ES2263862T3

ES2263862T3 - Ensayo de quinasa de linfoma anaplasico, sus reactivos y composiciones.

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Publication number: ES2263862T3
Application number: ES03005186T
Authority: ES
Inventors: Lorenzo A. Pinna; Arianna Donella-Deana; Oriano Marin; Luca Mologni; Rosalind Gunby; Carlo Gambacorti Passerini; Leonardo Scapozza
Original assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Current assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2023-03-07
Also published as: US20070031907A1; JP2006519800A; ATE328112T1; EP1454992B1; DK1454992T3; DE60305634D1; CN1756850A; HK1068154A1; WO2004079326A3; CY1106115T1; CA2518094A1; EP1454992A1; DE60305634T2; SI1454992T1; WO2004079326A2; CN100345978C; PT1454992E; IL170669A0

Abstract

Un procedimiento para detectar la actividad de tirosina-quinasa de ALK, que comprende las siguientes etapas: i) incubar la proteína ALK o un derivado funcional de la misma con un sustrato peptídico que se selecciona de SEC. ID. N.º 1 y 2 en condiciones adecuadas para la fosforilación del péptido; ii) detectar el péptido fosforilado.

Description

Ensayo de quinasa de linfoma anaplásico, sus reactivos y composiciones.

La presente invención proporciona un ensayo para medir la actividad de quinasa de la quinasa de linfoma anaplásico (ALK). Más específicamente la invención se refiere a procedimientos, reactivos y composiciones para detectar la actividad de fosforilación de tirosina de ALK. El ensayo es particularmente útil para la selección e identificación in vitro de inhibidores potenciales de ALK.

Antecedentes de la invención

La quinasa de linfoma anaplásico (ALK) es una tirosina-quinasa receptora, que se cree que desempeña un papel importante en el desarrollo y función del sistema nervioso. La ALK se expresa normalmente en el sistema nervioso central, con una expresión máxima durante el periodo neonatal. Sin embargo, debido a translocaciones cromosómicas, la ALK también se expresa y activa de forma aberrante en algunos cánceres en forma de proteínas de fusión oncógenas. Las proteínas de fusión de ALK son responsables de aproximadamente 5 - 10% de todos los linfomas no hodgkinianos. La incidencia anual de los linfomas positivos para ALK es de aproximadamente 100.000 en todo el mundo, produciéndose 2000 - 3000 casos nuevos en los países de la UE. La ALK es una candidata excelente para la intervención terapéutica, ya que desempeña un papel esencial en la oncogenia y su expresión normal está restringida en su mayoría al sistema nervioso central. Por lo tanto, un inhibidor específico de ALK podría ser un tratamiento eficaz para los linfomas positivos para ALK con pocos efectos secundarios clínicos asociados. Para la identificación de los inhibidores potenciales de ALK es muy deseable desarrollar un ensayo adecuado para evaluar directamente el efecto inhibidor de los compuestos sobre la actividad enzimática.

Descripción de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un ensayo de quinasa in vitro específico para ALK y de utilidad para seleccionar compuestos que modulan la actividad de ALK. Este ensayo se basa en el uso de un sustrato peptídico que es fácilmente fosforilado por ALK y en la detección subsiguiente del producto fosforilado así obtenido. En una realización preferida de la invención el ensayo es un ELISA en el que el producto fosforilado es detectado mediante reacciones inmunoquímicas.

Para generar un sustrato para ALK selectivo, se sintetizaron y analizaron péptidos que reproducían la secuencia del bucle de activación de ALK (aa 1274-1294: ALK_HUMAN, Q9UM73, swiss-PROT). Los péptidos ARDIYRASF
FRKGGCAMLPVK (SEC. ID. N.º 1) y ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK (SEC. ID. N.º 2) fueron particularmente eficaces como sustratos para ALK mostrando un grado de fosforilación mayor que el de poliGlu/Tyr, un polímero aleatorio que se sabe es un buen sustrato para la mayoría de las tirosina-quinasas. El primer objeto de la invención es por lo tanto un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de SEC. ID. N.º 1 y SEC. ID.
N.º 2.

