ES2535419T3

ES2535419T3 - Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente

Info

Publication number: ES2535419T3
Application number: ES08867007.0T
Authority: ES
Inventors: Ian Maclachlan; Adam Judge
Original assignee: Protiva Biotherapeutics Inc
Current assignee: Protiva Biotherapeutics Inc
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2015-05-11
Anticipated expiration: 2028-12-23
Also published as: AU2008342535B2; EP2238251A1; EP2238251B1; AU2008342535A1; CA2710713A1; JP2011507534A; US20090291131A1; CA2710713C; US20160115483A1; US9006191B2; EP2238251A4; WO2009082817A1; JP5697988B2

Abstract

Una molécula modificada de ARNip para silenciar la expresión quinasa 1 tipo polo (PLK-1), en la que la molécula modificada de ARNip comprende una hebra con sentido que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 400, una hebra antisentido complementaria, y una región bicatenaria de al menos 15 nucleótidos de longitud, y en la que la hebra antisentido comprende uno o más nucleótidos modificados en la región bicatenaria seleccionados entre el grupo que consiste en nucleótidos de 2'OMe-guanosina, nucleótidos de 2'OMe-uridina, y mezclas de los mismos.

Description

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realización, el colesterol o derivado de colesterol comprende de aproximadamente el 30% en mol a aproximadamente el 40% en mol del lípido total presente en la partícula. En otra realización descrita en este documento, el lípido no catiónico comprende un fosfolípido. En otra realización más, el lípido no catiónico comprende una mezcla de un fosfolípido y colesterol o un derivado de colesterol.

Los fosfolípidos adecuados para su uso en las realizaciones de SNALP descritas en este documento incluyen, aunque sin limitación, DPPC, DSPC, DOPE, POPC, POPE, POPG, DPPE, DMPE, DSPE, monometilfosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, DEPE, SOPE, EPC, y una mezcla de los mismos. Cuando el lípido no catiónico es una mezcla de un fosfolípido y colesterol o un derivado de colesterol, el fosfolípido comprende de aproximadamente el 4% en mol a aproximadamente el 10% en mol del lípido total presente en la partícula, y el colesterol o derivado de colesterol comprende de aproximadamente el 30% en mol a aproximadamente el 40% en mol del lípido total presente en la partícula. Si se usa un derivado de colesterol, el derivado de colesterol incluye, aunque sin limitación, colestanol, colestanona, colestenona, coprostanol, colesteril-2'-hidroxietil éter, y colesteril-4'hidroxibutil éter. En una realización preferida descrita en este documento, el fosfolípido comprende DPPC.

Los SNALP de las realizaciones descritas en este documento también comprenden un lípido conjugado que inhibe la agregación de las partículas. Ejemplos de lípidos conjugados adecuados incluyen, aunque sin limitación, un conjugado de PEG-lípido, un conjugado de poliamida (ATTA)-lípido, un conjugado de polímero catiónico-lípido (CPL), o mezclas de los mismos. En una realización preferida descrita en este documento, las partículas de ácido nucleico-lípido comprenden un conjugado de PEG-lípido o un conjugado de ATTA-lípido. En ciertas realizaciones descritas en este documento, el conjugado de PEG-lípido o el conjugado de ATTA-lípido se usa junto con un CPL. En una realización preferida descrita en este documento, el lípido conjugado es un PEG-lípido.

Ejemplos de PEG-lípidos adecuados incluyen, aunque sin limitación, un PEG-DAG, un PEG-DAA, un PEGfosfolípido, un PEG-ceramida (Cer), o mezclas de los mismos. En una realización preferida, el PEG-lípido es un conjugado de PEG-DAA. Ejemplos de conjugados PEG-DAA adecuados incluyen, aunque sin limitación, un PEGdilauriloxipropilo (C12), un PEG-dimiristiloxipropilo (C14), un PEG-dipalmitiloxipropilo (C16), y un PEGdisteariloxipropilo (C18). En una realización preferida, el conjugado de PEG-DAA es PEG-dimiristiloxipropilo (C 14). En otra realización preferida descrita en este documento, el conjugado de PEG-DAA es PEG-disteariloxipropilo (C18). Conjugados adicionales de PEG-lípido incluyen, aunque sin limitación, PEG-C-DOMG, 2KPEG-DMG, y una mezcla de los mismos. El conjugado lípido típicamente comprende de aproximadamente el 0,5% en mol a aproximadamente el 2% en mol del lípido total presente en la partícula.

Típicamente, los SNALP de las realizaciones descritas en este documento tienen una proporción de lípido:ácido nucleico de aproximadamente 1 a aproximadamente 100. En una realización preferida descrita en este documento, estos SNALP tienen una proporción de lípido:ácido nucleico de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, En otra realización preferida descrita en este documento, estos SNALP tienen una proporción lípido:ácido nucleico de aproximadamente 6. Típicamente, estos SNALP tienen un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm. En una realización preferida descrita en este documento, estos SNALP tienen un diámetro medio de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm.

En una realización específica descrita en este documento, el SNALP comprende: (a) uno o más ARNip no modificados y/o modificados que silencian la expresión de PLK-1; (b) un lípido catiónico que comprende de aproximadamente el 56,5% en mol a aproximadamente el 66,5% en mol del lípido total presente en la partícula; (c) un lípido no catiónico que comprende de aproximadamente el 31,5% en mol a aproximadamente el 42,5% en mol del lípido total presente en la partícula; y (d) un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas que comprende de aproximadamente el 1% en mol a aproximadamente el 2% en mol del lípido total presente en la partícula. Esta realización descrita en este documento de SNALP se menciona generalmente en este documento como la formulación "1:62". En una realización preferida descrita en este documento, el lípido catiónico es DLinDMA, el lípido no catiónico es colesterol y el lípido conjugado es un conjugado de PEG-DAA. Aunque estas son realizaciones preferidas de la formulación 1:62, los especialistas en la técnica apreciarán que pueden usarse otros lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, incluyendo otros derivados de colesterol, y lípidos conjugados en la formulación

1:62 descrita en este documento.

En otra realización específica descrita en este documento, el SNALP comprende: (a) uno o más ARNip no modificados y/o modificados que silencian la expresión de PLK-1; (b) un lípido catiónico que comprende de aproximadamente el 52% en mol a aproximadamente el 62% en mol del lípido total presente en la partícula; (c) un lípido no catiónico que comprende de aproximadamente el 36% en mol a aproximadamente el 47% en mol del lípido total presente en la partícula; y (d) un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas que comprende de aproximadamente el 1% en mol a aproximadamente el 2% en mol del lípido total presente en la partícula. Esta realización de SNALP se menciona generalmente en este documento como la formulación "1:57". En una realización preferida descrita en este documento, el lípido catiónico es DLinDMA, el lípido no catiónico es una mezcla de un fosfolípido (tal como DPPC) y colesterol, donde el fosfolípido comprende aproximadamente del 5% en mol a aproximadamente el 9% en mol del lípido total presente en la partícula, y el colesterol (o derivad de colesterol) comprende de aproximadamente el 32% en mol a aproximadamente el 37% en mol del lípido total presente en la partícula, y el PEG-lípido es PEG-DAA. Aunque estas son realizaciones preferidas de la formulación 1:57, los

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especialistas en la técnica apreciarán que pueden usarse otros lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos (incluyendo otros fosfolípidos y otros derivados de colesterol) y lípidos conjugados en la formulación 1:57 descrita en este documento.

En algunas realizaciones descritas en este documento, las partículas de ácido nucleico-lípido comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más moléculas no modificadas o modificadas de ARNip que comprenden o consisten en las secuencias expuestas en las Tablas 1-7 y 10-11, En otras realizaciones descritas en este documento, las partículas de ácido nucleico-lípido comprenden moléculas modificadas de ARNip seleccionadas entre el grupo que consiste en PLK1424 U4/GU, PLK1424 U4/G, PLK773 G/GU, PLK1425 3/5, y mezclas de las mismas.

Las partículas de ácido nucleico-lípido descritas en este documento son útiles para el suministro terapéutico de moléculas de ARNip que silencian la expresión de PLK-1. En una realización, una molécula modificada de ARNip descrita en este documento se formula en partículas de ácido nucleico-lípido, y las partículas se administran a un mamífero (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o un primate tal como un ser humano, chimpancé, o mono) que requiere dicho tratamiento. En ciertos casos descritos en este documento, puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de ácido nucleico-lípido al mamífero, por ejemplo, para tratar un cáncer tal como carcinoma hepatocelular (HCC). La administración de la partícula de ácido nucleico-lípido puede ser por cualquier vía conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intralesional, intratraqueal, subcutánea, o intradérmica.

