FI87469B - Foerfarande foer framstaellning av antibiotikum a 42867 och dess additionssalter. - Google Patents

Description

87469

Menetelmä antibiootin A 42867 ja sen additiosuolojen valmis-tami seksi Tämä keksintö koskee menetelmää uuden antibiootin, jota merkitään antibiootti A 42867 ja sen additiosuolojen valmistamiseksi. Uutta antibioottia ja sen farmaseuttisia koostumuk-5 siä voidaan käyttää lääkkeinä, erityisesti niille herkkien mi kro-organismien aiheuttamien infektiosairauksien hoidossa.

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat myös aktiivisia kasvua edistävinä aineina eläimillä, kuten siipikarjalla, sioilla, märehtijöillä, jne.

10 Erityisesti keksinnön kohteena on menetelmä antibiootti A 42867:n valmistamiseksi, jossa menetelmässä viljellään uutta kantaa Nocardia sp. ATCC 53492 tai sen antibioottia A 42867 tuottavaa muunnosta tai mutanttia.

Nocardia sp. ATCC 53492 on eristetty maanäytteestä ja tal-15 lennettu 23. toukokuuta 1986 kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 20852 Maryland, USA, Budapestin sopimuksen sopimusehtojen mukaisesti. Kannalle on annettu 1 i i ttymi s numero ATCC 53492.

Koska antibiootti A 42867:n ja vastaavien farmaseuttisesti .1 ‘ 20 hyväksyttävien suolojen antimikrobiset aktiivisuudet ovat hyvin samankaltaiset, tässä keksinnössä käsiteltäessä • * « *·**' antibiootti A 42867:n biologisia ominaisuuksia tarkoitetaan myös vastaavia suoloja, ja päinvastoin, käsiteltäessä anti-·: biootti A 42867:n farmaseuttisesti hyväksyttävän additio- : 25 suolan biologia ominaisuuksia tarkoitetaan myös vastaavaa "ei-additiosuola "-muotoa.

*-;· Antibiootti A 42867:n tuotanto aikaansaadaan viljelemällä ·:· kantaa Nocardia sp., joka pystyy tuottamaan sitä, t.s. kan taa Nocardia sp. ATCC 53492 tai sen antibioottia A 42867 30 tuottavaa muunnosta tai mutanttia, aerobisissa olosuhteissa, vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää assi- 2 87469 mi 1 oi tuvat hiili-, typpilähteet ja epäorgaanisia suoloja. Monia ravintoalustoja, joita tavallisesti käytetään fer-mentoitaessa, voidaan käyttää, kuitenkin tietyt kasvualustat ovat edullisia. Edullisia hi ililähteitä ovat glukoosi, 5 mannoosi, galaktoosi, tärkkelys, maissijauho ja vastaavat. Edullisia typpi lähteitä ovat ammoniakki, nitraatit, soija-papujauho, peptoni, lihauute, hiivauute, tryptoni , aminohapot ja vastaavat. Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan lisätä kasvualustoihin, ovat tavanomaiset liukoiset suo-10 lat, jotka pystyvät muodostamaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, fosfaatti-, nitraatti-ioneja ja vastaavia.

Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa esivi1jel1 ään 15 ravistuspullossa, sen jälkeen viljelmää käytetään ympättäessä käymisfermentorit oleellisten määrien antibioottia tuottamiseksi. Esikasvatukseen käytetty kasvualusta voi olla sama kuin mitä käytetään suuremmissa fermentoreissa, mutta myös muita kasvualustoja voidaan käyttää. Antibioot-20 tia A 42867 tuottava kanta voi kasvaa lämpötiloissa, jot-;; ka ovat 20°C - 40°C, mieluimmin 24-35°C.

Fermentoi nni n kuluessa antibioottituotantoa voidaan seura-ta testaamalla kasvuliemen ja myseelin uutenäyttei stä an-bioottinen aktiivisuus esimerkiksi kasvukokei 11 a tai TLC-25 tai HPLC-menetelmi 11ä.

Antibiootti A 42867:1 le herkkiä organismeja, kuten kanto-ja Bacillus subtilis ja S.aureus, voidaan käyttää testi-organismeina. Kasvukoe suoritetaan edullisesti agar-dif-fuusiomenetelmäl lä agarlevyi 11 ä. Antibioottisen aktiivi-- 30 suuden maksimi tuotanto tapahtuu tavallisesti fermentoin-nin toisen ja viidennen päivän välisenä aikana.

Antibiootti A 4 2867:ää tuotetaan viljelemällä kantaa No-cardia sp. ATCC 53492 tai sen antibioottia A 42867 3 87469 tuottavaa mutanttia tai muunnosta, ja antibiootti on pääasiassa löydettävissä ka svatus 1iera istä.

Kannan Nocardia sp. ATCC 53492 morfologiset ominaisuudet Tämän kannan morfologia kasvatettuna maa-agarkasvua1 usta! -5 la on samanlainen kuin aktinomykeetei11ä osoittaen runsas ta ilmamyseelin kehittymistä, jossa pitkät hyyfit kohtalaisen haarautuneina. Tämän kannan pääasiallinen morfologinen tunnusmerkki on substraatti- ja ilmamyseelin pilkkoutuminen tankomaisiksi kappaleiksi. Substraattimyseelin 10 pilkkoutuminen havaittiin kaikilla agarkasvualustoilla, joita käytettiin viljelytunnusmerkkien määrittämiseksi, paitsi kasvualustalla No 5, kasvualustalla No 7, Hickey-Tresner- ja munavalkuaisagareilla todettiin täydellinen pi 1kkoutumi nen.

15 Kannan Nocardia sp. ATCC 53492 substraattihyyfit kehittyivät täysin, haarautuminen ja pilkkoutuminen tankomaisiksi kappaleiksi riippuen viljelmän iästä.

. Ilmamyseeli kehittyi hyvin maa-agarilla ja ves iagari 11 a .

Ilmahyyfit olivat pitkiä suoria maa-agarilla, muodostaen i . 20 joskus solmuja tai pesämäisiä tiheikköjä. Tämän kannan morfologia muistuttaa Nocardia-suvun morfologiaa.

'/·/ Tämän kannan morfologinen karakteri soi nti suoritettiin sa moilla levyillä, joita käytettiin viljelyominaisuuksien tutkimiseen. Sen seikan varmentamiseksi, oliko agarlevyil-25 lä tapahtunut pilkkoutumista, kasvualustan pintaa leikattiin muovi veitsellä ja näyte tutkittiin lasilevyllä optisella mikroskoopilla. Ne stemäi sessä viljelmässä tällä kannalla havaittiin laaja pilkkoutuminen sauvamaisiksi kappaleiksi .

4 87469

Kannan Nocardia sp. ATCC 53492 vi1je1ytunnusmerkit

Viljelytunnusmerkkien tutkimiseksi kantaa Nocardia sp.

ATCC 53492 viljeltiin erilaisilla standardikasvua1ustoi1 -la, joita Shirling ja Gottlieb ovat esittäneet (Shirling 5 E.B. and Gottlieb D., 1966 - Method for characterization of Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol, 16, 313-340), sekä lisäksi useilla kasvualustoilla, joita Waksman suosittelee (Waksman, S.A. 1961 - The Actino-mycetes - The Williams and Wilkins Co. Baltimore; Voi. 2, 10 328-334).

Värin määrittäminen suoritettiin tarvittaessa menetelmällä, jonka ovat esittäneet Maerz ja Paul (Maerz A. and M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color -2nd Edition McGraw -Hill Book Company Inc., New York) 15 Organismin kykyä käyttää hyväkseen erilaisia hii1i1ähteitä tutkittiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Shirling ja Gottlieb.

