ES2304235T3 - Anticuerpo agonista de tpo modificado. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo modificado que comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L de un anticuerpo y que muestra acción agonista de TPO por reactividad cruzada con el receptor de TPO, en el que el anticuerpo modificado es: (i)un multímero del Fv de cadena sencilla que comprende una región V de la cadena H y una región V de la cadena L; o (ii)un polipéptido de cadena sencilla que comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones de la cadena L.
Description
Anticuerpo agonista de TPO modificado.
Esta invención se refiere a anticuerpos
modificados que contienen dos o más regiones V de la cadena H y dos
o más regiones V de la cadena L de un anticuerpo que muestra
actividad agonista de TPO por reactividad cruzada del receptor de
la TPO. Los anticuerpos modificados tienen actividad agonista de TPO
de transducción de una señal dentro de las células por reactividad
cruzada del receptor de TPO y son útiles como medicamento para
diferentes propósitos.
La trombopoyetina (TPO) es un factor de
regulación de la producción de plaquetas encontrado en 1994 y se
sabe que está compuesto de una glicoproteína que tiene un peso
molecular de 70-80.000 producida principalmente en
el hígado. La trombopoyetina es una citoquina que en la médula ósea
promueve la supervivencia, proliferación, diferenciación y
maduración de las células precursoras de plaquetas, es decir
promueve la diferenciación y proliferación de megacariocitos. El
receptor de trombopoyetina (TPO) se identificó antes que la TPO como
c-Mpl, un receptor de un factor específico para
regular la producción de plaquetas (M. Souyri y col., Cell
63: 1137 (1990)). Se ha publicado que c-Mpl está
distribuido principalmente en las células precursoras de plaquetas,
megacariocitos y células plaquetarias y que la supresión de la
expresión de c-Mpl inhibe selectivamente la
formación de megacariocitos (M. Methia y col., Blood 82: 1395
(1993)). Se ha publicado que el ligando de c-Mpl es
la TPO, basándose en los resultados del ensayo de proliferación de
células específicas para el ligando de c-Mpl y
purificación del ligando usando c-Mpl (F. de Sauvage
y col., Nature 369: 533 (1994); TD. Bartley y col.,
Cell 77: 1117 (1994)). Actualmente Mpl se denomina receptor
de la TPO. Por lo tanto, se esperaba que la TPO y los agonistas del
receptor de la TPO funcionaran como un agente terapéutico para la
trombocitopenia, por ejemplo, como un medicamento para aliviar la
trombocitopenia causada por la inhibición de la médula ósea o la
terapia de resección de la médula ósea para pacientes de cáncer.
Por otra parte, se desarrollaron anticuerpos
modificados, en especial anticuerpos con tamaño molecular reducido,
por ejemplo, Fv de cadena sencilla, para mejorar la permeabilidad
hacia le interior de tejido y tumores reduciendo el tamaño
molecular, y a producir por un procedimiento recombinante.
Recientemente, se han usado los dímeros de Fv de cadena sencilla,
en especial dímeros biespecíficos, para la reactividad cruzada de
células. Los ejemplos típicos de dichos dímeros son heterodímeros
de Fv de cadena sencilla que reconocen antígenos de células de
cáncer y antígenos de células huésped tales como células NK y
neutrófilos (Kipriyanov y col., Int. J. Cancer, 77,
9763-9772, 1998). Se produjeron por la técnica de
construcción de Fv de cadena sencilla en forma de anticuerpos
modificados, que son más eficaces para tratar cánceres por inducción
de reactividad cruzada intercelular. Se ha pensado que la
reactividad cruzada intercelular es inducida por anticuerpos y sus
fragmentos (p. ej., fragmento Fab), anticuerpos modificados
biespecíficos e incluso dímeros de Fv de cadena sencilla, que son
monoespecíficos.
Como anticuerpos capaces de transducir una señal
por reactividad cruzada con una molécula o moléculas de superficie
celular, se conocen un anticuerpo contra el receptor de EPO
implicado en la diferenciación y proliferación celular (documento
JP-A 2000-95800), un anticuerpo
contra el receptor MuSK (Xie y col., Nature Biotech. 15,
768-771, 1997) y otros. También se conocen un
anticuerpo agonista del receptor de TPO, sus fragmentos y Fv de
cadena sencilla (documento WO99/10494). Sin embargo, no se han
descrito dímeros de Fv de cadena sencilla ni anticuerpos
modificados tales como los anticuerpos bivalentes de cadena sencilla
que tengan actividad agonista.
Al observar que los monómeros de Fv de cadena
sencilla derivados de anticuerpos monoclonales (anticuerpo
MABL-1 y anticuerpo MABL-2
producidos por los autores de la invención) que inducen apoptosis de
las células que contienen IAP, no inducían la apoptosis de células
y que los dímeros inducían apoptosis, los autores de la invención
descubrieron que los dímeros reaccionan cruzadamente (dimerizan) con
el receptor de IAP sobre la superficie celular, de modo que se
transduce una señal al interior de las células y, como resultado, se
induce la apoptosis. Esto sugiere que los dímeros de Fv de cadena
sencilla monoespecíficos reaccionan cruzadamente con una
molécula(s) de superficie celular (p. ej., receptor) y
transducen una señal como un ligando, sirviendo así como un
agonista.
Centrándose en la reactividad cruzada
intercelular, se descubrió que los dímeros de Fv de cadena sencilla
mencionados antes no producen hemaglutinación, mientras que los
anticuerpos monoclonales mencionados antes sí lo hacen. Se observó
el mismo resultado con los anticuerpos bivalentes de cadena sencilla
(polipéptidos de cadena sencilla que contienen dos regiones V de la
cadena H y dos regiones V de la cadena L). Esto sugiere que los
anticuerpos monoclonales pueden formar enlaces cruzados
intercelulares mientras que los anticuerpos modificados como los
dímeros de Fv de cadena sencilla y los anticuerpos bivalentes de
cadena sencilla reaccionan cruzadamente con una molécula(s)
de superficie celular pero no forman enlaces cruzados
intercelulares.
Basándose en estas observaciones, los autores de
la invención acaban de descubrir que los anticuerpos modificados
tales como los dímeros de Fv de cadena sencilla y los anticuerpos
bivalentes de cadena sencilla reaccionan cruzadamente con una
molécula(s) de superficie celular o molécula(s)
intracelular(es) de la misma célula, además de la
reactividad cruzada intercelular conocida, y son adecuados como un
ligando para la o las moléculas (en especial como un ligando que
imita la acción del ligando natural).
Con el descubrimiento adicional de que una
molécula de anticuerpo (IgG entera) se puede modificar en dímeros
de Fv de cadena sencilla, anticuerpos bivalentes de cadena sencilla
y similares, que reaccionan cruzadamente con una molécula(s)
de superficie celular, reduciendo así los efectos secundarios
producidos por la reactividad cruzada intercelular, y
proporcionando así medicamentos nuevos que inducen sólo el efecto
deseado en la célula, los autores de la invención completaron la
invención. Los anticuerpos modificados de la invención tienen una
actividad notablemente alta comparado con los anticuerpos enteros
(IgG) que tienen la misma región V que los anticuerpos modificados.
Tienen una permeabilidad mejorada en los tejidos debido al tamaño
molecular reducido comparado con las moléculas de anticuerpo y a la
falta de regiones constantes.
Un objeto de esta invención es proporcionar
anticuerpos modificados de forma agonista de tamaño molecular
pequeño que contengan dos o más regiones V de la cadena H y dos o
más regiones V de la cadena L de un anticuerpo monoclonal y tengan
acción agonista de TPO por reactividad cruzada con el receptor de
TPO.
Por lo tanto, esta invención se refiere a los
anticuerpos modificados que contienen dos o más regiones V de la
cadena H y dos o más regiones V de la cadena L, preferiblemente de 2
a 6 cada una, en especial preferiblemente de 2 a 4 cada una, lo más
preferiblemente dos cada una, y muestran actividad agonista de TPO
por reactividad cruzada con el receptor de TPO.
Los "anticuerpos modificados" en esta
memoria descriptiva quieren definir cualquier sustancia que contenga
dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la
cadena L, en la que dichas regiones V se combinan directamente o
por un conector por enlace covalente o enlace no covalente. Por
ejemplo, polipéptidos y compuestos producidos combinando cada
región V del anticuerpo por un conector peptídico o un agente
químico de reactividad cruzada, y similares. Las dos o más regiones
V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L usadas en
la invención pueden derivar del mismo anticuerpo o de diferentes
anticuerpos.
Los anticuerpos modificados de la invención
pueden ser de cualquier forma siempre que reconozcan específicamente
y reaccionen cruzadamente con el receptor de TPO y de esta forma
puedan transducir una señal al interior de las células. Incluyen
anticuerpos modificados producidos por modificación adicional de una
parte de la secuencia de aminoácidos de la región V de los
anticuerpos modificados.
Los ejemplos preferidos de los anticuerpos
modificados de la invención son multímeros tales como dímeros,
trímeros o tetrámeros de Fv de cadena sencilla que contienen una
región V de la cadena H y una región V de la cadena L, o
polipéptidos de cadena sencilla que contienen dos o más regiones V
de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L. Cuando los
anticuerpos modificados de la invención son multímeros de Fv de
cadena sencilla tal como dímeros, trímeros, tetrámeros y similares,
que contienen una región V de la cadena H y una región V de la
cadena L, se prefiere que la región V de la cadena H y la región V
de la cadena L que existen en la misma cadena no estén asociadas
para formar un sitio de unión al antígeno.
Más preferiblemente, los ejemplos son dímeros de
Fv de cadena sencilla que contienen una región V de la cadena H y
una región V de la cadena L, o un polipéptido de cadena sencilla
que contiene dos regiones V de la cadena H y dos regiones V de la
cadena L. La región V de la cadena H y la región V de la cadena L
preferiblemente están conectadas por un conector en los anticuerpos
modificados.
El multímero de Fv de cadena sencilla mencionado
antes incluye un multímero por enlace no covalente, un multímero
por un enlace covalente a través de un radical de reactividad
cruzada y un multímero a través de un reactivo de reactividad
cruzada (un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o anticuerpo
modificado bivalente). Los radicales de reactividad convencionales
cruzada usados para hacer reaccionar cruzadamente péptidos se pueden
usar como los radicales de reactividad cruzada para formar los
multímeros. Son ejemplos la reactividad cruzada disulfuro por
restos de cisteína, otros radicales de reactividad cruzada tales
como alquileno C_{4}-C_{10} (p. ej.,
tetrametileno, pentametileno, hexametileno, heptametileno y
octametileno, etc.) o alquenileno C_{4}-C_{10}
(cis/trans-3-butileno,
cis/trans-2-pentenileno,
cis/trans-3-pentenileno,
cis/trans-3-hexenileno, etc.).
Además, el reactivo de reactividad cruzada que
se puede combinar con un Fv de cadena sencilla es, por ejemplo, una
secuencia de aminoácidos que opcionalmente se puede introducir en
Fv, por ejemplo, un anticuerpo contra la secuencia FLAG y similar o
un fragmento del mismo, o un anticuerpo modificado originado a
partir del anticuerpo, por ejemplo, Fv de cadena sencilla.
La "acción agonista de TPO" en la memoria
descriptiva significa una acción biológica que se produzca en
la(s) célula(s) al interior de la cual una señal es
transducida por reactividad cruzada con el receptor de TPO, por
ejemplo, la proliferación, diferenciación o estimulación de
crecimiento de megacariocitos, o producción de plaquetas.
La DE50 de la acción agonista de TPO en la
invención se determina por procedimientos conocidos para medir la
acción agonista. Los ejemplos de la medición son el ensayo de
proliferación celular usando líneas celulares sensibles a TPO tales
como BaF/mpl o UT7/TPO, medición de la fosforilación de la proteína
MPL, ensayo de colonia de megacariocitos por diferenciación a
partir de células de la médula ósea, ensayo de síntesis de
recuperación de plaquetas de ratón in vivo, medición de la
inducción de la expresión del antígeno de plaquetas GPIIbIIIa
(anti-GPIIbIIIa) usando una línea celular
megacarioblástica de leucemia humana (CMK) o medición de la
inducción poliploide de una línea celular megacarioblástica (DAMI).
DE50 es una dosis necesaria para alcanzar el 50% de reacción de la
actividad máxima fijada como 100% en la curva de
dosis-reacción.
Los anticuerpos modificados preferidos de la
invención tienen actividad agonista de TPO (DE50) equivalente a o
mejor que la de un anticuerpo que tiene la misma región de unión al
antígeno que el anticuerpo modificado, es decir el anticuerpo
entero (en lo sucesivo "anticuerpo original") como la IgG que
tiene la misma pareja de región V de la cadena H y región V de la
cadena L que la pareja de región V de la cadena H y región V de la
cadena L que forma la región de unión al antígeno del anticuerpo
modificado. Más preferibles son los que tienen una acción agonista
de TPO (DE50) que es más de dos veces mayor que la del anticuerpo
original, preferiblemente además de más de 5 veces, lo más
preferiblemente de más de 10 veces. La invención incluye anticuerpos
modificados, con acción agonista de TPO que contienen región V de
la cadena H y región V de la cadena L que forma la misma región de
unión al antígeno que el anticuerpo original que se une al receptor
de TPO, pero que no tiene la acción agonista de TPO frente a la
molécula.
Los compuestos que contienen dos o más regiones
V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L de la
invención pueden ser cualesquiera compuestos que contengan dos o más
regiones V de cadena la H y dos o más regiones V de la cadena L del
anticuerpo y muestren acción agonista de TPO (DE50) equivalente o
mejor que la de la trombopoyetina (TPO). Se prefieren los que
tienen acción un agonista de TPO (DE50) más de dos veces mayor que
la de la TPO, más preferiblemente de más de 5 veces, lo más
preferiblemente de más de 10 veces.
Los "compuestos" mencionados en este
documento incluyen no sólo los anticuerpos modificados de la
invención, sino también cualquier compuesto que contenga dos o más,
preferiblemente de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 4, lo más
preferiblemente 2 regiones de unión al antígeno tal como los
anticuerpos enteros o F(ab')_{2}.
Los anticuerpos modificados o compuestos
preferidos de la invención que contienen dos o más regiones V de la
cadena H y dos o más regiones V de la cadena L del anticuerpo tienen
una acción de adhesión intercelular (DE50) no mayor que 1/10
comparado con el anticuerpo original, más preferiblemente no tiene
acción sustancial de adhesión intercelular.
La DE50 de la acción de adhesión intercelular
mencionada antes se determina por procedimientos conocidos para
medir la acción de adhesión intercelular, por ejemplo, por medición
de la aglomeración de células que expresan el receptor de TPO.
La invención se refiere a ADN que codifican los
anticuerpos modificados.
La invención se refiere a células animales o
microorganismos que producen los anticuerpos modificados.
La invención se refiere al uso del anticuerpo
modificado como agonista de TPO.
La invención se refiere a un procedimiento de
transducción de una señal al interior de células por reactividad
cruzada con el receptor de TPO usando el anticuerpo modificado e
induciendo de esta forma la acción agonista de TPO, tal como la
proliferación, inducción-diferenciación o
estimulación de crecimiento de megacariocitos, producción de
plaquetas, fosforilación de la proteína receptora de TPO y
similares.
La invención se refiere a un medicamento para
tratar la trombocitopenia etc. que contiene el anticuerpo modificado
como componente activo.
La invención se refiere al uso del anticuerpo
modificado como un medicamento.
La invención se refiere a un procedimiento de
selección o medición del anticuerpo modificado, que contiene dos o
más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L
del anticuerpo y muestra acción agonista de TPO por reactividad
cruzada con el receptor de TPO, que comprende 1) preparar un
anticuerpo modificado que contiene dos o más regiones V de la
cadena H y dos o más regiones de la cadena L del anticuerpo y se une
específicamente al receptor de TPO, 2) poner en contacto el
anticuerpo modificado con células que expresan el receptor de TPO,
y 3) medir la acción agonista de TPO que ocurre en las células por
reactividad cruzada con el receptor de TPO. El procedimiento de
medición es útil para el control de calidad en la producción de
anticuerpos modificados de la invención como medicamento y para
otros propósitos.
Los anticuerpos modificados pueden ser
anticuerpos modificados monoespecíficos o anticuerpos modificados
multiespecíficos como anticuerpos modificados biespecíficos. Se
prefieren los anticuerpos modificados monoespecíficos.
La presente invención también se refiere a
anticuerpos modificados cuya región V de la cadena H y/o región V
de la cadena L es la región V de la cadena H derivada del anticuerpo
humano y/o la región V de la cadena L derivada del anticuerpo
humano. La región V de la cadena H y/o la región V de la cadena L
derivadas del anticuerpo humano se pueden obtener por selección de
bibliotecas de anticuerpos monoclonales humanos como se describe en
el documento WO99/10494. También están incluidas la región V de la
cadena H y la región V de la cadena L derivadas de los anticuerpos
monoclonales humanos producidos por ratones transgénicos y
similares.
La presente invención se refiere además a
anticuerpos modificados cuyas regiones V de la cadena H y/o regiones
V de la cadena L son regiones V de la cadena H humanizadas y/o
regiones V de la cadena L humanizadas. Específicamente, los
anticuerpos modificados humanizados consisten en la región V de la
cadena L humanizada que comprende regiones marco (FR) derivadas de
una región V de la cadena L del anticuerpo monoclonal humano y
regiones determinantes de la complementaridad (en lo sucesivo
"CDR") derivadas de una región V de la cadena L de anticuerpo
monoclonal de mamífero no humano (p. ej., ratón, rata, animal
bovino, oveja, mono) y/o la región V de la cadena H humanizada que
comprende la FR derivada de una región V de la cadena H de
anticuerpo monoclonal humano y la CDR derivada de una región V de
la cadena H de anticuerpo monoclonal de mamífero no humano (p. ej.,
ratón, rata, animal bovino, oveja, mono). En este caso, las
secuencias de aminoácidos de la CDR y FR pueden estar parcialmente
alteradas, p. ej., eliminadas, sustituidas o añadidas.
Las regiones V de la cadena H y/o regiones V de
la cadena L de los anticuerpos modificados de la invención pueden
ser regiones V de la cadena H y/o regiones V de la cadena L
derivadas de anticuerpos monoclonales de animales distintos del ser
humano (tal como ratón, rata, animal bovino, oveja, mono, pollo y
similares). En este caso, las secuencias de aminoácidos de la CDR y
FR pueden estar parcialmente alteradas, p. ej., eliminadas,
sustituidas o añadidas.
La invención también se refiere a ADN que
codifican los diferentes anticuerpos modificados mencionados antes
y a técnicas de ingeniería genética para producir vectores
recombinantes que comprenden los ADN.
La invención también se refiere a células
huésped transformadas con los vectores recombinantes. Los ejemplos
de células huésped son células animales tales como células humanas,
células de ratón o similares, y microorganismos tales como E.
coli, Bacillus subtilis, levaduras o similares.
La invención se refiere a un procedimiento para
producir los anticuerpos modificados, que comprende cultivar los
huéspedes mencionados antes y extraer los anticuerpos modificados
del cultivo de los mismos.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para producir un dímero del Fv de cadena sencilla,
que comprende cultivar células animales huésped que producen el Fv
de cadena sencilla en un medio sin suero para que segreguen el Fv
de cadena sencilla en el medio, y aislar el dímero de Fv de cadena
sencilla formado en el
medio.
medio.
La presente invención también se refiere al uso
de anticuerpos modificados como agonistas de TPO. Es decir, se
refiere a un agonista de transducción de señales que comprende como
un principio activo el anticuerpo modificado obtenido como se ha
mencionado antes.
Por lo tanto, las preparaciones farmacéuticas
que contienen los anticuerpos modificados agonistas de TPO de la
invención como un principio activo son útiles como agentes de
prevención y/o remedios para las enfermedades sanguíneas
relacionadas con la reducción de plaquetas, trombocitopenia
producida por quimioterapia de cáncer o leucemia y similares.
Los anticuerpos modificados de la presente
invención comprenden dos o más regiones V de la cadena H y dos o
más regiones de la cadena L derivadas de anticuerpos. La estructura
de los anticuerpos modificados puede ser un dímero de Fv de cadena
sencilla que comprende una región V de la cadena H y una región V de
la cadena L o un polipéptido que comprende dos regiones V de la
cadena H y dos regiones V de la cadena L. En los anticuerpos
modificados de la invención, las regiones V de la cadena H y la
cadena L están preferiblemente unidas por un conector peptídico que
consiste en uno o más aminoácidos. Los anticuerpos modificados
resultantes contienen regiones variables de anticuerpos y se unen
al antígeno con la misma especificidad que los anticuerpos
monoclonales
originales.
originales.
En la presente invención, la región V de la
cadena H derivada de un anticuerpo reconoce el receptor de TPO y
oligomeriza, por ejemplo, dimeriza por reactividad cruzada con dicha
molécula, y de esta forma transduce una señal al interior de las
células. La región V de la cadena H de la invención incluye regiones
V de la cadena H derivadas de un mamífero (p. ej., ser humano,
ratón, rata, animal bovino, oveja, mono etc.) y regiones V de la
cadena H que tienen secuencias de aminoácidos parcialmente
modificadas de las regiones V de la cadena H. Es más preferida una
región V de la cadena H humanizada que contienen la FR de la región
V de la cadena H de un anticuerpo monoclonal humano y la CDR de la
región V de la cadena H de un anticuerpo monoclonal de ratón.
También se prefiere una región V de la cadena H que tiene una
secuencia de aminoácidos derivada de un ser humano, que se puede
producir por una técnica de recombinación. La región V de la cadena
H de la invención puede ser un fragmento de la región V de la
cadena H mencionada, cuyo fragmento conserva la capacidad de unión
al antígeno.
En la presente invención, la región V de la
cadena L reconoce el receptor de TPO y oligomeriza, por ejemplo,
dimeriza por reactividad cruzada con dicha molécula, y de esta forma
transduce una señal al interior de las células. La región V de la
cadena L de la invención incluye regiones V de la cadena L derivadas
de un mamífero (p. ej., ser humano, ratón, rata, animal bovino,
oveja, mono etc.) y regiones V de la cadena L que tienen secuencias
de aminoácidos parcialmente modificadas de las regiones V de la
cadena L. Es más preferida una región V de la cadena L humanizada
que contienen la FR de la región V de la cadena L de un anticuerpo
monoclonal humano y la CDR de la región V de la cadena L de
anticuerpos monoclonales de ratón. También se prefiere una región V
de la cadena L que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de un
ser humano, que se puede producir por una técnica de recombinación.
Las regiones V de la cadena L de la invención pueden ser fragmentos
de la región V de la cadena L, cuyos fragmentos conservan la
capacidad de unión al antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada región V de la cadena L y la cadena H forma
un sitio de unión al antígeno. La región variable de las cadenas L
y H está compuesta de cuatro regiones marco comunes conservadas
comparativamente unidas a tres regiones hipervariables o regiones
determinantes de la complementaridad (Kabat, E.A. y col.,
"Sequences of Protein of Immunological Interest", US Dept.
Health and Human Services, 1983).
Las partes principales en las cuatro regiones
marco (FR) forman estructuras de lámina \beta y así tres CDR
forman un bucle. Las CDR pueden formar una parte de la estructura de
lámina \beta en determinados casos. Las tres CDR se mantienen en
posiciones estéricamente cercanas entre sí mediante las FR, que
contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno junto con
las tres CDR.
Estas tres CDR se pueden identificar comparando
la secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo obtenido
con las secuencias de aminoácidos de las regiones V de anticuerpos
conocidos de acuerdo con la norma empírica de Kabat E.A. y col.,
"Sequences of Protein of Immunological Interest".
