 <SEP> 000 <SEP> 46.5 <SEP> 100 <SEP> 0.4
<tb> Concentrate <SEP> of <SEP> purity
<tb> Intermediate <SEP> 194 <SEP> 700 <SEP> 79.8 <SEP> 79.8 <SEP> 1
<tb> (inactive <SEP> virally <SEP> by <SEP> a
<tb> mixture <SEP> solvent / detergent)
<tb> Immunopurification <SEP> 169 <SEP> 500 <SEP> 87 <SEP> 69.5 <SEP> -
Exchange <SEP> of ions <SEP> 152 <SEP> 500 <SEP> 89.9 <SEP> 62.5 <SE> 2400
<tb> Dialysis <SEP> 144 <SEP> 800 <SEP> 94.9 <SEP> 59.3 <SEP> 9.6
<Tb>

* Plasma estimé arbitrairement à 1 U/ml non dosé. * Plasma arbitrarily estimated at 1 U / ml unmeasured.

Un exemple comparatif a été réalisé dans les conditions indiquées dans le document EP-A-0 286 323, c'est-à-dire que l'immunopurification ne comporte pas l'étape a) mais comporte après l'étape b) une étape supplémentaire pour éliminer le Facteur von Willebrand. Dans ces conditions, le temps nécessaire pour charger la solution de Facteur VIII dans la colonne est de 27 heures, le lavage comportant la nécessité d'éliminer le Facteur von Willebrand dure 10 heures et l'élution dure 3 h 20 minutes. Le gain de temps obtenu selon l'invention est donc significatif. A comparative example was carried out under the conditions indicated in the document EP-A-0 286 323, that is to say that the immunopurification does not comprise step a) but comprises after step b) a step additional to remove von Willebrand Factor. Under these conditions, the time required to charge the Factor VIII solution in the column is 27 hours, the washing comprising the necessity of removing the von Willebrand factor lasts 10 hours and the elution lasts 3 hours 20 minutes. The time saved according to the invention is therefore significant.

Cet exemple est par ailleurs illustré par la figure 2 qui montre bien qu'après 50 mn de contact selon l'invention, 10 96 environ de Facteur
VIII seulement n'est pas adsorbé, alors que ce pourcentage s'élève à près de 65 Ó lorsque le Facteur VIII n'a pas été préalablement dissocié.This example is furthermore illustrated in FIG. 2, which clearly shows that after 50 minutes of contact according to the invention, approximately 10% of the factor
Only VIII is not adsorbed, whereas this percentage rises to almost 65% when Factor VIII has not been previously dissociated.

La figure 4 illustre par ailleurs l'intérêt de l'utilisation d'ions divalents plutôt que d'autres ions, en particulier des ions monovalents tels que NaCI. En effet, même si, d'après la figure 1, NaCl a tendance à déstabiliser moins rapidement le Facteur VIII que CaC12, le Facteur VIII est adsorbé beaucoup plus rapidement lorsqu'il a été dissocié avec des ions divalents. FIG. 4 also illustrates the advantage of using divalent ions rather than other ions, in particular monovalent ions such as NaCl. Indeed, even though, according to Figure 1, NaCl tends to destabilize Factor VIII less rapidly than CaCl2, Factor VIII adsorbs much faster when dissociated with divalent ions.

Exemple de purification du Facteur VIII à partir du plasma
a) Exemple comparatif, dans des conditions non dissociantes.Example of Purification of Factor VIII from Plasma
a) Comparative example, under non-dissociative conditions.

1000 ml de plasma inactivé viralement (Tween 80 256, TnBP 0,6 ,Ó) pH 6,8 sont mis à incuber avec 10 ml de gel d'immunoaffinité pendant 16 heures, soit 200 UI de Facteur VIII par mg d'anticorps monoclonal, 1'ACM anti-Facteur VIII étant 1'ACM463A8, à une concentration de 0,5 mg/ml de gel. Cette durée est celle nécessaire pour l'adsorption de 100 96 de Facteur VIII présent dans le milieu à + 4"C. Le gel est ensuite transféré en colonne, lavé avec un tampon imidazole 20 mM, pH 7, NaCI 0,15 M, jusqu'à élimination des protéines contaminantes (suivie par densitométrie jusqu'à annulation de la densité optique à 280 nm). 1000 ml of virally inactivated plasma (Tween 80 256, TnBP 0.6, 6) pH 6.8 are incubated with 10 ml of immunoaffinity gel for 16 hours, ie 200 IU of Factor VIII per mg of monoclonal antibody With the anti-Factor VIII ACM being ACM463A8 at a concentration of 0.5 mg / ml gel. This time is that necessary for the adsorption of 100% of factor VIII present in the medium at + 4 ° C. The gel is then transferred to a column, washed with a 20 mM imidazole buffer, pH 7, 0.15 M NaCl, until the contaminating proteins are removed (followed by densitometry until the optical density is canceled at 280 nm).