. Viljely- ja fysiologiset tunnusmerkit ja hi i 1 i 1 ähtei den hyväksikäyttö on esitetty Taulukoissa I, II, III, IV ja ,·. :20 V.

Taulukossa I esitetyt lukemat on saatu kahden viikon inku-boinnin jälkeen 28°C:ssa.

TAULUKKO I

,·:- KANNAN NOCARDIA sp. ATCC 53492 VILJELYTUNNUSMERKIT

: --25 Vil jelyalusta Tunnusmerkit

Kasvualusta No 2 runsasta kasvua, rypistynyt pin- (hiivauute-mal1asagar) ta, väri ruskea 15/H/11, liuke- neva pigmentti keltainen

Kasvualusta No 3 kohtuullista kasvua, pehmeä pin- 30 (kaurajauhoagar) ta, väri oranssi 12/L/12, jälkiä i1mamyseelistä valkoinen 5 87469 TAULUKKO I (jatk.)

Vi 1jelyalusta Tunnusmerkit

Kasvualusta No 4 runsasta kasvua, rypistynyt pin- (epäorgaanisia suoloja- ta, väri tummaoranssi 13/L/12, 5 tärkkelysagar) jälkiä i1mamyseelistä valkoinen, jälkiä liukenevasta pigmentistä, väri roosa

Kasvualusta No 5 runsasta kasvua, rypistynyt pin- (glyseroli-asparagiini- ta, väri tummaoranssi 13/L/12, 10 agar) jälkiä i1mamyseelistä valkoinen

Kasvualusta No 6 kohtuullista kasvua, pinta hiu- (peptoni-hiivauute- kan rypistynyt, väri aprikoosi rauta-agar) 10/F/7

Kasvualusta No 7 runsasta kasvua, pinta rypisty- 15 (tyrosiiniagar) nyt, väri ruskea 15/H/11, jälkiä i1mamyseelistä valkoinen

Czapek-sakkaroosiagar runsasta kasvua, pinta pehmeä, värikeltainen-oranssi9/G/8, jälkiä i1mamyseelistä 20 Kaurajauhoagar runsasta kasvua, pinta hiukan rypistynyt, väri oranssi 12/F/10, jälkiä i1mamyseelistä valkoinen, jälkiä liukenevasta pigmentistä roosa 25 Hickey'n ja Tresner'n agar runsasta kasvua, pinta rypistynyt, väri kultainen 9/1/6

Kai sium-malaatti agar runsasta kasvua, pinta pehmeä, värivaaleankeltainen10/C/4, jälkiä i1mamyseelistä valkoinen 30 Bennett'n agar runsasta kasvua, pinta rypisty- : nyt, väri ruskea 15/H/11

Czapek-glukoosiagar runsasta kasvua, pinta rypisty nyt, väri ruskea, 7/E/12, jälkiä i1 mamyseelistä valkoinen, liuke- 35 neva pigmentti tummankeltainen

Glukoosi-asparagiini- kohtuullista kasvua, pinta hiu- agar kan kova, väri keltainen 10/L/5

Ravintoagar runsasta kasvua, pinta pehmeä, väri keltainenoranssi 9/G/6 6 87469 TAULUKKO I (jatk.)

Vi1jelyalusta Tunnusmerkit

Kuorittumaitoagar runsasta kasvua, pinta pehmeä, persikan värinen 9/1/5, jälkiä 5 i1mamyseelistä valkoinen

Munanvalkuaisagar kohtuullista kasvua, pinta peh meä, väritön, jälkiä ilmamysee-1 i stä

Sabouraud-agar runsasta kasvua, pinta rypistyit) nyt, väri ruskea 10/L/10

Peruna-agar runsasta kasvua, pinta rypisty nyt, väri keltainen 10/L/7, jälkiä i1mamyseelistä valkoinen, liukeneva pigmentti roosa 15 Vesiagar hyvin niukkaa kasvua, pinta peh meä, väritön, hyvin muodostuvaa ilmamyseeliä valkoinen

Maa-agar kohtuullista kasvua, pinta peh meä, väritön, runsasta ilmamysee-20 Iin muodostumista . *·. Dekstroosi-tryptoniagar runsasta kasvua, pinta rypisty- ·; nyt, väri keltainen 10/L/7 V: Kirjaimet ja numerot viittaavat värin määrittämiseen

Maerzin ja Paulin (2) mukaan.

7 8 7 4 6 9

TAULUKKO II

KANNAN NOCARDIA sp. ATCC 53492 FYSIOLOGISET TUNNUSMERKIT

Kokeet Tulokset 5 Tärkkelyshydrolyysi positiivinen

Tyrosiinireaktio positiivinen

Kaseiinihydrolyysi positiivinen

Kai sium-malaatin liukoiseksi tekeminen negatiivinen 10 Nitriitti nitraatista negatiivinen

Selluloosan hajottaminen negatiivinen

Rikkivedyn muodostus positiivinen 1yijyasetaatti- 1iuskoi11 a (peptonisaati o positiivinen 15 Lakmusmai to-\ ^oagulaatio negatiivinen 8 87469

TAULUKKO III LÄMPÖTILA-TOLERANSSI

15° C = - 22° C = + 5 28° C = ++ 37° C = ++ 42° C = + 50° C = -

Kaikkein sopivin lämpötila pesäkkeiden kehittymiselle ha-10 valttiin olevan alue noin 22°C:sta noin 42°C:seen.

Optimi 1ämpöti1 a on 28°C:sta 37°C:seen.

TAULUKKO IV pH-TOLERANSSI

pH 3 = - 15 pH 4 = - ... pH 5 = ++ pH 6 = ++ pH 7 = ++ pH 8 = ++ 20 pH 9 + + pH 10 = - pH 11 = - = ei kasvua + = kohtuullista kasvua 25 ++ = runsasta kasvua

Fysiologisten tunnusmerkkien, pH- ja 1ämpöti1atoleranssi-kokeiden suorittamiseksi käytettiin Hickey'n ja Tresner'in agarkasvualustaa.

9 87469

TAULUKKO V

HIILEN HYVÄKSIKÄYTTÖ

Hiili lähde Kasvu

Laktoosi ++ 5 Arabinoosi ++

Ksyloosi ++

Mannoosi ++

Fruktoosi ++

Sei 1obi oos i + + 10 Galaktoosi ++

Inositoli ++

Glukoosi ++

Raffinoosi

Riboosi ++ 15 Sakkaroosi

Sa1i s i i n i +

Sei 1 uioosa Ramnoosi = ei kasvua 10 + kohtuullista kasvua ++ - runsasta kasvua Tähän kokeeseen käytettiin kasvualustaa No 8 ja tulokset luettiin sen jälkeen kun oli inkuboitu 10 päivää 28°C -- 30°C:ssa .

87469 1 o

KEMOTAKSONOMISET TUTKIMUKSET

Kantaa viljeltiin V-6 kasvualustassa (lihauutetta 0,5 %, autolysoitua hiivaa 0,5 %, peptonia 0,5 %, hydrolysoitua kaseiinia 0,3 %, glukoosia 2 %, N a C1 : ä ä 0,15 %) inkuboi-5 den kiertoravis telijassa 200 kierr./min. 30°C:ssa 72 tuntia. V-6 kasvualustassa kasvanut myseeli otettiin talteen sentrifugoimal1 a (3000 kierr./min. x 10 minuuttia) ja pestiin kaksi kertaa tislatulla vedellä. Myseeli pestiin edelleen etanolilla, jonka jälkeen kuivattiin huoneen lämpöti-10 lassa 1aminaarisessa virtauksessa.

