FI116067B - Kasveissa tehokas fosfinotrisiiniresistenssigeeni ja sen käyttö - Google Patents

Kasveissa tehokas fosfinotrisiiniresistenssigeeni ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI116067B
FI116067B FI880216A FI880216A FI116067B FI 116067 B FI116067 B FI 116067B FI 880216 A FI880216 A FI 880216A FI 880216 A FI880216 A FI 880216A FI 116067 B FI116067 B FI 116067B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
plants
plasmid
fragment
resistance gene
Prior art date
Application number
FI880216A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI880216A (fi
FI880216A0 (fi
Inventor
Eugen Uhlmann
Friedrich Wengenmayer
Peter Eckes
Guenter Donn
Wolfgang Wohlleben
Alfred Puehler
Eckhard Strauch
Walter Arnold
Renate Alijah
Friedrich Hein
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25851724&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI116067(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE19873737918 external-priority patent/DE3737918A1/de
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI880216A0 publication Critical patent/FI880216A0/fi
Publication of FI880216A publication Critical patent/FI880216A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116067B publication Critical patent/FI116067B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

116067
Kasveissa tehokas fosfinotrisiiniresistenssigeeni ja sen käyttö DE-patenttihakemuksessa P 36 28 747.7 ehdotetaan 5 fosfinotrisiini(PTC-)resistenssigeeniä, joka on saatavissa fosfinotrisyylialanyylialaniini(PTT-)resistenssin perusteella valikoidun Streptomycs viridochromogenes DSM 40736:n (yleinen kokoelma) tai DSM 4112:n (talletettu Budapestin sopimuksen ehdoilla) kokonais-DNA:sta pilkkomalla 10 BamHI:llä, kloonaamalla 4,0 ke:n kokoinen fragmentti ja valikoimalla PTT-resistenssin mukaan, samoin kuin tämän geenin käyttöä PTC-resistenttien kasvien valmistukseen; PTT-resistenttimarkkerina bakteereissa ja PTC-resistenssi-markkerina kasvisoluissa. 4 ke:n kokoisen BamHI-fragmen-15 tin, jossa resistenssigeeni sijaitsee, määrittelee tarkemmin restriktiokartta (kuvio 1) .
Koodausalueen sijaintikohta rajattiin tarkemmin kloonaamalla tämän 4 ke:n fragmentin osa-alueita. Tällöin kävi ilmi, että resistenssigeeni sijaitsee 1,6 ke:n kokoi-20 sessa Sstll - SstI -fragmentissa (asemat 0,55 - 2,15 pää-hakemuksen kuvassa 1). Pilkkomalla BglII:lla saadaan 0,8 ke:n kokoinen fragmentti, joka plasmidiin sijoittamisen ja . . S. lividansin transformoinnin jälkeen välittää PTT-resis- • » · -7 • * * tenssin. Tämä resistenssi vaatii PTC:n N-asetylaatiota.
* t ;;* 25 Resistenssigeeni koodaa siten asetyylitransferaasia.
’·*' Lisähakemuksessa P 36 42 829.9 esitetään edellä * a · *.*.· mainitun 0,8 ke:n fragmentin DNA-sekvenssi. Sekvenssistä voidaan määrittää geenisekvenssin aloituskodoni ja avoin
I I
jtj j lukukehys. Viimeinen nukleotidi on osa lopetuskodonista 30 TGA.
Streptomykeettigeeneissä G:n + C:n osuus on sangen * · » suuri; suhde adeniini (A) + tyrniini (T) : guaniini (G) + » » sytosiini (C) on noin 30 % : 70 %. Kasvien geenien · .' : GC-osuus on paljon pienempi, noin 50 %. Tästä syystä kek- : 3 5 sinnön lisäsuoritusmuodossa resitenssigeenin DNA-sekvenssi 2 116067 optimoitiin synteesillä kodonien käytöltään kasvien RNA-polymeraasi II:lie edulliseksi.
Keksintö koskee DE-patenttihakemuksessa P 36 28 747.7 ja lisähakemuksessa P 36 42 829.9 ehdotetun resistenssi-5 geenin muuntamista, nimittäin mukauttamista kasvien ko-donienkäyttöön. Vastaava aminohapposekvenssi annetaan liitteessä. Keksinnön muut suoritusmuodot määritellään patenttihakemuksissa tai niitä valaistaan seuraavassa.
Geneettinen koodi on tunnetusti degeneroitunut, 10 ts. vain kahta aminohappoa koodaa yksi ainoa tripletti, kun taas loppuja 18 geneettisesti koodattavissa olevaa aminohappoa vastaa 2-6 triplettiä. Geenin synteesiä varten on siten teoriassa valittavissa suuri joukko kodoniyh-distelmiä. Koska yksittäisten nukleotidien suhteellisella 15 osuudella kokonais-DNA-sekvenssissä on merkitystä, asetettiin se erääksi kriteeriksi sekvenssin optimoinnissa.
Sekvensoituun geeniin tehtiin seuraavat muutokset: 1. Streptomykeettigeenien aloituskodoni GTG (asemat 258 - 260 lisähakemuksen mukaisessa sekvenssissä) 20 vaihdettiin kasvien RNA-polymeraasi II:n käyttämäksi aloi-,·. tuskodoniksi ATG.
2. Geenin sisällä muutettiin streptomykeettigeeni- . kodoneja sillä tavalla, että tuloksena oli kasvigeeneihin soveltuvia kodoneja (G/C-suhde) .
» 25 3. Luentatapahtuman lopettamista varten sijoitet- ’’** tiin sekvenssin päähän TGA-lopetuskodoni.
V.· 4. Geenisekvenssin alku ja loppu varustettiin restriktiokohtien yksisäikeisillä päillä geenin amplifi-• t| j oimisen ja kasvien säätelysekvenssien väliin ligatoimisen 30 mahdollistamiseksi.
5. Palindromisekvenssien määrä tehtiin mahdolli-simman pieneksi.
Keksinnön mukainen DNA-sekvenssi I (ja vastaava · aminohapposekvenssi) esitetään liitteessä.
; 35 Kolme sisäistä yhden kerran esiintyvää pilkkoutu- miskohtaa, jotka vastaavat restriktioentsyymejä Xbal (ase- 3 116067 ma 152) , BamHI (312) ja Xmal (436) , mahdollistavat sellaisten osasekvenssien alakloonauksen, jotka voidaan sijoittaa hyvin tutkittuihin kloonausvektoreihin, kuten esimerkiksi pUC18:aan tai pU19:ään. Lisäksi geenin alueelle 5 sijoitettiin joukko muita yhden kerran esiintyviä restrik-tioentsyymien tunnistuskohtia, jotka mahdollistavat toisaalta asetyylitransferaasiosasekvenssien saannin ja toisaalta muutosten tekemisen.
