ES2692951T3 - Anticuerpos IgG biespecíficos como acopladores de células T - Google Patents

Anticuerpos IgG biespecíficos como acopladores de células T Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo IgG biespecífico humano de longitud completa, en donde dicho anticuerpo IgG biespecífico comprende un brazo que reconoce específicamente CLEC12A y un segundo brazo que reconoce específicamente CD3, y en donde el brazo que reconoce específicamente CLEC12A comprende una secuencia variable de cadena pesada que consiste en una secuencia que es idéntica a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGG STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGT LVTVSS; o una secuencia variable de cadena pesada que consiste en una secuencia que es idéntica a **Fórmula** y en donde ambos brazos comprenden una cadena ligera común que comprende una secuencia variable de cadena ligera que consiste en una secuencia que es idéntica a **Fórmula**

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos IgG biespedficos como acopladores de celulas T Campo tecnico
La invencion se refiere al campo de la ingeniena de anticuerpos. En particular se refiere al campo de los anticuerpos terapeuticos (humanos) para el tratamiento de enfermedades relacionadas con celulas aberrantes. Mas en particular se refiere a anticuerpos biespedficos para el tratamiento de tumores.
Antecedentes de la invencion
En los laboratorios, los anticuerpos biespedficos se han usado ampliamente para el redireccionamiento de celulas efectoras inmunitarias a celulas tumorales. En este caso, un sitio de union se dirige contra un antfgeno asociado a tumor (TAA) y el segundo antigeno contra una molecula activadora en las celulas efectoras, tales como por ejemplo CD3 en celulas T (Kontermann, MABS 2012 (4) 182-197; Chames y Baty, MABS 2009 (1) 539-547; Moore y otros Blood 2011 (117) 4542-4551). Los primeros anticuerpos biespedficos dirigidos a CD3 y a un antigeno asociado a celulas tumorales eran de naturaleza roedor y se produjeron con el uso de hibridomas fnbridos (Liu y otros 1985 PNAS 82: 8648, Staerz y otros 1986 PNAS 83:1453, Lanzavecchia y otros 1987, Eur.J.Imm. 17:105). En estos hibridomas fnbridos la redistribucion de las cadenas pesadas y ligeras de Ig dio lugar a la produccion de moleculas de anticuerpos funcionales biespedficos dentro de un grupo mucho mas grande de anticuerpos monoespedficos y biespedficos no funcionales resultantes de la combinacion erronea de cadenas pesadas y ligeras. Debido a su doble especificidad, estos anticuerpos biespedficos funcionales fueron capaces de vincular linfocitos T citotoxicos (CTL) murinos y humanos a celulas diana y activar la funcion citotoxica lo que dio lugar a la lisis de celulas tumorales que muestran el antfgeno relevante. Sin embargo, la induccion de la lisis de celulas tumorales mediada por IgG biespedfica CD3xTAA por celulas T humanas en reposo policlonales no podna lograrse a menos que se proporcione coestimulacion mediante la adicion de IL-2 exogena o AcM anti-CD28. Esto se ejemplifica mediante la molecula biespedfica CD3xCD19 fnbrida IgG2b de rata/IgG1 de raton que fue capaz de inducir la lisis de la lrnea de celulas tumorales REH B-ALL positivas para CD19 por linfocitos T humanos en reposo solo despues de la coadministracion de IL-2 (Haagen y otros 1995 Blood 85:3208). Zeidler y otros demostraron con el uso de una molecula CD3xEpcam IgG2b de rata/IgG2a de raton similar que la lisis de celulas tumorales positivas para Epcam inducida por IgG biespedfica podfa lograrse en cultivos celulares mixtos que comprenden celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y celulas tumorales sin adicion de IL2 exogena (Zeidler y otros 1999 J. Immunol. 163:1246). Los autores reivindicaron que el 'tercer' brazo del anticuerpo, la region Fc, provoca este efecto a traves de la interaccion con celulas auxiliares positivas para el receptor de Fcy presentes dentro de la fraccion de PBMC. En particular, el fuerte potencial de activacion se correlaciono con la combinacion de subclases tnbrida IgG2a de raton/IgG2b de rata que, a diferencia de otras combinaciones informadas (por ejemplo, IgG2a de raton/IgG1 de raton o IgG2b de rata/IgG1 de raton), no solo se une sino que tambien activa celulas auxiliares positivas para el receptor de Fcy. Este denominado anticuerpo biespedfico CD3xEpcam triomAb, tambien conocido como catumaxomab, se ha desarrollado clrnicamente y se ha registrado en Europa para el tratamiento paliativo de tumores abdominales de origen epitelial. Aunque este anticuerpo biespedfico ha demostrado claramente su eficacia clrnica, su naturaleza de roedor induce respuestas inmunitarias contra el producto tras la dosificacion repetida y por lo tanto impide una aplicacion generalizada de este formato.
Se han explorado formatos CD3xTAA alternativos para solucionar los problemas de fabricacion y los problemas de inmunogenicidad asociados con el formato triomAb de roedor fnbrido. Con frecuencia tales formatos son moleculas de tipo inmunoglobulina que se desvfan de moleculas de IgG humanas de longitud completa, e incluyen moleculas tales como moleculas de redireccionamiento de doble afinidad (Dual-Affinity Re-Targeting, DART™) desarrolladas por Macrogenics con sitio web en la red mundial en macrogenics.com/Platforms-DART.html, moleculas acopladoras de celulas T biespedficas (Bispecific T cell Engager, BiTE®) desarrolladas por Micromet, ahora Amgen (Sheridan C, Nat Biotechnol. 2012 (30):300-1), moleculas de inmunoglobulina con dominio variable doble (Dual Variable Domain - immunoglobulin, DVD-Ig™) desarrolladas por Abbott, y moleculas TandAb® RECRUIT desarrolladas por Affimed con sitio web en la red mundial en affimed.com/tandab-recruit. Se demostro para uno de estos formatos que el redireccionamiento exitoso de linfocitos de sangre periferica para lisar celulas tumorales positivas para CD19 con el uso de un diacuerpo CD3xCD19 requena la preactivacion de los linfocitos T de sangre periferica, ahora con el uso de anticuerpo anti-CD3 mas IL-2 humana (Kipriyanov y otros 1998 Int.J.Can. 77:763). Otros formatos, tales como el formato CD3xTAA BiTE® de cadena simple bivalente Fv (Loffler y otros 2000 Blood 95:2098) no requieren la preactivacion de celulas T en reposo y son capaces de inducir in vitro la lisis de celulas tumorales positivas para el antfgeno de una manera extremadamente eficiente (Dreier y otros 2002 Int.J.Canc. 100:690). Estudios adicionales con el uso de BiTE® dirigidos a diferentes TAA revelaron que la potente eficacia del formato BiTE® se correlacionaba con el tamano del antfgeno y particularmente con la distancia del epftopo en el TAA a la membrana de la celula tumoral (Bluemel y otros 2010 Cancer Immunol. Immunother. 59:1197). La formacion eficaz de sinapsis de celulas T citolfticas se demostro para moleculas BiTE® que se explica que forma la base estructural de su potencia (Offner y otros Molecular Immunology 2006 (43) 763-771) que se cree ademas que este asociada al tamano pequeno del formato BiTE®. Si el tamano es importante, esto podna sugerir que moleculas mas grandes tales como IgG intacta senan demasiado grandes para formar sinapsis citolfticas eficaces. El BiTE® CD3xCD19,
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blinatumomab, ha demostrado una eficacia clmica notable en pacientes con linfoma no Hodgkin y leucemia linfatica aguda refractarios (Bargou y otros 2008 Science 321:974). Aunque el BiTE® CD3xCD19 muestra lisis de celulas tumorales muy eficiente a bajos niveles in vitro, la administracion de este formato biespedfico a pacientes se asocia con retos significativos. Debido a su tamano pequeno, los BiTE® se eliminan rapidamente de la circulacion y la dosificacion de los pacientes requiere por lo tanto una infusion continua. Dado que el regimen de dosificacion tiene una duracion total de mas de 2 meses, este tratamiento tiene un impacto significativo sobre la calidad de vida de los pacientes.
Por lo tanto aun existe la necesidad de moleculas IgG biespedficas de longitud completa eficaces que se acoplen a celulas T para erradicar celulas aberrantes que combinen una vida media en circulacion larga tras la administracion intravenosa sin necesidad de infusion continua sin ser inmunogenicas y solo con efectos secundarios limitados.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1: CLEC12Ay secuencias relacionadas.
La Figura 2: Activacion de celulas T por varios anticuerpos: IgG contra CD3 bivalente monoclonal, IgG biespedfica CD3XCLEC12, IgG biespedfica CD3xcontrol de isotipo, IgG contra CLEC12A bivalente monoclonal, IgG control de isotipo bivalente monoclonal.
La Figura 3: Lisis espedfica de celulas HL60 por IgG biespedfica CD3XCLEC12Ay anticuerpos de control.
La Figura 4: Lisis espedfica de celulas HL60 por IgG biespedfica CD3XCLEC12A y anticuerpos de control (relaciones E:D).
La Figura 5: Lisis espedfica de celulas HL60 con varias moleculas de IgG biespedfica CD3XCLEC12A que consisten en varios brazos contra CLEC12A & brazo contra CD3 fijo, y anticuerpos de control.
La Figura 6: Lisis espedfica de celulas HL60 con IgG biespedfica CD3XCLEC12A en combinacion con silenciamiento de Fc (DM=doble mutante; TM= triple mutante; WT=silvestre, sin silenciamiento de Fc).
La Figura 7: El silenciamiento de Fc no afecta la union a FcRn.
La Figura 8: Induccion de la proliferacion de celulas T espedfica de diana del Acbe CD3xCLEC12A.
La Figura 9: Compartimiento de celulas T CD8+ de pacientes con AML en comparacion con donantes sanos.
La Figura 10: Activacion de celulas T y lisis de celulas tumorales HL60 espedficas inducidas por CD3xCLEC12A con DM-Fc por celulas T de pacientes con AML.
La Figura 11: Lisis espedfica de blastos de AML por celulas T autologas de pacientes con AML.
La Figura 12: Lisis espedfica de monocitos por celulas T de pacientes.
La Figura 13: El silenciamiento de Fc elimina significativamente la liberacion de citocinas por celulas circulantes.
La Figura 14A: Tincion por FACS de anticuerpos anti-CD3 en celulas HPB-ALL
La Figura 14B: IgG unida a placa, celulas T etiquetadas con CFSE, lectura en el dfa 5 por FACS
Figura 15:ensayo de citotoxicidad en HL60
Figura 16: Tincion por FACS de anticuerpos anti-CLEC12A en celulas HL60
La Figura 17: Ensayos de citotoxicidad en HL60
Figura 18: Analisis de FACS
Figura 19: Ensayos de citotoxicidad en HL60
Figura 20: Secuencias de VH de los brazos Fab espedficos para CD3 y espedficos para CLEC12A. Secuencia de VL de la cadena ligera comun 012. Las secuencias de las CDR estan en negritas y subrayadas.
Resumen de la invencion
La presente invencion se refiere a un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa completamente humano para el tratamiento de AML. Un brazo del anticuerpo se une a un epttopo en celulas efectoras inmunitarias, CD3, mientras que el otro brazo se dirige a CLEC12A, una diana de superficie espedfica de celulas mieloides que se expresa en 90-95 % de los pacientes con AML de novo y recidivante. CLEC12A se expresa en celulas madre leucemicas de AML, pero no en celulas hematopoyeticas normales. A diferencia de CD33, CLEC12A no se expresa en precursores eritroides o en megacariocitos, de modo que el anticuerpo IgG1 biespedfico CD3xCLEC12A de la presente invencion no debe inducir la reduccion de plaquetas o globulos rojos. Los experimentos con colonias de celulas de medula osea han demostrado que la reduccion de celulas CLEC12A+ en medula osea normal no afecta los linajes mieloides que producen plaquetas y globulos rojos. Un anticuerpo IgG biespedfico CD3xCLEC12A de acuerdo con la presente invencion en una modalidad preferida contiene una region Fc modificada a fin de reducir la activacion inmunitaria no espedfica resultante del acoplamiento de celulas T y celulas que expresan FcyR dentro de las PBMC. En base a los datos descritos para el anticuerpo biespedfico triomAb en el estado de la tecnica se dudaba mucho que una IgG biespedfica CD3xTAA de un formato IgG1 completamente humano fuera capaz de inducir actividad antitumoral lttica en linfocitos de sangre periferica en reposo sin necesidad de preactivacion de celulas T. Ademas, los datos disponibles para el formato BiTE® sugenan que una molecula de IgG de longitud completa sena demasiado grande para crear sinapsis citoltticas eficaces entre celulas tumorales y celulas efectoras. Sorprendentemente, se demostro que una IgG1 biespedfica CD3xCLEC12A de longitud completa completamente humana era capaz de inducir in vitro la lisis mediada por celulas T muy eficiente de celulas tumorales de AML HL60 positivas para CLEC12A. De hecho, la lisis eficaz estuvo mediada por linfocitos T en reposo purificados a partir de PBMC sin necesidad de activacion previa de las celulas T. Ademas, se demostro que esta actividad lttica no depende necesariamente de las interacciones con el FcyR presente en celulas HL60 dado que esta actividad lttica
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no se afecto por la presencia de exceso de IgG humana cuando el ensayo se realizo en medio que contiene suero humano. Esta es la primera vez que un anticuerpo IgG1 acoplador de celulas T biespedfico humano de longitud completa ejerce lisis de celulas tumorales eficiente sin necesidad de preactivacion de celulas T o necesidad de interacciones con FcyR activo. La lisis eficaz se logra a pesar del tamano relativamente grande de la IgG1 en comparacion con moleculas BiTE®. Notablemente, cuando se introdujeron mutaciones en CH2/bisagra inferior en la molecula IgG1 biespedfica CD3xCLEC12A para disminuir aun mas las interacciones con el receptor de Fc, esto aun dio lugar a la lisis eficiente de celulas tumorales por celulas efectoras inmunitarias. Un anticuerpo IgG1 acoplador de celulas T biespedfico humano tiene ventajas respecto a la IgG actual que usa la combinacion de subclases Idbrida IgG2a de raton/IgG2b de rata, dado que una IgG1 humana sera menos inmunogenica y por lo tanto puede aplicarse para la terapia repetida. Ademas, un anticuerpo IgG1 acoplador de celulas T biespedfico humano de longitud completa tiene ventajas respecto a moleculas de tipo inmunoglobulina tales como DART™, TandAb® o BiTE® dado que la IgG1 humana de longitud completa no se elimina rapidamente de la circulacion y por lo tanto la dosificacion de los pacientes no requerira infusion continua, lo que es mas beneficioso para los pacientes.