Kuivattua myseeliä käytettiin kokosoluvalmisteena. AMINOHAPPOJEN ANALYYSI:

Aminohappojen analysointi, joka suoritettiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Becker et ai., ("Rapid differentia-15 tion between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", Appi. Microbiol.

1 2 , 421-423 (1964)), osoitti, että läsnä oli meso-diamino-pimeliinihappoja.

SOKERI ANALYYSI: 20 Sokeripitoisuuden analyysi, joka suoritettiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet M.P. Lechevalier ("Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab. Clin. Med. _71_, 934-944 ( 1968)), käyttäen ohutkerroskroma-tografiassa kalvoja, kuten ovat esittäneet J.L. Staneck 25 ja G.D. Roberts ("Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chomatography", 28, 226-231 1971)), osoitti, että läsnä oli arabinoosia ja galaktoosia.

11 87469

KANNAN NOCARDIA sp. ATCC 53492 IDENTIFIOINTI

Meso-diaminopimeliinihappojen esiintyminen yhdessä tun-nussokereiden, kuten ga Vakioosi n ja arabinoosin kanssa, osoittaa, että tämä kanta on aktinomycetes, jonka solu-5 seinätyyppi on IV, luokituksen mukaan, jonka ovat esittäneet Lechevalier M.P. ja H. Lechevalier ("Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes", Int. Journ. Syst. Bacterial. 20, 435-443 (1970)).

10 Kuten on laita muilla mikro-organismeilla, antibioottia A 42867 tuottavan kannan tunnusmerkit ovat alttiina muutokselle. Esimerkiksi kannan keinotekoiset muunnokset ja mutantit voidaan saada käsittelemällä erilaisilla, tunnetuilla mutageenei11a , kuten UV-säteillä, röntgensäteillä, 15 suurtaajuusaal1 oi 11 a , radioaktiivisilla säteillä ja kemi kaaleilla, kuten typpihapolla, N-metyyli-N'-nitro-N-nit-rosoguanidiinilla ja monilla muilla. Kaikkia luonnollisia ja keinotekoisia muunnoksia ja mutantteja, jotka kuuluvat ; Nocardia-suvun lajeihin ja tuottavat A 42867 antibiootte- ; ;20 ja, pidetään ekvivalentteina kannan Nocardia sp. ATCC 53492 ; ’ suhteen ja katsotaan kuuluvaksi tämän keksinnön piiriin.

: ·.. Antibioottien A 42867 talteenotto tuottavan mikro-organis- min käymisliemistä tapahtuu sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, jolloin suoritetaan uutto liuottimilla, .-.:25 saostaminen lisäämällä ei-liuottimia tai muuttamalla liuok-sen pH-arvoa, jakaantumi skromatograf ia , käänteis-faasinen-jakaantumi skromatografi a, ion i nvaihtokromatografi a , affi-: '·· niteettikromatografia ja vastaavat toimenpiteet.

Edullisessa menetelmässä käytetään affiniteettikromatogra --30 fiaa immobi1isoidul1 a D-alanyyl i-D-alaniini 11 a, jonka jälkeen seuraa käänteisfaasinen pyiväskromatografia .

12 87 469

Immobilisoituja D-alanyyli-D-alaniini-matriiseja, jotka ovat sopivia tähän talteenottomenetelmäan, on esitetty eurooppalaisessa patenttihakemuksessa No 83112555. Edullinen matriisi tässä menetelmässä on D-al anyyl i-D-a 1 ani i n i 5 kytkettynä tasahuokoiseen risti inkytkettyyn polydekstraa- ni in.

Sen jälkeen suodatetuille käymisliemi 11 e suoritetaan affiniteetti kromatograf ia immobi1isoidul1 a D-a1anyyli-D--alaniinilla joko pylväässä tai panoksittain.

10 Antibiootti A 42867:n sitoutuminen affiniteettimatriisiin tapahtuu mieluimmin pH:ssa noin 7,0 - 8,0 ja sen eluointi suoritetaan emäksisemmillä pH-arvoilla (mieluimmin välillä 9,0 - 11,5) vesipitoisella emäksellä. Tämä vesipitoinen emäs voi olla ammoniakki, haihtuva amiini, alkali- tai 15 ai kai imetal lihydroksidi tai emäksinen, puskuroitu liuos mahdollisesti polaarisen orgaanisen liuottimen, kuten polaarisen veteensekoittuvan liuottimen, joita jäljempänä määritellään, läsnäollessa.

Sen jälkeen, kun epäpuhtaudet on poistettu huuhtomalla ;';':20 pylväs vesipitoisella puskurilla, jonka pH on 4-8 ja joka : mahdollisesti sisältää suoloja, karbamidia ja/tai veteen :\ sekoittuvia liuottimia, antibiootti A 42867 eluoidaan edel- * lä esitetyllä eluointiseoksella. Sen jälkeen raaka anti biootti otetaan talteen mieluimmin poistamalla vesi täy-. .25 sin yhdistetyistä antibioottia sisältävistä fraktioista tislaamalla atseotrooppisesti yhdessä orgaanisen liuotti-| men kanssa, joka pystyy muodostamaan veden kanssa atseo- ·.. trooppisia mi nimi seoksia, jonka jälkeen, lisäämällä ei- liuotinta, saostetaan toivottu tuote.

30 Tyypillisiä esimerkkejä orgaanisista liuottimista, jotka - pystyvät muodostamaan atseotrooppisia mi nimi seoksia veden kanssa, ovat n-butanoli, bentseeni, tolueeni, butyylieet-teri , hii1itetraklori di , kloroformi, sykloheksaani , 13 87469 2 ,5-dimetyylifuraani, heksaani ja m-ksyleeni; edullinen liuotin on n-butanoli.

Esimerkkejä ei-1iuottimista ovat petrolieetteri, alempi-alkyylieetterit, kuten etyylieetteri, propyyl ieetteri ja 5 butyylieetteri ja ai empi a 1 kyy1iketonit, kuten asetoni.

Vaihtoehtoisesti yhdistetyt antibioottia sisältävät fraktiot konsentroidaan pieneen tilavuuteen, mieluimmin tislaamalla atseotrooppisesti edellä määritellyn orgaanisen liuottimen kanssa ja muodostunut vesipitoinen liuos lyo-10 fi1i so i daan.

Jos eluointiin käytetty vesipitoinen emäs on haihtumaton, voi olla tarpeen suorittaa neutralointi ja suolan poistaminen konsentraatista ennen seostamista tai pakastus-kuivausta.

15 Sopiva suolanpoistomenetelmä käsittää antibioottia sisältävän vesipitoisen liuoksen valuttamisen läpi silanoidus-ta piihappogeelipyiväästä, joka pestään tislatulla vedellä ja eluoidaan polaarisen veteen sekoittuvan liuottimen ja veden seoksella.

20 Tyypillisiä esimerkkejä polaarisista, veteen sekoittuvista liuottimista ovat vesiliukoiset alkoholit (kuten meta-noli, etanoli, isopropanoli, n-butanoli), asetoni, aseto-nitriili, alempialkyylialkanoaatit (kuten etyyliasetaatti), tetrahydrofuraani, dioksaani ja dimetyyliformamidi ja näi-25 den seokset; edullinen polaarinen, veteen sekoittuva liuotin on asetoni tri i1i .

Vaihtoehtoisesti suolan poistaminen voidaan suorittaa käyttäen antibioottia sisältävälle liuokselle edellä kuvattua affiniteettipylvästä, joka pestään tislatulla vedellä ja 30 eluoidaan haihtuvalla, vesipitoisella emäksellä, kuten edellä esitettiin affiniteettikromatografiän eluoinnin yhteydessä .