10 Restriktio- Katkaisukohtaa edeltävän nuk- entsyymi leotidin nro(koodaava säie)
BspMII 11
SacII 64 15 EcoRV 74
Hpal 80
Aatll 99
BstXI 139
Apal 232 20 Seal 272
AvrII 308
Af lii 336 . Stul 385 *:,/ BssHII 449 25 FokI 487 V.·' Bgll 536 :.V Bglll 550 JJ Osasekvenssien muodostaminen kemiallisesti synte- 30 tisoimalla ja entsymaattisten ligaatioreaktioiden avulla tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla (EP-hakemusjulkaisut O 133 282, O 136 472, O 155 590, O 161 504f O 163 249, ;·’ 0 171 024, 0 173 149 ja 0 177 827) . Yksityiskohtia, kuten ’/> ’> restriktioanalyysejä, DNA-fragment ti en ligatointeja ja E.
35 colin transformointia plasmideilla kuvataan perusteeni- 4 116067 sesti Maniatisin et ai. oppikirjassa (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982) .
Siten kloonattu geenisekvenssi viedään sitten kasveihin kasvien säätelysignaalien ohjauksen alaiseksi ja 5 saatetaan ilmentymään. EP-hakemusjulkaisussa 0 122 791 esitetään katsaus tunnettuihin menetelmiin. Siten saadaan PTC-resistenttejä kasvisoluja (ts. käytettävissä on transformoituneiden solujen valikointimarkkeri), kasveja tai kasvinosia ja siemeniä.
10 Keksinnön joitakin suoritusmuotoja valaistaan yk sityiskohtaisesti seuraavissa esimerkeissä. Prosenttisuu-det ovat tässä yhteydessä painoprosentteja, ellei toisin mainita.
Esimerkit 15 Käytettiin seuraavia kasvualustoja: a) Bakteereille: YT-alusta: 0,5 % hiivauutetta, 0,8 Bacto-tryptonia, 0,5 % NaCl:a LB-alusta: 0,5 % hiivauutetta, 1 % Bacto-tryptonia, 20 1 % NaCl:a . ·, Kiinteä alusta: lisättiin kulloinkin 1,5 % agaria b) Kasveille: , M + S -alusta: katso Murashige ja Skoog, Physiologica
Plantarum 15 (1982) 473 25 2Ms-alusta: M + S -alusta, joka sisältää 2 % sakkaroosia MSCIO-alusta: M + S -alusta, joka sisältää 2 % sakka- roosia, 500 mg/1 kefotaksiimia, 0,1 % mg/1 naftyylietikkahappoa (NAA), 1 mg/1 bentsyy- * i * t| > liaminopuriinia (BAP) ia 100 mg/1 kanamy- ; ' ’; 3 0 siiniä, MSMSC15-alusta: M + S -alusta, joka sisältää 2 % sakka- roosia, 500 mg/1 kef otaksiimia ja 100 mg/1 * t kanamysiiniä.
5 116067 1. Yksisäikeisen oligonukleotidin kemiallinen synteesi
Fragmentin II, joka on yksi neljästä osafragmen-tista I - IV, synteesin lähtöaineena toimi pääteasemassa 5 oleva oligonukleotidi Ile (DNA-sekvenssin I koodaavan säikeen nukleotidit 219 - 312) . Kiinteätaasisynteesiä varten sidotaan 3'-päässä oleva nukleosidi, tässä tapauksessa siis guanosiini (nukleotidi nro 312), 31-pään funktionaa lisen hydroksyyliryhmän kautta kovalenttisesti kantajaan.
10 Kantajamateriaali on pitkäketjuisia aminoalkyyliryhmiä funktionaalisina ryhminä sisältävä CPG ("Controlled Pore Glass"). Synteesissä noudatetaan muuten tunnettuja menetelmiä (mainittu EP-hakemusjulkaisu, sivu 4, palstat 1 - 2).
Synteesisuunnitelma esitetään DNA-sekvenssin II 15 (liite) yhteydessä, joka muuten vastaa DNA-sekvenssiä I.
2. Yksisäikeisen oligonukleotidin entsymaattinen kytkeminen geenifragmenttiin II
Oligonukleotidien 5'-pään fosforyloimiseksi käsiteltiin kulloinkin 1 nmol oligonukleotidia Hb ja Ile 20 seoksella, joka sisälsi 5 nmol adenosiinitrifosfaattia ja 4 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia 20 μ1:333 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,6), joka sisälsi 10 nM magnesiumklori-, . dia ja 10 mmol/1 ditiotreitolia (DTT), 30 min lämpötilassa 37 °C. Entsyymi deaktivoidaan pitämällä seosta 5 min 95 25 °C:n lämpötilassa. Oligonukleotide j a Ha ja Ild, jotka • « * *·*.’ muodostavat DNA-fragmentissa II "ylimääräisen" sekvenssin, ei fosf oryloida. Tämä estää myöhemmässä ligaatiossa suurempien kuin DNA-fragmenttia II vastaavien alafragmenttien : ; muodostumisen.
• · · · 1 2 3 4 5 6
Oligonukelotidit Ha - Ild ligatoidaan alafrag- 2 • t i 3 \ menttien II seuraavasti: Oligonukleotideja Ha ja Ild sa- 4
• > I
5 moin kuin Ilkun ja Ile:n 5'-fosfaatteja (1 nmol kutakin) liuotetaan yhdessä 45 μ1:33η puskuria, joka sisältää 50 : mmol/1 Tris-HCl:a (pH 7,6), 20 mmol/1 magnesiumkloridia, 25 6 mmol/1 kaliumkloridia ja 10 mmol/1 DTT:tä. Oligonukleotidien pariuttamiseksi DNA-fragmenttiin II pidetään oligo- 6 116067 nukleotidiliuosta 2 min lämpötilassa 95 °C ja jäähdytetään sitten hitaasti (2-3 tuntia) lämpötilaan 20 °C. Entsy-maattisen kytkemisen tekemiseksi lisätään sitten 2 μΐ 0,1 M DTT-liuosta, 8 μΐ 2,5 mM adenosiinitrifosfaattiliuosta 5 (pH 7) sekä 5 μΐ T4-ligaasiliuosta (2000 yksikköä), ja in-kuboidaan 16 tuntia lämpötilassa 22 °C.
Geenitragmentti II puhdistetaan geelielektrofo-reettisesti 10-%:isella polyakryyliamidigeelillä (ilman ureaa, 20 x 40 cm, paksuus 1 mm), jolloin markkeriaineena 10 käytettiin Hinfl:llä pilkottua 0X 174-DNA:ta (valmistaja BRL) tai HaeIII:lla pilkottua pBR322:a.
