FI105690B

FI105690B - Menetelmä hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI105690B
Application number: FI974138A
Authority: FI
Inventors: Liisa Viikari; Johanna Buchert; Anita Teleman; Marja-Leena Niku-Paavola; Pirkko Forssell; Kristiina Kruus
Original assignee: Valtion Teknillinen
Priority date: 1997-11-04
Filing date: 1997-11-04
Publication date: 2000-09-29
Also published as: WO1999023240A1; FI974138A0; FI974138A; AU1035099A

Description

105690

Menetelmä hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista menetelmää 5 hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksi.

Tällaisen menetelmän mukaan tärkkelyspitoinen substraatti saatetaan kosketuksiin okso-ammonium-ionia tuottavan reagenssin kanssa hapetusaineen läsnäollessa. Reaktio suoritetaan sopivimmin nestemäisessä väliaineessa ja reaktiotuote erotetaan väliaineesta reaktion 10 jälkeen, pestään ja kuivatetaan.

Tärkkelys on luonnonpolymeeri, jonka johdannaisia käytetään paperi-ja kartonkiteollisuu-dessa täyteaineina, liimaukseen ja päällystykseen. Hapetettuja tärkkelysjohdannaisia kuten myös tärkkelyseettereitä ja kationoituja tärkkelyksiä käytetään pinta-liimaukseen paperin 15 lujuuden ja painatusominaisuuksien parantamiseen sekä päällystyksen sideaineina sitomaan pigmenttihiukkaset toisiinsa ja pohjapaperiin.

• · v, ·' Tärkkelys hapetetaan teollisesti pääasiallisesti epäorgaanisten hapettimien, kuten natrium- • # * : V hypokloriitin avulla, jolloin tärkkelysdispersion viskositeetti alenee sopivalle tasolle ja osa ' 20 tärkkelyksen hydroksyyliryhmistä hapettuu karbonyyli- ja karboksyyli-ryhmiksi. Primääri- i

« « I

;; · · sistä hydroksyyliryhmistä saadaan hapettamalla uronihapporyhmiä. Karboksyyliryhmät • i — - — • f · p t t ( ............

*... lisäävät dispersion viskositeettistabiilisuutta. Hypokloriittihapetukselle on esitetty vaih- • · « • i i toehtoisina menetelminä vetyperoksidin, bromin, perjodaatin, otsonin ja hapen käyttöä, ;·, joista vetyperoksidihapetus on lupaavin vaihtoehto (1 - 2).

• ·· ____ • _ ··· 25 .....

• · · · - ·------- - • ________ - . Perinteisiin hapetusmenetelmiin liittyy se ongelma, ettei hapetus ole tarpeeksi spesifinen • · .,..; primäärisille OH-ryhmille. Kemiallisissa hapetuksissa primääristen OH-ryhmien lisäksi • « •. hapettuvat aina myös sekundääriset OH-ryhmät jossain määrin. Sekundääristen OH-ryhmi- « « en hapettuminen johtaa polymeeriketjun katkeamiseen, depolymeroitumiseen. Tämän I f 30 vuoksi tärkkelyksen j a muiden luonnon polysakkaridien hapetukseen on jo kauan etsitty spesi-fisempiä menetelmiä.

105690 2

Erittäin selektiivinen TEMPO-johdannainen edustaa kiinnostavaa hapetusvaihtoehtoa. TEMPO-radikaali voidaan kirjallisuuden mukaan hapettaa hypohaliittien, kuten hypokloriitin ja -bromiitin avulla. Hapetettu TEMPO hapettaa puolestaan erilaisia primäärisiä alkoholiryhmiä karboksyyleiksi.

5 TEMPO-radikaalin (2,2,6,6-tetrametyyli-piperidiini-l-oksyyli) on todettu hapettavan erittäin selektiivisesti hiilihydraattipolymeerien primäärisiä OH-ryhmiä. Varsinaisena hapettimena toimii oksoammonium-ioni (nitrosonium-ioni)Joka saadaan hapettamalla TEMPO:a ensin hypohaliittien, kuten hypokloriitin tai -bromiitin avulla. Oksoammonium-ioni hapettaa hiilihyd-10 raattien primäärisiä OH-ryhmiä karbonyyleiksi, j otka voidaan edelleen hapettaa karboksyyleik- si.