Modalidades
La invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con las reivindicaciones, en donde dicho anticuerpo IgG biespedfico comprende un brazo que reconoce espedficamente CLEC12A y un segundo brazo que reconoce espedficamente un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias, CD3, capaz de reclutar tales celulas hacia una celula aberrante que expresa CLEC12A.
Como se usa en la presente, el termino "reconoce espedficamente CLEC12A" significa que dicho brazo tiene la capacidad de reconocer espedficamente CLEC12A, en la situacion en que CLEC12A este presente cerca de dicho anticuerpo. Del mismo modo, el termino "reconoce espedficamente un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias" significa que dicho brazo tiene la capacidad de reconocer espedficamente dicho antfgeno cuando dicho antfgeno esta presente cerca de dicho anticuerpo. Tal reconocimiento del antfgeno por un anticuerpo esta mediado tfpicamente a traves de las regiones de complementariedad del anticuerpo y la estructura tridimensional espedfica tanto del antfgeno como del brazo del anticuerpo lo que permite a estas dos estructuras unirse entre sf con precision (una interaccion similar a una cerradura y su llave), al contrario de la adhesion aleatoria, no espedfica de anticuerpos. Dado que un anticuerpo reconoce tfpicamente un epftopo de un antfgeno, y que tal epftopo tambien puede estar presente en otros compuestos, los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion que "reconocen espedficamente CLEC12A", y "reconocen espedficamente un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias" tambien pueden reconocer otros compuestos, si tales otros compuestos contienen el mismo tipo de epftopo. Por tanto, los terminos "reconoce espedficamente CLEC12A", "reconoce espedficamente un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias" y "reconoce espedficamente CD3" no excluyen la union de los anticuerpos a otros compuestos que contienen el mismo (tipo de) epftopo. En su lugar, se permite la reactividad cruzada. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invencion es capaz tfpicamente de unirse a CLEC12A y a un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias, cD3, con una afinidad de union de al menos 1x10-5 M, como se explica en mas detalle a continuacion.
El termino "anticuerpo" como se usa en la presente significa una molecula proteica perteneciente a la clase de protemas inmunoglobulinas, que contiene uno o mas dominios que se unen a un epftopo en un antfgeno, donde tales dominios se derivan de o comparten homologfa de secuencia con la region variable de un anticuerpo. Los anticuerpos para uso terapeutico son preferentemente tan cercanos a los anticuerpos naturales del sujeto a tratar como sea posible (por ejemplo anticuerpos humanos para sujetos humanos). La union del anticuerpo puede expresarse en terminos de especificidad y afinidad. La especificidad determina que antfgeno o epftopo de este se une espedficamente por el dominio de union. La afinidad es una medida de la fortaleza de la union a un antfgeno o epftopo particular. La union espedfica, o "reconocimiento espedfico" se define como la union con afinidades (KD) de al menos 1x10-5 M, con mayor preferencia 1x10-7 M, con mayor preferencia mayor que 1x10-9 M. Tfpicamente, los anticuerpos para aplicaciones terapeuticas tienen afinidades de hasta 1x10-10 M o incluso superiores. Los anticuerpos de la presente invencion son tfpicamente anticuerpos biespedficos de longitud completa de la subclase IgG humana. Preferentemente, los anticuerpos de la presente invencion son de la subclase IgG1 humana.
El termino 'IgG de longitud completa' de acuerdo con la invencion se define como que comprende una IgG esencialmente completa, que sin embargo no tiene necesariamente todas las funciones de una IgG intacta. Para evitar dudas, una IgG de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que pueden dividirse en dominios designados CH1, CH2, CH3, VH, y CL, VL. Un anticuerpo IgG se une a un antfgeno por medio de los dominios de region variable contenidos en la porcion Fab, y despues de la union puede interactuar con moleculas y celulas del sistema inmunitario a traves de los dominios constantes, principalmente a traves de la porcion Fc. Los terminos 'dominio de region variable', 'region variable', 'dominio variable', 'pareja VH/VL', 'VH/VL', 'porcion Fab', 'brazo Fab', 'Fab' o 'brazo' se usan indistintamente en la presente. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invencion abarcan moleculas de IgG en donde pueden estar presentes mutaciones que proporcionan caractensticas deseadas. Tales mutaciones no deben ser deleciones de porciones sustanciales de cualquiera de las regiones. Sin embargo, las moleculas de IgG en donde se eliminan uno o varios residuos de aminoacidos, sin alterar esencialmente las caractensticas de union de la molecula de IgG resultante, se incluyen dentro del termino "IgG de longitud completa". Por ejemplo, tales moleculas
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de IgG pueden tener una o mas deleciones de entre 1 y 10 residuos de aminoacidos, preferentemente en regiones que no son CDR, en donde los aminoacidos eliminados no son esenciales para la especificidad de union de la IgG.
Los anticuerpos IgG de longitud completa se prefieren debido a su vida media favorable y la necesidad de permanecer tan cerca de las moleculas completamente autologas (humanas) por razones de inmunogenicidad. De acuerdo con la invencion, se usan anticuerpos IgG biespedficos. En una modalidad preferida, se usan anticuerpos IgG1 biespedficos de longitud completa. La IgG1 se favorece en base a su vida media en circulacion larga en el hombre. Para impedir cualquier inmunogenicidad en seres humanos se prefiere que el anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion sea una IgG1 humana. El termino 'biespedfico' (be) significa que un brazo del anticuerpo se une a un primer antfgeno mientras que el segundo brazo se une a un segundo antfgeno, en donde dichos primer y segundo antfgenos no son identicos. De acuerdo con la presente invencion, dichos primer y segundo antfgenos son de hecho dos moleculas diferentes ubicadas en dos tipos de celulas diferentes. El termino 'un brazo [del anticuerpo]' significa preferentemente una porcion Fab del anticuerpo IgG de longitud completa. Los anticuerpos biespedficos que median la citotoxicidad mediante el reclutamiento y la activacion de celulas inmunitarias endogenas son una clase emergente de anticuerpos terapeuticos de nueva generacion. Esto puede lograrse mediante la combinacion de las especificidades de union a antfgeno para celulas diana (es decir, celulas tumorales) y celulas efectoras (es decir, celulas T, celulas NK, y macrofagos) en una molecula (Cui y otros JBC 2012 (287) 28206-28214; Kontermann, MABS 2012 (4) 182-197; Chames y Baty, MABS 2009 (1) 539-547; Moore y otros Blood 2011 (117) 4542-4551; Loffler y otros 2000 Blood 95:2098; Zeidler y otros 1999 J. Immunol. 163:1246). De acuerdo con la invencion, se proporcionan anticuerpos biespedficos en donde un brazo se une al antfgeno CLEC12A en celulas aberrantes (tumorales) mientras que el segundo brazo se une a un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias.
El termino 'CLEC12A' como se usa en la presente se refiere al miembro A de la familia 12 de dominios de lectina de tipo C, tambien conocido como molecula 1 tipo lectina de tipo C (CLL-1), un antfgeno que se expresa en celulas blasticas leucemicas y en celulas madre leucemicas en la leucemia mieloide aguda (AML), que incluyen las celulas madre leucemicas negativas para CD34 o con baja expresion de CD34 (poblacion secundaria) (A.B. Bakker y otros Cancer Res 2004, 64, p8443-50; Van Rhenen y otros 2007 Blood 110:2659; Moshaver y otros 2008 Stem Cells 26:3059). De cualquier otra manera la expresion de CLEC12A se restringe al linaje hematopoyetico, particularmente a celulas mieloides en sangre periferica y medula osea, es decir, granulocitos, monocitos y precursores de celulas dendnticas. Mas importante aun, CLEC12A esta ausente en celulas madre hematopoyeticas. Este perfil de expresion hace de CLEC12A una diana particularmente favorable en AML. Los nombres alternativos para CLEC12A incluyen lectina 2 de tipo C asociada a celulas dendnticas (DCAL-2), receptor tipo lectina de tipo C inhibidor mieloide (MICL) y subfamilia L de receptores tipo lectina de celulas asesinas, miembro 1 (KLRL1) (Zhang W. y otros num. de registro de GenBank: AF247788; A.S. Marshall, y otros J Biol Chem 2004, 279, p14792-802; num. de registro de GenBank: AY498550; Y.Han y otros Blood 2004, 104, p2858-66; H.Floyd, y otros num. de registro de GenBank: AY426759; C.H.Chen, y otros Blood 2006, 107, p1459-67). Un alineamiento de estas secuencias se representa en la Figura 1. La forma de longitud completa de CLEC12A comprende 275 residuos de aminoacidos, que incluyen un segmento intracelular adicional de 10 aminoacidos que esta ausente en la mayona de las otras isoformas, y muestra el perfil de expresion estrictamente mieloide (expresion en superficie y nivel de ARNm). El termino 'CLEC12A' significa todas las variantes a las que se hizo referencia anteriormente.
El termino 'celulas aberrantes' como se usa en la presente incluye celulas tumorales, mas espedficamente celulas tumorales de origen hematologico que incluyen ademas celulas preleucemicas tales como celulas que provocan smdromes mielodisplasicos (MDS) y celulas leucemicas tales como celulas tumorales de leucemia mieloide aguda (AML) o celulas de leucemia mielogena cronica (CML).
El termino 'celula efectora inmunitaria' o 'celula efectora' como se usa en la presente se refiere a una celula dentro del repertorio natural de celulas en el sistema inmunitario de mamfferos que puede activarse para afectar la viabilidad de una celula diana. Las celulas efectoras inmunitarias incluyen celulas del linaje linfoide tales como celulas asesinas naturales (NK), celulas T que incluyen celulas T citotoxicas, o celulas B, pero las celulas del linaje mieloide tambien pueden considerarse celulas efectoras inmunitarias, tales como monocitos o macrofagos, celulas dendnticas y granulocitos neutrofilos. Portanto, dicha celula efectora es preferentemente una celula NK, una celula T, una celula B, un monocito, un macrofago, una celula dendntica o un granulocito neutrofilo. De acuerdo con la invencion, el reclutamiento de celulas efectoras hacia celulas aberrantes significa que las celulas efectoras inmunitarias se acercan a las celulas diana aberrantes de manera que las celulas efectoras pueden causar directamente, o iniciar indirectamente la muerte de las celulas aberrantes hacia las que se reclutan. Para evitar interacciones no espedficas se prefiere que los anticuerpos biespedficos de la invencion reconozcan espedficamente los antfgenos en celulas efectoras inmunitarias que al menos se sobreexpresan en estas celulas efectoras inmunitarias en comparacion con otras celulas en el cuerpo. Los antfgenos diana presentes en celulas efectoras inmunitarias incluyen CD3. Preferentemente, el antfgeno en celulas efectoras inmunitarias es CD3 expresado en celulas T. El antfgeno mas preferido en una celula efectora inmunitaria es la cadena CD3e. Se ha demostrado que este antfgeno es muy eficaz para reclutar celulas T hacia celulas aberrantes. Por tanto, un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la presente invencion contiene preferentemente un brazo que reconoce espedficamente CD3e.
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Por lo tanto, la invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa de acuerdo con las reivindicaciones, en donde dicho anticuerpo biespedfico comprende un brazo que reconoce espedficamente CLEC12A y un segundo brazo que reconoce espedficamente un antigeno CD3 en celulas efectoras inmunitarias capaz de reclutar tales celulas hacia una celula aberrante que expresa CLEC12A, en donde dichas celulas efectoras inmunitarias comprenden celulas T. La invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion en donde dicho antfgeno en dichas celulas efectoras inmunitarias es CD3, preferentemente CD3e humano.
La invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con las reivindicaciones en donde ambos brazos comprenden una cadena ligera comun. El termino 'cadena ligera comun' de acuerdo con la invencion se refiere a cadenas ligeras que pueden ser identicas o tener algunas diferencias en la secuencia de aminoacidos mientras conservan la especificidad de union del anticuerpo. Es posible por ejemplo dentro del alcance de la definicion de cadenas ligeras comunes como se usa en la presente, preparar o encontrar cadenas ligeras que no son identicas pero aun asf funcionalmente equivalentes, por ejemplo, mediante la introduccion y prueba de cambios conservativos de aminoacidos, cambios de aminoacidos en regiones que no contribuyen o contribuyen solo en parte a la especificidad de union cuando se combinan con la cadena pesada, y similares. Los terminos 'cadena ligera comun', 'VL comun', 'cadena ligera individual', 'VL individual', con o sin la adicion del termino 'reordenada' se usan indistintamente en la presente. La presente invencion usa como cadena ligera comun una cadena ligera humana que puede combinarse con diferentes cadenas pesadas para formar anticuerpos con dominios de union a antfgeno funcionales (documentos WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant y otros 1998, Nissim y otros 1994). Preferentemente, la cadena ligera comun tiene una secuencia de lmea germinal. Una secuencia de lmea germinal preferida es una region variable de cadena ligera que se usa frecuentemente en el repertorio humano y tiene capacidad superior para combinarse con muchas regiones VH diferentes, y tiene buena estabilidad termodinamica, rendimiento y solubilidad. Una cadena ligera de lmea germinal de maxima preferencia es 012, preferentemente la cadena ligera kappa humana de lmea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01 (nomenclatura de acuerdo con la base de datos IMGT con sitio web en la red mundial en imgt.org) o fragmento o un derivado funcional de esta. Los terminos cadena ligera kappa humana de lmea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadena ligera huVKl-39 o abreviado huVKl-39 se usan indistintamente en toda la solicitud. Obviamente, los expertos en la tecnica reconoceran que "comun" tambien se refiere a equivalentes funcionales de la cadena ligera cuya secuencia de aminoacidos no es identica. Existen muchas variantes de dicha cadena ligera en donde estan presentes mutaciones (deleciones, sustituciones, adiciones) que no influyen materialmente en la formacion de regiones de union funcionales.
En una modalidad particularmente preferida se proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion en donde el brazo que reconoce espedficamente CLEC12A comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a SGYTFTSY y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a IINPSGGS y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a GTTGDWFD. Las secuencias de CDR mencionadas son las secuencias de CDR del brazo Fab de 4327 que, como se muestra en los Ejemplos, tiene buenas propiedades de union a CLEC12A. La secuencia de cadena pesada del brazo Fab de 4327, por tanto la VH del anticuerpo espedfico para CLEC12A 4327, se muestra en la Figura 20. En una modalidad preferida, un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion comprende una secuencia variable de cadena pesada (VH) que es identica a esta VH del anticuerpo 4327. Por lo tanto se proporciona ademas un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion, en donde el brazo que reconoce espedficamente CLEC12A comprende una secuencia de VH que consiste en una secuencia que es identica a la secuencia
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGS
TSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGTLV TVS. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos biespedficos de acuerdo con la invencion que contienen la secuencia de VH mencionada anteriormente, junto con una secuencia de VH de un brazo Fab que reconoce CD3 (y junto con una cadena ligera comun), tienen una excelente capacidad de inducir la lisis mediada por celulas T de celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A.
