ES2294848T3 - Vectores de virtus del herpes para celulas dendriticas. - Google Patents
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Abstract
Un herpesvirus atenuado capaz de infectar eficazmente una célula dendrítica sin impedir que se produzca el procesamiento de antígenos en el interior de la célula infectada, careciendo el virus de un gen UL43 funcional y de un gen vhs funcional.
Description
Vectores de herpesvirus para células
dendríticas.
La presente invención se refiere a virus herpes
simplex atenuados capaces de infectar eficazmente células
dendríticas. También se refiere al uso de tales virus en
procedimientos de inmunoterapia para el tratamiento de
enfermedades.
Las células dendríticas (DC) son las células
presentadoras de antígenos más potentes y son eficaces para inducir
respuestas incluso contra antígenos para los cuales el sistema
inmune se ha vuelto tolerante. Por lo tanto, para inmunoterapia de
tumores, en la que se provoca una respuesta inmune contra un tumor,
el uso de DC puede ser ideal si se generaron para presentar
antígenos específicos de tumor. También pueden usarse DC para
presentar antígenos derivados de agentes infecciosos tales como
bacterias, virus o parásitos, proporcionando vacunas protectoras o
terapéuticas para tales enfermedades. Sin embargo, se ha demostrado
que el mayor problema con este procedimiento es la transferencia
eficaz de antígenos a DC.
Para proporcionar una ocasión real de generar
una respuesta inmune terapéutica contra un antígeno tumoral u otro
antígeno relacionado con enfermedad, deben cumplirse varias
condiciones. En primer lugar, es necesario identificar moléculas
cuya expresión sea específica de tumor o de enfermedad (o al menos
selectiva) y que, por lo tanto, puedan servir como diana para una
respuesta inmune. Se ha demostrado que esta tarea es muy difícil
para la mayoría de los tumores comunes, pero se resuelve, por
ejemplo, en el caso del cáncer cervical mediante la presencia, en
la mayoría de los casos, de los oncogenes virales E6 y E7 y, para
otros tumores, comienzan a identificarse buenos antígenos
candidatos. Por ejemplo, el producto génico MUC-1 se
sobreexpresa en varios tumores, incluyendo el 90% de los cánceres
de ovario. También se han identificado otros diversos antígenos
asociados con tumores, cualquiera de los cuales puede usarse en un
tratamiento de inmunoterapia del cáncer. En segundo lugar, después
de la identificación del antígeno o antígenos, es necesario
administrar los antígenos al sistema inmune en una forma
inmunogénica. Para generar la respuesta inmune celular crítica para
el rechazo del tumor, las proteínas deben administrarse al interior
del citoplasma de una célula hospedadora (una tarea difícil para
antígenos proteicos de alto peso molecular) o sintetizarse por las
propias células hospedadoras después de la administración del gen o
de la inmunización con ADN. Se ha considerado utilizar para este fin
vectores virales que incluyen virus vaccinia, adenovirus o
retrovirus.
El tipo celular que actualmente se reconoce en
general que proporciona el estímulo inmune óptimo es la célula
dendrítica linfoide (DC; véase, por ejemplo, Girolomoni y
Ricciardi-Castagnoli, 1997). De hecho, las DC
parecen ser el único tipo celular capaz de estimular una respuesta
inmune primaria in vivo y, además, han demostrado ser
capaces incluso de superar una tolerancia establecida en
determinadas circunstancias. Varios grupos están investigando el
uso de DC en protocolos de inmunoterapia adoptiva autóloga para
estimular respuestas inmunes contra tumores con la esperanza de que
puedan demostrar un efecto terapéutico. Tales protocolos implican el
cultivo y/o enriquecimiento de DC de sangre periférica, cargar las
DC con antígeno in vitro, seguido de la reintroducción de
las DC en el paciente. No obstante, este enfoque se ha visto
obstaculizado por la ausencia de medios eficaces para cargar estas
células con antígenos. Sin embargo, un trabajo reciente ha
demostrado que la presentación de antígenos mediante DC pulsadas
con péptidos ha producido respuestas antitumorales in vivo
(Celluzi et al., 1996; Zitvogel et al., 1996). Con
respecto a los vectores virales, los retrovirus no proporcionan una
administración de genes de alta eficacia en células dendríticas
(Reeves et al., 1996; Aicher et al., 1997) y, según
nuestra experiencia, a diferencia de en trabajos publicados por
otros (Arthur et al., 1997), los adenovirus sólo
proporcionan una administración de genes de baja eficacia.
Se ha ensayado y publicado previamente que los
virus herpes simplex (HSV) pueden infectar y administrar genes
eficazmente en células dendríticas (Coffin et al., 1998),
aunque no se cuantificó la toxicidad asociada. Los HSV presentan
varias ventajas sobre otros sistemas de vectores para este fin, ya
que pueden infectar eficazmente una gran diversidad de tipos
celulares (incluyendo algunos muy difíciles de infectar con otros
sistemas de vectores, por ejemplo, Dilloo et al., 1997;
Coffin et al., 1998), son fáciles de manipular y pueden
tolerar grandes inserciones de ADN, permitiendo la expresión de
múltiples genes (véase la revisión por Coffin y Latchman 1996). La
administración de múltiples antígenos en células dendríticas seguida
de su reintroducción en el cuerpo puede ser un enfoque
particularmente prometedor para el tratamiento de algunos cánceres y
enfermedades infecciosas.
Se ha descubierto previamente que, a diferencia
de otros vectores, los HSV pueden transducir eficazmente células
dendríticas (Coffin et al., 1998), aunque no se ensayaron ni
los efectos tóxicos ni las capacidades funcionales de las células
dendríticas transducidas. En el presente trabajo se han ensayado una
diversidad de mutantes de HSV, desde virus esencialmente de tipo
silvestre hasta virus con mutaciones que impiden su replicación en
algunos tipos celulares (mutaciones en genes no esenciales) o en
todos los tipos celulares (mutaciones en genes esenciales), y
algunos mutantes con combinaciones de deleciones tanto en genes
esenciales como no esenciales. Se han descubierto diferencias
considerables tanto en la eficacia de administración de genes de
estos diversos mutantes como en el nivel de toxicidad que
presentaban (estimado por la muerte de células dendríticas).
Sorprendentemente, se ha descubierto que: (i) un
virus con mutaciones inactivantes en ICP34.5, VMW65, vhs y
UL43 proporciona, para células dendríticas, un virus con menor
toxicidad y con mayor eficacia de administración de genes que otros
virus ensayados capaces de replicarse, incluyendo el virus descrito
anteriormente (Coffin et al., 1998), y también que varios de
los virus incapaces de replicarse ensayados. Esto es particularmente
sorprendente ya que ICP34.5, VMW65, vhs y UL43 se consideran
habitualmente genes no esenciales. Por ejemplo, un virus similar
incluyendo la deleción de un gen esencial (mutaciones en ICP34.5,
VMW65, vhs y UL27) demostró una eficacia de administración
de genes mucho menor que este virus. Además, a diferencia de otros
virus mutantes ensayados, pudieron demostrarse resultados que
indicaban que se estaba produciendo un procesamiento de antígenos
eficaz en las células diana. Esto sugería que las células
dendríticas transducidas conservan una capacidad funcional que
puede permitir la estimulación de una respuesta inmune eficaz in
vivo. También se ha descubierto que (ii) un virus inutilizado
de tal modo que sólo se expresan niveles muy mínimos de genes
tempranos inmediatos en las células diana (y, por lo tanto, del cual
generalmente se esperaría solamente un nivel muy bajo de expresión
génica de HSV) dio resultados similares, a diferencia de otros
mutantes con sólo un único gen temprano inmediato eliminado.
Estos resultados demuestran que, aunque puede
conseguirse una administración de genes eficaz en células
dendríticas de manera relativamente fácil usando vectores de HSV,
debe seleccionarse cuidadosamente la combinación particular de
mutaciones en el virus para que las células conserven sus
capacidades de procesamiento de antígenos. La invención, por lo
tanto, proporciona por primera vez vectores virales para células
dendríticas que proporcionan una administración de genes muy
eficaz, sin afectar desfavorablemente a las capacidades de
procesamiento de antígenos de las células dendríticas
infectadas.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un herpesvirus atenuado capaz de infectar eficazmente células
dendríticas sin impedir un procesamiento de antígenos eficaz en la
célula infectada, careciendo el virus de un gen UL43 funcional y de
un gen vhs funcional. Preferiblemente, dicho herpesvirus es
un virus herpes simplex humano. Más preferiblemente, dicho virus es
HSV1 o HSV2.