\vskip1.000000\baselineskip
Un Fv de cadena sencilla es un monómero
polipéptido que comprende una región V de la cadena H y una región
V de la cadena L unidas entre sí, que derivan de anticuerpos. Los Fv
de cadena sencilla resultantes contienen regiones variables de los
anticuerpos originales y conservan sus regiones determinantes de la
complementaridad, y por lo tanto los Fv de cadena sencilla se unen
al antígeno con la misma especificidad que la de los anticuerpos
originales (solicitud japonesa 11-63557). Una parte
de la región variable y/o la CDR del Fv de cadena sencilla de la
invención o una parte de la secuencia de aminoácidos de las mismas
pueden estar parcialmente alterados, por ejemplo, eliminada,
sustituida o añadida. La región V de la cadena H y la región V de la
cadena L que componen el Fv de cadena sencilla de la invención se
han mencionado antes, y pueden estar unidas directamente o por un
conector, preferiblemente un conector peptídico. La constitución del
Fv de cadena sencilla puede ser [región V de la cadena H]-[región V
de la cadena L] o [región V de la cadena L]-[región V de la cadena
H]. En la presente invención, se puede hacer que el Fv de cadena
sencilla forme un dímero, un trímero o un tetrámero, a partir del
cual se puede formar el anticuerpo modificado de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos modificados de cadena sencilla
de la presente invención comprenden dos o más regiones V de la
cadena H y dos o más regiones V de la cadena L, preferiblemente de
dos a cuatro de cada, en especial se prefiere que cada una
comprenda dos o más regiones V de la cadena H y regiones V de la
cadena L, como se ha mencionado antes. Cada región del péptido debe
estar dispuesta de modo que el anticuerpo de cadena sencilla
modificado forme una estructura estérica específica, en concreto que
mimetice una estructura estérica formada por el dímero de Fv de
cadena sencilla. Por ejemplo, las regiones V están dispuestas
ordenadas de la siguiente forma:
[región V de la cadena H]-[región V de la cadena
L]-[región V de la cadena H]-[región V de la cadena L]; o
[región V de la cadena L]-[región V de la cadena
H]-[región V de la cadena L]-[región V de la cadena H];
en las que estas regiones están conectadas por
un conector peptídico, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En esta invención, los conectores para la
conexión entre la región V de la cadena H y la región V de la cadena
L puede ser cualquier conector peptídico que se pueda introducir
por un procedimiento de ingeniería genética o cualquier conector
químicamente sintetizado. Por ejemplo, se pueden usar los conectores
descritos en la bibliografía, p. ej., Protein Engineering,
9(3), 299-305, 1996. Estos conectores pueden
ser iguales o diferentes en la misma molécula. Si son necesarios
los conectores peptídicos, se citan los siguientes como conectores
de ejemplo:
en los que n es un número entero no
menor de 1. La longitud preferida del conector peptídico varía
dependiendo del receptor que va a ser el antígeno, en el caso de Fv
de cadena sencilla normalmente se prefiere el intervalo de 1 a 20
aminoácidos. En el caso de anticuerpos modificados de cadena
sencilla que comprenden dos o más regiones V de la cadena H y dos o
más regiones V de la cadena L, los conectores peptídicos que
conectan las que van a formar el mismo sitio de unión al antígeno
que comprenden [región V de la cadena H]-[región V de la cadena L]
(o [región V de la cadena L]-[región V de la cadena H]) tienen
longitudes de 1-30 aminoácidos, preferiblemente
1-20 aminoácidos, más preferiblemente
3-18 aminoácidos. Los conectores peptídicos que
conectan las que no forman el mismo sitio de unión al antígeno que
comprenden [región V de la cadena H]-[región V de la cadena L] (o
[región V de la cadena L]-[región V de la cadena H]) tienen
longitudes de 1-40 aminoácidos, preferiblemente
3-30 aminoácidos, más preferiblemente
5-20 aminoácidos. El procedimiento para introducir
estos conectores se describirá en la explicación para la
construcción del ADN que codifica los anticuerpos modificados de la
invención.
Los conectores sintetizados químicamente, es
decir, los agentes químicos de reactividad cruzada, de acuerdo con
la invención pueden ser cualesquiera conectores usados de forma
convencional para la unión de péptidos. Los ejemplos de conectores
pueden incluir N-hidroxi-succinimida
(NHS), suberato de disuccinimidilo (DSS), bis(suberato de
sulfosuccinimidilo) (BS^{3}), ditiobis(propionato de
succinimidilo) (DSP), ditiobis(propionato de
sulfosuccinimidilo) (DTSSP),
etilenglicol-bis(succinato de succinimidilo)
(EGS), etilenglicol-bis(succinato de
sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS), tartrato de
disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo
(sulfo-DST),
bis[2-(succinimido-oxicarboniloxi)etil]sulfona
(BSOCOES),
bis[2-(sulfosuccinimido-oxicarboniloxi)etil]sulfona
(sulfo-BSOCOES) o similares. Estos están
disponibles en el comercio. Se prefiere que los conectores
sintetizados químicamente tengan la longitud equivalente a la de
los conectores peptídicos.
Para formar un dímero del Fv de cadena sencilla
se prefiere seleccionar un conector adecuado para que dimerice en
solución tal como un medio de cultivo, más de 20%, preferiblemente
más de 50%, más preferiblemente más de 80%, lo más preferiblemente
más de 90% del Fv de cadena sencilla producido en las células
huésped. Específicamente, se prefiere un conector compuesto de 2 a
12 aminoácidos, preferiblemente de 3 a 10 aminoácidos u otros
conectores que se correspondan con estos.
Los anticuerpos modificados se pueden producir
por conexión, a través del conector mencionado, de una región V de
la cadena H y una región V de la cadena L derivadas de anticuerpos
conocidos o nuevos que se unen específicamente al receptor de TPO.
Como ejemplos de Fv de cadena sencilla se citan los que tienen la
región V de la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo
12B5 y el anticuerpo 12E10 descritos en el documento WO99/10494.
Como ejemplos de los anticuerpos modificados de la invención que
tienen dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V
de la cadena L se citan el dímero de sc12B5 (conector: 15
aminoácidos), dímero de sc12E10 (conector: 15 aminoácidos),
dímero de db12B5 (conector: 5 aminoácidos), dímero de db12E10
(conector: 5 aminoácidos), sc12B5sc(FV)_{2} y
sc12E10sc(Fv)_{2} que contienen las regiones V
de la cadena H y regiones V de la cadena L derivadas de los
anticuerpos monoclonales mencionados antes.
Para preparar los anticuerpos
modificados, se puede unir un péptido señal a su extremo
N-terminal si se desea que el polipéptido sea un
péptido secretorio. Se puede unir una secuencia de aminoácidos
conocida útil para la purificación del polipéptido tal como la
secuencia FLAG, para la purificación eficaz del polipéptido. En
este caso se puede formar un dímero usando un anticuerpo
anti-FLAG.
Para preparar el anticuerpo modificado de la
invención hay que obtener un ADN, es decir un ADN que codifica el
Fv de cadena sencilla o un ADN que codifica el polipéptido de cadena
sencilla reconstruido. Estos ADN, en especial para sc12B5, db12B5,
sc12E10 y/o db12E10 se pueden obtener a partir de los ADN que
codifican las regiones V de la cadena H y las regiones V de la
cadena L derivadas de dichos Fv. También se pueden obtener por el
procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
esos ADN como un molde y amplificando la parte del ADN contenida en
el mismo que codifica la secuencia de aminoácidos deseada con ayuda
de una pareja de cebadores correspondiente a ambos extremos de la
misma.
En el caso de que se desee que cada región V
tenga la secuencia de aminoácidos parcialmente modificada, las
regiones V en las que se modifican, es decir, eliminan, sustituyen o
añaden, uno o más aminoácidos, se pueden obtener por un
procedimiento conocido en la técnica usando la PCR. Una parte de la
secuencia de aminoácidos en la región V preferiblemente se modifica
por la PCR conocida en la técnica con el fin de preparar el
anticuerpo modificado que sea suficientemente activo contra el
antígeno específico.
Para determinar los cebadores para la
amplificación por PCR, se determinan los tipos de cadena H y cadena
L por un procedimiento de tipificación conocido en el campo técnico
si se usa un anticuerpo monoclonal como material de partida.
Para amplificar las regiones V de la cadena L
del anticuerpo 12B5 y el anticuerpo 12E10 por PCR, los cebadores
oligonucleótidos del extremo 5' y extremo 3' se deciden como se ha
mencionado antes. De la misma forma, se deciden los cebadores
oligonucleótidos del extremo 5' y extremo 3' para la amplificación
de las regiones V de la cadena H del anticuerpo 12B5 y anticuerpo
12E10.
En realizaciones de la invención se usan los
cebadores del extremo 5' que contienen una secuencia "GANTC"
que proporciona el sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción Hinf I en las proximidades de su extremo 5' y se usan
los cebadores del extremo 3' que contienen una secuencia de
nucleótidos "CCCGGG" que proporciona el sitio de
reconocimiento de XmaI en las proximidades de su extremo 5'. Se
pueden usar otros sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción en lugar de estos sitios, siempre que se usen para la
subclonación de un fragmento de ADN deseado en un vector de
clonación.
Se usan cebadores específicamente diseñados para
la PCR para que proporcionen las secuencias de nucleótidos
adecuadas en el extremo 5' y el extremo 3' de los ADNc que codifican
las regiones V de los anticuerpos 12B5 y 12E10, de modo que los
ADNc se insertan fácilmente en el vector de expresión y funcionan
adecuadamente en el vector de expresión (p. ej., esta invención
planea aumentar la eficacia de la transcripción insertando la
secuencia Kozak). Las regiones V de los anticuerpos 12B5 y 12E10
obtenidas por amplificación por PCR usando estos cebadores se
insertan en el vector de expresión HEF que contiene la región C
humana deseada (véase el documento WO 92/19759). Los ADN clonados
se pueden secuenciar usando cualquier procedimiento convencional,
por ejemplo, mediante un secuenciador de ADN automático (Applied
Biosystems).
Se puede introducir un conector tal como un
conector peptídico en el anticuerpo modificado de la invención de
la siguiente forma. Se diseñan cebadores que tienen secuencia
parcialmente complementaria con los cebadores para las regiones V
de la cadena H y las regiones V de la cadena L descritas antes y que
codifican el extremo N-terminal y el extremo
C-terminal del conector. Después, se puede llevar a
cabo el procedimiento de la PCR usando estos cebadores para
preparar un ADN que codifica el conector peptídico que tiene la
secuencia y longitud de aminoácidos deseados. Los ADN que codifican
la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se pueden
conectar por el ADN resultante para producir el ADN que codifica el
anticuerpo modificado de la invención que tiene el conector
peptídico deseado. Una vez que se ha preparado el ADN que codifica
uno de los anticuerpos modificados, los ADN que codifican los
anticuerpos modificados con o sin el conector peptídico deseado se
pueden producir fácilmente diseñando diferentes cebadores para el
conector y después llevando a cabo la PCR usando los cebadores y el
ADN mencionado como molde.
Cada región V del anticuerpo modificado de la
presente invención se puede humanizar usando técnicas convencionales
(p. ej., Sato, K. y col., Cancer Res., 53,
1-6 (1993)). Una vez que se ha preparado un ADN que
codifica cada uno de los Fv humanizados, se puede producir
fácilmente un Fv de cadena sencilla humanizado, un fragmento del Fv
de cadena sencilla humanizado, un anticuerpo monoclonal humanizado y
un fragmento del anticuerpo monoclonal humanizado, de acuerdo con
procedimientos convencionales. Preferiblemente las secuencias de
aminoácidos de sus regiones V se pueden modificar parcialmente, si
es necesario.
Además, se puede producir un ADN derivado de
otro origen mamífero, por ejemplo, un ADN que codifica cada una de
las regiones V del anticuerpo humano, de la misma forma usada para
producir el ADN que codifica la región V de la cadena H y la región
V de la cadena L derivadas de ratón, por procedimientos
convencionales como se ha mencionado antes. El ADN resultante se
puede usar para preparar una región V de la cadena H y una región V
de la cadena L de otro mamífero, en especial derivado de anticuerpo
humano, un Fv de cadena sencilla derivado de ser humano y un
fragmento del mismo, y un anticuerpo monoclonal de origen humano y
un fragmento del
mismo.
mismo.
Cuando los anticuerpos modificados de la
invención son anticuerpos modificados biespecíficos, se pueden
producir por procedimientos conocidos (por ejemplo, el
procedimiento descrito en el documento (WO9413804).
Como se ha mencionado antes, cuando se preparan
los ADN objetivo que codifican las regiones V de los anticuerpos
modificados y las regiones V de los anticuerpos modificados
humanizados, los vectores de expresión que los contienen y los
huéspedes transformados con los vectores se pueden obtener de
acuerdo con procedimientos convencionales. Además, los huéspedes se
pueden cultivar de acuerdo con un procedimiento convencional para
producir el Fv de cadena sencilla reconstruido, el Fv de cadena
sencilla humanizado reconstruido, los anticuerpos monoclonales
humanizados y los fragmentos de los mismos. Se pueden aislar de
células o un medio y se pueden purificar en una masa homogénea.
Para este propósito, se puede usar cualquier procedimiento de
aislamiento y purificación usados de forma convencional para
proteínas, p. ej., cromatografía, ultrafiltración, precipitación por
adición de sal y diálisis, si es necesario en combinación, sin
limitación.
Cuando el Fv de cadena sencilla reconstruido de
la presente invención se produce por cultivo de una célula animal
tal como células COS7 o células CHO, preferiblemente células CHO, en
un medio sin suero, el dímero de dicho Fv de cadena sencilla
formado en el medio se puede recuperar establemente y purificar con
un rendimiento alto. Así, el dímero purificado se puede conservar
de forma estable durante un periodo largo. El medio sin suero usado
en la invención puede ser cualquier medio usado de forma
convencional para la producción de una proteína recombinante, sin
limitación.
Para producir los anticuerpos modificados de la
presente invención se puede usar cualquier sistema de expresión,
por ejemplo, células eucariotas, tales como células animales, p.
ej., líneas de células de mamífero establecidas, hongos
filamentosos y levaduras, y células procariotas tales como células
bacterianas, p. ej. E. coli. Preferiblemente, los
anticuerpos modificados de la invención se expresan en células de
mamíferos, por ejemplo células COS7 o células CHO.
En estos casos, se pueden usar promotores
convencionales útiles para la expresión en células de mamíferos.
Preferiblemente, se usa el promotor temprano inmediato de
citomegalovirus humano (HCMV). Los vectores de expresión que
contienen el promotor de HCMV incluyen
HCMV-VH-HC\gamma 1,
HCMV-VL-HCK y similares que derivan
de pSV2neo (documento WO92/19759).
Además, otros promotores para la expresión de
genes en células de mamíferos que se pueden usar en la invención
incluyen promotores de virus derivados de retrovirus, poliomavirus,
adenovirus y virus de simio 40 (SV40) y promotores derivados de
mamíferos tales como el factor de elongación de la cadena
polipeptídica humano 1\alpha (HEF-1\alpha). El
promotor de SV40 se puede usar fácilmente de acuerdo con el
procedimiento de Mulligan, R.C., y col. (Nature 277,
108-114 (1979)) y el promotor de
HEF-1\alpha también se puede usar de acuerdo con
los procedimientos de Mizushima, S. y col. (Nucleic Acids
Research, 18, 5322 (1990)).
El origen de replicación (ori) que se puede usar
en la invención incluye el ori derivado de SV40, poliomavirus,
adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Un vector
de expresión puede contener, como marcador de selección, el gen de
la fosfotransferasa (3') II o I (neo), el gen de la timidina quinasa
(TK), el gen de la xantina-guanina fosforribosil
transferasa de E. coli (Ecogpt) o el gen de la dihidrofolato
reductasa (DHFR).
La actividad de unión al antígeno del anticuerpo
modificado preparado antes, se puede evaluar por un procedimiento
convencional tal como radioinmunoensayo (RIA), ensayo de
inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) o resonancia de plasmón
superficial. También se puede evaluar usando la capacidad inhibidora
de unión del anticuerpo original como un índice, por ejemplo, en
términos de la ausencia o presencia de inhibición de la unión de
dicho anticuerpo monoclonal al antígeno dependiente de la
concentración.
Más en detalle, se cultivan células animales
transformadas con un vector de expresión que contiene un ADN que
codifica el anticuerpo modificado de la invención, p. ej., células
COS7 o células CHO. Las células cultivadas y/o el líquido
sobrenadante del medio o el anticuerpo modificado purificado de los
mismos, se usan para determinar la unión al antígeno. Como control
se usa un líquido sobrenadante del medio de cultivo en el que se han
cultivado células transformadas sólo con el vector de expresión. En
el caso de un antígeno, por ejemplo, el anticuerpo 12B5 y el
anticuerpo 12E10, se añade una muestra de ensayo del anticuerpo
modificado de la invención o un líquido sobrenadante del control a
células Ba/F3 que expresan MPL humana y después se lleva a cabo un
ensayo, tal como citometría de flujo, para evaluar la actividad de
unión al antígeno.
La evaluación in vitro del efecto de
transducción de señal (por ejemplo, proliferación,
inducción-diferenciación o estimulación de
crecimiento de megacariocitos, producción de plaquetas o
fosforilación de la proteína del receptor de TPO) se lleva a cabo
de la siguiente forma. Se añade una muestra de ensayo del anticuerpo
modificado mencionado antes a las células que expresan el
anticuerpo o células en las que se ha introducido el gen para el
anticuerpo, y se evalúa por el cambio producido por la transducción
de señal (por ejemplo, proliferación específica de antígeno de MPL
humana, medición de la fosforilación de proteínas o expresión del
antígeno específico de plaquetas) usando procedimientos
convencionales.
La evaluación in vivo se lleva a cabo por
administración a ratones de un anticuerpo monoclonal que reconoce
la MPL, un anticuerpo modificado de la invención y PBS como control,
y evaluación de la fuerza de la actividad por el cambio de la
cantidad de plaquetas en el suero de ratón.
Como se ha mencionado antes, los anticuerpos
modificados de la invención se pueden obtener preparando anticuerpos
modificados que contienen dos o más regiones V de la cadena H y dos
o más regiones V de la cadena L y que se unen específicamente al
receptor de TPO, y seleccionando los anticuerpos modificados por
evaluación in vivo o in vitro como se ha mencionado
antes.
Los anticuerpos modificados de la invención, que
comprenden dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones
V de la cadena L, preferiblemente dos a cuatro cada una, más
preferiblemente dos cada una, pueden ser un dímero del Fv de cadena
sencilla que comprende una región V de la cadena H y una región V de
la cadena L, o un polipéptido de cadena sencilla en el que dos o
más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L
están conectadas. Se considera que debido a esta construcción, el
péptido imita la estructura tridimensional de la TPO y por
lo tanto retiene una excelente propiedad de unión al antígeno y
actividad agonista de TPO.
Los anticuerpos modificados de la invención
tienen un tamaño molecular notablemente reducido comparado con la
molécula de anticuerpo original (p. ej., IgG), y por lo tanto,
tienen una permeabilidad superior en tejidos y tumores y una
actividad mayor que la molécula de anticuerpo monoclonal original.
Por lo tanto, los anticuerpos modificados de la invención pueden
transducir eficazmente la señal de TPO al interior de las células.
Las preparaciones farmacéuticas que los contienen son útiles para
tratar las enfermedades sanguíneas relacionadas con la reducción de
plaquetas y la trombocitopenia causada por quimioterapia para
cánceres o leucemia. Se espera además que el anticuerpo de la
invención se pueda usar como un agente de contraste por marcaje RI.
El efecto se puede potenciar por unión de un compuesto RI o una
toxina.
La presente invención se ilustrará concretamente
con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no limitan de
ninguna forma el alcance de la invención.
Para ilustrar el procedimiento de producción de
los anticuerpos modificados de la invención, a continuación se
muestran ejemplos de producción de Fv de cadena sencilla. Se usaron
anticuerpos de ratón frente a IAP humana, MABL-1 y
MABL-2, en los ejemplos de producción de anticuerpos
modificados. Los hibridomas MABL-1 y
MABL-2 que los producen respectivamente se
depositaron internacionalmente como FERM BP-6100 y
FERM BP-6101 en el Instituto Nacional de Biociencia
y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología,
Ministerio de Comercio Internacional e Industria
(1-3 Higasi 1-chome,
Tsukuba-shi, Iberaki.ken, Japón), un depositario
para microorganismos autorizado, el 11 de septiembre de 1997.
Ejemplo comparativo
1
Los ADN que codifican las regiones variables de
los anticuerpos monoclonales de ratón frente a IAP humana,
MABL-1 y MABl-2, se clonaron como
sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ARNm de los hibridomas
MABL-1 y MABL-2 se obtuvieron usando
el kit de purificación de ARNm (Pharmacia Biotech).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc bicatenario se sintetizó a partir de
aproximadamente 1 \mug del ARNm usando el kit de amplificación de
ADNc Marathon (CLONTECH) y se unió un adaptador al mismo.
Los cebadores usados para el procedimiento de la
PCR son el cebador adaptador-1 (CLONTECH) mostrado
en el ID SEC Nº 1, que hibrida con una secuencia parcial del
adaptador, y el cebador MKC (región constante kappa de ratón)
(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) mostrado en el ID
SEC Nº 2, que hibrida con la región V de la cadena L de tipo kappa
de ratón.
50 \mul de solución para la PCR contienen 5
\mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,16 mM
(dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 2,5 unidades de una ADN polimerasa,
AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER), 0,2 \muM del cebador adaptador del
ID SEC Nº 1, 0,2 \muM del cebador MKC del ID SEC Nº 2 y 0,1 \mug
del ADNc bicatenario derivado de MABL-1. La
solución se precalentó a 94ºC de temperatura inicial durante 9
minutos y después se calentó a 94ºC durante 1 minuto, a 60ºC
durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto 20 segundos, en este
orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35 veces y después la
mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante 10 minutos.
Se usaron el cebador adaptador-1
mostrado en el ID SEC Nº 1, y el cebador
MHC-\gamma1 (región constante de cadena pesada de
ratón) (Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) mostrado en
el ID SEC Nº 3, como cebadores para la PCR.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo de
acuerdo con el procedimiento de amplificación del gen de la región
V de la cadena L, que se ha descrito en el Ejemplo 1.3-(1), excepto
que se usó 0,2 \muM del cebador MHC-\gamma1 en
lugar de 0,2 \muM del cebador MKC.
Se usaron el cebador adaptador-1
del ID SEC Nº 1, y el cebador MKC del ID SEC Nº 2, como cebadores
para la PCR.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo de
acuerdo con el procedimiento de amplificación del gen de la región
V de la cadena L de MABL-1 que se ha descrito en el
Ejemplo 1.3-(1), excepto que se usó 0,1 \mug de ADNc bicatenario
derivado de MABL-2 en lugar de 0,1 \mug de ADNc
bicatenario de MABL-1.
Se usaron el cebador adaptador-1
del ID SEC Nº 1, y el cebador MHC-\gamma2a
(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991) mostrado en el ID
SEC Nº 4, como cebadores para la PCR.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo de
acuerdo con el procedimiento de amplificación del gen de la región
V de la cadena L, que se ha descrito en el Ejemplo 1.3-(3), excepto
que se usó 0,2 \muM del cebador MHC-\gamma2a en
lugar de 0,2 \muM del cebador MKC.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN amplificado por la PCR como
se ha descrito antes, se purificó usando el kit de purificación de
la PCR QIAquick (QIAGEN) y se disolvió en Tris-HCl
10 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ligaron aproximadamente 140 ng del fragmento
de ADN que comprendía el gen que codifica la región V de la cadena
L de tipo kappa de ratón derivada de MABL-1 como se
ha preparado antes, con 50 ng del vector pGEM-T
Easy (Promega) en el tampón de reacción que comprendía
Tris-HCl 30 mM (pH 7,8), MgCl_{2} 10 mM,
ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM y 3 unidades de ADN ligasa T4
(Promega) a 15ºC durante 3 horas.