14 87 469 Näin saatu tuote on antibiootti A 42867. Sopiva menetelmä puhtaan antibiootti A 42867:n saamiseksi on sellainen, jossa edellä saatu antibiootti puhdistetaan edelleen affiniteetti kromatograf iapyl väässä . Tavallisesti käytetään 5 samaa s tationäärifaasia (immobi1isoitu D-a1 anyy1i-D-ala -niini) ja toivottu antibiootti eluoidaan edellä kuvatun affiniteettikromatografia-menetelmän mukaisesti immobili-s o idulla D-alanyyli-D-alaniinilla.

Edullinen immobi1isoitu D-alanyyli-D-alaniini on Sepha-10 rose--aminokaproyyli-D-alanyyli-D-alaniini , edullinen tasapainoitusseos on 0,16 %:inen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M NaClrää, pH säädettynä arvoon 7-8, edullinen huuhdeliuos on 0,16 %:inen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2M natriumkloridia, pH säädettynä 15 arvoon 7-8, edullinen eluointiseos on 16 %:inen (paino/ til.) ammoniakki .

Vaihtoehtoisesti keksinnön mukainen antibiootti voidaan ·-. eristää käymis 1 iemestä tai se voidaan edelleen puhdistaa vahvojen tai heikkojen anionihartsien avulla, mukaanluettu-. ;20 na funktionalisoidut polystyreeni-, akryyli- tai polydeks-;· traanimatriisit. Esimerkkejä heikoista anioninvaihtohart- seista ovat sellaiset, joita myydään seuraavilla kauppani-• ‘ millä: Dowex MWA-1 tai WGR (Dow Chemical), Amberlite I RA - 7 3 (Rohm and Haas), DEAE-Sephadex (Pharmacia). Esimerkkejä 25 vahvoista anioninvaihtohartseista, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, ovat sellaiset, joita myydään seuraavilla kauppanimillä: Dowex MSA -1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), Amberlite IR-904 (Rohm and Haas) ja QAE-Sephadex (Pharmacia).

Antibiootti A 42867:n eluointi näistä hartseista suorite-30 taan elektrolyyttien, kuten natrium- tai ka 1iumhydroklori-dien vesipitoisen liuoksen lineaaristen g radienttiseoksien avulla vedessä tai veden ja orgaanisen veteensekoittuvan liuottimen, kuten alempialkoholin (esim. (C^-C^)alkanolin) tai alempi-alkyyliketonien (esim. asetonin, metyylietyyliketoni n jne) seoksissa.

ις 87469 I b

ANTIBIOOTTI A 4 286 7 : n FYSIKO-KEMIALL I SET TUNNUSMERKIT

A) ultraviolettiabsorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten Kuviossa 1 ja jossa on seuraavat absorptiomaksimit:

Amaks (nm) 5 a) 0,1 N HC1 282 b) vesi 282 c) fosfaattipuskuri pH 7,4 282 d) fosfaattipuskuri pH 9 282 305 (olka) 10 e) 0,1 N N.) Oli 301.

265 (olka) B) infrapuna-absorptiospektri, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten Kuviossa 2 ja jossa on seuraavat absorptiomaksimit (cm-*): 15 3700-3100, 3000-2800 (nujoli); 1650; 1580; 1460 (nujoli) 1375 (nujoli); 1300; 1235; 1210; 1160; 1130; 1060; 1025; 1000; 970; 840; 790-700; 720 (nujoli) C) 1H-NMR-spektri, joka on esitetty Kuviossa 3 ja jos- : sa on seuraavat signaaliryhmä (ppm:ssä) 270 MHz, rekiste- Y 20 röity DMSO d^:ssa (heksadeuterodimetyy1isu 1 foksidi) sisäisenä standardina käytettiin TMS:ää (0,00 ppm), (b= ppm): " 0,90, d [(CH3)2-(CH)] ; 1,02, d \ C H 3 - (C H )3 ; 1,23, d \CH3-(CH5 ; 1,52, s I,77, m \CH(CH3)^]; 2,38, s (N-CH3); 3,0-6,35, s ja m (aromaattiset sokeri- ja Y: 2 5 peptidiset C H : t); 6,27-9,29 (aromaattiset CH:t, peptidi- set N H:t ja fenoliset 0H:t) - d = dupletti s = sing letti m=multipletti ie 87469 D) retentioaika (Rt) = 0,537 suhteessa vankomysiini.

HC1:ään (Vancocin, Eli Lilly, Rt = 16,36 min) analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:1 la seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 μπι) Altex (Beckman) 5 4,6 mm ( sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 jjm) eluentti: vesi:asetonitriili:2-etanoliamiini: tri fluori etikkahappo 9: 1:0,01:0,01 (til./til .) 10 virtausnopeus: 1,6 ml/min UV-detektori : 254 nm sisäinen standardi: vankomysiini.HC1 (R^ = 16,36 min) (Vancocin, Eli Lilly) E) retentioaika (Rj.) = 0,665 suhteessa vankomys i i n i .

15 HCl:ään (Vancocin, Eli Lilly, R^ = 9,96 min) analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:11ä seuraavissa olosuhteissa: ; -- kolonni: Ultrasphere ODS (5 ym) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni Brownlee Labs RP 18 (5 ym) 20 eluentti A: CHgCN 2%^} säädetty pH- (2,5 g/1) NaH^PO^.H^O 98%j arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70%^ säädetty pH- (2,5 g/1)NaH2P04.H20 30%J arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 25 60X:iineluenttiaBeluenttissaA, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,6 ml/min 17 87469 UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: vankomysiini-HC1 (R^ - 9,96) (Vancocin, Eli Lilly) F) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on 5 ensin kuivattu 140°C:ssa inerttikaasuatmosfäärissä, antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 53,3 %\ vetyä 5,9 %; typpeä 7,85 %; klooria (kokonais) 4,41 %; klooria (ioneja) 2,22 %; epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 0,875 % 10 G) happo-emästitrauskäyrällä vedessä, tiirattaessa 0,05 N vesipitoisella KQH:lla näyte, johon on etukäteen lisäily ylimäärin ν<·\i p i I n ι ·. I ,i llf. I:ää, o.iinlyy pKu-arvot 3,2, /,1 ja 8,3 H) R^-arvo 0,56 seuraavassa kroma tog ra fiasysteemissä: 15 (vesipitoinen natriumkloridi 87,5 g/1:

NaH9P0. 0,5 g/1) 70 pH säädetty \ CHgCN 30 % J arvoon 6 käytetään käänteisfaasisia silanoituja piihappogeeli-levyjä (RA-18 F254) 20 näkyväksi tekeminen: - UV-valo 254 nm - keltainen väri Pauly-reagenssi11 a, t.s. diatsotoidul1 a sul fani 1 i ini hapol 1 a (J. Chromatog. 2_0 , 1 7 1 ( 1 965 ), Z. Physiol. Chem. 292., 99 , ( 1953)) 25 - bioautografiässä käytetään B.subtilis ATCC 6633:a

Davisin mi nimi aiustal1 a I) molekyylipaino noin 1559 arvioituna FAB-massaspekt-ristä, jossa M+H ® -piikki 1560.

ie 87469

Antibiootti A 42867 sisältää happamia ja emäksisiä funktioita ja lisäksi muodostaa sisäisiä suoloja, sopivissa pH-oloissa se voi muodostaa suoloja orgaanisten ja epäorgaanisten vastaionien kanssa tavanomaisten menetelmien 5 mukaisesti.

