ES2649098T3

ES2649098T3 - Anticuerpos de unión a albumina y fragmentos de unión de los mismos

Info

Publication number: ES2649098T3
Application number: ES12801467.7T
Authority: ES
Inventors: Ralph Adams; Pallavi BHATTA; Sam Philip Heywood; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2018-01-10
Anticipated expiration: 2032-11-09
Also published as: JP6411214B2; CN103946237A; US10023631B2; US20140302033A1; MX2014005546A; PT2776466T; CN103946237B; CA2856216C; IL232226B; WO2013068571A1; JP2014534978A; SI2776466T1; CA2856216A1; KR20140093984A; PL2776466T3; NO2839445T3; US20180134774A1; EA201400568A1; HRP20171608T1; AU2012335496B2

Abstract

Un anticuerpo de unión a albúmina sérica o fragmento del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 1 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 3.

Description

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invención puede comprender una traducción de fragmento Fab fusionada (o fusionada químicamente) a una secuencia enlazadora que a su vez está fusionada por traducción (o fusionada químicamente) a una o más regiones variables de unión a albúmina. Preferiblemente, el fragmento Fab es un fragmento Fab que termina en las cisteínas intercadenas, como se describe en el documento WO2005/003169.

5 En la presente invención, cada dominio variable anti-albúmina fusionado a un fragmento Fab o Fab’ puede enlazarse directamente o a través de un enlazador.

Ligado directamente como se emplea en este documento, pretende hacer referencia al hecho que el “último” aminoácido del Fab o Fab’ está unido por un enlace peptídico al “primer” aminoácido del dominio variable único de un anticuerpo de unión a albúmina de la presente invención (o viceversa).

10 Los ejemplos de regiones enlazadoras adecuadas para unir un dominio variable a un Fab o Fab’ incluyen, pero no se limitan a, secuencias enlazadoras flexibles y secuencias enlazadoras rígidas. Las secuencias enlazadoras flexibles incluyen las descritas en Huston et al., 1988, PNAS 85: 5879-5883; Wright y Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44 (11): 2860 -2869; Alfthan et al. Prot. Eng., 1995, 8 (7): 725 -731; Luo et al., J. Biochem., 1995, 118 (4): 825 -831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 (26): 15682 -15686; y Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54 (ver

15 Tabla 1 para ejemplos representativos).

Tabla 1. Secuencias de enlazador flexible

SEQ. ID N°:: SECUENCIA

21: SGGGGSE

22: DKTHTS

23: (S)GGGGS

24: (S)GGGGSGGGGS

25: (S)GGGGSGGGGSGGGGS

26: (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

27: (S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

28: AAAGSG-GASAS

29: AAAGSG-XGGGS-GASAS

30: AAAGSG-XGGGSXGGGS -GASAS

31: AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGS -GASAS

32: AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS

33: AAAGSG-XS-GASAS

34: PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY

35: ATTTGSSPGPT

36: ATTTGS

-: GS

37: EPSGPISTINSPPSKESHKSP

38: GTVAAPSVFIFPPSD

39: GGGGIAPSMVGGGGS

40: GGGGKVEGAGGGGGS

41: GGGGSMKSHDGGGGS

42: GGGGNLITIVGGGGS

43: GGGGVVPSLPGGGGS

44: GGEKSIPGGGGS

45: RPLSYRPPFPFGFPSVRP

46: YPRSIYIRRRHPSPSLTT

47: TPSHLSHILPSFGLPTFN

48: RPVSPFTFPRLSNSWLPA

49: SPAAHFPRSIPRPGPIRT

50: APGPSAPSHRSLPSRAFG

51: PRNSIHFLHPLLVAPLGA

52: MPSLSGVLQVRYLSPPDL

53: SPQYPSPLTLTLPPHPSL

54: NPSLNPPSYLHRAPSRIS

55: LPWRTSLLPSLPLRRRP

56: PPLFAKGPVGLLSRSFPP

57: VPPAPVVSLRSAHARPPY

58: LRPTPPRVRSYTCCPTP

59: PNVAHVLPLLTVPWDNLR

60: CNPLLPLCARSPAVRTFP

(S) es opcional en las secuencias 23 a 27

Los ejemplos de enlazadores rígidos incluyen las secuencias peptídicas GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO: 61), PPPP (SEQ ID NO: 62) y PPP.

