ES2398492T3 - Proteínas de fusión que comprenden los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1 - Google Patents
Proteínas de fusión que comprenden los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1 Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína de fusión, que comprende: (a) NY-ESO-1 o un fragmento del mismo, enlazado con (b) LAGE-1 o un fragmento del mismo, en la que al menos uno de NY-ESO-1 y/o LAGE-1 está truncado o parcialmente truncado, o es un fragmento queincluye uno o más epítopos de NY-ESO-1 o LAGE-1, comprendiendo la proteína de fusión una secuencia deaminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 73, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 79, SEC ID Nº 81,SEC ID Nº 83, SEC ID Nº 85 SEC ID Nº 89, SEC ID Nº 93 y SEC ID Nº 97.
Description
Proteínas de fusión que comprenden los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1
La presente invención se refiere en general a polipéptidos y a constructos que comprenden un antígeno derivado de uno de los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1 o de ambos.
Los antígenos de cáncer testicular (CT) son una clase de antígenos asociados a tumores con una expresión normalmente restringida a células germinales de los testículos, ovarios o células trofoblásticas. Estos antígenos no se expresan normalmente en tejidos somáticos adultos. Véase Simpson y col., Nat. Rev. Cancer, 5(8):615-625 (2005); Scanlan y col., Immunol. Reviews, 188:22-32 (2002); Scanlan y col., Canc. Immun., 4:1-15 (2004).
La regulación genética de los antígenos de CT se altera en los pacientes de cáncer, conduciendo a la expresión aberrante de estos antígenos en una amplia diversidad de tumores. El primer antígeno de CT que se identificó, MAGE-1, fue identificado a principios de la década de 1990, mediante la clonación del epítopo de linfocitos T (van der Bruggen y col., 1991 Science 13;254(5038):1643-7; van der Bruggen y col., 1999 Science 254:1643-1647; Traversari y col., 1992 Immunogenetics, 35(3):145-152; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5.342.774). Desde entonces, la técnica de clonación de expresión serológica (SEREX) (Sahin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 92(25):11810-11813 (1995) y patente de Estados Unidos Número 5.698.396), la expresión de antígeno recombinante sobre superficie de levadura (RAYS) (Mischo y col., Canc. Immun., 3:5-16 (2003)), y el análisis de expresión de ARNm diferencial (Gure y col., Int. J. Canc., 85(5):726-732 (2000)), han conducido a la identificación de aproximadamente 90 antígenos de CT, y se espera que su número crezca en los próximos años. La inmunogenicidad de algunos antígenos de CT en pacientes de cáncer, los hace un objetivo ideal para el desarrollo de vacunas tumorales.
NY-ESO-1. Un antígeno de cáncer testicular que actualmente es de interés para su uso en la inmunoterapia de cáncer es NY-ESO-1. Este antígeno fue primeramente identificado por SEREX en un carcinoma esofágico de células escamosas a finales de la década de 1990, en la Sucursal de Nueva York del Ludwig Institute for Cancer Research (Chen y col., PNAS EUA, 94(5):1914-1918 (1997); y patente de Estados Unidos Número 5.804.381).
La proteína NY-ESO-1 tiene una longitud de 180 aminoácidos y se puede describir como compuesta por tres regiones:
- •
- Una región N-terminal: aproximadamente o alrededor de los aminoácidos 1 a 70,
- •
- Una región central: aproximadamente o alrededor de los aminoácidos 71 a 134, y
- •
- Una región C-terminal: aproximadamente o alrededor de los aminoácidos 135 a 180.
Una región de tipo colágeno comprende aproximadamente o alrededor de los aminoácidos 15 a 73 de la región Nterminal (véase la Figura 1).
La proteína NY-ESO-1 se ha encontrado en una amplia variedad de tumores, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer esofágico, cáncer de vejiga, y en melanomas. (Nicholaou T y col., Immunol Cell Biol. Junio 2006; 84(3): 303-17 y Jungbluth y col., 2001, Int. J. Canc., 92(6): 856-860). Se han descrito respuestas inmuninatarias humorales y celulares espontáneas contra este antígeno en pacientes con tumores positivos a NY-ESO-1 y se ha identificado un número de péptidos restringidos a HLA (Antígeno de Leucocitos Humanos) clase I y II (Jager y col., 1998 J. Exp. Med., 187(2): 265-270; Yamaguchi y col., 2004 Clin. Canc. Res., 10(3): 890-961; y Davis y col., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 101(29):10697-10702). Los ejemplos de la literatura de patente son las patentes de Estados Unidos Números 6.140.050; 6.251.603; 6.242.052; 6.274.145; 6.338.947; 6.417.165; 6.525.177; 6.605.711; 6.689.742; 6.723.832; 6.756.044 y 6.800.730. En un estudio clínico, se usaron tres péptidos derivados de NY-ESO-1 parcialmente sobrelapados con motivos de unión con HLA-A2 (157-167, 157-165 y 155-163) en una vacuna para tratar a doce pacientes con tumores que expresaban NY-ESO-1 metastásico. Este estudio demostró que se pueden administrar péptidos de NY-ESO-1 sintéticos con seguridad, y son capaces de generar respuestas de linfocitos T potencialmente benéficas (Jager y col., 2000 PNAS EUA, 97(22): 12198-12203).
Se han identificado un número de epítopos de MHC (complejo de histocompatibilidad principal) de clase I y II en la proteína por diferentes grupos, véase, por ejemplo, la Figura 1. Estos epítopos son meramente representativos de los epítopos comunicados para la proteína, y la lista de la Figura 1 no es exhaustiva. Adicionalmente, al menos uno
o más de los epítopos comunicados y/o enumerados en la Figura 1 no han sido confirmados mediante experimentación. La región de tipo colágeno en el extremo N-teminal contiene al menos un epítopo de MHC de clase I denominado en el presente documento A31. La región central comprende varios epítopos de MHC de clase II, denominados en el presente documento DR1, DR2, DR4, DR7 y DP4. Esta región también contiene varios epítopos
de MHC de clase I denominados en el presente documento B35, B51, Cw3 y Cw6. Se cree que el extremo Cterminal contiene al menos dos epítopos de clase II (DR4 y DP4) y un epítopo de clase I (A2).
LAGE-1. También se ha identificado un antígeno de cáncer testicular adicional, LAGE-1. Se han descrito dos tránscriptos de LAGE-1: LAGE-1a y LAGE1b. LAGE-1b está ayustado incompletamente y codifica una proteína putativa de aproximadamente 210 residuos de aminoácidos, mientras que el producto genético LAGE-1a contiene 180 residuos de aminoácidos (Sun y col., Cancer Immunol Immunother 2006: 55: 644-652).
Las regiones N-terminales de las proteínas LAGE-1 y NY-ESO-1 están muy conservadas, y se piensa que tienen más del 97 por ciento de identidad. Sin embargo, LAGE-1 difiere de NY-ESO-1 en las regiones centrales, que son solamente idénticas en un 62 %. Los extremos C-terminales de NY-ESO-1 y LAGE-1 están muy conservados (más del 97 por ciento de identidad). Sin embargo, el extremo C-terminal de LAGE-1a es más largo y no está conservado, y se piensa que tiene menos del 50 por ciento de identidad con la misma región de LAGE-1a/NY-ESO-1.
La información general en relación con estas proteínas está disponible en el sitio web de LICR (véase www.cancerimmunity.org/CIdatabase).
La presente invención proporciona una proteína de fusión inmunogénica que comprende:
- (i)
- NY-ESO-1 o un fragmento del mismo, enlazado con
- (ii)
- LAGE-1 o un fragmento del mismo,
en la que al menos uno de NY-ESO-1 y/o LAGE-1 está truncado o parcialmente truncado, o es un fragmento que incluye uno o más epítopos de NY-ESO-1 o LAGE-1, comprendiendo la proteína de fusión una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 73, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 79, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 83, SEC ID Nº 85 SEC ID Nº 89, SEC ID Nº 93 y SEC ID Nº 97.
También se proporcionan composiciones que implican proteínas y polipéptidos de fusión.
La Figura 1 muestra un número de epítopos de MHC (complejo de histocompatibilidad principal) de clase I y clase II en la proteína NY-ESO-1, que han sido identificados por diferentes grupos. Estos epítopos son meramente representativos de los epítopos comunicados para la proteína, de modo que la lista de la Figura 1 no es exhaustiva. Adicionalmente, al menos uno o más de los epítopos comunicados y/o enumerados en la Figura 1 no han sido confirmados mediante experimentación. La secuencia de aminoácidos que se ha comunicado para NY-ESO-1 se encuentra en el presente documento en la SEC ID Nº 49.
La Figura 2 muestra el constructo A, una proteína de fusión que comprende el NY-ESO-1 de longitud completa y el LAGE-1 truncado, tal como LAGE-1a. En esta realización, el extremo C-terminal del NY-ESO-1 está fusionado con el extremo N-terminal del LAGE-1 truncado, junto con una etiqueta de afinidad de histidina para proporcionar una proteína de fusión de 288 aminoácidos de longitud. Otros detalles del constructo A se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 1; SEC ID Nº 3).
La Figura 3 muestra el constructo B, una proteína de fusión que comprende el primer tercio de la proteína D sin su señal de secreción (por ejemplo, los aminoácidos 20 a 127), el NY-ESO-1 de longitud completa y el LAGE-1 truncado, tal como LAGE-1a. En esta realización, el aminoácido 127 de la proteína D está fusionado con el extremo N-terminal de NY-ESO-1, estando fusionado el extremo C-terminal del mismo con el extremo N-terminal del LAGE-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 398 aminoácidos de longitud. Otros detalles del constructo B se dan en la Tabla 1, en la sección 1.6 (SEC ID Nº 2; SEC ID Nº 4).
La Figura 4 muestra el constructo C, una proteína de fusión que comprende el NY-ESO-1 parcialmente truncado y el LAGE-1 truncado, tal como LAGE-1a. En esta realización, el extremo C-terminal del NY-ESO-1 parcialmente truncado está fusionado con el extremo N-terminal del LAGE-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 242 aminoácidos de longitud. Más detalles del constructo C se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 5; SEC ID Nº 7).
La Figura 5 muestra el constructo D, una proteína de fusión que comprende el primer tercio de la proteína D sin su señal de secreción (por ejemplo, los aminoácidos 20 a aproximadamente 127), el NY-ESO-1 parcialmente truncado y el LAGE-1 truncado, tal como LAGE-1a. En esta realización, el aminoácido 127 de la proteína D está fusionado con el extremo N-terminal del NY-ESO-1 parcialmente truncado, estando fusionado el extremo C-terminal del mismo con el extremo N-terminal del LAGE-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 352 aminoácidos de longitud. Más detalles de esta realización se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 6; SEC ID Nº 8).
La Figura 6 muestra el constructo E, una proteína de fusión que comprende el NY-ESO-1 truncado y el LAGE-1
truncado, tal como LAGE-1a. En esta realización, el extremo C-terminal del NY-ESO-1 truncado está fusionado con el extremo N-terminal del LAGE-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 211 aminoácidos de longitud. Otros detalles del constructo E se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 9; SEC ID Nº 11).