Un objeto adicional de la invención es un procedimiento para detectar la actividad de la tirosina-quinasa ALK, que esencialmente comprende las etapas de:

i) incubar la proteína ALK o un derivado funcional de la misma con un péptido que se selecciona de SEC. ID. N.º 1 y 2 en condiciones adecuadas para la fosforilación del péptido;

ii) detectar el péptido fosforilado así formado.

Tal como se usa en la presente memoria, "derivado funcional de ALK" quiere decir cualquier forma modificada de la proteína ALK, por ejemplo una forma truncada o conjugada o un fragmento de la misma, que mantiene la actividad catalítica de ALK no modificado. El derivado funcional debería preferiblemente contener el dominio catalítico completo de los residuos de ALK que abarca 1116-1392 de la secuencia de ALK (Q9UM73). Preferiblemente se usa la porción de la proteína de ALK que se extiende desde el residuo Leu^{1073} a Ala^{1459}. Cuando se produce por tecnología de recombinación génica usando el sistema de expresión con base de baculovirus, este fragmento de ALK muestra un plegamiento correcto (confirmado por espectros CD) y una actividad catalítica eficaz.

Además, puede usarse una preparación que contiene una forma constitutivamente activa de ALK en lugar de la proteína purificada o su derivado funcional. Tal preparación es preferiblemente un lisado celular, que podría usarse a) para evaluar la actividad de ALK en células enteras que expresan ALK o proteínas de fusión de ALK y b) para evaluar el efecto de inhibidores potenciales sobre ALK en una célula, tratando las células que expresan ALK con compuestos diferentes y después analizando el lisado celular para determinar la actividad de quinasa de
ALK.

Para detectar el péptido fosforilado en la etapa ii), la reacción de fosforilación de la etapa i) puede realizarse en presencia de un reactivo radioactivo, tal como [\gamma^{32}P]ATP o [\gamma^{33}P]ATP, formando así un producto radioactivo que es fácilmente detectado mediante técnicas radiométricas. De forma alternativa, puede realizarse una inmunorreacción, que comprende la formación de un inmunocomplejo entre el péptido fosforilado y un anticuerpo contra fosfotirosina. Este anticuerpo contra fosfotirosina puede marcarse radioactivamente o conjugarse con un enzima testigo, tal como peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina o glucosa oxidasa, permitiendo así la detección directa del anticuerpo y así del péptido fosforilado midiendo la radioactividad o actividad enzimática específica. Como alternativa adicional, el anticuerpo contra fosfotirosina puede detectarse indirectamente con un segundo anticuerpo que reconoce el anticuerpo contra fosfotirosina y que porta un marcador radioactivo o una enzima testigo, o mediante estreptavidina conjugada con una enzima que reconoce un marcador de biotina en el anticuerpo contra fosfo-
tirosina.

En una realización preferida, la invención proporciona un procedimiento para detectar la actividad de tirosina-quinasa de ALK que comprende las etapas de:

a) adherir un péptido de la SEC. ID. N.º 1 ó 2 a una fase sólida;

b) incubar la fase sólida con un fragmento de ALK que se extiende desde Leu^{1073} a Ala^{1459} en condiciones adecuadas para la fosforilación de tirosina;

c) lavar la fase sólida;

d) incubar la fase sólida con un anticuerpo contra fosfotirosina (anticuerpo primario) en condiciones adecuadas para la unión de antígeno y anticuerpo;

e) lavar la fase sólida;

f) incubar la fase sólida con un anticuerpo conjugado con enzimas (anticuerpo secundario) que reconoce el anticuerpo primario contra fosfotirosina en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo primario al anticuerpo secundario, de forma que se forme un inmunocomplejo ternario;

g) lavar la fase sólida;

h) medir la actividad enzimática del inmunocomplejo en el que la actividad medida es proporcional a la cantidad de fosforilación de la tirosina.

Este ensayo, que es realmente un ensayo de quinasa con base de ELISA, utiliza conjugados de enzima y anticuerpo. La enzima conjugada escinde un sustrato generando un producto de reacción con color que puede detectarse espectrofotométricamente midiendo la absorbancia de la solución con color, que es proporcional a la cantidad de fosfotirosinas.