En una realización, se usa una secuencia de la región bisagra de anticuerpo o parte de la misma como un

5 enlazador, por ejemplo, la secuencia bisagra superior. Típicamente, los fragmentos Fab’ de anticuerpo para uso en la presente invención poseen una región bisagra nativa o modificada. Dichas regiones bisagra se usan como un enlazador natural para el resto del dominio variable de unión a albúmina. La región bisagra nativa es la región bisagra normalmente asociada con el dominio CH1 de la molécula de anticuerpo. Una región bisagra modificada es cualquier bisagra que difiere en longitud y/o composición de la región bisagra nativa. Dichas bisagras pueden incluir

10 regiones articuladas de cualquier otra especie, tales como regiones bisagra humanas, de ratón, de rata, de conejo, de hámster, de camello, de llama o de cabra. Otras regiones bisagra modificadas pueden comprender una región bisagra completa derivada de un anticuerpo de una clase o subclase diferente de la del dominio CH1. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio de CH1 de clase γ1 se puede unir a una región bisagra de clase γ4. Alternativamente, la región bisagra modificada puede comprender parte de una bisagra natural o una unidad repetitiva en la que cada

15 unidad en la repetición se deriva de una región bisagra natural. En una alternativa adicional, la región bisagra natural se puede alterar convirtiendo uno o más residuos de cisteína u otros en residuos neutros, tales como alanina, o convirtiendo restos colocados adecuadamente en residuos de cisteína. De este modo, el número de residuos de cisteína en la región bisagra puede aumentarse o reducirse. Además, se pueden controlar otras características de la bisagra, como la distancia de la(s) cisteína(s) de bisagra de la cadena ligera a la cisteína intercadena, la distancia

20 entre las cisteínas de la bisagra y la composición de otros aminoácidos en la bisagra que pueden afectar propiedades de la bisagra como la flexibilidad, por ejemplo, las glicinas pueden incorporarse en la bisagra para aumentar la flexibilidad de rotación o pueden incorporarse prolinas para reducir la flexibilidad. Alternativamente, se pueden incorporar combinaciones de residuos cargados o hidrófobos en la bisagra para conferir propiedades de multimerización, véase, por ejemplo, Richter et al., 2001, Prot. Eng. 14 (10): 775-783 para el uso de colas cargadas

25 o iónicas, por ejemplo, colas ácidas como enlazadores y Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 5 (1): 1547-1553 para secuencias de cremallera de leucina. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser completamente sintéticas y pueden diseñarse para que posean propiedades deseadas tales como longitud, composición y flexibilidad.

Se han descrito ya varias regiones de bisagra modificadas, por ejemplo, en los documentos US 5,677,425, US

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6,642,356, WO9915549, WO2005003170, WO2005003169, WO2005003170, WO9825971 y WO2005003171. Dichas bisagras generalmente siguen desde la región CH1, pero también pueden incorporarse en el extremo de la región constante de un fragmento kappa o lambda de cadena ligera; ver la Tabla 3 para ejemplos.

Tabla 3. Secuencias de enlazador de bisagra

SEQ ID NO:: SECUENCIA

63: DKTHTCAA

64: DKTHTCPPCPA

65: DKTHTCPPCPATCPPCPA

66: DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA

67: DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY

68: DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

69: DKTHTCCVECPPCPA

70: DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA

71: DKTHTCPSCPA

Los dominios variables de anticuerpos de la presente invención son un par complementario VH/VL que se unen al antígeno cooperativamente, es decir, son un par complementario VH/VL que tienen la misma especificidad de unión. De hecho, son un par VH/VL derivado del mismo anticuerpo.