La Figura 7 muestra el constructo F, una proteína de fusión que comprende el primer tercio de la proteína D sin su señal de secreción (por ejemplo, los aminoácidos 20 a aproximadamente 127), el NY-ESO-1 truncado y el LAGE-1 truncado, tal como LAGE-1a. En esta realización, el aminoácido 127 de la proteína D está fusionado con el extremo N-terminal del NY-ESO-1 truncado, estando fusionado el extremo C-terminal del mismo con el extremo N-terminal del LAGE-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 321 aminoácidos de longitud. Otros detalles del constructo F se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 10; SEC ID Nº 12).
La Figura 8 muestra una realización alternativa del constructo E, en decir, E', en el que el extremo C-terminal del LAGE-1 truncado está fusionado con el extremo N-terminal del NY-ESO-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 212 aminoácidos de longitud. Más detalles de esta realización del constructo E' se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 21; SEC ID Nº 23).
La Figura 9 muestra el constructo G, una proteína de fusión que comprende el NY-ESO-1 truncado, el LAGE-1 truncado, tal como LAGE-1a, y la región de tipo colágeno, tal como la región de tipo colágeno de NY-ESO-1. En esta realización, el extremo C-terminal de la región de tipo colágeno, por ejemplo, está fusionado con el extremo Nterminal del LAGE-1 truncado. A su vez, el extremo C-terminal del LAGE-1 truncado está fusionado con el extremo N-terminal del NY-ESO-1 truncado, para proporcionar una proteína de fusión de 289 aminoácidos de longitud. Más detalles del constructo G se dan en la Tabla 1 (SEC ID Nº 13; SEC ID Nº 15).
La Figura 10 muestra un esquema de un polipéptido recombinante a modo de ejemplo que comprende NY-ESO-1 con un dominio de tipo colágeno parcialmente truncado. Los epítopos mostrados en las Figuras 10 a 13 son meramente representativos de los epítopos comunicados para la proteína y no han sido confirmados mediante experimentación.
La Figura 11 muestra un esquema de una proteína de fusión a modo de ejemplo que comprende el primer tercio de la proteína D sin su señal de secreción (por ejemplo, los aminoácidos 20 a aproximadamente 127) y NY-ESO-1 con un dominio de tipo colágeno parcialmente truncado.
La Figura 12 muestra un esquema de un polipéptido recombinante a modo de ejemplo que comprende NY-ESO-1 con un dominio de tipo colágeno parcialmente truncado.
La Figura 13 muestra un esquema de una proteína de fusión a modo de ejemplo que comprende el primer tercio de la proteína D sin su señal de secreción (por ejemplo, los aminoácidos 20 a aproximadamente 127) y NY-ESO-1 con un dominio de tipo colágeno truncado.
La Figura 14 es un esquema que muestra un número de epítopos identificados dentro de la proteína LAGE-1a truncada. Estos epítopos son meramente representativos de los epítopos comunicados para la proteína, y por consiguiente, la lista no es exhaustiva. Para evitar dudas, los epítopos comunicados y/o enumerados en las figuras pueden haberse confirmado o no mediante experimentación (es decir, pueden haber sido predichos, etc.), a menos que se indique lo contrario en el presente documento. La secuencia de aminoácidos completa de LAGE-1a se establece en el listado de secuencias como la SEC ID Nº 58. La secuencia de aminoácidos completa de LAGE-1b (LAGE-1b no se ilustra en esta Figura) se establece en el listado de secuencias como la SEC ID Nº 71.
La Figura 15 muestra un esquema de tanto NY-ESO-1 como LAGE-1, así como un número de epítopos de MHC (complejo de histocompatibilidad principal) de clase I y II. Estos epítopos son meramente representativos de los epítopos comunicados para la proteína, y por consiguiente, la lista no es exhaustiva; uno o más de los epítopos comunicados y/o enumerados no han sido confirmados mediante experimentación.
La Figura 16 muestra un esquema del diseño de fusión NY-ESO-1/LAGE-1.
La Figura 17 resume, de una forma esquemática, quince constructos y sus niveles de producción. P = proteína D; C (cuadro gris) = dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1; C (cuadro blanco) = dominio de tipo colágeno truncado; L = Lage 1 sin el dominio de tipo colágeno; N = NY-ESO-1 sin el dominio de tipo colágeno; flecha negra = cola de polihistidina; (-) = baja producción; (+) = alguna producción; (++) = alta producción; (+++) = la mejor producción. Las secuencias de aminoácidos para ocho de los constructos y las secuencias de nucleótidos que los codifican se resumen en la Tabla 4 y en el listado de secuencias.
La Figura 18 resume la investigación Nº 1, un estudio de 76 días que usa ratones CB6F1 para evaluar cada uno de LVL076, LVL079, LVL78, LVL68, LVL020, LVL26, LVL024, LVL30 con el fin de determinar si la inmunización intramuscular con la proteína de fusión más el coadyuvante confirió protección frente a la exposición subcutánea a tumores trasplantados (B16/NYESO1).
La Figura 19 resume el crecimiento tumoral de B-16-NY-ESO-1 en los ratones de control usados en el estudio de 76 días.
La Figura 20 muestra la supervivencia de los ratones inmunizados con NY-ESO-1 de longitud completa, LVL030, LVL068, LVL079, o LVL026.
La Figura 21 resume las respuestas inmunitarias específicas de NY-ESO-1, tal como se evaluaron mediante ELISA, FACS e inmunotransferencia (Western), y las respuestas inmunitarias específicas de LAGE-1a (sin el dominio de tipo colágeno), tal como se evaluaron mediante ELISA y FACS.
La Figura 22 resume el diseño experimental de la investigación Nº 2, un estudio de 105 días con el fin de determinar si la inmunización intramuscular con las proteínas de fusión seleccionadas más el coadyuvante confiere protección frente a la exposición a B16/NY-ESO-1 y la exposición a B16/LAGE-1a. Se muestra la exposición a B16/NY-ESO-1.
La Figura 23 resume la investigación Nº 2 y muestra la exposición a B16/LAGE-1a.
La Figura 24 muestra la supervivencia de los ratones inmunizados con LVL078, LVL068, NY-ESO-1 de longitud completa, LVL024 y LVL076 después de la exposición a B16/NY-ESO-1. Véase la Figura 24.
La Figura 25 muestra la supervivencia de los ratones inmunizados con LVL076, LAGE-1a sin la región de tipo colágeno, LVL024, NY-ESO-1 de longitud completa, LVL078, o LVL068 después de la exposición a B16/LAGE-1a.
Figura 26. Las columnas 1 a 8, de izquierda a derecha, muestran los resultados de los ELISA llevados a cabo para detectar las posibles respuestas inmunitarias específicas de colágeno humano en los ratones inmunizados con uno de los siguientes: (1) Tampón (control); (2) NY-ESO-1 de longitud completa; (3) LAGE-1a sin el dominio de tipo colágeno; (4) LVL068; (5) LVL078; (6) LVL024; (7) LVL076. El control positivo (columna 8) contiene un anticuerpo monoclonal anti-colágeno humano 1 (mAb anti-colágeno humano I).
Proteínas de fusión. Las proteínas de fusión de la invención son útiles para el tratamiento de cánceres, y más específicamente para el tratamiento de: melanoma; cáncer de mama; cáncer de próstata; cáncer de vejiga incluido el carcinoma de células de transición; cáncer de pulmón incluido el carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC); cáncer de cabeza y cuello incluido el carcinoma esofágico; carcinoma de células escamosas; carcinoma del tracto gastrointestinal; cáncer de hígado; tumores de cerebro; leucemia y diferentes sarcomas.
En base a los perfiles de expresión de LAGE-1 y NY-ESO-1, la proteína de fusión según la invención tiene el potencial para ser eficaz en un 37 % estimado de cánceres de mama. El tratamiento según la presente invención también puede ser particularmente adecuado para el tratamiento de pacientes no elegibles para la terapia dirigida a Her2/neu. También se ha predicho que la proteína de fusión de la invención es eficaz en aproximadamente el 35 % de los pacientes de cáncer de próstata, en el 35 % de los pacientes de cáncer de vejiga, en el 40 % de los pacientes de melanoma, y en el 35 % de los pacientes con NSCLC (carcinoma pulmonar de células no pequeñas). En una realización, la proteína de fusión de la invención puede posibilitar que se trate a una población más amplia de pacientes, debido a que a los pacientes que tengan tumores que expresen NY-ESO-1 y/o LAGE-1 (incluidos LAGE1a y LAGE-1b), se les puede administrar una proteína de fusión de la presente invención.
La proteína de fusión según la invención también puede ser más inmunogénica que sus proteínas componentes individuales, por las siguientes razones:
- •
- la eliminación de uno o más de los dominios de tipo colágeno puede reducir la inmunotolerancia potencial del compuesto causada por su homología con la estructura de colágeno endógena natural, o
- •
- la adición opcional de un asociado de fusión heterólogo puede estimular adicionalmente las respuestas de los linfocitos T CD4. Por consiguiente, las proteínas de fusión son útiles para inducir una respuesta inmunogénica a un antígeno de cáncer, tal como NY-ESO-1 o LAGE-1, o ambos.
El NY-ESO-1 descrito en el presente documento puede ser NY-ESO-1 de longitud completa, estar parcialmente truncado, o truncado, o cualquier fragmento del mismo que incluya uno o más epítopos capaces de provocar una respuesta inmunitaria al NY-ESO-1. La proteína NY-ESO-1 de longitud completa, en el contexto de la presente memoria descriptiva, se pretende que signifique una proteína de aproximadamente 1 a 180 aminoácidos y al menos el 95, 96, 97, 98, 99 % o 100 % idéntica a la proteína de origen natural (SEC ID Nº 49). Tal como se usa en el presente documento, el término "LAGE-1" se refiere a uno o más miembros de la familia LAGE-1, tales como LAGE1a y LAGE 1b, tal como se describen en las siguientes líneas. Proteína "LAGE-1a de longitud completa" se pretende que signifique una proteína que es el 95, 96, 97, 98, 99 % o 100 % idéntica a la proteína de origen natural (SEC ID Nº 71).
En un ejemplo, la identidad está sobre la longitud completa de la secuencia. Por consiguiente, también se describen
proteínas de fusión con sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas y se establecen en general como las matrices de puntuación predeterminada en los programas informáticos de alineamiento de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M.O. y col., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (editor), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), y "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89 (Biochemistry): 10915-10919.
En términos generales, la sustitución dentro de los siguientes grupos son sustituciones conservadoras, pero las sustituciones entre grupos se consideran no conservadas. Los grupos son:
i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina,
ii) Serina/treonina,
iii) Lisina/arginina,
iv) Fenilalanina/tirosina/triptófano,
v) Leucina/isoleucina/valina/metionina,
vi) Glicina/alanina.
"Parcialmente truncada", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se pretende que signifique la proteína NY-ESO-1 o LAGE-1 (como sea apropiado) en la que se ha eliminado la mayor parte de la región de tipo colágeno, pero que todavía comprende o consiste en el epítopo A31 encontrado en esta región.