En ciertas realizaciones descritas en este documento, la molécula de ARNip en la partícula de ácido nucleico-lípido no se degrada sustancialmente después de exposición de la partícula a una nucleasa a 37°C durante al menos 20, 30, 45 ó 60 minutos, o después de incubación de la partícula en suero a 37°C durante al menos 30, 45 ó 60 minutos

o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 horas.

En algunas realizaciones descritas en este documento, la molécula de ARNip está completamente encapsulada en la partícula de ácido nucleico-lípido. En otras realizaciones descritas en este documento, la molécula de ARNip está en complejo con la parte lipídica de la partícula.

En otro aspecto más descrito en este documento, las moléculas de ARNip descritas en este documento se usan en métodos para silenciar la expresión de PLK-1. En particular, un objeto de la presente descripción es proporcionar métodos in vitro e in vivo para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un mamífero regulando negativamente o silenciando la transcripción y/o traducción de un gen PLK-1. En una realización, la presente invención proporciona un método in vitro para introducir un ARNip que silencie la expresión de la quinasa 1 tipo polo (PLK-1) en una célula, comprendiendo el método: poner en contacto la célula con una molécula modificada de ARNip de la invención, o una partícula de ácido nucleico-lípido de la invención que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico. En otra realización, la presente invención proporciona una molécula modificada de ARNip de la invención o una partícula de ácido nucleico-lípido de la invención que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico, para su uso en un método para el suministro in vivo de un ARNip que silencie la expresión de la quinasa 1 tipo polo (PLK-1), comprendiendo dicho método administrar dicha molécula de ARNip o dicha partícula de ácido nucleico-lípido a un sujeto mamífero in vivo. La administración de la molécula de ARNip puede ser por cualquier vía conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intralesional, intratraqueal, subcutánea, o intradérmica.

En estas realizaciones, la molécula de ARNip que silencia la expresión de PLK-1 se formula típicamente con un sistema de vehículo, y el sistema de vehículo que comprende la molécula de ARNip se administra a un mamífero que requiere dicho tratamiento. Como alternativa, se retiran células de un mamífero tal como un ser humano, se suministra el ARNip in vitro usando un sistema de vehículo, y las células después se administran al mamífero, tal como por inyección. Ejemplos de sistemas de vehículo adecuados para su uso como se describe en este documento incluyen, aunque sin limitación, partículas de ácido nucleico-lípido, liposomas, micelas, virosomas, complejos de ácido nucleico (por ejemplo, lipoplexes, poliplexes, etc.), y mezclas de los mismos. El sistema de vehículo puede comprender al menos una o un cóctel (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) de moléculas de ARNip que silencian la expresión de PLK-1. En ciertas realizaciones descritas en este documento, el sistema de vehículo comprende al menos una o un cóctel de las secuencias expuestas en las Tablas 1-7 y 10-11.

En algunas realizaciones, la molécula de ARNip que silencia la expresión de PLK-1 está en una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende la molécula de ARNip, un lípido catiónico, y un lípido no catiónico. Preferiblemente, la molécula de ARNip está en una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende la molécula de ARNip, un lípido catiónico, un lípido no catiónico, y un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de ácido nucleico-lípido a un mamífero (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o un primate tal como un ser humano, chimpancé, o mono).

En algunas realizaciones descritas en este documento, el mamífero tiene un trastorno proliferativo celular. En ciertos aspectos de esta realización descrita en este documento, el mamífero tiene un trastorno proliferativo celular seleccionado entre el grupo que consiste en neoplasia (por ejemplo, cáncer), hiperplasia, reestenosis, hipertrofia

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celular se deben al silenciamiento del ARNm de PLK-1. La Figura 3 ilustra datos que demuestran la actividad iARN de secuencias adicionales de ARNip para PLK-1 formuladas en SNALP en células HT29 y Neuro2A. La Figura 4 ilustra datos que demuestran la actividad de PLK1424 y PLK773 formulados en SNALP en células HT29 y LS 174T. La Figura 5 ilustra datos que demuestran que PLK1424 y PLK773 formulados en SNALP inducen apoptosis en células LS174T. La Figura 6 ilustra datos que demuestran la actividad iARN de secuencias adicionales de ARNip para PLK-1 formuladas en SNALP en células HT29 y Neuro2A. La Figura 7 ilustra datos que demuestran que diferentes patrones de modificación 2'OMe en la secuencia de ARNip PLK1424 estaban bien tolerados y las moléculas modificadas de ARNip retenían potente actividad. La Figura 8 ilustra datos que demuestran que ARNip PLK1424 2'OMe modificados inducían respuesta no detectable IL-6 o IFN-� en cultivos murinos FLT3L DC. La Figura 9 ilustra datos que demuestran que diferentes patrones de modificación 2'OMe en la secuencia de ARNip PLK773 estaban bien tolerados y las moléculas modificadas de ARNip retenían potente actividad. La Figura 10 ilustra datos que demuestran que diferentes patrones de modificación 2'OMe en la secuencia de ARNip PLK1425 estaban bien tolerados y las moléculas modificadas de ARNip retenían potente actividad. La Figura 11 ilustra datos que demuestran que el tratamiento secuencial de combinación con SNALP para PLK-1 y paclitaxel (taxol) potenciaba significativamente la inhibición del crecimiento de células Neuro2A y HepG2. La Figura 12 ilustra datos que demuestran que el tratamiento secuencial de combinación con SNALP para PLK-1 y paclitaxel (taxol) potenciaba significativamente el nivel de apoptosis inducido en células Neuro2A. La Figura 13 ilustra datos que demuestran que un régimen de tratamiento de PLK1424 formulado en SNALP es bien tolerado sin signos aparentes de toxicidad relacionada con el tratamiento en ratones que albergan tumores hepáticos Hep3B. La Figura 14 ilustra datos que demuestran que el tratamiento con PLK1424 formulado en SNALP causaba un aumento significativo en la supervivencia de ratones que albergan tumor Hep3B. La Figura 15 ilustra datos que demuestran que el tratamiento con PLK1424 formulado en SNALP reducía los niveles de ARNm de PLK-1 en un 50% en tumores intrahepáticos Hep3B que crecen en ratones 24 horas después de la administración de SNALP. La Figura 16 ilustra datos que demuestran que un producto de escisión específica de ARNm de PLK-1 era detectable en ratones tratados con SNALP PLK1424 por 5' RACE-PCR. Se cargaron 10 µl de producto de PCR/pocillo en un gel de agarosa al 1,5%. Nos de carril: (1) marcador de peso molecular (PM); (2) PBS ratón 1;

(3) PBS ratón 2; (4) PBS ratón 3; (5) SNALP Luc ratón 1; (6) SNALP Luc ratón 2; (7) SNALP PLK ratón 1; (8) SNALP PLK ratón 2; (9) SNALP PLK ratón 3; y (10) control sin molde. La Figura 17 ilustra datos que demuestran que ratones tratados con SNALP de control (Luc) presentaban mitosis normales en tumores Hep3B (paneles superiores), mientras que ratones tratados con SNALP PLK1424 mostraban numerosas mitosis aberrantes y apoptosis de células tumorales en tumores Hep3B (paneles inferiores). La Figura 18 ilustra datos que demuestran que múltiples dosis de SNALP PLK-1 1:57 que contenía PEG-cDSA inducían la regresión de tumores subcutáneos (S.C.) Hep3B establecidos. La Figura 19 ilustra datos que demuestran el silenciamiento del ARNm de SNALP PLK 1:57 en tumores Hep3B

S.C.: después de una única administración intravenosa de SNALP. La Figura 20 ilustra datos que demuestran que SNALP PLK1-cDSA inhibía el crecimiento de tumores Hep3B

S.C.: grandes. La Figura 21 ilustra datos que demuestran el silenciamiento de ARNm de PLK-1 derivado de tumor en tumores intrahepáticos Hep3B. La Figura 22 ilustra datos que demuestran el perfil de eliminación en sangre de SNALP PLK-1 1:57 que contenía PEG-cDMA o PEG-cDSA.

La Figura 23 ilustra datos que demuestran una exploración de actividad in vitro de secuencias de ARNip para PLK-1. Se evaluó la actividad de secuencias de ARNip para PLK-1 nativo que abordan ARNm de PLK-1 humano en el ensayo de viabilidad en células HT29. Las células se trataron con PLK-1 formulado en SNALP o ARNip Luc a 1 nM (barra blanca), 5 nM (barra gris), y 25 nM (barra negra). La viabilidad celular se evaluó a las 72 horas usando colorante de resazurina CellTiter Blue. Se realizaron dos rondas de diseño de ARNip (A y B, C). Los números de secuencia representan el sitio diana de ARNip en la fase de lectura abierta del ARNm de hPLK-1 (Número de Acceso a GenBank NM_005030).