Geenitragmentit I, III ja IV valmistetaan samalla tavalla, mutta muutetaan "ylimääräiset" sekvenssit 5'-fosfaateiksi ennen pariuttamista, sillä ligaatiovaihetta 15 ei tarvita.
3. Geenifragmentit I, II, III ja IV sisältävien hybridiplasmidien valmistus a) Geenifragmentin I sijoittaminen pUC18:aan
Kaupallisesti saatavissa oleva plasmidi pUC18 ava-20 taan tunnetulla tavalla restriktioendonukleaaseilla Sali . ,*. ja Xnal valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkkomisseoksel- la tehdään erotus käsittelemällä se elektroforeettisesti »Ml» , , l-%:isella agaroosigeelillä, ja fragmentit visualisoidaan värjäämällä etidiumbromidilla. Plasmidivyöhyke (noin 2,6 ke) • * *···* 25 leikataan sitten irti agaroosigeelistä ja erotetaan aga- roosista elektroeluutiolla.
1 μg Xbalrllä ja Sällillä avattua plasmidia liga-toidaan sitten yön yli lämpötilassa 16 °C DNA-fragmentin I : : : (10 ng) kanssa.
30 b) Geenif ragmentin II sijoittaminen pUC18:aan • » « pUC18 pilkotaan Xbalillä ja BamHItllä kohdan a) ;;; mukaisesti, ja tehdään ligaatio geenif ragmentin II kanssa, jonka yksisäikeiset päät on fosforyloitu ennalta esimer-; . : kissä 2 kuvatulla tavalla.
:' ·,: 3 5 7 116067 c) Geenifragmentin III sijoittaminen pUC18:aan pUC18 pilkotaan XmaIII:lla ja Sallrllä kohdassa a) kuvatulla tavalla, ja tehdään ligaatio geenifragmentin IV kanssa.
5 4. Täydellisen geenin muodostaminen ja kloonaami nen pUC-plasmidissa a) Geenifragmenttien I - IV transformointi ja amplifiointi
Siten saaduilla hybridiplasmideilla transformoi-10 daan E. coli. Tätä varten tehdään E. coli -kannasta K 12 kompetentti käsittelemällä 70 mM kalsiumkloridiliuoksella, ja lisätään hybridiplasmidin suspensiota 10 mM Tris-HCl-puskurissa (PH 7,5), joka sisältää 70 mmol/1 kalsiumklori-dia. Transformoituneet kannat valikoidaan tavanomaisesti 15 käyttämällä hyväksi plasmidin välittämiä antibioottiresistenssejä tai -herkkyyksiä, ja lisätään hybridivektoreita. Solujen tappamisen jälkeen eristetään hybridiplasmidit, pilkotaan alunperin käytetyillä restriktioentsyymeillä, ja eristetään geenifragmentit I, II, III ja IV geelielektro-20 foreesilla.
, .·, b) Geenifragmenttien I, II, III ja IV liittäminen yhteen . , Amplifikaatiossa saadut alafragmentit I ja II lii- • » · *,,* tetään seuraavasti. Eristetyt fragmentit I ja II (100 ng ··' 25 kumpaakin) liuotetaan yhdessä 10 μΐ.-aan puskuria, joka si- *·'·’ sältää 50 mmol/1 Tri-HCl:a (pH 7,6), 20 mmol/1 magnesium- ‘.V kloridia ja 10 mmol/1 DTT:tä, ja pidetään tätä liuosta 5 min lämpötilassa 57 °C. Kun liuos on jäähtynyt huoneen : : lämpötilaan, lisätään 1 μΐ 10 mM adenosiinitrifosfaatti- 30 liuosta (pH 7) ja 1 μΐ T4-DNA-ligaasiliuosta (400 yksikköä) , ja inkuboidaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa. Kun ,';i‘ tuote on pilkottu restriktioentsyymeillä Sali ja BamHI, puhdistetaan haluttu 312 ep:n fragmentti (nukleotidit 1 -; : : 212, Sall-BamHI) tekemällä geelielektroforeesi 8-%:isella 35 polyakryyliamidigeelillä, jolloin käytetään markkeriainee- 8 116067 na restriktioentsyymillä Haelll pilkottua 0X 174 RF -DNA:ta (valmistaja BRL).
Geenifragmentit III ja IV kytketään toisiinsa samalla tavalla, jolloin puhdistuksen jälkeen saadaan 246 5 ep:n fragmentti (nukleotidit 313 - 558, BamHI - Sali).
Geelielektroforeesissa käytetään markkerina restriktioentsyymillä Mspl pilkottua pBR322:a.
Kokonaisen geenin (DNA-sekvenssin I) muodostamiseksi ligatoidaan 15 ng 312 ep:n fragmenttia ja 12 ng 246 10 ep:n fragmenttia 1 pg:n kanssa kaupallista plasmidia pUC18, joka on ennalta pilkottu restriktioentsyymillä Sali ja jonka päät on defosforyloitu entsymaattisesti, edellä kuvatulla tavalla. Esimerkissä 4a kuvatulla tavalla tehdyn transformoinnin ja ampilifioinnin jälkeen identifioidaan 15 Sall-pilkkomisen avulla oikea klooni, jossa on DNA-sek-venssin I mukainen 558 ep:n fragmentti.
5. Hybridiplasmiditransformaatio
Kompetentit E. coli -solut transformoidaan 0,1 - 1 μg:lla hybridiplasmidia, joka sisältää DNA-sekvenssin I, 20 ja siirrostetaan ampisilliinia sisältäville agarmaljoille.
, ,·. Sen jälkeen voidaan kloonit, jotka sisältävät plasmidissa oikein integroituneita sekvenssejä, identifioida DNA-pika-. , käsittelyllä (Maniatis, loc. cit.).
6. Syntetisoidun geenin fuusiointi säätelysignaa- *···' 25 leihin, jotka tulevat tunnistetuiksi kasveissa.
Optimoitu resistenssigeeni, jonka päitä on varus-tettu Sall-pilkkoutumiskohdilla, ligatoitiin plasmidin pDH51 [Pietrzak et ai., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5857] : : ; polykytkijäsekvenssin Sali-pilkkoutumiskohtaan. Tämä plas- 30 midi sisältää kukkakaalin mosaiikkiviruksen 35S-trans-skriptin promoottorin ja terminaattorin, jotka kasvien transskriptiojärjestelmä tunnistaa.
Resistenssigeeni insertoitiin 35S-transskriptin ; ; : promoottorin taakse ja terminaattorin eteen tekemällä li- ;' ·. > 35 gaatio. Geenin oikea orientaatio varmistettiin restriktio- analyyseillä.