En un ejemplo, el NY-ESO-1 y/o LAGE-1 parcialmente truncado comprende o consiste en una serie de aminoácidos desde el aminoácido 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o 52 hasta el aminoácido 175, 176, 177, 178, 179 o 180 o cualquier combinación de estos aminoácidos, por ejemplo desde el aminoácido 48 hasta el aminoácido 180 o desde el aminoácido 46 hasta el 178. En una realización, el NY-ESO-1 o LAGE-1 parcialmente truncado comprende o consiste en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 48 a 180 (o aproximadamente o exactamente los aminoácidos 48 a 210 en el caso de LAGE-1b). En una realización, el término “aproximadamente”, en el presente contexto, puede entenderse como que se añade o se elimina de la secuencia hasta +/-10 % de aminoácidos del número total de aminoácidos de la secuencia. En una realización, el NY-ESO-1 parcialmente truncado comprende o consiste en los aminoácidos 48 hasta 180 de NY-ESO-1.
En un ejemplo, el LAGE-1b parcialmente truncado comprende o consiste en una serie de aminoácidos desde el aminoácido 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o 52 hasta el aminoácido 205, 206, 207, 208, 209 o 210 o cualquier combinación de estos aminoácidos, por ejemplo desde el aminoácido 48 hasta el aminoácido 210 o desde el aminoácido 46 hasta el 208. En un ejemplo, el LAGE-1b parcialmente truncado comprende o consiste en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 48 hasta 210. El término “aproximadamente”, en el presente contexto, puede entenderse como que opcionalmente se añade a, o se elimina de, la secuencia hasta +/-10 % de aminoácidos del número total de aminoácidos de la secuencia. En un ejemplo, el LAGE-1b parcialmente truncado comprende o consiste en los aminoácidos 48 hasta 210 de LAGE-1b.
"Truncado", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se pretende que signifique la proteína NY-ESO-1 o LAGE-1 (como sea apropiado) en la que se ha eliminado la región de tipo colágeno (incluyendo la eliminación del epítopo A31). El NY-ESO-1 y/o LAGE 1 truncado comprende o consiste en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 71 a 180 (o aproximadamente o exactamente los aminoácidos 71 a 210 en el caso de LAGE-1b).
En un ejemplo, el NY-ESO-1 o LAGE-1 truncado comprende o consiste en una serie de aminoácidos desde el aminoácido 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 o 75 hasta el aminoácido 175, 176, 177, 178, 179 o 180 o cualquier combinación de estos aminoácidos, por ejemplo desde el aminoácido 71 hasta el aminoácido 180 o desde el aminoácido 69 hasta el 178. En un ejemplo el NY-ESO-1 o LAGE-1 truncado comprende o consiste en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 71 hasta 180 (o aproximadamente o exactamente los aminoácidos 71 a 210 en el caso de LAGE-1b).
El término “aproximadamente”, en el presente contexto, puede entenderse como que opcionalmente se añade a, o se elimina de, la secuencia hasta +/-10 % de aminoácidos del número total de aminoácidos de la secuencia. En una realización, el NY-ESO-1 o LAGE-1 truncado comprende o consiste en los aminoácidos 71 hasta 180 de NY-ESO-1
o LAGE-1.
En una realización, el LAGE-1 truncado comprende o consiste en una gama de aminoácidos desde el aminoácido 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 o 75 hasta el aminoácido 205, 206, 207, 208, 209 o 210 o cualquier combinación de estos aminoácidos, por ejemplo desde el aminoácido 71 hasta el aminoácido 210 o desde el aminoácido 69 hasta el
208. En una realización, el LAGE-1b truncado comprende o consiste en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 71 hasta 210. El término “aproximadamente”, en el presente contexto, puede entenderse como que opcionalmente se añade a, o se elimina de, la secuencia hasta +/-10 % de aminoácidos del número total de aminoácidos de la secuencia. En un ejemplo, el LAGE-1b truncado comprende o consiste en los aminoácidos 71 hasta 210 de LAGE-1b.
Por "otros fragmentos" se pretende decir los que cuando se incorporan en la proteína de fusión de la invención, dan como resultado una proteína final con las propiedades deseadas y las ventajas de las proteínas de fusión de la invención.
NY-ESO-1. De conformidad con lo anterior, se proporcionan antígenos modificados que comprenden un antígeno derivado del antígeno de rechazo tumoral NY-ESO-1, en los que la región de colágeno está parcialmente truncada o completamente truncada. En algunos ejemplos, se elimina más que la región de colágeno. En algunos ejemplos, el antígeno modificado está genéticamente modificado. En algunos ejemplos, el antígeno modificado es recombinante. En algunos ejemplos, se proporcionan polipéptidos que comprenden un antígeno tal como se describe en los enunciados anteriores. En algunos ejemplos, los polipéptidos a modo de ejemplo comprenden una proteína heteróloga, tal como proteína D de Haemophilus influenzae de tipo B o un fragmento de la misma. En algunos ejemplos, se proporcionan constructos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos anteriormente mencionados.
En algunas realizaciones, se proporciona un polipéptido inmunogénico que comprende NY-ESO-1 o un fragmento del mismo, en el que NY-ESO-1 no incluye la región de tipo colágeno. En otras, NY-ESO-1 está parcialmente truncado o truncado, o comprende cualquier fragmento del mismo que incluya uno o más epítopos. En algunas realizaciones, estos polipéptidos tienen sustituciones conservadoras. En algunas realizaciones, estos polipéptidos y constructos son útiles como un producto profiláctico para la prevención o la disminución sustancial de recurrencia de cáncer.
Las proteínas para su inclusión en un asociado de fusión de la presente invención se pueden conjugar químicamente, o se pueden expresar como proteínas de fusión recombinantes. En una realización, la proteína de fusión se expresa como una proteína de fusión recombinante.
El asociado de fusión heterólogo adicional puede ayudar a proporcionar epítopos auxiliares T (asociado de fusión inmunológico), o puede ayudar en la expresión de la proteína con rendimientos más altos (potenciador de la expresión). En una realización, el asociado de fusión heterólogo adicional puede ser tanto un asociado de fusión inmunológico como un asociado potenciador de la expresión.
En una realización, la proteína D o un derivado de la misma, comprende aproximadamente o exactamente el primer tercio de la proteína, por ejemplo, aproximadamente o exactamente los aminoácidos 1 a 109 de la proteína D. En esta realización, los aminoácidos 2-Lys y/o 3-Thr de la secuencia de protéina D nativa pueden sustituirse con los aminoácidos 2-Asp y/o 3-Pro. En una realización adicional, la proteína D o un derivado de la misma, comprende o consiste en aproximadamente o exactamente los aminoácidos 20 a 127 de la proteína D. En una realización, la proteína D para su uso en la presente invención no incluye la secuencia de secreción de la proteína. En términos generales, en las proteínas de fusión de la presente invención, el derivado de la proteína D no está lipidado.
En una realización, la proteína D comprende además los aminoácidos Met, Asp y Pro, por ejemplo, fusionados con el extremo N-terminal del fragmento de la proteína D (es decir, el constructo puede comprender o consistir en "MDP -20-127 proteína D"). Se piensa que estos tres aminoácidos adicionales pueden ayudar a la estabilidad de la proteína y/o aumentar el nivel de expresión de proteína de la misma.
En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión en el que el fragmento N-terminal (es decir el primer tercio) de la proteína D (tal como se ha descrito anteriormente) está fusionado con el extremo N-terminal de una proteína de fusión de la invención o un fragmento inmunogénico de la misma. De una manera más específica, se puede efectuar una fusión de la proteína D y el extremo N-terminal de la proteína de fusión de la invención de tal manera que éste último reemplace al fragmento C-terminal de la proteína D que se vaya a escindir. Por consiguiente, el extremo N-terminal de la proteína D se convierte en el extremo N-terminal de la proteína de fusión.
Se pueden incluir otros asociados de fusión heterólogos o fragmentos de los mismos en la proteína de fusión de la invención, en lugar de, o en adición a, la proteína D, por ejemplo:
- •
- la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Normalmente, se pueden usar los 81 aminoácidos N-terminales, aunque se pueden usar diferentes fragmentos, conla condición de que incluyan a los epítopos auxiliares-T;
- •
- LytA derivado de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza un LytA de amidasa de N-acetil-Lalanina codificado por el gen LytA (Gen, 43 (1986) páginas 265-272), tal como la porción de repetición de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal, por ejemplo empezando en el residuo 178, tal como los residuos 188 a 305. En una realización, el asociado de fusión heterólogo es CLytA. En una realización adicional, el asociado de fusión heterólogo es CPC, una proteína de fusión que comprende CLytA-P2-CLytA, tal como se describe en el documento WO03/104272. La purificación de las proteínas híbridas que contienen al fragmento C-LytA en su extremo amino terminal se ha descrito en Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798.
Las proteínas de fusión de la invención pueden incluir además una etiqueta de afinidad, por ejemplo, una cola de
histidina (también conocida como una cola de His) que comprende entre 1 y 10, por ejemplo, 6 o 10 residuos de histidina. Estos residuos pueden estar, por ejemplo, en la porción terminal, tal como la porción N-terminal y/o Cterminal de la proteína. La etiqueta de afinidad se puede incorporar para mejorar adicionalmente la purificación de la proteína.
Por ejemplo, se pueden construir determinadas proteínas de fusión específicas de la invención tal como se describe en las Figuras. Cada una de las realizaciones representadas en las Figuras representa aspectos independientes de la invención. Se dan ejemplos adicionales de constructos de proteínas de fusión según la presente invención en las Tablas 1 a 4 y en el Listado de secuencias.
Ácidos Nucleicos. La presente invención también se extiende a los ácidos nucleicos y a los ácidos polinucleicos, tales como ADN, que codifican las proteínas de fusión de la invención. Los procedimientos de la invención se pueden llevar a cabo mediante técnicas recombinantes convencionales, tales como las que se describen en Maniatis y col., Molecular Cloning -A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989. En particular, un procedimiento puede comprender las etapas de:
i) preparar un vector de expresión replicable o integrador capaz de expresar, en una célula huésped, un polímero de ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique la proteína de fusión o un derivado inmunogénico de la misma;
ii) transformar una célula huésped con este vector;
iii) cultivar la célula huésped transformada en condiciones que permitan la expresión del polímero de ADN para producir la proteína mencionada; y
iv) recuperar dicha proteína.
El término "transformar" tal como se usa en el presente documento significa la introducción de ADN extraño en una célula huésped. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante transformación, transfección o infección con un plásmido o vector vírico apropiado, usando, por ejemplo, técnicas convencionales, tal como se describen en Genetic Engineering; Editores. S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. El término "transformado" o "transformante" se aplicará posteriormente en el presente documento a la célula huésped resultante que contenga y exprese el gen extraño de interés. Los vectores de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la presente invención son novedosos y también forman parte de la invención.