Preferiblemente, el virus de la invención carece
además de un gen ICP34.5 de HSV funcional. El virus de la invención
puede carecer también de un gen VMW65 funcional, especialmente
debido a una mutación en dicho gen que suprime su actividad de
activación transcripcional. En realizaciones preferidas de la
presente invención, el virus de la invención es una cepa de HSV
atenuada que comprende una mutación en al menos cuatro genes, de
tal modo que carece de un gen vhs funcional, de un gen UL43
funcional, de un gen ICP34.5 funcional y de un gen VMW65 funcional
(debido a una mutación en dicho gen VMW65 que suprime su actividad
de activación transcripcional).
La invención también proporciona el uso de un
virus herpes simplex atenuado capaz de infectar eficazmente una
célula dendrítica, sin impedir que se produzca el procesamiento de
antígenos en el interior de la célula infectada, en la fabricación
de un medicamento para usar en un método de estimulación de una
respuesta inmune, comprendiendo el método infectar células
dendríticas con dicho virus, en el que dicho virus es un virus de la
invención.
La invención proporciona además un virus de la
invención que lleva un gen o genes heterólogos, o el uso de un
virus de acuerdo con la invención en el que el virus comprende un
gen o genes heterólogos. El término gen heterólogo se pretende que
incluya cualquier gen que no se encuentre en el genoma viral. El gen
heterólogo puede ser una variante alélica de un gen de tipo
silvestre o puede ser un gen mutante. Los genes heterólogos están
preferiblemente unidos operativamente a una secuencia de control que
permite la expresión de dicho gen heterólogo en una célula
dendrítica, preferiblemente en una célula dendrítica humana. El
virus de la invención puede usarse, por lo tanto, para administrar
un gen heterólogo en una célula dendrítica en la que se
expresará.
El gen o genes heterólogos codifican
preferiblemente un polipéptido de uso terapéutico. En particular, el
gen o genes heterólogos pueden codificar un polipéptido capaz de
modificar respuestas inmunes, por ejemplo, una citocina u otro
polipéptido inmunomodulador. El gen o genes heterólogos pueden
codificar también un polipéptido antigénico que esté presente en
células tumorales pero no en células no tumorales, o que esté
sobrerregulado en células tumorales con respecto a células no
tumorales. Esto será útil en la terapia del cáncer, ya que una
célula dendrítica infectada de la invención puede usarse para
estimular al sistema inmune del hospedador para que reaccione
contra el antígeno o antígenos específicos de tumores o más
frecuentes en tumores, dando como resultado la reducción o la
regresión del tumor. El antígeno o antígenos polipeptídicos son
preferiblemente un polipéptido de superficie celular o un
polipéptido que se ha generado de tal modo que será transportado a
la superficie celular (por ejemplo, por fusión con un péptido
señal). El gen heterólogo puede también codificar un polipéptido o
polipéptidos de origen parasitario, viral o bacteriano de tal modo
que, por ejemplo, una célula dendrítica infectada con un virus de
la invención puede usarse para estimular al sistema inmune del
hospedador para producir una respuesta inmune contra un patógeno,
antes de la infección o después de la infección del hospedador por
el patógeno. El gen o genes heterólogos pueden codificar también una
proteína o proteínas asociadas con otras enfermedades (por ejemplo,
enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Huntington,
Alzheimer o Parkinson) para las que pueda ser beneficioso inducir
una respuesta inmune.
La invención proporciona además un virus de la
invención que lleva un gen o genes heterólogos para usar en el
tratamiento de seres humanos y de animales, en particular mediante
inmunoterapia. Por ejemplo, tales virus pueden usarse en el
tratamiento o la prevención de tumores o de infecciones
parasitarias, bacterianas o virales.
También se proporciona una célula dendrítica
transducida con un virus de la invención. Tal célula puede usarse
en un método de tratamiento de enfermedades ex vivo, por
ejemplo, de malignidades o de infección por patógenos virales o
bacterianos. Por consiguiente, la presente invención proporciona el
uso ex vivo de una célula dendrítica, infectada con un virus
herpes simplex atenuado capaz de infectar eficazmente una célula
dendrítica, sin impedir que se produzca el procesamiento de
antígenos en el interior de la célula infectada, en la fabricación
de un medicamento para usar en un método de estimulación de una
respuesta inmune, comprendiendo el método infectar células
dendríticas con un virus de la invención.
Un virus atenuado de la invención es capaz de
infectar eficazmente células dendríticas sin impedir que se
produzca el procesamiento de antígenos en el interior de la célula
infectada. Un virus de la invención es preferiblemente capaz de
infectar al menos el 40% de las células a una multiplicidad de
infección de 1, más preferiblemente al menos el 50, 60, 70 u 80% de
las células. El nivel o la eficacia de la expresión obtenida en una
célula individual usando un virus de la invención variará
dependiendo del polipéptido(s) que se exprese y de la
secuencia(s) de control unida operativamente al gen que
codifica el polipéptido(s), pero típicamente será al menos
tan eficaz como la que se obtiene usando un virus de tipo silvestre.
Además, el virus de la invención presenta una baja toxicidad para
las células infectadas. Preferiblemente, la supervivencia celular
post-infección será de la menos el 50% a un día
post-infección, más preferiblemente de al menos el
60, 70, 80 o 90% a un día post-infección.
Para conseguir una toxicidad reducida al tiempo
que se mantiene una infección eficaz de y el procesamiento de
antígenos en las células dendríticas, un virus de la invención
carecerá típicamente de un gen UL43 funcional y de un gen
vhs funcional (en HSV) o de homólogos o equivalentes
funcionales de los mismos en otras especies virales. Pueden
generarse mutaciones adicionales para reducir más la toxicidad del
virus, por ejemplo, mediante la inclusión de una mutación en el gen
que codifica vmw65 de tal modo que minimice la actividad de
transactivación de la proteína, y/o mediante la inclusión de una
mutación inactivante en el gen que codifica ICP34.5. Como
alternativa, o adicionalmente, el virus contendrá mutaciones que
minimicen la expresión de genes tempranos inmediatos del virus,
opcionalmente junto con mutaciones adicionales. Tal virus de la
invención puede mutarse también típicamente en ICP27, ICP4 y con
una mutación en vmw65 que minimice la actividad de transactivación
de la proteína, o alternativamente mutarse para cada uno de los
genes que codifican ICP4, ICP27, ICP0 e ICP22. Un virus de la
invención puede mutarse además para el gen que codifica ICP47.
Aunque se ha ejemplificado la presente invención
usando virus herpes simplex, se entenderá que pueden modificarse
otros virus de la familia herpesviridae para conseguir una toxicidad
reducida al tiempo que se mantiene una infección eficaz de y el
procesamiento de antígenos en células dendríticas. En particular,
cuando existan genes homólogos de los genes de HSV descritos
anteriormente (especialmente UL43 y vhs) en otras especies
de herpesvirus, entonces se modificarán estos homólogos. Como
alternativa, o adicionalmente, se prefieren especialmente virus con
mutaciones en los genes tempranos inmediatos o con mutaciones que
dan como resultado una expresión de genes tempranos inmediatos
reducida. El término "homólogo" se refiere a un gen que
presenta una homología de secuencia, ya sea homología de secuencia
de aminoácidos o de ácidos nucleicos, con el gen de HSV
correspondiente. Típicamente, un homólogo de un gen de HSV tendrá
una identidad a nivel de aminoácidos de al menos el 15%,
preferiblemente de al menos el 20%, con el gen de HSV
correspondiente. Por ejemplo el gen, prv43 de un herpesvirus
porcino, el virus de la pseudorrabia, tiene una identidad del 23%
con UL43 (Powers et al., 1994).
Se conocen bien en la técnica métodos para medir
la homología de ácidos nucleicos y de proteínas. Por ejemplo, el
UWGCG Package proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para
calcular la homología (Devereux et al (1984) Nucleic
Acids Research 12: 387-395).