La Figura 24 ilustra datos que demuestran la actividad de ARNip para PLK-1 in vitro. Correlación entre el silenciamiento del ARNm y la viabilidad de células HT29 para tratamientos con (A) PLK1424, (B) PLK773, o (C) ARNip Luc. Se determinó el ARNm de PLK-1 por análisis de ADNb a las 24 h. Se evaluaron placas duplicadas para la viabilidad celular a las 72 h. (D) el ARNip PLK1424 causa reducciones dependientes de la dosis en la viabilidad de cultivos celulares LS 174T, HT29, Hep3B, y HepG2. Las células se trataron durante 72 h con SNALP PLK1424 a ARNip 5 (barra negra), 2,5, 1,25, 0,63, y 0,31 (barra blanca) nM. Los valores en (A)-(D) se expresan como % de viabilidad o ARNm de PLK-1 respecto al control de PBS y reflejan la media de 3 experimentos diferentes (+/- DT) realizados en cultivos triplicados. (E) La viabilidad celular disminuida está asociada con la inducción de apoptosis. La actividad Caspasa 3/7 en células LS 174T se evaluó 24 h y 48 h después del tratamiento con PLK773, PLK1424, o

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de una mezcla lipídica relativamente desordenada. La expresión vesícula lipídica abarca cualquiera de una diversidad de sistemas de vehículo basados en lípido incluyendo, sin limitación, SPLP, pSPLP, SANLP, liposomas, micelas, virosomas, complejos de lípido-ácido nucleico, y mezclas de los mismos.

Como se usa en este documento, "lípido encapsulado" puede referirse a una formulación lipídica que proporciona un compuesto, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, un ARN interferente), con encapsulación completa, encapsulación parcial, o ambas. En una realización preferida descrita en este documento, el ácido nucleico está completamente encapsulado en la formulación lipídica (por ejemplo, para formar una SPLP, pSPLP, SNALP, u otra partícula de ácido nucleico-lípido).

Como se usa en este documento, el término "SNALP" se refiere a una partícula estable de ácido nucleico-lípido. Una SNALP representa una partícula hecha de lípidos (por ejemplo, un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido conjugado que evita la agregación de la partícula), donde el ácido nucleico (por ejemplo, ARNip, ARNia, miARN, ADNmc, ADNbc, ARNmc, ARN de horquilla corta (ARNhp), ARNbc, o un plásmido, incluyendo plásmidos para los cuales se transcribe un ARN interferente) está completamente encapsulado dentro del lípido. Como se usa en este documento, el término "SNALP" incluye una SPLP, que es el término usado para hacer referencia a una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) encapsulado dentro del lípido. Las SNALP y SPLP típicamente contienen un lípido catiónico, un lípido no catiónico, y un conjugado lipídico (por ejemplo, un conjugado PEG-lípido). Las SNALP y SPLP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que pueden mostrar tiempos prolongados en circulación después de inyección intravenosa (i.v.), pueden acumularse en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración) y pueden mediar la expresión del gen transfectado o silenciamiento de la expresión del gen diana en estos sitios distales. Las SPLP incluyen "pSPLP", que comprenden un complejo de agente de condensación-ácido nucleico encapsulado expuesto en la publicación PCT Nº WO 00/03683.

Las partículas de ácido nucleico-lípido descritas en este documento típicamente tienen un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más típicamente de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más típicamente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, mucho más típicamente de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácido nucleicos, cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido descritas en este documento, son resistentes en solución acuosa a degradación con una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se describen en, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos Nº 20040142025 y la publicación de patente de Estados Unidos Nº 20070042031.

"Formulación lipídica" o, como alternativa, una "formulación basada en lípido" se usa en este documento para hacer referencia a una SNALP que puede usarse para suministrar un ácido nucleico, tal como un ARN interferente, a un sitio diana de interés. En la formulación lipídica, que se forma típicamente a partir de un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un conjugado lipídico, el ácido nucleico se encapsula en el lípido, protegiendo de este modo el ácido nucleico de la degradación por nucleasa.

La expresión "conjugado lipídico" se refiere a un lípido conjugado que inhibe la agregación de las partículas de ácido nucleico-lípido. Dichos conjugados lipídicos incluyen, aunque sin limitación, oligómeros de poliamida (por ejemplo, conjugados ATTA-lípido), conjugados PEG-lípido, tales como PEG acoplado a dialquiloxipropilos, PEG acoplado a diacilgliceroles, PEG acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas, PEG conjugado con ceramidas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.885.613), PEG lípidos catiónicos, y mezclas de los mismos. El PEG puede conjugarse directamente con el lípido o puede unirse al lípido mediante un resto enlazador. Puede usarse cualquier resto enlazador adecuado para acoplar el PEG a un lípido incluyendo, por ejemplo, restos enlazadores que no contiene éster y restos enlazadores que contiene éster. En realizaciones preferidas descritas en este documento, se usan restos enlazadores que no contienen éster.

La expresión "lípido anfipático" se refiere, en parte, a cualquier material adecuado donde la parte hidrófoba del material lipídico se orienta dentro de una fase hidrófoba, mientras que la parte hidrófila se orienta hacia la fase acuosa. Las características hidrófilas derivan de la presencia de grupos polares o cargados tales como carbohidratos, fosfato, ácido carboxílico, sulfato, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxilo, y otros grupos similares. La hidrofobicidad puede conferirse por la inclusión de grupos apolares que incluyen, aunque sin limitación, grupos de hidrocarburo alifático saturado e insaturado de cadena larga y dichos grupos sustituidos por uno o más grupos aromáticos, cicloalifáticos, o heterocíclicos. Ejemplos de compuestos anfipáticos incluyen, aunque sin limitación, fosfolípidos, aminolípidos, y esfingolípidos.

Ejemplos representativos de fosfolípidos incluyen, aunque sin limitación, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, y dilinoleoilfosfatidilcolina. Otros compuestos que carecen de fosforo, tales como esfingolípidos, familias de glicoesfingolípidos, diacilgliceroles, y �-aciloxiácidos, también están dentro del grupo designado como lípido anfipáticos. Adicionalmente, los lípidos anfipáticos descritos anteriormente pueden mezclarse con otros lípidos incluyendo triglicéridos y esteroles.

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descritos en este documento (por ejemplo, 2'OMe nucleótidos).

En algunas realizaciones descritas en este documento, la hebra con sentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias modificadas de hebra con sentido expuestas en la Tabla 3. En una realización preferida descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 57. En otra realización preferida descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 64. En otra realización preferida más descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 67. En algunos casos descritos en este documento, la hebra con sentido contiene salientes 3' "dTdT" o "UU". En otros casos descritos en este documento, la hebra con sentido contiene salientes 3' que tienen complementariedad con la hebra complementaria de la secuencia diana. En casos adicionales descritos en este documento, el saliente 3' en la hebra con sentido comprende uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos modificados tales como los descritos en este documento (por ejemplo, 2'OMe nucleótidos).

En otras realizaciones descritas en este documento, la hebra antisentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias modificadas de hebras antisentido expuestas en la Tabla 3. En una realización preferida descrita en este documento, la hebra antisentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 54. En otra realización preferida descrita en este documento, la hebra antisentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 56. En otra realización preferida más descrita en este documento, la hebra antisentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 63. En una realización preferida adicional descrita en este documento, la hebra antisentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 68. En algunos casos descritos en este documento, la hebra antisentido contiene salientes 3' "dTdT" o "UU". En otros casos descritos en este documento, la hebra antisentido contiene salientes 3' que tienen complementariedad con la secuencia diana. En casos adicionales descritos en este documento, el saliente 3' en la hebra antisentido comprende uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos modificados tales como los descritos en este documento (por ejemplo, 2'OMe nucleótidos).

En algunas realizaciones descritas en este documento, la hebra con sentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias de hebra con sentido expuestas en las Tablas 4-5. En otras realizaciones descritas en este documento, la hebra antisentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias de hebra antisentido expuestas en las Tablas 4-5. Como se describe en este documento, uno o más de los nucleótidos en las secuencias de hebra con sentido y/o antisentido expuestas en las Tablas 4-5 pueden comprender nucleótidos modificados, donde los nucleótidos modificados están localizados en la región bicatenaria de la molécula de ARNip. En algunos casos descritos en este documento, la hebra con sentido y/o antisentido contiene salientes 3' "dTdT" o "UU". En otros casos descritos en este documento, la hebra con sentido y/o antisentido contiene salientes 3' que tienen complementariedad con la secuencia diana o la hebra complementaria de la misma. En casos adicionales descritos en este documento, el saliente 3' en la hebra con sentido, hebra antisentido, o ambas hebras comprenden uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos modificados tales como los descritos en este documento (por ejemplo, 2'OMe nucleótidos).