9 116067
Solanum tuberosumin ST-LS1-geeniä [Eckes et al., Mol. Gen. Genet. 205 (1986) 14] promoottoria käytettiin samoin optimoidun asetyylitransferaasigeenin saattamiseen ilmentymään kasveissa.
5 7. Resistenssigeenin sijoittaminen yhdessä sääte- lysekvenssien kanssa Agrobacterium tumefaciensiin a) Kointegraattimenetelmä
Koko promoottorista, optimoidusta resistenssi-geenistä ja terminaattorista (esimerkki 6) koostuva trans-10 skriptioyksikkö (esimerkki 6) pilkottiin restriktioentsyy-millä EcoRI ja ligatoitiin E. coli -välivaihevektorin pMPKUO (Peter Eckes, Dissertation, Univ. Köln 1985, s. 91) EcoRI-pilkkoutumiskohtaan. Tämä välivaihevektori oli välttämätön resistenssigeenin siirtämiseksi säätelysek-15 vensseineen Agrobacterium tumefaciensin Ti-plasmidiin. Tämä niin kutsuttu konjugaatio tehtiin Van Hauten et ai. [EMBO J. 2 (1983) 411] kuvaamalla menetelmällä. Tällöin geeni in tegroitiin säätelysignaaleineen Ti-plasmidiin tekemällä homologinen rekombinaatio pMPKUO-vektorissa ja Ti-plas-20 midissa pGV3850kanR [Jones et ai., EMBO J. 4 (1985) 2411] . .·. esiintyvien standardivektorin pBR322 sekvenssien kautta.
• · 1 Tämän aikaansaamiseksi sekoitettiin E. coli -kan- • · « M • · . nan DH1 (PMPKUO-johdannaisen isäntäkanta) ja GJ23:n [Van
Heute et ai., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5857] tuoreita 25 nesteviljelmiä (50 μΐ kumpaakin) kuivalla YT-aqarmaljalla, ja inkuboitiin 1 tunti lämpötilassa 37 "C. Bakteerit sus-V.· pendoitiin takaisin 3 ml:aan 10 mM MgS04-liuosta ja siir- rostettiin antibiottiagarmaljoille (50 μg/ml spektinomy-jj j siiniä, valikointi pMPK110:n suhteen; 10 μg/ml tetrasyk- 30 liiniä, valikointi R64drdll:n suhteen; 50 μg/ml kanamysii-niä, valikointi pGJ28:n suhteen). Selektiivisillä agarmal-t; joilla kasvavat bakteerit sisälsivät nämä kolme plasmidia, ja niitä lisättiin nestemäisessä YT-alustassa lämpötilassa * ; : 37 'C Agrobacterium tumefaciensin kanssa tehtävää konju- ; > · 35 gaatiota varten. Agrobakteereja kasvatettiin LB-alustassa lämpötilassa 28 ‘C. Bakteerisuspensioita (50 μΐ kutakin) 1 1 6 067 10 sekoitettiin kuivalla YT-agarmaljalla, ja inkuboitiin 12 -16 tuntia lämpötilassa 28 'C. Bakteerit suspendoitiin ta kaisin 3 ml: aan 10 mM MgS04-liuosta, ja siirrostettiin an-tibioottimaljoille (0,05 g/1 erytromysiiniä ja 0,025 g/1 5 kloramifenikolia; valikointi agrobakteerikannan suhteen; 0,3 g/1 streptomysiiniä ja 0,1 g/1 spektinomysiiniä, valikointi pMK110:n Ti-plasmidiin integroitumisen suhteen). Näillä selektiivisillä maljoilla pystyvät kasvamaan vain ne agrobakteerit, joissa pMPKUO-johdannainen on integroi-10 tuneena bakteerin Ti-plasmidiin homologisen rekombinaation kautta.
Ti-plasmidi pGV3850kanR sisälsi nyt jo aiemmin läsnä olleen kasveissa vaikuttavan kanamysiiniantibiootti-resistenssigeenin lisäksi myös PTC-resistenssigeenin. En-15 nen näiden aqrobakteerikloonien käyttöä transformointiin varmistettiin "Southern Blot" -kokeella, että haluttu integroituminen oli tapahtunut.
b) Binaarinen vektori -menetelmä Käytettiin binaarista vektorijärjestelmää, jota 20 ovat kuvanneet Koncz et ai. [Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383] . Konczin et ai. [PNAS 84 (1987) 131] kuvaamaa vekto ria pPCV701 muutettiin seuraavasti: Vektorista poistettiin , , restriktioentsyymeillä BamHI ja Hindlll fragmentti, jossa ’; · sijaitsevat mm. promoottorit TRI ja TR2. Tuloksena oleva 25 plasmidi suljettiin takaisin renkaaksi. Tässä vektorissa olevaan EcoRI-pilkkoutumiskohtaan insertoitiin noin 800 V,* emäsparin pituinen, vektorista pDH51 saatu fragmentti, jo ka sisälsi kukkakaalinmosaiikkiviruksen 35S-transskriptin : promoottorin ja terminaattorin [Pietrzak et ai., Nucleic 30 Acids Res. 14 (1986) 5858]. Tuloksena olevassa plasmidissa pPCV801 oli 35S-promoottorin ja -terminaattorin välissä ;;; yhden kerran esiintyvä Sall-pilkkoutumiskohta. Optimoitu PTC-resistenssigeeni insertoitiin tähän pilkkoutumiskoh-: . ; taan. Sen ilmentyminen oli nyt 35S-transskriptin sääte- : / 35 lysekvenssien ohjauksessa.
11 116067 Tällä plasmidilla (pPCV80aAc) transformoitiin E. coli -kanta SM10 [Simon et ai., Bio/Technology 1 (1983) 784] . Plasmidin pPCV801Ac siirtämiseksi Agrobacterium tu-mefaciensiin sekoitettiin 50 μΐ SMIO-viljelmää ja 50 μΐ 5 C58-agrobakteeriviljelmää [GV101, Van Larebeke et ai., Nature 252 (1974) 169] apuplasmidina käytetyn Ti-plasmidin pMP90RK (Koncz et ai., Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383) kanssa kuivalla YT-agarmaljalla, ja inkuboitiin noin 15 tuntia lämpötilassa 28 °C. Sen jälkeen bakteerit suspen- 10 soitiin takaisin 1 mM MgS04-liuokseen (3 ml) ja siirros-tettiin antibioottimaljoille (0,1 g/l rifampisiinia, valikointi GV3101:n suhteen; 0,025 g/l kanamysiiniä, valikointi pMP90RK:n suhteen; 0,1 g/l karbenisilliinia, valikointi nPCV801ac:n suhteen). Näillä maljoilla pystyivät kasvamaan 15 vain ne agrobakteerit, jotka sisältävät molemmat plasmidit (pMP90RK ja pPCV(OlAc). Ennen näiden agrobakteerien käyttöä kasvien transformointiin varmistettiin "Southern Blotting" - menetelmällä, että plasmidi pPCV801Ac esiintyy oikeassa muodossaan agrobakteereissa.