De manera similar, pueden usarse los algoritmos
PILEUP y BLAST para alinear secuencias (por ejemplo, como se
describe en Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol., 36:
290-300; Altschul, S. F. et al (1990) J.
Mol. Biol. 215: 403-10). Está disponible
públicamente un software para realizar un análisis de BLAST a través
del Centro Nacional para la Información Biotecnológica
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Son posibles muchos ajustes diferentes para
tales programas. De acuerdo con la invención, pueden usarse los
ajustes por defecto.
Pueden identificarse homólogos de genes de HSV
de varias formas, por ejemplo, sondado bibliotecas genómicas o de
ADNc generadas a partir de otros virus con sondas que comprenden la
totalidad o parte del gen de HSV en condiciones de rigurosidad
media a alta (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M, y citrato sódico
0,03 M, a de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC). Como
alternativa, pueden obtenerse también homólogos de especie usando
PCR degenerada que usará cebadores diseñados para secuencias diana
dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de
aminoácidos conservadas. Los cebadores contendrán una o más
posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de rigurosidad
menores que las usadas para clonar secuencias con cebadores de
secuencia única contra secuencias conocidas (por ejemplo, cloruro
sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a aproximadamente 40ºC).
Por razones de seguridad, los virus de la
invención están atenuados, típicamente de tal modo que son incapaces
de replicarse eficazmente en la célula diana. Las regiones virales
alteradas con el fin de la atenuación pueden eliminarse
(completamente o parcialmente), o hacerse no funcionales o
sustituirse por otras secuencias, en particular por una secuencia
génica heteróloga. Se han descrito mutaciones atenuantes para todos
los grupos virales que se usan como vectores virales. Por ejemplo,
el HSV puede volverse avirulento mediante mutaciones en ICP34.5 y/o
en genes esenciales tales como ICP4 e ICP27.
Cuando el virus de la invención es un virus
herpes simplex, el virus puede obtenerse a partir de, por ejemplo,
cepas de HSV1 o de HSV2, o de derivados de las mismas,
preferiblemente de HSV1. Los derivados incluyen recombinantes
inter-tipo que contienen ADN de cepas de HSV1 y de
HSV2. Los derivados tienen preferiblemente al menos el 70% de
homología de secuencia con el genoma de HSV1 o de HSV2, más
preferiblemente al menos el 80%, aún más preferiblemente al menos
el 90 ó 95%, medida típicamente mediante los métodos descritos en
este documento. Otros derivados que pueden usarse para obtener los
virus de la presente invención incluyen cepas que ya contienen
mutaciones en genes que se desea inactivar funcionalmente en un
virus de la invención, por ejemplo, la cepa 1716 (MacLean et
al., 1991), las cepas R3616 y R4009 (Chou y Roizman, 1992) y
R930 (Chou et al., 1994), que tienen todas mutaciones en
ICP34.5, la cepa d120 que tiene una deleción en ICP4 (DeLuca et
al., 1985), la cepa d27-1 (Rice y Knipe, 1990)
que tiene una deleción en ICP27, o la cepa d92 que tiene deleciones
tanto en ICP27 como en ICP4 (Samaniego et al., 1995). El uso
de estas cepas reducirá el número de etapas que se requieren para
producir las cepas mutantes de HSV de la presente invención.
La terminología usada para describir los
diversos genes de HSV es la que se encuentra en Coffin y Latchman,
1996.
Cuando los virus herpes simplex de la invención
carecen de un gen esencial funcional particular, por ejemplo, un
gen que codifica ICP4 o ICP27, el virus de la invención se propaga
usando una línea celular que exprese ese gen esencial. Por ejemplo,
cuando el virus carece de un gen ICP27 funcional, el virus puede
propagarse usando células V27 (Rice y Knipe, 1990), células
2-2 (Smith et al., 1992) o células B130/2
(documento WO98/30707), preferiblemente células B130/2. Cuando el
virus carece de un gen ICP4 funcional, el virus puede propagarse
usando una línea celular que exprese ICP4, por ejemplo células E5
(DeLuca, et al., 1985). Cuando el virus carece de un gen
ICP4 funcional y de un gen ICP27 funcional, el virus se propaga
usando una línea celular que exprese tanto ICP4 como ICP27 (tal
como células E26; Samaniego et al., 1995), y cuando el virus
además carece de un gen vmw65 funcional, el virus puede propagarse
usando una línea celular que también contenga un homólogo de vmw65
que no sea de HSV (por ejemplo, el gen 12 de herpesvirus equino o el
BTIF de herpesvirus bovino).
Pueden producirse líneas celulares que expresen
ICP27 co-transfectando células de mamíferos, por
ejemplo, las células Vero o BHK, con un vector, preferiblemente un
vector plasmídico, que comprenda un gen ICP27 de HSV funcional
capaz de expresarse en dichas células y con un vector,
preferiblemente un vector plasmídico, que codifique un marcador
seleccionable, por ejemplo de resistencia a neomicina. Después, los
clones que posean el marcador seleccionable se seleccionan además
para determinar qué clones expresan también ICP27 funcional, por
ejemplo, en base a su capacidad para permitir el crecimiento de
cepas ICP27^{-} de HSV, usando métodos conocidos por los
especialistas en la técnica (por ejemplo, como se describe en Rice y
Knipe, 1990).
Se producen, como se ha descrito anteriormente,
líneas celulares que no permitan la reversión de una cepa mutante
ICP27^{-} de HSV a un cepa con ICP27 funcional, asegurándose de
que el vector que comprende un gen ICP27 funcional no contenga
secuencias que solapen con (es decir, que sean homólogas a) las
secuencias restantes del virus mutante ICP27^{-}.
Cuando las cepas de HSV de la invención
comprenden modificaciones inactivantes en otros genes esenciales,
por ejemplo en ICP4, las líneas celulares complementarias
comprenderán un gen de HSV funcional que complemente al gen
esencial modificado de la misma manera que se describe para ICP27.
Por ejemplo, en el caso de cepas de HSV que comprenden mutaciones
tanto en ICP27 como en ICP4, se usa una línea celular que exprese
tanto ICP27 como ICP4 (tal como células E26 (Samaniego et
al., 1995)). Pueden construirse cepas de HSV que expresen otros
genes esenciales de manera similar a la descrita para ICP27.
Los diversos genes virales a los que se hace
referencia pueden volverse funcionalmente inactivos mediante
diversas técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden
volverse funcionalmente inactivos mediante deleciones,
sustituciones o inserciones, preferiblemente mediante deleción. Las
deleciones pueden eliminar porciones de los genes o el gen
completo. Por ejemplo, puede generarse una deleción de un solo
nucleótido, dando lugar a un cambio en una fase de lectura. Sin
embargo, preferiblemente se realizan deleciones más grandes, por
ejemplo de al menos el 25%, más preferiblemente de al menos el 50%
de la secuencia codificante y no codificante total (o como
alternativa, en términos absolutos, de al menos 10 nucleótidos, más
preferiblemente de al menos 100 nucleótidos, más preferiblemente de
al menos 1000 nucleótidos). Se prefiere particularmente eliminar el
gen completo y algunas de las secuencias flanqueantes. Las
secuencias insertadas pueden incluir los genes heterólogos
descritos a continuación. En particular, se prefiere insertar el gen
heterólogo en ICP27 o ICP4. En el caso del gen VMW65, no se
deleciona el gen completo ya que codifica una proteína estructural
esencial, pero se realiza una pequeña mutación inactivante que
suprime la capacidad de VMW65 de activar transcripcionalmente genes
IE (por ejemplo, como en Ace et al., 1989 o en Smiley et
al., 1997).
Se realizan mutaciones en los herpesvirus
mediante métodos de recombinación homóloga bien conocidos por los
especialistas en la técnica. Por ejemplo, se transfecta ADN genómico
de HSV junto con un vector, preferiblemente un vector plasmídico,
que comprende la secuencia mutada flanqueada por secuencias
homólogas de HSV. La secuencia mutada puede comprender deleciones,
inserciones o sustituciones, pudiendo todas generarse mediante
técnicas de rutina. Las inserciones pueden incluir genes marcadores
seleccionables, por ejemplo lacZ o GFP, para seleccionar virus
recombinantes mediante, por ejemplo, actividad
\alpha-galactosidasa o fluorescencia.