En otras realizaciones descritas en este documento, la hebra con sentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias no modificadas de hebra con sentido expuestas en la Tabla 6. En una realización preferida descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 211. En otra realización preferida descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 218. En otras ciertas realizaciones descritas en este documento, la hebra antisentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias no modificadas de hebra antisentido expuestas en la Tabla 6. En una realización preferida descrita en este documento, la hebra antisentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 212. En otra realización preferida descrita en este documento, la hebra antisentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 219. Como se describe en este documento, uno o más de los nucleótidos en las secuencias no modificadas de hebra con sentido y/o antisentido expuestas en la Tabla 6 pueden comprender nucleótidos modificados, donde los nucleótidos modificados están localizados en la región bicatenaria de la molécula de ARNip. En algunos casos descritos en este documento, uno o ambos de los nucleótidos uridina en el saliente 3' "UU" en la hebra con sentido y/o antisentido comprende nucleótidos modificados tales como los descritos en este documento (por ejemplo, nucleótidos de 2'OMe uridina).

En algunas realizaciones descritas en este documento, la hebra con sentido de la molécula modificada de ARNip comprende o consiste en una de las secuencias modificadas de hebra con sentido expuestas en la Tabla 6. En una realización preferida descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 214. En otra realización preferida descrita en este documento, la hebra con sentido comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 220. En algunos casos descritos en este documento, uno o ambos de los nucleótidos uridina en el saliente 3' "UU" en la hebra con sentido y/o antisentido comprende nucleótidos modificados tales como los descritos en este documento (por ejemplo, nucleótidos de 2'OMe uridina).

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(d) un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas que comprende de aproximadamente el 1% en mol a aproximadamente el 2% en mol del lípido total presente en la partícula.

En una realización descrita en este documento, la molécula de ARNip comprende una región bicatenaria de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud. En otra realización descrita en este documento, la molécula de ARNip comprende al menos una de las secuencias expuestas en las Tablas 1-7 y 10-11.

En ciertas realizaciones descritas en este documento, el lípido catiónico es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en DLinDMA, DLenDMA, DODAC, DDAB, DOTAP, DSDMA, DOTMA, DODMA, DC-Chol, DMRIE, DOSPA, DOGS, CLinD-MA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, DLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, y una mezcla de los mismos. Preferiblemente, el lípido catiónico comprende DLinDMA.

En otras realizaciones descritas en este documento, el lípido no catiónico comprende colesterol o un derivado del mismo. Preferiblemente, el lípido no catiónico comprende colesterol.

En realizaciones adicionales descritas en este documento, el lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas es un conjugado de PEG-lípido seleccionado entre el grupo que consiste en un PEG-diacilglicerol, un PEG dialquiloxipropilo, un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida, y una mezcla de los mismos. Preferiblemente, el lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas comprende un conjugado PEG-DAA. Conjugados adicionales de PEG-lípido incluyen, por ejemplo, PEG-C-DOMG, 2KPEG-DMG, o mezclas de los mismos.

Otra realización preferida descrita en este documento proporciona una partícula de ácido nucleico-lípido, que comprende:

(a): una molécula de ARNip que silencia la expresión de PLK-1;

(b): un lípido catiónico que comprende de aproximadamente el 52% en mol a aproximadamente el 62% en mol del lípido total presente en la partícula;

(c): un lípido no catiónico que comprende de aproximadamente el 36% en mol a aproximadamente el 47% en mol del lípido total presente en la partícula; y

(d): un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas que comprende de aproximadamente el 1% en mol a aproximadamente el 2% en mol del lípido total presente en la partícula.

En otras ciertas realizaciones descritas en este documento, el lípido no catiónico comprende un fosfolípido. En realizaciones alternativas, el lípido no catiónico comprende una mezcla de un fosfolípido y colesterol o un derivado del mismo. El fosfolípido puede ser, por ejemplo, DPPC, DSPC, DOPE, POPC, POPE, POPG, DPPE, DMPE, DSPE, DEPE, SOPE, EPC, monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, o una mezcla de los mismos. Preferiblemente, el lípido no catiónico comprende una mezcla de DPPC y colesterol. En dichos casos, el DPPC típicamente comprende de aproximadamente el 5% en mol a aproximadamente el 9% en mol del lípido total presente en la partícula y el colesterol típicamente comprende de aproximadamente el 32% en mol a aproximadamente el 37% en mol del lípido total presente en la partícula.

En realizaciones adicionales descritas en este documento, el lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas es un conjugado de PEG-lípido seleccionado entre el grupo que consiste en un PEG-diacilglicerol, un PEG dialquiloxipropilo, un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida, o una mezcla de los mismos. Preferiblemente, el lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas comprende un conjugado PEG-DAA. Conjugados adicionales de PEG-lípido incluyen, por ejemplo, PEG-C-DOMG, 2KPEG-DMG, o mezclas de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para introducir un ARNip que silencie la expresión de la quinasa 1 tipo polo (PLK-1) en una célula, comprendiendo el método:

poner en contacto la célula con una molécula modificada de ARNip de la invención, o una partícula de ácido nucleico-lípido de la invención que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico.

En una realización descrita en este documento, la molécula modificada de ARNip es un sistema de vehículo. El sistema de vehículo puede ser, por ejemplo, una partícula de ácido nucleico-lípido, un liposoma, una micela, un virosoma, un complejo de ácido nucleico, o una mezcla de los mismos. Típicamente, el complejo de ácido nucleico

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ARNip: Secuencia de ARNip para PLK-1 % modificado en región BC

PLK1424 U3/GU: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3' (SEC ID Nº 53) 3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 54) 5/38 = 13,2%

PLK1424 U3/UG: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3' (SEC ID Nº 53) 3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 55) 7/38 = 18,4%

PLK1424 U3/G: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3' (SEC ID Nº 53) 3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 56) 6/38 = 15,8%

PLK1424 U4/GU: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3' (SEC ID Nº 57) 3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 54) 6/38 = 15,8%

PLK1424 U4/UG: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3' (SEC ID Nº 57) 3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº55) 8/38 = 21%

PLK1424 U4/G: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3' (SEC ID Nº 57) 3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº56) 7/38 = 18,4%

PLK773: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 58) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº59) 0/38 = 0%

PLK773 U/U: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 60) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 61) 6/38 = 15,8%

PLK773 U/G: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 60) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 62) 7/38 = 18,4%

PLK773 U/GU: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 60) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 63) 6/38 = 15,8%

PLK773 G/U: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 64) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 61) 5/38 = 13,2%

PLK773 G/G: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 64) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 62) 6/38 = 15,8%

PLK773 G/GU: 5'-AGACCUACCUCCGGAUCAANN-3' (SEC ID Nº 64) 3'-NNUCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 63) 5/38 = 13,2%

PLK1425: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 65) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 66) 0/38 = 0%

PLK1425 3/2: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 67) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 66) 3/38 = 7,9%

PLK1425 3/5: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 67) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 68) 5/38 = 13,2%

PLK1425 3/6: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 67) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 69) 6/38 = 15,8%

PLK1425 3/7: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 67) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 70) 7/38 = 18,4%

PLK1425 3/8: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 67) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 71) 7/38 = 18,4%

PLK1425 4/2: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 72) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 66) 4/38 = 10,5%

PLK1425 4/5: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 72) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 68) 6/38 = 15,8%

PLK1425 4/6: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 72) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 69) 7/38 = 18,4%

PLK1425 4/7: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 72) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 70) 8/38 = 21%

PLK1425 4/8: 5'-GAUCACCCUCCUUAAAUAUNN-3' (SEC ID Nº 72) 3'-NNCUAGUGGGAGGAAUUUAUA-5' (SEC ID Nº 71) 8/38 = 21%

Columna 1: El número después de "PLK" se refiere a la posición de nucleótido de la base 5' de la hebra con sentido respecto al codón de inicio (ATG) de la secuencia de ARNm de PLK-1 humana NM_005030. Columna 2: Los 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos se indican en negrita y subrayados. El ARNip puede comprender alternativa o adicionalmente 2'-desoxi-2'-fluoro (2'F) nucleótidos, 2'-desoxi nucleótidos, 2'-O-(2-metoxietil) (MOE) nucleótidos, y/o nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA). N = nucleótido desoxitimidina (dT), ribonucleótido uridina (U) modificada o no modificada, o ribonucleótido modificado o no modificado que tiene complementariedad con la secuencia diana o la hebra complementaria de la misma. Columna 3: Se proporcionan la cantidad y porcentaje de nucleótidos modificados en la región bicatenaria (BC) del dúplex de ARNip.