Fases sólidas o soportes que pueden usarse de acuerdo con la invención comprenden un material plástico (placas de reacción, pocillos, viales), poliestireno, retículas, y perlas magnéticas, partículas metálicas coloidales, superficies de vidrio y/o sílice y otros.

El ensayo de ALK con base de ELISA preferiblemente se usa para la selección de compuestos que modulan la actividad de fosforilación de tirosina de ALK, en particular para detectar inhibidores de ALK.

En una realización preferida, la invención por lo tanto se refiere a un procedimiento para la identificación de compuestos que modulan actividad de tirosina-quinasa de ALK, en el que el ensayo de ALK que se describe anteriormente se realiza en presencia de un compuesto candidato o de un compuesto que se sabe que estimula o inhibe la actividad de tirosina-quinasa de ALK (control). Específicamente, el procedimiento para identificar compuestos que modulan la actividad de tirosina-quinasa de ALK comprende las etapas de

i) incubar proteína ALK o un derivado funcional de la misma con un péptido que se selecciona de SEC. ID. N.º 1 ó 2, preferiblemente SEC. ID. N.º 1, en presencia de un compuesto candidato, en condiciones adecuadas para la fosforilación del péptido;

ii) cuantificar el péptido fosforilado así formado;

Los compuestos que inhiben la actividad de ALK se seleccionan como agentes terapéuticos potenciales para usar en el tratamiento de tumores relacionados con ALK, tales como linfomas macrocíticos anaplásicos y linfomas no hodgkinianos. La actividad de modulación de ALK de un compuesto candidato puede compararse con la de un compuesto de referencia (control), que se prueba en las mismas condiciones que el compuesto candidato. Estaurosporina (Meggio F. y cols., Eyr. J. Biochem. (1995) 234, 317-322), que demostró ser eficaz como inhibidor de ALK a una concentración de 0,2 - 0,3 \muM, puede usarse como control positivo cuando se seleccionan otros compuestos por su actividad de inhibición ALK.

\newpage

Los estudios de modelos moleculares proporcionaron indicaciones importantes referentes al patrón de substituciones necesario para mejorar la afinidad y especificidad de la estaurosporina por la proteína ALK. Las estructuras más eficaces se representan en la siguiente fórmula general (I):

1

En las que R1 y R2, independientemente el uno del otro se seleccionan de halógeno, preferiblemente cloro, fenilo o alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; R3 es hidroxilo; R4 es hidroxilo o hidroximetilo; R5 es alquilo C_{1}-C_{3}, opcionalmente sustituido con halo, o bencilo.

Los compuestos de la fórmula (I) actúan como antagonistas de la unión de ATP al dominio de la tirosina-quinasa de ALK en las proteínas de fusión oncógenas tales como NPM-ALK, ATIC-ALK, CTLC-ALK, TGF-ALK u otras fusiones esporádicas con tropomiosinas.

En una realización diferente de la invención, los compuestos (I) se usan en un ensayo de ALK para seleccionar los inhibidores de ALK, tal como se describe en la presente memoria. También pueden implementarse selecciones de gran capacidad usando en ensayo de ALK de la invención.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para llevar a cabo el ensayo de ALK que se describe anteriormente. El kit consiste en una combinación de reactivos envasados en proporciones determinadas. Típicamente, el kit contendrá un péptido de la SEC. ID. N.º: 1 ó 2, opcionalmente inmovilizado sobre una fase sólida, el anticuerpo contra fosfotirosina y, si fuera necesario, un anticuerpo marcado con un marcador enzimático o radioactivo. Además el kit puede contener reactivos para reacciones colorimétricas o radiométricas, tampones, controles tales como estaurosporina o un derivado de la misma, diluyentes, detergentes, estabilizantes y otros muchos componentes de utilidad para preparar y realizar el ensayo. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse para optimizar la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse en preparaciones sólidas o líquidas, tales como solución, suspensión, dispersión, polvos secos, preparación liofilizada. Los componentes del kit se propor-
cionan en un único envase o en envases separados. El kit también puede incluir instrucciones para realizar el ensayo.