Tyypillisiä ja sopivia keksinnön mukaisten yhdisteiden hap-poadditiosuoloja ovat sellaiset suolat, jotka muodostetaan standardireaktiolla sekä orgaanisten että epäorgaanisten happojen, kuten esimerkiksi kloorivety-, bromivety-, rik-10 ki-, fosfori-, etikka-, trif1uorietikka-, trikloorietikka-, meripihka-, sitruuna-, askorbiini-, maito-, omena-, fumaa-ri-, palmitiini-, kooli-, pamoe-, lima-, glutamiini-, kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, 15 sorbiini-, pikriini-, bentsoe-, kanelihapon ja vastaavien kanssa.

Tyypillisiä esimerkkejä emäksistä ovat: alkali metalli- tai -- maa-aikai imetä! 1 ihydroksidi, kuten natrium-, kalium-, kalsium-, magnesium-, ba r i umhydroksidi; ammon i akk i ja ai i faatti set, a 1 i -; 20 sykliset tai aromaattiset, orgaaniset amiinit, kuten metyy- liamiini, dimetyyliamiini, trimetyyliamiini ja pikoliini.

Keksinnön mukaisten "ei-suola" yhdisteiden muuttaminen vas-taavi ks i additiosuoloiksi ja päinvastoin, t.s. keksinnön mukaisen yhdisteen additiosuolan muuttaminen ei-suolamuo-..:25 toon, ovat alan ammattimiehen suoritettavissa ja kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

'· Esimerkiksi antibiootti A 42867 voidaan muuttaa vastaavak- .*··. si happoadditiosuolaksi liuottamalla ei-suo!amuoto vesipi toiseen liuottimeen ja lisäämällä pieni ylimäärä valittua 30 happoa tai emästä. Sen jälkeen muodostunut liuos tai suspensio lyofilisoidaan toivotun suolan taiteenottamiseksi.

,9 87469

Siinä tapauksessa, että lopullinen suola on liukenematon liuottimeen, johon ei-suolamuoto liukenee, se saadaan talteen suodattamalla ei-suolamuodon orgaanisesta liuoksesta, sen jälkeen kun stökiometrinen määrä tai pieni ylimäärä 5 valittua happoa tai emästä on lisätty.

Ei-suolamuoto voidaan valmistaa vastaavasta happo- tai emässuolasta liuottamalla vesipitoiseen liuottimeen, joka sen jälkeen neutraloidaan vapaaksi ei-suolamuodoksi.

Kun neutralointia seuraava ylimääräisen hapon tai emäksen 10 poistaminen on tarpeen, voidaan käyttää tavallista suolan-poi stomenetelmää.

Esimerkiksi pyiväs kromatogra fiaa silanoidulla piihappogee-Iillä, ei-funktionalisoidulla polystyreeni -, akryyli- ja tasahuokoisi11 a polydekstraanihartsei11 a (kuten Sephadex 15 LH 20) tai voidaan edullisesti käyttää aktivoitua hiiltä. Sen jälkeen kun ei-toivotut suolat on eluoitu vesipitoisella liuoksella, toivottu tuote eluoidaan lineaarisella '···' gradientilla tai veden ja polaarisen tai apolaarisen liuot- timen seoksen vaihegradientil la , kuten asetoni tri i 1 i/vesi .-\:20 50 :50 - noin 100 %:iin asetoni tri i 1 i ä .

Kuten on tunnettua suolan muodostusta joko farmaseutti-• - sesti hyväksyttävien happojen (tai emästen) tai ei-farma- seuttisesti hyväksyttävien happojen (tai emästen) kanssa . . voidaan käyttää sopivana puhdistusmenetelmänä. Muodosta- ’25 misen ja eristämisen jälkeen antibiootti A 42867:n suola-muoto voidaan muuttaa vastaavaksi ei-suolamuodoksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Eräissä tapauksissa antibiootti A 42867:n emäsadditio-suola on liukenevampi veteen ja hydrofiilisiin liuotti-3 0 m i i n .

2 0 8 7 469

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antibakteerinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro standardi 1aimennustestien avulla erilaisilla mikro-organismeilla.

Viljelyolot ja kasvuolot MIC-arvojen (minimaalinen inhi-5 biitio-konsentraatio) määrityksille olivat seuraavat: Isosensitest-kasvuliemi (Oxoid), 24 h, stafylokokit,

Strep.faecalis ja gram-negatiiviset bakteerit (Escherichia coli); Todd-Hewitt-kasvuliemi (Difco), 24 h, muut streptokokki1 ajit; GC-peruskasvuliemi (Difco) + 10 1 % Isovitalex (BBL), 48 h, Cl^-rikastettu atmosfääri

Neisseria gonorrhoeae; Brain-Heart-kasvuliemi (Difco) + 1 % Supplement C (Difco), 48 h, Haemophilus influenzae; AC-kasvuliemi (Difco), 24 h, anaerobinen atmosfääri, Clostridium perfringens; Wi1 kins-Cha1gren-agar (viit. T.D.

15 Wilkins & S. Chalgren, 1976, Antimicrob. Ag. Chemother.

1 0 , 926), 48 h, anaerobinen atmosfääri anaerobeille (C.di ffici 1 e , Propionibacterium acnes, Bacteroides fragi-lis); PPLO-kasvuliemi (Difco) + 10 % hevosen seerumia + 1 % glukoosia, 48 h, Mycoplasma gal 1isepticum; PPLO-kasvu-20 liemi yhdessä lisäysten kanssa, kuten R.T. Evans ja D.

Taylor-Robinson ovat esittäneet (J. Antimicrob. Chemother. 4, 57), 24 h, U.urealyticum.

Inkubointi suoritettiin 37°C:ssa. Ymppäykset olivat seuraavat: M.gal 1isepticum 1 % (til./til.) 48 tunnin kasvulie- 4 25 miviljelmää; noin 10 väriä-vaihtavaa yksikköä/ml U.urea- 4 5 lyticum; noin 10 -10 pesäkettä muodostavaa yksikköä/ml : muissa kasvuliemi1aimennoksissa MIC-kokeissa ; 4 5 noin 10 -10 bakteeria/täplä (ymppäys monipiste ymppäys-laitteella) agar-laimennus-MIC-kokeissa (C.di ffici1 e , 30 P.acnes, B.fragilis).

Pienimmät estävät konsentraatiot (MIC, jjg/1 ) eräille mikroorganismei11 e on esitetty seuraavassa Taulukossa VI.