La Figura 7 muestra que diferentes patrones de modificación química en la secuencia de ARNip PLK1424 se toleraban bien y las moléculas modificadas de ARNip retenían potente actividad. Las moléculas modificadas de ARNip más activas, PLK1424 U4/GU y PLK1424 U3/GU, fueron tan potente como la secuencia no modificada PLK1424 en la eliminación de células tumorales humanas. PLK1424 U4/G y PLK1424 U3/G mostraron actividad

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y (5) son tramos de cuatro nucleótido de la misma base. Las secuencias seleccionadas se verificaron y se identificaron las posiciones dentro de la secuencia diana de PLK-1 humana.

Después se realizaron búsquedas BLASTn frente a las bases de datos de secuencias humanas y de ratón sobre todas las secuencias. Se eliminaron las secuencias que hibridaban de forma cruzada con >17 de sus nucleótidos internos.

Las secuencias candidatas se muestran en las Tablas 4-5.

Tabla 4. Secuencias adicionales de ARNip que abordan la expresión de PLK-1 humana.

ARNip: Hebra con sentido (5' � 3') SEC ID Nº Hebra antisentido (5' � 3') SEC ID Nº

PLK(-23): GGUCUGCAGCGCAGCUUCG 73 CGAAGCUGCGCUGCAGACC 74

PLK(-15): GCGCAGCUUCGGGAGCAUG 75 CAUGCUCCCGAAGCUGCGC 76

PLK272: AGCCGCACCAGAGGGAGAA 77 UUCUCCCUCUGGUGCGGCU 78

PLK273: GCCGCACCAGAGGGAGAAG 79 CUUCUCCCUCUGGUGCGGC 80

PLK288: GAAGAUGUCCAUGGAAAUA 81 UAUUUCCAUGGACAUCUUC 82

PLK363: GGACAACGACUUCGUGUUC 83 GAACACGAAGUCGUUGUCC 84

PLK420: GCUGCACAAGAGGAGGAAA 85 UUUCCUCCUCUUGUGCAGC 86

PLK429: GAGGAGGAAAGCCCUGACU 87 AGUCAGGGCUUUCCUCCUC 88

PLK431: GGAGGAAAGCCCUGACUGA 89 UCAGUCAGGGCUUUCCUCC 90

PLK438: AGCCCUGACUGAGCCUGAG 91 CUCAGGCUCAGUCAGGGCU 92

PLK439: GCCCUGACUGAGCCUGAGG 93 CCUCAGGCUCAGUCAGGGC 94

PLK450: GCCUGAGGCCCGAUACUAC 95 GUAGUAUCGGGCCUCAGGC 96

PLK456: GGCCCGAUACUACCUACGG 97 CCGUAGGUAGUAUCGGGCC 98

PLK498: CCUGCACCGAAACCGAGUU 99 AACUCGGUUUCGGUGCAGG 100

PLK504: CCGAAACCGAGUUAUUCAU 101 AUGAAUAACUCGGUUUCGG 102

PLK589: CUGGCAACCAAAGUCGAAU 103 AUUCGACUUUGGUUGCCAG 104

PLK618: GAGGAAGAAGACCCUGUGU 105 ACACAGGGUCUUCUUCCUC 106

PLK627: GACCCUGUGUGGGACUCCU 107 AGGAGUCCCACACAGGGUC 108

PLK629: CCCUGUGUGGGACUCCUAA 109 UUAGGAGUCCCACACAGGG 110

PLK663: GGUGCUGAGCAAGAAAGGG 111 CCCUUUCUUGCUCAGCACC 112

PLK693: GGUGGAUGUGUGGUCCAUU 113 AAUGGACCACACAUCCACC 114

PLK710: UUGGGUGUAUCAUGUAUAC 115 GUAUACAUGAUACACCCAA 116

PLK736: GUGGGCAAACCACCUUUUG 117 CAAAAGGUGGUUUGCCCAC 118

PLK744: ACCACCUUUUGAGACUUCU 119 AGAAGUCUCAAAAGGUGGU 120

PLK745: CCACCUUUUGAGACUUCUU 121 AAGAAGUCUCAAAAGGUGG 122

PLK774: GACCUACCUCCGGAUCAAG 123 CUUGAUCCGGAGGUAGGUC 124

PLK776: CCUACCUCCGGAUCAAGAA 125 UUCUUGAUCCGGAGGUAGG 126

PLK780: CCUCCGGAUCAAGAAGAAU 127 AUUCUUCUUGAUCCGGAGG 128

PLK884: CCAUUAACGAGCUGCUUAA 129 UUAAGCAGCUCGUUAAUGG 130

PLK894: GCUGCUUAAUGACGAGUUC 131 GAACUCGUCAUUAAGCAGC 132

PLK903: UGACGAGUUCUUUACUUCU 133 AGAAGUAAAGAACUCGUCA 134

PLK1024: GUCCUCAAUAAAGGCUUGG 135 CCAAGCCUUUAUUGAGGAC 136

PLK1137: GCAGCUGCACAGUGUCAAU 137 AUUGACACUGUGCAGCUGC 138

PLK1235: GCAAGUGGGUGGACUAUUC 139 GAAUAGUCCACCCACUUGC 140

PLK1319: CACGCCUCAUCCUCUACAA 141 UUGUAGAGGAUGAGGCGUG 142

PLK1321: CGCCUCAUCCUCUACAAUG 143 CAUUGUAGAGGAUGAGGCG 144

PLK1347: CAGCCUGCAGUACAUAGAG 145 CUCUAUGUACUGCAGGCUG 146

PLK1363: GAGCGUGACGGCACUGAGU 147 ACUCAGUGCCGUCACGCUC 148

PLK1404: UCCCAACUCCUUGAUGAAG 149 CUUCAUCAAGGAGUUGGGA 150

PLK1409: ACUCCUUGAUGAAGAAGAU 151 AUCUUCUUCAUCAAGGAGU 152

PLK1422: GAAGAUCACCCUCCUUAAA 153 UUUAAGGAGGGUGAUCUUC 154

PLK1430: CCCUCCUUAAAUAUUUCCG 155 CGGAAAUAUUUAAGGAGGG 156

PLK1457: UGAGCGAGCACUUGCUGAA 157 UUCAGCAAGUGCUCGCUCA 158

PLK1550: CCCGCAGCGCCAUCAUCCU 159 AGGAUGAUGGCGCUGCGGG 160

PLK1577: GCAACGGCAGCGUGCAGAU 161 AUCUGCACGCUGCCGUUGC 162

PLK1580: ACGGCAGCGUGCAGAUCAA 163 UUGAUCUGCACGCUGCCGU 164

PLK1581: CGGCAGCGUGCAGAUCAAC 165 GUUGAUCUGCACGCUGCCG 166

PLK1586: GCGUGCAGAUCAACUUCUU 167 AAGAAGUUGAUCUGCACGC 168

PLK1620: GCUCAUCUUGUGCCCACUG 169 CAGUGGGCACAAGAUGAGC 170

PLK1640: UGGCAGCCGUGACCUACAU 171 AUGUAGGUCACGGCUGCCA 172

PLK1645: GCCGUGACCUACAUCGACG 173 CGUCGAUGUAGGUCACGGC 174

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Se aplicó un enfoque similar al diseño de ARNip para PLK1424 y PLK773 para generar dúplex que no poseyeran efectos medibles de estimulación inmune reteniendo al mismo tiempo completa actividad iARN. Esta etapa se consideró como un pre-requisito para la realización de estudios in vivo para concluir la especificidad de efectos antitumores que puedan observarse. Se sustituyeron nucleótidos 2'OMe-U o 2'OMe-G en los oligonucleótidos nativos 5 con sentido y AS para formar un panel de dúplex modificados PLK1424 y PLK773 (Tabla 6) que después se seleccionaron para la conservación de actividad iARN. Los dúplex 2'OMe-PLK1424 que contienen las hebras AS modificadas A o B mostraron actividad anti-proliferativa similar a la secuencia PLK1424 nativa cuando aparearon con cualquiera de las hebras con sentido modificadas 1 ó 2. 2'OMe-PLK1424 que contiene la hebra AS C presentó actividad anti-proliferativa a concentraciones mayores (Figura 26A). El panel de dúplex 2'OMe-PLK773 presento 10 diferencias moderadas en la actividad en comparación con la secuencia PLK773 nativa (Figura 26B). Se seleccionaron los dúplex de ARNip PLK1424-2/A y PLK773-1/B (que comprenden las hebras con sentido/AS 2'OMemodificadas designadas) para evaluación en un modelo de estimulación inmune in vitro. Como se esperaba, el ARNip PLK1424 y PLK773 nativo y su ARN monocatenario constituyente (ARNmc) estimularon células dendríticas derivadas de ligando Flt3 murino para producir altos niveles tanto de IFN-� como de IL-6 (Figura 26C), mientras que 15 esta reactividad inmune estuvo completamente anulada en los dúplex PLK1424-2/A y PLK773-1/B.