TEMPO.a ja sen johdannaisia on käytetty aikaisemmin hapetettaessa alkoholien ja diolien primäärisiä hydroksyyliryhmiä aldehydeiksi sekä karboksyyleiksi samoin kuin hapetettaes-15 sa alifaattisia ja aromaattisia aldehydejä karboksyyleiksi. Tällöin mukana on ollut lisäkata-lyyttejä ja reaktio on tapahtunut alkaalisessa kaksifaasisysteemissä (3-5). TEMPO:a on käytetty myös erilaisten polysakkaridien, kuten tärkkelyksen hapettamiseen vesifaasissa (6- • · j ' ·' 9). Tällöin primäärihapettimina on ollut edellä mainittu hypokloriitti ja katalyyttinen määrä « » « : ·' natriumbromidia, joiden reagoidessa muodostuu vahvempi hapetin hypobromiitti.

« I

. 20 * 4 I I

|!" Menetelmän on todettu olevan erittäin selektiivinen ja tehokas. Välituotteena syntyy hydra- • · · .·:·. tottuneita aldehydeja vesiliuoksessa; aldehydit hapettuvat edelleen karboksyyleiksi (7-9).

• · · | *. < _ Tunnetun tekniikan epäkohtana on, että hypokloriitti on paitsi kallis myös ympäristölle 25 haitallinen. Tämä aiheuttaa ongelmia teollisuusmittakaavassa toimittaessa.

• · ....: Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät epäkoh- dat ja saada aikaan aivan uudenlainen menetelmä tärkkelyksen selektiiviseksi hapettami- . · · ·. seksi. Etenkin keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uudenlainen ratkaisu tärkkelyspi- • · 30 toisen lähtöaineen hapettamiseksi oksoammonium-ionia tuottavan reaktantin kanssa, kuten TEMPO:n avulla, jolloin reaktantin regeneroivana hapettimena käytetään haliditonta hapetinta.

3 105690

Keksintö perustuu siihen ajatukseen, että TEMPO hapetetaan hapettavan entsyymin avulla. Sopivia hapettavia entsyymejä ovat fenoloksidaasit, etenkin lakkaasi ja peroksidaasit.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle ratkaisulle on pääasiallisesti tun-5 nusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Esillä olevalla keksinnöllä saavutetaan huomattavia etuja. Niinpä ratkaisulla saadaan aikaan varsin selektiivinen hapetus, jolloin hapetettuun tärkkelykseen saadaan syntymään sopivassa suhteessa sekä karboksyyli- että karbonyyliryhmiä. Käyttämällä fenoloksidaasia 10 regeneroivana hapettimena päästään edelleen eroon ympäristön kannalta ongelmalliseksi katsotuista halidi-pitoisista aineista. Lopullisena elektroniakseptorina toimii happi, jolloin samalla vältetään hankalien sivutuotteiden muodostuminen reaktiojäijestelmään, mikä helpottaa tuotteen erotusta ja puhdistusta. Niin ikään käytettessä hapettavaa entsyymiä, kuten fenoloksidaasia, regeneroivana hapettimena voidaan käyttää mietoja reaktio-olosuh-15 teitä, kuten neutraalia tai lähes neutraalia pH:ta ja alhaista lämpötilaa.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan yksityiskohtaisen selityksen ja 4 « 1.'.' muutaman sovellutusesimerkin avulla. Selityksessä on viitattu oheiseen piirustukseen,

M I

• t I

: ·' jossa on kaaviomaisesti esitetty TEMPO:n reaktiot hapetusjärjestelmässä. Kuviossa IA on 20 esitetty TEMPO:n hapettuminen kemiallisten hapettimien vaikutuksesta ja kuviossa IB on

III

!' annettu vastaava esitys keksinnön mukaisesta ratkaisusta, jossa hapetus saadaan aikaan < -----= * · · entsyymillä.

« · · .........

• - — — - -

Kuten kuviosta IA ja IB käy ilmi, stabiili nitroksyyliradikaali (kohta 1) hapettuu okso-• * * ------------ .