En una modalidad preferida adicional se proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion en donde el brazo que reconoce espedficamente CLEC12A comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a SGYTFTSY y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a IINPSGGS y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a GNYGDEFDY. Las secuencias de CDR mencionadas son las secuencias de CDR de la region Vh del anticuerpo 4331 que, como se muestra en los Ejemplos, tiene buenas propiedades de union a CLEC12A. La secuencia de VH del brazo Fab de 4331 tambien se muestra en la Figura 20. En una modalidad preferida, un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion comprende una secuencia de VH que es identica a esta VH del brazo Fab de 4331. Por lo tanto se proporciona ademas un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion, en donde el brazo que reconoce espedficamente CLEC12A comprende una secuencia de VH que consiste en una secuencia que es identica a la secuencia EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGS
TSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYGDEFDYWGQGTLV TVSS. Como se muestra en
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los Ejemplos, los anticuerpos biespedficos de acuerdo con la invencion que contienen la secuencia de VH del brazo Fab de 4331, junto con una secuencia de VH de un brazo Fab que reconoce CD3, (junto con una cadena ligera comun) tienen una excelente capacidad de inducir la lisis mediada por celulas T de celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A.
En una modalidad preferida adicional se proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion en donde el segundo brazo reconoce espedficamente CD3 y comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia SYGMH y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia IIWYSGSKKNYADSVKG y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia GTGYNWFDP. Preferentemente, dicho brazo espedfico para CD3 comprende una secuencia de VH que consiste en la secuencia QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGSK
KNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLV TVSS. Las secuencias de CDR y la secuencia de VH mencionadas son las secuencias del anticuerpo 3896. Estas secuencias tambien se representan en la Figura 20. Una cadena pesada que comprende estas secuencias de CDR espedficas para CD3 y/o la secuencia de VH del brazo Fab de 3896 mencionada se prefieren para un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion, dado que estas secuencias proporcionan al anticuerpo biespedfico una afinidad optima por celulas inmunitarias que expresan CD3, mientras permiten de forma simultanea la union suficiente a celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A. Sin desear estar ligado a la teona, se piensa que el efecto general de un anticuerpo biespedfico esta determinado por el efecto combinado de la afinidad de un brazo para el antigeno 1 y la afinidad del otro brazo para el antfgeno 2. Para un anticuerpo de la presente invencion, que tiene una especificidad por CLEC12A y un antigeno en celulas efectoras inmunitarias, CD3, se prefiere una sincronizacion optimizada de la union a celulas inmunitarias positivas para CD3 y celulas tumorales que expresan CLEC12A para inducir eficientemente la lisis mediada por celulas T de celulas tumorales positivas para CLEC12A. Se plantea la hipotesis de que el equilibrio entre las afinidades de un anticuerpo biespedfico CLEC12A/CD3 es de suma importancia. Se piensa que una afinidad significativamente mayor por CD3 frente a una afinidad mucho menor por CLEC12A (es decir, una afinidad demasiado alta por CD3) dara lugar a una situacion en donde los anticuerpos se uniran principalmente a celulas T que expresan CD3. Tales celulas T 'cargadas de anticuerpo biespedfico' pueden internalizar sus CD3 o pueden invadir los tejidos para de este modo abandonar la circulacion incluso antes de haber encontrado una celula tumoral positiva para CLEC12A. Esto disminuina el efecto terapeutico del anticuerpo biespedfico.
En un modo de accion mas favorable, las celulas tumorales positivas para CLEC12A se unen primero a uno o mas anticuerpos biespedficos de acuerdo con la invencion, donde despues las celulas T son atrafdas por el brazo contra CD3 libre del anticuerpo biespedfico y tiene lugar la activacion posterior de celulas T. Alternativamente, las celulas T positivas para CD3 y las celulas tumorales positivas para CLEC12A se unen esencialmente de forma simultanea al anticuerpo biespedfico. Por tanto, las afinidades tanto por CLEC12A como por un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias, cD3, se eligen o se modulan preferentemente de manera que se logre el equilibrio correcto, es decir que los anticuerpos biespedficos resultantes se unan a CLEC12A y CD3 esencialmente de forma simultanea o que los anticuerpos biespedficos tengan una tendencia a unirse a celulas tumorales positivas para CLEC12A en un grado suficiente, donde despues tiene lugar la activacion de celulas T y las celulas tumorales se lisan. De acuerdo con la presente invencion, tal equilibrio excelente entre las afinidades de union por CD3 y CLEC12A se logra preferentemente mediante la combinacion de una VH que tiene las secuencias de CDR (o la secuencia de VH completa) del brazo Fab de 3896 (que es espedfico para CD3) con una VH que tiene las secuencias de CDR (o la secuencia de VH completa) de cualquiera de los brazos Fab de 4327 o 4331 (que son espedficos para CLEC12A). Tales anticuerpos biespedficos resultantes muestran un equilibrio favorable entre las afinidades de union por CD3 y CLEC12A, de manera que las celulas T y las celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A se acercan eficientemente, y la lisis mediada por celulas T de celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A se induce de manera optima.
Como se describio anteriormente en la presente, se proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con las reivindicaciones en donde ambos brazos comprenden un dominio variable de cadena ligera comun. Una cadena ligera comun particularmente preferida es la cadena ligera kappa humana reordenada IgVKl-39*01/IgJKl*01, tambien llamada 012. Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la VL de 012 tambien se representan en la Figura 20. Las secuencias de CDR estan en negritas y subrayadas. Por lo tanto se proporciona un anticuerpo biespedfico de acuerdo con la invencion que contiene una cadena ligera comun que al menos comprende las secuencias de CDR de 012. Por lo tanto un aspecto de la invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion, en donde el primer y el segundo brazos comprenden ademas una secuencia de CDR1 de cadena ligera que consiste en una secuencia que es identica a RASQSISSYLN y una secuencia de CDR2 de cadena ligera que consiste en una secuencia que es identica a AASSLQS y una secuencia de CDR3 de cadena ligera que consiste en una secuencia que es identica a QQSYSTPPT. Un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion comprende una secuencia de VL que es identica a la cadena VL de 012. Por lo tanto se proporciona ademas un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion, en donde el primer y el segundo brazos comprenden una secuencia de VL que consiste en una secuencia que es identica a la secuencia
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Un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa de acuerdo con la invencion tiene por definicion dos sitios de union a anttgeno diferentes pero la region Fc de la IgG comprende ademas un tercer sitio de union para un receptor de Fc. Si una celula porta tanto un receptor de Fc como una de las dianas del anticuerpo biespedfico, puede producirse el entrecruzamiento del receptor de Fc y dicha diana en la superficie de dicha celula, lo que puede conducira efectos no deseados. En una modalidad preferida la invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa de acuerdo con la invencion, en donde dicho anticuerpo IgG biespedfico tiene mutados los dominios de bisagra inferior y/o CH2 de manera que la interaccion de dicho anticuerpo IgG biespedfico con los receptores de Fc gamma (Fcy) se reduce significativamente. Como se usa en la presente, el termino "de manera que la interaccion de dicho anticuerpo IgG biespedfico con receptores de Fc gamma se reduce significativamente" significa que la capacidad de dicho anticuerpo IgG biespedfico de interactuar con receptores de Fc gamma, si tales receptores de Fc gamma estan presentes cerca de dicho anticuerpo, se reduce. Por lo tanto, de acuerdo con la invencion una region del anticuerpo, preferentemente la bisagra inferior y/o el dominio CH2 del anticuerpo se muta (tfpicamente mediante la expresion de una secuencia de acido nucleico mutada que lo codifica) de modo que la capacidad de interactuar con un receptor de Fc disminuye. Se prefiere que la interaccion con el receptor de Fc se suprima esencialmente. Los residuos de aminoacidos en la IgG1 humana que participan en la union a receptores de Fcy se han mapeado anteriormente. Ademas de los residuos que, cuando se alteran, mejoran la union solamente a receptores espedficos o de forma simultanea mejoran la union a un tipo de receptor y reducen la union a otro tipo, se encontraron varios residuos que suprimen la union a uno o mas de los receptores (Shields RL y otros JBC 2001 (276) 6591-6604; Armour y otros Mol. Immunol. 2003 (40) 585-593). En una modalidad preferida adicional, dichos dominios de bisagra inferior y/o CH2 mutados comprenden al menos una sustitucion en las posiciones de aminoacidos 235 y/o 236 (numeracion de acuerdo con Kabat). Preferentemente, se sustituyen ambas posiciones de aminoacidos 235 y 236. Se muestra en los ejemplos que las sustituciones en estos sitios son capaces de impedir esencialmente la interaccion entre el anticuerpo biespedfico y el receptor de Fc presente en las celulas tumorales. En particular se muestra que las sustituciones L235G y/o G236R son muy adecuadas para ese proposito. Por lo tanto en la presente se proporciona ademas un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion, en donde dichos dominios CH2 y/o bisagra inferior mutados comprenden la sustitucion L235G y/o G236R. Preferentemente, se sustituyen tanto L235G como G236R. Alternativamente, un experto en la tecnica puede introducir mutaciones en la bisagra inferior y/o el dominio CH2 que comprenden las sustituciones 234F, 235E y/o 331S (Oganesyan y otros Biol. Crystall. 2008(D64)700). Preferentemente, las tres sustituciones se introducen en esta alternativa.
En la solicitud provisional de Estados Unidos 61/635,935, a la que sigue la solicitud regular de Estados Unidos num. 13/866,747 y la solicitud PCT num. PCT/NL2013/050294, se describen metodos y medios para producir anticuerpos biespedficos a partir de una celula individual, de modo que se proporcionan medios que favorecen la formacion de anticuerpos biespedficos respecto a la formacion de anticuerpos monoespedficos. Estos metodos tambien pueden emplearse favorablemente en la presente invencion. Por lo tanto la invencion proporciona un metodo de acuerdo con las reivindicaciones para producir un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa de acuerdo con la invencion a partir de una celula individual. Dichas primera y segunda moleculas de acido nucleico pueden ser parte del mismo vector o vehuculo de suministro de genes y pueden integrarse en el mismo sitio del genoma de la celula huesped. Alternativamente, dichas primera y segunda moleculas de acido nucleico se proporcionan por separado a dicha celula.
Una modalidad preferida proporciona un metodo para producir un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa de acuerdo con la invencion a partir de una celula individual, en donde dicho anticuerpo IgG biespedfico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfase, dicho metodo comprende proporcionar:
• una celula que tiene a) una primera secuencia de acido nucleico que codifica dicha cadena pesada de IgG que reconoce espedficamente CLEC12A y que contiene un 1er dominio CH3, y b) una segunda secuencia de acido nucleico que codifica dicha cadena pesada de IgG que reconoce espedficamente un antfgeno en celulas efectoras inmunitarias, CD3, y que contiene un 2do dominio CH3, en donde dichas secuencias de acido nucleico se proporcionan con medios para la combinacion preferencial de dichos 1er y 2do dominios CH3, dicho metodo comprende ademas la etapa de cultivar dicha celula y permitir la expresion de dichas dos secuencias de acido nucleico y cosechar dicho anticuerpo IgG biespedfico del cultivo. Dicha celula tiene ademas una tercera secuencia de acido nucleico que codifica una cadena ligera comun de acuerdo con las reivindicaciones. Una cadena ligera comun preferida es 012, preferentemente la cadena ligera kappa humana de lmea germinal reordenada IgVK1- 39*01/iGJk1*01, como se describio anteriormente. Las mutaciones preferidas para producir esencialmente solo moleculas de IgG biespedficas de longitud completa son las sustituciones de aminoacidos L351K y T366K (numeracion de acuerdo con Kabat) en el primer dominio CH3 y las sustituciones de aminoacidos L351D y L368E en el segundo dominio CH3, o viceversa. Por lo tanto se proporciona ademas un metodo de acuerdo con la invencion para producir un anticuerpo IgG1 biespedfico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoacidos L351K y T366K (numeracion de acuerdo con Kabat) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoacidos L351D y L368E, dicho metodo comprende ademas la etapa de cultivar dicha celula y permitir la expresion de dichas secuencias de acido nucleico y cosechar dicho anticuerpo biespedfico
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del cultivo. Se proporciona ademas un metodo de acuerdo con la invencion para producir un anticuerpo IgG1 biespedfico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoacidos L351D y L368E (numeracion de acuerdo con Kabat) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoacidos L351K y T366K, dicho metodo comprende ademas la etapa de cultivar dicha celula y permitir la expresion de dichas secuencias de acido nucleico y cosechar dicho anticuerpo biespedfico del cultivo. Los anticuerpos que pueden producirse por estos metodos tambien son parte de la presente invencion.
La invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion y un portador farmaceuticamente aceptable. Como se usa en la presente, tal 'portador farmaceuticamente aceptable' incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y que retardan la absorcion, y similares que son fisiologicamente compatibles. En dependencia de la via de administracion (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intraarticular y similares) el compuesto activo puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la accion de acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los anticuerpos y composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion son utiles en el tratamiento de varias leucemias y enfermedades preleucemicas de origen mieloide pero tambien de linfomas de celulas B. Las enfermedades que pueden tratarse de acuerdo con la invencion incluyen leucemias mieloides o enfermedades preleucemicas tales como AML, MDS y CML y linfomas de Hodgkin y la mayona de los linfomas no Hodgkin. Por lo tanto la invencion proporciona un anticuerpo IgG biespedfico de longitud completa de acuerdo con la invencion para el uso como un producto farmaceutico en el tratamiento de smdrome mielodisplasico (MDS), leucemia mielogena cronica (CML) o preferentemente leucemia mieloide aguda (AML). Se contempla ademas un uso de un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de smdrome mielodisplasico (MDS), leucemia mielogena cronica (CML) o preferentemente leucemia mieloide aguda (AML).
La cantidad de anticuerpo de acuerdo con la invencion que se administrara a un paciente esta tfpicamente en la ventana terapeutica, lo que significa que se usa una cantidad suficiente para obtener un efecto terapeutico, mientras la cantidad no exceda un valor umbral que conduzca a un grado inaceptable de efectos secundarios. Tfpicamente mientras menor sea la cantidad de anticuerpo necesaria para obtener un efecto terapeutico deseado, mayor sera la ventana terapeutica. Por lo tanto, se prefiere un anticuerpo de acuerdo con la invencion que ejerce efectos terapeuticos suficientes a dosis bajas.