Ensuite, le gel est lavé avec un tampon imidazole 20 mM, pH 6,8,
CaCl2 0,25 M, pour éluer le vWF. Le Facteur VIII est élué ultérieurement avec un tampon imidazole 10 mM pH7 NaCI 0,075 M éthylène glycol 50 96
Tween 80 1 96. Le rendement en Facteur VIII est de 24 %.Then, the gel is washed with a 20 mM imidazole buffer, pH 6.8,
0.25 M CaCl 2 to elute the vWF. Factor VIII is eluted later with 10 mM imidazole buffer pH7 0.075 M NaCl 0.05 ethylene glycol
Tween 80 1 96. The yield of Factor VIII is 24%.

b) Selon l'invention
A 1000 ml de plasma, on ajoute CaCl2 à une concentration finale de 0,113 M, on inactive viralement le plasma avec un mélange de 2 96 de
Tween 80 et de 0,6 % de TnBP, et on ajuste le pH à 6,8.b) According to the invention
To 1000 ml of plasma, CaCl 2 is added to a final concentration of 0.113 M, the plasma is inactivated virally with a mixture of 2 96 of
Tween 80 and 0.6% TnBP, and the pH was adjusted to 6.8.

On effectue l'immunoadsorption en colonne avec un débit de 120 ml/cm2/h, dans une colonne de 5 cm de diamètre, ce qui correspond à un débit volumique de 2,4 I/heure et à un temps de charge de 25 mn pour 1 1 de plasma. Le rendement en Facteur VIII est de 61 %. The column is immunoadsorbed at a flow rate of 120 ml / cm 2 / h, in a column 5 cm in diameter, which corresponds to a flow rate of 2.4 l / h and a loading time of 25 min. for 1 1 of plasma. The yield of Factor VIII is 61%.

Le même essai répété 10 fois donne à chaque fois des rendements à peu près constants, aussi bien pour l'exemple comparatif que pour l'exemple conforme à l'invention (respectivement 24,3 + 2,3 96 et 61.1 +, 6.3 %). The same test repeated 10 times gives each time approximately constant yields, both for the comparative example and for the example according to the invention (respectively 24.3 + 2.3 96 and 61.1 +, 6.3% ).

La figure 3 illustre bien cet aspect de l'invention appliqué au plasma. Après 25 mn pratiquement tout le Facteur VIII est adsorbé selon l'invention, tandis que près de 70 % ne l'est pas selon l'exemple comparatif. Figure 3 illustrates well this aspect of the invention applied to the plasma. After 25 minutes, almost all the Factor VIII is adsorbed according to the invention, whereas nearly 70% is not adsorbed according to the comparative example.

Claims

A process for the preparation of very high purity Factor VIII from a complex aqueous mixture containing von Willebrand Factor VIII complexed, a process comprising a step of immunoadsorption on a monoclonal anti-Factor VIII antibody, characterized in that than

a) adding to said complex aqueous mixture divalent ions in an amount sufficient to obtain the dissociation of the complex Factor

VIII-von Willebrand Factor

b) the mixture obtained in a) is brought into contact with an immunoadsorbent consisting of a covalently immobilized anti-Factor VIII monoclonal antibody on a rigid support, said monoclonal antibody being directed against the light chain of Factor VIII and having at the ability to inhibit Factor VIII :: C coagulant activity and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions

c) eluting the Factor VIII solution of the immunoadsorbent

2. Method according to claim 1, characterized in that step b) is continued until adsorption of all of the Factor VIII present in the complex mixture.

3. Method according to claim 2, characterized in that, for 200 to 600 IU of Factor VIII per mg of monoclonal antibody, the contact time is less than 1 hour 30 minutes, preferably less than 1 hour.

4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that said mixture is selected from the plasma, the cryoprecipitate in solution, a concentrate of intermediate purity, a high purity concentrate, a culture supernatant containing Factor Recombinant VIII.

5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the divalent ions are added at concentrations ranging from 0.1 to 0.6

M, preferably 0.2 to 0.4 M.

6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the divalent ions added in step a) are selected from Mg ++, Mn Bat +, Cl ++.

7. Process according to claim 6, characterized in that the divalent ions are Calf ions.

8. Method according to one of the preceding claims, characterized in that said mixture is inactivated virally.

9. Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that said carrier and / or said monoclonal antibody are inactivated virally.

10. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the support of step b) comprises a gel of very high porosity.

11. The method of claim 10, characterized in that it is an acrylamide gel.

12. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the concentration of monoclonal antibody is 0.1 to 5 mg / ml, preferably 0.3 to 1 mg / ml.

13. Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the complex mixture is human plasma and before step b), the pH is adjusted to around 6.5 to 6.8.

14. Method according to one of the preceding claims, characterized in that as anti-Factor VIII monoclonal antibody is used a monoclonal antibody which binds 100 96 Factor VIII, in the presence of Cas12 at a concentration of 0.25 Mr.

15. Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that in step c) uses an elution buffer which comprises a detergent.

16. Process according to one of the preceding claims, characterized in that it comprises a step d) according to which the Factor VIII solution eluted in step c) is chromatographed by ion exchange.