Los virus de la invención pueden modificarse
para que lleven un gen o genes heterólogos. El término "gen
heterólogo" incluye a cualquier gen. Aunque un gen heterólogo es
típicamente un gen que no está presente en el genoma de un
herpesvirus, puede usarse un gen de herpes a condición de que la
secuencia codificante no esté unida operativamente con las
secuencias de control viral con las que se asocia de forma natural.
El gen heterólogo puede ser cualquier variante alélica de un gen de
tipo silvestre o puede ser un gen mutante. El término "gen" se
pretende que abarque secuencias de ácidos nucleicos que son capaces
de al menos transcribirse. Por lo tanto, se incluyen en esta
definición secuencias que codifican ARNm, ARNt y ARNr. Sin embargo,
la presente invención se ocupa de la expresión de polipéptidos más
que de ARNt y ARNr. Opcionalmente, las secuencias que codifican
ARNm incluirán algunas o todas las secuencias flanqueantes 5' y/o 3'
que se transcriben pero no se traducen asociadas de forma natural,
o de otra forma, con la secuencia codificante traducida. Además,
pueden incluir opcionalmente las secuencias de control
transcripcional asociadas que se asocian normalmente con las
secuencias transcritas, por ejemplo señales de parada
transcripcionales, sitios de poliadenilación y elementos
potenciadores cadena abajo.
El gen o genes heterólogos pueden insertarse en
el genoma viral mediante recombinación homóloga de cepas de HSV
con, por ejemplo, vectores plasmídicos que lleven el gen o genes
heterólogos flanqueados por secuencias de HSV. El gen o genes
heterólogos pueden introducirse en un vector plasmídico adecuado que
comprenda secuencias de herpesvirus usando técnicas de clonación
bien conocidas en la técnica. El gen o genes heterólogos pueden
insertarse en el genoma viral en cualquier localización a condición
de que el virus pueda todavía propagarse. Se prefiere que el gen o
genes heterólogos se inserten en un gen esencial. Pueden insertarse
genes heterólogos en múltiples localizaciones dentro del genoma del
virus.
Las secuencias transcritas del gen o genes
heterólogos están preferiblemente unidas operativamente a una
secuencia de control que permite la expresión del gen o genes
heterólogos en células dendríticas, preferiblemente en células
dendríticas de mamíferos, más preferiblemente en células dendríticas
humanas. La expresión "unidos operativamente" se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una
relación que les permite funcionar de la manera que se pretende.
Una secuencia de control "unida operativamente" a una
secuencia codificante está ligada de tal modo que la expresión de la
secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la
secuencia de control.
La secuencia de control comprende un promotor
que permite la expresión del gen o genes heterólogos y una señal
para la terminación de la transcripción. El promotor se selecciona
de entre promotores que son funcionales en mamíferos,
preferiblemente en células dendríticas humanas. El promotor o
promotores pueden obtenerse a partir de secuencias de promotores de
genes eucariotas. Por ejemplo, pueden obtenerse promotores a partir
del genoma de una célula en la que se produzca expresión del gen
heterólogo, preferiblemente de una célula dendrítica de mamíferos
o, más preferiblemente, de una célula dendrítica humana. Con
respecto a los promotores eucariotas, pueden ser promotores que
funcionen de manera ubicua (tal como los promotores de
\beta-actina y de tubulina) o, como alternativa,
de manera específica de tejido (tal como los promotores de los genes
de la piruvato quinasa). Puede haber también promotores que
respondan a estímulos específicos, por ejemplo, promotores que se
unan a receptores de hormonas esteroides. Pueden usarse también
promotores virales, por ejemplo, el promotor de la repetición
terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (LTR de
MMLV) o promotores de genes de herpesvirus.
El promotor LAT de HSV y los promotores que
contienen elementos de la región promotora LAT, pueden preferirse
especialmente debido a la posibilidad de conseguir expresión de
genes heterólogos de larga duración durante la latencia. En
particular, se prefiere especialmente un casete de expresión
constituido esencialmente por una región LAT P2, que no actúa aquí
en sí como promotor, unida a un promotor y a un gen heterólogo, por
ese orden.
Los términos "expresión de larga duración"
se refieren a la expresión de un gen heterólogo en una célula
infectada con un virus herpes simplex de la invención incluso
después de que el virus herpes simplex haya entrado en latencia.
Preferiblemente, esto se produce durante el menos dos semanas, más
preferiblemente al menos uno o dos meses después de la infección,
aún más preferiblemente durante la vida de la célula.
Los casetes de expresión pueden comprender
además un segundo promotor y un segundo gen heterólogo unido
operativamente, por ese orden, a dicha región LAT P2 de HSV y en
orientación opuesta al primer promotor y al primer gen heterólogo,
en los que dicho segundo promotor y dicho segundo gen heterólogo son
los mismos o distintos del primer promotor y del primer gen
heterólogo. Por lo tanto, un par de construcciones promotor/gen
heterólogo en orientaciones opuestas flanquean una sola región LAT
P2, permitiendo la expresión de larga duración de parejas de genes
heterólogos, que pueden ser iguales o diferentes, dirigidos por el
mismo o por diferentes promotores. Además, el producto del primer
gen heterólogo puede regular la expresión del segundo gen heterólogo
(o viceversa) en condiciones fisiológicas adecuadas.
Pueden generarse casetes de expresión y otras
construcciones adecuadas que comprendan el gen o genes heterólogos
y las secuencias de control usando técnicas de clonación de rutina
conocidas por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - a laboratory
manual; Cold Spring Harbor Press). La región LAT P2 se define en
este documento como los nucleótidos 118866-120219 de
HSV1 de la cepa 17+ de HSV (GenBank HE1CG: de los sitios
PstI-BstXI) e incluye fragmentos o derivados de esta
región, incluyendo regiones homólogas de otras cepas de HSV1 y de
cepas de HSV2 que sean capaces de proporcionar una capacidad de
expresión de larga duración a los promotores a los que se unan.
También puede ser ventajoso que los promotores
sean inducibles de manera que los niveles de expresión del gen
heterólogo puedan regularse durante la vida de la célula. El término
inducible significa que los niveles de expresión que se obtienen
usando el promotor pueden regularse. Por ejemplo, en una realización
preferida en la que se inserta más de un gen heterólogo en el
genoma de HSV, un promotor comprenderá un promotor sensible al
represor tet/proteína de fusión activadora de la trascripción VP16,
descrito anteriormente (Gossen y Bujard, 1992, Gossen et
al., 1995), y dirigirá la expresión del gen heterólogo que debe
regularse. El segundo promotor comprenderá un promotor potente (por
ejemplo, el promotor IE de CMV) que dirija la expresión del
represor tet/proteína de fusión VP16. Por lo tanto, en este ejemplo,
la expresión del primer gen heterólogo dependerá de la presencia o
ausencia de
tetraciclina.
tetraciclina.
Además, puede modificarse cualquiera de estos
promotores mediante la adición de secuencias reguladoras
adicionales, por ejemplo, secuencias potenciadoras (incluyendo
elementos de la región LAT de HSV). También pueden usarse
promotores quiméricos que comprendan elementos de la secuencia de
dos o más promotores diferentes descritos anteriormente, por
ejemplo, un promotor de fusión LTR de MMLV/LAT (Lokensgard et
al., 1994) o promotores que comprenden elementos de la región
LAT (véase la referencia anterior).
Típicamente, los genes heterólogos codifican
polipéptidos de uso terapéutico. Por ejemplo, para estimular una
respuesta inmune específicamente contra un tumor particular, será
deseable transfectar células dendríticas con un virus de la
invención que dirija la expresión de un antígeno o antígenos
tumorales. Un antígeno tumoral puede ser específico de una célula
tumoral o puede estar presente a mayores niveles en esa célula
tumoral que en una célula no tumoral de ese tipo, por ejemplo,
debido a la sobrerregulación de la expresión del antígeno. En
particular, se prefiere que el antígeno o antígenos tumorales se
expresen en la superficie de la célula tumoral, por ejemplo, un
receptor de superficie celular o una proteína de adhesión celular.
Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen el producto génico
MUC-1 (Gendler et al., 1990) que se
sobreexpresa en varios tumores incluyendo cánceres de ovario, y las
proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano, que se asocian con el
cáncer cervical. Se prefieren particularmente antígenos tumorales
que desencadenen respuestas de células T.