20 8. Nicotiana tabacumin transformointi Agrobacte- rium tumefaciensilla
Optimoitu resistenssigeeni siirrettiin niin kutsu- , „ tulla "leaf disc" -transformointimenetelmällä tupakkakas- • · » |#>* veihin.
25 Agrobakteereja kasvatettiin 30 ml:ssa LB-alustaa,
·,*.* joka sisälsi vastaavia antibiootteja, lämpötilassa 28 °C
jatkuvasti ravistellen (noin 5 vrk) . Sitten bakteerit se-dimentoitiin sentrifugoimalla 10 min kierrosnopeudella : 7000 min'1 Christ-sentrifugissa ja pestiin kerran 20 30 ml :11a 10 mM MgS04-liuosta. Lisäsentrifugoinnin jälkeen bakteerit suspensoitiin 20 ml:aan 10 mM MgS04-liuosta ja siirrettiin petrimaljaan. Lehdenpalojen infektointiin käy-'"·* tettiin steriiliviljelmänä 2MS-alustassa kasvavan Wiscon- ; sin 38 -tupakkakasvinlehtiä. Kaikkia steriiliviljelmiä pi- ;’ [ 35 dettiin lämpötilassa 25 - 27 °C valaistusrytmin ollessa 16 tuntia valkoisessa valossa/8 tuntia pimeässä.
12 116067
Tupakan lehdet leikattiin, ja hiottiin lehtien pinnat hiekkapaperilla. Hionnan jälkeen lehdet leikattiin pienemmiksi paloiksi, jotka kasteltiin bakteeriviljelmäs-sä. Sitten lehdenpalat siirrettiin M + S -alustalle ja 5 niitä pidettiin 2 vrk normaaleissa kasvatusolosuhteissa. Kun oli tehty 2 vrk kestävä infektointi bakteereilla, kasvatettiin lehdenpaloja nestemäisessä M + S -alustassa ja siirrettiin ne sitten MSCIO-agarmaljoille. Transformoituneet versot valikoitiin kanamysiiniresistenssin perusteelle) la. Ensimmäiset versot olivat havaittavissa 3-6 viikon kuluttua. Yksittäisiä versoja kasvatettiin edelleen lasi-tölkeissä MSC15-alustassa. Seuraavien viikkojen aikana muodostui joidenkin irtileikattujen versojen leikkauskohtiin juuria.
15 Transformoidut kasvit voitiin valikoida myös suo raan PTC-pitoisilla kasvien kasvatusalustoilla. Transformoitujen kasvien DNA-analyysillä ("Southern Blotting") ja RNA-analyysillä ("Northern Blotting") osoitettiin PTC-re-sistenssigeenin läsnäolo ja ilmentyminen.
20 9. Transformoitujen kasvien PTC-resistenssin osoittaminen
Transformoiduissa kasveissa olevan resistenssigee- , . nin toimivuuden osoittamiseksi siirrettiin transformoitu- « · * jen ja transformoimattomien kasvien lehdenpaloja M + S 25 -alustalle, joka sisälsi 1 x 10'4 mol/1 L-PTC:tä. Trans- formoimattomien kasvien osat kuolivat, kun taas transfor-·,·.· moituneiden kasvien osista voitiin saada uusia versoja.
Transformoidut versot juurtuivat ja kasvoivat ongelmatto-: : : masti M + S -alustoilla, jotka sisälsivät 1 x 10"3 mol/1 30 L-PTC:tä. Transformoidut kasvit istutettiin steriilistä olosuhteista maahan, ja tehtiin PTC-ruiskutus (2 ja 5 ;;; kg/ha) . Transformoimattomat kasvit eivät kestäneet tätä ’;** herbisidikäsittelyä, kun taas transformoiduissa kasveissa ; ; : ei esiintynyt herbisidin aiheuttamia vaurioita. Ruiskutet- 35 tujen transformoitujen kasvien ulkonäkö ja kasvukäyttäyty- 13 1 i6D67 minen olivat vähintään yhtä hyviä kuin ruiskuttamattomien vertailukasvien.
10. Asetyylitransferaasitesti PTC-resistenttien kasvien, joille on tehty geeninsiirto, PTC-asetyloinnin osoitta-5 miseksi 0,3 mg/ml naudan seerumialbumiinia, 0,3 mg/ml DTTstä ja 0,15 mg/ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF).
Sentrifugoinnin jälkeen 20 μΐ.-aan kirkasta super-natanttia lisättiin 1 μΐ radioaktiiviseksi leimatun D,L-PTC:n 10 mM liuosta ja 1 μΐ 100 mM asetyyli-CoA-10 liuosta, ja inkuboitiin 20 min lämpötilassa 37 °C. Sen jälkeen reaktioseokseen lisättiin 25 μΐ 12-%:ista trikloo-rietikkahappoliuosta, ja sentrifugoitiin. 7 μΐ superna- tanttia siirrettiin ohutkerroskromatografialevylle, joka kehitettiin kahdesti käyttämällä nousevana eluenttina 15 seosta joka sisälsi pyridiiniä, n-butanolia, etikkahappoa ja vettä tilavuussuhteessa 50:75:15:60.
PTC ja asetyyli-PTC erottuivat tällöin toisistaan ja ne voitiin osoittaa autoradiografiällä. Transformoimat-tomissa kasveissa ei esiintynyt PTC:n reagoimista asetyy-20 li-PTC:ksi, kun taas resistentit kasvit, joille oli tehty geeninsiirto, pystyivät siihen.
* · 14 116067 £28 «55 328 585 §82 h H < «OO OOU OOU JH< <<fr- « H < « U O g < £ g<g ί 11 ί xoo hh< >αο ouo t-<e- >uo z u o o < « « < h < o o Jr g 2 g 5 «sr: 228 828 388 88B SB8 25S 82$ «88 328" |S8 §88 >(jq <ου t-* t— <c o o o <:oo cct-· UO(3 2 < « « < 5 P 2 JOO Suo . 1 u «f ,3 <* fc— U5 < fr— Wt-< “ λ flf<» 3<i o o o <oo S<E- <oo «uo « « < oou « u g «h< «<g g 5 o «55 Sh< £$< «82 SS8
WH< O O U < S? g P g P £28 JUO
582 228 388- 558 8$« <»° JK< 300 £ u o =M 2ou Suo $55 858 <<8 385 88u «oo <OU n < E- OOO DOO S P 2 588 WH< goo Wi-< S5S “8< <uo %h< <£< «55 555 328 S88 258- <08 Suo 2ou ouo t-oo ««< ««u «<g 328 XH< “2$ <58 5 <8 828 oou «e-< «t- < wk xo8 £28 8 < 5 « < $
<OU 8<$ 882 «$< 3=UO <00 M
< e- < «00 2 R 2 5 P 2 382 «08 .