25 ammoniumioniksi (kohta 2), joka hapettaa alkoholiryhmän (RCH2OH) esim. aldehydiksi • _________“ - (RCHO), jolloin oksoammoniumioni samalla pelkistyy hydroksyyliamiiniksi (kohta 3).

• · ________ .

• f

Regeneroituvana hapetusaineena käytetään kuvion 1A mukaisesti hypokloriittia ja kuvios- [ ·'t sa 1B happea. Ensimmäisessä tapauksessa reaktioon tuodaan myös katalyyttinen määrä ·

• « I

30 bromidia, joka hapettuu hypobromiitiksi, joka on voimakkaampi hapetin kuin hypokloriitti.

105690 4

Peroksidaaseja käytettäessä hapen tilalla voidaan käyttää vetyperoksidia elektroniaksepto-rina.

Kuten edellä mainittiin, keksinnössä käytetään hapettavia (oksidatiivisia) entsyymejä.

5 Edullisia ovat fenolisten ryhmien hapettumista katalysoivat hapettavat entsyymit. Nämä entsyymit ovat oksidoreduktaaseja, kuten oksidaasit ja peroksidaasit. “Oksidaasit” ovat entsyymejä, jotka katalysoivat hapetusreaktiota käyttämällä molekulaarista happea substraattinaan, kun taas “peroksidaasit” ovat entsyymejä, jotka katalysoivat hapetusreaktioita käyttämällä vetyperoksidia substraattinaan. Fenoloksidaasit (EC 1.10.3.2 bentseenidioli:-10 happi oksidoreduktaasi) katalysoivat o- ja p-substituoitujen fenolisten hydroksyyliryhmien ja amino/amiiniryhmien hapettumista monomeerisissa ja polymeerisissä aromaattisissa yhdisteissä.

Spesifisinä esimerkkeinä oksidaaseista voidaan mainita: lakkaasit (EC 1.10.3.2), kateko-15 lioksidaasit (EC 1.10.3.1), tyrosinaasit (EC 1.14.18.1) ja bilirubiinioksidaasit (EC 1.3.3.5). Erityisen edullisesti keksinnössä käytetään fenoloksidaaseja, etenkin lakkaaseja. Lak-kaaseja voidaan tuottaa valkolahottajasienillä, etenkin Trametes (aikaisemmin Coriolus-) ' ' ' versicolor tai hirsuta tai villosa -kannoilla. Muita tunnettuja lakkaasia tuottavia mikro- ' organismeja ovat seuraavien sienien eri kannat: Agaricus, Armillaria, Aspergillus, 20 Botrytis, Fusarium, Lentinus, Monocillium, Neurospora, Phlebia, Polyporus, Podospora, Pycnoporus ja Schizophyllum.

* « • · · • · « • · ·

Keksintö ei kuitenkaan rajoitu näihin entsyymien lähteisiin eikä johonkin tiettyyn eris- :’.f> tysmenetelmään, vaan entsyymit voidaan saada muillakin keinoin.

* * * _ - • · * 95 • I «

Niinpä on mahdollista tuottaa oksidatiiviset entsyymit mikro-organismeilla, jotka on • · mutatoitu ja geneettisesti rakennettu tuottamaan haluttua entsyymiä, tai niitä tuotetaan |_ muilla isäntäkannoilla, joihin entsyymiä koodaavat geenit on siirretty.

•

IMI

IM • * • · • · · 30 Hapetettava tärkkelys voi olla mikä tahansa luonnon tärkkelys, jonka amyloosi/amylo-pektiini-suhde voi olla 1:0...0:1. Esimerkkeinä tyypillisistä tärkkelyslähteistä mainitta- 5 105690 koon mukula- ja viljakasvit, kuten peruna, vehnä, ohra, kaura, herne, maissi, riisi, sago ja tapioka.

Lakkaasin määrä tärkkelyksen hapetuksessa voi olla noin 1 ...1000 nkat/g tärkkelystä.

5 Tärkkelyksen pitoisuus voi vaihdella laajalla välillä, se voi esim. olla 5...35 % (v/w).

Hapetus tehdään nestefaasissa, koska TEMPO on veteen liukeneva sopivimmin vedessä, lämpötila-alueella 10...70 °C, mieluimmin 20...40 °C sekä pH-alueella 4...9. TEMPO:n määrä on 0,01 - 50 paino-%, edullisesti noin 0,1-20 paino-%, tärkkelyksen määrästä.