En una realización, el dominio VH se fusiona con el extremo C de la región constante de la cadena pesada (CH1) y el dominio VL se fusiona con el extremo C de la región constante de la cadena ligera (C kappa o C lambda).

En una realización, VH y VL están unidos por un enlace disulfuro que se cree que proporciona estabilización adicional a la construcción, lo que puede ser ventajoso.

En una o más realizaciones, el enlace disulfuro entre las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, por ejemplo, en un Fab, tal como entre el dominio CH y el dominio CL o CK no está presente, por ejemplo, porque una o más cisteínas que forman el enlace se reemplazan. Dicha una o más cisteínas pueden reemplazarse, por ejemplo, con serina.

En una o más realizaciones, está presente un enlace disulfuro intercadena entre las cadenas pesada y ligera entre el dominio CH y el dominio CL o CK.

En un ejemplo, la presente invención proporciona una proteína de fusión de anticuerpo biespecífica que comprende:

una cadena pesada que comprende, en secuencia del N-terminal, un primer dominio variable de cadena pesada (VH1), un dominio CH1 y un segundo dominio variable de cadena pesada (VH2),

una cadena ligera que comprende, en secuencia del N-terminal, un primer dominio variable de cadena ligera (VL1), un dominio CL y un segundo dominio variable de cadena ligera (VL2),

donde dichas cadenas pesada y ligera están alineadas de modo que VH1 y VL1 forman un primer sitio de unión a antígeno y VH2 y VL2 forman un segundo sitio de unión a antígeno,

donde el antígeno unido por el segundo sitio de unión a antígeno es albúmina de suero humano y en el segundo dominio variable de cadena pesada (VH2) tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:1 y el segundo dominio variable de cadena ligera (VL2) tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 3.

En una realización, las regiones variables de cadena pesada y ligera de unión a albúmina están unidas mediante un enlace disulfuro. Por consiguiente, en un ejemplo, la presente invención proporciona una proteína de fusión de anticuerpo biespecífica que comprende:

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donde dichas cadenas pesada y ligera están alineadas de manera que VH1 y VL1 forman un primer sitio de unión a antígeno y VH2 y VL2 forman un segundo sitio de unión a antígeno,

donde el antígeno unido por el segundo sitio de unión a antígeno es albúmina de suero humano,

donde el segundo dominio variable de cadena pesada (VH2) tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 y el segundo dominio variable de cadena ligera (VL2) tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 4 y

el segundo dominio variable de cadena pesada (VH2) y el segundo dominio variable de cadena ligera (VL2) están unidos por un enlace disulfuro.

En un ejemplo, la presente invención proporciona una proteína de fusión de anticuerpos multiespecífica que comprende:

una cadena pesada que comprende, en secuencia desde el N-terminal, un primer dominio variable de cadena pesada (VH1), un dominio CH1, un segundo dominio variable de cadena pesada (VH2) y un tercer dominio variable de cadena pesada (VH3),

una cadena ligera que comprende, en secuencia del N-terminal, un primer dominio variable de cadena ligera (VL1), un dominio CL, un segundo dominio variable de cadena ligera (VL2 ) y un tercer dominio variable de cadena ligera (VL3),

donde dichas cadenas pesada y ligera están alineadas de manera que VH1 y VL1 forman un primer sitio de unión a antígeno y VH2 y VL2 forman un segundo sitio de unión a antígeno y VH3 y VL3 forman un tercer sitio de unión a antígeno,

donde el antígeno unido por el segundo o tercer sitio de unión a antígeno es albúmina de suero humano y donde el segundo o tercer dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y el segundo o tercer dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

Se apreciará que puede haber enlazadores entre uno o más de los dominios enumerados anteriormente. En particular, puede haber un enlazador entre CL y VL2 y CH1 y VH2 y, cuando está presente, un enlazador entre VL2 y VL3 y VH2 y VH3. Los enlazadores adecuados ya se han descrito anteriormente en la presente. En la figura 2 (e) y (f), SEQ ID NOs 5 y 6, se proporcionan enlazadores adicionales.