Descripción de las figuras

Figura 1

Purificación y actividad de ALK recombinante con marcador de His

A) Gel de SDS al 10%-PAGE con tinción argéntea que muestra el marcador (M), las fracciones de la columna de DEAE dializadas y agrupadas cargadas en la columna HiTrap (carga), las fracciones de la columna HiTrap (los números indican el número de la fracción). B) Ensayo de autofosforilación radioactiva de rALK purificada. Carril 1: autorradiografía de rALK marcada con ^{32}P. Carril 2: tinción argéntea de la misma muestra que en el carril 1.

Figura 2

Cinética para ALK con péptidos

Figura 3

Detección de la actividad de rALK usando el ensayo para quinasa con base de ELISA

A) Fosforilación del péptido de la SEC. ID. N.º 2 por rALK purificada. Se realizó una reacción de quinasa en ELISA con o sin 0,5 \mug de rALK purificada, 15 \mug de péptido de la SEC. ID. N.º: 2 o sin péptido, a 30ºC durante 30 minutos. La gráfica muestra la absorbancia a 450 nm. B) Cinética de la fosforilación del sustrato peptídico de ALK. Se realizó una reacción de quinasa en ELISA usando péptido de la SEC. ID. N.º: 2 206 \muM o péptido de la SEC. ID. N.º: 1 42 \muM con 0,1 \mug de rALK purificada. La reacción se detuvo añadiendo EDTA después de 0, 0,5, 2, 5, 10 y 15 minutos.

Figura 4

El efecto de la concentración del sustrato peptídico sobre el nivel de fosforilación

El ensayo ELISA se realizó en presencia de 0,2 \mug de rALK purificada y péptido de la SEC. ID. N.º 1 0-105 \muM (A) o péptido de la SEC. ID. N.º 2 0-315 \muM (B) a 30ºC durante 15 minutos.

Figura 5

El efecto de la concentración de rALK sobre la fosforilation del sustrato

Se realizó un ensayo ELISA usando péptido de la SEC. ID. N.º 2 206 \muM o péptido de la SEC. ID. N.º 1 42 \muM y rALK que variaba en el intervalo de 0 - 225 ng, a 30ºC durante 15 minutos.

Figura 6

Inhibición de la actividad de rALK por estaurosporina

Se realizó un ensayo ELISA usando 42 \muM de la SEC. ID. N.º 1, 20 ng de rALK, a 30ºC durante 15 minutos en presencia de 0 - 5 \muM de estaurosporina o un volumen equivalente de disolvente, DMSO. La gráfica muestra A450 normalizado con el control sin tratar.

Resultados experimentales Síntesis de los péptidos

Los péptidos se sintetizaron mediante síntesis automática en fase sólida utilizando reacciones químicas con 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) con un sintetizador de Applied Biosystems Modelo 431A en resina de 4-hidroximetil-copoliestireno-divinilbenceno al 1% (0,95 mmol/g, 0,05 mmol).

Los aminoácidos con Fmoc (0,5 mmol) se activaron mediante hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) (1 eq) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (1 eq) en presencia de DIPEA (2 eq).

Se escindieron los peptidilos y las resinas (100 mg) y se desprotegieron en una mezcla que contenía 5 ml de ácido trifluoroacético, 0,375 g de fenol, 0,125 \mul de 1,2-etanoditiol, 0,250 \mul de tioanisol, y 0,25 \mul de agua durante 2 horas. La mezcla de reacción se filtró en un tubo que contenía éter etílico enfriado a 0ºC. Los péptidos precipitados se separaron por centrifugación y se lavaron con éter reciente.

Se bombearon péptidos brutos (50-100 mg en 10 ml de agua) en una columna de RP preparativa (prepNova-Pak HR CIS, 6 \mum, 25 x 10 mm, Waters) y se eluyeron con un gradiente lineal de acetonitrilo del 10% al 45% a 12 ml/minuto.