10 Käytännössä reaktio suoritetaan siten, että valittu määrä TEMPOa (stabiilin nitroksyyli-radikaalin muodossa) liuotetaan veteen, johon suspendoidaan tärkkelystä. Suspension kuiva-ainepitoisuudeksi asetetaan yleensä noin 0,1 - 20 paino-%. Veteen voidaan lisätä puskuria reaktioväliaineen pH:n asettamiseksi haluttuun, lakkaasikäsittelyn kannalta sopivaan arvoon (yli 4). Lakkaasin lisäyksen jälkeen reaktioseokseen tuodaan happea joko 15 kaasuna tai ilmana samalla, kun seosta sekoitetaan. Hapentuonti kestää hapetettavan aineksen määrän mukaan yleensä noin 10 min - 24 tuntia. Reaktion jälkeen hapetettu tärkkelys erotetaan suodattamalla nesteestä, pestään ja kuivatetaan.

I f « · · n i I | I _______ _______ ' . · Peroksidaaseja käytettäessä TEMPO hapetetaan vetyperoksidilla, kuten edellä todettiin.

• mi . _ . ..

' ' 20 I I | ;; ·; Keksinnön mukaisen hapetuksen seurauksena saadaan tärkkelys, jonka primäärisistä OH- » »i '.,, ryhmistä osa on muuttunut karbonyyli- ja karboksyyliryhmiksi. Tyypillisesti esillä olevan • · · • ♦ · menetelmän mukaan hapetetussa tärkkelyksessä karbonyyli/karboksyyliryhmien suhde on :·. 1...5. Tärkkelyksen moolimassa alenee mahdollisesti hapetuksen seurauksena, mutta on · · • . .... . ..

25 yleensä vielä yli 300.000 g/mol, esim. ainakin 400.000 g/mol.

• ___________ _ *····· ..........

• · .,.,; Hapetettua tärkkelystä voidaan sellaisenaan käyttää mm. paperinvalmistuksen lisäaineena, » 9 paperikoneen märässä päässä tai päällystysaineena. Koska karbonyyliryhmien ansiosta c c e '!!! tärkkelyksestä saadaan reaktiivinen (karbonyyliryhmien ansiosta), tuotetta voidaan myös

f I

30 jatkohapettaa, ja karbonyyliryhmiä voidaan edelleen modifioida.

Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat keksintöä.

105690 6

Esimerkki 1 (vertailuesimerkki)

Kemiallinen hapetus 5 TEMPO:n katalysoima hapetus tehtiin seuraavasti: TEMPO 0.3 g liuotettiin 3000 ml vettä, suspendoitiin liuokseen 30 g tärkkelystä, lisättiin 12 g NaBr. Reaktioseosta termostoitiin 0 °C:seen. Valmistettiin toinen liuos Jossa oli 345 ml 8 %:sta hypokloriittia; pH säädettiin 3 M suolahapolla arvoon 10,8 ja liuos termostoi-10 tiin 0 °C:seen. Liuos lisättiin kerralla tärkkelystä sisältävään liuokseen ja inkuboitiin 2 h. Inkuboinnin aikana tarkistettiin liuoksen pH ja säädettiin tarpeen mukaan takaisin arvoon 10-11 käyttämällä 0.5 MNaOH:a. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 60 ml 96 %:sta etanolia ja säätämällä tämän jälkeen suspension pH 7:ksi. Tärkkelys erotettiin ja pestiin 1000 ml vettä ja kuivattiin huoneenlämmössä.

15

Esimerkki 2 Tärkkelyksen lakkaasi-TEMPO-hapetus • · $ ί .' Natiivia perunatärkkelystä hapetettiin käyttämällä TEMPO:a välittäjäaineena ja lakkaasi- I I I I « 20 entsyymiä hapettajana.

• t ·

Entsyymi: Trametes hirsuta D 443 -sieni lakkaasi, kasvuliuoskonsentraatti. Aktiivisuus

• « I

• · · määritettiin käyttämällä ABTS-substraattia (10).