Tabla 6. Secuencias de ARNip para PLK-1, KSP, y Luc con patrones de 2'OMe modificación.

Nombre: Hebra Secuencia (5'-3'21 mero) SEC ID Nº

PLK1424: S AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU 211

PLK1424: AS UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU 212

PLK1424-1: S AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU 213

PLK1424-2: S AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU 214

PLK1424-A: AS UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU 215

PLK1424-B: AS UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU 216

PLK1424-C: AS UAUU UAAG GAGGGUGAUCUUU 217

PLK773: S AGACCUACCUCCGGAUCAAUU 218

PLK773: AS UUGAUCCGGAGGUAGGUCUUU 219

PLK773-1: S AGACCUACCUCCGGAUCAAUU 220

PLK773-2: S AGACCUACCUCCGGAUCAAUU 221

PLK773-A: AS UUGAUCCGGAGGUAGGUCUUU 222

PLK773-B: AS UUGAU CCGGAGGUAGGUCU UU 223

PLK773-C: AS UUGAUCCGGAGGUAGGUCUUU 224

KSP2263: S CUGAAGACCUGAAGACAAUdTdT 225

KSP2263: AS AUUGUCUUCAGGUCUUCAGdTdT 226

KSP2263-U: S CUGAAGACCUGAAGACAAUdTdT 227

KSP2263-G: S CUGAAGACCUGAAGACAAUdTdT 228

KSP2263-U: AS AUUGUCUUCAGGUCUUCAGdTdT 229

KSP2263-G: AS AUUGUCUUCAGGUCUUCAGdTdT 230

Luc: S GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU 231

Luc: AS UACAUAACCGGACAUAAUCUU 232

Luc-U: S GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU 233

Luc-U: AS UACAUAACCGGACAUAAUCUU 234

Los 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos se indican en negrita y subrayados. La hebra con sentido (S) o antisentido (AS) puede comprender alternativa o adicionalmente 2'-desoxi-2'-fluoro (2'F) nucleótidos, 2'-desoxi nucleótidos, 2'-O-(2metoxietil) (MOE) nucleótidos, y/o nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA).

Para demostrar la utilidad de este enfoque para el diseño de ARNip, se aplicó la misma metodología a un ARNip publicado dirigido a KSP (38). El ARNip para KSP seleccionado (llamado KSP2263 a partir de su descripción 20 original) tiene homología de secuencia completa con el ARNm de KSP de ratón y ser humano y mostró potentes efectos anti-proliferativos en líneas de células cancerosas tanto humanas como de ratón. Como ejemplo, el tratamiento de células Neuro2a de ratón con KSP2263 formulado en SNALP indujo reducciones dependientes de dosis en el ARNm de KSP 24 h después de transfección, que se correlaciona con una pérdida posterior de viabilidad celular a las 72 h (Figura 26D). Después se seleccionó un panel de dúplex KSP2263 modificados que contenían

25 nucleótidos 2'OMe-U o 2'OMe-G (Tabla 6) en este ensayo. En este caso, cada combinación de las dos hebras modificadas con sentido y AS generó un dúplex con potencia equivalente a la secuencia KSP2263 nativa, confirmando la conservación de la actividad iARN (Figura 26E). Se seleccionó la variante 2'OMe-modificada KSP2263-U/U para caracterización adicional.

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Colesteril-4'-hidroxibutil éter

5 La Tabla 8 proporciona ejemplos no limitantes de moléculas de ARNia que son adecuadas para modular (por ejemplo, silenciar) la expresión de PLK-1. El primer conjunto de moléculas de ARNia comprende la secuencia de hebra antisentido del ARNip PLK1424 (SEC ID Nº 2). El segundo conjunto de moléculas de ARNia comprende la secuencia de hebra antisentido del ARNip PLK773 (SEC ID Nº 4).

10 El saliente antisentido 5' puede contener uno, dos, tres, cuatro, o más nucleótidos no dirigidos (por ejemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc.). Preferiblemente, el saliente antisentido 5' contiene dos nucleótidos no dirigidos. El saliente antisentido 3' puede contener uno, dos, tres, cuatro, o más nucleótidos no dirigidos. Las moléculas de ARNia pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, por ejemplo, en la región bicatenaria (dúplex) y/o en los salientes

15 antisentido. Se describen en este documento ejemplos de nucleótidos modificados e incluyen 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro (2'F) nucleótidos, 2'-desoxi nucleótidos, 2'-O-(2-metoxietil) (MOE) nucleótidos, y nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA). Las moléculas de ARNia pueden comprender adicionalmente uno de los sistemas de vehículo descritos en este documento (por ejemplo, una partícula de ácido nucleico) y encontrar utilidad en el tratamiento de cánceres tales como cáncer de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).

20 Tabla 8. Dúplex de ARNia que comprenden polinucleótidos de ARN con sentido y antisentido de PLK-1.

ARNia: Secuencia de ARNia de PLK-1

PLK1424 (12 pb/1): 5' -CCCUCCUUAAAU-3' (SEC ID Nº 287) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (12 pb/2): 5'-ACCCUCCUUAAA-3' (SEC ID Nº 288) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (12 pb/3): 5'-CACCCUCCUUAA-3' (SEC ID Nº 289) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (13 pb/1): 5'-ACCCUCCUUAAAU-3' (SEC ID Nº 290) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (13 pb/2): 5'-CACCCUCCUUAAA-3' (SEC ID Nº 291) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (13 pb/3): 5'-UCACCCUCCUUAA-3' (SEC ID Nº 292) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (14 pb/1): 5'-CACCCUCCUUAAAU-3' (SEC ID Nº 293) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (14 pb/2): 5'-UCACCCUCCUUAAA-3' (SEC ID Nº 294) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (14 pb/3): 5'-AUCACCCUCCUUAA-3' (SEC ID Nº 295) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (15 pb/1): 5'-UCACCCUCCUUAAAU-3' (SEC ID Nº 296) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (15 pb/2): 5'-AUCACCCUCCUUAAA-3' (SEC ID Nº 297) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (15 pb/3): 5'-GAUCACCCUCCUUAA-3' (SEC ID Nº 298) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (16 pb/1): 5'-AUCACCCUCCUUAAAU-3' (SEC ID Nº 299) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (16 pb/2): 5'-GAUCACCCUCCUUAAA-3' (SEC ID Nº 300) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK1424 (17 pb): 5'-GAUCACCCUCCUUAAAU-3' (SEC ID Nº 301) 3'-UCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 2)

PLK773 (12 pb/1): 5'-ACCUCCGGAUCA-3' (SEC ID Nº 302) 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 4)

83

ARNia: Secuencia de AR Nia de PLK-1

PLK773 (12 pb/2): 5'-UACCUCCGGAUC-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 303) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (12 pb/3): 5'-CUACCUCCGGAU-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 304) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (13 pb/1): 5'-UACCUCCGGAUCA-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 305) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (13 pb/2): 5'-CUACCUCCGGAUC-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 306) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (13 pb/3): 5'-CCUACCUCCGGAU-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 307) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (14 pb/1): 5'-CUACCUCCGGAUCA-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 308) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (14 pb/2): 5'-CCUACCUCCGGAUC-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 309) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (14 pb/3): 5'-ACCUACCUCCGGAU-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 310) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (15 pb/1): 5'-CCUACCUCCGGAUCA-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 311) (SEC ID Nº4)

PLK773 (15 pb/2): 5'-ACCUACCUCCGGAUC-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 312) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (15 pb/3): 5'-GACCUACCUCCGGAU-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 313) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (16 pb/1): 5'-ACCUACCUCCGGAUCA-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 314) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (16 pb/2): 5'-GACCUACCUCCGGAUC-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 315) (SEC ID Nº 4)

PLK773 (17 pb): 5'-GACCUACCUCCGGAUCA-3' 3'-UCUGGAUGGAGGCCUAGUU-5' (SEC ID Nº 316) (SEC ID Nº 4)

Experimento 18. Moléculas ejemplares de miARN dirigidas a PLK-1.