La pureza de los péptidos era > 90% según se determinó por RP-HPLC analítica en una columna C18 Symmetry300 de 5 \mum, 4,6 x 250 mm (Waters) usando un gradiente lineal de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% a 1 ml/minuto. Los pesos moleculares de los péptidos se confirmaron por espectroscopia de masas usando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con ionización mediante desorción por láser asistida por matriz, (MALDI-Tof) (Maldi-1; Kratos-Schimadzu, Manchester, Reino Unido).

Producción y purificación de ALK recombinante

Una porción de ALK, que se extiende desde los aminoácidos Leu^{1073} a Ala^{1459}, ha sido clonada en el vector de transferencia de baculovirus, pBlueBacHis2C (Invitrogen). Usando este vector y el sistema de expresión en baculovirus MaxBac® 2.0 (Invitrogen), los presentes inventores han producido baculovirus recombinantes y han expresado proteína ALK recombinante (rALK) en células de insecto Sf9 (Spodoptera frugiperda). Esta proteína tiene un peso molecular teórico de 49 kDa y contiene el dominio catalítico previsto ALK (Ile^{1116} a Val^{1392}) fusionado a un marcador de 6 histidinas (marcador de His). La actividad de autofosforilación de rALK marcado con His, que es indicativa de plegamiento correcto, ha sido verificada mediante inmunotransferencia contra fosfotirosina de lisados de células enteras y un ensayo de quinasa radioactiva in vitro.

Para producir proteína para ser purificada, se infectaron células Sf9 con virus recombinantes con una multiplicidad de infección (MOl) de 5. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 27ºC y después se recogieron centrifugando a 400 g durante 10 minutos a 4ºC. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Para lisar las células, los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón hipotónico (Tampón A) que contenía Tris-HCl 50 mM a pH 8, NaCl 20 mM e inhibidores de proteasas (Pepstatina, Benzamidina, Leupeptina y Aprotinina). Después de 30 minutos de incubación sobre hielo, la suspensión celular se centrifugó a 1500 g durante 15 minutos a 4ºC y el sobrenadante se filtró con un filtro de 0,45 \mum. El filtrado después se cargó en una columna de intercambio aniónico de 80 ml Fast Flow DEAE-sepharose (Sigma) en presencia de Tampón A con un caudal de 1,5 ml/minuto usando el sistema AKTA FPLC (Amersham-Pharmacia Biotech). Las proteínas unidas se eluyeron en un gradiente de NaCl que variaba desde 20 a 200 mM. Las fracciones se analizaron para determinar la presencia de proteína ALK por inmunotranferencia. Las fracciones positivas se agruparon y se dializaron durante 3 horas a 4ºC en 1 litro de tampón de unión nativo (fosfato sódico 20 mM a pH 7,8, NaCl 500 mM y PI), cambiando el tampón cada hora. Las fracciones dializadas se cargaron después en una columna de cromatografía por afinidad por níquel HiTrap^{TM} (Amersham-Pharmacia Biotech), previamente equilibrada con tampón de unión nativo suplementado con imidazol 50 mM y \beta-mercaptoetanol 20 mM. Se aplicó un caudal de 0,5 - 1 ml/minuto a la columna. Después de lavar la columna con tampón de unión nativo, las proteínas unidas se eluyeron usando un gradiente lineal de imidazol que variaba en el intervalo de 50 a 200 mM. Después las fracciones se analizaron para determinar la presencia y pureza de rALK por SDS-PAGE y tinción argéntea. La Figura 1A muestra un ejemplo de purificación de rALK.

Finalmente, las fracciones positivas se dializaron en Tris 50 mM a pH 7,4, NaCl 100 mM, glicerol al 10%, \beta-mercaptoetanol 20 mM e inhibidores de proteasas, y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Para verificar que la rALK purificada era activa, los presentes inventores han realizado un ensayo de autofosforilación radioactiva. Una mezcla de reacción que contenía 25 \mul de una fracción positiva para rALK, ATP frío 6 \muM, DTT 1,2 mM, 10 \muCi de [\gamma^{32}P]ATP, Hepes 25 mM a pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, y MnCl_{2} 10 mM se incubó a 30ºC durante 30 minutos. La reacción se detuvo añadiendo tampón de Laemmli y calentando a 95ºC durante 5 minutos. Las muestras se resolvieron en un gel de SDS al 10%-PAGE y se transfirieron a una membrana Immobilon^{TM}-P. Las proteínas marcadas radioactivamente se visualizaron por autorradiografía tal como se muestra en la Figura 1B.