Aproximadamente 30.000 pacientes se diagnostican cada ano con leucemia mieloide aguda (AML) en Europa y Estados Unidos. La mayona de estos pacientes son de 60 anos de edad o mas. La vejez es un determinante negativo principal del resultado en AML y la sobrevivencia a largo plazo (a 5 anos) de pacientes ancianos con AML tratados intensivamente es aproximadamente 10 %. En casi todos los pacientes que han logrado la remision tras la quimioterapia de induccion, la progresion de la enfermedad se observa dentro de 3 anos. El tratamiento actual posterior a la remision ha mostrado un valor limitado, de tenerlo, en pacientes ancianos con AML. Por lo tanto, queda una carga significativa de leucemia resistente residual, y la subpoblacion sobreviviente de celulas leucemicas resistentes a farmaco rapidamente genera recurrencia. Nuevos tipos de farmacos con modos de accion completamente diferentes son necesarios para actuar sobre estas celulas tumorales de AML que no responden a la quimioterapia en los esfuerzos para inducir y mantener remisiones completas. Aunque la remision completa (CR) puede lograrse con una serie de combinaciones de quimioterapia intensiva en mas de 50 % de los pacientes ancianos con AML y alrededor de 80 % en pacientes mas jovenes, los progresos de respuesta o sobrevivencia son aun un reto importante en la investigacion. En un metaanalisis de redes publicado recientemente de 65 ensayos clmicos aleatorios (15.110 pacientes) en pacientes ancianos con AML la mayona de los regfmenes de induccion investigativa enmendados tienen perfiles de eficacia similares o incluso peores en comparacion con el regimen de induccion 3+7 convencional sin daunorrubicina y citarabina. Este tratamiento estandar de AML se asocia con alta morbilidad e incluso mortalidad. La mayona de los pacientes en CR recaen debido a las celulas madre leucemicas restantes despues de la quimioterapia. La intensificacion adicional de la dosis es limitada debido a la toxicidad inaceptable. Por lo tanto esta surgiendo una necesidad urgente de modalidades de tratamiento preferentemente con menos toxicidad especialmente en pacientes ancianos con AML.
El tratamiento de AML que no responde a la quimioterapia podna lograrse mediante el acoplamiento de celulas T del propio sistema inmunitario del paciente y celulas tumorales de AML con el uso de un anticuerpo biespedfico. De esta manera, el sistema inmunitario de los pacientes se fortalece y se redirige para atacar y erradicar las celulas tumorales de AML. La presente invencion proporciona anticuerpos IgG biespedficos CD3xCLEC12A que inducen eficientemente la lisis de celulas tumorales de AML. Por lo tanto los anticuerpos biespedficos CD3xCLEC12A son una terapia dirigida con menos efectos secundarios que erradica espedficamente las celulas madre leucemicas para mejorar el pronostico de pacientes con AML. Debido a que CLEC12A se expresa en celulas madre leucemicas (LSC) y no en celulas madre hematopoyeticas normales, la terapia dirigida contra este antfgeno (como se ha demostrado in vitro) erradicara las LSC mientras preserva la celula madre normal. Con mayor probabilidad esto tendra el mayor impacto en situaciones de enfermedad residual minima (MRD). La expectativa es que el porcentaje de recidiva se reduzca debido a la erradicacion de la MRD. Asf el impacto para el paciente con aMl de esta nueva modalidad de
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tratamiento sena un tratamiento menos toxico con un menor porcentaje de recidiva lo que da lugar a una mejora del resultado asociada con una mejor calidad de vida. Estos anticuerpos IgG biespedficos de longitud completa se evaluan clmicamente en pacientes con AML recidivante. La eficacia clmica se analiza con el uso de la reduccion de blastos de AML en la medula osea como criterio objetivo de respuesta. Una IgG biespedfica eficaz para AML proporciona una nueva opcion terapeutica para un gran segmento de pacientes para los que actualmente no se dispone de tratamiento. Ademas de proporcionar un medio para lograr remisiones duraderas, esta opcion de tratamiento tambien tiene un potencial curativo para AML cuando se aplica durante la remision.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generacion y caracterizacion funcional de una IgG1 biespedfica CD3xCLEC12 candidata
Para validar el concepto de dirigir una celula efectora inmunitaria a una celula aberrante con una IgG biespedfica de longitud completa, se genero una IgG biespedfica CD3XCLEC12A1 candidata cuyos brazos Fab contra CD3 y CLEC12A se derivan de los anticuerpos descritos anteriormente. En el brazo Fab contra CD3, se uso la region VH del anticuerpo anti-CD3 15C3, uno de los anticuerpos espedficos para CD3 como se describe en el documento WO2005/118635, y esta VH se refiere como '3056'. En el brazo Fab contra CLEC12A, la region VH de scFv SC02- 357, se uso uno de los anticuerpos espedficos para CLEC12A como se describe en el documento W02005/000894, (llamado en lo adelante '[brazo Fab o anticuerpo] contra CLEC12A de referenda'; alternativamente esta VH se refiere como '3116'). Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la VH del brazo contra CD3 (3056), asf como las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la VH del brazo contra CLEC12A (3116) de esta molecula candidata, que se refiere como candidato 3056x3116, se proporcionan en la Figura 20. Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la VL comun (huVK1-39; 012) tambien se proporcionan en la Figura 20.
Las regiones VH respectivas se clonaron en vectores de expresion con el uso de metodos conocidos en la tecnica para la produccion de IgG1 biespedfica (Gunasekaran y otros JBC 2010 (285) 19637-19646; documento W02009/089004), junto con la cadena ligera IGKV1-39/IGKJ1 (huVK1-39) humana reordenada. Anteriormente se demostro que la cadena huVK1-39 es capaz de combinarse con mas de una cadena pesada para de este modo producir anticuerpos con diversas especificidades, lo que facilita la generacion de moleculas biespedficas (De Wildt RM y otros J. Mol. Biol. 1999 (285) 895-901; De Kruif y otros J. Mol. Biol. 2009 (387) 548-58; documento WO2009/157771).
En primer lugar, la union de la IgG1 biespedfica CD3xCLEC12A candidata 3056x3116 a CD3e en celulas HPB-ALL se demostro por citometna de flujo, que se realizo de acuerdo con procedimientos estandares conocidos en la tecnica (Tabla 1). La union a CD3e expresado en celulas se confirma con el uso de celulas CHO transfectadas con CD36/e o CD3y/£. La union de la IgG1 biespedfica candidata 3056x3116 a CLEC12A se determino con el uso de celulas CHO transfectadas con una construccion de expresion de CLEC12A; el anticuerpo monoespedfico para CD3 (3056x3056) y el anticuerpo monoespedfico para CLEC12A (3116x3116), asf como un AcM control de isotipo IgG1 irrelevante se tomaron como controles.
Tabla 1: Union a CD3 y CLEC12A expresados en celulas por citometna de flujo.
IgG
Celulas HPB-ALL* Celulas CHO transfectadas con CLEC12A*
Candidato 3056x3116 CD3XCLEC12A
6216 5299
CD3
6899 282
CLEC12A
199 4147 .
Control de isotipo
34 289
*Los resultados se proporcionan como la intensidad de fluorescencia media.
Las mediciones de afinidad de la IgG1 biespedfica candidata 3056x3116 por CD36/e y el dominio extracelular de CLEC12A se determinan por resonancia de plasmones superficiales (BIAcore). Brevemente, los antfgenos recombinantes purificados se acoplan covalentemente a la superficie de un chip sensor CM5 con el uso de qmmica de amina libre: los antfgenos se diluyen en un tampon kAc a 10 pg/ml y se acoplan a una superficie que se activa con NHS/EDC (de acuerdo con las recomendaciones del fabricante). Para determinar las afinidades de los brazos Fab presentes en anticuerpos biespedficos, estos se diluyen de manera seriada a 100, 50, 20, 10, 1 y 0,1 nM en
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solucion salina tamponada con Hepes (HBS) y se dejan fluir sobre la superficie con antigenos acoplados del chip sensor CM5 a una velocidad de flujo alta (30 pl/min) (para impedir la readhesion). La celda de flujo 1 (FC1) se usa como superficie de control (blanco) y las respuestas (sensogramas) resultantes de esta superficie se sustraen a las respuestas medidas en las otras celdas de flujo (FC). Las celdas FC2 y FC3 se usan para los dos antigenos diferentes reconocidos por el anticuerpo biespedfico, para poder medir las afinidades de ambos brazos Fab en una sola corrida cinetica sobre las tres superficies. Dado que la concentracion de anticuerpo no cambia significativamente cuando este fluye sobre una superficie con antigenos acoplados, las velocidades de asociacion (que dependen de la concentracion) de los anticuerpos biespedficos se miden de forma simultanea en los dos antigenos diferentes que estos reconocen. Los sensogramas de las fases de asociacion y disociacion de las diferentes protemas biespedficas se obtienen de este modo. Con el uso del software de evaluacion BIA y el ajuste de la curva que emplea un modelo de interaccion 1:1 (para la interaccion monovalente), se determinan las afinidades de los brazos Fab. En el caso en que la union de la protema biespedfica a la superficie recubierta con antigenos del chip sensor este comprometida (es decir, se une muy poca protema, lo que da lugar a respuestas bajas y/o velocidades de disociacion muy rapidas), la configuracion del experimento se invierte: el anticuerpo biespedfico se acopla covalentemente a la superficie del chip sensor con el uso de qmmica de amina libre y el antigeno recombinante purificado se deja fluir sobre la superficie a una velocidad de flujo alta (30 pl/min) para medir la afinidad del brazo Fab dirigido a ese antigeno.
A continuacion, se probo la funcionalidad de la Ig biespedfica CD3xCLEC12A candidata 3056x3116. En primer lugar, se investigo la capacidad de estimulacion de celulas T con celulas T en reposo de donantes sanos. Brevemente, se obtuvo sangre periferica de donantes sanos despues del consentimiento informado. Las celulas T se aislaron mediante aislamiento por gradiente de densidad estandar para el enriquecimiento en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), seguido de seleccion negativa con el uso de esferas magneticas (kit de celulas pan T, Miltenyi Biotec, num. de cat.130-091-155). Con el uso de esta estrategia de purificacion, las celulas T se denominaron 'intactas' (es decir, no tenidas por anticuerpos, denominadas 'celulas T en reposo') para limitar la posibilidad de preactivacion. Las celulas T en reposo purificadas se incubaron posteriormente con celulas de la lmea celular HL60 derivada de leucemia en suero fetal bovino (FBS) al 10 % o suero humano normal (HS) al 10 % a una relacion de celulas efectoras: dianas de 10:1 durante dos dfas. Los resultados se expresaron como el porcentaje de celulas positivas para CD69 o positivas para CD25 dentro de la poblacion de celulas T positivas para CD4 o positivas para CD8.
Tanto la IgG contra CD3 bivalente como la IgG biespedfica CD3XCLEC12A indujeron eficientemente la regulacion positiva de los marcadores de activacion de celulas T CD69 y CD25 en celulas T positivas para CD4 y positivas para CD8 (Figura 2). En presencia de FBS que no bloqueo los receptores de Fc presentes en celulas HL60 (Liesveld y otros 1988, J. Immunol. 140(5), paginas 1527-1533), la molecula de control IgG biespedfica CD3Xcontrol de isotipo demostro inducir la activacion de celulas T. Este efecto disminuyo en presencia de HS, lo que sugiere que la activacion de celulas T observada por la union monovalente a CD3 de la IgG CD3Xcontrol de isotipo depende del entrecruzamiento de Fc. Sin embargo, la activacion de celulas T inducida por la IgG biespedfica CD3xCLEC12A candidata 3056x3116 dependfa solo parcialmente de las interacciones de Fc, dado que la potencia para regular positivamente a CD69 y CD25 se mantuvo en gran parte en presencia de HS (Figura 2). Esto indico que la potencia intrmseca de la union monovalente a CD3 fue suficiente para activar celulas T cuando la molecula de union se vinculo al antfgeno CLEC12A en las celulas diana HL60 despues de la union con el otro brazo Fab.
Para investigar si el grado de activacion de celulas T por la IgG biespedfica CD3XCLEC12A candidata 3056x3116 es suficiente para inducir la lisis de celulas diana, las celulas HL60 en este ensayo se etiquetaron con ester succimidflico de diacetato de carboxifluorescema (CFSE) y se cultivaron junto con celulas T a varias relaciones de celulas efectoras: diana. Despues de uno, dos o tres dfas, las celulas HL60 positivas para CFSE sobrevivientes se cuantificaron por citometna de flujo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis espedfica con relacion a PBS.
Como se esperaba, la IgG bivalente monoespedfica para CD3 indujo la muerte mediada por celulas T en reposo de las celulas HL60 (Figura 3). Sorprendentemente, la IgG monovalente biespedfica CD3XCLEC12A y el control CD3Xcontrol de isotipo tambien indujeron la muerte mediada por celulas T en reposo de las celulas HL60. Estos efectos fueron mas prominentes cuando el ensayo se realizo en ausencia de exceso de IgG humana, es decir, cuando los receptores de Fc en las celulas diana HL60 no estaban bloqueados (condicion con FBS; Figura 3). Sorprendentemente, incluso en presencia de exceso de IgG humana (condicion de HS al 10 % ) la IgG biespedfica CD3XCLEC12A fue muy eficiente para causar la muerte de celulas HL60 lo que indica que la induccion de la lisis de HL60 no depende de las interacciones con el receptor de Fcy. En el dfa 3 tambien se observo lisis de HL60 inducida por el anticuerpo CD3Xcontrol de isotipo, probablemente debido al bloqueo incompleto del receptor de Fc-gamma tras penodos de incubacion prolongados. La muerte de celulas diana HL60 vario con diferentes relaciones de celulas efectoras: diana (Figura 4).
En conclusion, este ejemplo demuestra que una molecula biespedfica CD3xCLEC12A es un inductor potente de la lisis de celulas tumorales mediada por celulas T y confirma la hipotesis de que el acoplamiento de celulas T para la muerte eficaz de celulas aberrantes puede estar mediado por un anticuerpo IgG1 biespedfico CD3xCLEC12A de
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longitud completa. Sorprendentemente, la actividad inducida por la IgG biespedfica CD3XCLEC12A no depende de las interacciones con el receptor de Fcy. Para ampliar el panel de IgG biespedfica CD3XCLEC12A de longitud completa para llegar a un candidato clmico final, se generan paneles de brazos Fab contra CD3 y brazos Fab contra CLEC12A. La validacion de la especificidad y la funcionalidad de los brazos Fab contra CD3 y CLEC12A se realiza por fijacion del otro brazo con el uso del Fab respectivo de la IgG biespedfica CD3XCLEC12A candidata 3056x3116 que se muestra en el presente ejemplo.
Ejemplo 2: Generacion y caracterizacion de brazos Fab contra CD3 para Acbe CD3xCLEC12
El Ejemplo 1 demostro que las moleculas biespedficas CD3xCLEC12A pueden ser inductores potentes de la lisis de celulas tumorales mediada por celulas T. Por lo tanto, para generar paneles mas amplios de tales moleculas biespedficas se generaron paneles separados de aglutinantes de CD3 asf como aglutinantes de CLEC12A.