uuo «00 <g u o S5S j r: < < < e- <<« - = uu 5gg S55 «88 3S8_8 “
288 858 888 S28 “u« *> S
£58 3<8 «85 S88 <g< £pg £ p28 οδο <ou ««** >uu t-e-< φ < t~ < o -e h p y g 558 w55 « 8 < 2 388 £38 £$2 888 “·*< ^ o<« «<f- <55 =<g §55-§ 585 § £88 828 <88 «85 a- ouo 0 118 858 82$ §§8 238 555 " Γ; 355 £88 olu §83 Bt 258 o ‘; ’: = gg 328 «85 «88 § §38 555 ίο ,’·, gg5 555 <ou <<^ -^ ^ου xou ^ '···* uh< «<*- JgS «<8 38< «88 2 ;V: $55 SSS >55 855 Suo e~H< 0 *! OCE- OO U «1-5 2<5 JOO «58 3 ,;. £88 <28 > 8 u xuo 000 ouu 855 S85 «85 888 «ί< §85 ^UU £5< OOO <<t- -.<£- OOU υ oou 2UO guu-O «f:< «55 g :.: · «gg ssf: 858 ^ «55 08 .*“. oou <8$ S5o juo S<8 ; 55 5S5 $55 585 «82 <uu «<e ! 82 oou «<f- ggg it< S28 «pg £B5 828 858 558 58u η^< £55 ... «t~< «H< r\ <t-< S2P 282 JOU 200 582 “8<-£ <B8 ^52 uuc> ouo" :, t-o o «ou «h< «h< «5< 555 «g g : . ; £28 58u 5So “3< <00 ggg „,. OOU OOU «S-< i228 JUU JH< .·. ; y° 328 w8< «uo ^58 <88 <f-< . j g o55 f- < e j<h <00 >00 f) Wf-< «ou «H< SirS «88 O < f- B * £5< 582 «28 £8< <S8- £gg m 116067 15
KOC3 OPC DUO VPC DUO UUO
£ < (- ΚϋΟ DCP JUO WPC “JOO
P P < Pou uoo uoo jpc « < p in p < (suo JH< z < p k < P'-'fi o f- < o<i- £ < p c (- c jcp Zoo., <£*5 KUU P p < > O O UOU p < P[M > o o
ZUU O <1- «CP <UO PPC SÄiC
w<t- auo Eou joo \·α juo «pu
< < [- CCP P· C P CUO ' U U O EOU
jf-< ppc fctju duo I gufcl upp <i-< m<(- (suu j<p I «op göo
>uO <DU rH< UUO J COp cCP
wou . xcp ppc huo Jt_ cxijjj J (- < 1¾. - ^ ^ C\ «CP UH< JUU PS o o
>-.<(- ^uuop) < O O £ < f- Ii <UO (SUU
p i- c Duokd « p u os f- < «cp Q p < in cp Wk< 1 pep Coo sou «pu
<UO JPC Hh< m P C P < H POU
«pc guo <pc wuo «po Soi vuo guo o o u v < p pcp bh< c <e- cuo jcρ ppc <oo
J|-< DUO., ZOU D P C >· C P O < P
•4Γ f» ·< J c (— 1 f 1 ppc juo «o u > u o OU&- CCP 1« JOO UUO pou <UO D < P UUO ’$1 D U O DUO pop uSBS 5S2 SCifei 353 353 588 Γ&55 555. 255 255 3§2
<UU < O O <uulj ZOU CUO UUO
uni) cuh< mouly « < p duo ωv< SSic wcp Pj v < p t sou j< h d p < m
£<5 cuo ^ Sih pcP ouo cut-< M
£L«-< Wf-< PUO OSUU «PC “;H< 2go 255 Pt-< ppc sou <uo w ίμ< puo oou duo duo upp w JUU Suo «OO M P C W H < guo
Suu ppc pou jpc Jp< <<*- 5 DUO >"UO «CP ouo ZCP > S VJ jMij λ J<p JUO ZOU KOU O C p u ^ coo^5 UUO UOO pcp , OOU ^ *<jr^ 355 555 SSiSt. i£3 £88 γ 355 <uo Stsic >uo Kt-< i
- n-ffM, ai O O w U >- < t- OS H < WH< S
^ ft i? §55 C <H T JUU WOO IH5 ^
5: g S £00 ρρ[*Τ ~*~οΤΓο WH< *«-< Q
i§s lii Jiili ’ SSS iiigl§N§lB £ «g 93E fasa §i§ K,gea &
I ·:··: l§s ls§ 3E3 ISS I
·. ·: 35(3 £ u5o,·^ <oB £ou =ou c ^§55S igg 55C «h5 SS8 'g ί55 ΕίέέΞ ίου UOU Sou e.H< ^ o<h 2f2R it 5 255 Suo Suo
£gg SiSB >uo sou uöo UUO
o<*- «fcs SSS Suo S55 S55 ϋ k £^5 oSo S<H «<H uöo o ouo sou puo 255 <£< 255 °o
1«^ S5S UUO SUO >UO sou ,<H
*’· duo juo wjh<v5 g< *;»>,. 555 2 < h ' h <
UUO >uo ^iouM WH<fcd <uo j5h WOU
ouo «<^ puo iuo^ iti 552 «55 £3S 5Ϊ2 UUO >UO >00 HH< ζυο : ϊμ< «pc 555 5<2 <2< 55δ uouiif :** ggs S2S <S8 Ph< >uo uöo guo^ ; i huo «oo iC5 c!-5 S55 555 . ^ p<2 ;* g55 552 555 ί55 S2S <uo jh .·:·. oui DUO gpo «HC UUO 3 < £ cp2 g 355 3h5 P<^ ^·5ρ <uo o<^
:' · ; uH 5p5 S80 Suo Pfci l§! POU
: T P JP< Ppc U <p pp-ä <oa

Claims (7)

116067
1. Aminohapposekvenssin I (liite, s. 15) mukaista proteiinia koodittava resistenssigeeni, tunnettu 5 siitä, että aloituskodonina käytetään ATG ja lopetus-kodonina TGA, ja että geenin GC-pitoisuus on mukautettu kasveihin sopivaksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen resistenssigeeni, tunnettu siitä, että sillä on DNA-sekvenssi I 10 (liite, s. 15 nukleotidit 9 - 554) .
3. Geenirakenne, tunnettu siitä, että siinä on DNA-sekvenssi I (liite, s. 15) kytkettynä kasveissa toimiviin säätely- ja ilmentymissignaaleihin.