Los vectores de expresión replicables se pueden preparar según la invención escindiendo un vector compatible con la célula huésped para proporcionar un segmento de ADN lineal que tiene un replicón intacto y combinando este segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal, codifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la invención o un derivado de la misma en condiciones de ligamiento. Por consiguiente, el polímero de ADN se puede preformar o formar durante la construcción del vector, como se desee.
La elección del vector se determinará en parte por la célula huésped, que puede ser procariótica o eucariótica, pero en general son células de E. coli o CHO. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, por ejemplo TMCP14 o pET21
- o pET26, pcDNA3, bacteriófagos, cósmidos, y virus recombinantes. En una realización en la que la expresión es en baculovirus, levadura, o células huésped de CHO, se podría usar uno de los siguientes vectores: pEE14, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pDMT-DEST48 y pAcSG2. La preparación del vector de expresión replicable se puede llevar a cabo convencionalmente con enzimas apropiadas para la restricción, polimerización, y ligamiento del ADN, mediante los procedimientos descritos, por ejemplo, en Maniatis y col., citado anteriormente.
La célula huésped recombinante se prepara, según la invención, mediante la transformación de la célula huésped con un vector de expresión replicable de la invención en condiciones de transformación. Las condiciones de transformación adecuadas son convencionales y se describen, por ejemplo, en Maniatis y col., citado anteriormente,
- o en "DNA Cloning" Volumen II, D.M. Glover editor, IRL Press Ltd, 1985. La elección de las condiciones de transformación la determina la célula huésped. Por consiguiente, un huésped bacteriano, tal como E. coli, se puede tratar con una solución de CaCl2 (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110), o con una solución que comprenda una mezcla de RbCl, MnCl2, acetato de potasio y glicerina, y después con ácido 3-[N-morfolino]-propansulfónico, RbCl, y glicerina. Las células de mamífero en cultivo se pueden transformar mediante coprecipitación de calcio del ADN del vector sobre las células. La invención también se extiende a una célula huésped transformada con un vector de expresión replicable de la invención.
Se pueden optimizar los codones del ADN mediante técnicas convencionales para facilitar adicionalmente la expresión del huésped relevante.
El cultivo de la célula huésped transformada en condiciones que permitan la expresión el polímero de ADN se lleva a cabo convencionalmente, tal como se describe, por ejemplo, en Maniatis y col., y en "DNA Cloning" citado anteriormente. Por consiguiente, preferentemente, a la célula se le suministran nutrientes y se cultiva a una temperatura inferior a 50 °C. Las proteínas de la presente invención se pueden expresar en procariotas o eucariotas,
tales como levadura, pero frecuentemente se expresan en E. coli. Las cepas particulares de E. coli son tales como:
- •
- AR58: Un derivado de lisógeno λ críptico de N99 que es gal E::Tn 10,!-8(chlD-pgl), !-H1(crochlA), N+, y c1857 (referencia: Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, Volumen82, páginas 88-92, Enero 1985, Biochemistry).
- •
- BLR (DE3) Novagen, WI, EUA (número de catálogo: 69053-4): BLR es un derivado recA– de BL21 que se puede usar. En términos generales, se incorpora un marcador de selección, por ejemplo de resistencia a la canamicina o de resistencia a la ampicilina, para facilitar la identificación de la incorporación con éxito del gen/constructo recombinante en el sistema de expresión.
El producto se recupera mediante procedimientos convencionales según la célula huésped, y según la localización del producto de expresión (intracelular o secretado al medio de cultivo o al periplasma celular). Por consiguiente, cuando la célula huésped es bacteriana, tal como E. coli, ésta, por ejemplo, se puede lisar físicamente, químicamente o enzimáticamente, y se puede aislar el producto proteico del lisado resultante. Cuando la célula huésped es de mamífero, el producto se puede aislar en general a partir del medio nutriente o a partir de extractos sin células. Las técnicas de aislamiento de proteínas convencionales incluyen precipitación selectiva, cromatografía por adsorción, y cromatografía por afinidad, incluida una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal.
Las proteínas de la presente invención se proporcionan bien en una forma soluble en un líquido o bien en una forma liofilizada. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, tal como una vacuna, que comprende una proteína de fusión de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Cuando se administran, las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden administrar en preparaciones farmacéuticamente aceptables. Estas preparaciones pueden contener de manera rutinaria concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tamponadores, conservantes, vehículos compatibles, agentes potenciadores inmunitarios complementarios tales como coadyuvantes y citocinas y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos.
Las cantidades dependerán, por supuesto, de la afección particular que se esté tratando, de la gravedad de la afección, de los parámetros individuales del paciente incluidos la edad, la condición física, la altura y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (en su caso), la vía de administración específica y factores similares, dentro del conocimiento y experiencia del médico. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden abordar con solo una experimentación rutinaria. En general es preferente usar una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta según un buen juicio médico. Entenderán los expertos en la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis más baja o una dosis tolerable por razones médicas, por razones psicológicas o por virtualmente cualesquiera otras razones. En general se espera que cada dosis para seres humanos comprenda de 1 a 1.000 μg de proteína y preferentemente de 3 a 300 μg.
En un aspecto, las composiciones farmacéuticas usdas para administrar las proteínas de fusión de la invención serán una vacuna. La vacuna puede contener opcionalmente uno o más antígenos asociados con tumor, polipéptidos y/o péptidos diferentes. Por ejemplo, los miembros pertenecientes a las familias MAGE, LAGE y GAGE.
Las proteínas de fusión de la presente invención pueden contener opcionalmente además, uno o más aminoácidos como "enlazantes" entre las secuencias del antígeno y los asociados de fusión o proteínas asociadas de fusión o entre el antígeno y una cola de His, si están presentes. Los aminoácidos pueden estar no relacionados con las secuencias del antígeno y/o asociado de fusión.
Las proteínas de fusión de la presente invención, tal como se describen en el presente documento, pueden contener adicionalmente los aminoácidos Met-Asp-Pro en el extremo N-terminal de la secuencia de la proteína de fusión. El aminoácido Met puede ser de la secuencia de la proteína D original o puede ser de una secuencia no relacionada.
La presente invención también se extiende a procedimientos para preparar dichas vacunas/composiciones y a proteínas de fusión y vacunas/composiciones obtenidas por o obtenibles por los procedimientos descritos.
La preparación de la vacuna se describe en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Editores: Powell M.F. y Newman M.J). (1995) Plenum Press, Nueva York). La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton, patente de Estados Unidos Número 4.235.877.
Las proteínas de fusión de la presente invención pueden estar coadyuvadas en una formulación de vacuna de la invención. Los coadyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, hiero o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónicamente o aniónicamente derivados, o polifosfacenos. Otros coadyuvantes conocidos incluyen los oligonucleótidos que contienen CpG. Los oligonucleótidos se caracterizan porque el dinucleótido CpG no está metilado. Estos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/02555.
En la formulación de la invención puede ser deseable que la composición de coadyuvante induzca una respuesta inmunitaria preferentemente del tipo TH1. En una realización se proporciona un sistema coadyuvante que incluye, por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido A, preferentemente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los oligonucleótidos de CpG también pueden inducir una respuesta de TH1 y también pueden estar incluidos.
En una realización se proporciona una composición que contiene una proteína de fusión como la descrita en el presente documento y una composición coadyuvante que contiene la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y 3D-MPL, tal como se da a conocer en el documento WO 94/00153, o una combinación menos reactogénica, en la que QS21 se inactiva con colesterol, tal como se da a conocer en el documento WO 96/33739. Una formulación que puede usarse, que contiene QS21, 3D-MPL y tocoferol, por ejemplo en una emulsión de aceite en agua, se describe en el documento WO 95/17210. Otra formulación coadyuvante es QS21, 3D-MPL y CpG, o el equivalente de los mismos, por ejemplo en una emulsión de aceite en agua, o como una formulación liposomal. De conformidad con lo anterior, en una realización de la presente invención, se proporciona una vacuna que comprende una proteína de fusión de la invención y un coadyuvante, por ejemplo tal como se describe anteriormente. La presente invención también se extiende a los procedimientos de preparación de vacunas y a composiciones que comprenden proteínas de fusión tal como se describen en el presente documento.
La presente invención también contempla el suministro de ácidos nucleicos, polipéptidos, o péptidos, tal como se describen en el presente documento, para vacunación. El suministro de polipéptidos y péptidos se puede llevar a cabo según los protocolos de vacunación convencionales, que son bien conocidos en la técnica. En otra realización, el suministro de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante procedimientos ex vivo, es decir, retirando una célula de un sujeto, diseñando genéticamente la célula para incluir un antígeno asociado con cáncer y volviendo a introducir la célula diseñada en el sujeto. En general, esto puede involucrar la introducción in vitro de una copia funcional de un gen en una célula de un sujeto y devolver la célula genéticamente diseñada al sujeto. La copia funcional del gen está bajo el control operativo de los elementos reguladores, que permiten la expresión del gen en las células diseñadas genéticamente. Numerosas técnicas de transfección y transducción, así como los vectores de expresión apropiados, son bien conocidos por los expertos en la técnica, algunos de las cuales se describen en la solicitud TCP WO 95/00654. También se contempla el suministro de ácidos nucleicos in vivo usando vectores, tales como virus y liposomas dirigidos, según la invención.
CO región de tipo colágeno.
W/Ocoll sin región de tipo colágeno (dominio de tipo colágeno).
PD1/3 primer tercio de la proteína D.
Las realizaciones a modo de ejemplo de las proteínas de fusión y las secuencias de nucleótidos que las codifican se proporcionan en las Tablas 1 a 3.
Tabla 1. Se proporcionan realizaciones a modo de ejemplo de las proteínas de fusión y las secuencias de nucleótidos que las codifican. Cada secuencia de nucleótidos se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de nucleótidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias. Cada proteína de fusión se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de aminoácidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias.