Para la generacion de un panel de aglutinantes de CD3, se generan regiones VH espedficas para CD3£ mediante la inmunizacion de ratones transgenicos para la cadena ligera huVKl-39 (documento WO2009/157771) y para un minilocus de cadena pesada (HC) humana con CD3£ en varios formatos: (1) CD38/£ o CD3y/£ aislado que puede fusionarse o acoplarse a una molecula portadora (tal como Fc de IgG humana o una etiqueta de His) como se conoce en la tecnica con o sin adyuvante, (2) celulas que expresan CD38/£ o CD3y/£, o (3) construccion de ADN que codifica CD38/E o CD3y/£, o una combinacion de estas estrategias. De los ratones inmunizados que muestran un tftulo espedfico de antfgeno suficiente como se determina por ELISA y/o citometna de flujo, se cosechan los bazos y/o los ganglios linfaticos a partir de los cuales se generan bibliotecas de Fab en fagos. Alternativamente, las secuencias de regiones VH se obtienen directamente del material del bazo y los ganglios linfaticos por secuenciacion profunda (solicitud provisional de Estados Unidos 61/539,116 en tramitacion pendiente).
Los brazos Fab espedficos de antfgeno se seleccionan de las bibliotecas de fagos de ratones inmunizados o de bibliotecas sinteticas de presentacion en fagos que contienen la region VL de la cadena ligera huVK1-39 y una coleccion de regiones VH humanas. Para la generacion de bibliotecas sinteticas, se usaron cebadores de CDR3 aleatorios como se describe en De Kruif y otros 1995, J Mol Biol 248(1), paginas 97-105. Los bacteriofagos de estas bibliotecas se seleccionan en multiples rondas en cuanto a la union de la protema CD38/£ aislada que puede acoplarse a una molecula portadora (ver arriba) o a celulas que expresan CD3£ tales como HPB-ALL o celulas transfectadas para expresar CD38/£ o CD3y/£, o una combinacion de estas estrategias. Los fagos que no se unen se eliminan y los fagos que se unen se eluyen con un tampon acido o, para dirigir el repertorio de Fab seleccionado a una especificidad deseada, con anticuerpos contra un epttopo espedfico, por ejemplo con anticuerpos que tienen reactividad cruzada con CD3£ de cynomolgous. Despues estos fagos se transfectan en bacterias competentes que se cultivaron con presion de seleccion para bacterias que contienen fagos. Despues de escoger una serie de colonias bacterianas sobrevivientes, los fagos se recuperan y se envfan a la siguiente ronda de seleccion.
Despues de completar la seleccion, los fagos restantes se tamizan en cuanto a la union a antfgeno expresado en celulas por citometna de flujo y a antfgeno aislado por ELISA. Como control positivo de union, se usan anticuerpos contra CD3 de referencia conocidos en la tecnica, por ejemplo, OKT-3. El material nucleotfdico de esencialmente todos los fagos que mostraron union espedfica a celulas que expresan antfgeno se envfa a PCR de colonias para amplificar las regiones VH y la PCR se secuencia para determinar la secuencia de la region VH. Las secuencias resultantes se agrupan en base a la singularidad de sus HCDR3. Para las secuencias derivadas de ratones inmunizados, en las que puede producirse hipermutacion somatica (limitada), las secuencias de VH se agrupan adicionalmente en base a la probabilidad de una VDJ unica (es decir, si las HCDR3 en grupos diferentes contiene una diferencia <2 aminoacidos, estas se consideran parte del mismo grupo y se agrupan). De cada grupo, se seleccionan una o algunas regiones VH por grupo para su clonacion en vectores para la expresion en un formato de IgG bivalente monoespedfica junto con la cadena ligera huVK1-39. Las regiones VH cuya union espedfica a antfgeno aislado y a antfgeno expresado en celulas se confirmo se clonan posteriormente en vectores para la expresion en un formato biespedfico CD3XCLEC12A. Despues estas se caracterizan para seleccionar un candidato con potencial terapeutico (ver los ejemplos siguientes).
Ejemplo 3: Generacion y caracterizacion de brazos Fab contra CLEC12 para Acbe CD3xCLEC12
Dado que en el Ejemplo 1 se demostro que las moleculas biespedficas CD3xCLEC12A tienen la potencia para inducir la lisis de celulas tumorales mediada por celulas T, a continuacion, se quiso establecer paneles mas amplios de tales moleculas biespedficas. Ademas del panel de aglutinantes de CD3 como se describio en el Ejemplo 2 tambien se genero un panel de aglutinantes de CLEC12A.
Brevemente, se seleccionaron brazos Fab espedficos para CLEC12A a partir de bibliotecas sinteticas de Fab de presentacion en fagos que conternan la region VL de IGKV1-39/IGKJ1 humana reordenada y una coleccion de regiones VH humanas (De Kruif y otros Biotechnol Bioeng. 2010 (106)741-50). Los bacteriofagos de estos bancos se seleccionaron en dos rondas en cuanto a la union a CLEC12A. Esto se realizo por incubacion con el dominio extracelular de CLEC12A (aminoacidos 75 a 275) acoplado a una etiqueta de His (Sino Biological, num. de cat. 11896-H07H) que se uso para recubrir una superficie. Los fagos que no se unen se eliminaron, los fagos que se
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unen se eluyeron qmmicamente, y se usaron para infectar bacterias que se cultivaron con presion de seleccion para bacterias que contienen fagos. Despues de escoger una serie de colonias bacterianas sobrevivientes, los fagos se recuperaron y se enviaron a la siguiente ronda de seleccion y propagacion.
Despues de completar la seleccion, los fagos restantes se tamizaron por citometna de flujo en cuanto a la union a CLEC12A expresado en la lmea de celulas tumorales HL60. Como control positivo de union, se uso el anticuerpo contra CLEC12A de referencia. El material nucleotfdico de esencialmente todos los fagos que mostraron union espedfica a celulas que expresan CLEC12A se envio a PCR de colonias para amplificar las regiones VH y la PCR se secuencio para determinar la secuencia de la region VH. Las secuencias resultantes se agruparon en base a la singularidad de sus HCDR3. Las regiones VH de cada grupo de HCDR3 unicas se clonaron en vectores para la expresion en formatos de IgG monoespedfica o biespedfica junto con la LC IGKV1-39/IGKJ1 humana reordenada.
Tres moleculas de union a CLEC12A seleccionadas con una secuencia de HCDR3 unica mostraron el perfil deseado en formato de IgG, que comprendfan las caractensticas siguientes (Tabla 2 y datos no mostrados):
Union espedfica a dominio extracelular aislado de CLEC12A.
Union espedfica a CLEC12A expresado en una lmea de celulas tumorales.
Confirmacion del patron de expresion espedfico de linaje mieloide en PBMC humanas.
Tabla 2: Caracterizacion de los brazos Fab contra CLEC12A.
Fab
Lougitud de CDR3 Union a CLEC12A recubierta* Union a celulas que expresan CUEC12A** Competencia por epitopo con CUEC12A de referencia***
CLEC12A de referencia
.....9... 1,422 1467 :
3918
10 1,253 899 Si
4327
9 1,307 1559 ; No
4331
9 1,328 1106 Si
*Probado en ELISA, dominio extracelular de CLEC12A (Sino Biological) recubierto a 2 pg/ml, los resultados se proporcionan como densidad optica (senal de fondo de control de isotipo: 0,127).
**Probado por citometna de flujo en celulas HL60 con concentracion de IgG optimizada, los resultados se proporcionan como intensidad de fluorescencia media (senal de fondo de control de isotipo: 116).
***Probado en ELISA con formato Fab, contra IgG de referencia a 20 pg/ml.
Ejemplo 4: Seleccion de brazo Fab contra CLEC12 funcional para Acbe CD3xCLEC12
Los brazos Fab contra CLEC12 seleccionados como se describio en el Ejemplo 3 se expresaron posteriormente en formato de IgG biespedfica con un nuevo brazo Fab contra CD3 como brazo fijo. Este nuevo brazo Fab contra CD3, referido como 'IgG contra CD3 de 3896' o '3896' abreviado, tambien usa la cadena ligera huVK1-39. Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de este candidato 3896 de VH espedfica para CD3 se representan en la Figura 20. Por tanto, se expresaron varias moleculas biespedficas CD3XCLEC12A que teman el mismo brazo anti-CD3 de 3896 pero que difenan en el brazo contra CLEC12A (ya fuera el brazo contra CLEC12A de referencia, o cualquiera de los brazos Fab contra CLEC12 candidatos de 4327, 4331 o 3918). Despues estas moleculas biespedficas CD3xCLEC12A se probaron funcionalmente en un ensayo de lisis de celulas diana como se describio en el Ejemplo 1. Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis espedfica con relacion al control de isotipo. Todos los brazos Fab contra CLEC12 candidatos mostraron una lisis espedfica dependiente de la dosis de celulas diana HL60 en el formato biespedfico, con cineticas que eran similares o mejores que cuando se uso el brazo Fab contra CLEC12A de referencia (Figura 5).
Ademas, el Acbe CD3xcontrol de isotipo mostro una lisis de celulas diana dependiente de la dosis, aunque se requirieron concentraciones 1 log mayores para el mismo grado de lisis espedfica. A pesar de la presencia de exceso de IgG humana por medio de la adicion de HS, la actividad de muerte de esta IgG contra CD3 monovalente aun era evidente, probablemente por el entrecruzamiento mediado por Fc. Como resultara evidente a partir del
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Ejemplo 7, esta lisis no espedfica de la diana puede de hecho suprimirse completamente por medio del silenciamiento de la interaccion con el receptor de Fc mediante ingeniena de CH2.
Ejemplo 5: eficacia de los candidatos del producto CD3xCLEC12 con el uso de celulas T de AML y/o celulas tumorales de AML
Los Ejemplos 1 y 4 demostraron la potencia de la IgG biespedfica CD3XCLEC12A con el uso de un brazo Fab contra CD3 de 3056 o 3896 y con el uso de los brazos Fab contra CLEC12A candidatos de 4327, 4331 o 3918 o el brazo Fab contra CLEC12A de referencia de 3116 para inducir la lisis de celulas diana HL60 mediada por celulas T en reposo de donantes sanos. En el presente ejemplo, se investiga si las celulas T derivadas de pacientes con AML, una de las indicaciones primarias para la aplicacion terapeutica de un farmaco biespedfico CD3XCLEC12A, pueden estimularse para causar la muerte de las dianas tumorales tras la estimulacion con una IgG biespedfica CD3XCLEC12A de longitud completa. A continuacion, se determina si las celulas T derivadas de pacientes pueden causar la muerte de blastos de celulas tumorales de AML autologas tras la estimulacion con una IgG biespedfica CD3XCLEC12A de longitud completa.
Las celulas T se afslan a partir de sangre periferica de pacientes con AML de acuerdo con procedimientos como se describio en el Ejemplo 1. Despues las celulas T derivadas de pacientes purificadas se incuban con celulas HL60 etiquetadas con CFSE y se monitorean en cuanto a la lisis celular como se describio en el Ejemplo 1.
Ademas, el ensayo de lisis de celulas diana mediada por celulas T se realiza con blastos tumorales de AML aislados del mismo paciente (Norde y otros Blood 2009 (113)2312). Despues los blastos aislados se etiquetan con CFSE y se cultivan junto con celulas T autologas derivadas de pacientes en presencia de la mezcla de citocinas como se describe en Norde y otros y en presencia de la IgG biespedfica CD3XCLEC12A o de controles. La lisis de celulas diana se monitorea como se describio en el Ejemplo 1.
Ejemplo 6: Liberacion de citocinas por celulas T despues del contacto con IgG biespedfica CD3XCLEC12A
Al usar productos biologicos estimuladores de celulas T, la sobreestimulacion de celulas T es un riesgo serio dado que esto puede conducir al smdrome de liberacion de citocinas (Suntharalingam y otros 2006, New England J Med 355(10), paginas 1018-1028; Chatenoud y otros 1990, Transplantation 49(4), paginas 697-702). Para investigar el grado de estimulacion de celulas T inducida por IgG biespedfica CD3XCLEC12A, se estudio la induccion de citocinas de celulas T en un cultivo conjunto de celulas T y celulas diana que expresan receptor de Fc.
Brevemente, se cultivaron celulas T en reposo de donantes sanos junto con celulas diana HL60 en presencia de la IgG biespedfica CD3XCLEC12A candidata 3056x3116 (1 pg/ml) o IgG de control como se describio en el Ejemplo 1. Despues de dos dfas, se recolecto el sobrenadante y los niveles de produccion de citocinas se determinaron en un ensayo Luminex como se conoce en la tecnica con el uso del panel de citocinas humanas Human 10-Plex (Invitrogen, num. de cat.LHC0001). Este panel abarca las diez principales citocinas de Th1 y Th2.
Como se esperaba, la IgG bivalente monoespedfica para CD3 indujo una fuerte produccion de IFNy, TNFa e IL-2 (Tabla 3), que se consideran las principales causantes del smdrome de liberacion de citocinas. Ademas, la produccion de IL-4, IL-6, IL-8 e IL-10 aumento por incubacion con IgG contra CD3. Por el contrario, la IgG biespedfica CD3XCLEC12A solo indujo la produccion de IL-8 a un nivel similar a la IgG contra CD3; las otras citocinas no se indujeron significativamente con la IgG biespedfica. El GM-CSF estuvo por debajo del lfmite de deteccion en cualquier condicion.
Tabla 3: liberacion de citocinas por celulas T inducida por anticuerpos.
Citocina
IgG contra CD3 IgG CD3XCLEC12A CD3Xcontrol de isotipo
IFNy
484,3 ± 155,0 : 13,5 ± 19,1 0,0 ±0,0 ■
TNFa
85,8 ±23,1 14,5 ± 1,4 4,6 ±1,1
IL-2
7 285,6 ± 325,5 3,4 ±0,8 ■ 1,7 ±0,6
IL-4
23,6 ±3,7 10,2 ±0,2 7,3 ± 1,3
IL-6
9,0 ± 1,8 . 3,7 ±0,3 ...2,3 ±0,0 :
IL-8
1567,8 ±5,2 1280,1 ± 118,4 359,6= 183,6
11,-10
■531,5 = 224,0 21,1 ±3,0 ' 3.7 ± 4,0:
IL-lp
4,4 ± 0,4 3,3 ±0,1 2,5 ±0,1
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Los resultados se proporcionan como la concentracion promedio de citocina en pg/ml de dos donantes ± desviacion estandar.
Los datos que se muestran aqu sugieren un perfil terapeutico favorable para las diferentes moleculas de IgG biespedfica CD3XCLEC12A, dado que inducen de manera potente la lisis de celulas diana (Ejemplos 1 y 4) sin activar la secrecion por celulas T de cantidades potencialmente perjudiciales de citocinas proinflamatorias como se observa con la IgG contra CD3.