Los genes heterólogos pueden codificar también
un polipéptido que sea capaz de modificar una respuesta inmune, por
ejemplo, citocinas (tales como interferón \alpha, \beta o
\gamma, interleucinas incluyendo IL-1 e
IL-2, factor de necrosis tumoral o factores de
crecimiento de tipo insulina I o II) u otras proteínas
inmunomoduladoras.
Los genes heterólogos pueden codificar también
polipéptidos antigénicos para usar como vacunas. Preferiblemente,
tales polipéptidos antigénicos se obtienen a partir de organismos
patógenos, por ejemplo parásitos, bacterias o virus. Los ejemplos
de tales polipéptidos antigénicos incluyen antígenos del virus de la
hepatitis C, antígenos de la superficie o del núcleo de la
hepatitis B, antígenos del HIV, antígenos de malaria, toxina
pertussis, toxina del cólera o toxina de la difteria.
Los genes heterólogos pueden incluir también
genes marcadores (por ejemplo, que codifican
\beta-galactosidasa o proteína verde
fluorescente) o genes cuyos productos regulan la expresión de otros
genes (por ejemplo, factores de regulación transcripcional
incluyendo el represor tet/proteína de fusión activadora de la
transcripción VP16, descrito anteriormente).
La terapia génica y otras aplicaciones
terapéuticas pueden requerir la administración de múltiples genes.
La expresión de múltiples genes puede ser ventajosa en el
tratamiento de diversas afecciones. Los herpesvirus son
excepcionalmente apropiados ya que no tienen las capacidades de
empaquetamiento limitadas de otros sistemas de vectores virales.
Por lo tanto, pueden integrar en su genoma múltiples genes
heterólogos. Existen, por ejemplo, al menos dos maneras de
conseguir esto. Por ejemplo, puede introducirse más de un gen
heterólogo y las secuencias de control asociadas en una cepa
particular de HSV en un único sitio o en múltiples sitios del
genoma viral. También es posible usar parejas de promotores
(promotores iguales o diferentes) en orientaciones opuestas entre
sí, dirigiendo cada uno de estos promotores la expresión de un gen
heterólogo (genes heterólogos iguales o diferentes), como se ha
descrito anteriormente.
Pueden aislarse o prepararse células dendríticas
por varios medios, por ejemplo, pueden purificarse directamente a
partir de sangre periférica o generarse a partir de células
precursoras CD34+, por ejemplo, después de su movilización hacia
sangre periférica mediante el tratamiento con G-CSF
o directamente a partir de la médula ósea. Pueden tratarse
precursores adherentes de sangre periférica con una mezcla de
GM-CSF/IL-4 (Inaba et al.,
1992) o pueden tratarse células CD34+ no adherentes de médula ósea
con GM-CSF y con TNF-\alpha (Caux
et al., 1992). Pueden prepararse rutinariamente DC a partir
de sangre periférica de voluntarios humanos, de manera similar al
método de Sallusto y Lanzavecchia, 1994, usando células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) purificadas y tratando
las células adherentes durante dos horas con GM-CSF
e IL-4. Después, se separan de las células B CD19+
y de las células T CD3+ y CD2+ usando perlas magnéticas (véase
Coffin et al., 1998). También pueden usarse otros métodos
para la preparación de células dendríticas.
Pueden usarse virus de la invención y células
dendríticas infectadas con virus de la invención en métodos de
terapia. En particular, pueden usarse virus de la invención y
células dendríticas infectadas con virus de la invención que
expresen antígenos tumorales en métodos para tratar el cáncer.
Específicamente, pueden usarse los virus de la invención y las
células dendríticas infectadas con virus de la invención para
inhibir el desarrollo de diversos tumores en mamíferos, incluyendo
seres humanos, tales como, por ejemplo, tumores ovárico, cervical y
endometrial, y carcinomas, por ejemplo, carcinoma mamario, carcinoma
pulmonar, carcinoma de vejiga y carcinoma de colon. Otras
neoplasias cuyo desarrollo puede inhibirse incluyen sarcomas, por
ejemplo, sarcomas de tejidos blandos y óseos, y malignidades
hematológicas tales como leucemias. Los ejemplos particulares de
cánceres que pueden tratarse usando un virus de la invención y/o
células dendríticas infectadas con un virus de la invención que
expresen antígenos tumorales incluyen melanomas, leucemias, cánceres
cervicales y cánceres ováricos.
Pueden usarse virus de la invención y células
dendríticas infectadas con virus de la invención en métodos de
tratamiento o de prevención de infecciones patógenas, por ejemplo,
infecciones parasitarias, bacterianas o virales. En este caso,
pueden administrarse los virus o células dendríticas antes de la
infección para estimular una respuesta inmune protectora en el
hospedador, o después de la infección para estimular el sistema
inmune del hospedador para combatir la infección.
Por lo tanto, los herpesvirus de la presente
invención pueden usarse para administrar genes terapéuticos a un
ser humano o a un animal que necesite tratamiento. Puede usarse la
administración de genes terapéuticos usando los herpesvirus de la
invención para tratar, por ejemplo, malignidades e infecciones
patógenas.
Un método para llevar a cabo la terapia implica
insertar el gen o genes terapéuticos en el genoma del herpesvirus
de la invención, como se ha descrito anteriormente, y después
combinar el virus recombinante resultante con un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen
soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina
tamponada con fosfato. La composición puede formularse para la
administración por vía parenteral, intramuscular, intravenosa,
subcutánea o transdérmica.
La infección de células dendríticas con el virus
de la invención puede realizarse in vivo mediante la
administración de una composición que comprende el virus a un
paciente. La composición farmacéutica se administra de tal modo que
el virus que contiene el gen o genes terapéuticos pueda incorporarse
en las células de un área apropiada. La cantidad de virus
administrado está en el intervalo de 10^{4} a 10^{10} ufp,
preferiblemente de 10^{5} a 10^{8} ufp, más preferiblemente de
aproximadamente 10^{6} a 10^{7} ufp. Cuando se inyecta, se
administran típicamente de 10 \mul a 1 ml, preferiblemente de 100
\mul a 1 ml de virus en un vehículo o diluyente adecuado
farmacéuticamente aceptable.
Otro método implica aislar o preparar células
dendríticas a partir de sangre periférica o de médula ósea e
infectar las células con el virus de la invención in vitro.
Después, típicamente, se administran células dendríticas
transducidas al paciente mediante inyección por vía intramuscular,
intraperitoneal, subcutánea o intravenosa, o mediante inyección
directa en los ganglios linfáticos del paciente, preferiblemente
mediante inyección directa en los ganglios linfáticos. Típicamente,
se administran al paciente de 10^{4} a 10^{8} células
dendríticas transducidas, preferiblemente de 10^{5} a 10^{7}
células, más preferiblemente aproximadamente 10^{6} células.
Las vías de administración y dosificaciones
descritas se pretende sólo que sirvan de guía, ya que un
especialista será capaz de determinar fácilmente la vía óptima de
administración y la dosificación para un paciente particular
dependiendo de, por ejemplo, la edad, el peso y el estado del
paciente.
La invención se describirá con referencia a los
siguientes ejemplos, que se pretende sólo que sean ilustrativos,
pero no limitantes.