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- NY-ESO-1 de Colágeno Híbrido/LAGE1a sin colágeno
- 1
- Realización A – secuencia de nucleótidos NY-ESO-1 de colágeno Híbrido/LAGE1asin colágeno (codones optimizados)
- Dominio de tipo colágeno
- 1-210bp
- NY-ESO-1
- 1-537bp
- Enlazador
- 538-543bp
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- LAGE1a
- 544-846bp
- Cola de His
- 847-864bp
- De detención
- 865-867bp
- 2
- Realización B – secuencia de nucleótidos 1/3 proteína D/NY-ESO-1 de colágeno Híbrido/LAGE1a sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno
- 334-540bp
- NY-ESO-1
- 334-867bp
- Enlazador
- 868-873bp
- LAGE1a
- 874-1176bp
- Cola de His
- 1177-1194bp
- De detención
- 1195-1197bp
- 3
- RealizaciónRealización A – secuencia de aminoácidos NY-ESO-1 de Colágeno Híbrido/LAGE1a sin colágeno con cola de His
- Dominio de tipo colágeno
- 1-70aa
- NY-ESO-1
- 1-179aa
- Enlazador
- 180-181aa
- LAGE1a
- 182-282aa
- Cola de His
- 283-288aa
- 4
- Realización B – secuencia de aminoácidos 1/3 proteína D/NY-ESO-1 de Colágeno Híbrido/LAGE1a sin colágeno con cola de His
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- Dominio de tipo colágeno
- 112-180aa
- NY-ESO-1
- 112-289aa
- Enlazador
- 290-291aa
- LAGE1a
- 292-392aa
- Cola de His
- 393-398aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- NY-ESO-1 truncado de colágeno híbrido/LAGE1a sin colágeno
- 5
- Realización C -NY-ESO-1 truncado de colágeno híbrido/LAGE1a sin colágeno (codones optimizados)
- Dominio de tipo colágeno
- 1-72bp
- NY-ESO-1
- 1-399bp
- Enlazador
- 400-405bp
- LAGE1a
- 406-708bp
- Cola de His
- 709-726bp
- De detención
- 727-729bp
- 6
- Realización D – secuencia de nucleótidos--1/3 proteína D/NY-ESO-1 truncado de colágeno híbrido/LAGE1a sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno
- 334-402bp
- NY-ESO-1
- 334-729bp
- Enlazador
- 730-735bp
- LAGE1a
- 736-1038bp
- Cola de His
- 1039-1056bp
- De detención
- 1057-1059bp
- 7
- Realización C -NY-ESO-1 truncado de colágeno híbrido/LAGE1a sin colágeno con cola de His
- Dominio de tipo colágeno
- 1-24aa
- NY-ESO-1
- 1-133aa
- Enlazador
- 134-135aa
- LAGE1a
- 136-236aa
- Cola de His
- 237-242aa
- 8
- Realización D – secuencia de aminoácidos 1/3 proteína D/NY-ESO-1 truncado de colágeno híbrido/ LAGE1a sin colágeno con cola de His
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- Dominio de tipo colágeno
- 112-134aa
- NY-ESO-1
- 112-243aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- Enlazador
- 244-245aa
- LAGE1a
- 246-346aa
- Cola de His
- 347-352aa
- NY-ESO-1 híbrido/LAGE1a sin dominio de tipo colágeno y región rica en cisteína contigua (8aa)
- 9
- Realización E – secuencia de nucleótidos NY-ESO-1 híbrido/LAGE1a sin colágeno (codones optimizados)
- NY-ESO-1
- 1-306bp
- Enlazador
- 307-312bp
- LAGE1a
- 313-615bp
- Cola de His
- 616-633bp
- De detención
- 634-636bp
- 10
- Realización F – secuencia de nucleótidos 1/3 proteína D/NY-ESO-1 híbrido/LAGE1asin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- NY-ESO-1
- 334-636bp
- Enlazador
- 637-642bp
- LAGE1a
- 643-945bp
- Cola de His
- 946-963bp
- De detención
- 964-966bp
- 11
- Realización E – secuencia de aminoácidos NY-ESO-1 híbrido/LAGE1a sin colágeno con cola de His
- NY-ESO-1
- 1-102aa
- Enlazador
- 103-104aa
- LAGE1a
- 105-205aa
- Cola de His
- 206-211aa
- 12
- Realización F – secuencia de aminoácidos 1/3 proteína D/NY-ESO-1 híbrido/LAGE1asin colágeno con cola de His
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- NY-ESO-1
- 112-212aa
- Enlazador
- 213-214aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- LAGE1a
- 215-315aa
- Cola de His
- 316-321aa
- LAGE1a de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno
- 13
- Realización G – secuencia de nucleótidos LAGE1a de colágeno híbrido/NY-ESO-1sin colágeno (codones optimizados)
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-210bp
- LAGE1a
- 211-540bp
- Enlazador
- 541-546bp
- NY-ESO-1
- 547-849bp
- Cola de His
- 850-867bp
- De detención
- 868-870bp
- 14
- 1/3 proteína D/LAGE1a de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 334-540bp
- LAGE1a
- 541-870bp
- Enlazador
- 871-876bp
- NY-ESO-1
- 877-1179bp
- Cola de His
- 1180-1197bp
- De detención
- 1198-1200bp
- 15
- Realización G – secuencia de aminoácidos LAGE1a de colágeno híbrido/NY-ESO-1sin colágeno con cola de His
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-70aa
- LAGE1a
- 71-180aa
- Enlazador
- 181-182aa
- NY-ESO-1
- 183-283aa
- Cola de His
- 284-289aa
- 16
- 1/3 proteína D/LAGE1a de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His(codificado por la SEC ID Nº 14)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 112-180aa
- LAGE1a
- 181-290aa
- Enlazador
- 291-292aa
- NY-ESO-1
- 293-393aa
- Cola de His
- 394-399aa
- LAGE1a truncado de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno
- 17
- LAGE1a truncado de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno (codones optimizados)
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-72bp
- LAGE1a
- 73-402bp
- Enlazador
- 403-408bp
- NY-ESO-1
- 409-711bp
- Cola de His
- 712-729bp
- De detención
- 730-732bp
- 18
- 1/3 proteína D/LAGE1a truncado de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 334-402bp
- LAGE1a
- 403-732bp
- Enlazador
- 733-738bp
- NY-ESO-1
- 739-1041bp
- Cola de His
- 1042-1059bp
- De detención
- 1060-1062bp
- 19
- LAGE1a truncado de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His(codificado por la SEC ID Nº 17)
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-24aa
- LAGE1a
- 25-134aa
- Enlazador
- 135-136aa
- NY-ESO-1
- 137-237aa
- Cola de His
- 238-243aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- 20
- 1/3 proteína D/LAGE1a truncado de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 18)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 112-134aa
- LAGE1a
- 135-244aa
- Enlazador
- 245-246aa
- NY-ESO-1
- 247-347aa
- Cola de His
- 348-353aa
- LAGE1a híbrido/NY-ESO-1 sin dominio de tipo colágeno y región rica en cisteína contigua (8aa)
- 21
- Realización E' – secuencia de nucleótidos LAGE1a híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno (codones optimizados)
- LAGE1a
- 1-309bp
- Enlazador
- 310-315bp
- NY-ESO-1
- 316-618bp
- Cola de His
- 619-636bp
- De detención
- 637-639bp
- 22
- 1/3 proteína D/LAGE1a híbrido/NY-ESO1 sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- LAGE1a
- 334-639bp
- Enlazador
- 640-645bp
- NY-ESO-1
- 646-948bp
- Cola de His
- 949-966bp
- De detención
- 967-969bp
- 23
- Realización E' – secuencia de aminoácidos LAGE1a híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His
- LAGE1a
- 1-103aa
- Enlazador
- 104-105aa
- NY-ESO-1
- 106-206aa
- Cola de His
- 207-212aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- 24
- 1/3 proteína D/LAGE1a híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 22)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- LAGE1a
- 112-213aa
- Enlazador
- 214-215aa
- NY-ESO-1
- 216-316aa
- Cola de His
- 317-322aa
- His N-terminal -NY-ESO-1 híbrido/LAGE1a sin colágeno y región rica en cisteína contigua (8aa)
- 25
- Sitio de enterocinasa-His-NY-ESO-1/LAGE1a (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-36bp
- Sitio de enterocinasa
- 37-72bp
- NY-ESO-1
- 73-375bp
- Enlazador
- 376-381bp
- LAGE1a
- 382-684bp
- De detención
- 685-687bp
- 26
- Sitio de enterocinasa-His-NY-ESO-1/LAGE1a (codificado por la SEC ID Nº 25)
- Cola de His (10 His)
- 1-12aa
- Sitio de enterocinasa
- 13-24aa
- NY-ESO-1
- 25-125aa
- Enlazador
- 126-127aa
- LAGE1a
- 128-228aa
- 27
- His-NY-ESO-1/LAGE1a (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-21bp
- NY-ESO-1
- 22-324bp
- Enlazador
- 325-330bp
- LAGE1a
- 331-633bp
- De detención
- 634-636bp
- 28
- His-NY-ESO-1/LAGE1a (codificado por la SEC ID Nº 26)
- Cola de His (6 His)
- 1-7aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- NY-ESO-1
- 8-108aa
- Enlazador
- 109-110aa
- LAGE1a
- 111-211aa
- His-N-terminal NY-ESO-1 truncado de colágeno híbrido/ LAGE1a sin colágeno
- 29
- Sitio de enterocinasa-His-NY-ESO-1 de colágeno truncado/LAGE1a (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-36bp
- Sitio de enterocinasa
- 37-72bp
- Dominio de tipo colágeno
- 73-141bp
- NY-ESO-1
- 73-468bp
- Enlazador
- 469-474bp
- LAGE1a
- 475-777bp
- De detención
- 778-780bp
- 30
- Sitio de enterocinasa-His-NY-ESO-1 de colágeno truncado/LAGE1a (codificado por la SEC ID Nº 29)
- Cola de His (10 His)
- 1-12aa
- Sitio de enterocinasa
- 13-24aa
- Dominio de tipo colágeno
- 25-47aa
- NY-ESO-1
- 25-156aa
- Enlazador
- 157-158aa
- LAGE1a
- 159-259aa
- 31
- His-NY-ESO-1 de colágeno truncado/LAGE1a (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-21bp
- Dominio de tipo colágeno
- 22-90bp
- NY-ESO-1
- 22-417bp
- Enlazador
- 418-423bp
- LAGE1a
- 424-726bp
- De detención
- 727-729bp
- 32
- His-NY-ESO-1 de colágeno truncado/LAGE1a (codificado por la SEC ID Nº 31)
- Cola de His (6 His)
- 1-7aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- Dominio de tipo colágeno
- 8-30aa
- NY-ESO-1
- 31-139aa
- Enlazador
- 140-141aa
- LAGE1a
- 142-242aa
- His N-terminal -NY-ESO-1 de Colágeno Híbrido/LAGE1a sin dominio de tipo colágeno
- 33
- Sitio de enterocinasa-His-NY-ESO-1 de colágeno/LAGE1a (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-36bp
- Sitio de enterocinasa
- 37-72bp
- Dominio de tipo colágeno
- 73-279bp
- NY-ESO-1
- 73-606bp
- Enlazador
- 607-612bp
- LAGE1a
- 613-915bp
- De detención
- 916-918bp
- 34
- Sitio de enterocinasa-His-NY-ESO-1 de colágeno/LAGE1a (codificado por la SEC ID Nº 33)
- Cola de His (10 His)
- 1-12aa
- Sitio de enterocinasa
- 13-24aa
- Dominio de tipo colágeno
- 25-93aa
- NY-ESO-1
- 25-202aa
- Enlazador
- 203-204aa
- LAGE1a
- 205-305aa
- 35
- His-NY-ESO-1 de colágeno/LAGE1a (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-21bp
- Dominio de tipo colágeno
- 22-228bp
- NY-ESO-1
- 22-555bp
- Enlazador
- 556-561bp
- LAGE1a
- 562-864bp
- De detención
- 865-867bp
- 36
- His-NY-ESO-1 de colágeno/LAGE1a (codificado por la SEC ID Nº 35)
- Cola de His (6 His)
- 1-7aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- Dominio de tipo colágeno
- 8-76aa
- NY-ESO-1
- 77-185aa
- Enlazador
- 186-187aa
- LAGE1a
- 188-288aa
- His-N-terminal LAGE1a híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno y región rica en cisteína contigua (8aa)
- 37