Ejemplo 7: Efecto del silenciamiento de Fc sobre la eficacia in vitro del Acbe CD3XCLEC12A
Se sugirio que la lisis de celulas diana dependiente de la dosis por el Acbe CD3xcontrol de isotipo que se muestra en el Ejemplo 4 se debe a la interaccion de la parte Fc del Acbe con receptores de Fc en celulas diana HL60. Dado que esta lisis celular no espedfica de la diana tambien puede producirse in vivo, ya sea por interaccion con receptores de Fc en celulas diana o en celulas circulantes tales como celulas NK, se empleo la ingeniena de la region CH2/bisagra inferior para inducir el silenciamiento de la actividad del Acbe mediada por Fc.
Para esto, se examinaron dos estrategias de mutacion de Fc, con el uso de una mutacion doble 235G 236R (DM; DM-Fc) o una mutacion triple 234F 235E 331S (TM; TM-Fc). Se generaron los Acbe CD3XCLEC12A (3056x3116) con una mutacion DM-Fc o una TM-Fc y por citometna de flujo se confirmo que se unen a celulas que expresan CLEC12A con la misma intensidad que el Acbe con Fc silvestre (datos no mostrados). A continuacion, estos Acbe y las versiones silvestre, DM-Fc y TM-Fc del Acbe CD3xcontrol de isotipo se probaron en el ensayo de lisis de celulas diana HL60 (ver los Ejemplos 1 y 4). Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis espedfica con relacion al control de isotipo.
El silenciamiento de Fc ya sea por la DM o por la TM no tuvo o solo tuvo una influencia menor sobre el grado de lisis espedfica de celulas hL60 inducida por Acbe CD3XCLEC12A (Figura 6). Para el Acbe CD3xcontrol de isotipo, sin embargo, la potencia para inducir la lisis de celulas HL60 se redujo significativamente con la TM e incluso mas con la DM.
Esto demuestra que el silenciamiento de Fc por ingeniena de CH2/bisagra inferior contribuye adicionalmente a la muerte espedfica de diana de celulas aberrantes mediante la creacion de un formato de IgG1 biespedfica CD3xCLEC12A que recluta eficientemente y espedficamente las celulas efectoras, y disminuye la activacion inmunitaria no espedfica potencial mediada por celulas auxiliares que expresan receptor de Fcy normales.
Ejemplo 8: Efecto del silenciamiento de Fc sobre la union a FcRn, CD16, CD32, CD64 y C1q
La union del Acbe CD3XCLEC12A candidato 3056x3116 con WT-Fc o con DM-Fc o TM-Fc silenciado a FcRn humano se determino por interferometna de biocapa (BLI, Octet QK, ForteBio). Brevemente, IgG1 CD3XCLEC12A purificada con WT-Fc, IgG1 con DM-Fc o IgG1 con TM-Fc se capturo en biosensores de Protema L (ForteBio, num. de cat. 18-5085) a una concentracion de 50 pg/ml en tampon fosfato 0,1 M/Tween20 al 0,002 % que contiene BSA a 1,0 mg/ml pH 6,0 (tampon de union a FcRn) a RT. Posteriormente se anadio FcRn humano soluble (Sino Biological Inc, CT009-H08H) a una concentracion de 1 pg/ml en tampon de union a FcRn) a RT. El analisis de los datos con el uso del software de analisis Octet QK mostro tras la normalizacion de la union de IgG al sensor de ProtL que la union posterior de Acbe CD3XCLEC12A con Fc silenciado por DM o TM a FcRn humano era comparable a Acbe CD3XCLEC12A con cola Fc silvestre (Figura 7) y por lo tanto el silenciamiento de Fc no afecto la union a FcRn.
La union de Acbe CD3XCLEC12A con Fc silenciado a CD16, CD32 y CD64 se determina por interferometna de biocapa (BLI, Octet QK, ForteBio). Protocolo abreviado: la IgG1 CD3XCLEC12A purificada con WT-Fc, IgG1 con DM-Fc o IgG1 con TM-Fc se captura en biosensores de Protema L (ForteBio, num. de cat. 18-5085) a una concentracion de 50 pg/ml en tampon Kinetics 1x (ForteBio 18-5032) a RT. Posteriormente se anade protema CD16 (Sino Biological Inc, 10389-H08H1), CD32 (Sino Biological Inc, 10374-H08H) y CD64 (Sino Biological Inc, 10256- H08H) recombinante a una concentracion de 1,0 pg/ml en tampon Kinetics (ForteBio 18-5032) a RT. La union de los receptores FcR a Acbe se analiza con el uso del software de analisis Octet QK.
La union de Acbe CD3XCLEC12A con Fc silenciado a C1q humano se determina por ELISA de captura. Para este fin una placa Nunc-Immuno maxisorp F96 (Nunc, 439454) se recubre con IgG1 CD3XCLEC12A purificada con WT- Fc silvestre, IgG1 con DM-Fc o IgG1 con TM-Fc en un intervalo de concentracion de 25-0,012 pg/ml en PBS O/N a 4 C. Posteriormente se anade C1q humano (Quidel, A400) a 2,0 pg/ml en tampon de ELISA (2 % de leche/PBST). Despues este complejo se visualiza con el uso de IgG policlonal de oveja anti-C1q humano (Meridian, K90020C) e IgG policlonal de conejo antioveja conjugada a HRP (Southern Biotech, 6150-05). Por ultimo, con el uso del sustrato TMB (BD 51-2606KC/51-2607KC) se revela la union y la OD450 se cuantifica con el uso de un lector de microplacas (Multiskan EX, Thermo Electron Corporation).
Ejemplo 9: Evaluacion de la eficacia in vivo de la IgG biespedfica CD3xCLEC12A.
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Se realizan estudios de xenoinjerto en animales con el uso de celulas HL60 que expresan luciferasa (celulas HL60(- Luc)) para confirmar y ampliar los hallazgos in vitro con el uso de la IgG1 biespedfica CD3xCLEC12A. Mas espedficamente estos estudios se realizan para determinar las concentraciones plasmaticas en equilibrio a dosis eficaces, que se tendran en cuenta para establecer la dosis inicial para la evaluacion clmica de Fase 1. Para este proposito se inyectan ratones NOD/SCID (o ratones inmunodeprimidos comparables) por via subcutanea con una cantidad de celulas HL60(-Luc) viables que da lugar al establecimiento de tumores subcutaneos de HL60 en la mayona de los animales dentro de dos semanas despues de la inyeccion. Paralelamente a la inoculacion de HL60(Luc), o tras la toma inicial del tumor, se administran 5x10E6 o 1x10E7 PBMC humanas. La IgG biespedfica CD3xCLEC12A o la IgG monoespedfica de control o biespedfica de control se administran por via intravenosa a varios niveles de dosis en el primer dfa de administracion de PBMC, y 3, 6, y 9 dfas despues. Las dimensiones del tumor se califican 1 semana despues de la inoculacion de HL60(Luc) inicial. El promedio aritmetico de las dimensiones del tumor (indicado como volumenes tumorales o como bioluminiscencia total) de cada grupo se representa graficamente contra el tiempo.
Ejemplo 10: Uso de un anticuerpo IgG1 biespedfico CD3xCLEC12A de longitud completa en un estudio Fase la/Ib.
El candidato final de IgG1 biespedfica CD3xCLEC12A de longitud completa se usa para fabricar material de calidad GMP y se evalua clmicamente en pacientes con AML. En primer lugar, se realiza un analisis formal de seguridad no clmico del candidato de producto para establecer una dosis inicial segura para los primeros estudios en humanos. En lo adelante, se realiza un ensayo Fase la/b de escalado de dosis abierto y multicentrico, en AML recidivante y/o refractaria y en pacientes no aptos para el tratamiento intensivo, para explorar la seguridad y la tolerabilidad de la IgG biespedfica CD3xCLECl2A tras la administracion i.v. Los criterios de valoracion secundarios incluyen la caracterizacion farmacocinetica y farmacodinamica y el analisis preliminar de la eficacia. Las tasas de respuesta global se evaluan por evaluacion de la reduccion de blastos de AML en la medula osea. En Fase Ia la dosis maxima tolerada (MTD) se evalua tras el escalado de dosis unicas/multiples. Despues del analisis PK interino, la parte Fase 1b del estudio implica una cohorte de extension de dosis a la MTD o implica una exploracion adicional de la frecuencia de dosificacion.
Ejemplo 11: Capacidad de Acbe CD3XCLEC12A para inducir la proliferacion de celulas T.
En pacientes con AML las cantidades de celula T son bajas en comparacion con la cantidad de blastos de AML en el diagnostico. Se conoce bien que las celulas T experimentan proliferacion tras la activacion lo que da lugar a un aumento de la cantidad de celulas T. Por otra parte, en el Ejemplo 1 se ha demostrado que un Acbe CD3XCLEC12A puede activar las celulas T y tiene la potencia para inducir la lisis de celulas tumorales mediada por celulas T. Se plantea la hipotesis de que los pacientes con aMl tratados con Acbe CD3XCLEC12A se benefician de la expansion de subconjuntos de celulas T tras la activacion de celulas T mediada por la molecula biespedfica CD3xCLEC12A dado que la proliferacion de celulas T dara lugar a un aumento de la cantidad de celulas T efectoras. Para demostrar que Acbe CD3XCLEC12A induce la proliferacion de celulas T in vitro, se purificaron celulas T en reposo, se etiquetaron con ester succimidflico de diacetato de carboxifluorescema (CFSE) y se cultivaron junto con monocitos CLEC12A+ autologos en presencia de Acbe CD3XCLEC12A o Ac de control. Para investigar espedficamente la proliferacion de celulas T inducida por CD3xCLEC12A sin activacion no espedfica de Fcgamma, se usaron Acbe CD3XCLEC12A con la cola DM-Fc, como se describio en los Ejemplos 7 y 8. Como controles, se incluyeron un Acbe CD3xcontrol de isotipo con WT-Fc, un Acbe CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc, un monoclonal contra CD3 con WT- Fc y un control de isotipo irrelevante (IgG con WT-FC). Los monocitos y celulas T de sangre periferica de donantes sanos se aislaron mediante aislamiento por gradiente de densidad estandar para el enriquecimiento en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), seguido de una seleccion de monocitos positivos para CD14 con el uso de microesferas con CD14 (microesferas con CD14 humano, Miltenyi Biotec, num. de cat. 130-050-201) y una seleccion negativa de celulas T intactas con el uso de esferas magneticas contra otros leucocitos (kit de aislamiento de celulas pan T, Miltenyi Biotec, num. de cat. 130-096-535). El kit de aislamiento de celulas pan T permite el aislamiento de celulas T en reposo (intactas) (es decir no tenidas con anticuerpos) lo que evita la posibilidad de preactivacion de celulas T.
Las celulas T en reposo purificadas etiquetadas con CFSE se incubaron posteriormente con monocitos purificados y Acbe en medio con suero humano normal (HS) al 10 % a una relacion de celulas efectoras: dianas de 5:1 durante siete dfas. En el dfa 7 se midio la disminucion de la senal de CFSE como lectura de la proliferacion de celulas T por citometna de flujo. Los resultados se expresaron como la senal de CFSE por celulas T CD3+, CD3+CD4+ o CD3+CD8+ en histogramas.
El Ac contra CD3 con WT-Fc de control positivo indujo la proliferacion de celulas T mientras que la IgG control de isotipo con WT-Fc no indujo la proliferacion de celulas T (Figura 8). Como se esperaba el Acbe CD3xcontrol de isotipo con WT-Fc indujo la proliferacion de celulas T, pero en menor grado en comparacion con la IgG anti-CD3 monoespedfica bivalente de control. Por el contrario, el Acbe CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc no indujo la proliferacion de celulas T debido a su cola de Fc silenciado. El Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc tambien indujo la proliferacion de celulas T deseada mediada por el vinculo espedfico de CD3 con el antfgeno CLEC12A
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Esto demuestra que un Acbe CD3XCLEC12A no solo es capaz de inducir la lisis tumoral mediada por celulas T espedfica de diana como se demostro anteriormente, sino que tambien puede inducir de manera potente la proliferacion de celulas T espedfica de diana lo que da lugar a un aumento de la cantidad de celulas T. Por otra parte, esto demuestra ademas que el silenciamiento de Fc por ingeniena de CH2/bisagra inferior no solo contribuye a la muerte espedfica de diana de celulas aberrantes sino tambien a la induccion espedfica de diana de la proliferacion de celulas T por el Acbe IgG CD3xCLEC12A con DM-Fc.
Ejemplo 12: Evaluacion de la expansion inducida por CD3xCLEC12A del subconjunto Temra de pacientes con AML.
Dado que la activacion de la proliferacion de celulas T se demostro para Acbe CD3xCLEC12 con DM-Fc, a continuacion, se quiso investigar si Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc es capaz de inducir la proliferacion del compartimiento de celulas T citotoxicas CD8+ en pacientes con AML. Las celulas T citotoxicas CD8+ se han reconocido como los principales efectores que median la regresion tumoral (Sluijter y otros, 2010). Las celulas T CD8+ pueden dividirse en cuatro subconjuntos: celulas vfrgenes (CCR7+CD45RA+), de memoria centrales (Tcm, CCR7+CD45RA-), de memoria efectoras (Tem, CCR7-CD45RA-), y de memoria efectoras CD45RA+ (Temra, cCr7- CD45RA+). Los estudios han demostrado que los subconjuntos de celulas T CD8+ vfrgenes y de memoria tienen capacidades diferentes para proliferar y diferenciarse en respuesta a la estimulacion del tCr (Geginat y otros, 2003).
En primer lugar, el compartimiento de CD8+ en sangre periferica de pacientes con AML en remision clfnica se analizo en comparacion con donantes sanos. Para este fin las PBMC se aislaron a partir de muestras de sangre periferica congelada de pacientes con AML y donantes sanos mediante aislamiento por gradiente de densidad estandar. A continuacion, las PBMC se tineron con anticuerpos contra CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA y CD45RO para analizar los subconjuntos de celulas T CD8+ por citometna de flujo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de un subconjunto en el compartimiento total de celulas T CD8+.
De manera similar a lo que se describio anteriormente, se observo que el subconjunto de celulas T CD8+ vfrgenes se redujo en la sangre de pacientes con AML en comparacion con el subconjunto de celulas T CD8+ vfrgenes de individuos sanos, mientras que el compartimiento de Temra (CCR7-CD45RA+) aumento en pacientes con AML en comparacion con donantes sanos (Figura 9).
A continuacion, se realizan experimentos para estudiar la proliferacion de celulas T espedfica de diana tumoral del compartimiento de celulas T de pacientes con AML. Mas espedficamente, estos experimentos se realizan para determinar si el Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc puede mejorar la proliferacion de celulas T y el crecimiento excesivo de los subconjuntos de celulas T efectoras (Tem y Temra) de pacientes con AML con relacion a las celulas T CD8+ vfrgenes de pacientes con AML.