Después, se añadió 1 \mul de la mezcla de
reacción a 50 \mul de células competentes DH\alpha5 de E.
coli (Toyobo Inc.) y las células se almacenaron en hielo durante
30 minutos, se incubaron a 42ºC durante 1 minuto y se almacenaron
en hielo durante 2 minutos otra vez. Se añadieron 100 \mul de
medio SOC (GIBCO BRL). Las células de E. coli se pusieron en
placa en medio agar LB (Molecular Cloning; A Laboratory Manual,
Sambrook y col., Cold Springer Harbor Laboratory Press, 1989) que
contenía ampicilina 100 \mug/ml (SIGMA) y se cultivaron a 37ºC
toda la noche para obtener el transformante de E. coli.
El transformante se cultivó en 3 ml de medio LB
que contenía ampicilina 50 \mug/mol a 37ºC toda la noche y el ADN
plasmídico se preparó a partir del cultivo usando el kit QIAprep
Spin Miniprep (QIAGEN).
El plásmido resultante que comprendía el gen que
codifica la región V de la cadena L de tipo Kappa de ratón derivada
del hibridoma MABL-1 se denominó
pGEM-M1L.
De la misma forma descrita antes, se preparó un
plásmido que comprendía el gen que codifica la región V de la
cadena H de ratón derivada del hibridoma MABL-1, a
partir del fragmento de ADN purificado y se denominó pGEM.M1H.
Se preparó un plásmido que comprendía el gen que
codifica la región V de la cadena L de tipo kappa de ratón derivada
del hibridoma MABL-2, a partir del fragmento de ADN
purificado y se denominó pGEM-M2L.
Se preparó un plásmido que comprendía el gen que
codifica la región V de la cadena H de ratón derivada del hibridoma
MABL-2 a partir del fragmento de ADN purificado y se
denominó pGEM-M2H.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
2
La secuencia de nucleótidos del ADNc que
codifica la región en los plásmidos mencionados antes se determinó
usando el Auto DNA Sequencer (Applied Biosystem) y el kit ABI PRISM
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystem)
de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena L del anticuerpo MABL-1 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M1L,
se muestra en el ID SEC Nº 5.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena H del anticuerpo MABL-1 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M1H,
se muestra en el ID SEC Nº 6.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena L del anticuerpo MABL-2 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M2L,
se muestra en el ID SEC Nº 7.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la región V de la cadena H del anticuerpo MABL-2 de
ratón, que está incluida en el plásmido pGEM-M2H,
se muestra en el ID SEC Nº 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
3
Las regiones V de la cadena L y la cadena H en
general tienen estructuras similares y cada una de las cuatro
regiones marco en las mismas están unidas por tres regiones
hipervariables, es decir, regiones determinantes de la
complementaridad (CDR). Una secuencia de aminoácidos de la
estructura marco está relativamente bien conservada, mientras que
una secuencia de aminoácidos de la CDR tiene una variación
extremadamente alta (Kabat, E.A., y col., "Sequences of Proteins
of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services,
1983).
Basándose en estos hechos, las secuencias de
aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos
monoclonales de ratón frente a la IAP humana se aplicaron a las
bases de datos de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos
hechos por Kabat y col. para investigar la homología. Las regiones
CDR se determinaron basándose en la homología mostrada en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\global\parskip0.830000\baselineskip
Ejemplo comparativo
4
Los clones de ADNc, pGEM-M1L y
pGEM-M1H, que codifican las regiones V de la cadena
L y la cadena H del anticuerpo de ratón MABL-1,
respectivamente, se modificaron por el procedimiento de la PCR y se
introdujeron en el vector de expresión HEF (documento WO92/19759)
para preparar los vectores que expresaban el anticuerpo
MABL-1 quimérico.
Se diseñaron un cebador directo MLS (ID SEC Nº
9) para la región V de la cadena L y un cebador directo MHS (ID SEC
Nº 10) para la región V de la cadena H, para que hibridaran con un
ADN que codifica el inicio de la secuencia líder de cada una de las
regiones V y que contengan la secuencia consenso Kozak (J. Mol.
biol., 196, 647-950, 1987) y el sitio de la
enzima de restricción HindIII. Se diseñaron un cebador inverso MLAS
(ID SEC Nº 11) para la región V de la cadena L y un cebador inverso
MHAS (ID SEC Nº 12) para la región V de la cadena H, para que
hibridaran con un ADN que codifica el extremo de la región J y que
contuvieran la secuencia donadora de empalme y el sitio de la
enzima de restricción BamHI.
100 \mul de una solución para la PCR que
contenía 10 \mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2 mM,
dNTP 0,16 mM (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 unidades de una ADN
polimerasa AmpliTaq Gold, 0,4 \muM de cada uno de los cebadores y
8 ng del ADN molde (pGEM-M1L o
pGEM-M1H) se precalentaron a 94ºC de temperatura
inicial durante 9 minutos y después se calentaron a 94ºC durante 1
minuto, a 60ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto 20
segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35
veces y después la mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante
10 minutos.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación de la PCR QIAquick (QIAGEN) y después se digirió
con HindIII y BamHI. El producto de la región V de la cadena L se
clonó en el vector de expresión HEF, HEF-\kappa,
y el producto de la región V de la cadena H se clonó en el vector de
expresión HEF, HEF-\gamma. Después de la
secuenciación del ADN, los plásmidos que contienen un fragmento de
ADN con una secuencia de ADN correcta se denominan
HEF-M1L y HEF-M1H,
respectivamente.
La modificación y clonación del ADNc se llevaron
a cabo de la misma forma descrita en el Ejemplo 4.1, excepto que se
usaron pGEM-M2L y pGEM-M2H como ADN
molde en lugar de pGEM-M1L y
pGEM-M1H. Después de la secuenciación del ADN, los
plásmidos que contienen fragmentos de ADN con las secuencias de ADN
correctas se denominan HEF-M2L y
HEF-M2H, respectivamente.
Los vectores de expresión mencionados antes se
probaron en células COS7 para observar la expresión transitoria de
los anticuerpos MABL-1 y MABL-2
quiméricos.
Se cotransformaron células COS7 con los vectores
HEF-M1L y HEF-M1H por
electroporación usando el aparato Gene Pulser (BioRad). Se
añadieron cada uno de los ADN (10 \mug) y 0,8 ml de PBS con 1 x
10^{7} células/ml a una cubeta. La mezcla se trató con pulsos a
1,5 kV, 25 \muF de capacidad eléctrica.
Después de restauración durante 10 minutos a
temperatura ambiente, las células electroporadas se transfirieron a
medio de cultivo DMEM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal
sin \gamma-globulina al 10%. Después de cultivo
durante 72 horas, se recogió el líquido sobrenadante, se centrifugó
para separar los fragmentos celulares y se recuperó.
La cotransfección de células COS7 con los genes
que codifican el anticuerpo MABL-2 quimérico se
llevó a cabo de la misma forma descrita en el Ejemplo 4.3-(1)
excepto que se usaron los vectores HEF-M2L y
HEF-M2H en lugar de los vectores
HEF-M1L y HEF-M1H. El líquido
sobrenadante se recuperó de la misma forma.
La citometría de flujo se llevó a cabo usando el
líquido sobrenadante del cultivo de las células COS7 mencionado
antes, para medir la unión al antígeno. Se añadieron el líquido
sobrenadante del cultivo de las células COS7 que expresaban el
anticuerpo MABL-1 quimérico o las células COS7 que
expresaban el anticuerpo MABL-2 quimérico, o el
anticuerpo IgG humano (SIGMA) como un control a 4 x 10^{5} células
de la línea celular de leucemia de ratón L1210 que expresa IAP
humana y se incubaron en hielo. Después de lavar, se le añadió el
anticuerpo anti-IgG humana marcado con FITC
(Cappel). Después de incubar y lavar, se midió su intensidad de
fluorescencia usando el aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Puesto que los anticuerpos
MABL-1 y MABL-2 quiméricos se unían
específicamente a células L1210 que expresan IAP humana, se
confirma que estos anticuerpos quiméricos tienen estructuras
adecuadas de las regiones V de los anticuerpos monoclonales de
ratón MABL-1 y MABL-2,
respectivamente (Figuras 1-3).
Ejemplo comparativo
5
El Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-1 se preparó como sigue. La región V
de la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo
MABL-1 y un conector, se amplificaron
respectivamente por el procedimiento de la PCR y se conectaron para
producir el Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-1. El procedimiento de producción se ilustra en
la Figura 4. Se usaron seis cebadores (A-F) para la
producción del Fv de cadena sencilla del anticuerpo
MABL-1. Los cebadores A, C y E tienen una secuencia
homosentido y los cebadores B, D y F tienen una secuencia
antisentido.
Se diseñó el cebador directo VHS para la región
V de la cadena H (cebador A, ID SEC Nº 13) para que hibridara con
un ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena H y que contuviera el sitio de reconocimiento
de la enzima de restricción NcoI. Se diseñó el cebador inverso VHAS
para la región V de la cadena H (cebador B, ID SEC Nº 14) para que
hibridara con un ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H y que se
superpusiera con el conector.
Se diseñó el cebador directo LS para el conector
(cebador C, ID SEC Nº 15) para que hibridara con un ADN que
codifica el extremo N-terminal del conector y para
que se superpusiera con un ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H. Se diseñó
el cebador inverso LAS para el conector (cebador D, ID SEC Nº 16)
para que hibridara con un ADN que codifica el extremo
C-terminal del conector y para que se superpusiera
con un ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena L.
Se diseñó el cebador directo VLS para la región
V de la cadena L (cebador E, ID SEC Nº 17) para que hibridara con
un ADN que codifica el extremo C-terminal del
conector y para que se superpusiera con un ADN que codifica el
extremo N-terminal de la región V de la cadena L. Se
diseñó el cebador inverso VLAS-FLAG para la región
V de la cadena L (cebador F, ID SEC Nº 18) para que hibridara con un
ADN que codifica el extremo C-terminal de la región
V de la cadena L y para que tuviera una secuencia que codifica el
péptido FLAG (Hopp T.P. y col., Bio/Technology, 6,
1204-1210, 1988), dos codones de parada y el sitio
de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI.
En la primera etapa de la PCR se llevaron a cabo
tres reacciones, A-B, C-D y
E-F, y los productos de la PCR de las mismas se
purificaron. Tres productos de la PCR obtenidos de la primera etapa
de la PCR se ensamblaron por su complementaridad. Después, se
añadieron los cebadores A y F y se amplificó el ADN de longitud
completa que codifica el Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-1 (segunda PCR). En la primera PCR,
el plásmido pGEM-M1H que codifica la región V de la
cadena H del anticuerpo MABL-1 (véase el Ejemplo 2),
un plásmido pSC-DP1 que comprende una secuencia de
ADN que codifica una región del conector que comprende: Gly Gly Gly
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (ID SEC Nº 19)
(Huston, J.S., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
5879-5883, 1988) y el plásmido
pGEM-M1L que codifica la región V de la cadena L del
anticuerpo MABL-1 (véase el Ejemplo 2) se usaron
respectivamente como molde.
50 \mul de solución en la primera etapa de la
PCR comprenden 5 \mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2
mM, dNTP 0,16 mM, 2,5 unidades de una ADN polimerasa, AmpliTaq Gold
(PERKIN ELMER), 0,4 \muM de cada uno de los cebadores y 5 ng de
cada ADN molde. La solución de la PCR se precalentó a 94ºC de
temperatura inicial durante 9 minutos y después se calentó a 94ºC
durante 1 minuto, a 65ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto
20 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35
veces y después la mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante
7 minutos.
Los productos de la PCR A-B (371
pb), C-D (63 pb) y E-F (384 pb) se
purificaron usando el kit de purificación de la PCR QIAquick
(QIAGEN) y se ensamblaron en la segunda PCR. En la segunda PCR, 98
\mul de una solución de PCR que comprendía 120 ng del producto
A-B de la primera PCR, 20 ng del producto
C-D de la PCR y 120 ng del producto
E-F de la PCR, 10 \mul de 10 x tampón de la PCR
II, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,16 mM, 5 unidades de ADN polimerasa
AmpliTaq Gold (PERKIN ELMER), se precalentaron a 94ºC de temperatura
inicial durante 8 minutos y después se calentaron a 94ºC durante 2
minutos, a 65ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 2 minutos, en
este orden. Este ciclo de temperatura se repitió dos veces y después
se añadieron a la reacción respectivamente 0,4 \muM de cada uno
de los cebadores A-F. La mezcla se precalentó a 94ºC
de temperatura inicial durante 1 minuto y después se calentó a 94ºC
durante 1 minuto, a 65ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto
20 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 35
veces y después la mezcla de reacción se calentó más a 72ºC durante
7 minutos.
Un fragmento de ADN de 843 pb producido por la
segunda PCR se purificó y se digirió con NcoI y EcoRI. El fragmento
de ADN resultante se clonó en el vector pSCFVT7. El vector de
expresión pSCFVT7 contiene una secuencia señal pelB adecuada para
el sistema de expresión periplásmico de E. coli (Lei, S.P. y
col., J. Bacteriology, 169, 4379-4383,
1987). Después de la secuenciación del ADN, el plásmido que contiene
el fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos
correcta del Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-1 se denomina "pscM1" (véase la Figura
5). La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv
de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-1 contenida en el plásmido pscM1 se muestran en
el ID SEC Nº 20.
El vector pscM1 se modificó por el procedimiento
de la PCR para preparar un vector que expresaba el Fv de cadena
sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-1 en
células de mamífero. El fragmento de ADN resultante se introdujo en
el vector de expresión pCHO1. Este vector de expresión, pCHO1, se
construyó haciendo digerir
DHFR-\DeltaE-rvH-PM1-f
(documento WO92/19759) con EcoRI y SmaI para eliminar el gen de
anticuerpo y conectar el adaptador
EcoRI-NotI-BamHI (Takara Shuzo) al
mismo.
Como cebador directo para la PCR se diseñó el
cebador Sal-VHS mostrado en el ID SEC Nº 21 para que
hibridara con un ADN que codifica el extremo
N-terminal de la región V de la cadena H y para que
contuviera el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
SalI. Como cebador inverso para la PCR, se diseñó el cebador
FRH1anti mostrado en el ID SEC Nº 22 para que hibridara con un ADN
que codifica el extremo de la primera secuencia marco.
100 ml de solución para la PCR que comprendía 10
ml de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,16 mM, 5
unidades de una ADN polimerasa, AmpliTaq Gold, 0,4 mM de cada uno de
los cebadores y 8 ng del ADN molde (pscM1) se precalentaron a 95ºC
de temperatura inicial durante 9 minutos y después se calentaron a
95ºC durante 1 minuto, a 60ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1
minuto 20 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura se
repitió 35 veces y después la mezcla de reacción se calentó más a
72ºC durante 7 minutos.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación QIAquick (QIAGEN) y se digirió con SalI y MboII
para obtener un fragmento de ADN que codifica el extremo
N-terminal del Fv de cadena sencilla reconstruido
del anticuerpo MABL-1. El vector pscM1 se digirió
con MboII y EcoRI para obtener un fragmento de ADN que codifica el
extremo C-terminal del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-1. El fragmento de
ADN SalI-MboII y el fragmento de ADN
MboII-EcoRI se clonaron en el vector
pCHO1-Igs. Después de secuenciar el ADN, el plásmido
que comprendía la secuencia de ADN deseada se denominó
"pCHOM1" (véase la Figura 6). El vector de expresión
pCHO1-Igs, contiene una secuencia señal IgG1 de
ratón adecuada para el sistema de
expresión-secreción en células de mamífero
(Nature, 322, 323-327, 1988). La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv de cadena
sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-1 contenida en el plásmido pCHOM1 se muestran en el ID SEC Nº 23.
sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-1 contenida en el plásmido pCHOM1 se muestran en el ID SEC Nº 23.
El Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-2 se preparó de acuerdo con el
Ejemplo 5.1 mencionado antes. En la etapa de la primera PCR se usó
el plásmido pGEM-M2H que codificaba la región V de
la cadena H de MABL-2 (véase el Ejemplo 2) en lugar
de pGEM-M1H y el plásmido pGEM-M2L
que codifica la región V de la cadena L de MABL-2
(véase el Ejemplo 2) en lugar de pGEM-M1L, para
obtener un plásmido pscM2 que comprende un fragmento de ADN que
codifica la secuencia de aminoácidos deseada del Fv de cadena
sencilla del anticuerpo MABL-2. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 contenida en el
plásmido pscM2 se muestran en el ID SEC Nº 24.
El vector pscM2 se modificó por el procedimiento
de la PCR para preparar un vector, pCHOM2, para la expresión en
células de mamífero, que contiene el fragmento de ADN que codifica
la secuencia correcta de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 contenida en el
plásmido pCHOM2 se muestran en el ID SEC Nº 25.
El vector pCHOM2 se probó en células COS7 para
observar la expresión transitoria del Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2.
Las células COS7 se transformaron con el vector
pCHOM2 por electroporación usando el aparato Gene Pulser (BioRad).
Se añadieron el ADN (10 \mug) y 0,8 ml de PBS con 1 x 10^{7}
células/ml a una cubeta. La mezcla se trató con pulsos a 1,5 kV, 25
\muF de capacidad eléctrica.
Después de restauración durante 10 minutos a
temperatura ambiente, las células electroporadas se transfirieron a
medio de cultivo IMDM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal al
10%. Después de cultivo durante 72 horas, se recogió el líquido
sobrenadante, se centrifugó para separar los fragmentos celulares y
se recuperó.
La existencia del Fv de cadena sencilla del
anticuerpo MABL-2 en el líquido sobrenadante del
cultivo de células COS7 que se habían transfectado con el vector
pCHOM2 se confirmó por el procedimiento de transferencia
Western.
El líquido sobrenadante del cultivo de células
COS7 transfectadas con el vector pCHOM2 y el líquido sobrenadante
del cultivo de células COS7 transfectadas con el vector pCHO1 como
control, se sometieron a electroforesis en SDS y se transfirieron a
una membrana REINFORCED NC (Schlecher & Schuell). La membrana se
bloqueó con leche desnatada al 5% (Morinaga
Nyu-gyo), se lavó con Tween 20-PBS
al 0,05% y se mezcló con un anticuerpo anti-FLAG
(SIGMA). La membrana se incubó a temperatura ambiente, se lavó y se
mezcló con anticuerpo IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina
(Zymed). Después de incubar y lavar a temperatura ambiente, se
añadió la solución de sustrato (Kirkegaard Perry Laboratories) para
el revelado de color (Figura 7).
Se detectó una proteína específica del péptido
FLAG solamente en el líquido sobrenadante del cultivo de las
células COS7 en las que se había introducido el vector pCHOM2, y por
lo tanto, se confirma que el Fv de cadena sencilla reconstruido del
anticuerpo MABL-2 era segregado en este líquido
sobrenadante de cultivo.
La citometría de flujo se llevó a cabo usando el
líquido sobrenadante del cultivo de células COS7 antes mencionadas
para medir la unión al antígeno. Se añadió el líquido sobrenadante
del cultivo de células COS7 que expresan el Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 o el líquido
sobrenadante del cultivo de células COS7 transformadas con el
vector pCHO1 como control a 2 x 10^{5} células de la línea celular
de leucemia de ratón L1210 que expresa la proteína asociada a
integrina (IAP) humana o de la línea celular L1210 transformada con
pCOS1 como control. Después de incubar sobre hielo y lavar, se
añadió el anticuerpo anti-FLAG de ratón (SIGMA).
Después las células se incubaron y se lavaron. Después se le añadió
el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC
(BECTON DICKINSON) y las células se incubaron y lavaron otra vez.
Posteriormente, se midió la intensidad de la fluorescencia usando
el aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Puesto que el Fv de cadena sencilla del
anticuerpo MABL-2 se unía específicamente a las
células L1210 que expresaban la IAP humana, se confirma que el Fv
de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 tiene una afinidad por la proteína asociada
a la integrina humana (IAP) (Véase las Figuras
8-11).
Se midió la actividad de unión del Fv de cadena
sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-2,
basándose en la actividad inhibidora frente a la unión de
anticuerpos monoclonales de ratón al antígeno.
Se añadió el anticuerpo
anti-FLAG ajustado a 1 \mug/ml a cada uno de los
pocillos de una placa de 96 pocillos y se incubó a 37ºC durante 2
horas. Después de lavar, se llevó a cabo el bloqueo con
BSA-PBS al 1%. Después de incubar y lavar a
temperatura ambiente el líquido sobrenadante del cultivo de las
células COS7 en las que se había introducido el gen del antígeno de
la IAP humana de tipo secreción (ID SEC Nº 26) se diluyó con PBS en
el doble de volumen y se añadió a cada pocillo. Después de incubar y
lavar a temperatura ambiente, se añadió a cada pocillo una mezcla
de 50 \mul del anticuerpo MABL-2 biotinilado
ajustado a 100 ng/ml y 50 \mul del líquido sobrenadante diluido
de forma secuencial de las células COS7 que expresaban el Fv de
cadena sencilla reconstruido del anticuerpo MABL-2.
Después de incubar y lavar a temperatura ambiente, se añadió a cada
pocillo la estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Zymed).
Después de incubar y lavar a temperatura ambiente, se añadió la
solución de sustrato (SIGMA) y se midió la absorbancia de la mezcla
de reacción en cada pocillo a 405 nm.
Los resultados pusieron de manifiesto que el Fv
de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 (MABL2-scFv) inhibía de
forma evidente de forma dependiente de la concentración la unión del
anticuerpo MABL-2 de ratón al antígeno IAP humano
en comparación con el líquido sobrenadante del cultivo de células
COS7 a las que se había introducido PCHO1 como control (Figura 12).
Por consiguiente, se sugiere que el Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 tiene la
estructura correcta de cada una de las regiones V del anticuerpo
monoclonal de ratón MABL-2.
Se examinó una acción de inducción de apoptosis
del Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 mediante tinción con
Anexina-V (Boehringer Mannheim) usando las células
L1210 transfectadas con el gen de IAP humana, las células L1210
transfectadas con el vector pCOS1 como control y células
CCRF-CEM.
A cada una de 1 x 10^{5} células de las
células anteriores se añadió el líquido sobrenadante del cultivo de
células COS7 que expresaban el Fv de cadena sencilla reconstruido
del anticuerpo MABL-2 o el líquido sobrenadante del
cultivo de células COS7 transfectadas con el vector pCHO1 como
control, con una concentración final de 50% y las mezclas se
cultivaron durante 24 horas. Después se llevó a cabo la tinción con
Anexina-V y se midió la intensidad de la
fluorescencia usando el aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Los resultados de la tinción con
Anexina-V se muestran en las Figuras
13-18, respectivamente. Los puntos en la región
inferior izquierda representan células vivas y los puntos en la
región inferior derecha representan células en la etapa temprana de
apoptosis, y los puntos en la región superior derecha representan
células en la etapa tardía de apoptosis. Los resultados muestran
que el Fv de cadena sencilla reconstruido del anticuerpo
MABL-2 (MBAL2-scFv) inducía
notablemente la muerte celular de células L1210 específicas para el
antígeno IAP humana (Figuras 13-16) y que el Fv de
cadena sencilla reconstruido también inducía notablemente la muerte
celular de células CCRF-CEM en comparación con el
control (Figuras 17-18).
Se transfectaron células CHO con el vector
pCHOM2 para establecer una línea de células CHO que exprese de
forma constante el Fv de cadena sencilla (polipéptido) derivado del
anticuerpo MABL-2.
Se transformaron células CHO con el vector
pCHOM2 por electroporación usando el aparato Gene Pulser (BioRad).