En una realización, el anticuerpo es un scFv. En una realización, el anticuerpo es un scFv en el que los dominios variables (VH y VL) están unidos por el enlazador proporcionado en SEQ ID NO: 17.

Los dominios variables de anticuerpos de la presente invención se unen a albúmina con una afinidad de unión suficiente para extender la vida media del conjugado, tal como Fab o Fab’ in vivo. Se ha informado que una afinidad para la albúmina menor o igual a afinidad de 2.5 µM extenderá la vida media in vivo (Nguyen, A. et al (2006) Protein Engineering, Design & Selection, 19 (7), 291-297). En un ejemplo, el par de anticuerpos de dominio variable de la presente invención tiene una alta afinidad de unión, por ejemplo, 3 nM nanomolar. En un ejemplo, los anticuerpos de dominio único tienen una afinidad de unión por antígeno que es nanomolar o micromolar. La afinidad puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye resonancia plasmónica de superficie usando albúmina de suero natural o recombinante.

Preferiblemente, el anticuerpo de unión a albúmina de la presente invención tiene una afinidad de unión por albúmina de suero humano de aproximadamente 1 µM o mejor. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 500 M o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 200 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 50 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 20 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 10 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 5 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 2 nM o menos. En una realización, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de aproximadamente 1 nM o menos. Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos proporcionados por la presente invención se puede alterar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La presente invención, por lo tanto, también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada por la albúmina. Dichas variantes se pueden obtener mediante varios protocolos de maduración de afinidad que incluyen mutar las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), mezcla de ADN (Patten et al., Curr. Opin Biotechnol., 8, 724 -733, 1997), expresión en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77 -88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288 -291, 1998). Vaughan et al. (supra) discute estos métodos de maduración de afinidad.

La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica un anticuerpo de unión a

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albúmina o proteína de fusión de la presente invención. Las secuencias de ADN de la presente invención pueden comprender ADN sintético, por ejemplo, producido por procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.

Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión de anticuerpo de doble especificidad de la presente invención se pueden obtener por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de los fragmentos de anticuerpo, enlazadores y/o dAbs pueden sintetizarse según se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las secuencias de aminoácidos correspondientes.

Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican la proteína de fusión de anticuerpo de doble especificidad de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. La mutagénesis dirigida al sitio y las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden usar según corresponda.

La presente invención se refiere además a un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican una proteína de fusión de anticuerpo de doble especificidad de la presente invención. En una realización preferida, el vector de clonación o expresión comprende una única secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión de anticuerpo de doble especificidad completa. Por lo tanto, el vector de clonación o expresión comprende unidades de transcripción codificadas por ADN en secuencia de manera que se produce una proteína de fusión de traducción.

De hecho, los expertos en la técnica entenderán que una proteína de fusión de la invención puede tener el dominio variable de unión a la albúmina en el extremo N o el extremo C y, por lo tanto, la unidad de transcripción codificada de ADN de unión a la albúmina será el primero o el último, respectivamente, dentro de la secuencia de ADN que codifica la fusión de traducción. Por lo tanto, una fusión de traducción puede comprender un dominio variable Nterminal y un Fab o Fab’ C-terminal. Además, una fusión de traducción puede comprender un Fab o Fab’ N-terminal y un dominio variable de unión a albúmina C-terminal.

Se apreciará que la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de la misma se pueden incorporar en el mismo vector o vectores diferentes. En una realización, un vector puede comprender una fusión de traducción que comprende una cadena pesada y otro vector puede comprender una fusión de traducción que comprende una cadena ligera.

El código de ADN para un fragmento de anticuerpo comprendido dentro de una fusión de traducción de la invención puede incorporarse en un vector como unidad de transcripción en configuraciones conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, una unidad de transcripción puede comprender un código para la cadena ligera seguida por el código de cadena pesada, o viceversa; ver, en particular, Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26: 309-320.