21 87469 <x> oo c\j ^ <C lo co co in co

P— Csl T— «<— CvJ T— LO

g f-' r\ «IM A A 01

\ 4-> Ot— cdcd··— OOCMCDCOOOOOOOCOCOOO

CJ) -M C\J CM CVI C\J (\J (\J C\j -3“ o /\ /\ /\ /\ S\ /\ S\ •i— o xi I—I *1— 2: *-> c (Ö c <u c •r— >

(O

1—1 CJ)

> CD

c o ·!-

^ +J

ZJ C 00 _I ·!— =0 o =* <C r— cd I— d T- ω

CD >> CD

(Ο -M <_> Ό O +-> CD CJ T- CD »—I— 5-

—·· +-1 CO CD CD «C XI

CO «3- CO CO CO >>

00 -r- LT) CD C\J CD CD

CM C_ CJ CD CJ *— 3

CM CD CO CJ \ CD

CM O I— 00 CO

t— -r- 00 CJ <t CO I LDC/) i— 0-MC/)(— s: cd o «a- E cj oo i/)i—i«a;<ci-oox)r-^d- —-

CJ OCD T— I—I T— CO

3 I— Γ-^ CO CJ CO CJ CD 1 CM 1*3-

4_ =£ r— -I— OJ CO '— Γ"— Q_ —- I —I

CJ «J- CJ X CM OO I ΟΊ >> «— CD

PO CJ CJ -r- _] *— CD +J 00 Ll LO N E

«a- «i- cj zj >— ·- _i co _i co iC cm j

CJ *— CM «tl— jp CD CD C/J *— CM O

1— 0«J- φ CD X CD 03 O CD -1-

—-- I -ct" CD "— CD1— C> rti N CJ I-'- '— L_-*J

CD _l «f C -i- (O CD £0 I— <t iC a

en co «1- i-cot-cj o cu < j u on CD

CO -1— I CD —I CD S--1- Ex: D CJ CO

1— "Ό to Nt-VjCi-Kl-rl-Vl-r _I -r- co -r-t/l S- 4- -r- S- <4_ .1— ,— «tCi— £ CD E -i— ΙΦ-Ι— i-OCi-O (Oi—

coC-COr— CLTJCDC-i-tOOtOOfO

D CD CD E (O CO +-> O CD co-1-CD

CD "U ODD CJ -I— E E O CD co i— fO OXi S--i-0(DCD-t->DD<0 DDS-I-Cf— to

D CL >, C (0-1--1--1- XI (Or— > X -I- (O E

(O CD Q. Q. 4- E Ό "O -I--I-··- CJCD CO

-I- -i- e i- x co -- d to to ......i- S- O CD Q- D S- C- “O I— (O XXO.a.Q-a.+J-M-r-coOCDCDCD-1-Q.

+-> Q.CLCDCDaJCDi0i0CLC0E+->X(0'aO

C (OtOS-S-ES-OOO-r-CDOCJ CO

(O -(-I+J+J+J+J+J,— I— C. CD (Ο O CO · (O >1 ^ oococooococ/icjcjQ-zrjco-ujo-cjS: 22 8 7 469

Antibiootti A 42867 on todettu aktiiviseksi koagulaasi-negatiivisia stafylokokkeja vastaan. MIC-arvot (yjg/ml) suhteessa S.epidermidis- ja S.haemolyticus-kantojen kliinisesti eristettyyn sarjaan on esitetty seuraavassa:

5 TAULUKKO VII

Kanta Antibiootti A 42867 MIC (jjg/ml) S. epidermidis L 393 1 S. epidermidis L 408 1 10 S.epidermidisL410 0,5 S. haemolyticus L 381 4 S. haemolyticus L 382 8 S. haemolyticus L 383 1

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antimikrobinen aktiivi-15 suus vahvistettiin myös hiiren kokeellisessa verenmyrkytyksessä (experimental septicemia).

Kontrolli- ja käsittelyryhmissä oli 10 CD-1-hiirtä (Charles River) paino 18-22 g. Ne infektoitiin intraperitoneaa-lisesti 0,5 ml :11a bakteerisuspensiota, joka oli valmis-20 tettu laimentamalla yön yli viljeltyä S.pyogenes C 203 (L49)-viljelmää steriilillä peptonoidul1 a suolaliuoksella. Ymppäykset laskettiin siten, että käsittelemättömät eläimet kuolivat verenmyrkytykseen 48 tunnin sisällä.

Testattavat yhdisteet annostettiin subkutaanisesti välit-25 tömästi infektion jälkeen. Seitsemäntenä päivänä ED^g-arvo laskettiin mg/kg:ssa menetelmällä, jonka ovat esittäneet 23 87469

Spearman ja Kärber (D.J. Finney "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, sivu 524, 1952) elossa olevien eläinten prosentuaalisesta määrästä jokaisella annoksella.

5 Näissä olosuhteissa antibiootti A 42867:n ED^g-arvo oli 1 ,54 mg/kg.

Yleensä antibakteerisessa hoidossa antibiootti A 42867:ää sekä sen myrkyttömiä, farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja tai näiden seoksia voidaan annostaa eri tavoin, ku -10 ten topikaalisesti tai parenteraalisesti. Parenteraali-nen annostus on yleensä edullinen annostamistapa.

Injektoitavat koostumukset voivat olla suspensioita, liuoksia tai emulsioita öljymäisissä tai vesipitoisissa kanto-aineissa ja ne voivat sisältää apuaineita, kuten suspen-15 doivia, stabiloivia ja/tai dispergoivia aineita.

Vaihtoehtoisesti aktiiviaine voi olla jauhemuodossa, josta se valmistetaan annostushetkel1ä lisäämällä sopivaa kanto-ainetta, kuten steriiliä vettä.

Riippuen annostamistavasta, nämä yhdisteet voidaan valmis-‘20 taa erilaisina annosmuotoina.

Eräissä tapauksissa voi olla mahdollista valmistaa keksinnön mukaiset yhdisteet enteropää11ys teisinä annosmuotoina oraaliseen annostukseen, mikä voidaan tehdä alalla tunnetulla tavalla (kts. esimerkiksi "Remington's Pharmaceuti-- 25 cal Sciences", 151h edition, Mack Publishing Company,

Easton, Pennsylvania, USA, sivu 1614).

Näin voi olla erityisesti silloin, kun antimikrobisen aineen absorption halutaan tapahtuvan suolistossa (enteric tract) samalla kun niiden toivotaan ohittavan maha-alueen 30 (gastric tract) muuttumattomina.

24 87469

Annostettavan aktiiviaineen määrä riippuu erilaisista tekijöistä, kuten hoidettavan koosta ja kunnosta, annosta-mistavasta ja -tiheydestä ja taudin aiheuttajasta.

Tämän keksinnön mukaiset antibiootit ja niiden fysiolo-5 gisesti hyväksyttävät suolat ovat yleensä tehokkaita päivittäisen annoksen ollessa 0,5 - 50 mg aktiiviainetta per potilaan painokilo, mahdollisesti jaettuna 1-4 annokseen per päivä.

Erityisen toivottuja koostumuksia ovat sellaiset, jotka 10 valmistetaan annosyksikköinä ja jotka sisältävät noin 100 - noin 5000 mg per yksikkö.

Tyypillisiä esimerkkejä injektioon sopivista kantoaineis-ta ovat steriili vesi injektioon, Ringerin liuos, 0,9 %: i nen suolaliuos ja 5 %:inen dekstroosi.

15 Antibiootin sopiva konsentraatio kantoaineessa suonensi-‘ säiseen (i.v.) infuusioon on noin 5 % - 10 %. Muita sopi via valmisteita annosyksiköiksi ovat hermeettisesti sulje-; tut ampullit, muovipussit, steriilit, kumikorkilliset pienpullot ja vastaavat.

20 Lisäksi keksinnön mukainen antibiootti voidaan valmistaa topikaalisena valmisteena kuten liuoksena, voiteena tai lotionina. Nämä valmisteet sisältävät tavallisesti 0,1 -15 % (paino/til.) aktiiviainetta.

Lisäksi keksinnön mukaiset antibiootit ovat käyttökel-25 poisia ehkäisten Clostridium diffici1e-kannan kasvun, joka aiheuttaa kalvoisen paksunsuolentulehduksen suolistossa. Näitä antibiootteja voitaisiin käyttää hoidettaessa kalvoista paksunsuolentulehdusta annostamalla tehokas määrä antibioottia tai sen farmaseuttisesti hyväksyttä-30 vää suolaa valmistettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään annosmuotoon. Tällaisessa käytössä antibiootteja voidaan annostaa gel ati i ni kapse! ei ssa tai nestemäisessä suspensiossa.