Se añadió una mezcla de ADN (10 \mug) y 0,7 ml de PBS con células
CHO (1 x 10^{7} células/ml) a una cubeta. La mezcla se trató con
pulsos a 1,5 kV, 25 \muF de capacidad eléctrica. Después de
restauración durante 10 minutos a temperatura ambiente, las células
electroporadas se transfirieron a medio \alpha-MEM
sin ácido nucleico (GIBO BRL) que contenía suero bovino fetal al
10% y se cultivaron. La expresión de la proteína deseada en los
clones resultantes se confirmó por SDS-PAGE y se
seleccionó un clon con un nivel de expresión alto como una línea
celular que producía el Fv de cadena sencilla derivado del
anticuerpo MABL-2. La línea celular se cultivó en
medio CHO-S-SFM II sin suero (GIBCO
BRL) que contenía metotrexato 10 nM (SIGMA). Después se recogió el
líquido sobrenadante del cultivo, se centrifugó para separar los
fragmentos celulares y se recuperó.
El líquido sobrenadante del cultivo de la línea
celular CHO que expresaba el Fv de cadena sencilla obtenido en el
Ejemplo 5.8 se concentró hasta veinte veces usando un cartucho para
la diálisis artificial (PAN130SF, ASAHI MEDICALS). La solución
concentrada se almacenó a -20ºC y se descongeló en la
purificación.
La purificación del Fv de cadena sencilla del
líquido sobrenadante del cultivo de células CHO se llevó a cabo
usando tres tipos de cromatografía, es decir, en Sefarosa azul, un
hidroxiapatito y una filtración en gel.
El líquido sobrenadante concentrado se diluyó
diez veces con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) y se centrifugó
para separar los materiales insolubles (10000 x rpm, 30 minutos). El
líquido sobrenadante se aplicó en una columna de Sefarosa azul (20
ml) equilibrada con el mismo tampón. Después de lavar la columna con
el mismo tampón, las proteínas adsorbidas en la columna se eluyeron
por un gradiente gradual de NaCl en el mismo tampón, 0,1, 0,2, 0,3,
0,5 y hasta 1,0 M. La fracción de paso continuo y cada fracción
eluida se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones
en las que se confirmó el Fv de cadena sencilla (las fracciones
eluidas con NaCl 0,1 a 0,3 M) se juntaron y se concentraron hasta
aproximadamente 20 veces usando CentriPrep-10
(AMICON).
La solución concentrada obtenida en (1) se
diluyó hasta 10 veces con tampón de fosfato 10 mM (pH 7,0) y se
aplicó en la columna de hidroxiapatito (20 ml, BIORAD). La columna
se lavó con 60 ml de tampón de fosfato 10 mM (pH 7,0). Después las
proteínas adsorbidas en la columna se eluyeron con un gradiente
lineal de tampón de fosfato sódico hasta 200 mM (véase la Figura
19). El análisis de cada fracción por SDS-PAGE
confirmó el Fv de cadena sencilla en la fracción A y fracción
B.
Cada una de las fracciones A y B en (2) se
concentró por separado con CentriPrep-10 y se aplicó
a la columna TSKgel G3000SWG (21,5 x 600 mm) equilibrada con tampón
de acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 0,15 M. Los
cromatogramas se muestran en la Figura 20. El análisis de las
fracciones por SDS-PAGE confirmó que ambos picos
mayoritarios (AI y BI) son del Fv de cadena sencilla deseado. En el
análisis de la filtración en gel, la fracción A eluyó a 36 kDa de
peso molecular aparente y la fracción B eluyó a 76 kDa. Los Fv de
cadena sencilla purificados (AI, BI) se analizaron en gel de
poliacrilamida con SDS al 15%. Las muestras se trataron en ausencia
o presencia de un reductor y se llevó a cabo la electroforesis de
acuerdo con el procedimiento de Laemmli. Después la proteína se
tiñó con azul brillante de Coomassie. Como se muestra en la Figura
21, tanto AI como BI dieron una sola banda a 35 kDa de peso
molecular aparente, independientemente de la ausencia o presencia
del reductor. A partir de lo anterior, se concluye que AI es un
monómero de Fv de cadena sencilla y BI es un dímero unido no
covalentemente del Fv de cadena sencilla. El análisis de la
filtración en gel de las fracciones AI y BI con la columna TSKgel
G3000SWG (7,5 x 60 mm) puso de manifiesto que se detecta un pico del
monómero sólo en la fracción AI y se detecta un pico del dímero
sólo en la fracción BI (Figura 22). La fracción de dímero (fracción
BI) daba cuenta de 4 por ciento (%) de los Fv de cadena
sencilla
totales. Más del 90% del dímero en la fracción de dímero se conservaba establemente durante más de un mes a 4ºC.
totales. Más del 90% del dímero en la fracción de dímero se conservaba establemente durante más de un mes a 4ºC.
El vector pscM2 se modificó por el procedimiento
de la PCR para preparar un vector que expresara eficazmente el Fv
de cadena sencilla del anticuerpo MABL-2 en células
de E. coli. El fragmento de ADN resultante se introdujo en
el vector de expresión pSCFVT7.
Como cebador directo para la PCR se diseñó el
cebador Nde-VHSm02 mostrado en el ID SEC Nº 27 para
que hibridara con un ADN que codifica el extremo
N-terminal de la región V de la cadena H y para que
contuviera un codón de iniciación y el sitio de reconocimiento de
la enzima de restricción NdeI. Como cebador inverso para la PCR, se
diseñó el cebador VAS mostrado en el ID SEC Nº 28 para que hibridara
con un ADN que codifica el extremo C-terminal de la
región V de la cadena L y para que contuviera dos codones de parada
y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI. El
cebador directo, Nde-VHSm02, comprende cinco
mutaciones puntuales en la parte que hibrida con el ADN que
codifica el extremo N-terminal de la región V de la
cadena H para la expresión eficaz en E. coli.
100 \mul de una solución para la PCR que
comprendía 10 \mul de 10 x tampón de PCR nº 1, MgCl_{2} 1 mM,
dNTP 0,2 mM, 5 unidades de ADN polimerasa KOD (todos de TOYOBO), 1
\muM de cada cebador y 100 ng de un ADN molde (pscM2) se
calentaron a 98ºC durante 15 segundos, a 65ºC durante 2 segundos y a
74ºC durante 30 segundos, en este orden. Este ciclo de temperatura
se repitió 25 veces.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) y se digirió con NdeI y
EcoRI, y después el fragmento de ADN resultante se clonó en el
vector pSCFVT7, del cual se había eliminado la secuencia señal pelB
por digestión con NdeI y EcoRI. Después de secuenciar el ADN, el
plásmido resultante que comprende un fragmento de ADN con la
secuencia de ADN deseada se denomina "pscM2DEm02" (véase la
Figura 23). La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos del Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 contenida en el plásmido pscM2DEm02 se
muestran en el ID SEC Nº 29.
BL21(DE3)pLysS de E. coli
(STRATAGENE) se transformó con el vector pscM2DEm02 para obtener una
cepa de E. coli que expresaba el Fv de cadena sencilla
derivado del anticuerpo MABL-2. Se examinó en los
clones resultantes la expresión de la proteína deseada usando
SDS-PAGE, y se seleccionó un clon con un nivel de
expresión alto como una cepa productora del Fv de cadena sencilla
derivado del anticuerpo MABL-2.
Se cultivó una colonia individual de E.
coli obtenida por al transformación, en 3 ml de medio LB a 28ºC
durante 7 horas y después en 70 ml de medio LB a 28ºC toda la
noche. Este precultivo se trasplantó a 7 litros de medio LB y se
cultivó a 28ºC con agitación a 300 rpm usando el fermentador de
tanque. Cuando la absorbancia del medio alcanzó una DO = 1,5, se
indujeron las bacterias con IPTG 1 mM y después se cultivaron
durante 3 horas.
El medio de cultivo se centrifugó (10000 x g, 10
minutos) y se recuperaron las bacterias precipitadas. Se añadió a
las bacterias tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que
contenía EDTA 5 mM, NaCl 0,1 M y Triton X-100 al 1%
y las bacterias se alteraron por ultrasonidos (salida: 4; ciclo de
trabajo: 70%, 1 minuto x 10 veces). La suspensión de las bacterias
alteradas se centrifugó (12000 x g, 10 minutos) para precipitar el
cuerpo de inclusión. El cuerpo de inclusión aislado se mezcló con
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía EDTA 5
mM, NaCl 0,1 M y Triton X-100 al 4%, se trató por
ultrasonidos (salida: 4, ciclo de trabajo: 50%, 30 segundos x 2
veces) otra vez y se centrifugó (12000 x g, 10 minutos) para aislar
la proteína deseada como precipitado y separar las proteínas
contenidas en el líquido sobrenadante.
El cuerpo de inclusión que comprendía la
proteína deseada se lisó en tampón Tris-HCl 50 mM
(pH 8,0) que contenía urea 6 M, EDTA 5 mM y NaCl 0,1 M y se aplicó
en columna de filtración en gel Sephacryl S-300 (5 x
90 cm, Amersham Pharmacia) equilibrada con tampón de
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía urea 4 M, EDTA
5 mM, NaCl 0,1 M y mercaptoetanol 10 mM con un caudal de 5
ml/minuto para separar los Fv de cadena sencilla con peso molecular
alto asociados. Las fracciones obtenidas se analizaron con
SDS-PAGE y las fracciones con pureza alta de la
proteína se diluyeron con el tampón usado en la filtración en gel
hasta DO_{280}=0,25. Después, las fracciones se dializaron tres
veces frente a tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que
contenía EDTA 5 mM, NaCl 0,1 M, Arg 0,5 M, glutatión 2 mM en la
forma reducida y glutatión 0,2 mM en la forma oxidada con el fin de
volver a plegar la proteína. Además, la fracción se dializó tres
veces frente a tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl
0,15 M para intercambiar el tampón.
El producto dializado se aplicó en la columna de
filtración en gel Superdex 200 pg (2,6 x 60 cm, Amersham Pharmacia)
equilibrada con tampón de acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl
0,15 M para separar una pequeña cantidad de proteína de alto peso
molecular que estaba intermolecularmente entrecruzada por enlaces
S-S. Como se muestra en la Figura 24, se eluyeron
dos picos, principal y subpico, después de los picos anchos que
supuestamente se atribuían a un agregado de alto peso molecular. El
análisis por SDS-PAGE (véase la Figura 21) y las
posiciones de elución de los dos picos en el análisis de filtración
en gel sugerían que el pico principal es el del monómero del Fv de
cadena sencilla y el subpico es el del dímero unido no
covalentemente del Fv de cadena sencilla. El dímero unido no
covalentemente daba cuenta del 4 por ciento de los Fv de cadena
sencilla totales.
Se examinó la acción de inducción de apoptosis
del Fv de cadena sencilla del anticuerpo MABL-2
(MABL2-scFv) producido por las células CHO y E.
coli de acuerdo con dos protocolos por tinción con
Anexina-V (Boehringer Mannheim) usando las células
L1210 (hIAP/L1210) en las que se había introducido el gen de IAP
humana.
En el primer protocolo, se añadieron los
anticuerpos de las muestras con una concentración final de 3
\mug/ml a 5 x 10^{4} células de hIAP/L1210 y se cultivaron
durante 24 horas. Se analizaron los anticuerpos de las muestras, es
decir, el monómero y el dímero de Fv de cadena sencilla de
MABL-2 de las células CHO obtenidas en el Ejemplo
5.9, el monómero y el dímero del Fv de cadena sencilla de
MABL-2 de E. coli obtenido en el ejemplo
5.12, y el anticuerpo IgG de ratón como control. Después del
cultivo, se llevó a cabo la tinción con Anexina-V y
se midió la intensidad de fluorescencia usando el aparato FACScan
(BECTON DICKINSON).
En el segundo protocolo, los anticuerpos de las
muestras con una concentración final de 3 \mug/ml se añadieron a
5 x 10^{4} células de la línea celular hIAP/L1210, se cultivaron
durante 2 horas y se mezclaron con anticuerpo
anti-FLAG (SIGMA) con una concentración final de 15
\mug/ml y después se cultivaron durante 22 horas. Se analizaron
los anticuerpos de las muestras del monómero del Fv de cadena
sencilla de MABL-2 de células CHO obtenidos en el
Ejemplo 5.9 y el anticuerpo IgG de ratón como control. Después del
cultivo, se llevó a cabo la tinción con Anexina-V y
se midió la intensidad de fluorescencia usando el aparato
FACScan.
Los resultados de los análisis por tinción con
Anexina-V se muestran en las Figuras
25-31. Los resultados muestran que los dímeros del
polipéptido Fv de cadena sencilla de MABL-2
producidos en las células CHO y E. coli inducían
notablemente la muerte celular (Figuras 26, 27) en comparación con
el control (Figura 25), mientras que no se observó inducción de la
apoptosis en los monómeros del polipéptido Fv de cadena sencilla de
MABL-2 producidos en las células CHO y E.
coli (Figuras 28, 29). Cuando se usó junto con el anticuerpo
anti-FLAG, el monómero del polipéptido Fv de cadena
sencilla derivado del anticuerpo MABL-2 producido en
las células CHO inducía notablemente la muerte celular (Figura 31)
en comparación con el control (Figura 30).
La medición de IgG humana (proteína M) producida
por células de mieloma humano y contenida en el suero de ratón, se
llevó a cabo mediante el siguiente ELISA. Se añadieron 100 \mul de
anticuerpo anti-IgG humana de cabra (BIOSOURCE,
lote nº 7902) diluidos a 1 \mug/ml con tampón de bicarbonato al
0,1% (pH 9,6) a cada pocillo en una placa de 96 pocillos (Nunc) y
se incubó a 4ºC toda la noche de modo que se inmovilizara el
anticuerpo. Después del bloqueo, se añadieron 100 \mul de suero de
ratón diluido gradualmente o de la IgG humana (CAPPEL, lote nº
00915) como patrón a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente. Después de lavar, se añadieron 100 \mul de
anticuerpo anti-IgG humana marcado con fosfatasa
alcalina (BIOSOURCE, lote nº 6202) que se había diluido 5000 veces,
y se llevó a cabo la incubación durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de lavar, se añadió una solución de sustrato.
Después de incubación, se midió la absorbancia a 405 nm usando le
lector MICROPLATE READER Modelo 3550 (BioRad). La concentración de
IgG humana en el suero de ratón se calculó basándose en la curva de
calibración obtenida con los valores de absorbancia de la IgG
humana como patrón.
El monómero y el dímero del polipéptido de
scFv/CHO se diluyeron respectivamente a 0,4 mg/ml o 0,25 mg/ml con
PBS(-) esterilizado por filtración el día de la administración para
preparar las muestras para la administración.
Se preparó un modelo de ratón de mieloma humano
como sigue. Células KPMM2 pasadas in vivo (documento
JP-Appl. 7-236475) por un ratón
SCID (Japan Clare) se suspendieron en medio RPMI1640
(GIBCO-BRL) que contenía suero bovino fetal al 10%
(GIBCO-BRL) y se ajustaron a 3 x 10^{7}
células/ml. Se trasplantaron 200 \mul de la suspensión de células
KPMM2 (6 x 10^{6} células/ratón) al ratón SCID (macho, 6 semanas
de edad) por la vena caudal del mismo, al que se le había inyectado
por vía subcutánea el anticuerpo asialo-GM1 (WAKO
JUNYAKU, 1 vial disuelto en 5 ml) un día antes del trasplante.
Las muestras de los anticuerpos preparadas en
(2), el monómero (250 \mul) y el dímero (400 \mul), se
administraron al ratón modelo de mieloma humano preparado en (3)
por la vena caudal del mismo. La administración se inició tres días
después del trasplante de las células KPMM2 y se llevó a cabo dos
veces al día durante tres días. Como control, se administraron de
la misma forma 200 \mul de PBS(-) esterilizado por filtración, dos
veces al día durante tres días, por la vena caudal. Cada grupo
consistía en 7 ratones.
El efecto antitumoral del monómero y el dímero
del polipéptido scFv/CHO con el ratón modelo de mieloma humano se
evaluó en términos de cambio de la concentración de IgG humana
(proteína M) en el suero de ratón y el tiempo de supervivencia del
ratón. El cambio de concentración de IgG humana se determinó
midiéndola en el suero de ratón recogido 24 días después del
trasplante de células KPMM2, por el ELISA descrito antes en (1). La
cantidad de IgG humana (proteína M) en el suero del grupo al que se
le había administrado PBS(-) (control) aumentó a aproximadamente
8500 \mug/ml, mientras que la cantidad de IgG humana del grupo al
que se le había administrado el dímero de scFv/CHO era notablemente
baja, es decir, tan baja como una décima parte o menos que la del
grupo de control. Por lo tanto, los resultados muestran que el
dímero de scFv/CHO inhibe fuertemente el crecimiento de las células
KPMM2 (Figura 32). Como se muestra en la Figura 33, se observó una
prolongación notable del tiempo de supervivencia en el grupo al que
se le había administrado el dímero de scFv/CHO comparado con el
grupo al que se le había administrado PBS(-).
A partir de lo anterior se confirma que el
dímero de scFv/CHO tiene un efecto antitumoral para el modelo de
ratón de mieloma humano. Se considera que el efecto antitumoral del
dímero de scFv/CHO, el anticuerpo modificado de la invención,
resulta de la acción inductora de apoptosis del anticuerpo
modificado.
El ensayo de hemaglutinación y la determinación
de la hemaglutinación se llevaron a cabo de acuerdo con
"Immuno-Biochemical Investigation",
Zoku-Seikagaku Jikken Koza, editado por la Sociedad
Bioquímica de Japón, publicado por Tokyo Kagaku Dojin.
Se tomó sangre de un donante sano usando
jeringuillas tratadas con heparina y se lavó con PBS(-) tres veces,
y después se preparó una suspensión de eritrocitos con una
concentración final de 2% en PBS(-). Las muestras de ensayo eran el
anticuerpo MABL-2, el monómero y el dímero del
polipéptido Fv de cadena sencilla producido por las células CHO, y
el monómero y el dímero del polipéptido Fv de cadena sencilla
producido por E. coli, y el control era IgG de ratón
(ZYMED). Para la investigación del efecto de hemaglutinación, se
usaron placas de 96 pocillos de fondo redondo disponibles en
Falcon. Se añadieron y mezclaron en el pocillo 50 \mul por
pocillo de las muestras de anticuerpos mencionadas antes y 50 \mul
de suspensión de eritrocitos al 2%. Después de incubación durante 2
horas a 37ºC, las mezclas de reacción se almacenaron a 4ºC toda la
noche y se determinó la hemaglutinación de las mismas. Como
control, se usaron 50 \mul por pocillo de PBS(-) y el ensayo de
hemaglutinación se llevó a cabo de la misma manera. La IgG de ratón
y el anticuerpo MABL-2 se usaron con 0,01, 0,1, 1,0,
10,0 ó 100,0 \mug/ml de la concentración final de los
anticuerpos. Los Fv de cadena sencilla se usaron con 0,004, 0,04,
0,4, 4,0, 40,0 ó 80,0 \mug/ml de la concentración final y además a
160 \mug/ml sólo en el caso del dímero del polipéptido producido
por E. coli. Los resultados se muestran en la Tabla 2. En el
caso del anticuerpo MABL-2, la hemaglutinación se
observó con una concentración de más de 0,1 \mug/ml, mientras que
no se observó hemaglutinación para el monómero ni para el dímero
del Fv de cadena sencilla.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
6
Para preparar un plásmido que expresa el
anticuerpo modificado [sc(Fv)_{2}] que comprende dos
regiones V de la cadena H y dos regiones v de la cadena L derivadas
del anticuerpo MABL-2, el pCHOM2 mencionado antes,
que comprende el ADN que codifica el scFv derivado de
MABL-2 descrito antes, se modificó por el
procedimiento de la PCR como se menciona a continuación y el
fragmento de ADN resultante se introdujo en pCHOM2.
Los cebadores usados para la PCR son el cebador
EF1 (ID SEC Nº: 30) como cebador homosentido, que se diseñó para
que hibridara con un ADN que codifica EF1\alpha y un cebador
antisentido (ID SEC Nº: 19) que se diseñó para que hibridara con el
ADN que codifica el extremo C-terminal de la región
V de la cadena L y para que contuviera una secuencia de ADN para
una región conectora, y el cebador VLLAS que contiene el sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción SalI (ID SEC Nº 31).
100 \mul de solución para la PCR comprenden 10
\mul de 10 x tampón de PCR nº 1, MgCl_{2} 1 mM, dNTP 0,2 mM
(dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 unidades de ADN polimerasa KOD (Toyobo,
Inc.), 1 \muM de cada uno de los cebadores y 100 ng del ADN molde
(pCHOM2). La solución de la PCR se calentó a 94ºC durante 30
segundos, a 50ºC durante 30 segundos y a 74ºC durante 1 minuto, en
este orden. Este ciclo de temperatura se repitió 30 veces.
El producto de la PCR se purificó usando el kit
de purificación QIAquick (QIAGEN) y se digirió con SalI. El
fragmento de ADN resultante se clonó en el vector pBluescript
KS^{+} (Toyobo, Inc.). Después de secuenciación del ADN, se
digirió un plásmido que comprendía la secuencia de ADN deseada con
SalI y el fragmento de ADN obtenido se conectó usando el kit Rapid
DNA Ligation (BOEHRINGER MANNHEIM) a pCHOM2 hecho digerir con SalI.
Después de secuenciación del ADN, el plásmido que comprende la
secuencia de ADN deseada se denomina
"pCHOM2(Fv)_{2}" (véase la Figura 34). La
secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la región
sc(Fv)_{2} del anticuerpo MABL-2
contenida en el plásmido pCHOM2(Fv)_{2} se muestran
en el ID SEC Nº 32.
Los scFv que contienen conectores con diferentes
longitudes y las regiones V que se diseñan en el orden [cadena
H]-[cadena L] (en lo sucesivo "HL") o [cadena L]-[cadena H] (en
lo sucesivo "LH") se prepararon usando como molde ADNc que
codifican la cadena H y la cadena L derivadas de
MABL-2 como se menciona a continuación.
Para la construcción de scFv de tipo HL, el
procedimiento de la PCR se llevó a cabo usando pCHOM2
(Fv)_{2} como molde. En la etapa de la PCR, se usaron una
pareja de cebador CFHL-F1 (ID SEC Nº: 33) y cebador
CFHL-R2 (ID SEC Nº: 34) o una pareja de cebador
CFHL-F2 (ID SEC Nº: 35) y cebador
CFHL-R1 (ID SEC Nº: 36) y polimerasa KOD. El
procedimiento de la PCR se llevó a cabo repitiendo 30 veces un ciclo
de temperatura que consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto con el fin de producir
un ADNc para la cadena H que contenía una secuencia líder en el
extremo 5' o un ADNc para la cadena L que contenía la secuencia
FLAG en su extremo 3'. Los ADNc resultante para la cadena H y la
cadena L se mezclaron y se llevó a cabo la PCR repitiendo 5 veces
el ciclo de temperatura que consistía en 94ºC durante 30 segundos,
60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, en este orden,
usando la mezcla como moldes y la polimerasa KOD. Se añadieron a la
mezcla de reacción los cebadores CFHL-F1 y
CFHL-R1 y después la reacción PCR se llevó a cabo
repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura mencionado antes para
producir el ADNc para el tipo HL-0 sin conector.
Para construir el scFv de tipo LH, la reacción
PCR se llevó a cabo usando, como molde pGEM-M2L y
pGEM-M2H que contienen los ADNc que codifican la
región V de la cadena L y la región V de la cadena H del anticuerpo
MABL-2, respectivamente (véase el documento
JP-Appl. 11-63557). Se usaron una
pareja del cebador T7 (ID SEC Nº: 37) y el cebador
CFLH-R2 (ID SEC Nº: 38) o una pareja del cebador
CFLH-F2 (ID SEC Nº: 39) y CFLH-R1
(ID SEC Nº: 40) y la polimerasa KOD (Toyobo Inc.). La reacción PCR
se llevó a cabo repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto en un orden secuencial para producir un ADNc
de una cadena L que contiene un secuencia líder en el extremo 5' o
un ADNc de una cadena H que contiene la secuencia FLAG en su extremo
3'. Los ADNc resultantes de la cadena L y la cadena H se mezclaron
y se llevó a cabo la PCR usando esta mezcla como moldes y la
polimerasa KOD, repitiendo 5 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, en este orden. A la mezcla de reacción se
añadieron los cebadores T7 y CFLH-R1 y la reacción
se llevó a cabo repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura
mencionado antes. El producto de reacción se usó como molde y la
PCR se llevó a cabo usando una pareja del cebador
CFLH-F4 (ID SEC Nº: 41) y el cebador
CFLH-R1 repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura
que consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos
y 72ºC durante 1 minuto, en este orden, para producir un ADNc de
tipo LH-0 sin conector.