Preferiblemente, un vector de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia líder apropiada, tal como una secuencia líder de anticuerpo. Dichas secuencias líder son bien conocidas en la técnica.

Los métodos generales por los que pueden construirse los vectores, los métodos de transfección y transformación y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican una proteína de fusión de anticuerpo de doble especificidad de la presente invención. Se puede usar cualquier sistema de célula huésped/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la proteína de fusión de anticuerpo de doble especificidad. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos o eucariotas, por ejemplo, mamíferos, también pueden usarse sistemas de expresión de células del huésped. Las células huésped adecuadas de mamífero incluyen células NS0, CHO, mieloma o hibridoma. Por consiguiente, en una realización, la proteína de fusión de la presente invención se expresa en E. coli. En otra realización, la proteína de fusión de la presente invención se expresa en células de mamífero.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de un anticuerpo de unión a albúmina o proteína de fusión que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de proteína a partir de la secuencia de ADN que codifica dicho anticuerpo de unión a albúmina. La invención proporciona además métodos para aislar el anticuerpo de unión a albúmina.

En la producción, un anticuerpo de unión a albúmina de la presente invención se puede purificar, cuando sea necesario, usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, pero sin limitación, se pueden usar técnicas cromatográficas tales como intercambio iónico, exclusión de tamaño, proteína G o cromatografía de interacción hidrofóbica.

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Lista de Figuras:

Figura 1A: Representación diagramática de un Fab-Fv

Figura 1B: Representación diagramática de un Fab-dsFv

Figuras 2 a 5: Secuencias de la presente invención

Figura 6: Muestra el enlace de AlexaFluor 488 marcado A26 Fab-dsFv con células T CD4+OX40+ humanas activadas

Figura 7: Muestra μg/ml de constructos de anticuerpos producidos por expresión transitoria en células HEK293

Figura 8: Muestra SDS-PAGE de Fab disulfuro estabilizado scFv.

Figura 9: Muestra datos tabulados relacionados con la afinidad de unión a la albúmina sérica humana de diversos constructos

Figura 10: Muestra datos tabulados del antígeno Fab de unión de afinidad de diversos constructos

Figura 11: Muestra μg/ml de constructos de anticuerpos producidos por expresión transitoria en células CHO

Figura 12: Muestra el análisis SDS-PAGE de diversos constructos

Figura 13: Muestra datos de termoestabilidad para diversos constructos expresados en células CHO.

Manipulación de ADN y métodos generales

Se usaron cepas de E. coli competentes para transformación y cultivo de crecimiento de rutina. Las enzimas de restricción y modificación de ADN se obtuvieron de Roche Diagnostics Ltd. y New England Biolabs. Las preparaciones de plásmido se realizaron usando kits de purificación Maxi Plasmid (QIAGEN, catálogo Nº 12165). Las reacciones de secuenciación de ADN se realizaron usando el kit de secuenciación terminador ABI Prism Big Dye (catálogo Nº 4304149) y se procesaron en un secuenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems). Los datos fueron analizados utilizando el programa Sequencher (Genecodes). Los oligonucleótidos se obtuvieron de Sigma o Invitrogen. Los genes que codifican las secuencias de la región V inicial se construyeron mediante un enfoque de síntesis automatizado por DNA2.0, y se modificaron para generar las versiones injertadas mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. La concentración de Fab-Fv se determinó mediante un método de HPLC basado en Proteína-G.

Ejemplo 1

Generación y análisis de diferentes injertos de humanización de 645 en A26 Fab-645dsFv

Hemos descrito previamente el formato del anticuerpo Fab-dsFv (Figura 1B) y un anticuerpo anti-albúmina humanizado conocido como “645gH1gL1” en WO2010/035012. También hemos descrito previamente la generación de un anticuerpo anti-OX40 antagonista humanizado conocido como “A26” en WO2010096418. Aquí describimos la generación de un nuevo injerto humanizado mejorado de anticuerpo ‘645’ conocido como 645dsgH5gL4 y la generación de una molécula de anticuerpo Fab-dsFv que incorpora ese injerto en el componente Fv y las regiones variables ‘A26’ en el componente Fab.