5 La Tabla 9 proporciona ejemplos no limitantes de moléculas de miARN que son adecuadas para modular (por ejemplo, silenciar) la expresión de PLK-1. Las moléculas de miARN descritas en este documento pueden comprender uno o más nucleótidos modificados. Se describen en este documento ejemplos de nucleótidos modificados e incluyen 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro (2'F) nucleótidos, 2'-desoxi nucleótidos, 2'O-(2-metoxietil) (MOE) nucleótidos, y nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA). Los extremos 5' y/o 3' de la

10 secuencia de miARN pueden contener uno, dos, tres, cuatro, o más nucleótidos no dirigidos. En ciertos casos descritos en este documento, un fragmento de una de las secuencias de miARN expuestas en la Tabla 9 puede usarse para modular (por ejemplo, silenciar) la expresión de PLK-1. En otros ciertos casos descritos en este documento, un agente que bloquea la interacción entre una o más de las moléculas de miARN expuestas en la Tabla 9 y su secuencia o secuencias diana de ARNm de PLK-1 pueden usarse para modular (por ejemplo, silenciar)

15 la expresión de PLK-1. Las moléculas de miARN o agentes de bloqueo de las mismas pueden comprender adicionalmente uno de los sistemas de vehículo descritos en este documento (por ejemplo, una partícula de ácido nucleico) y encuentran utilidad en el tratamiento de cánceres tales como carcinoma hepatocelular.

También son adecuadas secuencias no modificadas o modificadas de pre-miARN correspondientes a cualquiera de

20 las secuencias maduras de miARN enumeradas en la Tabla 9 para su uso como se describe en este documento, por ejemplo, para modular (por ejemplo, silenciar) la expresión de PLK-1. La molécula de pre-miARN puede comprender adicionalmente uno de los sistemas de vehículo descritos en este documento (por ejemplo, una partícula de ácido nucleico) y encuentra utilidad en el tratamiento de cánceres tales como cáncer de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).

25 Tabla 9. Secuencias de miARN que abordan la expresión de PLK-1 humana.

Nombre del miARN maduro: Nº de acceso del miARN maduro Secuencia del miARN maduro (5' � 3') SEC ID Nº del miARN maduro Nº de acceso del premiARN

hsa-miR-509-3-5p: MIMAT0004975 UACUGCAGACGUGGCAAUCAUG 317 MI0005717

mmu-miR-705: MIMAT0003495 GGUGGGAGGUGGGGUGGGCA 318 MI0004689

hsa-miR-509-5p: MIMAT0004779 UACUG CAGACAG UGG CAAUCA 319 MI0003196

hsa-miR-505*: MIMAT0004776 GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU 320 MI0003190

mmu-miR-762: MIMAT0003892 GGGGCUGGGGCCGGGACAGAGC 321 MI0004215

84 85

hsa-miR-149*: MIMAT0004609 AGGGAGGGACGGGGGCUGUGC 322 MI0000478

hsa-miR-183: MIMAT0000261 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 323 MI0000273

hsa-miR-9*: MLMAT0000442 AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 324 MI0000466

mmu-miR-673-3p: MIMAT0004824 UCCGGGGCUGAGUUCUGUGCACC 325 MI0004601

hsa-miR-630: MIMAT0003299 AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU 326 MI0003644

hsa-miR-491-3p: MIMAT0004765 CUUAUGCAAGAUUCCCUUCUAC 327 MI0003126

hsa-miR-559: MIMAT0003223 UAAAGUAAAUAUGCACCAAAA 328 MI0003565

hsa-miR-593*: MIMAT0003261 AGGCACCAGCCAGGCAUUGCUCAGC 329 MI0003605

mmu-miR-327: MIMAT0004867 ACUUGAGGGGCAUGAGGAU 330 MI0005493

hsa-let-7f-2*: MIMAT0004487 CUAUACAGUCUACUGUCUUUCC 331 MI0000068

hsa-miR-100: MIMAT0000098 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 332 MI0000102

hsa-miR-767-3p: MIMAT0003883 UCUGCUCAUACCCCAUGGUUUCU 333 MI0003763

hsa-miR-532-3p: MIMAT0004780 CCUCCCACACCCAAGGCUUGCA 334 MI0003205

hsa-miR-106b*: MIMAT0004672 CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC 335 MI0000734

hsa-miR-568: MIMAT0003232 AUG UAUAAAUGUAUACACAC 336 MI0003574

hsa-miR-652: MIMAT0003322 AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG 337 MI0003667

hsa-let-7e*: MIMAT0004485 CUAUACGGCCUCCUAGCUUUCC 338 MI0000066

hsa-miR-340: MIMAT0004692 UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU 339 MI0000802

hsa-miR-198: MIMAT0000228 GGUCCAGAGG GGAGAUAGGUUC 340 MI0000240

hsa-miR-548b-5p: MIMAT0004798 AAAAGUAAUUGUGGUUUUGGCC 341 MI0003596

hsa-miR-452*: MIMAT0001636 CUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUG 342 MI0001733

hsa-miR-148b*: MIMAT0004699 AAGUUCUGUUAUACACUCAGGC 343 MI0000811

hsa-let-7g*: MIMAT0004584 CUGUACAGGCCACUGCCUUGC 344 MI0000433

hsa-miR-488: MIMAT0004763 UUGAAAGGCUAUUUCUUGGUC 345 MI0003123

mmu-miR-693-5p: MIMAT0003472 CAGCCACAUCCGAAAGUUUUC 346 MI0004662

hsa-miR-136: MIMAT0000448 ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA 347 MI0000475

hsa-miR-744: MIMAT0004945 UGCGGGGCUAGGGCUAACAGCA 348 MI0005559

hsa-miR-324-3p: MIMAT0000762 ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG 349 MI0000813

hsa-miR-320: MIMAT0000510 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 350 MI0000542

hsa-miR-99a: MIMAT0000097 AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 351 MI0000101

hsa-miR-590-5p: MIMAT0003258 GAGCUUAUUCAUAAAAGUGCAG 352 MI0003602

hsa-miR-622: MIMAT0003291 ACAGUCUGCUGAGGUUGGAGC 353 MI0003636

hsa-miR-151-5p: MIMAT0004697 UCGAGGAGCUCACAGUCU AGU 354 MI0000809

hsa-miR-142-5p: MIMAT0000433 CAUAAAGUAGAAAGCACUACU 355 MI0000458

hsa-miR-648: MIMAT0003318 AAGUGUGCAGGGCACUGGU 356 MI0003663

hsa-miR-643: MIMAT0003313 ACUUGUAUGCUAGCUCAGGUAG 357 MI0003658

hsa-miR-19a*: MIMAT0004490 AGUUUUG CAUAGUUGCACUACA 358 MI0000073

hsa-miR-516b: MIMAT0002859 AUCUGGAG GUAAGAAGCACUUU 359 MI0003172

hsa-miR-296-5p: MIMAT0000690 AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU 360 MI0000747

hsa-miR-619: MBvIAT0003288 GACCUGGACAUGUUUGUGCCCAGU 361 MI0003633

mmu-miR-742: MIMAT0004237 GAAAGCCACCAUGCUGGGUAAA 362 MI0005206

hsa-miR-147b: MIMAT0004928 GUGUGCGGAAAUGCUUCUGCUA 363 MI0005544

mmu-miR-466h: MIMAT0004884 UGUGUGCAUGUGCUUGUGUGUA 364 MI0005511

mmu-miR-700: MIMAT0003490 CACGCGGGAACCGAGUCCACC 365 MI0004684

hsa-miR-941: MBvIAT0004984 CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC 366 MI0005763

hsa-miR-21: MIMAT0000076 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 367 MI0000077

mmu-miR-666-5p: MIMAT0003737 AGCGGGCACAGCUGUGAGAGCC 368 MI0004553

hsa-miR-17*: MIMAT0000071 ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAG 369 MI0000071

hsa-miR-188-3p: MIMAT0004613 CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA 370 MI0000484

hsa-miR-520d-5p: MIMAT0002855 CUACAAAGGGAAGCCCUUUC 371 MI0003164

hsa-miR-19ª: MIMAT0000073 UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA 372 MI0000073

hsa-miR-153: MIMAT0000439 UUGCAU AGUCACAAAAGUGAUC 373 MI0000463

hsa-miR-554: MIMAT0003217 GCUAGUCCUGACUCAGCCAGU 374 MI0003559

hsa-miR-610: MIMAT0003278 UGAGCUAAAUGUGUGCUGGGA 375 MI0003623

hsa-miR-454: MIMAT0003885 UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU 376 MI0003820

hsa-miR-10b*: MIMAT0004556 ACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAU 377 MI0000267

hsa-miR-654-5p: MIMAT0003330 UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC 378 MI0003676

mmu-miR-466f-5p: MIMAT0004881 UACGUGUGUGUGCAUGUGCAUG 379 MI0005507

hsa-miR-210: MIMAT0000267 CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA 380 MI0000286