Para este fin se purifican celulas T en reposo de pacientes con AML en remision clfnica de acuerdo con el ejemplo 11. La composicion de los subconjuntos de celulas T CD8+ en el dfa = 0 se analiza por tincion de las PBMC con anticuerpos contra CCR7, CD3, cD4, CD8, CD45RA y CD45RO, seguido de analisis de citometna de flujo. Ademas, las celulas T en reposo se etiquetan con CFSE o no se etiquetan (el etiquetado con CFSE es como se describio en el ejemplo 11) y se cultivan junto con celulas leucemicas HL60 a una relacion E:D de 5:1 con anticuerpos de control o de prueba durante 7 dfas. Las celulas T etiquetadas con CFSE se usan para la cuantificacion de la proliferacion de celulas T, mientras que las celulas T no etiquetadas se usan para determinar el porcentaje de subconjuntos de celulas T proliferadas. Las celulas T etiquetadas y no etiquetadas con CFSE se incuban con PBS, Ac control de isotipo con WT-Fc, Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc, Acbe CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc y Ac monoclonal contra CD3 con WT-Fc a 1 pg/ml. Despues de 7 dfas, las celulas T etiquetadas con CFSE se tinen con anticuerpos contra CD3, CD4 y CD8 y se someten a analisis de FACS para determinar las cantidades absolutas de celulas T y el numero de divisiones celulares, mientras que las celulas T no etiquetadas con CFSE se tinen con anticuerpos contra CCR7, CD3, CD4, CD8, CD45RA y CD45Ro para determinar la composicion de los subconjuntos de celulas T CD8+ proliferadas por citometna de flujo. La proliferacion de celulas T se expresa como la senal de CFSE por subconjunto de celulas T en histogramas y el tamano de los cuatro subconjuntos de celulas T CD8+ se expresa como porcentaje dentro del compartimiento total de celulas T CD8+.
Ejemplo 13: Eficacia de Acbe CD3XCLEC12A para inducir la lisis de celulas tumorales mediada por celulas T de pacientes con AML.
En el ejemplo 1 se demostro que un Acbe CD3XCLEC12A puede inducir la muerte de celulas HL60 positivas para CLEC12A por celulas T en reposo de donantes sanos. A continuacion, se investigo la capacidad del Acbe CD3XCLEC12A de inducir la activacion espedfica de diana de celulas T de pacientes con AML y su capacidad de inducir la muerte de celulas HL60 mediada por celulas T de pacientes con AML.
Las celulas T se aislaron a partir de sangre periferica congelada de pacientes con AML (clasificacion de AML FAB AML-M1/M2, M4 o M5) en remision clfnica con el uso del kit de aislamiento de celulas pan T como se describio en el ejemplo 11. Las celulas T en reposo derivadas de pacientes con AML purificadas se incubaron posteriormente con
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celulas HL60 etiquetadas con CSFE en medio complementado con HS normal al 10 % a una relacion de celulas efectoras: dianas de 5:1 durante dos d^as, en presencia de PBS, Ac control de isotipo con WT-Fc, CD3xCLEC12A con DM-Fc, CD3xisotipo con DM-Fc, y Ac contra CD3 con WT-Fc de control positivo (todos los anticuerpos a concentracion de 1 pg/ml). Despues de dos dfas de cultivo conjunto, la activacion de celulas T se determino mediante analisis de citometna de flujo para CD3, CD4, y CD25. Estos resultados se expresaron como porcentaje de celulas CD25+ por celulas T CD4+. Por otra parte, las celulas HL60 positivas para CFSE sobrevivientes se cuantificaron por citometna de flujo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis espedfica con relacion a IgG.
Estos datos demuestran que la activacion espedfica de antfgeno de celulas T de donantes sanos y pacientes con AML mediada por Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc fue comparable (Figura 10A). Como se esperaba el Acbe CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc no indujo la activacion de celulas T derivadas de donantes sanos ni de celulas T de pacientes con aMl. Se demostro que la lisis de celulas HL60 mediada por Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc por celulas T derivadas de pacientes con AML (68 % de lisis de celulas HL60) era comparable a la provocada por celulas T de donantes sanos (69 % de lisis de celulas HL60, Figura 10B). Como se esperaba, el Acbe CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc no indujo la muerte de celulas HL60, ni por celulas T de pacientes con AML ni por celulas T de donantes sanos. Por lo tanto, la molecula biespedfica CD3xCLEC12A es un inductor potente de la lisis de celulas tumorales mediada por celulas T, independientemente de si estas celulas T se derivan de pacientes con AML o de donantes sanos.
Dado que se demostro que Acbe CD3XCLEC12A tiene la capacidad de inducir la lisis potente de celulas tumorales HL60 por celulas T de pacientes con AML, posteriormente se evaluo la capacidad del Acbe CD3XCLEC12A de producir la activacion espedfica de diana de celulas T de AML. Ademas, se determino la capacidad del Acbe CD3XCLEC12A de inducir la lisis de blastos de AML primarios positivos para CLEC12A por celulas T autologas derivadas de pacientes con AML. En primer lugar, se descongelaron muestras de medula osea almacenadas por congelacion de pacientes con AML en muestras de diagnostico que contienen >70 % de blastos de AML primarios como se determina por analisis de citometna de flujo, se cultivaron durante toda la noche (O/N) en medio IMDM complementado con FCS al 10 %, GM-CSF a 100 ng/ml, G-CSF a 100 ng/ml, IL-3 a 50 ng/ml, ScF a 25 ng/ml y Flt3L a 20 ng/ml como se describio anteriormente (Norde y otros, 2009). Despues del cultivo O/N, los blastos de AML primarios se fenotipificaron por citometna de flujo en cuanto a la expresion en superficie de CLEC12A, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD33, CD34, CD38, CD45 y CD117 y se etiquetaron con CFSE. Las celulas T en reposo autologas derivadas de pacientes, recolectadas cuando el paciente habfa logrado la remision clmica, se aislaron a partir de la sangre periferica con el uso del kit de aislamiento de celulas pan T como se describio en el ejemplo 11. Posteriormente, los blastos de AML se cultivaron junto con celulas T en reposo autologas a una relacion E:D de 5:1 en medio con HS al 10 % durante dos dfas. Las condiciones probadas inclrnan PBS, Ac control de isotipo con WT- Fc, CD3xCLEC12A con DM-Fc, CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc y Ac contra CD3 con WT-Fc de control positivo (todos los anticuerpos a 1 pg/ml). Despues de dos dfas de cultivo conjunto, la activacion de celulas T se determino por analisis de citometna de flujo para CD3, CD4, CD8, y CD25. Estos resultados se expresaron como porcentaje de celulas CD25+ por celulas T de AML CD4+ o CD8+. La lisis de blastos de AML se determino mediante la cuantificacion de los blastos de AML dobles positivos para CFSE+/CD45bajo sobrevivientes por citometna de flujo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis de blastos espedficos con relacion a IgG.
Estos datos demuestran que el Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc tiene la capacidad de inducir la activacion de celulas T de AML espedficas para los blastos de AML diana de manera comparable al Ac monoclonal contra CD3 con WT-Fc de control positivo (Figura 11A/B). Por otra parte estos datos demuestran que la muerte potente de blastos de AML autologos inducida por Acbe CD3XCLEC12A por celulas T derivadas de pacientes con AML es tan potente como la muerte inducida por el Ac monoclonal contra CD3 con WT-Fc de control positivo (Figura 11C). Como se esperaba, no se indujo o fue minoritaria la muerte de blastos de AML por el Ac CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc, lo que indica que la muerte de blastos de AML observada mediada por el Acbe CD3XCLEC12A es el resultado principalmente de la activacion de celulas T espedfica de antfgeno y la lisis espedfica de celulas tumorales de AML CLEC12A+. En general, este estudio demuestra que el Acbe CD3XCLEC12A puede inducir eficientemente la muerte de celulas tumorales positivas para CLEC12A por celulas T de pacientes con AML.
Ejemplo 14: Efecto del silenciamiento de Fc sobre la liberacion no espedfica de citocinas
En los ejemplos 7 y 8 se demostro que el formato de Acbe IgG1 CD3XCLEC12A con silenciamiento de Fc por ingeniena de CH2/bisagra inferior (DM-Fc) dio lugar a la reduccion de la afinidad por receptores de Fcgamma y suprimio la citotoxicidad no espedfica mediada por receptor de Fc de la lmea celular HL60 derivada de leucemia. A continuacion, se investigo si el formato de Acbe IgG1 con silenciamiento por DM-Fc suprimfa la citotoxicidad no espedfica mediada por receptor de Fc en presencia de celulas circulantes positivas para receptor de Fc tales como celulas NK. En este estudio, las celulas T en reposo autologas derivadas de donantes sanos se redirigieron contra monocitos positivos para CLEC12A en presencia de otras celulas efectoras innatas circulantes positivas para receptor de Fc tales como celulas NK. Para este fin las PBMC se aislaron a partir de sangre periferica heparinizada de donantes sanos mediante centrifugacion por gradiente de densidad y se sembraron en placa a una densidad de 1*10A6 celulas/ml. Las PBMC se cultivaron durante dos dfas en medio con FBS al 10 % en presencia de PBS, Ac
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control de isotipo, Acbe CD3xCLEC12A con WT-Fc, Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc, Acbe CD3xcontrol de isotipo con WT-Fc, Acbe CD3xcontrol de isotipo con DM-Fc o Ac monoclonal contra CD3 con WT-Fc. Despues de dos dfas de cultivo, los monocitos sobrevivientes se cuantificaron por citometna de flujo en base a la expresion de CD14. Los resultados se expresaron como el porcentaje de lisis espedfica con relacion a IgG.
Se demostro que, para el anticuerpo biespedfico CD3xCLEC12A, el silenciamiento de Fc a traves de la presencia de la region DM-Fc solo tuvo un efecto menor sobre la lisis de monocitos (Figura 12). Por el contrario, para el Acbe CD3xcontrol de isotipo, el silenciamiento de Fc a traves de la presencia de la region DM-Fc redujo significativamente la lisis no espedfica de monocitos. Por lo tanto, se llego a la conclusion de que el silenciamiento de Fc en el Acbe CD3XCLEC12A contribuye adicionalmente a la muerte espedfica de diana: el Acbe CD3xCLEC12A con DM-Fc recluta espedficamente celulas T y disminuye la activacion inmunitaria no espedfica mediada por celulas auxiliares que expresan receptor de Fcy normales.
A continuacion, se cuestiono si el silenciamiento de Fc por la mutacion DM en el Acbe CD3XCLEC12A suprime la liberacion de citocinas mediada por receptor de Fc, conocida por su asociacion con el smdrome de liberacion de citocinas (CRS), un evento clmico comun con terapias de anticuerpos provocado por celulas auxiliares. Para este fin el perfil de citocinas en los sobrenadantes del ensayo de muerte de monocitos descrito en la Figura 13 se analizo con el uso del panel de citocinas humanas 10-plex para la plataforma Luminex (Invitrogen, LHC0001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El perfil de las siguientes citocinas humanas se midio en el sobrenadante del dfa 2: GM-CSF, IFN-y, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 y TNF-a. Los resultados mostrados son de concentracion de citocina medida en pg/ml. Los niveles de citocinas GM-CSF, IL-4 e IL-5 estuvieron por debajo del lfmite de deteccion de este ensayo (datos no mostrados).
Los datos demuestran que CD3xCLEC12A y Acbe CD3xcontrol de isotipo, ambos con cola WT-Fc indujeron la liberacion de IL-1p, IL-6, TNF-a, IL-10, IL-2 e IFN-y (Figura 13). Sin embargo, no se encontraron esas citocinas o solo a niveles muy bajos en CD3xCLEC12A y Acbe CD3xcontrol de isotipo cuando portan la cola DM-Fc, con una excepcion para IL-8. Dado que los monocitos son la principal fuente de IL-8, se supone que los altos niveles de IL-8 se liberan de los monocitos lisados y no son un resultado de la liberacion mediada por un FcR espedfico. Se llego a la conclusion de que el silenciamiento de Fc a traves de las mutaciones DM en el formato de Acbe IgG elimina significativamente la liberacion mediada por receptor de Fc de las citocinas IL-1b, IL-6, TNF-a, IL-2 e IFN-y asociadas con CRS. En general, estos datos demuestran que el silenciamiento de Fc por la mutacion DM en la region CH2/bisagra inferior contribuye a la mejora de la eficiencia y el reclutamiento espedfico de celulas efectoras por Acbe CD3xCLEC12A con DM mediante la disminucion de la activacion inmunitaria no espedfica potencial mediada por celulas auxiliares que expresan receptor de Fcy normales y la liberacion de citocinas proinflamatorias asociada.
Ejemplo 15
La union del candidato 3896 como IgG anti-CD3 monoclonal bivalente de longitud completa a CD3 unido a membrana se comparo con el candidato 3056 como IgG anti-CD3 monoclonal bivalente de longitud completa por analisis de FACS con el uso de celulas HPB-ALL que expresan CD3. Una IgG1 humana irrelevante sirvio como IgG control de isotipo. La citometna de flujo se realizo de acuerdo con procedimientos estandares conocidos en la tecnica. Como se muestra en la Figura 14A, la IgG contra CD3 3896 se unio a CD3 de manera dependiente de la dosis en celulas HPB-ALL, al igual que la IgG contra CD3 3056.
A continuacion, se probo la capacidad de la IgG contra CD3 3896 de inducir proliferacion de celulas T en comparacion directa con el anticuerpo contra CD3 OKT3 murino, la IgG contra CD3 3056, y la IgG control de isotipo. Brevemente, los anticuerpos se diluyeron de manera seriada y se inmovilizaron en placas de 96 pocillos. Tras la eliminacion de la IgG no unida, se anadieron celulas T etiquetadas con CFSE y se incubaron a 37 °C. En el dfa 5, el nivel de induccion de la proliferacion de celulas T se analizo por citometna de flujo. Los resultados se expresan como el porcentaje de celulas T viables que muestran al menos una reduccion en dos veces del nivel de expresion de CFSE y se muestran en la Figura 14B. Se demostro que la IgG contra CD3 3896 como anticuerpo monoespedfico bivalente fue menos potente para inducir la proliferacion de celulas T en comparacion con la IgG contra CD3 3056 candidata y el OKT3 murino. Estos datos sugieren que la reduccion del nivel de proliferacion de celulas T inducido por 3896 en comparacion con la IgG contra CD3 3056 refleja la reduccion de la capacidad de union a CD3 analizada por citometna de flujo. Esta diferencia en la union permite elegir un brazo con una afinidad deseada, lo que da lugar a un anticuerpo biespedfico que muestra un equilibrio favorable entre las afinidades de union por CD3 y CLEC12A, de manera que las celulas T y las celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A se acercan eficientemente, y se induce de manera optima la lisis mediada por celulas T de celulas tumorales de AML positivas para CLEC12A.