Las secuencias de 645gH1 y gL1 se dan en la Figura 3 (a) y (b), SEQ ID NOs 9 y 10.

Construcción de plásmidos A26 Fab-645dsFv (gH1gL1) y A26 Fab-645dsFv (gH5gL4).

La región codificante total de la cadena ligera A26 Fab-645dsFv (gL1) (SEQ ID NO: 12) se clonó en un vector de expresión de mamífero UCB bajo el control del promotor HCMV-MIE y la secuencia SV40E poliA. La región variable de la cadena ligera de 645dsFv (gL1) (SEQ ID NO: 10) se mutó a 645dsFv (gL4) (SEQ ID NO: 4) mediante un método de PCR solapante. La región codificante total de la cadena pesada A26 Fab-645dsFv (gH1) (SEQ ID NO: 11) se clonó en un vector de expresión de mamífero UCB bajo el control del promotor HCMV-MIE y la secuencia SV40E poliA. La región variable de la cadena pesada de 645dsFv (gH1) (SEQ ID NO: 9) se mutó a 645dsFv (gH5) (SEQ ID NO: 2) mediante un método de PCR solapante. Los constructos se verificaron por secuenciación.

Expresión de células de mamífero de A26 Fab-645dsFv (gH1gL1) y A26 Fab-645dsFv (gH5gL4)

Se transfectaron células HEK293 con los plásmidos de cadena pesada y ligera usando el reactivo de transfección 293fectina de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron plásmido de cadena pesada de 25 µg y plásmido de cadena ligera de 25 µg con 100 µl de 293fectina y 1700 µl de medio Optipro durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se añadió entonces a 50x106 células HEK293 en 50 ml de suspensión y se incubó durante 6 días con agitación a 37°C. Después de 6 días, el sobrenadante se recogió

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mediante centrifugación a 1500xg durante 10 minutos para eliminar las células y luego se filtró estérilmente a 0.22 µm.

Purificación con proteína G de A26 Fab-645dsFv (gH1gL1) y A26 Fab-645dsFv (gH5gL4)

Los ~50 ml de sobrenadantes filtrados de 0.22 µm se concentraron a ~2 ml usando concentradores Amicon Ultra-15 con una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa y centrifugación a 4000xg en un rotor oscilante. Se aplicaron 1.8 ml de sobrenadante concentrado a 1 ml/min a una columna de 1 ml de Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 40 mM, pH7.4. La columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCl 40 mM pH7.4 y el material unido se eluyó con glicina/HCl 0.1 M, pH2.7. El pico de elución se recogió y el pH se ajustó a ~ pH7 con Tris/HCl 2M pH 8.5. La elución ajustada al pH se concentró y se diafiltró en fosfato 20mM, NaCl 150 mM pH7,4 usando concentradores Amicon Ultra-15 con una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa y centrifugación a 4000xg en un rotor oscilante, hasta un volumen final de ~0,3 ml.

Análisis de exclusión de tamaño A26 Fab-645dsFv (gH1gL1) y A26 Fab-645dsFv (gH5gL4)

Las muestras purificadas de proteína G se analizaron por HPLC de exclusión por tamaño. Las muestras se separaron en una columna Superdex 200 10/300 GL Tricorn (GE Healthcare) desarrollada con un gradiente isocrático de PBS pH7.4 a 1 ml/min. La detección del pico se realizó a 280 nm y se calculó el peso molecular aparente por comparación con una curva estándar de proteínas de peso molecular conocidas frente al volumen de elución. El cambio del injerto de humanización de 645dsFv de gH1gL1 a gH5gL4 dio como resultado un aumento en el porcentaje de monómero del A26 Fab-645dsFv expresado de 59% a 71%, un aumento del 12%, sin ningún cambio en la estabilidad térmica de la dsFv (datos no mostrados) o en la afinidad de unión del dsFv a HSA (datos no mostrados).