Todas las cepas de virus derivan de la cepa 17+
de HSV1, cuya secuencia de nucleótidos está depositada en el
GenBank (Nº de Acceso HE1CG). Todas las cepas se produjeron y se
propagaron usando células BHK C-21 (ECACC Nº
8501143), excepto las cepas 17+/27-/pR20 y 1764/27-/pR20.5/vhs que
se desarrollaron en células B130/2 (células BHK transfectadas de
manera estable con el gen ICP27 de HSV1) y la cepa
1764/27-4-/pR20.5 que se propagó usando células
transfectadas de manera estable con los genes que codifican ICP27 e
ICP4 de HSV1 y el gen 12 de herpesvirus equino. El gen 12 de EHV es
el homólogo en el EHV del gen vmw65 de HSV, que se ha descubierto
que cuando se incluye en líneas celulares puede compensar las
deficiencias de desarrollo asociadas con la mutación de vmw65,
aunque el producto proteico del gen 12 de EHV no se empaqueta
después en los viriones de HSV resultantes, como ocurriría en el
caso de que se incluyera el gen vmw65 de HSV inalterado en las
células usadas para el desarrollo del virus. Tales células se
generaron como sigue: se transfectaron (mediante el método de
Gorman, 1985) células BHK (cultivadas en DMEM + FCS al 10%, ambos
de Gibco, a 37ºC/CO_{2} al 5%) en placas de 10 cm con plásmidos
que contienen el gen 12 de EHV (Lewis J. B., et al., (1997)
Virology, 230, 369-375) bajo el control de un
promotor de CMV y de una secuencia BGHpA (pcDNA3/E) y con un
plásmido que codifica ICP27 (pSG130BS [Sekulovich et al
1988]). Después de la selección con neomicina, se seleccionaron los
clones resistentes a neomicina, se evaluó su capacidad para
permitir el crecimiento de HSV mutado para ICP27 y vmw65 y se
seleccionó un clon muy permisivo. Para introducir ICP4, se produjo
una línea celular resistente a pleomicina/neomicina a partir de
estas células BHK que contienen el gen 12 de EHV e ICP27, en las que
ICP4 estaba dirigido por el promotor MMTV inducible con
dexametasona y un poli A SV40 (usando un plásmido pMAMzeo/ICP4).
Para la construcción de pMAMzeo/ICP4 se reemplazó el gen de la
resistencia a neomicina (escindiéndolo como un fragmento de BamHI)
del plásmido pMAMneo (Invitrogen) por el gen de la resistencia a
pleomicina, como un fragmento de BamHI del pVgRXR (Invitrogen).
Después, se insertó la región codificante de ICP4 (nucleótidos
127.167-131.187 [MseI-BstEII] de
HSV1, GenBANK archivo he1cg) después del promotor MMTV en el sitio
XhoI. Después de la transfección en células que contienen ICP27/gen
12 de EHV y su selección con pleomicina (Zeocina; Cayla, Toulouse,
Francia), se seleccionó entonces un clon muy permisivo para el
desarrollo de HSV mutado para ICP4, ICP27
y vmw65.
y vmw65.
Para virus con mutaciones en VMW65, se incluyó
hexametilen-bisacetamida (HMBA) 3 mM en el medio
usado para el desarrollo del virus (McFarlane et al.,
1992).
Se insertó un casete de un plásmido pR20.5
constituido por una secuencia RSV/lacZ/pA y una secuencia
CMV/
GFP/pA contiguas pero en orientaciones opuestas y separadas por una secuencia de región LAT de HSV (nucleótidos 118.886-120.219) en el locus UL43 mediante recombinación homóloga con ADN genómico purificado de la cepa 17+ de HSV1 por métodos convencionales. El casete de pR20.5 se insertó primero en un plásmido que contenía las regiones flanqueantes de UL43 (Coffin et al., 1996) en el único sitio NsiI, dando lugar al plásmido pR20.5/43. El casete 20.5 puede escindirse de la estructura del plásmido pGEM5 (Promega) con SrfI, ya que se insertó un oligonucleótido que codificaba SrfI en cualquiera de los dos lados del casete. Se escindió el promotor de RSV del pRc/RSV (Invitrogen), el lacZ/pA del pCH110 (Pharmacia), el CMV/pA del pcDNA3 (Invitrogen) y el GFP del pEGFP-N1 (Clontech) para construir el plásmido pR20.5.
GFP/pA contiguas pero en orientaciones opuestas y separadas por una secuencia de región LAT de HSV (nucleótidos 118.886-120.219) en el locus UL43 mediante recombinación homóloga con ADN genómico purificado de la cepa 17+ de HSV1 por métodos convencionales. El casete de pR20.5 se insertó primero en un plásmido que contenía las regiones flanqueantes de UL43 (Coffin et al., 1996) en el único sitio NsiI, dando lugar al plásmido pR20.5/43. El casete 20.5 puede escindirse de la estructura del plásmido pGEM5 (Promega) con SrfI, ya que se insertó un oligonucleótido que codificaba SrfI en cualquiera de los dos lados del casete. Se escindió el promotor de RSV del pRc/RSV (Invitrogen), el lacZ/pA del pCH110 (Pharmacia), el CMV/pA del pcDNA3 (Invitrogen) y el GFP del pEGFP-N1 (Clontech) para construir el plásmido pR20.5.
El casete del pR20.5 se insertó en el locus US5
de HSV1 mediante inserción del casete pR20.5 en las regiones
flanqueantes de US5 (plásmido p\DeltaUS5) generando el plásmido
pR20.5/US5 seguido de la recombinación homóloga junto con ADN
genómico purificado de la cepa 17+ de HSV1 en células BHK, dando
lugar a la cepa vírica 17+/pR20.5/US5. El plásmido p\DeltaUS5 se
preparó clonando un fragmento BamHI-EcoNI
(nucleótidos 136.289-131.328) del HSV1, que incluye
la región codificante de US5, en un plásmido pAT153. Se insertó el
pR20.5 en un sitio único SacI en el nucleótido 137.945 del gen
US5.
Se usó un plásmido pR20 para la recombinación
homóloga con ADN purificado de la cepa 17+ de HSV. El plásmido pR20
contiene un casete LAT P2 (nucleótidos
118866-120219)/CMV/lacZ insertado en las regiones
flanqueantes de ICP27 (nucleótidos 11095-113273 y
nucleótidos 116869-118439 del HSV1 en el pACYC184
[NBL] permitiendo la inserción en el sitio único MluI que une los
dos fragmentos). Se purificaron las placas que expresaban lacZ
usando células B130/2.
Se usó un plásmido pR20.5/43 para la
recombinación homóloga con ADN purificado de la cepa 1764 de HSV
(Coffin et al., 1996) y la purificación en placa de las
placas que expresen GFP y LacZ. La cepa 1764 de HSV es la cepa 17+
de la que se han delecionado ambas copias de ICP34.5 y con una
mutación inactivante en el gen de VMW65 (Ace et al,
1989).
Se usó un plásmido pR20.5/5 para la
recombinación homóloga con ADN purificado de la cepa 1764 de HSV y
la purificación en placa de las placas que expresen GFP y LacZ.
Se usó un plásmido pR15 para la recombinación
homóloga con el gen de la proteína "virion host shutoff" (UL41)
de la cepa in1814 (Ace et al., 1989). El plásmido pR15
contiene las regiones flanqueantes de vhs con la inserción
de un gen lacZ dirigido mediante un promotor quimérico LAT de
HSV/LTR de MMLV (esencialmente idéntico al descrito por Lokensgard
et al., 1994) en el sitio único NruI del gen UL41. Se
purificaron las placas que expresaban LacZ.
Se usó un plásmido pR15 para la recombinación
homóloga con ADN purificado de la cepa 1764 de HSV, y se purificaron
las placas que expresaban lacZ.
Se insertó el casete pR20.5 en las regiones
flanqueantes de vhs en el sitio único NruI y el plásmido
resultante (pR20.5/vhs) se usó para la recombinación homóloga con
ADN purificado de la cepa 1764/27- de HSV. Se purificaron las
placas que expresaban tanto lacZ como GFP usando células B130/2. Se
generó la cepa 1764/27- a partir de la cepa 1764/27-/pR20 (generada
por recombinación homóloga del plásmido pR20 con ADN de la cepa 1764
de HSV y selección de las placas que expresaban lacZ) mediante
recombinación homóloga para eliminar el gen lacZ, delecionando los
nucleótidos 113322-115743 alrededor del locus de
ICP27.
Se insertó un casete de promotor LTR de MSV/GFP
en las regiones flanqueantes de UL43 en el sitio único NsiI, dando
lugar al plásmido pMSVGFP/43. Después, se usó el pMSVGFP/43 para la
recombinación homóloga con ADN genómico purificado de la cepa
1764/pR15 de HSV y se purificaron las placas que expresaban tanto
lacZ como GFP.