Fosforilación de los péptidos (ensayo radioactivo)

Los péptidos y el polímero aleatorio poliGlu/Tyr (1:4) se fosforilaron en 30 \mul de un medio que contenía Tris/HCl 50 mM, a pH 7,5, MnCl_{2} 5 mM, vanadato sódico 10 \muM, [\gamma^{32}P]ATP o [\gamma^{33}P]ATP 30 \muM (actividad específica de 1000 cpm/pmol) y 10 unidades de rALK [una unidad se definió como la cantidad de enzima que transfiere 1 pmol de fosfato por minuto a poliGlu/Tyr (0,1 mg/ml)]. Las reacciones se terminaron después de 10 minutos de incubación a 30ºC transfiriendo puntos de 25 \mul de la mezcla sobre papeles de fosfocelulosa P81, que se procesaron tal como se describe en otros documentos (1). Las constantes cinéticas se determinaron mediante el programa GraphPad Prism introduciendo los datos directamente en la ecuación de Michaelis-Menten usando regresión no lineal.

Resultados

El péptido que se deriva de la secuencia de referencia de ALK, que contenía Tyr-1278 era un buen sustrato de rALK, mientras que los péptidos que contenían Tyr-1282 o Tyr-1283 eran afectados ligeramente por la enzima (véase la Fig. 2). El derivado de Tyr-1278 se fosforiló con una eficiencia incluso mayor que la que presentaba el péptido que portaba tres residuos Tyr (Tabla I). Para confirmar que el derivado con Tyr-1278 es un sustrato peptídico óptimo para el dominio catalítico de ALK, los presentes inventores compararon su grado de fosforilación con el que presentaba poliGlu/Tyr (1:4)) un polímero aleatorio que es muy buen sustrato para la mayoría de las tirosina-quinasas. La Tabla II muestra que el derivado con Tyr-1278 es un mejor sustrato para ALK que poliGlu/Tyr.

TABLA I Constantes cinéticas para rALK con péptidos sintéticos

Péptido	V_{max} (pmol/minuto)	K_{m} (\muM)	Eficacia (V_{max}/K_{m})

ARDIYRASYYRKGGCAMLPVK	99,5	90,5	1,1
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK	186,3	109,4	1,7

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TABLA II Velocidades de fosforilación de sustratos modelo por el dominio catalítico de ALK

Las concentraciones de poli(Glu/Tyr) y péptido eran 0,1 mg/ml y 400 \muM, respectivamente. La concentración de la enzima era de 10 unidades. Los valores que se reseñan representan las medias de tres experimentos diferentes. Los valores del ETM fueron siempre inferiores al 14%.

Sustrato	Grado de fosforilación (pmol/minuto)