Ejemplo 2

2.1 Cinética BIAcore para A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) que se une a OX40

En este y en todos los ejemplos posteriores, el A26 Fab-dsFv 645gH5gL4 tenía la secuencia de cadena pesada dada en SEC ID NO: 7 (Figura 2 (g)) y la secuencia de cadena ligera dada en SEC ID NO: 8 (Figura 2 (h)) es decir, la cadena pesada contenía el enlazador G4S, G4T, G4S dado en la SEQ ID NO: 5, figura 2 (e).

BIA (análisis de interacción biamolecular) se realizó con BIAcore T200 (GE Healthcare). Affinipure F(ab’)2 Fragmento anti-IgG humana de cabra, fragmento F (ab’)2 específico (Jackson ImmunoResearch) se inmovilizó en un chip sensor CM5 mediante química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ≈5000 unidades de respuesta (RUs). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, tensoactivo P20 0.05%, GE Healthcare) como tampón de funcionamiento con un flujo de 10 µL/min. Se usó una inyección de 10 µL de A26 Fab’ a 0.5ug/ml o A26 Fab-dsFv a 1 µg/ml para la captura por la IgG-F (ab’)2 antihumana inmovilizada. El OX40 humano se tituló sobre el A26 capturado a diversas concentraciones (de 25 nM a 1,5625 nM) a un caudal de 30 µl/min. La superficie se regeneró mediante una inyección de 2 x 10 µL de HCl 50 mM, seguido de una inyección de 5 µL de NaOH 5 mM a un caudal de 10 µL/min. Las curvas de unión de sustracción de fondo se analizaron usando el software T200evaluation (versión 1.0) siguiendo procedimientos estándar. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de ajuste.

Muestra: ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) KD (pM)

Fab’: 2.18 ± 0.38 E+05 1.00 E-05 4.68 E-11 46.8

Fab-Fv: 2.55 + 0.35 E+05 1.04 E-05 4.12 E-11 41.2

Promedio de 4 determinaciones

2.2. Cinética BIAcore para A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) que se une a la albúmina.

Se realizó BIA (análisis de interacción biamolecular) usando un BIAcore T200 (GE Healthcare). Affinipure F (ab’)2 Fragmento anti-IgG humana de cabra, fragmento F(ab’)2 específico (Jackson ImmunoResearch) se inmovilizó en un chip sensor CM5 mediante química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ≈5000 unidades de respuesta (RUs). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, tensoactivo P20 0.05%, GE Healthcare) como tampón de funcionamiento con un caudal de 10 µL/min. Se usó una inyección de 10 µL de Fab-Fv a 0.75 µg/mL para la captura por la IgG-F (ab’)2 antihumana inmovilizada. La albúmina sérica humana (HSA), la albúmina sérica de ratón (MSA) y la albúmina sérica Cynomolgus (CSA) se titularon sobre el Fab-Fv capturado a diversas concentraciones (50 nM a 6.25 nM) a un caudal de 30 µL/min. La superficie se regeneró mediante una inyección de 2 x 10 µL de HCl 50 mM, seguido de una inyección de 5 µL de NaOH 5 mM a un caudal de 10 µL/min. Las curvas de unión de sustracción de fondo se analizaron usando el software T200evaluation (versión 1.0) siguiendo procedimientos estándar. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de

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La tasa de asociación de anticuerpo con receptor = Kon x [Receptor libre] x [Anticuerpo libre]

La tasa de disociación del complejo receptor-anticuerpo = koff x [Receptor-Anticuerpo]

En equilibrio, las velocidades de asociación y disociación son iguales y se puede derivar una ecuación que describe la isoterma de unión; en un diagrama semilogarítmico, la unión es sigmoidal. La KD se define por koff/kon y se puede calcular a partir de la curva de unión como la concentración a la que se produce la unión semimáxima.

La unión del A26 Fab-Fv marcado con AlexaFluor488 a las células T CD4+OX40+ humanas activadas se midió por citometría de flujo en un intervalo de concentración de 5 log.