Se generó la cepa de virus 1764/27-/4-/pR20.5
mediante la inserción de un casete constituido por GFP
(E-GFP; Clontech) y lacZ dirigidos por los
promotores de CMV y de RSV, respectivamente, en una orientación
contigua y separados por las secuencias LAT de HSV1
(PstI-BstXI: nucleótidos
118.866-120.219 [PstI-BstXI] GenBank
archivo he1cg) en las regiones flanqueantes de ICP4 (nucleótidos
123.459-126.774 [Sau3aI-Sau3aI] y
131.730-134.792 [SphI-KpnI] de HSV1
con los nucleótidos 124.945-125.723
[NotI-NotI; codifica ICP34.5] delecionados,
separados por sitios únicos XbaI y SalI en el plásmido pDICP4) y la
recombinación con la cepa de virus 1764/27- (véase la referencia
anterior) usando células B4/27 que complementan tanto ICP27 como
ICP4. Se seleccionaron las placas con tinción
X-gal/verdes fluorescentes y se purificaron
adicionalmente. Se preparó la línea celular B4/27 mediante
co-transfección del pSG130BS, del plásmido p4/2 (que
codifica ICP4, promotor y regiones poli A) y del pMAMneo
(Invitrogen) en células BHK. Se seleccionaron después los clones
resistentes a neomicina.
Estos experimentos tenían el objetivo de
determinar si los HSV podían infectar y administrar genes en células
dendríticas, usando esencialmente virus de tipo silvestre. Se
usaron multiplicidades de infección (MOI) de entre 0,1 y 10. Se
infectaron en cada caso 1 x 10^{5} células dendríticas mediante
sedimentación suave, resuspensión en aproximadamente 100 \mul de
suspensión vírica en DMEM, incubación a 37ºC durante 1 hora y
después transferencia a placas de 24 pocillos con 2 ml de RPMI/FCS
al 10% + GM-CSF 100 ng/ml e IL-4 50
ng/ml. Después, estas placas se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 5%
durante el resto del experimento. Se usaron para estos experimentos
virus 17+/pR20.5/UL43 y 17+/pR20.5/US5, cada uno mutado para un gen
diferente (UL43 o US5) mediante la inserción del casete de pR20.5.
Tanto UL43 como US5 se han identificado anteriormente como
innecesarios para el desarrollo de HSV en cultivo y como no
influyentes en la cinética de infección en modelos de ratón in
vivo. Se evaluó la eficacia de la administración de genes
contando células GFP positivas bajo un microscopio de fluorescencia
24 horas después de la infección. Los resultados que se muestran a
continuación en la Tabla 1 demuestran que el HSV puede administrar
genes eficazmente en células dendríticas.
Para determinar si la administración de genes
eficaz observada en el Ejemplo 1 se debía a la replicación lítica
de los virus, se realizaron curvas de desarrollo en las que se
infectaron células dendríticas a MOI que variaban de 0,1 a 10, como
en el Ejemplo 1, y se cuantificó el desarrollo de los virus en el
tiempo. Se titularon muestras de los medios de cultivo a intervalos
de 24 horas en células BHK -que permiten el desarrollo de HSV- y se
contó el número de placas.
Como se muestra en la Tabla 2 anterior, estos
experimentos demostraron que aunque puede producirse una infección
productiva limitada en cultivos de células dendríticas infectadas
con HSV, esto es sólo evidente a MOI bajas (particularmente del
virus con US5 delecionado). La inactivación de UL43 en lugar de US5
reduce adicionalmente esta infección productiva limitada. Parece
que puede producirse una reversión lenta del HSV de tipo silvestre
en cultivos de células dendríticas, que se reduce mediante la
inactivación de UL43, pero que esto no se acompaña de una muerte de
células dendríticas significativa (véase el Ejemplo 3). No se ha
descubierto anteriormente que la inactivación de UL43 afecte a la
cinética de desarrollo del HSV (Maclean et al., 1991).
Se usaron las cepas de virus (i)-(x) descritas
anteriormente para infectar células dendríticas a MOI en un
intervalo de entre 0,1 y 10 como en el Ejemplo 1. Se tomaron
muestras por duplicado (2 x 100 \mul del cultivo) a intervalos y
se visualizó en una muestra la expresión de GFP (microscopía de
fluorescencia) y/o se tiñó con X-gal mediante
sedimentación y resuspensión suave en solución fijadora
(glutaraldehído al 0,8% durante 10 minutos) seguido de tampón de
X-gal (como en Coffin et al., 1996) y de la
incubación a 37ºC durante 2 horas, dependiendo de la naturaleza de
la inserción en el virus particular del ensayo. La otra muestra se
tiñó con azul tripán -excluyendo las células vivas la tinción y
contando el número de células no teñidas como un porcentaje del
número de células en el cultivo original. En cada conjunto
individual de experimentos, que se repitieron dos veces, y en los
que habitualmente se ensayaron tres virus a la vez, se usó virus (i)
como control interno para tener en cuenta cualquier variación entre
las preparaciones de células dendríticas. Se muestran los
resultados para MOI = 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demostraron que diferentes
combinaciones de deleciones de genes proporcionan virus con diversas
combinaciones de eficacia de administración de genes y de carencia
de toxicidad, algunos mejorados para una u otra o para ambas
características en comparación con los virus originales (i) y (ii),
y con otros en los que la eficacia de administración de genes o la
supervivencia celular se redujo. La eliminación de un gen temprano
inmediato esencial (ICP27) parece que dio lugar a virus que eran
aparentemente mínimamente tóxicos, pero en los que la eficacia de
administración de genes estaba considerablemente reducida. Se
descubrió que un virus con una combinación de genes no esenciales
inactivados (ICP34.5, VMW65, vhs y UL43), cada uno de los
cuales se ha demostrado anteriormente que reducen individualmente la
virulencia in vivo (aparte de UL43), proporcionaba la mejor
combinación de eficacia de administración de genes (al menos para
GFP, véase el Ejemplo 4) y de carencia de toxicidad, siendo esta
eficacia de administración de genes considerablemente mayor que la
de cualquiera de los otros virus ensayados. Sin embargo, se demostró
que el virus (x), que también era mínimamente tóxico, proporcionaba
un alto nivel de expresión de ARN de GFP y de lacZ (véase a
continuación), de nivel similar al del virus (ix), aunque podía
detectarse menos GFP por fluorescencia. Transferencias de western
usando anticuerpos anti-ICP2, ICP4, ICP19, ICP22 e
ICP47 de HSV han demostrado anteriormente que este virus expresa
solamente niveles muy bajos de cualquier gen temprano inmediato en
células que no complementan las deficiencias del virus (es decir,
las mutaciones en ICP27, ICP4
y vmw65).
y vmw65).
El virus con UL43, ICP34.5, vhs y VMW65
delecionados proporcionó una administración de GFP muy eficaz. Por
otro lado, aunque la actividad de lacZ estaba presente en muchas
células, sólo estaba presente a muy bajo nivel 24 horas después de
la infección, en los límites de detección con tinción de
X-gal. Esto planteó la posibilidad de que tanto
lacZ como GFP se produjeran eficazmente en las células, a pesar de
que se estaba reduciendo la actividad aparente de lacZ por
procesamiento proteolítico eficaz del antígeno lacZ -como cabría
esperar en una célula dendrítica totalmente funcional. El gen lacZ
se transcribe a partir de un promotor idéntico al de otros de los
virus que no proporcionan una fuerte tinción de
X-gal en células dendríticas. Por lo tanto, si se
está produciendo procesamiento de lacZ en las células, tanto el ARNm
de lacZ como el ARN de GFP deberían ser fácilmente detectables a
niveles relativamente equivalentes por transferencia de northern,
pero los niveles de proteína lacZ por transferencia de western
deberían estar muy reducidos.
Se realizaron transferencias de northern y de
western usando ARN y proteínas (extraídos de 1 x 10^{5}
células/carril en cada caso) de células dendríticas infectadas con
17+/pR20.5/UL43 o con 1764/pR15/MSVGFP/UL43 a una MOI de 1.
Después, se sondaron las transferencias de western con un anticuerpo
anti-lacZ (Promega) o con un anticuerpo
anti-GFP (Quantum). Se sondaron las transferencias
de northern con el gen de lacZ (escindido del pCH110 (Pharmacia)
con HindIII y BamHI) o con el gen de GFP (escindido del
pEGFP-N1 (Clontech) con NotI y HindIII). Se
realizaron transferencias de northern y de western mediante métodos
convencionales (Sambrook et al. 1989) por medios
radioactivos (transferencias de northern) o no radiactivos
(transferencias de western; ECL, Amersham).