4. Vektori, tunnettu siitä, että siinä on 15 patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen resistenssigeeni.
5. Vektori, tunnettu siitä, että siinä on patenttivaatimuksen 3 mukainen geenirakenne.
6. Vektoreita, tunnettu siitä, että niissä on yksi tai useampia geenitragmenteista I - IV (liite, s. 20 16) .
7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen geenin tai :: patenttivaatimuksen 3 mukaisen geenirakenteen käyttö, fos- v; finotrisiiniresistenttien kasvisolujen, kasvinosien, kas- vien, ja siemenien aikaansaantiin. • · a s a * I · * · 116067
FI880216A 1987-01-21 1988-01-19 Kasveissa tehokas fosfinotrisiiniresistenssigeeni ja sen käyttö FI116067B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3701624 1987-01-21
DE3701624 1987-01-21
DE19873737918 DE3737918A1 (de) 1986-08-23 1987-11-07 In pflanzen wirksames resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung
DE3737918 1987-11-07

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI880216A0 FI880216A0 (fi) 1988-01-19
FI880216A FI880216A (fi) 1988-07-22
FI116067B true FI116067B (fi) 2005-09-15

Family

ID=25851724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI880216A FI116067B (fi) 1987-01-21 1988-01-19 Kasveissa tehokas fosfinotrisiiniresistenssigeeni ja sen käyttö

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0275957B1 (fi)
JP (3) JP2993964B2 (fi)
CN (2) CN87100603A (fi)
AU (1) AU609082B2 (fi)
CA (1) CA1321364C (fi)
DE (1) DE3878699D1 (fi)
DK (1) DK175800B1 (fi)
ES (1) ES2054708T3 (fi)
FI (1) FI116067B (fi)
GR (1) GR3007859T3 (fi)
HU (1) HU215079B (fi)
IL (1) IL85143A0 (fi)
NZ (1) NZ223227A (fi)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3716309A1 (de) * 1987-05-15 1988-11-24 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin
DE3732972A1 (de) * 1987-07-02 1989-01-12 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung
EP1103616A3 (en) * 1989-02-24 2001-06-27 Monsanto Company Synthetic plant genes and method for preparation
US20010003849A1 (en) 1989-08-07 2001-06-14 Kenneth A. Barton Expression of genes in plants
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
HUT65648A (en) * 1990-01-26 1994-07-28 Mta Biolog Kutato Intezete Transgenic plants expressing a prokaryotic ammonium dependent asparagine synthetase
US5739082A (en) * 1990-02-02 1998-04-14 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Method of improving the yield of herbicide-resistant crop plants
DE4003045A1 (de) * 1990-02-02 1991-08-08 Hoechst Ag Virus/herbizidresistenz-gene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE4013099A1 (de) * 1990-04-25 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
US5792936A (en) * 1990-06-23 1998-08-11 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
IL101119A0 (en) * 1992-03-03 1992-11-15 Univ Ramot Transgenic wheat
DE4222407C1 (de) * 1992-07-08 1993-10-07 Max Planck Gesellschaft Modulartiges Promotor-Konstrukt
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
IL122270A0 (en) * 1997-11-20 1998-04-05 Yeda Res & Dev DNA molecules conferring to plants resistance to a herbicide and plants transformed thereby
DE19836700A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Getreidekulturen
DE19836659A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Baumwollkulturen
DE19836684A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Reiskulturen
CZ305417B6 (cs) 1998-08-13 2015-09-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Herbicidní prostředek pro tolerantní nebo rezistentní kultury kukuřice
DE19836660A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Sojakulturen
US6333449B1 (en) 1998-11-03 2001-12-25 Plant Genetic Systems, N.V. Glufosinate tolerant rice
US6395485B1 (en) * 2000-01-11 2002-05-28 Aventis Cropscience N.V. Methods and kits for identifying elite event GAT-ZM1 in biological samples
US7517975B2 (en) 2000-09-26 2009-04-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
ATE510015T1 (de) 2001-02-08 2011-06-15 Hexima Ltd Aus pflanzen stammende moleküle und diese codierende genetische sequenzen sowie verwendungen dafür
EP1279737A1 (en) 2001-07-27 2003-01-29 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging, van Aardappelmeel en Derivaten AVEBE B.A. Transformation method for obtaining marker-free plants
AU2003902253A0 (en) 2003-05-12 2003-05-29 The University Of Queensland Method for increasing product yield
WO2006054458A1 (ja) 2004-11-17 2006-05-26 Hokko Chemical Industry Co., Ltd. 除草剤耐性遺伝子及びその利用
US8993846B2 (en) 2005-09-06 2015-03-31 Monsanto Technology Llc Vectors and methods for improved plant transformation efficiency
AU2006302969B2 (en) 2005-10-13 2011-09-22 Monsanto Technology, Llc Methods for producing hybrid seed
WO2007137075A2 (en) 2006-05-16 2007-11-29 Monsanto Technology Llc Use of non-agrobacterium bacterial species for plant transformation
US7939721B2 (en) 2006-10-25 2011-05-10 Monsanto Technology Llc Cropping systems for managing weeds
EP1949785A1 (en) 2007-01-26 2008-07-30 Coöperatie AVEBE U.A. Use of R-genes as a selection marker in plant transformation and use of cisgenes in plant transformation
WO2008112633A2 (en) 2007-03-09 2008-09-18 Monsanto Technology Llc Method of meristem excision and transformation
EP2631243A3 (en) 2007-08-03 2013-11-20 Pioneer Hi-Bred International Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
CN101970668B (zh) 2007-11-27 2014-05-07 澳大利亚联邦科学与工业研究组织 淀粉代谢途径经过修饰的作物
WO2010009353A1 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Monsanto Technology Llc Methods and vectors for producing transgenic plants
CN102202498B (zh) 2008-07-21 2016-09-07 澳大利亚联邦科学与工业研究组织 改良的棉籽油及应用
BR122021003835B1 (pt) 2008-11-18 2022-02-08 Grains Research And Development Corporation Polinucleotídeo isolado e/ou exógeno que não ocorre de forma natural, vetor compreendendo o referido polinucleotídeo e método de produção de óleo contendo ácidos graxos insaturados
WO2011034433A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Wageningen Universiteit Cloning and exploitation of a functional r-gene from solanum chacoense
AU2011237909B2 (en) 2010-04-09 2015-08-20 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of derivatives of the (1-cyanocyclopropyl)phenylphosphinic acid, the esters thereof and/or the salts thereof for enhancing the tolerance of plants to abiotic stress
US20110294663A1 (en) 2010-05-21 2011-12-01 Bayer Cropscience Ag Herbicidal composition for tolerant or resistant corn crops
US20110287933A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bayer Cropscience Ag Herbicidal composition for tolerant or resistant oilseed rape crops
BR112012029634A2 (pt) 2010-05-21 2015-10-20 Bayer Ip Gmbh agentes herbicidas para as culturas de arroz tolerantes ou resistentes
CN103025166A (zh) 2010-05-21 2013-04-03 拜耳知识产权有限责任公司 用于耐受性或抗性谷物作物的除草剂
EP2390332A1 (en) 2010-05-31 2011-11-30 Coöperatie Avebe U.A. Cloning and exploitation of a functional R-gene from Solanum x edinense
AR083323A1 (es) 2010-06-28 2013-02-21 Commw Scient Ind Res Org Metodos para producir lipidos
EP2597943B1 (en) 2010-07-29 2018-02-07 Dow AgroSciences LLC Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency
NL2006378C2 (en) 2011-03-11 2012-09-12 Univ Wageningen Tyclv resistance.