- Sitio de enterocinasa-His-LAGE1a/NY-ESO-1 (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-36bp
- Sitio de enterocinasa
- 37-72bp
- LAGE1a
- 73-378bp
- Enlazador
- 379-384bp
- NY-ESO-1
- 385-687bp
- De detención
- 688-690bp
- 38
- Sitio de enterocinasa-His-LAGE1a/NY-ESO-1 (codificado por la SEC ID Nº 37)
- Cola de His (10 His)
- 1-12aa
- Sitio de enterocinasa
- 13-24aa
- LAGE1a
- 25-126aa
- Enlazador
- 127-128aa
- NY-ESO-1
- 129-229aa
- 39
- His-LAGE1a/NY-ESO-1 (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-21bp
- LAGE1a
- 22-327bp
- Enlazador
- 328-333bp
- NY-ESO-1
- 334-636bp
- De detención
- 637-639bp
- 40
- His-LAGE1a/NY-ESO-1 (codificado por la SEC ID Nº 39)
- Cola de His (6 His)
- 1-7aa
- LAGE1a
- 8-109aa
- Enlazador
- 110-111aa
- NY-ESO-1
- 112-212aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- His-N-terminal LAGE1a truncado de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin colágeno
- 41
- Sitio de enterocinasa-His-LAGE1a truncado de colágeno/NY-ESO-1 (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-36bp
- Sitio de enterocinasa
- 37-72bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 73-141bp
- LAGE1a
- 142-471bp
- Enlazador
- 472-477bp
- NY-ESO-1
- 478-780bp
- De detención
- 781-783bp
- 42
- Sitio de enterocinasa-His-LAGE1a truncado de colágeno/NY-ESO-1 (codificado por la SEC ID Nº 41)
- Cola de His (10 His)
- 1-12aa
- Sitio de enterocinasa
- 13-24aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 25-47aa
- LAGE1a
- 48-157aa
- Enlazador
- 158-159aa
- NY-ESO-1
- 160-260aa
- 43
- His-LAGE1a truncado de colágeno/NY-ESO-1 (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-21bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 22-90bp
- LAGE1a
- 91-420bp
- Enlazador
- 421-426bp
- NY-ESO-1
- 427-729bp
- De detención
- 730-732bp
- 44
- His-LAGE1a truncado de colágeno/NY-ESO-1 (codificado por la SEC ID Nº 43)
- Cola de His (6 His)
- 1-7aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 8-30aa
- LAGE1a
- 31-140aa
- Enlazador
- 141-142aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- NY-ESO-1
- 143-243aa
- His N-terminal -LAGE1a de colágeno híbrido/NY-ESO-1 sin dominio de tipo colágeno
- 45
- Sitio de enterocinasa-His-LAGE1a de colágeno/NY-ESO-1 (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-36bp
- Sitio de enterocinasa
- 37-72bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 73-279bp
- LAGE1a
- 280-609bp
- Enlazador
- 610-615bp
- NY-ESO-1
- 616-918bp
- De detención
- 919-921bp
- 46
- Sitio de enterocinasa-His-LAGE1a de colágeno/NY-ESO-1 (codificado por la SEC ID Nº 45)
- Cola de His (10 His)
- 1-12aa
- Sitio de enterocinasa
- 13-24aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 25-93aa
- LAGE1a
- 94-203aa
- Enlazador
- 204-205aa
- NY-ESO-1
- 206-306aa
- 47
- His-LAGE1a de colágeno/NY-ESO-1 (codones optimizados)
- Secuencia de cola de His
- 1-21bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 22-228bp
- LAGE1a
- 229-558bp
- Enlazador
- 559-564bp
- NY-ESO-1
- 565-867bp
- De detención
- 868-870bp
- 48
- His-LAGE1a de colágeno/NY-ESO-1 (codificado por la SEC ID Nº 47)
- Cola de His (6 His)
- 1-7aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 8-76aa
- LAGE1a
- 77-186aa
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 1 DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- Enlazador
- 187-188aa
- NY-ESO-1
- 189-289aa
Tabla 2. Se proporcionan realizaciones a modo de ejemplo adicionales de las proteínas de fusión y las secuencias
5 de nucleótidos que las codifican. Cada secuencia de nucleótidos se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de nucleótidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias. Cada proteína de fusión se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de aminoácidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias.
- SEC ID Nº
- TABLA 2. DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- NY-ESO-1 de colágeno parcialmente truncado
- 50
- NY-ESO-1 truncado de colágeno (codones optimizados)
- Dominio de tipo colágeno
- 1-72bp
- NY-ESO-1
- 1-399bp
- Cola de His
- 400-417bp
- De detención
- 418-420bp
- 51
- NY-ESO-1 truncado de colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 50)
- Dominio de tipo colágeno
- 1-24aa
- NY-ESO-1
- 1-133aa
- Cola de His
- 134-139aa
- 52
- 1/3 proteína D/NY-ESO-1 truncado de colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno
- 334-402bp
- NY-ESO-1
- 334-729bp
- Cola de His
- 730-747bp
- De detención
- 748-750bp
- 53
- 1/3 proteína D/NY-ESO-1 truncado de colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 52)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- Dominio de tipo colágeno
- 112-134aa
(continuación)
- SEC Nº
- ID TABLA 2. DESCRIPCIÓN DEL CONSTRUCTO COMPONENTES DE SECUENCIA
- NY-ESO-1
- 112-243aa
- Cola de His
- 244-249aa
- NY-ESO-1 sin colágeno
- 54
- NY-ESO-1 sin colágeno (codones optimizados)
- NY-ESO-1
- 1-306bp
- Cola de His
- 307-324bp
- De detención
- 325-327bp
- 55
- NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 54)
- NY-ESO-1
- 1-102aa
- Cola de His
- 103-108aa
- 56
- 1/3 proteína D/NY-ESO-1 sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- NY-ESO-1
- 334-636bp
- Cola de His
- 637-654bp
- De detención
- 655-657bp
- 57
- 1/3 proteína D/NY-ESO-1 sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 56)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- NY-ESO-1
- 112-212aa
- Cola de His
- 213-218aa
Tabla 3. Se proporcionan realizaciones a modo de ejempolo adicionales de las proteínas de fusión y las secuencias de nucleótidos que las codifican. Cada secuencia de nucleótidos se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de nucleótidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias. Cada proteína de fusión se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de aminoácidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias.
- SEC ID Nº
- TABLA 3 DESCRIPCIÓN COMPONENTES DE SECUENCIA
- LAGE-1a de colágeno híbrido sin LAGE-1a de dominio de tipo colágeno
- 59
- LAGE-1a de colágeno híbrido sin colágeno (codones optimizados)
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-210bp
- LAGE-1a
- 211-540bp
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 3. DESCRIPCIÓN COMPONENTES DE SECUENCIA
- Cola de His
- 541-558bp
- De detención
- 559-561bp
- 60
- LAGE-1a de colágeno híbrido sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº59)
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-70aa
- LAGE-1a
- 71-180aa
- Cola de His
- 181-186aa
- 61
- 1/3 proteína D/LAGE-1a de colágeno híbrido sin colágeno con cola de His (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 334-540bp
- LAGE-1a
- 541-870bp
- Cola de His
- 871-888bp
- De detención
- 889-891bp
- 62
- 1/3 proteína D/LAGE-1a de colágeno híbrido sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 61)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 112-180aa
- LAGE-1a
- 181-290aa
- Cola de His
- 291-296aa
- LAGE-1a truncado de colágeno híbrido sin dominio de tipo colágeno
- 63
- LAGE-1a truncado de colágeno híbrido sin dominio de tipo colágeno
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-72bp
- LAGE-1a
- 73-402bp
- Cola de His
- 403-420bp
- De detención
- 421-423bp
- 64
- LAGE-1a truncado de colágeno híbrido sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 63)
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 1-24aa
- LAGE-1a
- 25-134aa
- Cola de His
- 135-140aa
- 65
- 1/3 proteína D/LAGE-1a truncado de colágeno híbrido sin colágeno con cola de His (codones optimizados)
(continuación)
- SEC ID Nº
- TABLA 3. DESCRIPCIÓN COMPONENTES DE SECUENCIA
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 334-402bp
- LAGE-1a
- 403-732bp
- Cola de His
- 733-750bp
- De detención
- 751-753bp
- 66
- 1/3 proteína D/LAGE-1a truncado de colágeno híbrido sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 65)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- Dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1
- 112-134aa
- LAGE-1a
- 135-244aa
- Cola de His
- 245-250aa
- LAGE-1a sin dominio de tipo colágeno y región rica en cisteína contigua (8aa)
- 67
- LAGE-1a sin colágeno (codones optimizados)
- LAGE-1a
- 1-309bp
- Cola de His
- 310-327bp
- De detención
- 328-330bp
- 68
- LAGE-1a sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 67)
- LAGE-1a
- 1-103aa
- Cola de His
- 104-109aa
- 69
- 1/3 proteína D/LAGE-1a sin colágeno (codones optimizados)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-9bp
- 1/3 proteína D
- 10-333bp
- LAGE-1a
- 334-639bp
- Cola de His
- 640-657bp
- De detención
- 6578-660bp
- 70
- 1/3 proteína D/LAGE-1a sin colágeno con cola de His (codificado por la SEC ID Nº 69)
- Secuencia de iniciación MDP
- 1-3aa
- 1/3 proteína D
- 4-111aa
- LAGE-1a
- 112-213aa
- Cola de His
- 214-219aa
Tabla 4. Se proporcionan las proteínas de fusión discutidas en los Ejemplos y las secuencias de nucleótidos que las codifican. Cada secuencia de nucleótidos se describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de nucleótidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias. Cada proteína de fusión se
describe por el asunto objeto, se identifica mediante el identificador de secuencia de aminoácidos único (SEC ID Nº) y se representa en el listado de secuencias.
- TABLA 4
- NOMBRE DEL CONSTRUCTO
- SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
- LVL020
- SEC ID Nº 72 SEC ID Nº 73
- LVL024
- SEC ID Nº 74 SEC ID Nº 75
- LVL026
- SEC ID Nº 76 SEC ID Nº 77
- LVL030
- SEC ID Nº 78 SEC ID Nº 79
- LVL068
- SEC ID Nº 80 SEC ID Nº 81
- LVL076
- SEC ID Nº 82 SEC ID Nº 83
- LVL078
- SEC ID Nº 84 SEC ID Nº 85
- LVL079
- SEC ID Nº 86 SEC ID Nº 87
- LVL106
- SEC ID Nº 88 SEC ID Nº 89
- LVL151
- SEC ID Nº 90 SEC ID Nº 91
- LVL155
- SEC ID Nº 92 SEC ID Nº 93
- LVL156
- SEC ID Nº 94 SEC ID Nº 95
- LVL157
- SEC ID Nº 96 SEC ID Nº 97
Como será evidente por el listado de secuencias, muchos de los constructos de la Tabla 4 tienen diseños similares a los de una o más realizaciones representadas en las tablas anteriores. Por ejemplo, LVL068 comparte el mismo diseño que la realización representada como la SEC ID Nº 45, Tabla 1. LVL076 comparte el mismo diseño que la
10 realización representada como la SEC ID Nº 25, Tabla 1. LVL078 comparte el mismo diseño que la realización representada como la SEC ID Nº 33, Tabla 1. LVL079 comparte el mismo diseño que la realización representada como la SEC ID Nº 37, Tabla 1.