Las transferencias de western demostraron:
(i) Detección eficaz tanto de lacZ como de GFP
en células dendríticas infectadas con 17+/pR20.5/UL43. Se observó
una única banda definida del peso molecular esperado en cada caso,
siendo visibles también algunas bandas débiles más pequeñas.
(ii) Como se esperaba con la tinción de
X-gal, mientras que se detectaba fácilmente GFP con
1764/pR15/MSV/GFP/
UL43, los niveles de proteína lacZ del peso molecular esperado se redujeron significativamente.
UL43, los niveles de proteína lacZ del peso molecular esperado se redujeron significativamente.
Las transferencias de northern mostraron una
banda fuerte y definida del tamaño esperado en cada caso, según las
células se infectaron con 17+/pR20.5/UL43 o con
1764/pR15/MSVGFP/UL43.
Estos resultados demuestran que mientras que se
produce eficazmente ARNm de lacZ en células dendríticas después de
la infección tanto con 1764/pR15/MSVGFP/UL43 como con
17+/pR20.5/UL43, para 1764/pR15/MSVGFP/
UL43 este ARN no se traduce o la proteína lacZ se degrada rápidamente después de la traducción, de tal modo que los niveles detectables de proteína de longitud completa por transferencia de western están significativamente reducidos. Considerando el papel de las células dendríticas en el procesamiento de antígenos, es más probable que este último sea el caso, ya que es lo que se esperaría si un antígeno tal administrado se procesara de manera eficaz. No se produce tal procesamiento eficaz de antígenos con los otros mutantes ensayados (distintos de los del Ejemplo 5 a continuación), ya que puede verse una fuerte tinción de X-gal en cada caso. Por lo tanto, para que se produzca el procesamiento de antígenos de un antígeno administrado mediante virus en células dendríticas, debe elegirse cuidadosamente la selección precisa de virus mutante que se usa para la administración.
UL43 este ARN no se traduce o la proteína lacZ se degrada rápidamente después de la traducción, de tal modo que los niveles detectables de proteína de longitud completa por transferencia de western están significativamente reducidos. Considerando el papel de las células dendríticas en el procesamiento de antígenos, es más probable que este último sea el caso, ya que es lo que se esperaría si un antígeno tal administrado se procesara de manera eficaz. No se produce tal procesamiento eficaz de antígenos con los otros mutantes ensayados (distintos de los del Ejemplo 5 a continuación), ya que puede verse una fuerte tinción de X-gal en cada caso. Por lo tanto, para que se produzca el procesamiento de antígenos de un antígeno administrado mediante virus en células dendríticas, debe elegirse cuidadosamente la selección precisa de virus mutante que se usa para la administración.
Como en el ejemplo 4 anterior, se realizaron
transferencias de western y de ARN comparativas (usando
transferencias por ranuras para ARN). Se compararon los niveles de
proteína y de ARN de lacZ y de GFP en los extractos de células
dendríticas infectadas con 17+/pR20.5/UL43, 1764/pR15/MSVGFP/UL43 ó
1764/27-/4-/pR20.5.
Los resultados de este experimento fueron como
en el ejemplo 4 excepto para las células infectadas con
1764/27-4-/pR20.5. En este caso, aunque pudieron
detectarse niveles equivalentes de ARN de GFP y de lacZ como en las
células infectadas con 17+/pR20.5/UL43 y 1764/pR15/MSVGFP/UL43,
sólo pudo detectarse un nivel relativamente bajo de GFP por
transferencia de western, considerablemente menor que con
17+/pR20.5/UL43 ó 1764/pR15/MSVGFP/UL43. Por lo tanto, en el caso
de 1764/27-/4-/pR20.5 pudieron detectarse menores niveles de
proteínas tanto lacZ como GFP (en lugar de sólo menores niveles de
proteína lacZ con 1764/pR15/MSVGFP/UL43, como previamente en el
ejemplo 4), que los que se esperarían teniendo en cuenta la cantidad
de ARN específico de lacZ y de GFP presente, que era similar con
todos los virus ensayados en los ejemplos 4 y 5. Este resultado es
indicativo de que, al contrario que con cualquiera de los otros
virus ensayados, después de la administración de genes con
1764/27-/4-/pR20.5, tanto lacZ como GFP están experimentando un
procesamiento proteolítico tal como se esperaría en una célula
dendrítica funcional. Esto sugiere una funcionalidad adicional sobre
y por encima de la proporcionada después de la administración de
genes usando 1764/pR15/MSVGFP/UL43.
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Claims (29)
1. Un herpesvirus atenuado capaz de infectar
eficazmente una célula dendrítica sin impedir que se produzca el
procesamiento de antígenos en el interior de la célula infectada,
careciendo el virus de un gen UL43 funcional y de un gen vhs
funcional.
2. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1,
que es un virus herpes simplex 1 ó 2.
3. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
1 ó 2, que carece además de un gen ICP34.5 funcional.
4. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, que carece además de un gen VMW65
funcional debido a una mutación en dicho gen que suprime su
actividad de activación transcripcional.
5. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que carece de al menos un gen temprano
inmediato funcional
6. Un virus de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que dicho gen temprano inmediato se selecciona de entre los
genes que codifican ICP0, ICP4, ICP22 e ICP27.
7. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
5 ó 6, que carece tanto de un gen funcional que codifica ICP 4 como
de un gen funcional que codifica ICP27 y que tiene una mutación
inactivante en el gen que codifica VMW65, suprimiendo su actividad
de activación transcripcional.
8. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, que carece de los genes funcionales que
codifican ICP0, ICP4, ICP22 e ICP27.
9. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que carece además de un gen funcional
que codifica ICP47.
10. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que comprende un gen
heterólogo.
11. Un virus de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicho gen heterólogo está unido operativamente a una
secuencia de control que permite la expresión de dicho gen
heterólogo en una célula dendrítica.
12. Una cepa de virus de acuerdo con la
reivindicaciones 10 u 11, en la que dicho gen heterólogo codifica
un polipéptido de uso terapéutico.
13. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho gen heterólogo
codifica un polipéptido cuyo nivel de expresión está aumentado en o
sobre la superficie de células tumorales, en comparación con
células no tumorales; o un polipéptido que está presente en o sobre
la superficie de células tumorales pero ausente en células no
tumorales; o un polipéptido capaz de modificar respuestas
inmunes.
14. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho gen heterólogo
codifica un polipéptido de origen parasitario, viral o
bacteriano.
15. Un virus de acuerdo con la reivindicación
14, en el que el gen heterólogo es un gen de HSV que no está unido
operativamente a las secuencias de control con las que está asociado
de forma natural.
16. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho gen heterólogo
codifica un antígeno tumoral.
17. Un virus de acuerdo con una de las
reivindicaciones 10 a 16, que comprende más de un gen
heterólogo.
18. Una célula dendrítica aislada infectada con
un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17.
19. Una célula dendrítica de acuerdo con la
reivindicación 18, que es una célula dendrítica humana.
20. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 17, o una célula de acuerdo con las
reivindicaciones 18 ó 19, para usar en un método de tratamiento del
cuerpo humano o animal.
21. Uso de un virus de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la fabricación de un
medicamento para usar en un método de estimulación de una respuesta
inmune, comprendiendo el método infectar células dendríticas con
dicho virus.
22. Uso de una célula dendrítica ex vivo
de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, en la fabricación de
un medicamento para estimular una respuesta inmune.
23. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 21 ó
22, en el que dicha respuesta inmune se dirige contra un
polipéptido de origen parasitario, viral o bacteriano.
24. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23, en el que dicha respuesta inmune protege
contra o trata una infección viral.
25. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 21 ó
22, en el que dicha respuesta inmune se dirige contra un antígeno
tumoral.
26. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25, en el que dichas células dendríticas se
aíslan o se preparan a partir de sangre periférica o de médula ósea
y se devuelven al cuerpo después de la infección.
27. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, en el que dichas células dendríticas se
infectan in vivo después de la administración del virus al
cuerpo humano o animal.
28. Un proceso para producir una célula de
acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, que comprende infectar
in vitro una célula dendrítica con un virus de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
29. Una composición farmacéutica que comprende
un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17, o una célula de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, junto
con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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