hsa-miR-603: MIMAT0003271 CACACACUGCAAUUACUUUUGC 381 MI0003616

hsa-miR-216b: MIMAT0004959 AAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGA 382 MI0005569

mmu-miR-704: MIMAT0003494 AGACAUGUGCUCUGCUCCUAG 383 MI0004688

hsa-miR-331-5p: MIMAT0004700 CUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC 384 MI0000812

mmu-miR-434-3p: MIMAT0001422 UWGAACCAUCACUCGACUCCU 385 MI0001526

hsa-miR-589: MIMAT0004799 UGAGAACCACGUCUGCUCUGAG 386 MI0003599

hsa-miR-548b-3p: MIMAT0003254 CAAGAACCUCAGUUGCUUUUGU 387 MI0003596

hsa-miR-10a*: MIMAT0004555 CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA 388 MI0000266

hsa-miR-604: MIMAT0003272 AGGCUGCGGAAUUCAGGAC 389 MI0003617

hsa-miR-485-3p: MIMAT0002176 GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU 390 MI0002469

mmu-miR-883b-3p: MIMAT0004851 UAACUGCAACAUCUCUCAGUAU 391 MI0005477

hsa-miR-329: MIMAT0001629 AACACACCUGGUUAACCUCUUU 392 MI0001725

hsa-miR-585: MIMAT0003250 UGGGCGUAUCUGUAUGCUA 393 MI0003592

hsa-miR-551b: MDAAT0003233 GCGACCCAUACUUGGUUUCAG 394 MI0003575

hsa-miR-886-3p: MIMAT0004906 CGCGGGUGCUUACUGACCCUU 395 MI0005527

mmu-miR-714: MIMAT0003505 CGACGAGGGCCGGUCGGUCGC 396 MI0004699

mmu-miR-293: MIMAT0000371 AGUGCCGCAGAGUUUGUAGUGU 397 MI0000391

hsa-miR-95: MIMAT0000094 UUCAACGG GUAUUUAUUGAGCA 398 MI0000097

hsa-miR-99b: MIMAT0000689 CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 399 MI0000746

Los Nº de acceso para las secuencias de miARN maduro y pre-miARN corresponden con las entradas que pueden encontrarse en la miRBase Sequence Database del Sanger Institute. La miRBase Sequence Database es una base de datos de búsqueda de secuencias de miARN publicadas y comentarios.

Experimento 19. ARNip modificados adicionales para PLK-1 son no inmunoestimuladores e inhiben el crecimiento de células cancerosas.

5 Se formularon moléculas de ARNip para PLK-1 que contenían 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos en posiciones selectivas en las hebras con sentido y antisentido del ARNip como SNALP y se evaluaron para sus efectos inhibidores sobre el crecimiento celular in vitro. Las secuencias de hebra con sentido y antisentido del ARNip modificado para PLK-1 se muestran en la Tabla 10. Las moléculas modificadas bicatenarias ejemplares de ARNip para PLK-1 generadas a partir de las secuencias de la Tabla 10 se muestran en la Tabla 11.

10 Tabla 10. Secuencias de hebra con sentido y antisentido de ARNip modificado para PLK-1.

ARNip: Secuencia 5' � 3' Hebra SEC ID Nº

PLK1424-1: AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU Con sentido 214

PLK1424-2: AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU Con sentido 400

PLK1424-3: UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU Antisentido 215

PLK1424-4: UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUC Antisentido 401

PLK1424-5: UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUC Antisentido 402

PLK1424-6: UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUC Antisentido 403

PLK1424-7: UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU Antisentido 216

PLK1424-8: UAUUUAAGGAGGGUGAUCUUU Antisentido 404

PLK773-1: AGACCUACCUCCGGAUCAAUU Con sentido 220

PLK773-2: AGACCUACCUCCGGAUCAAGA Con sentido 405

PLK773-3: UUGAUCCGGAGGUAGGUCUUU Antisentido 223

PLK773-4: UUGAUCCGGAGGUAGGUCUCU Antisentido 406

PLK773-5: UUGAUCCGGAGGUAGGUCUCU Antisentido 407

Columna 1: El número después de "PLK" se refiere a la posición de nucleótido de la base 5' de la hebra con sentido respecto al codón de inicio (ATG) de la secuencia de ARNm de PLK-1 humana NM_005030. Columna 2: Los 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos se indican en negrita y subrayados. El ARNip puede comprender alternativa o adicionalmente 2'-desoxi-2'-fluoro (2'F) nucleótidos, 2'-desoxi nucleótidos, 2'-O-(2-metoxietil) (MOE) nucleótidos, y/o nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA).

86

Tabla 11. Moléculas de ARNip para PLK-1 que comprenden secuencias de hebra con sentido y antisentido.

ARNip: Secuencia de ARNip para PLK-1 % de modificación 2'OMe % de modificación en región BC

PLK1424 1/3: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3 (SEC ID Nº 214) 3'-UUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 215) 6/42 = 14,3% 6/38 = 15,8%

PLK1424 1/4: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 214) 3'-CUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 401) 6/42 = 14,3% 6/38 = 15,8%

PLK1424 1/5: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 214) 3'-CUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 402) 7/42 = 16,7% 6/38 = 15,8%

PLK1424 1/6: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 214) 3'-CUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 403) 8/42 = 19% 7/38 = 18,4%

PLK1424 1/7: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 214) 3'-UUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 216) 7/42 = 16,7% 7/38 = 18,4%

PLK1424 1/8: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 214) 3'-UUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 404) 9/42 = 21,4% 9/38 = 23,7%

PLK1424 2/3: 5'-AGAUCACCCUCCU UAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 400) 3'-UUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 215) 7/42 = 16,7% 6/38 = 15,8%

PLK1424 2/4: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 400) 3'-CUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 401) 7/42 = 16,7% 6/38 = 15,8%

PLK1424 2/5: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 400) 3'-CUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 402) 8/42 = 19% 6/38 = 15,8%

PLK1424 2/6: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 400) 3'-CUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 403) 9/42 = 21,4% 7/38 = 18,4%

PLK1424 2/7: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 400) 3'-UUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 216) 8/42 = 19% 7/38 = 18,4%

PLK1424 2/8: 5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUAUU-3' (SEC ID Nº 400) 3'-UUUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEC ID Nº 404) 10/42 = 23,8% 9/38 = 23,7%

Columna 1: El número después de "PLK" se refiere a la posición de nucleótido de la base 5' de la hebra con sentido respecto al codón de inicio (ATG) de la secuencia de ARNm de PLK-1 humana NM_005030. Columna 2: Los 2'-O-metil (2'OMe) nucleótidos se indican en negrita y subrayados. El dúplex de ARNip puede comprender alternativa o adicionalmente 2'-desoxi-2'-fluoro (2'F) nucleótidos, 2'-desoxi nucleótidos, 2'-O-(2metoxietil) (MOE) nucleótidos, y/o nucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA). Columna 3: Se proporcionan el número y porcentaje de 2'OMe-nucleótidos modificados en la molécula de ARNip. Columna 4: Se proporcionan el número y porcentaje de nucleótidos modificados en la región bicatenaria (BC) de la molécula de ARNip.

Ensayos de viabilidad celular. Para ensayos de actividad de ARNip para PLK-1 in vitro, se cultivaron células HT29 en placas de 96 pocillos en presencia de ARNip para PLK-1 formulado en SNALP. Se realizó análisis de viabilidad

5 celular a las 72 horas después de transfección con un intervalo de dosificaciones de SNALP para PLK-1. La Figura 40 muestra que diferentes patrones de modificación química en la secuencia de ARNip PLK1424 se toleraban bien y las moléculas modificadas de ARNip retenían potente actividad en la eliminación de células tumorales humanas.

Ensayos de estimulación inmune in vivo. Se realizaron estudios en animales para ensayar la actividad

10 inmunoestimuladora de SNALP que contienen ARNip PLK1424 2'OMe-modificados. Se usaron ratones CD1 ICR hembra de 6 semanas de edad en este estudio. Se administró a los ratones ARNip formulados en SNALP resuspendidos en PBS mediante inyección intravenosa convencional en la vena lateral de la cola y después se sacrificaron 4 horas después de la administración de SNALP. La tolerabilidad del régimen de tratamiento se controló por el aspecto y comportamiento de los animales. Se recogió sangre por punción cardiaca y se procesó como

15 plasma para el análisis de citoquinas de los niveles de proteínas IFN-� e IL-6 por ELISA. Se recogieron el hígado y el bazo de los mismos animales en RNALater (Sigma Co.) para el análisis de ARNm de IFIT1 por ensayo de ADNb (QG).

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Claims

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