25 87 469

Paitsi, että antibiootti A 42867 tai sen hyväksyttävä suola ovat aktiivisia lääkkeinä, niitä voidaan käyttää eläinten kasvua edistävinä aineina.

Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukaista yhdistettä 5 annostetaan oraalisesti sopivassa ravintoaineessa. Tarkka käyttökonsentraatio on sellainen, joka on tarpeen kasvun edistämiseksi tehokkaasti käytettäessä normaaleja määriä ravintoa.

Keksinnön mukaisen aktiiviaineen lisääminen eläinten ra-10 vintoon suoritetaan mieluimmin valmistamalla sopiva en nalta sekoitettu ravinto, joka sisältää aktiivisen yhdisteen tehokkaassa määrässä, ja tämä ennalta valmistettu ravinto yhdistetään valmiiseen päivän ravintoannokseen.

Vaihtoehtoisesti välituote konsentraatti tai ravintolisä-15 aine, joka sisältää aktiivisen aineosan, voidaan sekoittaa ravintoon.

Tapa, jolla tällaiset ravintoseokset ja valmiit päivän ravintoannokset voidaan valmistaa ja annostaa, on kuvattu viitekirjoissa (kuten "Applied Animal Nutrition", W.H.

20 Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 tai "Livestock Feeds and Feeding" 0 and B Books, Corvallis, Oregon, USA 1977) ja liitetään tähän selitykseen viitteinä.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä eikä niiden tarkoitus ole rajoittaa keksinnön piiriä.

26 87469 ESIMERKKI 1

ANTIBIOOTTI A 42867:n TUOTTAMINEN

Tuottavan organismin (Nocardia sp. ATCC 53492) varastovil-jelmää sivellään kaurajauhoagarvinopinnoi11 e ja inkuboi-5 daan 28°C:ssa 2 viikkoa.

Yksi si1 mu ka 11inen kasvatettua kantaa ympätään 500 ml :n erienmeyerpul1oon , jossa on 100 ml ymppialustaa , muodostuen dekstroosista 2,0 %, soijapapujauhosta 0,8 %, hiivauuttees-ta 0,2 %, NaClrstä 0,1 % ja CaCO^sta 0,4 % ja jonka pH on 10 säädetty arvoon 7,3 ennen sterilointia. Pulloa inkuboidaan kiertoravistelijassa 28°C:ssa 72 tuntia. Sen jälkeen 100 ml:n erä viljelmää ympätään käymisastiaan, jossa on 4 litraa samaa ymppialustaa ja viljelmää inkuboidaan 28°C:ssa 48 tuntia ravistellen noin 900 kierr./min ja ilmastaen yk-15 si litra ilmaa per tilavuus per minuutti. Ympätään neljällä litralla ymppivi1j e1 mää käymisastiat, jotka sisältävät 200 1 käymisalustaa, jonka koostumus on sama kuin ymppi-viljelmän, käyminen suoritetaan 96 tunnin ajan samalla sekoittaen noin 250 kierr./min ja ilmastaen yksi litra ilmaa .'20 per tilavuus per minuutti.

Antibiootin aktiivisuutta seurattiin mikrobiologisella kokeella käyttäen B.subtilis-viljelmää Davisin minimi-alustalla.

·· : ESIMERKKI 2

25 ANTIBIOOTTI A 42867:n TALTEENOTTO

Koko käymisliemi (400 1), joka saadaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, suodatetaan käyttäen suodatusapuainetta ( Hyf 1 o-Fl oMa ® ) k i ertosuoda 11. i tnell a (a rotary filter). Suodatetun liemen pH säädetään arvoon 7,5 2 N kloorivety-30 hapolla ja lisätään 1000 ml:aan etukäteen turvotettua 27 87469 D-Ala-D-Ala-aminokaproyyli-Sepharose-4B-modifioitua matriisia (valmistetaan kuten eurooppalaisessa patenttihakemuksessa No 83112555.4 esitetään) ja annetaan seistä yön yli samalla varovasti sekoittaen.

5 Hartsi otetaan talteen suodattamalla ja pestään noin 10 litralla 0,5 %:ista (paino/til.) HCl-tris-puskuria pH 7,5, joka sisältää 5 % (paino/til.) NaCl:ää, jonka jälkeen vedellä (4 x 5 1), liemi hylätään.

Tuote, joka on selektiivisesti sitoutunut hartsiin, eluoi-10 daan 1,5 % : i s e 1 la (paino/til.) ammoniumhydroksidil1 a (4 x 5 1) ja konsentroidaan pieneen tilavuuteen (noin 1800 ml) tislaamalla atseotrooppisesti yhdessä n-butanolin kanssa alennetussa paineessa.

Konsentroitu, vesipitoinen liuos lyofilisoidaan, saadaan 15 raaka antibiootti A 42867 (75,6 g).

ESIMERKKI 3

RAA'AN ANTIBIOOTTI A 42867:n PUHDISTAMINEN

Raaka antibiootti A 42867 (75 g), joka saadaan esimerkin 2 menetelmän mukaisesti, liuotetaan 2 litraan vettä, joka 20 sisältää 2 M natriumkloridia, pH säädetään arvoon 7,5 0,1 N natriumhydroksidiliuoksella, jonka jälkeen suodatetaan.

Suodosta siirretään 500 ml/tunti 1000 ml:n pylvääseen (0,1 x 0,1 m), jossa etukäteen turvotettua D-Ala-D-Ala-6--aminokaproyyli-Sepharose-4B-modifioitua matriisia (val-25 mistettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa No 83112555.4 kuvatulla tavalla) ja joka pylväs on etukäteen tasapainotettu 0,04 M boraattipuskuri 11 a, pH 7,5 sisältäen 2 M natriumkloridia ja 0,6 ml Triton x 100 (Baker grade).

Pylväs pestään 8 litralla 8 M karbamidia (pH 7,5), virtaus-30 nopeuden ollessa 500 ml/h, jonka jälkeen 70 litralla vesi- 28 87469 pitoista NaOH:ta, pH-arvossa 10, kerätään fraktiot, joista jokainen 1 000 ml .

Nämä fraktiot testataan B.subtilis-viljelmillä agar-kiek-ko-kokeessa ja ne fraktiot, jotka ovat inaktiivisia, hy-5 lätään, kun taas aktiiviset (kuten fraktiot 63-70 tässä tapauksessa) yhdistetään, konsentroidaan pieneen tilavuuteen (500 ml) alennetussa paineessa tislaamalla atseo-trooppisesti n-butanolin kanssa ja 1yofi1isoidaan jolloin saadaan antibiootti A 42867 (4 g).

10 ESIMERKKI 4

ANTIBIOOTTI A 42867:n PUHDISTAMINEN JA SUOLAN POISTAMINEN

3,5 g antibiootti A 42867:ää, joka saadaan esimerkin 3 menetelmän mukaisesti, liuotetaan 70 ml:aan liuosta, jossa on natriumdivetyfosfaattimonohydraattia (2,5 g/1) ja aseto-15 nitri iliä (91:1), ja suodatetaan.

10 ml tätä suodosta laitetaan ruostumattomaan teräspylvää-seen (2 x 50 cm), joka on pakattu 40 g: 11 a 10 μτη RP 18 Lichrosorb-käänteis-faasi-piihappogeeliä (Merck).

Pylväs on osa Chromatospac Modulprep-yksikköä (Jobin Yvon, 20 16-18 Rue de Canal 91169 Longjumeau, Ranska).