Los ADNc resultantes de los tipos
LH-0 y HL-0 se digirieron con las
enzimas de restricción EcoRI y BamHI (Takara Shuzo) y los ADNc
digeridos se introdujeron en un plásmido de expresión INPEP4 para
células de mamífero usando Ligation High (Toyobo Inc.),
respectivamente. Se transformó JM109 de E. coli competente
(Nippon Gene) con cada uno de los plásmidos, y los plásmidos
deseados se aislaron de E. coli transformada usando el kit
QIAGEN Plasmid Maxi (QUIAGEN). De esta forma se prepararon los
plásmidos pCF2LH-0 y pCF2HL-0.
Para construir los plásmidos de expresión de
tipo HL que contienen conectores con tamaños diferentes, se usaron
pCF2HL-0 como molde y CFHL-X3 (ID
SEC Nº: 42), CFHL-X4 (ID SEC Nº: 43),
CFHL-X5 (ID SEC Nº: 44), CFHL-X6 (ID
SEC Nº: 45) o CFHL-X7 (ID SEC Nº: 46), como un
cebador homosentido, y el cebador BGH-1 (ID SEC
Nº:47) como un cebador antisentido, que es complementario con la
secuencia del vector. La reacción de la PCR se llevó a cabo usando
la polimerasa KOD repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, en este orden, y los productos de reacción
se digirieron con las enzimas de restricción XhoI y BamHI (Takara
Shuzo). Los fragmentos digeridos se introdujeron entre los sitios
XhoI y BamHI en pCF2HL-0 usando Ligation High
(Toyobo Inc.), respectivamente. Se transformó JM109 de E.
coli competente con cada uno de los plásmidos, y los plásmidos
deseados se aislaron de E. coli transformada usando el kit
Qiagen Plasmid Maxi. Así, se prepararon los plásmidos de expresión
pCF2HL-3, pCF2HL-4,
pCF2HL-5, pCF2HL-6 y
pCF2HL-7.
Para construir el plásmido de expresión para la
expresión transitoria en células COS7 los plásmidos
pCF2HL-0, pCF2HL-3,
PCF2HL-4, pCF2HL-5,
pCF2HL-6 y pCF2HL-7 se digirieron
con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (Takara Shuzo) y los
fragmentos resultantes de aproximadamente 800 pb se purificaron con
electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos obtenidos se
introdujeron entre los sitios EcoRI y BamHI en un plásmido de
expresión pCOS1 para la expresión en células de mamífero usando
Ligation High (Toyobo Inc.), respectivamente. Se transformó
DH\alpha5 de E. coli competente (Toyobo Inc.) con cada uno
de los plásmidos, y los plásmidos deseados se aislaron de E.
coli transformada usando el kit Qiagen Plasmid Maxi. Así, se
prepararon los plásmidos CF2HL-0/pCOS1,
CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1,
CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 y
CF2HL-7/pCOS1.
Como ejemplo típico de estos plásmidos, se
ilustra en la Figura 35 la construcción del plásmido
CF2HL-0/pCOS1 y la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos de MABL2-scFv
<HL-0> contenida en el plásmido, se muestran
en el ID SEC Nº 48. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias
de aminoácidos de las regiones del conector en estos plásmidos
también se muestran en la Fig. 36.
Para construir los plásmidos de expresión de
tipo LH que contienen conectores de tamaño diferente, se usaron
pCF2LH-0, como un molde, y CFLH-X3
(ID SEC Nº: 49), CFLH-X4 (ID SEC Nº: 50),
CFLH-X5 (ID SEC Nº: 51), CFLH-X6,
(ID SEC Nº: 52) o CFLH-X7 (ID SEC Nº: 53), como un
cebador homosentido, y el cebador BGH-1 como un
cebador antisentido, que es complementario con la secuencia del
vector usado. La reacción de la PCR se llevó a cabo usando la
polimerasa KOD, repitiendo 30 veces el ciclo de temperatura que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, en este orden, y los productos de reacción se
digirieron con las enzimas de restricción XhoI y BamHI. Los
fragmentos digeridos se introdujeron en pCF2LH-0
entre los sitios XhoI y BamHI usando Ligation High,
respectivamente. Se transformó DH\alpha5 de E. coli
competente (Toyobo Inc.) con cada uno de los plásmidos, y los
plásmidos deseados se aislaron de E. coli transformada
usando el kit Qiagen Plasmid Maxi. Así, se prepararon los vectores
de expresión pCF2LH-3, pCF2LH-4,
pCF2LH-5, pCF2LH-6 y
pCF2LH-7.
Para construir el plásmido de expresión para la
expresión transitoria en células COS7 los plásmidos
pCF2LH-0, pCF2LH-3,
pCF2LH-4, pCF2LH-5,
pCF2LH-6 y pCF2LH-7 se digirieron
con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (Takara Shuzo) y los
fragmentos resultantes de aproximadamente 800 pb se purificaron por
electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos obtenidos se
introdujeron entre los sitios XhoI y BamHI en un plásmido de
expresión pCOS1 para la expresión en células de mamífero usando
Ligation High, respectivamente. Se transformó DH\alpha5 de E.
coli competente (Toyobo Inc.) con cada uno de los plásmidos y
los plásmidos deseados se aislaron de E. coli transformada
usando el kit Qiagen Plasmid Maxi. Por consiguiente, se prepararon
los plásmidos CF2LH-0/pCOS1,
CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1,
CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 y
CF2LH-7/pCOS1.
Como ejemplo típico de estos plásmidos, en la
Figura 37 se ilustra la construcción del plásmido
CF2LH-0/pCOS1 y la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos de MABL2-scFv
<LH-0> contenida en el plásmido, se muestran
en el ID SEC Nº 54. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias
de aminoácidos de las regiones del conector en estos plásmidos
también se muestran en la Fig. 38.
Los scFv y sc(Fv)_{2} de tipo HL
y tipo LH se expresaron transitoriamente en células COS7 (JCRB9127,
Japan Health Sciences Foundation). Las células COS7 se
subcultivaron en medio DMEM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino
fetal al 10% serum (HyClone) a 37ºC en un incubador en atmósfera de
dióxido de carbono. Las células COS7 se transfectaron con los
vectores CF2HL-0, 3\sim7/pCOS1, o
CF2LH-0/ 3\sim7/pCOS1 preparados en el Ejemplo 6.2
o los vectores pCHOM2(Fv)_{2} por electroporación
usando el aparato Gene Pulser (BioRad). Se añadieron a la cubeta el
ADN (10 \mug) y 0,25 ml de 2 x 10^{7} células/ml en medio de
cultivo DMEM que contenía FBS al 10% y BES 5 mM (SIGMA). Después de
reposar durante 10 minutos las mezclas se trataron con pulsos a 0,17
kV, 950 \muF de capacidad eléctrica. Después de restauración
durante 10 minutos a temperatura ambiente, las células
electroporadas se transfirieron al medio de cultivo DMEM (FBS al
10%) en un matraz de 75 cm^{3}. Después de cultivar durante 72
horas, se recogió el líquido sobrenadante del cultivo y se
centrifugó para separar los fragmentos celulares. El líquido
sobrenadante del cultivo se sometió a filtración usando un filtro
superior de botella de 0,22 \mum (FALCON) para obtener el líquido
sobrenadante del cultivo (en lo sucesivo "CM").
Las células transfectadas de la misma forma que
en (1) se transfirieron al medio DMEM (FBS al 10%) en un matraz de
75 cm^{3} y se cultivaron toda la noche. Después del cultivo, se
descartó el líquido sobrenadante y las células se lavaron con PBS y
después se añadieron al medio
CHO-S-SFM II (GIBCO BRL). Después de
cultivar durante 72 horas, se recogió el líquido sobrenadante del
cultivo, se centrifugó para separar los fragmentos celulares y se
filtró usando un filtro superior de botella de 0,22 \mum (FALCON)
para obtener el CM.
Los diferentes MABL2-scFv y
sc(Fv)_{2} en el CM de COS7 preparado en el Ejemplo
6.3 (2) mencionado antes, se detectaron por el procedimiento de
transferencia Western.
Cada CM de COS7 se sometió a electroforesis en
SDS-PAGE y se transfirió a una membrana REINFORCED
NC (Schleicher & Schuell). La membrana se bloqueó con leche
desnatada al 5% (Morinaga Nyu-gyo) y se lavó con
TBS. Después se añadió a la misma un anticuerpo
anti-FLAG (SIGMA). La membrana se incubó a
temperatura ambiente y se lavó. Se añadió un anticuerpo IgG de
ratón marcado con peroxidasa (Jackson Immuno Research). Después de
incubar y lavar a temperatura ambiente, se añadió la solución de
sustrato (Kirkegaard Perry Laboratories) para el desarrollo de
color (Fig. 39).
La citometría de flujo se llevó a cabo usando
los líquidos sobrenadantes del cultivo de células COS7 preparadas
en el Ejemplo 6.3 (1), para medir la unión de
MABL2-scFv y sc(Fv)_{2} al antígeno
proteína asociada a integrina (IAP) humana. Se añadieron los
líquidos sobrenadantes del cultivo que se iban a ensayar o un
líquido sobrenadante del cultivo de células COS7 como un control a
2 x 10^{5} células de la línea celular de leucemia de ratón L1210
que expresa la IAP humana. Después de incubar sobre hielo y lavar,
se añadieron 10 \mug/ml del anticuerpo anti-FLAG
de ratón (SIGMA) y después las células se incubaron y se lavaron.
Después, se le añadió el anticuerpo anti-IgG de
ratón marcado con FITC (BECTON DICKINSON) y las células se incubaron
y lavaron otra vez. Se midió la intensidad de la fluorescencia
usando el aparato FACScan (BECTON DICKINSON). Los resultados de la
citometría de flujo muestran que los MABL2-scFv que
tienen conectores con diferente longitud y los
sc(Fv)_{2} en los líquidos sobrenadantes del
cultivo de COS7 tienen una alta afinidad por la IAP humana (Véanse
las Figuras 40a y 40b).
Se examinó la acción de inducción de apoptosis
de los líquidos sobrenadantes del cultivo de COS7 preparados en el
Ejemplo 6.3 (1) por tinción con Anexina-V
(Boehringer Mannheim) usando las células L1210 transfectadas con el
gen de IAP humano (hIAP/L1210).
A 5 x 10^{4} células de las células hIAP/L1210
se añadieron los líquidos sobrenadantes del cultivo de células COS7
transfectadas con cada uno de los vectores o un líquido sobrenadante
del cultivo de células COS7 como control con una concentración
final de 10% y las mezclas se cultivaron durante 24 horas. Después,
se llevó a cabo la tinción con Anexina-V/PI y se
midió la intensidad de la fluorescencia usando el aparato FACScan
(BECTON DICKINSON). Los resultados pusieron de manifiesto que los
scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> y
sc(Fv)_{2} en los CM de COS7 inducían de forma
notable la muerte celular de las células hIAP/L1210. Estos
resultados se muestran en la Figura 41.
Para aislar y purificar
MABL2-scFv y sc(Fv)_{2} del líquido
sobrenadante del cultivo, se construyeron los vectores de expresión
para la expresión en células CHO como sigue.
Los fragmentos EcoRI-BamHI de
pCF2HL-0, 3\sim7, y PCF2LH-0,
3\sim7 preparados en el Ejemplo 6.2 se introdujeron entre los
sitios EcoRI y BamHI en un vector de expresión pCHO1 para células
CHO usando el Ligation High. Se transformaron DH5\alpha de E.
coli competentes con los mismos. Los plásmidos se aislaron de
E. coli transformada usando el kit QIAGEN Plasmid Midi
(QIAGEN) para preparar los plásmidos de expresión
pCHOM2HL-0, 3\sim7, y pCHOM2LH-0,
3\sim7.
Las células CHO se transformaron con cada uno de
los plásmidos de expresión pCHOM2HL-0, 3\sim7, y
pCHOM2
LH-0, 3\sim7, construidos en el Ejemplo 6.7 y el vector pCHOM2(Fv)_{2} para preparar las células CHO que expresan de forma constante cada anticuerpo modificado. Como un ejemplo típico de las mismas, se ilustra a continuación la producción de células CHO que expresan de forma constante MABL2-scFv <HL-5> o sc(Fv)_{2}.
LH-0, 3\sim7, construidos en el Ejemplo 6.7 y el vector pCHOM2(Fv)_{2} para preparar las células CHO que expresan de forma constante cada anticuerpo modificado. Como un ejemplo típico de las mismas, se ilustra a continuación la producción de células CHO que expresan de forma constante MABL2-scFv <HL-5> o sc(Fv)_{2}.
Los plásmidos de expresión
pCHOM2HL-5 y pCHOM2(Fv)_{2} se
linealizaron por digestión con una enzima de restricción PvuI y se
sometieron a transfección a células CHO mediante electroporación
usando el aparato Gene Pulser (BioRad). Se añadieron el ADN (10
\mug) y 0,75 ml de PBS con 1 x 10^{7} células/ml a una cubeta y
se trataron con pulsos a 1,5 kV, 25 \muF de capacidad eléctrica.
Después de restauración durante 10 minutos a temperatura ambiente,
las células electroporadas se transfirieron a medio de cultivo
\alpha-MEM que contenía ácido nucleico (GIBCO
BRL) que contenía suero bovino fetal al 10% y se cultivaron. Después
de cultivo durante toda la noche, el líquido sobrenadante se
descartó. Las células se lavaron con PBS y se añadieron a medio de
cultivo \alpha-MEM sin ácido nucleico (GIBCO BRL)
que contenía suero bovino fetal al 10%. Después de cultivo durante
dos semanas, las células se cultivaron en un medio que contenía
metotrexato 10 nM (concentración final) (SIGMA), después
metotrexato 50 nM y 100 nM. Las células resultantes se cultivaron en
el medio CHO-S-SFM II sin suero
(GIBCO BRL) en una botella giratoria. Se recogió el líquido
sobrenadante del cultivo, se centrifugó para separar los fragmentos
celulares y se filtró usando un filtro con un tamaño de poros de
0,22 \mum para obtener el CM, respectivamente.
De acuerdo con lo anterior, se obtuvieron
células CHO que expresan de forma constante
MABL2-scFv <HL-0, -3, -4, -6>
-7> y <LH-0, -3, -4, -5, -6, -7> y los CM
de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los MABL2-scFv
<HL-5> y sc(Fv)_{2} se
purificaron a partir de los CM preparados en el Ejemplo 6.8 por dos
tipos de procedimientos de purificación, como sigue.
HL-5 y
sc(Fv)_{2} se purificaron por cromatografía en
columna de afinidad de anticuerpo anti-FLAG, usando
la secuencia FLAG localizada en el extremo
C-terminal del polipéptido, y por filtración en gel.
Un litro de CM obtenido en 6.8 se aplicó en una columna (7,9 ml)
preparada con el gel de afinidad anti-FLAG M2
(SIGMA) equilibrada con tampón Tris-HCl 50 mM (TBS,
pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM. Después de lavar la columna con
TBS, el scFv eluyó con tampón de glicina-HCl 0,1 M,
pH 3,5. Las fracciones resultantes se analizaron por
SDS-PAGE y se confirmó la elución del scFv. La
fracción de scFv se mezcló con Tween 20 hasta 0,01% de la
concentración final y se concentró usando el
Centricon-10 (MILIPORE). El concentrado se aplicó en
una columna TSKgel G300SWG (7,5 x 600 mm) equilibrada con tampón de
acetato 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,01%.
Con un caudal de 0,4 ml/minuto, el scFv se detectó por absorción a
280 nm. El HL-5 eluyó como la fracción principal en
la posición del dímero y el sc(Fv)_{2} eluyó en la
posición del monómero.
HL-5 y
sc(Fv)_{2} se purificaron usando tres etapas que
comprendían cromatografía de intercambio iónico, hidroxiapatito y
filtración en gel. En la cromatografía de intercambio iónico se usó
la columna de flujo rápido de sefarosa-Q
(Pharamacia) para HL-5 y la columna de flujo rápido
de sefarosa-SP para sc(Fv)_{2}. En y
después de la segunda etapa, HL-5 y
sc(Fv)_{2} se procesaron por el mismo
procedimiento.
Primera etapa para
HL-5
El CM de HL-5 se diluyó dos
veces con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH 9,0) que
contenía Tween 20 al 0,02% y después el pH se ajustó a 9,0 con Tris
1 M. La solución se aplicó en la columna de flujo rápido de sefarosa
Q equilibrada con tampón de Tris-HCl 20 mM (pH 8,5)
que contenía Tween 20 al 0,02%. Se eluyó un polipéptido adsorbido en
la columna por un gradiente lineal de NaCl en el mismo tampón, de
0,1 a 0,55 M. Haciendo el seguimiento de las fracciones eluidas por
SDS-PAGE, se recogieron las fracciones que contenían
HL-5 y se sometieron al hidroxiapatito de la segunda
etapa.
Primera etapa para
sc(Fv)_{2}
El CM de sc(Fv)_{2} se diluyó
dos veces con tampón de acetato 20 mM (pH 5,5) que contenía Tween 20
al 0,02% y después el pH se ajustó a 5,5 con ácido acético 1 M. La
solución se aplicó en una columna de flujo rápido de
sefarosa-SP equilibrada con tampón de acetato 20 mM
(pH 5,5) que contenía Tween 20 al 0,02%. Eluyó un polipéptido
adsorbido en la columna por un gradiente lineal de NaCl en el
tampón, de 0 a 0,5 M. Haciendo el seguimiento de las fracciones
eluidas por SDS-PAGE, se recogieron las fracciones
que contenían sc(Fv)_{2} y se sometieron al
hidroxiapatito de la segunda etapa.
Segunda etapa: Cromatografía en
hidroxiapatito de HL-5 y
sc(Fv)_{2}
Las fracciones de HL-5 y
sc(Fv)_{2} obtenidas en la primera etapa se
aplicaron por separado en la columna de hidroxiapatito (Tipo I,
BIORAD) equilibrada con tampón de fosfato 10 mM que contenía Tween
20 al 0,02%, pH 7,0. Después de lavar la columna con el mismo
tampón, eluyeron los polipéptidos adsorbidos en la columna por un
gradiente lineal de tampón de fosfato hasta 0,5 M. Haciendo el
seguimiento de las fracciones eluidas por SDS-PAGE,
se recogieron las fracciones que contenían los polipéptidos
deseados.
Tercera etapa: Filtración en gel de
HL-5 y sc(Fv)_{2}
Cada una de las fracciones obtenidas en la
segunda etapa se concentró por separado con
CentriPrep-10 (MILIPORE) y se aplicó en una columna
Superdex (2,6 x 60 cm, Pharmacia) equilibrada con tampón de acetato
20 mM (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,02% y NaCl 0,15 M.
HL-5 eluyó en la posición del dímero y
sc(Fv)HL-5 y
sc(Fv)_{2} eluyeron en la posición del monómero
como un pico principal, respectivamente.
Puesto que el monómero de HL-5
apenas se detectaba por ambos procedimientos de purificación, se
demuestra que los dímeros de los Fv de cadena sencilla se forman
con rendimientos altos cuando el conector para el Fv de cadena
sencilla contiene alrededor de 5 aminoácidos. Además, el dímero de
HL-5 y sc(Fv)_{2} se conservaban
establemente durante un mes a 4ºC después de purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
La citometría de flujo se llevó a cabo usando el
dímero purificado MABL2-scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2}
purificado con el fin de evaluar la unión al antígeno proteína
asociada a integrina humana (IAP). Se añadieron 10 \mug/ml del
dímero purificado de MABL2-scFv
<HL-5>, el sc(Fv)_{2}
purificado, el anticuerpo MABL-2 como control
positivo o una IgG de ratón (Zymed) como control negativo a 2 x
10^{5} células de la línea celular de leucemia de ratón L1210 que
expresa la IAP humana (hIAP/L1210) o la línea celular L1210
transformada con pCOS1 (pCOS1/L1210) como control. Después de
incubación sobre hielo y lavadp, se añadieron 10 \mug/ml del
anticuerpo anti-FLAG de ratón (SIGMA) y después las
células se incubaron y lavaron. Se añadieron a las mismas,
anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC
(BECTON DICKINSON) y las células se incubaron y lavaron otra vez.
Después, se midió la intensidad de la fluorescencia usando el
aparato FACScan (BECTON DICKINSON).
Puesto que el dímero purificado de
MABL2-scFv <HL-5> y el
sc(Fv)_{2} purificado se unían específicamente a
las células hIAP/L1210, se confirma que el dímero de scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2} tienen
una alta afinidad por la IAP humana (véase la Fig. 42).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la acción de inducción de apoptosis
del dímero purificado de MABL2-scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2}
purificado por tinción con Anexina-V (Boehringer
Mannheim) usando las células L1210 en las que se había introducido
el gen de IAP humano y las células de la línea celular de leucemia
humana CCRF-CEM.
Se añadieron diferentes concentraciones del
dímero purificado de MABL2-scFv
<HL-5>, el
MABL2-sc(Fv)_{2} purificado, el
anticuerpo MABL-2 como control positivo o una IgG de
ratón como control negativo, a 5 x 10^{4} células de la línea
celular hIAP/L1210 o 1 x 10^{5} células de la línea celular
CCRF-CEM. Después de cultivar durante 24 horas, se
llevó a cabo la tinción con Anexina-V y se midió su
intensidad de fluorescencia usando el aparato FACScan (BECTON
DICKINSON). Como resultado, el dímero de MABL2-scFv
<HL-5> y el
MABL2-sc(Fv)_{2} inducían
notablemente la muerte celular de hHIAP/L1210 y
CCRF-CEM de una forma dependiente de la
concentración (véase la Fig. 43). Como resultado se ha mostrado que
el dímero de MABL2-scFv <HL-5>
y MABL2-sc(Fv)_{2}, tenían una
eficacia mejorada de inducción de la apoptosis comparado con el
anticuerpo original MABL-2.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de hemaglutinación se llevó a cabo
usando concentraciones diferentes del dímero purificado de scFv
<HL-5> y el sc(Fv)_{2}
purificado de acuerdo con el Ejemplo 5.15.
Se observó hemaglutinación con el anticuerpo
MABL-2 como control positivo, mientras que no se
observó hemaglutinación ni con el anticuerpo de cadena sencilla
MABL2-sc(Fv)_{2} ni el
MABL2-scFv <HL-5>. Además, no
había una diferencia sustancial en la hemaglutinación entre dos
tampones usados con el anticuerpo MABL-2. Estos
resultados se muestran en la Tabla 3.
Se ensayaron los efectos antitumorales del
dímero de scFv <HL-5> y
sc(Fv)_{2} preparados y purificados en los Ejemplos
6.8 y 6.9. El ensayo se llevó a cabo usando el modelo de ratón para
el mieloma humano producido en el Ejemplo 5.1 y determinando la
cantidad de proteína M producida por las células de mieloma humano
en el suero de ratón usando ELISA y examinando el tiempo de
supervivencia del ratón. Después, se evaluaron los efectos
antitumorales del dímero scFv <HL-5> y
sc(Fv)_{2} en términos del cambio de la cantidad de
proteína M en el suero de ratón y el tiempo de supervivencia del
ratón.