* · • · • «« 25 35 g natiivista perunatärkkelyksestä tehtiin 5 %:n suspensio 0,1 M NaAc puskuriin, jonka m . pH-arvo oli 5,0. TEMPO (3,5 g) liuotettiiin puskuriin, lisättiin tärkkelys ja suspendoitiin • · ....: tämä nestefaasiin, minkä jälkeen lisättiin lakkaasi (annos 200 nkat/g tärkkelystä). Reaktiota * · ', hapetettiin happivirtauksella 3 h huoneenlämmössä ja sekoitettiin samanaikaisesti mag- 'neettisekoittajalla. Tärkkelys poistettiin suodattamalla ja pestiin 1000 ml vettä. Pesun 30 jälkeen tärkkelys kuivattiin huoneenlämmössä.

7 105690

Esimerkki 3

Hapetettujen tärkkelysten ominaisuudet

Karboksyyli- ja karbonyyliryhmiä muodostui tärkkelykseen sekä kemiallisella hapetuksella 5 että lakkaasi-TEMPO-hapetuksella (määritys ref. 11 :n mukaan). Tulokset on ilmoitettu alla esitettävässä taulukossa:

I I

' I »

' « I

I (

' « I

I t .· * I ----------- I l .......— • < i f < ( c * «« * · « • · e - - —.....

• · · -------t-~ r-· • « • · • ·· • · ·

• f O

· · " • - ----------— - • ......

f M««| • · a • Ml| ----------- - ( , i · <~ i : i ft f t < ( ( 105690 8

Taulukko. Hapetettujen tärkkelysten ominaisuudet Tärkkelys COOH/100 glukoosi CHO/100 glukoosi -yksikköä -yksikköä natiivi perunatärkkelys 0,47-0,52 0 '.ν.^νΜ^^ΛνΛκ^ν.νΜν.ν^Μ'ι'.ν,ν.ν/.νΛνΛ'Μν.νι’ΛνΛ'Μ'.ν.ν.ν.νΛν.'.ν.'ΛίΗΜΒ^Μ^ΗΜΜΗΒΗΜΗΙ^ΗΗΜΙΙΙ^^^ΜΜβΗΒΗΒΜΙ^ΗΗΜηΜΜ^^^ΒΗΗ 5 kemiallinen TEMPO hapetus 1,07-10,3_2,86-11,0_

Lakkaasi-TEMPO hapetus_ 1,02_2,99_

Hapetetun (sekä kemiallisesti että lakkaasi-TEMPOlla hapetetun) tärkkelyksen molekyyli-10 painot olivat hieman alhaisemmat kuin natiivin perunatärkkelyksen.

Hapetettujen tärkkelysten geeliytymisominaisuudet mitattiin Bohlin VOR reometrilla (oskillointimenetelmä). Näytteitä jäähdytettiin 90 °C:sta 20 °C:seen nopeudella 1 °C/min. Mittaukset tehtiin 15 % tärkkelysliuoksista. Lakkaasi-TEMPO ja kaupallinen hapetettu 15 tärkkelys (hypokloriitti-hapetettu) eivät geeliytyneet mittausolosuhteissa.

Esimerkki 4 r ( < f * ! « ' ’ «

« I

' f' Tärkkelystä hapetettiin eri lakkaasi- ja TEMPO-annoksilla. Hapetettujen tärkkelysten « < t 20 ominaisuudet (molekyylipainojakauma, geelitymisominaisuudet ja rakenne) mitattiin ; # esimerkin 3 mukaisesti. Havaittiin, että vaihtelemalla TEMPO-ja lakkaasiannosta, voidaan • «· . ·: ·, tärkkelyksen modifiointiastetta muuttaa ja siten myös geeliytymis- ja molekyylipaino- • · · * ominaisuudet muuttuvat.

• · • · * · · V · · • · « • · · » • · « « · · · * · · • f • · 9 105690

Kirjallisuus 1. Forssell, P., Hamunen, A., Autio, K., Suortti, T. & Poutanen,K. Starch 47, 371-377 (1995).

5 2. Parovuori,P., Hamunen,A., Forssell, P., Autio,K. & Poutanen, K. Starch 47,19-23 (1995).