Para probar la potencia del nuevo brazo anti-CD3 de 3896 frente al brazo anti-CD3 de 3056 en un formato de anticuerpo biespedfico CD3xCLEC12A, el anticuerpo biespedfico 3896xCLEC12A de referencia del ejemplo 4 (candidato 3896x3116) y el anticuerpo biespedfico 3056xCLEC12A de referencia del ejemplo 1 (candidato 3056x3116) se compararon directamente en el ensayo de citotoxicidad en HL60 como se describio anteriormente.
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Los resultados se muestran en la Figura 15. Se observo que el Acbe 3896xCLEC12A de referencia tiene una potencia similar a la del Acbe 3056xCLEC12A de referencia. Por tanto, como ambos anticuerpos biespedficos difieren solamente en su brazo Fab contra CD3 mientras que el brazo Fab contra CLEC12A es el mismo, se llego a la conclusion de que la funcionalidad del brazo Fab contra CD3 de 3896 es similar a la del brazo Fab contra CD3 de 3056 en un Ac biespedfico CD3xCLEC12A. Cabe senalarque a concentraciones mas bajas el candidato 3896x3116 es incluso mejor que el candidato 3056x3116. Esto es favorable dado que proporciona una ventana terapeutica mas grande, como se explico anteriormente en la presente.
Ejemplo 16
En el ejemplo 3, se selecciono un panel de brazos Fab espedficos para CLEC12A a partir de bibliotecas de presentacion en fagos. Todas las moleculas de union a CLEC12A conteman la cadena ligera huVk1-39. Se seleccionaron tres moleculas de union a CLEC12A: Fab de 3918, 4327 y 4331. Estos Fab se expresaron como IgG1 humana de longitud completa: IgG contra CLEC12A 3918, IgG contra CLEC12A 4327 e IgG contra CLEC12A 4331. Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la VH de IgG contra CLEC12A 3918, la VH de IgG contra CLEC12A 4327, la VH de IgG contra CLEC12A 4331 y la VL comun (IGKV1-39; 012) se proporcionan en la Figura 20.
Los anticuerpos contra CLEC12A de longitud completa se probaron en cuanto a su union a CLEC12A expresado por celulas HL60.
La union de IgG contra CLEC12A 3918, IgG contra CLEC12A 4327 e IgG contra CLEC12A 4331 a CLEC12A unido a membrana se comparo con el anticuerpo contra CLEC12A de referencia (3116) por analisis de FACS con el uso de celulas HL60 que expresan CLEC12A. Una IgG1 humana irrelevante sirvio como IgG control de isotipo. La citometna de flujo se realizo de acuerdo con procedimientos estandares conocidos en la tecnica. Como se muestra en la Figura 16, la IgG contra CLEC12A 4327 se unio a CLEC12A se manera similar al anticuerpo contra CLEC12A de referencia. Los otros dos anticuerpos, IgG contra CLEC12A 3918 e IgG contra CLEC12A 4331 tambien demostraron una buena union a CLEC12A dependiente de la dosis en celulas HL60. Su union a CLEC12A pareda algo menor en comparacion con el anticuerpo contra CLEC12A de referencia. En conclusion, los Fab de 3918, 4327 y 4331 son buenos brazos de union a CLEC12A.
Ejemplo 17
Se probo si las moleculas biespedficas que contienen el brazo Fab contra CD3 de 3896 y el brazo Fab contra CLEC12A de 3981, 4327 o 4331 eran funcionales.
Para esto, la secuencia de VH del brazo Fab contra CD3 de 3896 y la region VH del anticuerpo contra CLEC12A de referencia, el Fab contra CLEC12A de 3918, el Fab contra CLEC12a de 4327 o el Fab contra CLEC12A de 4331 se clonaron en vectores de expresion con el uso de metodos conocidos en la tecnica para la produccion de IgG1 biespedfica (Gunasekaran y otros, documento WO2009/089004) junto con la cadena ligera huVK1-39 reordenada para dar lugar a anticuerpos biespedficos; 3896xCLEC12A de referencia, 3896x3918, 3896x4327 y 3896x4331.
Estos anticuerpos biespedficos se probaron en cuanto a su funcionalidad en el ensayo de citotoxicidad en HL60 descrito anteriormente. Las celulas T en reposo de dos donantes sanos (HD1 y HD2) se cultivaron junto con celulas HL60 etiquetadas con CFSE en presencia de varias concentraciones de anticuerpo biespedfico a una relacion E:D 5:1 durante 48 horas en presencia de HS al 10 %. Las celulas HL60 positivas para CFSE sobrevivientes se cuantificaron por citometna de flujo en el dfa 2. Los resultados en la Figura 17 se expresan como el porcentaje de lisis espedfica. Para los dos experimentos individuales con celulas T de donante 1 (HD1; Figura 17 panel superior) y celulas T para el donante 2 (HD2; Figura 17 panel inferior), se demostro que todos los anticuerpos biespedficos eran tan potentes como el anticuerpo biespedfico 3896xCLEC12A de referencia cuando se incuban a alta concentracion.
De hecho, especialmente a concentraciones mas bajas de anticuerpos biespedficos, se observo que los anticuerpos biespedficos 3896x4327 y 3896x4331 eran mas potentes que el anticuerpo biespedfico 3896xCLEC12A de referencia. Por tanto, como estos anticuerpos biespedficos difieren solamente en su brazo Fab contra CLEC12A mientras que el brazo Fab contra CD3 es el mismo, puede llegarse a la conclusion de que la funcionalidad de los brazos Fab contra CLEC12 de 4327 y 4331 es mas potente en comparacion con la del brazo Fab contra CLEC12A de referencia. Sin desear estar ligado a la teona, las diferencias observadas entre el 3896x4327 y 3896x4331 frente a la IgG biespedfica 3896xCLEC12A de referencia puede reflejar una diferencia en la afinidad de union de estos nuevos brazos Fab anti-CLEC12 o estos pudieran dirigirse a un epttopo de CLEC12A diferente que permite un entrecruzamiento mas eficiente de las celulas tumorales con celulas T que expresan CD3.
Ejemplo 18
En el ejemplo 2 se demostro que los Fab contra CLEC12A de 3918 y 4331 competfan por la union a un epttopo en CLEC12A cuando se probaron en ELISA como formato de Fab contra fragmentos Fab del anticuerpo contra
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CLEC12A de referencia. El Fab contra CLEC12A de 4327, sin embargo, no compitio con la IgG contra CLEC12A de referencia por la union en este ensayo (Tabla 2).
En este experimento, se probo si la IgG de longitud completa de la IgG contra CLEC12A 4327 competfa por la union a CLEC12A con el anticuerpo contra CLEC12A de referencia. Brevemente, las celulas HL60 se incubaron previamente con anticuerpo primario a 50 pg/ml en hielo durante 20 minutos. Posteriormente, se anadio un segundo anticuerpo etiquetado con verde Oregon (OG) (Invitrogen, num. de cat. A10476) a 1 pg/ml a las celulas mas el primer anticuerpo (concentracion del primer anticuerpo despues de la adicion de IgG etiquetada con OG -45 pg/ml). Despues de 20 minutos las celulas se lavaron y se analizaron por FACS.
Los resultados se muestran en la Figura 18: se llego a la conclusion de que la IgG contra CLEC12A 4327 y la IgG contra CLEC12A de referencia compiten por la union a CLEC12A. Esto sugiere que ambas IgG se unen a un epftopo estrechamente relacionado en el antfgeno CLEC12A o se unen a epftopos diferentes que no permiten la union simultanea de ambas IgG debido al impedimento esterico.
Ejemplo 19
En ejemplos anteriores se demostro que los brazos Fab contra CLEC12 de 4327, 4331, 3918 asf como de 3116 son buenos aglutinantes de CLEC12A e inductores potentes de la muerte mediada por celulas T en un formato biespedfico CD3xCLEC12A. Hasta el momento, los anticuerpos biespedficos se obteman con el uso de metodos conocidos para conducir la heterodimerizacion de cadenas pesadas de inmunoglobulina (Gunasekaran y otros).
En las solicitudes de Estados Unidos y PCT en tramitacion pendiente (solicitud regular de Estados Unidos num.: 13/866,747 y PCT/NL2013/050294; incorporadas en la presente como referencia) se han descrito metodos y medios para producir anticuerpos biespedficos a partir de una celula individual, de modo que se proporcionan medios que favorecen la formacion de anticuerpos biespedficos respecto a la formacion de anticuerpos monoespedficos. Estos metodos tambien pueden emplearse favorablemente en la presente invencion. Espedficamente, las mutaciones preferidas para producir esencialmente solo moleculas de IgG biespedfica de longitud completa son las sustituciones de aminoacidos L351K y T366K (numeracion de acuerdo con Kabat) en el primer dominio CH3 (la cadena pesada 'variante KK') y las sustituciones de aminoacidos L351D y L368E en el segundo dominio CH3 (la cadena pesada 'variante DE'), o viceversa. Se demostro anteriormente en las solicitudes US 13/866,747 y PCT/NL2013/050294 en tramitacion pendiente que la variante DE y la variante KK se combinan preferentemente para formar heterodfmeros (denominados moleculas biespedficas 'DEKK'). La homodimerizacion de las cadenas pesadas de variante DE (homodfmeros DEDE) o cadenas pesadas de variante KK (homodfmeros KKKK) diffcilmente se produce debido a la fuerte repulsion entre los residuos cargados en la interfase CH3-CH3 entre cadenas pesadas identicas.
Para demostrar que el efecto de moleculas biespedficas CD3xCLEC12A no se ve influido por las mutaciones para heterodimerizacion conocidas (Gunasekaran) o las mutaciones DEKK, las cadenas pesadas de variante De y variante KK se usaron para conducir la heterodimerizacion de las diferentes cadenas pesadas para producir CD3xCLEC12A biespedficas. Ademas se introdujeron las mutaciones dobles de CH2 / bisagra inferior (L235G y G236R; DM) en estas cadenas pesadas de variantes DE y KK. La cola Fc de estas moleculas biespedficas resultantes se refiere como 'DM DEKK'.
Brevemente, las regiones VH de cualquiera de los brazos Fab contra CLEC12 de 3116, 4327 o 4331 se clonaron en vectores de expresion que contienen la cadena pesada de variante DE + DM mientras que la region VH del anticuerpo contra CD3 3056 se clono en un vector de expresion que contiene la cadena pesada de variante KK +
DM (solicitud de Estados Unidos regular num.: 13/866,747 y PCT/NL2013/050294) y estos vectores de expresion, junto con una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera IGKV1-39/IGKJ1 (huVK1-39) humana reordenada, se proporcionaron a una celula huesped de manera que la celula huesped expreso y produjo anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos 3056x3116 DM DEKK, 3056x4327 DM DEKKy 3056x4331 DM DEKK resultantes se probaron posteriormente en cuanto a su potencia en el ensayo de citotoxicidad en HL60 como se describio anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 19: se demostro que todas las variantes aun son capaces de producir la lisis eficiente de celulas tumorales y por lo tanto se llego a la conclusion de que las mutaciones DM y DEKK pueden introducirse en la region Fc del anticuerpo biespedfico CD3xCLEC12A, mientras se mantiene la capacidad de inducir la lisis de celulas tumorales.
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WO2009/157771
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Claims (12)

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    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo IgG biespedfico humano de longitud completa, en donde dicho anticuerpo IgG biespedfico comprende un brazo que reconoce espedficamente CLEC12A y un segundo brazo que reconoce espedficamente CD3, y en donde el brazo que reconoce espedficamente CLEC12A comprende una secuencia variable de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGG STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGT LVTVSS; o una secuencia variable de cadena pesada que consiste en una secuencia que es identica a
    EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGG
    STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYGDEFDYWGQGTL
    VTVSS,
    y en donde ambos brazos comprenden una cadena ligera comun que comprende una secuencia variable de cadena ligera que consiste en una secuencia que es identica a
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP
    SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK.
  2. 2. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo reconoce espedficamente CD3s.
  3. 3. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicho anticuerpo biespedfico es una IgG1 humana.
  4. 4. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el segundo brazo que reconoce espedficamente CD3 comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia SYGMH y una secuencia de CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia IIWYSGSKKNYADSVKG y una secuencia de CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia GTGYNWFDP.
  5. 5. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el segundo brazo que reconoce espedficamente CD3 comprende una secuencia variable de cadena pesada que consiste en la secuencia
    QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGS
    KKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGT
    LVTVSS.
  6. 6. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo IgG biespedfico tiene dominios CH2 y/o bisagra inferior mutados de manera que la interaccion de dicho anticuerpo IgG biespedfico con receptores de Fcy se reduce significativamente.
  7. 7. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde dichos dominios CH2 y/o bisagra inferior mutados comprenden al menos una sustitucion en las posiciones de aminoacidos 235 y/o 236 (numeracion de acuerdo con Kabat).
  8. 8. El anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en donde dichos dominios CH2 y/o bisagra inferior mutados comprenden la sustitucion L235G y/o G236R, preferentemente L235G y G236R.
  9. 9. Un metodo para producir un anticuerpo IgG biespedfico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a partir de una celula individual, en donde dicho anticuerpo IgG biespedfico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfase, dicho metodo comprende proporcionar:
    - una celula que tiene a) una primera secuencia de acido nucleico que codifica dicha cadena pesada de IgG que reconoce espedficamente CLEC12A y que contiene un 1er dominio CH3, y b) una segunda secuencia de acido nucleico que codifica dicha cadena pesada de IgG que reconoce espedficamente CD3, y que contiene un 2do dominio CH3, en donde dicha celula tiene una tercera secuencia de acido nucleico que codifica dicha cadena ligera comun y en donde dichas secuencias de acido nucleico se proporcionan con mutaciones para la combinacion preferencial de dichos 1er y 2do dominios CH3, dicho metodo comprende ademas la etapa de cultivar dicha celula y permitir la expresion de dichas secuencias de acido nucleico y cosechar dicho anticuerpo IgG biespedfico del cultivo.
  10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9 para producir un anticuerpo IgG1 biespedfico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoacidos L351K y T366K (numeracion de acuerdo con Kabat) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoacidos L351D y
    L368E, dicho metodo comprende ademas la etapa de cultivar dicha celula y permitir la expresion de dichas secuencias de acido nucleico y cosechar dicho anticuerpo biespedfico del cultivo.
  11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo IgG biespedfico de cualquiera de las
    5 reivindicaciones 1-8 y un portador farmaceuticamente aceptable.
  12. 12. Un anticuerpo IgG biespedfico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para el uso como un producto farmaceutico en el tratamiento de smdrome mielodisplasico (MDS), leucemia mielogena cronica (CML) o preferentemente leucemia mieloide aguda (AML).
    10
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