En el ensayo, se usaron HL-5 y
sc(Fv)_{2} en forma de una solución de 0,01, 0,1 ó 1
mg/ml en vehículo que consistía en NaCl 150 mM, Tween al 0,02% y
tampón de acetato 20 mM, pH 6,0 y se administraron a los ratones
con una dosificación de 0,1, 1 ó 10 mg/kg. Al grupo de ratones de
control se les administró sólo vehículo.
El suero de ratón se recogió 26 días después del
trasplante de las células de mieloma humano y se midió la cantidad
de proteína M en el suero usando ELISA de acuerdo con el Ejemplo
5.14. Como resultado, la cantidad de proteína M en el suero de
ambos grupos de ratones a los que se había administrado
HL-5, el dímero y sc(Fv)_{2},
disminuyó de una forma dependiente de la dosis (véase la Figura 44).
Además, se observó una prolongación significativa del tiempo de
supervivencia en ambos grupos a los que se había administrado
HL-5 (Fig. 45) y el sc(Fv)_{2}
(Fig. 46) en comparación con el grupo de control al que se había
administrado vehículo. Estos resultados muestran que
HL-5 y sc(Fv)_{2} de la invención
tienen un excelente efecto antitumoral in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un ADN que codificaba las regiones
V del anticuerpo monoclonal humano 12B5 frente a MPL, como
sigue:
El gen que codifica la región V de la cadena H
del anticuerpo humano 12B5 que se une a la MPL humana se diseñó
para que conectara la secuencia de nucleótidos del gen del mismo (ID
SEC Nº: 55) en el extremo 5' a la secuencia líder (ID SEC Nº: 56)
originada del gen del anticuerpo humano (Eur. J. Immunol.
1996; 26: 63-69). La secuencia de nucleótidos
diseñada se dividió en cuatro oligonucleótidos que tenían secuencias
que se superponían de 15 pb cada una (12B5VH-1,
12B5VH-2, 12B5VH-3,
12B5VH-4). 12B5VH-1 (ID SEC Nº: 57)
y 12B5VH-3 (ID SEC Nº: 59) se sintetizaron en la
dirección homosentido, y 12B5VH-2 (ID SEC Nº: 58) y
12B5VH-4 (ID SEC Nº: 60) en la dirección
antisentido, respectivamente. Después de ensamblar cada
oligonucleótido sintetizado por la respectiva complementaridad, se
añadieron los cebadores exteriores (12B5VH-S y
12B5VH-A) para amplificar la longitud entera del
gen. Se diseñó 12B5VH-S (ID SEC Nº: 61) para que
hibridara con el extremo 5' de la secuencia líder por el cebador
directo y para que tuviera el sitio de reconocimiento de la enzima
de restricción HindIII y la secuencia Kozak, y se diseñó
12B5VH-A (ID SEC Nº: 62) para que hibridara con la
secuencia de nucleótidos que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H por el
cebador inverso y para que tuviera una secuencia donadora de
empalme y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
BamHI, respectivamente.
100 \mul de una solución para la PCR que
contenía 10 \mul de 10 x tampón para la PCR II, MgCl_{2} 1,5
mM, dNTP 0,08 mM (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 unidades de una ADN
polimerasa AmpliTaq Gold (todos de PERKIN ELMER) y 2,5 pmoles de
cada uno de los oligonucleótidos sintetizados
(12B5VH-1 a 4) se calentaron a 94ºC de temperatura
inicial durante 9 minutos, a 94ºC durante 2 minutos, a 55 durante 2
minutos y a 72ºC durante 2 minutos. Después de repetir este ciclo
dos veces se añadieron 100 pmoles de los cebadores externos
12B5VH-S y 12B5VH-A. La mezcla se
sometió al ciclo que consistía en 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, 35 veces y se calentó
a 72ºC durante 5 minutos más.
El producto de la PCR se purificó por gel de
agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% (Sigma), se digirió con las
enzimas de restricción BamHI y Hind III y se clonó en el vector de
expresión HEF-g\gamma1 para la cadena H humana.
Después de determinar la secuencia de ADN, el plásmido que contiene
la secuencia de ADN correcta se llamó
HEF-12B5H-g\gamma1.
Se digirió
HEF-12B5H-g\gamma1 con las enzimas
de restricción EcoRI y BamHI para producir el gen que codifica
12B5VH que después se clonó en un vector de expresión
pCOS-Fd para la cadena H de Fab humana para producir
pFd-12B5H. El vector de expresión para la cadena H
de Fab humana se construyó por amplificación del ADN (ID SEC Nº:
63) que contenía la región intrón que existe entre los genes que
codifican la región V de la cadena H del anticuerpo humano y la
región constante, y el gen que codifica una parte de la región
constante de la cadena H humana por PCR, e inserción del producto
de la PCR en un vector de expresión pCOS1 de célula animal. La
región constante de la cadena H humana se amplificó para el gen en
las mismas condiciones mencionadas antes usando como molde
HEF-g\gamma1, como cebador directo
G1CH1-S (ID SEC Nº: 64) que se diseñó para que
hibridara con la secuencia del extremo 5' del intrón 1 y que
tuviera los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción
EcoRI y BamHI y como cebador inverso G1CH1-A (ID SEC
Nº: 65) que se diseñó para que hibridara con el extremo 3' del ADN
del dominio CH1 de la región constante de la cadena H humana y para
que tuviera una secuencia que codificara una parte de la región
bisagra, dos codones de parada y el sitio de reconocimiento de la
enzima de restricción Bg1 II.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos de la región variable de la cadena 12B5H reconstruida
que estaba incluida en los plásmidos
HEF-12B5H-g\gamma1 y
pFd-12B5H se muestran en el ID SEC Nº: 66.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica la región V de la cadena L
del anticuerpo humano 12B5 que se une a la MPL humana se diseñó
conectando la secuencia de nucleótidos del gen (ID SEC Nº: 67) en el
extremo 5' con la secuencia líder (ID SEC Nº: 68) originada del gen
del anticuerpo humano 3D6 (Nuc. Acid Res. 1990: 18; 4927). De
la misma forma mencionada antes, la secuencia de nucleótidos
diseñada se dividió en cuatro oligonucleótidos que tenían secuencias
que se superponían de 15 pb cada una (12B5VL-1,
12B5VL-2, 12B5VL-3,
12B5VL-4) y se sintetizaron respectivamente.
12B5VL-1 (ID SEC Nº: 69) y 12B5VL-3
(ID SEC Nº: 71) tenían secuencias homosentido, y
12B5VL-2 (ID SEC Nº: 70) y 12B5VL-4
(ID SEC Nº: 72) tenían secuencias antisentido, respectivamente. Cada
uno de los nucleótidos sintetizados se ensambló por
complementaridad respectiva y se mezclaron con el cebador externo
(12B5VL-S y 12B5VL-A) para
amplificar la longitud completa del gen. Se diseñó
12B5VL-S (ID SEC Nº: 73) para que hibridara con el
extremo 5' de la secuencia líder por el cebador directo y para que
tuviera el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
HindIII y la secuencia Kozak. Se diseñó 12B5VL-A (ID
SEC Nº: 74) para que hibridara con la secuencia de nucleótidos que
codifica el extremo C-terminal de la región V de la
cadena L por el cebador inverso y para que tuviera la secuencia
donadora de empalme y el sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción BamHI.
Llevando a cabo la PCR como se ha mencionado
antes, el producto de la PCR se purificó en gel de agarosa de bajo
punto de fusión al 1,5% (Sigma), se digirió con las enzimas de
restricción BamHI y HindIII y se clonó en un vector de expresión
HEF-g\kappa para la cadena L humana. Después de
determinar la secuencia de ADN, el plásmido que contenía la
secuencia de ADN correcta se llamó
HEF-12B5L-g\kappa. La secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la región V de la
cadena L de 12B5 reconstruida que se había incluido en el plásmido
HEF-12B5L-g\kappa se muestran en
el ID SEC Nº: 75.
\vskip1.000000\baselineskip
El Fv de cadena sencilla del anticuerpo 12B5
reconstruido se diseñó para que estuviera en el orden de
12B5VH-conector-12B5VL y que
tuviera la secuencia FLAG (ID SEC Nº: 76) en el extremo
C-terminal para facilitar la detección y
purificación. El Fv de cadena sencilla de 12B5 reconstruido
(sc12B5) se construyó usando una secuencia conectora que consistía
en 15 aminoácidos representados por (Gly_{4}Ser)_{3}.
El gen que codifica el Fv de cadena sencilla del
anticuerpo 12B5 reconstruido, que contiene la secuencia conectora
que consiste en 15 aminoácidos, se construyó conectando la región V
de la cadena H de 12B5, la región conectora y la región V de la
cadena L de 12B5, que se amplificaron por PCR respectivamente. Este
procedimiento se muestra esquemáticamente en la Figura 47. Se
usaron 6 cebadores (A-F) en la PCR para la
producción del Fv de cadena sencilla de 12B5 reconstruido. Los
cebadores A, C y E tienen secuencias homosentido, y los cebadores
B, D y F tienen secuencias antisentido.
El cebador directo 12B5-S
(cebador A, ID SEC Nº: 77) para la región V de la cadena H se diseñó
para que hibridara con el extremo 5' de la secuencia líder de la
cadena H y para que tuviera el sitio de reconocimiento de la enzima
de restricción EcoRI. El cebador inverso HuVHJ3 (cebador B, ID SEC
Nº: 78) para la región V de la cadena H se diseñó para que
hibridara con el ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H.
El cebador directo RHuJH3 (cebador C, ID SEC Nº:
79) para el conector se diseñó para que hibridara con el ADN que
codifica el extremo N-terminal del conector y para
que se superpusiera con el ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H. El cebador
inverso RHuVK1 (cebador D, ID SEC Nº: 80) para el conector se
diseñó para que hibridara con el ADN que codifica el extremo
C-terminal del conector y para que se superpusiera
con el ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena L.
El cebador directo HuVK1.2 (cebador E, ID SEC
Nº: 81) para la región V de la cadena L se diseñó para que hibridara
con el ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena L. El cebador inverso 12B5F-A
para la región V de la cadena L (cebador F, ID SEC Nº: 82) se
diseñó para que hibridara con el ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena L y para que
tuviera la secuencia que codifica el péptido FLAG (Hopp, T. P. y
col., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), dos
codones de parada de la transcripción y el sitio de reconocimiento
de la enzima de restricción NotI.
En la etapa de la primera PCR, se llevaron a
cabo tres reacciones A-B, C-D y
E-F, y los tres productos de la PCR de la primera
etapa de la PCR se ensamblaron por complementaridad respectiva.
Después de añadir los cebadores A y F, se amplificó el ADN de
longitud completa que codifica el Fv de cadena sencilla de 12B5
reconstruido que tiene el conector que consiste en 15 aminoácidos
(la segunda PCR). En la PCR de la primera etapa se usaron el
plásmido HEF-12B5H-g\gamma1 (véase
el Ejemplo 7.1), que codifica la región V de la cadena H de 12B5
reconstruido, pSCFVT7-hM21 (anticuerpo
ONS-M21 humanizado) (Ohtomo y col., Anticancer
Res. 18 (1998), 4311-4316) que contiene el ADN
(ID SEC Nº: 83) que codifica la región conectora que consiste en Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (Huston y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
5879-5883, 1988) y el plásmido
HEF-12B5L-g\kappa (véase el
Ejemplo 7.2) que codifica la región V de la cadena L de 12B5
reconstruido, como moldes, respectivamente.
50 \mul de solución para la PCR para la
primera etapa contenían 5 \mul de 10 x tampón para la PCR Gold II,
MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 0,08 mM, 5 unidades de ADN polimerasa
AmpliTaq Gold (todos de PERKIN ELMER), 100 pmoles de cada uno de
los cebadores y 100 ng de cada ADN molde. La solución de la PCR se
calentó a 94ºC de temperatura inicial durante 9 minutos, a 94ºC
durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto. Después de repetir este ciclo 35 veces la mezcla de
reacción se calentó más a 72ºC durante 5 minutos.
Los productos de la PCR A-B,
C-D y E-F se ensamblaron por la
segunda PCR. La solución de la mezcla de la PCR para la segunda
etapa de 98 \mul que contenía como molde 1 \mul del producto
A-B de la primera PCR, 0,5 \mul del producto
C-D de la PCR y 1 \mul del producto
E-F de la PCR, 10 \mul de 10 x Tampón de la PCR
Gold II, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 0,08 mM, 5 unidades de ADN
polimerasa AmpliTaq Gold (todos de PERKIN ELMER), se calentó a 94ºC
de temperatura inicial durante 9 minutos, a 94ºC durante 2 minutos,
a 65ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos. Después de
repetir el ciclo dos veces, se añadieron 100 pmoles de cada uno de
los cebadores A y F. Después de repetir el ciclo que consistía en a
94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto, 35 veces, la mezcla de reacción se calentó a 72ºC durante 5
minutos.
Los fragmentos de ADN producidos por la segunda
PCR se purificaron usando gel de agarosa de bajo punto de fusión al
1,5%, se digirieron con EcoRI y NotI, y se clonaron en el vector
pCHO1 y el vector pCOS1 (solicitud de patente japonesa nº
8-255196). El vector de expresión pCHO1 era un
vector construido eliminado el gen de anticuerpo de
DHFR-\DeltaE-rvH-PM1-f
(véase el documento WO92/19759) por digestión con EcoRI y SmaI, y
conectando al adaptador
EcoRI-NotI-BamHI (TAKARA SHUZO).
Después de determinar la secuencia de ADN, los plásmidos que
contenían el fragmento de ADN que codificaba la secuencia de
aminoácidos correcta del Fv de cadena sencilla de 12B5 reconstruido
se llamaron pCHO-sc12B5 y
pCOS-sc12B5. La secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla de 12B5
reconstruido, incluida en los plásmidos pCHO-sc12B5
y pCOS-sc12B5 se muestran en el ID SEC Nº: 84.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo 12B5 (IgG, Fab) y el Fv de cadena
sencilla derivado del anticuerpo 12B5, se expresaron usando células
COS-7 o células CHO.
La expresión transitoria usando células
COS-7 se llevó a cabo como sigue. La transfección se
llevó a cabo por el procedimiento de electroporación usando el
equipo Gene Pulser (BioRad). Para la expresión del anticuerpo 12B5
(IgG) se añadieron 10 \mug de cada uno de los vectores de
expresión mencionados antes
HEF-12B5H-g\gamma1 y
HEF-12B5L-g\kappa, para la
expresión del fragmento 12B5Fab se añadieron 10 \mug de cada uno
de pFd-12B5H y
HEF-12B5L-g\kappa y para la
expresión de Fv de cadena sencilla se añadieron 10 \mug de
pCOS-sc12B5 a células COS-7 (1 x
10^{7} células/ml) suspendidas en 0,8 ml de PBS. La mezcla
mantenida en una cubeta se trató por pulsos con una capacidad de
1,5 kV, 25 \muFD. Después de recuperación durante 10 minutos a
temperatura ambiente, las células electroporadas se añadieron al
medio de cultivo DMEM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal
al 10% y se cultivaron. Después de cultivo durante toda la noche,
las células se lavaron una vez con PBS, se añadieron a medio
CHO-S-SFM II sin suero y se
cultivaron durante 2 días. El medio de cultivo se centrifugó para
separar los restos celulares y se filtró con un filtro de 0,22
\mum para preparar el líquido sobrenadante del cultivo.
Para establecer una línea celular CHO de
expresión estable para el Fv de cadena sencilla (polipéptido)
derivado del anticuerpo 12B5, se introdujo el vector de expresión
pCHO-sc12B5 en células CHO como sigue.
El vector de expresión se introdujo en células
CHO por el procedimiento de electroporación usando el equipo Gene
Pulser (BioRad). Se mezclaron el ADN linealizado (100 \mug)
obtenido por digestión con la enzima de restricción PvuI y células
CHO (1 x 10^{7} células/ml) suspendidas en 0,8 ml de PBS en una
cubeta, se dejaron reposar sobre hielo durante 10 minutos y se
trataron con pulsos a una capacidad de 1,5 kV, 25 \muFD. Después
de recuperación durante 10 minutos a temperatura ambiente, las
células electroporadas se añadieron a
CHO-S-SFM II (GIBCO BRL) que
contenía suero bovino fetal al 10% y se cultivaron. Después de
cultivo durante 2 días, el cultivo se continuó en medio
CHO-S-SFM II (GIBCO BRL) que
contenía metotrexato 5 nM (SIGMA) y suero bovino fetal al 10%. De
estos clones obtenidos, se seleccionó un clon con una alta tasa de
expresión como la línea celular productora para el Fv de cadena
sencilla de 12B5. Después de cultivo en medio
CHO-S-SFM II sin suero (GIBCO BRL)
que contenía metotrexato 5 nM (SIGMA), se obtuvo el líquido
sobrenadante del cultivo por separación de los restos celulares por
centrifugación.
El líquido sobrenadante del cultivo de la línea
celular CHO que expresa el Fv de cadena sencilla de 12B5 obtenido
en 7.4 se purificó por columna de anticuerpo
anti-FLAG y columna de filtración en gel.
El líquido sobrenadante del cultivo se añadió al
gel de afinidad anti-FLAG M2 (SIGMA) equilibrado con
PBS. Después de lavar la columna con el mismo tampón, las proteínas
adsorbidas en la columna eluyeron con tampón de
glicina-HCl 0,1 M (pH 3,5). Las fracciones eluidas
se neutralizaron inmediatamente por adición de tampón de
Tris-HCl 1 M (pH 8,0). Las fracciones eluidas se
analizaron por SDS-PAGE y la fracción que se
confirmó que contenía el Fv de cadena sencilla se concentró usando
el Centricon-10 (MILLIPORE).
La solución concentrada obtenida en (1) se
añadió a la columna Superdex200 (10x300 mm, AMERSHAM PHARMACIA)
equilibrada con PBS que contenía Tween 20 al 0,01%. El producto
sc12B5 eluyó en dos picos (A, B) (véase la Figura 48). Las
fracciones A y B se analizaron usando el gel de
poliacrilamida-SDS al 14%. La muestra se procesó
por electroforesis en presencia y ausencia de un agente reductor de
acuerdo con el procedimiento de Laemmli, y se tiñó con azul
brillante de Coomassie después de la electroforesis. Como se muestra
en la Figura 49, las fracciones A y B, independientemente de la
presencia del agente de reducción o su ausencia, produjeron una
sola banda que tenía un peso molecular aparente de aproximadamente
31 kD. Cuando las fracciones A y B se analizaron por filtración en
gel usando Superdex200 PC 3.2/30 (3,2x300 mm, AMERSHAM PHARMACIA),
la fracción A produjo un producto de elución con un peso molecular
aparente a aproximadamente 44 kD y la fracción B lo produjo a 22 kD
(véase la Figura 50a y b). Los resultados muestran que la fracción A
es el dímero con enlace no covalente del Fv de cadena sencilla de
sc12B5, y B es el monómero.
La actividad de tipo TPO del anticuerpo de
cadena sencilla anti-MPL se evaluó midiendo la
actividad de proliferación para las células Ba/F3 (BaF/mpl) que
expresan el receptor de TPO humano (MPL). Después de lavar las
células BaF/Mpl dos veces con medio de cultivo RPMI1640 (GIBCO) que
contenía suero bovino fetal al 10% (GIBCO), las células se
suspendieron en el medio de cultivo con una densidad celular de 5 x
10^{5} células/ml. El anticuerpo de cadena sencilla
anti-MPL y la TPO humana (R&D Systems) se
diluyeron con el medio de cultivo, respectivamente. Se añadieron 50
\mul de la suspensión celular y 50 \mul del anticuerpo o de la
TPO humana diluidos en una microplaca de 96 pocillos (fondo plano)
(Falcon), y se cultivaron en un incubador con CO_{2}
(concentración de CO_{2}: 5%) durante 24 horas. Después de la
incubación, se añadieron 10 \mul de reactivo WST-8
(reactivo para medir el número de células SF originales: Nacalai
Tesque) y se midió inmediatamente la absorbancia a una longitud de
onda de medición de 450 nm y una longitud de onda de referencia de
620 nm usando el fotómetro de absorbencia fluorescente SPECTRA
Fluor (TECAN). Después de incubar en un incubador con CO_{2}
(concentración de CO_{2}: 5%) durante 2 horas, se volvió a medir
la absorbancia a 450 nm de longitud de onda de medición y 620 nm de
longitud de onda de referencia usando el SPECTRA Fluor. Puesto que
el reactivo WST-8 desarrollaba la reacción de color
dependiendo del número de células vivas a la longitud de onda de 450
nm, la actividad de proliferación de BaF/Mpl basado en el cambio de
absorbancia en 2 horas se evaluó por la DE50 calculado como sigue.
En la curva de la reacción de proliferación en la que se representó
gráficamente la absorbancia en el eje de ordenadas frente a la
concentración de anticuerpo en el eje de abscisas, la absorbancia de
la meseta se estableció como 100% de tasa de reacción. Obteniendo
una fórmula de aproximación por un procedimiento de aproximación de
variación lineal basado en los valores representados cerca de la
tasa de reacción de 50%, se calculó la concentración de anticuerpo
de 50% de tasa de reacción y se adoptó como DE50.
Los resultados de la actividad agonista a MPL
medida usando los líquidos sobrenadantes del cultivo de las células
COS-7 que expresan diferentes moléculas de
anticuerpo 12B5 mostraban, como se ilustra en la Figura 51, que
12B5IgG que tiene un sitio de unión al antígeno bivalente aumentó la
absorbancia de una forma dependiente de la concentración y tenía
actividad agonista de tipo TPO (DE50; 29 nM), mientras que la
actividad agonista de 12B5Fab que tenía un sitio de unión al
antígeno monovalente era muy débil (DE50, 34,724 nM). Al contrario
el Fv de cadena sencilla (sc12B5) que tenía un sitio de unión al
antígeno monovalente como Fab mostró una fuerte actividad agonista
a un nivel en el que la DE50 era 75 nM. Sin embargo, se sabe que hay
regiones variables de la cadena H y la cadena L del Fv de cadena
sencilla que están asociadas por enlace no covalente, y por lo
tanto, cada región variable se disocia en solución y se puede
asociar con la región variable de otra molécula para formar
multímeros como dímeros. Cuando se midió el peso molecular de sc12B5
purificado por filtración en gel, se confirmó que había moléculas
que se reconoce que eran monómeros y dímeros (véase la Figura 48).
Se aislaron el monómero de sc12B5 y el dímero de sc12B5 (véase la
Figura 50) y se midió la actividad agonista frente a MPL. Como se
muestra en las Figuras 51 y 52, la DE50 del monómero de sc12B5 era
4438,7 nM, lo que confirmaba que la actividad agonista era menor
comparada con el resultado usando el líquido sobrenadante del
cultivo de células COS-7. Al contrario, el Fv de
cadena sencilla (dímero de sc12B5) que tenía el sitio de unión al
antígeno bivalente mostró una actividad de aproximadamente 400 veces
más fuerte (DE50, 10,1 nM) comparado con sc12B5 monovalente.
Además, el Fv de cadena sencilla bivalente mostró una actividad
agonista equivalente o mayor que la actividad agonista de TPO
humana y 12B5IgG.