Además, se generaron varios de los constructos de proteínas de fusión representadas en la Tabla 4, es decir,
15 LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151, mediante modificaciones rutinarias de otras secuencias de proteínas de fusión representadas en la Tabla 4, es decir, LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024, respectivamente. Estas modificaciones incluyen la eliminación de los residuos de aminoácidos entre la proteína D y el principio de las quimeras (es decir, la porción derivada de cualquiera de entre NY-ESO-1 y de LAGE-1) y la eliminación de los aminoácidos entre la cola de His y el principio de la quimera. Por consiguiente, algunas de las proteínas de fusión de
20 la Tabla 4 corresponden estrechamente con las otras proteínas de fusión de la Tabla 4. La correspondencia entre estas proteínas de fusión se representa en la Tabla 5 y se describe con mayor detalle en el Ejemplo 4.
Tabla 5. Correspondencia entre LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024 y los LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151 modificados.
- TABLA 5
- CONSTRUCTO DE PROTEÍNA DE FUSIÓN
- CORRESPONDE A
- CONSTRUCTO DE PROTEÍNA DE FUSIÓN
- LVL068
- LVL155
- LVL030
- LVL106
- LVL076
- LVL156
- LVL078
- LVL157
- LVL024
- LVL151
Ejemplos
10 Se diseñaron varias proteínas de fusión NY-ESO-1/LAGE-1 con y sin el dominio de tipo colágeno, y con y sin el extremo terminal de la proteína D, como se resume en la Figura 17. Se optimizaron los codones de los constructos diseñados para la expresión en Escherichia coli. El gen sintético se ensambló a partir de los oligonucleótidos y/o de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa. El fragmento se clonó en la estructura base de pGA4
15 (AmpR) usando los sitios de restricción KpnI y SacI, con la adición de los sitios NdeI y XhoI en el extremo 5' y en el extremo 3' del gen optimizado, respectivamente.
El ADN del plásmido se purificó a partir de las bacterias transformadas y se determinó la concentración mediante espectrometría ultravioleta. El constructo final se verificó mediante secuenciación. La secuencia de codificación 20 optimizada para los diferentes constructos quiméricos de NY/LAGE se subclonó directamente en el sitio de clonación múltiple pET19 (AmpR) usando los sitios de restricción NdeI y XhoI, para obtener los plásmidos de expresión quimérica NY/LAGE. Para la clonación en pET26, se diseñaron cebadores de reacción en cadena de la polimerasa con el objeto de agregar una cola de histidina N-terminal. Esta amplificación dio como resultado la adición de la cola de 6 histidinas en fase con la región codificante de los diferentes constructos. Este fragmento amplificado se digirió
25 enzimáticamente con las enzimas de restricción NdeI/XhoI y subsiguientemente se clonaron los diferentes constructos quiméricos NY/LAGE en el sitio de clonación múltiple pET26 (KanR), para obtener el plásmido de expresión. Los constructos finales se verificaron mediante secuenciación.
Se cultivaron bacterias en 800 ml de caldo Luria-Bertani (LB) (BD) + glucosa al 1 por ciento (peso/volumen) (Laboratoire MAT, número de catálogo: GR-0101) + antibiótico (100 μg/mililitro de carbenicilina para pET19, 40 35 μg/mililitro de canamicina para pET26), en un matraz de agitación de 2.5 litros. Los cultivos se incubaron a 37∀C para células BLR (DE3) hasta una D.O.600nm de aproximadamente 0,8.
40 A una D.O.600nm de aproximadamente 0,8, los cultivos de BLR (DE3) se indujeron a 1 mM de ß-D-1tiogalactopiranosida de isopropilo (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815), y se incubaron durante 16 a 18 horas a 16 °C. Se obtuvieron de 5 a 15 miligramos de proteína específica/800 ml con los constructos LVL106, 151, 155 y 157. La producción de proteína para cada constructo se resume en la Figura 17.
45 Ejemplo 2. Resumen de purificación preliminar y estabilidad
Las células se recogen mediante centrifugación y dspués se alteran por medios físicos o químicos, y se retiene el 50 extracto crudo resultante para aislar el polipéptido de interés.
Las proteínas recombinantes expresadas se solubilizaron con una solución de clorhidrato de guanidina y se cargaron en una resina de cromatografía por afinidad de metal inmovilizado (IMAC). Luego se lavaron las proteínas en una columna con soluciones de urea 8 M y 4 M antes de la elución mediante el incremento de la concentración de imidazol. Entonces las proteínas se desalaron en el tampón de urea 4 M final, pH de 7,0, para su uso adicional.
5 La purificación se evaluó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia (Western), con el fin de verificar la pureza y la identidad de las proteínas.
10 Se llevaron a cabo ensayos de estabilidad a 37 °C y se evaluaron las proteínas mediante SDS-PAGE. El ensayo de estabilidad preliminar no reveló ninguna cuestión principal.
15 Se evaluó la solubilidad de las proteínas como se resume en el siguiente cuadro
- TAMPÓN
- CONSTRUCTO
- LVL 076
- LVL 079 LVL 78 LVL 68 LVL 020 LVL 26 LVL 024 LVL 30
- PBS 1X; TCEP 1mM; EDTA 1mM, pH 7,03
- p S S P P P NT P
- Bicina 20mM; NaCl 138mM; TCEP 1mM; EDTA 1mM, pH 8,68
- p S P P P P NT P
- imidazol 20mM; NaCl 138mM; TCEP 1mM; EDTA 1mM, pH 5,99
- p S P P P P NT P
- Ac Sodio 10mM; NaCl 5mM; TCEP 1mM; EDTA 1mM, pH 4.99
- S S S S S S NT S
- ácido cítrico 10mM; NaCl 5mM; TCEP 1mM; EDTA 1mM, pH 3.7
- NT NT S S NT NT NT S
- Cuadro 1. Solubilidad de la proteína de fusión. Clave: P precipitada; S no precipitada; NT no analizada.
Ejemplo 3: Inmunización IM con las proteínas de fusión
20 Las proteínas de fusión se evaluaron preclínicamente en un modelo de ratón que involucró una serie de experimentos de análisis de inmunizaciones intramusculares, tal como se describe más adelante. El modelo de ratón seleccionado fue CB6F1, una primera generación resultante del cruzamiento de ratones C57BL6 y ratones Balb/c. Estos ratones están comercialmente disponibles en Charles River Laboratories, Inc., 251 Ballardvale Street,
25 Wilmington, MA 01887-1000. La línea celular de tumor elegida fue B16 (línea celular de melanoma de ratón), un melanoma de murino trasplantable comercialmente disponible para el estudio de terapias de cáncer.
30 Diseño experimental. En un estudio de 76 días, se usaron ratones CB6F1 para evaluar cada uno de LVL076, LVL079, LVL078, LVL068, LVL020, LVL026, LVL024, LVL030 con el fin de determinar si la inmunización intramuscular con la proteína de fusión más el coadyuvante confería protección frente a la exposición subcutánea a células tumorales trasplantadas (B16/NYESO1). De una manera específica, los ratones se inmunizaron intramuscularmente con inyecciones de 50 microlitros conteniendo 15 μg de proteína y un coadyuvante. El
35 coadyuvante seleccionado fue AS15. El AS15 es una formulación de coadyuvante liposomal que comprende QS21, 3D-MPL y CpG.
Se llevaron a cabo estudios con las proteínas de fusión representadas en 1A y 1B siguientes. Los ratones se dividieron en grupos de 15 ratones/grupo. Los ratones se inmunizaron en el día 0 y nuevamente en el día 14 como sigue:
Estudio 1A
• LVL079
• LVL026 10 • LVL068
• LVL030
Estudio 1B
- •
- LVL020
- •
- LVL078
- •
- LVL024
20 Controles
- •
- Tampón de antígeno/Tampón AS15
- •
- NY-ESO-1 de longitud completa
• LAGE-1a sin el dominio de tipo colágeno (CLD) 25 • MAGE A3
Seis ratones/grupo se expusieron a tumores B16/NY-ESO-1 trasplantados subcutáneos en el día 28. Se evaluó la respuesta del anticuerpo a NY-ESO-1 de longitud completa, LAGE-1a sin dominio de tipo colágeno y colágeno humano en el día 0, 14, 28, y 76 mediante ELISA (IgG1 e IgG2a). La respuesta mediada por células se evaluó
30 mediante FACS en el día 28, usando esplenocitos cosechados (reestímulo--3 conjuntos de 3--con los conjuntos de péptidos NY-ESO-1 y LAGE-1a). El diseño experimental del análisis Nº 1 se resume en la Figura 18.
Resultados. De los cuatro controles, solamente el NY-ESO-1 de longitud completa confirió alguna protección en comparación con el tampón. Véase la Figura 19. De los grupos de ratones que recibieron bien NY-ESO-1 de longitud 35 completa o bien LVL030, dos de cada grupo carecieron de tumor al final del estudio. De los ratones que recibieron LVL068, cuatro carecieron de tumor al final del estudio. LVL068 y LVL078 confirieron una supervivencia más larga en comparación con los ratones que recibieron tampones. Véase la Figura 20. Se evaluaron las respuestas inmunes específicas de NY-ESO-1 mediante ELISA, FACS e inmunotransferencia (Western). Se evaluaron las respuestas inmunitarias específicas de LAGE-1a (sin el dominio de tipo colágeno) mediante ELISA y FACS. Véase la Figura 21.
40 Estos resultados se resumen en el siguiente cuadro.
- Inmunógeno
- Protección de B16/NY-ESO-1 Inmunidad Específica de NY-ESO-1 Inmunidad Específicade LAGE1a
- LVL068
- ++ ++ ++
- LVL078
- + ++ ++
- LVL076
- + ++ +
- LVL024
- + ++ +
- LVL030
- + ++ +
- LVL020
- + + +
- LVL079
- - + +
- LVL026
- - + +
- Cuadro 1. Resumen de Inmunidad Específica. Clave: (-) – respuesta más baja; (+) – respuesta media; (++) – respuesta más alta.
Análisis Nº 2
45 Diseño experimental. En un estudio de 105 días se usaron ratones CB6F1 para evaluar cada uno de LVL076, LVL078, LVL068, y LVL024 con el fin de determinar si la inmunización intramuscular con la proteína de fusión más el coadyuvante confería protección frenta a la exposición subcutáneo a células tumorales trasplantadas B16/NYESO1
(después de dos inmunizaciones) o con células tumorales B16/LAGE-1a (después de cuatro inmunizaciones). De una manera específica, los ratones se inmunizaron intramuscularmente con inyecciones de 50 microlitros que contenían 15 μg de proteína y 25 microlitros de coadyuvante AS15.