3. Anelli, P.L., Biffi, C., Montanari, F. & Quid,S. J.Org. Chem. 52,2559 (1987) 10 4. Anelli, P.L., Banfi, S., Montanari, F. & Quid,S. J.Org. Chem.,54,2970(1989) 5. Kabalka, G.W., Chatla, N., Wadgaonkar, P.P. & Deshpande, S.M. Synth. Comm., 20.1617(1990).

15 6. deNooy, A.E.J., Besemer, A.C. & van Bekkum, H. RecI.Trav.Chim. Pays-Bas 113, 165-166(1994).

• | 7. de Nooy, A.E.J., Besemer, A.C. & van Bekkum, H. Carbohydrate Res. 269, 89-98

* I

:··; 20 (1995). ;;

* * I

r I « I < • *·· 8. Besemer, A.C & de Nooy, A.EJ. PCT WO 95/07303.

• · t • · · • · · 9. Chang, P.S. & Robyt, J.F. J. Carboh. Chem., 15, 819-830 (1996).

·· ----:-:-.-=:-.-: • · : ** 25 .....

• · · • · · ...-.

*. * 10. Niku-Paavola, M.-L., E. Karhunen, P. Salola, and V. Raunio. Biochem. J. 254, 877-884 (1988).

11. Smith, R. J. in Starch: Chemistry and Technology, Eds.R.L. Whistler & E.F. Paschall,

Voi II, Academic Press, Inc., New York 1967, pp.620-625.

# · · u • « • · • · ·

K

Claims

105690

1. Menetelmä hapetetun tärkkelyksen valmistamiseksi Jonka menetelmän mukaan tärkkelyspitoinen lähtöaine saatetaan kosketuksiin okso-ammonium-ionia tuottavan 5 reaktantin kanssa tätä reaktanttia hapettavan hapetusaineen läsnäollessa, tunnettu siitä, että hapetusaineena käytetään oksidatiivista entsyymiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oksidatiivisena entsyyminä käytetään fenoloksidaasia.

3. Patenttivaatimuksen I tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan nestemäisessä väliaineessa ja reaktiotuote erotetaan väliaineesta reaktion jälkeen ja saatetaan jatkokäsittelyyn sen puhdistamiseksi.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oksoammonium-ionia tuottavana reaktanttina käytetään 2,2,6,6-tetrametyylipiperidiini-l-oksyyliä (TEMPO:a) ja tämän kanssa reagoivana hapettimena lakkaasia.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 20 fenoloksidaasina käytetään Trametes-, Agaricus-, Armillaria-, Aspergillus-, Botrytis-, Fusarium-, Lentinus-, Monocillium-, Neurospora-, Phlebia-, Polyporus-, Podospora-, Pycnoporus- tai Schizophyllum-suvun lakkaasia. M · a · * a a a · a

• · · · · • 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a a a ”·' 25 oksoammonium-ionia tuottavana reaktanttina käytetään 2,2,6,6-tetrametyylipiperidiini-l- a · a aa "... oksyyliä (TEMPO:a) ja tämän kanssa reagoivan regeneroivana hapettimena peroksidaasia. a a a a a a a

,«- , 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että <11 . · *', tärkkelystä hapetetaan aldehydi- ja karboksyyliryhmien muodostamiseksi erityisesti • a a . '.t 30 primääriseen OH-ryhmään. • a · a a a · • a f • · • a • aa .

8. Tärkkelyksen modifiointi entsymaattisesti hapetetulla TEMPO:11a. a ♦ · a · I I > a * ala 705690

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen modifiointi, tunnettu siitä, että TEMPO on hapetettu lakkaasin avulla.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen modifiointi, tunnettu siitä, että TEMPO on 5 hapetettu peroksidaasin avulla.

11. Sellaisten modifioitujen tärkkelysten käyttö paperinvalmistuksen lisäaineena, paperikoneen märässä päässä tai päällystysaineena, jotka on käsitelty entsymaattisesti hapetetulla TEMPOdla. • • · · « « ....... • 1 • · __ --- M» _____ • Mf - - • « « · • · · ----------- • · • · · I « · — · 1C • 4 · 105690