Se construyó un ADN que codificaba la región
variable del anticuerpo 12E10 monoclonal humano frente a MPL
humana, como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos del ID SEC Nº: 86 se
diseñó como un gen que codifica la región V de la cadena H del
anticuerpo humano 12E10 que se une a la MPL humana basándose en la
secuencia de aminoácidos descrita en el documento WO99/10494 (ID
SEC Nº:85). La longitud completa de la secuencia de nucleótidos se
diseñó conectando a su extremo 5' la secuencia líder (ID SEC Nº:
87) derivada del gen del anticuerpo humano (GenBank Nº de acceso
AF062252). La secuencia de nucleótidos diseñada se dividió en cuatro
oligonucleótidos que tenían secuencias que se superponían de 15 pb
cada uno (12E10VH1, 12E10VH2, 12E10VH3, 12E10VH4). 12E10VH1 (ID SEC
Nº: 88) y 12E10VH3 (ID SEC Nº: 90) se sintetizaron en la dirección
homosentido, y 12E10VH2 (ID SEC Nº: 89) y 12E10VH4 (ID SEC Nº: 91)
en la dirección antisentido, respectivamente. Después de ensamblar
cada oligonucleótido sintetizado por su respectiva
complementaridad, se añadieron los cebadores externos (12E10VHS y
12E10VHA) para amplificar la longitud completa del gen. 12E10VHS
(ID SEC Nº: 92) se diseñó para que hibridara con el extremo 5' de la
secuencia líder por el cebador directo y para que tuviera el sitio
de reconocimiento de la enzima de restricción HindIII y la
secuencia Kozak, y 12E10VHA (ID SEC Nº: 93) se diseñó para que
hibridara con la secuencia de nucleótidos que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H por el
cebador inverso y para que tuviera una secuencia donadora de
empalme y el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
BamHI, respectivamente.
100 \mul de la solución para la PCR que
contenía 10 \mul de 10 x tampón de PCR Gold II, MgCl_{2} 1,5
mM, dNTP 0,08 mM (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 unidades de ADN
polimerasa AmpliTaq Gold (todos de PERKIN ELMER) y 2,5 pmoles de
cada uno de los oligonucleótidos sintetizados
(12E10VH-1 a 4), se calentaron a 94ºC de temperatura
inicial durante 9 minutos, a 94ºC durante 2 minutos, a 55ºC durante
2 minutos y a 72ºC durante 2 minutos. Después de repetir el ciclo
dos veces, se añadieron 100 pmoles de cada uno de los cebadores
externos 12E10VHS y 12E10VHA. La mezcla se sometió al ciclo que
consistía en 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y
72ºC durante 1 minuto, 35 veces, y se calentó a 72ºC durante 5
minutos adicionales.
El producto de la PCR se purificó en gel de
agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% (Sigma), se digirió con las
enzimas de restricción BamHI y HindIII, y se clonó en un vector de
expresión de la cadena H humana HEF-g\gamma1.
Después de determinar la secuencia de ADN, el plásmido que contenía
la secuencia de ADN correcta se llamó
HEF-12E10H-g\gamma1.
El
HEF-12E10H-g\gamma1 se digirió con
las enzimas de restricción EcoRI y BamHI para producir el gen que
codifica 12E10VH y después se clonó en el vector de expresión de la
cadena H de Fab humana pCOS-Fd. para producir
pFd-12E10H. El vector de expresión de la cadena H de
Fab humana se construyó por amplificación del ADN (ID SEC Nº: 63)
que contenía la región intrón que existe entre los genes que
codifican la región V de la cadena H y la región constante del
anticuerpo humano, y el gen que codifica una parte de la región
constante de la cadena H humana por PCR, e inserción del producto
de la PCR en el vector de expresión de células animales pCOS1. La
región constante de la cadena H humana se amplificó para el gen en
las mismas condiciones mencionadas antes usando como molde
HEF-g\gamma1, como cebador directo
G1CH1-S (ID SEC Nº: 64) que se diseñó para que
hibridara con la secuencia del extremo 5' del intrón 1 y para que
tuviera los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción
EcoRI y BamHI, y como cebador inverso G1CH1-A (ID
SEC Nº: 65) que se diseñó para que hibridara con el ADN del extremo
3' del dominio CH1 de la región constante de la cadena H humana y
para que tuviera una secuencia que codifica una parte de la región
bisagra, dos codones de parada y el sitio de reconocimiento de la
enzima de restricción Bg1 II.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos de la región variable de la cadena H de 12E10
reconstruido que se incluyó en los plásmidos
HEF-12E10H-g\gamma1 y
pFd-12E10H se muestran en el ID SEC Nº: 94.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos del ID SEC Nº: 96 se
diseñó como un gen que codifica la región V de la cadena L del
anticuerpo humano 12E10 que se une a la MPL humana, basándose en la
secuencia de aminoácidos descrita en el documento WO99/10494 (ID
SEC Nº: 95). Además se diseñó conectando a su extremo 5' la
secuencia líder (ID SEC Nº: 97) derivada del gen del anticuerpo
humano (Mol. Immunol. 1992; 29: 1515-1518).
De la misma forma mencionada antes, la secuencia de nucleótidos
diseñada se dividió en 4 oligonucleótidos que tenían secuencias que
se superponían, de 15 pb cada uno (12E10VL1, 12E10VL2, 12E10VL3,
12E10VL4) y se sintetizaron respectivamente. 12E10VL1 (ID SEC Nº:
98) y 12E10VL3 (ID SEC Nº: 100) tenían secuencias homosentido, y
12E10VL2 (ID SEC Nº: 99) y 12E10VL4 (ID SEC Nº: 101) tenían
secuencias antisentido, respectivamente. Cada uno de los
oligonucleótidos sintetizados se ensambló por la respectiva
complementaridad y se mezcló con los cebadores externos (12E10VLS y
12E10VLA) para amplificar la longitud entera del gen. 12E10VLS (ID
SEC Nº: 102) se diseñó para que hibridara con el extremo 5' de la
secuencia líder por el cebador directo y para que tuviera el sitio
de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI y la secuencia
Kozak. 12E10VLA (ID SEC Nº: 103) se diseñó para que hibridara con
la secuencia de nucleótidos que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena L por el
cebador inverso y para que tuviera el sitio de de reconocimiento de
la enzima de restricción BlnI.
Llevando a cabo la PCR como se ha mencionado
antes, el producto de la PCR se purificó en gel de agarosa de bajo
punto de fusión al 1,5% (Sigma), se digirió con las enzimas de
restricción EcoRI y BlnI, y se clonó en pUC19 que contenía un gen
para la región constante de la cadena lambda humana. Después de
determinar la secuencia de ADN, el plásmido que contenía la
secuencia de ADN correcta se digirió por EcoRI para producir un gen
que codificaba la región V de la cadena L de 12E10 y la región
constante de la cadena lambda humana y después se insertó en el
vector de expresión pCOS1. El plásmido que tenía el gen de la cadena
L de 12E10 (ID SEC Nº: 104) se llamó
pCOS-12E10L.
\vskip1.000000\baselineskip
El Fv de cadena sencilla del anticuerpo 12E10
reconstruido se diseñó para que estuviera en el orden de
12E10VH-conector-12E10VL y que
tuviera la secuencia FLAG (ID SEC Nº: 105) en el extremo
C-terminal para facilitar la detección y
purificación. Los Fv de cadena sencilla de 12E10 reconstruidos
(sc12E10 y db12E10) se construyeron usando una secuencia conectora
que consistía en 15 aminoácidos representados por
(Gly_{4}Ser)_{3} o 5 aminoácidos representados por
(Gly_{4}Ser)_{1}.
El gen que codifica el Fv de cadena sencilla de
12E10 reconstruido, que contiene la secuencia conectora que
consiste en 5 aminoácidos, se construyó introduciendo la secuencia
de nucleótidos para el conector (Gly_{4}Ser)_{1} en el
extremo 3' del gen que codifica la región V de la cadena H de 12E10
y en el extremo 5' del gen que codifica la región V de la cadena L
de 12E10, amplificando los respectivos genes así obtenidos por PCR y
conectando los genes amplificados. Se usaron 4 cebadores
(A-D) en la PCR para producir el Fv de cadena
sencilla de 12E10 reconstruido. Los cebadores A y C tenían
secuencias homosentido, y los cebadores B y D tenían secuencias
antisentido.
El cebador directo para la región V de la cadena
H fue 12E10S (cebador A, ID SEC Nº: 106). El cebador inverso DB2
(cebador B, ID SEC Nº: 107) para la región V de la cadena H se
diseñó para que hibridara con el ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H y para que
tuviera la secuencia de nucleótidos que codifica el conector
(Gly_{4}Ser)_{1} y la secuencia de nucleótidos que
codifica el extremo N-terminal de la región V de la
cadena L.
El cebador directo DB1 (cebador C, ID SEC Nº:
108) para la región V de la cadena L se diseñó para que hibridara
con el ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena L y para que tuviera la secuencia de
nucleótidos que codifica el conector (Gly_{4}Ser)_{1} y
la secuencia de nucleótidos que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H. El cebador
inverso 12E10FA (cebador D, ID SEC Nº: 109) para la región V de la
cadena L se diseñó para que hibridara con el ADN que codifica el
extremo C-terminal de la región V de la cadena L y
para que tuviera la secuencia de nucleótidos que codifica FLAG y el
sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NotI.
En la etapa de la primera PCR, se llevaron a
cabo dos reacciones A-B y C-D, y los
dos productos de la PCR obtenidos de la primera etapa de la PCR se
ensamblaron por complementaridad respectiva. Después de añadir los
cebadores A y D, se amplificó el ADN de longitud completa que
codifica el Fv de cadena sencilla de 12E10 reconstruido que tiene
el conector que consiste en 5 aminoácidos (la segunda PCR). En la
PCR de la primera etapa se usaron el plásmido
HEF-12E10H-g\gamma1 (véase el
Ejemplo 8.2), que codifica la región V de la cadena H de 12E10
reconstruido, pCOS-12E10L (véase el Ejemplo 8.1) que
codifica la región V de la cadena L de 12E10 reconstruido, como
moldes, respectivamente.
50 \mul de solución para la PCR para la
primera etapa contenían 5 \mul de 10 x tampón para la PCR Gold II,
MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 0,08 mM, 5 unidades de ADN polimerasa
AmpliTaq Gold (todos de PERKIN ELMER), 100 pmoles de cada uno de
los cebadores y 100 ng de cada ADN molde. La solución de la PCR se
calentó a 94ºC de temperatura inicial durante 9 minutos, a 94ºC
durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto. Después de repetir este ciclo 35 veces la mezcla de
reacción se calentó más a 72ºC durante 5 minutos.
Los productos de la PCR A-B (429
pb) y C-D (395 pb) se ensamblaron mediante la
segunda PCR. La solución de la mezcla para la PCR de la segunda
etapa (98 \mul) que contenía como moldes 1 \mul de cada uno de
los productos A-B y C-D de la
primera PCR, 100 pmoles de cada uno de los cebadores, 10 \mul de
10 x tampón de la PCR Gold II, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 0,08 mM, 5
unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (todos de PERKIN ELMER),
se hizo reaccionar en las mismas condiciones mencionadas antes.
El fragmento de ADN de 795 pb producido por la
segunda PCR se purificó usando gel de agarosa de bajo punto de
fusión al 1,5%, se digirió con EcoRI y NotI, y se clonó en el vector
pCHO1 o el vector pCOS1. El vector de expresión pCHO1 era un vector
construido eliminado el gen de anticuerpo de
DHFR-\DeltaE-RVH-PM1-f
(véase el documento WO92/19759) por digestión con EcoRI y SmaI, y
conectando al adaptador
EcoRI-NotI-BamHI (TAKARA SHUZO).
Después de determinar la secuencia de ADN, los plásmidos que
contenían el fragmento de ADN que codificaba la secuencia de
aminoácidos correcta del Fv de cadena sencilla de 12E10 reconstruido
se llamaron pCHO-db12E10 y
pCOS-db12E10. La secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla de 12E10
reconstruido, incluida en los plásmidos pCHO-db12E10
y pCOS-db12E10 se muestran en el ID SEC Nº: 110.
El gen que codifica el Fv de cadena sencilla de
12E10 reconstruido, que contiene la secuencia conectora que
consiste en 15 aminoácidos, se construyó introduciendo la secuencia
de nucleótidos para el conector (Gly_{4}Ser)_{3} en el
extremo 3' del gen que codifica la región V de la cadena H de 12E10
y en el extremo 5' del gen que codifica la región V de la cadena L
de 12E10, amplificando los respectivos genes así obtenidos por PCR y
conectando los genes amplificados. Se usaron 4 cebadores
(A-D) en la PCR para producir el Fv de cadena
sencilla de 12E10 reconstruido. Los cebadores A y C tenían
secuencias homosentido, y los cebadores B y D tenían secuencias
antisentido.
El cebador directo para la región V de la cadena
H era 12E10S (cebador A, ID SEC Nº: 106). El cebador inverso sc4.3
(cebador B, ID SEC Nº: 111) para la región V de la cadena H se
diseñó para que hibridara con el ADN que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H y para que
tuviera la secuencia de nucleótidos que codifica el conector
(Gly_{4}Ser)_{3} y la secuencia de nucleótidos que
codifica el extremo N-terminal de la región V de la
cadena L.
El cebador directo sc1.3 (cebador C, ID SEC Nº:
112) para la región V de la cadena L se diseñó para que hibridara
con el ADN que codifica el extremo N-terminal de la
región V de la cadena L y para que tuviera la secuencia de
nucleótidos que codifica el conector (Gly_{4}Ser)_{3} y
la secuencia de nucleótidos que codifica el extremo
C-terminal de la región V de la cadena H. El cebador
inverso 12E10FA (cebador D, ID SEC Nº: 109) para la región V de la
cadena L se diseñó para que hibridara con el ADN que codifica el
extremo C-terminal de la región V de la cadena L y
para que tuviera la secuencia de nucleótidos que codifica FLAG y el
sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NotI.
En la etapa de la primera PCR, se llevaron a
cabo dos reacciones A-B y C-D, y los
dos productos de la PCR obtenidos de la primera etapa de la PCR se
ensamblaron por complementaridad respectiva. Después de añadir los
cebadores A y D, se amplificó el ADN de longitud completa que
codifica el Fv de cadena sencilla de 12E10 reconstruido que tiene
el conector que consiste en 15 aminoácidos (la segunda PCR). En la
PCR de la primera etapa se usó el plásmido
pCOS-db12E10 (véase el Ejemplo 8.3(1)), que
codifica el Fv de cadena sencilla de de 12E10 reconstruido, como
molde.
50 \mul de solución para la PCR de la primera
etapa contenían 5 \mul de 10 x tampón ExTaq, dNTP 0,4 mM, 2,5
unidades de ADN polimerasa TaKaRa ExTaq (de TAKARA), 100 pmoles de
cada uno de los cebadores y 10 ng de cada ADN molde. La solución de
la PCR se calentó a 94ºC de temperatura inicial durante 30 segundos,
a 94ºC durante 15 segundos y a 72ºC durante 2 minutos y el ciclo se
repitió 5 veces. Después de repetir 28 veces el ciclo de a 94ºC
durante 15 segundos y a 70ºC durante 2 minutos, la mezcla de
reacción se calentó más a 72ºC durante 5 minutos.
Los productos de la PCR A-B (477
pb) y C-D (447 pb) se ensamblaron por la segunda
PCR. La solución de la mezcla para la PCR de la segunda etapa (98
\mul) que contenía como moldes 1 \mul de cada uno de los
productos A-B y C-D de la primera
PCR, 100 pmoles de cada uno de los cebadores A y D, 5 \mul de 10 x
Tampón ExTaq, dNTP 0,4 mM, 2,5 unidades de ADN polimerasa TaKaRa
ExTaq (de TAKARA), se hizo reaccionar en las mismas condiciones
mencionadas antes.
El fragmento de ADN de 825 pb producido por la
segunda PCR se purificó usando gel de agarosa de bajo punto de
fusión al 1,0%, se digirió con EcoRI y NotI. El fragmento de ADN así
obtenido se clonó en el vector pCHO1 o el vector pCOS1. Después de
determinar la secuencia de ADN, los plásmidos que contenían el
fragmento de ADN que codificaba la secuencia de aminoácidos
correcta del Fv de cadena sencilla de 12E10 reconstruido se
llamaron pCHO-sc12E10 y
pCOS-sc12E10. La secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos del Fv de cadena sencilla de 12E10
reconstruido, incluida en los plásmidos pCHO-sc12E10
y pCOS-sc12E10 se muestran en el ID SEC Nº: 113.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo 12E10 (IgG, Fab) y el Fv de cadena
sencilla derivado del anticuerpo 12E10 (secuencia conectora de 5
aminoácidos, 15 aminoácidos), se expresaron usando células
COS-7 o células CHO.
La expresión transitoria usando células
COS-7 se llevó a cabo como sigue. La transfección se
llevó a cabo por el procedimiento de electroporación usando el
equipo Gene Pulser II (BioRad). Para la expresión del anticuerpo
12E10 (IgG) se añadieron 10 \mug de cada uno de los vectores de
expresión mencionados antes
HEF-112E10H-g\gamma1 y
pCOS-12E10L, para la expresión del fragmento
12E10Fab se añadieron 10 \mug de cada uno de
pFd-112E10H y pCOS-12E10L y para la
expresión de Fv de cadena sencilla se añadieron
pCOS-sc12E10 (10 \mug) o
pCOS-db12E10 (10 \mug) a células
COS-7 (1 x 10^{7} células/ml) suspendidas en 0,8
ml de PBS. La mezcla mantenida en una cubeta se trató con pulsos a
una capacidad de 1,5 kV, 25 \muFD. Después de recuperación durante
10 minutos a temperatura ambiente, las células electroporadas se
añadieron al medio DMEM (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal
al 10% y se cultivaron. Después de cultivo durante toda la noche,
las células se lavaron una vez con PBS, se añadieron a medio
CHO-S-SFM II sin suero (GIBCO BRL) y
se cultivaron durante 3 días. El líquido sobrenadante del cultivo
se centrifugó para separar los restos celulares y se filtró con un
filtro de 0,22 \mum.
Para establecer una línea celular CHO de
expresión estable para el Fv de cadena sencilla (polipéptido)
derivado del anticuerpo 12E10, se introdujo el vector de expresión
pCHO-sc12E10 o pCHO-ds12E10 en
células CHO, respectivamente.
Cada vector de expresión se introdujo en células
CHO por el procedimiento de electroporación usando el equipo Gene
Pulser II (BioRad). Se mezclaron el ADN linealizado (100 \mug)
obtenido por digestión con la enzima de restricción PvuI y células
CHO (1 x 10^{7} células/ml) suspendidas en 0,8 ml de PBS en una
cubeta, se dejaron reposar sobre hielo durante 10 minutos y se
trataron con pulsos a la capacidad de 1,5 kV, 25 \muFD. Después
de recuperación durante 10 minutos a temperatura ambiente, las
células electroporadas se añadieron a medio
CHO-S-SFM II (GIBCO BRL) que
contenía suero bovino fetal dializado al 10% y ácido nucleico y se
cultivaron. Después de cultivo durante 2 días, el cultivo se
continuó en un medio CHO-S-SFM II
sin ácido nucleico (GIBCO BRL) que contenía suero bovino fetal
dializado al 10%. De estos clones obtenidos, se seleccionó un clon
con una alta tasa de expresión como la línea celular productora
para el Fv de cadena sencilla de 12E10. Después de cultivar en
medio CHO-S-SFM II sin suero (GIBCO
BRL),
líquido sobrenadante del cultivo se centrifugó para separar los restos celulares y se filtró con un filtro de 0,22 \mum.
líquido sobrenadante del cultivo se centrifugó para separar los restos celulares y se filtró con un filtro de 0,22 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Los líquidos sobrenadantes de los cultivos
producidos por las líneas celulares CHO que expresan los Fv de
cadena sencilla de 12E10 obtenidos en el ejemplo 8.4 se purificaron
por columna de anticuerpo anti-FLAG y columna de
filtración en gel, respectivamente para producir los Fv de cadena
sencilla purificados.
Cada líquido sobrenadante de los cultivos
(sc12E10 y db12E10) se añadió a la columna de gel de afinidad
anti-FLAG M2 (SIGMA) equilibrada con tampón de
Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150 mM.
Después de lavar la columna con el mismo tampón, las proteínas
adsorbidas en la columna eluyeron con tampón de glicina 100 mM (pH
3,5). Las fracciones eluidas se neutralizaron inmediatamente por
adición de tampón de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y se
analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que se
confirmó que contenían el Fv de cadena sencilla se juntaron y
concentraron aproximadamente 20 veces usando el
Centricon-10 (AMICON).
La solución concentrada obtenida en (1) se
añadió a la columna Superdex200 HR (10x300 mm, AMERSHAM PHARMACIA)
equilibrada con PBS que contenía Tween 20 al 0,01%. Los
cromatogramas se muestran en las Figuras 53 y 54. El producto
sc12E10 eluyó en dos picos (A, B) (véase la Figura 53). El producto
db12E10 eluyó en dos picos (C, D) (véase la Figura 54). Se recogió
la fracción de cada pico, se trató en presencia y ausencia de un
agente reductor, se procesó por electroforesis de acuerdo con el
procedimiento de Laemmli, y se tiñó con azul brillante de Coomassie
después de la electroforesis. Como se muestra en la Figura 55, todas
las fracciones A, B, C y D, independientemente de la presencia o
ausencia del agente de reducción, produjeron una sola banda que
tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 31 kD. Cuando
se analizaron estas fracciones por filtración en gel usando
Superdex200 HR, la fracción A produjo un producto eluido a un peso
molecular aparente de aproximadamente 42 kD, la fracción B a 20 kD
(véase la Figura 56), la fracción C a 96 kD y la fracción D a 41 kD
(véase la Figura 57). Los resultados sugieren que la fracción A
derivada de sc12E10 es el dímero con enlace no covalente del Fv de
cadena sencilla y la fracción B es el monómero de Fv de cadena
sencilla, y la fracción C derivada de db12E10 es el trímero con
enlace no covalente de Fv de cadena sencilla y D es el dímero con
enlace no covalente de Fv de cadena sencilla.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de tipo TPO del anticuerpo de
cadena sencilla anti-mpl se evaluó midiendo la
actividad de proliferación para las células Ba/F3 (BaF/mpl) que
expresan el receptor de TPO humano (MPL).
Después de lavar las células BaF/mpl dos veces
con medio RPMI1640 (GIBCO) que contenía suero bovino fetal al 1%,
las células se suspendieron en el medio con una densidad celular de
5 x 10^{5} células /ml. El anticuerpo de cadena sencilla
anti-MPL o la TPO humana (R&D Systems) se
diluyeron con el medio, respectivamente. Se añadieron 50 \mul de
la suspensión celular y 50 \mul del anticuerpo o de la TPO humana
diluidos en una microplaca de 96 pocillos (fondo plano) (Corning),
y se cultivaron en un incubador con CO_{2} (concentración de
CO_{2}: 5%) durante 24 horas. Después de la incubación, se
añadieron 10 \mul de reactivo WST-8 (reactivo para
medir el número de células SF originales: Nacalai Tesque) y se
midió inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de
medición de 450 nm y una longitud de onda de referencia de 655 nm
usando el fotómetro de absorbencia Benchmark Plus (BioRad). Después
de incubar en un incubador con CO_{2} (concentración de CO_{2}:
5%) durante 2 horas, se volvió a medir la absorbancia a 450 nm de
longitud de onda de medición y 655 nm de longitud de onda de
referencia usando el Benchmark Plus. Puesto que el reactivo
WST-8 desarrollaba la reacción de color dependiendo
del número de células vivas a la longitud de onda de 450 nm, la
actividad de proliferación de BaF/mpl se evaluó basándose en el
cambio de absorbancia en 2 horas.
La actividad agonista frente a MPL medida usando
los líquidos sobrenadantes del cultivo de células
COS-7 que expresaban diferentes moléculas de
anticuerpo 12E10 se muestra en la Figura 58. Los Fv de cadena
sencilla que tenían el conector de 5 aminoácidos (ds12E10) y el
conector de 15 aminoácidos (sc12E10) aumentaron la absorbancia de
una forma dependiente de la concentración, mostrando la actividad
agonista de tipo TPO (DE50, 9 pM y 51 pM respectivamente), mientras
que 12E10IgG y 12E10Fab no tenían actividad.