5 Los ratones se dividieron en grupos de 29 ratones/grupo. Los ratones se inmunizaron el día 0, 14, 28 y 42 tal como sigue:
Estudio
- •
- LVL068
- •
- LVL078
- •
- LVL024
15 Controles
- •
- Tampón de antígeno/Tampón AS15
- •
- NY-ESO-1 de longitud completa
• LAGE-1a sin el dominio de tipo colágeno (CLD) 20 • MAGE A3
Diez ratones/grupo se expusieron a células tumorales B16/NY-ESO-1 trasplantadas subcutáneas el día 28. Nueve ratones/grupo se expusieron a células tumorales B16/LAGE-1A trasplantadas subcutáneas el día 56. Se extrajeron sueros y se evaluó la respuesta del anticuerpo a (i) NY-ESO-1 de longitud completa, (ii) LAGE-1a sin dominio de tipo
25 colágeno y (iii) colágeno humano, el día 0, 14, 28, 42 56, 84 y 105 mediante ELISA (IgG1 e IgG2a). El diseño experimental del análsis Nº 2 se resume en las Figuras 22 y 23.
Resultados
De los ratones que recibieron LVL078, dos carecieron de tumor durante más de 50 días después de la exposición a B16-NY-ESO-1. De los ratones que recibieron bien NY-ESO-1 de longitud completa o bien LVL024, dos de cada grupo carecieron de tumor durante más de 50 días y tres estaban vivos. De los ratones que recibieron LVL068, tres
35 carecieron de tumor y cuatro estaban vivos. De los ratones que recibieron LVL076, 3 carecieron de tumor y cinco estaban vivos. Véase la Figura 24.
40 Todos los ratones que recibieron LVL076 o LAGE-1a sin la región de tipo colágeno murieron antes del día 40 después de la exposición. De los ratones que recibieron solamente tampón, uno sobrevivió sin tumor al final del estudio. De los ratones que recibieron LVL024, uno careció de tumor al final del estudio. De los ratones que recibieron NY-ESO-1 de longitud completa, ninguno careció de tumor, pero uno estaba todavía vivo al final del estudio. De los ratones que recibieron LVL078, uno careció de tumor. De los ratones que recibieron LVL068, tres
45 carecieron de tumor. De los ratones que recibieron LVL076, tres carecieron de tumor al final del estudio. Véase la Figura 25. Estos resultados se resumen en el siguiente cuadro.
- Inmunógeno
- NY-ESO-1 LAGE-1a
- Protección
- Inmunidad específica Protección Inmunidad específica
- LVL068
- ++ ++ ++ ++
- LVL078
- ++ ++ ++ ++
- LVL024
- ± ++ - +
- LVL076
- + + - +
- Cuadro 2. Protección frente a la exposición al Tumor B16-LAGE1a. Clave: (-) – la más baja; (±) – siguiente respuesta más baja; (+) – respuesta media; (++) – la respuesta más alta.
Con el objeto de estudiar si el dominio de tipo colágeno de NY-ESO-1 estimuló las respuestas inmunitarias 31
específicas de colágeno humano, se extrajeron sueros y se reservaron 14 días después de la inoculación de ratones inmunizados con uno de los siguientes: (1) Tampones (control); (2) NY-ESO-1 de longitud completa; (3) LAGE-1a sin el dominio de tipo colágeno; (4) LVL068; (5) LVL078; (6) LVL024; (7) LVL076. Se llevaron a cabo ELISA para cada uno de estos siete conjuntos de sueros, así como para un control positivo que contenía anticuerpo monoclonal anticolágeno humano I. El dominio de tipo colágeno no estimuló la producción de anticuerpo de anti-colágeno humano I de ratón. Véase la Figura 26. Se llevaron a cabo estudios similares (no se muestran los resultados) para colágeno III y colágeno VI; no se detectó producción de anticuerpo anti-colágeno humano III de ratón ni anticuerpo anti-colágeno humano VI de ratón.
Ejemplo 4: Constructos refinados
Se llevaron a cabo modificaciones empleando técnicas de clonación rutinarias sobre algunas de los constructos enumerados en la Tabla 4. De una manera específica, se modificaron LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024 para proporcionar LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151. Hubo dos clases de modificaciones, primero la eliminación de 5 residuos de aminoácidos entre la proteína D y el principio de las quimeras. Por ejemplo, esta modificación se llevó a cabo con LVL024 (SEC ID Nº 74; SEC ID Nº 75) para proporcionar el LVL151 (SEC ID Nº 90; SEC ID Nº 91). Por consiguiente, LVL024 corresponde con LVL 151. El segundo tipo de modificación fue la eliminación de los aminoácidos entre la cola de His y el principio de la quimera. Esta modificación se llevó a cabo con LVL068 (SEC ID Nº 80; SEC ID Nº 81) para proporcionar el LVL155 (SEC ID Nº 92; SEC ID Nº 93). Por consiguiente, LVL068 corresponde con LVL 151. Cada constructo de proteína de fusión que se modificó y el constructo de proteína de fusión a la que corresponde, se representan en la Tabla 5 de la descripción.
Como puede entenderse, no se espera que las modificaciones descritas anteriormente den como resultado diferencias funcionales entre una proteína de fusión y su proteína de fusión modificada correspondiente. Por lo tanto, se espera que se pueda usar cada proteína de fusión modificada enumerada en el lado derecho de la Tabla 5 de una manera intercambiable con su proteína de fusión correspondiente enumerada en el lado izquierdo de la tabla.
Ejemplo 5.
Diseño experimental. En un estudio de 105 días, se usaron ratones CB6F1 para evaluar cada uno de LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024 y los LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151 modificados, para estudiar la inmunización intramuscular con la proteína de fusión más el coadyuvante frente a la exposición subcutáneo con células tumorales trasplantadas B16/NYESO1 (después de dos inmunizaciones) o con células tumorales B16/LAGE1a (después de cuatro inmunizaciones). De una manera específica, los ratones se inmunizan intramuscularmente con inyecciones de 50 microlitros que contienen 15 μg de proteína, y 25 microlitros de coadyuvante AS15.
Los ratones se dividieron en grupos de 29 ratones/grupo. Los ratones se inmunizaron el día 0, 14, 28 y 42 tal como sigue:
Estudio
- •
- LVL068
- •
- LVL030
- •
- LVL076
- •
- LVL078
- •
- LVL024
- •
- LVL155
- •
- LVL106
- •
- LVL156
- •
- LVL157
- •
- LVL151
Controles
- •
- Tampón de antígeno/Tampón AS15
- •
- NY-ESO-1 de longitud completa
- •
- LAGE-1a sin el dominio de colágeno
- •
- MAGE A3
Diez ratones/grupo se exponen a células tumorales B16/NY-ESO-1 trasplantadas subcutáneas el día 28. Nueve ratones/grupo se exponen a células tumorales B16/LAGE-1A trasplantadas subcutáneas el día 56. Con el fin de realizar un seguimiento de la respuesta inmunitaria específica, se pueden extraer sueros y se puede medir la respuesta de anticuerpo a: (i) NY-ESO-1 de longitud completa, (ii) LAGE-1a sin dominio de tipo colágeno, y (iii) colágeno humano en el día 0, 14, 28, 42 56, 84 y 105 mediante ELISA (IgG1 e IgG2a).
Los ejemplos anteriores se proporcionan a modo de ilustración, y no a modo de limitación.
Dentro de la presente solicitud, el artículo "un" y "uno" se usa en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos.
5 Las unidades, prefijos y símbolos se pueden denotar en su forma aceptada SI. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha con la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha con la orientación de amino a carboxilo, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden designarse en la presente bien por sus
10 símbolos de tres letras comúnmente conocidos o bien por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. De la misma manera, los nucleótidos pueden designarse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los términos definidos anteriormente se definen más completamente haciendo referencia a la memoria descriptiva como un todo.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Denis Martin Remi Palmantier
5 <120> Proteína de fusión novedosa
<130> VB62288
<160>97 10
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
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- <220>
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<223> Constructo LAGE/NY-ESO-1 10
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Constructo LAGE/NY-ESO-1
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<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 49
<212> ADN
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
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- <212>
- PRT 15 <213> Homo Sapiens
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- <212>
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<213> Homo Sapiens
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- <212>
- PRT 15 <213> Homo Sapiens
10 <400> 57 <210> 58
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5 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (0).. (0) <223> Lage 1a
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
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<213> Homo Sapiens
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<213> Homo Sapiens
<400> 62 <212> ADN
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<212> PRT
<213> Homo Sapiens
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<213> Homo Sapiens
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<212> PRT 15 <213> Homo Sapiens
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<211> 210
5 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> PÉPTIDO 10 <222> (0) (0)
<223> Lage 1b
<400> 71
<210> 72
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
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- <212>
- PRT 15 <213> Homo Sapiens
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
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- PRT 10 <213> Homo Sapiens
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<213> Homo Sapiens
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5 <211> 918
<212> ADN
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
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<212> PRT 15 <213> Homo Sapiens
<400> 83 <212> ADN
<213> Homo Sapiens
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<212> PRT
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<400> 85
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<210> 87
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<212> PRT
<213> Homo Sapiens
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<212> ADN 15 <213> Homo Sapiens
<400> 88 <212> PRT
<213> Homo Sapiens
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<212> ADN
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<400> 90
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
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<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<400> 92
<210> 93
<211> 289
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 93
<210> 94
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- <212>
- ADN 10 <213> Homo Sapiens
<400> 94
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 95
<210> 96
<211> 864
- <212>
- ADN 15 <213> Homo Sapiens
<400> 96
<210> 97
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 97
<210> 98
<211> 450
- <212>
- PRT 15 <213> Secuencia artificial
<223> Proteína D-MAGE-A3-His
<400> 98
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Una proteína de fusión, que comprende:
- (a)
- NY-ESO-1 o un fragmento del mismo, enlazado con
- (b)
- LAGE-1 o un fragmento del mismo,
en la que al menos uno de NY-ESO-1 y/o LAGE-1 está truncado o parcialmente truncado, o es un fragmento que incluye uno o más epítopos de NY-ESO-1 o LAGE-1, comprendiendo la proteína de fusión una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 73, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 79, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 83, SEC ID Nº 85 SEC ID Nº 89, SEC ID Nº 93 y SEC ID Nº 97. -
- 2.
- Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.
-
- 3.
- Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.
-
- 4.
- Una célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 3.
-
- 5.
- Una composición inmunogénica o una vacuna que comprenden una proteína de fusión según la reivindicación 1, una molécula de ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 2 o un vector tal como se reivindica en la reivindicación 3 que comprende adicionalmente un coadyuvante y/o una citocina o una quimiocina inmunoestimulantes.
-
- 6.
- Una composición inmunogénica o una vacuna tal como se reivindica en la reivindicación 5 para su uso en medicina.
TipoTumores con adyuvante/antígeno
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