Poli(Glu/Tyr)	10,0
ARDIYRASFFRKGGCAMLPVK	30,3

Ensayo de quinasa in vitro con base de ELISA

Se incubó una placa Nunc Immuno de 96 pocillos toda la noche a 37ºC con solución de recubrimiento (125 \mul/pocillo) que contenía sustrato peptídico de ALK (SEC. ID. N.º 1 o SEC. ID. N.º 2) a diversas concentraciones en PBS. Después los pocillos se lavaron con 200 \mul de tampón de lavado (PBS- Tween al 0,05%) y se dejaron secar durante al menos 2 horas a 37ºC. La reacción de la quinasa se realizó incubando tampón de quinasa (Hepes 25 mM a pH 7,5, MnCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM), ATP 0,3 mM y rALK purificada a diversas concentraciones en un volumen total de 100 \mul/pocillo a 30ºC durante 15 minutos. Después se eliminó la mezcla de reacción y los pocillos se lavaron 5 veces con 200 \mul de tampón de lavado. El péptido fosforilado se detectó usando 100 \mul/pocillo de un anticuerpo monoclonal de ratón contra fosfotirosina (clon 4G10 Upstate Biotech Ltd) diluido 1:500 en PBS + BSA al 4%. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, el anticuerpo se eliminó y los pocillos se lavaron tal como se describe anteriormente. Se añadieron 100 \mul de un anticuerpo secundario (anticuerpo entero contra IgG de ratón, ligado a peroxidasa de rábano, de oveja, Amersham Pharmacia Biotech) diluido 1:1000 en PBS + BSA al 4% a cada pocillo y la placa se incubó de nuevo durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de lavar como anteriormente. La placa se reveló usando 100 \mul/pocillo de Solución de Sustrato TMB (Endogen) y la reacción se detuvo añadiendo un volumen igual de H_{2}SO_{4} 0,18 M. Finalmente, se leyó la absorbancia a 450 ó 490 nm usando un espectrofotómetro Ultrospec® 300 (Amersham-Pharmacia Biotech).

Resultados

Los presentes inventores han demostrado que puede usarse el ensayo de quinasa con base de ELISA para detectar los sustratos peptídicos fosforilados de ALK (SEC. ID. N.º 1 y N.º 2) y por lo tanto la actividad de rALK purificada. En los experimentos iniciales los presentes inventores realizaron el ensayo en presencia y ausencia tanto de rALK purificada como del sustrato peptídico de la SEC. ID. N.º 2, para determinar si podía observarse un aumento específico de la absorbancia a 450 nm (A450) (Figura 3A). De hecho, en presencia tanto de rALK como de sustrato se observó un aumento espectacular de la A450. Por el contrario, en ausencia bien del péptido o de rALK o de ambos, la A450 era baja, lo que indicaba un nivel bajo de absorbancia de fondo. Para determinar la cinética de la fosforilación de los sustratos, los presentes inventores midieron A450 después de diversos tiempos de incubación (Figura 3B). Para ambos péptidos, la cinética de la reacción fue similar, alcanzando una fosforilación máxima después de 10 minutos.

Para comparar la eficacia de los dos péptidos en el ensayo de quinasa en ELISA y para determinar la concentración óptima de péptido a usar, los presentes inventores realizaron curvas de patrones para ambos péptidos. Los resultados indican que al aumentar la cantidad de sustrato peptídico aumentaba A450 y por lo tanto la actividad de quinasa de rALK. Para el sustrato peptídico de la SEC. ID. N.º 2, la A450 y por lo tanto la fosforilación máximas se observaron a aproximadamente 200 \muM, comparado con sólo 25 \muM para el sustrato peptídico de la SEC. ID. N.º 1 (Figuras 4A y B). Esto indica que el sustrato peptídico de la SEC. ID. N.º: 1 es más eficaz como sustrato para rALK.

Para observar la inhibición de la actividad de quinasa, era esencial usar una concentración apropiada de la enzima, es decir, en el intervalo lineal de una curva de patrones. Se realizó un ELISA usando SEC. ID. N.º 2 206 \muM o SEC. ID. N.º 1 42 \muM y rALK que variaba en el intervalo de 0 - 220 ng. El intervalo lineal de la curva para ambos sustratos estaba aproximadamente entre 0 - 15 ng de rALK, después de lo cual las curvas alcanzaban una meseta (Figura 5).

El efecto del inhibidor estaurosporina sobre la actividad de rALK se evaluó usando el sustrato peptídico de la SEC. ID. N.º 2 42 \muM. También se realizó un control con disolvente que contenía DMSO a concentraciones correspondientes. La estaurosporina inhibió marcadamente la actividad de rALK alcanzando una inhibición máxima a 1 \muM y con una CI_{50} estimada = 300 nM (Figura 6). El disolvente (DMSO) solo no tuvo efecto sustancial sobre la actividad de rALK.

Referencias

[1] Glass, D.B., Masaracchia, R.A:, Feramisco, J.R. y Kemp, D.E. (1978) Anal. Biochem. 87, 566-575.