Se ha mostrado que la cadena H y la cadena L del
Fv de cadena sencilla se asocian no sólo dentro de una molécula
sino también entre moléculas para formar multímeros, tal como
dímeros. Los líquidos sobrenadantes del cultivo de células CHO que
expresaban los Fv de cadena sencilla de 12E10 se filtraron en gel y
se ensayó la actividad agonista en MPL. Los resultados se muestran
en la Figura 59. El dímero, que estaba contenido en sc12E10 en una
cantidad pequeña, mostró una actividad agonista de tipo TPO
aproximadamente 5000 veces más fuerte (dímero de sc12E10, DE50, 1,9
pM) comparado con el monómero (monómero de sc12E10, DE50; >10
nM). La actividad era mayor que la de la TPO (DE50, 27 pM). El
dímero de db12E10 (dímero de db12E10, DE50, 2,0 pM) mostró una
actividad fuerte comparable a la del dímero de sc12E10. El trímero
de db12E10 (DE50, 7,4 pM), que se suponía que era un trímero por el
peso molecular obtenido por la filtración en gel, mostró una
actividad alta que es menor que la del dímero db12E10. Estos
resultados sugieren que para la actividad del anticuerpo 12E10
agonista es importante que el sitio de unión al antígeno sea
bivalente (dímero). Teniendo en cuenta el hecho de que IgG de 12E10
no tenía actividad, se supone que son importantes otros factores
además de ser bivalente, tal como la situación del sitio de unión
al antígeno, la distancia o el ángulo.
\vskip1.000000\baselineskip
la fig. 1 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que el anticuerpo IgG humano no se
une a las células L1210 que expresan la IAP humana (hIAP/L1210);
la fig. 2 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que el anticuerpo
MABL-1 quimérico se une específicamente a las
células L1210 que expresan la IAP humana (hIAP/L1210);
la fig. 3 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que el anticuerpo
MABL-2 quimérico se une específicamente a las
células L1210 que expresan la IAP humana (hIAP/L1210);
la fig. 4 ilustra esquemáticamente el
procedimiento para producir el Fv de cadena sencilla de acuerdo con
la presente invención;
la fig. 5 ilustra una estructura de un plásmido
de expresión que se puede usar para expresar un ADN que codifica el
Fv de cadena sencilla de la invención en E. coli;
la fig. 6 ilustra una estructura de un plásmido
de expresión que se usa para expresar un ADN que codifica el Fv de
cadena sencilla de la invención en células de mamífero;
la fig. 7 muestra el resultado de la
transferencia Western en el Ejemplo 5.4. Desde la izquierda, un
marcador de peso molecular (que indica 97,4, 66, 45, 31, 21,5 y
14,5 kDa desde la parte superior), el líquido sobrenadante del
cultivo de células COS7 en las que se ha introducido pCHO1 y el
líquido sobrenadante del cultivo de células COS7 en las que se ha
introducido pCHOM2. Ilustra que el Fv de cadena sencilla
reconstruido del anticuerpo MABL-2 (flecha) está
contenido en el líquido sobrenadante del cultivo de las células en
las que se ha introducido pCHOM2;
la fig. 8 muestra el resultado de la citometría
de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido sobrenadante
del cultivo de células pCHO1/COS7 como control, no se une a células
pCOS1/L1210 como control;
la fig. 9 muestra el resultado de la citometría
de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido sobrenadante
del cultivo de células MABL2-scFv/COS7 no se une a
células pCOS1/L1210 como control;
la fig. 10 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido
sobrenadante del cultivo de células pCOS1/COS7 como control no se
une a células hIAP/L1210;
la fig. 11 muestra el resultado de la
citometría de flujo, que ilustra que un anticuerpo en el líquido
sobrenadante del cultivo de células
MABL-2-scFv/COS7 se une
específicamente a células hIAP/L1210;
la fig.12 muestra el resultado del ELISA
competitivo en el Ejemplo 5.6, en el que se demuestra la actividad
de unión del Fv de cadena sencilla de la invención
(MABL2-scFv) al antígeno, en términos de inhibición
de la unión del anticuerpo MABL-2 monoclonal de
ratón al antígeno como un índice, en comparación con el líquido
sobrenadante del cultivo de células pCHO1/COS7 como control;
la fig. 13 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
pCHO1/COS7 como control no induce la apoptosis de células
pCOS1/L1210 como control;
la fig. 14 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
MABL2-scFv/COS7 no induce la apoptosis de células
pCOS1/L1210 como control;
la fig. 15 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
pCHO1/COS7 como control no induce la apoptosis de células
hIAP/L1210;
la fig. 16 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
MABL2-scFv/COS7 induce específicamente la apoptosis
de células hIAP/L1210;
la fig. 17 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
pCHO1/COS7 como control no induce la apoptosis de células
CCRF-CEM (al 50% de la concentración final);
la fig. 18 muestra los resultados del efecto de
inducción de la apoptosis en el Ejemplo 5.7, que ilustra que el
anticuerpo en el líquido sobrenadante del cultivo de células
MABL2-scFv/COS7 induce específicamente la apoptosis
de células CCRF-CEM (al 50% de la concentración
final);
la fig. 19 muestra el cromatograma obtenido en
la purificación del Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por las células CHO en el Ejemplo
5.9, que ilustra que la fracción A y la fracción B se obtuvieron
como picos mayoritarios cuando la fracción de la columna de
sefarosa-azul se purificó con la columna de
hidroxiapatito;
la fig. 20 muestra los resultados de la
purificación por filtración en gel de la fracción A y la fracción B
obtenidas en el Ejemplo 5.9-(2), que ilustra que los picos
principales (AI y BI, respectivamente) eluyeron de la fracción A a
aproximadamente 36 kD de peso molecular aparente y de la fracción B
a aproximadamente 76 kD;
la fig. 21 es el análisis en
SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la
purificación del Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por las células CHO en el Ejemplo
5.9, que ilustra que en ambas fracciones se observaba una sola
banda de aproximadamente 35 kD de peso molecular;
la fig. 22 muestra los resultados del análisis
de las fracciones AI y BI obtenidas por la filtración en gel, en la
purificación de Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por las células CHO, en la que la
fracción AI comprende el monómero y la fracción BI comprende el
dímero.
la fig. 23 ilustra una estructura de un
plásmido de expresión que se puede usar para expresar un ADN que
codifica el Fv de cadena sencilla de la invención, en E.
coli;
la fig. 24 muestra los resultados de la
purificación en la columna de filtración en gel de los productos
brutos del polipéptido Fv de cadena sencilla derivado del anticuerpo
MABL-2 producido por E. coli, obtenido en el
Ejemplo 5.12,
en la que cada pico indica monómero o dímero, respectivamente, del Fv de cadena sencilla producido por E. coli;
en la que cada pico indica monómero o dímero, respectivamente, del Fv de cadena sencilla producido por E. coli;
la fig. 25 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
anticuerpo IgG de ratón como control no induce la apoptosis de las
células hIAP/L1210 (concentración final de
3 \mug/ml).
3 \mug/ml).
la fig. 26 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
dímero de MABL2-scFv producido por las células CHO
induce notablemente la apoptosis de células hIAP/L1210
(concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 27 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
dímero de MABL2-scFv producido por E. coli
induce notablemente la apoptosis de células hIAP/L1210
(concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 28 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que la
inducción de apoptosis en células hIAP/L1210 por el monómero de
MABL2-scFv producido por células CHO es del mismo
nivel que el del control (concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 29 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que la
inducción de apoptosis en células hIAP/L1210 del monómero de
MABL2-scFv producido por E. coli es del
mismo nivel que el del control (concentración final de 3
\mug/ml);
la fig. 30 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
anticuerpo IgG de ratón usado como control no induce la apoptosis en
células hIAP/L1210 incluso cuando se añade el anticuerpo
anti-FLAG (concentración final de 3 \mug/ml);
la fig. 31 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis en el Ejemplo 5.13, que ilustran que el
monómero de MABL2-scFv producido por células CHO
induce notablemente la apoptosis de células hIAP/L1210 cuando se
añade el anticuerpo anti-FLAG (concentración final
de 3 \mug/ml);
la fig. 32 muestra los resultados de la
medición cuantitativa de la IgG humana en el suero de un ratón al
que se ha trasplantado una línea celular de mieloma humano KPMM2,
que indican cantidades de IgG humana producida por las células de
mieloma humano en el ratón. Ilustra que el dímero de scFv/CHO induce
notablemente el crecimiento de células KPMM2;
la fig. 33 muestra el tiempo de supervivencia
del ratón después del trasplante del tumor, que ilustra que el
grupo al que se administró el dímero de scFv/CHO prolongaba
notablemente el tiempo de supervivencia;
la fig. 34 ilustra una estructura de un
plásmido de expresión que expresa un anticuerpo modificado
[sc(Fv)_{2}] que comprende dos regiones V de la
cadena H y dos regiones V de la cadena L derivadas del anticuerpo
MABL-2;
la fig. 35 ilustra una estructura de un
plásmido que expresa un scFv (tipo HL) en el que las regiones V
están unidas de la forma [cadena H]-[cadena L] sin un péptido
conector;
la fig. 36 ilustra una estructura del
polipéptido de tipo HL y las secuencias de aminoácidos de conectores
peptídicos;
la fig. 37 ilustra una estructura de un
plásmido que expresa un scFv (tipo LH) en el que las regiones V
están unidas de la forma [cadena L]-[cadena H] sin un péptido
conector;
la fig. 38 ilustra una estructura del
polipéptido de tipo LH y las secuencias de aminoácidos de conectores
peptídicos;
la fig. 39 muestra los resultados de la
transferencia Western en el Ejemplo 6.4, que ilustra que se expresan
el anticuerpo modificado sc(Fv)_{2} que comprende
dos regiones V de la cadena H y dos cadenas V de la cadena L, y el
MABL2-scFv que tiene conectores peptídicos con
diferentes longitudes;
las figs. 40a y 40b muestran los resultados de
la citometría de flujo usando el líquido sobrenadante del cultivo
de células COS7 preparado en el Ejemplo 6.3 (1), que ilustra que
MABL2-scFv y sc(Fv)_{2} que tienen
conectores peptídicos con diferentes longitudes tienen afinidades
altas frente a la IAP humana;
las figs. 41a y 41b muestran los resultados del
efecto de inducción de apoptosis en el Ejemplo 6.6, que ilustran
que el scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6 y 7> y el
sc(Fv)_{2} inducen notablemente la muerte celular de
células hIAP/L1210;
la fig. 42 muestra los resultados de la
evaluación de la capacidad de unión al antígeno en el Ejemplo 6.10,
que ilustra que el dímero de scFv <HL5> y
sc(Fv)_{2} tienen afinidades altas frente a la IAP
humana;
la fig. 43 muestra los resultados del efecto de
la inducción de apoptosis in vitro en el Ejemplo 6.11, que
ilustran que el dímero de scFv <HL5> y sc(Fv)2
inducen la apoptosis de células hIAP/L1210 y células
CCRF-CEM de forma dependiente de la
concentración;
la fig.44 muestra los resultados de la medición
cuantitativa de la proteína M producida por una línea celular de
mieloma humano KPMM2 en el suero de ratón al que se ha trasplantado
la línea celular de mieloma humano. Ilustra que el dímero de scFv
<HL5> y sc(Fv)_{2} inhiben notablemente el
crecimiento de las células KPMM2;
la fig. 45 muestra el tiempo de supervivencia
(días) de los ratones después del trasplante del tumor, que ilustra
que el tiempo de supervivencia del grupo al que se había
administrado scFv <HL5> se había prolongado notablemente;
la fig. 46 muestra el tiempo de supervivencia
(días) de los ratones después del trasplante del tumor, que ilustra
que el tiempo de supervivencia del grupo al que se había
administrado sc(Fv)_{2} se había prolongado
notablemente;
la fig. 47 es un esquema que muestra el
procedimiento para la construcción del fragmento de ADN que codifica
el Fv de cadena sencilla de 12B5 reconstruido que contiene la
secuencia conectora que consiste en 15 aminoácidos y la estructura
del mismo;
la fig. 48 muestra el resultado de la
purificación de cada uno de los Fv de cadena sencilla de 12B5 por
filtración en gel obtenido en el Ejemplo 7.5 (1), que ilustra que
sc12B5 se dividió en dos picos (fracciones A y B);
la fig. 49 muestra el resultado analítico de
cada una de las fracciones A y B por SDS-PAGE
llevado a cabo en el Ejemplo 7.5 (2);
la fig. 50 muestra el resultado analítico de
cada una de las fracciones A y B por la columna Superdex200 llevada
a cabo en el Ejemplo 7.5 (2), que ilustra que el pico mayoritario de
la fracción A eluía a un peso molecular aparente de aproximadamente
44 kD mostrado en (a) y que el pico mayoritario de la fracción B
eluía a un peso molecular aparente de aproximadamente 22 kD
mostrado en (b);
la fig. 51 muestra el resultado de la medición
de la actividad agonista de tipo TPO de sc12B5 y el anticuerpo 12B5
(IgG, Fab), que ilustra que 12B5IgG y el Fv de cadena sencilla
monovalente (sc12B5) mostraban actividad agonista de tipo TPO de
una forma dependiente de la concentración;
la fig. 52 muestra el resultado de la medición
de la actividad agonista de tipo TPO del monómero y dímero de
sc12B5, que ilustra que el Fv de cadena sencilla (dímero de sc12B5)
que tiene el sitio de unión al antígeno bivalente tenía una
actividad agonista aproximadamente 400 veces mayor que el sc12B5
monovalente y que la eficacia es equivalente a o mayor que la de la
TPO humana;
la fig. 53 muestra el resultado de la
purificación de la cadena sencilla de sc12E10 obtenida por
cromatografía de filtración en gel usando una columna
Superdex200HR, que ilustra que sc12E10 se dividía en dos picos
(fracciones A y B);
la fig. 54 muestra el resultado de la
purificación de la cadena sencilla de db12E10 obtenida por
cromatografía de filtración en gel usando una columna
Superdex200HR, que ilustra que db12E10 se dividía en dos picos
(fracciones C y D);
la fig. 55 muestra el análisis por
SDS-PAGE de las fracciones A y B (sc12E10) y las
fracciones C y D (db12E10) en condiciones reductoras y no
reductoras;
la fig. 56 muestra el resultado analítico de las
fracciones A y B por cromatografía de filtración en gel usando la
columna Superdex200HR, que ilustra (1) el pico principal de la
fracción A que eluía a un peso molecular aparente de
aproximadamente 42 kD y (2) el pico principal de la fracción B que
eluía a un peso molecular aparente de aproximadamente 20 kD;
la fig. 57 muestra el resultado analítico de las
fracciones C y D por cromatografía de filtración en gel usando la
columna Superdex200HR, que ilustra (1) el pico principal de la
fracción C que eluía a un peso molecular aparente de
aproximadamente 69 kD y (2) el pico principal de la fracción D que
eluía a un peso molecular aparente de aproximadamente 41 kD;
la fig. 58 es una gráfica que muestra la
actividad agonista de diferentes moléculas de anticuerpo 12E10 en
MPL, que ilustra que los Fv de cadena sencilla (sc12E10, db12E10)
mostraban actividad agonista de tipo TPO, mientras que 12E10 IgG y
12E10 Fab no;
la fig. 59 es una gráfica que muestra la
actividad agonista del monómero y el dímero de sc12E10 y el dímero
y el trímero de db12E10 en MPL, que ilustra que el dímero de sc12E10
y el dímero y trímero de db12E10 mostraban mayor actividad agonista
de tipo TPO que la TPO.
Los anticuerpos modificados de la invención
tienen una actividad agonista capaz de transducir una señal dentro
de las células por reactividad cruzada con una molécula(s) de
la superficie celular y son ventajosos en cuanto que la
permeabilidad en tejidos y tumores es alta debido al tamaño
molecular reducido comparado con la molécula de anticuerpo (IgG
entera). Esta invención proporciona los anticuerpos modificados con
una actividad agonista notablemente mayor que la TPO o los
anticuerpos originales (IgG entera). En especial, incluso los
anticuerpos originales sin actividad agonista se pueden alterar en
los anticuerpos modificados con una actividad agonista mayor que la
TPO. Por lo tanto, los anticuerpos modificados se pueden usar como
agonistas de transducción de señales. La modificación de la
molécula de anticuerpo da como resultado la reducción de los efectos
secundarios producidos por la reactividad cruzada intercelular y
proporciona nuevos medicamentos que sólo inducen la acción
requerida por reactividad cruzada con una molécula(s) de la
superficie celular. Las preparaciones médicas que contienen como
principio activo los anticuerpos modificados de la invención son
útiles como agentes de prevención y/o remedios para enfermedades
sanguíneas relacionadas con plaquetas, trombocitopenia producida
por quimioterapia para cánceres o leucemia y similares.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo agonista de TPO
degradado
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FP1033
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
22-10-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2000-321821
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-10-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP01/03288
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-04-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2001-277314
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-09-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(393)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M1L.
1-57; péptido señal, 58-394; péptido
maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M1H.
1-57; péptido señal, 58-409; péptido
maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(393)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M2L.
1-57; péptido señal, 58-394; péptido
maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pGEM-M2H.
1-57; péptido señal, 58-409; péptido
maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm16
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
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<400> 13
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 17
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos y secuencia
de nucleótidos del conector
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pscM1.
MABL1-scFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(813)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHOM1.
MABL1-scFv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(822)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pscM2.
MABL2-scFv
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(813)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHOM2.
MABL2-scFv
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(450)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHO-shIAP. IAP
humana soluble
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 26
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 27
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
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<400> 28
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(735)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pscM2DEm01.
MABL2-scFv
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<400> 29
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1599)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pCHOM2(Fv)2.
MABL2-sc(Fv)2
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<400> 32
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<210> 33
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<210> 37
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 37
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
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<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 39
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
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<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<211> 40
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
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<400> 42
\hskip1cm58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm59
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
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<211> 49
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
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<211> 52
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 46
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 47
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<211> 780
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> CF2HL-0/pCOS1.
MABL2-scFv <HL-0>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm66
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm67
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 780
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(768)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CF2HL-0/pCOS1.
MABL2-scFv <LH-0>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(351)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5HV. Péptido
1-351
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia lectora
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VH-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VH-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VH-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VH-S, cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VH-A, cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm82
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (236)...(558)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1-235; intrón,
236-588; región constante de IgG humana
(parcial)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1CH1-S, cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm85
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1CH1-A, cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(419)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
HEF-12B5H-g gamma. Péptido
12-419
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(321)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5LV. Péptido
1-321
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia lectora
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VL-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VL-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VL-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VL-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VL-S; cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5VL-A; cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm96
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
HEF-12B5H-g kappa. Péptido
12-398
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia marcadora FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm98
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5-S; cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm99
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HuVHJ3; cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RhuJH3; cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RhuVK1; cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HuVK1.2; cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm103
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12B5F-A; cebador de
PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos y secuencia
de nucleótidos conectora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(809)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sc12B5, Fv de cadena sencilla
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia lectora
\vskip0.400000\baselineskip
<308> GenBank nº AF062252
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VH4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VHS, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\hskip1cm117
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VHA, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\hskip1cm118
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(417)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10H, región V de la cadena H
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia lectora
\vskip0.400000\baselineskip
<310>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VL1, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VL2, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VL3, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VL4, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VLS, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\hskip1cm127
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10VLA, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\hskip1cm128
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(387)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10L, región V de la cadena L
\vskip0.400000\baselineskip
<310>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FLAG, secuencia lectora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip1cm130
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10S, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip1cm131
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DB2, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\hskip1cm132
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DB1, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip1cm133
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10FA, cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 792
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)... (778)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12E10, Fv de cadena sencilla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sc4.3, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sc1.3, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(807)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sc12E10, Fv de cadena sencilla
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
Claims (23)
1. Un anticuerpo modificado que comprende dos o
más regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L
de un anticuerpo y que muestra acción agonista de TPO por
reactividad cruzada con el receptor de TPO, en el que el anticuerpo
modificado es:
(i) un multímero del Fv de cadena sencilla que
comprende una región V de la cadena H y una región V de la cadena
L; o
(ii) un polipéptido de cadena sencilla que
comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones
de la cadena L.
2. El anticuerpo modificado de la reivindicación
1, en el que la región V de la cadena H y la región V de la cadena
L están conectadas por un conector.
3. El anticuerpo modificado de la reivindicación
2 ó 3, en el que el conector es un conector peptídico que comprende
al menos un aminoácido.
4. El anticuerpo modificado de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo modificado está
compuesto del tetrámero, trímero o dímero del Fv de cadena
sencilla.
5. El anticuerpo modificado de la reivindicación
4, en el que el anticuerpo modificado está compuesto del dímero del
Fv de cadena sencilla.
6. El anticuerpo modificado de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo modificado es
un polipéptido de cadena sencilla que comprende dos regiones V de la
cadena H y dos regiones V de la cadena L.
7. El anticuerpo modificado de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo modificado
además comprende una secuencia(s) de aminoácidos para la
purificación del péptido.
8. El anticuerpo modificado de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo modificado se
ha purificado.
9. El anticuerpo modificado de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que la región V de la cadena H
y/o la región V de la cadena L es la región V de la cadena H y/o la
región V de la cadena L derivadas de un anticuerpo humano.
10. El anticuerpo modificado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la región V de la cadena H
y/o la región V de la cadena L es la región V de la cadena H y/o la
región V de la cadena L humanizadas.
11. El anticuerpo modificado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo modificado
es un anticuerpo modificado monoespecífico.
12. El anticuerpo modificado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo modificado
es el anticuerpo modificado multiespecífico.
13. El anticuerpo modificado de la
reivindicación 12, en el que el anticuerpo modificado es un
anticuerpo modificado biespecífico.
14. El anticuerpo modificado de la
reivindicación 11, en el que la región V de la cadena L y la región
V de la cadena H proceden del mismo anticuerpo monoclonal.
15. El anticuerpo modificado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14, que deriva de un anticuerpo
original que sustancialmente no tiene acción agonista.
16. Un ADN que codifica el anticuerpo modificado
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Una célula animal que produce el anticuerpo
modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
18. Un microorganismo que produce el anticuerpo
modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
19. Un medicamento que comprende como principio
activo el anticuerpo modificado de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15.
20. Uso del anticuerpo modificado de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para preparar un
medicamento para tratar la trombocitopenia.
21. Un procedimiento de selección de un
anticuerpo modificado que comprende dos o más regiones V de la
cadena H y dos o más regiones V de la cadena L del anticuerpo y que
muestra una acción agonista por reactividad cruzada con el receptor
de TPO, en el que el anticuerpo modificado es
(i) un multímero del Fv de cadena sencilla que
comprende una región V de la cadena H y una región V de la cadena
L; o
(ii) un polipéptido de cadena sencilla que
comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones
de la cadena L,
que comprende las etapas de
(1) producir un anticuerpo modificado que
comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones
V de la cadena L del anticuerpo y que se une específicamente al
receptor de TPO,
(2) someter las células que expresan dicho
receptor de TPO a reacción con el anticuerpo modificado y
(3) medir la acción agonista de TPO en las
células producida por reactividad cruzada con el receptor de
TPO.
22. Un procedimiento de medición de la acción
agonista de un anticuerpo modificado que comprende dos o más
regiones V de la cadena H y dos o más regiones V de la cadena L del
anticuerpo y que muestra una acción agonista por reactividad
cruzada con el receptor de TPO, en el que el anticuerpo modificado
es
(i) un multímero del Fv de cadena sencilla que
comprende una región V de la cadena H y una región V de la cadena
L; o
(ii) un polipéptido de cadena sencilla que
comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones
de la cadena L,
que comprende las etapas de
(1) producir un anticuerpo modificado que
comprende dos o más regiones V de la cadena H y dos o más regiones
V de la cadena L del anticuerpo y que se une específicamente al
receptor de TPO,
(2) someter las células que expresan dicho
receptor de TPO a reacción con el anticuerpo modificado y
(3) medir la acción agonista de TPO en las
células producida por reactividad cruzada con el receptor de
TPO.
23. El anticuerpo modificado de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en un método para el
tratamiento de la trombocitopenia.
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