Pylväs eluoidaan nopeudella 8 ml/min samalla liuoksella, jota käytettiin näytteen liuottamiseksi, ja kerätään fraktiot, joista jokainen on 50 ml.

' Jokainen fraktio tarkastetaan HPLC:llä ja paperi-kiekko- 25 kasvukokeel1 a käyttäen herkkiä mikro-organismeja, kuten B.subti 1i s ta .

Fraktiot, jotka ovat aktiivisia seitsemän sarjan B.subti-lista vastaan, yhdistetään, asetonitrii1i poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa ja jäännös laimennetaan 30 vesimäärällä, joka on suurin piirtein sama kuin alkupe- 29 87469 räinen tilavuus.

Liuoksen pH säädetään arvoon 7,5, jonka jälkeen siirretään nopeudella 100 ml/h pylvääseen (5 x 15 cm), joka on täytetty etukäteen turvotetulla D-A1a-D-Ala-6-aminokapro-5 yyli-Sepharose-4B-modifioidulla matriisilla (valmistetaan kuten eurooppalaisessa patenttihakemuksessa No 83112555.4 on esitetty), ja joka pylväs etukäteen tasapainoitetaan 0,04 M boraattipuskuria pH 7,5.

Pylväs pestään 8 litralla vettä (hapotettu 0,5 ml/1 1 N 10 kloorivetyhappoa).

Sen jälkeen pylväs eluoidaan 1,5 %:isella (paino/til.) am-moniumhydroksidi 11 a , kerätään fraktiot, joista jokainen 100 ml .

Ne fraktiot, jotka ovat aktiivisia B.subtilista vastaan, 15 yhdistetään, konsentroidaan alennetussa paineessa ja lyo- filisoidaan, saadaan 1,2 g antibiootti A 42867:n tuotetta ei-suolamuodossa , jonka fysiko-kemia 11iset tunnusmerkit on edellä esitetty.

Claims (5)

30 8 7 469

1. Menetelmä antibiootin A 42867 tai sen suolan valmistamiseksi, jolla on ei-suolamuodossa seuraavat tunnusmerkit: antibiootti A 42867:n fysiko-kemia 11iset tunnusmerkit

5 A) u11ravio 1 e11iabsorptiospektri , joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1 ja jossa on seuraavat absorpti oma k s imit: X ma k s (nm) a) 0,1 N HC1 282 10 b) vesi 282 c) fosfaattipuskuri pH 7,4 282 d) fosfaattipuskuri pH 9 282 3 05 (olka) e) 0,1 N NaOH 305 15 265 (olka) B) infrapuna-absorptiospektri , joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 2 ja jossa on seuraavat absorptiomaks imi t (cm"M: 3700-3100, 3000-2800 (nujoli); 1650; 1580; 1460 (nujoli) .20 1375 (nujoli); 1300; 1235; 1210; 1160; 1130; 1060; 1025; :.:V 1 000; 970 ; 840; 790-700 ; 720 (nujoli) : C) ^H-NMR-spektri, joka on esitetty kuviossa 3 ja jos- ' sa on seuraavat s ignaal i ryhmät (ppm:ssä) 2 70 MHz, rekiste röity DMSO dgtssa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi) sisäi-25 senä standardina käytettiin TMS:ää (0,00 ppm), ( §= ppm): 0,90, d [_(CH3)2-(CH)] ; 1,02, d \CH3-(CH)]; 1,23, d •v: \CH3 - (CH )3 ; 1,52, s 1,77, m \CH (CH3) 2~\ ; 2,38, s (N-CHj); 3,0-6,35, s ja m (aromaattiset sokeri- ja peptidiset CH:t); 6,27-9,29 (aromaattiset CH:t, peptidikö set NH : t ja f e noli set 0 H : t) ,.r d = dupletti s = singletti m = multipletti 3, 87469 D) retentioaika (R^.) = 0,537 suhteessa vankomysiini. HCIrään (Vancocin, Eli Lilly, Rt = 16,36 min) analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 5 4,6mm(sisähalkaisija)x250mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti: vesi:asetonitriili:2-etanoliamiini: trifluorietikkahappo 9:1:0,01:0,01 (til ./til .) 10 virtausnopeus: 1,6 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: vankomysiini .HC1 (R^ = 16,36 min) (Vancoci n , Eli Lilly) E) retentioaika (R^.) = 0,665 suhteessa vankomys i i ni .

15 HClrään (Vancocin, Eli Lilly, R^ = 9,96 min) analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:llä seuraavissa olosuhteissa: kolooni: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm ( sisaha 1 kaisija ) x 250 mm esikolonni Brownlee Labs RP 18 (5 pm) 20 eluentti A: CH^CN 2%^ säädetty pH- (2,5 g/1) Naf^PO^.H^O 98%J arvoon 6,0 eluentti B: CH-jCN 70%Ί säädetty pH- (2,5 g/1)NaH2P0^.H20 30%J arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti 5 %:sta 25 60 ¾:iin eluentti a β eluenttissa A, 40 minuutissa virtausnopeus: 1,6 ml/min 32 87469 UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: vankomysiini-HC1 (R^. - 9,96) (Vancoc i n , Eli Lilly) F) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on 5 ensin kuivattu 140°C:ssa inerttikaasuatmosfäärissä, antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 53,3 %; vetyä 5,9 %; typpeä 7,85 %\ klooria (kokonais) 4,41 %; klooria (ioneja) 2,22 %\ epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 0,875 %

10 G) happo-emäs ti trauskäyrällä vedessä, tiirattaessa 0,05 N vesipitoisella KOH:11a näyte, johon on etukäteen lisätty ylimäärin vesipitoista HCl:ää, esiintyy pKa-arvot 3,2, 7,1 ja 8,3 H) R^-arvo 0,56 seuraavassa kromatografiasysteemissä: 15 (vesipitoinen natriumkloridi 87,5 g/1: ΝβΗ,,ΡΟ^ 0,5 g/1 ) 70 nfj pH säädetty CHjCN 30 arvoon 6 käytetään käänteisfaasisia silanoituja piihappogeeli-- levyjä (RA-18 F254) 20 näkyväksi tekeminen: -UV-valo254nm - keltainen väri Pau1y-reagenssi11 a , t.s. diatsotoidulla sul f ani 1 i i ni hapol 1 a (J. Chromatog. 2Q_, 1 71 ( 1 965), Z. Physiol. Chem. 2J92, 99, (1953)) 25. bioautografiässä käytetään B.subtilis ATCC 6633:a Davisin minimialustal1 a I) molekyylipaino noin 1559 arvioituna FAB-massaspekt-ristä, jossa M+H® -piikki 1560, 33 87469 tunnettu siitä, että viljellään kantaa Nocardia sp. ATCC 53492 tai sen antibioottia A 42867:ää tuottavaa mutanttia tai muunnosta submerssisissa, aerobisissa oloissa assimiloituvien hiili-, typpilähteiden ja epäor-5 gaanisten suolojen läsnäollessa, mainittu antibiootti otetaan talteen ja eristetään käymisliemistä ja haluttaessa se muutetaan halutuksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -10 n e t t u siitä, että kantaa viljellään lämpötilassa, joka on 20°C - 40°C.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on 24°C - 35°C. 15

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootin talteenottaminen ja eristäminen tehdään suorittamalla suodatetulle käymis-liemelle affiniteettikromatografia immobilisoidulla D-

20 Alanyyli-D-Alaniinilla, jonka jälkeen käytetään jakaantu-mis-, käänteisfaasi- tai ioninvaihtokromatografiaa.

5. Nocardia sp. ATCC 53492. 34 87 469