En la Figura 4 se muestra una curva de unión representativa para A26 Fab-Fv.

El valor medio de KD obtenido en células activadas de 5 donantes diferentes es 145 pM.

Ejemplo 3 Expresión de 645gL4gH5 como scFv

Construcción de plásmidos

Los scFv se expresaron a partir de uno de dos plásmidos de expresión de mamífero modificados por UCB estrechamente relacionados; pVKΔPvuII se usó para clonación y expresión de scFv en la orientación HL, mientras que pKHΔEcoRV se usó para clonación y expresión de scFv en la orientación de LH. Todos los scFv se diseñaron para contener un péptido enlazador de 20 aminoácidos, (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 17) y un marcador 10xHis Cterminal. Los plásmidos aceptores scFv 362HL y 240LH codifican sitios de restricción únicos en los bordes FW1-FW4 de vH (PvuII y XhoI) y vL (EcoRV y BsiWI) que permiten la clonación de restricción de las regiones variables scFv subsiguientes en una ligación en dos etapas. Los genes que codifican 645gH5 vH y 645gL4 vL se sintetizaron mediante DNA2.0, con oscilaciones de cisteína en las posiciones de Kabat vH44 y vL100 para la generación de scFv estabilizado con disulfuro (ds). Estos genes de la región V se clonaron en plásmidos scFv aceptores usando PvuII y XhoI (vH) o EcoRV y BsiWI (vL) y se verificó la ligación con éxito mediante secuenciación de ADN.

Expresión y Purificación

Se transfectaron células HEK293F (cultivos de 50 ml a 106 células/ml) con 50 mg de ADN plásmido y se cultivaron a 37ºC en medios FreeStyle™. Los sobrenadantes se recogieron 6 días después de la transfección y scFv se purificaron mediante purificación discontinua de Ni2 + -NTA. La proteína purificada se concentró y se cambió el tampón en PBS para la posterior caracterización biofísica.

Ensayo de termoestabilidad

Se realizó un ensayo de termoflúor para evaluar las estabilidades térmicas de las moléculas purificadas. Las proteínas purificadas (0.1 mg/ml) se mezclaron con colorante SYPRO® Orange (Invitrogen), y la mezcla se dispensó por cuadruplicado en una placa de pocillos ópticos de PCR 384. Las muestras se analizaron en un sistema de PCR rápido en tiempo real 7900HT (Agilent Technologies) en un rango de temperatura de 20°C a 99°C, con una velocidad de aumento de 1.1 °C/min. Los cambios de intensidad de fluorescencia por pocillo se representaron frente a la temperatura y los puntos de inflexión de las pendientes resultantes se usaron para generar la Tm.

HPLC de exclusión de tamaño

Se analizaron proteínas purificadas (10 µg y 50 µg) por HPLC de exclusión por tamaño en una Columna Tricorne Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Se usó un gradiente isocrático de PBS pH7.4 a un caudal de 1 ml/min, con detección UV a 214 nm y 280 nm.

Resumen de resultados

645gH5gL4 HLds dio 97% de monómero y una Tm en °C de 75.6.

645gH5gL4 HL dio 86% de monómero y una Tm en °C de 75.6.

Ejemplo 4

Construcción de las fusiones FabA-dsscFv

Plásmidos para la expresión en células de mamíferos.

Se construyó una cadena única de Fv (scFv) uniendo los dominios de la región variable de cadena ligera y pesada de un anticuerpo de unión a albúmina de suero humano (SEQ ID: 1 y 3 o 2 y 4) a través de un enlazador flexible (SEQ ID: 17) en la orientación HL. Las mutaciones puntuales se introdujeron en las secuencias de ADN en residuos seleccionados en la región marco tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de Fv. Las mutaciones se introdujeron para crear un enlace disulfuro intercadena entre las cadenas pesada y ligera de Fv, la cadena pesada G44C y la cadena ligera G100C para formar un scFv unido por disulfuro (dsscFv). Las proteínas de fusión FabA

Claims

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