EP2524602A1 (de) 2011-05-20 2012-11-21 Bayer CropScience AG Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Sojakulturen
CA2860432C (en) 2011-12-27 2024-06-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and suppressing gene silencing in the same cell
CA2860416C (en) 2011-12-27 2024-04-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
CA2860434C (en) 2011-12-27 2023-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
WO2013176548A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Wageningen Universiteit New plant resistance gene
NZ631702A (en) 2012-06-15 2017-01-27 Grains Res & Dev Corp Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
UA117816C2 (uk) 2012-11-06 2018-10-10 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт Гербіцидна комбінація для толерантних соєвих культур
WO2014112875A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Wageningen Universiteit A new method to provide resistance to bacterial soft rot in plants
AU2014308558B2 (en) 2013-08-21 2020-11-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Rust resistance gene
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
UA122768C2 (uk) 2013-12-18 2021-01-06 Коммонвелз Сайнтіфік Енд Індастріал Рисерч Организейшн Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти
CA3216668A1 (en) 2014-07-07 2016-01-14 Nuseed Global Innovation Ltd Processes for producing industrial products from plant lipids
CN104721835A (zh) * 2014-11-26 2015-06-24 浙江医药高等专科学校 抗黑色素瘤dna质粒疫苗及其制备方法
NL2014107B1 (en) 2015-01-09 2016-09-29 Limgroup B V New methods and products for breeding of asparagus.
US11236347B2 (en) 2015-08-28 2022-02-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
MX2018004063A (es) 2015-10-02 2019-04-01 Monsanto Technology Llc Secuencias recombinantes de cromosoma b de maíz y sus usos.
MX2018006192A (es) 2015-11-18 2018-12-19 Commw Scient Ind Res Org Grano de arroz con aleurona engrosada.
CN109642235B (zh) 2016-06-28 2023-12-29 孟山都技术公司 用于植物中的基因组修饰的方法和组合物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE57390T1 (de) * 1986-03-11 1990-10-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
ES2038631T3 (es) * 1986-08-23 1993-08-01 Hoechst Aktiengesellschaft Procedimiento para la obtencion de un gen de resistencia frente a fosfinotricina (ptc).
DE3716309A1 (de) * 1987-05-15 1988-11-24 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin
DE3732972A1 (de) * 1987-07-02 1989-01-12 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
HU215079B (hu) 1998-09-28
CN1057120C (zh) 2000-10-04
JPH1080278A (ja) 1998-03-31
DK175800B1 (da) 2005-02-28
JP2993964B2 (ja) 1999-12-27
FI880216A (fi) 1988-07-22
GR3007859T3 (fi) 1993-08-31
FI880216A0 (fi) 1988-01-19
EP0275957B1 (de) 1993-03-03
NZ223227A (en) 1989-06-28
AU609082B2 (en) 1991-04-26
AU1061988A (en) 1988-07-28
DK23988A (da) 1988-07-22
HUT47636A (en) 1989-03-28
EP0275957A3 (en) 1990-02-28
CN88100322A (zh) 1988-08-10
CA1321364C (en) 1993-08-17
CN87100603A (zh) 1988-08-10
EP0275957A2 (de) 1988-07-27
JP3062125B2 (ja) 2000-07-10
DE3878699D1 (de) 1993-04-08
IL85143A0 (en) 1988-06-30
JP3093686B2 (ja) 2000-10-03
JPH1080289A (ja) 1998-03-31
ES2054708T3 (es) 1994-08-16
JPS63273479A (ja) 1988-11-10
DK23988D0 (da) 1988-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI116067B (fi) Kasveissa tehokas fosfinotrisiiniresistenssigeeni ja sen käyttö
US6100446A (en) Microorganisms and plasmids for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)monooxygenase formation and process for the production of these plasmids and strains
US5276268A (en) Phosphinothricin-resistance gene, and its use
AU633202B2 (en) Dna to control fruit ripening encoding antisense rna for pectinesterase
CA2061636C (en) Chimeric gene for the transformation of plants
SU1582990A3 (ru) Способ получени трасформированных клеток двудольных растений
KR930009337B1 (ko) 히루딘을 유전공학적으로 제조하는 방법
EP0189707B1 (en) Recombinant dna which can be introduced into plant cells
André et al. Gene tagging in plants by a T-DNA insertion mutagen that generates APH (3′) II-plant gene fusions
EP0242246B1 (en) Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US6015891A (en) Synthetic insecticidal crystal protein gene having a modified frequency of codon usage
Hansen et al. Agrobacterium rhizogenes pRi8196 T-DNA: mapping and DNA sequence of functions involved in mannopine synthesis and hairy root differentiation.
US7138564B2 (en) Isolated Amaranthus agglutinin gene and uses thereof
AU614727B2 (en) DNA molecules coding for proteins targeted to plant cell walls
KR100312456B1 (ko) 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자
WO1986003776A1 (en) Process for preparing genetically stably transformed monocotyledonous plant cells
WO2003066836A2 (en) Udp-glucosyltransferases
US5846803A (en) Process for the isolation and characterization of a gene enzyme system for inactivation of the herbicide phenmedipham and transfer of the gene into plants to produce herbicide-tolerant plants
Hong et al. Functional role of the Ti plasmid-encoded catabolic mannopine cyclase in mannityl opine catabolism by Agrobacterium spp
EP0707070B1 (en) Method for enhancing disease and pest resistance of plants
CN112080513A (zh) 一套编辑范围扩展的水稻人工基因组编辑系统及其应用
Hartley The structure and control of the pentitol operons
IL85143A (en) Resistance gene against phosphinothricin
CN114507672A (zh) OsSLT1基因在控制水稻耐盐性中的应用
DE3737918A1 (de) In pflanzen wirksames resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 116067

Country of ref document: FI

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: BAYER CROPSCIENCE AG

Free format text: BAYER CROPSCIENCE AG

MA Patent expired