[2] Till, J.H., Ablooglu, A.J., Frankel, M., Bishop, S.M., Kohanski, R.A. y Hubbard, S.R. (2001) J. Biol. Chem. 276, 10049-10055.

<110> ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI

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<120> ENSAYO DE QUINASA DE LINFOMA ANAPLÁSICO, SUS REACTIVOS Y COMPOSICIONES

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<130> 1206 EUR

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> péptido sintético

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<400> 1

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\sa{Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Phr Phe Arg Lys Gly Gly Cys Ala}

\sac{Met Leu Pro Val Lys}

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<210> 2

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> péptido sintético

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<400> 2

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\sa{Ala Arg Asp Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Cys Ala}

\sac{Met Leu Pro Val Lys}

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Claims

1. Un procedimiento para detectar la actividad de tirosina-quinasa de ALK, que comprende las siguientes etapas:

i) incubar la proteína ALK o un derivado funcional de la misma con un sustrato peptídico que se selecciona de SEC. ID. N.º 1 y 2 en condiciones adecuadas para la fosforilación del péptido;

ii) detectar el péptido fosforilado.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido tiene la secuencia SEC. ID. N.º: 1.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se usa proteína ALK purificada o una preparación que contiene ALK.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha preparación es un lisado celular.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho derivado funcional contiene el dominio catalítico completo de ALK que abarca los residuos 1116-1392 de la secuencia de ALK.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho derivado funcional es un fragmento de la proteína ALK que se extiende desde el residuo Leu^{1073} a Ala^{1459}.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende las etapas de:

a) adherir un péptido de la SEC. ID. N.º 1 ó 2 a una fase sólida;

b) incubar la fase sólida con dicho fragmento de ALK en condiciones adecuadas para la fosforilación de tirosina;

c) lavar la fase sólida;

e) lavar la fase sólida;

f) incubar la fase sólida con un anticuerpo conjugado con enzima (anticuerpo secundario) que reconoce el anticuerpo primario en condiciones adecuadas para la unión de los anticuerpos primario y secundario, de forma que se forme un inmunocomplejo ternario;

g) lavar la fase sólida;

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la enzima conjugada con el anticuerpo es peroxidasa de rábano.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la actividad enzimática se detecta mediante reacción colorimétrica.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la identificación de compuestos que modulan la actividad de tirosina-quinasa de ALK.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende las etapas de

i) incubar la proteína ALK o un derivado funcional de la misma con un péptido que se selecciona de la SEC. ID. N.º 1 ó 2 en presencia de un compuesto candidato (a) en condiciones adecuadas para la fosforilation de los péptidos;

ii) detectar el péptido fosforilado así formado.

12. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, en el que la actividad de modulación de ALK del compuesto candidato se compara con la de un compuesto de referencia que se ensaya en las mismas condiciones que el compuesto candidato.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el compuesto de referencia es estaurosporina.

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14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el compuesto de referencia es un derivado de estaurosporina de la fórmula general (I):

2

En el que R1 y R2, independientemente el uno del otro se seleccionan de halógeno, preferiblemente cloro, fenilo o alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con uno o más halógenos; R3 es hidroxilo; R4 es hidroxilo o hidroximetilo; R5 es alquilo C_{1}-C_{3}, opcionalmente sustituido con halo, o bencilo.

15. Un péptido de utilidad como sustrato de ALK que se selecciona de la SEC. ID. N.º: 1 ó 2.

16. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 15, que es la SEC. ID. N.º 1.

17. El uso de un péptido de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 para la determinación de la actividad de tirosina-quinasa de ALK.

18. Un kit para detectar la actividad de tirosina-quinasa de ALK de acuerdo con las reivindicaciones 1-14, que comprende un péptido de la SEQ ID N: 1 ó 2 y un anticuerpo contra fosfotirosina.

19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18, que contiene un componente adicional que se selecciona de reactivos para reacciones colorimétricas, tampones, diluyentes, detergentes, estabilizantes, estaurosporina o un derivado de la misma según la reivindicación 14.